特表 2024-509424 生物学的試料からの核酸の電気泳動抽出のための装置および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-01

(54)【発明の名称】生物学的試料からの核酸の電気泳動抽出のための装置および方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 1/28 20060101AFI20240222BHJP

   G01N 1/10 20060101ALI20240222BHJP

   C12M 1/34 20060101ALI20240222BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20240222BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALN20240222BHJP

【ＦＩ】

G01N1/28 J

G01N1/10 B

C12M1/34 Z

C12Q1/6844 Z

C12Q1/6869 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023552577

(86)(22)【出願日】2022-03-03

(85)【翻訳文提出日】2023-08-30

(86)【国際出願番号】 EP2022055421

(87)【国際公開番号】W WO2022184836

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】63/155,940

(32)【優先日】2021-03-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】591003013

【氏名又は名称】エフ． ホフマン－ラ ロシュ アーゲー

【氏名又は名称原語表記】Ｆ． ＨＯＦＦＭＡＮＮ－ＬＡ ＲＯＣＨＥ ＡＫＴＩＥＮＧＥＳＥＬＬＳＣＨＡＦＴ

(74)【代理人】

【識別番号】100118902

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 修

(74)【代理人】

【識別番号】100106208

【弁理士】

【氏名又は名称】宮前 徹

(74)【代理人】

【識別番号】100196508

【弁理士】

【氏名又は名称】松尾 淳一

(74)【代理人】

【識別番号】100202854

【弁理士】

【氏名又は名称】森本 卓行

(72)【発明者】

【氏名】アスティエ，ヤン

(72)【発明者】

【氏名】ゲイビ，パンテア

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ジェヨン

(72)【発明者】

【氏名】ダティンスカ，ブラディミラ

(72)【発明者】

【氏名】ジェファーソン，ケインティシャ

(72)【発明者】

【氏名】ビタヤルクスクル，ケビン

【テーマコード（参考）】

2G052

4B029

4B063

【Ｆターム（参考）】

2G052AA28

2G052AB20

2G052AD26

2G052EA02

2G052EA08

2G052ED14

4B029AA09

4B029AA23

4B029BB20

4B029HA05

4B029HA09

4B063QA13

4B063QA20

4B063QQ42

4B063QQ52

4B063QR62

4B063QS24

(57)【要約】

本発明は、試料から生物学的ポリマーを単離するための装置、方法およびアセンブリに関するものであり、当該装置は、上部リザーバと、下部リザーバと、上部リザーバと下部リザーバとの間に配置され、且つ上部リザーバおよび下部リザーバに動作可能に接続された収集チャンバと、抽出されるべき生物学的ポリマーを通過させることができるふるい分けマトリックスと、抽出されるべき生物学的ポリマーを通過させることができない半透膜と、作用電極および対向電極の少なくとも１つのセットとを備える。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料から生物学的ポリマーを単離するための装置であって、
ａ）上部リザーバと、
ｂ）下部リザーバと、
ｃ）前記上部リザーバと前記下部リザーバとの間に配置され、前記上部リザーバおよび前記下部リザーバに動作可能に接続された収集チャンバと、
ｄ）抽出されるべき前記生物学的ポリマーを通過させることができるふるい分けマトリックスと、
ｅ）抽出されるべき前記生物学的ポリマーを通過させることができない半透膜と、
ｆ）作用電極および対向電極の少なくとも１つのセットと、
を備える、装置。

【請求項2】

前記作用電極が前記上部リザーバ内に配置されている、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記対向電極が前記下部リザーバ内に配置されている、請求項１に記載の装置。

【請求項4】

前記収集チャンバが円筒形である、請求項１に記載の装置。

【請求項5】

前記収集チャンバが円錐形である、請求項１に記載の装置。

【請求項6】

前記ふるい分けマトリックスが前記上部チャンバ内に配置される、請求項１に記載の装置。

【請求項7】

前記ふるい分けマトリックスが、前記上部チャンバと前記収集チャンバとの境界面に配置される、請求項６に記載の装置。

【請求項8】

前記半透膜が前記収集チャンバ内に配置される、請求項１に記載の装置。

【請求項9】

前記半透膜が、前記収集チャンバと前記下部リザーバとの境界面に配置される、請求項９に記載の装置。

【請求項10】

前記半透膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）が、前記ふるい分けマトリックスの前記ＭＷＣＯよりも大きい、請求項１に記載の装置。

【請求項11】

前記上部リザーバおよび前記下部リザーバ内に電解質緩衝液をさらに含む、請求項１に記載の装置。

【請求項12】

前記上部リザーバおよび前記下部リザーバが同じ電解質を含む、請求項１１に記載の装置。

【請求項13】

前記上部リザーバが、先行電解質を有する緩衝液を含み、前記下部リザーバが、後続電解質を有する緩衝液を含む、請求項１１に記載の装置。

【請求項14】

試料から生物学的ポリマーを抽出する方法であって、
ａ．請求項１に記載の装置の前記下部リザーバおよび前記収集チャンバに先行電解質を装填することと、
ｂ．生物学的試料を後続電解質と接触させることと、
ｃ．請求項１に記載の装置の前記上部リザーバ内に前記試料を配置することと、
ｄ．前記電極に電圧を印加することと、
ｅ．抽出された前記生物学的ポリマーを含む前記収集チャンバの内容物を収集することと、
を含む、方法。

【請求項15】

ステップｃ．において、前記試料が、前記上部チャンバ内のふるい分けマトリックス上に配置される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記生物学的ポリマーが核酸である、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

単離された前記核酸を増幅することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項18】

単離された前記核酸をシーケンシングすることをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項19】

ステップｄ．において、前記電圧が一定の電力で印加される、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

前記試料が、ステップｂ．の前に濃縮される、請求項１４に記載の方法。

【請求項21】

前記試料が、ステップｂ．の前に抽出プロセスを受ける、請求項１４に記載の方法。

【請求項22】

前記試料が、ステップｂ．の前に脱パラフィンプロセスを受ける、請求項１４に記載の方法。

【請求項23】

試料から生物学的ポリマーを単離するためのアセンブリであって、
ａ）複数の上部リザーバと、
ｂ）前記上部リザーバの数と一致する複数の下部リザーバと、
ｃ）前記上部リザーバと前記下部リザーバとの間に配置され、前記上部リザーバおよび前記下部リザーバに動作可能に接続された複数の収集チャンバと、
ｄ）各上部リザーバ内における、抽出されるべき前記生物学的ポリマーを通過させることができるふるい分けマトリックスと、
ｅ）各収集チャンバ内における、抽出されるべき前記生物学的ポリマーを通過させることができない半透膜と、
ｆ）各上部リザーバ内の作用電極および対向電極のセットと、
を備える、アセンブリ。

【請求項24】

前記複数の上部リザーバのうちの１つまたは複数のリザーバに１つまたは複数の試料を分注するための自動ディスペンサをさらに備える、請求項２３に記載のアセンブリ。

【請求項25】

核酸を増幅するためのモジュールをさらに備える、請求項２３に記載のアセンブリ。

【請求項26】

核酸をシーケンシングするためのモジュールをさらに備える、請求項２３に記載のアセンブリ。

【請求項27】

前記試料を移送するための移送モジュールをさらに備える、請求項２３に記載のアセンブリ。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、生物学的試料からの核酸の単離の分野に関する。より具体的には、本発明は、電気泳動を使用して核酸を単離する機器、システムおよび方法に関する。

【背景技術】

【0002】

発明の背景
核酸に基づく診断は、日常的な臨床診療になりつつある。例えば、血液中に存在する腫瘍または無細胞腫瘍ＤＮＡの遺伝子分析は、患者の腫瘍突然変異プロファイルに特異的な標的療法を指摘することによって処置を導くために使用される。母体血液中の胎児ＤＮＡの発見は、様々な遺伝子異常および染色体異常の早期出生前検査を可能にした。ゲノム試験は、臨床試料からの核酸の分析を含む。体液、新鮮組織、凍結組織およびホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織を含む様々な臨床試料タイプが分析に提出される。前者は、核酸が微量で存在し得る大きな体積を特徴とする。後者は、保存プロセスが核酸を損傷および断片化することが知られているため、核酸単離にとって特に困難である。下流の分析ステップは、例えば、次世代シーケンシングおよび臨床アッセイの所望の感度および特異性をもたらすのに十分な量の質の核酸に依存する他の複雑な方法を含む。

【0003】

近年のあらゆる技術的進歩により、広範囲の生物学的試料を処理することができる、より堅牢で迅速な核酸抽出システムが緊急に必要とされている。記載される発明は、一般的に使用されるタイプの臨床試料からの全核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）の抽出に適した適応可能な抽出システムを提供することによってこの必要性を満たすことを目的とする。

【発明の概要】

【0004】

発明の概要
本発明は、生物学的試料から核酸を含む生物学的ポリマーを電気泳動的に単離するための装置、アセンブリおよび方法を含む。

【0005】

いくつかの実施形態では、本発明は、上部リザーバと、下部リザーバと、上部リザーバと下部リザーバとの間に配置され、且つ上部リザーバおよび下部リザーバに動作可能に接続された収集チャンバと、抽出されるべき生物学的ポリマーを通過させることができるふるい分けマトリックスと、抽出されるべき生物学的ポリマーを通過させることができない半透膜と、作用電極および対向電極の少なくとも１つのセットとを含む、試料から生物学的ポリマーを単離するための装置である。いくつかの実施形態では、作用電極は、上部リザーバに配置され、対向電極は、下部リザーバに配置される。いくつかの実施形態では、収集チャンバは、円筒形または円錐形である。いくつかの実施形態では、ふるい分けマトリックスは、上部チャンバ内、例えば上部チャンバと収集チャンバとの境界面に配置される。いくつかの実施形態では、半透膜は、収集チャンバ内に、例えば収集チャンバと下部リザーバとの境界面に配置される。いくつかの実施形態では、半透膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、ふるい分けマトリックスのＭＷＣＯよりも大きい。

【0006】

いくつかの実施形態では、装置は、上部および下部リザーバ内に電解質緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、上部および下部リザーバは、同じ電解質を含む。いくつかの実施形態では、上部リザーバは、先行電解質を含む緩衝液を含み、下部リザーバは、後続電解質を含む緩衝液を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、本発明は、試料から生物学的ポリマーを抽出する方法であって、先行するセクションに記載された装置の下部リザーバおよび収集チャンバに先行電解質を装填することと、生物学的試料を後続電解質と接触させることと、先行セクションに記載された装置の上部リザーバに試料を配置することと、電極に電圧を印加することと、抽出された生物学的ポリマーを含む収集チャンバの内容物を収集することと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、試料は、上部チャンバ内のふるい分けマトリックス上に配置される。

【0008】

いくつかの実施形態では、生物学的ポリマーは核酸である。いくつかの実施形態では、本方法は、単離された核酸を増幅および／またはシーケンシングすることをさらに含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、電圧は、一定の電力で印加される。いくつかの実施形態では、試料は、装置に適用される前に濃縮され、抽出プロセスまたは脱パラフィンプロセスを経る。

【0010】

いくつかの実施形態では、本発明は、試料から生物学的ポリマーを単離するためのアセンブリであって、複数の上部リザーバと、上部リザーバの数に一致する複数の下部リザーバと、上部リザーバと下部リザーバとの間に配置され、且つ上部リザーバおよび下部リザーバに動作可能に接続された複数の収集チャンバであって、各上部リザーバ内における、抽出されるべき生物学的ポリマーを通過させることができるふるい分けマトリックスと、各収集チャンバ内における、抽出されるべき生物学的ポリマーを通過させることができない半透膜と、各上部リザーバ内の作用電極および対向電極のセットと、を備える、アセンブリである。いくつかの実施形態では、アセンブリは、１つまたは複数の試料を複数の上部リザーバのうちの１つまたは複数のリザーバに分注するための自動ディスペンサをさらに備える。いくつかの実施形態では、アセンブリは、核酸を増幅するためのモジュールをさらに備える。いくつかの実施形態では、アセンブリは、核酸をシーケンシングするためのモジュールをさらに備える。いくつかの実施形態では、アセンブリは、試料を移送するための移送モジュールをさらに備える。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のための装置の概要である。

【図2】収集チャンバの形状および例示的な寸法を示している。

【図3A】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のためのアセンブリシステムの図である。

【図3B】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のためのアセンブリシステムの図である。

【図3C】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のためのアセンブリシステムの図である。

【図4A】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のための自動化装置の図である。

【図4B】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のための自動化装置の図である。

【図5A】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のための試作装置を組み立てるステップを示している。

【図5B】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のための試作装置を組み立てるステップを示している。

【図5C】生物学的ポリマーの電気泳動抽出のための試作装置を組み立てるステップを示している。

【図6A】装置を使用して核酸を単離した結果を示している。

【図6B】装置を使用して核酸を単離した結果を示している。

【図6C】装置を使用して核酸を単離した結果を示している。

【図6D】装置を使用して核酸を単離した結果を示している。

【図6E】装置を使用して核酸を単離した結果を示している。

【発明を実施するための形態】

【0012】

発明の詳細な説明
序論

【0013】

本発明は、生物学的試料からの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含む生物学的ポリマーの電気駆動抽出に必要な複数の成分を統合する装置を記載する。各装置は、図１に示す配置の構成要素からなる。各構成要素は、その機能、幾何学的形状および／または材料に関して以下に説明される。本発明の様々な態様を以下でさらに詳細に説明する。

【0014】

試料

【0015】

本発明は、試料から核酸などの生物学的ポリマーを抽出する方法を含む。いくつかの実施形態では、試料は、被験者または患者に由来する。いくつかの実施形態では、試料は、例えば、生検によって、被験者または患者に由来する固形組織または固形腫瘍の断片を含み得る。試料はまた、核酸を含み得る体液（例えば、尿、痰、血清、血液若しくは血液分画、すなわち、血漿、リンパ液、唾液、痰、汗、涙、脳脊髄液、羊水、滑液、心膜液、腹水、胸水、嚢胞液、胆汁、胃液、腸液、または糞便試料）を含み得る。他の実施形態では、試料は、培養試料、例えば、核酸を単離し得る細胞および流体を含有する組織培養物である。いくつかの実施形態では、試料中の目的の核酸は、ウイルス、細菌、原虫または真菌などの感染病原体に由来する。さらに他の実施形態では、試料は、抽出されるべき生物学的ポリマーが存在する固体または液体材料を含む環境試料である。

【0016】

いくつかの実施形態では、試料は、ＦＦＰＥＴ、新鮮凍結組織、針生検から選択される固体試料である。いくつかの実施形態では、試料は、培養細胞、ならびに血漿、血液、尿および唾液などの体液から選択される液体試料である。いくつかの実施形態では、電気泳動装置に適用された試料は、予備濃縮ステップを経る。いくつかの実施形態では、試料、例えば尿または血漿などの大量試料を、例えばＡｍｉｃｏｎカラム（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、Ｓｉｇｍａ）などの濃縮カラムでの遠心分離を使用して濃縮して、体積を減らし、試料を濃縮する。

【0017】

いくつかの実施形態では、試料を本明細書に開示される電気泳動装置に適用する前に、試料が前処理されて、試料中の関連分子からバイオポリマーを放出させる。いくつかの実施形態では、前処理は、例えば細胞膜および核膜などのタンパク質、脂質およびリン脂質から核酸を放出する。そのような処置は、ＦＦＰＥＴ試料の脱パラフィン化、プロテアーゼ消化および細胞溶解を含むが、これらに限定されない。

【0018】

核酸を他の生物学的物質から分離する方法は、当該技術分野において周知である。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、１９８９，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。生物学的試料から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出して核酸の溶液を形成するための様々なキットが市販されている（例えば、ＫＡＰＡ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｅｘｔｒａｃｔ（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州プレザントン））およびＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ウィスコンシン州マディソン）からの他の同様の製品、Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）、およびＱｉａｇｅｎ（カリフォルニア州バレンシア）、Ａｍｂｉｏｎ（テキサス州オースチン）、ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州ハーキュリーズ）など）。

【0019】

装置

【0020】

いくつかの実施形態では、本発明は、生物学的試料からの核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含む生物学的ポリマーの電気駆動抽出に必要な複数の構成要素を組み込んだ装置である。各装置は、図１に示す配置の構成要素からなる。各構成要素は、その機能、幾何学的形状および材料に関して以下に説明される。いくつかの実施形態では、装置は、上部リザーバ１および下部リザーバ２を備える。上部リザーバ１は、電解質緩衝液と混合された試料を収容する。下部リザーバ２は、電解質緩衝液を収容する。装置は、駆動電界がその間に形成される作用電極３および対向電極４のセットをさらに備える。いくつかの実施形態では、作用電極３は、上部リザーバ１に配置される。いくつかの実施形態では、作用電極３は、上部リザーバ１の上部リムまたはその近くに配置される。いくつかの実施形態では、対向電極４は、下部リザーバ２内に配置される。

【0021】

いくつかの実施形態では、装置は、抽出された材料がその後の収集のために濃縮される収集チャンバ５をさらに備える。いくつかの実施形態では、収集チャンバ５は、上部リザーバ１と下部リザーバ２との間に配置される。いくつかの実施形態では、収集チャンバ５は、反対側に開口部を有する本体を有し、上側開口部は、上部リザーバ１に接続され、下側開口部は、下部リザーバ２に接続される。収集チャンバ５は、図２に示すように異なる幾何学的形状を有することができる。様々な実施形態では、収集チャンバ５は、円筒形（Ａ）または円錐形（Ｂ～Ｃ）である。いくつかの実施形態では、円錐形（Ｂ）収集チャンバ５は、上部リザーバ１に面するより広い基部を有する。いくつかの実施形態では、円錐形（Ｃ）収集チャンバ５は、下部リザーバ２に面するより広い基部を有し、「逆円錐形」と呼ばれる。いくつかの実施形態では、収集チャンバ５は、単離された核酸を含む試料を採取するために使用される任意の用途特異的収集体積またはピペットチップの種類と一致するように構成されている。

【0022】

いくつかの実施形態では、装置は、試料の他の成分から抽出されるべき生物学的ポリマーを分離するためのふるい分けマトリックスまたはフィルタ６を備える。いくつかの実施形態では、ふるい分けマトリックスまたはフィルタ６は、上部リザーバ１に配置される。いくつかの実施形態では、ふるい分けマトリックスまたはフィルタ６は、上部リザーバ１と収集チャンバ５との境界面に配置される。ふるい分けマトリックスまたはフィルタ６の特性は、試料の組成および所望の下流手順に応じて異なる。いくつかの実施形態では、ふるい分けマトリックスまたはフィルタ６の寸法は、試料核酸がふるい分けマトリックスまたはフィルタ６内の細孔を通って移動するようなものである。いくつかの実施形態では、ふるい分けマトリックスまたはフィルタ６の寸法は、汚染粒子、例えば細胞破片、未溶解細胞および核酸よりも大きい他の材料のサイズベースの排除を可能にする。いくつかの実施形態では、ふるい分けマトリックスまたはフィルタ６の寸法は、上部リザーバおよび下部リザーバに装填される２つの異なる緩衝液間の予混合を最小限に抑えることを可能にする。

【0023】

いくつかの実施形態では、装置は、核酸を含む生物学的ポリマーを保持するための半透膜７を備える。いくつかの実施形態では、半透膜７は、収集チャンバ５内に配置される。いくつかの実施形態では、半透膜７は、収集チャンバ５と下部リザーバ２との境界面に配置される。いくつかの実施形態では、半透膜７は、抽出されるべき生物学的ポリマーを保持するための比分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。いくつかの実施形態では、半透膜７のＭＷＣＯは、収集チャンバ内のふるい分けマトリックスまたはフィルタ６のＭＷＣＯよりも小さい。いくつかの実施形態では、半透膜７は、透析膜または多孔質箔を含み、多孔質プラスチック材料、フリット、ゲル、紙、不織布および濾過紙のうちの１つまたは複数を含む。

【0024】

緩衝液システム

【0025】

いくつかの実施形態では、電気泳動装置は、双方のリザーバがバックグラウンド電解質（例えば、ゾーン電気泳動）によって充填されている１電解質システムを利用する。他の実施形態では、電気泳動装置は、上部リザーバおよび下部リザーバが２つの別個の電解質緩衝液によって充填される不連続電解質システムに使用される。いくつかの実施形態では、電気泳動装置は、例えば、米国特許出願公開第２０２００２８２３９２号明細書に記載されているエピタコフェレーシスを使用した試料分析のための装置に記載されているように、エピタコフェレーシスに使用される先行電解質および後続電解質を含む２緩衝液システムとともに使用される。いくつかの実施形態では、電気泳動装置は、例えば、米国特許出願公開第２０１９００７１６６１号明細書に記載されている等速電気泳動のためのシステム装置および方法に記載されているように、等速電気泳動に使用される先行電解質および後続電解質を含む２緩衝液システムとともに使用される。

【0026】

装置の動作

【0027】

いくつかの実施形態では、電気泳動装置は、電気の流れを利用して、負に帯電した核酸分子を電解質によって充填された下部リザーバ２に浸漬された正に帯電した電極に向かって電気的に輸送する。いくつかの実施形態では、電気泳動装置は、一定の電気的パラメータ下で動作する。一定の電気的パラメータは、定電力、定電流または定電圧のうちの１つである。

【0028】

アセンブリ

【0029】

いくつかの実施形態では、電気泳動装置は、図３Ａおよび図３Ｂに記載された核酸を単離するためのアセンブリシステムの一部である。いくつかの実施形態では、アセンブリ装置は、上部プレート８および下部プレート９を備える。上部プレート８は、リザーバおよび収集チャンバ５内に電極３、４、フィルタ６、および膜７を含む。上部プレート８は、図３Ａおよび図３Ｂに見られるように、下部ウェルプレート９とともに組み立てられる。

【0030】

アセンブリの動作

【0031】

図３Ａおよび図３Ｂの例では、下部リザーバ２は、収集チャンバ５および濾紙６の内側とともに、先行電解質イオンを含む緩衝液によって充填されている。次いで、濾紙６の外側領域は、後続電解質と予混合された液体試料Ｐ３６７４１によって充填される。

【0032】

いくつかの実施形態では、試料は、アセンブリに適用する前に濃縮される。他の実施形態では、単離される微量の生物学的ポリマー（例えば、無細胞核酸）を含有する大きな体積試料が濃縮されて、無細胞核酸の濃度を高める。いくつかの実施形態では、アセンブリに適用する前に、試料は、単離される生物学的ポリマーを含む任意の細胞および細胞内構造を破壊するための初期前処理手順を受けている。いくつかの実施形態では、細胞を含有する試料は、核酸を放出させるために界面活性剤およびプロテアーゼによって処置される。いくつかの実施形態では、試料は、アセンブリに適用する前に脱パラフィン手順を受けたＦＦＰＥＴ試料である。

【0033】

次に、作用電極３と対向電極４との間に電圧が印加される。電圧によって駆動されて、分散して帯電した生物学的ポリマーは、発生した電界に沿って対向電荷電極に移動する。例えば、負に帯電した核酸は、カソードに向かって移動する。いくつかの実施形態では、未溶解細胞または細胞破片などの試料中に存在する大きな汚染粒子は、適切な孔径を有するフィルタ６の孔を通って拡散することが防止される。同時に、抽出されるべき生物学的ポリマーは、フィルタ６を通過し、収集チャンバ５に到達する。いくつかの実施形態では、不純物を構成するより小さな分子が半透膜７を通過する。同時に、抽出されるべき生物学的ポリマーは、半透膜７のＭＷＣＯよりも大きい分子量を有し、収集チャンバ５内に保持され、濃縮される（図３Ｃ）。次いで、濃縮された材料は、手動または自動ピペッティングによって収集され、その後の試料処理および分析のために移送される。

【0034】

自動化

【0035】

いくつかの実施形態では、電気泳動装置を使用した生物学的ポリマーの単離は自動化される。本技術は、スループットおよび再現性を改善するためにワークフローを自動化するための機器の下で動作され得る。完全に自動化されたワークフローは、ピペッティング、ならびに電気的および熱的制御のための液体処理ロボットの下で実装され得る。いくつかの実施形態では、自動化装置は、標準的な培養プレート、例えば、６ウェル、１２ウェル、９６ウェルまたは同様の培養プレートを使用して組み立てられる。説明のために、単純な固定具が図４に示されている。図４に示すように、試料および電解質緩衝液を装填した６ウェル抽出プレート８、９が最初に下部基材１０内に配置される。下部基材１０は、個々のウェルに電力を供給するための多数（例えば、図４の例では６個）のプログラマブル電源１１を収容する。電源１１はまた、プロセス中に各ウェルからフィードバック電圧を読み取る。電圧が所定のカットオフ値に到達すると、電力は、自動的に低減または遮断され、次いでシリンジポンプ１２を作動させて、流体ライン１３を介して収集チャンバ５から濃縮核酸を吸引する。

【0036】

装置の組み立て

【0037】

いくつかの実施形態では、装置は、図５に示すように、プラスチックなどの成形可能な材料の１つまたは複数の層から組み立てられる。いくつかの実施形態では、図５Ａに左に見られるように、複数の成形可能な層が積層され、層２は、上部リザーバ２の側壁、層３は、上部リザーバ２の下部、および上部インサートの収集チャンバ５を提供する。いくつかの実施形態では、半透膜７は、収集チャンバ５の下側開口部において装置の下部に配置され、半透膜７は、図５Ｂ（左：底面図、右：半透膜７を分解した斜視図）に見られるように、各チャンバ（例えば、ウェル）の形状に適応するように成形される。図５Ｃに示すように、収集チャンバ５の開口部を囲むようにフィルタ６が配置されている。いくつかの実施形態では、フィルタ６の厚さおよび粒子保持は、試料の性質に適応するように選択される。いくつかの実施形態では、粒子保持率は、２５μｍである。いくつかの実施形態では、層の厚さ（高さ）は、５ｍｍである。

【0038】

生物学的ポリマーの抽出方法

【0039】

装置を動作させるために、先行電解質は、上部インサートの下部リザーバ２および収集チャンバ５内に配置される。いくつかの実施形態では、先行電解質緩衝液は、後続電解質よりも高いイオン強度および低いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、核酸を単離するために、先行電解質は、１００ｍＭ ＨＣｌ．Ｈｉｓ緩衝液、ｐＨ６．２５を含む。次に、生物学的ポリマー（例えば、核酸）を含む試料溶液が中空リザーバに接触される。いくつかの実施形態では、試料は、上部リザーバに配置されたフィルタ６に接触される。いくつかの実施形態では、試料は、上部リザーバの上部インサート内の濾紙壁６の外側に装填される。

【0040】

いくつかの実施形態では、試料溶液は、１つまたは複数の追跡色素をさらに含む。いくつかの実施形態では、追跡色素（例えば、ブリリアントブルー）溶液は、後続電解質中で調製される。いくつかの実施形態では、後続電解質緩衝液は、先行電解質緩衝液と比較して、より低いイオン強度およびより高いｐＨを有する。いくつかの実施形態では、核酸を単離するために、後続電解質は、２０ｍＭ Ｔａｐｓ．Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３０を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、生物学的ポリマーの単離を行うために、装置は、定電力で作動する。他の実施形態では、定電圧または定電流が使用されてもよい。電力は、ポリマーおよび追跡色素を収集チャンバ５内に駆動する（図６Ａ）。収集チャンバから収集された画分は、さらなる分析のために回収される。いくつかの実施形態では、収集は、追跡色素の移動に基づいて時間調整される。

【0042】

抽出された核酸の検出

【0043】

いくつかの実施形態では、本発明は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を介して、抽出された核酸を検出、定性化または定量化するステップを含む。増幅は、上流プライマーおよび下流プライマーを利用する。いくつかの実施形態では、双方のプライマーは、標的特異的プライマー、すなわち、抽出された核酸に存在することが知られている配列に相補的な配列を含むプライマーである。他の実施形態では、一方または双方のプライマーは、ランダムプライマーの混合物である。いくつかの実施形態では、ＰＣＲは、定量的ＰＣＲとしても知られているリアルタイムＰＣＲである。ｑＰＣＲは、蛍光のレベルが反応混合物中の標的核酸の量を反映する蛍光プローブを利用する。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲが使用されて、本明細書に開示される方法および装置によって抽出された核酸の量を検出、定性化または定量化する。

【0044】

いくつかの実施形態では、本発明は、生物学的ポリマーに特異的な蛍光を使用して、本明細書に開示される方法および装置によって抽出された生物学的ポリマーを検出するステップを含む。いくつかの実施形態では、本発明は、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍの光の吸収を読み取ることができる蛍光光度計によって抽出物を分析し、タンパク質および核酸に特徴的な２６０／２８０吸収比を決定するステップを含む。

【0045】

シーケンシング

【0046】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および装置によって単離および抽出された核酸は、シーケンシングに供される。いくつかの実施形態では、単離または抽出された核酸は、シーケンシングの前に増幅される。現在使用されているシーケンシング方法およびプラットフォームは、シーケンシングライブラリを形成することを必要とする。ライブラリは、プラットフォーム特異的アダプタに連結された複数の核酸を含む。様々な形状および機能のアダプタが当該技術分野において知られている（例えば、国際公開第２０１９／１６６５６５号パンフレット、米国特許第８８２２１５０号明細書および米国特許第８４５５１９３号明細書を参照）。いくつかの実施形態では、アダプタの機能は、所望の要素を核酸に導入することである。アダプタ由来要素は、核酸バーコード、プライマー結合部位またはライゲーション可能部位のうちの少なくとも１つを含む。核酸を調製し、アダプタライゲーションを行ってライブラリを形成し、ライブラリを増幅するための市販のキットは、ＡＶＥＮＩＯ ｃｔＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ＫｉｔまたはＫＡＰＡ ＨｙｐｅｒＰｒｅｐおよびＨｙｐｅｒＰｌｕｓキット（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州プレザントン））を含む。いくつかの実施形態では、アダプタまたは増幅プライマーは、バーコード配列を導入する。シーケンシングプロセスにおける分子バーコードおよび試料バーコードの使用は、米国特許第７，３９３，６６５号明細書、米国特許第８，１６８，３８５号明細書、米国特許第８，４８１，２９２号明細書、米国特許第８，６８５，６７８号明細書、米国特許第８，７２２，３６８号明細書および国際公開第２０１９／１６６５６５号パンフレットに記載されている。

【0047】

本明細書に開示される方法による使用に適した配列アッセイおよびプラットフォームの非限定的な例は、ナノポアシーケンシング（米国特許出願公開第２０１３／０２４４３４０号明細書、米国特許出願公開第２０１３／０２６４２０７号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０１３４６１６号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０１１９２５９号明細書および米国特許出願公開第２０１５／０３３７３６６号明細書）、サンガーシーケンシング、キャピラリーアレイシーケンシング、熱サイクルシーケンシング（Ｓｅａｒｓら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：６２６－６３３（１９９２））、固相シーケンシング（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，３：３９－４２（１９９２））、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳ；Ｆｕら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：３８１－３８４（１９９８））などの質量分析によるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング（Ｄｒｍａｎａｃら，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１６：５４－５８（１９９８）、および限定されないが、合成によるシーケンシング（例えば、ＨｉＳｅｑ（商標）、ＭｉＳｅｑ（商標）、またはＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ、それぞれＩｌｌｕｍｉｎａから入手可能）を含むＮＧＳ法、ライゲーションによるシーケンシング（例えば、ＳＯＬｉＤ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、イオン半導体シーケンシング（例えば、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、およびＳＭＲＴ（登録商標）シーケンシング（例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。

【0048】

市販のシーケンシング技術は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｉｎｃ．（カリフォルニア州サニーベール）のハイブリダイゼーションによるシーケンシングプラットフォーム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ／Ｓｏｌｅｘａ（カリフォルニア州サンディエゴ）およびＨｅｌｉｃｏｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）の合成によるシーケンシングプラットフォーム、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州フォスターシティ）のライゲーションによるシーケンシングプラットフォームを含む。他のシーケンシング技術は、限定されないが、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔ技術（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびナノポアシーケンシング（Ｒｏｃｈｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（カリフォルニア州サンタクララ）のＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）およびＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国オックスフォード）を含む。

【0049】

参考文献

【0050】

米国仮特許出願第６３／０００，０２２、Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

【0051】

米国特許出願公開第２０２００２８２３９２号明細書、Ｄｅｖｉｃｅｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｕｓｉｎｇ ｅｐｉｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ

【0052】

国際公開第２０２０／０７４７４２号パンフレット、Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｅｐｉｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ

【0053】

国際公開第２０２０／２２９４３７号パンフレット、Ｄｅｖｉｃｅｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｓａｍｐｌｅ ａｎａｌｙｓｉｓ

【0054】

Ｆｏｒｅｔ，Ｆ．ら（２０１９）Ｍａｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｅｖｉｃｅ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ Ｂａｓｅｄ ｏｎ Ｅｐｉｔａｃｈｏｐｈｏｒｅｓｉｓ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ９１（１１），７０４７－７０５３，ＤＯＩ：１０．１０２１／ａｃｓ．ａｎａｌｃｈｅｍ．８ｂ０５８６０

【0055】

実施例

【0056】

実施例１．電気泳動装置を使用した核酸の単離（予言的？）

【0057】

この実施例では、図３Ａおよび図３Ｂに示す装置が使用されて、ＦＦＰＥＴ試料から核酸を単離した。下部リザーバ２は、収集チャンバ５および濾紙６の内側とともに、先行電解質イオンを含む緩衝液によって充填される。次いで、濾紙６の外側領域は、後続電解質イオンを含有する緩衝液と混合された前処置されたＦＦＰＥＴ試料によって充填される。作用電極３と対向電極４との間に電圧が印加されると、試料中の分散した負に帯電した核酸が、発生した電界に沿って正に帯電した対向電極４に向かって移動する。未溶解細胞または細胞破片などの大きな汚染粒子が濾紙６の孔を通って拡散するのが防がれる一方で、核酸分子は、構造を通過して収集チャンバ５に到達する。半透膜７のＭＷＣＯよりも大きい分子量を有する核酸は、収集チャンバ５内に保持され、濃縮される（図３Ｃ）。次いで、濃縮された核酸がピペッティングによって収集され、その後の試料処理および分析のために移送される。

【0058】

実施例２．核酸の電気泳動単離のための試作装置のアセンブリ。

【0059】

この実施例では、ＮＡ抽出の技術的実現可能性を実証するために、本発明者らはまず、標準的な６ウェル培養プレート上に配置され得る単一インサートフォーマットの装置を試作した。レーザー切断機を使用して複数層のプラスチック部品（層１、層２、層３）が切断され、両面接着剤を使用して積層した後、図５に記載のように半透膜を装置の下部に取り付けた。濾紙（ＶＷＲ（登録商標）グレード４１５濾紙、定性、クレープ、粒子保持率２５μｍ）が収集チャンバの内壁に取り付けられて、上部インサートに高さ５ｍｍの分離壁を形成した。

【0060】

実施例３．核酸の電気泳動単離のための試作装置を試験する。

【0061】

この実施例では、図６Ａの試作装置をエピタコフェレーシスベースのＤＮＡ抽出について試験した。最初に、先行電解液（８．３ｍＬの１００ｍＭ ＨＣｌ．Ｈｉｓ緩衝液、ｐＨ６．２５）を下部リザーバ２に入れた。上部インサートの収集チャンバ５に、２００μＬの先行電解液が充填された。次いで、トレイリング緩衝液（１．０ｍＬの２０ｍＭ Ｔａｐｓ．Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．３０）中で調製したＤＮＡラダー（１μｇの１Ｋｂプラス、１００ｂｐ～１０Ｋｂｐ）および（追跡マーカーとしての）ブリリアントブルー色素を含有する試料溶液が、上部インサート内の濾紙壁６の外側に装填された。装置に定数０．５Ｗが印加されて、ＤＮＡおよび青色色素分子の収集チャンバ（図６Ａ）への移動を駆動した。次いで、８分後に収集した試料溶出液がＱｕｂｉｔによって分析されて、抽出収率を決定した（すなわち、回収率＝７５％、図６Ｃ）。さらに、図６ＤのＴａｐｅｓｔａｔｉｏｎの結果は、試料の入力と出力との間の同等のサイズ分布（すなわち、装置から収集された溶出液）を示しており、装置がそれらのサイズに関係なくＤＮＡを抽出することができることを示している。

【0062】

本発明が特定の実施例を参照して詳細に説明されたが、本発明の範囲内で様々な変更を行うことができることは、当業者にとって明らかであろう。したがって、本発明の範囲は、本明細書に記載された例によって限定されるべきではなく、以下に提示される特許請求の範囲によって限定されるべきである。

【図1】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図6E】

【国際調査報告】