特表 2024-509510 抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-04

(54)【発明の名称】抗ＰＤ１抗体と抗ＣＴＬＡ４抗体との組み合わせ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240226BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/86 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/863 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 37/02 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 35/761 20150101ALI20240226BHJP

   A61K 35/763 20150101ALI20240226BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240226BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C12N15/86 Z

C12N15/861 Z

C12N15/863 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12N5/10

C12P21/08

A61K39/395 N

A61K39/395 U

A61P35/00

A61P37/02

A61P31/00

A61K48/00

A61P43/00 121

A61K31/7088

A61K35/761

A61K35/763

A61K35/76

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023549911

(86)(22)【出願日】2022-02-18

(85)【翻訳文提出日】2023-10-12

(86)【国際出願番号】 US2022017093

(87)【国際公開番号】W WO2022178319

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】63/151,030

(32)【優先日】2021-02-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519155088

【氏名又は名称】クイル ピュージェット サウンド バイオセラピューティクス コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】リウ，ジー

(72)【発明者】

【氏名】ファンスロウ，ウィリアム シー．

(72)【発明者】

【氏名】ヤン，ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】トレイバー，デイビッド エル．

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C085

4C086

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA13

4C084MA55

4C084MA65

4C084MA66

4C084NA05

4C084ZB07

4C084ZB26

4C084ZB32

4C084ZC75

4C085AA14

4C085BB11

4C085EE03

4C085GG02

4C085GG03

4C085GG04

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA02

4C086MA04

4C086MA55

4C086MA65

4C086MA66

4C086NA05

4C086ZB07

4C086ZB26

4C086ZB32

4C086ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BC83

4C087CA12

4C087MA55

4C087MA65

4C087MA66

4C087NA05

4C087ZB07

4C087ZB26

4C087ZB32

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA26

(57)【要約】

本明細書では、抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体を含む抗体の混合物、そのような混合物をコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを含む宿主細胞、このような混合物の製造方法および使用方法、ならびにこのような抗体の混合物、または混合物をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む医薬組成物が提供される。
【選択図】図２０Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む抗ヒトプログラム死１（抗ｈＰＤ１）抗体であって、ここで、（１）前記抗ｈＰＤ１抗体の前記ＨＣは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ、２）前記抗ｈＰＤ１抗体の前記ＬＣは、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる、抗ヒトプログラム死１（抗ｈＰＤ１）抗体と；
（ｂ）ＨＣおよびＬＣを含む抗ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（抗ｈＣＴＬＡ４）抗体であって、（１）前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体の前記ＨＣは、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ、（２）前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体の前記ＬＣは、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる、抗ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（抗ｈＣＴＬＡ４）抗体と、を含む、抗体の混合物であって、
ここで、前記混合物中の前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体の量と前記混合物中の前記抗ｈＰＤ１抗体の量との重量対重量（ｗ／ｗ）比（抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比）は、１：１～１：４の範囲であり、
ここで、前記抗ｈＰＤ１抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において２２０～３８０時間のｉｎ ｖｉｖｏ半減期（ｔ_１／２）を有し、かつ／またはこれまでに前記抗ｈＰＤ１抗体を投与されていないヒトに投与した場合、前記抗ｈＰＤ１抗体は、１３５～３００時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、
ここで、前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において４０～１５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、かつ／またはこれまでに前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体を投与されていないヒトに投与した場合に、前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、９０～２１０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有する、混合物。

【請求項2】

配列番号１のアミノ酸配列をコードする前記核酸配列が、配列番号１０のアミノ酸配列もコードし、
配列番号５のアミノ酸配列をコードする前記核酸配列が、配列番号１２のアミノ酸配列もコードし、
配列番号１３のアミノ酸配列をコードする前記核酸配列が、配列番号２２のアミノ酸配列もコードし、
配列番号１７のアミノ酸配列をコードする前記核酸配列が、配列番号２４のアミノ酸配列もコードする、請求項１に記載の混合物。

【請求項3】

前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１～１：３の範囲である、請求項１または２に記載の混合物。

【請求項4】

前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．２～１：２．５の範囲である、請求項３に記載の混合物。

【請求項5】

前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．５～１：２．５の範囲である、請求項４に記載の混合物。

【請求項6】

前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．７～１：２．３の範囲である、請求項５に記載の混合物。

【請求項7】

前記抗ｈＰＤ１抗体の前記ＨＣおよび前記ＬＣの前記アミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および６の核酸配列によってコードされ；
前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体の前記ＨＣおよび前記ＬＣの前記アミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４および１８の核酸配列によってコードされる、請求項１～６のいずれか一項に記載の混合物。

【請求項8】

前記抗ｈＰＤ１抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において２５０～３５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、かつ／またはこれまでに前記抗ｈＰＤ１抗体を投与されていないヒトに投与した場合、前記抗ｈＰＤ１抗体は、１４０～２５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、
前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において７０～１３０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、かつ／またはこれまでに前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体を投与されていないヒトに投与した場合に、前記抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、９０～１４０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有する、請求項１～７のいずれか一項に記載の混合物。

【請求項9】

前記混合物を少なくとも１０名のヒト患者の群に、５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合、前記患者の１５％、１４％、１３％、１２％、または１１％以下が、グレード３またはグレード４の有害事象（ＡＥ）を経験する、請求項１～８のいずれか一項に記載の混合物。

【請求項10】

前記混合物を少なくとも１０名のヒト患者の群に、５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合、前記患者の１０％、９％、または８％以下が、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する、請求項９に記載の混合物。

【請求項11】

前記混合物を少なくとも１０名のヒト患者の群に、５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合、前記患者の７％以下、６％、または５％が、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する、請求項１０に記載の混合物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の混合物を含む医薬組成物。

【請求項13】

前記医薬組成物の前記ｐＨが、ｐＨ４．５～ｐＨ５．５である、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記組成物中の総タンパク質濃度が、２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記医薬組成物が、２５０～３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

請求項１～１１のいずれか一項に記載の混合物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド。

【請求項17】

前記ポリヌクレオチド（複数可）が、配列番号２、６、１４、および１８の前記核酸配列を含む、請求項１６に記載のポリヌクレオチド（複数可）。

【請求項18】

請求項１６または１７に記載のポリヌクレオチド（複数可）を含む１つ以上のベクター。

【請求項19】

ウイルスベクター（複数可）である、請求項１８に記載のベクター（複数可）。

【請求項20】

腫瘍溶解性ウイルスベクター（複数可）である、請求項１９に記載のベクター（複数可）。

【請求項21】

レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシナウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス（複数可）、またはポックスウイルスベクターである、請求項１９または２０に記載のベクター（複数可）。

【請求項22】

請求項１６もしくは１７に記載のポリヌクレオチド（複数可）および／または請求項１８に記載のベクター（複数可）を含む宿主細胞であって、請求項１～１１のいずれか一項に記載の混合物を産生することができる宿主細胞。

【請求項23】

前記宿主細胞により産生される前記混合物の前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．２～１：３の範囲である、請求項２２に記載の宿主細胞。

【請求項24】

前記宿主細胞により産生される前記混合物の前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．５～１：２．５の範囲である、請求項２３に記載の宿主細胞。

【請求項25】

前記宿主細胞により産生される前記混合物の前記抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．７～１：２．３の範囲である、請求項２４に記載の宿主細胞。

【請求項26】

ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、請求項２２～２５のいずれか一項に記載の宿主細胞。

【請求項27】

以下のステップ：
請求項２２～２６のいずれか一項に記載の宿主細胞を培養するステップと；
前記培養上清または前記宿主細胞塊から前記抗体の前記混合物を回収するステップと；を含む、抗体の混合物を作製するための方法。

【請求項28】

がん、免疫不全障害、または感染症を有する患者を治療するための方法であって、
（ａ）ある用量の請求項１～１１のいずれか一項に記載の混合物もしくは請求項１２～１５のいずれか一項に記載の医薬組成物を前記患者に投与するステップ、または
（ｂ）ある用量の請求項１６もしくは１７に記載のポリヌクレオチド（複数可）または請求項１８～２１のいずれか一項に記載のベクター（複数可）を前記患者に投与するステップ、を含む、方法。

【請求項29】

前記用量の前記混合物または前記医薬組成物が、週に約２回、週に１回、または２週、３週、４週、５週、６週、７週もしくは８週に１回投与され、前記混合物または前記医薬組成物の前記用量が、以下のうちの１つ以上によって表される、請求項２８（ａ）に記載の方法：
（１）前記用量が、少なくとも約０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０ｍｇ／ｋｇである；
（２）前記用量が、最大で約９、８、７、６、５、４、または３ｍｇ／ｋｇである；
（３）前記用量が、約１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０ｍｇ／ｋｇである；
（４）前記用量が、約２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｍｇである；
（５）前記用量が、少なくとも約７５、１００、１２５、１５０、２００、２２５、または２５０ｍｇである；および
（６）前記用量が、最大で約６００、５００、４００、または３００ｍｇである。

【請求項30】

前記用量が、少なくとも３ｍｇ／ｋｇ、かつ５ｍｇ／ｋｇ以下である、および／または
前記用量が、少なくとも１８０ｍｇかつ４００ｍｇ以下であり、
ここで、前記用量は、約３週間ごとに１回投与される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記用量が、約５ｍｇ／ｋｇである、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記用量が、３００～４００ｍｇである、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

前記患者が、がんを有し、
前記混合物または前記医薬組成物が、少なくとも１０名の患者に投与され、
前記客観的奏効率（ＯＲＲ）が、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５パーセントであり、および／または前記病勢コントロール率（ＤＣＲ）が、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０パーセントである、請求項２９～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記ポリヌクレオチド（複数可）または前記ベクター（複数可）の前記用量が、週に約２回、週に１回、または２週、３週、４週、５週、６週、７週、または８週に１回投与され、前記ポリヌクレオチド（複数可）または前記ベクター（複数可）の前記用量は、以下の１つ以上によって表される：請求項２８（ｂ）に記載の方法：
（１）前記用量が、患者の体重１ｋｇあたり、少なくとも約５ｘ１０^９コピー（コピー／ｋｇ）の前記ポリヌクレオチド（複数可）または前記ベクター（複数可）である；
（２）前記用量が、最大約１０^１５コピー／ｋｇである；
（３）前記用量が、約１０^１０コピー／ｋｇ～約１０^１４コピー／ｋｇである；および
（４）前記用量が、約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、５ｘ１０^１３、１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、または１０^１５コピーである。

【請求項35】

前記混合物、前記医薬組成物、前記ポリヌクレオチド（複数可）、または前記ベクター（複数可）の前記用量が、注入またはボーラス注射などの静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射によって投与される、請求項２８～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記患者が、黒色腫、扁平上皮非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌、上咽頭癌、頭頸部の扁平上皮癌、胃癌もしくは胃食道癌、明細胞または非明細胞腎細胞癌、尿路上皮癌、軟部組織もしくは骨肉腫、中皮腫、古典的ホジキンリンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、メルケル細胞癌、神経内分泌癌、子宮頸癌、肝細胞癌、卵巣癌、または高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）もしくはＤＮＡミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の成人および小児固形腫瘍を有する、請求項２８～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記患者が、前記混合物、前記医薬組成物、前記ポリヌクレオチド（複数可）、または前記ベクター（複数可）の前記投与前、前記投与後、または前記投与と同時に、化学療法剤または放射線で治療される、請求項２８～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記用量の前記混合物、前記医薬組成物、前記ポリヌクレオチド（複数可）、または前記ベクター（複数可）が、少なくとも１０名の患者に投与され、前記用量を投与された前記患者が、放射線または化学療法剤と同時に治療されておらず、前記用量が投与された前記患者の１５％以下、１４％、１３％、１２％、または１１％が、グレード３またはグレード４ＡＥを経験する、請求項２８～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記用量が投与された前記患者の１０％以下、９％または８％が、グレード３またはグレード４ＡＥを経験する、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記用量が投与された前記患者の７％以下、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％が、グレード３またはグレード４ＡＥを経験する、請求項３９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本明細書には、治療用組換え抗体の分野における組成物および方法が記載される。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年２月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、１２６８６１－０００３ＷＯ０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４７，９１５バイトのサイズである。

【背景技術】

【0003】

モノクローナル抗体技術は、徐々により成熟し、多くの成功したモノクローナル抗体製品が承認されている。しかし、１つの有効な抗体薬物の開発に適した、完全に検証された標的の数はますます不足している。完全な治療効果を得るには、多くの場合、２つ以上の個別の抗体を組み合わせる必要がある。例えば、ペルツズマブとトラスツズマブとの併用により、乳癌患者の生存期間を１５ヶ月以上延長させ得、その効果は、トラスツズマブ単独療法よりもはるかに大きくなる^１。近年、アテゾリズマブとベバシズマブとの併用により、転移性肝細胞癌患者の生存を大幅に延長させることが示され、肝癌の治療において、免疫チェックポイント阻害剤および血管新生阻害剤の相乗効果をもたらす抗体併用療法の力が強調されている^２。

【0004】

本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２２年２月１５日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、１２６８６１－０００３ＷＯ０１＿ＳＬ．ｔｘｔという名称であり、４７，９１５バイトのサイズである。

【0005】

現在、多くの抗体が組み合わせて臨床評価されているが、抗体併用療法が承認されるまでの規制の道のりは、多くの場合長く、費用を要する。典型的には、抗体の併用は、個々の抗体単独に対してランダム化試験でテストする必要があり、多くの場合、抗体併用療法が承認され得る前に、個々の抗体が承認された製品であるものとする。このプロセスは、個々の抗体がそれ自体ではほとんど有効性を有しない併用製品にとって大きな課題となる。したがって、開発者は、併用試験が実施され得る前に、第１相試験を超えて単一抗体を開発するために多くのリソースを投入する必要がある。この理由により、単純な制御経路を有する１つの実体であるが、２つの異なる標的に係合することができる二重特異性抗体を開発することは、多くの場合、抗体の併用で同じ目的を達成するための選択肢である。しかし、設計の制限により、二重特異性抗体は、特に各標的に対する２つの抗体アームの比率を制御する際に、抗体の併用の完全な柔軟性を有しない。二重特異性抗体を含む１つの製品では、１種類のＦｃ骨格のみ選択できるが、抗体の併用では、２つの抗体のそれぞれに、適切な効果機能および薬物動態（ＰＫ）を有するＦｃ骨格を柔軟に選択できるようになる。抗体併用療法の開発においては、新規アプローチが急務となっている。

【0006】

細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４（ＣＴＬＡ－４）^３およびプログラム細胞死１（ＰＤ－１）^４は、Ｔ細胞免疫応答の重要な免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）である。ＣＴＬＡ－４シグナル伝達は、免疫応答の初期段階中に、リンパ節におけるＴ細胞増殖の開始を制限するのに対し、ＰＤ－１は、腫瘍微小環境におけるプロセス後半でのＴ細胞活性を制限する^５。ＣＴＬＡ－４は、自己免疫の抑制および自己寛容の維持に不可欠であるが、抑制的な腫瘍環境の維持にも重要な役割を果たす制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の機能に重要である^６。ＣＴＬＡ－４およびＰＤ－１チェックポイントは、一般に、がん細胞または腫瘍浸潤免疫細胞上のこれらの阻害性受容体のリガンドの上方制御を介して腫瘍によって悪用され、免疫系を回避および／または抑制する^７，８。ＣＴＬＡ－４またはＰＤ－１の遮断により、結果として、がん患者の腫瘍量が劇的に減少し、複数の適応症に対するいくつかの製品が規制当局の承認を受けている^９，１０。さらに、ニボルマブなどのＰＤ－１ブロック抗体およびイピリムマブなどのＣＴＬＡ－４ブロック抗体は、異なるが相補的な作用機序を介して作用することが示されている
^{１１－１３}。

【0007】

抗ＰＤ－１（ａＰＤ－１）抗体と抗ＣＴＬＡ－４（ａＣＴＬＡ－４）抗体との併用は、臨床試験で複数の腫瘍タイプで広範囲にテストされている^{１４，１５}。併用試験の主な原動力は、ＰＤ－１単独療法よりも全体的な奏効率および奏効期間を改善することであったが、これは典型的には、約２０～３０％の患者および高レベルのＰＤリガンド１（ＰＤ－Ｌ１）の発現を伴う腫瘍中で働く。ＰＤ－１遮断に抗ＣＴＬＡ－４抗体を添加することにより、ほぼすべての場合に全奏効率が数値的に増加し、多くの場合、奏効期間および生存期間の延長となり得る^１６。ニボルマブとイピリムマブとの併用は、黒色腫、腎癌、ＭＳＩ－Ｈ ＣＲＣ、ＮＳＣＬＣ、ＭＰＭ、および肝癌の治療に承認された。しかし、この併用による応答増加の正確なメカニズムは、依然として不明である。近年公開された多群フェーズ３研究では、進行性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の第一選択治療として、２つの異なる抗ＣＴＬＡ－４抗体が抗ＰＤ－１抗体またはＰＤ－Ｌ１抗体と併称して試験した
^{１７，１８}。ＩｇＧ１抗ＣＴＬＡ－４抗体であるイピリムマブとニボルマブ（抗ＰＤ－１抗体）との併用は、化学療法と比較して全生存期間を改善し、ＰＤ－Ｌ１≧１％を発現する腫瘍を有する患者に対して、米国で承認されている^１７。対照的に、ＩｇＧ２抗ＣＴＬＡ－４抗体であるトレメリムマブは、デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）と併用した場合、化学療法と比較して、無増悪生存期間または全生存期間を改善しない^１８。これら２つの試験間での結果の差について、依然として説明されていない。サブグループ分析では、ＰＤ－Ｌ１レベル（＞１％もしくは＜１％）または腫瘍変異負荷（ＴＭＢ）閾値に関係なく、イピリムマブの追加が、ＰＤ－１単独療法よりも利益をもたらし得ることが示されている。一方、トレメリムマブは、ｂＴＭＢが２０ｍｕｔ／Ｍｂを超える患者にのみ利益をもたらし得る。抗ＣＴＬＡ－４抗体が利益をもたらす複数のメカニズムが存在する可能性がある。ＩｇＧ１アイソタイプの選択は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＴＬＡ－４抗体活性の一部にとって重要であり得る。例えば、ヒトでは確認されていないが、マウスでの複数の前臨床研究では、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる能力、または腫瘍内のＴｒｅｇ対ＣＤ８細胞の相対比を変化させる能力が、抗ＣＴＬＡ－４抗体の抗腫瘍応答にとって重要であることが示唆されている。この能力は、Ｆｃ媒介抗体エフェクター機能に依存する^{１９－２１}。

【0008】

ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４との併用の遮断は、抗ＰＤ－１単独療法と比較して、免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）の増加を引き起こし得る^２２。最も一般的なｉｒＡＥとしては、掻痒症、悪心、発疹、下痢、および無緊張が挙げられる。異なる比率のニボルマブとイピリムマブとを併用して使用した試験では、ｉｒＡＥのレベルが、ニボルマブの用量よりもイピリムマブの用量と関連している可能性が高いことが実証された。併用療法の毒性の上昇を管理する現在の戦略は、ニボルマブと共に投与した場合の、イピリムマブの用量および頻度を減少させることによるものである^２３。一般的に使用される１ｍｇ／ｋｇのイピリムマブを６週間ごとに投与し、ニボルマブを２週間または３週間ごとに３ｍｇ／ｋｇまたは２４０ｍｇの一定用量で投与するレジメンでは、重篤なＡＥによる患者の脱落率を顕著に減少させることができる。しかし、グレード３または４のＡＥの頻度は、ＰＤ－１単独療法よりも併用療法の方が依然としてはるかに高い^１７。興味深いことに、ＮＳＣＬＣ患者における抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１分子であるクアボンリマブとペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１抗体）との併用に関する最近の試験では、低用量のＣＴＬＡ－４抗体（６週間ごとに２５ｍｇ）では、他の高用量レジメンよりも優れた安全性プロファイルを備えた同等の有効性が示され、通常用量のペムブロリズマブ（３週間ごとに２００ｍｇ）とのさらなる併用試験の推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ）として選択された^２４。これらの発見により、併用治療の安全性および忍容性をさらに改善する必要性がもたらされる。

【0009】

上述のとおり、有効性のさらなる改善が必要である。さらに、一部の試験では、このような併用療法は、抗ＰＤ１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体のいずれかを単独で使用する治療よりも、グレード３および４の有害事象など、より多くの有害事象（以下の定義、および有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）バージョン５．０ ２０１０ ／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ＿ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｏｃｓ／ＣＴＣＡＥ＿ｖ５＿Ｑｕｉｃｋ＿Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿８．５ｘ１１．ｐｄｆで入手可能）を参照されたい、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）と関連している。さらに、２つの異なる抗体を別々に生産することは、煩わしく、高価、かつ複雑である。したがって、当技術分野では、抗ＰＤ１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体のより効率的に産生される併用、および既存の組み合わせよりも安全かつ効果的な併用が必要とされている。

【発明の概要】

【0010】

本明細書では、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４免疫チェックポイント経路の二重遮断を送達することができる併用製品が提供される。一実施形態では、本発明のＰＳＢ２０５（ＱＬ１７０６）が提供され、１つの宿主細胞株から天然の形態に近い２つの抗体の産生が可能になる新規技術プラットフォームを使用して生成され、１つの製品として製造される。新規ＰＳＢ２０５産物は、二重遮断剤の抗腫瘍活性の増強を維持するが、ｉｒＡＥの発生率の増加を誘導させないことが本明細書において企図される。二重特異性抗体とは対照的に、ＰＳ２０５の抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４成分は、各抗体および併用療法の状況において最適な標的範囲および生物学的活性を達成するように個別に設計された。ＰＳＢ２０５の抗ＣＴＬＡ－４成分は、他のＣＴＬＡ－４抗体よりも速いクリアランス速度を有するように操作されており、これにより各治療サイクル内での曝露量の減少が生じる。一定期間の抗ＰＤ－１曝露の存在下で抗ＣＴＬＡ－４曝露が減少するこの独特のプロファイルは、忍容性を改善し、したがって患者が、ＣＴＬＡ－４抗体媒介ｉｒＡＥによる中断なく、ＰＳＢ２０５の長期間投与を受けることができるようにすることを本明細書では企図する。本発明者らの第１相試験の予備データでは、ＰＳＢ２０５（ＱＬ１６０７）が良好な忍容性を呈し、ＰＤ－１阻害剤に耐性のある患者など、上咽頭癌患者および肺癌患者において、良好な抗腫瘍反応を呈したことが示された。

【0011】

また、本明細書では、抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体を含む抗体の混合物、そのような混合物をコードするポリヌクレオチドおよびこれらのポリヌクレオチドを含む宿主細胞、このような混合物およびそれらをコードするポリヌクレオチドの製造方法および使用方法、ならびにこのような抗体の混合物、または混合物をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含む医薬組成物が提供される。以下の番号付き項目は、これらの組成物および方法の態様を説明するものであり、本明細書の説明の範囲を限定することを意図するものではない。

【0012】

特定の実施形態では、ＰＳＢ２０５（ＱＬ１７０６）は、同じ１つの細胞から一定の比率で発現され、１つの製品（ＭａｂＰａｉｒ）として一緒に製造される２つの操作されたモノクローナル抗体（抗ＰＤ－１ＩｇＧ４および抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１）を含む。最適な有効性および安全性プロファイルを達成するために、ＰＳＢ２０５は、ＰＤ－１とＣＴＬＡ－４の異なるレベルの対象範囲を１つの製品中で実現するように設計された。特定の実施形態では、抗ＣＴＬＡ－４抗体は、その曝露を減少させ、ｉｒＡＥのリスクを低下させるために、より短い半減期を有するように操作された。前臨床実験および第１相臨床試験の両方で、ＰＳＢ２０５は、抗腫瘍活性を示し、ＫＩ６７＋ＣＤ８ Ｔ細胞およびＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の増加を含むＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４経路の両方の機能的二重遮断を明らかに示すことが判明した。第Ｉ相試験の予備データでは、ＰＳＢ２０５（ＱＬ１６０７）が、ＰＤ１阻害剤に耐性のある固形腫瘍患者など、固形腫瘍患者において良好な抗腫瘍効果を示し、忍容性も良好であることも示された。

【0013】

ＭａｂＰａｉｒプラットフォームにより、１つの二機能性製品中で抗体併用療法の送達が可能である。ＰＳＢ２０５（ＱＬ１７０６）などのＭａｂＰａｉｒ分子は、抗ＰＤ－１モノクローナル抗体および抗ＣＴＬＡ－４モノクローナル抗体などの２つの異なる分子の標的範囲の最適レベルを達成するように特別に操作でき、これにより良好な忍容性を有し、有効性の改善となり得る。

【0014】

また、本明細書では、以下を含む抗体の混合物に対応する、例えば態様１などの番号付き態様として記載される特定の実施形態も提供される：
（ａ）重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）を含む抗ヒトプログラム死１（抗ｈＰＤ１）抗体であって、ここで、（１）抗ｈＰＤ１抗体のＨＣは、配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ、２）抗ｈＰＤ１抗体のＬＣは、配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる、抗ヒトプログラム死１（抗ｈＰＤ１）抗体と；
（ｂ）ＨＣおよびＬＣを含む抗ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（抗ｈＣＴＬＡ４）抗体であって、ここで、（１）抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣは、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ、（２）抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＬＣは、配列番号１７のアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされる、抗ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（抗ｈＣＴＬＡ４）抗体と、を含み、
（ｃ）ここで、混合物中の抗ｈＣＴＬＡ４抗体の量と混合物中の抗ｈＰＤ１抗体の量との重量対重量（ｗ／ｗ）比（抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比）は、１：１～１：４の範囲であり、
ここで、抗ｈＰＤ１抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において２２０～３８０時間のｉｎ ｖｉｖｏ半減期（ｔ_１／２）を有し、かつ／またはこれまでに抗ｈＰＤ１抗体を投与されていないヒトに投与した場合、抗ｈＰＤ１抗体は、１３５～３００時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、
（ｄ）ここで、抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において４０～１５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、かつ／またはこれまでに抗ｈＣＴＬＡ４抗体を投与されていないヒトに投与した場合に、抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、９０～２１０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有する。

【0015】

態様２．配列番号１のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号１０のアミノ酸配列もコードし、
配列番号５のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号１２のアミノ酸配列もコードし、
配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号２２のアミノ酸配列もコードし、
配列番号１７のアミノ酸配列をコードする核酸配列は、配列番号２４のアミノ酸配列もコードする、態様１の混合物。

【0016】

態様３．抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１～１：３の範囲である、態様１または２の混合物。

【0017】

態様４．抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．２～１：２．５の範囲である、態様３に記載の混合物。

【0018】

態様５．抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．５～１：２．５の範囲である、態様４に記載の混合物。

【0019】

態様６．抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．７～１：２．３の範囲である、態様５に記載の混合物。

【0020】

態様７．抗ｈＰＤ１抗体のＨＣおよびＬＣのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２および６の核酸配列によってコードされ；
抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣおよびＬＣのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４および１８の核酸配列によってコードされる、態様１～６のいずれか１つの混合物。

【0021】

態様８．抗ｈＰＤ１抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において２５０～３５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、かつ／またはこれまでに抗ｈＰＤ１抗体を投与されていないヒトに投与した場合、抗ｈＰＤ１抗体は、１４０～２５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、
抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において７０～１３０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し、かつ／またはこれまでに抗ｈＣＴＬＡ４抗体を投与されていないヒトに投与した場合に、抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、９０～１４０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有する、態様１～７のいずれか１つの混合物。

【0022】

態様９．混合物を少なくとも１０名のヒト患者の群に、５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合、患者の１５％以下、１４％、１３％、１２％、または１１％が、グレード３またはグレード４の有害事象（ＡＥ）を経験する、態様１～８のいずれか１つの混合物。

【0023】

態様１０．混合物を少なくとも１０名のヒト患者の群に、５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合、患者の１０％以下、９％、または８％が、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する、態様９の混合物。

【0024】

態様１１．混合物を少なくとも１０名のヒト患者の群に、５ｍｇ／ｋｇ以下の用量で投与した場合、患者の７％以下、６％、または５％が、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する、態様１０の混合物。

【0025】

態様１２．態様１～１１のいずれか１つの混合物を含む医薬組成物。

【0026】

態様１３．医薬組成物のｐＨが、ｐＨ４．５～ｐＨ５．５である、態様１２の医薬組成物。

【0027】

態様１４．組成物中の総タンパク質濃度が、２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬである、態様１２または１３の医薬組成物。

【0028】

態様１５．医薬組成物が、２５０～３８０ｍＯｓｍ／ｋｇの重量オスモル濃度を有する、態様１２～１４のいずれか１つの医薬組成物。

【0029】

態様１６．態様１～１１のいずれか１つの混合物をコードする１つ以上のポリヌクレオチド。

【0030】

態様１７．ポリヌクレオチド（複数可）が、配列番号２、６、１４、および１８の核酸配列を含む、態様１６のポリヌクレオチド（複数可）。

【0031】

態様１８．態様１６または１７のポリヌクレオチド（複数可）を含む１つ以上のベクター。

【0032】

態様１９．ウイルスベクター（複数可）である、態様１８のベクター（複数可）。

【0033】

態様２０．腫瘍溶解性ウイルスベクター（複数可）である、態様１９のベクター（複数可）。

【0034】

態様２１．レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ワクシニアウイルス、改変ワクシナウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルス、またはポックスウイルスベクターである、態様１９または２０のベクター（複数可）。

【0035】

態様２２．態様１～１１のいずれか１つの混合物を産生することができる、態様１６もしくは１７のポリヌクレオチド（複数可）および／または態様１８のベクター（複数可）を含む宿主細胞。

【0036】

態様２３．宿主細胞により産生される混合物の抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．２～１：３の範囲である、態様２２の宿主細胞。

【0037】

態様２４．宿主細胞により産生される混合物の抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．５～１：２．５の範囲である、態様２３の宿主細胞。

【0038】

態様２５．宿主細胞により産生される混合物の抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比が、１：１．７～１：２．３の範囲である、態様２４の宿主細胞。

【0039】

態様２６．ＣＨＯ細胞またはマウス骨髄腫細胞である、態様２２～２５の宿主細胞。

【0040】

態様２７．以下のステップ：
態様２２～２６のいずれか１つの宿主細胞を培養するステップと；
培養上清または宿主細胞塊から抗体の混合物を回収するステップと、を含む、抗体の混合物を作製するための方法。

【0041】

態様２８．がん、免疫不全障害、または感染症を有する患者を治療するための方法であって、
（ａ）ある用量の態様１～１１のいずれか１つの混合物もしくは態様１２～１５のいずれか１つの医薬組成物を患者に投与するステップ、または
（ｂ）ある用量の態様１６もしくは１７のポリヌクレオチド（複数可）または態様１８～２１のいずれか１つのベクター（複数可）を患者に投与するステップ、を含む、方法。

【0042】

態様２９．態様２８（ａ）の方法であって、ある用量の混合物または医薬組成物が、週に約２回、週に１回、または２週、３週、４週、５週、６週、７週もしくは８週に１回投与され、ある用量の混合物または医薬組成物は、以下のうちの１つ以上によって表される：
（１）用量が、少なくとも約０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０ｍｇ／ｋｇである；
（２）用量が、最大で約９、８、７、６、５、４、または３ｍｇ／ｋｇである；
（３）用量が、約１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、または８．０ｍｇ／ｋｇである；
（４）用量が、約２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、または５００ｍｇである；
（５）用量が、少なくとも約７５、１００、１２５、１５０、２００、２２５、または２５０ｍｇである、および
（６）用量が、最大で約６００、５００、４００、または３００ｍｇである、方法。

【0043】

態様３０．態様２９に記載の方法であって、
用量が、少なくとも３ｍｇ／ｋｇかつ５ｍｇ／ｋｇ以下である、および／または、
用量が、少なくとも１８０ｍｇかつ４００ｍｇ以下であり、
ここで、用量が、約３週間に１回投与される、方法。

【0044】

態様３１．用量が、約５ｍｇ／ｋｇである、態様３０に記載の方法。

【0045】

態様３２．用量が、３００～４００ｍｇである、態様３０の方法。

【0046】

態様３３．態様２９～３２のいずれか１つに記載の方法であって、
患者が、がんを有し、
混合物または医薬組成物が、少なくとも１０名の患者に投与され、
客観的奏効率（ＯＲＲ）は、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、または３５パーセントであり、および／または病勢コントロール率（ＤＣＲ）は、少なくとも２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０パーセントである、方法。

【0047】

態様３４．態様２８（ｂ）の方法であって、ポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）の用量が、週に約２回、週に１回、または２週、３週、４週、５週、６週、７週、または８週に１回投与され、ポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）の用量は、以下の１つ以上によって表される：
（１）用量は、患者の体重１ｋｇあたり、少なくとも約５ｘ１０^９コピー（コピー／ｋｇ）のポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）である；
（２）用量は、最大約１０^１５コピー／ｋｇである；
（３）用量は、約１０^１０コピー／ｋｇ～約１０^１４コピー／ｋｇである；および
（４）用量は、約１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、５ｘ１０^１３、１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、または１０^１５コピーである、方法。

【0048】

態様３５．混合物、医薬組成物、ポリヌクレオチド（複数可）、またはベクター（複数可）の用量が、注入またはボーラス注射などの静脈内注射、皮下注射、または筋肉内注射によって投与される、態様２８～３４のいずれか１つの方法。

【0049】

態様３６．患者が、黒色腫、扁平上皮非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む肺癌、上咽頭癌、頭頸部の扁平上皮癌、胃癌または胃食道癌、明細胞または非明細胞腎細胞癌、尿路上皮癌、軟部組織または骨肉腫、中皮腫、古典的ホジキンリンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、メルケル細胞癌、神経内分泌癌、子宮頸癌、肝細胞がん、卵巣がん、または高マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ－Ｈ）またはＤＮＡミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）の成人および小児固形腫瘍を有する、態様２８～３５のいずれか１つの方法。

【0050】

態様３７．患者が、混合物、医薬組成物、ポリヌクレオチド（複数可）、またはベクター（複数可）の投与前、投与後、または投与と同時に、化学療法剤または放射線で治療される、態様２８～３６のいずれか１つの方法。

【0051】

態様３８．本用量の混合物、医薬組成物、ポリヌクレオチド（複数可）、またはベクター（複数可）が、少なくとも１０名の患者に投与され、その用量を投与された患者が、放射線または化学療法剤と同時に治療されておらず、本用量が投与された患者の１５％以下、１４％、１３％、１２％、または１１％が、グレード３またはグレード４ＡＥを経験する、態様２８～３７のいずれか１つの方法。

【0052】

態様３９．本用量が投与された患者の１０％以下、９％、または８％が、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する、態様３８に記載の方法。

【0053】

態様４０．本用量が投与された患者の７％以下、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０％が、グレード３またはグレード４ＡＥを経験する、態様３９に記載の方法。

【図面の簡単な説明】

【0054】

【図1】抗ｈＰＤ１ＩｇＧ４抗体ＰＳＢ１０３をコードするベクターのプラスミドマップを示す図である。プラスミド内の様々な遺伝エレメントは、次のように標識されている：ＰｒｏＰＧＫ、ホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター；ＤＨＦＲ、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子；ＳＶ４０ｐＡ、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル；ＰｒｏＥＦ２／ＣＭＶ；伸長因子２とサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）のハイブリッドプロモーター；抗ＰＤ－１ＩｇＧ４－ＨＣ；ＰＳＢ１０３抗ｈＰＤ１ＨＣをコードする配列；ＣＭＶｐＡ；ＣＭＶからのポリアデニル化シグナル；ＰｒｏＣＭＶ／ＥＦ１；ＣＭＶと伸長因子１のハイブリッドプロモーター；抗ＰＤ－１ＬＣ；カッパＬＣであるＰＳＢ１０３抗ｈＰＤ１抗体のＬＣをコードする配列；ＰｕｒｏＲｅｓｉｓ；ピューロマイシン耐性遺伝子；ｐＭＢ１ｏｒｉ；ＤＮＡ複製のｐＭＢ１起点；ｋａｎａＲｅｓｉｓ；カナマイシン耐性遺伝子；ＮｒｕＩ；制限酵素ＮｒｕＩの認識部位。

【図2】ＰＳＢ１０３を発現するＣＨＯ細胞株を得るための選択スキームを示す図である。このプロセスは実施例１で説明する。左側の「トランスフェクション」と表示したボックスは、図１に図示したプラスミドによるＣＨＯ細胞のトランスフェクションを表す。トランスフェクトされた細胞は、２つのプールに分割し、中央の２つのボックスに示すとおり、これらは２つの異なるフェーズ１選択レジメンに供される。次に、右側の４つのボックスに示すとおり、２つの第１相プールをそれぞれ２つのプールに分割し、２つの異なる第２相選択レジメンに供した。

【図3】抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＨＣをコードするベクターのプラスミドマップを示す図である。プラスミド内の様々な遺伝エレメントは、次のように標識されている：プロモーターＰＧＫ Ｍｍ、ハツカネズミ由来のホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター；プロモーターＥＦ１ａ Ｈｓ、ホモ・サピエンス由来の伸長因子１－αのプロモーター；イントロンＥＦ１ａ Ｈｓ、ホモ・サピエンス由来の伸長因子１－αのイントロン；抗ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ１－ＨＣ、抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＩｇＧ１ ＨＣをコードするＤＮＡ；ＥＥＳ、Ａｔｕｍ（Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）が有する発現増強配列；ＨＰＲＥ、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント；Ｏｃｒａｂｂｉｔ、ウサギベータグロビン遺伝子のポリアデニル化（ポリ（Ａ））シグナル；ＨＳ４インシュレータ、ニワトリベータグロビン遺伝子由来のＨＳ４インシュレータエレメント；Ｏｒｉ ｐＵＣ、大腸菌における複製のためのＤＮＡ複製起点；カナマイシン耐性、カナマイシン耐性遺伝子；ＮｒｕＩ、制限酵素ＮｒｕＩの認識部位；ｐＡグロビンＨｓ、ホモ・サピエンスベータグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル；およびハイグロマイシン耐性、ハイグロマイシン耐性遺伝子。

【図4】抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＬＣをコードするベクターのプラスミドマップを示す図である。プラスミド内の様々な遺伝エレメントは、次のように標識されている；Ｐ－ＥＦ１ａ Ｈｓ、ホモ・サピエンス由来の伸長因子１－αのプロモーター；ＥＦ１－Ｈｓ エクソン１、ホモ・サピエンス由来の伸長因子アルファのエクソン１；イントロンＥＦ１ａ Ｈｓ、ホモ・サピエンス由来の伸長因子１－αのイントロン；イントロンアクセプターＭｍ ＩｇＨ、ハツカネズミ由来のＩｇＨイントロンアクセプター；抗ＣＴＬＡ－４ ＬＣ、抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＬＣをコードするＤＮＡ；ＥＥＳ、Ａｔｕｍ独自の発現増強配列（Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）；ＨＰＲＥ、Ｂ型肝炎ウイルス転写後調節エレメント；Ｏｃｒａｂｂｉｔ、ウサギベータグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル；ＨＳ４インシュレータ、ニワトリベータグロビン遺伝子由来のＨＳ４インシュレータエレメント；Ｏｒｉ ｐＵＣ、大腸菌における複製のためのＤＮＡ複製起点；カナマイシン耐性、カナマイシン耐性遺伝子；ＮｒｕＩ、制限酵素ＮｒｕＩの認識部位；ｐＡグロビンＨｓ、ホモ・サピエンスベータグロビン遺伝子のポリ（Ａ）シグナル；Ｍｍグルタミン合成酵素、ハツカネズミ由来のグルタミン合成酵素；およびＰ－ＰＧＫ Ｍｍ、ハツカネズミ由来のホスホグリセリン酸キナーゼのプロモーター。

【図5】ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の結合特異性を示す図である。実験は、実施例２に記載する。パネル、図５Ａおよび図５Ｂは、それぞれ、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３および抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５の結果を示す。パネルＡおよびＢの両方において、これらの抗体への結合について試験したリガンドは、次のようにｘ軸下に左から右に示す：ｈｕＰＤ１、Ｆｃ断片に融合したヒトＰＤ１の細胞外ドメイン；ｍｕＰＤ１、ヒスチジン－ａｖｉタグに融合したマウスＰＤ１の細胞外ドメイン（これにより、タンパク質の効率的な精製（ヒスチジンタグ）およびビオチンによるタンパク質（ａｖｉタグ）の標識が可能になる）；ｈｕＰＤＬ１、ヒスチジン－ａｖｉタグに融合したヒトＰＤＬ１の細胞外領域；ｈｕＣＤ２８、Ｆｃ断片に融合したヒトＣＤ２８の細胞外ドメイン；ｈｕＣＴＬＡ４、Ｆｃ断片に融合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン。斜めの縞模様、不連続な短い水平線、または太い連続した水平線の棒グラフは、それぞれ１００ｎｇ／ｍＬ、３３ｎｇ／ｍＬ、または０ｎｇ／ｍＬの試験リガンドを含むサンプルからのデータを示す。ｙ軸は、４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ_４５０）を示し、このアッセイにおける結合量を反映する。

【図6A】カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるＰＳＢ１０３および関係のないＩｇＧ４抗体の単回用量薬物動態を示す図である。この実験は、実施例３に記載されている。パネル図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、ＰＳＢ１０３および関係のないＩｇＧ４抗体を注射されたサルからのデータを示す。ｘ軸は、試験抗体注射後の時間（時間）、ｙ軸は、血清中に検出された抗体濃度（μｇ／ｍＬ）をそれぞれ示す。記号は、次のことを意味する：白丸および黒丸は、それぞれ、第１および第２のアリコートからのデータを示し、両方とも雌のサルからのサンプルからのものである。白三角および黒三角は、それぞれ、雄のサルからのサンプルからの第１および第２のアリコートからのデータを示す。

【図6B】カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）におけるＰＳＢ１０３および関係のないＩｇＧ４抗体の単回用量薬物動態を示す図である。この実験は、実施例３に記載されている。パネル図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、ＰＳＢ１０３および関係のないＩｇＧ４抗体を注射されたサルからのデータを示す。ｘ軸は、試験抗体注射後の時間（時間）、ｙ軸は、血清中に検出された抗体濃度（μｇ／ｍＬ）をそれぞれ示す。記号は、次のことを意味する：白丸および黒丸は、それぞれ、第１および第２のアリコートからのデータを示し、両方とも雌のサルからのサンプルからのものである。白三角および黒三角は、それぞれ、雄のサルからのサンプルからの第１および第２のアリコートからのデータを示す。

【図7】カニクイザルにおける、ＰＳＢ１０５、関係のないＩｇＧ１抗体であるおよびイピリムマブの単回投与薬物動態を示す図である。この実験は、実施例３に記載されている。ｘ軸およびｙ軸は、それぞれ、試験抗体の注射後の時間（時間）および血清中で検出された抗体の量（μｇ／ｍＬ）を示す。記号は次のことを示す。黒四角および白四角は、それぞれＰＳＢ１０５を投与した雄サルおよび雌サルからのデータを示す。黒丸および白丸は、それぞれ関係のないＩｇＧ１抗体を投与された雄サルおよび雌サルからのデータを示す。黒三角および白三角は、それぞれイピリムマブを投与された雄サルおよび雌サルからのデータを示す。

【図8A】ＰＳＢ１０３（抗ｈＰＤ１抗体）およびＰＳＢ１０５（抗ｈＣＴＬＡ４抗体）の両方を発現する宿主細胞を産生するための一般的な選択スキームを示す図である。パネル図８Ａは、実施例１に記載される抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３を発現する宿主細胞の作製を示す。細胞内の記号「Ｙ」は、抗体を表す。

【図8B】ＰＳＢ１０３（抗ｈＰＤ１抗体）およびＰＳＢ１０５（抗ｈＣＴＬＡ４抗体）の両方を発現する宿主細胞を産生するための一般的な選択スキームを示す図である。パネル図８Ｂは、実施例４に記載されている、ＰＳＢ１０３および抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５の両方を発現する細胞の作製を示す図である。

【図9】ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５を発現する細胞を選択するための薬物選択プロトコルの図を示す。このプロセスは、実施例４に記載されている。一番左のボックスは、ＰＳＢ１０５の重鎖および軽鎖をコードするベクターによるＧ１９Ｇ４－４Ｂ４細胞（ＰＳＢ１０３を発現）のトランスフェクションを表す。４８時間後、この培養物を３つの培養物に再分割し、異なる薬物選択を行った（図９の中央の３つのボックスに示す）。これら３つの培養物を、９６ウェルプレートに播種した（図９の右側の９つのボックスに示す）。示されているとおり、選択下で成長を示すこれらのウェルのうち４８個を１２ウェルマイクロタイタープレートで拡大させ、それらが産生する抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の相対量をアッセイした。

【図10A】トランスフェクトされた細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。実施例４で説明したように、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方をコードするベクターをトランスフェクトした細胞株を、ＦＡＣＳを用いてスクリーニングし、細胞株内のほとんどの個々の細胞が、ＰＳＢ１０３（ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体）およびＰＳＢ１０５（ＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４抗体）の両方を発現する株を見出した。パネル図１０Ａは、ＰＳＢ１０３のみ、ＰＳＢ１０５のみ、または両方を発現する細胞が出現すると予想されるＦＡＣＳデータのグラフの部分を示す。示されているとおり、ＰＳＢ１０５の検出に使用される抗ＩｇＧ１抗体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）で標識され、ＰＳＢ１０３の検出に使用される抗ＩｇＧ４抗体は、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）で標識されている。

【図10B】トランスフェクトされた細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。実施例４で説明したように、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方をコードするベクターをトランスフェクトした細胞株を、ＦＡＣＳを用いてスクリーニングし、細胞株内のほとんどの個々の細胞が、ＰＳＢ１０３（ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体）およびＰＳＢ１０５（ＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４抗体）の両方を発現する株を見出した。パネル図１０Ｂは、細胞株内のほとんどの個々の細胞が、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方を発現し、ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５のみを発現する細胞はほとんどなかった細胞株からのデータを示す。パネル図１０Ｃは、明らかに検出可能な数の細胞が、ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５のみを発現する一方、個々の細胞の大部分が両方を発現する細胞株からのデータを示す。

【図10C】トランスフェクトされた細胞の蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）分析を示す図である。実施例４で説明したように、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方をコードするベクターをトランスフェクトした細胞株を、ＦＡＣＳを用いてスクリーニングし、細胞株内のほとんどの個々の細胞が、ＰＳＢ１０３（ＩｇＧ４抗ｈＰＤ１抗体）およびＰＳＢ１０５（ＩｇＧ１抗ｈＣＴＬＡ４抗体）の両方を発現する株を見出した。パネル図１０Ｃは、明らかに検出可能な数の細胞が、ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５のみを発現する一方、個々の細胞の大部分が両方を発現する細胞株からのデータを示す。

【図11A】総抗体力価および抗ｈＰＤ１抗体パーセントに関するクローン細胞株のスクリーニングを示す図である。実施例４で説明したように、総抗体力価（パネル図１１Ａに示す）および抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３である抗体のパーセント（パネル図１２Ｂに示す）を決定した。示されているとおり、クローン細胞株は、ｘ軸下のクローン番号によって識別させ、その後に抗体が収集されたときに、細胞が培養された日数を括弧内に示す。

【図11B】総抗体力価および抗ｈＰＤ１抗体パーセントに関するクローン細胞株のスクリーニングを示す図である。実施例４で説明したように、総抗体力価（パネル図１１Ａに示す）および抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３である抗体のパーセント（パネル図１２Ｂに示す）を決定した。示されているとおり、クローン細胞株は、ｘ軸下のクローン番号によって識別させ、その後に抗体が収集されたときに、細胞が培養された日数を括弧内に示す。

【図12A】クローン細胞株２０Ｆ５の生産性および成長特性を示す図である。方法は、実施例４で説明する。図１２Ａにおいて、ｘ軸は、流加生産培養を開始するために使用される培養物の集団倍加レベル（ＰＤＬ、すなわち、リサーチセルバンク（ＲＣＢ）からの解凍後の細胞倍加数）を示し（パネル図１２Ａおよび図１２Ｂ内のデータが得られる）、これは、各棒グラフの下の数字で示す。流加培養を開始するために使用される培養培地中のハイグロマイシンＢ（ＨＧＢ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ）の有無は、ＰＤＬの下に示す。すべての流加培養は、ＭＴＸおよびＨＧＢを含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）中で行った。左端の４つの棒グラフで表す培養は、流加培養の開始前に９～１０回の細胞倍加の間、ＭＴＸおよびＨＧＢを含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ）中であり、これも－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中であった。それ以前は、これらはＭＴＸを含みＨＧＢを含まない培地（＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）に含まれていた。したがって、左端の棒グラフで表される培養物は、この培養物から流加培養を開始したとき、ＰＤＬ９．２までの増殖全体において、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中であった。左から５番目および６番目の棒グラフで表される培養物は、それぞれ、ＰＤＬで示される細胞倍加数の＋ＭＴＸ／－ＨＧＢおよび＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地で行った。流加培養（そこから図１２Ａおよび図１２Ｂのパネルのデータが得られる）を、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中のこれらの培養物から開始した。ｙ軸は、流加培養の総抗体生産性（グラム／リットル）を示し、これは、各流加培養の開始（１１日目）から１１日後に採取したサンプルから決定した。パネル図１２Ｂでは、３つの棒グラフ群のそれぞれの個々の棒グラフは、パネル図１２Ａと同じ順序で同じ流加培養からのデータを表す。分析されたサンプルが採取された流加培養日は、ｘ軸下の３つの棒グラフの群のそれぞれの下に示す。ｙ軸は、抗ｈＰＤ１抗体、すなわちＰＳＢ１０３である、産生された総抗体のパーセントを示す。パネル図１２Ｃは、＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地（破線）または＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地（実線）における細胞株２０Ｆ５の細胞倍加時間を、ＰＤＬと対応させて示す。示されているように、ｘ軸は、ＰＤＬを示し、ｙ軸は、細胞倍加時間を示す。

【図12B】クローン細胞株２０Ｆ５の生産性および成長特性を示す図である。方法は、実施例４で説明する。図１２Ａにおいて、ｘ軸は、流加生産培養を開始するために使用される培養物の集団倍加レベル（ＰＤＬ、すなわち、リサーチセルバンク（ＲＣＢ）からの解凍後の細胞倍加数）を示し（パネル図１２Ａおよび図１２Ｂ内のデータが得られる）、これは、各棒グラフの下の数字で示す。流加培養を開始するために使用される培養培地中のハイグロマイシンＢ（ＨＧＢ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ）の有無は、ＰＤＬの下に示す。すべての流加培養は、ＭＴＸおよびＨＧＢを含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）中で行った。左端の４つの棒グラフで表す培養は、流加培養の開始前に９～１０回の細胞倍加の間、ＭＴＸおよびＨＧＢを含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ）中であり、これも－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中であった。それ以前は、これらはＭＴＸを含みＨＧＢを含まない培地（＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）に含まれていた。したがって、左端の棒グラフで表される培養物は、この培養物から流加培養を開始したとき、ＰＤＬ９．２までの増殖全体において、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中であった。左から５番目および６番目の棒グラフで表される培養物は、それぞれ、ＰＤＬで示される細胞倍加数の＋ＭＴＸ／－ＨＧＢおよび＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地で行った。流加培養（そこから図１２Ａおよび図１２Ｂのパネルのデータが得られる）を、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中のこれらの培養物から開始した。ｙ軸は、流加培養の総抗体生産性（グラム／リットル）を示し、これは、各流加培養の開始（１１日目）から１１日後に採取したサンプルから決定した。パネル図１２Ｂでは、３つの棒グラフ群のそれぞれの個々の棒グラフは、パネル図１２Ａと同じ順序で同じ流加培養からのデータを表す。分析されたサンプルが採取された流加培養日は、ｘ軸下の３つの棒グラフの群のそれぞれの下に示す。ｙ軸は、抗ｈＰＤ１抗体、すなわちＰＳＢ１０３である、産生された総抗体のパーセントを示す。パネル図１２Ｃは、＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地（破線）または＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地（実線）における細胞株２０Ｆ５の細胞倍加時間を、ＰＤＬと対応させて示す。示されているように、ｘ軸は、ＰＤＬを示し、ｙ軸は、細胞倍加時間を示す。

【図12C】クローン細胞株２０Ｆ５の生産性および成長特性を示す図である。方法は、実施例４で説明する。図１２Ａにおいて、ｘ軸は、流加生産培養を開始するために使用される培養物の集団倍加レベル（ＰＤＬ、すなわち、リサーチセルバンク（ＲＣＢ）からの解凍後の細胞倍加数）を示し（パネル図１２Ａおよび図１２Ｂ内のデータが得られる）、これは、各棒グラフの下の数字で示す。流加培養を開始するために使用される培養培地中のハイグロマイシンＢ（ＨＧＢ）およびメトトレキサート（ＭＴＸ）の有無は、ＰＤＬの下に示す。すべての流加培養は、ＭＴＸおよびＨＧＢを含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）中で行った。左端の４つの棒グラフで表す培養は、流加培養の開始前に９～１０回の細胞倍加の間、ＭＴＸおよびＨＧＢを含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ）中であり、これも－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中であった。それ以前は、これらはＭＴＸを含みＨＧＢを含まない培地（＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）に含まれていた。したがって、左端の棒グラフで表される培養物は、この培養物から流加培養を開始したとき、ＰＤＬ９．２までの増殖全体において、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中であった。左から５番目および６番目の棒グラフで表される培養物は、それぞれ、ＰＤＬで示される細胞倍加数の＋ＭＴＸ／－ＨＧＢおよび＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地で行った。流加培養（そこから図１２Ａおよび図１２Ｂのパネルのデータが得られる）を、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中のこれらの培養物から開始した。ｙ軸は、流加培養の総抗体生産性（グラム／リットル）を示し、これは、各流加培養の開始（１１日目）から１１日後に採取したサンプルから決定した。パネル図１２Ｂでは、３つの棒グラフ群のそれぞれの個々の棒グラフは、パネル図１２Ａと同じ順序で同じ流加培養からのデータを表す。分析されたサンプルが採取された流加培養日は、ｘ軸下の３つの棒グラフの群のそれぞれの下に示す。ｙ軸は、抗ｈＰＤ１抗体、すなわちＰＳＢ１０３である、産生された総抗体のパーセントを示す。パネル図１２Ｃは、＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地（破線）または＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地（実線）における細胞株２０Ｆ５の細胞倍加時間を、ＰＤＬと対応させて示す。示されているように、ｘ軸は、ＰＤＬを示し、ｙ軸は、細胞倍加時間を示す。

【図13A】液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によるＰＳＢ２０５の調製物（ＰＳＢ１０３－ＳおよびＰＳＢ１０５－Ｓと呼ばれる）から単離されたＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の分析を示す図である。この実験は、実施例５に記載している。パネル図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃは、それぞれ、ＰＳＢ１０３－Ｓ、ＰＳＢ１０５－Ｓ、およびこれらの抗体が単離されたＰＳＢ２０５の調製からのデータを示す。ダルトン単位でのピークのサイズは、最大のピークの近くに示す。様々な種のＨＣ残基Ｎ２９７のグリコシル化状態（Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９），Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ γＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６３：７８－８５の番号付けスキームに従って番号付け、これは、参照により本明細書に組み込まれる；Ｎ２９７は、それぞれ配列番号１および１３のＮ２９６位およびＮ２９８位に対応する）は、以下のマークによって示す：Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ、各ＨＣのＮ２９７に３つのマンノース（Ｍａｎ３）残基、４つのＮ－アセチルグルコサミン残基（（ｇｌｃＮＡｃ）４）、および１つのフコース残基（（Ｆｕｃ）１）（Ｍａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１）を含むグリカン；Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ、一方のＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１グリカンと、他方のＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１グリカン；Ｇ０Ｆ／Ｇ１Ｆ、１つのＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１グリカン、および他のＨＣのＮ２９７上に１つのガラクトース残基（（Ｇａｌ）１）、３つのマンノース残基、４つのＮ－アセチルグルコサミン残基、および１つのフコース残基を含むグリカン（（Ｇａｌ）１Ｍａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１）。これらの化学構造の描写については、例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭＡｂｓ８（４）：７０６－７１７およびグリカンの記号命名法（ＳＮＦＧ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｌｙｃａｎｓ／ｓｎｆｇ．ｈｔｍｌで入手可能）を参照され、これは参照により本明細書に組み込まれる。ｘ軸は、検出された抗体種の質量（ダルトン）を示し、ｙ軸は、分析されたサンプル内の存在量のパーセントを反映するパーセント強度を示す。

【図13B】液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によるＰＳＢ２０５の調製物（ＰＳＢ１０３－ＳおよびＰＳＢ１０５－Ｓと呼ばれる）から単離されたＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の分析を示す図である。この実験は、実施例５に記載している。パネル図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃは、それぞれ、ＰＳＢ１０３－Ｓ、ＰＳＢ１０５－Ｓ、およびこれらの抗体が単離されたＰＳＢ２０５の調製からのデータを示す。ダルトン単位でのピークのサイズは、最大のピークの近くに示す。様々な種のＨＣ残基Ｎ２９７のグリコシル化状態（Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９），Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ γＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６３：７８－８５の番号付けスキームに従って番号付け、これは、参照により本明細書に組み込まれる；Ｎ２９７は、それぞれ配列番号１および１３のＮ２９６位およびＮ２９８位に対応する）は、以下のマークによって示す：Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ、各ＨＣのＮ２９７に３つのマンノース（Ｍａｎ３）残基、４つのＮ－アセチルグルコサミン残基（（ｇｌｃＮＡｃ）４）、および１つのフコース残基（（Ｆｕｃ）１）（Ｍａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１）を含むグリカン；Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ、一方のＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１グリカンと、他方のＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１グリカン；Ｇ０Ｆ／Ｇ１Ｆ、１つのＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１グリカン、および他のＨＣのＮ２９７上に１つのガラクトース残基（（Ｇａｌ）１）、３つのマンノース残基、４つのＮ－アセチルグルコサミン残基、および１つのフコース残基を含むグリカン（（Ｇａｌ）１Ｍａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１）。これらの化学構造の描写については、例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭＡｂｓ８（４）：７０６－７１７およびグリカンの記号命名法（ＳＮＦＧ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｌｙｃａｎｓ／ｓｎｆｇ．ｈｔｍｌで入手可能）を参照され、これは参照により本明細書に組み込まれる。ｘ軸は、検出された抗体種の質量（ダルトン）を示し、ｙ軸は、分析されたサンプル内の存在量のパーセントを反映するパーセント強度を示す。

【図13C】液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によるＰＳＢ２０５の調製物（ＰＳＢ１０３－ＳおよびＰＳＢ１０５－Ｓと呼ばれる）から単離されたＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の分析を示す図である。この実験は、実施例５に記載している。パネル図１３Ａ、図１３Ｂ、および図１３Ｃは、それぞれ、ＰＳＢ１０３－Ｓ、ＰＳＢ１０５－Ｓ、およびこれらの抗体が単離されたＰＳＢ２０５の調製からのデータを示す。ダルトン単位でのピークのサイズは、最大のピークの近くに示す。様々な種のＨＣ残基Ｎ２９７のグリコシル化状態（Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９６９），Ｔｈｅ ｃｏｖａｌｅｎｔ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ａｎ ｅｎｔｉｒｅ γＧ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌｅ， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ６３：７８－８５の番号付けスキームに従って番号付け、これは、参照により本明細書に組み込まれる；Ｎ２９７は、それぞれ配列番号１および１３のＮ２９６位およびＮ２９８位に対応する）は、以下のマークによって示す：Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ、各ＨＣのＮ２９７に３つのマンノース（Ｍａｎ３）残基、４つのＮ－アセチルグルコサミン残基（（ｇｌｃＮＡｃ）４）、および１つのフコース残基（（Ｆｕｃ）１）（Ｍａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１）を含むグリカン；Ｇ０Ｆ／Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮＡｃ、一方のＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１グリカンと、他方のＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）３（Ｆｕｃ）１グリカン；Ｇ０Ｆ／Ｇ１Ｆ、１つのＨＣのＮ２９７上のＭａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１グリカン、および他のＨＣのＮ２９７上に１つのガラクトース残基（（Ｇａｌ）１）、３つのマンノース残基、４つのＮ－アセチルグルコサミン残基、および１つのフコース残基を含むグリカン（（Ｇａｌ）１Ｍａｎ３（ｇｌｃＮＡｃ）４（Ｆｕｃ）１）。これらの化学構造の描写については、例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６）、Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭＡｂｓ８（４）：７０６－７１７およびグリカンの記号命名法（ＳＮＦＧ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｌｙｃａｎｓ／ｓｎｆｇ．ｈｔｍｌで入手可能）を参照され、これは参照により本明細書に組み込まれる。ｘ軸は、検出された抗体種の質量（ダルトン）を示し、ｙ軸は、分析されたサンプル内の存在量のパーセントを反映するパーセント強度を示す。

【図14A】ＬＣ－ＭＳによる異なるロットのＰＳＢ２０５の分析を示す。実施例５に記載のとおり、２つの異なるロットのＰＳＢ２０５をＬＣ－ＭＳによって分析した。パネル図１４Ａおよび図１４Ｂは、それぞれ、ＰＳＢ２０５－ＴｏｘロットおよびＰＳＢ２０５－ＧＭＰロットからのデータを示す。ｘ軸は、検出された抗体種の質量（ダルトン）を示し、ｙ軸は、分析されたサンプル内の存在量のパーセントを反映するパーセント強度を示す。抗体のグリコシル化状態は、図１３のように示す。

【図14B】ＬＣ－ＭＳによる異なるロットのＰＳＢ２０５の分析を示す。実施例５に記載のとおり、２つの異なるロットのＰＳＢ２０５をＬＣ－ＭＳによって分析した。パネル図１４Ａおよび図１４Ｂは、それぞれ、ＰＳＢ２０５－ＴｏｘロットおよびＰＳＢ２０５－ＧＭＰロットからのデータを示す。ｘ軸は、検出された抗体種の質量（ダルトン）を示し、ｙ軸は、分析されたサンプル内の存在量のパーセントを反映するパーセント強度を示す。抗体のグリコシル化状態は、図１３のように示す。

【図15】ＰＳＢ２０５のＧＭＰロットからの熱容量プロットを示す図である。この実験は、実施例７に示す。ｘ軸は、温度（℃）を示し、ｙ軸は、モル熱容量（ｋｃａｌ／モル／℃）を示す。

【図16】ＣＭＶ感染細胞溶解物および抗体で刺激され、抗ＣＤ８抗体およびＨＬＡ－ＣＭＶデキストラマーで標識された細胞のフローサイトメトリー分析を示す図である。この実験は、実施例８に記載されている。すべてのパネルのｘ軸は、ＦＩＴＣ標識抗ＣＤ８抗体からの蛍光を示し、ｙ軸は、フィコエリトリン（ＰＥ）標識ＨＬＡ－ＣＭＶデキストラマーからの蛍光を示す。各パネルの四角で囲んだ領域は、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞を示し、四角で囲んだ領域の左側の数字は、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞である全細胞のパーセンテージを示す。パネル図１６Ａは、ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体およびＣＭＶ感染細胞ライセートで刺激した細胞からのデータを示す。パネル図１６Ｂは、ＰＳＢ１０３およびＣＭＶ感染細胞ライセートで刺激した細胞からのデータを示す。パネル図１６Ｃは、ＰＳＢ１０５およびＣＭＶ感染細胞ライセートで刺激した細胞からのデータを示す。パネル図１６Ｄは、ＰＳＢ２０５およびＣＭＶ感染細胞ライセートで刺激した細胞からのデータを示す。

【図17A】ＣＭＶ感染細胞ライセートおよび抗体で刺激した細胞中のＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞のパーセンテージおよび絶対数の定量を示す図である。この実験は、実施例８に記載されている。パネル図１７Ａは、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞であった全細胞のパーセンテージを示す。ｘ軸は、サンプルを刺激するために使用された抗体を示し、ｙ軸は、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞であった全細胞のパーセンテージを示す。パネル図１７Ｂのグラフは、検出されたＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞の絶対数をｙ軸に示し、サンプルを刺激するために使用した抗体をｘ軸に示す。両方のパネルで、エラーバーは標準偏差を示す。簡素にするために、エラーバーの半分のみを示す。

【図17B】ＣＭＶ感染細胞ライセートおよび抗体で刺激した細胞中のＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞のパーセンテージおよび絶対数の定量を示す図である。この実験は、実施例８に記載されている。パネル図１７Ａは、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞であった全細胞のパーセンテージを示す。ｘ軸は、サンプルを刺激するために使用された抗体を示し、ｙ軸は、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞であった全細胞のパーセンテージを示す。パネル図１７Ｂのグラフは、検出されたＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞の絶対数をｙ軸に示し、サンプルを刺激するために使用した抗体をｘ軸に示す。両方のパネルで、エラーバーは標準偏差を示す。簡素にするために、エラーバーの半分のみを示す。

【図18】腫瘍モデル系におけるＰＳＢ２０５およびその成分抗体の効果を示す図である。実験は、実施例９に詳細に記載されている。ｘ軸は、実験期間中の日数を示し、ｙ軸は、腫瘍体積をｍｍ^３で示す。腫瘍に対する試験済みの抗体治療は次の記号で示す：黒丸、ＩｇＧ陰性対照抗体；黒四角、ＰＳＢ１０３（抗ｈＰＤ１抗体）；上向き黒三角形、ＰＳＢ１０５（抗ｈＣＴＬＡ４抗体）；下向き黒三角形、ＰＳＢ２０５（ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の混合）。アスタリスクは、ＩｇＧ対照抗体のデータとＰＳＢ２０５のデータと間の差の統計的有意性レベルに関する以下のｐ値を示す。＊、ｐ＝０．０３；＊＊、ｐ＝０．０１；および＊＊＊、ｐ＝０．０００６。

【図19】個々の患者の腫瘍直径のベースラインからの変化を示す図である。方法は、実施例１０に記載されている。棒グラフは、表１２に列挙されている評価可能な患者３２名のうち、肺癌（ＬＣ）患者１３名（青色の棒）および上咽頭癌（ＮＰＣ）患者１９名（茶色の棒）を含む、個々の各ヒト患者の腫瘍直径のベースラインからの変化を示している。ｙ軸は、腫瘍直径の変化をｍｍ単位で示す。直径の変化も、各棒グラフの上（増加の場合）または各棒グラフの下（減少の場合）に示される。各患者に投与されるＰＳＢ２０５の投与量は、ｘ軸の真下に示す。その上に星印が付けられた３つの棒グラフは、元の腫瘍の直径の変化を有することに加えて、新規腫瘍を有している患者を示す。

【図20】ＰＳＢ２０５の生成および特性評価を示す図である。（図２０Ａ）：１つの哺乳動物細胞株から２つの正しく組み立てられた抗体を産生するためのＭａｂＰａｉｒ技術の原理を示す。独自に設計されたＨＣペアリングキーおよびＨＣ／ＬＣペアリングキーを使用して、同族のＨＣおよびＬＣペアリングを制御し、望ましくない副産物を排除できる。（図２０Ｂ）：産生細胞株におけるＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の共発現は、それぞれｈｕＩｇＧ４およびｈｕＩｇＧ１特異的試薬の細胞内染色によって検出された。（図２０Ｃ）：ＰＳＢ２０５サイズバリアントをサイズ排除ＨＰＬＣによって分析した。クロマトグラムは、ＰＳＢ２０５の２つのｍＡｂのモノマーのメインピークを重ねて示し、高分子量（ＨＭＷ）種の前部マイナーピーク、および低分子量（ＬＭＷ）種の後部マイナーピーク（検出されない）を示している。その結果、モノマー（メインピーク）によって定義されるＰＳＢ２０５純度は、典型的には、様々なバッチで９７～９９％と測定された。（図２０Ｄ）ＰＳＢ２０５における２つのｍＡｂのベースライン分離は、疎水性相互作用ＨＰＬＣ法によって達成された。したがって、これは２つのｍＡｂ、［抗ＰＤ－１］：［抗ＣＴＬＡ－４］（ｗ／ｗ）の濃度比を決定するためのツールとして機能した。（図２０Ｅ）液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によるＰＳＢ２０５の無傷のグリコフォーム質量プロファイルの分析を示す。デコンボリューションされた質量スペクトルの１４９，３２０Ｄａおよび１４７，６１０Ｄａの２つのメインピークは、それぞれ抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４のＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆグリコフォームと十分に一致する。（図２０Ｆ）：ＬＣ－ＭＳ／ＭＳペプチドマッピングによるＰＳＢ２０５中の２つのｍＡｂの特徴を示す図である。いずれかのｍＡｂから同定されたペプチドを区別するために、精製した個々の抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４もＰＳＢ２０５サンプルと共に分析した。抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４のトリプシンペプチドのほとんどは、２つのマップに割り当てられたピークで同定された。中央のパネルには、ＰＳＢ２０５のペプチドマップ（抗ＰＤ－１および抗ＣＴＬＡ－４の両方を含む）が含まれており、これは２つの個別のｍＡｂペプチドマップを組み合わせたペプチドマップを表す。同定された配列カバー率は、抗ＰＤ－１については９８．２％、抗ＣＴＬＡ－４については９５．８％であったため、タンパク質配列は、高い信頼度で確認された。

【図21】ＰＳＢ２０５の前臨床評価を示す図である。（図２１Ａ）：健康なドナーからの単球由来未熟樹状細胞を、１０倍段階希釈した様々な抗体の存在下で、１：１０および１：３の比率で、異なるドナーからの精製Ｔ細胞と混合した（１０μｇ／ｍｌ～０．００１μｇ／ｍｌ）。６日目に、上清中のＩＦＮガンマのレベルをＥＬＩＳＡによって評価した。（図２１Ｂ）：健康なドナーからのＰＢＭＣを、異なる比率（５：１～０．２：１）で混合した様々な濃度のＰＳＢ１０３（０．５μｇ／ｍｌ～２０μｇ／ｍｌ）およびＰＳＢ１０５（０．０５μｇ／ｍｌ～４μｇ／ｍｌ）の存在下で、ＳＥＢ（１００ｎｇ／ｍｌ）で９６時間刺激した。上清中のＩＬ－２のレベルをＥＬＩＳＡによって測定した。等高線プロットは、異なる濃度および様々な比率でのＩＬ－２の倍加を示す。各データポイントは、グラフ上の赤い点で表す。右側の棒グラフは、倍加を白（最高）および緑（最低）で色別に表す。この結果は、異なるドナーからの３つの実験を代表するものである。（図２１Ｃ）：ＨＬＡ－ＣＭＶｐｐ６５陽性ドナーからのＰＢＭＣを、様々な抗体の存在下で、ＣＭＶ（３μｇ／ｍＬ）ライセートで７日間刺激した：ＩｇＧ１（５μｇ／ｍＬ）、ＰＳＢ１０３（５μｇ／ｍＬ）、ＰＳＢ１０５（２．５μｇ／ｍＬ）、ＰＳＢ２０５（５μｇ／ｍＬ）。培養物中のＣＭＶｐｐ６５陽性ＣＤ８Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって数えた。（図２１Ｄ）：ＨＣＣ８２７をＮＣＧマウスに移植した。腫瘍サイズが６０～８０ｍｍ＾３に達したとき、「方法および材料」に記載のとおり、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを使用して、ＮＣＧマウスを再構成した。対照ヒトＩｇＧ１（７．５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）、ＰＳＢ１０３（５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）、ＰＳＢ１０５（２．５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）、およびＰＳＢ１０３：ＰＳＢ１０５と２：１の比率で混合（７．５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）に週に２回、３週間ｉ．ｐ．注射した。（図２１Ｅ）：それぞれ５ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇをカニクイザルに単回静脈内投与後のＰＳＢ１０３（左）、ＰＳＢ１０５およびイピリムマブ（右）の血清濃度対時間曲線を示す図である。

【図22】サイクル１および定常状態（サイクル６）における投与後の時間を対応させたａＣＴＬＡ－４（図２２Ａ）およびａＰＤ－１（図２２Ｂ）の平均（＋ＳＤ）血漿濃度であり、Ｑ３Ｗの０．３ｍｇ／ｋｇ～１０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでのｌｏｇ１０スケール（μｇ／ｍＬ）で示す。１つの時点での値の半分以上（＞５０％）がＢＱＬである場合、平均値は、０として報告される。これらのＢＱＬ値については、片対数スケールプロットでは省略される。１つの時点において、サンプルが２つのみ存在する場合、エラーバーは、表示しない。（図２２Ｃ）：ＰＳＢ２０５治療後の循環ＣＤ３Ｔ細胞におけるＰＤ－１受容体の占有率を示す図である。ＰＤ１受容体占有率の平均パーセンテージを、ＰＳＢ２０５の治療前および後の様々な時点でプロットした。（図２２Ｄ）ＰＳＢ２０５治療後のＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞の増殖を示す図である。治療前または治療後１６８時間後のＫｉ６７＋ＣＤ４ Ｔ細胞（左パネル）とＣＤ８ Ｔ細胞（右パネル）のパーセンテージを各患者において比較し、線で結び付けた。治療前または治療後１６８時間のＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の平均値：パーセンテージを比較し、線で結び付けた。（図２２Ｄ）および（図２２Ｅ）に示すｐ値は、ウィルコクソンの符号付きランク検定を使用して計算した。

【図23】腫瘍反応を示す図である。ベースラインからの標的病変の最良客観的反応（図２３Ａ）。１名の患者は、ベースライン後の腫瘍評価結果を１つのみ得て、標的病変のうちの１つを測定できなかった。以前の免疫療法を受けていない患者（図２３Ｂ）および以前の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けた患者（図２３Ｃ）における腫瘍縮小のベースラインからの変化率を示す。－３０％の点線は、ＰＲのしきい値を示す。個々の患者の治療期間（図２３Ｄ）を示す。図２３Ｅには、以前のＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβ二重特異性阻害剤療法に対して抵抗性であった、５ｍｇ／ｋｇでの上咽頭癌患者における代表的な部分腫瘍応答を示す。すべての標的病変の直径の合計は、ベースラインで１０１ｍｍ、７週目で４７ｍｍ（－５３．５％）であった。図２３Ｆは、以前のニボルマブおよび４－１ＢＢ阻害剤療法に対して抵抗性であった、１０ｍｇ／ｋｇでの非小細胞肺癌患者における代表的な部分腫瘍応答を示す。すべての標的病変の直径の合計は、ベースラインで７７ｍｍ、１３週目で４９ｍｍ（－３６．４％）であった。

【図24】両方のパネル図２４Ａおよび図２４Ｂは、ＰＳＢ１０３と称される抗ＰＤ－１ＩｇＧ４のＡｌｌｏ－ＭＬＲにおけるＴ細胞活性化の増強を示す。Ａｂ＝抗体；ＩＦＮγ＝インターフェロンガンマ；ＭＬＲ＝混合リンパ球反応；Ｎｉｖｏ＝ニボルマブ；Ｐｅｍｂｒｏ＝ペンブロリズマブ。

【図25】二重細胞レポーター細胞アッセイにおいて、ＰＳＢ２０５およびＰＳＢ１０３が、ＰＤ－１結合および機能活性を阻害し（図２５Ａ）、ＰＳＢ２０５およびＰＳＢ１０５が、ＣＴＬＡ４媒介阻害活性を阻害した（図２５Ｂ）ことを示す図である。

【図26】ＰＳＢ２０５がＳＥＢスーパー抗原によって誘導されるＴ細胞活性化を相乗的に増強することを示す。

【図27】ＨＬＡ－ＣＭＶｐｐ６５陽性ドナーからのＰＢＭＣが、７日間、様々な抗体の存在下でＣＭＶ（３ｕｇ／ｍｌ）ライセートによって、二重で刺激されたことを示す図である：ＩｇＧ１（５ｕｇ／ｍｌ）、ＰＳＢ１０３（５ｕｇ／ｍｌ）、ＰＳＢ１０５（２．５ｕｇ／ｍｌ）、ＰＳＢ２０５（５ｕｇ／ｍｌ）。培養物中のＣＭＶｐｐ６５陽性ＣＤ８Ｔ細胞の数をフローサイトメトリーによって数えた。

【図28】Ｊｅｋｏ－１をＮＣＧマウスに移植した。腫瘍サイズが８０～１００ｍｍ＾３に達したとき、「方法および材料」に記載のとおり、健康なドナーからのヒトＰＢＭＣを使用して、ＮＣＧマウスを再構成した。対照ヒトＩｇＧ１（７．５ｍｇ／ｋｇｎ＝５）、ＰＳＢ１０３（５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）、ＰＳＢ１０５（２．５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）、およびＰＳＢ１０３：ＰＳＢ１０５と２：１の比率で混合（７．５ｍｇ／ｋｇ ｎ＝５）に週に２回、３週間ｉ．ｐ．注射した。

【図29】ＰＳＢ２０５治療により、カニクイザルにおける循環ＣＤ４＋／ＣＤ２７８＋Ｔ細胞のレベルが増加することを示す。１６日目（２回目の投与から２４時間後）の推定血清濃度を、１６日目のＰＳＢ２０５治療サルの血液中の循環ＣＤ４＋／ＣＤ２７８＋Ｔ細胞の％に対してプロットした。

【図30】ＣＴＬＡ－４（図３０Ａ）およびａＰＤ－１（図３０Ｃ）の実際の用量によって正規化された個々のＣｍａｘ、ならびにａＣＴＬＡ－４（図３０Ｂ）およびａＰＤ－１（図３０Ｄ）について実際の用量によって正規化させた個々のＡＵＣ０－ｔが、用量レベルに対応させて示されることが示されている。

【図31】ＰＳＢ２０５治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋ＣＤ８－Ｔ細胞の拡大を示す図である。異なる時点（投与前、治療後１６８時間および３３６時間）における各用量群のＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の平均パーセンテージを比較し、実線で結び付けた。

【図32】ＰＳＢ２０５治療後のＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋ＣＤ８－Ｔ細胞の拡大を示す図である。異なる時点（投与前、治療後１６８時間および３３６時間）における各用量群のＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の平均パーセンテージを比較し、実線で結び付けた。

【発明を実施するための形態】

【0055】

【表1】

【0056】

本明細書に記載されるのは、１つの細胞株中で産生され得る抗体の混合物または組み合わせであり、本明細書に記載される混合物中の抗体は、抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体であり、それぞれが、特定の配列および特性を有する。抗体は、混合物中に特定の比率で存在する。本明細書に提供されるデータによって明らかであるように、この混合物は、抗体単独、２つの別個の細胞株中で産生された抗体の混合物、および／または抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の他の混合物のいずれかと比較して、有利な特性を有する。

【0057】

定義
本明細書で意味する「有害事象」（ＡＥ）とは、医学的治療または処置の使用に一時的に関連し、医学的治療または処置に関連しているとみなされ得る、またはみなされ得ない、好ましくない意図しないあらゆる兆候（臨床検査所見の異常を含む）、症状、または疾患である。ＡＥは、以下のようにグレード１～５ＡＥに分類される：グレード１、無症候性、または臨床もしくは診断検査で観察される軽度の症状を含む軽度のＡＥ、いかなる介入も示さない；グレード２、年齢に応じた日常生活活動（ＡＤＬ）を制限し得る最小限の症状を含む中程度のＡＥ、局所的または非侵襲的介入を示す；グレード３、直ちに生命を脅かすものではなく、生活に支障をきたし得る、またはセルフケアに伴うＡＤＬを制限し得る、入院または入院の延長の必要性を示す重度または医学的に重大なＡＥ；グレード４、緊急介入を示す生命を脅かすＡＥ；グレード５、死に関連するＡＥ。免疫関連有害事象（ｉｒＡＥ）は、本明細書においてＡＥが意味する範囲内に含まれる。ｉｒＡＥは、一時的に薬物治療に関連しており、身体内のあらゆる器官系、最も一般的には消化管、内分泌腺、皮膚、および肝臓の炎症で構成され得る。例えば、Ｐｏｓｔｏｗ ｅｔ ａｌ．（２０１８）、Ｉｍｍｕｎｅ－ｒｅｌａｔｅｄ ａｄｖｅｒｓｅ ｅｖｅｎｔｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．３７８：１５８－１６８を参照のこと（ＤＯＩ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｒａ１７０３４８１で入手可能であり、これは、参照により本明細書に組み込まれる）。中枢神経系、または心血管系、肺系、筋骨格系、および血液系の炎症も、ｉｒＡＥの一部であり得る。同上

【0058】

本明細書で意味する「改変」は、アミノ酸配列の変化である。改変は、挿入、欠失、または置換であり得る。「改変」とは、１つのアミノ酸の挿入、欠失、または置換である。例えば、欠失によってアミノ酸配列から３つのアミノ酸が除去された場合、３つの改変（この場合は欠失）が発生している。置換である改変は、元の配列中に存在するアミノ酸、その後に元の配列内のアミノ酸の位置、その後に元のアミノ酸を置き換えるアミノ酸を記載することによって言及することができる。例えば、Ｇ１３３Ｍは、元の配列の１３３位のグリシンが、メチオニンに置き換えられることを意味する。さらに、１３３Ｍは、１３３位のアミノ酸がメチオニンであることを意味するが、元のアミノ酸の同一性を特定するものではなく、メチオニンなど、任意のアミノ酸であり得る。最後に、Ｇ１３３は、グリシンが元の配列の１３３位のアミノ酸であることを意味する。

【0059】

本明細書で意味する「抗体」は、少なくとも１つの重鎖（ＨＣ）可変ドメイン（Ｖ_Ｈ）または軽鎖（ＬＣ）可変ドメイン（Ｖ_Ｌ）を含むタンパク質である。抗体は、多くの場合、Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌの両方を含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２，１９９１，ｐｐ．ｘｖｉ－ｘｉｘおよびｐｐ．１０３－５３３に詳細に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。「抗体」には、単鎖Ｆｖ抗体（リンカーによって連結されたＶ_ＨおよびＶ_Ｌを含むｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ：Ｆｃ抗体などの異なる形式を有する分子（Ｃａｒａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｓ ａｎｄ Ｃａｐｒａ，Ｃｈ．９ ｉｎ ＦＵＮＤＡＭＥＮＴＡＬ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，３．ｓｕｐ．ｒｄ ｅｄ．，Ｐａｕｌ， ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３，ｐｐ．２８４－２８６に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる）、および他の多くの可能な形式の中でも、以下に定義するＩｇＧ抗体が挙げられる。

【0060】

本明細書で意味する「二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）」は、例えば、Ｈｕｅｈｌｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒｓ ｆｏｒ ｃａｎｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９３（３）：２９０－２９６に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0061】

「化学療法剤」は、分裂中の細胞を標的とし、細胞分裂に関連するプロセス、例えば、ＤＮＡ複製、ＲＮＡ合成、タンパク質合成、有糸分裂紡錘体の組み立て、分解または機能、および／またはヌクレオチドまたはアミノ酸など、これらのプロセスにおいて任意の役割を担う分子の合成もしくは安定性を妨害する。したがって、化学療法剤は、がん細胞および他の分裂細胞の両方を死滅させ得る。化学療法剤は、当技術分野においてよく知られている。それらには、例えば、以下の剤が挙げられる：アルキル化剤（例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、メチルロムスチン、シス－ジアンミンジクロロ白金、チオテパ、およびアジリジニルベンゾキノン）；無機イオン（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ナイトロジェンマスタード（例えば、塩酸メルファラン、クロランブシル、イホスファミド、および塩酸メクロレタミン）；ニトロソウレア（例えば、カルムスチン（ＢＣＮＵ））；抗腫瘍性抗生物質（例えば、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、ミトラマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、およびブレオマイシン）；植物誘導体（例えば、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＶＰ－１６、およびＶＭ－２６）；代謝拮抗剤（例えば、ロイコボリンを含むまたは含まないメトトレキサート、ロイコボリンを含むまたは含まない５－フルオロウラシル、５－フルオロデオキシウリジン、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ゲムシタビン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、およびフルダラビン）；ポドフィロトキシン（例えば、エトポシド、イリノテカン、およびトポテカン）；ならびにアクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、およびミトキサントロン。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）を参照されたい。この関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0062】

他の化学療法剤としては、上記に列挙したものと同じ一般的なメカニズムによって作用するものが挙げられる。例えば、アルキル化剤およびナイトロジェンマスタードなどのように、ＤＮＡをアルキル化することによって作用する剤は、化学療法剤とみなされる。例えば、メトトレキサート、シタラビン、６－メルカプトプリン、５－フルオロウラシル、およびゲムシタビンなどのヌクレオチド合成を妨げる剤は、化学療法剤とみなされる。有糸分裂紡錘体毒は、例えばパクリタキセルおよびビンブラスチンと同様に化学療法剤とみなされている。ＤＮＡ複製を妨害するトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、ポドフィロトキシン）は、化学療法剤とみなされている。様々な機構によってＤＮＡ合成を妨げる抗生物質（例えば、ドキソルビシン、ブレオマイシン、およびマイトマイシン）は、化学療法剤とみなされている。アミノ酸をカルバモイル化する剤（例えば、ロムスチン、カルムスチン）、またはアスパラギンプールを枯渇させる剤（例えば、アスパラギナーゼ）も化学療法剤とみなされる。Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，１７．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｅｃｔｉｏｎ １１，Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１４４．Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔａｂｌｅ１４４－２（１９９９）。化学療法剤には、上記に挙げた化学療法剤によって影響を受けるのと同じ細胞プロセスに直接影響を与えるものが特に含まれる。

【0063】

抗体の混合物に関連して本明細書で意味する「同族」ＨＣは、特定のＬＣが対合して特定の抗原に対する結合部位を形成することが知られているＨＣである。例えば、既知の完全長ＩｇＧ抗体Ｘが、抗原Ｘに結合する場合、抗体Ｘ ＨＣは、抗体Ｘ ＬＣの同族ＨＣであり、その逆も同様である。さらに、抗体の混合物が抗原Ｙに結合する抗体Ｘおよび抗体Ｙの両方を含む場合、抗体Ｙ ＨＣは、抗体Ｘ ＬＣに対して「非同族」であり、その逆も同様であり、抗体Ｙ ＬＣは、抗体Ｘ ＨＣに対して「非同族」であり、その逆も同様である。

【0064】

「相補性決定領域」（ＣＤＲ）は、Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ内の超可変領域である。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲを含む。ＣＤＲは、抗体の表面にループを形成し、主に抗体の結合特異性の決定に関与する。ＣＤＲは、さらに４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４と呼ばれる）の間、ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４などに点在している。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、Ｖ_Ｈ ＣＤＲを次のように配置する：ＣＤＲ１は、３１～３５位にある（３５Ａおよび３５Ｂに番号付けされた挿入であり得る）；ＣＤＲ２は、５０～６５位にある（５２Ａ～５２Ｃに番号付けされた挿入であり得る）；ＣＤＲ３は、９５～１０２位にある（１００Ａ～１００Ｋの番号付けされた挿入であり得る）。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上記、ｘｖｉｉ。重鎖ＣＤＲのこれらの位置は、Ｖ_Ｈ ＣＤＲ１が本明細書では２６～３５位を含むとみなされることを除いて、本明細書で使用される。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．は、Ｖ_Ｌ ＣＤＲを以下のように配置する：ＣＤＲ１は、２４～３４位にある（２７Ａ～２７Ｆに番号付けされた挿入であり得る）；ＣＤＲ２は、５０～５６位にある；ＣＤＲ３は、８９～９７位にある（９５Ａ～９５Ｆに番号付けされた挿入であり得る）。Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記、ｘｖｉｉ、参照により本明細書に組み込まれる。Ｖ_Ｌを有するＣＤＲのこれらの位置が本明細書で使用される。直前に使用した番号付けスキームは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．によって利用されたものであり、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記、１０３～５３９ページに例示されている。

【0065】

２つの治療／薬物が同じ短い時間枠内、例えば同じ日、または同じより長い時間枠内で投与される場合、治療または薬物は、別の治療または薬物と「同時に」投与されたとみなされる。このようなより延長された時間枠には、例えば、一方の治療／薬物が週に１回投与され、他方が４日ごとに投与される状況が含まれ得る。２つの治療／薬物が同日に投与されることはまったくない、またはまれである場合もあり得るが、２つの治療／薬物は、数週間、数ヶ月、またはそれ以上の一般的な期間にわたって、継続して投与される。同様に、一方の薬物が年に１回投与され、他方の薬物が毎週投与される場合、年に１回投与される薬物の投与前および／または投与後に、毎週投与される薬物がその年の間に投与される場合、それらは「同時」に投与されたものとみなされる。したがって、本明細書で意味するように、２つの治療／薬物の「同時」投与には、共通の期間に継続する２つの異なる治療／薬物による進行中の治療が含まれる。

【0066】

「完全奏効」（ＣＲ）は、治療中のがん患者に関連して使用される場合、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（バージョン１．１）に記載のとおり評価される。Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００９），Ｎｅｗ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｕｒｓ：ｒｅｖｉｓｅｄ ＲＥＣＩＳＴ ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（ｖｅｒｓｉｏｎ １．１．），Ｅｕｒ． Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ４５：２２８－２４７、その全体が本明細書に組み込まれる。これらのガイドラインでは、ベースラインにおいて、最大５個の腫瘍の、測定可能なすべての腫瘍の直径を測定することによって、全体的な腫瘍量を評価する方法について説明している。これらの直径を加算して、合計を求める。これらの測定された腫瘍は、「標的病変」と呼ばれる。ＣＲでは、本試験の過程において、すべての標的病変が検出不可能となった。

【0067】

「部分奏効」（ＣＲ）も、治療中のがん患者に関連して使用される場合、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（バージョン１．１）に記載のとおり評価される。ＰＲを有すると判定された患者では、標的病変（複数可）の直径の合計が、ベースラインでのこれらの直径の合計と比較して、治療の過程で、少なくとも３０％減少している。

【0068】

「進行性疾患」（ＰＤ）も、治療中のがん患者に関連して使用される場合、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（バージョン１．１）に記載のとおり評価される。ＰＤを有すると判定された患者では、標的病変（複数可）の直径の合計が、試験の過程中に検出された最小の合計と比較して、少なくとも２０％増大している。この最小の合計は、ベースラインで検出された合計、または本試験の後半で検出された合計であり得る。さらに、合計が少なくとも２０％増加した場合には、少なくとも５ｍｍの絶対的増加を示す必要がある。１つ以上の新規腫瘍の出現もＰＤであるとみなされる。

【0069】

「安定疾患」（ＳＤ）も、治療中のがん患者に関連して使用される場合、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（バージョン１．１）に記載のとおり評価される。ＳＤは、試験の過程において検出された直径の最小合計と比較した場合、標的病変の直径の合計がＰＲとして認定されるほど十分に縮小していないか、またはＰＤとして認定されるほど十分に増大していないことを意味する。この最小の合計は、ベースラインで検出された合計、または本試験の後半で検出された合計であり得る。

【0070】

「客観的奏効率」（ＯＲＲ）は、ＰＲを達成した患者の割合とＣＲを達成した患者の割合との合計である。

【0071】

「病勢コントロール率」（ＤＣＲ）は、ＰＲを達成した患者の割合と、ＣＲを達成した患者の割合と、ＳＤを達成した患者の割合との合計である。

【0072】

本明細書で意味する場合、第１の核酸配列がアミノ酸配列を「コードする」とは、遺伝暗号に従って、第１の核酸配列が、転写および翻訳されたときに、そのアミノ酸配列を含むタンパク質を産生するための青写真を提供することができる場合である。第１の核酸配列はまた、第１の核酸配列を含むポリヌクレオチドが導入された宿主細胞によって産生されるが、第１の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含まない同じ宿主細胞によって産生されないタンパク質によって構成されるアミノ酸配列を「コードする」。このようなアミノ酸配列は、大部分が、遺伝暗号によって予測されるとおりであるが、アミノ酸配列を変化させる翻訳後修飾を含み得る（または含み得ない）。このようなわずかに改変されたアミノ酸配列は、実際には、第１の核酸配列によってコードされており、本明細書では、たとえそれが、予測されたアミノ酸配列からの軽微な変動を含み得るとしても、実際にその産生のための青写真として機能する。

【0073】

本明細書で意味する「Ｆｃ断片」、「Ｆｃ領域」、または「Ｆｃ部分」は、ＨＣ由来のヒンジドメイン（ヒンジ）、第２のＨＣ定常ドメイン（Ｃ_Ｈ２）、および第３のＨＣ定常ドメイン（Ｃ_Ｈ３）から本質的になるが、ＩｇＡまたはＩｇＭなどの一部のアイソタイプでは、Ｃ_Ｈ３の下流に、領域、例えば第４のＨＣ定常ドメイン（Ｃ_Ｈ４）をさらに含み得る。

【0074】

本明細書で意味する「重鎖（ＨＣ）」は、少なくともＶ_Ｈ、第１のＨＣ定常ドメイン（Ｃ_Ｈ１）、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む。これらのドメインをすべて含むＨＣは、「完全長ＨＣ」または「ＩｇＧ ＨＣ」（ＨＣがＩｇＧアイソタイプのものである場合）とも呼ばれ得る。ＩｇＡまたはＩｇＭなどの一部のアイソタイプには、ＩｇＭ Ｃ_Ｈ４ドメインなどの追加の配列が含まれ得る。

【0075】

「ヒト」ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、タンパク質、または抗体は、ヒトにおいて天然に存在するもの、または以下に説明する少数の改変を除いて、そのような配列またはタンパク質と同一であるものである。多くのヒトのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列が、例えば、当該技術分野における「ヒト」という語の使用を例示している上記のＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，に報告されている。本明細書で意味する「ヒト」アミノ酸配列または抗体は、天然に存在する配列と比較して、１つ以上の挿入、欠失、または置換を含み得る。ただし、「ヒト」アミノ酸配列には、天然に存在する配列の１００個のアミノ酸ごとに１個のアミノ酸の挿入、欠失、および／または置換が１０個を超えて含まれないことを条件とする。同様に、ヒトのヌクレオチド配列には、天然に存在する配列中において、３００ヌクレオチドごとに１ヌクレオチドの挿入、欠失、および／または置換を、３０を超えずに含む。Ｖ_ＨまたはＶ_Ｌ配列の特定の場合には、ＣＤＲは、非常に可変であることが予想され、特定のＶ_ＨまたはＶ_Ｌアミノ酸配列（またはそれをコードするヌクレオチド配列）が、「ヒト」配列であるかを決定する目的である場合、ＣＤＲ（またはそれらをコードするヌクレオチド）は、配列の一部とはみなされない。

【0076】

本明細書で意味する「ヒト化」抗体は、抗体が非ヒト起源であるが、可能な限りヒトになるように操作され、それにより、抗体の安定性および結合特性を保持しながら、望ましくはヒトにおける免疫原性を低下させる抗体である。一般に、これは、定常ドメインおよび可変ドメインのフレームワーク領域の大部分またはすべてがヒト配列またはほぼヒト配列であるのに対し、ＣＤＲは、異なる生物に由来することを意味する。しかし、例えば、マウス抗体由来のＣＤＲをヒトのフレームワークに移植するのみでは、所望の特性を有する抗体が産生されない可能性があり、さらなる修飾が必要になり得る。近年では、ヒト化の結果を合理化し改善するための様々なアプローチが開発されている。例えば、Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）、ｍＡｂｓ７（６）：１０４５－１０５７、およびそこに引用されている参考文献を参照されたい。

【0077】

本明細書で意味する「ＩｇＧ抗体」は、（１）それぞれがＶ_Ｈ、Ｃ_Ｈ１、ヒンジ、Ｃ_Ｈ２、およびＣ_Ｈ３を含む２つのＨＣ、ならびに（２）それぞれがＶ_ＬおよびＬＣ定常ドメイン（Ｃ_Ｌ）を含む２つのＬＣを含む。ＩｇＧ抗体の重鎖は、ＩｇＧアイソタイプ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のものである。これらのドメインは、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．、上述、ｐｐ．ｘｖ－ｘｉｘおよび６４７～６９９に記載されており、これらのページは、参照により本明細書に組み込まれる。Ｃ_Ｌは、カッパ（Ｃ_Ｌκ）またはラムダ（Ｃ_Ｌλ）ドメインであり得る。

【0078】

本明細書で意味する「免疫調節分子」は、免疫系の活性を媒介することができる成分、例えばタンパク質と相互作用し、それによって免疫系の活性を調節する分子である。免疫系の活性は、以下の実施例８に記載のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リコール応答アッセイで評価することができ、免疫調節分子は、陰性対照分子と比較して、このアッセイにおいて活性を増加または減少させることができる。一例として、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１ ＰＳＢ１０３抗体およびＰＳＢ２０５抗体混合物は、この定義によれば免疫調節分子である。

【0079】

本明細書で意味する「軽鎖（ＬＣ）」は、Ｖ_ＬおよびＣ_Ｌを含み、これはＣ_ＬκまたはＣ_Ｌλであり得る。これらのドメインは、その例示的なアミノ酸配列を含めて、例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，上記、ｘｉｉｉ－ｌｉｘ，１０３－３０９、および６４７－６６０に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。

【0080】

抗体の混合物という文脈における抗体の「主要種」とは、本明細書で意味する場合、混合物内の抗体の総量の少なくとも１０％を構成する特定の抗体である。抗体の混合物中に主要種がいくつあるかを決定するには、実施例５に記載され、米国仮出願第６２／３４２，１６７号の図１４に示されている低ｐＨカチオン交換（ＣＥＸ）クロマトグラフィー（米国仮出願第６２／３４２，１６７号の一部が、参照により本明細書に記載される）が実施され得る。この方法は、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９：１１９１－１２０４によって説明され、これは、その全体が本明細書に組み込まれる。簡単に言えば、これは、Ｗａｔｅｒｓ Ａｌｌｉａｎｃｅ２６９５高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用する、Ｔｈｅｒｍｏ ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０ ｗｅａｋ ＣＥＸカラム、４ｘ２５０ｍｍを使用し、その後に５０ｍｍ ｇｕａｒｄカラム（ＰｒｏＰａｃ（商標）ＷＣＸ－１０Ｇ）を使用する。クロマトグラフィーは、１００％緩衝液Ａ（２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．２）から１００％緩衝液Ｂ（２０ｍＭ酢酸ナトリウムと２５０ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ５．２）の直線勾配で、３０分間実施され得る。カラムを高塩（１Ｍ塩化ナトリウム）で洗浄し、緩衝液Ａの開始条件に再平衡化することができる。抗体は、２１４ｎｍの吸光度により、カラム流出液中で検出され得る。検出されたピークの相対量は、ＥＭＰＯＷＥＲ（商標）ソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して決定され得る。低ｐＨ ＣＥＸは、異なる全長抗体種を区別でき、混合物中の特定の抗体種の相対量を定量するために使用可能である。

【0081】

本明細書において意味される、抗体の混合物内の抗体の「微量種」は、混合物中の抗体の総量の１０％未満を構成する。これは、「主要種」の定義で説明されているように、低ｐＨ ＣＥＸクロマトグラフィーによって決定され得る。

【0082】

用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書において互換的に使用される。

【0083】

本明細書で意味する「腫瘍溶解性ウイルス」は、正常細胞と比較して、がん細胞を優先的に溶解するウイルスである。腫瘍溶解性ウイルスは、天然に存在し得るか、または研究室で構築され得る。腫瘍溶解性ウイルスの例としては、アデノウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、単純ヘルペスウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびワクシニアウイルスが挙げられる。

【0084】

本明細書で意味する「ＰＳＢ１０３」は、配列番号１および５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（複数可）によってコードされる抗ｈＰＤ１ＩｇＧ４抗体を指す。

【0085】

本明細書で意味する「ＰＳＢ１０５」は、配列番号１３および１７のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ（複数可）によってコードされる抗ｈＣＴＬＡ４ ＩｇＧ１抗体を指す。

【0086】

本明細書で意味する「ＰＳＢ２０５」は、上で定義したＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の抗体混合物であり、混合物中のＰＳＢ１０５：ＰＳＢ１０３の重量／重量（ｗ／ｗ／）比は、それぞれ、１：１～１：４であり、ここで、混合物は、ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３以外の主要種の抗体を含まない。

【0087】

本明細書で意味する「放射線」は、がんの治療に使用される。本明細書で意味する放射線治療には、例えば、光子、陽子、または電子ビームを使用する外部ビーム放射線、および／または内部放射線が含まれ得る。多くの種類の外部放射線療法、例えば、３Ｄ構造放射線療法、強度変調放射線療法（ＩＭＲＴ）、画像誘導放射線療法（ＩＧＲＴ）、トモセラピー（登録商標）、定位放射線手術、および定位体放射線療法がある。内部照射法には、例えば、放射性物質、例えば放射性ヨウ素を使用する、近接照射療法または全身投与が含まれる。

【0088】

本明細書で意味するカニクイザルにおける「単回用量試験」は、試験対象の薬物を１回用量のみカニクイザルに投与する薬物動態試験である。このような試験は、実施例３に記載の方法からの軽微な変更、例えば、投与される薬物の用量または薬物を投与されるサルの数の変更が、依然として本明細書で意味する「単回用量試験」とみなされる範囲内であることを理解して、実施例３に本質的に記載のとおりに実施される。

【0089】

本明細書で意味する「カニクイザルにおける単回用量試験におけるｉｎ ｖｉｖｏ半減期（ｔ_１／２）」は、本質的に以下の実施例３に記載のとおりに決定される。例えば、異なる用量を試験する、および／または異なる数のサルを試験するなど、実施例３に記載のプロトコルと軽微に異なるプロトコルの結果によるｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２も、本明細書で意味する「カニクイザルにおける単回用量試験でのｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２」とみなされる。

【0090】

本明細書で意味する「標的生物製剤」は、別の特定の分子（タンパク質であり得る）との相互作用を介して、細胞の生物学的状態の態様に影響を与え得るタンパク質である。例えば、「標的生物製剤」は、細胞の生存、増殖、特定のサイトカインまたはタンパク質の産生などの能力に影響を与え得る。一例として、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、「標的生物製剤」であり、これは、ＰＤ１と相互作用し、増殖の増加およびＩＦＮγ産生の増加など、Ｔ細胞に複数の生物学的効果を引き起こすためである。

【0091】

本明細書で意味する「標的阻害剤」は、特定の細胞分子（タンパク質であり得る）との相互作用を介して、細胞の生物学的状態の態様に影響を与えることができる低分子である。例えば、「チロシンキナーゼ阻害剤」は、チロシンキナーゼとの相互作用を介して、チロシンキナーゼの活性（様々な細胞機能に影響を与える）に影響を与える低分子である。

【0092】

本明細書で意味する場合、特定の疾患または状態に対する「治療」とは、１つ以上の抗体、または１つ以上の抗体をコードするポリヌクレオチドの投与を含み得、その結果、ヒト患者または疾患もしくは状態を反映すると考えられる動物モデル系において、１つ以上の症状が軽減されるか、または疾患もしくは状態の予想される進行が減少または中断される一連の行動を指す。あるいは、またはさらに、治療により、疾患または症状を反映すると考えられるｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞ベースアッセイの結果が変化し得る。これらの違いは、ヒトまたは動物における症状の客観的測定によって、または細胞ベースのアッセイにおける様々なパラメータ（例えば、１つ以上のサイトカイン、例えばＩＦＮγの産生、細胞増殖、細胞死、細胞傷害性免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の増殖など）の測定によって、確認され得る。例えば、がんの「治療」の場合、その治療により、結果として、腫瘍体積の減少、ヒトまたは動物モデル系において予期される腫瘍転移の消失、生存期間の延長、またはがんに罹患しているヒトまたは動物における無増悪期間または無病生存期間の延長をもたらし得る。がん治療により、結果として、細胞ベースのアッセイにおける免疫系の活性化を示す指標の増加、例えば、抗原特異的Ｔ細胞の数の増加、および／またはＴ細胞による、サイトカイン、例えば、ＩＦＮγおよび／またはＩＬ－２の産生の増加がもたらされ得る。

【0093】

抗ｈＰＤ１抗体
本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体であり得る。本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＨＣは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ ＨＣなどのヒトまたはヒト化ＩｇＧ ＨＣであり得る。いくつかの実施形態では、このＨＣは、ＩｇＧ４ ＨＣである。一態様では、このＨＣは、配列番号２の核酸配列によってコードされ得る。配列番号２によってコードされる例示的なアミノ酸配列としては、配列番号１および／もしくは配列番号１０、または配列番号１もしくは配列番号１０に対して４、３、２、もしくは１つの改変を含むアミノ酸配列が挙げられる。ポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、例えば遺伝暗号によって予測されるアミノ酸配列と比較して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。このような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は配列番号１０であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞で作製された抗ｈＰＤ１抗体のＨＣに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号１０のアミノ酸配列を有するＨＣを含む抗ｈＰＤ１抗体は、配列番号１のアミノ酸配列を含むＨＣをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＨＣのアミノ酸配列は、ＨＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号１または配列番号１０に対する１０以下、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０個の改変を含み得る。

【0094】

混合物中の抗ｈＰＤ１のＶ_Ｈは、例えば、配列番号３および／もしくは配列番号９のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号３および／もしくは配列番号９に対して４、３、２、または１つの改変を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。そのような核酸配列の１つは、配列番号４である。配列番号４によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号３と比較して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。そのような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は、配列番号９であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞内で作製された抗ｈＰＤ１抗体のＶ_Ｈに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号９のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈを含む抗ｈＰＤ１抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＶ_Ｈのアミノ酸配列は、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号３または配列番号９に対して４、３、２、１、または０個の改変を含み得る。

【0095】

別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、配列番号３をコードする核酸配列によってコードされるＶ_Ｈを含むことができ、配列番号１に含まれるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有する定常ドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、またはＩｇＧ３抗体の定常ドメイン（これらは、ヒトまたはヒト化抗体であり得るかまたはあり得ない）を含むことができる。

【0096】

本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＬＣは、Ｃ_ＬκまたはＣ_Ｌλを含むヒトまたはヒト化ＩｇＧ ＬＣであり得る。いくつかの実施形態では、Ｃ_Ｌは、Ｃ_Ｌκを含む。本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＬＣは、配列番号５および／もしくは配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号５に対する４つ、３つ、２つ、もしくは１つの改変を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。そのような核酸配列の１つは、配列番号６である。配列番号６によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号５に対して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。そのような翻訳後修飾の正確な性質は、宿主細胞の性質に依存し得る。そこで抗体が産生される。このようなアミノ酸配列の例は配列番号１２であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞中で作製された抗ｈＰＤ１のＬＣに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号１２のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗ｈＰＤ１抗体は、配列番号５のアミノ酸配列を含むＬＣをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＬＣのアミノ酸配列は、ＬＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号５または配列番号１２に対して４、３、２、１、または０個の改変を含み得る。

【0097】

本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＶ_Ｌは、配列番号７および／もしくは配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号７に対する４つ、３つ、２つ、もしくは１つの改変を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。そのような核酸配列の１つは、配列番号８である。配列番号８によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号７に対して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。そのような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は、配列番号１１であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞中で作製された抗ｈＰＤ１抗体のＶ_Ｌに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号１１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含む抗ｈＰＤ１抗体は、配列番号７のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞において産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＶ_Ｌのアミノ酸配列は、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号７または配列番号１１に対して４、３、２、１、または０個の改変を含み得る。

【0098】

別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、配列番号７をコードする核酸配列によってコードされるＶ_Ｌを含むことができ、配列番号５に含まれるアミノ酸配列以外のアミノ酸配列を有するＣ_Ｌを含むことができる。例えば、そのようなＣ_Ｌは、ラムダまたはカッパＣ_Ｌであり得、これは、ヒト抗体またはヒト化抗体由来であっても、ヒト抗体またはヒト化抗体由来でなくてもよい。

【0099】

さらに、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、様々な機能的属性を有し得る。一態様では、そのような抗ｈＰＤ１抗体は、ヒトおよびカニクイザルＰＤ１に結合できるが、マウスＰＤ１、ヒトＰＤＬ１、ヒトＣＤ２８、またはヒトＣＴＬＡ４には結合できない。これらの機能的態様は、実施例２および７、ならびに図５で実証される。したがって、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、ヒトＰＤ１および密接に関連する抗原であるカニクイザルＰＤ１に対して特異的結合を呈することができる。考えられるすべての関連抗原を試験してはいないが、実施例２および７、ならびに図５に示される試験結果は、本明細書で意味されるヒトＰＤ１への「特異的」結合が何を意味するかを定義する。

【0100】

別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、ヒトＰＤＬ１（ｈＰＤＬ１）のｈＰＤ１への結合を遮断することができる。この特性は、国際公開第２０１８／０８９２９３号の実施例７ならびに図１３および１４に示されるデータによって実証され、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0101】

さらなる態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、１ｘ１０^－５１／ｓ以下、７ｘ１０^－４１／ｓ、５ｘ１０^－４１／ｓ、３ｘ１０^－４１／ｓ、または２ｘ１０^－４１／ｓのｋ_ｄ、および／または３０ｎＭ以下、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、または４ｎＭのＫ_Ｄで、ヒトＰＤ１の細胞外ドメインを含む単量体分析物に結合することができる。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、２ｘ１０^－５１／ｓ、１ｘ１０^－５１／ｓ、９ｘ１０^－４１／ｓ、８ｘ１０^－４１／ｓ、７ｘ１０^－４１／ｓ、または６ｘ１０^－４１／ｓのｋ_ｄ、および／または３０ｎＭ以下、２０ｎＭ、１０ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、または６ｎＭのＫ_Ｄで、カニクイザルＰＤ１の細胞外ドメインを含む単量体分析物に結合することができる。このような速度論的測定は、実施例７に記載されているように、Ｂｉａｃｏｒｅ光学バイオセンサーを使用して決定することができる。そのような単量体分析物には、例えば、ヒスチジンタグ（ｈｉｓタグ）および／またはグルタチオンＳ－トランスフェラーゼタグ（ＧＳＴタグ）に融合されたｈＰＤ１またはカニクイザルＰＤ１（ｃＰＤ１）の細胞外ドメインが含まれる。対照的に、抗体のＦｃ領域に融合されたｈＰＤ１またはｃＰＤ１の細胞外ドメインは、二量体化するため、本明細書で意味するような単量体分析物ではない。

【0102】

さらに別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において、約１００～４００時間、１２０～３５０時間、２００～３５０時間、２５０～３５０時間、または２７５～３５０時間の範囲のｉｎ ｖｉｖｏ半減期（ｔ_１／２）を有し得る。

【0103】

さらに、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、抗ｈＰＤ１抗体を以前に投与されていないヒト対象において、１３５～３００時間、１３５～２７５時間、または１４０～２５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し得る。

【0104】

さらに、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、そのＨＣのアミノ酸配列中に２２８Ｐを含むことができる。この説明で使用されている番号付けシステムは、上記のＥｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．の番号付けシステムである。抗体の様々な部分の長さにある程度のばらつきがあり得るため、そのような番号付けは、特定の抗体の番号付けに正確に対応し得ない。誤解を回避するため、このＨＣ位（２２８）は、配列番号１の２２７位に対応する。

【0105】

抗ｈＣＴＬＡ４抗体
本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、ヒトまたはヒト化ＩｇＧ抗体であり得る。本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ ＨＣなどのヒトまたはヒト化ＩｇＧ ＨＣであり得る。いくつかの実施形態では、このＨＣは、ＩｇＧ１ ＨＣである。一態様では、このＨＣは、配列番号１４の核酸配列によってコードされ得る。配列番号１４によってコードされる例示的なアミノ酸配列としては、配列番号１３および／または配列番号２２、または配列番号１３もしくは配列番号２２に対して１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１つの改変（複数可）を含むアミノ酸配列が挙げられる。配列番号１４によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号１３に対して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。このような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は、配列番号２２であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞中で作製された抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＨＣを含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、配列番号１３のアミノ酸配列を含むＨＣをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞中で産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣのアミノ酸配列は、ＨＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号１３または配列番号２２に対して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１、または０個の改変（複数可）を含み得る。

【0106】

混合物中の抗ｈＣＴＬＡ４のＶ_Ｈは、例えば、配列番号１５および／または配列番号２１のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１５および／または配列番号２１に対して４、３、２、または１つの改変を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。１つのこのような核酸配列は、配列番号１６である。配列番号１６によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号１５に対して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。このような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は、配列番号２１であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞中で作製された抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｈに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号２１のアミノ酸配列を有するＶ_Ｈを含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むＶ_Ｈをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞中で産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｈのアミノ酸配列は、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号１５または配列番号２１に対して、４、３、２、１、または０個の改変（複数可）を含み得る。

【0107】

本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＬＣは、Ｃ_ＬκまたはＣ_Ｌλを含むヒトまたはヒト化ＬＣであり得る。いくつかの実施形態では、このＬＣは、Ｃ_Ｌκを含むことができる。本明細書に記載される抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＬＣは、配列番号１７および／または配列番号２４のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１７に対して、４、３、２、または１個の改変（複数可）を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。１つのこのような核酸配列は、配列番号１８である。配列番号１８によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号１７に対して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。このような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は、配列番号２４であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞中で作製された抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＬＣに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号２４のアミノ酸配列を有するＬＣを含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、配列番号１７のアミノ酸配列を含むＬＣをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞によって産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＬＣのアミノ酸配列は、ＬＣのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号１７または配列番号２４に対して、４、３、２、１、または０個の改変（複数可）を含むことができる。

【0108】

本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｌは、配列番号１９および／または配列番号２３のアミノ酸配列をコードする核酸配列、または配列番号１９に対して、４、３、２、または１個の改変（複数可）を含むアミノ酸配列をコードする核酸配列によってコードされ得る。１つのこのような核酸配列は、配列番号２０である。配列番号２０によってコードされるアミノ酸配列は、例えば配列番号１９に対して、その配列を改変させる翻訳後改変を含むことができる。このような翻訳後修飾の正確な性質は、抗体が産生される宿主細胞の性質に依存し得る。このようなアミノ酸配列の例は、配列番号２３であり、これは、ＣＨＯ宿主細胞中で作製された抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｌに見られる実際の翻訳後修飾を反映している。以下の実施例６を参照されたい。明確にするために、配列番号２３のアミノ酸配列を有するＶ_Ｌを含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＶ_Ｌをコードする核酸を含む宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞中で産生され得る。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＶ_Ｌのアミノ酸配列は、Ｖ_Ｈのアミノ酸配列をコードする核酸配列に関係なく、配列番号１９または配列番号２３に対して、４、３、２、１、または０個の改変（複数可）を含み得る。

【0109】

さらに、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、様々な機能的属性を有する。一態様では、このような抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４に結合できるが、ヒトＰＤ１、マウスＰＤ１、ヒトＰＤＬ１、またはヒトＣＤ２８には結合できない。これらの機能的態様は、実施例２および７、ならびに図５で実証される。したがって、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、ヒトＣＴＬＡ４および密接に関連する抗原であるカニクイザルＣＴＬＡ４に対して、特異的結合を呈し得る。考えられるすべての関連抗原を試験してはいないが、実施例２および７、ならびに図５に示される試験結果は、本明細書で意味されるヒトＣＴＬＡ４への「特異的」結合が何を意味するかを定義する。

【0110】

別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、そのリガンドであるヒトＢ７－１および／またはＢ７－１（ｈＢ７－１および／またはｈＢ７－２）へのｈＣＴＬＡ４の結合を遮断することができ、かつ標的細胞上で、ＣＴＬＡ４の機能的効果を遮断することができる。これらの属性は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／０８９２９３号の実施例４に示されるデータによって実証される。

【0111】

さらなる態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、５ｘ１０^－３１／ｓ以下、２ｘ１０^－３１／ｓ、８ｘ１０^－４１／ｓ、５ｘ１０^－４１／ｓ、１ｘ１０^－４１／ｓ、もしくは８ｘ１０^－５１／ｓのｋ_ｄおよび／または３０ｎＭ以下、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、または２ｎＭのＫ_Ｄで、ヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む単量体分析物に結合することができる。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、５ｘ１０^－３１／ｓ以下、２ｘ１０^－３１／ｓ、８ｘ１０^－４１／ｓ、５ｘ１０^－４１／ｓ、もしくは４ｘ１０^－４１／ｓのｋ_ｄ、および／または３０ｎＭ以下、２０ｎＭ、１０ｎＭ、７ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、または３ｎＭのＫ_Ｄで、カニクイザルＣＴＬＡ４の細胞外ドメインを含む単量体分析物に結合することができる。このような体内動態的測定は、実施例７に記載されているように、Ｂｉａｃｏｒｅ光学バイオセンサーを使用して決定することができる。このような単量体分析物の例としては、ｈｉｓタグおよび／またはＧＳＴタグに融合されたｈＣＴＬＡ４またはｃＣＴＬＡ４の細胞外ドメインが挙げられる。一方、抗体のＦｃ領域に融合したｈＣＴＬＡ４またはｃＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、二量体化するであろうため、単量体分析物とはみなされない。

【0112】

さらに別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、カニクイザルにおいて、約２５～２００、５０～１５０、または７５～１２５時間の範囲の単回用量血清半減期を有し得る。

【0113】

さらに、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、抗ｈＣＴＬＡ４抗体を以前に投与されていないヒト対象において、９０～２１０、１００～１９５、１００～１４０、または１４０～２５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し得る。

【0114】

さらに、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、その定常ドメイン内の特定の部位に、特定のアミノ酸を含むことができる。これらには、次のうちの１つ以上（またはすべて）が含まれ得る：ＨＣ内では１４７Ｄ；ＨＣ内では１７０Ｃ；ＨＣ内では１７３Ｃ；ＨＣ内では２２０Ｇ；ＨＣ内では２５５Ｋ；ＨＣ内では３９９Ｒ；ＨＣ内では４０９Ｅ；ＬＣ内では１３１Ｋ；ＬＣ内では１６０Ｃ；ＬＣ内では１６２Ｃ；ＬＣ内では２１４Ｓ。この説明では、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．（前出）の番号付けシステムが使用される。上述したとおり、抗体の様々な部分の長さにばらつきがあるため、この番号付けは、特定の抗体のアミノ酸配列における実際の位置に正確に対応しない場合がある。誤解を回避するために、これらのＨＣ位置は、配列番号１３中の以下の位置に（上記と同じ順序で）対応する：１４８位、１７１位、１７４位、２２１位、２５６位、４００位、および４１０位。これらのＬＣ位置は、配列番号１７中の以下の位置に（上記と同じ順序で）対応する：１３１位、１６０位、１６２位、および２１４位。本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、配列番号１６および２０によってコードされる可変ドメインと、その配列が配列番号１３、１７、２２、および／または２４中に含まれない定常ドメインとを含むことができるが、これらの定常ドメインは、この段落で述べた特定の位置に、特定のアミノ酸の１つ以上（またはすべて）を含むものとする。このような抗体は、カッパまたはラムダＬＣを有するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４抗体であり得、ヒト抗体または非ヒト抗体であり得る。

【0115】

抗体混合物
本明細書には、上記の抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体を含む２つの主要な抗体種を含む抗体の混合物が記載される。これら２つの抗体を含む混合物を、本明細書ではＰＳＢ２０５と称する。いくつかの実施形態では、ＰＳＢ２０５は、これら２つの主要な抗体種以外の主要な抗体種を含まない。いくつかの実施形態では、このような混合物は、抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体をコードする核酸を含む宿主細胞内で作製され得る。いくつかの実施形態では、これらの宿主細胞は、抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体以外の主要な種の抗体を含まない混合物を産生することができる。したがって、宿主細胞によって潜在的に産生される可能性のある他の抗体種からこれら２つの抗体種を分離することが不要であり得る。あるいは、ＰＳＢ２０５中の抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体を別々の宿主細胞株で産生し、所望の比率で組み合わせて混合物ＰＳＢ２０５を作製することもできる。ＰＳＢ２０５は、以下に説明し、以下の実施例において例示する特定の特性を有する。

【0116】

一態様では、ＰＳＢ２０５は、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体を、それぞれ、約３：１～約１：４、約２：１～１：４、約１：１～約１：３、約１：１．５～約１：２．５、または約１：１．７～約１：２．３、の重量／重量（ｗ／ｗ）比（抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比）で含むことができる。いくつかの実施形態では、この抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比は、それぞれ、３：１、２：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、または１：４であり得る。したがって、ＰＳＢ２０５は、抗ｈＣＴＬＡ４抗体の量と比較して、より多量の抗ｈＰＤ１抗体を含むことができ、または、代替として、抗ｈＰＤ１抗体の量と比較して、より多量の抗ｈＣＴＬＡ４抗体を含むことができる。この比は、ＰＳＢ２０５中の抗ｈＣＴＬＡ４抗体および抗ｈＰＤ１抗体の結合特性および薬物動態特性などの特性と合わせて、ＰＳＢ２０５の機能的特性に影響を与え得る。

【0117】

一態様では、カニクイザルにおける単回用量試験における、ＰＳＢ２０５の一部である抗ｈＰＤ１抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２は、ＰＳＢ２０５中の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のものよりも長い。カニクイザルにおける単回用量試験における抗ｈＰＤ１抗体と比較した、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２の比（ｔ_１／２（ＣＴＬＡ４）：ｔ_１／２（ＰＤ１））は、それぞれ、約１：４～約１：１であり得る。より具体的には、この比は、約１：４、１：３．８、１：３．７、１：３．６、１：３．５、１：３．４、１：３．３、１：３．２、１：３．１、１：３、１：２．９、１：２．８、１：２．７、１：２．６、１：２．５、１：２．４、１：２．３、１：２．２、１：２．１、１：２、１：１．９、１：１．８、１：１．７、１：１．６、１：１．５、１：１．４、１：１．３、１：１．２、１：１．１、または１：１であり得る。ＰＳＢ２０５中の２つの抗体のｗ／ｗ比とともに、これらのｔ_１／２が異なる場合には、抗体混合物ＰＳＢ２０５の投与により、抗ｈＣＴＬＡ４抗体の用量よりも高い、および／またはよりゆっくりとｉｎ ｖｉｖｏで除去される抗ｈＰＤ１抗体の用量を確実に送達することができる。

【0118】

同様に、これまでに抗ｈＣＴＬＡ４抗体または抗ｈＰＤ１抗体のいずれも投与されていないヒト患者では、ｔ_１／２（ＣＴＬＡ４）：ｔ_１／２（ＰＤ１）は、約１：３、１：２．７５、１：２．５、１：２．２５、１：２、１：１．７５、１：１．５または１：１．２５であり得る。

【0119】

より具体的には、ＰＳＢ２０５に含まれる本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において、約１５０時間～約３５０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し得る。いくつかの実施形態では、そのようなｔ_１／２は、約２７５時間～約３５０時間、約２８０時間～約３４０時間、約２９０時間～約３３０時間、または約２９０時間～約３１０時間であり得る。いくつかの実施形態において、そのようなｔ_１／２は、約２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、または３０２時間であり得る。

【0120】

別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体を以前に投与されていないヒト患者において、ＰＳＢ２０５抗体混合物の一部である本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のｔ_１／２は、約１２０～約３００時間、約１３５～約３００時間、または約１４０～約２５０時間であり得る。いくつかの実施形態では、そのようなｔ_１／２は、約１３５時間、１４０時間、１４５時間、１４７時間、１５０時間、１５５時間、１６０時間、１６５時間、１７０時間、１７５時間、１８０時間、１８５時間、１９０時間、１９５時間、２００時間、２０５時間、２１０時間、２１５時間、２２０時間、２２５時間、２２７時間、２３０時間、２４０時間、２５０時間、または２７５時間であり得る。

【0121】

ＰＳＢ２０５中に含まれる本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、カニクイザルにおける単回用量試験において、約３０時間～約１３０時間のｉｎ ｖｉｖｏ ｔ_１／２を有し得る。いくつかの実施形態において、そのようなｔ_１／２は、約４０時間～約２００時間、約４０時間～約１５０時間、約７０時間～約１３０時間、約５０時間～約１２０時間、約６０時間～約１１０時間、または約８０時間～約１１０時間であり得る。いくつかの実施形態では、そのようなｔ_１／２は、約４０時間、４５時間、時間、５０時間、５５時間、６０時間、６５時間、７０時間、７５時間、８０時間、８５時間、９０時間、９５時間、１００時間、１０１時間、１０２時間、１０３時間、１０４時間、１０５時間、１０６時間、１０７時間、１０８時間、１０９時間、１１０時間、１１１時間、１１２時間、１１３時間、１１４時間、１１５時間、１１６時間、１１７時間、１１８時間、１１９時間、または１２０時間であり得る。

【0122】

さらなる態様では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４を以前に投与されていないヒト患者において、ＰＳＢ２０５抗体混合物の一部である本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のｔ_１／２は、約８０時間～約２５０時間、約９０時間～約２１０時間、約１００時間～約１９５時間、または約９０時間～約１４０時間であり得る。いくつかの実施形態において、そのようなｔ_１／２は、約９０時間、９５時間、１００時間、１０５時間、１１０時間、１１５時間、１２０時間、１２５時間、１３０時間、１３５時間、１４０時間、１５０時間、１６０時間、１７０時間、１８０時間、または１９０時間であり得る。

【0123】

別の態様では、ＰＳＢ２０５は、ＰＳＢ１０５中の抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３または抗ｈＣＴＬＡ４抗体のいずれかと比較して、ｉｎ ｖｉｖｏで相乗的な機能的効果を呈し得る。例えば、ＰＳＢ２０５は、ヒト腫瘍のマウス異種移植モデル系などの腫瘍モデル系において、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３または抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のいずれか単独よりも大幅に、腫瘍体積および／または腫瘍直径を減少させることができる。例えば、実施例９を参照されたい。さらなる態様では、ＰＳＢ２０５は、抗ｈＰＤ１抗体または抗ｈＣＴＬＡ４抗体のいずれか単独よりも、ＣＭＶリコール応答アッセイにおいて産生されるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）特異的Ｔ細胞の数を増加させることができる。実施例８。別の態様では、ヒトがん患者へのＰＳＢ２０５の投与は、本明細書に定義される部分奏効（ＰＲ）または完全奏効（ＣＲ）をもたらし得る。さらなる態様では、ヒトがん患者へのＰＳＢ２０５の投与は、プラセボの投与よりも長い無増悪生存期間をもたらし得る。さらに、ヒトがん患者へのＰＳＢ２０５の投与は、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体または抗ｈＣＴＬＡ４抗体のいずれかを単独で投与するよりも長い無増悪生存期間をもたらし得る。

【0124】

さらなる態様では、ＰＳＢ２０５の投与は、ヒト患者において低レベルの有害事象（ＡＥ）を生じさせ得る。上記および当技術分野の標準刊行物で定義されているように（例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ＿ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｏｃｓ／ｃｔｃａｅ＿ｖ５＿ｑｕｉｃｋ＿ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿５ｘ７．ｐｄｆを参照）、グレード３または４のＡＥは、介入が必要であることを示す重篤事象である。当然のことながら、ＡＥの発生は、薬物の用量に関連し得る。一態様では、約０．３ｍｇ／ｋｇ以下、または約２４ｍｇ以下、２１ｍｇ、１８ｍｇ、１５ｍｇもしくは１２ｍｇの用量のＰＳＢ２０５では、グレード３または４のＡＥは生じ得ない。別の態様では、約１．０ｍｇ／ｋｇ以下、または約９０ｍｇ以下、８０ｍｇ、７０ｍｇ、６０ｍｇ、５０ｍｇもしくは４０ｍｇの用量のＰＳＢ２０５では、グレード３または４のＡＥは生じ得ない。さらに別の態様では、約３．０ｍｇ／ｋｇ以下、または約２７０ｍｇ以下、２４０ｍｇ、２１０ｍｇ、１８０ｍｇ、１５０ｍｇもしくは１２０ｍｇの用量のＰＳＢ２０５では、投与された患者の１０パーセント以下、９、８、７、６、５、４、３、２、もしくは１パーセントにおいて、グレード３もしくは４のＡＥが生じ得るか、または、いくつかの実施形態では、投与された患者のいずれにおいてもグレード３もしくは４のＡＥは生じ得ない。さらなる態様では、約５．０ｍｇ／ｋｇ以下、または約４５０ｍｇ以下、４２５ｍｇ、４００ｍｇ、３７５ｍｇ、３５０ｍｇ、３２５ｍｇ、３００ｍｇ、２７５ｍｇ、２５０ｍｇ、２２５ｍｇもしくは２００ｍｇのＰＳＢ２０５の用量により、投与された患者の１５パーセント以下、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１パーセントにおいて、３または４のＡＥが生じたか、またはいくつかの実施形態では、投与された患者のいずれにおいても、３または４のＡＥは生じ得ない。

【0125】

抗ｈＰＤ１抗体および／または抗ｈＣＴＬＡ４抗体をコードするポリヌクレオチド
本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体もしくは抗ｈＣＴＬＡ４抗体、または両方の抗体を含む混合物、すなわちＰＳＢ２０５をコードする核酸は、以下の実施例１および４に記載のように、またはこれらの配列および本明細書に提供する他の開示を使用する他の適切な方法を使用することによって作製することができる。例えば、本明細書の開示を考慮すると、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体をコードするＤＮＡ配列を合成することができる。別の態様では、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体由来および抗ｈＣＴＬＡ４抗体由来のＨＣおよびＬＣをコードするベクターは、実施例１に記載のように作製することができる。

【0126】

本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体のＨＣ、ＬＣ、Ｖ_Ｈ、およびＶ_Ｌをコードする特定のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとしては、それぞれ、配列番号２、配列番号６、配列番号４、および配列番号８を含むポリヌクレオチドが挙げられる。これらの配列は、それぞれ、以下のアミノ酸配列：配列番号１、配列番号５、配列番号３、および配列番号７をコードする。遺伝暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列も、配列番号１、配列番号５、配列番号３、および配列番号７をコードし得る。このようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも、本明細書において企図されるポリヌクレオチドの範囲内である。配列番号１に対して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の改変（複数可）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドもまた、配列番号５、配列番号３、および／または配列番号７に対して、４、３、２、または１個の改変（複数可）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであるとして企図される。

【0127】

本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣ、ＬＣ、Ｖ_Ｈ、およびＶ_Ｌをコードする特定のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドとしては、それぞれ、配列番号１４、配列番号１８、配列番号１６、および配列番号２０を含むポリヌクレオチドが挙げられる。これらの配列は、それぞれ、以下のアミノ酸配列：配列番号１３、配列番号１７、配列番号１５、および配列番号１９をコードする。遺伝暗号の縮重のため、他のヌクレオチド配列も、配列番１３、配列番号１７、配列番号１５、および配列番号１９をコードすることができる。このようなヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドも、本明細書で企図されるポリヌクレオチドの範囲内である。配列番号１３に対して、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１個の改変（複数可）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドもまた、配列番号１７、配列番号１５、および／または配列番号１９に対して、４、３、２、または１個の改変（複数可）を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドであるとして企図される。

【0128】

本明細書に記載の抗ｈＰＤ１および／または抗ｈＣＴＬＡ４抗体をコードするポリヌクレオチド（複数可）を含むベクター（複数可）は、様々な種類のベクターのいずれかの中で作製することができる。ベクターは、ベクターを含む宿主細胞の選択のため、および／または宿主細胞中でのベクターの維持および／または増幅のための選択マーカーを含むことができる。そのようなマーカーとしては、例えば、（１）原核宿主細胞に対して抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリン、またはカナマイシンに対する耐性を付与する遺伝子、（２）細胞の栄養要求性欠損を補う遺伝子、または（３）その操作により、複雑な培地または規定された培地からは得られない重要な栄養素が供給される遺伝子が挙げられる。具体的な選択可能マーカーとしては、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、およびテトラサイクリン耐性遺伝子が挙げられる。ゼオシン耐性遺伝子またはネオマイシン耐性遺伝子も、原核生物宿主細胞および真核生物宿主細胞の両方中での選択に使用され得る。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子および／またはプロモーターレスチミジンキナーゼ遺伝子は、当技術分野で知られているように、哺乳類細胞において使用することができる。例えば、Ｋｉｎｇｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．２００２，Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＣＨＯ ｃｅｌｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．１６，Ｕｎｉｔ １６．２３，Ｗｉｌｅｙ ２００２を参照されたい。

【0129】

さらに、ベクターは、ベクターの維持および／または本明細書に記載の抗体または抗体混合物をコードする挿入配列の発現に必要な１つ以上の他の配列エレメントを含み得る。そのようなエレメントとしては、例えば、複製起点、プロモーター、１つ以上のエンハンサー、転写ターミネーター、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、外因性配列（本明細書に記載の抗体または抗体の混合物をコードするＤＮＡなど）のポリリンカー挿入部位、ならびに２つの挿入配列間の介在配列、例えば、ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡが挙げられる。これらの配列エレメントは、ベクターの複製および／または増幅、ならびにベクターに挿入された異種配列のび発現を促進するように、所望の宿主細胞内で機能するように選択することができる。このような配列エレメントは、当技術分野でよく知られており、多数の市販のベクターで入手可能である。

【0130】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体もしくは抗ｈＰＤ１抗体、または本明細書に記載のこれらの抗体の混合物、すなわちＰＳＢ２０５をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のウイルスベクター、任意により腫瘍溶解性ウイルスベクター上に担持され得る。そのようなウイルスベクターの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、ワクシニアウイルス、改変ワクシニアウイルスアンカラ（ＭＶＡ）、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ニューカッスル病ウイルス、麻疹ウイルス、コクサッキーウイルス、レオウイルス、およびポックスウイルスベクターが挙げられる。このような実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを含むこれらのウイルスベクターは、疾患を治療するために患者に投与することができる。

【0131】

例えば、がん患者において、抗体または抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドを含むそのようなウイルスベクターは、多くの可能性の中でも、例えば注射、吸入（例えば、肺癌）、局所投与（例えば、皮膚癌）、および／または（核酸が吸収され得る）粘膜への投与によって、患者中の腫瘍またはがん細胞の主要部位に直接投与できる。あるいは、このようなウイルスベクターは、本明細書に記載されるように、例えば、経口、局所、粘膜を介して、または皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは腹膜注射によって、全身投与することができる。

【0132】

同様に、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体もしくは抗ｈＰＤ１抗体またはこれらの抗体の混合物をコードするポリヌクレオチドは、疾患に罹患している患者に投与することができる担体構造、例えばリポソームに封入することができる。本明細書で企図されるポリヌクレオチドとしては、ＲＮＡおよびＤＮＡ、ならびに例えば天然に存在するＤＮＡおよび／またはＲＮＡよりも安定および／または有効である化学的に修飾されたポリヌクレオチドが挙げられる。例えば、Ｂｕｒｎｅｔｔ ａｎｄ Ｒｏｓｓｉ（２０１２），ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ－ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｆｕｔｕｒｅ ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１９（２１）：６０－７１を参照されたい。これらの封入ポリヌクレオチドは、多くの可能性の中でも、例えば注射、吸入（例えば、肺癌）、局所投与（例えば、皮膚癌）、および／または（核酸が吸収され得る）粘膜への投与によって、患者中の腫瘍またはがん細胞の主要部位に直接投与できる。あるいは、このような封入ポリヌクレオチドは、本明細書に記載されるように、例えば、経口、局所、粘膜を介して、または皮下、静脈内、動脈内、筋肉内もしくは腹膜注射によって、全身投与することができる。

【0133】

医薬組成物
本明細書に記載の抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、および／またはベクターは、薬学的に許容される製剤中で投与され得る。抗体の混合物に関しては、各抗体を別々にまたは一緒に製剤化し、投与することができる。多数の医薬製剤が当技術分野で知られている。このような製剤の多くは、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１^ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５に記載されており、その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。このような薬学的に許容される製剤は、例えば、溶液または懸濁液などの液体、丸薬、カプセル、ペースト、またはゲルなどの固体であり得る。液体製剤は、例えば、以下の成分：緩衝剤、賦形剤、塩、糖、洗浄剤、およびキレート剤のうちの１つ以上を含むことができる。これは、抗体、抗体混合物、ポリヌクレオチド、またはベクターの機能を保存し、患者が十分に耐えられるように設計され得る。

【0134】

抗体または抗体の混合物の場合、医薬組成物は、約４．５～約７．５、約４．５～約７．０、約４．５～約６．５、約４．５～約６．０、または４．５～約５．５のｐＨを有し得る。このような製剤中の抗体の濃度は、約５ｍｇ／ｍＬ～約４０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３５ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬであり得る。このような組成物の重量オスモル濃度は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ、約２７５～約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ、および／または約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ～約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であり得る。このような組成物は、他の多くの可能性の中でもとりわけ、スクロース、トレハロース、またはソルビタールなどの糖を含むことができる。このような組成物は、多くの可性の中で、塩、例えば、ナトリウム塩、塩酸塩の塩、硫酸塩の塩、酢酸塩の塩、またはリン酸塩の塩を含むことができる。このような組成物は、他の可能性の中でも特に、ポリソルベート－２０などの界面活性剤を含むことができる。

【0135】

ポリヌクレオチドおよび抗体などのタンパク質は、通常、経口投与ではなく非経口投与される。製剤によって、経口投与によりタンパク質またはポリヌクレオチドが胃の酸性環境にさらされる可能性があり、これにより、例えばタンパク質の加水分解により、タンパク質またはポリヌクレオチドが不活性化される可能性がある。いくつかの実施形態では、特定の製剤は、特定のタンパク質またはポリヌクレオチドの経口投与が可能になり得、そのタンパク質またはポリヌクレオチドは、胃酸に対して感受性がないか、または例えば丸薬もしくはカプセル上の特定のコーティングによって酸性環境から十分に保護されている。製剤はまた、例えば、鼻腔内、膣、直腸、もしくは経口投与、または吸入剤としての投与など、粘膜を介して投与することもできる。いくつかの実施形態では、製剤を局所的に投与することもできる。一般に、抗体およびポリヌクレオチドは、液体製剤の非経口注射、例えば、皮下、静脈内、動脈内、病巣内（例えば、腫瘍内）、筋肉内、または腹膜注射によって投与される。

【0136】

低分子である標的阻害剤は、経口投与または上記の他の方法によって投与することができる。経口投与に適した製剤には、例えば、溶液または懸濁液などの液体、ペースト、ゲル、カプセル、または丸薬などの固体が含まれ得る。

【0137】

抗ｈＣＴＬＡ４抗体および／または抗ｈＰＤ１抗体をコードする核酸を含む宿主細胞
本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４もしくは抗ｈＰＤ１抗体またはそれらの混合物をコードする核酸、または（例えば、トランスフェクション、形質導入、リポフェクション、形質転換、微粒子による衝撃、マイクロインジェクション、またはエレクトロポレーションによって）導入できるような核酸を担持するベクターは、宿主細胞に個別に、同時に、または順次導入され得る。いくつかの実施形態において、それらは、実施例４に記載されるように順次導入され得る。本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体および／または抗ｈＣＴＬＡ４抗体をコードする核酸を含むそのような宿主細胞は、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の両方をコードする核酸を含むことができる。

【0138】

これらの宿主細胞は、哺乳動物、原生動物、真菌、植物、または細菌の細胞であり得る。より具体的には、グラム陰性またはグラム陽性の原核生物、例えば、大腸菌、枯草菌、またはネズミチフス菌などの細菌を宿主細胞として使用することができる。他の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ（シゾサッカロマイセス ポンビー）などの種、またはＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ属、カンジダ属、Ｓｐｏｄｏｔｅｒａ属の真核生物、または異種ポリペプチドを発現できる任意の細胞などの真核細胞であり得る。

【0139】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞であり得る。異種ポリペプチドの発現に適した多くの哺乳動物細胞株が当技術分野で知られており、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）など、様々な販売業者から入手することができる。適切な哺乳動物宿主細胞株としては、例えば、例えば、ＣＯＳ－７株（ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１）（Ｇｌｕｚｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｃｅｌｌ２３：１７５）、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ１６３）、チャイニーズハムスターの卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはそれらの誘導体、例えば、ＶｅｇｇｉｅＣＨＯおよび関連細胞株（これらは、無血清培地で成長する（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃｙｔｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２８：３１）、ＣＨＯ－Ｋ１およびＣＨＯｐｒｏ－３細胞株およびそれらの誘導体例えば、ＤＵＫＸ－Ｘ１１およびＤＧ４４細胞株（ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）活性が欠損しているもの）、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ１０）、ＭｃＭａｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＥＭＢＯＪ．１０：２８２１に記載されているアフリカミドリザル腎臓細胞株ＣＶＩ（ＡＴＣＣＣＣＬ７０）に由来するＣＶＩ／ＥＢＮＡ細胞株、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞、例えば、２９３、２９３ＥＢＮＡまたはＭＳＲ２９３、ヒト表皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、ＨＬ－６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、ＨｅｐＧ２／３Ｂ細胞、ＫＢ細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、Ｓ４９細胞、ならびにマウス骨髄腫細胞（ＮＳ０およびＳｐ２／０細胞など）が挙げられる。異種ポリペプチドを発現できる他の原核生物、真核生物、または哺乳動物の細胞種も使用することができる。

【0140】

より詳細には、本明細書に記載の抗ｈＣＴＬＡ４抗体と抗ｈＰＤ１抗体の混合物、すなわちＰＳＢ２０５をコードする核酸を含む宿主細胞株、例えばＣＨＯ細胞株は、これら２つの抗体を安定した比率、すなわち、例えば約１：２（抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１）で産生することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞によって産生される抗体の抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比は、約３：１～約１：４、約２：１～１：４、約１：１～約１：３、約１：１．５～約１：２．５、または約１：１．７～約１：２．３であり得る。さらなる実施形態では、宿主細胞によって産生される抗体混合物中の抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比は、約３：１、２：１、１：１、１：１．１、１：１．２、１：１．３、１：１．４、１：１．５、１：１．６、１：１．７、１：１．８、１：１．９、１：２、１：２．１、１：２．２、１：２．３、１：２．４、１：２．５、１：２．６、１：２．７、１：２．８、１：２．９、１：３、１：３．１、１：３．２、１：３．３、１：３．４、１：３．５、１：３．６、１：３．７、１：３．８、１：３．９、または１：４であり得る。さらなる実施形態では、宿主細胞によって産生される抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１比は、約１：１．８～約２．２であり得る。このような比は、少なくとも約３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、または１００の集団倍加レベル（ＰＤＬ）で、細胞について維持することができる。

【0141】

さらなる態様では、本明細書に記載の宿主細胞、例えばＣＨＯ細胞株は、その細胞上清中に少なくとも約０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、２、２．５、または３グラム／リットル（ｇ／Ｌ）の総量の抗体を産生することができる。他の実施形態では、宿主細胞による抗体産生は、以下の範囲のうちの１つ以上内であり得る：１．０～４．０ｇ／Ｌ、１．０～３．０ｇ／Ｌ、１．０～２．０ｇ／Ｌ、２．０～４．０ｇ／Ｌ、０．５～２．０ｇ／Ｌ、０．５～１．５ｇ／Ｌ、０．６～１．４ｇ／Ｌ、０．７～１．３ｇ／Ｌ、０．８～１．２ｇ／Ｌ、または０．９～１．２ｇ／Ｌ。

【0142】

別の態様では、ＰＳＢ２０５を産生できるＣＨＯ宿主細胞株の細胞倍加時間は、約１８～３２、１８～３０、１９～２８、または２０～２５時間であり得る。さらに、そのような宿主細胞株は、１０～２００、２０～２００、１０～１７５、２０～１５０、２０～１００、２０～６０、または１０～６０の集団倍加レベル（ＰＤＬ）で、この範囲内の倍加時間を維持することができる。本明細書で意味するＰＤＬは、凍結細胞バンクから解凍してから集団内の細胞が２倍になった回数である。

【0143】

抗体または抗体混合物を作製する方法
本明細書に記載される抗体および抗体の混合物は、様々な方法によって作製することができる。本明細書に記載の抗ｈＰＤ１および／または抗ｈＣＴＬＡ４抗体は、抗体（複数可）をコードするポリヌクレオチド（複数可）を宿主細胞に導入すること、宿主細胞を培養すること、細胞塊または細胞上清から抗体（複数可）を回収すること、および任意により、抗体を精製することによって作製され得る。

【0144】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体混合物は、２つの別個の宿主細胞株で作製することができ、そのうちの１つは、抗ｈＰＤ１抗体を産生し、もう１つは、抗ｈＣＴＬＡ４抗体を産生する。このような実施形態では、２つの宿主細胞株を別々にまたは一緒に培養し、それらが産生する抗体（複数可）を細胞上清（複数可）または細胞塊（複数可）から精製することができる。いくつかの実施形態では、宿主細胞株は、別々に培養され、細胞上清または細胞塊は、抗体の精製前に混合される。他の実施形態では、２つの細胞株は、別々に培養され、抗体は、２つの細胞上清または細胞塊から別々に精製される。さらなる実施形態では、２つの宿主細胞株は、一緒に培養され、抗体を細胞上清または細胞塊から精製する。２つの細胞株を別々に培養する場合、抗体は、任意の所望の比率で組み合わせることができる。精製は、例えば、プロテインＡカラムクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、沈殿戦略による様々な精製など、潜在的なステップを含めて、必要に応じて実施され得る。

【0145】

別の実施形態では、本明細書に記載の抗体混合物は、抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の両方をコードするポリヌクレオチドを含む１つの宿主細胞株、例えば実施例４に記載のクローンＣＨＯ細胞株中で作製することができる。この場合、宿主細胞株を培養し、宿主細胞により産生される抗体を細胞上清または細胞塊から単離する。本明細書に記載の抗体混合物を産生する宿主細胞株は、多くても３つまたは２つの主要な抗体種を産生する。さらなる精製は、例えば、プロテインＡカラムクロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、沈殿戦略による様々な精製など、潜在的なステップを含めて、必要に応じて実施され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞株は、本明細書に記載の抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３および抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５の２つの主要な抗体種のみを産生する。このような場合、場合によっては宿主細胞によって産生される抗体種の中に存在する可能性がある他の抗体種からこれらの種を精製することは不要であり得る。このような状況では、抗体混合物ＰＳＢ２０５は、１つの産生および精製プロセスで産生することができる。

【0146】

治療方法
抗ｈＣＴＬＡ４抗体もしくは抗ｈＰＤ１抗体、またはそれらの混合物、すなわちＰＳＢ２０５、またはこれらの治療薬のいずれかをコードするポリヌクレオチド（複数可）もしくはベクター（複数可）をヒト患者に投与して、様々な状態を治療することができる。任意により、このような治療法は、非経口的に投与することもできるが、胃の酸性環境において治療薬が破壊されることなく経口投与を可能にするように治療薬が特に製剤化されている場合には、経口経路も可能であり得る。いくつかの実施形態では、このような治療薬は、注射によって、任意によっては、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、動脈内、皮内、または腫瘍内注射によって投与することができる。注射は、注入またはボーラスによって投与され得る。いくつかの実施形態では、治療薬の投与は、粘膜を介して行い得る。そのような投与経路としては、例えば、鼻、直腸、もしくは経膣投与、または眼瞼もしくは舌の下への投与（嚥下を伴わない）、または吸入による投与が含まれる。

【0147】

ＰＳＢ２０５の用量は、少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇであり、５、１０、または１５ｍｇ／ｋｇ以下であり得る。いくつかの実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、８ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇもしくは１ｍｇ／ｋｇ、および／または少なくとも０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇもしくは３ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、または９ｍｇ／ｋｇであり得る。さらに、投与量は、患者の体重とは関係なく、特定の量として定義され得る。このような用量は、約５ｍｇ～約８００ｍｇの範囲であり得る。特定の実施形態において、そのような用量は、８００ｍｇ以下、７００ｍｇ、６００ｍｇ、５５０ｍｇ、５００ｍｇ、４７５ｍｇ、４５０ｍｇ、４２５ｍｇ、４００ｍｇ、３７５ｍｇ、３５０ｍｇ、３２５ｍｇ、３００ｍｇ、２７５ｍｇ、２５０ｍｇ、２２５ｍｇ、２００ｍｇ、１７５ｍｇ、１５０ｍｇ、１００ｍｇ、７５ｍｇ、または５０ｍｇ、および／または少なくとも約６０ｍｇ、８０ｍｇ、１００ｍｇ、１５０ｍｇ、２００ｍｇ、２５０ｍｇ、または３００ｍｇであり得る。さらに、用量は、約１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、または４５０ｍｇであり得る。あるいは、患者の皮膚の表面積に対して、投与量を定義することもできる。例えば、いくつかの実施形態では、投与量は、少なくとも３．５ｍｇ／ｍｍ^２、１８０ｍｇ／ｍｍ^２以下であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、４００以下ｍｇ／ｍｍ^２、３５０ｍｇ／ｍｍ^２、３００ｍｇ／ｍｍ^２、３５０ｍｇ／ｍｍ^２、２００ｍｇ／ｍｍ^２、１８０ｍｇ／ｍｍ^２、１５０ｍｇ／ｍｍ^２、１１０ｍｇ／ｍｍ^２、７５ｍｇ／ｍｍ^２、５０ｍｇ／ｍｍ^２、４０ｍｇ／ｍｍ^２、３０ｍｇ／ｍｍ^２、２５ｍｇ／ｍｍ^２、１２ｍｇ／ｍｍ^２、１０ｍｇ／ｍｍ^２、７．５ｍｇ／ｍｍ^２、もしくは５ｍｇ／ｍｍ^２および／または少なくとも０．２ｍｇ／ｍｍ^２、０．５ｍｇ／ｍｍ^２、１ｍｇ／ｍｍ^２、３ｍｇ／ｍｍ^２、５ｍｇ／ｍｍ^２、１０ｍｇ／ｍｍ^２、２０ｍｇ／ｍｍ^２、３０ｍｇ／ｍｍ^２、５０ｍｇ／ｍｍ^２、７５ｍｇ／ｍｍ^２、もしくは１００ｍｇ／ｍｍ^２であり得る。

【0148】

抗ｈＣＴＬＡ４または抗ｈＰＤ１抗体の用量は、少なくとも０．０３３ｍｇ／ｋｇであり、３．３５ｍｇ／ｋｇ、６．７ｍｇ／ｋｇ、または１０ｍｇ／ｋｇ以下であり得る。いくつかの実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ以下、６．７ｍｇ／ｋｇ、４．８ｍｇ／ｋｇ、３．３５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、または０．６７ｍｇ／ｋｇｍｇ／ｋｇ、および／または少なくとも０．０３３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３３ｍｇ／ｋｇ、０．６７ｍｇ／ｋｇ、または１ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、投与量は、約０．０３３ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．６７ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、１．６７ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、３．３３ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、７ｍｇ／ｋｇ、８ｍｇ／ｋｇ、ｏｒ１０ｍｇ／ｋｇであり得る。さらに、投与量は、患者の体重とは関係なく、特定の量として定義され得る。このような用量は、約６０ｍｇ～約７００ｍｇの範囲であり得る。特定の実施形態では、そのような用量は、７００ｍｇ以下、６００ｍｇ、５００ｍｇ、４５０ｍｇ、４００ｍｇ、３５０ｍｇ、３００ｍｇ、２５０ｍｇ、２１５ｍｇ、１７０ｍｇ、１３０ｍｇ、１００ｍｇ、もしくは７０ｍｇ、および／または少なくとも約０．０３３ｍｇ、０．１ｍｇ、０．７ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．７ｍｇ、３．５ｍｇ、５ｍｇ、７ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、１７ｍｇ、２０ｍｇ、２５ｍｇ、３５ｍｇ、４５ｍｇ、５５ｍｇ、６５ｍｇ、１００ｍｇ、もしくは１５０ｍｇであり得る。あるいは、患者の皮膚の表面積に対して、投与量を定義することもできる。例えば、投与量は、少なくとも０．１ｍｇ／ｍｍ^２以下、０．５ｍｇ／ｍｍ^２、または１．１ｍｇ／ｍｍ^２であり、３５０ｍｇ／ｍｍ^２、３００ｍｇ／ｍｍ^２、２５０ｍｇ／ｍｍ^２、２００ｍｇ／ｍｍ^２、または１３０ｍｇ／ｍｍ^２であり得る。いくつかの実施形態では、用量は、３００ｍｇ／ｍｍ^２以下、２００ｍｇ／ｍｍ^２、１３０ｍｇ／ｍｍ^２、１２０ｍｇ／ｍｍ^２、１００ｍｇ／ｍｍ^２、７５ｍｇ／ｍｍ^２、５０ｍｇ／ｍｍ^２、３５ｍｇ／ｍｍ^２、３０ｍｇ／ｍｍ^２、２０ｍｇ／ｍｍ^２、１５ｍｇ／ｍｍ^２、１０ｍｇ／ｍｍ^２、７．５ｍｇ／ｍｍ^２、５ｍｇ／ｍｍ^２、または３ｍｇ／ｍｍ^２、および／または少なくとも０．１８ｍｇ／ｍｍ^２、０．３ｍｇ／ｍｍ^２、１ｍｇ／ｍｍ^２、２ｍｇ／ｍｍ^２、３ｍｇ／ｍｍ^２、６ｍｇ／ｍｍ^２、１０ｍｇ／ｍｍ^２、１７ｍｇ／ｍｍ^２、２５ｍｇ／ｍｍ^２、３３ｍｇ／ｍｍ^２、６６ｍｇ／ｍｍ^２、または８０ｍｇ／ｍｍ^２であり得る。

【0149】

ＰＳＢ２０５または抗ｈＣＴＬＡ４もしくは抗ｈＰＤ１抗体をコードするポリヌクレオチド（複数可）単独の用量、またはそのようなポリヌクレオチド（複数可）を含むベクター（複数可）の用量は、患者の体重１キログラム当たり少なくとも約１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３ コピー（コピー／ｋｇ）のポリヌクレオチド（複数可）またはベクター（複数可）であり得る。別の態様では、そのような用量は、最大約６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、または１０^１５コピー／ｋｇであり得る。さらなる態様では、そのような用量は、約１０^１０コピー／ｋｇ～約１０^１４コピー／ｋｇであり得る。あるいは、用量は、患者の体重に関係なく、約１０^９、１０^１０、１０^１１、１０^１２、１０^１３、５ｘ１０^１３、１０^１４、２ｘ１０^１４、３ｘ１０^１４、４ｘ１０^１４、５ｘ１０^１４、６ｘ１０^１４、７ｘ１０^１４、８ｘ１０^１４、９ｘ１０^１４、１０^１５、または１０^１６コピーのポリヌクレオチド（複数可）であり得る。

【0150】

上で論じた量の投与の頻度は調整することができる。いくつかの実施形態では、抗ｈＣＴＬＡ４または抗ｈＰＤ１抗体、ＰＳＢ２０５、またはこれらの治療薬のいずれかをコードするポリヌクレオチド（複数可）は、３週間に１回投与され得る。他の実施形態では、そのような治療薬は、週に２回、週に１回、１０日ごとに１回、２週ごとに１回、または３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週もしくは１０週ごとに１回投与することができる。さらなる実施形態では、そのような治療薬は、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、または１２ヶ月ごとに１回投与することができる。

【0151】

抗ｈＣＴＬＡ４もしくは抗ｈＰＤ１抗体、ＰＳＢ２０５、またはこれらのいずれかをコードするポリヌクレオチド（複数可）は、様々な状態を有するヒト患者を治療するために使用することができる。このような治療薬は、免疫応答のいくつかの態様を増強できるため、それらが有用な症状には、一般に、免疫応答の増強が有用である症状が含まれる。本明細書で意味するように、免疫応答が特定の治療薬によって増強されたか否かは、実施例８に記載のＣＭＶリコール応答アッセイによって評価することができる。上記の治療薬で治療可能な状態としては、感染症、免疫不全障害、ならびにこれらに限定されないが、様々ながん、例えば、黒色腫、扁平上皮非小細胞肺癌および小細胞肺癌などの肺癌、上咽頭癌、頭頸部の扁平上皮癌、胃癌または胃食道癌、明細胞癌または非明細胞癌腎細胞癌、尿路上皮癌、軟部組織または骨肉腫、中皮腫、古典的ホジキンリンパ腫、原発性縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、膀胱癌、メルケル細胞癌、神経内分泌癌、子宮頸癌、肝細胞癌、卵巣癌、マイクロサテライト不安定性高（ＭＳＩ－Ｈ）またはＤＮＡミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）成人および小児固形腫瘍、明細胞腎肉腫、結腸直腸癌、食道扁平上皮癌などの食道癌、子宮内膜癌、腫瘍変異負荷の高い癌、および皮膚扁平上皮癌が挙げられる。

【0152】

一態様では、ＰＳＢ２０５による治療は、一定の割合の患者において何らかの有害事象（ＡＥ）の発生を引き起こす可能性があり、これは、投与量および／または投与頻度に依存し得る。また、ＰＳＢ２０５と同時に投与され得る他の薬物の存在にも依存し得る。ＰＳＢ２０５に関連するＡＥを決定する目的では、重大なＡＥを引き起こすことが知られている他の薬物または治療、例えば化学療法または放射線療法を同時に受けている患者は除外される。場合によっては、ＡＥには、グレード３またはグレード４のＡＥなど、重篤なＡＥが含まれ得る。特定の用量および投与頻度でグレード３または４のＡＥを経験する患者の割合を決定するには、少なくとも約１０名、２０名、３０名、４０名、５０名、６０名、７０名、８０名、９０名、１００名、またはそれ以上の患者に投与させ得る。いくつかの実施形態では、１０名以上の患者が、３週間に１回、３ｍｇ／ｋｇ以下のＰＳＢ２０５を投与される場合、投与を受けた患者の２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１パーセントが、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する。他の実施形態では、これらの患者はいずれも、グレード３または４のＡＥを経験しない。いくつかの実施形態では、１０名以上の患者が、３週間ごとに１回、５ｍｇ／ｋｇ以下のＰＳＢ２０５を投与される場合、患者の２０パーセント以下、１５パーセント、１０パーセント、９パーセント、８パーセント、７パーセント、６パーセント、５パーセント、４パーセント、３パーセント、２パーセント、または１パーセントが、グレード３またはグレード４のＡＥを経験する。

【0153】

別の態様では、ＰＳＢ２０５による治療は、様々な状態、例えば上記の様々ながんを効果的に治療することができる。有効性の割合、例えば客観的奏効率（ＯＲＲ）または病勢コントロール率（ＤＣＲ）を決定するには、少なくとも約１０名、２０名、３０名、４０名、５０名、６０名、７０名、８０名、９０名、１００名、またはそれ以上の患者に投与することができる。いくつかの実施形態では、１０名以上のがん患者に、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇかつ５ｍｇ／ｋｇ以下のＰＳＢ２０５を２週間、３週間、または４週間ごとに約１回投与する場合、ＯＲＲは、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、または６０パーセントであり得る。いくつかの実施形態では、１０名以上のがん患者に、少なくとも約３ｍｇ／ｋｇで５ｍｇ／ｋｇ以下のＰＳＢ２０５を２週間、３週間、または４週間ごとに約１回投与する場合、ＤＣＲは、少なくとも約１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、または６０パーセントであり得る。いくつかの実施形態では、治療される患者は、肺癌または上咽頭癌を有し得る。

【0154】

抗ｈＣＴＬＡ４もしくは抗ｈＰＤ１抗体、ＰＳＢ２０５、またはこれらのいずれかをコードするポリヌクレオチド（複数可）は、抗体、抗体の混合物またはポリヌクレオチド（複数可）の前、後、および／または同時に投与される追加の治療法とともに投与することができる。追加の治療法は、免疫調節分子、放射線、化学療法剤、標的生物剤、標的阻害剤、および／または腫瘍溶解性ウイルスからなる群から選択され得る。

【0155】

いくつかの実施形態では、追加の治療法は、ＰＤＬ１、ＴＩＧＩＴ、ＣＣＲ４、ＣＣＲ８、ＣＳＦＲ１ａ、Ｂ７Ｈ３、Ｂ７Ｈ４、ＣＤ９６、またはＣＤ７３のアンタゴニスト、ＧＩＴＲ、４１ＢＢ、ＯＸ４０、またはＣＤ４０のアゴニスト、タリモジーン・ラハーパレプベック（ＩＭＬＹＧＩＣ（商標））などの腫瘍溶解性ウイルス、ブリナツモマブなどの二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴＥ）、インドールアミン２、３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）阻害剤、ベバシズマブなどの抗血管新生剤、抗体薬物複合体、またはチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。

【0156】

追加療法が化学療法剤である場合、それは、例えば、ブスルファン、テモゾロミド、シクロホスファミド、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ストレプトゾトシン、メチルロムスチン、シス－ジアンミンジクロロ白金、チオテパ、アジリジニルベンゾキノン、シスプラチン、カルボプラチン、塩酸メルファラン、クロランブシル、イホスファミド、塩酸メクロレタミン、カルムスチン（ＢＣＮＵ））、アドリアマイシン（ドキソルビシン）、ダウノマイシン、ミトラマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、マイトマイシンＣ、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビンブラスチン、ビノレルビン、パクリタキセル、ドセタキセル、ＶＰ－１６、ＶＭ－２６、メトトレキサート（ロイコボリンを含むまたは含まない）、５－フルオロウラシル（ロイコボリンを含むまたは含まない）、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウラシル、６－メルカプトプリン、６－チオグアニン、ゲムシタビン、シタラビン、５－アザシチジン、ヒドロキシウレア、デオキシコホルマイシン、フルダラビン、エトポシド、イリノテカン、トポテカン、アクチノマイシンＤ、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ｍＡＭＳＡ、プロカルバジン、ヘキサメチルメラミン、ペンタメチルメラミン、Ｌ－アスパラギナーゼ、ミトキサントロンであり得る。例えば、Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，４．ｓｕｐ．ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＤｅＶｉｔａ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．（１９９３）を参照されたい。この関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0157】

上記で本発明を一般的な用語で説明してきたが、以下の特定の実施例は、本発明を例示するために提供されるものであり、その範囲を限定するものではない。本明細書に記載の本発明の趣旨に沿って、本発明に対して様々な変更および修正を加えることができ、当業者には明らかであることが理解される。そのような変更および修正は、添付の特許請求の範囲を含め、本明細書に記載の本発明の範囲内にある。

【0158】

実施例
実施例１：個々の抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の作製
抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３のＨＣおよびＬＣをコードする配列を含む１つのベクターを以下のように作製した。配列番号１および配列番号５のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ断片の配列を、Ｇｅｎｅ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）オンラインソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ）を使用して、ハムスター（Ｃｒｉｃｅｔｕｌｕｓ ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞における発現用に最適化した。得られ最適化されたＤＮＡ配列、すなわち配列番号２および６を化学合成した。ＨＣおよびＬＣをコードするＤＮＡ配列を一過性発現ベクターに別々にサブクローニングし、大腸菌細胞に導入した。この抗体のＨＣは、改変Ｓ２２８Ｐを含んでいた（ここで、２２８位は、Ｅｄｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（前出）に示されているとおりであり、配列番号１の２２７位に対応する）。この改変により、ＩｇＧ４抗体中でのＦａｂアームの交換が妨げられ得る。Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ．（２０１５）では、新規の定量的イムノアッセイと生理学的マトリックス調製物の組み合わせを使用して実証されたように（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２９０（９）：５４６２－５４６９）、Ｓ２２８Ｐ変異により、ｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏのＩｇＧ４ Ｆａｂアームの交換が妨げられる。

【0159】

大腸菌細胞からのプラスミドＤＮＡのインサートの配列を決定し、この配列が正しいことを確認した。配列は、設計した配列と１００％同一であった。これらのプラスミドＤＮＡを鋳型として使用し、ＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉ部位（ＨＣ）またはＥｃｏＲＶおよびＰａｃＩ部位（ＬＣ）を含むプライマーを使用したポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＨＣおよびＬＣをコードする配列を個別に増幅した。得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲルからバンドを切り出し、これらのゲルバンドからＤＮＡ断片を精製することによって精製した。ＨＣをコードするバンドをＡｖｒＩＩおよびＢｓｔＺ１７Ｉで消化し、これらの同じ酵素で消化したＦｒｅｅｄｏｍ（登録商標）ｐＣＨＯ１．０ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にライゲーションし、大腸菌細胞に導入した。個々のコロニーからのプラスミドＤＮＡの配列が決定され、ＰＳＢ１０３のＨＣの正確なアミノ酸配列をコードする、設計されたＤＮＡ配列を含むプラスミドＤＮＡを含む１つのコロニーを同定した。このコロニーを拡大し、そのプラスミドＤＮＡを精製した。

【0160】

ＬＣをコードする精製バンドをＥｃｏＲＶおよびＰａｃＩで消化し、同じ酵素で消化した上記のＰＳＢ１０３のＨＣをコードする挿入ＤＮＡを含むＦｒｅｅｄｏｍ（登録商標）ｐＣＨＯ１．０ベクターにライゲーションした。このＤＮＡを大腸菌細胞に導入した。個々のコロニーをカナマイシン上で選択し、選択したコロニーからのプラスミドＤＮＡの配列決定を行った。抗ｈＰＤ１抗体のＨＣおよびＬＣをコードする配列と一致するインサートを有するプラスミドＤＮＡを含むコロニーを２回再度ストリークした。１つのコロニーが選択され、そのプラスミドＤＮＡの両方の鎖の配列を決定した。配列は、ベクター配列と一致し、プラスミド内のインサートは、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３のＨＣおよびＬＣをコードする配列と１００％一致した。図１は、このベクターとそのインサートの図を示す。

【0161】

ＰＳＢ１０３を産生するクローン細胞株を産生する最初のステップとして、ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のリサーチセルバンク（ＲＣＢ）を以下のように作製した。現在の適正製造基準（ｃＧＭＰ）に従って産生されたＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞のマスターセルバンク（ＭＣＢ）バイアルを３７℃のウォーターバスで解凍し、８ｍＭ Ｌ－グルタミンを補充した２９ｍＬのＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に接種した。十分な細胞数が得られた場合、細胞を遠心分離し、細胞ペレットを８ｍＭＬ－グルタミンと１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を１０^７細胞／ｍＬの濃度で添加したＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地に再懸濁し、これらの細胞の１ｍＬアリコートをバイアルに分配した。細胞のバイアルを凍結し、－７０℃の冷凍庫に一晩移し、その後液体窒素冷凍庫の気相に移した。

【0162】

次いで、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３のＨＣおよびＬＣをコードするインサートを含むＦｒｅｅｄｏｍ（登録商標）ｐＣＨＯ１．０ベクターをＲＣＢからＣＨＯ細胞に導入した。以下に詳細に説明するように、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３を安定して発現するクローン細胞株（Ｇ１９Ｇ４－４Ｂ４と呼ばれる）が樹立された。Ｇ１９Ｇ４－４Ｂ４を培養し、ＰＳＢ１０３を細胞上清から回収し、以下に記載する実験で使用するために精製した。

【0163】

より詳細には、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３のＨＣおよびＬＣをコードするベクター（図１に図示）は、制限酵素ＮｒｕＩによる切断によって線状にし、製造業者の指示に従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞の３つの並行トランスフェクションを実施した。Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ－Ｓ（商標）Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１３６９６０１）ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＭＡＮ０００３５０５、ＲｅｖｉｓｉｏｎＣ．０、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃを参照されたい。その関連部分は、参照により本明細書に組み込まれる。図２に示すとおり、トランスフェクションの３日後、３つのトランスフェクションのそれぞれを２つのプールに分割した。１つのプールは、それぞれ１０μｇ／ｍＬおよび１００ｎＭのピューロマイシンおよびメトトレキサート（ＭＴＸ）を含み、他方は、それぞれ２０μｇ／ｍＬおよび２００ｎＭのピューロマイシンおよびＭＴＸを含む。トリパンブルー染色で測定して、プールが少なくとも８５％の生存率を回復したら、選択の第２段階を開始した。この第２段階では、第１段階の各プールを２つのプールに分割し、１つのプールは、それぞれ３０μｇ／ｍＬおよび５００ｎＭのピューロマイシンおよびＭＴＸを含み、他方は、それぞれ５０μｇ／ｍＬおよび１μＭのピューロマイシンおよびＭＴＸを含んだ。トリパンブルー染色で測定した場合、第２段階選択プールの生存率が９０％に達したら、１０日間培養した流加生産物における抗ｈＰＤ１抗体力価を評価した。プール３－２－５は、抗体力価に基づいて選択した。これらの細胞を、上記のようにＤＭＳＯを含むＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地中、バイアル中で凍結させて、ＲＣＢを作製した。

【0164】

クローン細胞株を得るために、直前に記載したＲＣＢからの凍結細胞のバイアルを、８ｍＭのグルタミン、１μＭのＭＴＸ、および１％の抗凝集剤（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号００１００５７ＡＥ）を含有するＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地中で解凍させた。３日間の成長後、細胞を遠心分離し、８ｍＭグルタミン、１μＭＭＴＸ、および１％抗凝集剤を補充した既知組成培地に再懸濁させた。細胞をさらに２回継代培養し、各移植間に３日間成長させた。

【0165】

次いで、細胞を、グルタミン、１μＭＭＴＸ、および０．５％ＣｌｏｎｅＤｅｔｅｃｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を補充した半固体ＣｌｏｎｅＭｅｄｉａ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＳａｎＪｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）中で最終濃度３００細胞／ｍＬに希釈した。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ，アプリケーションノート「Ｃｏｎｆｉｄｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＣＨＯ－Ｓ ｃｅｌｌｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ｓｅｍｉ－ｓｏｌｉｄ ｍｅｄｉａ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣｌｏｎｅＳｅｌｅｃｔ Ｉｍａｇｅｒ」（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／ｅｎ／ａｓｓｅｔｓ／ａｐｐ－ｎｏｔｅ／ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｃｏｎｆｉｄｅｎｔ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ－ｏｆ－ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ－ｃｈｏ－ｓ－ｃｅｌｌｓ－ｇｒｏｗｎ－ｉｎ－ｓｅｍｉ－ｓｏｌｉｄ－ｍｅｄｉａ－ｕｓｉｎｇ－ｃｌｏｎｅｓｅｌｅｃｔ＃ｇｒｅｆで入手可能）を参照されたい。これは、参照により本明細書に組み込まれる。細胞を６ウェルプレートに２ｍＬ／ウェルで播種し、３６．５℃、５％ＣＯ_２、および９０％相対湿度（ＲＨ）でインキュベートした。１０日間の静置培養後、ＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）２システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、プレートの蛍光をスクリーニングした。ＣｌｏｎｅＰｉｘ（商標）２システムは、高蛍光を発する３５６個のコロニーを、１００μＬの既知組成培地を含む９６ウェルプレートの個々のウェルに移した。４～５日間の静置培養後、各ウェル中の培地を慎重に吸引し、５０μＬの新鮮培地と交換した。その後、コロニーが８０％コンフルエンスに達するまで、培地をこのようにして３～４日ごとに交換した。培地を再度交換し、コロニーをさらに３日間インキュベートした。

【0166】

次に、抗ｈＰＤ１抗体の発現および成長特性についてコロニーを評価した。上記の３５６個の拡大させたコロニーを、９６ウェルプレートからスピンチューブにコロニーを移すことによってさらに拡大させた。これらのスピンチューブ培養物を上記のようにバイアル中で凍結し、１つの細胞クローニングに使用するＲＣＢを作製した。拡大プロセス中に、流加生産における細胞株の発現および成長特性を評価した。最初の生産は、２４ウェルのマイクロタイタープレートで行った。ＦｏｒｔｅＢｉｏＯｃｔｅｔ（登録商標）システムプロテインＡ定量アッセイ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して測定した抗体発現レベルに基づいて、高い抗体発現および許容可能な成長特性を有する１８５細胞株をスピンチューブに拡大し、２回目の流加生産を実施した。この評価に基づいて、以下に説明する限界希釈によるクローニングのために、Ｇ１９Ｇ４細胞株を選択し、前述のようにＧ１９Ｇ４のＲＣＢを作製した。

【0167】

Ｇ１９Ｇ４ ＲＣＢのバイアルを既知組成培地で解凍し、培養した。数回継代後、細胞をＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地で希釈し、限界希釈法によりクローニングのために９６ウェルプレートに播種した。ウェルは、播種後３時間後（Ｔ＝０）、ならびに１日目、３日目、９日目、および１３日目に撮像した。１つの細胞からのクローン（イメージングに基づく）を拡大し、成長特性についてスクリーニングし、流加培養における抗体産生性能を評価した。クローンＧ１９Ｇ４－４Ｂ４は、その成長特性および抗体産生性能に基づいて、リードクローンとして選択し、１Ｌ振盪フラスコで拡大させ、ＤＭＳＯを補充した既知組成培地で凍結させて、上記のようにＲＣＢを生成した。

【0168】

抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５を発現する細胞株を作製するために、ＰＳＢ１０５のＨＣをコードするベクターと、ＰＳＢ１０５のＬＣをコードするもう１つのベクターの２つのベクターを以下のように作製した。抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＨＣをコードするベクターを構築するために、配列番号１３（抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣのアミノ酸配列）をコードするＤＮＡ断片の配列を、ＧｅｎｅＯｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）オンラインソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ）を使用して、ハムスター細胞（Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ）での発現用に最適化した。その配列が配列番号１４に示される最適化されたＤＮＡ断片は、化学的に合成された。このＤＮＡ断片は、次の位置で次のアミノ酸改変を有するＨＣをコードする（Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．、前出により定義）：Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｃ２２０Ｇ、Ｒ２５５Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、およびＫ４０９Ｅ（配列番号１３の１４８位、１７１位、１７４位、２２１位、２５６位、４００位、および４１０位に対応する）。これらの改変の一部（Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、Ｖ１７３Ｃ、Ｃ２２０Ｇ、および抗ｈＣＴＬＡ４ＬＣ改変Ｓ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２Ｃ、およびＣ２１４Ｓ）は、確実に同族ＨＣ／ＬＣの対形成を行う。その他（Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅ）は、確実にホモ二量体ＨＣ／ＨＣ対の形成行う。１つ（Ｒ２５５Ｋ）は、ｉｎ ｖｉｖｏクリアランス率の上昇および／またはｉｎ ｖｉｖｏ半減期（ｔ_１／２）の短縮を引き起こす。この合成されたＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、得られた断片を上記のようにアガロースゲル上で精製した。精製した断片をＳａｐＩで消化し、ＳａｐＩで消化したＭ２６８－ｃベクター（Ａｔｕｍ，Ｎｅｗａｒｋ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にライゲートさせた。ライゲーションした混合物を大腸菌細胞に導入し、コロニーを選択し、これらのコロニーからのプラスミドインサートの配列を決定した。抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣをコードする配列と１００％一致するコロニーをさらに２回ストリークし、第２のストリークからのコロニー由来のプラスミドＤＮＡのインサートの配列を決定した。それは、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣをコードする配列と一致した。

【0169】

第２のステップでは、Ｅｌｅｃｔｒａキット（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｔｕｍ．ｂｉｏ／ｃａｔａｌｏｇ／ｒｅａｇｅｎｔｓ／ｅｌｅｃｔｒａを参照）を使用して、製造業者のプロトコルに従って、インサートを哺乳動物細胞での安定した発現に好適であるベクター、すなわちｐＤ２５３７（Ａｔｕｍ）に移入した。室温で１５分間インキュベート後、Ｅｌｅｃｔｒａ反応物をエレクトロポレーションによって大腸菌に導入した。細胞を、３０μｇ／ｍＬカナマイシン（それによりｐＤ２５３７ベクターを選択する）およびｐＭ２６８－ｃプラスミドに対して逆選択する１０ｍＭｐ－クロロフェニルアラニンを含む酵母抽出グルコース（ＹＥＧ）寒天プレート上にプレーティングした。抗ｈＣＴＬＡ４ ＨＣをコードするＤＮＡの存在についてコロニーをスクリーニングし、陽性コロニー中のプラスミドのインサートの配列決定を行った。次いで、抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣをコードするＤＮＡの配列と一致するプラスミドを含むコロニーをさらに２回ストリークし、２番目のストリークからのコロニー由来のプラスミド全体の両鎖の配列を決定した。それは、ベクター配列および抗ｈＣＴＬＡ４ＨＣのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列と一致した。抗ｈＣＴＬＡ４ＨＣのＨＣをコードするＤＮＡを含むプラスミドｐＤ２５３７のマップを図３に示す。

【0170】

抗ｈＣＴＬＡ４ ＳＢ１０５抗体のＬＣをコードするベクターを以下のように構築した。抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＬＣをコードするＤＮＡ配列を、上記のようにハムスター（Ｃ．ｇｒｉｓｅｕｓ）細胞での発現用に最適化し、化学合成し、ＳａｐＩ部位を含むプライマーを使用するＰＣＲによって増幅した。このＰＣＲ断片をＳａｐＩで消化し、ＳａｐＩで消化したｐＭ２６８－ｃ（Ａｔｕｍ）にライゲーションし、大腸菌細胞に導入した。選択したコロニーからのプラスミドインサートのＤＮＡ配列を決定し、抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＬＣをコードする配列を含むコロニーを同定した。このコロニーを拡大させ、第２のステップ用のプラスミドＤＮＡを作製するに使用した。

【0171】

第２のステップでは、ＰＳＢ１０５のＬＣをコードするＤＮＡが挿入されたｐＭ２６８－ｃベクター（上記）および哺乳動物細胞中で安定して発現するためのベクターであるｐＤ２５３１－ＥＦＭベクター（Ａｔｕｍ）を使用して、Ｅｌｅｃｔｒａ反応（あるベクターから別のベクターにインサートを効率的に移すため）を実施した。反応を１５分間実施し、次に大腸菌細胞に導入し、３０μｇ／ｍＬカナマイシン（それによりｐＤ２５３１－ＥＦＭベクターを選択する）および１０ｍＭｐ－クロロフェニルアラニン（ｐＭ２６８－ｃプラスミドに対して選択するため）上にプレーティングした。選択されたコロニーからのプラスミドＤＮＡの配列が決定され、ＰＳＢ１０５のＬＣをコードするインサートを含むコロニーを同定した。次いで、このコロニーを２回ストリークし、２番目のストリークからのコロニー由来のプラスミドＤＮＡの配列を決定した。この配列は、ベクター配列と一致し、挿入された配列は、ＰＳＢ１０５のＬＣをコードした。プラスミドＤＮＡは、このコロニーから作製された。このベクターのマップを図４に示す。

【0172】

ＰＳＢ１０５を発現するＣＨＯ細胞株は、上記ならびに図３および図４に図示されているＰＳＢ１０５のＨＣおよびＬＣをコードする哺乳動物発現プラスミドを同時に導入することによって作製した。より詳細には、２つのベクターをＮｒｕＩ－ＨＦ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状にし、製造業者の指示に従って、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を使用して、ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞をトランスフェクトするために使用した。Ｆｒｅｅｄｏｍ（商標）ＣＨＯ－Ｓ（商標）Ｋｉｔ（カタログ番号Ａ１３６９６０１）ＵｓｅｒＧｕｉｄｅ、Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒＭＡＮ０００３５０５、ＲｅｖｉｓｉｏｎＣ．０、Ｔｈｅｒｍｏ ＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃを参照されたい。これは、参照により本明細書に組み込まれる。トランスフェクションの２日後、２５μＭメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）および２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（ＨＧＢ）を補充した４０ｍＬＣＤ－ＦｏｒｔｉＣＨＯ培地への完全な培地交換を行うことによって選択を開始した。トランスフェクション培養物を３つの別々のプールに分割し、それぞれをＴ－１５０フラスコに３ｘ１０^５、５ｘ１０^５、または８ｘ１０^５細胞／ｍＬで播種した。６日後、すべてのプールを遠心分離し、培地を注意深く吸引した。細胞ペレットをそれぞれ、２５μＭＭＳＸおよび２００μｇ／ｍＬＨＧＢを含む新鮮な培地中に３ｘ１０^５細胞／ｍＬで再懸濁させ、１２５ｍＬの通気口付き振盪フラスコ中で培養した。続いて、プールを、生存率がすべて＞９０％（トリパンブルー染色により測定した場合）になるまで、直前に記載したように継代し、その時点で、１１日間の流加生産において、抗体発現について判定した。発現レベルに基づいて、Ｔ－１５０フラスコに３ｘ１０^５細胞／ｍＬで初期播種することによって生成されたプール（ＰＳＢ１０５プール２．０３と称する）を、５Ｌ撹拌タンクバイオリアクター内でＰＳＢ１０５を生産するために選択した。

【0173】

最後に、Ｇ１９Ｇ４－４Ｂ４細胞株とＰＳＢ１０５プール２．０３とをそれぞれ別々に培養すること、これらの培養物の細胞上清から抗体を回収すること、グラジエント溶出ではなく１つの溶出ステップを使用してプロテインＡカラムで抗体を精製すること、により、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５抗体を並行して作製した。

【0174】

実施例２：抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の結合特異性の評価。
抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体、すなわちＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の結合の特異性は、ｈＰＤ１、ｈＣＴＬＡ４、およびＣＤ２８ファミリーの他のメンバーへの結合を測定する固相酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。

【0175】

簡潔に説明すると、９６ウェルの平底マイクロタイタープレートのウェルを１μｇ／ｍＬの捕捉分子でコーティングし、これは、（１）Ｆｃ断片に融合したヒトＰＤ１の細胞外ドメイン（ｈＰＤ１．Ｆｃ）、（２）Ｆｃ断片に融合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン（ｈＣＴＬＡ４．Ｆｃ）、（３）ヒスチジン－ａｖｉタグと融合したヒトＰＤＬ１の細胞外領域（ｈＰＤＬ１－ｈｉｓ－ａｖｉ）（タンパク質の効率的な精製（ヒスチジンタグ）とビオチンによるタンパク質（ａｖｉタグ）の標識が可能になる）、（４）ヒスチジン－ａｖｉタグに融合したマウスＰＤ１の細胞外ドメイン（ｍＰＤ１－ｈｉｓ－ａｖｉ）、または（５）Ｆｃ断片に融合されたヒトＣＤ２８の細胞外ドメイン（ｈＣＤ２８．Ｆｃ；Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍｓカタログ番号３４２－ＣＤ）のいずれかであった。プレートを粘着ストリップで密封し、１８～２４℃で一晩インキュベートした。プレートを、０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０を含む１ｘリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄した。３００μＬのブロック緩衝液（１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む１ｘダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））を各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートすることによってプレートをブロックした。プレートを上記のとおり洗浄した。

【0176】

一次抗体（ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５）を１００μＬの量で各ウェルに添加した。連続希釈系列で同じ一次抗体を含む複数のウェルをテストした。プレートを接着ストリップで密封し、室温で１時間インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲートしたポリクローナルヤギ抗ヒトκ軽鎖１００μＬ（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ａ７１６４）を試薬希釈剤（０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０および０．１％ＢＳＡを含むダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ））で１：１００００に希釈し、これを各ウェルに添加した。プレートを再度接着ストリップで密封し、室温で１時間インキュベートし、上記のように洗浄した。次に、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）基質溶液（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＴＭＢ基質キット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒカタログ番号３４０２１より）１００μＬを、各ウェルに添加し、プレートは直射光下に置くことなく、室温で２０分間インキュベートした。最後に、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＴＭＢ基質Ｋｉｔの停止溶液５０μＬを各ウェルに添加し、４５０ｎｍに設定したマイクロプレートリーダーで、各ウェルの光学密度を測定した。

【0177】

結果を図５、パネルＡおよびＢに示す。ＰＳＢ１０３は、ｈＰＤ１への結合を示したが、ｍＰＤ１、ｈＰＤＬ１、ｈＣＤ２８、またはｈＣＴＬＡ４には結合しなかった。同様に、ＰＳＢ１０５は、ｈＣＴＬＡ４への結合を示したが、ｈＰＤ１、ｍＰＤ１、ｈＰＤＬ１、またはｈＣＤ２８には結合しなかった。したがって、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５は両方とも、それらの抗原に対して特異的な結合を呈した。

【0178】

実施例３：カニクイザルにおけるＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の単回投与薬物動態。
カニクイザルにおけるＰＳＢ１０３の単回投与薬物動態学的特性を以下のように評価した。カンボジア起源のタンパク質ナイーブカニクイザル（すなわち、以前にヒト抗体を投与されていないサル）（体重４．１２９～５．９７１ｋｇ、年齢５～７歳）２頭の雄および２頭の雌を、２つの試験群のうちの一方に配置し（ｎ＝２、雄１匹／群、雌１匹／群）、投与開始前の７日間、試験室に順応させた。一方の群のサルは、ＰＳＢ１０３の投与を受け、他方の群は、関係のないＩｇＧ４抗体の投与を受けた。ＰＳＢ１０３およびＩｇＧ４抗体を、試験１日目に５ｍｇ／ｋｇの用量で、１回のゆっくりとした静脈内（ＩＶ）ボーラス注射により注射した。投与前日を－１日目と示し、それより前の日を－２日目、－３日目などと順に番号を付けた。１日目の翌日を２日目、３日目と順に番号を付けた。体重は、－４日目、－１日目、９日目、および２３日目に記録し、臨床観察は、順応中の選択日および生涯毎日２回行った。血液サンプル約０．５ｍＬを、投与前ならびに、投与後０．０８３（５分）、０．５（３０分）、２、８、１６、２４、７２、１４４、２４０、３３６、５０４、および６７２時間後に採取した。室温、２，０００ｘｇで１５分間遠心分離することにより血清を得た。各サンプルを２つのアリコート、すなわちアリコート１および２に分割した。

【0179】

サンプルの生物分析は、ＰＳＢ１０３に対する抗イディオタイプ抗体を使用する検証済みのＥＬＩＳＡプロトコルによって実施した。簡潔に説明すると、ＰＳＢ１０３（３Ｇ１２）に対する抗イディオタイプ抗体を使用して、マイクロプレートのウェルをプレコートした。ブロッキングおよび洗浄後、サンプル（試験サンプル、ブランク、標準、および品質管理サンプルを含む）をウェルに加え、プレートをインキュベートし、その後洗浄した。次に、抗イディオタイプ３Ｇ１２（ｂｉｏ－３Ｇ１２）抗体のビオチン化型をウェルに添加した。結合したｂｉｏ－３Ｇ１２は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識ストレプトアビジンで検出した。ＨＲＰの基質であるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を含む展開溶液をマイクロプレートのウェルに添加すると、サンプル中のＰＳＢ１０３の濃度に比例する４５０ｎｍの比色シグナルが得られた。光学密度データからサンプル中のＰＳＢ１０３の濃度への変換は、４パラメータロジスティックモデルに従って回帰された、同時に分析された検量線との比較によって行った。ＰＳＢ１０３の定量下限（ＬＬＯＱ）は、５０ｎｇ／ｍＬであった。図６は、これらのデータの片対数プロットを示す。

【0180】

薬物動態（ＰＫ）評価は、検証済みのＰｈｏｅｎｉｘＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（登録商標）バージョン６．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の非コンパートメント分析モデル血漿（２００－２０２）ＩＶボーラスによる個々の血清濃度および公称時間データを使用して実施した。公称ＰＫ採血時点は、投与前、ならびに投与後０．０８３（５分）、０．５（３０分）、２、８、１６、２４、７２、１４４、２４０、３３６、５０４および６７２時間であった。血清濃度時間曲線下面積（ＡＵＣ）は、線形対数台形則によって推定され、ラムダｚ（λｚ）を推定するための時点は、回帰用に最適に適合し均一に重み付けされた濃度データを使用して、ソフトウェアによって選択された。これらのデータを以下の表１に示す。

【0181】

【表2】

【0182】

^ａこれには、各時点で群内の２匹のサルのそれぞれから採取されたサンプルが含まれ、各サンプルは、分析のために２つの別々のアリコートに分割された。

【0183】

^ｂＳＤは、標準偏差を意味する。

【0184】

個々の動物のアリコート間または動物間のＰＫパラメータの違いは、生物分析データの変動性および動物の数が制限されていることに起因していた。ＩＶボーラス投与で予想されるように、最高血清濃度（Ｃ_ｍａｘ）は、一般に、最初の時点、０．０８３時間（Ｔ_ｍａｘ）であった。

【0185】

第２の単回投与ＰＫ試験では、抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＰＫパラメータを評価した。タンパク質ナイーブカニクイザル６匹を、雄１匹および雌１匹を含む３つの群に分けた。３つの群は、ＰＳＢ１０５（群１）、関係のないヒトＩｇＧ１抗体（群２）、またはイピリムマブと呼ばれる市販の抗ｈＣＴＬＡ４抗体（群３）を３ｍｇ／ｋｇの用量でボーラスＩＶ注射によって単回投与を受けた。公称採血時点は、投与前、ならびに投与後０．０８３（５分）、０．５（３０分）、２、８、１６、２４、７２、１４４、２４０、３３６、５０４および６７２時間であった。血清を上記のように調製し、ＰＳＢ１０５（３Ｇ４）に対する抗イディオタイプ抗体を使用する検証済みのＥＬＩＳＡ法により、試験抗体の血清濃度を測定した。このアッセイは、３Ｇ１２およびｂｉｏ－３Ｇ１２の代わりに、３Ｇ４およびそのビオチン化型（ｂｉｏ－３Ｇ４）を使用したことを除いて、ＰＳＢ１０３について上述したように実施した。ＰＳＢ１０５のＬＬＯＱは、２５０ｎｇ／ｍＬであった。図７にこれらのデータを示す。

【0186】

ＰＫパラメータは、上記のように決定され、以下の表２に示す。

【0187】

【表3】

【0188】

^aこれには、各時点で、各群２匹のサルのそれぞれから採取されたサンプルが含まれる。

【0189】

^ｂＳＤは、標準偏差を意味する。

【0190】

表１のデータと併せて考えると、これらのデータは、ＰＳＢ１０３が、カニクイザルにおいて、ＰＳＢ１０５（１０９時間）のほぼ３倍であるｔ_１／２（２９７時間）を有し、これは、ＰＳＢ１０３がＰＳＢ１０５よりも長く血流中に残留する可能性が高いことを示している。さらに、ＰＳＢ１０５は、また、カニクイザルにおいて、承認済みの抗ｈＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブ（３９７時間）よりもはるかに短いｔ_１／２を有する。

【0191】

実施例４：ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方を発現する哺乳動物宿主細胞株の作製
以下に、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５を発現するＣＨＯ宿主細胞株の作製について説明する。最初のステップとして、ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のＲＣＢを実施例１に記載のとおり作製した。

【0192】

その後、図８に示すように、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３および抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５の両方を発現する細胞株を２つのステップで作製した。まず、実施例１で上述したクローン細胞株Ｇ１９Ｇ４－４Ｂ４ＲＣＢ（ＰＳＢ１０３を発現する）からの１つのバイアルを解凍し、８ｍＭのグルタミンおよび１μＭのＭＴＸを補充した１９ｍＬのＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地を含む１２５ｍＬのフラスコ中で拡大させた。細胞を２～３日ごとに２週間にわたり希釈して継代し、その後トランスフェクトした。トランスフェクションの前に、上記および図３および４に図示した抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＨＣおよびＬＣをコードするプラスミドを、ＮｒｕＩ－ＨＦ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｐｓｗｉｃｈ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）で線状にした。それぞれ３ｘ１０^７細胞と上記の抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＨＣおよびＬＣをコードするプラスミドのそれぞれ２５μｇとを使用する２つのトランスフェクションを、製造業者の指示を利用して、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）ＭＡＸ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実施した。トランスフェクトされた細胞を、８ｍＭグルタミンおよび１μＭ ＭＴＸを補充した３０ｍＬのＣＤＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地を含む２つのフラスコに、細胞濃度１０^６細胞／ｍＬで播種した。フラスコを、１５０ＲＰＭで回転する軌道直径２５ｍｍのシェーカープラットフォーム上で、３７℃、５％ＣＯ_２で４８時間インキュベートした。

【0193】

その後、２つのフラスコを組み合わせること、得られた培養物を３つのプールに分離すること、および０．５Ｘグルタミンシンセターゼ発現（ＧＳ）培地サプリメント（Ｓｉｇｍａ）、１００ｎＭＭＴＸ、２００μｇ／ｍＬハイグロマイシンＢ（ＨＧＢ）、およびメチオニンスルホキシミン（ＭＳＸ）なし、１０μＭＭＳＸ、または２５μＭＭＳＸのいずれかで、約１０００～３０００細胞／ウェルを使用して、細胞を９６ウェルプレートに播種することによって選択を開始した。この選択スキームを図９に示す。ＭＴＸは、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３をコードするベクターの存在のために選択する。ＨＧＢは、抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＨＣをコードするベクターの存在のために選択する。グルタミンが不在であり、グルタミンシンセターゼ阻害剤ＭＳＸが存在することにより、ハツカネズミグルタミンシンセターゼをコードするＤＮＡを含む抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５のＬＣをコードするベクターの存在について選択される。プレートを１２日間インキュベート後、成長を示すウェルを識別するために撮像した。４８個のウェルを選択し、１２ウェルプレートに播種するまで順次大きいウェルに拡大した。

【0194】

細胞が１２ウェルプレート内でコンフルエントに達したときに、上清をＥＬＩＳＡによって分析して、抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５および抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３を約１：２の比で発現するウェルを同定した。３つのプールのそれぞれから選択したウェル（ＭＳＸなし、１０μＭＭＳＸ、または２５μＭＭＳＸ）を分析して、細胞によって産生された総抗体の何パーセントが抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３であるかを決定した。データを以下の表３に示す。

【0195】

【表4】

【0196】

表３のデータは、ＭＳＸを含まないウェルが、平均してより高い割合の抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３を産生したことを示している。テスト対照の、ＭＳＸを含まない１６ウェルのうち１５ウェル、すなわち５Ｇ７を除くすべてを、５０ｍＬコニカルチューブにまとめてプールし、軌道直径２５ｍｍのシェーカープラットフォーム上２２５ＲＰＭで回転させ、３７℃、５％ＣＯ_２でさらに４日間インキュベートした。細胞を、６ｍＭグルタミンを補充したＣＤ ＦｏｒｔｉＣＨＯ（商標）培地で２．５細胞／ｍＬに希釈し、９６ウェルプレートに０．５細胞／ｍＬで播種した。細胞を１つのみ含むウェルを識別するために、プレーティングの２時間後、ならびに２、１３、および２１日目にウェルを撮像した。１つの細胞クローンを１４０個、拡大させた。

【0197】

これらの細胞株のうち１２５個は、最初に細胞を透過処理し、次にＩｇＧ４およびＩｇＧ１の細胞内発現を染色することによって、抗ｈＰＤ１抗体ＰＳＢ１０３（ＩｇＧ４抗体）および抗ｈＣＴＬＡ４抗体ＰＳＢ１０５（ＩｇＧ１抗体）の発現についてスクリーニングした。いくつかの細胞が主にＩｇＧ４抗体のみまたは抗ＩｇＧ１抗体のみを発現するクローン細胞株（図１０、パネルＣに示すように）は、さらなる分析のためには選択されなかった。ほとんどすべての細胞が抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体の両方を発現するクローン細胞株（図１０、パネルＢに示すように）をさらなる分析のために選択した。

【0198】

これらの細胞株のうち１４株を振盪フラスコで拡大させ、培養開始から１２日後および／または１４日後にプロテインＡカラムを使用して細胞上清から抗体を回収した。抗体の量は、２２０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を既知の濃度の標準タンパク質の希釈系列の吸光度と比較することによって判定した。抗ｈＰＤ１抗体である全抗体のパーセント（抗ｈＰＤ１％）は、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１３）によって、Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｐＨ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｃａｔｉｏｎ－ｅｘｃｈａｎｇｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｏｆ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｂｙ ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ ｉｏｎｉｃ ｓｔｒｅｎｇｔｈ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ １２７２：５６－６４に記載されているとおり、ｐＨ勾配陽イオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）によって決定した。これは、参照により本明細書に組み込まれる。これらのデータを以下の表４および図１１に示す。

【0199】

【表5】

【0200】

上記の表４に示すように、約５０～７５％の抗ｈＰＤ１抗体および少なくとも１ｇ／Ｌの総抗体から産生される５つのクローン細胞株をさらなる分析のために選択した。これらの細胞をベンチスケールバイオリアクター内で成長させ、細胞倍加時間を測定した。抗体を細胞上清から回収し、抗体力価および抗ｈＰＤ１抗体パーセントを上記のように決定した。抗体混合物中の抗体の純度は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実施することによって評価した。これらのデータを以下の表５に示す。

【0201】

【表6】

【0202】

さらなる特性評価のために細胞株２０Ｆ５を選択した。２０Ｆ５細胞のＲＣＢを上記のように作製した。集団倍加レベル（ＰＤＬ）、すなわちＲＣＢの確立以来、集団内の細胞が２倍になった回数、および／または全体的な抗体発現、抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１抗体比、および／または細胞倍加時間に影響を及ぼす培地中におけるメトトレキサート（ＭＴＸ）またはハイグロマイシンＢ（ＨＧＢ）の存在を決定するために、さらなる実験を行った。

【0203】

簡潔に言えば、２０Ｆ５ ＲＣＢのバイアルを１００ｎＭ ＭＴＸおよび２００μｇ／ｍＬ ＨＧＢを含む培地（＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地）で解凍させた。解凍の３日後、この培養物を使用して、１００ｎＭ ＭＴＸを含有し、ＨＧＢを含まない培地（＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）中で追加の培養物を作製した。得られた２つの培養物を、それぞれの培地中で３～４日ごとに継代することにより、約６０ＰＤＬの間、熟成させた。倍加時間を監視し、図１２、パネルＣに示すデータを生成した。これらのデータは、２０Ｆ５の倍加時間が約１０～６０のＰＤＬでほぼ一定であり、＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢおよび＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地でも同様であることを示した。

【0204】

上述の＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢおよび＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地での培養物を熟成している間、各培養物のバイアルをＰＤＬ約１３および約２８で凍結させた（ＲＣＢの作製について上述したとおりである）。約３５のＰＤＬで、＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地の培養物を使用して、ＭＴＸおよびＨＧＢを両方とも含まない培地（－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地）で別の培養物を作製し、これをＰＤＬ４５．３に達するまで培養した。この時点で、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地で流加培養を接種するために使用され、図１２、パネルＡの左から４番目の棒グラフに示すデータが得られた。＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地は、ＰＤＬ４５．４に達し、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地で流加培養を接種するために使用された。これにより、図１２、パネルＡの左から５番目の棒グラフに示されるデータが得られた。

【0205】

さらに、＋ＭＴＸ／＋ＨＧＢ培地での培養がＰＤＬ４４．５に達したとき、それを使用して－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地で流加培養を開始し、図１２、パネルＡの右端の棒グラフに示すデータが得られた。

【0206】

さらに、ＰＤＬ約１３および２８で凍結させた＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ培養物からの細胞のバイアルを－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地に解凍し、それぞれＰＤＬ２２．４および３７．２に達するまで、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地中で培養した。この時点で、これらの培養物を使用して、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地で流加培養物を接種し、図１２、パネルＡの左から２番目および３番目の棒グラフにそれぞれ示すデータが得られた。

【0207】

最後に、２０Ｆ５ＲＣＢからの細胞のバイアルを－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地で解凍し、ＰＤＬ９．２に達するまで－ＨＧＢ／－ＭＴＸ培地で培養した。その培養物を使用して、－ＭＴＸ／－ＨＧＢ培地で流加培養したものを接種し、図１２、パネルＡの左端の棒グラフに示すデータが得られた。

【0208】

各培養の開始後６、８、および１１日目に、上記のすべての流加培養物から細胞培養上清サンプルを採取し、産生された抗体の総量および抗ｈＰＤ１抗体である抗体のパーセントを決定した。１１日目のサンプル中の抗体は、プロテインＡカラムを使用して回収した。回収した抗体の量は、２２０ｎｍで吸光度を測定し、その結果を既知の濃度の抗体の希釈系列の吸光度と比較することによって判定した。これらの結果を図１２、パネルＡに示す。

【0209】

ストレプトアビジン（ＳＡ）センサーを備えたＯｃｔｅｔ Ｒｅｄシステム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用して開発された社内メソッドを使用して（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、カタログ番号：１８－５０１９）、抗ｈＰＤ１抗体のパーセントは、６、８、１１日目に収集された細胞培養上清サンプルから直接測定した。簡潔に言えば、抗ｈＰＤ１抗体および抗ｈＣＴＬＡ４抗体に特異的な抗イディオタイプ抗体（抗ｉｄ Ａｂ）を、市販のキットを使用して、製造業者のプロトコル（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，カタログ番号：２１９５５）に従って、ビオチン／抗ｉｄＡｂモル比１：１でビオチン化した。次に、ビオチン化抗イディオタイプ抗体をＳＡセンサーに固定化し、２セットのセンサーを生成した。一方のセットは、抗ｈＰＤ１ 抗－ｉｄＡｂを使用し、他方のセットは、抗ｈＣＴＬＡ４ 抗－ｉｄＡｂを使用した。精製した抗ｈＰＤ１および抗ｈＣＴＬＡ４をＰＢＳで連続希釈して、既知の濃度で各抗体の標準曲線を作成し、希釈した６、８、および１１日目の細胞上清サンプルも含むアッセイプレートに添加した。抗ｈＰＤ１抗－ｉｄを固定化したＳＡセンサーを使用して、細胞培養サンプル中の抗ｈＰＤ１抗体の量を測定し、抗ＣＴＬＡ４抗－ｉｄを固定化したＳＡセンサーを使用して、細胞培養サンプル中の抗ＣＴＬＡ４抗体の量を測定した。結果を、既知の濃度での各抗体の精製サンプルからの結果と比較して、細胞培養サンプル中に存在する抗体の量を決定した。各サンプル中に存在する抗体の総量は、サンプル中に検出された抗ｈＰＤ１および抗ＣＴＬＡ４の量を加えることによって決定した。各サンプル中に存在する抗ｈＰＤ１抗体のパーセントは、各サンプル中で測定された抗ｈＰＤ１の量を各サンプル中に存在する抗体の総量で割ることによって決定した。データを図１２、パネルＢに示す。

【0210】

まとめると、図１２のデータは、ＰＤＬが試験範囲内のＰＤＬを有する細胞集団中での抗ｈＣＴＬＡ４：抗ｈＰＤ１抗体比または全体的な抗体発現に実質的に影響を及ぼすことはないことを示した。図１２、パネルＡおよびＢ。さらに、全体的な抗体力価および抗ｈＣＴＬＡ４／抗ｈＰＤ１抗体比は、すべての培養物で本質的に同じであり、試験した様々な培地がこれらの指標に影響を及ぼすものではなかったことを示している。図１２、パネルＡおよびＢ。さらに、細胞株２０Ｆ５の倍加時間は、培地が＋ＭＴＸ／－ＨＧＢ／培地または＋ＨＧＢ／＋ＭＴＸ培地であるかに関係なく、ＰＤＬ約１０～６０での培養において、ほぼ一定であった。図１２、パネルＣ。２０Ｆ５細胞株によって産生されるＰＳＢ１０３とＰＳＢ１０５との混合物を、本明細書ではＰＳＢ２０５と称する。

【0211】

実施例５：ＰＳＢ２０５の作製
ＰＳＢ２０５は、以下のとおり作製した。２０Ｆ５細胞株を培養し、細胞上清を回収した。ＰＳＢ２０５は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを使用して、細胞上清から精製され、抗体混合物は、勾配ではなく、１つのステップでプロテインＡから溶出させた。調製物の純度を高めるために、例えば、アニオンおよび／またはカチオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、および／またはサイズ排除クロマトグラフィーなどの様々なカラムクロマトグラフィーステップに加えて、様々な沈殿戦略、透析、および／または様々なろ過ステップのいずれかなどの他のステップを任意により追加することができる。

【0212】

最後に、重量／重量（ｗ／ｗ／）パーセンテージとしてのＰＳＢ１０５とＰＳＢ１０３の比を、２つの異なるロットのＰＳＢ２０５について決定した。一方のロットは、毒性学研究に使用されたもの（ＰＳＢ２０５－Ｔｏｘ）であり、他方のロットは、適正製造基準（ＧＭＰ）プロトコルを使用して産生されたもの（ＰＳＢ２０５－ＧＭＰ）である。抗体の相対濃度は、減少させた塩濃度を用いて、抗体を分離する疎水性相互作用高速液体クロマトグラフィー（ＨＩ－ＨＰＬＣ）を使用して決定した。抗体は、ＵＶ光により検出した。ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の個別のピーク面積を並行して積分し、合計した。各抗体の比率は、２つの抗体ピークのそれぞれの面積を両方の抗体ピークの面積の合計で割ることによって決定した。これらのデータを以下の表６にまとめる。

【0213】

【表7】

【0214】

これらのデータは、異なるロットにおけるＰＳＢ１０５：ＰＳＢ１０３の比率が非常に同等であることを示している。

【0215】

ＰＳＢ２０５－ＴｏｘおよびＰＳＢ２０５－ＧＭＰ中の抗体の非還元無傷質量を、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって測定した。同様のデータが、ＰＳＢ２０５の調製物から単離されたＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の種からも得られ、これらを本明細書ではＰＳＢ１０３－ＳおよびＰＳＢ１０５－Ｓと称する。より具体的には、質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を備えた四重極飛行時間型（ＱＴＯＦ）質量分析計に接続されたサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって取得された。結果を、図１３、パネルＡ（ＰＳＢ１０３－Ｓ）、Ｂ（ＰＳＢ１０５－Ｓ）、およびＣ（ＰＳＢ１０３－ＳおよびＰＳＢ１０５－Ｓが単離されたＰＳＢ２０５調製物）、ならびに図１４、パネルＡ（ＰＳＢ２０５－Ｔｏｘ）およびＢ（ＰＳＢ２０５－ＧＭＰ）に示す。検出された主要な抗体種のサイズは、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の様々なグリコシル化種に対応していた（Ｎ－グリコシル化抗体種の詳細な説明については、例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１６），Ｕｌｔｒａｆａｓｔ ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｎ－ｇｌｙｃａｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ＭＡｂｓ ８（４）：７０６－７１７を参照されたい。これは参照により本明細書に組み込まれる）。ここで、以下に説明するとおり、両方の抗体のＨＣは、Ｃ末端リジンを含まない。両方の抗体のＨＣのＮ末端グルタミンは、ピログルタミン酸に変換されている。検出されたグリコシル化種の同定は、図１３の簡単な説明で説明している。Ｃ末端リジンまたは未修飾のＮ末端グルタミンなどの主要な抗体種は検出されなかった。図１３に示す結果から導き出されたサイズを以下の表７に示す。

【0216】

【表8】

【0217】

示差走査熱量測定（ＤＳＣ）を使用して、ＰＳＢ２０５の安定性を測定した。理論的には、ＤＳＣは、溶液中のタンパク質の過剰熱容量とタンパク質を含まない対照溶液の過剰熱容量を温度変化に対応させて測定し、その間、構造のアンフォールディング遷移が、吸熱ピークとして観察される。この転移の中間点の温度が、融解温度（Ｔｍ）として定義される。この試験では、熱安定性は、ＭｉｃｒｏＣａｌＶＰ－ＤＳＣキャピラリーセル微量熱量計を使用したＤＳＣによって測定した。ＤＳＣおよびその結果の分析は、例えば、Ｄｕｒｏｗｏｊｕ ｅｔ ａｌ．（２０１７），Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｓｃａｎｎｉｎｇ ｃａｌｏｒｉｅｔｒｙ－ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ａｓｓｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｈｅｒｍａｌ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｔｉｇｅｎ，Ｊ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｅｄ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ １２１：ｅ５５２６２（ｄｏｉ：１０．３７９２／５５２６２で入手可能）に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。

【0218】

図１５に示す例示的な結果のサーモグラムは、ＰＳＢ２０５のＧＭＰロットが３つの熱転移を呈したことを示している。ＰＳＢ２０５の毒性ロットおよびＧＭＰロットの両方で、同様のサーモグラムが示された。非二状態モデル（ｎｏｎ－ｔｗｏ－ｓｔａｔｅ ｍｏｄｅｌ）を各熱スキャンにフィットさせ、３つのＴｍ値（Ｔｍ１、Ｔｍ２、およびＴｍ３）を取得した。具体的には、ＰＳＢ２０５の毒性ロットは、それぞれ６４．６℃、７３．３℃、および７７．９℃のＴｍ１値、Ｔｍ２値、およびＴｍ３値を有する。ＰＳＢ２０５のＧＭＰロットのＴｍ１、Ｔｍ２、およびＴｍ３値は、それぞれ６４．０℃、７３．０℃、および７８．０℃であった。したがって、観察された熱転移は、ロットごとにほとんど変化しなかった。

【0219】

実施例６：ＰＳＢ２０５の構造バリアント
ＰＳＢ２０５がＣＨＯ細胞内で産生されたということは、例えばグリコシル化形態または修飾もしくは欠失アミノ酸を含む形態などの翻訳後修飾形態などの構造バリアントが、調製物ＰＳＢ２０５中に存在することが可能であった。上記のように、ＰＳＢ２０５、すなわちＰＳＢ１０５における抗ｈＣＴＬＡ４抗体のＨＣおよびＬＣは、配列番号１４および１８の核酸配列によってコードされ得る。これらの配列は、それぞれ配列番号１３および１７のアミノ酸配列をコードする。同様に、ＰＳＢ２０５、すなわちＰＳＢ１０３における抗ｈＰＤ１抗体のＨＣおよびＬＣは、配列番号２および６の核酸配列によってコードされ得、これらは、配列番号１および５のアミノ酸配列をコードする。しかし、翻訳後修飾の可能性があるため、これらの抗体がこれらの核酸配列を含むポリヌクレオチドでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞で作製される場合、これらの配列は、ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の構造を正確に定義できない可能性がある。

【0220】

上で説明したとおり、ＰＳＢ２０５中の抗体の非還元無傷質量は、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）によって測定した。具体的には、質量スペクトルは、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を備えた四重極飛行時間型（Ｑ ＴＯＦ ＭＳ）質量分析計に接続されたサイズ排除超高速液体クロマトグラフィー（ＳＥ－ＵＰＬＣ）によって取得された。これは、ＰＳＢ２０５、ならびにクロマトグラフィーによってＰＳＢ２０５の調製物から単離されたＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３に対して行われた。ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３のこれらの単離された調製物は、それぞれＰＳＢ１０５－ＳおよびＰＳＢ１０３－Ｓと称した。生データは、スペクトルデコンボリューションソフトウェアで分析した。以下で説明するように、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方のＨＣ上のＮ末端グルタミンは、ＰＳＢ２０５に存在するほとんどの種でピログルタミン酸に変換でき（例えば、Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅ ｉｎ ＰｕｂＣｈｅｍ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｓｕｍｍａｒｙ（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｃｈｅｍ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｏｍｐｏｕｎｄ／Ｐｙｒｏｇｌｕｔａｍａｔｅで入手可能）を参照されたい）、両方のＨＣ中のＣ末端リジンは、ＰＳＢ２０５に存在するほとんどの種で欠失され得る。ＰＳＢ２０５中で最も豊富な２つの抗体種のサイズ、すなわち１４７，６０９．８ダルトンおよび１４９，３１９．７ダルトンは、それぞれＰＳＢ１０５種とＰＳＢ１０３種と一致しており、かつ各ＨＣ／ＨＣ対上に直前に言及した２つの修飾、およびＧ０Ｆ／Ｇ０Ｆグリコシル化を有し、おそらく各ＨＣ上のＮ２９７のよく知られたグリコシル化部位に付着している（例えば、Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ，．上記および図１３の簡単な説明）を有する。これは、Ｅｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（前出）に従って番号付けされた位置であり、それぞれ配列番号１および１３の２９６位および２９８位に対応する。１４７，７６９．７ダルトンおよび１４９，４７５．０ダルトンで検出された２番目に顕著な２種は、ＨＣ／ＨＣ対上に直前に言及した２つの修飾およびＧ０Ｆ／Ｇ１Ｆ（同上）グリコソイル化を有するＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３種と一致しており、これもおそらくＮ２９７に付着している。したがって、ＰＳＢ２０５には、特定のグリコシル化抗体種が含まれている。

【0221】

上で述べたように、ＰＳＢ２０５中の抗体の一次アミノ酸配列は、検出された抗体種中で修飾されていることが判明した。これは、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）トリプシンペプチドマッピングによって確認された。例えば、Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（２０１５），Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｂｉｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ＡＡＰＳ Ｊｏｕｒｎａｌ １７（１）：１７ｐａｇｅｓ（ＤＯＩ：１０．１２０８／ｓ１２２４８－０１４－９６８５－５で入手可能である）を参照されたい。これは、参照により本明細書に組み込まれる。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳは、ＥＳＩを備えたＱ ＴＯＦ ＭＳに接続したＵＶ２１５ｎｍ検出を備えた逆相超高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＵＰＬＣ）を使用して実施した。

【0222】

ＰＳＢ２０５には、ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の両方が含まれるため、個々の精製抗体ＰＳＢ１０５－ＳおよびＰＳＢ１０３－Ｓのトリプシンペプチドマップを最初にＰＳＢ２０５のトリプシンペプチドマップと比較して、ＰＳＢ２０５マップ内のどのトリプシンペプチドがどの抗体に由来するかを決定した。ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の予測される個々のペプチドのほとんどは、それぞれＰＳＢ１０５－ＳおよびＰＳＢ１０３－Ｓのトリプシンペプチドマップで検出され、ＰＳＢ２０５のペプチドマップでも検出された。４アミノ酸以下のいくつかの短いペプチドが検出されなかったが、これは、この方法の限界によるものであった。

【0223】

しかし、一部のペプチドは、理論的に予測されたサイズと一致しなかった。ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３は両方とも、これらのＨＣをコードするＤＮＡ配列に基づいて、ＨＣ内にＮ末端グルタミン残基を有すると予測される。ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の両方のＮ末端トリプシンペプチド（単離された形態、およびＰＳＢ２０５中の混合物の一部の場合）は、Ｎ末端グルタミンがピログルタミン酸に変換された場合のこれらのペプチドの理論的サイズと一致するサイズを有していた。同様に、ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の両方のＨＣのＣ末端アミノ酸は、これらのＨＣをコードするＤＮＡ配列に基づいてリジンであると予測される。しかし、ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ１０３の両方のＣ末端ペプチドのサイズは、Ｃ末端リジンを除くこれらのペプチドの理論的に決定されたサイズと一致していた。したがって、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５は両方とも、Ｎ末端グルタミンの修飾、およびＣ末端リジンの欠失を有する。

【0224】

さらに、アスパラギン（Ｎ）残基の若干の脱アミド化が、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の両方の特定のトリプシンペプチド中で観察された。この脱アミド化は、上記のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法を使用して、トリプシンペプチドのサイズの変化によって検出された。パーセンテージは、脱アミド化トリプシンペプチドのピーク面積を、脱アミド化ペプチドのピーク面積と、同じ脱アミド化されていないペプチドのピーク面積との合計で割ることによって求めた。これらの結果を表８にまとめる。

【0225】

【表9】

【0226】

^ａこれは、図１４のパネルＡに質量データが示されているのと同じ毒性ロットである。

【0227】

^ｂこれは、図１４のパネルＢに質量データが示されているのと同じＧＭＰロットである。

【0228】

^ｃＰＳＢ１０３とＰＳＢ１０５との間で共有されている配列。

【0229】

これらのデータは、脱アミド化パーセントがＰＳＢ２０５の２つのロットで本質的に同じであることを示している。一部のアスパルギン残基における比較的高レベルの脱アミド化は、トリプシン消化条件、すなわち、ｐＨ８、３７℃で一晩という、脱アミド化を誘導可能な条件によって説明され得る。

【0230】

実施例７：ＰＳＢ１０３、ＰＳＢ１０５、およびＰＳＢ２０５のそれらの抗原への結合動力学
ヒトＰＤ１およびカニクイザルＰＤ１（ｈＰＤ１およびｃＰＤ１）の細胞外ドメインへのＰＳＢ１０３の結合、およびｈＰＤ１の細胞外ドメインへのＰＳＢ２０５の結合の動力学は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用し、ＣＭ５センサーチップを備えたＢｉａｃｏｒｅ３０００光学バイオセンサーによって、製造業者の一般的プロトコルに従って測定して判定した。

【0231】

最初にセンサーチップを機器上に置き、一晩以上平衡化させた。ランニング緩衝液（０．０１Ｍ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４，０．１５Ｍ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．００５％ｖ／ｖ界面活性剤Ｐ２０（ＨＢＳ－ＥＰ，ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（現Ｃｙｔｉｖａ）カタログ番号ＢＲ１００１８８））を濾過し、システムに配置する前に脱気させた。ランニング緩衝液が接続されたら、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を３回プライミングし、実験を行う前に「正規化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）」システム手順を実施して、システムの光学系を校正した。すべての測定は、２５℃で行った。

【0232】

最初に、アミンカップルキット（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＢＲ１０００５０）を使用して約８０００共鳴単位（ＲＵ）のヤギ抗ヒト抗体捕捉抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ，カタログ番号１０９－００５－０９８）を、ＣＭ５チップ（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓカタログ番号ＢＲ１００３９９）の２つのフローセルのそれぞれに固定した。カニクイザルＰＤ１のＰＳＢ１０３リガンドへの結合を評価するために、ＣＭ５チップの１つのフローセルは、約１００～２００ＲＵのＰＳＢ１０３を捕捉するのに使用し、他方のフローセルは、実験の参照チップとして機能した。ｃＰＤ１－ｈｉｓ分析物（Ｃ末端にヒスチジンタグを有するｃＰＤ１のアミノ酸１～１６７；Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、カタログ番号９０３１１－Ｃ０８Ｈ）を、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充したランニング緩衝液で、濃度１．２、３．７、１１．１、３３．３、１００、および３００ｎＭまで希釈した。これらの希釈液を、捕捉されたＰＳＢ１０３を含む試験フローセルおよび参照フローセルに流速５０μＬ／分で注入した。複合体をそれぞれ３００秒間会合させ、１５００秒間解離させた。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５を３０秒間注入して再生した。各分析物サンプルと緩衝液ブランクの二重注入を、参照フローセルおよびリガンド捕捉フローセル上に流した。

【0233】

Ｓｃｒｕｂｂｅｒ２ソフトウェアバージョン２．０ｃ（ＢｉｏＬｏｇｉｃ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して、ｃＰＤ１－ｈｉｓ分析物を使用して生成されたデータを位置合わせし、二重参照した。解離定数（ｋ_ｄ）は、解離相データから決定した。この解離相係数は、一次結合モデルを使用して会合相データのグローバルフィットにおける固定パラメータとして適用され、結合速度係数（ｋ_ａ）を決定した。

【0234】

ヒスチジンタグに融合したヒトＰＤ１（ｈＰＤ１－ｈｉｓ）の細胞外ドメインを含むＰＤ１分析物への結合を評価するために、上記のヤギ抗ヒト抗体捕捉抗体の約８０００共鳴単位（ＲＵ）を、上記に記載のとおり、ＣＭ５チップの３つのフローセルのそれぞれに固定した。次に、約３５０ＲＵのＰＳＢ１０３または６００ＲＵのＰＳＢ２０５を、ヤギ抗ヒト捕捉抗体でコーティングされた２つの異なるフローセル上で捕捉した。第３のフローセルは、参照フローセルとして機能した。ｈＰＤ１－ｈｉｓリガンドを、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加したランニング緩衝液で濃度１２、２５、５０、１００、２００、および３００ｎＭに希釈した。これらの希釈液を流速３０μＬ／分で３つのフローセルに注入した。複合体をそれぞれ１２０秒間会合させ、６００秒間解離させた。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５を、２回２０秒間注入して再生した。各分析物サンプルと緩衝液ブランクの二重注入を、参照フローセルおよびリガンド捕捉フローセル上に流した。

【0235】

これらのデータは、手動で調整し、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎバージョン４．１．１ソフトウェア（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して二重参照させた。ソフトウェア内のグローバルデータ分析オプションを使用して、データを単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。ｃＰＤ１－ｈｉｓおよびｈＰＤ１－ｈｉｓの両方のデータを以下の表９に示す。

【0236】

【表10】

【0237】

これらのデータは、ＰＳＢ１０３が同等の高い親和性で単量体抗原ｃＰＤ１－ｈｉｓおよびｈＰＤ１－ｈｉｓに結合すること、およびＰＳＢ１０３およびＰＳＢ２０５が、ｈＰＤ１－ｈｉｓに対してほぼ同じ結合動態で結合することを示している。

【0238】

同様の一連の実験において、ＰＳＢ１０５のヒトＣＴＬＡ４（ｈＣＴＬＡ４）およびカニクイザルＣＴＬＡ４（ｃＣＴＬＡ４）への結合動力学、およびＰＳＢ２０５のｈＣＴＬＡ４への結合動態を評価した。ＣＭ５センサーチップをＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器に置き、一晩以上平衡化させた。ランニング緩衝液は、システムに置く前に濾過し、脱気した。ランニング緩衝液が接続されたら、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００を３回プライミングし、実験を実行する前に「正規化（Ｎｏｒｍａｌｉｚｅ）」システム手順を実施して、システムの光学系を校正した。すべての測定は、２５℃で行った。約８０００共鳴単位（ＲＵ）のヤギ抗ヒト抗体捕捉抗体を、各リガンドのフローセルとリガンドのない参照フローセルなどのＣＭ５チップの各フローセルに固定した。

【0239】

約５５０ＲＵのＰＳＢ１０５が、フローセル上に捕捉された。ｈＣＴＬＡ４－ｈｉｓリガンド（ヒスチジンタグに融合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン；ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＣＴ４－Ｈ５２２９－１００μｇ）を、０．１％ＢＳＡを含むランニング緩衝液で、０．６４、１．２５、２．５、５、１０、および２０ｎＭに希釈し、流速３０μＬ／分でフローセルに注入した。ｃＣＴＬＡ４－ｈｉｓリガンド（ヒスチジンタグに融合したカニクイザルＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン；ＡｃｒｏＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓカタログ番号ＣＴ４－Ｃ５２２７－２００μｇ）を、濃度３．７５、７．５、１５、３０、および６０ｎＭ、流速３０μＬ／分で、フローセルに注入した。複合体をそれぞれ１８０秒間会合させ、３００秒間解離させた。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５を流速３０μＬ／分で４０秒間注入して再生した。各分析物サンプルおよび緩衝液ブランクを二重に注入し、参照表面およびリガンド捕捉表面上に流した。

【0240】

別の分析物、ｈＣＴＬＡ４－ＧＳＴ－ｈｉｓ（グルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグおよびヒスチジンタグが融合したヒトＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン、社内で作製）のＰＳＢ１０５およびＰＳＢ２０５への結合に関する情報を収集する最初のステップとして、ＰＳＢ１０５の約３００ＲＵおよびＰＳＢ２０５の約４８０ＲＵを、ＣＭ５チップの２つの異なるフローセルに捕捉させた。別のフローセルには、捕捉されたリガンドは有さず、参照フローセルとして使用した。分析物は、濃度１２．５、２５、５０、１００、および２００ｎＭで、流速３０μＬ／分で、フローセルに注入させた。複合体をそれぞれ１２０秒間会合させ、６００秒間解離させた。表面は、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ１．５を１２秒間２回注入して再生した。各分析物サンプルおよび緩衝液ブランクの二重注入を、参照フローセルおよびリガンド捕捉表面上に流した。

【0241】

ＣＴＬＡ４分析物を使用した上記の実験からのデータは、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアバージョン４．１．１（Ｇｅｎｅｒａｌ Ｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｃｏｍｐａｎｙ）を使用して評価し、データを手動で位置合わせし、二重参照した。ソフトウェア内のグローバルデータ分析オプションを使用して、データを単純な１：１ラングミュア相互作用モデルに適合させた。結果を以下の表１０に示す。

【0242】

【表11】

【0243】

これらのデータは、ＰＳＢ１０５が単量体ヒトおよびカニクイザルＣＴＬＡ４抗原の両方に高親和性で結合することを示している。さらに、ＰＳＢ１０５とＰＳＢ２０５は、ｈＣＴＬＡ４－ＧＳＴ－ｈｉｓ分析物の結合動態が類似している。表９のデータと併せて考えると、これらのデータは、ＰＳＢ２０５中の２つの抗体のそれぞれが、これら２つの抗体のいずれか単独のものと本質的に同じ動態でその抗原に結合することを示す。

【0244】

実施例８：サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）リコール応答アッセイにおけるＰＳＢ２０５の活性。
以下の実験では、ＣＭＶリコール応答アッセイで検出されたＣＤ８^＋Ｔ細胞の数に対するＰＳＢ２０５の効果を、ＰＳＢ１０３、ＰＳＢ１０５、またはＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体と比較して試験した。

【0245】

ＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体調製物は、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ（カタログ番号０１５１ｋ－１４）から入手し、ＰＳＢ１０３、ＰＳＢ１０５、およびＰＳＢ２０５を本明細書に記載のとおり作製した。ＣＭＶ^＋ドナーからのヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｂｅｎｔｅｃｈ Ｂｉｏ（現在は、Ｂｌｏｏｄｗｏｒｋｓ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）から購入した。

【0246】

ＰＢＭＣを解凍し、マイクロタイタープレートの１６ウェルに播種し、各ウェルには、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充した容量２００μＬのＲｏｓｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ）培地中に３．８ｘ１０^６個の細胞を入れた。これらの細胞を、５μｇ／ｍＬのＩｇＧ１アイソタイプ対照、５μｇ／ｍＬのＰＳＢ１０３、２．５μｇ／ｍＬのＰＳＢ１０５、または７．５μｇ／ｍＬのＰＳＢ２０５のいずれかの存在下、３μｇ／ｍＬの濃度で、ＣＭＶに感染した細胞のライセート（ＡｓｔａｒｔｅＢｉｏｌｏｇｉｃｓ（現Ｃｅｌｌｅｒｏ）から購入、カタログ番号１００４、ロット番号３３４１ＤＥ１６）で刺激した。細胞を刺激開始７日後に収集し、室温で１５分間、２μＬのデキストラマー（ＨＬＡ－Ａ＊０２０１［ＮＬＶＰＭＶＡＴＶ］－ＰＥ、Ｉｍｍｕｄｅｘから購入）、ＣＭＶ抗原ｐｐ６５を特異的に認識するＣＤ８^＋Ｔ細胞に結合することが予想されるフィコエリトリン（ＰＥ）標識デキストラン／ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣＩ）／ペプチド複合体で染色した。次に、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅから購入したフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）にコンジュゲートした抗ＣＤ８抗体２μＬを加え、染色を室温で３０分間続けた。次に、細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３回洗浄し、最終細胞ペレットを、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補充した４００μＬのＰＢＳに再懸濁させた。細胞を分析して、ＦＡＣｓｃａｌｉｂｕｒ（商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して、抗ＣＤ８抗体および／またはデキストラマーによって結合された細胞の数を決定した。

【0247】

これらのデータから生成したグラフを図１６に示す。データは、ＣＭＶライセート（抗原）およびＰＳＢ２０５の存在下で刺激されたＰＢＭＣが、ＣＭＶライセートおよびＰＳＢ１０５またはＰＳＢ１０３単独のいずれかの存在下で刺激されたＰＢＭＣよりも、デキストラマーに結合するＣＤ８^＋細胞、すなわちＣＭＶ抗原を認識するＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞）をより多く拡大させることを示している。（１）ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞の絶対数および（２）ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞である全細胞の割合の定量では、ＣＭＶライセートとＰＳＢ２０５の存在下で刺激されたＰＢＭＣが、ＣＭＶライセートとＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５のいずれか単独で刺激した細胞より多いＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞を有することが示されている。図１７。これらのデータでは、ＰＳＢ１０５は、ＣＤ８^＋ＣＭＶ^＋細胞の数にほとんどまたはまったく影響を有しない一方で、ＰＳＢ１０３では、ある程度のプラスの効果を有し、ＰＳＢ２０５では、ＰＳＢ１０３より明らかに大きいプラスの効果を有することを示している。したがって、ＰＳＢ２０５は、ＣＭＶ抗原特異的ＣＤ８^＋Ｔ細胞の拡大に対して、（ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５単独と比較して）相乗効果を示す。

【0248】

実施例９：ＨＣＣ８２７異種移植片腫瘍モデル系におけるＰＳＢ２０５、ＰＳＢ１０３、およびＰＳＢ１０５の有効性。
この試験の目的は、樹立されたヒト肺腺癌細胞株由来の腫瘍異種移植片に対するＰＳＢ２０５とその構成成分である抗体ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の有効性を評価することであった。異種移植片を作製するために使用したヒト腺癌細胞株は、ＨＣＣ８２７であった。例えば、ＡＴＣＣカタログ番号ＣＲＬ－２８６８を参照されたい。

【0249】

より詳細には、２０匹のマウスのそれぞれの右脇腹に、５ｘ１０^６個のＨＣＣ８２７細胞を含む０．１ｍＬのＰＢＳを皮下接種した。この接種日を０日目と称する。それ以降の試験日には、順番に上向きの番号を付ける。一方、ヒトＰＢＭＣは、標準手順を使用して１名の健康なヒトドナーの末梢血から単離され、移植のために１ｘ１０^８細胞／ｍＬで再懸濁させた。腫瘍サイズ中央値が６０～８０ｍｍ^３に達したとき（腫瘍接種後約５日）、１ｘ１０^７個のＰＢＭＣを各マウスに静脈内移植した。その後、すべてのマウスの体重を測定し、ノギスを使用して腫瘍サイズを測定した。その後、マウスを抗体治療のために４つの群に分配した。

【0250】

４つの異なる抗体治療（１群あたり５匹のマウス）のいずれかによる治療を、ＰＢＭＣ移植の１時間後に開始した。この治療は、週２回（ＢＩＷ）抗体治療コースの最初の投与であり、これを３週間継続した。抗体は、腹腔内注射により投与した。腫瘍は、ノギスを使用して、週２回測定した。プロトコルの詳細を以下の表１１に示す。

【0251】

【表12】

【0252】

結果を図１８に示す。二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を使用して、時間および治療を対応させて、腫瘍阻害を分析した。これらのデータは、ＰＳＢ２０５群のマウスは、ヒトＩｇＧ１群のマウスと比較して、統計的に有意な腫瘍縮小を示したが、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５群のマウスは、そのような縮小を示さなかった。したがって、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５の組み合わせ、すなわちＰＳＢ２０５は、これらの抗体のいずれか単独よりも有効であった。

【0253】

実施例１０：ヒトにおけるＰＳＢ２０５の投与量および安全性の予備評価。
ヒト患者におけるＰＳＢ２０５の安全性を確認するための非盲検の用量漸増試験を、上咽頭癌（ＮＰＣ）および肺癌（ＬＣ）患者の治療センターで実施した。用量漸増は、ＰＳＢ２０５の用量０．３～１０ｍｇ／ｋｇを３週間ごと（ｑ３ｗ）に静脈内投与する加速３＋３設計に基づくものであった。拡大段階は、選択された用量コホートで実施した。本試験の主な目的は、進行性悪性腫瘍患者におけるＰＳＢ２０５の最大耐用量（ＭＴＤ）および推奨第２相用量（ＲＰ２Ｄ）を決定することにより、ＰＳＢ２０５の安全性および忍容性を定義することであった。

【0254】

４４名のＮＰＣおよびＬＣ患者が登録された。各患者の１つ以上の腫瘍（最大５個の腫瘍）の直径（複数可）を、ベースライン時とその後７、１３、２２、および３１週目に、コンピューター断層撮影スキャン（ＣＴスキャン）を使用して測定した。複数の腫瘍が測定された場合、測定された腫瘍の直径の合計を決定した。この合計は、標的病変の合計と称する。患者はいかなる時でも自由に試験への参加を中止できた。以下の表１２は、反応評価可能な対象の登録状況および予備有効性データをまとめたものである。「反応評価可能」であるためには、ＰＳＢ２０５による治療後に、腫瘍（複数可）が、縮小したか、成長したか、または変化がないかを判断するために、患者は、少なくとも７週目のＣＴスキャンを受けている必要があった。

【0255】

【表13】

^１用量表示後に「－ＰＫ」が続く場合は、安全性および有効性の指標のモニタリングに加えて、薬物動態測定が行われた患者を示す。
^２「ＬＣ」は、肺癌を表す。
^３「ＮＰＣ」は、上咽頭癌を表す。
^４空白のボックスは、以前に抗ｈＰＤ１標的治療を受けていないことを示す。２つの治療（例えば「カムレリズマブ／プラセボ」）のいずれかである以前の治療を受けた記載されている患者は、薬物を受けたかプラセボを受けたか不明である盲検臨床試験に参加していた。
^５「サイクル番号」は、患者にＰＳＢ２０５が投与された回数を示す。
^６「Ｄｉｓｃｔｄ」は、中止を表す。
^７これらの対象は、用量制限毒性（ＤＬＴ）のため試験治療を中止した。
^８この対象は、グレード４の注入反応のため試験治療を中止した。
^９奏効は、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（バージョン１．１）に準拠して、本明細書で上記に定義されているように、進行性疾患（ＰＤ）、部分奏効（ＰＲ）、安定疾患（ＳＤ）、または完全奏効（ＣＲ）として示す。

【0256】

この臨床試験の結果によって示唆されたＰＳＢ２０５の観察された有効性を強調するために、入手可能な予備データを表１３にまとめる。これは、病勢コントロール率（ＤＣＲ、すなわち、部分奏効または完全奏効（ＰＲまたはＣＲ）または安定疾患（ＳＤ）を呈する評価可能対象の割合）、および客観的奏効率（ＯＲＲ、すなわち、治療後にＰＲまたはＣＲを示した患者の割合）を示す。

【0257】

【表14】

【0258】

１～１０ｍｇ／ｋｇの用量での集合データは、ＰＳＢ２０５のこれらの用量がＬＣおよびＮＰＣに対する有効な治療用量であり得ることを示唆している。観察された反応の程度を説明するために、図１９は、３２名の評価可能な対象のそれぞれについて、ベースラインからの腫瘍直径の変化を、それぞれが受けた用量と共に示す。これらのデータは、１～１０ｍｇ／ｋｇの用量のＰＳＢ２０５を投与された一部の患者によって実質的な反応が達成されたことを示している。

【0259】

表１４は、１または３ｍｇ／ｋｇのＰＳＢ２０５を投与された患者が経験した有害事象（ＡＥ）に関するデータを提供する。グレード１、２、３、および４のＡＥは、上記のとおり定義されており、有害事象共通用語基準（ＣＴＣＡＥ）バージョン５．０２０１０（／／ｃｔｅｐ．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ／ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ＿ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ／ｄｏｃｓ／ＣＴＣＡＥ＿ｖ５＿Ｑｕｉｃｋ＿Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ＿８．５ｘ１１．ｐｄｆで入手可能）で定義されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。０．３ｍｇ／ｋｇで治療された患者では、ＡＥは、観察されなかった。

【0260】

【表15】

【0261】

表１５は、５ｍｇ／ｋｇまたは１０ｍｇ／ｋｇのＰＳＢ２０５を投与された患者で観察されたＡＥに関するデータを示す。

【0262】

【表16】

【0263】

表１６には、表１４および１５のデータをまとめる。

【0264】

【表17】

【0265】

表１４～１６のデータは、１ｍｇ／ｋｇまたは３ｍｇ／ｋｇの用量群では、グレード３または４のＡＥが観察されなかったことを示している。５ｍｇ／ｋｇ群では、２２名中１名（４．５％）のみの患者が、グレード３または４の事象を経験した。１０ｍｇ／ｋｇでは、患者６名中３名（５０％）が、グレード３または４の事象を経験した。最も一般的なＡＥには、グレード１の掻痒症、発疹、およびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加（肝臓、心臓、または他の臓器の機能不全を示し得る）が含まれる。

【0266】

実施例１１：ヒトにおけるＰＳＢ２０５の用量および安全性の補足評価。
図２０～３２、表１７～２６およびそれらの凡例などの以下の実施例１１は、上記の内容の様々な態様に関する追加のデータおよび分析を提供し、上記の内容の範囲を限定するものではなく補足することを意図している。

【0267】

ＰＳＢ２０５の設計および生成
組換え抗体は、典型的には、１つの操作された細胞株によって産生され、そこで、分泌され得る前に抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）は、正しく組み立てられる必要がある。２つの抗体を一緒に産生するためには、２つの異なるＨＣおよびＬＣを同じ宿主細胞に導入する必要がある。ＨＣおよびＬＣのランダムなペアリングにより、合計１０個の生成物を生成することができ、そのうちの２個のみが同族鎖ペアリングを有する（図２０Ａ）。特に、同族のＨＣ／ＨＣおよびＨＣ／ＬＣのペアリングが正確に組み立てられるように、ＨＣ／ＨＣおよびＨＣ／ＬＣ界面残基を変更した。これらの独自に設計されたＨＣペアリングキーとＬＣペアリングキーが導入されると、いかなる種も誤ってペアリングされることなく、２つの異なる抗体を一緒に発現させることができる。この抗体工学技術プラットフォームによって生成される生成物には、２つの組換え抗体が一定の割合である混合物が含まれており、これは、ＭａｂＰａｉｒ分子と称する。ＰＳＢ２０５は、２つの主要な免疫チェックポイント調節因子であるＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的として開発されたＭａｂＰａｉｒ製品である。

【0268】

抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ４抗体は、個別に操作され、特性評価した（表２０～２１）。ＰＳＢ１０３と称される抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４は、複数の細胞ベースのアッセイにおいて、ペムブロリズマブと同様の効力を有することが示された（図２４、表２０）。ＰＳＢ１０５と呼ばれる抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１は、イピリムマブと同様の遮断活性を呈した。アルギニン２５５の１つの変異（Ｒ２５５Ｋ）がＦｃ領域に導入され、ＦｃＲｎへの結合が減少し（表２２）、イピリムマブと比較して、抗ＣＴＬＡ－４のｉｎ ｖｉｖｏでのクリアランスが速くなり、抗体半減期が短縮された（表２３）。

【0269】

ＰＳＢ１０３（抗ＰＤ－１ ＩｇＧ４）およびＰＳＢ１０５（抗ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ１）は、ＣＨＯ細胞株において２：１の固定比で一緒に産生させた（図２０Ｂ）。ＰＳＢ２０５中の抗ＰＤ－１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体との相対比は、その成分に対して比色スケールのＰＫシミュレーションを使用して決定した。このシミュレーションでは、ＰＳＢ２０５を３週間間隔で投与したときに、異なるレベルの定常状態での抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体の曝露が得られることが予測される。ＰＳＢ２０５は、１つの製品として製造され、その純度および製品の品質は、一連の分析方法を使用することによって、完全に特性評価した。製品中に、検出可能なミスペアリング種は見られなかった（図２０Ｃ～Ｅ）。

【0270】

ＰＳＢ２０５の前臨床特性評価
ＰＳＢ２０５とその抗ＰＤ－１成分（ＰＳＢ１０３）または抗ＣＴＬＡ４成分（ＰＳＢ１０５）が、ＰＤ－１：ＰＤ－Ｌ１相互作用またはＣＴＬＡ－４：Ｂ７－１／Ｂ７－２相互作用を遮断する能力は、２つの異なるデュアルセルレポーターアッセイを使用して評価した。図２５に示すように、ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ２０５は両方とも、ＮＦＡＴ活性化およびルシフェラーゼシグナルの増加を可能にするＰＤ－Ｌ１：ＰＤ－１相互作用の濃度依存性阻害を媒介した。ＰＳＢ１０５およびＰＳＢ２０５も、レポーターアッセイにおいてＣＴＬＡ４媒介阻害を解除した。

【0271】

樹状細胞は、共刺激分子（Ｂ７－１およびＢ７－２）および共抑制分子（ＰＤ－Ｌ１）を発現し、Ｔ細胞によって発現されるＣＤ２８／ＣＴＬＡ４およびＰＤ－１にそれぞれ係合する。ＰＳＢ２０５が樹状細胞によるＴ細胞刺激にどのような影響を与えるかを調べるために、同種反応性ドナーの単球由来の未成熟樹状細胞を使用して、精製Ｔ細胞を刺激した。図２１Ａに示すように、ＰＳＢ１０３単独およびＰＳＢ２０５の両方が、異なるＤＣ／Ｔ比でＴ細胞によるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）産生を増加させた。抗ＣＴＬＡ－４は、ＩＦＮ－γ産生の増加に寄与しなかった。

【0272】

ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５は、異なるＰＫプロファイルを有するため、ヒトにおけるそれらの比率は、時間の経過とともに変化する。ＰＳＢ２０５の相乗効果の範囲を評価するために、様々な比率で混合した様々な濃度のＰＳＢ１０３およびＰＢＳ１０５の存在下でＳＥＢを使用して、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激した。図２１Ｂおよび図２６に示すように、ＰＳＢ１０３（０．５～２０μｇ／ｍＬの範囲）とＰＳＢ１０５（０．０５～４μｇ／ｍＬの範囲）を異なる比率（５：１～０．２：１の範囲）で組み合わせた場合、Ｔ細胞によるインターロイキン２（ＩＬ－２）の産生が増加し、これは、ＰＢＳ２０５中のＰＳＢ１０３およびＰＢＳ１０５が、治療中にｉｎ ｖｉｖｏにおいて、広範囲の相乗効果を達成できることを示唆している。

【0273】

ＰＳＢ２０５における比率２：１でのＰＳＢ１０３とＰＳＢ１０５との組み合わせが、抗原特異的ＣＤ８Ｔ細胞の刺激において相乗効果を達成できるか否かを調べるために、ＣＭＶ感染細胞からのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ライセートを使用して、血清陽性個体からのＰＢＭＣを刺激した。ｉｍｍｕｄｅｘ ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＮＬＶＰＭＶＡＴＶのデキストラマーを使用して、７日目のＣＭＶのｐｐ６５に特異的なＣＤ８Ｔ細胞の拡大を列挙した。図２１Ｃおよび図２７に示すとおり、ＰＳＢ１０３（抗ＰＤ１）またはＰＳＢ１０５（抗ＣＴＬＡ４）のいずれか単独で治療した群よりも、ＰＳＢ２０５治療群からより高いパーセンテージおよび絶対数のＣＭＶ＋ＣＤ８Ｔ細胞が回収された。

【0274】

ＰＳＢ２０５は、ＰＢＭＣ由来のヒト免疫細胞を含むＮＯＤ－Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ（ＮＣＧ）マウスの腫瘍異種移植モデルで評価した。図２１Ｄに示すように、２：１の比率でのＰＳＢ１０３とＰＳＢ１０５との組み合わせ（ＰＳＢ２０５）は、ＨＣＣ８２７腫瘍成長の制御に有効であったが、このモデルでは、ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５のいずれか単独では、いかなる効果も示さなかった。腫瘍がＨＣＣ８２７よりも速く成長するＪｅｋｏ－１腫瘍モデルでＰＳＢ２０５をさらに試験した。図２８に示すとおり、ＰＳＢ１０３またはＰＳＢ１０５のいずれか単独は、Ｊｅｋｏ－１腫瘍成長を有意に阻害したが、ＰＳＢ２０５は、ＰＳＢ１０３単独よりも、さらに有効であった。

【0275】

ＰＳＢ１０３およびＰＳＢ１０５のＰＫプロファイルは、カニクイザルにおける単回投与探索実験で個別に評価した。全身曝露は、１回のｉ．ｖ．注射後にすべての動物で達成された。平均最終消失半減期（ｔ_１／２）は、ＰＳＢ１０３について２９７時間であると決定した。（表２３）ＰＳＢ１０５は、イピリムマブと比較して、クリアランス率の上昇および全身曝露の減少を示した。ＰＳＢ１０５およびイピリムマブのｔ_１／２は、それぞれ１０９時間および３９７時間であった（図２１Ｅ）。これは、少なくとも部分的には、ＰＳＢ１０５におけるＦｃＲｎ親和性の低下に起因する。

【0276】

ＰＳＢ２０５は、複数回投与のＧＬＰ毒性実験で評価した。カニクイザルに、それぞれ３、１５、または６０ｍｇ／ｋｇで、２週間ごとに４週間（１、１５、および２９日目）にわたってＰＳＢ２０５を注射したところ、良好な忍容性で、ＰＳＢ２０５に関連する肉眼で確認される有害事象は発生しなかった。６０ｍｇ／ｋｇでは、数頭の動物で軟便が観察されたが、病理学的変化は確認されなかった。ＰＳＢ２０５治療により、Ｋｉ６７＋Ｔ細胞およびＩＣＯＳ＋ＣＤ４Ｔ細胞が増加した。これは、ＣＴＬＡ－４遮断の固有のバイオマーカーである。ＩＣＯＳ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の増加は、ＰＳＢ２０５の用量に直接関係していた（図２９）。

【0277】

ＰＳＢ２０５（ＱＬ１７０６）の第１相臨床試験
ベースライン特性
２０２０年３月３１日から１２月２０日までの固形腫瘍患者計４７名が登録され、それぞれ１６名が、用量漸増コホート、３１名の患者が用量拡大コホートに含まれた。患者のベースライン臨床特性を表１７に示す。年齢中央値は、５１歳（２７歳から７３歳の範囲）で、３８名（８０．９％）が男性であった。１７名（３６．２％）の患者は、ＥＣＯＧパフォーマンスステータスが０であった。患者のうち、２５名（５３．２％）が鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、２０名（４２．６％）がＮＳＣＬＣ、１名（２．１％）が甲状腺癌、１名（２．１％）が臍管の粘液性腺癌を有した。４６名（９７．９％）の患者が、ステージＩＶで、１名のみがステージＩＩＩであった。２８名（５９．６％）の患者は、免疫療法歴を有さず、１８名（３８．３％）は、ＩＣＩ治療を受け、４名（８．５％）は、他の免疫療法を受けた。以前の治療ラインの中央値は、２．０（０～５の範囲）であった。

【0278】

薬物動態分析
ＰＳＢ２０５の抗ＰＤ－１成分および抗ＣＴＬＡ－４成分のＰＫプロファイルは、各成分に特異的な２つの異なる抗イディオタイプ抗体を使用することによって、個別に特性評価した。分析は、治療のサイクル１（Ｎ＝３６）およびサイクル６（Ｎ＝９）から収集されたデータを使用して実施した。

【0279】

図２２Ａ～Ｂは、０．３～１０ｍｇ／ｋｇのＰＳＢ２０５を３週間ごと（Ｑ３Ｗ）に投与後のａＰＤ－１およびａＣＴＬＡ－４の平均濃度－時間プロファイルを示す。ａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１の両方の曝露は、単回投与および複数回投与後に用量が増加するにつれて増加した。図３０Ａ～Ｄに示すように、異なる用量間でのａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１の個々の用量正規化Ｃ_ｍａｘおよびＡＵＣ_０－ｔの分布は類似しており、これは、ａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１の両方が、０．３～１０ｍｇ／ｋｇの範囲の単回用量で、線形ＰＫ特性を呈し得ることを示している。利用可能な複数回投与データを有する患者の数が制限されていることを考慮すると、複数回投与後のａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１のＰＫ特性の直線性は、この時点では、確立されていない。ａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１のＰＫパラメータを表２４にまとめる。

【0280】

ａＣＴＬＡ－４のクリアランス（ＣＬ）は、単回投与および複数回投与後も同様のままであった（すなわち、それぞれ０．０１５９～０．０２５２Ｌ／ｈおよび０．０１３４～０．０２２５Ｌ／ｈ）。対応する平均ｔ_１／２は、それぞれ１０４～１２１時間（４～５日）および１１１～１９０時間（５～８日）であった。複数回投与後、ａＣＴＬＡ－４の有意な蓄積は観察されなかった。

【0281】

ａＰＤ－１の平均ＣＬは、単回投与後（ｎ＝１０）０．０１２２～０．０１５９Ｌ／ｈであったが、複数回投与後は、０．００６７６～０．００７２０Ｌ／ｈに減少した（ｎ＝５、サイクル６）。平均ｔ_１／２は、単回投与後１４７～２２７時間（６～９日）（ｎ＝１０）であったが、サンプリング時点が限られているため、複数回投与後には正確に推定できなかった。それにもかかわらず、定常状態でははるかに長いｔ_１／２が予想される。表２４に示すとおり、ＰＳＢ２０５のＱ３Ｗ反復投与後には、ａＰＤ－１のある程度の蓄積が存在し得る。平均Ｒ_ａｃ＿Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}（トラフ濃度［Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}］によって評価された蓄積比）、Ｒ_ａｃ＿Ｃ_ｍａｘ（Ｃ_ｍａｘによって評価された蓄積比）、およびＲ_ａｃ＿ＡＵＣ（ＡＵＣ_{０－ｔａｕ}によって評価された蓄積比）は、それぞれ、１．７９～２．４０（ｎ＝８）、１．２４～１．５９（ｎ＝９）、および１．５２～１．７７（ｎ＝４）であった。

【0282】

薬力学
ＰＳＢ２０５によるＰＤ－１標的範囲のレベルは、循環ＣＤ３Ｔ細胞に対する受容体占有アッセイによって評価した。高いパーセンテージのＰＤ－１受容体占有率の持続が、治療サイクル全体を通してすべての投与群で観察された（図２２Ｃ）。受容体占有率の用量依存的な差は観察されなかった。１０ｍｇ／ｋｇを摂取した一部の患者で示された受容体占有率の変動は、サンプルサイズが小さいことおよび個人差が原因であると考えられる。ＰＳＢ２０５の投与は、ＣＤ４細胞およびＣＤ８細胞の両方の増殖の増強と関連していた。図２２Ｄに示すとおり、ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞集団におけるＫＩ６７＋細胞の増加は、低用量群よりも５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ群でより顕著であった。さらに、ＣＤ４ Ｔ細胞では、ＣＴＬＡ－４遮断の代用としてよく知られているＩＣＯＳの用量依存的な上方制御が存在した。ベースラインを超えるＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の最も高い増加は、５ｍｇ／ｋｇ群および１０ｍｇ／ｋｇ群で観察された（図２２Ｅ、図３１）。ＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の増加は、５ｍｇ／ｋｇおよび１０ｍｇ／ｋｇ群では少なくとも２週間（３３６時間）持続したが、１ｍｇ／ｋｇおよび３ｍｇ／ｋｇ群では持続しなかった（図３２）。Ｋｉ６７＋Ｔ細胞およびＩＣＯＳ＋ＣＤ４Ｔ細胞の一貫した持続的な増加は、５ｍｇ／ｋｇを超える用量で、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の機能的遮断が達成できることを示唆するものである。

【0283】

安全性データ
患者は、中央値で２サイクル（１～１２）のＰＳＢ２０５を３週間ごとに投与された。２０２０年１２月２０日の時点で、追跡期間の中央値は、５４日（１６日、１２８日）で、患者４７名中２５名（５３．２％）がまだ治療を受けていた。治療を中止した２２名の患者のうち、最も一般的な理由は、疾患の進行（ｎ＝１５、６８．２％）であり、次いでＡＥ（ｎ＝５、２２．７％）、試験からの離脱（ｎ＝２、９．１％）であった。

【0284】

治療関連有害事象（ＴＲＡＥ）は、患者４７名中３１名（６６．０％）に発生し、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、および１０ｍｇ／ｋｇの群において、その頻度は、それぞれ、８３．３％（５／６）、３３．３％（２／６）、６７．８％（１９／２８）および８３．３％（５／６）であった（表１８）。ほとんどの患者が、特に５ｍｇ／ｋｇを投与された患者（５０％、１４／２８）において、グレード１のＴＲＡＥを経験した（３８．３％、１８／４７）。５ｍｇ／ｋｇを投与された２名の患者および１０ｍｇ／ｋｇを投与された３名の患者は、グレード３以上のＴＲＡＥを経験した。全体として、最も一般的な（５％以上）ＴＲＡＥは、掻痒症（２３．４％、１１／４７）、発疹（２１．３％、１０／４７）、ＡＳＴ増加（１４．９％、７／４７）、疲労（１２．８％、６／４７）、甲状腺機能亢進症（１０．６％、５／４７）、甲状腺機能低下症（１０．６％、５／４７）、ＡＬＴ増加（８．５％、４／４７）、発熱（８．５％、４／４７）、注入関連反応（６．４％、３／４７）であった。

【0285】

あらゆるグレードのｉｒＡＥが、４７名の患者中１６名（３４．０％）に発生した。最も一般的な（５％以上）ｉｒＡＥは、掻痒症（２３．４％、１１／４７）、発疹（２１．３％、１０／４７）、甲状腺機能亢進症（１０．６％、５／４７）、および甲状腺機能低下症（１０．６％、５／４７）であった（表２５）。２名（４．３％）の患者（１名は、５ｍｇ／ｋｇ群、他の１名は、１０ｍｇ／ｋｇ群）は、グレード３以上のｉｒＡＥを有した。

【0286】

原因に関係なく重篤な有害事象（ＳＡＥ）は、患者４７名中７名（１４．９％）で発生し、６名は薬物関連と考えられ、５名の患者で発生し、そのうち１名は、５ｍｇ／ｋｇ、４名は、１０ｍｇ／ｋｇを投与された。

【0287】

１０ｍｇ／ｋｇ群の２名の患者は、用量制限毒性（ＤＬＴ）を経験し、その内の１名は、グレード１の歯肉出血を合併したグレード３の血小板数減少、他の１名は、グレード４の免疫介在性腎炎であった。したがって、最大耐用量（ＭＴＤ）は５ｍｇ／ｋｇＱ３Ｗと決定した。

【0288】

臨床有効性
表１９に示すとおり、有効性分析に利用可能なデータを有する３５名の患者のうち、１０名（２８．６％）が、部分奏効（ＰＲ）を有し、７名（２０．０％）が、安定疾患（ＳＤ）を有し、客観的奏効率（ＯＲＲ）は、２８．６％、病勢コントロール率（ＤＣＲ）は、４８．５％であった。２０名のＮＰＣ患者のうち、７名（３５．０％）がＰＲを達成し、２名（１０．０％）がＳＤを達成し、ＯＲＲは、３５．５％、ＤＣＲは、４５．０％であった。１４名のＮＳＣＬＣ患者のうち、３名（２１．４％）がＰＲを達成し、５名（３５．７％）がＳＤを達成し、ＯＲＲは２１．４％、ＤＣＲは５７．１％であった。すべての患者のベースラインおよび治療期間からの標的病変の最良客観的反応（ＢＯＲ）を図２３Ａおよび２３Ｂに示す。無増悪生存期間（ＰＦＳ）の中央値、奏効期間、および全生存期間（ＯＳ）は、追跡した患者数が少なく、かつ比較的短い追跡期間であったため、評価しなかった。免疫療法歴のない２０名の患者では、ＰＲ率およびＳＤ率は、それぞれ４０．０％（ｎ＝８）および２５．０％（ｎ＝５）であり、ＯＲＲは、４０．０％（ｎ＝８）、ＤＣＲは、６５．０％であった（ｎ＝１３）（表２６）。

【0289】

以前に抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けた患者１０名のうち、２名（２０．０％）がＰＲを達成し、１名（１０．０％）がＳＤを達成し、ＯＲＲは、２０．０％、ＤＣＲは、３０．０％となった（表２６）。図２３Ｃおよび図２３Ｄは、以前の任意の免疫療法を受けなかった患者および以前の抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１療法を受けた患者における腫瘍縮小のベースラインからの変化率を示す。第３選択療法として、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβを標的とする二重特異性抗体を以前投与した最良の腫瘍反応が進行性疾患（ＰＤ）であったステージＩＶ ＮＰＣの５５歳男性患者は、５ｍｇ／ｋｇ群に登録され、７週目にＰＲを達成した。この患者の腫瘍ＣＴスキャンを図２３Ｅに示す。ステージＩＶのＮＳＣＬＣを有する４６歳の男性患者は、最良の腫瘍反応が、以前のニボルマブ療法中（２行目）ＰＲであり、以前の抗４－１ＢＢ抗体療法中（４行目）ＳＤであったため、１０ｍｇ／ｋｇコホートに登録され、１３週目にＰＲを達成した（図２３Ｆ）。

【0290】

ＲＰ２Ｄの判定
忍容性、ＰＫ、および薬力学の総合評価に基づいて、進行固形悪性腫瘍におけるＰＳＢ２０５をさらに調査するため、５ｍｇ／ｋｇＱ３ＷのレジメンをＲＰ２Ｄとして選択した。

【0291】

考察
本発明によれば、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の二重遮断を有する最初のＭａｂＰａｉｒ製品であるＰＳＢ２０５の設計および第１相臨床試験が本明細書に提供される。ＰＳＢ２０５は、他のＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤による治療歴のある患者を含む第１相試験の混合コホートにおいて、抗腫瘍反応を促進することを実証した。臨床試験は、依然として進行中であるが、初期解析では、他のＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の二重遮断薬と比較して、グレード３以上のＴＲＡＥの発生率が低く、全体的な安全性プロファイルが良好であることも示している。予備データは、固形悪性腫瘍の治療における抗腫瘍反応および忍容性の向上による患者転帰の改善におけるＰＳＢ２０５の可能性についてのさらなる調査を裏付けるものである。本試験は、ＭａｂＰａｉｒ分子の最初の臨床試験を表す。ＰＳＢ２０５の開発に使用された戦略は、抗体成分ごとに有効性および毒性の最適なバランスを注意深く維持する必要がある他のプログラムにも適用され得る。

【0292】

ＰＳＢ２０５の２つの抗体成分は、１つの製品として機能するように製造されており、それぞれ、ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４を標的として阻害する。抗体の２つのアームが１：１の比率に固定されている二重特異性抗体とは対照的に、ＰＳＢ２０５などのＭａｂＰａｉｒ製品では、その２つの抗体成分により、異なる標的特異的レベルのＰＫカバレッジおよび抗体エフェクター機能を提供できる。この機能は、ＣＨＯ細胞株中で２つの抗体が一緒に産生される比率と各抗体のＰＫプロファイルを調整することによって、実現可能である。ＰＳＢ２０５の抗ＰＤ－１成分は、ＩｇＧ４であるが、抗ＣＴＬＡ－４成分は、ＩｇＧ１アイソタイプである。抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１のＦｃ媒介エフェクター機構は、腫瘍微小環境における制御性Ｔ細胞に対するその効果にとって重要であり得る。これは、Ｆｃ受容体（ＣＤ１６ａ－Ｖ１５８）の高親和性対立遺伝子を有する患者におけるイピリムマブに対する応答が改善されたという最近の報告によって裏付けられている^２０。さらに、ＣＴＬＡ－４遮断は、Ｔ細胞応答のプライミングを改善し、Ｔ細胞クローンの多様性を増加させることができ、これは、新しいＴ細胞を腫瘍にもたらす助けとなり得る^２５。しかし、Ｔ細胞の拡大の延長により、免疫関連毒性が引き起こされ得る^２６。各治療サイクル内でＰＤ１およびＣＴＬＡ４経路の二重遮断、およびＰＤ１阻害による腫瘍特異的Ｔ細胞の局所活性化により、強力な共刺激およびＴ細胞の拡大の最適なバランスを達成するためにいかにＣＴＬＡ－４遮断のレベルを調整するかは、併用療法を奏効させるために重要となるであろう。ＰＳＢ２０５の抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１は、ＦｃＲｎへの結合を減少させるように操作されており、これにより循環中のクリアランスが急速になる。ＰＳＢ２０５における抗ＣＴＬＡ４抗体の消失半減期は、ヒトでは約５日であり、イピリムマブの半減期１５日と比較して著しく短い。これにより、用量漸増中の曝露制御がより柔軟になり、ＴＲＡＥ事象では、薬物を迅速に消失させ得る。この独自の特徴は、ヒトにおける腫瘍反応の改善および忍容性の向上につながり得る。

【0293】

最初のヒト試験におけるＰＫ分析は、ＰＳＢ２０５の各投与後にＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４に対して異なるレベルの標的範囲をもたらす設計目標を達成したことを示唆している。５ｍｇ／ｋｇ用量群におけるＰＳＢ２０５の最初の単回投与後のａＰＤ－１およびａＣＴＬＡ－４成分の平均ｔ_１／２は、それぞれ約８日および４日であった。複数回投与後のａＣＴＬＡ－４の平均ｔ_１／２は、約５日であった。各用量群のａＣＴＬＡ－４は、複数回投与後も身体内に明らかな蓄積を示さなかった。対照的に、ニボルマブおよびイピリムマブの平均ｔ_１／２は、それぞれ、約１９．１日^２７、および１５．４日であった。イピリムマブは半減期が長いため、３週間ごとに使用した場合、複数の治療サイクル後にイピリムマブのレベルが大幅に蓄積する可能性があり、これが、ｉｒＡＥの上昇に寄与し得る。ニボルマブ（３ｍｇ／ｋｇ）およびイピリムマブ（１ｍｇ／ｋｇ）をＱ３Ｗで併用した場合、イピリムマブ（１ｍｇ／ｋｇ）を６週間ごとに投与したレジメンと比較して、顕著に高いｉｒＡＥ率が観察された^２３。イピリムマブの投与頻度を６週間ごとに少なくすることにより、抗体の定常状態濃度が低下し、併用療法の忍容性が改善し得る。ａＣＴＬＡ－４成分の半減期が短いため、３週間ごとに投与した場合、ＰＳＢ２０５の繰り返し投与後に、顕著な蓄積なく、ａＣＴＬＡ－４の所望のトラフレベルを維持することが可能である。この独自のＰＫプロファイルは、ＰＳＢ２０５の全体的な良好な安全性プロファイルに寄与し得る。比較的速いクリアランスにもかかわらず、ＰＳＢ２０５治療後のＣＴＬＡ－４の機能的遮断の強力な所見が存在する。ＰＳＢ２０５は、５ｍｇ／ｋｇで投与した場合、ＣＤ８細胞の増殖とＩＣＯＳ＋ＣＤ４ Ｔ細胞の拡大を効果的に誘導することができ、これにより、５ｍｇ／ｋｇの用量でＰＤ１およびＣＴＬＡ４経路の機能的遮断が示されたが、ｉｒＡＥの悪化は引き起こさないであろう。

【0294】

この試験では、ＰＳＢ２０５は、一般に忍容性が良好であり、ＲＰ２Ｄでの患者の７．１％で、グレード３以上のＴＲＡＥが生じた。これまでの試験では、オプジーボおよびヤーボイの併用療法におけるグレード３以上のＴＲＡＥの発生率は、２２％～５９％の範囲であり、ＮＳＣＬＣでは３２．８％^１７、ＭＳＩ－Ｈ／ｄＭＭＲ結腸直腸癌では２２％^２８、肝細胞癌では２９％～５３％^２９、悪性胸膜中皮腫では３０．３％^３０、腎細胞癌では４６％^３１、黒色腫では５９％^３２であることが示されている。臨床試験が進行中であることにより、データは、現在も成熟しているところであるが、予備データに基づくＰＳＢ２０５の全体的な安全性プロファイルは、抗ＰＤ－１抗体および抗ＣＴＬＡ－４抗体の併用に関する他の試験により公開されているデータと比べて同程度である。ＴＲＡＥの発生率が低下すると、患者は、長期間治療を継続できるようになり、これが、有効性の改善に寄与し得る。

【0295】

ＰＳＢ２０５は、本試験でも有望な臨床活性を示した。評価可能な患者３５名のうち１０名（２８．６％）が部分奏効を達成し、これには、他のＰＤ１／ＰＤＬ１阻害剤で以前に治療を受けた患者も含めた。反応の持続期間は、より長期の追跡調査によって確立する必要があるが、抗腫瘍活性の初期観察は、特にＮＰＣについては有望であり、全奏効率は、３５％（７／２０）であった。現在、ＮＰＣに対する承認された免疫療法は依然として存在しない２ライン以上のＮＰＣ免疫療法に関するいくつかの臨床試験が進行中であり、報告されたＯＲＲは、２０．５％～３４％の範囲である^{３３－３６}。ＮＰＣ患者は、腫瘍内でのＴｒｅｇの浸潤が増加していることが示されている^３７。これらの患者は、抗ＰＤ－１抗体と抗ＣＴＬＡ－４抗体との併用に対してより感受性が高い可能性がある。２ライン以上のＮＰＣ患者を対象としたニボルマブ（３ｍｇ／ｋｇ、２週間ごと）と低用量イピリムマブ（１ｍｇ／ｋｇ、６週間ごと）の最近の第２相試験では、全奏効率３０％（１２／４０）、ＴＲＡＥを経験した患者８６％（３４／４０）、グレード３以上のＴＲＡＥを経験した患者１０％（４／４０）が報告された^３８。本試験で観察された最初の有望なデータは、ニボルマブと低用量イピリムマブの併用によって得られるものと同様の抗腫瘍反応を達成するＰＳＢ２０５の可能性を示しており、これにより、ＮＰＣ患者でのさらなる臨床試験が認可される。ＮＳＣＬＣおよびＮＰＣを伴うＰＤ－１抵抗性患者における抗腫瘍反応の最初の所見では、これらの治療困難な患者集団においてＰＳＢ２０５を探索できることが示唆されており、これにより、併用療法の見込みがもたらされる。

【0296】

ＰＳＢ２０５は、その良好な安全性プロファイルおよび有望な抗腫瘍活性により、低分子、がんワクチン、腫瘍溶解性ウイルス、治療用抗体などの他の治療用分子とのさらなる併用試験のためのバックボーンとしてさらに開発することができる。２つの薬物の投与を必要とする従来の抗体併用療法と比較して、ＭａｂＰａｉｒ製品は、単純な制御経路を備えた１つの実体として開発され得る。これにより、抗体併用療法の開発にかかる時間およびコストが削減される。

【0297】

本発明によれば、１つのバイアル製品で抗体併用療法を送達するための新規アプローチが本明細書で提供される。ＰＤ－１およびＣＴＬＡ－４の二重遮断機能を備えた最初のＭａｂＰａｉｒ製品であるＰＳＢ２０５（ＱＬ１６０７）は、第１相臨床試験で評価され、進行性固形悪性腫瘍における許容可能な安全性プロファイルおよび臨床抗腫瘍活性の初期エビデンスを示した。

【0298】

材料および方法
ＰＳＢ２０５の設計および生成
ＭａｂＰａｉｒプラットフォームの開発については、別の報告で説明する（ＬｉｕＺ ｅｔ ａｌ、原稿準備中）。抗ヒトＰＤ－１抗体クローン＃１および抗ヒトＣＴＬＡ－４抗体１１Ｆ４の生成および操作は、別々に記載されている（米国特許第２０１９／０２４８８９９号および米国特許第２０１９／０２７６５４２号）。抗ＰＤ１抗体の可変重鎖（ＶＨ）遺伝子および可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子を、それぞれヒトガンマ４定常重鎖および定常カッパ軽鎖に挿入した。ＩｇＧ４のＦａｂアーム交換を防ぐために、ヒンジ領域に置換Ｓ２２８Ｐを導入した。抗ＣＴＬＡ－４の可変重鎖（ＶＨ）遺伝子および可変軽鎖（ＶＬ）遺伝子を、それぞれヒトガンマ１定常重鎖および定常カッパ軽鎖に挿入した。同じ細胞内で抗ＰＤ－１ＩｇＧ４抗体と共発現させた場合に、同族のＨＣ／ＨＣ鎖およびＨＣ／ＬＣ鎖の対形成を正確に制御するために、抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１抗体にいくつかの置換を導入させた。抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１のＣ_Ｈ３領域に２つの置換（Ｄ３９９ＲおよびＫ４０９Ｅ）を導入して、ＨＣの対形成を制御した。Ｃ_Ｈ１領域に３つの置換（Ｋ１４７Ｄ、Ｆ１７０Ｃ、およびＶ１７３Ｃ）、重鎖の上部ヒンジ領域に１つの置換（Ｃ２２０Ｇ）、およびＣκ領域に４つの置換（Ｓ１３１Ｋ、Ｑ１６０Ｃ、Ｓ１６２Ｃ、およびＣ２１４Ｓ）を導入して、抗ＣＴＬＡ－４ ＩｇＧ１抗体におけるＬＣの正しい対形成を制御した。さらに、Ｃ_Ｈ２領域に１つの置換（Ｒ２５５Ｋ）を導入して、ＦｃＲｎの結合を改変した。

【0299】

ＭａｂＰａｉｒカクテルは、Ｅｘｐｉ２９３細胞およびＥｘｐｉＣＨＯ細胞の両方中において、複数回の一過性トランスフェクションによって産生され、プロテインＡカラムで精製した。質量分析により、すべてのＨＣ／ＨＣおよびＨＣ／ＬＣ鎖がいかなる誤対形成もなく、正確に組み立てられていることが確認された。

【0300】

安定ＣＨＯ細胞株中でのＰＳＢ２０５（ＱＬ１７０６）の産生
抗ＰＤ－１ＩｇＧ４抗体のＨＣおよびＬＣの両方をコードするＤＮＡをｐＣＨＯ１．０ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）にサブクローニングし、ＣＨＯ－Ｓ（商標）細胞株のトランスフェクションおよび選択に使用する。高レベルの抗ＰＤ－１ＩｇＧ４抗体を産生する１つの安定細胞株、クローンＧ１９Ｇ４－４Ｂ４を、操作された抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１抗体のＬＣおよびＨＣを導入するための宿主細胞として選択した。両方の抗体の発現力価が高い安定クローンをさらにスクリーニングして、抗ＰＤ１ＩｇＧ４抗体および抗ＣＴＬＡ－４ＩｇＧ１抗体を約２：１の比で産生できるＣＨＯ細胞の１つのクローンを同定した。

【0301】

臨床試験
試験設計および参加者
これは、進行性悪性腫瘍患者におけるＰＳＢ２０５の安全性、忍容性、ＭＴＤ、ＰＫ、および一次臨床活性を評価するための第Ｉ相非盲検用量漸増および拡張試験であった。

【0302】

最初の用量漸増は、ＰＳＢ２０５のＤＬＴ、ＭＴＤ、およびＲＰ２Ｄを決定するために実施した。標準的な３＋３用量漸増設計と組み合わせた加速滴定を採用した。簡潔に言えば、最初の投与群には１名の対象のみが登録された。ＤＬＴ評価期間中に、薬物関連ＡＥ≦グレード２のみが観察された場合、対象は、標準的な３＋３用量設計を使用して実施された第２の用量群に登録される。最大投与量（ＭＡＤ）は、１０ｍｇ／ｋｇに設定される。用量漸増プロセスにおいて、選択した用量群の対象が拡大され、したがって、進行悪性腫瘍患者におけるＰＳＢ２０５のＰＫ評価および一次有効性評価に十分な症例が提供された。試験プロトコルは、Ｓｕｎ Ｙａｔ－ｓｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒの倫理委員会によって承認されている（Ｎｏ．Ａ２０１９－０９１－１）。すべての参加者は、書面によるインフォームドコンセントを提出している。

【0303】

以下の主要な対象基準を満たす患者が登録された：（１）１８歳以上の男性または女性の対象；（２）標準治療が無効であるか、有効な治療法がない進行性悪性腫瘍の病理学的に診断が確定し、固形腫瘍については、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１に従って画像測定可能な病変が観察された；（３）Ｅａｓｔｅｒｎ Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｇｒｏｕｐ（ＥＣＯＧ）のパフォーマンスステータスが、０または１であり、余命が３ヶ月より長い；（４）最初の薬物投与前に必要な臓器の機能レベル；（５）治験治療期間全体および治験薬の最後の投与後１８０日まで、有効な避妊法を実施することに同意する。主な除外基準は次のとおりである：（１）過去または進行中の自己免疫疾患、間質性肺疾患、および全身性コルチコステロイド（＞１０ｍｇ／日プレドニゾンまたは同等物）または他の免疫抑制薬の長期使用を必要とする他の疾患；（２）以前のがん免疫療法に関連したグレード３または４の免疫関連ＡＥ；（３）ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１阻害剤と組み合わせたＣＴＬＡ－４阻害剤による以前の治療；（４）妊娠中または授乳中の女性。

【0304】

治療
ＰＳＢ２０５の５つの用量（０．３、１、３、５、および１０ｍｇ／ｋｇ）を３週間ごとに静脈内注入によって投与した。各対象は、１つの投与のみを受けた。いずれの対象も、以下のいずれかの理由により試験を中止させ得る：疾患の進行（治験責任医師が継続的な臨床効果があると考えていない限り）、試験の完了（最長２年間）、耐えられないＡＥの発現、新規抗腫瘍治療の開始もしくはインフォームドコンセントの撤回のいずれか早い方。

【0305】

ＲＥＣＩＳＴｖ１．１標準に従って疾患が疾患の進行を有する固形腫瘍患者については、対象が臨床的に安定しており、治療継続の利点が有利であると治験責任医師が判断した場合、ＰＳＢ２０５治療は継続される。同時に、画像検査によって疾患の進行を監視する必要がある（間隔は、４週間以上）。疾患の進行が確認されたが、対象が臨床的に安定しており、治療継続の利点が得られると治験責任医師が判断した場合は、利点がなくなるまでＰＳＢ２０５治療を行う。

【0306】

結果
主要評価項目は、進行性悪性腫瘍患者におけるＡＥ、ＳＡＥ、ＤＬＴの発生率によって定義されるＰＳＢ２０５の安全性および忍容性、ならびにＰＳＢ２０５のＲＰ２Ｄであった。副次評価項目は、進行性悪性腫瘍患者におけるＰＳＢ２０５のＰＫ、予備的有効性および免疫原性であった。

【0307】

ＰＳＢ２０５曝露と機能的ＲＯとの相関関係、およびバイオマーカーとＰＳＢ２０５有効性との相関関係も分析した。

【0308】

安全性分析には、ＰＳＢ２０５を少なくとも１回投与されたすべての対象を含めた。ＡＥの等級付けは、共通有害事象評価基準（ＣＴＣＡＥ）ｖ５．０に従って行った。用量漸増段階では、ＰＳＢ２０５の初回用量の投与後２１日（１サイクル）以内に発生したＰＳＢ２０５関連ＡＥに基づいてＤＬＴを評価した。ＣＴＣＡＥｖ５．０標準によれば、ＤＬＴは、次のように定義されている：グレード３または４の非血液学的毒性（適切な支持療法により７２時間以内に回復するグレード３の疲労、グレード３の悪心／嘔吐を除く）、あらゆるグレード４の血液学的事象（グレード４の血小板減少症など）、出血を伴うあらゆるグレード３の血小板減少症、またはグレード３の発熱性好中球減少症、およびあらゆる新たなステロイド使用事象（すでにステロイドを服用している対象は除く）。ｉｒＡＥは、主に地域の医療行為に従って管理した。治験責任医師は、Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｅ－Ｒｅｌａｔｅｄ Ａｄｖｅｒｓｅ Ｅｖｅｎｔｓ ｉｎ Ｐａｔｉｅｎｔｓ Ｔｒｅａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｔｈｅｒａｐｙ： Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ（２０１８ ｖｅｒｓｉｏｎ）に従い、対象のベネフィット／リスク比を総合的に評価し、投与の中止／再開を判断した^４２。

【0309】

固形腫瘍患者の場合、腫瘍反応は、ＲＥＣＩＳＴｖ１．１に従って評価した。ＣＴスキャンまたはＭＲＩは、ベースラインで、最初の４サイクルでは２治療サイクル（６週間）ごとに、その後は３治療サイクル（９週間）ごとに実施した。

【0310】

免疫原性評価は、各サイクルの投与前に採取した血液を使用して実施した。

【0311】

薬物動態のサンプリングスケジュールおよびアッセイ方法
ａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１の薬物動態の特徴を明らかにするための血漿サンプルを以下の時点で収集した。サイクル１では、１日目から１４日目（単回投与）およびサイクル６では１日目から１４日目（複数回投与）：投与前、注入終了時、投与後２、８、２４、４８、７２、１６８、３３６時間；サイクル２および他のサイクルでは：投与前、注入終了時、および注入終了４８時間後：来院終了、ならびに最終投与から３０、６０、および９０日後。これらのサンプルは、検証済みの酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）法を使用して分析した。

【0312】

薬物動態分析方法
ａＣＴＬＡ－４およびａＰＤ－１のＰＫパラメータは、ソフトウェアＷｉｎＮｏｎｌｉｎバージョン８．２（Ｃｅｒｔａｒａ ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，ＵＳ）のノンコンパートメントアプローチを使用して分析した。単回投与段階のＰＫパラメータとしては、最大濃度に達するまでの時間（Ｔ_ｍａｘ）、最大濃度（Ｃ_ｍａｘ）、トラフ濃度（Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}）、時間ゼロから最後の定量可能な濃度の時間までの曲線下面積（ＡＵＣ_０－ｔ）、外挿後に導出された曲線下面積のパーセンテージ（ＡＵＣ_{＿％Ｅｘｔｒａｐ}）、時間０から無限大までの曲線下面積（ＡＵＣ_{０－ｉｎｆ}）、時間０から２１日目までの曲線下面積（ＡＵＣ_{０－２１ｄ}）、消失半減期（ｔ_１／２）、クリアランス（ＣＬ）および分布容積（Ｖ_ｚ）が挙げられ、複数回投与段階のパラメータとしては、Ｔ_ｍａｘ、Ｃ_ｍａｘ、Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}、平均濃度（Ｃ_ａｖｇ）、投与間隔にわたる曲線下面積（ＡＵＣ_{０－ｔａｕ}、ｔａｕは２１日に等しい）、ＡＵＣ_{０－ｉｎｆ}、ＡＵＣ_{＿％Ｅｘｔｒａｐ}、ｔ_１／２、定常状態でのクリアランス（ＣＬ_ｓｓ）、定常状態での分布容積（Ｖ_ｓｓ）、Ｃ_ｍａｘによって評価される蓄積率（Ｒ_ａｃ＿Ｃ_ｍａｘ）、Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}によって評価される蓄積率（Ｒ_ａｃ＿Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}）、ＡＵＣによって評価される蓄積率（Ｒ_ａｃ＿ＡＵＣ）が挙げられる。

【0313】

薬動力学的評価
ＰＤ－１受容体占有検出のための血液は、サイクル１では投与前、投与後７２、１６８および３３６時間、サイクル２では投与前１日目、および投与後４８時間、ならびに腫瘍の各画像評価で採取される。他のバイオマーカーは、サイクル１では、投与前、投与後１６８時間および３３６時間、サイクル２では、投与前１日目、および投与後４８時間、ならびに腫瘍の各画像評価において、Ｔ細胞中で検出された。

【0314】

統計分析
この第Ｉ相試験は、標準的な３＋３用量漸増設計と組み合わせた加速滴定に基づいて、安全性および忍容性を評価できるように設計した。人口動態、安全性、および忍容性の分析は、記述式であった。ＯＲＲ（ＤＣＲを含む）の推定値およびその９５％ＣＩは、評価可能な患者に基づいて、正確なＣｌｏｐｐｅｒ－Ｐｅａｒｓｏｎ法によって計算した。特定の薬力学マーカーの投与前と投与後（サイクル１ １６８時間）の値の比較は、ＷｉｌｃｏｘｏｎＳｉｇｎｅｄ－ＲａｎｋＴｅｓｔを使用して行った。

【0315】

表と表の凡例

【表18】

【0316】

略語：ＥＣＯＧ、ＥａｓｔｅｒｎＣｏｏｐｅｒａｔｉｖｅＯｎｃｏｌｏｇｙＧｒｏｕｐ；ＮＳＣＬＣ、非小細胞肺癌；ＮＰＣ、上咽頭癌；ａＰＤ－１、抗プログラム細胞死タンパク質１；ａＰＤ－Ｌ１、抗ＰＤ－１リガンド。
^ａ１名の対象は、ＰＤ－Ｌ１／ＴＧＦβに対する二重特異性抗体を受けた；１名の対象は、抗ＰＤ－１抗体および抗４－１ＢＢ抗体の２種類の免疫療法を受けた；１名の対象は、抗ＰＤ－１抗体および抗ＯＸ４０抗体の２種類の免疫療法を受けた；これら３例は、「ａＰＤ－１／ａＰＤ－Ｌ１」および「他の免疫療法」の両方で１回記録された。
^ｂＯＸ４０、４－１ＢＢ、およびＴＧＦβを標的とする薬物を含む。

【0317】

【表19】

【0318】

【表20】

【0319】

【表21】

【0320】

【表22】

【0321】

【表23】

【0322】

【表24】

【0323】

【表25】

【0324】

注１：薬物動態パラメータは、平均±ＳＤ（ＣＶ％）［Ｎ］として表される。ここで、Ｎは、統計的記述に含まれるデータの数である。Ｎが２の場合、すべてのパラメータは、中央値（最小値、最大値）として表わされる［２］。Ｔ_ｍａｘおよびＴ_ｌａｓｔは、中央値（最小値、最大値）［Ｎ］として表される。

【0325】

注２：サイクル６のＡＵＣ_{０－２１ｄ}、Ｖ_ｚおよびＣＬの結果は、それぞれサイクル６のＡＵＣ_{０－ｔａｕ}、Ｖ_ｓｓおよびＣＬ_ｓｓの結果を使用して報告した。
ａ．サイクル１では、５ｍｇ／ｋｇコホートの対象０１０４０、０１０４１、０１０４２、および０１０４８、ならびに１０ｍｇ／ｋｇコホートの対象０１０３０、０１０３６、および０１０３７は、すべてのサンプルを収集しなかったため、これらの対象のＣ_{ｔｒｏｕｇｈ}およびＡＵＣ_０－ｔは、分析に含まなかった。
ｂ．サイクル１では、ＡＵＣ_{＿％Ｅｘｔｒａｐ}＞２０％およびＲ^２＿ａｄｊｕｓｔ＜０．９の場合、λ_ｚは、正確に推定されなかった。したがって、ＡＵＣ_０－∞、ＡＵＣ_{＿％Ｅｘｔｒａｐ}、ＣＬ、Ｖ_ｚ、ｔ_１／２など、λ_ｚに基づいて計算した一部の対象のパラメータは、λ_ｚが不正確な場合、この分析においては、まとめなかった。
ｃ．サイクル１では、λ_ｚが正確に推定されなかった場合、一部の対象のＡＵＣ_{０－２１ｄ}は分析に含まれなかったが、この条件では、Ｔ_ｌａｓｔ＜ｔａｕ（５０４時間）であり、Ｔ_ｌａｓｔとｔａｕとの差が１％未満の場合、ＡＵＣ_{０－２１ｄ}の結果は、ＡＵＣ_０－ｔ値に置き換えられ、分析に含まれた。
ｄ．サイクル６では、５ｍｇ／ｋｇコホートの対象０１０１８は、すべてのサンプルを収集しなかったため、この対象のＣ_{ｔｒｏｕｇｈ}およびＡＵＣ_０－ｔは、分析に含めなかった。
ｅ．サイクル６では、ＡＵＣ_{＿％Ｅｘｔｒａｐ}＞２０％およびＲ^２＿ａｄｊｕｓｔ＜０．９の場合、λ_ｚは、正確に推定されなかった。したがって、ＡＵＣ_０－∞、ＡＵＣ_{＿％Ｅｘｔｒａｐ}、ｔ_１／２など、λ_ｚに基づいて計算した一部の対象のパラメータは、λ_ｚが不正確な場合、この分析においては、まとめなかった。
ｆ．サイクル６では、ＡＵＣ_{０－ｔａｕ}が正確に推定されなかった場合、Ｃ_ａｖｇ、ＣＬ_ｓｓなどのＡＵＣ_{０－ｔａｕ}に基づいて計算されたパラメータは、分析においてまとめなかった。
g. サイクル６では、λ_ｚまたはＡＵＣ_{０－ｔａｕ}が正確に推定されなかった場合、この２つに基づくＶ_ｓｓは、まとめなかった。
ｈ．サイクル６では、いずれかの対象のサイクル１のＡＵＣ_{０－２１ｄ}またはサイクル６のＡＵＣ_{０－ｔａｕ}が正確に推定されなかった場合、それらのＲ_ａｃ＿ＡＵＣは、不正確とみなし、まとめなかった。
ｉ．サイクル６では、対象がサイクル１またはサイクル６のいずれかですべてのサンプルを収集しなかった場合、それらのＲ_ａｃ＿Ｃ_{ｔｒｏｕｇｈ}は、不正確とみなし、まとめなかった。

【0326】

【表26】

【0327】

【表27】

【0328】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6A】

【図6B】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図11A】

【図11B】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図14A】

【図14B】

【図15】

【図16】

【図17A】

【図17B】

【図18】

【図19】

【図20-1】

【図20-2】

【図20-3】

【図21-1】

【図21-2】

【図21-3】

【図22-1】

【図22-2】

【図22-3】

【図23-1】

【図23-2】

【図23-3】

【図23-4】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【手続補正書】

【提出日】2023-10-23

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024509510000001.app

【国際調査報告】