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特表2024-509507ヒトパピローマウイルス関連癌の管理のための組成物及び方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-04
(54)【発明の名称】ヒトパピローマウイルス関連癌の管理のための組成物及び方法
(51)【国際特許分類】
A61K 31/352 20060101AFI20240226BHJP
A61K 33/243 20190101ALI20240226BHJP
A61K 31/704 20060101ALI20240226BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240226BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240226BHJP
【ＦＩ】
A61K31/352
A61K33/243
A61K31/704
A61K39/395 N
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549859
(86)(22)【出願日】2022-02-17
(85)【翻訳文提出日】2023-10-16
(86)【国際出願番号】 US2022070714
(87)【国際公開番号】W WO2022178527
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】63/200,156
(32)【優先日】2021-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519222933
【氏名又は名称】ロマ リンダ ユニヴァーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】デュルクセン－ヒューズ ペネロペ ジェイ
(72)【発明者】
【氏名】チツィケ レノックス
【テーマコード（参考）】
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C085AA14
4C085BB01
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C086CA01
4C086EA10
4C086HA12
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086NA05
4C086NA14
4C086ZB26
(57)【要約】
ここに提供されるのは、ヒトパピローマウイルス関連癌の管理のための組成物及び方法である。被験者においてヒトパピローマウイルス関連癌を治療するためのこのような方法の１つは、治療上有効量のガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を、被験者に投与することを含む。これらの方法は、また、放射線又は化学療法剤のうちの１つ以上を投与することを含み得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
被験者においてヒトパピローマウイルス関連癌を治療する方法であって、治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を、被験者に投与することを含む、方法。
【請求項2】
前記ヒトパピローマウイルス関連癌が、子宮頸癌、中咽頭癌、肛門癌、陰茎癌、膣癌、又は外陰癌のうちの１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ヒトパピローマウイルス関連癌が、頭頸部扁平上皮癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
治療上有効量のアポトーシス活性化学療法剤を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、及びドキソルビシンのうち１つ以上を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与の前に、治療上有効量の放射線を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与の後に、治療上有効量の放射線を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
治療上有効量のアポトーシス活性化学療法剤を、被験者に投与することをさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項9】
治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、及びドキソルビシンのうちの１つ以上を、被験者に投与することをさらに含む、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項10】
被験者においてヒトパピローマウイルス関連癌を治療する方法であって、治療上有効量の３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を、被験者に投与することを含む、方法。
【請求項11】
前記ヒトパピローマウイルス関連癌が、子宮頸癌、中咽頭癌、肛門癌、陰茎癌、膣癌、又は外陰癌のうちの１つである、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ヒトパピローマウイルス関連癌が、頭頸部扁平上皮癌である、請求項１０に記載の方法。
【請求項13】
治療上有効量のアポトーシス活性化学療法剤を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、及びドキソルビシンのうち１つ以上を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記治療上有効量の３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与の前に、治療上有効量の放射線を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記治療上有効量の３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与の後に、治療上有効量の放射線を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
治療上有効量のアポトーシス活性化学療法剤を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項18】
治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、及びドキソルビシンのうちの１つ以上を、被験者に投与することをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２０２１年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２００，１５６号の利益及び優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年２月１７日に出願された米国仮特許出願第６３／２００，１５６号の利益及び優先権を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（政府の支援）
本発明は、米国国立衛生研究所の国立一般医科学研究所から授与された助成金番号Ｐ２０ＧＭ１１３１１７、及び米国国立衛生研究所の国立神経疾患・脳卒中研究所から授与された助成金番号Ｒ２１ＮＳ７３０５９に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は、米国国立衛生研究所の国立一般医科学研究所から授与された助成金番号Ｐ２０ＧＭ１１３１１７、及び米国国立衛生研究所の国立神経疾患・脳卒中研究所から授与された助成金番号Ｒ２１ＮＳ７３０５９に基づく政府の支援を受けて行われた。政府は本発明について一定の権利を有する。
【0003】
本開示は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連癌の管理ための組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【0004】
高リスクＨＰＶは、特に子宮頸部、中咽頭、肛門、陰茎、膣、及び外陰においてをいくつかのタイプの癌を引き起こす。ＨＰＶ関連癌は、子宮頸癌、中咽頭癌、肛門癌、陰茎癌、膣癌、及び外陰癌を含む。ＨＰＶは、これらの臓器の内面を覆う扁平上皮細胞に感染し、従って扁平上皮癌を引き起こす。
【0005】
頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）は、上気道に発生する異質な腫瘍であり、及び発生率では世界で６番目に多い癌である。ＨＮＳＣＣ－ＨＰＶ--ＨＮＳＣＣ及びＨＰＶ+-ＨＮＳＣＣ－の２つの主要なサブタイプは、それらの特徴が、異なり及び分岐している。歴史的にアルコール及びタバコなどの化学発癌物質が原因であるＨＰＶ-－ＨＮＳＣＣは、過去３０年間で減少傾向にある。並行して、ＨＰＶによって引き起こされるＨＰＶ+－ＨＮＳＣＣは、同期間で、劇的に増加した（２２５％以上）。特に西洋諸国における、性習慣の変化により、ＨＰＶによる口腔粘膜のコロニー形成、それに伴う関連する悪性腫瘍が増加している。ＨＰＶワクチンの出現は、今後の数十年の間にこの数値が上昇するのを防ぐ可能性を有する。しかしながら、ワクチンが利用可能になっても、ＨＰＶ+－ＨＮＳＣＣの負担は、ワクチンの接種は限られているため、将来も懸念される。前記ワクチンは、既に感染している患者には効果がない。既にＨＮＳＣＣが発生している患者については、現在の治療ガイドラインは、ＨＰＶの状態にかかわりなく、手術、放射線療法及び化学療法を含む併用療法を推奨している。この方法は、既知の異なる腫瘍の生物学及び治療に対する反応を考慮すると最適ではない。そのＨＰＶ-カウンターパートと比較して、ＨＰＶ+－ＨＮＳＣＣは、より良い予後を示し、並びに若年及びそれ以外は健康な患者でより蔓延している。重要なことは、そのような標準的な治療法の使用は、衰弱を伴う生涯にわたる罹患率と関連しているということである。総合すれば、ＨＰＶ+サブグループは、過剰治療を受ける可能性があり、並びにこれらの長期間及び有害な副作用から患者を救う選択的治療が必要であるというのが、一般的な見解である。
【0006】
ＨＮＳＣＣ患者の治療は、放射線及びシスプラチンなどの細胞傷害性治療に主に基づいており、並びに他の癌の傾向のように腫瘍生物学に基づく薬剤はあまり用いられない。しかしながら、放射線治療は、シスプラチンの細胞毒性によって悪化する重度な長期影響を伴う。この問題は、一般に治療効果が高く及び予後も良好なＨＰＶ関連ＨＮＳＣＣ患者では、より顕著である。従って、患者の生活の質を損なうことなく、腫瘍学的転帰（ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｏｕｔｃｏｍｅ）を維持する、より安全で攻撃性の低いレジメン、又はシスプラチンの代替が必要とされている。さらに、最近の臨床試験は、大多数のＨＰＶ関連患者が、セツキシマブによる治療に耐性（原発性及び／又は後天性）を有することが明らかになっており、有効性の点からセツキシマブがシスプラチンに劣ることが観察される一因となり得る。従って、このセツキシマブ耐性を克服する必要もある。
【発明の概要】
【0007】
出願人は、ＨＰＶ関連癌の管理に対する満たされていなく及び緊急の必要性を認識している。本明細書に開示されるのは、当該技術の欠点に対処する化合物及び方法であり、並びに任意の数の追加の又は別の利点を提供することができ、ＨＰＶ状態に基づくＨＰＶ関連癌の管理のための組成物及び方法を含み得る。
【0008】
被験者においてＨＰＶ関連癌を治療する方法の一実施態様は、治療上有効量のガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を被験者に投与するステップを含む。前記被験者は、子宮頸癌、中咽頭癌、肛門癌、陰茎癌、膣癌、又は外陰癌を持ち得る。一実施態様において、前記被験者は、頭頸部扁平上皮癌を持ち得る。前記方法は、治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与の前に、前記被験者に治療上有効量の放射線を与えることをさらに含み得る。前記方法は、治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与後に、治療上有効量の放射線を被験者に与えることをさらに含み得る。前記方法は、被験者に治療上有効量のアポトーシス活性化学療法剤を投与することをさらに含み得る。前記方法は、被験者に治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、オルムチニブ（ｏｍｕｌｔｉｎｉｂ）、およびドキソルビシンのうちの１つ以上を投与することをさらに含み得る。特定の実施態様において、治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）も含み得る。
【0009】
被験者の頭頸部扁平上皮癌を治療する方法の一実施態様は、治療上有効量のガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体、加えてアポトーシスを活性化するための少なくとも１種の化学療法剤の治療上有効量を、被験者に投与するステップを含む。特定の実施態様において、前記治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）も含み得る。被験者において頭頸部扁平上皮癌を治療する方法の一実施態様は、治療上有効量のガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体、加えて、治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、オルムチニブ（ｏｍｕｌｔｉｎｉｂ）、およびドキソルビシンのうちの１つ以上を、被験者に投与するステップを含む。特定の実施態様において、前記治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）も含み得る。
【0010】
本特許又は出願ファイルには、少なくとも１つのカラーで作成された図面が含まれている。カラー図面を含む本特許又は特許出願公開公報の写しは、請求及び必要な手数料の支払いにより、国内官庁から提供される。
実施態様は、添付図面と併せて以下の詳細な説明により容易に理解される。この説明を容易にするために、同様の参照数字は、方法における同様の構造要素又は手順を示す。実施態様は、例として図示されており、及び添付図面に限定する目的ではない。
実施態様は、添付図面と併せて以下の詳細な説明により容易に理解される。この説明を容易にするために、同様の参照数字は、方法における同様の構造要素又は手順を示す。実施態様は、例として図示されており、及び添付図面に限定する目的ではない。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１は、特定の実施態様についての高含量のスクリーニング戦略の図表示である。スクリーニングファネルスキームは、ヒット化合物のトリアージの各工程で実行されるスクリーニング活動及びヒットの選択に使用されるそれぞれの決定基準を示す。１次スクリーニングに続いて、２次スクリーニング及びＰＡＩＮＳデータベースを用いるケモインフォマティクスフィルタリングが行われた。その後、構造及び活性の関係を、分析した後、細胞研究のために１つの候補を、選択した。
【図2A-C】図２Ａ～２Ｃは、アッセイ最適化のための３つの変数：Ｚ因子、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）、及び変数係数（ＶＣ％）のグラフ表示である。図２Ａは、Ｚ因子のグラフ表示である。スコアを、各プレートについて決定し、並びに中央値及び平均スコアは、共に０．６以上であることが分かり、高含量スクリーニングに適したアッセイであることを示した。図２Ｂは、各プレートについてのシグナル対バックグラウンド比のグラフ表示である。図２Ｃは、前記化合物の活性の散布図である（緑の実線より上の化合物をさらに分析した）ヒットは、平均値から３標準偏差に対する阻害パーセントの計算されたカットオフ値を用いて選択した。
【図3A-L】図３Ａ～３Ｋは、選択された１１個の化合物の選択性プロファイル及び指数のグラフ表示である。６ｘＨｉｓ-ＧＳＴ及びＣａｓｐａｓｅ８-Ｃａｓｐａｓｅ８のカウンタースクリーニングの両方を通過した１１個の化合物についての結合活性グラフを、表示する。前記グラフは、Ｃａｓｐａｓｅ８-Ｅ６及び６ｘＨｉｓ-ＧＳＴ結合に対する各化合物の活性、並びにこれら２種類の基質に対する活性から算出したＳＩ値（ＩＣ50／ＩＣ50）を示す。図３Ａは、化合物＃２についてのそのようなグラフであり、図３Ｂは、化合物＃４についてのそのようなグラフであり、図３Ｃは、化合物＃６についてのそのようなグラフであり、図３Ｄは、化合物＃９についてのそのようなグラフであり、図３Ｅは、化合物＃１１についてのそのようなグラフであり、図３Ｆは、化合物＃１５についてのそのようなグラフであり、図３Ｇは、化合物＃２４についてのそのようなグラフであり、図３Ｈは、化合物＃２９についてのそのようなグラフであり、図３Ｉは、化合物＃３０についてのそのようなグラフであり、図３Ｊは、化合物＃３２についてのそのようなグラフであり、及び図３Ｋは、化合物＃３８についてのそのようなグラフである。図３Ｌは、Ｃａｓｐａｓｅ８の二量化とこれらの化合物との相互作用のグラフ表示である。
【図4A-B】図４Ａ～４Ｂは、Ｃａｓｐａｓｅ８及びｐ５３のそれぞれとの結合アッセイにおけるミリセチンと比較したガンボギン酸の活性のグラフ表示である。図４Ａは、以前にＣａｓｐａｓｅ８及びＥ６ＡＰと結合するＥ６に対する活性を実証した、ミリセチンとガンボギン酸との直接比較のグラフ表示である。図４Ｂは、以前にＥ６ＡＰに結合するＥ６に対する活性を実証した、ミリセチンとガンボギン酸との直接比較のグラフ表示である。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMによって測定されたガンボギン酸の阻害活性は、ミリセチンの阻害活性よりも優れている。
【図5】図５は、構造活性相関分解析後のガンボギン酸の類縁体を示す画像である。環Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、ガンボギン酸の中心骨格を構成する。類縁体＃１は３０-ヒドロキシガンボギン酸（ＧＡ-ＯＨ）であり、類縁体＃２はモレリン酸であり、類縁体＃３はガンボゲン酸（ｇａｍｂｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）であり、類縁体＃４はガンボギン酸アミドであり、類縁体＃５はネオガンボギン酸（ｎｅｏ-ｇａｍｂｏｇｉｃ ａｃｉｄ）であり、類縁体＃６はガンボギン（ｇａｍｂｏｇｉｎ）であり、類縁体＃７はイソモレリノールであり、及び類縁体＃８はイソガンボギン酸アセチルである。
【図6A-B】図６Ａ～６Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）及びｉｎ ｖｉｖｏ（ＨＰＶ+細胞株アッセイ）におけるガンボギン酸の類縁体の活性プロファイルのグラフ表示である。図６Ａは、Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＥ６ヒット類縁体活性のグラフ表示である。＃３、５、及び６を除き、ほとんどの類縁体は、親化合物に近い活性を示す。図６Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏ（細胞）状況におけるＥ６ヒット類縁体活性のグラフ表示であり、＃３、５、及び６は、低活性も示し、＃８は、このグループに加わった驚きである。＃１は、ＨＰＶ+細胞株での活性という点では、依然として最も有望なリードである。
【図7A-C】図７Ａ～７Ｃは、ＧＡ-ＯＨを介する成長阻害に対するＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の感度のグラフ表示である。図７Ａは、ＧＡ-ＯＨによるＨＮＳＣＣ ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の細胞増殖阻害のグラフ表示である。図７Ｂは、ＧＡ-ＯＨによる子宮頸癌ＨＰＶ+及びＨＰＶ-細胞株の細胞増殖阻害のグラフ表示である。ＨＰＶ+細胞株は、図７ＡのＨＰＶ+曲線（ＳＣＣ４７、９０、１０４、１５２）並びに図７ＢのＳｉＨａ及びＣａＳｋｉの左方シフトによって示されるような、ＨＰＶ-細胞株よりも高い感度を示す。図７Ｃは、ＨＰＶ+細胞株対ＨＰＶ-細胞株の生存率のクローン形成能におけるＧＡ-ＯＨの効果をグラフ表示したものである。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶ+細胞に対してより高い細胞毒性を示した。（＋及び閉じた形は、ＨＰＶ+細胞株を表し、並びに-と開いた形は、ＨＰＶ-細胞株を表す。）
【図8A-B】図８Ａは、Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びダウンストリーム標的の活性化を分析したブロットの写真画像である。ＳＣＣ１９、ＳＣＣ９０及びＳＣＣ１０４を、播種し、並びにビヒクル、０．５μＭ及び１μＭのＧＡ-ＯＨで２４時間処置した。ｐ５３の活性化を、ｐ５３の発現及び活性化についてブロッティングすることにより検査した。Ｃａｓｐａｓｅ８活性及びアポトーシスを、Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びダウンストリーム標的の活性化についてブロッティングすることにより検査した。図８Ｂは、種々のＨＰＶ+及びＨＰＶ-細胞株におけるガンボギン酸のＣａｓｐａｓｅ３／７活性のグラフ表現である。これらの細胞株を、９６ウェルプレートに播種し、及び０．７５μＭのＧＡ-ＯＨで処置した。Ｃａｓｐａｓｅ３／７活性を、２４時間後に測定した。ＨＰＶ+細胞株は、高レベルのＣａｓｐａｓｅ３／７活性を示した。
【図9A-E】図９Ａ～Ｅは、ビヒクル、又は０．５μＭ若しくは１μＭのＧＡ-ＯＨで処置した場合の、ＳＣＣ１９、ＳＣＣ９０、及びＳＣＣ１０４細胞株における、それぞれのｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、ｐ５３、ｐ２１、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ３、及びｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ ８の相対的発現のグラフ表示であり、ローディングコントロールとしてＢ-アクチンを用いる上記の各ターゲットが示される。
【図10】図１０は、３つのＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ０９０、ＳＣＣ１０４、ＳｉＨａ）及び２つのＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９、ＳＣＣ８４）を、ガンボギン酸で処置した場合に、ＭＴＴ（３-[４，５-ジメチルチアゾール-２-イル]-２，５-ジフェニルテトラゾリウムブロミド）で測定した細胞生存率のグラフ表示である。
【図11A-H】図１１Ａ～１１Ｄは、光子放射線を受けた後にビヒクル単独又はシスプラチン（ＣＣＤＰ）のいずれかで処置した場合に、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１０４）の放射線応答をＭＴＴアッセイにより測定したグラフ表示である。１０％の生存についての線量増感比（ＤＥＲ10）を、以下：
【数1】
【図12A-D】図１２Ａ～１２Ｄは、光子放射線を受けた後にビヒクル単独又はＧＡ-ＯＨで処置した場合に、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１０４）の放射線応答をＭＴＴアッセイにより測定したグラフ表示である。
【図13A-C】図１３Ａ～１３Ｃは、光子放射線を受けた後にビヒクル単独、シスプラチン、セツキシマブ、又はＧＡ-ＯＨで処置した場合に、ＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ１５２）の放射線応答をＭＴＴアッセイにより測定したグラフ表示である。
【図14A-E】図１４Ａ～１４Ｅは、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７、ＳＣＣ１０４、及びＳＣＣ１５２）が、光子放射線を受けた後、シスプラチン、セツキシマブ、又はＧＡ-ＯＨで処置した場合に、ＤＥＲ10により測定されたＨＮＳＣＣ細胞株における感度の程度のフラフ表示である。
【図16A-B】図１６Ａ～１６Ｂは、照射後に、対照又はＧＡ-ＯＨによる処置後、２４時間後にフローサイトメトリーアッセイで測定した、ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９株における、Ｇ２-Ｍ停止細胞の割合のグラフ表示である。
【0012】
本開示の多数の他の態様、特徴及び利点は、式及び表と共に理解される以下の詳細な説明から明らかになり得る。
【発明を実施するための形態】
【0013】
（詳細な説明）
以下の説明では、多数の具体的な詳細を、様々な実施態様の完全な理解を提供するために記載する。他の例では、周知のプロセス及び方法は、本明細書に記載される実施態様を不必要に分かりにくくしないように、特に詳細に説明されないことがある。さらに、本明細書の実施態様の図示は、本明細書で説明される実施態様を分かりにくくしないために、特定の特徴又は詳細を省略し得る。
以下の説明では、多数の具体的な詳細を、様々な実施態様の完全な理解を提供するために記載する。他の例では、周知のプロセス及び方法は、本明細書に記載される実施態様を不必要に分かりにくくしないように、特に詳細に説明されないことがある。さらに、本明細書の実施態様の図示は、本明細書で説明される実施態様を分かりにくくしないために、特定の特徴又は詳細を省略し得る。
【0014】
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を構成する添付の式及び表を参照する。他の実施態様を、利用することができ、及び論理的な変更を、本開示の範囲から逸脱することなく加え得る。従って、以下の詳細な説明は、限定的な意味でとらえられるものではない。
【0015】
本明細書において開示されるのは、被験者におけるＨＰＶ関連癌の管理のための組成物及び方法である。ＨＰＶ関連癌を治療する方法の一実施態様は、治療上有効量のガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を被験者に投与するステップを含む。前記被験者は、子宮頸癌、中咽頭癌、肛門癌、陰茎癌、膣癌、又は外陰癌を有し得る。前記方法は、治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与の前に、治療上有効量の放射線を、被験者に投与することをさらに含み得る。前記方法は、治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体の投与後に、治療上有効量の放射線を、被験者に投与することをさらに含み得る。前記方法は、被験者に治療上有効量のアポトーシス活性化学療法剤を投与することをさらに含み得る。そのような化学療法剤は、アポトーシスシグナル伝達経路を誘導又は開始し、及び細胞死又は増殖減少をもたらす。前記方法は、被験者にシスプラチン、セツキシマブ、シスプラチン、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、オルムチニブ、およびドキソルビシンのうち１つ以上の治療上有効量を投与することをさらに含み得る。特定の実施態様において、前記治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）もさらに含み得る。
【0016】
本明細書に開示されるのは、頭頸部扁平上皮癌の管理のための組成物及び方法である。前記被験者の頭頸部扁平上皮癌を治療する方法の一実施態様は、当該被験者に治療上有効量のガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を投与するステップを含む。この例の前記頭頸部扁平上皮癌は、ヒトパピローマウイルスの存在に対して陽性である。被験者の頭頸部扁平上皮癌を治療する方法の一実施態様は、当該被験者に治療上有効量の３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体を投与するステップを含む。この例の前記頭頸部扁平上皮癌は、ヒトパピローマウイルスの存在に対して陽性である。特定の実施態様において、治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）も含み得る。被験者の頭頸部扁平上皮癌を治療する方法の一実施態様は、治療上有効量のガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体、加えてアポトーシスを活性化するために構成される少なくとも１つの化学療法剤の治療上有効量を、被験者に投与するステップを含む。特定の実施態様において、前記治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）も含み得る。
【0017】
被験者において扁平上皮癌を治療する方法の一実施態様は、治療上有効量の３０-ヒドロキシガンボギン酸若しくはガンボギン酸又はその薬学的に許容される誘導体、加えて、治療上有効量のシスプラチン、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、オルムチニブ（ｏｍｕｌｔｉｎｉｂ）、又はドキソルビシンのうちの１つ以上を被験者に投与するステップを含む。特定の実施態様において、前記治療計画は、放射線（光子又は陽子のいずれか）も含み得る。
【0018】
本明細書で使用される場合、“薬学的に許容される誘導体（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）”という用語は、被験者への投与により、活性成分を提供することができる（直接的又は間接的に）、本明細書に記載される化合物の任意の薬学的に許容される塩、プロドラッグ、代謝物、エステル、エーテル、水和物、多形体、溶媒和物、錯体、及び付加物を指し、かつ、これらを含む。例えば、ガンボギン酸の“薬学的に許容される誘導体”という用語は、被験者への投与により、ガンボギン酸を提供することができる（直接的又は間接的に）、ガンボギン酸の全ての誘導体（例えば、塩、プロドラッグ、代謝物、エステル、エーテル、水和物、多形体、溶媒和物、錯体、及び付加物など）を含む。いくつかの実施態様において、ガンボギン酸又は３０-ヒドロキシガンボギン酸の官能基を、効力の改善、副作用の減少、又は吸収の増加など、特定の生物学的効果を変化させるために修飾する。
【0019】
本明細書で使用される場合、“薬学的に許容される塩（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ ｓａｌｔ）”は、ガンボギン酸又は３０-ヒドロキシガンボギン酸の生物学的有効性及び特性を保持する塩を指す。並びに別段の指示がない限り、薬学的に許容される塩は、酸性基又は塩基性基の塩が含まれ、本明細書で開示される式の化合物中に存在し得る。本開示は、例として、上記の薬学的に許容される塩、それらの誘導体、それらの類縁体、それらの互変異性体、それらの立体異性体、それらの多形体、及びそれらを含む医薬組成物を調製するための特定のプロセスも提供する。
【0020】
特定の実施態様は、ガンボギン酸又は３０-ヒドロキシガンボギン酸、それらの誘導体、それらの類縁体、それらの互変異性体、それらの立体異性体、それらの多形体、及びそれらを含む薬学的に許容される組成物によって形成される薬学的に許容される塩に関連する。そのような塩を形成するために使用される典型的な無機酸は、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、硫酸、リン酸、次亜リン酸などが含まれる。脂肪族モノカルボン酸及びジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸及びヒドロキシアルカンジオン酸（ｈｙｄｒｏｘｙａｌｋａｎｄｉｏｉｃ ａｃｉｄｓ）、芳香族酸、脂肪族スルホン酸及び芳香族スルホン酸などの、有機酸から誘導される塩も、使用し得る。従って、そのような薬学的に許容される塩は、酢酸塩、フェニル酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、アクリル酸塩、アスコルビン酸塩、安息香酸塩、クロロ安息香酸塩、ジニトロ安息香酸塩、ヒドロキシ安息香酸塩、メトキシ安息香酸塩、メチル安息香酸塩、ｏ-アセトキシ安息香酸塩、ナフタレン-２-安息香酸塩、臭化物、イソ酪酸塩、フェニル酪酸塩、β-ヒドロキシ酪酸塩、塩化物、ケイ皮酸塩、クエン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、グリコール酸塩、ヘプタン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、ヒドロキシマレイン酸塩、マロン酸塩、メシル酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、フタル酸塩、リン酸塩、リン酸一水素塩、リン酸二水素塩、メタリン酸塩、ピロリン酸塩、プロピオン酸塩、フェニルプロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、ピロ硫酸塩、亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、スルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ-ブロモフェニルスルホネート、クロロベンゼンスルホネート、エタンスルホネート、２-ヒドロキシエタンスルホネート、メタンスルホネート、ナフタレン-１-スルホネート、ナフタレン-２-スルホネート、ｐ-トルエンスルホネート、キシレンスルホネート、酒石酸塩（ｔａｒｔａｒａｔｅ）などを含む。
【0021】
本発明の実施態様は、ガンボギン酸若しくは３０-ヒドロキシガンボギン酸、又は薬学的に許容される誘導体、及び薬学的に許容される担体若しくは賦形剤を含む医薬組成物を含む。賦形剤、希釈剤、充填剤、結合剤、及び担体などの薬学的に許容される成分は、不活性であるか、又はガンボギン酸又は３０-ヒドロキシガンボギン酸の送達及び分布に積極的に寄与し得る。本明細書の実施態様で使用される前記製剤は、微結晶セルロース、ラクトース一水和物、ヒドロキシプロピルセルロース、クロスカルメロースナトリウム及びステアリン酸マグネシウムなどの賦形剤、好ましくは、少なくとも約５０質量％、例えば、約５０質量％～約９５質量％の範囲であり、例えば約５０質量％～約９０質量％の範囲を含み、及びより好ましくは約５５質量％～約８５質量％の範囲であり、例えば約６０質量％～約８５質量％の範囲であり、又は約６５質量％～約８０質量％の範囲であり、約６０質量％、約６５質量％、約７０質量％、約７５質量％、若しくは約８０質量％を含む。
【0022】
本明細書で使用される場合、“治療上有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）”は、活性成分（例えば、ガンボギン酸、３０-ヒドロキシガンボギン酸、シスプラチン、セツキシマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、オルムチニブ、又はドキソルビシン）又はその薬学的に許容される塩の量であり、それが投与される症状の除去、改善、緩和、又は救済を提供し、並びにそのようなものとして“治療上有効な量”は、それが適用される文脈に依存する。治療上有効な量のガンボギン酸及び３０-ヒドロキシガンボギン酸の化合物を、１回又は複数回の投与で投与することができる。本明細書で使用される場合、“管理（ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ）”、“管理する（ｍａｎａｇｉｎｇ）”、“管理する（ｍａｎａｇｅ）”、“治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）”、“治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）”及び“治療する（ｔｒｅａｔ）”という用語は、傷害、疾患、若しくは状態の治療若しくは改善における成功の指標を指し、軽減；回復；症状の減少、又は障害、疾患若しくは状態が被験者にとってより耐えられるようになること；変性若しくは衰弱の速度が遅くなること；変性の最終点がより衰弱しにくくなること；及び／又は被験者の身体的若しくは精神的な健康が改善されることなどの客観的な若しくは主観的なパラメータを含む。
【0023】
標的療法のような革新的でより安全な治療戦略は、増加するＨＰＶ+-ＨＮＳＣＣの流行に安全に戦うために必要である。ＨＰＶの癌タンパク質、特にＥ６は、標的ＨＰＶ+-ＨＮＳＣＣ治療のための独特な及び潜在的に治療的に有利な戦略的アプローチを示している。Ｅ６は、ケラチノサイトの細胞形質転換及び不死化における原因物質であり、並びにその連続的発現は、腫瘍の進行を維持するために必要である。Ｅ６は、また、アポトーシス刺激に対する反応に影響を与えることにより、ＨＰＶ+腫瘍細胞の生存を調節する。これは、主にｐ５３及びＣａｓｐａｓｅ８などのタンパク質との抑制性のタンパク質間相互作用を介して起こる。Ｅ６は、Ｃａｓｐａｓｅ８などの外因性アポトーシス経路のタンパク質と直接結合する。Ｅ６は、ｐ５３及びＢａｋなどの内因性アポトーシス経路のタンパク質と物理的に結合し、及びその結果、それらのプロテアソーム分解を促進する。さらに、そのようなＥ６を介したＣａｓｐａｓｅ８の阻害は、アポトーシスを誘導する癌治療によるＨＰＶ+細胞の細胞死の誘導を鈍らせる。ＨＮＳＣＣにおけるｐ５３及びＣａｓｐａｓｅ８の欠損は、化学療法及び放射線に対するＨＰＶ+-ＨＮＳＣＣの感度の減衰と相関している。これと一致して、ＣＲＩＳＰＥＲ、ＴＡＬＥＮ遺伝子ノックアウト、ＲＮＡｉ、及びＥ６ｍＲＮＡを間接的にノックダウンする他の薬剤などの遺伝子学的ツールは、Ｅ６のタンパク質量を消耗せることが、増殖抑制効果をもたらし、並びに化学療法剤及び放射線に対するＨＰＶ+細胞の応答を増強することを実証している。従って、Ｅ６は、アポトーシスを妨げることにより作用し、及びＨＰＶ+腫瘍における生存因子としてその重要な役割から、魅力的な治療標的となる。
【0024】
本明細書で提供されるのは、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８との結合を阻害する低分子阻害剤である。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙTM(Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、マサチューセッツ州ウォルサム)を、予備的なスクリーニング戦略として用いた。この技術は、２つのビーズ状タンパク質の特定の相互作用をかき乱すヒット化合物を同定するための近接ベースのプラットフォームである。このアプローチを使用して、５０００を超える低分子のライブラリーは、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８との結合に拮抗する化合物について調査された。約９６のヒットが同定され、並びにそれらの活性及び特異性を確認するために、多くの相補的かつ直交的なテストを通してさらに特徴づけられた。ＧＡ-ＯＨが、最も有望なＥ６の阻害剤として浮上し、及び細胞ベースの研究の追跡において、選択的な増殖抑制及び細胞死の増加が示された。これらの結果は、ＨＰＶ+-ＨＮＳＣＣについての新規治療法の開発のための戦略を示唆するものである。
【0025】
１次スクリーニング及びヒットの同定
３つの構造的に多様なライブラリー（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍライブラリー及びカンザス大学の組織内コレクション；表１を参照）を、以前に最適化されたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMプロトコルを用いて、全長ＨＰＶ Ｅ６とヒトＣａｓｐａｓｅ８との結合を阻害する化合物の能力についてスクリーニングした。
表１-１次スクリーニングの後、初期ヒットとして選択された９６個の化合物のＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合に対するＩＣ５０（μＭ）値。カウンタースクリーニングに選択された６９のヒットは、灰色で強調されている。
３つの構造的に多様なライブラリー（Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋライブラリー、Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍライブラリー及びカンザス大学の組織内コレクション；表１を参照）を、以前に最適化されたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMプロトコルを用いて、全長ＨＰＶ Ｅ６とヒトＣａｓｐａｓｅ８との結合を阻害する化合物の能力についてスクリーニングした。
表１-１次スクリーニングの後、初期ヒットとして選択された９６個の化合物のＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合に対するＩＣ５０（μＭ）値。カウンタースクリーニングに選択された６９のヒットは、灰色で強調されている。
【0026】
【表1】
【0027】
図１は、特定の実施態様についての高含量スクリーニング戦略の図表示である。スクリーニングファネルスキームは、ヒット化合物トリアージの各所与のステップで実行されるスクリーニング活性及びヒット選択に使用されるそれぞれの決定基準を示す。１次スクリーニングに続いて、２次スクリーニング及びＰＡＩＮＳデータベースを用いたケモインフォマティクスフィルタリングが行われた。その後、構造及び活性の関係を、１つの候補を細胞試験用に選択する前に、解析した。スクリーニングされた各化合物について、阻害パーセントを、計算した。それらの阻害パーセントに対する全化合物のヒストグラムプロットは、正規分布を示した。
【0028】
アッセイ最適化のための３つの変数-Ｚ因子（統計的効果の大きさの尺度）、シグナル対バックグラウンド比、及び変数係数を、アッセイの品質及び性能について評価した。スクリーニングデータから得られた統計的パラメータは、良好な統計的妥当性、及び高含量スクリーニングについてのアッセイの適切な安定性を示した。図２Ａ～２Ｃは、Ｚ因子、シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）、及び変動係数（ＣＶ％）のグラフ表示である。図２Ａは、各プレートについて決定したＺ因子のグラフ表示であり、並びに中央値及び平均値は、どちらも０．６を超えることが分かり、高含量スクリーニングについてのアッセイの適合性を示す。図２Ｂは、各プレートのシグナル対バックグラウンド比のグラフ表示である。図２Ｃは、化合物（緑の実線より上の化合物）の散布図である。ヒットを、阻害パーセントの３ＳＤルールの計算されたカットオフ値を用いて、選択した。Ｚ因子＞０．５は、アッセイが優れている及び高含量スクリーニングに適している閾値と考えられる。５ｋライブラリーのスクリーニングに使用した１６個の３８４ウェルプレートについて計算された前記Ｚ因子の平均値と中央値は、それぞれ、０．７２及び０．６７であった。これらのＺ因子スコアは、ハイスループットスクリーニングに適していることを示している。同様に、前記アッセイは、３６の平均Ｓ／Ｂ比という高い感度も示した（図２Ｂ）。プレート間のばらつきも、１６プレート全てで低く、９．６％の平均ＣＶであり、及び許容限度の＜２０％を大きく下回った。これらの品質管理パラメータが、許容範囲内にあり、及び全体的に頑健性があることが示唆されたので、焦点を、ヒット化合物の可能性を同定することに当てた。各化合物のサンプル平均からの標準偏差を、Ｃａｓｐａｓｅ８とＥ６との結合の阻害パーセントに対してプロットした。μ＋３ＳＤルールを、正規化した阻害パーセントデータに適用し、及びサンプル平均より３Ｚ-スコアが高い化合物を、選択した（図２Ｃ）。このヒット選択カットオフで、９６個の化合物を、約１．９％の初期ヒット率で、予備ヒットとして選択した。次に、これら９６個の化合物を、用量反応解析に供し、競合挙動並びに濃度及びＥ６の結合の阻害活性の関係を、評価した。初期ヒットのうち、６９個は、明確なシグモイド挙動及び１０μＭ以下のＩＣ50値によって示されるような強い用量反応を示し（表１）、及び従って、後述するような２次スクリーニングを、選択した。
【0029】
カウンタースクリーニング及びヒット確認
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM法では、アッセイされる２つのタンパク質の結合ではなく、シグナル発生及びビーズ捕捉の側面を妨害するアーチファクトが、最初にヒットとして同定されることがあり得る。カウンタースクリーニングは、そのような非特定的及び無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）相互作用を持つ化合物を除去する必要がある。そうするために、２つの異なるカウンタースクリーニングを、採用した。１つ目は、ＧＳＴ-６ｘＨｉｓ融合ペプチドを、用いた。このペプチドは、それぞれＥ６及びＣａｓｐａｓｅ８のアフィニティハンドル（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈａｎｄｌｅｓ）を含み、ヌルコントロール反応を表していた。特異性を評価するために、１次スクリーニング（Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８）も、並行して行った。ヌル反応及び１次反応から、選択指数（ＳＩ）を計算し、及びＧＳＴ－Ｈｉｓ6に対してＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８を優先的に阻害する化合物を、選択し；残りは無差別として検討から除外された。初期のヒット化合物のうち３４個は、ＳＩ＞１０を示し；すなわち、初期ヒットの約５０％は、対照基質に対してＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合を阻害する選択性が少なくとも１０倍高かった。反対に、約半数の化合物を、フリークエントヒッターとして同定され、及び従って、非選択的であった。これらの残りのヒットから、１８個の化合物を、市販及び選択指数の強さ、並びにＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ結合の最大阻害パーセントが、５０％以上であるかどうかに基づいて、選択した。次いで、これらの化合物を、２次カウンタースクリーニングに供した。このカウンタースクリーニングは、ＧＳＴ-Ｅ６-Ｈｉｓ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合ではなく、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８-Ｈｉｓ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合を阻害する化合物の能力を評価し、及びその目的は、Ｅ６ではなくＣａｓｐａｓｅ８に優先的に結合し、宿主細胞のアポトーシスを阻害する可能性がある化合物にフラグを付けることであった。このスクリーニングにおいて好ましい化合物の選択基準は、Ｃａｓｐａｓｅ８-Ｃａｓｐａｓｅ８結合の阻害パーセントが２０％未満に設定された。この基準を使用して、１８化合物のうち１１化合物が、“真の（ｔｕｒｅ）”１次ヒットとなり、確認されたヒット率は０．２２％であった。１１化合物の選択性プロファイル及び指数を、図３に示す。Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合に対するこれらの化合物の前記ＩＣ50値も、表２に示す。
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM法では、アッセイされる２つのタンパク質の結合ではなく、シグナル発生及びビーズ捕捉の側面を妨害するアーチファクトが、最初にヒットとして同定されることがあり得る。カウンタースクリーニングは、そのような非特定的及び無差別な（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）相互作用を持つ化合物を除去する必要がある。そうするために、２つの異なるカウンタースクリーニングを、採用した。１つ目は、ＧＳＴ-６ｘＨｉｓ融合ペプチドを、用いた。このペプチドは、それぞれＥ６及びＣａｓｐａｓｅ８のアフィニティハンドル（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｈａｎｄｌｅｓ）を含み、ヌルコントロール反応を表していた。特異性を評価するために、１次スクリーニング（Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８）も、並行して行った。ヌル反応及び１次反応から、選択指数（ＳＩ）を計算し、及びＧＳＴ－Ｈｉｓ6に対してＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８を優先的に阻害する化合物を、選択し；残りは無差別として検討から除外された。初期のヒット化合物のうち３４個は、ＳＩ＞１０を示し；すなわち、初期ヒットの約５０％は、対照基質に対してＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合を阻害する選択性が少なくとも１０倍高かった。反対に、約半数の化合物を、フリークエントヒッターとして同定され、及び従って、非選択的であった。これらの残りのヒットから、１８個の化合物を、市販及び選択指数の強さ、並びにＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ結合の最大阻害パーセントが、５０％以上であるかどうかに基づいて、選択した。次いで、これらの化合物を、２次カウンタースクリーニングに供した。このカウンタースクリーニングは、ＧＳＴ-Ｅ６-Ｈｉｓ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合ではなく、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８-Ｈｉｓ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合を阻害する化合物の能力を評価し、及びその目的は、Ｅ６ではなくＣａｓｐａｓｅ８に優先的に結合し、宿主細胞のアポトーシスを阻害する可能性がある化合物にフラグを付けることであった。このスクリーニングにおいて好ましい化合物の選択基準は、Ｃａｓｐａｓｅ８-Ｃａｓｐａｓｅ８結合の阻害パーセントが２０％未満に設定された。この基準を使用して、１８化合物のうち１１化合物が、“真の（ｔｕｒｅ）”１次ヒットとなり、確認されたヒット率は０．２２％であった。１１化合物の選択性プロファイル及び指数を、図３に示す。Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合に対するこれらの化合物の前記ＩＣ50値も、表２に示す。
【0030】
【表2】
【0031】
図３Ａ～３Ｋは、選択された１１個の化合物の選択性プロファイル及び指数のグラフ表示である。６ｘＨｉｓ-ＧＳＴ及びＣａｓｐａｓｅ８-Ｃａｓｐａｓｅ８のカウンタースクリーニングの両方を通過した１１個の化合物の結合活性グラフが示されている。前記グラフは、Ｃａｓｐａｓｅ８-Ｅ６及び６ｘＨｉｓ-ＧＳＴ結合に対する各化合物の活性を示し、並びにこれら２種類の基質に対する活性から算出したＳＩ値（ＩＣ50／ＩＣ50）を示す。
【0032】
結合プロファイルは、これらの化合物が、アッセイ自体に対してほとんど干渉を示さないことを示している。図３Ｌは、Ｃａｓｐａｓｅ８の二量化とこれらの化合物の相互作用のグラフ表示である。さらに、これらの化合物は、図３Ｌに示されるように、Ｃａｓｐａｓｅ８の二量化ともほとんど相互作用を示さない。これらの結果は、それらが、Ｅ６及びＣａｓｐａｓｅ８との間の相互作用の特異的阻害剤であることを示している。
【0033】
ケモインフォマティクス解析
残りの１１個のヒット化合物について、ＳＡＲ及び細胞ベース機能性研究などのダウンストリーム解析に優先順位をつけるために、より定性的なケモインフォマティックアプローチを、実施した。我々の目的は、ＰＡＩＮＳ（パンアッセイ干渉化合物（Ｐａｎ-ａｓｓａｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ））パターンの存在を調べることにより、生化学的アッセイにおける未知の無差別性のない化合物に優先順位をつけることであった。フリークエントヒッター化合物の部分構造を認識する４つのＰＡＩＮＳ検出オンラインツールを用いて、任意のフラグづけられた化合物を、除去し、及び４つのすべての実行でＰＡＩＮＳフリーとして現れたそれらの化合物のみが、選択された。この解析は、残りの化合物の検査によって補完され、計算上見逃された可能性のある不良な官能基（ＢＦＧｓ）又は問題のある部分構造にフラグを付けた。文献所見との比較により、さらに、Ｅ６に対する新規活性を持つ化合物だけを残すことができた。これらのステップの後、ガンボギン酸（化合物＃２４）が、さらなる研究の最有力候補として残った。次いで、その活性は、基質としてＧＳＴ－Ｅ６及びＨｉｓ6－Ｅ６ＡＰを用いたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎｉｎｇTMの追加試験を実施することにより、交差検証された。Ｃａｓｐａｓｅ８及びＥ６ＡＰの両方がＥ６に結合するのを阻害する既知のＥ６阻害剤であるミリセチンは、このアッセイで陽性対照として含まれた。Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合に対するこれら２つの阻害剤の活性を、直接比較するために、並行して評価した。ミリセチンと比較して、ガンボギン酸は、少なくとも２倍低い阻害濃度（Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８に対するＩＣ50が、１．９μＭ対４．６μＭ、及びＥ６-Ｅ６ＡＰに対するＩＣ50が１．７μＭ対５．６μＭ）を持ち、両方の基質への結合に対してミリセチンよりも優れた効力を示した。図４Ａ～４Ｂは、Ｃａｓｐａｓｅ８及びｐ５３それぞれとの結合アッセイにおいて、ミリセチンと比較したガンボギン酸の活性のグラフ表示である。図４Ａは、Ｃａｓｐａｓｅ８へのＥ６の結合に対する活性に関する、ガンボギン酸とミリセチンとの直接比較のグラフ表示である。図４Ｂは、Ｅ６ＡＰへのＥ６の結合に対する活性に関する、ガンボギン酸とミリセチンの直接比較のグラフ表示である。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMで測定したガンボギン酸の阻害活性は、ミリセチンのよりも優れている。これらの所見は、細胞におけるＣａｓｐａｓｅ８及びｐ５３の機能を助ける可能性を示唆している。
残りの１１個のヒット化合物について、ＳＡＲ及び細胞ベース機能性研究などのダウンストリーム解析に優先順位をつけるために、より定性的なケモインフォマティックアプローチを、実施した。我々の目的は、ＰＡＩＮＳ（パンアッセイ干渉化合物（Ｐａｎ-ａｓｓａｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ））パターンの存在を調べることにより、生化学的アッセイにおける未知の無差別性のない化合物に優先順位をつけることであった。フリークエントヒッター化合物の部分構造を認識する４つのＰＡＩＮＳ検出オンラインツールを用いて、任意のフラグづけられた化合物を、除去し、及び４つのすべての実行でＰＡＩＮＳフリーとして現れたそれらの化合物のみが、選択された。この解析は、残りの化合物の検査によって補完され、計算上見逃された可能性のある不良な官能基（ＢＦＧｓ）又は問題のある部分構造にフラグを付けた。文献所見との比較により、さらに、Ｅ６に対する新規活性を持つ化合物だけを残すことができた。これらのステップの後、ガンボギン酸（化合物＃２４）が、さらなる研究の最有力候補として残った。次いで、その活性は、基質としてＧＳＴ－Ｅ６及びＨｉｓ6－Ｅ６ＡＰを用いたＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎｉｎｇTMの追加試験を実施することにより、交差検証された。Ｃａｓｐａｓｅ８及びＥ６ＡＰの両方がＥ６に結合するのを阻害する既知のＥ６阻害剤であるミリセチンは、このアッセイで陽性対照として含まれた。Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合に対するこれら２つの阻害剤の活性を、直接比較するために、並行して評価した。ミリセチンと比較して、ガンボギン酸は、少なくとも２倍低い阻害濃度（Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８に対するＩＣ50が、１．９μＭ対４．６μＭ、及びＥ６-Ｅ６ＡＰに対するＩＣ50が１．７μＭ対５．６μＭ）を持ち、両方の基質への結合に対してミリセチンよりも優れた効力を示した。図４Ａ～４Ｂは、Ｃａｓｐａｓｅ８及びｐ５３それぞれとの結合アッセイにおいて、ミリセチンと比較したガンボギン酸の活性のグラフ表示である。図４Ａは、Ｃａｓｐａｓｅ８へのＥ６の結合に対する活性に関する、ガンボギン酸とミリセチンとの直接比較のグラフ表示である。図４Ｂは、Ｅ６ＡＰへのＥ６の結合に対する活性に関する、ガンボギン酸とミリセチンの直接比較のグラフ表示である。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMで測定したガンボギン酸の阻害活性は、ミリセチンのよりも優れている。これらの所見は、細胞におけるＣａｓｐａｓｅ８及びｐ５３の機能を助ける可能性を示唆している。
【0034】
ＳＡＲ解析
この情報に導かれ、ガンボギン酸の８個の類縁体を市販業者から購入し、限定的な構造活性相関（ＳＡＲ）解析を実施した（図５及び図６）。図５は、構造活性相関解析後のガンボギン酸の類縁体を示す画像である。環Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、ガンボギン酸の中心骨格を構成している。類縁体＃１は、３０-ヒドロキシガンボギン酸（ＧＡ-ＯＨ）であり、類縁体＃２はモレリン酸であり、類縁体＃３はガンボゲン酸（ｇａｍｂｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）であり、類縁体＃４はガンボギン酸アミドであり、類縁体＃５はネオガンボギン酸（ｎｅｏ-ｇａｍｂｏｇｉｃ ａｃｉｄ）であり、類縁体＃６はガンボギン（ｇａｍｂｏｇｉｎ）であり、類縁体＃７はイソモレリノールであり、及び類縁体＃８はイソガンボギン酸アセチルである。
この情報に導かれ、ガンボギン酸の８個の類縁体を市販業者から購入し、限定的な構造活性相関（ＳＡＲ）解析を実施した（図５及び図６）。図５は、構造活性相関解析後のガンボギン酸の類縁体を示す画像である。環Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、ガンボギン酸の中心骨格を構成している。類縁体＃１は、３０-ヒドロキシガンボギン酸（ＧＡ-ＯＨ）であり、類縁体＃２はモレリン酸であり、類縁体＃３はガンボゲン酸（ｇａｍｂｏｇｅｎｉｃ ａｃｉｄ）であり、類縁体＃４はガンボギン酸アミドであり、類縁体＃５はネオガンボギン酸（ｎｅｏ-ｇａｍｂｏｇｉｃ ａｃｉｄ）であり、類縁体＃６はガンボギン（ｇａｍｂｏｇｉｎ）であり、類縁体＃７はイソモレリノールであり、及び類縁体＃８はイソガンボギン酸アセチルである。
【0035】
これらの構造類縁体のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎｉｎｇTM解析を、Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合を阻害するそれらの能力について実施した。一般的に、類縁体間の阻害活性は、それらの構造的類似のため、類似していた（図５及び図６）。図６Ａ～６Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ）及びｉｎ ｖｉｖｏ（ＨＰＶ+細胞株アッセイ）におけるガンボギン酸の類縁体の活性プロファイルのグラフ表示である。図６Ａは、Ｅ６-Ｃａｓｐａｓｅ８基質を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるＥ６ヒット類縁体のグラフ表示である。類縁体＃３、５、及び６を除き、ほとんどの類縁体は、親化合物に近い活性を示す。図６Ｂは、ｉｎ ｖｉｖｏ（細胞）状況におけるＥ６ヒットの類縁体活性のグラフ表示であり、＃３、５、及び６も、低活性を示し；＃８は、このグループに加わった驚きである。＃１は、ＨＰＶ+細胞株での活性という点では、依然として最も有望なリードである。そうは言っても、これらの類縁体のうち３つ（＃３、５、及び６）の活性は、前記親化合物から顕著に逸脱していた（３ログ以下の活性）。類縁体＃３及び５は、ガンボギン酸の中心骨格から環Ａに修飾が加えられていた。類縁体＃３は、開環したＡ環を持ち、一方で類縁体＃５は、酸化されたＣ３／４オレフィン及びＣ４にヒドロキシ基を有した。類縁体＃６の修飾は、中心の環系から離れており、Ｃ２９のカルボン酸を欠き、代わりに酸化されていないメチル基を有していた。類縁体＃２（Ｃ２のイソプレニル基の除去）、類縁体＃４（Ｃ２９のカルボン酸を第１級アミドに置換）、類縁体＃７（Ｃ２のイソプレニル基の除去及びＣ２９のカルボン酸のアルコールへの還元）、及び類縁体＃８（Ｃ８のフェノールのアセチル化及びＣ２のエピマー化）に代表される前記構造変化は、ＧＡに対する類縁体の活性に著しい影響を与えなかった。注目すべきは、類縁体＃１の３０-ヒドロキシガンボギン酸が、任意の他の類縁体又は親化合物よりも効果的にＥ６のＣａｓｐａｓｅ８への結合を阻害した。Ｃ３０に水素結合性ヒドロキシ基を持つ、類縁体１の結合の増加及びＣ２９のカルボン酸を除去した、類縁体＃６の活性の消失は、Ｅ６に対するこれらの化合物の活性にＣ２２の酸化されたイソプレニル基の重要性を示している。Ｃ２９アミド類縁体＃４の活性が影響を受けなかったことも、重要である。
【0036】
次に、前記類縁体を、ＳＣＣ１０４である、ＨＰＶ+ＨＮＳＣＣ細胞株を用いて、前述したようにＭＴＴアッセイで機能的活性について評価し、ｉｎ ｖｉｔｒｏのＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM解析において、同様の所見が観察されるかどうかを決定した。１つを除いて、前記パターンは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMのデータと同様であったが、細胞ベースのスクリーニングでは、違いが比較的顕著であった（図６Ｂ）。類縁体＃３、５、及び６は、それぞれ親化合物に対して、３番、４番、及び１番に高いＩＣ50sを示した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMの結果でみられる傾向と著しく異なる唯一の化合物は、類縁体＃８であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏで高い活性を示したが、この細胞ベースのアッセイでは活性が減少した。ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM解析の場合のように、類縁体＃１（３０-ヒドロキシガンボギン酸）は、前記親化合物を含む全ての類縁体の中で最も高い効力を示した。これらの所見に基づき、３０-ヒドロキシガンボギン酸（ＧＡ-ＯＨ）は、より広範な機能性研究の候補として選択された。
【0037】
ＨＰＶ+細胞株における細胞増殖及び細胞生存を選択的に阻害するＧＡ-ＯＨ
ＳＣＣ１０４細胞株を用いたＳＡＲ研究により、類縁体の活性を証明されたが、さらなる研究を、効力だけでなく選択性も評価するために実施した。その目標に向けたステップとして、ＧＡ-ＯＨの有効性を、ＭＴＴ細胞の生存率解析を用いて、ＨＰＶ+及びＨＰＶ-のＨＮＳＣＣ細胞株の両方を含むパネルで評価した。４つのＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７、ＳＣＣ０９０、ＳＣＣ１０４、ＳＣＣ１５２）及び４つのＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９、ＳＣＣ２９、ＳＣＣ４９、ＳＣＣ８４）を、使用した。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶの有無にかかわらず、細胞株に対して用量依存的に作用した。しかしながら、本明細書で試験したＨＰＶ+細胞株は、ＨＰＶ-細胞株よりも高い感度を示した（図７Ａ）。図７Ａ～７Ｃは、ＧＡ-ＯＨを介した増殖阻害に対するＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の感度のグラフ表現である。図７Ａは、ＧＡ-ＯＨによるＨＮＳＣＣのＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の細胞増殖阻害のグラフ表現である（＋及び閉じた形は、ＨＰＶ+細胞株を表し、並びに-と開いた形は、ＨＰＶ-細胞株を表す）。ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の間におけるこれらの活性の差は、ＧＡ-ＯＨが、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８及びＥ６ＡＰなどのアポトーシス促進分子との相互作用を阻害する証拠を示したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMの結果と一致していた。これらの結果をさらに検証するために、ＧＡ-ＯＨの前記活性を、子宮頸癌（ＣＣ）細胞株のパネルでも試験した。ＨＰＶは、ＣＣ発癌の原因物質として確立されているので、これらの細胞は、良好な対照であった。２つのＨＰＶ+細胞株、ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉを、陽性対照として選択し、並びにＳａｏｓ-２細胞株を、ＨＰＶ陰性対照として用いた。細胞株のＨＰＶの状態によって区別される選択性において同様のパターンを、観察した（図７Ｂ）。図７Ｂは、ＧＡ-ＯＨによる子宮頸癌ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の細胞増殖阻害のグラフ表示である。ＨＰＶ+細胞株は、ＨＰＶ-細胞株よりも高い感度を示すことが、ＨＰＶ+曲線の左方シフトによって示されている（図７ＡのＳＣＣ４７、ＳＣＣ９０、ＳＣＣ１０４、ＳＣＣ１５２並びに図７ＢのＳｉＨａ及びＣａＳｋｉ）。
ＳＣＣ１０４細胞株を用いたＳＡＲ研究により、類縁体の活性を証明されたが、さらなる研究を、効力だけでなく選択性も評価するために実施した。その目標に向けたステップとして、ＧＡ-ＯＨの有効性を、ＭＴＴ細胞の生存率解析を用いて、ＨＰＶ+及びＨＰＶ-のＨＮＳＣＣ細胞株の両方を含むパネルで評価した。４つのＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７、ＳＣＣ０９０、ＳＣＣ１０４、ＳＣＣ１５２）及び４つのＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９、ＳＣＣ２９、ＳＣＣ４９、ＳＣＣ８４）を、使用した。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶの有無にかかわらず、細胞株に対して用量依存的に作用した。しかしながら、本明細書で試験したＨＰＶ+細胞株は、ＨＰＶ-細胞株よりも高い感度を示した（図７Ａ）。図７Ａ～７Ｃは、ＧＡ-ＯＨを介した増殖阻害に対するＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の感度のグラフ表現である。図７Ａは、ＧＡ-ＯＨによるＨＮＳＣＣのＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の細胞増殖阻害のグラフ表現である（＋及び閉じた形は、ＨＰＶ+細胞株を表し、並びに-と開いた形は、ＨＰＶ-細胞株を表す）。ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の間におけるこれらの活性の差は、ＧＡ-ＯＨが、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８及びＥ６ＡＰなどのアポトーシス促進分子との相互作用を阻害する証拠を示したＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMの結果と一致していた。これらの結果をさらに検証するために、ＧＡ-ＯＨの前記活性を、子宮頸癌（ＣＣ）細胞株のパネルでも試験した。ＨＰＶは、ＣＣ発癌の原因物質として確立されているので、これらの細胞は、良好な対照であった。２つのＨＰＶ+細胞株、ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉを、陽性対照として選択し、並びにＳａｏｓ-２細胞株を、ＨＰＶ陰性対照として用いた。細胞株のＨＰＶの状態によって区別される選択性において同様のパターンを、観察した（図７Ｂ）。図７Ｂは、ＧＡ-ＯＨによる子宮頸癌ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の細胞増殖阻害のグラフ表示である。ＨＰＶ+細胞株は、ＨＰＶ-細胞株よりも高い感度を示すことが、ＨＰＶ+曲線の左方シフトによって示されている（図７ＡのＳＣＣ４７、ＳＣＣ９０、ＳＣＣ１０４、ＳＣＣ１５２並びに図７ＢのＳｉＨａ及びＣａＳｋｉ）。
【0038】
ＧＡ-ＯＨ処置後の細胞の生存に対する長期的な影響を評価するために、コロニー形成アッセイ（ＣＦＡ）を、実施した。ＳＣＣ１９（ＨＰＶ-）及びＳＣＣ１０４（ＨＰＶ+）の２つの細胞株を、この研究に用いた。前記細胞を、ＧＡ-ＯＨで２４時間処置し、次にコロニー形成の評価のために播種した。この研究から得られた細胞生存率データは、ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の細胞生存率におけるＧＡ-ＯＨの影響を反映していた。ＨＰＶ+細胞株のコロニーの数は、ＳＣＣ１９細胞株と比較して、試験したＧＡ-ＯＨの全ての用量においても、顕著に及び用量依存的に減少した。一方、ＳＣＣ１９のコロニーの数は、高濃度のＧＡ-ＯＨを除き、それらの対照と比較して顕著な減少を示さなかった（図７Ｃ）。図７Ｃは、ＨＰＶ+細胞株対ＨＰＶ-細胞株の生存率のコロニー形成能におけるＧＡ-ＯＨの効果のグラフ表示である。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶ+細胞に対してより高い細胞毒性を示した。これは、ＧＡ-ＯＨ処置は、ＨＰＶ-細胞と比較して、ＨＰＶ+細胞の生存率及びその後の生存について長期にわたって影響を及ぼすことを示す。
【0039】
ｐ５３レベルを安定化させ、及びＨＰＶ+細胞株にアポトーシスを誘導するＧＡ-ＯＨ
上述の細胞生存率の研究、並びにＧＡ-ＯＨが、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８及びｐ５３-リクルーターであるＥ６ＡＰの両方との結合を阻害することを示すＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMデータに基づくと、ｐ５３の活性化及び関連するアポトーシス作用は、細胞生存率の低下に寄与し得る。ｐ５３及びその標的遺伝子産物であるｐ２１のレベルを、免疫ブロット法を用いて評価した。ＧＡ-ＯＨでの処置は、ＨＰＶ+ＳＣＣ９０及びＳＣＣ１０４細胞株の両方でｐ５３の増加をもたらしたが、ＨＰＶ-対照物（ＳＣＣ１９）では増加しなかった（図８Ａ）。図８Ａは、Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びダウンストリーム標的の活性化を解析したブロットの写真画像である。ＳＣＣ１９、ＳＣＣ９０及びＳＣＣ１０４を、播種し、並びにビヒクル、０．５μＭ及び１μＭのＧＡ-ＯＨで２４時間処置した。ｐ５３の活性化は、ｐ５３の発現及び活性化についてブロッティングすることにより試験した。Ｃａｓｐａｓｅ８の活性化及びアポトーシスを、Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びダウンストリーム標的の活性化についてブロッティングすることにより試験した。これらの観察を、ｐ５３の標的であるｐ２１のレベルの誘導によって裏付けた。前記データは、ビヒクル対照と比較して、ｐ２１レベルの強固な誘導を示した。ＨＰＶ+細胞株のｐ５３の基礎レベルは、ＨＰＶ-細胞株と比較してより低い。
上述の細胞生存率の研究、並びにＧＡ-ＯＨが、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８及びｐ５３-リクルーターであるＥ６ＡＰの両方との結合を阻害することを示すＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMデータに基づくと、ｐ５３の活性化及び関連するアポトーシス作用は、細胞生存率の低下に寄与し得る。ｐ５３及びその標的遺伝子産物であるｐ２１のレベルを、免疫ブロット法を用いて評価した。ＧＡ-ＯＨでの処置は、ＨＰＶ+ＳＣＣ９０及びＳＣＣ１０４細胞株の両方でｐ５３の増加をもたらしたが、ＨＰＶ-対照物（ＳＣＣ１９）では増加しなかった（図８Ａ）。図８Ａは、Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びダウンストリーム標的の活性化を解析したブロットの写真画像である。ＳＣＣ１９、ＳＣＣ９０及びＳＣＣ１０４を、播種し、並びにビヒクル、０．５μＭ及び１μＭのＧＡ-ＯＨで２４時間処置した。ｐ５３の活性化は、ｐ５３の発現及び活性化についてブロッティングすることにより試験した。Ｃａｓｐａｓｅ８の活性化及びアポトーシスを、Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びダウンストリーム標的の活性化についてブロッティングすることにより試験した。これらの観察を、ｐ５３の標的であるｐ２１のレベルの誘導によって裏付けた。前記データは、ビヒクル対照と比較して、ｐ２１レベルの強固な誘導を示した。ＨＰＶ+細胞株のｐ５３の基礎レベルは、ＨＰＶ-細胞株と比較してより低い。
【0040】
Ｅ６の別の標的であるＣａｓｐａｓｅ８及びアポトーシスカスケードにおけるそのダウンストリーム標的の活性化におけるＧＡ-ＯＨ処置の効果を、評価した。ウェスタンブロット解析は、ＧＡ-ＯＨ処置が用量依存的にＣａｓｐａｓｅ８の切断を引き起こすことを示す。ＨＰＶ-細胞株においてＧＡ-ＯＨにさらされるＣａｓｐａｓｅ８レベルが顕著に増加する。しかしながら、Ｃａｓｐａｓｅ８自体の切断は見られない（図８Ａ）。アポトーシスのダウンストリームエフェクターを見ると、同様の傾向を示す。Ｃａｓｐａｓｅ８で観察されるように、Ｃａｓｐａｓｅ３を、用量依存的に切断する。ＰＡＲＰも切断されるが、その切断はわずかである。Ｂ-アクチンをローディングコントロールとして用いた、上記の標的の相対発現の定量化。図９Ａ～Ｅは、ＳＣＣ１９、ＳＣＣ９０及びＳＣＣ１０４細胞株のそれぞれを、ビヒクル、又は０．５μＭ若しくは１μＭのＧＡＯＨで処置した場合、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、ｐ５３、ｐ２１、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ３、及びｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ８の相対的発現のグラフ表示であり、Ｂ-アクチンをローディングコントロールとして用いた上記の各標的が示されている。
【0041】
次いで、これらの所見を、アポトーシス誘導の代用であるＣａｓｐａｓｅ３／７活性Ｇｌｏアッセイを実施することにより確認した。３つのＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ０９０、ＳＣＣ１０４、ＳｉＨａ）及び２つのＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９、ＳＣＣ８４）を、Ｃａｓｐａｓｅ３及び７の活性化、及び次いで、アポトーシス活性を評価した。ＨＰＶ+細胞株で、対照と比較して顕著なアポトーシス誘導を、観察した（図８Ｂ）。図８Ｂは、種々のＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株におけるガンボギン酸のＣａｓｐａｓｅ３／７活性のグラフ表示である。これらの細胞株を、９６のウェルプレートに播種し、及び０．７５μＭのＧＡ-ＯＨを処置した。Ｃａｓｐａｓｅ３／７活性を、２４時間後に測定した。ＨＰＶ+細胞株は、高レベルのＣａｓｐａｓｅ３／７活性を示した。細胞生存率も、この結果を裏付けるために並行して、評価した。より高いアポトーシス誘導を有する細胞は、一般的に、ＭＴＴによって測定された細胞生存率においてもより高い減少を示した。図１０は、３つのＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ０９０、ＳＣＣ１０４、ＳｉＨａ）及び２つのＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９、ＳＣＣ８４）を、ガンボギン酸で処置した場合、ＭＴＴによって測定された細胞生存率のグラフ表示である。これらの結果は、Ｃａｓｐａｓｅ８及びＣａｓｐａｓｅ３に関係するウェスタンブロッティング解析と一致しており、並びにＧＡ-ＯＨが、Ｅ６とＣａｓｐａｓｅ８との結合を阻害するということを示すＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMデータとも一致する。また、イムノブロット法で見られたように、アポトーシス活性は、ＨＰＶ-細胞株のＣａｓｐａｓｅ Ｇｌｏ実験では、ほとんど観察されなかった。総合すると、これらの結果は、ＨＰＶ+細胞株対ＨＰＶ-細胞株において、ＧＡ-ＯＨによる細胞生存率の抑制がより高いことを示した。
【0042】
本開示の実施態様は、治療開発の可能性がより高いＨＰＶ癌タンパク質Ｅ６の新たな及び新規な阻害剤を含む。全ての化合物を、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMプロトコルを用いてスクリーニングした。分野の標準的な慣行と一致する多くのフィルターステップ及びゲートを、組み込み、ヒット同定プロセスを適切で厳密なものにした。初期ヒットの選択は、当分野における多くの研究が信頼してきた基準、例えば、サンプル平均限界を超える統計的に重要な３つのＺ-スコアに基づく。さらに、この基準を満たすヒットが、Ｅ６結合の少なくとも～５０％阻害を示さない場合でも、除外した。次いで、前記１次ヒットは、さらにろ過するために、２次アッセイを受けた。カウンタースクリーニングにおいて、少なくとも１０の選択指数を持つヒットを、選択し；この最小閾値は、一般的に、特異性を示す化合物を選択するための厳密な出発点とみなされる。
【0043】
前記ＧＡ-ＯＨの有効性は、細胞ベースのアッセイを通じて、生物学的な事情でさらに実証された。前記結果は、ＧＡ-ＯＨがＨＰＶ依存的に細胞増殖を抑制し、及び細胞を死滅さることを示しており、これは、細胞増殖及びアポトーシス誘導の阻害におけるＥ６の役割と一致する。さらに、ｐ５３を含む、アポトーシスのメディエーターの活性化も、特にＨＰＶ+細胞モデルにおいて観察された。
【0044】
ガンボギン酸は、ＨＰＶ-細胞株に対して活性を示したが、ＨＰＶ+細胞株は、より顕著に感度が高かった。重要なことは、ＧＡ-ＯＨは、ガンボギン酸と比較して、ＨＰＶ+細胞対ＨＰＶ-細胞についてより強力及び選択的であったことであり、それは、親化合物よりも高い特異性を有することを示している。ＧＡ-ＯＨは、溶解性を改善し、及び追加されたヒドロキシ基は、分子とＥ６との水素結合のための別のハンドルを提供することにより全体的な活性に寄与しているようである。さらに、追加の極性基は、低分子とＥ６との間で観察された水素結合ネットワークを強化する。安全性プロファイルの点に関しては、追加のヒドロキシ基が、ＧＡと比較してＧＡ-ＯＨの忍容性を低下させることは、まったくありそうにない。ＧＡは、動物研究において比較的忍容性があることが見出されており、及び臓器に対する毒性は、高濃度のみ観察された。
【0045】
ＨＰＶ関連ＨＮＳＣＣ、特に中咽頭癌の患者に対する最大及び現在まだ満たされていない臨床的ニーズの１つは、治療後の安全性である。患者の大部分は、局所進行性のＨＮＳＣＣであり、及び標準的な治療は、アジュバント療法又は化学放射線療法と外科処置とからなる。本来より進行性の高いＨＰＶ非関連ＨＮＳＣＣのために設計された、これらの標準的な治療は、集中的であり、及び重度な長期にわたる治療関連の後遺症を引き起こす。しかしながら、ＨＰＶ状態は、全ての治療法に奏効率（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｒａｔｅ）が高いだけでなく、より良好な局所領域の制御及び生存にも関連することが明らかになっている。従って、化学放射線療法の現在の治療計画は、同様の生存転帰、並びにより良好な機能的な転帰及び生活の質を達成するために、非強化され得る可能性がある。これは、一般的に、放射線線量及び放射線量を減らすか、又は標準的な放射線増感剤であるシスプラチンを置き換えることによって達成し得る。現在、シスプラチンを置き換える試みは、セツキシマブ（抗-ＥＧＦＲモノクローナル抗体）を用いて行われているが、これは、通常シスプラチンの毒性にあまり耐性のない患者のためである。不運にも、デ・エスカレーション臨床試験の初期結果は、セツキシマブが、放射線と組み合わせた場合、シスプラチンに劣ることを示しており、及びその結果、最終的な治療には推奨されない。セツキシマブ以外に、ＨＮＳＣＣの治療に使用する臨床的に承認されている標的療法を、デ・エスカレーション目的で試験できるものはない。これは、放射線増感剤として作用し、及びデ・エスカレーションレジメンに安全に組み入れることができる新規で選択的な薬剤の必要性が高いことを示している。この目的のために、私たちは、新たに発見したＥ６特異的阻害剤を放射線と組み合わせて試験した。Ｅ６の阻害は、アポトーシスのブレーキを解除し、及び原則的には、アポトーシス誘導の増大を通じて、放射線誘発細胞死を相乗的に増加する。予備的な知見は、ＧＡ-ＯＨが、ＨＰＶ+細胞では、光子放射の効果を改善するが、ＨＰＶ-細胞では改善しない。具体的には、表４にまとめたように、使用した２つのＨＰＶ+細胞株について以下の併用係数（ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｉｃｅｓ）が得られ、及びこれらの指数は、Ｂｌｉｓｓ独立性モデルによる相乗効果を示している。ＨＰＶ-細胞株について、相乗効果は、放射線をＧＡ-ＯＨと併用しても観察されなかった（表４参照）。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶ+細胞において、セツキシマブ及びシスプラチンと相加的又は相乗的に作用する。ＨＰＶ-陰性細胞では、相互作用は拮抗的であった。これらの相互作用の結果を、以下の表にまとめた。特定の実施態様において、前記ＧＡ及びＧＡ-ＯＨの相加的又は相乗的な相互作用は、ゲフィチニブ、エルロチニブ、アファチニブ、ダコミチニブ、オシメルチニブ、ロシレチニブ、及びオルムチニブなどの他のＥＧＦＲ標的薬剤にも及ぶ。
【0046】
表４Ａ ＧＡ-ＯＨと異なる標準治療薬との組み合わせ。
ＧＡ-ＯＨとセツキシマブ又はシスプラチンとの場合、等しい効能の組み合わせスケジュールを使用して、個々の阻害剤ごとに細胞生存率２０％低下させる効能（ＩＣ20）で阻害剤を混合した。放射線については、ＧＡ-ＯＨとの組み合わせによる放射線量２Ｇｙでの相乗効果を示し、全ての併用療法における併用係数を示した。観察された相乗作用／相加作用／拮抗作用の程度を以下のキーで示す。ＣＩは、併用係数を表す。
ＧＡ-ＯＨとセツキシマブ又はシスプラチンとの場合、等しい効能の組み合わせスケジュールを使用して、個々の阻害剤ごとに細胞生存率２０％低下させる効能（ＩＣ20）で阻害剤を混合した。放射線については、ＧＡ-ＯＨとの組み合わせによる放射線量２Ｇｙでの相乗効果を示し、全ての併用療法における併用係数を示した。観察された相乗作用／相加作用／拮抗作用の程度を以下のキーで示す。ＣＩは、併用係数を表す。
【0047】
【表3】
【0048】
細胞が放射線に感作するＧＡ-ＯＨ
ＣＣＤＰ、セツキシマブ、及びＧＡ-ＯＨは、ＨＮＳＣＣ細胞株を光子放射に感作する能力について評価された。細胞を、投与量（０～４Ｇｙ）を使用する放射線で処置し、及びＣＤＤＰ、セツキシマブ、又はＧＡ-ＯＨの１つで処置した（表５は、種々の阻害剤の濃度を提供する）。
ＣＣＤＰ、セツキシマブ、及びＧＡ-ＯＨは、ＨＮＳＣＣ細胞株を光子放射に感作する能力について評価された。細胞を、投与量（０～４Ｇｙ）を使用する放射線で処置し、及びＣＤＤＰ、セツキシマブ、又はＧＡ-ＯＨの１つで処置した（表５は、種々の阻害剤の濃度を提供する）。
【0049】
【表4】
【0050】
コロニーを、１４～２１日後にカウントし、及びビヒクル対照に対して正規化し、並びに生存率分析を実施した。図１１Ａ～１１Ｄは、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１０４）に光子放射後に、ビヒクル単独又はシスプラチン（ＣＣＤＰ）のいずれかで処置した場合の放射線応答（ｒａｄｉｏ-ｒｅｓｐｏｎｓｅ）をＭＴＴアッセイで測定したグラフ表示である。ＣＣＤＰ及び放射線の組み合わせは、ＨＰＶの状態に関係なく、全ての細胞株で感作を示す。シスプラチンは、最大の感作性を示す。図１１Ｅ～１２Ｈは、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１０４）に光子放射後に、ビヒクル単独又はセツキシマブのいずれかで処置した場合の放射線応答をＭＴＴアッセイで測定したグラフ表示である。セツキシマブは、また、ＨＰＶの状態と無関係に感作を示す。それは最も感作性が低いことを示す。図１２Ａ～１２Ｄは、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１０４）に光子放射後に、ビヒクル単独又はＧＡ-ＯＨのいずれかで処置した場合の放射線応答をＭＴＴアッセイで測定したグラフ表示である。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶ+細胞株で最も感作性を示す。
【0051】
ＣＣＤＰ、セツキシマブ及びＧＡ-ＯＨによる放射線に対する追加のＨＰＶ+細胞株の感作を評価した。図１３Ａ～１３Ｃは、ＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ１５２）に光子放射した後に、ビヒクル単独、シスプラチン、セツキシマブ、又はＧＡ-ＯＨのいずれかで処置した場合の放射線応答を、ＭＴＴアッセイで測定したグラフ表示である。ＧＡ-ＯＨは、このＨＰＶ+細胞株の光子放射に対する感作性も増強した。図１４Ａ～１４Ｅは、ＨＰＶ-細胞株（ＳＣＣ１９及びＳＣＣ２９）及びＨＰＶ+細胞株（ＳＣＣ４７、ＳＣＣ１０４、及びＳＣＣ１５２）が、光子放射を受けた後に、シスプラチン、セツキシマブ、又はＧＡ-ＯＨで処置した場合の、ＤＥＲ10で測定したＨＮＳＣＣ細胞株における感作の程度を示すグラフ表示である。一般的にＣＤＤＰは、ＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株の両方で最大の感作を示し、並びにセツキシマブは、最小の感作を示す。ＧＡ-ＯＨは、ＨＰＶ+細胞株で感作を示す。その感作の大きさは、ＣＤＤＰより小さいが、セツキシマブよりも大きい。
【0052】
放射線に対するＨＰＶ+細胞株の細胞周期応答に影響を及ぼすＧＡ-ＯＨ
細胞を、放射線（４Ｇ）で処置した後に、ＧＡ-ＯＨで処置し、２４時間後にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）フローサイトメトリーアッセイを用いて、細胞周期解析を実施した。図１５Ａ～１５Ｂは、放射線照射した後に、対照又はＧＡ-ＯＨで処置し場合、２４時間後にフローサイトメトリーアッセイで測定したＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９細胞株の細胞周期解析のグラフ表示である。両方の細胞株において、Ｇ２-Ｍは、細胞周期の最も影響を受けたステージであり、及びＧ２-Ｍで停止した細胞が増加している。前記ＨＰＶ+細胞株-ＳＣＣ４７は、ＨＰＶ-細胞株-ＳＣＣ１９と比較して、２４時間後にＧ２-Ｍ期に停止している細胞の割合がより高い。図１６Ａ～１６Ｂは、ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９株において、放射線照射後に、対照又はＧＡ-ＯＨで処置した場合、２４時間後にフローサイトメトリーアッセイで測定した、Ｇ２-Ｍで停止した細胞の割合のグラフ表示である。ＳＣＣ４７は、ＳＣＣ１９と比較して、停止した細胞の割合が高い。ＨＰＶ-株ではなくＨＰＶ+株では、放射線プロトコルへのＧＡ-ＯＨの追加は、放射線単独と比較して、２４時間後の停止が増加した。
細胞を、放射線（４Ｇ）で処置した後に、ＧＡ-ＯＨで処置し、２４時間後にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）フローサイトメトリーアッセイを用いて、細胞周期解析を実施した。図１５Ａ～１５Ｂは、放射線照射した後に、対照又はＧＡ-ＯＨで処置し場合、２４時間後にフローサイトメトリーアッセイで測定したＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９細胞株の細胞周期解析のグラフ表示である。両方の細胞株において、Ｇ２-Ｍは、細胞周期の最も影響を受けたステージであり、及びＧ２-Ｍで停止した細胞が増加している。前記ＨＰＶ+細胞株-ＳＣＣ４７は、ＨＰＶ-細胞株-ＳＣＣ１９と比較して、２４時間後にＧ２-Ｍ期に停止している細胞の割合がより高い。図１６Ａ～１６Ｂは、ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９株において、放射線照射後に、対照又はＧＡ-ＯＨで処置した場合、２４時間後にフローサイトメトリーアッセイで測定した、Ｇ２-Ｍで停止した細胞の割合のグラフ表示である。ＳＣＣ４７は、ＳＣＣ１９と比較して、停止した細胞の割合が高い。ＨＰＶ-株ではなくＨＰＶ+株では、放射線プロトコルへのＧＡ-ＯＨの追加は、放射線単独と比較して、２４時間後の停止が増加した。
【0053】
ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９を、ＧＡ-ＯＨを併用又は併用せずに照射した場合の、Ｇ２-Ｍの動態は、停止する。細胞を、放射線（４Ｇｙ）で処置し、次いでＧＡ-ＯＨで処置した後に、細胞周期解析を、Ａｎｎｅｘｉｎ Ｖフローサイトメトリーアッセイを用いて、２４時間後に実施した。図１７Ａ～１７Ｂは、ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９を、放射線照射した後に、対照又はＧＡ-ＯＨで処置した場合、Ｇ２-Ｍ停止の動態を、２４時間後のフローサイトメトリーアッセイで測定したグラフ表示である。細胞は、短期間で同程度、停止するが、長期間では、ＳＣＣ１９細胞はより早くＧ２-Ｍ期を脱する。ＨＰＶ-株ではなくＨＰＶ+株では、放射線プロトコルにＧＡ-ＯＨを加えると、Ｇ２-Ｍ期からの脱出が放射線単独と比較して、２４時間遅れる。ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９のアポトーシス解析を、放射線照射し、次いで対照又はＧＡ-ＯＨで処置し、２４時間後にフローサイトメトリーアッセイで測定した。図１８Ａ～１８Ｂは、フローサイトメトリーアッセイで測定した、ＳＣＣ４７及びＳＣＣ１９の２４時間後のＧＡ-ＯＨの有無による放射線照射後のアポトーシス解析のグラフ表示である。放射線単独では、アポトーシスの誘導は最小である。ＧＡ-ＯＨは、単独でかなりのアポトーシスを誘導する。ＧＡ-ＯＨと放射線との組み合わせは、ＨＰＶ-細胞株-ＳＣＣ１９と比較して、ＨＰＶ+細胞株-ＳＣＣ４７では、より多くのアポトーシスを誘導し、及びより高い割合で誘導する。
【0054】
（物質及び方法）
タンパク質の精製及び調製
Ｅ６及びＣａｓｐａｓｅ８を有するプラスミド（ｐＧＥＸ-Ｅ６及びｐＴｒｉＥｘ-Ｃａｓｐａｓｅ８）を、以前に構築した。大腸菌でのＧＳＴ－Ｅ６、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８及びＨｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びその後の精製を、以前に記載されたように実施した。ＧＳＴ－Ｅ６、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８及びＨｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８のタンパク質を、それぞれＧＳＴタンパク質緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ８．０、５％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ）及びＨｉｓタンパク質緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ）に希釈した。タンパク質の濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ-Ｔｈｅ Ｂｅｔｔｅｒ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用いて決定した。単離したタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分離及びクマシー染色で評価した。
タンパク質の精製及び調製
Ｅ６及びＣａｓｐａｓｅ８を有するプラスミド（ｐＧＥＸ-Ｅ６及びｐＴｒｉＥｘ-Ｃａｓｐａｓｅ８）を、以前に構築した。大腸菌でのＧＳＴ－Ｅ６、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８及びＨｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８の発現及びその後の精製を、以前に記載されたように実施した。ＧＳＴ－Ｅ６、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８及びＨｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８のタンパク質を、それぞれＧＳＴタンパク質緩衝液（ＰＢＳ ｐＨ８．０、５％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ）及びＨｉｓタンパク質緩衝液（２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＫＣｌ、５％グリセロール、２ｍＭ ＤＴＴ）に希釈した。タンパク質の濃度を、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｐｌｕｓ-Ｔｈｅ Ｂｅｔｔｅｒ Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ａｓｓａｙ Ｒｅａｇｅｎｔ(Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国マサチューセッツ州ウォルサム)を用いて決定した。単離したタンパク質の純度を、ドデシル硫酸ナトリウム-ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）分離及びクマシー染色で評価した。
【0055】
化合物ライブラリーの収集
スクリーニングに使用したラブラリーは、３つのサブライブラリーを含み、約５０４０個の低分子化合物が含まれた。Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙは、１２００個の低分子を含む。このライブラリーの化合物の９０％は、過去に販売された又は現在販売されている医薬品であり、一方で１０％は、生理活性アルカノイド又は関連物質であるため、このライブラリーの多くの化合物は、薬らしい（ｄｒｕｇ-ｌｉｋｅｎｅｓｓ）性質（ヒトにおける生物学的利用能及び安全性）を有する。Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、幅広い生物活性及び構造の多様性を有する、２０００個の低分子化合物からなった。一部の前記化合物は、既知の薬物であったが、その他は、薬理学的プロファイルがまだ十分に解明されていない天然物及び非薬物の酵素阻害剤であった。残りは、カンザス大学化学コア並びに化学方法論及びライブラリー方法論センターが独自に合成した合成化合物であった。
スクリーニングに使用したラブラリーは、３つのサブライブラリーを含み、約５０４０個の低分子化合物が含まれた。Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｌｉｂｒａｒｙは、１２００個の低分子を含む。このライブラリーの化合物の９０％は、過去に販売された又は現在販売されている医薬品であり、一方で１０％は、生理活性アルカノイド又は関連物質であるため、このライブラリーの多くの化合物は、薬らしい（ｄｒｕｇ-ｌｉｋｅｎｅｓｓ）性質（ヒトにおける生物学的利用能及び安全性）を有する。Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎは、幅広い生物活性及び構造の多様性を有する、２０００個の低分子化合物からなった。一部の前記化合物は、既知の薬物であったが、その他は、薬理学的プロファイルがまだ十分に解明されていない天然物及び非薬物の酵素阻害剤であった。残りは、カンザス大学化学コア並びに化学方法論及びライブラリー方法論センターが独自に合成した合成化合物であった。
【0056】
１次ライブラリースクリーニング及び初期ヒットの選択
合計では、化合物の収集は、構造的に多様な３つの化合物のライブラリーから、５０４０個の低分子を含んだ（詳細については表３を参照）。前記化合物を、ＤＭＳＯで実用的な濃度に希釈し、及び反復を行わずに１０μＭの単一点の最終濃度でスクリーニングした。簡単に説明すると、７５ｎＬの各化合物を、移し及びＥｃｈｏディスペンサーを使用して目的の３８４-ウェルプレートのウェルに４μＬのブロッキング溶液を加えた。８００ｎＭのＧＳＴ-Ｅ６の４μＬ及びＨｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８の４μＬを、加え並びに室温で６０分間、プレインキュベートした。その後、８μＬのドナー及びアクセプターのビーズ混合物（２０μｇ／ｍｌの最終濃度）を、加えた。前記プレートを、密封し及び室温で4時間、インキュベートした後、当該プレートを、ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉ-Ｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して、読み取った。各化合物の阻害パーセントを、計算し、及び上記サンプルの平均値（μ＋３ＳＤ）より高い３標準偏差である前記阻害パーセントの値を、選択閾値（ｓｅｌｅｃｉｔｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として使用した。これらの化合物の１０点の段階希釈を、用量依存性の再確認のために行った。用量反応阻害曲線を、作図し及びＩＣ50を、４パラメータ非線形回帰分析を用いるＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。
合計では、化合物の収集は、構造的に多様な３つの化合物のライブラリーから、５０４０個の低分子を含んだ（詳細については表３を参照）。前記化合物を、ＤＭＳＯで実用的な濃度に希釈し、及び反復を行わずに１０μＭの単一点の最終濃度でスクリーニングした。簡単に説明すると、７５ｎＬの各化合物を、移し及びＥｃｈｏディスペンサーを使用して目的の３８４-ウェルプレートのウェルに４μＬのブロッキング溶液を加えた。８００ｎＭのＧＳＴ-Ｅ６の４μＬ及びＨｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８の４μＬを、加え並びに室温で６０分間、プレインキュベートした。その後、８μＬのドナー及びアクセプターのビーズ混合物（２０μｇ／ｍｌの最終濃度）を、加えた。前記プレートを、密封し及び室温で4時間、インキュベートした後、当該プレートを、ＥｎｖｉｓｉｏｎＴＭ Ｍｕｌｔｉ-Ｌａｂｅｌプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ社）を使用して、読み取った。各化合物の阻害パーセントを、計算し、及び上記サンプルの平均値（μ＋３ＳＤ）より高い３標準偏差である前記阻害パーセントの値を、選択閾値（ｓｅｌｅｃｉｔｏｎ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）として使用した。これらの化合物の１０点の段階希釈を、用量依存性の再確認のために行った。用量反応阻害曲線を、作図し及びＩＣ50を、４パラメータ非線形回帰分析を用いるＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて計算した。
【0057】
【表5】
【0058】
カウンタースクリーニングアッセイ及びヒット確認
１次カウンタースクリーニングアッセイは、ＧＳＴ-Ｅ６-Ｈｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８の代わりにＧＳＴ-Ｈｉｓ6融合ペプチドをＥ６結合パートナーとして用いることをベースとした。１次スクリーニングのヒット候補化合物を、６点の段階希釈を使用して調製した。Ｅｃｈｏディスペンサーを用いて、化合物を、４μＬのブロッキングバッファーを含むプレートに移した。次いで、５ｎＭのＧＳＴ-Ｈｉｓ6ペプチドの８μＬを、加えた。前記混合物を、室温で６０分間、プレインキュベートした。グルタチオンドナー及びニッケルキレートアクセプタービーズ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を、加え及び室温でさらに６０分間インキュベートした。ＧＳＴ-Ｅ６-Ｈｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８を用いる化合物の用量依存性を、１次スクリーニングと同様のプロトコルを用いて並行して実施した。その後、シグナルを、ＥｎｖｉｓｉｏｎTMプレートリーダーを用いて読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いるＩＣ50計算の後に、選択は、選択指数（ＳＩ）及びＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合の最大阻害≧５０％に基づいた。
１次カウンタースクリーニングアッセイは、ＧＳＴ-Ｅ６-Ｈｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８の代わりにＧＳＴ-Ｈｉｓ6融合ペプチドをＥ６結合パートナーとして用いることをベースとした。１次スクリーニングのヒット候補化合物を、６点の段階希釈を使用して調製した。Ｅｃｈｏディスペンサーを用いて、化合物を、４μＬのブロッキングバッファーを含むプレートに移した。次いで、５ｎＭのＧＳＴ-Ｈｉｓ6ペプチドの８μＬを、加えた。前記混合物を、室温で６０分間、プレインキュベートした。グルタチオンドナー及びニッケルキレートアクセプタービーズ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を、加え及び室温でさらに６０分間インキュベートした。ＧＳＴ-Ｅ６-Ｈｉｓ6-Ｃａｓｐａｓｅ８を用いる化合物の用量依存性を、１次スクリーニングと同様のプロトコルを用いて並行して実施した。その後、シグナルを、ＥｎｖｉｓｉｏｎTMプレートリーダーを用いて読み取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いるＩＣ50計算の後に、選択は、選択指数（ＳＩ）及びＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８結合の最大阻害≧５０％に基づいた。
【0059】
２次カウンタースクリーニングは、ＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８及びＨｉｓ６-Ｃａｓｐａｓｅ８に基づく。ＧＳＴ-６ｘＨｉｓカウンタースクリーニングからのヒットを、１０μＭの単一濃度で、３回試験した。簡単に説明すると、５μＬの化合物を、５μＬのブロッキングバッファーを含むプレートウェルに手動で加えた。４００ｎＭのＧＳＴ-Ｃａｓｐａｓｅ８の５μＬ及び４００ｎＭのＨｉｓ-Ｃａｓｐａｓｅ８の５μＬを、加え及び室温で１時間プレインキュベートした。グルタチオンドナー及びニッケルキレートアクセプタービーズ（最終濃度２０μｇ／ｍＬ）を、加え、及びシグナルを定量化する前に室温でさらに６０分間インキュベートした。この実験を、異なる日に２回繰り返した。結果を上記のように処理し、及び阻害パーセントは、ビヒクル対照に対して計算された。Ｃａｓｐａｓｅ８の二量化の阻害パーセントが２０％未満の化合物を、さらに検討するために選択した。
【0060】
ケモインフォマティクスのフィルタリング及び交差検証
２つのカウンタースクリーニングを通過した化合物は、問題のある部分構造を有する化合物を認識及び排除するための追加フィルターとして、ケモインフォマティクス解析を受けた。これらの部分構造は、多くの無関係な生化学的アッセイにおいて、非特異的な方法で結合を分裂させ得る官能基を含む。具体的には、ヒット化合物の名前及びＳＭＩＬＥＳから、以下のデータベースを、パンアッセイ干渉（ＰＡＩＮＳ）パターンを持つヒット化合物：Ｚｉｎｃ１５、ＳｗｉｓｓＡＤＭＥ、ＦＡＦｄｒｕｇｓ４及びＰＡＩＮＳ-Ｒｅｍｏｖｅｒを見つけるために検索した。次いで、これらのオンラインツールでフィルタリングした後に、ＰＡＩＮＳパターンを持たないとしてコンセンサスリストに入った化合物を、選択した。その後、前記選択された化合物を、関連するが異なる１次スクリーニングアッセイで交差検証した。具体的に、１次スクリーニングで使用するＣａｓｐａｓｅ８を、Ｅ６ＡＰに置き換え、及び阻害活性を、Ｅ６ＡＰとＥ６との結合（Ｅ６-Ｅ６ＡＰ）に対して、上記のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMプロトコルと同様の手順を用いて評価した。
２つのカウンタースクリーニングを通過した化合物は、問題のある部分構造を有する化合物を認識及び排除するための追加フィルターとして、ケモインフォマティクス解析を受けた。これらの部分構造は、多くの無関係な生化学的アッセイにおいて、非特異的な方法で結合を分裂させ得る官能基を含む。具体的には、ヒット化合物の名前及びＳＭＩＬＥＳから、以下のデータベースを、パンアッセイ干渉（ＰＡＩＮＳ）パターンを持つヒット化合物：Ｚｉｎｃ１５、ＳｗｉｓｓＡＤＭＥ、ＦＡＦｄｒｕｇｓ４及びＰＡＩＮＳ-Ｒｅｍｏｖｅｒを見つけるために検索した。次いで、これらのオンラインツールでフィルタリングした後に、ＰＡＩＮＳパターンを持たないとしてコンセンサスリストに入った化合物を、選択した。その後、前記選択された化合物を、関連するが異なる１次スクリーニングアッセイで交差検証した。具体的に、１次スクリーニングで使用するＣａｓｐａｓｅ８を、Ｅ６ＡＰに置き換え、及び阻害活性を、Ｅ６ＡＰとＥ６との結合（Ｅ６-Ｅ６ＡＰ）に対して、上記のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTMプロトコルと同様の手順を用いて評価した。
【0061】
構造活性相関（ＳＡＲｓ）
ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ及びＺｉｎｃ１５データベースを用いて、いくつかのガンボギン酸構造の類縁体を、同定及び選択した。８個の類縁体は、以下の：ガンボギン酸アミド（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ガンボゲン酸（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、モレリン酸（Ａｏｂｉｏｕｓ）、３０-ヒドロキシガンボゲン酸（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ, ＬＬＣ）、アセチルガンボギン酸（Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ）、並びにガンボギン、ネオガンボギン酸、及びイソモレリノール（ＭｏｌＰｏｒｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）のように入手した。追加のガンボギン酸は、Ｔｏｃｒｉｓから購入した。類縁体とＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８との相互作用を、１次スクリーニングと同様のプロトコルを用いるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM技術を用いて試験し、及び親化合物と比較した。細胞生存率への影響も、ＭＴＴアッセイ（下記参照）によってＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株で同様に行い、並びに有効性を、ＧｒａｐｈＰａｄ ＩＣ50カーブフィッティングを用いて決定した。
ＳｃｉＦｉｎｄｅｒ及びＺｉｎｃ１５データベースを用いて、いくつかのガンボギン酸構造の類縁体を、同定及び選択した。８個の類縁体は、以下の：ガンボギン酸アミド（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ガンボゲン酸（Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ）、モレリン酸（Ａｏｂｉｏｕｓ）、３０-ヒドロキシガンボゲン酸（Ｑｕａｌｉｔｙ Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ, ＬＬＣ）、アセチルガンボギン酸（Ｍｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ）、並びにガンボギン、ネオガンボギン酸、及びイソモレリノール（ＭｏｌＰｏｒｔ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）のように入手した。追加のガンボギン酸は、Ｔｏｃｒｉｓから購入した。類縁体とＥ６-Ｃａｓｐａｓｅ８との相互作用を、１次スクリーニングと同様のプロトコルを用いるＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎTM技術を用いて試験し、及び親化合物と比較した。細胞生存率への影響も、ＭＴＴアッセイ（下記参照）によってＨＰＶ+細胞株及びＨＰＶ-細胞株で同様に行い、並びに有効性を、ＧｒａｐｈＰａｄ ＩＣ50カーブフィッティングを用いて決定した。
【0062】
細胞培養
Ｓａｏｓ-２、ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から入手した。ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉを、イーグル最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で上記のように培養した。ＨＮＳＣＣ細胞株を、いくつかの供給源から入手し：ＵＭ-ＳＣＣ４７-ＴＣ-Ｃｌｏｎｅ３（＃４７ＣＬ３）、ＵＰＣＩ-ＳＣＣ９０-ＵＰ-Ｃｌｏｎｅ ３５（＃９０）、及びＳＣＣ８４は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ(米国サウスダコタ州)のＪｏｈｎ Ｌｅｅ博士から贈られた。ＵＭＳＣＣ１９（＃１９）、ＵＭＳＣＣ２９（＃２９）、ＵＭＳＣＣ４９（＃４９）及びＵＭＳＣＣ１０４（＃１０４）を、ミシガン大学（米国ミシガン州）のＴｈｏｍａｓ Ｃａｒｅｙ博士から贈られた。ＵＰＣ１-ＳＣＣ１５２は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＮＳＣＣ細胞を、１０％のＦＢＳを補完したダルベッコ改変イーグル培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国バージニア州マナサス）で培養した。Ｓａｏｓ-２細胞を、ＭｃＣｏｙ５ａ培地で培養し、及びＨＣＴ１１６細胞を、１０％ＦＢＳを補完したＲＰＭＩ培地で培養した。
Ｓａｏｓ-２、ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉ細胞を、Ａｍｅｒｉｃａ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（米国バージニア州マナサス）から入手した。ＳｉＨａ及びＣａＳｋｉを、イーグル最小必須培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国カリフォルニア州カールスバッド）中で上記のように培養した。ＨＮＳＣＣ細胞株を、いくつかの供給源から入手し：ＵＭ-ＳＣＣ４７-ＴＣ-Ｃｌｏｎｅ３（＃４７ＣＬ３）、ＵＰＣＩ-ＳＣＣ９０-ＵＰ-Ｃｌｏｎｅ ３５（＃９０）、及びＳＣＣ８４は、Ｓａｎｆｏｒｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ(米国サウスダコタ州)のＪｏｈｎ Ｌｅｅ博士から贈られた。ＵＭＳＣＣ１９（＃１９）、ＵＭＳＣＣ２９（＃２９）、ＵＭＳＣＣ４９（＃４９）及びＵＭＳＣＣ１０４（＃１０４）を、ミシガン大学（米国ミシガン州）のＴｈｏｍａｓ Ｃａｒｅｙ博士から贈られた。ＵＰＣ１-ＳＣＣ１５２は、ＡＴＣＣから購入した。ＨＮＳＣＣ細胞を、１０％のＦＢＳを補完したダルベッコ改変イーグル培地（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、米国バージニア州マナサス）で培養した。Ｓａｏｓ-２細胞を、ＭｃＣｏｙ５ａ培地で培養し、及びＨＣＴ１１６細胞を、１０％ＦＢＳを補完したＲＰＭＩ培地で培養した。
【0063】
ＭＴＴ細胞生存率アッセイ
全ての実際に使用する濃度は、使用前に所望の濃度にＰＢＳで希釈した。細胞生存率におけるガンボギン酸及び／又はその誘導体の効果を試験するために、全ての細胞株を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０4で播種し、及び一晩接着させた。様々な濃度の前記類縁体を、添加し及び前記細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、生存率を、前述のようにＭＴＴアッセイを用いて測定した。全ての実験は、少なくとも３回繰り返した（３回の生物学的複製、異なる日に実施した）。データは、代表的な実験から得られたものである。細胞の生存率及び有効性を、ビヒクル対照に対する阻害パーセントから評価し、及びＩＣ５０の線量曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて作成した。
全ての実際に使用する濃度は、使用前に所望の濃度にＰＢＳで希釈した。細胞生存率におけるガンボギン酸及び／又はその誘導体の効果を試験するために、全ての細胞株を、９６ウェルプレートの１ウェル当たり２×１０4で播種し、及び一晩接着させた。様々な濃度の前記類縁体を、添加し及び前記細胞を３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、生存率を、前述のようにＭＴＴアッセイを用いて測定した。全ての実験は、少なくとも３回繰り返した（３回の生物学的複製、異なる日に実施した）。データは、代表的な実験から得られたものである。細胞の生存率及び有効性を、ビヒクル対照に対する阻害パーセントから評価し、及びＩＣ５０の線量曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて作成した。
【0064】
Ｃａｓｐａｓｅ活性アッセイ
細胞を、１００μＬ培地中で、１ウェル当たり２×１０4細胞で白壁の９６ウェルプレートに播種し、並びに一晩インキュベートした。次いで、ＧＡ-ＯＨ（０．７５μＭ）及びビヒクルを追加し、及び３７℃で２４時間インキュベートした。Ｃａｓｐａｓｅ３／７活性を、Ｃａｓｐａｓｅ３／７Ｇｌｏ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州フィッチバーグ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。簡単に説明すると、室温で平衡化したＣａｓｐａｓｅ-Ｇｌｏ試薬を、各ウェルに加えた（Ｐｒｏｍｅｇａ）。前記プレートを、オービタルシェーカーに置いて混合し、及び室温で３０秒間インキュベートした後に、室温でインキュベートした。２時間のインキュベート後に、発光を、プレート読み取りの蛍光光度計（Ｆｌｘ８００、Ｂｉｏ-Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、米国バーモント州ウィヌースキー）を用いて測定した。バックグラウンド活性（ブランク反応）を、全ての実験ウェルから差し引いた。その後、ＧＡで処置したウェルにおけるＣａｓｐａｓｅ３／７の活性パーセントは、ビヒクル処置されたウェルに対して表した。
細胞を、１００μＬ培地中で、１ウェル当たり２×１０4細胞で白壁の９６ウェルプレートに播種し、並びに一晩インキュベートした。次いで、ＧＡ-ＯＨ（０．７５μＭ）及びビヒクルを追加し、及び３７℃で２４時間インキュベートした。Ｃａｓｐａｓｅ３／７活性を、Ｃａｓｐａｓｅ３／７Ｇｌｏ Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国ウィスコンシン州フィッチバーグ）を用いて、製造者の指示に従って測定した。簡単に説明すると、室温で平衡化したＣａｓｐａｓｅ-Ｇｌｏ試薬を、各ウェルに加えた（Ｐｒｏｍｅｇａ）。前記プレートを、オービタルシェーカーに置いて混合し、及び室温で３０秒間インキュベートした後に、室温でインキュベートした。２時間のインキュベート後に、発光を、プレート読み取りの蛍光光度計（Ｆｌｘ８００、Ｂｉｏ-Ｔｅｋ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ社、米国バーモント州ウィヌースキー）を用いて測定した。バックグラウンド活性（ブランク反応）を、全ての実験ウェルから差し引いた。その後、ＧＡで処置したウェルにおけるＣａｓｐａｓｅ３／７の活性パーセントは、ビヒクル処置されたウェルに対して表した。
【0065】
ウェスタンブロッティング
接着細胞を、氷冷のＰＢＳで洗浄した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファーを、添加し、及び細胞を、氷上でチューブに削り取った。前記細胞を、氷上で１０分間インキュベートした。細胞溶解物を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、及び電気泳動でＰＶＤＦ膜に移った。ブロッキング後、Ｃａｓｐａｓｅ８、ｐ５３、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ３、ｐ２１、及びβ-アクチン（細胞シグナル伝達）に対する抗体を、１：５０００の希釈で適用した。その後、抗マウス及び抗ウサギ２次抗体を、用いた（ＬＩ-ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ネブラスカ州リンカーン）。シグナルを、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇシステム(ＬＩ-ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)を用いて測定し、及びＩｍａｇｇｅ Ｊを用いて定量した。
接着細胞を、氷冷のＰＢＳで洗浄した。プロテアーゼ阻害剤カクテルを含む細胞溶解バッファーを、添加し、及び細胞を、氷上でチューブに削り取った。前記細胞を、氷上で１０分間インキュベートした。細胞溶解物を、ＳＤＳ-ＰＡＧＥで分離し、及び電気泳動でＰＶＤＦ膜に移った。ブロッキング後、Ｃａｓｐａｓｅ８、ｐ５３、ｃｌｅａｖｅｄ ＰＡＲＰ、ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ３、ｐ２１、及びβ-アクチン（細胞シグナル伝達）に対する抗体を、１：５０００の希釈で適用した。その後、抗マウス及び抗ウサギ２次抗体を、用いた（ＬＩ-ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国ネブラスカ州リンカーン）。シグナルを、Ｏｄｙｓｓｅｙ Ｉｎｆｒａｒｅｄ Ｉｍａｇｉｎｇシステム(ＬＩ-ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ)を用いて測定し、及びＩｍａｇｇｅ Ｊを用いて定量した。
【0066】
コロニー形成アッセイ
サブコンフルエントな単層細胞を、異なる用量のＧＡ-ＯＨで２４時間、処置した。細胞を、細胞株に応じて、ＤＭＥＭ又はＭＥＭ中の６ウェルプレートに５００～１０００細胞密度で再プレートする前に、トリプシン処理及び再懸濁した。次いで、細胞を、固定及び染色する前に、前記細胞株に応じて１０～２０日間増殖した。メタノール／酢酸の混合溶液を、固定に用いた後、０．５％のクリスタルバイオレットで染色した。プレートは、ＵＶイメージャーを使用して撮像し、及び５０個を超えるコロニーをｉｍａｇｅ Ｊを用いてカウントした。生存率を、コロニーの数を、対応するプレーティング効率の積として播種された細胞の数で割ることによって決定された。生存率曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、プロットした。
サブコンフルエントな単層細胞を、異なる用量のＧＡ-ＯＨで２４時間、処置した。細胞を、細胞株に応じて、ＤＭＥＭ又はＭＥＭ中の６ウェルプレートに５００～１０００細胞密度で再プレートする前に、トリプシン処理及び再懸濁した。次いで、細胞を、固定及び染色する前に、前記細胞株に応じて１０～２０日間増殖した。メタノール／酢酸の混合溶液を、固定に用いた後、０．５％のクリスタルバイオレットで染色した。プレートは、ＵＶイメージャーを使用して撮像し、及び５０個を超えるコロニーをｉｍａｇｅ Ｊを用いてカウントした。生存率を、コロニーの数を、対応するプレーティング効率の積として播種された細胞の数で割ることによって決定された。生存率曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを用いて、プロットした。
【0067】
データ解析
結合曲線及び用量反応曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ラホヤ）を用いてフィルターした。
Ｚ因子を、式[２９]：
を用いて上記のようにプレート内対照から計算し、ＳＴＤＥＶは、標準偏差であり、並びに対照は、０％の阻害（最大シグナル）であり、及びバックグラウンドは１００％の阻害である（最小シグナル）。
シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ ｒａｔｉｏ）を、以下：
のように決定した。
化合物の活性パーセント（％）及び結合阻害パーセント（％）は、
ここで、μはサンプル平均、ＳＤは標準偏差である、式を用いてＡｌｐｈａ Ｓｃｒｅｅｎシグナルから算出した
結合曲線及び用量反応曲線は、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、カリフォルニア州ラホヤ）を用いてフィルターした。
Ｚ因子を、式[２９]：
シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ ｒａｔｉｏ）を、以下：
化合物の活性パーセント（％）及び結合阻害パーセント（％）は、
【0068】
特定の実施態様において、本明細書に記載された化合物を、さらなる有効性又は標的送達のために開発し得る。本明細書に開示された前記組成物及び前記方法の種々の態様のさらなる改変又は別の実施態様は、本明細書の観点から当業者には明らかであろう。従って、本明細書は、例示的なものとしてのみ解釈され、及び当業者に実施態様の行うための一般的な方法を教示するためのものである。要素及び物質を、本明細書に図示及び記載されたものと置換することができ、部品及び工程を、反対に又は省略することができ、並びに実施態様の特定の特徴を、すべて、実施態様のこの説明の利益を得た後に当業者に明らかになるように、独立して利用し得る。以下の特許請求の範囲に記載された実施態様の要旨及び範囲から逸脱することなく、ここに記載された要素に変更を加え得る。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図3L】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図11G】
【図11H】
【図12A】
【図12B】
【図12C】
【図12D】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図14D】
【図14E】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図17A】
【図17B】
【図18A】
【図18B】
【国際調査報告】