特表 2024-509369 抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-01

(54)【発明の名称】抗ＰＤ－Ｌ１抗体及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240222BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240222BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240222BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240222BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240222BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240222BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240222BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240222BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240222BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240222BHJP

   C07K 16/30 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240222BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C12P21/08 ZNA

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61P37/04

A61P43/00 107

A61K31/7088

A61K35/76

A61K35/12

A61P35/00

A61K48/00

C07K16/30

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548265

(86)(22)【出願日】2022-02-09

(85)【翻訳文提出日】2023-10-02

(86)【国際出願番号】 CN2022075599

(87)【国際公開番号】W WO2022171108

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】202110183554.X

(32)【優先日】2021-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521155852

【氏名又は名称】シャンハイ ジェミンケア ファーマシューティカル カンパニー，リミティド

(71)【出願人】

【識別番号】521155863

【氏名又は名称】チアンシー ジェミンケア グループ カンパニー、リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100170852

【弁理士】

【氏名又は名称】白樫 依子

(72)【発明者】

【氏名】ワン ツォンター

(72)【発明者】

【氏名】ソン チエンチウ

(72)【発明者】

【氏名】リウ シアオウー

(72)【発明者】

【氏名】ツァオ シアオタン

(72)【発明者】

【氏名】トン スーチュン

(72)【発明者】

【氏名】パン チョンツォン

(72)【発明者】

【氏名】ワン シュエピン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064DA03

4B064DA14

4B065AA87X

4B065AA87Y

4B065AB04

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084ZB09

4C084ZB22

4C084ZB26

4C085AA13

4C085AA14

4C085DD62

4C085EE01

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB22

4C086ZB26

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB65

4C087CA12

4C087CA20

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB22

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA50

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA51

(57)【要約】

本出願は単離された抗原結合タンパク質を提供し、これは、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合し、ＰＤ－１タンパク質とＰＤ－Ｌ１タンパク質の結合をブロックし、及び／又は免疫細胞を刺激してサイトカインを分泌させることができる。本出願はまた、薬剤の製造における単離された抗原結合タンパク質の使用を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

以下の特性の１つ以上を有する単離された抗原結合タンパク質：
（１）霊長類由来のＰＤ－Ｌ１タンパク質に１×１０⁹Ｍ以下のＫ_D値で結合することができる、
（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１タンパク質への結合をブロックすることができる、及び
（３）免疫細胞におけるサイトカインの分泌を刺激することができる。

【請求項2】

前記霊長類がヒト及び／又はサルを含む、請求項１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項3】

前記抗体又はその抗原結合断片を含む、請求項１又は２に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項4】

前記抗原結合断片が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ'）₂、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、及び／又はｄＡｂを含む、請求項３に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項5】

前記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体からなる群から選択される、請求項３～４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質であって、ここで、前記単離された抗原結合タンパク質が、ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合に関して参照抗体と競合し、前記参照抗体が、重鎖可変領域ＶＨと軽鎖可変領域ＶＬとを含み、前記参照抗体のＶＨがＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、前記参照抗体のＶＬがＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ１が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ２が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＨＣＤＲ３が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＬＣＤＲ１が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、前記参照抗体のＬＣＤＲ２が配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記参照抗体のＬＣＤＲ３が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、上記タンパク質。

【請求項7】

前記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ３を含み、前記ＨＣＤＲ３が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項8】

前記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ２を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項9】

前記単離された抗原結合タンパク質がＨＣＤＲ１を含み、前記ＨＣＤＲ１が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項10】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質であって、ここで前記ＨＣＤＲ１が配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＨＣＤＲ２が配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＨＣＤＲ３が配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む、上記タンパク質。

【請求項11】

重鎖可変領域ＶＨを含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質であって、ここで前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、及び前記Ｈ－ＦＲ１のＣ末端が前記ＨＣＤＲ１のＮ末端に直接的又は間接的に連結され、及び前記Ｈ－ＦＲ１が配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む、上記タンパク質。

【請求項12】

前記Ｈ－ＦＲ１が配列番号７又は配列番号８のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項13】

前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含み、前記Ｈ－ＦＲ２が前記ＨＣＤＲ１と前記ＨＣＤＲ２との間に位置し、及び前記Ｈ－ＦＲ２が配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１～１２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項14】

前記Ｈ－ＦＲ２が配列番号９～１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１３に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項15】

前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、前記Ｈ－ＦＲ３が前記ＨＣＤＲ２と前記ＨＣＤＲ３との間に位置し、及び前記Ｈ－ＦＲ３が配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１～１４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項16】

前記Ｈ－ＦＲ３が、配列番号１２～１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項17】

前記ＶＨがフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ４を含み、前記Ｈ－ＦＲ４のＮ末端が前記ＨＣＤＲ３のＣ末端に連結され、及び前記Ｈ－ＦＲ４が配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１１～１６のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項18】

前記Ｈ－ＦＲ４が配列番号１８又は１９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項19】

Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４を含む、請求項１～１８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質であって、ここで、前記Ｈ－ＦＲ１が配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ２が配列番号９～１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、前記Ｈ－ＦＲ３が配列番号１２～１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、及び前記Ｈ－ＦＲ４が配列番号１８又は１９に記載のアミノ酸配列を含む、上記タンパク質。

【請求項20】

Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４を含み、並びに前記Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４が以下のアミノ酸配列の群のいずれか１つから選択される、請求項１～１９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質：
（１）Ｈ－ＦＲ１：配列番号７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１２、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１８；
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１３、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９；
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１４、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１８；
（４）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１５、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９；
（５）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９；及び
（６）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１７、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９。

【請求項21】

前記単離された抗原結合タンパク質が、重鎖可変領域ＶＨを含み、前記ＶＨが配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項22】

前記ＶＨが、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項２１に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項23】

前記単離された抗原結合タンパク質が重鎖定常領域を含み、及び前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ定常領域に由来する、請求項１～２２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項24】

前記重鎖定常領域がヒトＩｇＧ１定常領域に由来し、及び前記ヒトＩｇＧ１定常領域が配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項25】

前記単離された抗原結合タンパク質が抗体重鎖ＨＣを含み、及び前記ＨＣが請求項４２～４６のいずれか１項に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項26】

前記単離された抗原結合タンパク質がＬＣＤＲ３を含み、及び前記ＬＣＤＲ３が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２５のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項27】

前記単離された抗原結合タンパク質がＬＣＤＲ２を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２６のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項28】

前記単離された抗原結合タンパク質がＬＣＤＲ１を含み、前記ＬＣＤＲ１が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２７のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項29】

ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここで、前記ＬＣＤＲ１が配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、前記ＬＣＤＲ２が配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み、及び前記ＬＣＤＲ３が配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項30】

軽鎖可変領域ＶＬを含み、ここで、前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１を含み、前記Ｌ－ＦＲ１のＣ末端が直接的又は間接的に前記ＬＣＤＲ１のＮ末端に連結されており、及び前記Ｌ－ＦＲ１が配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～２９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項31】

前記Ｌ－ＦＲ１が配列番号２６又は２７に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項32】

前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ２を含み、前記Ｌ－ＦＲ２がＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ２との間に位置し、及び前記Ｌ－ＦＲ２が配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３０～３１のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項33】

前記Ｌ－ＦＲ２が配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３２に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項34】

前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ３を含み、前記Ｌ－ＦＲ３がＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３との間に位置し、及び前記Ｌ－ＦＲ３が配列番号５７に記載のアミノ配列を含む、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項35】

前記Ｌ－ＦＲ３が配列番号３０～３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項36】

前記ＶＬがフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ４を含み、前記Ｌ－ＦＲ４のＮ末端が前記ＬＣＤＲ３のＣ末端に連結されており、及び前記Ｌ－ＦＲ４が配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３０～３４のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項37】

前記Ｌ－ＦＲ４が配列番号３４又は３５に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項38】

Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４を含み、ここで、前記Ｌ－ＦＲ１が配列番号２６又は２７に記載のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ－ＦＲ２が配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を含み、前記Ｌ－ＦＲ３が配列番号３０～３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、及び前記Ｌ－ＦＲ４が配列番号３４又は３５に記載のアミノ酸配列を含む。請求項１～３７のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項39】

Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４を含み、並びに前記Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４が、以下のアミノ酸配列の群のいずれか１つから選択される、請求項１～３８のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質：
（１）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２６、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２８、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３０、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３４；
（２）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３１、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３５；
（３）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３２、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３５；及び
（４）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３３、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３５。

【請求項40】

前記単離された抗原結合タンパク質が軽鎖可変領域ＶＬを含み、及び前記ＶＬが配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項41】

前記ＶＬが、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４０のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項42】

前記単離された抗原結合タンパク質が抗体の軽鎖定常領域軽を含み、及び前記抗体軽鎖定常領域が配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項43】

前記単離された抗原結合タンパク質が抗体軽鎖ＬＣを含み、及び前記ＬＣが、配列番号４７～４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４２のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項44】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を含むポリペプチド。

【請求項45】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質又は請求項４４に記載のポリペプチドを含む免疫結合体。

【請求項46】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸分子。

【請求項47】

請求項４６に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項48】

請求項４６に記載の核酸分子又は請求項４７に記載のベクターを含む細胞。

【請求項49】

請求項４８に記載の細胞を、請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を発現できる条件下で培養することを含む、請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を調製する方法。

【請求項50】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、及び／又は請求項４８に記載の細胞、及び任意選択的に医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物。

【請求項51】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４４に記載のポリペプチド、請求項４５に記載の免疫結合体、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、及び／又は請求項５０に記載の医薬組成物の使用であって、前記医薬は腫瘍を予防、軽減、及び／又は治療するためである、上記使用。

【請求項52】

前記腫瘍が、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の高発現を有する腫瘍を含む、請求項５１に記載の使用。

【請求項53】

前記腫瘍が固形腫瘍を含む、請求項５１～５２のいずれか１項に記載の使用。

【請求項54】

前記腫瘍が、乳癌、肺癌、胃癌、及び尿路上皮癌を含む、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の使用。

【請求項55】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質を、必要とする対象に投与することを含む、腫瘍を予防、軽減、又は治療するための方法。

【請求項56】

ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の高発現を有する腫瘍、請求項４４に記載のポリペプチド、請求項４５に記載の免疫結合体、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、及び／又は請求項５０に記載の医薬組成物を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記腫瘍が固形腫瘍を含む、請求項５５～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

前記腫瘍が、乳癌、肺癌、胃癌、及び尿路上皮癌を含む、請求項５５～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

腫瘍の予防、軽減、又は治療に使用するための、請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項60】

前記腫瘍がＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の高発現を伴う腫瘍を含む、請求項５９に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４４に記載のポリペプチド、請求項４５に記載の免疫結合体、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、及び／又は請求項５０に記載の医薬組成物。

【請求項61】

前記腫瘍が固形腫瘍を含む、請求項５９～６０のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項62】

前記腫瘍が、乳癌、肺癌、胃癌、及び尿路上皮癌を含む、請求項５９～６１のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質。

【請求項63】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４４に記載のポリペプチド、請求項４５に記載の免疫結合体、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、及び／又は請求項５０に記載の医薬組成物を投与することを含む、ＰＤ－１タンパク質のＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合を阻害する方法。

【請求項64】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４４に記載のポリペプチド、請求項４５に記載の免疫結合体、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、及び／又は請求項５０に記載の医薬組成物を投与することを含む、免疫細胞におけるサイトカインの分泌を刺激する方法。

【請求項65】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、及び／又は請求項４４に記載のポリペプチドを投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在及び／又は含有量を検出するための方法。

【請求項66】

請求項１～４３のいずれか１項に記載の単離された抗原結合タンパク質、請求項４４に記載のポリペプチド、請求項４５に記載の免疫結合体、請求項４６に記載の核酸分子、請求項４７に記載のベクター、請求項４８に記載の細胞、及び／又は請求項５０に記載の医薬組成物を含むキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本出願は生物医学の分野、特に抗ＰＤ－Ｌ１抗体及び薬剤の製造におけるその使用に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
悪性腫瘍は現在、世界中で人間の健康を深刻に脅かしている疾患であり、人間の死を引き起こす主要な種類の疾患である。中国では人口の高齢化に伴い、癌の発生率が増加して、有効な治療薬の開発が急務となっており、その中でも、近年免疫チェックポイント薬の開発が研究の中心となっている。

【0003】

ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１免疫療法のメカニズムは、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１に対する特異的モノクローナル抗体を設計し、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１の認識を防ぎ、Ｔ細胞の正常な機能を回復させ、こうして、細胞が腫瘍細胞を効果的に死滅させることができるようにすることである。現在、デュルバルマブ（Durvalumab）やアテゾリズマブ（Atezolizumab）のように、このシグナル伝達経路に対して多くの治療用抗体が開発されている。しかし、治療中には、反応率が低く、薬剤耐性が生じやすいなどの現象が広く存在する。従って、安定した構造、優れた治療効果を有し、大規模な工業的生産に適した抗腫瘍ＰＤ－Ｌ１抗体が緊急に必要とされている。

【発明の概要】

【0004】

本出願は、以下の特性の１つ又はそれ以上を有する単離された抗原結合タンパク質を提供する：（１）霊長類由来のＰＤ－Ｌ１タンパク質に１×１０⁹Ｍ以下のＫ_D値で結合することができる；（２）ＰＤ－Ｌ１タンパク質のＰＤ－１タンパク質への結合をブロックすることができる；及び（３）免疫細胞におけるサイトカインの分泌を刺激することができる。

【0005】

いくつかの実施態様において、霊長類はヒト及び／又はサルを含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、抗体又はその抗原結合断片を含む。
いくつかの実施態様において、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ'）₂、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、及び／又はｄＡｂを含む。
いくつかの実施態様において、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、及び完全ヒト抗体からなる群から選択される。

【0006】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、ＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合に関して参照抗体と競合し、ここで参照抗体は重鎖可変領域ＶＨ及び軽鎖可変領域ＶＬを含み、参照抗体のＶＨは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、参照抗体のＶＬは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、参照抗体のＨＣＤＲ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、参照抗体のＨＣＤＲ２は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、参照抗体のＨＣＤＲ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含み、参照抗体のＬＣＤＲ１は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、参照抗体のＬＣＤＲ２は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み、及び参照抗体のＬＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。

【0007】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ３を含み、及びＨＣＤＲ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ２を含み、及びＨＣＤＲ２は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ１を含み、及びＨＣＤＲ１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0008】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含み、ここでＨＣＤＲ１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含み、ＨＣＤＲ２は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含み、及びＨＣＤＲ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含む。

【0009】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は重鎖可変領域ＶＨを含み、ここでＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ１を含み、及びＨ－ＦＲ１のＣ末端は、直接的又は間接的にＨＣＤＲ１のＮ末端に連結され、及びＨ－ＦＲ１は、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0010】

いくつかの実施態様において、Ｈ－ＦＲ１は、配列番号７又は８の任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0011】

いくつかの実施態様において、ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ２を含み、Ｈ－ＦＲ２はＨＣＤＲ１とＨＣＤＲ２との間に位置し、及びＨ－ＦＲ２は配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＦＲ２は、配列番号９～１１の任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0012】

いくつかの実施態様において、ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ３を含み、Ｈ－ＦＲ３はＨＣＤＲ２とＨＣＤＲ３との間に位置し、及びＨ－ＦＲ３は配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＦＲ３は、配列番号１２～１７の任意の１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0013】

いくつかの実施態様において、ＶＨはフレームワーク領域Ｈ－ＦＲ４を含み、Ｈ－ＦＲ４のＮ末端はＨＣＤＲ３のＣ末端に連結され、及びＨ－ＦＲ４は配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、Ｈ－ＦＲ４は、配列番号１８又は１９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0014】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４を含み、ここでＨ－ＦＲ１は、配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列を含み、Ｈ－ＦＲ２は配列番号９～１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、Ｈ－ＦＲ３は配列番号１２～１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、及びＨ－ＦＲ４は、配列番号１８又は１９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0015】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４を含み、そしてＨ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、及びＨ－ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の群のいずれか１つから選択される：
（１）Ｈ－ＦＲ１：配列番号７、Ｈ－ＦＲ２：配列番号９、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１２、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１８；
（２）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１３、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９；
（３）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１４、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１８；
（４）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１５、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９；
（５）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１０、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１６、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９；及び
（６）Ｈ－ＦＲ１：配列番号８、Ｈ－ＦＲ２：配列番号１１、Ｈ－ＦＲ３：配列番号１７、及びＨ－ＦＲ４：配列番号１９。

【0016】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は重鎖可変領域ＶＨを含み、及びＶＨは配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ＶＨは、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は重鎖定常領域を含み、及び重鎖定常領域はヒトＩｇＧ定常領域に由来する。
いくつかの実施態様において、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１定常領域に由来し、及びヒトＩｇＧ１定常領域は配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0017】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は抗体重鎖ＨＣを含み、及びＨＣは配列番号４２～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0018】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ３を含み、及びＬＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ２を含み、及びＬＣＤＲ２は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ１を含み、及びＬＣＤＲ１は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0019】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含み、ここでＬＣＤＲ１は、配列番号４に記載のアミノ酸配列を含み、ＬＣＤＲ２は、配列番号５に記載のアミノ酸配列を含み、及びＬＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含む。

【0020】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域ＶＬを含み、ここでＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ１を含み、Ｌ－ＦＲ１のＣ末端は、直接的又は間接的にＬ－ＣＤＲ１のＮ末端に連結され、及びＬ－ＦＲ１は配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0021】

いくつかの実施態様において、Ｌ－ＦＲ１は、配列番号２６又は２７に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ２を含み、Ｌ－ＦＲ２はＬＣＤＲ１とＬＣＤＲ２との間に位置し、及びＬ－ＦＲ２は配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、Ｌ－ＦＲ２は、配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0022】

いくつかの実施態様において、ＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ３を含み、Ｌ－ＦＲ３はＬＣＤＲ２とＬＣＤＲ３の間に位置し、Ｌ－ＦＲ３は配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、Ｌ－ＦＲ３は、配列番号３０～３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0023】

いくつかの実施態様において、ＶＬはフレームワーク領域Ｌ－ＦＲ４を含み、Ｌ－ＦＲ４のＮ末端はＬＣＤＲ３のＣ末端に連結され、及びＬ－ＦＲ４は配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、Ｌ－ＦＲ４は、配列番号３４又は３５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0024】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４を含み、ここで、Ｌ－ＦＲ１は、配列番号２６又は２７に記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ－ＦＲ２は配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を含み、Ｌ－ＦＲ３は配列番号３０～３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含み、及びＬ－ＦＲ４は配列番号３４又は３５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0025】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４を含み、及びＬ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、及びＬ－ＦＲ４は、以下のアミノ酸配列の群のいずれか１つから選択される：
（１）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２６、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２８、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３０、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３４；
（２）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３１、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３５；
（３）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３２、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３５；及び
（４）Ｌ－ＦＲ１：配列番号２７、Ｌ－ＦＲ２：配列番号２９、Ｌ－ＦＲ３：配列番号３３、及びＬ－ＦＲ４：配列番号３５。

【0026】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は軽鎖可変領域ＶＬを含み、ＶＬは配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、ＶＬは、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0027】

いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は抗体軽鎖定常領域を含み、及び抗体軽鎖定常領域は配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施態様において、単離された抗原結合タンパク質は抗体軽鎖ＬＣを含み、及びＬＣは配列番号４７～４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含む。

【0028】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質を含むポリペプチドを提供する。
別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質又はポリペプチドを含む免疫結合体（immunoconjugate）を提供する。
別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質をコードする単離された核酸分子を提供する。
別の態様において、本出願は、核酸分子を含むベクターを提供する。
別の態様において、本出願は、核酸分子又はベクターを含む細胞を提供する。

【0029】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質を発現できる条件下で細胞を培養することを含む、単離された抗原結合タンパク質を調製する方法を提供する。
別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター及び／又は細胞、及び任意選択的に医薬的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。

【0030】

別の態様において、本出願は、腫瘍を予防、軽減、及び／又は治療するための薬剤の製造における、単離された抗原結合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、及び／又は医薬組成物の使用を提供する。

【0031】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを必要とする対象に投与することを含む、腫瘍を予防、軽減、又は治療する方法を提供する。
別の態様において、本出願は、腫瘍の予防、軽減、又は治療に使用するための、単離された抗原結合タンパク質を提供する。

【0032】

いくつかの実施態様において、腫瘍は、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の高発現を伴う腫瘍を含む。
いくつかの実施態様において、腫瘍は固形腫瘍を含む。
いくつかの実施態様において、腫瘍は、乳癌、肺癌、胃癌、及び尿路上皮癌を含む。

【0033】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを投与することを含む、ＰＤ－１タンパク質のＰＤ－Ｌ１タンパク質への結合を阻害する方法を提供する。
別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを投与することを含む、免疫細胞におけるサイトカインの分泌を刺激する方法を提供する。
別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在及び／又は含有量を検出する方法を提供する。

【0034】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質、ポリペプチド、免疫結合体、核酸分子、ベクター、細胞、及び／又は医薬組成物を含むキットを提供する。

【0035】

本発明の他の態様及び利点は、以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。以下の詳細な説明では、本発明の例示的な実施態様のみが示され、説明される。当業者には理解されるように、本出願の内容により、当業者は、本出願が関連する本出願の精神及び範囲から逸脱することなく、開示された特定の実施態様を修正することができる。従って、本出願の図面及び明細書の記載は例示にすぎず、限定的なものではない。

【図面の簡単な説明】

【0036】

本出願が関連する本出願の特定の特徴は、添付の特許請求の範囲に示されている。本出願が関連する本出願の特徴及び利点は、以下に詳細に説明される例示的な実施態様及び図面を参照することによって、よりよく理解されるであろう。添付図面の簡単な説明は次のとおりである。

【図1】図１は、本出願に記載される抗原結合タンパク質がＨＥＫ２９３細胞上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することを示す。

【図2】図２は、本出願に記載される抗原結合タンパク質がＣＨＯＫ１細胞上のサルＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することを示す。

【図3】図３は、本出願に記載される抗原結合タンパク質が、ヒトＰＤ－１とＨＥＫ２９３細胞上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合をブロックすることを示す。

【図4】図４は、本出願に記載される抗原結合タンパク質が、ヒトＰＤ－１とＣＨＯＫ１細胞上のサルＰＤ－Ｌ１タンパク質との結合をブロックすることを示す。

【図5】図５は、本出願に記載される抗原結合タンパク質が、免疫細胞を刺激してサイトカインＩＬ－２を分泌させることを示す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

発明の詳細な説明
以下、具体例を挙げて本出願の実施態様を説明するが、当業者であれば本明細書の開示から本出願の他の利点や効果を容易に理解することができる。

【0038】

用語の定義
本出願において、「ＰＤ－１」という用語は一般に、プログラムされた死１受容体を指し、これはまた、「プログラムされた死１」、「ＣＤ２７９」、「分化クラスター２７９」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、又は「ＣＤ２９７」とも呼ばれている。ＰＤ－１タンパク質は通常、細胞外ＩｇＶドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内尾部から構成される。ＰＤ－１は通常、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、活性化単球、及び樹状細胞（ＤＣ）で発現される。ＰＤ－１は、そのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２に結合することができる。「ＰＤ－１」という用語は、霊長類（例えば、ヒト又はサル）及びげっ歯類（例えば、マウス又はラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物に由来する任意の天然ＰＤ－１又は修飾ＰＤ－１を包含する。この用語には、「全長」、未プロセシングＰＤ－１、及び細胞内でのプロセシングによって生成されるあらゆる形態のＰＤ－１が含まれる。ＰＤ－１は、膜貫通タンパク質又は可溶性タンパク質として存在することができる。「ＰＤ－１」は、完全なＰＤ－１及びその断片、並びにＰＤ－１の機能性変種、アイソフォーム、相同体、誘導体、及び類似体、並びにＰＤ－１と少なくとも１つの共通エピトープを有する類似体を含む。ＰＤ－１配列は当技術分野で知られている。例えば、例示的な全長ヒトＰＤ－１タンパク質配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００５００９．２で見つけることができ、例示的な全長カニクイザルＰＤ－１タンパク質配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿００１２７１０６５又はＵｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｂ０ＬＡＪ３で見つけることができる。

【0039】

本出願において、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は一般に、プログラム細胞死リガンド１タンパク質を指す。ＰＤ－Ｌ１はまた、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）又はＢ７相同体１（Ｂ７－Ｈ１）とも呼ばれ、（ヒト）ＣＤ２７４遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＰＤ－Ｌ１は、プログラムされた死１（ＰＤ－１）などのその受容体に結合することができる。ＰＤ－Ｌ１とＰＤ－１の複合体形成は、Ｔ細胞の増殖を阻害し、サイトカインＩＬ－２及びＩＦＮ－γを産生することにより、免疫抑制の役割を果たす。「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、霊長類（例えば、ヒト又はサル）及びげっ歯類（例えば、マウス又はラット）などの哺乳動物を含む任意の脊椎動物に由来する任意の天然のＰＤ－Ｌ１又は修飾されたＰＤ－１を包含する。この用語には、「全長」の未プロセシングＰＤ－Ｌ１、及び細胞内でのプロセシングによって生成されるあらゆる形態のＰＤ－Ｌ１が含まれる。ＰＤ－Ｌ１は、膜貫通タンパク質又は可溶性タンパク質として存在することができる。この用語には、スプライス変種又はアレレ変種などの、ＰＤ－Ｌ１の天然に存在する変種も含まれる。ＰＤ－Ｌ１の基本構造は、細胞外Ｉｇ様ＶドメインとＩｇ様Ｃ２ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメインの４つのドメインで構成される。ＰＤ－Ｌ１配列は当技術分野で知られている。例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（ゲノムＤＮＡ配列を含む）に関する情報は、ＮＣＢＩＧｅｎｅＩＤＮｏ．２９１２６で確認することができる。例示的な全長ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ＿０５４８６２又はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＮＺＱ７で見つけることができる。

【0040】

本出願において、「抗原結合タンパク質」という用語は一般に、抗原に結合する部分と、任意選択的に足場又は骨格部分とを含むタンパク質を指し、ここで、前記足場又は骨格部分は、抗原に結合する部分が、抗原結合タンパク質が抗原に結合するのを促進するコンフォメーションをとることを可能にする。抗原結合タンパク質は典型的には、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）、又はこれらの両方、及びこれらの機能的断片を含むことができる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗原結合タンパク質の例には、必要な抗原結合活性を示す限り、特に限定されるものではないが、抗体、抗原結合断片、免疫結合体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、抗体断片、抗体誘導体、抗体類似体、又は融合タンパク質などが含まれる。

【0041】

本出願において、「抗体」という用語は一般に、特定のタンパク質又はペプチド又はこれらの断片に対して反応性のある免疫グロブリンを指す。抗体は、特に限定されるものではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥを含む任意のクラスからの抗体、及び任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）の抗体であり得る。抗体は、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４から選択される重鎖定常領域を含むことができる。抗体はまた、例えばカッパ（κ）又はラムダ（λ）から選択される軽鎖を含むことができる。本出願の抗体は、任意の種に由来し得る。

【0042】

本出願において、「抗原結合断片」という用語は一般に、抗原と相互作用し、抗体に抗原に対する特異性及び親和性を与えるアミノ酸残基を含む抗体分子の一部を指す。抗原結合断片の例には、特に限定されるものではないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ'）₂、ｓｃＦｖ、ｄｉ－ｓｃＦｖ、及び／又はｄＡｂが含まれ得る。本出願において、「Ｆａｂ」という用語は一般に、重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインとを含む断片を指し、さらに軽鎖の定常ドメインと重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）も含む。；「Ｆａｂ'」という用語は一般に、少量の残基（抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む）を重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシル末端に付加することによって、Ｆａｂとは異なる断片を指す。「Ｆ（ａｂ'）₂」という用語は一般に、Ｆａｂ'の二量体を指し、これはヒンジ領域上のジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ断片の抗体断片を含む。「Ｆｖ」という用語は一般に、完全な抗原認識部位と結合部位とを含む最小の抗体断片を指す。いくつかの実施態様において、断片は、密接に非共有結合した重鎖可変領域と軽鎖可変領域を有する二量体から構成され得る。「ｄｓＦｖ」という用語は一般に、単一の軽鎖可変領域と単一の重鎖可変領域との結合がジスルフィド結合である、ジスルフィド安定化されたＦｖ断片を指す。「ｄＡｂ断片」という用語は一般に、ＶＨドメインから構成される抗体断片を指す。本出願において、「ｓｃＦｖ」という用語は一般に、柔軟なペプチドリンカーを介して抗体の重鎖可変ドメインと軽鎖可変ドメインの共有結合及び対合によって形成される一価の分子を指し、このようなｓｃＦｖ分子は、一般構造：ＮＨ₂－ＶＬ－リンカー－ＶＨ－ＣＯＯＨ、又はＮＨ₂－ＶＨ－リンカー－ＶＬ－ＣＯＯＨを含むことができる。

【0043】

本出願において、用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は一般に、抗原への抗体の結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。本出願において、用語「可変」は一般に、抗体の可変ドメインの配列の一部が大きく変化し、それらの特異的抗原に対する様々な特異抗体の結合及び特異性を生成することを意味する。可変性は抗体の可変領域全体に不均一に分布している。これは主に軽鎖可変領域と重鎖可変領域の３つのセグメントに存在し、これらのセグメントは、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は高可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれ、それぞれＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３である。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域（Ｈ－ＦＲ１、Ｈ－ＦＲ２、Ｈ－ＦＲ３、Ｈ－ＦＲ４、Ｌ－ＦＲ１、Ｌ－ＦＲ２、Ｌ－ＦＲ３、Ｌ－ＦＲ４）を含み、これらのほとんどはβ折り畳み構造を有し、３つのＣＤＲ構造ループ領域によって接続されている。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域を通じて互いに近接しており、他の鎖のＣＤＲとともに抗体の抗原結合部位を形成する。

【0044】

この分野では、抗体の可変領域又は抗体のＣＤＲは、Kabatの番号付けスキームや配列の可変性に基づく定義規則（例えば、 Kabat et al., protein sequence in immunology, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland (1991) を参照) 、構造ループ領域の位置に基づくChothia番号付けスキーム及び定義規則（A1- Lazikani et al., J Mol Biol 273:927-48,1997を参照）、efranc et al. による生殖系列Ｖ遺伝子のアミノ酸配列アライメントに基づくＩＭＧＴ番号付けスキーム、及び Honneger の番号付けスキーム (ＡＨｏ'ｓ)、Martin番号付けスキーム、Gelfand番号付けスキームなどのさまざまな方法で番号付けできる。例えば、Mathieu Dondelinger et al., Understanding the Significance and Implications of Antibody Numbering and Antigen-Binding Surface/Residue Definition, Front. Immunol., 16 October 2018を参照されたい。

【0045】

本出願において、「モノクローナル抗体」という用語は一般に、基本的に均質な抗体の群から得られる抗体を指し、すなわち、その群を構成する各抗体は、微量に存在する可能性がある天然の突然変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。モノクローナル抗体は単一の抗原部位に対する特異性が高い。

【0046】

本出願において、「キメラ抗体」という用語は一般に、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来する抗体を指す。一般に、可変領域はげっ歯類などの実験動物の抗体（「親抗体」）に由来し、定常領域はヒト抗体に由来するため、得られるキメラ抗体は、親（例えば、マウス由来）抗体と比較して、ヒト個体において有害免疫応答を引き起こしにくい。

【0047】

本出願において、「ヒト化抗体」という用語は一般に、非ヒト抗体（例えば、マウス抗体）のＣＤＲ領域以外のアミノ酸の一部又は全部が、ヒト免疫グロブリン由来の対応するアミノ酸で置換された抗体を指す。ＣＤＲ領域のアミノ酸の付加、欠失、挿入、置換、又は修飾は、それらが特定の抗原に結合する能力を依然として保持している限り、許容される。ヒト化抗体は、任意選択的に、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含むことができる。ヒト化抗体は、元の抗体と同様の抗原特異性を保持している。非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、少なくとも非ヒト免疫グロブリンの配列に由来するキメラ抗体を含むことができる。場合によっては、ヒト免疫グロブリン（受容体抗体）のＣＤＲ領域の残基は、望ましい特性、親和性、及び／又は能力を有する非ヒト種（ドナー抗体）（例えば、マウス、ラット、ウサギ、非ヒト霊長類）のＣＤＲ領域の残基で置き換えることができる。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦＲ領域の残基は、対応する非ヒト残基に置き換えることができる。さらにヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体には存在しないアミノ酸修飾を含むことができる。

【0048】

本出願において、「完全ヒト抗体」という用語一般に、全ての部分（抗体の可変領域及び定常領域を含む）がヒト起源の遺伝子によってコードされている抗体を指す。この分野で完全ヒト抗体を得る方法には、ファージ表示技術、トランスジェニックマウス技術、リボゾーム表示技術、及びＲＮＡ－ポリペプチド技術が含まれ得る。

【0049】

本出願において、「結合する」、「特異的に結合する」、又は「に特異的な」という用語は一般に、測定可能かつ再現可能な相互作用、例えば生物学的分子を含む分子の不均一な集団の存在下で、標的の存在を決定することができる抗原と抗体との結合を指す。例えば、抗体はその抗原結合ドメインを介してエピトープに結合し、この結合には抗原結合ドメインとエピトープの間にある程度の相補性を必要とする。例えば、標的（エピトープでもよい）に特異的に結合する抗体は、他の標的への抗体の結合よりも高い親和性、結合親和性、並びにより容易及び／又はより長い持続時間、でこの標的に結合する抗体である。抗体が、ランダムな無関係なエピトープに結合するよりも、その抗原結合ドメインを介してエピトープに結合する可能性が高い場合、抗体は抗原に「特異的に結合する」と呼ばれる。

【0050】

本出願において、「ＫＤ」及び「Ｋ_D」という用語は互換的に使用することができ、通常は平衡解離定数を指し、「ＫＤ」は解離速度定数（ｋ_dis、「解離速度（ｋ_off）」又は「ｋｄ」としても知られている）と結合速度定数（ｋ_on、「結合速度（ｋ_on）」又は「ｋａ」としても知られている）と比率である。結合速度定数（ｋ_on）、解離速度定数（ｋ_dis）、及び平衡解離定数（ＫＤ）は、抗原に対する抗原結合タンパク質（例えば、抗体）の結合親和性を表すために使用することができる。結合速度定数及び解離速度定数を決定するための方法は当技術分野でよく知られており、特に限定されるものではないが、生物層干渉法（ＢＬＩ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、平衡透析、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、共同免疫沈降（Ｃｏ－ＩＰ）、及びプロテインチップテクノロジーが含まれる。異なる条件（例えば、塩濃度やｐＨ）で測定すると、特異的なタンパク質－タンパク質相互作用の測定された親和性が異なる場合がある。

【0051】

本出願において、「霊長類」という用語は通常サル及び類人猿種、例えばマカク属（Macaca）のサル（例えば、カニクイザル（Macaca fascicularis）及び／又はアカゲザル（Macaca mulatta））及びヒヒ（Papio ursinus）などのサル種、並びにマーモセット（マーモセット属（Callithrix）の種）、リスザル（リスザル属（Saimiri）の種）、及びシシザル（tamarin）（サグイヌス属（Saguimus）の種）、及びチンパンジー（Pan troglodytes）などの類人猿を指し、及びホモサピエンスも含まれる。

【0052】

本出願において、「ポリペプチド」又は「タンパク質」という用語は互換的に使用され、一般にアミノ酸残基のポリマーを指す。この用語は、１つ又はそれ以上のアミノ酸残基が、対応する天然アミノ酸の類似体又は模倣物であるアミノ酸ポリマー、並びに天然アミノ酸ポリマーにも適用される。この用語はまた、例えば、糖残基を付加して糖タンパク質を形成するか、又はリン酸化の修飾による、修飾されたアミノ酸ポリマーも含むことができる。ポリペプチド及びタンパク質は、天然に存在する細胞と非組換え細胞、又は遺伝子操作された細胞若しくは組換え細胞によって産生することができ、天然タンパク質のアミノ酸配列を有する分子、又は天然配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を有する分子を含むことができる。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、特に、本出願に記載される抗原結合タンパク質の配列の１つ又はそれ以上のアミノ酸の欠失、付加、及び／又は置換を含む。

【0053】

本出願において、「相同体」という用語は一般に、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を指す。「相同性」という用語は、配列の「同一性」と同等である場合がある。相同配列は、対象配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、又は９９．９％同一であり得るアミノ酸配列を含むことができる。典型的には、相同体は対象アミノ酸配列と同じ活性部位などを含むであろう。相同性は、類似性（すなわち、類似の化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）の観点から考慮することもできるし、又は配列同一性の観点から表現することもできる。本出願において、上記アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の上記配列番号のいずれかにおいて同一性パーセントを有する配列とは、上記配列番号の全長にわたって同一性パーセントを有する配列をいう。

【0054】

本出願において、「単離された」という用語は一般に、通常はそれらの自然環境に付随又は相互作用する成分を実質的に含まない生物学的材料（例えば、ウイルス、核酸、又はタンパク質）を指す。単離された生物学的材料は、任意選択的に、その自然環境では見出されない追加の材料（例えば、核酸又はタンパク質）を含む。本出願において、タンパク質に関して「単離」とは、通常、その分子が自然に存在することが認められる生物全体から単離及び分離されているか、又は基本的に同種の生体高分子が存在しないことを意味する。核酸分子が言及される場合、それは、自然に結合する配列から完全又は部分的に分離されているか、又はその核酸がそれに結合する異種配列を有するか、又はその核酸が染色体から分離されている。

【0055】

本出願において、「免疫結合体」という用語は一般に、抗原結合タンパク質と他の活性剤との結合によって形成される物質を指し、これは、化学療法剤、毒素、免疫療法剤、イメージングプローブ、又は蛍光プローブなどの小分子活性剤であってもよい。

【0056】

本出願において、「核酸」分子という用語は一般に、自然環境から単離されたか人工合成されたヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチド、又はその類似体の任意の長さの単離された形態を指す。

【0057】

本出願において、「ベクター」という用語は一般に、挿入された核酸分子を宿主細胞中に及び／又は宿主細胞間で移入する、適切な宿主内で自己複製できる核酸分子を指す。ベクターは、主にＤＮＡ又はＲＮＡを細胞に挿入するために使用されるベクター、主にＤＮＡ又はＲＮＡを複製するために使用されるベクター、及び主にＤＮＡ又はＲＮＡの転写及び／又は翻訳の発現に使用されるベクターを含むことができる。ベクターには、上記の機能を複数有するベクターも含まれる。ベクターは、適切な宿主細胞に導入されたときに、ポリペプチドに転写及び翻訳され得るポリヌクレオチドであり得る。一般にベクターは、ベクターを含む適切な宿主細胞を培養することによって所望の発現産物を産生することができる。

【0058】

本出願において、「細胞」という用語は一般に、本出願に記載される核酸分子を含むプラスミドもしくはベクターを含むことができるか若しくは既に含んでいるか、又は本出願に記載される抗原結合タンパク質を発現することができる、個々の細胞、細胞株、又は細胞培養物を指す。細胞は、単一の宿主細胞の子孫を含むことができる。自然の突然変異、予期せぬ突然変異、又は意図的な突然変異のため、子孫細胞は形態又はゲノムにおいて元の親細胞と全く同じではない可能性があるが、これらは本出願に記載される抗体又はその抗原結合断片を発現することができる。細胞は、本出願に記載されるベクターを使用してインビトロで細胞をトランスフェクトすることによって得ることができる。細胞は、原核細胞（例えば、大腸菌）又は真核細胞（例えば、酵母細胞、例えばＣＯＳ細胞、チャイナハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＨｅＬａ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＣＯＳ－１細胞、ＮＳ０細胞、又は骨髄腫細胞）であり得る。場合によっては、細胞は哺乳類細胞であってもよい。例えば、哺乳類細胞はＣＨＯ－Ｋ１細胞であってもよい。

【0059】

本出願において、「医薬組成物」という用語は一般に、有効成分の生物学的活性が効果的であることを可能にする形態で存在し、かつ組成物が投与される対象に対して許容できない毒性を有する追加の成分を含まない調製物製剤を指す。

【0060】

本出願において、「治療」という用語は一般に、治療される個体の自然な経過を変えたいという願望を指し、予防及び治療を達成するための又は臨床病変の過程における臨床介入であり得る。望ましい治療効果には、特に限定されるものではないが、疾患の発生又は再発の予防、症状の緩和、疾患の直接的又は間接的な病理学的結果の弱体化、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患状態の改善又は軽減、及び予後の軽減又は改善が含まれる。場合によっては、本出願の抗原結合タンパク質（例えば、抗ＰＤ－Ｌ１抗体）は、疾患の発症を遅らせたり、疾患の進行を遅らせたりするために使用することができる。

【0061】

本出願において、「投与」という用語は一般に、ある用量の化合物（例えば、抗癌治療薬）又は医薬組成物（例えば、抗癌治療薬を含む医薬組成物）を対象（例えば、患者）に投与する方法を指す。投与は、非経口、肺内、及び鼻腔内投与、並びに（局所治療に必要な場合）病巣内投与を含む任意の適切な手段によって実施することができる。非経口注入には、例えば、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与が含まれる。

【0062】

本出願において、「腫瘍」という用語は一般に、すべての新生物細胞（悪性又は良性）並びにすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織の成長及び増殖を指す。本出願において腫瘍は、細胞及び組織においてＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の高発現を伴う腫瘍であり得る。腫瘍は、固形腫瘍及び／又は非固形腫瘍（例えば、血腫、リンパ腫）を含むことができる。

【0063】

本出願において、「の間」という用語は一般に、アミノ酸断片のＣ末端が第１のアミノ酸断片のＮ末端に直接的又は間接的に連結されており、そのＮ末端が第２のアミノ酸断片のＮ末端に直接的又は間接的に連結されていることを意味する。例えば軽鎖では、Ｌ－ＦＲ２のＮ末端がＬＣＤＲ１のＣ末端に直接的又は間接的に連結され、Ｌ－ＦＲ２のＣ末端がＬＣＤＲ２のＮ－末端に直接的又は間接的に連結されている。別の例として、Ｌ－ＦＲ３のＮ末端がＬＣＤＲ２のＣ末端に直接的又は間接的に連結され、Ｌ－ＦＲ３のＣ末端がＬＣＤＲ３のＮ末端に直接的又は間接的に連結されている。例えば重鎖では、Ｈ－ＦＲ２のＮ末端がＨＣＤＲ１のＣ末端に直接的又は間接的に連結され、Ｈ－ＦＲ２のＣ末端がＨＣＤＲ２のＮ－末端に直接的又は間接的に連結されている。別の例として、Ｈ－ＦＲ３のＮ末端がＨＣＤＲ２のＣ末端に直接的又は間接的に連結され、Ｈ－ＦＲ３のＣ末端がＨＣＤＲ３のＮ末端に直接的又は間接的に連結されている。本出願において、「第１のアミノ酸断片」及び「第２のアミノ酸断片」は、同一のアミノ酸断片であってもよいし、異なるアミノ酸断片であってもよい。

【0064】

本出願において、「含む（includes）／含む（include）」という用語は一般に、含む（comprising）、包んで（inclusive）、又は包含する（encompassing）を指す。場合によっては、これは「である」及び「からなる」という意味も表す。

【0065】

本出願において、「約」という用語は一般に、特定された値の上又は下に０．５％～１０％の範囲の変化、例えば、特定された値の上又は下に０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．５％、６％、６．５％、７％、７．５％、８％、８．５％、９％、９．５％、又は１０％の範囲の変化である。
［発明を実施するための形態］

【0066】

本出願の詳細な説明
抗原結合タンパク質
１つの態様において、本出願は、霊長類（例えば、ヒト又はサル）由来のＰＤ－Ｌ１に１×１０^-9Ｍ以下のＫＤ値で結合することができる単離された抗原結合タンパク質を提供する。霊長類ＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質のＰＤ－Ｌ１に対する結合親和性は、当技術分野で知られている任意の方法によって測定することができる。場合によっては、結合親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、結合抗原沈降法、平衡透析法、及び生体層干渉（ＢＬＩ）によって測定することができる。場合によっては、ＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質の結合親和性及びＫＤ値は、生体層干渉（ＢＬＩ）によって測定することができる。例えば、ForteBio Octet分子相互作用分析装置を使用して、抗原と抗体間の結合動力学を分析することができる。

【0067】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、霊長類由来のＰＤ－Ｌ１に１×１０^-9Ｍ以下のＫＤ値で結合することができる。例えばＫＤ値は、ヒト由来のＰＤ－Ｌ１に対して、約１×１０^-9Ｍ以下、約９×１０^-10Ｍ以下、約８×１０^-10Ｍ以下、約７×１０^-10Ｍ以下、約６×１０^-10Ｍ以下、約５×１０^-10Ｍ以下、約４×１０^-10Ｍ以下、約３×１０^-10Ｍ以下、約２×１０^-10Ｍ以下、及び約１×１０^-10Ｍ以下の結合であり得、例えば、FortieBio Octet分子相互作用分析装置を使用して検出される。

【0068】

別の場合では、本出願に記載されるＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性は、フローサイトメトリー又は酵素結合免疫吸着測定法によって検出することができる。

【0069】

例えばＦＡＣＳ検査では、ヒトＰＤ－Ｌ１を安定に発現する宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）が使用され、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質のＥＣ５０値は、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、例えば約０．００１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．００１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．００１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約０．５μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約０．１μｇ／ｍＬ、又は約０．０１μｇ／ｍＬ～約０．０５μｇ／ｍＬである。

【0070】

例えばＦＡＣＳ検査では、サルＰＤ－Ｌ１を安定に発現する宿主細胞（例えば、ＣＨＯＫ１細胞）が使用され、ＰＤ－Ｌ１に結合するＰＤ－Ｌ１抗原結合タンパク質のＥＣ５０値は、約０．０００１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、例えば約０．００１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．００１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．０２μｇ／ｍＬ～約０．５μｇ／ｍＬ、及び約０．０３μｇ／ｍＬ～約０．１μｇ／ｍＬである。

【0071】

別の態様において、本出願に記載される抗原結合タンパク質は、ＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合をブロックすることができる。場合によっては、抗原結合タンパク質によるＰＤ－１のＰＤ－Ｌ１への結合のブロックは、フローサイトメーターＦＡＣＳ又は酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）によって測定することができる。

【0072】

例えば、ヒトＰＤ－Ｌ１を安定に発現する宿主細胞（例えば、ＨＥＫ２９３細胞）は、まず低下する量の非標識抗原結合タンパク質とともにインキュベートされ、次にビオチン標識ＰＤ－１タンパク質とともにインキュベートされる。次に、細胞はＦＡＣＳを使用して分析され、抗原結合タンパク質がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合をブロックすることを確認された。例えば、約０．００１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．００１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、約０．０２μｇ／ｍＬ～約０．５μｇ／ｍＬ、及び約０．０２μｇ／ｍＬ～約０．１μｇ／ｍＬ。

【0073】

例えば、サルＰＤ－Ｌ１を安定に発現する宿主細胞（例えば、ＣＨＯＫ１細胞）は、まず低下する量の非標識抗原結合タンパク質とともにインキュベートされ、次にビオチン標識ＰＤ－１タンパク質とともにインキュベートされる。次に、細胞はＦＡＣＳを使用して分析され、抗原結合タンパク質がＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１の結合をブロックすることを確認された。例えば、約０．００１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、約０．００１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約１μｇ／ｍＬ、及び約０．１μｇ／ｍＬ～約０．７μｇ／ｍＬ。

【0074】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨからのＣＤＲ３を含むことができ、ＶＨは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0075】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ３を含むことができ、ＨＣＤＲ３は、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。例えば、単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ３を含むことができ、及びＨＣＤＲ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0076】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨからのＣＤＲ２を含むことができ、ＶＨは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0077】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ２を含むことができ、ＨＣＤＲ２は、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができる。例えば、単離された結合タンパク質はＨＣＤＲ２を含むことができ、ＨＣＤＲ２は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0078】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨからのＣＤＲ１を含むことができ、ＶＨは配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0079】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１を含むことができ、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができる。例えば、単離された抗原結合タンパク質はＨＣＤＲ１を含むことができ、ＨＣＤＲ１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0080】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むことができ、ＨＣＤＲ１は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、ＨＣＤＲ２は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そしてＨＣＤＲ３は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0081】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むことができ、ＨＣＤＲ１は、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、ＨＣＤＲ２は、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そしてＨＣＤＲ３は、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0082】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0083】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号２１に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0084】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号２２に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0085】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号２３に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0086】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0087】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有するＶＨのＣＤＲ３を含むことができる。

【0088】

例えば、本出願に記載される単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、及びＨＣＤＲ３を含むことができ、ＨＣＤＲ１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ＨＣＤＲ２は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＨＣＤＲ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0089】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ１を含むことができ、Ｈ－ＦＲ１は配列番号５０に記載されたアミノ酸配列：ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＸ₁₆ＳＬＸ₁₉ＬＳＣＸ₂₃ＡＳ（配列番号５０）を含むことができ、ここで、Ｘ₁₆はＧ又はＲであり、Ｘ₁₉はＫ又はＲであり、Ｘ₂₃はＡ又はＶである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0090】

場合によっては、配列番号７に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｈ－ＦＲ１は、Ｘ₁₆、Ｘ₁₉、及び／又はＸ₂₃におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0091】

例えば、Ｈ－ＦＲ１は、配列番号７又は８に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0092】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ２を含むことができ、Ｈ－ＦＲ２は、配列番号５１に記載されたアミノ酸配列：ＷＭＸ₃ＷＸ₅ＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＳＩ（配列番号５１）を含むことができ、ここで、Ｘ₃はＳ又はＴであり、及びＸ₅はＩ又はＶである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0093】

場合によっては、配列番号９に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｈ－ＦＲ２は、Ｘ₃及び／又はＸ₅におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0094】

例えば、Ｈ－ＦＲ２は、配列番号９～１１のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0095】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ３を含むことができ、Ｈ－ＦＲ３は配列番号５２に記載のアミノ酸配列：

【化1】

を含むことができ、ここで、Ｘ₄はＡ、Ｐ、又はＶであり、Ｘ₁₇はＤ又はＮであり、Ｘ₁₈はＡ又はＳであり、Ｘ₂₀はＮ又はＳであり、Ｘ₂₁はＳ又はＴであり、Ｘ₃₁はＡ又はＳであり、Ｘ₃₆はＴ又はＶである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0096】

場合によっては、配列番号１２に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｈ－ＦＲ３は、Ｘ₄、Ｘ₁₇、Ｘ₁₈、Ｘ₂₀、Ｘ₂₁、Ｘ₃₁、及び／又はＸ₃₆におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0097】

例えば、Ｈ－ＦＲ３は、配列番号１２～１７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0098】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＨ－ＦＲ４を含むことができ、Ｈ－ＦＲ４は配列番号５３に記載のアミノ酸配列：ＷＧＱＧＸ₅Ｘ₆ＶＴＶＳＳ（配列番号５３）を含むことができ、ここで、Ｘ₅はＴ又はＶであり、Ｘ₆はＬ又はＭである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0099】

場合によっては、配列番号１８に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｈ－ＦＲ４は、Ｘ₆及び／又はＸ₅に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0100】

例えば、Ｈ－ＦＲ４は、配列番号１８又は１９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0101】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、重鎖可変領域ＶＨを含むことができ、ＶＨは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列：

【化2】

を含むことができ、ここで、Ｘ₁₆はＧ又はＲであり、Ｘ₁₉はＫ又はＲであり、Ｘ₂₃はＡ又はＶであり、Ｘ₃₅はＳ又はＴであり、Ｘ₃₇はＩ又はＶであり、Ｘ₆₁はＡ、Ｐ、又はＶであり、Ｘ₇₄はＤ又はＮであり、Ｘ₇₅はＡ又はＳであり、Ｘ₇₇はＮ又はＳであり、Ｘ₇₈はＳ又はＴであり、Ｘ₈₈はＡ又はＳであり、Ｘ₉₃はＴ又はＶであり、Ｘ₁₁₂はＴ又はＶであり、Ｘ₁₁₃はＬ又はＭである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0102】

場合によっては、配列番号２０に記載のアミノ酸配列と比較して、ＶＨは、Ｘ₁₆、Ｘ₁₉、Ｘ₂₃、Ｘ₃₅、Ｘ₃₇、Ｘ₆₁、Ｘ₇₄、Ｘ₇₅、Ｘ₇₇、Ｘ₇₈、Ｘ₈₈、Ｘ₉₃、Ｘ₁₁₂、及び／又はＸ₁₁₃におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0103】

例えば、ＶＨは、配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0104】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域ＶＬからのＣＤＲ３を含むことができ、ＶＬは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0105】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ３を含むことができ、ＬＣＤＲ３は、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。例えば、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ３を含むことができ、ＬＣＤＲ３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0106】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域ＶＬからのＣＤＲ２を含むことができ、ＶＬは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0107】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ２を含むことができ、ＬＣＤＲ２は、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができる。例えば、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ２を含むことができ、ＬＣＤＲ２は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0108】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域ＶＬからのＣＤＲ１を含むことができ、ＶＬは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0109】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ１を含むことができ、ＬＣＤＲ１は、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができる。例えば、単離された抗原結合タンパク質はＬＣＤＲ１を含むことができ、ＬＣＤＲ１は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0110】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むことができ、ＬＣＤＲ１は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができ、ＬＣＤＲ２は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができ、ＬＣＤＲ３は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。

【0111】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むことができ、ＬＣＤＲ１は、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができ、ＬＣＤＲ２は、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができ、そしてＬＣＤＲ３は、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。

【0112】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。

【0113】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。

【0114】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。

【0115】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ１を含むことができ、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ２を含むことができ、そして配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有するＶＬのＣＤＲ３を含むことができる。

【0116】

例えば、本出願に記載される単離された抗原結合タンパク質は、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むことができ、ＬＣＤＲ１は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ＬＣＤＲ２は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＬＣＤＲ３は、配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0117】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ１を含むことができ、Ｌ－ＦＲ１は、配列番号５５：ＤＩＱＭＴＱＳＰＸ₉ＳＬＳＡＳＸ₁₅ＧＤＸ₁₈ＶＴＩＴＣ（配列番号５５）に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、Ｘ₉はＰ又はＳであり、Ｘ₁₅はＬ又はＶであり、及びＸ₁₈はＱ又はＲである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0118】

場合によっては、配列番号２６に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｌ－ＦＲ１は、Ｘ₉、Ｘ₁₅、及び／又はＸ₁₈におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0119】

例えば、Ｌ－ＦＲ１は、配列番号２６又は２７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0120】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ２を含むことができる、Ｌ－ＦＲ２は、配列番号５６：ＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＸ₁₁ＱＬＩＲ（配列番号５６）に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、Ｘ₁₁はＫ又はＲである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0121】

場合によっては、配列番号２８に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｈ－ＦＲ２は、Ｘ₁₁におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0122】

例えば、Ｌ－ＦＲ２は、配列番号２８又は２９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0123】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ３を含むことができる、Ｌ－ＦＲ３は、配列番号５７：

【化3】

に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、Ｘ₂はＴ又はＶであり、Ｘ₁₅はＦ又はＹであり、Ｘ₁₆はＳ又はＴ、Ｘ₁₈はＳ又はＴであり、Ｘ₂₁はＮ又はＳであり、Ｘ₂₂はＬ又はＶであり、Ｘ₂₃はＥ又はＱであり、Ｘ₂₄はＰ又はＳであり、Ｘ₂₉はＳ又はＴである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0124】

場合によっては、配列番号３０に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｌ－ＦＲ３は、Ｘ₂、Ｘ₁₅、Ｘ₁₆、Ｘ₁₈、Ｘ₂₁、Ｘ₂₂、Ｘ₂₃、Ｘ₂₄、及び／又はＸ₂₉におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0125】

例えば、Ｌ－ＦＲ３は、配列番号３０～３３のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0126】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質はＬ－ＦＲ４を含むことができ、Ｌ－ＦＲ４は、配列番号５８：ＦＧＸ₃ＧＴＫＬＥＸ₉Ｋ（配列番号５８）に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、Ｘ₃はＡ又はＱであり、及びＸ₉はＩ又はＬである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0127】

場合によっては、配列番号３４に記載のアミノ酸配列と比較して、Ｌ－ＦＲ４は、Ｘ₃及び／又はＸ₉におけるアミノ酸置換からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0128】

例えば、Ｌ－ＦＲ４は、配列番号３４又は３５に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0129】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、軽鎖可変領域ＶＬを含むことができ、ＶＬは、配列番号５９：

【化4】

に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ここで、Ｘ₉はＰ又はＳであり、Ｘ₁₅はＬ又はＶであり、Ｘ₁₈はＱ又はＲであり、Ｘ₄₅はＫ又はＲであり、Ｘ₅₈はＴ又はＶであり、Ｘ₇₁はＦ又はＹであり、Ｘ₇₂はＳ又はＴであり、Ｘ₇₄はＴ又はＳであり、Ｘ₇₇はＮ又はＳであり、Ｘ₇₈はＬ又はＶであり、Ｘ₇₉はＥ又はＱであり、Ｘ₈₀はＰ又はＳであり、Ｘ₈₅はＳ又はＴであり、Ｘ₁₀₀はＡ又はＱであり、Ｘ₁₀₆はＬ又はＩである。例えば、それはChothia規則に従って分割することができる。

【0130】

場合によっては、配列番号３６に記載のアミノ酸配列と比較して、ＶＬは、Ｘ₉、Ｘ₁₅、Ｘ₁₈、Ｘ₄₅、Ｘ₅₈、Ｘ₇₁、Ｘ₇₂、Ｘ₇₄、Ｘ₇₇、Ｘ₇₈、Ｘ₇₉、Ｘ₈₀、Ｘ₈₅、Ｘ₁₀₀、及び／又はＸ₁₀₆からなる群から選択される位置に少なくともアミノ酸置換を含むことができる。

【0131】

例えば、ＶＬは、配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0132】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、及びＬＣＤＲ３を含むことができ、ＨＣＤＲ１は配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ＨＣＤＲ２は配列番号２に記載のアミノ酸配列を含むことができる。ＨＣＤＲ３は配列番号３に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ＬＣＤＲ１は配列番号４に記載のアミノ酸配列を含むことができ、ＬＣＤＲ２は配列番号５に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＬＣＤＲ３は配列番号６に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0133】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0134】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２０～２５のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３６～３９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0135】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0136】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0137】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0138】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0139】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0140】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、ＶＨ及びＶＬを含むことができ、ＶＨは配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そしてＶＬは配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0141】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は、ＩｇＧに由来し得る重鎖定常領域を含むことができる。例えば、重鎖定常領域はヒトＩｇＧに由来し得る。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４に由来し得る。例えば、重鎖定常領域はヒトＩｇＧ１に由来し得る。天然のヒトＩｇＧ１と比較して、重鎖定常領域はアミノ酸変異している可能性がある。例えば、重鎖定常領域は、ＩｇＧ１に対してＮ２９７Ａアミノ酸点突然変異を行うことによって得られる配列であってもよい。例えば、重鎖定常領域は、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0142】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は重鎖を含むことができ、重鎖は配列番号４２～４６のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0143】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は軽鎖定常領域を含むことができ、軽鎖定常領域は軽鎖λ及び軽鎖κに由来してもよい。例えば、軽鎖定常領域は、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0144】

本出願において、単離された抗原結合タンパク質は軽鎖を含むことができ、軽鎖は配列番号４７～４９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0145】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は重鎖及び軽鎖を含むことができ、重鎖は配列番号４２に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そして軽鎖は配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0146】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は重鎖及び軽鎖を含むことができ、重鎖は配列番号４３に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そして軽鎖は配列番号４８に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0147】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は重鎖及び軽鎖を含むことができ、重鎖は配列番号４４に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そして軽鎖は配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0148】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は重鎖及び軽鎖を含むことができ、重鎖は配列番号４５に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そして軽鎖は配列番号４７に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0149】

例えば、単離された抗原結合タンパク質は、重鎖及び軽鎖を含むことができ、重鎖は配列番号４６に記載のアミノ酸配列を含むことができ、そして軽鎖は配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含むことができる。

【0150】

本出願において、抗原結合タンパク質の各重鎖又は軽鎖のアミノ酸配列の一部は、特定の種の又は特定のカテゴリーに属する抗体における対応するアミノ酸配列と相同である。例えば、軽鎖及び重鎖の可変領域及び定常部分は両方とも、ある動物種（例えば、ヒト）の抗体の可変領域及び定常領域に由来する。本出願において、相同体は、タンパク質及び／又はポリペプチド（例えば、ＰＤ－Ｌ１タンパク質に特異的に結合する抗体又はその断片）のアミノ酸配列と、少なくとも約８５％（例えば、少なくとも約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％以上）の同一性を有するタンパク質及び／又はポリペプチドであり得る。

【0151】

本出願において、相同性は一般に、２つ以上の配列間の類似性、類似点、又は関連を指す。配列相同性のパーセントを決定するためのアライメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して、当技術分野で知られている様々な方法で実現することができる。当業者は、比較される全長配列内又は標的配列領域内で最大のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アライメント配列の適切なパラメーターを決定することができる。相同性はまた、ＦＡＳＴＡ及びＢＬＡＳＴの方法によっても決定することができる。ＦＡＳＴＡアルゴリズムの説明についてはW．R．Pearson and D．J．Lipman, "Improved Tools for Biological Sequence Comparison", Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444-2448, 1988; 及び D．J．Lipman and W．R．Pearson, " Rapid and sensitive protein similarity searches", Science, 227:1435-1441, 1989を参照されたい。ＢＬＡＳＴアルゴリズムの説明は、S. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers and D. Lipman, "Basic Local Alignment Search Tool", Journal of Molecular Biology, 215:403-410, 1990中に見いだすことができる。

【0152】

試験方法
本出願に記載されるＰＤ－１抗原結合タンパク質の物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって同定、スクリーニング、又は特性解析することができる。

【0153】

１つの態様において、例えば、本出願の抗原結合タンパク質の抗原結合活性は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット（例えば、タンパク質ブロット）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、免疫組織化学、免疫蛍光法などの公知の方法によって試験することができる

【0154】

核酸、ベクター、宿主細胞及び調製方法
別の態様において、本出願はまた、１つ又はそれ以上の単離された核酸分子を提供する。１つ以上の核酸分子は、本出願に記載される抗原結合タンパク質をコードすることができる。例えば、１つ以上の核酸分子中の各核酸分子は、完全な抗原結合タンパク質をコードしてもよく、又はその一部（例えば、ＨＣＤＲ１～３、ＬＣＤＲ１～３、ＶＬ、ＶＨ、軽鎖又は重鎖の１つ又はそれ以上）をコードしてもよい。

【0155】

本出願に記載される核酸分子は単離されていてもよい。例えば、それは以下の方法によって生成又は合成され得る：（ｉ）インビトロ増幅、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、（ｉｉ）クローニング及び組換え、（ｉｉｉ）精製、例えば酵素消化及びゲル電気泳動による分画、又は（ｉｖ）合成、例えば化学合成。いくつかの実施態様において、単離される核酸は、組換えＤＮＡ技術によって調製される核酸分子である。

【0156】

本出願において、抗体及びその抗原結合断片をコードする核酸は、特に限定されるものではないが、制限断片操作、又は合成オリゴヌクレオチドを使用する重複伸長ＰＣＲを含む当技術分野で公知の様々な方法によって調製することができる。

【0157】

別の態様において、本出願は、本出願に記載される１つ又はそれ以上の核酸分子を含む１つ又はそれ以上のベクターを提供する。各ベクターは、１つ又はそれ以上の核酸分子を含むことができる。さらに、ベクターは、他の遺伝子、例えば適切な宿主細胞内及び適切な条件下でベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子も含むことができる。さらに、ベクターは、コード領域が適切な宿主内で正確に発現されることを可能にする発現制御要素を含むことができる。例えば、ベクターは発現ベクターである。

【0158】

別の態様において、本出願は宿主細胞を提供し、宿主細胞は本出願に記載される１つ又はそれ以上の核酸分子及び／又は１つ又はそれ以上のベクターを含むことができる。いくつかの実施態様において、各又はすべての宿主細胞は、本出願に記載される１つ又はそれ以上の核酸分子又はベクターを含むことができる。いくつかの実施態様において、各又はすべての宿主細胞は、本出願に記載される複数（例えば、２つ以上）又は多数（例えば、２種類以上）の核酸分子又はベクターを含むことができる。

【0159】

別の態様において、本出願は、抗体又はその抗原結合断片を調製する方法を提供する。この方法は、本出願に記載される宿主細胞を、抗体又はその抗原結合断片が発現されるような条件下で培養することを含むことができる。例えば、適切な培地、適切な温度及び培養時間などを使用するこれらの方法は、当業者に知られている。

【0160】

医薬組成物、方法、及び使用
別の態様において、本出願は医薬組成物を提供する。医薬組成物は、本出願に記載の抗原結合タンパク質、ポリペプチド、核酸分子、ベクター、宿主細胞、及び任意選択的に医薬的に許容し得る担体を含むことができる。医薬的に許容し得る補助剤は、採用される用量及び濃度ではレシピエントに対して毒性がなく、本出願における医薬組成物は、相補的な活性を有し、通常は互いに悪影響を及ぼさない活性化合物である複数の活性化合物を含むこともできる。このような医薬品の形態及び有効量は、例えば、製剤中に存在するアンタゴニストの量及び形態、及び対象の臨床パラメーターに依存する。

【0161】

医薬組成物は、腫瘍増殖を阻害するために使用することができる。例えば、本出願の医薬組成物は、疾患の発症又は進行を阻害又は遅延させ、腫瘍サイズを縮小し（基本的に腫瘍を除去することさえできる）、及び／又は疾患状態を緩和及び／又は安定化させることができる。

【0162】

本出願の医薬組成物は、予防的及び／又は治療的に有効な量の抗体、その抗原結合断片を含むことができる。予防的及び／又は治療的有効量は、疾患又は障害を有するか又は発症するリスクがあるか対象において、疾患又は障害及び／又はその任意の合併症を予防及び／又は治療（少なくとも部分的に治療）するのに必要な用量である。

【0163】

別の態様において、本出願は、薬剤の製造における抗原結合タンパク質及び／又は融合タンパク質の使用を提供する。この薬剤は、癌の治療、腫瘍増殖の阻害、及び／又は腫瘍細胞増殖の阻害に使用するためのものである。いくつかの実施態様において、腫瘍又は癌は、ＰＤ－Ｌ１の異常な発現を伴う腫瘍又は癌である。本出願において、腫瘍には、ＰＤ－１又はＰＤ－Ｌ１の高発現を有する腫瘍が含まれ得る。本出願において、腫瘍には、ＰＤ－Ｌ１の高発現を有する腫瘍が含まれ得る。本出願において、腫瘍には固形腫瘍が含まれ得る。本出願において、腫瘍には、乳癌、肺癌、胃癌、及び尿路上皮癌が含まれ得る。

【0164】

別の態様において、本出願は、本出願に記載の抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合を阻害する方法を提供する。例えば、この方法はエクスビボでもインビトロでもよい。例えばこの方法は、非治療目的の方法であってもよい。場合によっては本方法は、抗原結合タンパク質及び／又はＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１に結合することを可能にする条件下で、生物学的試料に本出願に記載の抗原結合タンパク質及び／又はＰＤ－１を接触させること、抗原結合タンパク質とＰＤ－Ｌ１との間で複合体が形成されるかどうかを検出すること、及びＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１との間で複合体が形成されているかどうかを検出することを含む。

【0165】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを投与することを含む、免疫細胞におけるサイトカインの分泌を刺激する方法を提供する。サイトカインはＩＬ－２であってもよい。免疫細胞はリンパ球であってもよい。例えば、Ｔリンパ球。例えば、この方法はエクスビボでもインビトロでもよい。例えば、この方法は、非治療目的の方法であってもよい。

【0166】

別の態様において、本出願は、単離された抗原結合タンパク質及び／又はポリペプチドを投与することを含む、ＰＤ－Ｌ１タンパク質の存在及び／又は含有量を検出する方法を提供する。例えば、この方法はエクスビボでもインビトロでもよい。例えば、この方法は、非治療目的の方法であってもよい。

【0167】

本出願はまた、腫瘍又は癌に罹患している対象を診断するための方法における抗原結合タンパク質の使用を提供し、この方法は、試料に本出願の抗原結合タンパク質を接触させて、対象から得られた試料中のＰＤ－Ｌ１の存在又は発現レベルを測定し、結合した抗体の存在を検出することを含む。

【0168】

別の態様において、本出願は、本出願に記載される核酸分子又は抗原結合タンパク質を含むことができるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。

【0169】

別の態様において、本出願は、抗原結合断片を含むことができる抗体薬物結合体を提供する。

【0170】

別の態様において、本出願は、抗原結合タンパク質、キメラ抗原受容体、遺伝子改変細胞、本出願に記載される抗体薬物結合体、及び／又は本出願に記載される医薬組成物を含むことができるキットを提供する。それは、単一の共通の容器内に、抗原結合タンパク質、キメラ抗原受容体、本出願に記載される遺伝子改変細胞、及び／又は本出願に記載される抗体薬物結合体を含むことができ、また任意選択的に、１つ又はそれ以上の治療薬と組み合わせ、及び任意選択的に医薬組成物中に一緒に配合される。

【0171】

別の態様において、本出願は、抗原結合タンパク質又はその医薬組成物を投与するために使用することができる薬物送達デバイスを提供する。

【0172】

いかなる理論にも束縛されるものではないが、以下の実施例は本発明の様々な実施態様を説明するためだけのものであり、本発明の範囲を限定するために使用されるものではない。

【実施例】

【0173】

実施例１．マウス抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の調製
ヒトＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１タンパク質、Ｆｃ Ｔａｇ（Acro Biosystem ＰＤ１－Ｈ５２５８）、及びＰＡＤＲＥを用いて乳化した後、６～８週齢の雌ＳＤラットに５０μgのヒトＰＤ－Ｌ１／Ｂ７－Ｈ１タンパク質、Ｆｃ Ｔａｇ／ラット、２５μｇのＰＡＤＲＥ／ラットを腹腔内注射した。その後、２～３週間の間隔で追加免疫を実施した。ラットを合計３回免疫し、最後の免疫から２週間後にラットの尾血を採取し、血清中の抗ヒトＰＤＬ１抗体の力価を測定した。急性免疫衝動のためにフロイントアジュバントを含まない５０μｇのタンパク質をラットに腹腔内注射した後、ラットの脾臓細胞を採取し、３日目に骨髄腫（Ｓｐ２／０）細胞と融合させた。

【0174】

ＨＥＫ２９３－ＰＤ－Ｌ１細胞に特異的に結合し、同時にＨＥＫ２９３－ｈＰＤ－Ｌ１細胞への受容体ＰＤ－１の結合をブロックできるクローンを、フローサイトメーターにより融合プレートからスクリーニングし、限界希釈法によりサブクローニングを行い、最終的に特異的な抗体を分泌できるモノクローナルがスクリーニングされた。モノクローナル抗体は、その後の同定のために無血清培地での小規模生産及び精製によって得られ、前記その後の同定には、ＨＥＫ２９３－ＰＤ－Ｌ１に対する抗体の結合能力、ＰＤ－１とＨＥＫ２９３－ｈＰＤ－Ｌ１細胞の結合をブロックする機能の検出、及び最終的に候補抗ヒトＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体５０Ｇ２－３を得ることによって得るための混合リンパ球実験が含まれた。モノクローナル抗体配列決定によって得られたマウスハイブリドーマクローン５０Ｇ２－３の可変領域の配列は以下のとおりである：
＞５０Ｇ２－３軽鎖可変領域配列

【化5】

＞５０Ｇ２－３重鎖可変領域配列

【化6】

【表1】

【0175】

実施例２．モノクローナル抗体のヒト化
最も相同的なヒト生殖系列抗体（データソース：ＩＭＧＴ）をヒト化設計フレームワーク（軽鎖のフレームワークはＩＧＫＶ１－３３^*０１、ＩＧＫＪ２^*０１に基づき、重鎖のフレームワークはＩＧＨＶ３－７^*０１、ＩＧＨＪ４^*０１に基づいた）として選択し、抗体の軽鎖及び重鎖の可変領域はChothia［Chothia & Lesk, 1987］によって番号付けされ、抗体のＣＤＲ領域は、ＣＤＲＬ１（Ｌ２４～Ｌ３４））、ＣＤＲＬ２（Ｌ５０～Ｌ５６）、ＣＤＲＬ３（Ｌ８９～Ｌ９７）、ＣＤＲＨ１（Ｈ２６～Ｈ３２）、ＣＤＲＨ２（Ｈ５２～Ｈ５６）、及びＣＤＲＨ３（Ｈ９５～Ｈ９７）として定義され、並びに抗体の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸のヒト化変異は、可変領域の配列アライメントと構造情報に従って実行された。発現ベクターを設計し、遺伝子を合成し、組換え抗体を哺乳動物細胞で発現させて精製し、ヒト化抗体とキメラ抗体の活性及び物理化学的性質の違いを比較し、及び１～２回のヒト化最適化を実施した。

【0176】

生殖系列抗体の配列情報：
・ ＩＧＫＶ１－３３^*０１

【化7】

・ ＩＧＫＪ２^*０１
ＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ （配列番号６１）
・ ＩＧＨＶ３－７^*０１

【化8】

・ ＩＧＨＪ４^*０１
ＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ （配列番号６３）

【0177】

軽鎖と重鎖の以下の最適化された設計は、上記の生殖系抗体（Germanline antibody）の配列に基づいてフレームワークＣＤＲとして移植されたヒト化配列であった（１９１０Ｇ２ＨｚＬ０及び１９１０Ｇ２ＨｚＨ０は、キメラ抗体の軽及び重鎖であり、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ２、１９１０Ｇ２ＨｚＨ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３、１９１０Ｇ２ＨｚＨ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４、１９１０Ｇ２ＨｚＨ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７、１９１０Ｇ２ＨｚＨ７、１９１０Ｇ２ＨｚＬ９、及び１９１０Ｇ２ＨｚＨ９は、ヒト化抗体の軽鎖及び重鎖である）。

【0178】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＬ０軽鎖可変領域配列

【化9】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＬ２軽鎖可変領域配列

【化10】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＬ３軽鎖可変領域配列

【化11】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＬ４軽鎖可変領域配列
１９１０Ｇ２ＨｚＬ２（配列番号３７）と同じ
・ １９１０Ｇ２ＨｚＬ７軽鎖可変領域配列
１９１０Ｇ２ＨｚＬ２（配列番号３７）と同じ
・ １９１０Ｇ２ＨｚＬ９軽鎖可変領域配列

【化12】

【0179】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＨ０重鎖可変領域配列

【化13】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＨ２重鎖可変領域配列

【化14】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＨ３重鎖可変領域配列

【化15】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＨ４重鎖可変領域配列

【化16】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＨ７重鎖可変領域配列

【化17】

・ １９１０Ｇ２ＨｚＨ９重鎖可変領域配列

【化18】

【0180】

上記抗体の軽鎖及び重鎖を組み合わせて、抗原結合タンパク質１９１０Ｇ２ＨｚＬ２Ｈ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３Ｈ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４Ｈ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７Ｈ７、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ９Ｈ９が得られる。

【0181】

実施例３．本出願の抗原結合タンパク質の速度論的パラメーターの決定
（１）ヒト化抗体１９１０Ｇ２ＨｚＬ２Ｈ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３Ｈ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４Ｈ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７Ｈ７、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ９Ｈ９のヒトＰＤ－Ｌ１（Acro、カタログ番号：Ｈ５２２９）に対する親和性を、Octet RED96e（Fortebio）によって決定し、抗原及び抗体の両方を１×ＰＢＳＴ（１×ＰＢＳ：Sangon，Ｂ５４８１１７－０５００；０．０２％ツイーン２０：Sigma-Alorich，Ｐ１３７９）で希釈し、使用する抗原濃度は１００ｎＭ、及び使用する抗体濃度は５０ｎＭとした。

【0182】

（２）機械での試料の検出（Octet Data Acquisition11.1.0.11）：まず、試料を２００μＬ／ウェルのシステムで９６ウェルプレート（Greiner bio-one、655209）に加えた。次に、ソフトウェアパラメータを設定し、プレート温度を３０℃に設定し、標準動的信号を収集する周波数を５．０Ｈｚに設定した。次に、ＡＨＣセンサー（Fortebio、カタログ番号：１８－００１５）を１×ＰＢＳＴで事前に１０分間湿らせた後、試料を装置で検出した。各サイクルには次の工程が含まれる：１）緩衝液に６０秒間に浸漬；２）抗原が非特異的にセンサーに結合するかどうかの検出；３）ｐＨ１．７の１０ｍＭグリシン溶液の再生；４）緩衝液に６０秒間浸漬；５）抗体をセンサー上に２０秒間固定化；６）センサーを緩衝液に１８０秒間浸漬；７）抗原を抗体に１８０秒間結合；８）抗原を抗体から１０分間解離；９）センサーを再生。

【0183】

（３）データ解析
１：１の比率の抗原－抗体の結合速度（Ｋａ）と解離速度（Ｋｄ）をFortebioのData Analysis 11.0 ソフトウェアを用いて測定し、これらに基づいて抗体の平衡解離定数（ＫＤ）を算出した。結果は以下の表に示されているとおりであり、ヒト化抗体１９１０Ｇ２ＨｚＬ２Ｈ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３Ｈ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４Ｈ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７Ｈ７、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ９Ｈ９のヒトＰＤ－Ｌ１に対する親和性がアテゾリズマブ（Atezolimumab）と同等であり、さらにはＫＤ値がより低いことを示している。これらは、本出願の抗原結合タンパク質がより高い結合親和性を有することを示した。

【表2】

【0184】

実施例４．細胞表面上の抗原ＰＤ－Ｌ１に対する本出願の抗原結合タンパク質の結合活性
ＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１又はＨＥＫ２９３－ｈＰＤ－Ｌ１を各９６ウェルプレートに５Ｅ６細胞とともに収集し、３００ｇで５分間遠心分離し、予冷したＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、３７９９Ｕ字型プレート上に１００μＬ／ウェルずつ均等に広げ、室温で１５分間ブロックした。ヒト化抗体を取り、初期濃度３．３３μｇ／ｍＬで開始して、次に３倍希釈して１２の勾配を確立した。ブロックし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去した。希釈した抗体を１００μＬ／ウェルずつ加えて、混合液を均一に混合し、４℃で１時間インキュベートした。混合物を２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、残渣をＦＡＣＳ緩衝液で１～２回洗浄した。二次抗体ヤギ－抗ヒト４８８、１：１０００を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間インキュベートした後、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去し、残渣をＦＡＣＳ緩衝液で１～２回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液を３０μｌ／ウェルで添加して、細胞を再懸濁し、装置で検出した。

【0185】

図１は、本出願に記載される抗原結合タンパク質がＨＥＫ２９３細胞上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することを示した。図２は、本出願に記載される抗原結合タンパク質がＣＨＯＫ１細胞上のサルＰＤ－Ｌ１タンパク質に結合することを示した。結果は図１及び図２に示すとおりであり、本出願抗原結合タンパク質１９１０Ｇ２ＨｚＬ２Ｈ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３Ｈ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４Ｈ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７Ｈ７、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ９Ｈ９の、細胞表面上の抗原ＰＤ－Ｌ１に対する結合活性が、アテゾリズマブと同等か又はそれ以上であった。本出願の抗原結合タンパク質のＰＤ－Ｌ１に対する結合活性が優れていることが示された。

【0186】

実施例５．本出願の抗原結合タンパク質は細胞表面上の抗原ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合活性をブロックする
ＨＥＫ２９３－ｈＰＤ－Ｌ１又はＣＨＯＫ１－ｃｙｎｏＰＤ－Ｌ１を各９６ウェルプレート内の５Ｅ６細胞によって収集し、３００ｇで５分間遠心分離し、予冷したＦＡＣＳ緩衝液で再懸濁し、３７９９Ｕ字型プレート上に１００μＬずつ均等に広げ、室温で１５分間ブロックした。ヒト化抗体を取り、初期濃度１０μｇ／ｍＬで開始して、次に３倍に希釈して１２の勾配を得た。０．２２４ｍｇ／ｍＬのビオチン－ＰＤ－１－ｍＦｃを２μｇ／ｍＬで調製した。ブロッし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去した。希釈した抗体を５０μＬ／ウェルで加え、混合液を均一に混合した後、２μｇ／ｍＬのビオチン－ＰＤ－１－ｍＦｃを５０μＬ／ウェル添加し、均一に混合して、４℃で１時間インキュベートした。２０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上清を除去し、残渣をＦＡＣＳ緩衝液で１～２回洗浄した。二次抗体ＳＡ４８８，１：１０００を１００μＬ／ウェルで添加し、４℃で１時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去した。残渣をＦＡＣＳ緩衝液で１～２回洗浄し、その後、ＦＡＣＳ緩衝液を３０μｌ／ウェルで添加して、細胞を再懸濁し、装置で検出した。図３は、本出願に記載される抗原結合タンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞上のヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質へのＰＤ－１の結合をブロックしたことを示した。図４は、本出願に記載される抗原結合タンパク質が、ＣＨＯＫ１細胞上のサルＰＤ－Ｌ１タンパク質へのＰＤ－１の結合をブロックすることを示した。結果は図３及び図４に示すとおりであり、本出願の抗原結合タンパク質１９１０Ｇ２ＨｚＬ２Ｈ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３Ｈ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４Ｈ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７Ｈ７、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ９Ｈ９の、細胞表面上の抗原ＰＤ－Ｌ１のＰＤ－１への結合をブロックする活性は、アテゾリズマブと同等であった。本出願の抗原結合タンパク質が、ＰＤ－１に対するＰＤ－Ｌ１の結合をブロックする活性が優れていることが示された。

【0187】

実施例６．混合リンパ球反応：サイトカインＩＬ－２の分泌
ヒト樹状ＤＣ細胞を細胞培養培地（１６４０＋２％ＦＢＳ）で蘇生させ、ＤＣ細胞の密度を１×１０⁵～１×１０⁷細胞／ｍＬに調整し、その後マイトマイシンＣを最終濃度５０μｇ／ｍｌで添加し、３７℃、暗所で３０分間処理し、その後１０ｍＬの培地を加えて処理を終了させた。混合物を４００ｇで１０分間遠心分離し、その後１０ｍＬの培地で洗浄した。抗ＰＤ１抗体の勾配希釈：抗体の最大最終濃度は２．５μｇ／ｍＬ（調製濃度は１０μｇ／ｍＬ）、勾配希釈は１０倍（５濃度点＋１つの０濃度）であり、その後調製した抗ＰＤ１抗体５０μＬを対応する細胞培養プレート（Corning、カタログ番号：３５９９）に添加した。ヒト末梢血リンパ球ＰＢＭＣ及びマイトマイシンＣで処理したＤＣ細胞を収集し、ＤＣ細胞の密度を２×１０⁵細胞／ｍＬに調整し、次に細胞を５０μＬ／ウェルで培養プレートに添加し、すなわち、ウェル当たりのＤＣ細胞の数は１×１０⁴細胞／ウェルであった。ＰＢＭＣ細胞の密度を２×１０⁶細胞／ｍＬに調整し、次に細胞を１００μＬ／ウェルで培養プレートに添加し、すなわち、ウェルあたりのＰＢＭＣ細胞の数は２×１０⁵細胞／ウェルであった。細胞培養プレートを、５％二酸化炭素、３７℃の細胞インキュベーター内に５日間入れた。５日後、３００ｇで５分間遠心分離して上清を収集し、ＩＬ－２の含有量をヒトＩＬ－２ ＥＬＩＳＡキット（BD、カタログ番号：５５０６１１）を用いて検出した。検出方法はキットの説明書に従って厳密に実行され、データはGraphPad Prismソフトウェアで処理された。結果は図５に示すとおりであり、本出願の全ての抗原結合タンパク質１９１０Ｇ２ＨｚＬ２Ｈ２、１９１０Ｇ２ＨｚＬ３Ｈ３、１９１０Ｇ２ＨｚＬ４Ｈ４、１９１０Ｇ２ＨｚＬ７Ｈ７、及び１９１０Ｇ２ＨｚＬ９Ｈ９が、アテゾリズマブよりも優れた効果で、リンパ球を刺激してサイトカインを分泌させ得ることを示した。本出願の抗原結合タンパク質が、免疫細胞を刺激してサイトカインを分泌させる高い能力を有することが示された。

【0188】

前述の詳細な説明は、説明及び例として提供されたものであり、添付の特許請求の範囲を限定することを意図したものではない。本発明で列挙した実施態様の多くの変形は当業者には明らかであり、これらは添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内にある。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2024509369000001.app

【国際調査報告】