特表 2024-509454 大規模並列ＲＮＡ機能摂動プロファイリングのためのアッセイ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-01

(54)【発明の名称】大規模並列ＲＮＡ機能摂動プロファイリングのためのアッセイ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240222BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240222BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240222BHJP

   C12Q 1/6897 20180101ALI20240222BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240222BHJP

   C12N 7/01 20060101ALI20240222BHJP

   C40B 40/06 20060101ALI20240222BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240222BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 Z

C12N15/113 Z

C12N15/63 Z

C12N15/867 Z

C12Q1/6897 Z

C12N5/10

C12N7/01

C40B40/06

C12Q1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023555220

(86)(22)【出願日】2022-03-08

(85)【翻訳文提出日】2023-09-07

(86)【国際出願番号】 EP2022055951

(87)【国際公開番号】W WO2022189464

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】2103216.4

(32)【優先日】2021-03-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523342067

【氏名又は名称】ラダー・セラピューティクス・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100108453

【弁理士】

【氏名又は名称】村山 靖彦

(74)【代理人】

【識別番号】100110364

【弁理士】

【氏名又は名称】実広 信哉

(74)【代理人】

【識別番号】100133400

【弁理士】

【氏名又は名称】阿部 達彦

(72)【発明者】

【氏名】ラビア・カーン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ08

4B063QQ52

4B063QQ79

4B063QR16

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR77

4B063QS05

4B063QS36

4B063QX02

4B065AA90X

4B065AA97X

4B065AA97Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA01

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、レポーター遺伝子及びクエリー配列を含む核酸構築物を特徴とし、クエリー配列は、二次構造に折り畳まれたＲＮＡ及び若しくはＲＮＡ調節エレメントをコードするか、又はそれである。これらの核酸構築物は、本明細書にも開示される摂動プロファイリングのための大規模並列アッセイ方法において使用することができる。そのような方法は、細胞内状況内でＲＮＡを調節するための化学的又は遺伝的な摂動の効果を研究する能力を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

核酸構築物であって、
ｉ．）第１のレポーター遺伝子をコードする第１の配列と、
ｉｉ．）第２のレポーター遺伝子をコードし、クエリー配列を含む第２の配列であって、
前記クエリー配列が、前記第２のレポーター遺伝子に作動可能に結合し、前記クエリー配列が、
遺伝子転写物の二次構造及び／若しくはＲＮＡ調節エレメントに折り畳まれたＲＮＡをコードするか、又はそれであり、前記二次構造及び／又は転写物が、前記第２のレポーター遺伝子の前記転写物の一部ではない、第２の配列と、
ｉｉｉ．）ｉ）及びｉｉ）の発現を駆動することができる１つ以上のプロモーターと、を含む、核酸構築物。

【請求項2】

前記第２の配列が、前記クエリー配列に固有のバーコード配列を含む、請求項１に記載の核酸構築物。

【請求項3】

ｉｉｉ）が、
ｉ）の発現を駆動することができる第１のプロモーターと、
ｉｉ）の発現を駆動することができる第２のプロモーターと、を含み、
前記第１及び第２のプロモーターが、互いに独立して作動する、請求項１又は２に記載の核酸構築物。

【請求項4】

ｉｉｉ）が、ｉ）及びｉｉ）の発現を駆動することができる単一プロモーターを含む、請求項１又は２に記載の核酸構築物。

【請求項5】

ｉｉｉ）が、単方向プロモーターを含む、請求項４に記載の核酸構築物。

【請求項6】

前記クエリー配列が、非翻訳領域（ＵＴＲ）又はイントロンであるＲＮＡ調節エレメントをコードするか、又はそれである、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項7】

前記クエリー配列が、前記第２のレポーター遺伝子ではない遺伝子の５’ＵＴＲをコードするか、又はそれである、請求項６に記載の核酸構築物。

【請求項8】

前記クエリー配列が、前記第２のレポーター遺伝子ではない遺伝子の変異５’ＵＴＲをコードするか、又はそれである、請求項７に記載の核酸構築物。

【請求項9】

前記クエリー配列が、前記第２のレポーター遺伝子ではない遺伝子の３’ＵＴＲをコードするか、又はそれである、請求項６に記載の核酸構築物。

【請求項10】

前記クエリー配列が、前記第２のレポーター遺伝子ではない遺伝子の変異３’ＵＴＲをコードするか、又はそれである、請求項９に記載の核酸構築物。

【請求項11】

前記ＵＴＲ又はイントロンが、１つ以上のＲＮＡ二次構造を含む、請求項６～１０のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項12】

前記クエリー配列が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）であるＲＮＡ調節エレメントをコードするか、又はそれである、請求項１～５のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項13】

前記ＩＲＥＳが、１つ以上のＲＮＡ二次構造を含む、請求項１２に記載の核酸構築物。

【請求項14】

前記１つ以上のＲＮＡ二次構造が、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）、トリプルヘリックス、シュードノット、ステム－ループ、及びマルチウェイジャンクションからなるリストから選択される、請求項１１又は１３に記載の核酸構築物。

【請求項15】

前記第１及び第２のレポーター遺伝子が、それらの間に前記ＩＲＥＳを有して配置される、バイシストロニックレポーターシステムを含む、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項16】

前記クエリー配列が、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）を含む二次構造をコードするか、又はそれである、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項17】

前記クエリー配列が、トリプルヘリックスを含む二次構造をコードするか、又はそれである、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項18】

前記クエリー配列が、シュードノットを含む二次構造をコードするか、又はそれである、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項19】

前記クエリー配列が、ステム－ループを含む二次構造をコードするか、又はそれである、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項20】

前記クエリー配列が、マルチウェイジャンクションを含む二次構造をコードするか、又はそれである、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項21】

前記クエリー配列が、二次構造に折り畳まれた野生型ＲＮＡを含む二次構造をコードするか、又はそれである、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項22】

前記クエリー配列が、変異体ＲＮＡをコードするか、又はそれであり、前記変異体ＲＮＡが、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）、トリプルヘリックス、シュードノット、ステム－ループ、及び／又はマルチウェイジャンクションを含む二次構造に折り畳まれるＲＮＡの野生型配列に対して１つ以上の変異を含む、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項23】

前記野生型配列に対する変異が、生物学的疾患状態に関連する変異である、請求項２２に記載の核酸構築物。

【請求項24】

前記生物学的疾患状態が、哺乳動物における疾患である、請求項２３に記載の核酸構築物。

【請求項25】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項２４に記載の核酸構築物。

【請求項26】

前記クエリー配列が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスから二次構造に折り畳まれたＲＮＡを含む二次構造をコードするか、又はそれであり、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項27】

前記クエリー配列が、Ｇ４、シュードノット、ステムループ、トリプルヘリックス、及びマルチウェイジャンクション、又はＩＲＥＳなどの機能単位からなるリストから選択される２つ以上の二次構造をコードするか、又はそれらを含む、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項28】

前記２つ以上の二次構造が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの機能単位を形成する、請求項２７に記載の核酸構築物。

【請求項29】

前記２つ以上の二次構造が、ＵＴＲなどの機能単位を形成する、請求項２７に記載の核酸構築物。

【請求項30】

前記ＩＲＥＳが、ＵＴＲに含まれる、請求項２８に記載の核酸構築物。

【請求項31】

前記第１及び／又は第２のレポーター遺伝子が、（ａ）蛍光タンパク質を発現する、先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物。

【請求項32】

前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び／又は橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）を含む、請求項３１に記載の核酸構築物。

【請求項33】

前記第１及び第２のレポーター遺伝子の一方が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である、請求項３２に記載の核酸構築物。

【請求項34】

前記緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）が、不安定化ＧＦＰである、請求項３３に記載の核酸構築物。

【請求項35】

先行請求項のいずれか一項に記載の核酸構築物を含む、ベクター。

【請求項36】

前記ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項３５に記載のベクター。

【請求項37】

前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項３５に記載のベクター。

【請求項38】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項３８に記載のベクター。

【請求項39】

前記ベクターが、ＲＮＡを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項40】

前記ベクターが、ＤＮＡを含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項41】

ＲＮＡ構築物を含む１つ以上の細胞を各々含む多数の細胞集団を含む、細胞のライブラリーであって、１つの単一集団の細胞の各ＲＮＡ構築物が、互いに同じであるが、異なる集団の細胞のＲＮＡ構築物が、互いに異なり、
各ＲＮＡ構築物が、レポーター遺伝子を発現することができる発現カセットを含む第１のドメインと、前記ＲＮＡが二次構造に折り畳まれ、かつ／又は前記レポーター遺伝子転写物ではない遺伝子転写物のＲＮＡ調節エレメントを含む、第２のドメインと、を含む、細胞のライブラリー。

【請求項42】

各ＲＮＡ構築物が、請求項１～３４のいずれか一項に記載の核酸構築物であるか、又は請求項３５～４０のいずれか一項に記載のベクターから転写される、請求項４１に記載の細胞のライブラリー。

【請求項43】

各第２のドメインが、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）を含む二次構造を含む、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項44】

各第２のドメインが、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む二次構造を含む、請求項４１～４３のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項45】

各第２のドメインが、トリプルヘリックスを含む二次構造を含む、請求項４１～４４のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項46】

各第２のドメインが、シュードノットを含む二次構造を含む、請求項４１～４５のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項47】

各第２のドメインが、ステム－ループを含む二次構造を含む、請求項４１～４６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項48】

前記ライブラリーの１つ以上の細胞集団が、野生型Ｇ４構造を含むＧ４含有ＲＮＡ構築物を含み、前記ライブラリーの他の細胞集団が、変異体Ｇ４構造を含むＧ４含有ＲＮＡ構築物を含む、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項49】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコード若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのＧ４構造を含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項50】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのＧ４構造を含む、請求項４３に記載の細胞のライブラリー。

【請求項51】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのＩＲＥＳ構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項52】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのＩＲＥＳ構造を含む、請求項４４に記載の細胞のライブラリー。

【請求項53】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのトリプルヘリックス構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項54】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのトリプルヘリックス構造を含む、請求項４５に記載の細胞のライブラリー。

【請求項55】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのシュードノット構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項56】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのシュードノット構造を含む、請求項４６に記載の細胞のライブラリー。

【請求項57】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのステム－ループ構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項58】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される全てのステム－ループ構造を含む、請求項４７に記載の細胞のライブラリー。

【請求項59】

各第２のドメインが、非翻訳領域（ＵＴＲ）又はイントロンであるＲＮＡ調節エレメントを含む、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項60】

各第２のドメインが、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）に結合するか、又はＲＮＡ結合タンパク質に結合する結合部位を含む、請求項４１～５９のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項61】

各第２のドメインが、前記レポーター遺伝子ではない遺伝子の５’ＵＴＲを含む、請求項４１～６０のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項62】

各第２のドメインが、前記レポーター遺伝子ではない遺伝子の３’ＵＴＲを含む、請求項４１～６１のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項63】

各第２のドメインが、Ｇ４及びＩＲＥＳを含む二次構造を含む、請求項４１又は４２に記載の細胞のライブラリー。

【請求項64】

前記ＲＮＡ構築物が、前記細胞によって安定に発現される、請求項４１～６３のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項65】

前記ＲＮＡ構築物が、前記細胞によって一時的に発現される、請求項４１～６３のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項66】

前記細胞が、１つ以上のＲＮＡ結合タンパク質をノックアウト、ノックダウン、又はサイレンシングするように遺伝子修飾されている、請求項４１～６５のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項67】

前記細胞集団が、単一培養体積内にプールされる、請求項４１～６６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項68】

各細胞集団が、各々の他の細胞集団の細胞培養体積とは別の細胞培養体積中に存在する、請求項４１～６６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項69】

各第１のドメインの前記レポーター遺伝子が、１つ以上の蛍光タンパク質を発現する、請求項４１～６８のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項70】

前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び／又は橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）を含む、請求項６９に記載の細胞のライブラリー。

【請求項71】

前記発現カセットが、ＧＦＰのコード配列と、ＲＦＰのコード配列と、それらの間にバイシストロニックプロモーターと、を含む、請求項７０に記載の細胞のライブラリー。

【請求項72】

前記発現カセット内、ＧＦＰをコードする配列とＲＦＰをコードする配列との間に、前記第２のドメインのＩＲＥＳを更に含む、請求項７０又は７１に記載の細胞のライブラリー。

【請求項73】

前記第２のドメインが、各ＲＮＡ構築物の５’末端にある、請求項４１～７２のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項74】

前記第２のドメインが、各ＲＮＡ構築物の３’末端にある、請求項４１～７２のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項75】

各ＲＮＡ構築物が、バーコード配列を更に含む、請求項４１～７４のいずれか一項に記載の細胞のライブラリー。

【請求項76】

請求項１～３４のいずれか一項に記載の核酸構築物又は請求項３５～４０のいずれか一項に記載のベクターを含む１つ以上の細胞を各々含む多数の細胞集団を含む、細胞のライブラリーであって、１つの単一集団の細胞の各核酸構築物が、互いに同じであるが、異なる集団の細胞の核酸構築物が、互いに異なる、細胞のライブラリー。

【請求項77】

各ＲＮＡ構築物が、レポーター遺伝子を発現することができる発現カセットを含む第１のドメインと、前記ＲＮＡが二次構造に折り畳まれ、かつ／又は前記レポーター遺伝子転写物ではない遺伝子転写物のＲＮＡ調節エレメントを含む、第２のドメインと、を含む、ＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項78】

各第２のドメインが、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）を含む二次構造を含む、請求項７７に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項79】

各第２のドメインが、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む二次構造を含む、請求項７７又は７８に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項80】

各第２のドメインが、トリプルヘリックスを含む二次構造を含む、請求項７７～７９のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項81】

各第２のドメインが、シュードノットを含む二次構造を含む、請求項７７～８０のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項82】

各第２のドメインが、ステム－ループを含む二次構造を含む、請求項７７～８１のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項83】

前記ライブラリーの１つ以上の細胞集団が、野生型Ｇ４構造を含むＧ４含有ＲＮＡ構築物を含み、前記ライブラリーの他の細胞集団が、変異体Ｇ４構造を含むＧ４含有ＲＮＡ構築物を含む、請求項７８に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項84】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのＧ４構造を含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項７８に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項85】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのＧ４構造を含む、請求項７８に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項86】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのＩＲＥＳ構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項７９に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項87】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのＩＲＥＳ構造を含む、請求項７９に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項88】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのトリプルヘリックス構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項８０に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項89】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのトリプルヘリックス構造を含む、請求項８０に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項90】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのシュードノット構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項８１に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項91】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのシュードノット構造を含む、請求項８１に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項92】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからの全てのステム－ループ構造のサブセットを含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項８２に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項93】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される実質的に全てのステム－ループ構造を含む、請求項８２に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項94】

各第２のドメインが、非翻訳領域（ＵＴＲ）であるＲＮＡ調節エレメントを含む、請求項７７に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項95】

各ＵＴＲが、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）を結合する結合部位を含む、請求項９４に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項96】

各第２のドメインが、前記レポーター遺伝子ではない遺伝子の５’ＵＴＲを含む、請求項７７～９５のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項97】

各第２のドメインが、前記レポーター遺伝子ではない遺伝子の３’ＵＴＲを含む、請求項７７～９５のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項98】

各第２のドメインが、Ｇ４及びＩＲＥＳを含む二次構造を含む、請求項７７に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項99】

各第１のドメインの前記レポーター遺伝子が、１つ以上の蛍光タンパク質を発現する、請求項７７～９８のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項100】

前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び／又は橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）を含む、請求項９９に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項101】

前記発現カセットが、ＧＦＰのコード配列と、ＲＦＰのコード配列と、それらの間にバイシストロニックプロモーターと、を含む、請求項１００に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項102】

前記発現カセット内、ＧＦＰをコードする配列とＲＦＰをコードする配列との間に、前記第２のドメインのＩＲＥＳを更に含む、請求項１００又は１０１に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項103】

前記第２のドメインが、各ＲＮＡ構築物の５’末端にある、請求項７７～１０２のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項104】

前記第２のドメインが、各ＲＮＡ構築物の３’末端にある、請求項７７～１０２のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項105】

各ＲＮＡ構築物が、バーコード配列を更に含む、請求項７７～１０４のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリー。

【請求項106】

各核酸構築物が、請求項１～３４に記載の構築物である、核酸構築物のライブラリー。

【請求項107】

請求項７７～１０６のいずれか一項に記載のＲＮＡ構築物のライブラリーを含むか、又はそれをコードする、ベクターのライブラリー。

【請求項108】

各ベクターが、非ウイルスベクターである、請求項１０７に記載のベクターのライブラリー。

【請求項109】

前記非ウイルスベクターが、前記ＲＮＡ構築物を発現するＤＮＡプラスミドを含む、請求項１０８に記載のベクターのライブラリー。

【請求項110】

前記非ウイルスベクターが、前記ＲＮＡ構築物を含む、請求項１０８に記載のベクターのライブラリー。

【請求項111】

各ベクターが、ウイルスベクターである、請求項１０７に記載のベクターのライブラリー。

【請求項112】

前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項１１１に記載のベクターのライブラリー。

【請求項113】

請求項１０８～１１０のいずれか一項に記載のベクターのライブラリーで細胞の集団をトランスフェクトすること、又は請求項１１１若しくは１１２に記載のベクターのライブラリーで細胞の集団をトランスフェクトすることを含む、請求項４１～７６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリーを生成する方法。

【請求項114】

前記細胞集団が、腫瘍細胞を含む、請求項１１３に記載の方法。

【請求項115】

前記細胞集団が、組織試料を含むか、又は組織試料由来である、請求項１１３又は１１４に記載の方法。

【請求項116】

前記細胞集団が、哺乳動物対象からの生検由来である、請求項１１３～１１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記哺乳動物対象が、ヒト対象である、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記生検が、腫瘍由来である、請求項１１６又は１１７に記載の方法。

【請求項119】

前記細胞集団が、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）である、請求項１１３に記載の方法。

【請求項120】

ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造と相互作用する薬剤を選択するために候補薬剤のパネルをスクリーニングする多重化された方法であって、
ａ．請求項４１～７６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリーを多重化された方法で候補薬剤のパネルと接触させることと、次いで
ｂ．（ａ）レポーター遺伝子発現が平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している細胞集団を特定することと、次いで
ｃ．ステップｂにおいて特定された前記細胞集団と接触していた前記候補薬剤を選択することと、を含む、方法。

【請求項121】

前記ＲＮＡ構築物が、バーコード配列を含み、ステップｂ．が、レポーター遺伝子発現が、平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、細胞集団のバーコード配列を読み取ることを更に含む、請求項１２０に記載の多重化された方法。

【請求項122】

ステップｂ．が、レポーター遺伝子発現が、平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、細胞集団を特定するため、及びレポーター遺伝子発現レベルに従って細胞集団を分離するため、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いる、請求項１２０又は１２１に記載の多重化された方法。

【請求項123】

ステップａ．が、マルチウェルプレートにおいて前記細胞のライブラリーを前記候補薬剤のパネルと接触させることによって行われる、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の多重化された方法。

【請求項124】

ステップａ．が、高スループット液滴マイクロ流体システムを介して前記細胞のライブラリーを前記候補薬剤のパネルと接触させることによって行われる、請求項１２０～１２２のいずれか一項に記載の多重化された方法。

【請求項125】

前記候補薬剤が、小分子である、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の多重化された方法。

【請求項126】

前記候補薬剤が、ＲＮＡ分子である、請求項１２０～１２４のいずれか一項に記載の多重化された方法。

【請求項127】

前記候補ＲＮＡ分子が、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｌｎｃＲＮＡである、請求項１２６に記載の多重化された方法。

【請求項128】

請求項１２５～１２７のいずれか一項に記載の方法によって選択される薬剤。

【請求項129】

ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造の集団を、前記エレメント／構造の機能を評価するためにスクリーニングする方法であって、請求項４１～７６のいずれか一項において定義される細胞のライブラリーを提供することと、前記細胞を増殖させることと、各細胞集団におけるレポーター遺伝子の発現レベルを評価することと、を含む、方法。

【請求項130】

各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造が、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）を含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのＧ４構造を含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される全てのＧ４構造を含む、請求項１３０に記載の方法。

【請求項133】

各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造が、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項134】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのＩＲＥＳ構造を含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項１３１に記載の方法。

【請求項135】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される全てのＩＲＥＳ構造を含む、請求項１３３に記載の方法。

【請求項136】

各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造が、トリプルヘリックスを含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項137】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのトリプルヘリックス構造を含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項１３６に記載の方法。

【請求項138】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される全てのトリプルヘリックス構造を含む、請求項１３７に記載の方法。

【請求項139】

各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造が、シュードノットを含む、請求項１２９に記載の方法。

【請求項140】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのシュードノット構造を含むパネルを構成し、前記非コードＲＮＡ配列のクラスが、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される、請求項１３９に記載の方法。

【請求項141】

前記ＲＮＡ構築物が、目的の生物のゲノムによって発現される全てのシュードノット構造を含む、請求項１３９に記載の方法。

【請求項142】

前記細胞が、１つ以上のＲＮＡ結合タンパク質をノックアウト、ノックダウン、又はサイレンシングするように遺伝子修飾されている、請求項１２９～１４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項143】

請求項４１～７６のいずれか一項において定義されるＲＮＡ構築物。

【請求項144】

疾患状態に関連する遺伝的摂動を特定する方法であって、請求項４１～７６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリーを提供することであって、前記細胞の第１の亜集団が、特定の疾患を有する１つ以上の対象由来のＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造を含み、前記細胞の第２の亜集団が、特定の疾患を有しない１つ以上の対象由来のＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造を含む、提供することと、前記第１及び第２の亜集団における相対レポーター遺伝子発現レベルを比較することと、を含む、方法。

【請求項145】

疾患状態に関連する化学的摂動を特定する方法であって、請求項４１～７６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリーを提供し、前記細胞の第１の亜集団を１つ以上の化学剤と接触させることと、前記第１の亜集団における相対レポーター遺伝子発現レベルを、前記１つ以上の化学剤と接触していない第２の亜集団の相対レポーター遺伝子発現レベルと比較することと、を含む、方法。

【請求項146】

前記１つ以上の化学剤が、治療剤、小分子、及び更なるＲＮＡ分子から選択される、請求項１４５に記載の方法。

【請求項147】

細胞ネットワーク又は生物学的表現型若しくは回路を作製する方法であって、
（ａ）請求項４１～７６のいずれか一項に記載の細胞のライブラリーにおける前記クエリー配列に、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ以上の一次又はコンビナトリアル遺伝的摂動を導入することであって、前記複数の細胞における各細胞が、少なくとも１つの摂動を受ける、導入することと、
（ｂ）測定することであって、
（ｉ）いずれの摂動も受けなかった１つ以上の細胞と比較して、単一細胞におけるゲノム、遺伝子、プロテオミック、エピジェネティック、及び／又は表現型の違いを検出することと、
（ｉｉ）単一細胞において前記摂動を検出することと、を含む、測定することと、
（ｃ）前記測定された違いに共変量を説明するモデルを適用することによって、前記摂動に関連する測定された違いを決定することと、を含み、それによって、細胞間及び／又は細胞内ネットワーク又は回路が推測される、方法。

【請求項148】

測定ステップ（ｂ）が、単一細胞配列決定を含む、請求項１４７に記載の方法。

【請求項149】

測定ステップ（ｂ）が、前記バーコード配列を読み取ることを含む、請求項１４７又は１４８に記載の方法。

【請求項150】

前記モデルが、測定されたシグナルの捕捉率、前記摂動が実際に前記細胞を摂動させたか（表現型の影響）、異なる細胞若しくは細胞状態のいずれかの亜集団の存在、及び／又はいずれの摂動も伴わない一致した細胞の分析を説明することを含む、請求項１４７～１４９のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＲＮＡ構築物を含む細胞のパネルを含むスクリーニング方法に関し、特に、排他的ではないが、細胞ベースのスクリーニングプラットフォームにおけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＲＮＡが、薬物いわゆる「創薬不可能な」タンパク質への、及び非コードゲノムを調節するための機構としての両方で、魅力的な標的薬物発見及び開発であることは、十分に確立されている。しかしながら、小分子でＲＮＡを調節する能力は、体系的な方法ではまだ達成されていない。

【0003】

以前の研究は、ＲＮＡが細胞状況内で二次及び三次構造を形成することを実証した。これらのＲＮＡ構造モチーフは、遺伝子発現、ＲＮＡスプライシング、及び翻訳の調節などの多様な範囲の生物学的機能にわたって重要である。これらは、ＲＮＡ－タンパク質相互作用（ＲＮＡがＲＮＡ結合タンパク質と相互作用する）及びＲＮＡ－ＤＮＡ相互作用（ＤＮＡに結合するＲＮＡ）などの他の細胞構成要素との機能的相互作用の結果として、細胞内で機能する。

【0004】

標的毎のスクリーニングアプローチを可能にする、ＲＮＡ構造（例えば、マイクロアレイ、ＡＳＭＳ、Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ）に対して小分子をスクリーニングするためのいくつかの生化学的アッセイが存在する。これらの方法は、大きな化学的ライブラリーがＲＮＡ標的に対してスクリーニングされることを可能にするが、ネイティブ細胞ＲＮＡ機能及び構造はこれらの方法において考慮されないため、細胞状況の欠如は依然として課題である。

【0005】

細胞状況内でＲＮＡ構造に結合する小分子をスクリーニングする細胞システムも、標的毎に開発されている。ネイティブＲＮＡ構造は、細胞状況内で維持されるが、この方法を使用した複数の標的にわたる高スループットスクリーニングは、面倒であり、複数の化学的ライブラリーの構築を必要とする。

【0006】

既存の方法は、単一標的の特定を必要とし、多数のＲＮＡ構造に対する多数の分子の影響を研究することができない。これまで、細胞内状況内でＲＮＡを調節するための化学的又は遺伝的な摂動の効果を研究する能力は、体系的な方法ではまだ達成されていない。

【発明の概要】

【0007】

本発明者らは、インシリコ方法を使用して、ゲノムにおいて多数のＲＮＡ二次構造を特定した。例えば、約４，０００個のＧ－クアドルプレックス構造が特定された。本発明は、第一に、ＵＴＲ内などの、それらの内因性ゲノムコンテキスト内のこれらの構造の機能的性質を可能にし、この機能が、例えば、細胞内でプローブされ、解明されることを可能にする。この形態のスクリーニングは、ネイティブ生物学的状況内で、大規模にＲＮＡ構造への化学的又は遺伝的な摂動の効果の研究を可能にするため、調査のための生物学の新しい分野を開く。第二に、本発明は、これらの新たに特定された構造と相互作用することができる候補薬剤（例えば、治療剤、小分子、更なるＲＮＡ分子）をスクリーニングするための、例えば、これらの二次構造を含む機能的構築物を含有する細胞のライブラリーを使用することによる、手段を提供する。これは、「多重化ＲＮＡ構造小分子スクリーニング」と呼ぶことができる。例えば、小分子の、ＲＮＡ構造モチーフを特異的かつ選択的に結合し、細胞内の生物学的機能を破壊する能力は、以前に古典的創薬によって標的化された、新規生物学を標的とすることを可能にする。

【0008】

したがって、第１の態様では、本発明は、核酸構築物であって、ｉ．）第１のレポーター遺伝子をコードする第１の配列と、ｉｉ．）第２のレポーター遺伝子をコードし、クエリー配列を含む第２の配列と、を含み、クエリー配列は、第２のレポーター遺伝子に作動可能に結合し、クエリー配列は、遺伝子転写物の二次構造及び／若しくはＲＮＡ調節エレメントに折り畳まれたＲＮＡをコードするか、又はそれであり、当該二次構造及び／又は転写物は、第２のレポーター遺伝子の転写物の一部ではない、核酸構築物を提供する。核酸構築物はまた、第１及び第２の配列の発現を駆動することができる１つ以上のプロモーターを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、第２の配列は、クエリー配列に固有のバーコード配列を含む。

【0010】

１つ以上のプロモーター（ｉｉｉ）は、第１の配列の発現を駆動することができる第１のプロモーターと、第２の配列の発現を駆動することができる第２のプロモーターと、を含み得る（第１及び第２のプロモーターは互いに独立して作動することができる）。他の実施形態では、核酸構築物は、第１及び第２の配列の発現を駆動することができる単一プロモーターを含む。単一プロモーターは、双方向プロモーター又は単方向プロモーターであり得る。

【0011】

好ましい実施形態では、クエリー配列は、非翻訳領域（ＵＴＲ）であるＲＮＡ調節エレメントをコードするか、又はそれである。ＵＴＲは、異種遺伝子（すなわち、第２のレポーター遺伝子ではない遺伝子のＵＴＲ）由来である。いくつかの実施形態では、ＵＴＲは、異種遺伝子の５’ＵＴＲである。他の実施形態では、ＵＴＲは、異種遺伝子の３’ＵＴＲである。クエリー配列中のＵＴＲは、ネイティブ遺伝子のＵＴＲ配列に対して変異され得る。例えば、クエリー配列中のＵＴＲは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個以上の一塩基欠失、置換、及び／又は挿入を含み得る。

【0012】

ＵＴＲは、１つ以上のＲＮＡ二次構造、例えば、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）、トリプルヘリックス、シュードノット、ステム－ループ、及び／又はマルチウェイジャンクションを含み得る。ＵＴＲは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。

【0013】

いくつかの実施形態では、クエリー配列は、イントロンであるＲＮＡ調節エレメントをコードするか、又はそれである。

【0014】

いくつかの実施形態では、クエリー配列は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）であるＲＮＡ調節エレメントをコードするか、又はそれである。

【0015】

イントロン又はＩＲＥＳは、１つ以上のＲＮＡ二次構造、例えば、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）、トリプルヘリックス、シュードノット、ステム－ループ、及び／又はマルチウェイジャンクションを含み得る。

【0016】

いくつかの実施形態では、核酸構築物は、第１及び第２のレポーター遺伝子が、それらの間にＩＲＥＳを有して配置される、バイシストロニックレポーターシステムを含む。

【0017】

いくつかの実施形態では、クエリー配列は、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）を含む二次構造をコードするか、又はそれである。いくつかの実施形態では、クエリー配列は、トリプルヘリックスを含む二次構造をコードするか、又はそれである。いくつかの実施形態では、クエリー配列は、シュードノットを含む二次構造をコードするか、又はそれである。いくつかの実施形態では、クエリー配列は、ステム－ループを含む二次構造をコードするか、又はそれである。いくつかの実施形態では、クエリー配列は、マルチウェイジャンクションを含む二次構造をコードするか、又はそれである。

【0018】

クエリー配列は、二次構造に折り畳まれた部分を含む野生型ＲＮＡをコードし得るか、又はそれを含み得る。代替的に、クエリー配列は、変異体ＲＮＡをコードし得るか、又はそれを含み得、変異体ＲＮＡは、二次構造に折り畳まれた部分を含むＲＮＡの野生型配列に対して１つ以上の変異を含む。これらの二次構造は、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）、トリプルヘリックス、シュードノット、ステム－ループ、及び／又はマルチウェイジャンクションを含み得る。いくつかの実施形態では、野生型配列に対する変異は、生物学的疾患状態に関連する変異であることが知られているか、又はその疑いがある。

【0019】

いくつかの実施形態では、クエリー配列は、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスから二次構造に折り畳まれたＲＮＡを含む二次構造をコードするか、又はそれであり、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される。

【0020】

いくつかの実施形態では、クエリー配列は、Ｇ４、シュードノット、ステムループ、トリプルヘリックス、及びマルチウェイジャンクション、又はＵＴＲ又はＩＲＥＳなどの機能単位からなるリストから選択される２つ以上の二次構造をコードするか、又はそれらを含む。２つ以上の二次構造は、ＵＴＲ又はＩＲＥＳなどの機能単位を形成し得る。

【0021】

ステムループは、不対ループで終わるＲＮＡの同じ一本鎖の２つの領域間の塩基対合を含むＲＮＡ構造である。ステムループは、具体的には不対ループが短いとき、ヘアピン又はヘアピンループとしても知られている。

【0022】

いくつかの実施形態では、２つ以上の二次構造は、ＵＴＲなどの機能単位を形成する。例えば、ＵＴＲは、ＩＲＥＳ及び別の二次構造を含み得る。

【0023】

いくつかの実施形態では、第１及び／又は第２のレポーター遺伝子は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、橙色蛍光タンパク質（ＯＦＰ）、及び／又は青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）などの蛍光タンパク質を発現する。他の好適なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼを含む。いくつかの実施形態では、第１及び第２のレポーター遺伝子の一方は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。ＧＦＰは、不安定化ＧＦＰであり得る。同様に、ＲＦＰ、ＹＦＰ、ＯＦＰ、及び／又はＢＦＰは、不安定化され得る。

【0024】

本明細書におけるいくつかの実施形態では、第２のレポーター遺伝子は、「第１のドメイン」と称され得、クエリー配列は、「第２のドメイン」と称され得る。

【0025】

本発明はまた、先行請求項のいずれか一項の核酸構築物を含むベクターを提供する。ベクターは、ＤＮＡ又はＲＮＡを含み得る。ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。これらのベクターのライブラリーも提供される。

【0026】

いくつかの実施形態では、ベクターは、耐性遺伝子などの選択可能なマーカーを含み得る。そのような選択可能なマーカーは、ベクターのクローニング及び選択、並びに／又はベクターを含有する細胞の選択を補助することができる。選択マーカーは、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ネオマイシン、又はブラスチジンであり得る。

【0027】

本発明はまた、本発明の第１の態様による核酸構築物を含む１つ以上の細胞を各々含む多数の細胞集団を含む、細胞のライブラリーであって、１つの単一集団の細胞の各核酸構築物が、互いに同じであるが、異なる集団の細胞の核酸構築物が、互いに異なる、細胞のライブラリーを提供する。いくつかの態様では、細胞のライブラリーは、ＲＮＡ構築物を含む１つ以上の細胞を各々含む多数の細胞集団を含み、１つの単一集団の細胞の各ＲＮＡ構築物は、互いに同じであるが、異なる集団の細胞のＲＮＡ構築物は、互いに異なり、各ＲＮＡ構築物は、レポーター遺伝子を発現することができる発現カセットを含む第１のドメインと、ＲＮＡが二次構造若しくは構造の組み合わせに折り畳まれ、かつ／又はレポーター遺伝子転写物ではない遺伝子転写物のＲＮＡ調節エレメントを含む、第２のドメインと、を含む。

【0028】

第２の態様では、本発明は、各ＲＮＡ構築物が、レポーター遺伝子を発現することができる発現カセットを含む第１のドメインと、ＲＮＡが二次構造に折り畳まれ、かつ／又はレポーター遺伝子転写物ではない遺伝子転写物のＲＮＡ調節エレメントを含む、第２のドメインと、を含む、ＲＮＡ構築物のライブラリーを提供する。

【0029】

第３の態様では、本発明は、本発明の第２の態様によるＲＮＡ構築物のライブラリーを含むか、又はそれをコードするベクターのライブラリーを提供する。ベクターは、ウイルスベクター又は非ウイルスベクターであり得る。ライブラリーのベクターが非ウイルスベクターであるいくつかの実施形態では、それらは、ＲＮＡ構築物を発現するＤＮＡプラスミドを含み得る。ライブラリーのベクターが非ウイルスベクターである他の実施形態では、それらは、ＲＮＡ構築物自体を含み得る。ライブラリーのベクターがウイルスベクターである実施形態では、それらは、レンチウイルスベクター、例えば、組み込みレンチウイルスベクターであり得る。他のウイルスベクターは、本明細書に開示されるように、当業者に周知であり、本発明の作業において用いられ得る。

【0030】

第４の態様では、本発明は、ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造と相互作用する薬剤を選択するために候補薬剤のパネルをスクリーニングする多重化された方法を提供し、方法は、
ａ．第１の態様による細胞のライブラリーを多重化された方法で候補薬剤のパネルと接触させることと、次いで
ｂ．（ａ）レポーター遺伝子発現が平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している細胞集団を特定することと、次いで
ｃ．ステップｂにおいて特定された当該細胞集団と接触していた候補薬剤を選択することと、を含む。

【0031】

第５の態様では、本発明は、ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造の集団をスクリーニングして、それらの機能を評価する方法を提供する。この態様では、方法は、第１の態様による細胞のライブラリーを採取することと、細胞を増殖させることと、各細胞集団におけるレポーター遺伝子の発現レベルを評価することと、を含む。本発明の他の態様の構築物に沿って、１つの単一集団の細胞の各ＲＮＡ構築物は、互いに同じであるが、異なる集団の細胞のＲＮＡ構築物は、互いに異なる。各ＲＮＡ構築物は、レポーター遺伝子を発現することができる発現カセットを含む第１のドメインと、ＲＮＡが二次構造に折り畳まれ、かつ／又はレポーター遺伝子転写物ではない遺伝子転写物のＲＮＡ調節エレメントを含む、第２のドメインと、を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ構築物は、細胞によって安定して発現される。他の実施形態では、ＲＮＡ構築物は、細胞によって一時的に発現される。細胞は、１つ以上のＲＮＡ結合タンパク質をノックアウト、ノックダウン、又はサイレンシングするように遺伝子修飾されていてもよい。細胞は、患者由来細胞であってもよく、又はｉＰＳ由来細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞集団は、単一培養体積内にプールされる。他の実施形態では、各細胞集団は、各他の細胞集団のそれぞれの細胞培養体積とは別の細胞培養体積中にある。

【0033】

本発明のライブラリー（及び方法）において使用される細胞は、真核細胞、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞、細胞株、一次細胞、例えば、健康な個体又は病気の個体から採取されたものであり得る。細胞は、例えば、本明細書に記載されるような、遺伝子ノックアウトなどの更なる遺伝子修飾を含み得る。

【0034】

好ましい実施形態では、各ＲＮＡ構築物は、バーコード配列を含む。各バーコード配列は、各第２のドメインに固有である。よって、バーコードを読み取ること（例えば、配列決定などを介して）は、第２のドメインの種が決定されることを可能にする。

【0035】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ構造の組み合わせは、ｍＲＮＡの翻訳、又はＲＮＡ結合タンパク質への結合を通したｍＲＮＡのスプライシングに影響を及ぼすことができる。ライブラリーは、ＲＮＡ構造の組み合わせを有する野生型ＵＴＲ、及びＲＮＡ構造を破壊する変異を有するＲＮＡ構造を含むＵＴＲ含有の複数のＲＮＡ構築物を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、ＲＮＡ構造における変異を含むＵＴＲ含有ＲＮＡ構築物を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現されるコードＲＮＡ配列又は非コードＲＮＡ配列のクラスからのＵＴＲ構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるＵＴＲ構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0036】

同様に、ライブラリーは、ＲＮＡ構造の組み合わせを有する野生型ステムループ又はマルチウェイジャンクションを含むステムループ又はマルチウェイジャンクション含有の複数のＲＮＡ構築物、及びＲＮＡ構造を破壊する変異を有するＲＮＡ構造を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、ＲＮＡ構造における変異を含むステムループ又はマルチウェイジャンクション含有ＲＮＡ構築物を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現されるコードＲＮＡ配列又は非コードＲＮＡ配列のクラスからのステムループ又はマルチウェイジャンクション構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるステムループ又はマルチウェイジャンクション構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0037】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ構造の組み合わせは、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）などの、機能的ドメインを形成することができる。この第２のドメインは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を集合的に含む二次構造の組み合わせを含み得る。ライブラリーは、野生型ＩＲＥＳ構造を含むＩＲＥＳ含有ＲＮＡ構築物を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、変異体ＩＲＥＳ構造を含むＩＲＥＳ含有ＲＮＡ構築物を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現されるコードＲＮＡ配列又は非コードＲＮＡ配列のクラスからのＩＲＥＳ構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるＩＲＥＳ構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0038】

いくつかの実施形態では、各第２のドメインは、Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）、マルチウェイジャンクションのステムループ、シュードノット、又はそれらの組み合わせを含む二次構造などの、複数のＲＮＡ構造からなる完全調節エレメントを含む。ライブラリーは、野生型Ｇ４、ステムループ、又はマルチウェイジャンクション構造などの野生型構造を含む、マルチウェイジャンクション、又はステムループ、又はＧ４含有ＲＮＡ構築物などの、複数の二次構造を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、変異Ｇ４構造などの二次構造の変異体形態、又はマルチウェイジャンクション若しくはステムループ若しくは他の構造形成を破壊する変異を含む、ステムループ、マルチウェイジャンクション、Ｇ４含有ＲＮＡ構築物などの二次構造を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現されるコードＲＮＡ配列又は非コードＲＮＡ配列のクラスからのＧ４構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるＧ４構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0039】

いくつかの実施形態では、第２のドメインは、トリプルヘリックスを含む二次構造を含み得る。ライブラリーは、野生型トリプルヘリックス構造を含むトリプルヘリックス含有ＲＮＡ構築物を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、トリプルヘリックス構造を破壊することができる変異を含むトリプルヘリックス含有ＲＮＡ構築物を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現される非コードＲＮＡ配列のコードのクラスからのトリプルヘリックス構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるトリプルヘリックス構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0040】

いくつかの実施形態では、第２のドメインは、シュードノットを含む二次構造を含み得る。ライブラリーは、野生型シュードノット構造を含むシュードノット含有ＲＮＡ構築物を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、シュードノット構造を破壊することができる変異を含むシュードノット含有ＲＮＡ構築物を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現されるコードＲＮＡ配列及び／若しくは非コードＲＮＡ配列からのシュードノット構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるシュードノット構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0041】

いくつかの実施形態では、第２のドメインは、ステム－ループを含む二次構造を含み得る。ライブラリーは、野生型ステム－ループ構造を含むステム－ループ含有ＲＮＡ構築物を含み得、ライブラリーの他の細胞集団は、ステム－ループ構造を破壊することができる変異を含むステム－ループ含有ＲＮＡ構築物を含む。細胞におけるＲＮＡ構築物は、目的の生物（例えば、ヒト）によって発現される非コードＲＮＡ配列のクラスからのステム－ループ構造を含むパネルを構成し得、コードＲＮＡ配列又は非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ ＵＴＲ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、及びｃｉｒＲＮＡから選択される。細胞におけるＲＮＡ構築物は、例えば、インシリコ又はインビトロスクリーニングによって定義されるように、目的の生物のゲノムによって発現されるステム－ループ構造の大部分、又は実質的に全て、例えば、これらの構造の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％を含み得る。

【0042】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ構築物の各第２のドメインは、ＲＮＡ調節エレメントを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ調節エレメントは、ｍＲＮＡからの非翻訳領域（ＵＴＲ）又はイントロンである。いくつかの実施形態では、ＵＴＲ又はイントロンは、長非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）又はＲＮＡ結合タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）を結合する結合部位を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ各第２のドメインは、レポーター遺伝子ではない遺伝子の５’ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ各第２のドメインは、レポーター遺伝子ではない遺伝子の３’ＵＴＲを含む。

【0043】

好ましい実施形態では、各第２のドメインは、Ｇ４、ステムループ、マルチウェイジャンクション、又はＩＲＥＳなどの機能構造の構造の組み合わせの両方を含み得る。これらの構造／エレメントは、第２のドメイン／クエリー配列を形成するＵＴＲ構造内に含まれ得る。

【0044】

いくつかの実施形態では、各第１のドメインのレポーター遺伝子は、１つ以上の蛍光タンパク質を発現する。例えば、蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及び／又は赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）であり得る。広範囲のプロモーターは、ＲＮＡ構築物の一部、例えば、ＣＭＶ、ｓｖ４０、ＥＦ１ａ、ＣＡＧ、ＰＫＧ、又はＨ１を形成することができると想定される。プロモーターは、レポーター（例えば、ＧＦＰ及びＲＦＰ）をコードする配列の上流に存在し得る。代替的、双方向プロモーターは、それらの間に配置され得る。ＲＮＡ構築物は、蛍光タンパク質をコードする配列（例えば、ＧＦＰをコードする配列及びＲＦＰをコードする配列）間で、発現カセット内に第２のドメインのＩＲＥＳを含み得る。プロモーターは、ＧＦＰ及びＲＦＰをコードする配列の上流に存在し得る（ＩＲＥＳがそれらの間に配置されている）。代替的、発現カセットは、ＧＦＰのコード配列及びＲＦＰのコード配列、並びにその間にバイシストロニックプロモーターを含み得る。

【0045】

本発明のいくつかの実施形態では、第２のドメインは、各ＲＮＡ構築物の５’末端に配置される。他の実施形態では、第２のドメインは、各ＲＮＡ構築物の３’末端にある。

【0046】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ構造は、レポーター（すなわち、ＧＦＰ）の５’末端に配置される。他の実施形態では、ＲＮＡ構造は、レポーターの３’末端に配置される。

【0047】

好ましい実施形態では、ＲＮＡ構築物は、バーコード配列を含み、ステップｂ．は、レポーター遺伝子発現が、平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、細胞集団のバーコード配列を読み取るサブステップを更に含む。

【0048】

いくつかの実施形態では、ステップｂ．は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、レポーター遺伝子発現が、平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、細胞集団を特定し、レポーター遺伝子発現レベルに従って細胞集団を分離する。

【0049】

いくつかの実施形態では、ステップａ．は、マルチウェルプレートにおいて細胞のライブラリーを候補薬剤のパネルと接触させることによって行われる。他の実施形態では、ステップａ．は、高スループット液滴マイクロ流体システムを介して細胞のライブラリーを候補薬剤のパネルと接触させることによって行われる。

【0050】

いくつかの実施形態では、候補薬剤は、小分子である。他の実施形態では、候補薬剤は、ＲＮＡ分子、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｌｎｃＲＮＡである。候補薬剤が、タンパク質、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、イントラボディなどである、等価方法も想定される。

【0051】

いくつかの実施形態では、候補薬剤は、疾患を有する患者由来のｉＰＳ由来細胞株などの患者由来試料に導入された遺伝的摂動である。他の実施形態では、候補薬剤は、ＲＮＡ分子、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｌｎｃＲＮＡである。候補薬剤が、タンパク質、例えば、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）、イントラボディなどである、等価方法も想定される。

【0052】

いくつかの実施形態では、スクリーニング方法は、いくつかの細胞集団を標的とするが、他の細胞集団を標的としない薬剤（例えば、化学物質）又は遺伝的摂動のスクリーニングを伴う。細胞集団は、標的化が望まれるエレメント（例えば、がん関連遺伝子におけるＲＮＡ二次構造）を含むＲＮＡ構築物を含有するものと、標的化が望まれないエレメント（例えば、非がん関連遺伝子由来のＲＮＡ二次構造）を含むＲＮＡ構築物を含有するものと、に群化することができる。よって、我々は、例として、ＭＹＣ、ＲＡＳ、ＶＥＧＦ、及び／又はＫＲＡＳなどの、がん関連遺伝子のｍＲＮＡ中に存在する、複数のＧ４、ステムループ、又はマルチウェイジャンクション構造などの、複数のＲＮＡ構造と相互作用する薬剤をスクリーニングする方法を提供する。小分子、ＲＮＡ分子、イントラボディなどは、ＲＮＡ二次構造のこれらのサブセットを同時に結合して、複数の生物学的プロセスを標的とするように操作し、本発明を使用してスクリーニング及び検証することができる。

【0053】

これらの方法は、既知の及び／又は新しい薬剤が、ＲＮＡ標的化作用様式を示すものとして特定されることを可能にする。

【0054】

更なる態様では、本発明は、本明細書に記載されるベクターのライブラリーで細胞の集団をトランスフェクト又は形質導入することによって、細胞のライブラリーを生成する方法を提供する。細胞は、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞であり得る。細胞は、幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ＩＰＳ細胞）であり得る。細胞は、腫瘍細胞であり得る。細胞は、組織試料由来であり得る。細胞は、哺乳動物対象、例えば、ヒト対象からの生検由来であり得る。

【0055】

更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造と相互作用する薬剤を選択するために候補薬剤のパネルをスクリーニングする多重化された方法を提供し、方法は、ａ．多重化された方法で細胞のライブラリーを候補薬剤のパネルと接触させることと、次いで、ｂ．レポーター遺伝子発現が平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、１つ以上の細胞集団を特定することと、次いで、ｃ．ステップｂにおいて特定された当該細胞集団と接触していた候補薬剤を選択することと、を含む。

【0056】

ＲＮＡ構築物は、バーコード配列を含み得、ステップｂ．は、レポーター遺伝子発現が、平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、細胞集団のいずれかのバーコード配列を読み取ることを更に含み得る。

【0057】

ステップａ．は、マルチウェルプレートにおいて細胞のライブラリーを候補薬剤のパネルと接触させることによって、又は高スループット液滴マイクロ流体システムを介して細胞のライブラリーを候補薬剤のパネルと接触させることによって行われ得る。いくつかの実施形態では、候補薬剤は、小分子、又はｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、若しくはｌｎｃＲＮＡなどのＲＮＡ分子である。

【0058】

ステップｂ．は、レポーター遺伝子発現が、平均レポーター遺伝子発現に対して増加又は減少している、細胞集団を特定するため、及びレポーター遺伝子発現レベルに従って細胞集団を分離するため、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いてもよい。

【0059】

更なる態様では、本発明は、ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造の集団を、当該エレメント／構造の機能を評価するためにスクリーニングする方法を提供し、方法は、細胞のライブラリーを提供することと、細胞を増殖させることと、各細胞集団におけるレポーター遺伝子の発現レベルを評価することと、を含む。各ＲＮＡ調節エレメントは、ＵＴＲであり得る。各ＲＮＡ二次構造は、Ｇ４であり得る。ＲＮＡ構築物は、目的の生物のゲノムによって発現される全てのＧ４構造を含み得る。ＲＮＡ構築物は、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのＧ４構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される。各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含み得る。ＲＮＡ構築物は、目的の生物のゲノムによって発現される全てのＩＲＥＳ構造を含み得る。ＲＮＡ構築物は、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのＩＲＥＳ構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される。各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造は、トリプルヘリックスを含む。ＲＮＡ構築物は、目的の生物のゲノムによって発現される全てのトリプルヘリックス構造を含み得る。ＲＮＡ構築物は、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのトリプルヘリックス構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される。各ＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造は、シュードノットを含む。ＲＮＡ構築物は、目的の生物のゲノムによって発現される全てのシュードノット構造を含む。ＲＮＡ構築物は、目的の生物によって発現されるコードＲＮＡ配列若しくは非コードＲＮＡ配列のクラスからのシュードノット構造を含むパネルを構成し得、非コードＲＮＡ配列のクラスは、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉｒｏＲＮＡ、又はｃｉｒＲＮＡのイントロン若しくはＵＴＲから選択される。

【0060】

いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のＲＮＡ結合タンパク質をノックアウト、ノックダウン、又はサイレンシングするように遺伝子修飾されている。

【0061】

更なる態様では、本発明は、疾患状態に関連する遺伝的摂動を特定する方法を提供し、方法は、本発明の核酸構築物を含む細胞のライブラリーを提供することであって、細胞の第１の亜集団が、特定の疾患を有する１つ以上の対象由来のＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造を含み、細胞の第２の亜集団が、特定の疾患を有しない１つ以上の対象由来のＲＮＡ調節エレメント及び／又は二次構造を含む、提供することと、第１及び第２の亜集団における相対レポーター遺伝子発現レベルを比較することと、を含む。

【0062】

更なる態様では、本発明は、疾患状態に関連する化学的摂動を特定する方法を提供し、方法は、本発明の核酸構築物を含む細胞のライブラリーを提供し、細胞の第１の亜集団を１つ以上の化学剤と接触させることと、第１の亜集団における相対レポーター遺伝子発現レベルを、１つ以上の化学剤、例えば、小分子、既知の治療剤、及び／又は更なるＲＮＡ分子と接触していない第２の亜集団の相対レポーター遺伝子発現レベルと比較することと、を含む。

【0063】

更なる態様では、本発明は、細胞ネットワーク又は生物学的表現型若しくは回路を作製する方法を提供し、方法は、（ａ）複数の細胞における各細胞が少なくとも１つの摂動を受ける、本発明の核酸構築物を含む細胞のライブラリーにおけるクエリー配列に少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ以上の一次又はコンビナトリアル遺伝的摂動を導入することと、（ｂ）（ｉ）いずれの摂動も受けなかった１つ以上の細胞と比較した単一細胞におけるゲノム、遺伝的、プロテオミック、エピジェネティック、及び／又は表現型の違いを検出することと、（ｉｉ）単一細胞における摂動を検出することと、を含む、測定プロセスと、（ｃ）測定された違いに共変量を説明するモデルを適用することによって摂動に関連する測定された違いを決定することと、を含み、それによって、細胞間及び／又は細胞内ネットワーク又は回路が推測される。測定プロセス（ｂ）は、核酸構築物中に存在し得るバーコード配列を単一細胞配列決定すること及び／又は読み取ることを含み得る。モデルは、測定されたシグナルの捕捉率、摂動が実際に細胞を摂動させたか（表現型の影響）、異なる細胞若しくは細胞状態のいずれかの亜集団の存在、及び／又はいずれの摂動も伴わない一致した細胞の分析を説明し得る。

【0064】

本発明は、そのような組み合わせが明らかに許容されないか、又は明示的に回避される場合を除き、記載される態様及び好ましい特徴の組み合わせを含む。

【図面の簡単な説明】

【0065】

ここで、本発明の原理を例示する実施形態及び実験を、添付の図面を参照して考察する。

【0066】

【図1】ＲＮＡ構造の機能を調査するために利用されるレポーター構築物の３つの図表示を示す。図１Ａにおいて、ＲＮＡ構造又はその変異バージョンの配列は、ｄ２ＥＧＦＰのすぐ上流にクローニングされる。ｍＣｈｅｒｒｙは、それ自体のプロモーターによって発現され、内部対照として機能する。調査されている異なるＲＮＡ構造を表す、各レポーターは、ＥＦ１ａプロモーターのすぐ下流にクローニングされた固有のバーコードを含有する。図１Ｂにおいて、ＲＮＡ構造は、ｄ２ＥＧＦＰのすぐ下流にクローニングされる。調査されている異なるＲＮＡ構造を表す、各レポーターは、ＥＦ１ａプロモーターの下流にクローニングされた固有のバーコードを含有する。図１Ｃにおいて、バイシストロニックレポーターシステムが表される。ＥＦ１ａプロモーターは、ＩＲＥＳに隣接する２つのレポーター遺伝子（ｄ２ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙ）の上流にある。ヘアピンを形成するであろう配列は、リボソームのリードスルーを防止するように機能するｄ２ＧＦＰのすぐ下流にクローニングされる。調査されている異なるＩＲＥＳエレメントを表す、各レポーターは、ＩＲＥＳのすぐ上流にクローニングされた固有のバーコードを含有する。ピューロマイシンは、それ自体のプロモーターｈＰＧＫによって発現され、内部制御として機能する。

【図2】アッセイワークフローの一般的な概要を示す。異なるＲＮＡ構造を有する複数のレポーターがまず生成され、レンチウイルスにパッケージングされる。レンチウイルスがプールされ、プールのＭＯＩが決定される。細胞は、低ＭＯＩで感染させて、細胞当たりの単一レポーター組み込みを確実にする。未処理の、又はＲＮＡ構造を調節する小分子で処理された、感染細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ発現に基づいてＦＡＣＳ選別される。次いで、選別された集団は、バーコード及びＮＧＳのＰＣＲ増幅に供される。

【図3】アンプリコン配列決定戦略の例を示す。（Ａ）ユニバーサルフォワードプライマー及びリバースプライマーを、固有のバーコードに隣接する定常領域において設計して、２００～２５０ｎｔのアンプリコン生成物を得た。（Ｂ）２段階ＰＣＲ戦略が採用され、１．埋め込まれたバーコードを有する領域は、記載されるプライマーを用いてｇＤＮＡから増幅される。２．フォワードプライマー及びリバースプライマーは、第１のＰＣＲの生成物上にアニーリングされる。フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方は、固有の試料指標を有する。（Ｃ）ｇＤＮＡは、レポーターで感染させた細胞プールから単離し、バーコード領域は、ＰＣＲを用いて増幅した。ＰＣＲ生成物は、Ａｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで分析され、適切なインサートサイズを明らかにする。異なる実施形態では、プライマーは、ｄ２ＥＧＦＰの３′ＵＴＲにおいてクローニングされた構造のバーコードを増幅するように設計した。

【図4】Ｇクアドルプレックス（Ｇ４）である、例示的な標的ＬＴＸ０３２のための例示的なフローサイトメトリー分析ワークフローを示す。（Ａ）レポーターレンチベクターで感染させた細胞におけるＧＦＰ発現を調べるために用いられる典型的なフローサイトメトリーゲーティング戦略。ゲートは、単一の生細胞を特定するように設定した。次いで、ＧＦＰ発現は、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞において定量化した。（Ｂ）３つの異なるレポーター構築物で感染させた細胞におけるＧＦＰ発現を表すヒストグラム、１．５’ＵＴＲ空ベクター、２．５’ＵＴＲにクローニングされたＬＴＸ０３２（ＲＮＡ構造）、３．レポーターの上流のカセットにクローニングされたＬＴＸ０３２ｓｃ（同じＲＮＡ構造の変異バージョン）。

【図5】レポーターアッセイにおいてＲＮＡ構造機能性を試験する例を示す。細胞プールを、一定のＭＯＩで個々のレポーター構築物で感染させた。それぞれｍＣｈｅｒｒｙ％細胞及びｍＣｈｅｒｒｙ ＭＦＩによって決定される、感染効率及びｍＣｈｅｒｒｙ発現レベルは、感染細胞集団にわたって一定であった。変異した対照及び空ベクターに対して、野生型ＲＮＡ構造を含有するレポーターで感染させた細胞プールにおけるＧＦＰ発現の低減が観察された。これは、この例示的なＲＮＡ構造が、ＧＦＰの翻訳を抑制することにおいて機能的であることを示す。

【図6】プールされたレンチウイルスアプローチの例を示す。野生型ＲＮＡ構造及びそれらの変異体バージョン並びに空ベクターを含む、１０レポーターのレンチウイルスを手動でプールし、プールのＭＯＩを決定した。（Ａ）細胞をレンチウイルスプールで感染させ、フローサイトメトリー分析に供した。ゲートは、単一の生細胞を特定するように設定した。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞においてＧＦＰ発現分布を定量化した。細胞をそれらのＧＦＰ発現に基づいて選別した。選別された細胞集団を、図３に記載されるように、ユニバーサルプライマーを利用してバーコードのｇＤＮＡ抽出及びＰＣＲ増幅に供した。増幅された生成物をＮＧＳに供した。（Ｂ）レポーターをそれらのバーコードに基づいてデコンボリューションし、倍率変化をＧＦＰ低／ＧＦＰ低細胞間で計算した。

【発明を実施するための形態】

【0067】

ここで、本発明の態様及び実施形態を、添付の図面を参照して考察する。更なる態様及び実施形態は、当業者には明らかであろう。本文で言及される全ての文書は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0068】

本明細書では、我々は、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）などの機能的エレメントにおける特定のＲＮＡ構造クラス内の複数のＲＮＡ構造（例えば、Ｇ－クアドルプレックス、トリプルヘリックス、シュードノット、マルチウェイジャンクション、又はそれらの組み合わせに対して遺伝的又は化学的なライブラリーのスクリーニングを可能にする細胞スクリーニングプラットフォームについて記載する。

【0069】

ベクターは、真核細胞においてＲＮＡ構造を発現するために使用され得る。使用され得るベクターとしては、ウイルスベクター、プラスミド、コスミド、及び人工染色体が挙げられる。使用され得るウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、及びアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が挙げられる。レトロウイルスベクターとしては、レンチウイルスベクターが挙げられる。本発明のベクターは、安定してトランスフェクトされた細胞又は一時的にトランスフェクトされた細胞をもたらし得る。

【0070】

一実施形態では、ＲＮＡ構造モチーフの遺伝的摂動は、レポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態では、このレポーター遺伝子は、１つ以上の蛍光タンパク質を発現する。レポーター遺伝子の改変された発現は、改変された蛍光読み出しをもたらし、この蛍光読み出しは、細胞選別機構を使用して細胞を分離するために使用される。各カテゴリー内の細胞は、次いで選別され、ＲＮＡ構築物上のＤＮＡバーコードは、各プール内の細胞を配列決定して、各カテゴリー内の元の構築物の容易なマッピングを可能にするために、次いで使用される。

【0071】

一実施形態では、ＲＮＡ構造モチーフへの小分子の結合は、レポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすことができる。いくつかの実施形態では、このレポーター遺伝子は、１つ以上の蛍光タンパク質を発現する。レポーター遺伝子の改変された発現は、改変された蛍光読み出しをもたらし、この蛍光読み出しは、細胞選別機構を使用して細胞を分離するために使用される。各カテゴリー内の細胞は、次いで選別され、ＲＮＡ構築物上のＤＮＡバーコードは、各プール内の細胞を配列決定して、各カテゴリー内の元の構築物の容易なマッピングを可能にするために、次いで使用される。

【0072】

よって、ＩＲＥＳエレメント（内部リボソーム侵入部位）などの機能構造を形成することができる、Ｇ－クアドルプレックス、トリプルヘリックス、シュードノット、及びマルチウェイジャンクション、又はそれらの組み合わせなどのいくつかの異なる機能的ＲＮＡ構造は、調査の対象である。このアプローチは、並列した複数の遺伝的摂動の効果又は並列した複数の類似ＲＮＡ構造に対する化合物セットの効果の研究を可能にする。このアプローチは、我々が遺伝的変異又は化学的摂動の効果を大規模に特定することを可能にする。これは、一般的なＲＮＡモチーフ結合剤及び特定のＲＮＡ構造に特異的に結合する結合剤が互いに区別されることを可能にするであろう。更に、このアプローチはまた、医化学キャンペーンに適用することができ、科学文献からの化合物をスクリーニングし、Ｇ－クアドルプレックス、ステムループ、又はマルチウェイジャンクションなどの、所与のＲＮＡ構造クラスにわたる特異性及び選択性に対する化学修飾の影響を研究することができる。これらの組み合わせは、内部リボソーム侵入部位などの機能的エレメント、又はＨＮＲＮＰなどのＲＮＡ結合タンパク質のスプライシング部位のための結合部位を形成することができる。

【0073】

キナーゼパネルと同様に、Ｇ－クアドルプレックスなどの、ＲＮＡパネル、又はＩＲＥＳパネルが組み立てられ得る。これらのタイプのＲＮＡ二次構造は、以下のセクションにおいて簡潔に考察される。

【0074】

Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）
Ｇ－クアドルプレックス（Ｇ４）は、同じ又は異なる鎖上のいずれかで、グアニン塩基の会合によって形成される、核酸三次構造である。４つのグアニン塩基は、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ水素結合によって相互作用して、グアニンテトラッド（Ｇ－テトラッド）、他のＧ－テトラッドと水素結合することができる正方形平面構造を形成して、Ｇ－クアドルプレックスを形成する。Ｇ４は、転写調節、テロメア長調節、及び免疫グロブリン重鎖スイッチングなどの、広範な生物学的機能に関与すると考えられる。

【0075】

内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳは、キャップ非依存的な様式で翻訳開始を誘発することによって代替翻訳を調整するＲＮＡエレメントである。ＩＲＥＳは、ＲＮＡにおける５’ＵＴＲ又は他の場所に位置し得る。哺乳動物ｍＲＮＡの１０％は、代替的な翻訳に使用することができるＩＲＥＳエレメントを有する。ＩＲＥＳの構造は、リボソームがその二次又は三次構造に結合することによってＩＲＥＳにリクルートされるため、それらの機能にとって重要である。

【0076】

デュアルプロモーターレポーターシステム
ＲＮＡ構造の翻訳制御は、デュアルプロモーターレポーターシステムを使用して測定することができる。このレポーターは、ＯＲＦの５’又は３’末端に局在するＲＮＡ構造を含む。ＯＲＦは、ホタルルシフェラーゼ又はＧＦＰなどの、レポーター遺伝子をコードする。次いで、ＯＲＦの翻訳は、このＲＮＡ構造によって調節される。構造が翻訳を抑制するように機能する場合、蛍光シグナルの喪失が予想される。逆に、構造が翻訳を増強するように機能する場合、蛍光シグナルの獲得が予想される。第２のプロモーターは、第２のＯＲＦの発現を駆動するために含まれる。第２のＯＲＦは、内部対照として機能する、ＲＦＰ及びレニラルシフェラーゼなどの、異なるレポーター遺伝子をコードする。

【0077】

バイシストロニックレポーターシステム
ＩＲＥＳ活性は、バイシストロニックレポーターシステムによって測定することができる。これは、ＩＲＥＳに隣接する２つの完全オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の上流にプロモーターを有するｍＲＮＡを含む。各ＯＲＦは、ＧＦＰ又はホタルルシフェラーゼなどの、レポーター遺伝子をコードする。ｍＲＮＡの転写時に、ＩＲＥＳの上流のＯＲＦは、キャップ依存的な様式で翻訳され、一方ＩＲＥＳの下流のＯＲＦは、キャップ非依存的な様式で翻訳され、ＩＲＥＳによって開始される。

【0078】

それらの特定の形態で、又は開示される機能を行うための手段、又は必要に応じて、開示される結果を得るための方法若しくはプロセスの観点で表される、前述の記載において、又は以下の特許請求の範囲において、又は添付の図面において開示される特徴は、個別に、又はそのような特徴の任意の組み合わせで、その多様な形態で本発明を実現するために利用され得る。

【0079】

本発明は、上記に記載される例示的な実施形態と併せて記載されているが、多くの等価修飾及び変形は、本開示が与えられるとき当業者には明らかになるであろう。したがって、上記に記載される本発明の例示的な実施形態は、限定するものではなく、例示的であるとみなされる。記載される実施形態への様々な変更が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得る。

【0080】

任意の疑義の回避のために、本明細書で提供される任意の理論的説明は、読者の理解を改善する目的で提供される。本発明者らは、これらの理論的説明のいずれによっても拘束されることを望まない。

【0081】

本明細書で使用される任意のセクション見出しは、構成上の目的のためだけのものであり、記載される主題を限定するものと解釈されるべきではない。

【0082】

文脈が別段に必要としない限り、以下の特許請求の範囲を含む、本明細書全体を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という語、並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、及び「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、述べられた整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群の包含を意味するが、任意の他の整数若しくはステップ、又は整数若しくはステップの群の除外を意味するものではないことが理解されるであろう。

【0083】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別様に示さない限り、複数参照を含むことに留意する必要がある。本明細書では、範囲は、「約」ある特定の値から、及び／又は「約」別の特定の値まで、のように表現され得る。そのような範囲が表現される場合、別の実施形態は、そのある特定の値から、及び／又はその他の特定の値まで、を含む。同様に、値が近似値として表現される場合、先行詞の「約」を使用することによって、特定の値は別の実施形態を形成することが理解されよう。数値に関連する「約」という用語は、任意であり、例えば、＋／－１０％を意味する。

【0084】

定義
本明細書において、「作動可能に結合した」という用語は、選択されたヌクレオチド配列及び調節ヌクレオチド配列が、ヌクレオチドコード配列の発現を調節配列の影響又は制御下に置くような方法で共有結合している状況を含み得る。よって、調節配列が、選択されたヌクレオチド配列の一部又は全部を形成するヌクレオチドコード配列の転写に影響を及ぼすことができる場合、調節配列は、選択されたヌクレオチド配列に作動可能に結合している。必要に応じて、得られた転写物は、次いで、所望のタンパク質又はポリペプチドに翻訳され得る。

【0085】

本発明による方法は、インビトロ、エクスビボ、若しくはインビボで実施され得るか、又は生成物は、インビトロ、エクスビボ、若しくはインビボで存在し得る。「インビトロ」という用語は、実験室条件における又は培養における材料、生物学的物質、細胞、及び／又は組織での実験を包含することを意図しており、「インビボ」という用語は、無傷の多細胞生物での実験及び手順を包含することを意図している。「エクスビボ」は、有機物の外側、例えば、ヒト又は動物の体の外側に存在するか、又は発生するものを指し、これは、有機物から採取された組織（例えば、全臓器）又は細胞上にあり得る。

【0086】

方法がインビトロで実施される場合、それは、高スループットスクリーニングアッセイを含み得る。方法において使用される試験化合物は、合成コンビナトリアルペプチドライブラリーから得られ得るか、又は合成ペプチド若しくはペプチド模倣分子であり得る。他の試験化合物は、定義された化学物質、オリゴヌクレオチド、又は核酸リガンドを含み得る。

【実施例】

【0087】

実施例１
ＲＮＡ構造の機能調査のための高スループット試験に適したレポーターの設計
レンチベクター骨格を、以下の特徴：不安定化ＧＦＰ（ｄ２ＥＧＦＰ）、トランスフェクションの内部対照として機能するｍＣｈｅｒｒｙ：ピューロマイシン融合生成物、及びバーコードを含むように修飾した。このレポーターでは、ＥＦ１ａプロモーターは、ｄ２ＧＦＰの発現を駆動する。野生型又は変異体のいずれかの、ＲＮＡ構造を有するこのインサートを、レンチベクターにおけるｄ２ＥＧＦＰのＵＴＲにクローニングして、ｄ２ＥＧＦＰの翻訳に対するその機能的効果を研究した。ここで、ｍＣｈｅｒｒｙは、ＣＭＶプロモーターの制御下で独立して発現され、内部制御として機能する。調査された各ＲＮＡ構造について、ＲＮＡ構造の変異バージョンを含有するレンチベクターも生成した。レンチベクターをパッケージングし、レンチウイルス力価をｐ２４ ＥＬＩＳＡ法を用いて測定した。

【0088】

実施例２
レポーターシステムを使用したＲＮＡ構造の機能評価
まずレンチウイルス感染を最適化した。ウェル当たり４，０００個の細胞を、３つの異なるＭＯＩ（３、１０、３０）で感染させた。感染は、ポリブレン（２、４、又は８ｕｇ／ｍＬ）の有無、かつスピンフェクション（９００ｇ、１時間）の有無にかかわらず行った。蛍光を、感染から４８時間後の様々な感染条件において、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して評価した。スピンフェクションと組み合わせた８ｕｇ／ｍＬのポリブレンは、最も高い感染率をもたらしたが、感染は、ポリブレン又はスピンフェクションの非存在下で効率的であった。感染、ポリブレン、又はスピンフェクションによる細胞増殖に対する有意な効果は観察されなかった。蛍光タンパク質の発現ダイナミクスを評価するために、細胞を、上記のように感染させ、蛍光を、ＩｎｃｕＣｙｔｅを使用して監視した。ｄ２ＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの両方は、感染後１６～２０時間の間に検出可能になった。ｄ２ＧＦＰシグナルは、不安定化された性質のために３２～３６時間後にプラトーに到達した。

【0089】

ウェル当たり２００，０００個の細胞（６ウェルフォーマット）を、ポリブレン、又はスピンフェクションなしで、１のＭＯＩで感染させた。ウイルス含有培地を１８時間後に除去し、新鮮培地によって置き換えた。細胞を更に２４時間培養した。感染から４２時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、分離し、生存率染色のために９６ウェルフォーマットに移した。細胞をＺｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ Ｆｉｘａｂｌｅ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ色素で染色した。Ｚｏｍｂｉｅ Ｖｉｏｌｅｔ色素をＰＢＳ（１８ｍｌ＋１８μｌ ＺｏＶｉ）中で１：１０００で希釈し、１００ｕＬを各ウェルに添加した。細胞溶液を暗所で２０分間室温でインキュベートした。細胞をスピンダウンし、上清を除去した。細胞を１５０μｌ ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ’ｓ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号４２０２０１）で１回洗浄し、上清をスピンダウン後に除去した。１００ｕＬの４％ＰＦＡ溶液を各ウェルに添加し、クラスタリングを回避するために直ちに混合した。細胞を暗所で２０分間、室温で固定した。スピンダウン後、細胞を１００ｕＬのＰＢＳで洗浄した。染色及び固定された細胞を、ＦＡＣＳＪａｚｚ器具での獲得まで、４℃の暗所で保存した。

【0090】

実施例３
プールされたレンチウイルス形質導入
レンチウイルスプールを、ＷＴ、ＭＵＴ、又は対照レンチベクターのいずれかを含有する１０個のレンチウイルスをプールすることによって生成した。プールの力価は、３，４ｘ１０＾８ＴＵ／ｍｌであると決定した。２０００万個の細胞を、ＦＡＣＳを用いて分析した。プールの感染率は、２９．２％であると決定した。「ＧＦＰ高」カテゴリー（上位２５％）中の１００，０００個の細胞及び「ＧＦＰ低」カテゴリー（下位２５％）中の７２，０００個の細胞を細胞選別後に得た。

【0091】

実施例４
ｇＤＮＡ単離、ＰＣＲ、及び配列決定
ＤＮＡ単離を、ＧｅｎｅＲｅａｄ ＦＦＰＥキットを使用して行った。合計３４４．ｎｇのＤＮＡを「ＧＦＰ高」選別集団から単離し、３０５．１２ｎｇを「ＧＦＰ低」選別集団から単離した。１００ｎｇの投入材料をＰＣＲ反応に使用した。２００ｎｔアンプリコンが生成されるように、２１ｎｔの長さのフォワード及びリバースプライマーを、バーコード領域を増幅するように設計した。プライマーのＴｍは６１度であり、ＧＣ含有量は５７％であった。次いで、フォワードプライマー及びリバースプライマーを第１のＰＣＲ反応の生成物上にアニーリングした。フォワードプライマー及びリバースプライマーの両方は、固有の試料指標を有する。ＰＣＲ生成物をＡｇｉｌｅｎｔ ＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで分析した。

【0092】

参考文献
本発明及び本発明が関連する最新技術をより完全に記載及び開示するために、いくつかの刊行物が上記に引用されている。これらの参考文献の完全な引用は、以下に提供される。これらの参考文献の各々の全体が本明細書に組み込まれる。
Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ａ Ｓｃａｌａｂｌｅ，Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｃｏｄｉｎｇ ＧＰＣＲ－Ｌｉｇａｎｄ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈ ＲＮＡ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”，２０１９，Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ８，２５４－２６０
ＥＰ３６４９２３６Ａ１，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｌｉｇａｎｄ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｓ”（Ｋｏｓｕｒｉ＆Ｊｏｎｅｓ）
Ｄｉｘｉｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｐｅｒｔｕｒｂ－ｓｅｑ：Ｄｉｓｓｅｃｔｉｎｇ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｉｒｃｕｉｔｓ ｗｉｔｈ ｓｃａｌａｂｌｅ ｓｉｎｇｌｅ ｃｅｌｌ ＲＮＡ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｐｏｏｌｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ”Ｃｅｌｌ．２０１６；１６７（７）：１８５３－１８６６．ｅ１７．
ＷＯ２０１７／０７５２９４，“Ａｓｓａｙｓ Ｆｏｒ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ Ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃｉｒｃｕｉｔ Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”（Ｒｅｇｅｖ ｅｔ ａｌ．）
Ｒｉｚｖｉ ｅｔ ａｌ．，“ＲＮＡ－ＡＬＩＳ：Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ ｆｏｒ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｓｏｌｕｂｌｅ ＲＮＡｓ ａｓ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｕｓｉｎｇ ＡＬＩＳ ａｆｆｉｎｉｔｙ－ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ”，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１９；１６７：２８－３８
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Ｐｅｄｒａｍ Ｆａｔｅｍｉ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｆｏｒ Ｓｍａｌｌ－Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｏｆ Ｌｏｎｇ Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ”，Ｊ Ｂｉｏｍｏｌ Ｓｃｒｅｅｎ．２０１５ Ｏｃｔ；２０（９）：１１３２－４１
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Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，“ＩＲＥＳ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｃａｐ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ，ａ ｐａｔｈ ｌｅａｄｉｎｇ ｔｏ ｈｉｄｄｅｎ ｐｒｏｔｅｏｍｅ”，Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２０１９ Ｏｃｔ ２５；１１（１０）：９１１－９１９
Ｈｅｊａｚｉ Ｐａｓｔｏｒ，“Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｔｈｅ ＣＡＣＮＡ１Ａ ＩＲＥＳ ａｓ ａ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｆｏｒ Ｓｐｉｎｏｃｅｒｅｂｅｌｌａｒ Ａｔａｘｉａ Ｔｙｐｅ６”，Ｃｅｒｅｂｅｌｌｕｍ．２０１８ Ｆｅｂ；１７（１）：７２－７７
Ｖａｋｌａｖａｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ ＩＲＥＳ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１５；１６（１０）：１４７１－８５
標準的な分子生物学的手法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｒｕｓｓｅｌ，Ｄ．Ｗ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．３ ｅｄ．２００１，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓを参照されたい。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図5】

【図6A】

【図6B】

【国際調査報告】