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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-04
(54)【発明の名称】多重化蛍光顕微鏡検査のための方法及びキット
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/68 20180101AFI20240226BHJP
G01N 33/542 20060101ALI20240226BHJP
G01N 21/64 20060101ALI20240226BHJP
C12N 15/11 20060101ALN20240226BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/68 ZNA
G01N33/542 A
G01N21/64 E
G01N21/64 B
C12N15/11 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550272
(86)(22)【出願日】2022-02-18
(85)【翻訳文提出日】2023-10-17
(86)【国際出願番号】 EP2022054140
(87)【国際公開番号】W WO2022175483
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】2102391.6
(32)【優先日】2021-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
２．ＴＷＥＥＮ
３．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】523315186
【氏名又は名称】マイクログラフィア バイオ リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100149076
【弁理士】
【氏名又は名称】梅田 慎介
(74)【代理人】
【識別番号】100119183
【弁理士】
【氏名又は名称】松任谷 優子
(74)【代理人】
【識別番号】100173185
【弁理士】
【氏名又は名称】森田 裕
(74)【代理人】
【識別番号】100162503
【弁理士】
【氏名又は名称】今野 智介
(74)【代理人】
【識別番号】100144794
【弁理士】
【氏名又は名称】大木 信人
(74)【代理人】
【識別番号】100204582
【弁理士】
【氏名又は名称】大栗 由美
(72)【発明者】
【氏名】アジャリー，ソフィ
(72)【発明者】
【氏名】トンプソン，クリストファー シー．
【テーマコード（参考）】
2G043
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G043AA04
2G043BA16
2G043CA04
2G043DA02
2G043DA08
2G043EA01
2G043FA02
2G043FA03
2G043LA03
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ03
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QR32
4B063QR48
4B063QR66
4B063QS03
4B063QS33
4B063QX02
(57)【要約】
多重化蛍光顕微鏡検査のための方法であって、固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、該サンプル中に存在する任意の結合パートナーと該結合剤を結合させることであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、結合させることと、該サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることと、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのエミッター分子の励起を引き起こす波長を該サンプルに照射することと、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における該サンプルの蛍光動態プロファイルを１つ以上のピクセルで経時的に観察することとを含み、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、方法が提供される。関連するキット、結合剤Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、ならびにそのようなセットを設計する方法も提供される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
多重化蛍光顕微鏡検査のための方法であって、ａ． 固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、前記サンプル中に存在する任意の結合パートナーと前記結合剤を結合させることであって、前記セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、前記Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている前記結合剤に特有である、前記結合させることと、
ｂ． 前記サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることと、
ｃ． 前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのエミッター分子の励起を引き起こす波長を前記サンプルに照射することと、
ｄ． 前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における前記サンプルの蛍光動態プロファイルを１つ以上のピクセルで経時的に観察することと
を含み、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、前記セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、前記方法。
【請求項2】
前記蛍光動態プロファイルから区別可能なメトリックを計算することと、場合により、前記観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおける前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルから計算された前記メトリックに基づいてアイデンティティを割り当てることとをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
非結合状態の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、ステップａの後に除去される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記サンプルは、結合した任意の結合剤をさらに固定化するために、ステップａの後に再固定される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
ａ． 前記セット内の各Ｔオリゴヌクレオチドは、８～３５ヌクレオチド単位の長さである、及び／または、ｂ． 前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、（ｉ）前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子のフェルスター半径を超える長さである、及び／または（ｉｉ）少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
各Ｔオリゴヌクレオチドは、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、各Ｔオリゴヌクレオチドは、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの０～４０％の塩基ペアミスマッチを有する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記結合剤は、タンパク質性分子、場合により抗体またはその断片である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
少なくとも２つのメトリックが、前記蛍光動態プロファイルから計算され、前記観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルにアイデンティティを割り当てるために使用される、請求項２～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及びＴオリゴヌクレオチドペアの前記蛍光動態プロファイルから計算または導出される少なくとも１つのメトリックが、（ｉ）各蛍光放出の間の平均時間、
（ｉｉ）前記蛍光放出の平均持続時間、
（ｉｉｉ）蛍光放出の発生率、
（ｉｖ）前記蛍光動態プロファイルから推測される、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと前記Ｔオリゴヌクレオチドの結合の解離定数（Ｋｏｆｆ）、ならびに
（ｖ）前記蛍光動態プロファイル及び成分の濃度から推測される、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと前記Ｔオリゴヌクレオチドの結合の会合定数（Ｋｏｎ）
からなる群から選択される、請求項２～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
前記蛍光動態プロファイルは、単一分子点滅事象を検出することが可能な高フレームレートイメージングデバイスを使用して観察される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
（ｉ）ステップａは、前記サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群と接触させることであって、前記セット群が、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含む、前記接触させることを含み、（ｉｉ）ステップｂは、前記サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤を、第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、及び１つ以上の後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、
前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、前記第１のセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、前記後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの各々は、その対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、（ｉ）各セット内でそのペアに特有であり、かつ（ｉｉ）前記セット群内でそのペアに特有である蛍光動態プロファイルを生成する、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及び前記後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含み、場合により同じエミッター分子を有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
ステップａが、前記サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセット群であって、各セット群が、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含み、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中の前記エミッター分子の前記発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、前記複数のセット群と接触させることを含み、前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルを観察する前記ステップが、各セット群に対するチャネルで前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルを観察することを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項14】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セット群について、対応する前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及び前記後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、同じエミッター分子を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
（ｉ）ステップａは、前記サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中の前記エミッター分子の前記発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、前記複数のセットと接触させることを含むか、または、（ｉｉ）ステップａは、前記サンプルを、
（Ｉ）結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中の前記エミッター分子の前記発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、前記１つまたは複数のセット、及び
（ＩＩ）結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中の前記エミッター分子の前記発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、前記１つまたは複数のセット群
と接触させることを含み、
前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルを観察する前記ステップは、各セットに対する、または各セット群に対するチャネルで、前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルを観察することを含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項16】
（ｉ）ステップａは、前記サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セットについて、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、各セットに特異的なエミッター分子を含む、前記複数のセットと接触させることを含むか、または、（ｉｉ）ステップａは、前記サンプルを、
（Ｉ）結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セットについて、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、各セットに特異的なエミッター分子を含む、前記１つまたは複数のセット、及び
（ＩＩ）結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セット群について、対応する前記第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及び前記後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、同じエミッター分子を含む、前記１つまたは複数のセット群
と接触させることを含み、
前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルを観察する前記ステップは、各セットに対する、または各セット群に対するチャネルで、前記サンプルの前記蛍光動態プロファイルを観察することを含む、
請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記セットまたは各セットは、２～２５個の異なる結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの前記セット群または各セット群は、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの２～２５個のセットを含む、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの少なくとも１つのセットは、ａ． 配列番号１及び配列番号２の配列の前記Ｔオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方を含み、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、配列番号７の配列のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドであり、
及び／または
ｂ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの少なくとも１つのセットは、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列の前記Ｔオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、配列番号８の配列のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドである、
先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットであって、ａ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットであって、前記セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、前記Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている前記結合剤に特有である、前記セットと、
ｂ． ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと
を備え、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、前記セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、前記キット。
【請求項21】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の追加のセット、及び１つ以上の追加のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドをさらに備え、前記さらなるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの各々は、その対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、各セット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、請求項２０に記載のキット。
【請求項22】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの少なくとも１つのセットは、ａ． 配列番号１及び配列番号２の配列の前記Ｔオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方を含み、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、配列番号７の配列のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドであり、
及び／または
ｂ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの少なくとも１つのセットは、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列の前記Ｔオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、配列番号８の配列のＦＲＥＴ－オリゴヌクレオチドである、
請求項２０または２１に記載のキット。
【請求項23】
多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットを作製するための結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドであって、ａ． Ｔオリゴヌクレオチドのセットと、
ｂ． ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと
を含み、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、前記セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、前記結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
【請求項24】
前記結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、ａ． 配列番号１及び配列番号２の配列の前記Ｔオリゴヌクレオチドの一方もしくは両方を含み、対応する前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、配列番号７の配列のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドであるか、
または
ｂ． 前記結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、配列番号３、配列番号４、配列番号５及び配列番号６の配列の前記Ｔオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも１つを含み、前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、配列番号８の配列のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドである、
請求項２３に記載の多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットを作製するための結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
【請求項25】
請求項２１または２２に記載のキットを調製する方法であって、Ｔオリゴヌクレオチドのセット、及び結合剤のセット、及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを用意することと、請求項２３に記載のＴオリゴヌクレオチドのセットを前記結合剤のセットとコンジュゲートして、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを形成することとを含み、前記結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、前記Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、そのセット内で、それがコンジュゲートされている前記結合剤に特有である、前記方法。
【請求項26】
請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法で使用するためのＴオリゴヌクレオチドのセット及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを設計する方法であって、ａ． 少なくとも１２ヌクレオチドの長さのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列を選択することと、
ｂ． 前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に相補的である少なくとも８ヌクレオチドの長さの１つ以上の配列を取得することと、
ｃ． 各々が前記ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに相補的な前記配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる、複数の潜在的なＴオリゴヌクレオチド配列を生成することと、
ｄ． 互いに異なる蛍光動態プロファイルを生成する少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列の能力に基づいて、前記少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列を選択することと
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多重化蛍光顕微鏡検査の分野に属する。
【背景技術】
【0002】
蛍光顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査は、ライフサイエンス及び薬学的研究の主要な構成要素である。ライフサイエンス及び薬学的研究の多くの分野は、生物学的サンプルを細胞以下のレベルで観察して、細胞内の成分を高解像度でイメージングできるようにするために、蛍光顕微鏡検査に大きく依存している。直交標識ストラテジーにより、複数のチャネルを使用して（例えば、複数のフルオロフォアの使用に基づいて）、同じ細胞内で異なる成分をイメージングすることも可能になり、これらのマルチチャネル顕微鏡像の構成は、種々の下流分析において極めて有用である。
蛍光顕微鏡検査は、ライフサイエンス及び薬学的研究の主要な構成要素である。ライフサイエンス及び薬学的研究の多くの分野は、生物学的サンプルを細胞以下のレベルで観察して、細胞内の成分を高解像度でイメージングできるようにするために、蛍光顕微鏡検査に大きく依存している。直交標識ストラテジーにより、複数のチャネルを使用して（例えば、複数のフルオロフォアの使用に基づいて）、同じ細胞内で異なる成分をイメージングすることも可能になり、これらのマルチチャネル顕微鏡像の構成は、種々の下流分析において極めて有用である。
【0003】
同じサンプルから異なるチャネルをイメージングできるようにするには、通常、様々な蛍光タンパク質または色素からの既知の励起／発光スペクトルを利用する必要がある。標準的な蛍光顕微鏡検査のセットアップでイメージングできるチャネルの数は、利用可能なフルオロフォアの発光／励起の分布がオーバーラップする量によって制限される。実際、蛍光は、多重化すること、つまり、複数の分析物を同時に測定することが難しいことで知られている。理論上は、任意の数の異なるフルオロフォアを蛍光顕微鏡検査実験で使用できるが、異なるフルオロフォアがオーバーラップする光の波長で励起または発光する場合、蛍光シグナルをデコンボリューションする、またはそれぞれのチャネルに分離する方法がない。したがって、標準的な蛍光顕微鏡検査は、実際には、単一のサンプルで４～５つの画像モダリティを評価できるようにするために、各々の励起／発光波長が大きく異なる４～５つの異なるフルオロフォアの使用に制限されている。したがって、実際には、このスペクトルのオーバーラップの問題により、同時に視覚化できる異なる成分の数が制限される。
【0004】
単一分子局在顕微鏡検査における最近の進歩
アッベ回折限界を突破できるため、蛍光顕微鏡検査の解像度を向上させる、オリゴヌクレオチドに基づく蛍光標識ストラテジーが開発されてきた。簡潔に述べると、単一分子局在顕微鏡検査（ＳＭＬＭ）技術の一例であるＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ（Ｐｏｉｎｔ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（例えば、Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ，Ｊ．，Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｃｈｌｉｃｈｔｈａｅｒｌｅ，Ｔ．，Ｓｃｈｕｅｄｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ Ｊｕｎｇｍａｎｎ，Ｒ．（２０１７），Ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２，１１９８－１２２８を参照のこと）などの技術は、結合分子（例えば抗体）に繋がれた相補的なドッキング鎖に可逆的にハイブリダイズする蛍光タグ付きＤＮＡプローブを使用する。結合分子が静止している場合（例えば、固定細胞サンプル中の結合パートナーに結合しているため）、標識鎖とドッキング鎖との間の可逆的なハイブリダイゼーションにより、一時的な発光事象が生じる。一時的な発光事象は検出することができる。生成される局在データを使用すると、高解像度でサンプルの画像を作成することができる。発光事象の一時的な性質により、さもなければ（例えば、分子が互いの非常に近くに位置しているので、標準的技術を使用してイメージングしようとするとシグナルが区別不可能であるため）空間的に分解できなかった分子の時間的な分離が可能になる。
アッベ回折限界を突破できるため、蛍光顕微鏡検査の解像度を向上させる、オリゴヌクレオチドに基づく蛍光標識ストラテジーが開発されてきた。簡潔に述べると、単一分子局在顕微鏡検査（ＳＭＬＭ）技術の一例であるＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ（Ｐｏｉｎｔ Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｉｎｇ ｉｎ Ｎａｎｏｓｃａｌｅ Ｔｏｐｏｇｒａｐｈｙ）（例えば、Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ，Ｊ．，Ｓｔｒａｕｓｓ，Ｍ．Ｔ．，Ｓｃｈｌｉｃｈｔｈａｅｒｌｅ，Ｔ．，Ｓｃｈｕｅｄｅｒ，Ｆ．，ａｎｄ Ｊｕｎｇｍａｎｎ，Ｒ．（２０１７），Ｓｕｐｅｒ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ｗｉｔｈ ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ．Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １２，１１９８－１２２８を参照のこと）などの技術は、結合分子（例えば抗体）に繋がれた相補的なドッキング鎖に可逆的にハイブリダイズする蛍光タグ付きＤＮＡプローブを使用する。結合分子が静止している場合（例えば、固定細胞サンプル中の結合パートナーに結合しているため）、標識鎖とドッキング鎖との間の可逆的なハイブリダイゼーションにより、一時的な発光事象が生じる。一時的な発光事象は検出することができる。生成される局在データを使用すると、高解像度でサンプルの画像を作成することができる。発光事象の一時的な性質により、さもなければ（例えば、分子が互いの非常に近くに位置しているので、標準的技術を使用してイメージングしようとするとシグナルが区別不可能であるため）空間的に分解できなかった分子の時間的な分離が可能になる。
【0005】
複数の確率的結合事象（例えばサンプル中の異なる部位での結合事象）をキャプチャした動画を記録できるということは、これらの事象が最終的に単一の超解像度画像として再構成され得ることを意味する。各発光プロファイルは、回折限界未満の解像度で単一分子の正確な位置特定を可能にする点像分布関数に当てはめることができる。
【0006】
ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ技術の大きな制限は、この技術に関連する高いバックグラウンドである。これは、蛍光標識されたイメージャープローブの使用の結果として生じる。これらの非結合状態のプローブからの蛍光は、大量のバックグラウンド蛍光に寄与する。この高いバックグラウンドは、個々の結合したプローブ分子のシグナルピークの検出における問題を生じさせるだけでなく、他の実際的な制限も生じさせる。この高いバックグラウンドという問題を解決しようとする試み自体が二律背反になることがよくある。すなわち、イメージャープローブの濃度を低下させるとバックグラウンドが低下し得るが、イメージャープローブの濃度が低下すると、複合体が生じる速度（したがって結合事象の頻度）が低下するため、画像捕捉が起こり得る速度が制限され、ひいては迅速な画像捕捉が妨げられる。したがって、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴを用いた画像キャプチャプロセスは遅いことが多い。さらに、ＳＭＬＭは通常、励起用のレーザー波長が最大３つに制限されているため、３つを超えるモダリティを単一の実験でイメージングすることは通常不可能である。
【0007】
本発明者らは、単一波長励起照射プロトコルを使用できる多重化蛍光顕微鏡検査のための方法を考案した。本方法は、ＤＮＡに基づく蛍光ストラテジーによってもたらされる蛍光の確率的放出を利用するものであり、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）オリゴヌクレオチドの使用により、例えば蛍光標識されているがシグナルを常に放出し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用したイメージングと比較すると、強化されたスペクトル非依存多重化モダリティイメージングが可能になる。上記で説明したように、ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴのような技術における標準的な蛍光オリゴヌクレオチドの使用は、使用されるオリゴヌクレオチドの連続的な蛍光を所与として、高いバックグラウンドを伴う。この高いバックグラウンドは、本発明の方法では、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することによって回避される。本発明で使用されるこれらのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、溶液中で遊離しているときはバックグラウンド蛍光をほとんどまたは全く有しないが、オリゴヌクレオチドとハイブリダイズして結合ペアを形成すると蛍光を発し得る。高いバックグラウンドの回避は、本発明の方法においてより高濃度の蛍光オリゴヌクレオチドを使用できることを意味し、したがって観察のステップ（画像またはビデオのキャプチャを含む）がより迅速になることを意味する。
【0008】
ＦＲＥＴの原理、及びオリゴヌクレオチドに関連したＦＲＥＴの使用については、当技術分野でよく知られている。そのようなオリゴヌクレオチドでは、エミッター分子及び消光体を使用するＦＲＥＴの原理が使用される。エミッターの励起波長の照射では、エミッター分子及び消光体が互いの十分近く（典型的には１～１０ｎｍの範囲内）に位置している場合、エミッターの発光波長での蛍光は観察されない。これは、エミッター分子から消光体への効率的なエネルギー移動によるものである。しかし、エミッター分子及び消光体が物理的に十分離れていれば、ＦＲＥＴの速度は低下し、したがってエミッター分子からの発光がエミッターの発光波長で検出できるようになる。
【0009】
本発明では、この原理を操作して蛍光動態プロファイルを生成する。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、エミッター分子及び消光体を含む。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき、エミッターの励起波長を照射すると、近位に位置する消光体への効率的なエネルギー移動のために（例えば、近接するオリゴヌクレオチドの２つの端部またはその付近に通常位置するエミッター分子及び消光体を許容する自由／柔軟なコンフォメーションのために）、エミッターの発光波長では蛍光が観察されない。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、結合剤にコンジュゲートされたトランス活性化オリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド）のセットのメンバーと可逆的にハイブリダイズする能力を有する。Ｔオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの構造が、このハイブリダイゼーションによって拘束される。これにより、エミッター分子及び消光体が物理的に分離され、ＦＲＥＴの速度が低下し、エミッターの励起波長での照射により、エミッターの発光波長におけるエミッター分子からの発光がハイブリダイゼーション部位で検出できるようになる。Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、形成されるペア間の可逆的なハイブリダイゼーションを可能にするように設計される。これは、各ペアについて蛍光動態プロファイルが経時的に観察される、すなわち、結合ペアがハイブリダイズ構成にある場合には蛍光放出が起こるが、ペアが分離している場合には蛍光放出が起こらないことを意味する。上記で説明したＤＮＡ ＰＡＩＮＴのように、蛍光動態プロファイルが検出されるということは、高解像度が達成されることを意味する。ＤＮＡ ＰＡＩＮＴとは異なり、バックグラウンド蛍光が低いため、シグナルの感度または質は、シグナル対ノイズ比が高いなどの理由から、ＤＮＡ ＰＡＩＮＴよりも良好であり得る。
【0010】
さらに、本発明の方法及びキットは多重化を可能にする。各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、したがって複数のペアを形成することができる。異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する。これは、単一のセットで生成された複数の蛍光動態プロファイルを単一のチャネルで（すなわち同じ発光スペクトルに基づいて）同時に観察でき、また、その蛍光動態プロファイルがそのセット内でそのペアに特有であるため、各ペアにおけるＴオリゴヌクレオチドのアイデンティティをその蛍光動態プロファイルによって（例えば、そのペアに一意に起因する蛍光動態プロファイルの１つ以上のメトリックを計算することによって）決定できることを意味する。サンプル中の任意の蛍光動態プロファイルの観察（例えば検出またはキャプチャ）は、サンプル中の１つ以上の、例えば複数の位置またはピクセルで蛍光動態プロファイルをキャプチャする動画を記録することによるものであり得る。この情報を使用して、蛍光動態プロファイルの１つ以上のメトリックを計算し、次にこれを使用して、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイルから計算されたメトリックに基づいてアイデンティティを割り当て、最終的に、サンプルまたはその一部の１つ以上の画像を再構成する。蛍光動態プロファイルのメトリックは、単に、蛍光動態プロファイルの１つ以上の態様の尺度または表現であり、例えば蛍光動態プロファイルの１つ以上の態様の数学的分析により、蛍光動態プロファイルから計算または導出することができる。
【0011】
Ｔオリゴヌクレオチドは、Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている結合剤に特有であるように、結合剤にコンジュゲートされている。したがって、サンプル内の任意の与えられた位置で観察される蛍光動態プロファイルまたはそのメトリックに基づいて、その位置にどの結合剤が存在するかを決定することができる。これらのメトリックの非限定的な例には、（ｉ）各蛍光放出の間の平均時間（オフ時間とも呼ばれる）、（ｉｉ）蛍光放出の平均持続時間（オン時間とも呼ばれる）、及び（ｉｉｉ）蛍光放出の発生率が含まれる。少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのそのようなメトリックを蛍光動態プロファイルから抽出し、それを記述するために使用することができる。これらの例示的なメトリック以外のメトリックを使用してもよい。
【0012】
この技術で達成される高解像度及び低バックグラウンドは、固有の多重化機能と合わせて、この技術が特に有利であることを意味する。
【0013】
単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと、Ｔオリゴヌクレオチドのセットとを使用することで、複数の異なる蛍光動態プロファイル（例えば最大１０または最大２５）を生成することができる。ただし、多重化は複数のレベルで可能になる。第１のレベルでは、本発明は、セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドに結合できるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用して、そのセット内で形成される各ペアによって異なる蛍光動態プロファイルが生成されるようにする。したがって、経時的にサンプルから放出されるいずれかの蛍光動態プロファイル（またはそのメトリック）を観察することにより、観察されるいずれかの蛍光動態プロファイルを生じさせるＴオリゴヌクレオチドのアイデンティティ、ひいてはＴオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている特定の結合パートナーを、サンプル中の任意の位置で決定することができる。
【0014】
さらなる多重化は、各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが対応するＴオリゴヌクレオチドのセットを有する、複数のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することによって達成することができる。各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが対応するＴオリゴヌクレオチドのセットを有する２つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することにより、より広範囲の異なる蛍光動態プロファイルを生成することができ、したがって、より多くの結合剤を使用することができ、より多くの異なる標的分子を検出することができる。したがって、本方法は多重化に特に有利である。
【0015】
例として、Ｔオリゴヌクレオチドの第１のセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、複数の異なる蛍光動態プロファイルを生じさせ得る。蛍光動態プロファイルからは、任意の数の数値メトリックまたは特徴が抽出され得る。これらのメトリックの非限定的な例には、（ｉ）各蛍光放出の間の平均時間（オフ時間とも呼ばれる）、（ｉｉ）蛍光放出の平均持続時間（オン時間とも呼ばれる）、及び（ｉｉｉ）蛍光放出の発生率が含まれる。少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのメトリックを蛍光動態プロファイルから抽出し、それを記述するために使用することができ、これらのメトリックは、上記に列挙したメトリックでも、代替的なメトリックでもよい。
【0016】
さらに、「点滅」として概念化される、蛍光放出がオフ及びオンになることを使用して、各Ｔオリゴヌクレオチドと対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション親和性を記述する数値メトリックを定義することができる。点滅動態から、少なくとも（ｉ）Ｋｏｎ（会合速度定数、Ｍ－１．ｓ－１で表される）及び（ｉｉ）Ｋｏｆｆ（解離速度定数、ｓ－１で表される）を含む、任意の数の親和性メトリックが導出され得る。各Ｔオリゴヌクレオチドが、特有のハイブリダイゼーション動態プロファイル、ひいては特有の点滅動態プロファイルを呈するようにエンジニアリングされているため、任意の個々のメトリックまたはメトリックの組み合わせを使用して、観察下のＴオリゴヌクレオチドのアイデンティティを区別することができる。これらの親和性メトリックは、蛍光動態プロファイルを記述する方法にもなり得る。
【0017】
所定のＴオリゴヌクレオチドのセットは、例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１～１０）を含み得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡは、例えば、これら１０個のＴオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズし、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１～１０）を生成し得る。例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１１～２０）を含むさらなるＴオリゴヌクレオチドのセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢ）とを追加することにより、さらに１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１１～２０）を使用することができる。
【0018】
さらなる程度の多重化が、異なるスペクトルチャネルで（例えば異なるフルオロフォアを使用して）検出可能な蛍光放出を生じさせる異なるフルオロフォアを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することによってもたらされる。複数のスペクトルチャネルでシグナルを収集することにより、さらなるレベルの多重化が可能になり、単一のサンプル中で結合剤のさらに多くの標的を検出できるようになる。
【0019】
例えば、所定のＴオリゴヌクレオチドのセットは、例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１～１０）を含み得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡは、例えば、これら１０個のＴオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズし、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１～１０）を生成し得る。例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド２１～３０）を含むさらなるＴオリゴヌクレオチドのセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣ）［ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡとは異なるスペクトルチャネルで検出可能である蛍光シグナルを生じさせる（例えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡとは異なるフルオロフォアを含むため）］とを追加することにより、さらに１０個の蛍光動態プロファイル（プロファイル２１～３０）を使用することができる。プロファイル２１～３０は、プロファイル１～１０とは異なるスペクトルチャネルで検出可能であるため、該プロファイルのうちの１つ以上は、それらが異なるスペクトルチャネルで検出されることに基づいて（例えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡとは異なるフルオロフォアを含むため）区別可能であることから、プロファイル１～１０のうちの１つ以上と類似または同一である可能性がある。Ｔオリゴヌクレオチドは、依然として結合パートナーに特有であり、各Ｔオリゴヌクレオチドは、その検出チャネル内で特有の蛍光動態プロファイルを生じさせるはずである。
【0020】
したがって、このアプローチでは、多くの他のアプローチとは異なり、多重化する能力が、スペクトル分解可能な異なるフルオロフォアの数によって制限されない。本方法における多重化は、Ｔオリゴヌクレオチドの塩基配列における差異を使用することによって達成できる、区別可能な蛍光動態プロファイルを生成する能力に依存する。多数の異なるＴオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの配列を設計し、生成することができ、これはつまり、単一のフルオロフォアしか使用しなくても（または、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含んでいても）、本発明には固有の多重化能力があることを意味するが、異なるチャネルで検出され得る発光を生じさせるフルオロフォアによって（例えば複数のフルオロフォアを使用して）、さらなるレベルの多重化が達成され得る。本発明の方法はさらに、標準的な顕微鏡検査のセットアップ、例えば落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、全内部反射蛍光顕微鏡（ＴＩＲＦ）、誘導放出抑制（ＳＴＥＤ）顕微鏡、構造化照射顕微鏡（ＳＩＭ）、及び、レーザー、ＬＥＤ、ハロゲン、または他の照射源によってサンプル内に含まれるフルオロフォア分子を標的とした励起が可能である他のタイプの蛍光顕微鏡と容易に統合することができる。
【0021】
他の技術は、ＤＮＡ ＰＡＩＮＴタイプのプローブの多重化を試みているが、一般にこれらは、ＷＯ２０１５／１３８６５３に記載されているようなプローブの順次結合を使用して多重化を達成した。本件の技術の多重化への適応性は、低いバックグラウンド蛍光及び向上したイメージング時間と共に、本方法の利点の一つである。これらの利点のため、本発明の方法はハイスループットアッセイに特に適用される。ハイスループットアッセイにおけるこの有用性は、高度な多重化を行う能力に特に関連しており、これは、実験セットアップごとにより多くの情報量が実験で得られるために望ましい。
【0022】
したがって、本明細書で提供される方法は、オリゴヌクレオチドの塩基配列が、オリゴヌクレオチドを一意に識別する方法であるということを利用する。その塩基配列は、オリゴヌクレオチドと他のオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの性質も決定する。Ｔオリゴヌクレオチド及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの塩基配列は、特定の蛍光動態プロファイルを有するペアを生成するためにプログラムすることができ、その結果、蛍光動態プロファイルの識別により、そのペアに存在する特定のＴオリゴヌクレオチドの識別が可能になり、これにより、Ｔオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている特定の結合パートナーの識別が可能になる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0023】
本発明は、オリゴヌクレオチドを使用して、それらがコンジュゲートされている結合パートナーを一意に識別し、これらのオリゴヌクレオチドがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとペアを形成するように、多重化蛍光顕微鏡検査の方法との関連でＦＲＥＴの原理を利用できるという、本発明者らの発見に基づく。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することには、さらに詳細に説明するように、幾つかの利点がある。第１に、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき（図１Ａ）、エミッター分子の励起波長を照射すると、エミッターの発光波長では蛍光は観察されない。これは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中で自由なコンフォメーションをとることによって可能になる、エミッターから消光体への効率的なエネルギー移動が起こるためである。これは、蛍光の（例えば、エミッターの発光波長での）バックグラウンドレベルが低いことを意味する。これに対し、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、細胞サンプル全体で固定化されている相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、エミッターの発光波長で蛍光を放出する（図１Ｂ）。ＴオリゴヌクレオチドとのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが線状化され、これにより消光成分が発光成分から物理的に分離され、ＦＲＥＴの速度が低下する。したがって、エミッターの発光波長での蛍光シグナルは、ハイブリダイゼーション部位で、かつＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしているときにのみ放出される。Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの配列は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがセット内の様々なＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズできるように設計される。形成される異なる各ペアにより、特有の蛍光動態プロファイルが生じる。これは、生成された蛍光動態プロファイルを観察し、蛍光動態プロファイルの区別可能なメトリックを計算することにより、サンプル中の特定の位置でペアのアイデンティティをデコンボリューションし（図４及び５）、ひいてはサンプル中のその特定の位置で結合した結合パートナーを決定することが可能であることを意味する。
【0024】
したがって、本発明は、多重化蛍光顕微鏡検査のための方法であって、
ａ． 固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、該サンプル中に存在する任意の結合パートナーと該結合剤を結合させることであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、結合させることと、
ｂ． 該サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることと、
ｃ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのエミッター分子の励起を引き起こす波長を該サンプルに照射することと、
ｄ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における蛍光動態プロファイルを１つ以上のピクセルで経時的に観察することと
を含み、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、方法を提供する。
ａ． 固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、該サンプル中に存在する任意の結合パートナーと該結合剤を結合させることであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、結合させることと、
ｂ． 該サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることと、
ｃ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのエミッター分子の励起を引き起こす波長を該サンプルに照射することと、
ｄ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における蛍光動態プロファイルを１つ以上のピクセルで経時的に観察することと
を含み、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、方法を提供する。
【0025】
本発明はまた、多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットであって、
ａ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、該セットと、
ｂ． ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと
を備え、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、キットを提供する。
ａ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、該セットと、
ｂ． ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと
を備え、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、キットを提供する。
【0026】
本発明はまた、多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットを作製するための結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドであって、
ａ． Ｔオリゴヌクレオチドのセットと、
ｂ． ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと
を含み、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを提供する。
ａ． Ｔオリゴヌクレオチドのセットと、
ｂ． ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと
を含み、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを提供する。
【0027】
本発明はまた、本発明のキットを調製する方法を提供し、該方法は、Ｔオリゴヌクレオチドのセット、及び結合剤のセット、及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを用意することと、該Ｔオリゴヌクレオチドのセットを該結合剤のセットとコンジュゲートして、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを形成することとを含み、該結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、そのセット内で、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である。
【0028】
本発明はさらに、本発明の方法で使用するためのＴオリゴヌクレオチドのセット及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供し、該方法は、
ａ． 少なくとも１２ヌクレオチドの長さのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列を選択することと、
ｂ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に相補的である少なくとも８ヌクレオチドの長さの１つ以上の配列を取得することと、
ｃ． 各々が該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに相補的な該配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる、複数の潜在的なＴオリゴヌクレオチド配列を生成することと、
ｄ． 互いに異なる蛍光動態プロファイルを生成する少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列の能力に基づいて、該少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列を選択することとを含む。
ａ． 少なくとも１２ヌクレオチドの長さのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列を選択することと、
ｂ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に相補的である少なくとも８ヌクレオチドの長さの１つ以上の配列を取得することと、
ｃ． 各々が該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに相補的な該配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる、複数の潜在的なＴオリゴヌクレオチド配列を生成することと、
ｄ． 互いに異なる蛍光動態プロファイルを生成する少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列の能力に基づいて、該少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列を選択することとを含む。
【0029】
多重化蛍光顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査は、蛍光化合物の検出に基づいており、これはサンプルの画像を生成するために使用され得る（これは、光の検出の代わり、またはそれに加えたものであり得る）。フルオロフォアは、光励起すると光を再放出することができる蛍光性の化学化合物または生物学的タンパク質である。蛍光顕微鏡検査では、１つ以上の特定の波長をもつ光をフルオロフォアに照射する。この光はフルオロフォア（複数可）によって吸収され、フルオロフォアのエネルギーは短時間により高い励起状態に上昇する。その後に基底状態に戻ると、検出及び測定され得る蛍光の放出が起こる。放出された光の検出は、画像を生成するために使用され得る。
蛍光顕微鏡検査
蛍光顕微鏡検査は、蛍光化合物の検出に基づいており、これはサンプルの画像を生成するために使用され得る（これは、光の検出の代わり、またはそれに加えたものであり得る）。フルオロフォアは、光励起すると光を再放出することができる蛍光性の化学化合物または生物学的タンパク質である。蛍光顕微鏡検査では、１つ以上の特定の波長をもつ光をフルオロフォアに照射する。この光はフルオロフォア（複数可）によって吸収され、フルオロフォアのエネルギーは短時間により高い励起状態に上昇する。その後に基底状態に戻ると、検出及び測定され得る蛍光の放出が起こる。放出された光の検出は、画像を生成するために使用され得る。
【0030】
したがって、フルオロフォアは、光励起に応答して光を放出する分子であり、再放出された光は、励起に使用される光よりも波長が長い。いかなるフルオロフォアも、励起及び発光スペクトルのピークに対応する定義された最大励起及び発光波長を有する。例としては、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ローダミン誘導体（ＴＲＩＴＣ）、クマリン誘導体、及びシアニン誘導体が挙げられる。
【0031】
蛍光顕微鏡検査は、例えば、サンプル内の１つ以上の標的分子の存在または位置を検出するために使用され得る。ある特定の標的分子、例えば核酸は、蛍光染色剤（内因的に蛍光を発する小分子であり得る）を使用して検出することができる。ＤＡＰＩ及びＨｏｅｃｈｓｔなどの核酸染色剤は、ＤＮＡの副溝に結合することから細胞核を蛍光標識するために慣例的に使用されている好適な例である。サンプル内の他の標的分子の存在または位置を検出するには、標的分子に結合する特異的結合剤の能力を操作することができる。例えば、抗体を結合剤として使用することはよく知られている。そのような方法では、特定の標的分子に対する抗体を使用することができる。一次抗体（標的分子に結合するもの）を蛍光分子で標識してもよいし、この蛍光分子を、一次抗体に結合する第２の抗体に搭載してもよい。このようにして、サンプル内の特定の位置における蛍光の検出は、標的分子がその位置に存在することを示す。
【0032】
以下にさらに詳細に記載するように、本方法は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間の解離及び再会合の結果として生成される蛍光動態シグナルの観察を含むため、本方法では蛍光顕微鏡検査が使用される。
【0033】
多重化
本明細書で使用される多重化とは、複数の結合剤が使用されることを意味し、これは一般に、複数の標的分子が存在すれば、それらが同じサンプル中で検出され得ることを意味する（ただし、複数の結合剤は、原理上、複数の抗体が大きなポリペプチドに結合し、各抗体が異なるエピトープに結合する場合など、単一の標的分子に結合し得る）。したがって、多重化は、複数の標的分子を並行して観察することを可能にし得る。
本明細書で使用される多重化とは、複数の結合剤が使用されることを意味し、これは一般に、複数の標的分子が存在すれば、それらが同じサンプル中で検出され得ることを意味する（ただし、複数の結合剤は、原理上、複数の抗体が大きなポリペプチドに結合し、各抗体が異なるエピトープに結合する場合など、単一の標的分子に結合し得る）。したがって、多重化は、複数の標的分子を並行して観察することを可能にし得る。
【0034】
これらの結合剤は、概して、例えば同時にサンプルと接触し、それぞれの標的が同じサンプル中に存在する場合には、それらに結合し得る。標準的な多重化アッセイの一例は、１つの標的分子に対する第１の一次抗体と、第２の標的分子に対する第２の一次抗体とを使用することである。次いで、サンプル及び結合した任意の一次抗体を、複数のフルオロフォア、すなわち第１の二次抗体に対する第１のフルオロフォアと、第２の二次抗体に対する第２のフルオロフォアとで標識された、対応する二次抗体と接触させる。２つのフルオロフォアの各々から全てのシグナルを検出することにより、サンプル内の２つの標的分子の位置の画像を生成することができる。
【0035】
したがって、多重化プロセスには、同じサンプルから複数の蛍光シグナルを検出する能力が必要である。標準的な蛍光顕微鏡検査技術において、これは、複数のフルオロフォア、例えば、差別化できるように十分に異なる波長の光を放出するフルオロフォアを使用することによって行われ得る。好適な例は、第１のフルオロフォアとしてフルオレセインに基づく分子を使用して、第２のフルオロフォアとしてローダミンに基づく分子を使用する方法である。しかし、上述のように、フルオロフォアに関しては多重化が困難である。ほとんどのフルオロフォアの発光スペクトルは広いため、標準的な蛍光顕微鏡では多重化が４つまたは５つの標識に制限される。さらに、二次抗体の使用に依存する技術では、異なる種に由来する抗体を使用することによって二次抗体間にクロスハイブリダイゼーションが生じないことを確実にする必要もある。これにより可能な組み合わせの数が制限されるが、この制限は、本発明で克服される。
【0036】
本発明では、多重化は、少なくとも、関連するエミッター分子の発光波長での蛍光シグナルの存在または非存在だけでなく、その時間的パターンも観察されるということによって達成される。関連するエミッター分子の発光波長での蛍光の存在または非存在を単に観察するのではなく、複数の「蛍光動態プロファイル」が観察される。蛍光動態プロファイルの使用は、使用される各チャネルから、より多くの情報を取得できることを意味する。異なる特異性を有する複数の結合剤が使用され、各結合剤はＴオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。Ｔオリゴヌクレオチドのセットには、セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができる、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがある。Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの配列は、形成されるペアが解離及び再会合を起こすようなものであり、異なる各ペアの間のこの解離及び再会合は、セット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する。蛍光動態プロファイルはセット内でそのペアに特有であるため、１つ以上のピクセルにおける特定の蛍光動態プロファイルの観察は、サンプル中のその位置における特定のＴオリゴヌクレオチドの存在（したがって、サンプル中のその位置における、Ｔオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている結合剤の存在、そして最終的には結合剤が結合する標的分子）を示す。言い換えれば、１つ以上のピクセルにおける特定の蛍光動態プロファイルの観察は、サンプル中のその位置に、対応する標的分子が存在することを示す。
【0037】
本明細書で使用される「蛍光動態プロファイル」という用語は、Ｔオリゴヌクレオチドとその対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの任意のペアの経時的な解離及び再会合から生じる蛍光放出のパターンを表す。エミッター分子の発光波長における（ペアの経時的な解離及び再会合の直接の結果である）エミッター分子からの蛍光は、経時的な蛍光強度として表すことができる（例えば、図３～５、１２、及び１３に示されるようにプロットされる）。ただし、各ペアの解離及び再会合は確率的プロセスであるため、ペアの蛍光動態プロファイルの個々の観察が、必ずしも毎回同一に見えるとは限らず、所定のペアの蛍光動態プロファイルの各個の観察が、プロットに表されたときに異なって見える場合があることは理解されよう。しかし、ペアの蛍光動態プロファイルには、それらの蛍光動態プロファイルの各個の観察の間で一貫している、認識できる特性または特徴がある。これらの一貫した特性または特徴を使用することで、ペアの蛍光動態プロファイルを記述及び／または定義することができる。これらの特性または特徴には、本明細書の他の箇所で説明されるメトリックが含まれる。
【0038】
したがって、単一の観察された蛍光動態プロファイルは、１つ以上の一貫した特性または特徴（例えば、本明細書の他の箇所で言及されるメトリックのうちの１つ以上）を参照して記述され得る。したがって、ペアの単一の観察された蛍光動態プロファイルは、必ずしもそれが観察されるたびに同一に見えるとは限らないが、所定のペアの蛍光動態プロファイルは独特であり、その一貫した特性または特徴が各セット内のペアの識別を可能にするため、各セット内のペアに特有である（または、各セット内のペアについて一意に認識できる）、またはセット群内で特有である（または、セット群内のペアについて一意に認識できる）と記述され得る。
【0039】
単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが複数のペアを形成でき、その各々が独特の蛍光動態プロファイルを生成し、各蛍光動態プロファイルが、ペアを形成したＴオリゴヌクレオチドに特異的であり、したがってそれを示すため、本件の方法は、効果的な多重化に容易に適応し、実際、そのために設計されている。観察段階では、蛍光動態プロファイルが、１つ以上のピクセルで観察され、記録され得る。蛍光動態プロファイルが観察されるところでは、蛍光動態プロファイルに基づいて、各ピクセルにアイデンティティが割り当てられ得る。これは概して、蛍光動態プロファイルの区別可能なメトリックを計算すること、そして場合により、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイルのメトリックに基づいてアイデンティティを割り当てることによって達成される。各々の異なるＴオリゴヌクレオチド－ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドペアが独自の蛍光動態プロファイルを生成するため、単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドでも、多重化が達成され得る。実際、複数の蛍光動態プロファイルを観察でき、場合により、同じスペクトルチャネルで記録できるため、単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用することは有利である。
【0040】
本発明の方法において、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、概して、異なる特異性を有する複数の結合剤を含む。例えば、異なる特異性を有する、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上または１０個以上、１１個以上、１２個以上、１３個以上、１４個以上、１５個以上、１６個以上、１７個以上、１８個以上、１９個以上、２０個以上、２１個以上、２２個以上、２３個以上、２４個以上、または２５個以上の結合剤がセット内にあってもよく、各結合剤は、Ｔオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。例えば、異なる特異性を有する、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個、最大１１個、最大１２個、最大１３個、最大１４個、最大１５個、最大１６個、最大１７個、最大１８個、最大１９個、最大２０個、最大２１個、最大２２個、最大２３個、最大２４個、最大２５個の結合剤がセット内にあってもよく、各結合剤は、Ｔオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。好適な範囲には、セット内の、異なる特異性を有する、２～２５個、３～２４個、４～２３個、５～２２個、６～２１個、７～２０個、８～１９個、９～２０個、１０～１９個、１１～１８個、１２～１７個、１３～１６個、１４～１５個の結合剤が含まれ、各結合剤は、Ｔオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされており、Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。
【0041】
使用する異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの数を増加させることにより、より多くの異なる蛍光動態プロファイルを達成することができる。これは、非常に多様な配列を有するＴオリゴヌクレオチドのセットを使用しても、所定のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（すなわち、所定の配列を有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド）について、生成できる異なる蛍光動態プロファイルの数が有限であり得るためである。本方法で使用される、各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが対応するＴオリゴヌクレオチドのセットを有する、異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの数を増加させることで、生成され得る異なる蛍光動態プロファイルの数が増加し得る。したがって、より多くの異なる結合剤を本発明の方法で使用することができ、より多くの標的分子を単一の実験で検出することができる。
【0042】
上記で説明したように、各蛍光放出（「点滅」として概念化され得る）の間の平均時間は、蛍光動態プロファイルの一成分であり、観察された蛍光動態プロファイルから導出され得るメトリックである。Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが比較的速くハイブリダイズまたは会合するとき、すなわち、２成分が互いから解離した状態にある持続時間が短い（オフ時間が短い）とき、エミッター分子の発光波長における各蛍光放出の間の短い平均時間が見られる。例えば図３では、プロファイルＢ及びＣは、プロファイルＡよりもオフ時間が短いペアを表す。Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが比較的速くハイブリダイズまたは会合するが、比較的速く解離もする場合には、高い頻度または速度の「点滅」が見られる。単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと、１セットのＴオリゴヌクレオチドとを使用して、ある特定の範囲の点滅動態プロファイルを達成することが可能であり得る。第２のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及び対応するＴオリゴヌクレオチドのセットを使用すると、第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及び対応するＴオリゴヌクレオチドのセットから生じるものとは異なる蛍光動態プロファイルを生成することが可能になり得る（例えば、それらは、第１の範囲とオーバーラップする、またはオーバーラップしない範囲を生じさせ得る）。
【0043】
容易に（例えば異なる蛍光動態プロファイルの数を増加させるために）変更できるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの一態様は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの長さである。長いオリゴヌクレオチドは、短いオリゴヌクレオチドよりもそのペアに強くハイブリダイズすることにより、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及びＴオリゴヌクレオチドが解離するのにかかる平均時間を増加させる可能性がある。これは、ペアのＫｏｆｆという観点から表すことができる（例えば、より弱くハイブリダイズするペアよりも、より強くハイブリダイズするペアについて、低下したＫｏｆｆ値が見られる）。したがって、より長いＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがより短いペアよりも、蛍光放出の平均持続時間がより長い（すなわち、オン時間がより長い）蛍光動態プロファイルを生成するペアに寄与し得る。例えば図３において、プロファイルＢは、プロファイルＡ及びＣよりもオン時間が長いペアの蛍光動態プロファイルの表現である。
【0044】
１つのより長いＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと、１つのより短いＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを有することは、増加した範囲の点滅動態プロファイルを生じさせるためのアプローチの一例にすぎない。他の例には、塩基含有量を変えることが含まれる（例えば、ＧＣリッチなＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、ＡＴリッチなオリゴヌクレオチドよりも強くそのペアにハイブリダイズする可能性を有する傾向があり、それにより、ＧＣリッチなＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及びＴオリゴヌクレオチドが解離するのにかかる平均時間を増加させる）。これは、ペアのＫｏｆｆという観点から表すことができる（例えば、より弱くハイブリダイズするペアよりも、より強くハイブリダイズするペアについて、低下したＫｏｆｆ値が見られる）。
【0045】
複数の蛍光動態プロファイルを生成する厳密な方法にかかわらず、Ｔオリゴヌクレオチドの複数のセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを作ることによって、生成され得る異なる蛍光動態プロファイルの数が増加することは理解されよう。図３は、これを簡略化した形式で示している。プロファイルＢ及びＣは、プロファイルＡよりもオフ時間が短いペアを表し、プロファイルＡ及びＣは、プロファイルＢよりもオン時間が短いペアを表す。例えばオン時間及びオフ時間の値が異なる、多数の異なる蛍光動態プロファイルが生成され得ることは理解されよう。これにより、多重化の可能性が高まる。言い換えれば、Ｔオリゴヌクレオチドの単一のセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを使用するよりも、Ｔオリゴヌクレオチドの複数のセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを使用することにより、より高度な多重化が可能である。以下でさらに詳細に説明するように、蛍光動態プロファイルから導出または計算することができる例示的で非限定的なメトリックには、（ｉ）各蛍光放出の間の平均時間（オフ時間とも呼ばれる）、（ｉｉ）蛍光放出の平均持続時間（オン時間とも呼ばれる）、及び（ｉｉｉ）蛍光放出の発生率が含まれ得る。
【0046】
上記を説明すると、所定の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１～１０）を含み得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡは、例えば、これら１０個のＴオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズし、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１～１０）を生成し得る。例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１１～２０）を含むさらなる結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢ）とを追加することにより、さらに１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１１～２０）を使用することができる。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡ及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢが、同じチャネルで観察され得る蛍光を放出する場合（例えば、それらが、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含む場合、または、それらが同じエミッター分子を含む場合）、２０個の異なる蛍光動態プロファイルのすべてが、単一のスペクトルチャネルで観察され得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡ及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢが、蛍光動態プロファイルを観察するために複数のスペクトルチャネルを必要とする蛍光を放出する場合、または、それらが異なるチャネルで観察され得る場合、もしくは異なるチャネルで最適に観察される場合（例えば、それらが、オーバーラップしない発光スペクトルを有するエミッター分子を含む場合、またはそれらが、発光最大値の異なる発光スペクトルを有するエミッター分子、もしくは異なるエミッター分子を含む場合）、蛍光動態プロファイルを観察するために、複数のスペクトルチャネルが使用され得る。
【0047】
複数のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及び対応するＴオリゴヌクレオチドが使用される場合、本明細書ではこれを、Ｔオリゴヌクレオチドのセット群を使用するという。Ｔオリゴヌクレオチドのセット群が使用される場合でも、存在する各Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。さらに、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、（ｉ）そのセット内でそのペアに特有であり、かつ（ｉｉ）該セット群内でそのペアに特有である蛍光動態プロファイルを生成する。さらに、いくつかの実施形態では、各Ｔオリゴヌクレオチドは、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドだけにハイブリダイズし、該セット群内の他のセットのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（複数可）にはハイブリダイズしない。蛍光動態プロファイル、Ｔオリゴヌクレオチド、及び結合剤の間の相関関係が維持されるように、クロスハイブリダイゼーションは避けるべきである。
【0048】
さらなるレベルの多重化は、例えば、異なるチャネルで検出され得る蛍光放出としての蛍光動態プロファイルを生成するために、異なる発光スペクトルを有するフルオロフォアを含むＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用して、蛍光動態シグナルが観察される異なるチャネルの数を増加させることによって達成され得る。このような場合、生成される蛍光動態プロファイルの各々は異なり得るが、複数のチャネルを使用することは、特定の蛍光動態プロファイルがセット群間で複製され得ることを意味する。言い換えれば、類似またはさらには同一の蛍光動態プロファイルを生成する２つ以上のペアが、異なるチャネルで観察される蛍光放出としての蛍光動態プロファイルを生成すれば、非常に類似またはさらには同一の蛍光動態プロファイルを生成するこれら２つ以上のペアを使用することができる。
【0049】
このタイプの多重化では、各Ｔオリゴヌクレオチドは依然として、それがコンジュゲートされている結合剤に特有の異なる配列を有し、セット内の異なる各ペアは、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成するが、異なるチャネルで検出され得る蛍光放出としての蛍光動態プロファイルを生成するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用すると、多重化の可能性がさらに向上する。
【0050】
上記を説明すると、所定の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１～１０）を含み得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡ（例えば、「赤」の蛍光を発する）は、例えば、これら１０個のＴオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズし、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１～１０）を生成し得る。例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１１～２０）を含むさらなる結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢ（例えば、同じく「赤」の蛍光を発する））とを追加することにより、さらに１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１１～２０）を使用することができる。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡ及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢは、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含むため（例えば、それらが同じエミッター分子を含む場合）、それらの蛍光を同じチャネル（ここでは「赤」という）で観察することができ、それゆえ、２０個の異なる蛍光動態プロファイルのすべてを単一のチャネルで観察することができる。ここで、Ｔオリゴヌクレオチド１～１０を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは１セットであり、Ｔオリゴヌクレオチド１１～２０を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは第２のセットであり、したがって、Ｔオリゴヌクレオチド１～２０を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは「セット群」である。
【0051】
さらなる結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群を使用してもよく、例えば、さらなる結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド２１～３０）を含み得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣ（例えば、「緑」の蛍光を発する）は、例えば、これら１０個のＴオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズし、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル２１～３０）を生成し得る。例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド３１～４０）を含むさらなる結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＤ（例えば、同じく「緑」の蛍光を発する））とは、さらに１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル３１～４０）を生成し得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣ及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＤは、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含むため（例えば、それらは同じエミッター分子を含む）、それらの蛍光を同じチャネル（ここでは「緑」という）で観察することができ、したがって、２０個の異なる蛍光動態プロファイルのすべてを単一のチャネルで観察することができる。ここで、Ｔオリゴヌクレオチド２１～３０を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは１セットであり、Ｔオリゴヌクレオチド３１～４０を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは第２のセットであり、したがって、Ｔオリゴヌクレオチド２１～４０を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは「セット群」である。
【0052】
したがって、この例では、これら２つのセット群（すなわち「複数のセット群」）を多重化蛍光顕微鏡検査法において一緒に使用することができ、ここでは４０個の結合剤が使用され得る。各結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている結合剤に特有の配列を有するＴオリゴヌクレオチドを含む。さらに、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、（ｉ）各セット内でそのペアに特有であり、かつ（ｉｉ）各セット群内でそのペアに特有である蛍光動態プロファイルを生成する。異なる各ペアの間の解離及び再会合は、同じく複数のセット群内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成し得るが、２つの蛍光動態プロファイルが、異なるエミッター分子（例えば、異なるチャネルで観察され得る、異なる蛍光発光スペクトルなどの発光スペクトルを有するエミッター分子）を有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドによって生成される場合、２つの類似または同一の蛍光動態プロファイルが使用され得るため、これは必須ではない。
【0053】
したがって、上記の理論上の例では、４０個の異なる蛍光動態プロファイルを生成するようにオリゴヌクレオチドが設計され得る。例えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡ及び１つのＴオリゴヌクレオチド、ならびにＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣ及び別のＴオリゴヌクレオチドを使用するペアが、両方とも類似または同一の蛍光動態プロファイルを生じさせる場合、４０個より少ない異なる蛍光動態プロファイルを生成するオリゴヌクレオチドを使用することができる。これは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡを使用して取得される蛍光動態プロファイルと、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＣを使用して取得されるものとが、異なるチャネルで検出されるためである。
【0054】
したがって、上記は、本発明を使用した場合にさらなる多重化がどのように達成され得るかを示す。厳密に上記のとおりに多重化を構築する必要はない。例えば、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットを使用することが可能であり、ここで、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルは、そのセットに特異的なチャネルで検出することができ、サンプルの蛍光動態プロファイルを観察するステップは、各セットに対するチャネルでサンプルの蛍光動態プロファイルを観察することを含む。
【0055】
例えば、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセットは、例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１～１０）を含み得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＡ（赤）は、例えば、これら１０個のＴオリゴヌクレオチドに可逆的にハイブリダイズし、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１～１０）を生成し得る。例えば、１０個のＴオリゴヌクレオチド（Ｔオリゴヌクレオチド１１～２０）を含む結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットと、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＢ（緑））は、１０個の異なる蛍光動態プロファイル（プロファイル１１～２０）を生成する。各結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている結合剤に特有の配列を有するＴオリゴヌクレオチドを含む。異なる各ペアの間の解離及び再会合は、各セット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する。蛍光動態プロファイルは、複数のセット内でそのペアに特有であり得るが、必ずしもそうとは限らない。異なる各ペアの間の解離及び再会合は、同じく複数のセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成し得るが、２つの蛍光動態プロファイルが、異なるエミッター分子（例えば、異なるチャネルで観察され得る、蛍光発光スペクトルなどの発光スペクトルを有するエミッター分子）を有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドによって生成される場合、２つの類似または同一の蛍光動態プロファイルが使用され得るため、これは必須ではない。
【0056】
別の例では、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、１つまたは複数のセットを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、１つまたは複数のセット群と共に使用する。言い換えれば、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのある（例えば１つの）セットを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのある（例えば１つの）セット群と共に使用してもよい（ここで、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルは、その群に特異的なチャネルで検出され得る）。結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのある（例えば１つの）セットを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセット群と共に使用してもよい（ここで、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルは、その群に特異的なチャネルで検出され得る）。結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、複数のセットを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのある（例えば１つの）セット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、その群に特異的なチャネルで検出され得る、セット群と共に使用してもよい。結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、複数のセットを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、その群に特異的なチャネルで検出され得る、複数のセット群と共に使用してもよい。
【0057】
本発明に従って多重化がどのように達成され得るかについての特定の例には、表１にまとめられたものが含まれる。
【表1-1】
【表1-2】
【0058】
サンプル
サンプルは、概して、１つ以上の細胞（例えば、細胞の集団）を含むか、または細胞もしくは細胞の集団からの細胞溶解物を含み得る。サンプルは、原核細胞または真核細胞、例えば動物、植物、酵母、細菌、または他の細胞を含み得る。細胞は動物細胞であることが好ましい。それらは動物由来であり得、特に哺乳動物由来であり得る。それらは初代細胞でもよく、または哺乳動物細胞株などの細胞株である細胞でもよい。サンプルは、疾患の動物モデルまたは疾患を有するヒトもしくは動物患者に由来する細胞を含み得る。サンプルは、例えば動物（好ましくはヒトまたはマウスもしくはラットなどの実験動物のような哺乳動物）由来の生物学的サンプルでもよく、サンプルは、例えば血液、痰、リンパ液、粘液、糞便、尿などでもよい。サンプルは、組織切片などの組織サンプルでもよい。サンプルは、水サンプル、空気サンプル、食品サンプルなどの環境サンプルでもよい。
サンプルは、概して、１つ以上の細胞（例えば、細胞の集団）を含むか、または細胞もしくは細胞の集団からの細胞溶解物を含み得る。サンプルは、原核細胞または真核細胞、例えば動物、植物、酵母、細菌、または他の細胞を含み得る。細胞は動物細胞であることが好ましい。それらは動物由来であり得、特に哺乳動物由来であり得る。それらは初代細胞でもよく、または哺乳動物細胞株などの細胞株である細胞でもよい。サンプルは、疾患の動物モデルまたは疾患を有するヒトもしくは動物患者に由来する細胞を含み得る。サンプルは、例えば動物（好ましくはヒトまたはマウスもしくはラットなどの実験動物のような哺乳動物）由来の生物学的サンプルでもよく、サンプルは、例えば血液、痰、リンパ液、粘液、糞便、尿などでもよい。サンプルは、組織切片などの組織サンプルでもよい。サンプルは、水サンプル、空気サンプル、食品サンプルなどの環境サンプルでもよい。
【0059】
サンプルの固定
本発明の方法は、化学的に固定されたサンプルであり得る固定サンプルに対して行われる。蛍光顕微鏡検査用のサンプルの固定はよく知られており、サンプルを保存するために（例えば、生存時の状態に構造的に近い状態で細胞の形態を維持するために）行われる。切除組織を使用する場合、固定により、その自己溶解及び壊死も防止できる。また、抗原性を保存し、本方法で使用される成分が細胞の内部部分により容易にアクセスできるようにすることもできる。
本発明の方法は、化学的に固定されたサンプルであり得る固定サンプルに対して行われる。蛍光顕微鏡検査用のサンプルの固定はよく知られており、サンプルを保存するために（例えば、生存時の状態に構造的に近い状態で細胞の形態を維持するために）行われる。切除組織を使用する場合、固定により、その自己溶解及び壊死も防止できる。また、抗原性を保存し、本方法で使用される成分が細胞の内部部分により容易にアクセスできるようにすることもできる。
【0060】
本発明の方法は、例えばサンプルを保存するために、サンプルを固定する１つ以上のステップをさらに含み得る。これは、本明細書に記載される方法のステップａ）の前に行われ得る。固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、サンプル中に存在する任意の結合パートナーと結合剤を結合させた後、かつ、サンプル及びステップａ）の結果として結合した任意の結合剤をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させる前に、さらなる任意選択の固定ステップを行ってもよい。本方法のこの段階でさらなる固定ステップを行うことは、サンプル上で結合した結合剤をさらに固定化するために有利である。結合剤は、例えば静電結合を使用してその標的分子に結合し得るが、固定を行うと、サンプルのさらなる処理ステップが向上し得る。この向上は、固定によって、サンプル中の結合した結合剤と標的分子との間により強い結合が作り出され得ること、例えば、サンプル中の結合した結合剤と標的分子とが共有結合で架橋されるということの結果として生じ得る。
【0061】
化学的固定などの固定は、当技術分野でよく知られている。
【0062】
化学的固定を行うための好適な方法の例としては、例えば、アルデヒドに基づくものなどの架橋固定剤（例えば、サンプル中のタンパク質間に共有結合性化学結合を作り出すため）、または酸化架橋固定剤の使用が挙げられる。アルデヒドに基づく固定剤の例としては、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール、パラホルムアルデヒドが挙げられる。酸化架橋固定剤は、例えば四酸化オスミウム、クロム酸、重クロム酸カリウム、過マンガン酸カリウムである。あるいは、沈殿固定剤、例えばアセトン、エタノール、メタノールを使用してもよい。代替的な薬剤には、Ｈｅｐｅｓ－グルタミン酸バッファー媒介有機溶媒保護効果（ＨＯＰＥ）固定剤、Ｂ－５及びツェンカー固定剤などの水銀剤、ならびにピクリン酸塩が含まれる。好ましくは、アルデヒド架橋固定剤が使用される。
【0063】
サンプルの透過処理
サンプルの透過処理を行ってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、本方法で使用される分子が細胞の内部にアクセスできるようにするために、サンプルを透過処理する１つ以上のステップを含む。これは、本明細書に記載される方法のステップａ）の前、かつ任意の固定ステップの前、その後、またはそれと同時に行われ得る。好適な透過処理剤及びプロトコルは、当技術分野で公知であり、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ及びＴｗｅｅｎ－２０などの薬剤の使用を含む。好適なプロトコルは、例えば、Ｊａｍｕｒ Ｍ．Ｃ．，Ｏｌｉｖｅｒ Ｃ．（（２０１０）Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｉｎ：Ｏｌｉｖｅｒ Ｃ．，Ｊａｍｕｒ Ｍ．（ｅｄｓ）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ｖｏｌ ５８８． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているか、またはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｐｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｆｉｘａｔｉｏｎ＿ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ｐｄｆに記載されているとおりである。
サンプルの透過処理を行ってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、例えば、本方法で使用される分子が細胞の内部にアクセスできるようにするために、サンプルを透過処理する１つ以上のステップを含む。これは、本明細書に記載される方法のステップａ）の前、かつ任意の固定ステップの前、その後、またはそれと同時に行われ得る。好適な透過処理剤及びプロトコルは、当技術分野で公知であり、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ及びＴｗｅｅｎ－２０などの薬剤の使用を含む。好適なプロトコルは、例えば、Ｊａｍｕｒ Ｍ．Ｃ．，Ｏｌｉｖｅｒ Ｃ．（（２０１０）Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ． Ｉｎ：Ｏｌｉｖｅｒ Ｃ．，Ｊａｍｕｒ Ｍ．（ｅｄｓ）Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ），ｖｏｌ ５８８． Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ）に記載されているか、またはｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ／ｐｓ／ｐｄｆ／ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ／ｆｉｘａｔｉｏｎ＿ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．ｐｄｆに記載されているとおりである。
【0064】
さらなるサンプル処理
ステップａ）では、固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、サンプル中に存在する任意の結合パートナーと結合剤を結合させる。概して、サンプルは固定され、したがって、蛍光顕微鏡検査のための任意の好適な時点で、固体支持体に付着する。接触ステップは、サンプル中に存在する任意の結合パートナーに結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットが結合することを可能にする任意の適切な様式で行われ得る。これは概して、サンプルが付着する固体支持体に、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを含む溶液を適用することによる。結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば５～５０ｕｇ／ｍｌ（または１～５００、２～２５０ｕｇ／ｍｌ）の濃度で溶液中に存在し得る。
ステップａ）では、固定サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットと接触させて、サンプル中に存在する任意の結合パートナーと結合剤を結合させる。概して、サンプルは固定され、したがって、蛍光顕微鏡検査のための任意の好適な時点で、固体支持体に付着する。接触ステップは、サンプル中に存在する任意の結合パートナーに結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットが結合することを可能にする任意の適切な様式で行われ得る。これは概して、サンプルが付着する固体支持体に、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを含む溶液を適用することによる。結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、例えば５～５０ｕｇ／ｍｌ（または１～５００、２～２５０ｕｇ／ｍｌ）の濃度で溶液中に存在し得る。
【0065】
好適な条件には、例えば、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲート及びＢＳＡまたはサケ精子ＤＮＡなどのブロッキング試薬を含む緩衝液中、約４℃、または約１５～２５℃でのインキュベーションが含まれる。
【0066】
接触させることは、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを任意の結合パートナーに結合させるために、任意の適切な長さの時間にわたって継続し得る。例示的な期間には、１０分から２時間、例えば３０分から１時間が含まれる。
【0067】
本明細書に記載される本方法の利点は、洗浄ステップが必要なく、例えば上記で説明したＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ法と比較すると、バックグラウンド蛍光レベルが概して高くないことである。これは、質の良いデータを取得するために、非結合状態の成分を除去する洗浄ステップが概して必要とされないことを意味する。しかし、ステップａの後に、非結合状態の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートを除去するステップを行ってもよい。これは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが非結合状態の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートに結合する場合があり、それによってバックグラウンド蛍光が生じ得ることから、バックグラウンド蛍光レベルをさらに低下させるために行われ得る。
【0068】
洗浄ステップは、例えば、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含む溶液を除去し、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含まない液体、例えば適切なバッファーの１回以上の交換でこれを置き換えることによって行われ得る。
【0069】
サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させるステップは、ステップａの直後、または１つ以上の洗浄ステップの後に行われ得る。接触ステップは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１つ以上のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることを可能にする任意の適切な様式で行われ得る。このようにして、複数のペアが形成される。これは概して、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを含む溶液を、サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤に適用することによって行われる。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、例えば１ｐＭ～１ｕＭ（または１０ｐＭ～５００ｎＭ、２０ｐＭ～２５０ｎＭ、５０ｐＭ～１００ｎＭ、１００ｐＭ～５０ｎＭ、２００ｐＭ～２５ｎＭ、５００ｐＭ～１ｎＭ）の濃度で溶液中に存在し得る。
【0070】
エミッター分子の励起を引き起こす波長でサンプルを照射するステップ、及びサンプルの動態蛍光プロファイルを１つ以上のピクセルで経時的に観察するステップは、概して、サンプルがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触してから行われる。したがって、照射及び観察ステップは、サンプルがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触している間に行われ、サンプルがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触している限り、または蛍光動態プロファイルをキャプチャし、場合により記録するために好適な期間にわたって継続し得る。
【0071】
オリゴヌクレオチド
ＴオリゴヌクレオチドまたはＦＲＥＴオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、連結された単位を含む線状ポリマー分子であり、その単位は核酸塩基またはその機能的均等物を含む。核酸塩基は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、７－メチルグアノシン（好ましくは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルから選択される）などの天然に発生する核酸塩基、及びそれらの誘導体、またはイソシトシン、イソグアニンなどの天然に発生しない核酸塩基であり得る。核酸塩基を含む単位は、ヌクレオシド（核酸塩基及び糖基、例えば五炭糖、好ましくはリボースまたはデオキシリボース）でもよいが、好ましくはヌクレオチド（ヌクレオシド及びリン酸）である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの単量体単位であり、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含むことが好ましい。
ＴオリゴヌクレオチドまたはＦＲＥＴオリゴヌクレオチドなどのオリゴヌクレオチドは、連結された単位を含む線状ポリマー分子であり、その単位は核酸塩基またはその機能的均等物を含む。核酸塩基は、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、ウラシル、イノシン、シュードウリジン、ジヒドロウリジン、７－メチルグアノシン（好ましくは、アデニン、チミン、グアニン、シトシン、及びウラシルから選択される）などの天然に発生する核酸塩基、及びそれらの誘導体、またはイソシトシン、イソグアニンなどの天然に発生しない核酸塩基であり得る。核酸塩基を含む単位は、ヌクレオシド（核酸塩基及び糖基、例えば五炭糖、好ましくはリボースまたはデオキシリボース）でもよいが、好ましくはヌクレオチド（ヌクレオシド及びリン酸）である。ヌクレオチドは、ＤＮＡ及びＲＮＡの単量体単位であり、本発明の方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド、例えばデオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはそれらの類似体を含むことが好ましい。
【0072】
好ましくは、オリゴヌクレオチドは蛍光核酸塩基を含まない。好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドはＤＮＡであるか、またはＤＮＡを含む。
【0073】
オリゴヌクレオチドのよく知られている例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸様構造であるか、またはそれらを含むものが挙げられる。それらは、リン酸－糖骨格、または非リン酸－糖部分（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）及びモルホリノ）を含む骨格を有し得る。リン酸－糖骨格類似体には、ＰＮＡ、モルホリノ及びロックド核酸（ＬＮＡ）、ならびにグリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）及びヘキシトール核酸（ＨＮＡ）が含まれる。これらは各々、分子の骨格に対する変化により、天然に存在するＤＮＡまたはＲＮＡから区別される。
【0074】
本発明は、一本鎖分子としてのオリゴヌクレオチドが、相補的または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズして、二本鎖ペアを形成する能力を利用する。２つの完全に相補的または部分的に相補的なオリゴヌクレオチドは、当技術分野でよく知られているように、相補的塩基ペアリングに基づいて互いに結合して二本鎖分子を形成することができる。
【0075】
本発明の方法において、Ｔオリゴヌクレオチド及びそれらの対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、概して部分的にのみ相補的である配列を有するように設計され、その結果、Ｔオリゴヌクレオチドとそれらの対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの間に形成されるオリゴヌクレオチドペアは、一時的にのみ二本鎖形態になる。各ペアは、一定期間にわたって会合及び解離のプロセスを受ける。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは蛍光エミッター分子及び消光体を含むため、ハイブリダイゼーションの一時的な性質が蛍光動態プロファイルに反映される。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき、消光体が蛍光エミッター分子に近接しているということは、適切な波長の光を照射した際に、エミッター分子から放出された蛍光が消光体によって消光され、エミッター分子の発光波長では検出されないことを意味する。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすると、それによってＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの構造が拘束されて、消光体及び蛍光エミッター分子が物理的に分離され、その結果、適切な波長の光を照射した際に、エミッター分子から放出された蛍光が消光体によって消光されず、エミッター分子の発光波長で観察できるようになる。したがって、各ペアの２つのメンバー間の会合は、エミッター分子の発光波長での蛍光に関連し、解離は、エミッター分子の発光波長での蛍光の非存在に関連する。
【0076】
Ｔオリゴヌクレオチドの各セットにおいて、セットのメンバーは、異なる配列を有し、それらの配列に依存する様式で、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと解離及び再会合する。したがって、各ペアの２つのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション動態により、観察され得る蛍光動態プロファイルが決まる。
【0077】
オリゴヌクレオチドは、その相補的または部分的に相補的なペアに結合していないとき、一本鎖である場合があり、安定な二次構造を持たない場合がある。好ましい実施形態において、本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドは、一本鎖形態では、ヘアピンループなどの安定な二次構造を形成しない。これは、本発明における利点を提供する。なぜなら、そのような安定な二次構造を形成しないオリゴヌクレオチドは、より容易に、したがってより迅速にペアを形成することができ、イメージングにより適したものとなるからである。
【0078】
Ｔオリゴヌクレオチド
Ｔオリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている結合剤に特異的な配列を有する。また、Ｔオリゴヌクレオチドは、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である。オリゴヌクレオチドの配列は、それを構成する単位の性質及び順序によって決定される。その配列を定義するには（例えば、分子の塩基配列に関して）、標準的な用語が使用され得る。
Ｔオリゴヌクレオチドは、それがコンジュゲートされている結合剤に特異的な配列を有する。また、Ｔオリゴヌクレオチドは、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能である。オリゴヌクレオチドの配列は、それを構成する単位の性質及び順序によって決定される。その配列を定義するには（例えば、分子の塩基配列に関して）、標準的な用語が使用され得る。
【0079】
Ｔオリゴヌクレオチドは、概して、８～３５ヌクレオチドまたは均等な単位の長さであり、１ヌクレオチド単位は、標準的なＤＮＡヌクレオチド単位のサイズである。あるいは、Ｔオリゴヌクレオチドは、９～３０、１０～２９、１１～２８、１２～２７、１３～２６、１４～２５、１５～２４、１６～２３、１７～２２、１８～２１、または１０～１９、１１～１８、１２～１７、１３～１８、１４～１７、１５～１６ヌクレオチド単位の長さ（例えば、最大３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、または少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４ヌクレオチド単位の長さ）でもよい。
【0080】
Ｔオリゴヌクレオチドは、概して、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることが可能であり、概して、セット内の他のＴオリゴヌクレオチド、または使用される場合にはセット群内の他のＴオリゴヌクレオチドにはハイブリダイズしない。概して、各Ｔオリゴヌクレオチドは、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズし、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド以外の、本方法で使用されるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにはハイブリダイズしない。
【0081】
Ｔオリゴヌクレオチド及びその対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、相補的なヌクレオチドまたはその機能的均等物を含む。２本のオリゴヌクレオチド鎖に相補的塩基が存在する場合、相補的塩基間に水素結合が発生し得る。ハイブリダイゼーションは、２本のオリゴヌクレオチド鎖間の非共有結合性で配列特異的な相互作用であり、２本の鎖の単一複合体を形成する。
【0082】
１つ以上のミスマッチを有する２つの相補鎖も互いに結合し得るが、ミスマッチによってそれらの間の結合がさほどエネルギー的に好都合でなくなるため、さほど容易には結合しない。結合特性に対する変化は、少なくとも、（ｉ）オリゴヌクレオチドの（例えば、オーバーラップ領域にわたる）長さ、（ｉｉ）配列の組成、（ｉｉ）相補性の（例えば、オーバーラップ領域にわたる）程度、（ｉｉｉ）２本の鎖におけるミスマッチの位置（隣接するミスマッチは、一般に、隣接しないミスマッチよりも、２本の鎖の間の相互作用の安定性に大きな影響を及ぼす）、（ｉｖ）相補的ペアの性質（例えば、核酸塩基Ａ＝Ｔのペアは、Ｇ≡Ｃペアよりも不安定な結合を形成する）に依存する。
【0083】
本明細書の他の箇所で説明するように、Ｔオリゴヌクレオチドは概して、８～３５または９～２０オリゴヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子のフェルスター半径を超える長さ、及び／または（ｉｉ）少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである。
【0084】
一般に、２つのオリゴヌクレオチドがハイブリダイズする強さは、２本の鎖の間の相補性の程度（すなわち、各オリゴヌクレオチドの全長と比較して、または配列が同じ長さでない場合は２つのオリゴヌクレオチド間のオーバーラップの長さと比較して、相補的である塩基の数）にも依存する。ハイブリダイゼーションが起こるには、ある程度の配列相補性が必要である。
【0085】
概して、Ｔオリゴヌクレオチドと、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの間には、そのようなペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数と比較して、０～４０％、１０～４０％、または２０～４０％の範囲のミスマッチがある。Ｔオリゴヌクレオチドは概して、８～３５ヌクレオチド単位の長さであり、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは概して、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子のフェルスター半径を超える長さであり、及び／または（ｉｉ）少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである。ミスマッチのパーセンテージは、２つのオリゴヌクレオチドが常に同じ長さであるとは限らないことを考慮して、形成され得る塩基ペアの最大数と比較したミスマッチのパーセンテージとして定義される。言い換えれば、Ｔオリゴヌクレオチドが１０ヌクレオチド単位の長さであり、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１５ヌクレオチド単位の長さである場合、このペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数は１０であり、したがって、このペアにおける０～４０％のミスマッチは、オーバーラップする１０ヌクレオチド単位の区間における０～４個のミスマッチに相当し、このペアにおける２０～４０％のミスマッチは、オーバーラップする１０ヌクレオチド単位の区間における２～４個のミスマッチに相当する。これは、以下の表に示されており、この表では、各ペアについて、２０～４０％のミスマッチをもたらすミスマッチの例示的な数が、各ペアで形成され得る塩基ペアの最大数（括弧内に示される）と共に示されている。Ｔオリゴヌクレオチドが１２ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドも１２ヌクレオチド単位の長さである別の例では、このペアで形成され得る塩基ペアの最大数は１２であり、この２０～４０％に相当するミスマッチの数は２～４である。
【0086】
Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの特定の好ましい組み合わせについて２０～４０％に相当するミスマッチの数を以下の表２に示す。
【表2】
【0087】
したがって、概して、Ｔオリゴヌクレオチドは、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの、１～８、２～７、３～６個のミスマッチ、例えば１～３、２～４、２～５、３～６、４～８個のミスマッチを有する。
【0088】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が９である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが９ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである場合）、１～３個のミスマッチが存在し得る。
【0089】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１０である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである場合）、２～４個のミスマッチが存在し得る。
【0090】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１１である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである場合）、２～４個のミスマッチが存在し得る。
【0091】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１２である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１２ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１３～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１２ヌクレオチド単位の長さである場合）、２～４個のミスマッチが存在し得る。
【0092】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１３である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１３ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１３ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１４～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１３ヌクレオチド単位の長さである場合）、２～５個のミスマッチが存在し得る。
【0093】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１４である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１４ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１４ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１５～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１４ヌクレオチド単位の長さである場合）、２～５個のミスマッチが存在し得る。
【0094】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１５である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１５ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１５ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１６～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１５ヌクレオチド単位の長さである場合）、３～６個のミスマッチが存在し得る。
【0095】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１６である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１６ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１７～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１６ヌクレオチド単位の長さである場合）、３～６個のミスマッチが存在し得る。
【0096】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１７である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１７ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１７ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１８～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１７ヌクレオチド単位の長さである場合）、３～６個のミスマッチが存在し得る。
【0097】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１８である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１８ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１８ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが１９～２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１８ヌクレオチド単位の長さである場合）、３～７個のミスマッチが存在し得る。
【0098】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が１９である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが１９ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも１９ヌクレオチド単位の長さである場合、または、Ｔオリゴヌクレオチドが２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１９ヌクレオチド単位の長さである場合）、３～７個のミスマッチが存在し得る。
【0099】
ペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数が２０である場合（例えば、Ｔオリゴヌクレオチドが２０ヌクレオチド単位の長さであり、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが少なくとも２０ヌクレオチド単位の長さである場合）、４～８個のミスマッチが存在し得る。
【0100】
ミスマッチは、２本の鎖上の塩基間に塩基ペアが生じないところで起こり得る。これは、ＴオリゴヌクレオチドまたはＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにおいて適切な位置に相補的塩基が存在しないためであり得る。非相補的塩基ペアは、天然に発生する塩基（例えばＡ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）を含むか、またはそれらからなり得る。天然に発生する非相補的塩基ペアの例には、Ａ－Ｇ、Ｇ－Ａ、Ａ－Ｃ、Ｃ－Ａ、Ａ－Ａ、Ｔ－Ｔ、Ｔ－Ｇ、Ｇ－Ｔ、Ｔ－Ｃ、Ｃ－Ｔ、Ｃ－Ｃ、Ｇ－Ｇ、Ｕ－Ｕ、Ｕ－Ｇ、Ｇ－Ｕ、Ｕ－Ｃ、Ｃ－Ｕペアが含まれる。他の塩基の存在（例えば、天然に発生しない塩基または修飾された塩基）も、ミスマッチを生じさせ得る。
【0101】
位置（または、複数のミスマッチがある場合は相対的位置）も、オリゴヌクレオチドペアの安定性に寄与する。２つ以上の隣接するミスマッチの存在は、隣接しない（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている）２つのミスマッチよりも大きな程度でハイブリダイゼーションに影響を与える傾向がある。したがって、本発明に従って使用されるＴオリゴヌクレオチドは、２つ以上の隣接するミスマッチ、例えば３つ以上、または４つ以上、または５つ以上の隣接するミスマッチを生じさせる配列を有し得る。したがって、本発明に従って使用される他のＴオリゴヌクレオチドは、隣接しない（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている）２つのミスマッチ、または隣接しない（例えば、ミスマッチのすべてのペアが、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている）少なくとも３つのミスマッチを生じさせる配列を有し得る。本発明に従って使用されるさらなるＴオリゴヌクレオチドは、隣接するミスマッチと、隣接しないミスマッチとの混合物を生じさせる配列を有し得る。
【0102】
Ｔオリゴヌクレオチドの末端の方、例えばＴオリゴヌクレオチドの末端の５、４、３、２ヌクレオチド単位以内のミスマッチにＧまたはＣ塩基が含まれると、ハイブリダイゼーションがさらに妨げられる。したがって、本発明に従って使用されるＴオリゴヌクレオチドは、Ｔオリゴヌクレオチドの末端の方、例えばＴオリゴヌクレオチドの末端の５、４、３、２ヌクレオチド単位以内に位置する１つ以上のミスマッチを生じさせる配列を有し得る。好ましくは、各ミスマッチペアにおけるミスマッチ塩基のうちの１つは、ＧもしくはＣまたはその機能的均等物である（例えば、ＧまたはＣが、ミスマッチが存在するようなこの位置でＴオリゴヌクレオチドまたは対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに存在し得る）。
【0103】
柔軟な突出部を作り出す、または新しい構造的コンフォメーションを生成するミスマッチを含めると、ハイブリダイゼーションがさらに妨げられる。ミスマッチの導入は、モノヌクレオチドリピートを生成する場合もある。モノヌクレオチドリピートは単一ヌクレオチドのリピートであり、したがって、例えば、ミスマッチにおける少なくとも１つのヌクレオチドがモノヌクレオチドリピートの一部である１つ以上のミスマッチ（例えば、リピートが少なくとも２、３、４、５、６ヌクレオチドである場合）が使用され得る。ミスマッチの導入は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに影響を与え得る二次構造も生成し得る（例えば、少なくとも２、３、４、５ヌクレオチド単位の長さのＴオリゴヌクレオチドにおけるヘアピン構造の形成など）。
【0104】
上記を考慮すると、本発明に従って使用される任意の個々のＴオリゴヌクレオチドは、上記の特性のうちの１つ以上を有し得る：
（ｉ）そのようなペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数と比較した、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの０～４０％、１０～４０％、または２０～４０％のミスマッチ、
（ｉｉ）２つ以上の隣接するミスマッチ（例えば３つ以上、または４つ以上、または５つ以上の隣接するミスマッチ）、
（ｉｉｉ）２つ以上の隣接しないミスマッチ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている、または、２つを超える隣接しないミスマッチがある場合、ミスマッチの各ペアは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている）、
（ｉｖ）Ｔオリゴヌクレオチドの末端の５、４、３、２ヌクレオチド単位以内に位置する１つ以上のミスマッチ［場合により、各ミスマッチペアにおけるミスマッチ塩基のうちの１つは、ＧもしくはＣまたはその機能的均等物である（例えば、ＧまたはＣが、ミスマッチが存在するようなこの位置でＴオリゴヌクレオチドまたは対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに存在し得る）］、
（ｖ）柔軟な突出部を作り出す１つ以上のミスマッチ、
（ｖｉ）新しい構造的コンフォメーションを生成する１つ以上のミスマッチ、
（ｖｉｉ）ミスマッチにおける少なくとも１つのヌクレオチドがモノヌクレオチドリピートの一部である１つ以上のミスマッチ（例えば、リピートが少なくとも２、３、４、５、６ヌクレオチドである場合）、
（ｖｉｉｉ）ミスマッチにおける少なくとも１つのヌクレオチドがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに影響を与え得る二次構造の一部を形成する１つ以上のミスマッチ（例えば、少なくとも２、３、４、５ヌクレオチド単位の長さのＴオリゴヌクレオチドにおけるヘアピン構造の形成など）。
（ｉ）そのようなペアにおいて形成され得る塩基ペアの最大数と比較した、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの０～４０％、１０～４０％、または２０～４０％のミスマッチ、
（ｉｉ）２つ以上の隣接するミスマッチ（例えば３つ以上、または４つ以上、または５つ以上の隣接するミスマッチ）、
（ｉｉｉ）２つ以上の隣接しないミスマッチ（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている、または、２つを超える隣接しないミスマッチがある場合、ミスマッチの各ペアは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９つの相補的塩基ペアによって隔てられている）、
（ｉｖ）Ｔオリゴヌクレオチドの末端の５、４、３、２ヌクレオチド単位以内に位置する１つ以上のミスマッチ［場合により、各ミスマッチペアにおけるミスマッチ塩基のうちの１つは、ＧもしくはＣまたはその機能的均等物である（例えば、ＧまたはＣが、ミスマッチが存在するようなこの位置でＴオリゴヌクレオチドまたは対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに存在し得る）］、
（ｖ）柔軟な突出部を作り出す１つ以上のミスマッチ、
（ｖｉ）新しい構造的コンフォメーションを生成する１つ以上のミスマッチ、
（ｖｉｉ）ミスマッチにおける少なくとも１つのヌクレオチドがモノヌクレオチドリピートの一部である１つ以上のミスマッチ（例えば、リピートが少なくとも２、３、４、５、６ヌクレオチドである場合）、
（ｖｉｉｉ）ミスマッチにおける少なくとも１つのヌクレオチドがＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションに影響を与え得る二次構造の一部を形成する１つ以上のミスマッチ（例えば、少なくとも２、３、４、５ヌクレオチド単位の長さのＴオリゴヌクレオチドにおけるヘアピン構造の形成など）。
【0105】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット
本発明による方法では、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットが使用される。セットでは、複数の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートが使用される。本方法は、各蛍光動態プロファイルが特定のＴオリゴヌクレオチドの存在に起因する異なる蛍光動態プロファイルを生成する能力を前提としているため、各セットを構成する異なるＴオリゴヌクレオチドの選択は、複数の蛍光動態プロファイルが生成されるようなやり方で行われなければならない。
本発明による方法では、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットが使用される。セットでは、複数の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートが使用される。本方法は、各蛍光動態プロファイルが特定のＴオリゴヌクレオチドの存在に起因する異なる蛍光動態プロファイルを生成する能力を前提としているため、各セットを構成する異なるＴオリゴヌクレオチドの選択は、複数の蛍光動態プロファイルが生成されるようなやり方で行われなければならない。
【0106】
Ｔオリゴヌクレオチドの各セットには、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがある。各セット内のＴオリゴヌクレオチドは、各Ｔオリゴヌクレオチド及びその対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの会合及び解離の結果として異なる蛍光動態プロファイルが生じるように選択される。結合剤Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セットは、２つ以上の異なるＴオリゴヌクレオチドを含み、Ｔオリゴヌクレオチドの構造的特徴（例えば配列）により、そのペアの蛍光動態プロファイルが決まる。したがって、セットは、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの会合及び解離の結果として異なる蛍光動態プロファイルを生じさせるＴオリゴヌクレオチドを含む。
【0107】
例えば、所定のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドについて、Ｔオリゴヌクレオチドのセットの１つのメンバーは、比較的速く、例えば１秒に１５回の点滅事象の頻度で会合及び解離するペアを生じさせる場合があり、Ｔオリゴヌクレオチドのセットの別のメンバーは、より遅く、例えば１秒に５回の点滅事象の頻度で会合及び解離するペアを生じさせる場合がある。概して、ミスマッチの数が多いオリゴヌクレオチドペアは、ミスマッチの数が少ないペアよりも高い頻度の点滅事象を有することになる。概して、完全に相補的なオーバーラップ領域を有する２つのペアを比較すると、より長いオーバーラップ領域を有するペアは、より短いオーバーラップ領域を有するペアよりも長いオフ時間及び長いオン時間を有する。
【0108】
本明細書の他の箇所で言及されるように、本明細書で定義されるセットは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、例えば１～２５、２～２４、３～２３、４～２２、５～２１、６～２０、７～１９、８～１８、９～１７、１０～１６、１１～１５、１２～１４個の結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートを含み得る。
【0109】
Ｔオリゴヌクレオチドは、概して、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのみにハイブリダイズし、他のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドまたは他のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることはない。
【0110】
好ましいＴオリゴヌクレオチドのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる：
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号１（５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）及び
配列番号２（５’－ＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）の一方または両方、
ならびに
ｏ配列番号７（５’－ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号３（５’－ＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＴ－３’）、
配列番号４（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴ－３’）、
配列番号５（５’－ＧＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴ－３’）及び
配列番号６（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、列挙されたＴオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２、３、または４つすべて）、
ならびに
ｏ配列番号８（５’－ＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号１（５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）及び
配列番号２（５’－ＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）の一方または両方、
ならびに
ｏ配列番号７（５’－ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号３（５’－ＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＴ－３’）、
配列番号４（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴ－３’）、
配列番号５（５’－ＧＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴ－３’）及び
配列番号６（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、列挙されたＴオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２、３、または４つすべて）、
ならびに
ｏ配列番号８（５’－ＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
【0111】
上記の２つのセットは、例えば、２つのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含み、場合により同じエミッター分子を有する場合、セット群として一緒に使用され得る。
【0112】
結合剤及び標的分子
結合剤は、結合パートナーまたは目的の標的分子に結合できる、例えば目的の標的分子に直接的または間接的に結合する、任意の作用因子である。結合剤は、概して、目的の標的分子に特異的であり、例えば、サンプル中の他の成分に対するものよりも高い親和性及び／または特異性で目的の標的分子に結合し得る。結合剤は、概して、目的の標的分子に直接、例えば静電結合を介して結合する。
結合剤は、結合パートナーまたは目的の標的分子に結合できる、例えば目的の標的分子に直接的または間接的に結合する、任意の作用因子である。結合剤は、概して、目的の標的分子に特異的であり、例えば、サンプル中の他の成分に対するものよりも高い親和性及び／または特異性で目的の標的分子に結合し得る。結合剤は、概して、目的の標的分子に直接、例えば静電結合を介して結合する。
【0113】
標的分子は、検出が必要とされる、いかなる目的の分子または実体でもよい。例えば、標的分子は、ペプチドまたはタンパク質、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の修飾形態）、脂質、炭水化物、小分子を含み得る。標的分子は、細胞内または細胞上に存在し得る。本発明の方法は複数の標的分子の研究を可能にするため、すべての標的分子が同じタイプのものである必要はない。したがって、本方法は、ペプチドもしくはタンパク質、核酸（ＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそれらの任意の修飾形態）、脂質、炭水化物、もしくは小分子、またはこれらのいくつかもしくはすべての組み合わせのうちの１つ以上の観察をもたらし得る。
【0114】
結合剤は、タンパク質（例えばポリペプチド）でもよく、もしくはそれを含んでもよく、または非タンパク質分子でもよく、もしくはそれを含んでもよい。タンパク質である、またはそれを含む結合剤の例としては、抗体、抗体断片、受容体（例えば可溶性受容体）、リガンド、レクチンが挙げられる。非タンパク質分子である、またはそれを含む結合剤の例としては、炭水化物及び核酸分子またはそれらの誘導体、ならびにアプタマーが挙げられる。
【0115】
結合剤は、その標的に対して高い結合親和性、例えば、解離定数がマイクロモルまたはナノモル範囲の（例えば、約１０－４Ｍ、１０－５Ｍ、１０－６Ｍ、１０－７Ｍ、１０－８Ｍ、もしくは１０－９Ｍ未満、または１０－４Ｍ～１０－６Ｍ、もしくは１０－７Ｍ～１０－９Ｍの範囲）の結合親和性を有するように選択され得る。親和性は、分子（例えば抗体）がそのリガンド（例えば抗原）に結合する強さである。これは通常、平衡解離定数（ＫＤ）によって測定及び報告される。ＫＤは、抗体の抗体会合速度（「オンレート」またはＫｏｎ）、すなわち抗体がその抗原に結合する速さに対する、抗体解離速度（「オフレート」またはＫｏｆｆ）、すなわち抗体がその抗原から解離する速さの比である。例えば、親和性が１μＭ以下の抗体は、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイによって決定して１μＭ以下のＫＤ値（すなわち、１μＭ以上の親和性）を有する。バイオレイヤー干渉法（例えば、Ｏｃｔｅｔ）または表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｓｙｓｔｅｍ）など、好適なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを使用して、よく知られている方法に基づくＫＤ値によって測定される親和性を評価することができる。標的分子に対して高い結合親和性を有する結合剤を選択することにより、本発明の方法の選択性及び感度が高まり得る。「抗体」という用語は、少なくとも１つのＶＨ及び／またはＶＬドメインを含み、標的分子に結合する免疫グロブリンタンパク質を意味するために使用される。ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む完全長抗体、ラクダ科及びサメのＨＣＡｂのような重鎖のみの抗体など、多くの抗体構造が知られている。抗体断片は、抗体またはその抗原結合部分を含み得る。抗体は、ポリクローナルでもモノクローナルでもよく、天然に発生するものでも合成のものでもよく、またはそれらの改変形態（例えば、ヒト化、キメラ）でもよい。
【0116】
抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片によって果たされ得る。本明細書で使用される場合、抗体の、例えばモノクローナル抗体の「抗原結合部分」は、抗原に特異的に結合する能力を保持する、抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＨ、ＶＬ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを含む一価断片）、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片）、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）Ｆｖ断片（抗体の１本のアームのＶＨ及びＶＬドメイン（ｓｃＦｖ断片、例えば、ＶＨ及びＶＬ部分が合成リンカーによって接合された断片、ならびにそれらの多量体を含む））、（ｖ）ｄＡｂ断片（単一ＶＨドメイン）、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、または、例えば合成リンカーによって接合されていてもよい少なくとも２つのＣＤＲの組み合わせが挙げられる。
【0117】
これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して取得され、これらの断片は、インタクトな抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【0118】
非タンパク質分子である、またはそれを含む結合剤の例としては、オリゴヌクレオチド（例えばＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成オリゴヌクレオチドであり得る、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド及び／または合成ヌクレオチド残基を含み得る）を含む結合剤が挙げられる。
【0119】
結合剤及びＴオリゴヌクレオチドのコンジュゲーション
結合剤及びＴオリゴヌクレオチドは、コンジュゲートされる。これは、コンジュゲートのこれら２成分が共有結合または非共有結合で連結されることを意味する。これは、任意の好適な手段によって達成することができる。コンジュゲートの成分は、直接的に、または間接的に、例えばリンカーを介して連結され得る。
結合剤及びＴオリゴヌクレオチドは、コンジュゲートされる。これは、コンジュゲートのこれら２成分が共有結合または非共有結合で連結されることを意味する。これは、任意の好適な手段によって達成することができる。コンジュゲートの成分は、直接的に、または間接的に、例えばリンカーを介して連結され得る。
【0120】
結合剤が核酸またはアプタマーである実施形態において、カップリングは、例えば、１つのヌクレオチドまたはその機能的均等物の５’リン酸基と、別のヌクレオチドまたはその機能的均等物の３’ＯＨ基との間の、共有結合性ホスホジエステル結合を介するものであり得る。このような実施形態では、結合剤成分及びＴオリゴヌクレオチド成分は、調和していてもよいし、１つ以上のオリゴヌクレオチド単位によって分離されていてもよい。このような場合、結合標的またはＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの結合に関与しないオリゴヌクレオチド単位は、連結オリゴヌクレオチド単位と表現され得る。例えば、２～３０、３～２５、４～２０、５～１５、６～１０個の連結オリゴヌクレオチド単位、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の連結オリゴヌクレオチド単位が存在し得る。
【0121】
結合剤が抗体などのタンパク質である実施形態では、結合剤とＴオリゴヌクレオチドとの間のコンジュゲーションは、任意の適切な共有結合性または非共有結合性の連結によるものであり得る。当技術分野で知られている好適な手段には、例えば、架橋剤などのリンカーを介した、コンジュゲートの２成分の化学架橋が含まれる。架橋試薬は、タンパク質または他の分子上の特定の官能基（第一級アミン、スルフヒドリルなど）に対する反応性末端を含む。タンパク質及びペプチドにおいて幾つかの化学基が利用可能であることで、これらは架橋法を使用したコンジュゲーションの標的となる。架橋剤は、タンパク質及び核酸などの生体分子に見られる一般的な官能基を標的とする少なくとも２つの反応性基を含む。一般的にバイオコンジュゲーションの標的とされる官能基には、第一級アミン、スルフヒドリル、カルボニル、炭水化物、及びカルボン酸が含まれる。他の例には、修飾された（例えば、マレイミド、ＮＨＳ、またはアジド基を持つ）Ｔオリゴを使用するクリック化学が含まれる。架橋剤の２つの反応性基は、例えばＰＥＧを含み得るスペーサーによって分離されている。スペーサーは概して、３～５０オングストロームの長さである。
【0122】
Ｔオリゴは、結合パートナーがその結合パートナーに結合する能力に干渉しない、結合剤上の位置でコンジュゲートされることが好ましい。例えば、抗体または抗体断片である結合剤の場合、Ｔオリゴは、定常領域で、及び／または抗体がその標的に結合するのに干渉しない領域内で、例えば抗原結合部位から離れたところでコンジュゲートされることが好ましい。
【0123】
結合剤の各分子は、単一のＴオリゴヌクレオチド分子、または複数のＴオリゴヌクレオチド分子にコンジュゲートされ得る。結合剤の分子ごとに複数のＴオリゴヌクレオチド分子が結合する場合、これらのＴオリゴヌクレオチド分子の各々は、同じオリゴヌクレオチド配列を有する（Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有であるため）。
【0124】
例として、１～１０、２～９、３～８、４～７、または５～６個のＴオリゴヌクレオチド分子が、結合剤の各分子にコンジュゲートされる。各Ｔオリゴヌクレオチド分子は、結合剤上の異なる位置で結合していてもよい。各結合剤分子に結合するＴオリゴヌクレオチド分子の数は、使用されるコンジュゲーションの性質に依存する。結合剤の分子ごとのＴオリゴヌクレオチドの分子のこの数は、例えば結合剤の各分子が同じ数のＴオリゴヌクレオチドの分子を有する場合、絶対的なものであり得る。あるいは、結合剤の分子ごとのＴオリゴヌクレオチドの分子の数は、結合剤の分子ごとのＴオリゴヌクレオチドの平均数を表してもよい。
【0125】
ＦＲＥＴオリゴ
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で定義されるオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドには、蛍光エミッター分子（エミッター分子）及び消光体が結合し、組み込まれ、及び／またはコンジュゲートされている。蛍光エミッター分子は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーでもよく、消光体は、対応するＦＲＥＴアクセプターでもよい。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき、エミッター分子の励起を引き起こす波長で照射すると、消光体への効率的なエネルギー移動のため、エミッター分子の発光波長では蛍光が観察されない。しかし、ＴオリゴヌクレオチドとのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、エミッター及び消光体が物理的に分離され、エミッターとクエンチャーとの間のエネルギー移動、例えばＦＲＥＴの速度が低下し、その結果、蛍光がエミッター分子の発光波長で観察できるようになる。
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で定義されるオリゴヌクレオチドである。このオリゴヌクレオチドには、蛍光エミッター分子（エミッター分子）及び消光体が結合し、組み込まれ、及び／またはコンジュゲートされている。蛍光エミッター分子は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーでもよく、消光体は、対応するＦＲＥＴアクセプターでもよい。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき、エミッター分子の励起を引き起こす波長で照射すると、消光体への効率的なエネルギー移動のため、エミッター分子の発光波長では蛍光が観察されない。しかし、ＴオリゴヌクレオチドとのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、エミッター及び消光体が物理的に分離され、エミッターとクエンチャーとの間のエネルギー移動、例えばＦＲＥＴの速度が低下し、その結果、蛍光がエミッター分子の発光波長で観察できるようになる。
【0126】
したがって、エミッター分子及び消光体は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが完全に線状であるとき（例えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと配列が完全に相補的なＴオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドにハイブリダイズするとき）、エミッター分子及び消光体が空間的に分離され、その結果、２つの分子間のエネルギーの移動が起こらず、蛍光がエミッター分子の発光波長で観察され得るような位置でオリゴヌクレオチド上に位置付けられる。
【0127】
これに対し、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき、その構成は乱れ、蛍光エミッター分子及び消光体は空間的に分離されない。したがって、エミッター分子と消光体との間のエネルギーの移動は起こらず、エミッター分子の発光波長で蛍光は観察できないか、または観察されない。消光体の性質に応じて、そのエネルギー移動の結果、すべての蛍光が消光または抑制され得る（例えば、ダーククエンチャーまたはブラックホールクエンチャーが使用される場合。なぜなら、ダーククエンチャーは一般に、エミッター分子から励起エネルギーを吸収し、エネルギーを熱として放散し、すなわち蛍光が全く検出されないためである）。あるいは、クエンチャー分子自体が蛍光を放出する場合があるが、これは、エミッター分子の発光波長とは異なる波長でクエンチャー分子から放出される。これは、クエンチャーの性質または消光のメカニズムにかかわらず、エミッター分子の発光の消光により、エミッター分子の発光波長での蛍光放出が低減または消失することを意味する。低減は、クエンチャー実体の非存在下でエミッター分子の発光波長において観察される蛍光放出の６０、５０、４０、３０、２０、１０％未満への低減であり得る。
【0128】
上記を考慮すると、蛍光放出は、大まかに言えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしているときは、エミッター分子の発光波長でＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中の蛍光エミッター分子から検出可能であるが、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中で遊離しているときには検出されない（または低下したレベルで検出される）。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとが会合すると、エミッター分子の発光波長での蛍光放出が「オン」になり、解離すると、エミッター分子の発光波長での蛍光放出が「オフ」になる。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及びＴオリゴヌクレオチドは、不完全にハイブリダイズするように設計されているため、それらは容易に解離及び再会合し、各ペアに特徴的な独特の蛍光動態プロファイルを生じさせる。蛍光動態プロファイルは、以下でさらに詳細に説明するように、点滅の頻度及び「オン」シグナルの持続時間の両方で構成される。
【0129】
したがって、蛍光エミッター分子及び消光体は、オリゴヌクレオチドが結合したコンフォメーションにあるとき、蛍光エミッター分子と消光体との間のエネルギー移動（例えばＦＲＥＴ）を妨げる距離で、オリゴヌクレオチドに結合し、組み込まれ、及び／またはコンジュゲートされる。別の言い方をすると、オリゴヌクレオチド中の２成分間の距離は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子のフェルスター半径を超える。したがって、ヌクレオチド単位の観点から表現すると、エミッター分子及び消光体は、少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さの距離でオリゴヌクレオチドに結合し、組み込まれ、及び／またはコンジュゲートされる。この距離は、ほとんどのＦＲＥＴペアについて少なくとも５、６、または７ｎｍ、好ましくは、ほとんどのＦＲＥＴペアについて少なくとも９ｎｍの距離に対応する。これらの距離は、線状の完全に伸長した形態、または結合したコンフォメーションでのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに関して測定または表現される。
【0130】
例えば、Ａｔｔｏ４２５／Ａｔｔｏ４８８を使用したＦＲＥＴオリゴの場合、フェルスター半径は５．２ｎｍである。Ａｔｔｏ４８８／Ａｔｔｏ５５０を使用したＦＲＥＴオリゴの場合、フェルスター半径は６．３ｎｍである。Ａｔｔｏ５５０／Ａｔｔｏ６４７を使用したＦＲＥＴオリゴの場合、フェルスター半径は６．５ｎｍである。Ａｔｔｏ６４７／ＢＨＱ３（ダーククエンチャー）を含むＦＲＥＴオリゴの場合、フェルスター半径は７．０ｎｍである。
【0131】
これは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド内の少なくとも１２ヌクレオチド単位隔てられた位置に蛍光エミッター分子及び消光体を位置付けることによって達成され得る。例えば、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが１２オリゴヌクレオチド以上の長さである場合、蛍光エミッター分子がＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も５’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けられ、消光体がＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も３’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けられる、またはその逆になるように、２つの分子を位置付けてもよい。あるいは、２つの分子が少なくとも１１オリゴヌクレオチド単位離れた（例えば少なくとも１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０オリゴヌクレオチド単位離れた）ヌクレオチド単位に位置付けられるように、それらをＦＲＥＴオリゴヌクレオチド上に位置付けてもよい。例えば、２つの分子は、ヌクレオチド単位１番及び１２番、１番及び１３番、１番及び１４番、１番及び１５番、１番及び１６番、１番及び１７番、１番及び１８番、１番及び１９番、１番及び２０番、２番及び１３番、２番及び１４番、２番及び１５番、２番及び１６番にある場合などに、１１オリゴヌクレオチド単位離れている。
【0132】
ある特定の実施形態では、蛍光エミッター分子及び消光体の少なくとも一方、及び好ましくは両方が、末端オリゴヌクレオチド単位に位置付けられる。例えば、蛍光エミッター分子をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も５’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けてもよく、消光体をＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も３’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けてもよく、またはその逆でもよい。
【0133】
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、ヘアピンまたはヘアピンループなどの二次構造を形成しない配列を有することが好ましい。これは、そのような二次構造を有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにとって、溶液中でこの二次構造を形成することがエネルギー的に好都合であるためである。二次構造が存在すると、Ｔオリゴヌクレオチドとの二量体が形成され得る速度が減少する。ＦＲＥＴオリゴは、セルフライゲーション、または本発明の方法で使用され得る他のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの交差二量化を許容しない配列を有することが好ましい。セルフライゲーション、または本発明の方法で使用され得る他のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの交差二量化は、Ｔオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションの非存在下で蛍光を生成する。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドはまた、サンプル中に存在するＤＮＡ配列に相補的であってはならない。
【0134】
蛍光エミッター分子及び消光体は、ある特定の実施形態では、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も５’側及び最も３’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けられる。蛍光エミッター分子及び消光体は、蛍光エミッター分子がＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も５’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けられ、消光体がＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの最も３’側のオリゴヌクレオチド単位に位置付けられる、またはその逆になるように位置付けられ得る。
【0135】
蛍光エミッター分子及び消光体
蛍光エミッター分子は、適切なスペクトル発光での照射時に既定の蛍光波長の発光を生成する分子である。
蛍光エミッター分子は、適切なスペクトル発光での照射時に既定の蛍光波長の発光を生成する分子である。
【0136】
本明細書で言及される消光体は、蛍光エミッター分子によって放出される既定の蛍光波長の発光が、例えばフェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）によって伝えられる分子である。クエンチャーが、例えば適切な位置に存在する場合、励起された蛍光エミッター分子は、光を放出することなく、そのエネルギーをクエンチャーに伝えることによって基底状態に戻ることができ、一方、クエンチャーは励起状態に活性化される。エミッターが励起状態にある間、エネルギーがエミッター（またはドナー）分子から移動する。ＦＲＥＴは、ドナー及びアクセプターの遷移双極子間の古典的な双極子間相互作用に基づいており、１／Ｒ６の率で減衰するドナーとアクセプターの距離Ｒに非常に依存している。
【0137】
蛍光エミッター分子は、適切なスペクトル発光（例えば、特定の波長）での照射によって励起されると、励起状態に活性化される。クエンチャーの非存在下では、励起された分子は、基底状態に戻る際に、その発光波長で光を放出する。クエンチャーが適切な位置に存在すると、エネルギーがクエンチャーに移動する結果、エミッター分子の発光波長での蛍光放出が低減または消失する。クエンチャーの性質に応じて、エネルギー移動の結果、蛍光が放出されない場合がある（例えば、ダーククエンチャーまたはブラックホールクエンチャーが使用される場合）。あるいは、発光波長とは異なる波長で光の放出を生じさせるクエンチャーを使用してもよく、その場合でも、エミッター分子の発光波長での蛍光放出の低減または消失が起こる。
【0138】
２つの分子間の（例えばＦＲＥＴによる）エネルギー移動が起こるには、ドナーとアクセプターのスペクトルが適切にオーバーラップする必要があり、エミッター分子の発光スペクトルは、クエンチャー実体の吸収スペクトルとオーバーラップしなければならない。したがって、ある特定の蛍光エミッター分子及び消光体のペアのみが使用され得る。ドナーの発光スペクトルがアクセプターの励起スペクトルとオーバーラップする限り、最適なＦＲＥＴペアを任意の波長で設計することができる。照射源の最適な励起波長は、ハイブリダイゼーション中のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの蛍光放出に基づくべきである。
【0139】
蛍光エミッター分子及び消光体の適切なペアが選択され得る。好適なペアの例としては、Ａｔｔｏ４２５／Ａｔｔｏ４８８（例えば、ＵＶ照射源で励起し、Ａｔｔｏ４２５発光波長で点滅を検出する）、Ａｔｔｏ４８８／Ａｔｔｏ５５０（例えば、青色照射源で励起し、ａｔｔｏ４８８発光波長で点滅を検出する）、Ａｔｏ５５０／Ａｔｔｏ６４７（例えば、緑色照射源で励起し、Ａｔｔｏ５５０発光波長で点滅を検出する）、Ａｔｔｏ６４７／ＢＨＱ３（ダーククエンチャー）（赤色照射源で励起し、Ａｔｔｏ６４７発光波長で点滅を検出する）、Ｃｙ５フルオロフォア及びＢＨＱ－３ダーククエンチャー（例えば、６３９ｎｍレーザーで励起し、Ｃｙ５発光波長で点滅を検出する）が挙げられる。
【0140】
ＢＨＱ－１、ＢＨＱ－２及びＢＨＱ－３は、当技術分野でよく知られており、広く使用されているブラックホールクエンチャーである。例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｔｅｃｈｎｉｃａｌ－ｄｏｃｕｍｅｎｔｓ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｂｉｏｌｏｇｙ／ｂｌａｃｋ－ｈｏｌｅ－ｑｕｅｎｃｈｅｒｓ．ｈｔｍｌを参照のこと。他のダーククエンチャーには、緑色スペクトルで吸収し、フルオレセインと共に使用されることの多いＤａｂｓｙｌ（ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸）、Ｑｘｌクエンチャー（可視スペクトル全体に及ぶ）、Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ ＦＱ（スペクトルの緑色から黄色の部分で吸収する）、Ｉｏｗａ ｂｌａｃｋ ＲＱ（スペクトルのオレンジ色から赤色の部分をブロックする）、ＩＲＤｙｅ ＱＣ－１（可視から近赤外の範囲（５００～９００ｎｍ）の色素を消光する）が含まれる。
【0141】
ＦＲＥＴプローブのペアの他の例は、Ｙｏｓｈｉｙｕｋｉ Ａｒａｉ ａｎｄ Ｔａｋｅｈａｒｕ Ｎａｇａｉ（２０１３）Ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ ｕｓｅ ｏｆ ＦＲＥＴ ｉｎ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｍａｇｉｎｇ，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ ０（０）：１－１０（２０１３）に記載されており、例えば、以下のエミッター分子及び消光体が好適な例である。
【表3-1】
【表3-2】
【0142】
本明細書では、エミッター分子の発光波長について言及する。エミッター分子からの発光が、ピーク波長または発光最大値の近くの複数の波長で発光が発生するスペクトルとして表され得ることはよく知られている。このスペクトルの正確な形状及び発光最大値は、各エミッター分子について容易に決定することができる。エミッター分子の発光波長に言及する場合、これは概して、エミッター分子の発光最大値またはそれに近い１つ以上の波長（例えば、エミッター分子の発光最大値、または所定のエミッター分子の発光最大値の上下１ｎｍ以内、２ｎｍ以内、３ｎｍ以内、４ｎｍ以内、５ｎｍ以内、１０ｎｍ以内、１５ｎｍ以内、２０ｎｍ以内、２５ｎｍ以内、３０ｎｍ以内、４０ｎｍ以内、５０ｎｍ以内のウィンドウ）を意味する。
【0143】
実際には、所定のエミッター分子について、その蛍光は、エミッター分子の発光スペクトルに基づいて選択される波長の予め定義されたウィンドウであるチャネルで観察される。チャネルは、例えば、所定のエミッター分子の発光最大値の上下１ｎｍ以内、２ｎｍ以内、３ｎｍ以内、４ｎｍ以内、５ｎｍ以内、１０ｎｍ以内、１５ｎｍ以内、２０ｎｍ以内、２５ｎｍ以内、３０ｎｍ以内、４０ｎｍ以内、５０ｎｍ以内であり得る。したがって、例えば、エミッターの発光波長における動態蛍光プロファイルの観察もしくは検出、またはその存在もしくは非存在、またはその低減に言及する場合、これは、エミッター分子の発光最大値での蛍光、またはエミッター分子の発光最大値を囲む既定のウィンドウ内の蛍光を指し得る。
【0144】
当業者は、所定のエミッター分子（複数可）の発光を観察するための１つ以上の適切なチャネルを選択することができる。チャネルのサイズは容易に決定でき、特定の実験パラメータに適合させることができる。概して、蛍光放出を観察するために単一のチャネルが使用される所定のセットアップが使用される場合、これは、複数のチャネルが使用される実験セットアップのためのウィンドウよりも大きなウィンドウになる。当業者は、例えば、吸収スペクトル及び発光スペクトルのオーバーラップを回避するために適切なパラメータを使用することについても理解している。使用される１つ以上のエミッター分子の性質に応じて、必要な蛍光動態プロファイルを観察するための慣例的な方法を使用して、任意の適切なチャネルを選択することができる。例えば、単一のエミッター分子が使用される場合、単一のチャネルを使用することができ、この場合、ウィンドウは比較的広くなり得る（例えば、３０ｎｍｍ以内、４０ｎｍ以内、５０、５０ｎｍ以内、７０ｎｍ以内、８０ｎｍ以内、９０ｎｍ以内、１００ｎｍ以内）。複数のエミッター分子からの蛍光動態プロファイルが使用される場合、各ウィンドウは概して、例えば様々なスペクトル間のオーバーラップを回避するために、より狭く、例えば１ｎｍ以内、２ｎｍ以内、３ｎｍ以内、４ｎｍ以内、５ｎｍ以内、１０ｎｍ以内、１５ｎｍ以内、２０ｎｍ以内、２５ｎｍ以内、３０ｎｍ以内になる。蛍光動態プロファイルは、エミッター分子の励起スペクトル内の任意の単一の波長または波長群において観察または検出され得る。
【0145】
照射
本方法は、適切なスペクトル発光を使用して蛍光エミッター分子を照射し、それによって蛍光エミッター分子にその既定の蛍光波長の発光を生成させる照射のステップを含む。これは「励起」と呼ばれることもあり、使用される蛍光エミッター分子の既知の特性またはそれらの組み合わせに基づいて、この目的のために適切な波長を選択することができる。複数の蛍光エミッター分子が使用される場合、単一の光源を使用してこれらを励起することができる。あるいは、使用される蛍光エミッター分子ごとに別個の光源を使用してもよいし、それらの組み合わせを使用してもよい。蛍光エミッター分子は、十分に特性解析された励起スペクトルまたは吸収スペクトルを有しており、すべての蛍光エミッター分子の励起に好適な波長またはその組み合わせを選択することは、慣例的なことである。
本方法は、適切なスペクトル発光を使用して蛍光エミッター分子を照射し、それによって蛍光エミッター分子にその既定の蛍光波長の発光を生成させる照射のステップを含む。これは「励起」と呼ばれることもあり、使用される蛍光エミッター分子の既知の特性またはそれらの組み合わせに基づいて、この目的のために適切な波長を選択することができる。複数の蛍光エミッター分子が使用される場合、単一の光源を使用してこれらを励起することができる。あるいは、使用される蛍光エミッター分子ごとに別個の光源を使用してもよいし、それらの組み合わせを使用してもよい。蛍光エミッター分子は、十分に特性解析された励起スペクトルまたは吸収スペクトルを有しており、すべての蛍光エミッター分子の励起に好適な波長またはその組み合わせを選択することは、慣例的なことである。
【0146】
一時的なハイブリダイゼーション及び蛍光動態プロファイル
上記で説明したように、Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドペアは完全に相補的ではなく、一時的にハイブリダイズする。すなわち、ペアの２成分間で解離及び再会合が起こる。ペア間のこの解離及び再会合により、蛍光動態プロファイルが生成される。セット内のＴオリゴヌクレオチド間の配列の差異の結果として、蛍光動態プロファイルは、そのセット内でそのペアに特有である。
上記で説明したように、Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドペアは完全に相補的ではなく、一時的にハイブリダイズする。すなわち、ペアの２成分間で解離及び再会合が起こる。ペア間のこの解離及び再会合により、蛍光動態プロファイルが生成される。セット内のＴオリゴヌクレオチド間の配列の差異の結果として、蛍光動態プロファイルは、そのセット内でそのペアに特有である。
【0147】
蛍光動態プロファイルには複数の成分がある。蛍光エミッター分子及び消光体は、ハイブリダイズした状態でしか、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における発光の消光を妨げるように十分に分離しないため、ペアの解離により、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長の蛍光シグナルが「オフ」になり、ペア間の再会合により、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長のシグナルが「オン」になる。蛍光動態プロファイルは、複数の異なるやり方で特性解析され得る。蛍光動態プロファイルからは、時空間情報を含む、任意の数の数値メトリックまたは特徴が抽出され得る。これらのメトリックの非限定的な例には、（ｉ）各蛍光放出の間の平均時間（オフ時間とも呼ばれる）、（ｉｉ）蛍光放出の平均持続時間（オン時間とも呼ばれる）、及び（ｉｉｉ）蛍光放出の発生率が含まれる。少なくとも１つ、少なくとも２つ、または少なくとも３つのそのようなメトリックを蛍光動態プロファイルから抽出し、それを記述するために使用することができる。これらの例示的なメトリック以外のメトリックを使用してもよい。
【0148】
さらに、「点滅」として概念化される、蛍光放出がオフ及びオンになることを使用して、各Ｔオリゴヌクレオチドと対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション親和性を記述する数値メトリックを定義することができる。点滅動態から、少なくとも（ｉ）Ｋｏｎ（会合速度定数、Ｍ－１．ｓ－１で表される）及び（ｉｉ）Ｋｏｆｆ（解離速度定数、ｓ－１で表される）を含む、任意の数のメトリックが導出され得る。各Ｔオリゴヌクレオチドが、特有のハイブリダイゼーション動態プロファイル、ひいては特有の点滅動態プロファイルを呈するようにエンジニアリングされているため、任意の個々のメトリックまたはメトリックの組み合わせを使用して、観察下のＴオリゴヌクレオチドのアイデンティティを区別することができる。これらの親和性メトリックは、蛍光動態プロファイルを記述する方法にもなり得る。
【0149】
所定の時間枠におけるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長での蛍光放出の発生回数は、所定の時間枠でＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長において蛍光放出がオンに切り替わる回数を意味する。ペアの２成分間のハイブリダイゼーションの一時的な性質は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における蛍光放出が時間と共に現れては消え、ペアがハイブリダイズ形態にあるときにＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長で発光が現れることを意味する。蛍光放出の発生回数、または蛍光強度のピークの数は、時間単位当たり、例えば１秒（Ｓ）当たりの数として表現することができる。標準濃度のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを仮定した場合、より高い点滅速度は通常、Ｔオリゴヌクレオチドが多数のミスマッチを含む場合など、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間の低親和性ハイブリダイゼーションを示す。逆に、標準濃度のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを仮定した場合、少ない点滅数は、高親和性ハイブリダイゼーションを示す。
【0150】
非限定的な例である（ｉ）各蛍光放出の間の平均時間（オフ時間とも呼ばれる）、（ｉｉ）蛍光放出の平均持続時間（オン時間とも呼ばれる）、及び（ｉｉｉ）蛍光放出の発生率を含む、様々なメトリックにより、様々な方法でプロファイルを記述することができる。オン時間は、蛍光放出の持続時間であり、結合状態または明時間とも表現できる。このパラメータは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとＴオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションの性質に固有のものである。これは、ペアの２成分がペアを形成した後にハイブリダイズした状態を維持できるかどうかが、オーバーラップ領域の配列に依存するためである。これに対し、蛍光放出が存在しない持続時間であるオフ時間（非結合状態／暗時間とも表現できる）は、オーバーラップ領域の配列に依存するが、固定化されたＴオリゴヌクレオチドに加えられるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの濃度にも依存する。これは、ペアの２つのメンバーがハイブリダイズする可能性が、それらの相互作用の強さだけでなく、２つのメンバーが互いに遭遇する確率にも依存するからである。
【0151】
上記のように、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド及びＴオリゴヌクレオチドの動態は、それぞれ、それらの解離（結合解除）及び会合（結合）速度定数であるＫｏｆｆ及びＫｏｎの観点から記述することもできる。その場合、ＫｏｎはＦＲＥＴオリゴの濃度及びその配列に影響され（例えば、ヘアピンの存在はＫｏｎを低下させる）、一方、Ｋｏｆｆはハイブリダイゼーションの安定性に影響される。したがって、例えばオーバーラップ領域が長いほど、Ｋｏｆｆは小さくなる（結合解除がゆっくりと起こる）。ミスマッチの導入は、ハイブリダイゼーションを不安定にし、したがってＫｏｆｆを増加させる（解離が急速に起こる）。
【0152】
蛍光動態プロファイルを記述するために使用できる特定のメトリック、例えば、指定された時間枠内での発生回数（蛍光強度のピーク）、Ｔオリゴヌクレオチド及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの所定濃度での各オリゴヌクレオチドペアについてのオン時間及びオフ時間は、Ｔオリゴヌクレオチドを固定化し、固定化されたＴオリゴヌクレオチドをＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させ、固定化された各Ｔオリゴヌクレオチドの蛍光動態プロファイルを観察することによって、実験的に測定及び／または計算することができる。所定の各ペアについての少なくとも１つのメトリックに関する情報は、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルにアイデンティティを割り当てるプロセスの一部を形成する。この割り当ては、観察及び／または計算される、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイルの少なくとも１つのメトリックに基づき得る。
【0153】
１つのメトリックに基づいてこのデコンボリューションを行うことが可能である。ある特定の実施形態では、蛍光動態プロファイルの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つのメトリックが使用される。概して、本方法は、複数のメトリックを使用することでより効率的にすることができるが、使用されるメトリックが区別可能である限り（例えば、そのメトリックに基づいてＴオリゴヌクレオチドにアイデンティティが割り当てられ得るという点で）、メトリックを単独で使用してもよい。ある特定の実施形態では、複数のメトリックに依存することが必要な場合があり、組み合わせられたメトリックは、別の所定の蛍光動態プロファイルに関するメトリックの組み合わせから区別可能であり得る。
【0154】
蛍光動態プロファイルの特定の成分は、例えばオリゴヌクレオチドセットの設計プロセス中に、例えば実施例２に示すように、漸増濃度のＴオリゴヌクレオチドをＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと共にインキュベートする場合の、溶液中の蛍光原性プロファイルを決定することによって調査することもできる。溶液中では、各ＴオリゴヌクレオチドへのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、より破壊的なミスマッチが蛍光原性の見かけの低減をもたらす、独特の蛍光原性プロファイルが生成される。
【0155】
実際、本発明の方法を行うとき、Ｔオリゴヌクレオチドは、Ｔオリゴヌクレオチドがコンジュゲートされている結合剤によってサンプル上に固定化される。結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートが固定化されるということは、任意の１つ以上のピクセルにおける蛍光動態プロファイルが観察され得ることを意味する。したがって、Ｔオリゴヌクレオチドを固定化し、固定化されたＴオリゴヌクレオチドにＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを加えることにより、特定のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＴオリゴヌクレオチドペアを本発明の方法で使用する前に、そのようなペアのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長における蛍光動態プロファイルを観察することが可能である。このようにして、各ペアの蛍光動態プロファイルを観察することができ、また、Ｔオリゴヌクレオチドのセットが、本発明の方法において有用となる適切な蛍光動態プロファイルを生成すること、そして特に、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルが存在することを確認することができる。さらに、各ペアのプロファイルの性質（例えば、蛍光動態プロファイルの１つ以上のメトリックの観察または計算を含む）を決定することができる。
【0156】
観察
標準的な顕微鏡ベース及び照射システムと適合するこの技術では、標準的な蛍光顕微鏡検査光学システムを使用することができる。観察されるサンプルの各ピクセルから発する蛍光プロファイルを観察するためには、経時的に画像捕捉を行う必要がある。この作業には、単一分子を検出することが可能な任意のタイプのイメージングデバイスが好適であるが、フレームレートが高ければ蛍光動態プロファイルのプロファイリングの精度が高まるため、高フレームレート（１秒当たり１００フレーム超）の相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）カメラが使用され得る。
標準的な顕微鏡ベース及び照射システムと適合するこの技術では、標準的な蛍光顕微鏡検査光学システムを使用することができる。観察されるサンプルの各ピクセルから発する蛍光プロファイルを観察するためには、経時的に画像捕捉を行う必要がある。この作業には、単一分子を検出することが可能な任意のタイプのイメージングデバイスが好適であるが、フレームレートが高ければ蛍光動態プロファイルのプロファイリングの精度が高まるため、高フレームレート（１秒当たり１００フレーム超）の相補型金属酸化物半導体（ＣＭＯＳ）カメラが使用され得る。
【0157】
各サンプルについて、例えば最長１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０秒、例えば１０～１２０、２０～１１０、３０～１００、４０～８０、５０～７０秒、好ましくは０～２、２～５、２～１０秒の合計捕捉時間で、経時的に画像が観察及び／または記録され得る。蛍光強度の時間トレースを生成して、画像スタック内の特定の関心領域の動態プロファイルを示すことができる。
【0158】
画像捕捉は概して、チャネルにおいて行われる。本明細書で使用される場合、チャネルとは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドエミッター分子の発光波長（複数可）を含み、エミッター分子の発光スペクトルに基づいて選択される波長の予め定義されたウィンドウを指す。チャネルは、例えば、所定のエミッター分子の発光最大値の上下１ｎｍ以内、２ｎｍ以内、３ｎｍ以内、４ｎｍ以内、５ｎｍ以内、１０ｎｍ以内、１５ｎｍ以内、２０ｎｍ以内、２５ｎｍ以内、３０ｎｍ以内、４０ｎｍ以内、５０ｎｍ以内であり得る。上記でも述べたように、チャネルのサイズは、使用されるエミッター分子またはエミッター分子の組み合わせに依存する。例えば、エミッターの発光波長における動態蛍光プロファイルの観察もしくは検出、またはその存在もしくは非存在、またはその低減に言及する場合、これは、エミッター分子の発光最大値での蛍光、またはエミッター分子の発光最大値を囲む既定のウィンドウ内の蛍光を指し得る。例えば、使用されるエミッター分子がＡｔｔｏ５５０であれば、発光チャネルは赤色発光のスペクトル帯域幅に相当し得、使用されるエミッター分子がＡｔｔｏ６４７であれば、発光チャネルは近赤外発光のスペクトル帯域幅に相当し得、使用されるエミッター分子がＡｔｔｏ４８８であれば、発光チャネルは緑色発光のスペクトル帯域幅に対応し得る。
【0159】
さらに、例えば将来の分析のために、蛍光動態プロファイルを記録してもよい。これは、当技術分野で知られている任意の適切な技術を使用して行うことができる。さらに、蛍光動態プロファイルを分析してもよい。例えば、他の箇所で説明するような少なくとも１つのメトリックを、観察及び／または記録された蛍光動態プロファイルから導出または計算することができる。
【0160】
画像処理
経時的連続画像は、連続的で順序付けられた捕捉画像のセットである。例えば、経時的連続画像では、各焦点について蛍光動態プロファイルが観察される。次に、これを分析して、例えば、他の箇所で説明するような少なくとも１つのメトリックを導出または計算することができる。蛍光動態プロファイルの任意の区別可能なメトリックなどの任意のメトリック（限定されるものではないが、例えば、指定された時間枠内での平均発生回数（蛍光強度のピーク）、平均オン時間、及び平均オフ時間のうちの１つ以上が測定または決定され得る）を使用して、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイルから計算されたメトリックに基づいてアイデンティティを割り当てることができる。
経時的連続画像は、連続的で順序付けられた捕捉画像のセットである。例えば、経時的連続画像では、各焦点について蛍光動態プロファイルが観察される。次に、これを分析して、例えば、他の箇所で説明するような少なくとも１つのメトリックを導出または計算することができる。蛍光動態プロファイルの任意の区別可能なメトリックなどの任意のメトリック（限定されるものではないが、例えば、指定された時間枠内での平均発生回数（蛍光強度のピーク）、平均オン時間、及び平均オフ時間のうちの１つ以上が測定または決定され得る）を使用して、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイルから計算されたメトリックに基づいてアイデンティティを割り当てることができる。
【0161】
焦点とは、単一分子から発する点滅が観察される領域である。通常、その直径は約３～５ピクセルであるが、これは使用される倍率及び光学系に応じて異なり得る。
【0162】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートが固定化されていないピクセルまたは焦点（すなわちバックグラウンドピクセル）については、確率的蛍光が観察され得るが、このバックグラウンド「ノイズ」の蛍光動態プロファイルは、例えば実施例２に示すように、標的のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＴオリゴヌクレオチドの蛍光動態プロファイルから非常に区別しやすい。３つの異なるペアに対するこれらの代表的な基本プロファイルの例を、図４Ａ（下側プロファイル）及び５Ａ（左下プロファイル）に示す。図１３にも代表的なプロファイルの例が含まれている。
【0163】
各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＴオリゴヌクレオチドペアが、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成するため、各ピクセルにおける蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）に、アイデンティティを（例えば、それを生成した特定のＴオリゴヌクレオチドに対して）割り当てることができる。このようにして、ピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）に基づいて、そのピクセルにアイデンティティが割り当てられる。これは、例えば図５に示されている。各抗体種が異なるＴオリゴにコンジュゲートされている、異なる分子エピトープを認識する抗体と接触させた細胞サンプルを、コンジュゲートされたＴオリゴに対応するＦＲＥＴオリゴと接触させた。経時的な画像捕捉により、５Ｂに示すように、各ピクセルの蛍光を測定し、プロファイルを観察または作成することができる。各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアは特有の動態結合プロファイルを有するため、このプロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）を使用して、ピクセルの蛍光プロファイルを、そのＴオリゴのアイデンティティ、ひいては細胞標的に関連付けることができる。（Ｃ）各ピクセルが特定のＴオリゴのアイデンティティ、またはバックグラウンドに割り当てられており、（Ｄ）単一のレーザー励起波長を使用した実験にもかかわらず、この割り当てから、各イメージングモダリティに対する別個のチャネル画像を生成することができる。これは、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）に基づいてアイデンティティを割り当てることが可能であることを意味する。
【0164】
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＴオリゴヌクレオチドの様々なペアの蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）は、例えば本明細書の他の箇所に記載されるように実験的に決定することができ、それにより、サンプル中でいずれかの蛍光動態プロファイルが観察されたとき、観察された蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）を、様々なペアの既知または既定の蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）と比較して、各位置にどのペアが存在するか（したがって、どのＴオリゴヌクレオチドがペア内に存在するか、ひいてはどの結合剤がその位置で結合したか）を決定することが可能である。
【0165】
この比較及び割り当ては、任意の好適な手段によって行うことができる。例えば、蛍光動態プロファイルの少なくとも１つのメトリックが、蛍光動態プロファイルから計算される。このメトリック（複数可）は、使用されたＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＴオリゴヌクレオチドの各ペアについての蛍光動態プロファイルの既知または既定のメトリック（複数可）と比較され得る。この比較により、観察されるサンプル中の１つ以上のピクセルに、そのピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイルから計算されたメトリックに基づいてアイデンティティを割り当てることができる。
【0166】
次いで、ピクセルのアイデンティティを使用して、例えばサンプル内の１つ以上の結合剤及び／または標的分子の位置を示す、サンプルの１つ以上の画像を生成することができる。各Ｔオリゴヌクレオチドのアイデンティティに割り当てられるピクセルは、個々のグレースケールチャネルに分離することができる。個々のグレースケールチャネル画像を合成すると、各Ｔオリゴヌクレオチドチャネルが異なる色で示される疑似カラー顕微鏡画像にすることができる。
【0167】
セット群による多重化
ある特定の実施形態では、ステップａは、サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群と接触させることであって、該セット群が、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含む、接触させることを含み、ステップｂは、該サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤を、第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、及び１つ以上の後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、該第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該第１のセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、該後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの各々は、その対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、（ｉ）各セット内でそのペアに特有であり、かつ（ｉｉ）該セット群内でそのペアに特有である蛍光動態プロファイルを生成する。
ある特定の実施形態では、ステップａは、サンプルを結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群と接触させることであって、該セット群が、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含む、接触させることを含み、ステップｂは、該サンプル及びステップａの結果として結合した任意の結合剤を、第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、及び１つ以上の後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、該第１のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該第１のセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、該後続のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの各々は、その対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、（ｉ）各セット内でそのペアに特有であり、かつ（ｉｉ）該セット群内でそのペアに特有である蛍光動態プロファイルを生成する。
【0168】
このような実施形態では、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含むセット群が使用される。したがって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが使用される。上記で説明したように、複数のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの使用は、より広範囲の蛍光動態プロファイルが生成され得ることを意味する。
【0169】
セット群は、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、または最大２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、例えば１～２５、２～２４、３～２３、４～２２、５～２１、６～２０、７～１９、８～１８、９～１７、１０～１６、１１～１５、１２～１４個のセットを含み得る。
【0170】
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群が使用される場合、対応する各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含み得る（そのため、放出された蛍光を単一のチャネルで検出することができる。例えば、それらは、同じ波長の蛍光を放出するエミッター分子を含んでもよいし、同じエミッター分子を含んでもよい）。これは、すべてのオリゴヌクレオチドペアについて同時に観察ステップを行うことを可能にするため、有利であり得る。例として、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群が使用される場合、各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含み得る。代替的な実施形態において、各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含み得る。さらなる代替的な実施形態において、各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含み得る。
【0171】
あるいは、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群が使用される場合、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、複数のチャネルで検出され得る蛍光を放出するエミッター分子を含んでもよく、例えば、異なる波長の蛍光を放出するエミッター分子を含んでもよいし、異なるエミッター分子を含んでもよい。例として、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセット群が使用される場合、
１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができるか、
１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
または、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができる。
１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができるか、
１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
または、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができ、１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができる。
【0172】
複数の蛍光動態プロファイルを生成する厳密な方法にかかわらず、Ｔオリゴヌクレオチドのセット群と、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを作ることによって、生成され得る異なる蛍光動態プロファイルの数が増加することは理解されよう。Ｔオリゴヌクレオチドの単一のセットと、対応する単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを使用するよりも、Ｔオリゴヌクレオチドのセット群と、対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを使用することにより、より高度な多重化が可能である。
【0173】
Ｔオリゴヌクレオチドのセット群が使用される場合でも、存在する各Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。さらに、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、（ｉ）そのセット内でそのペアに特有であり、かつ（ｉｉ）該セット群内でそのペアに特有である蛍光動態プロファイルを生成する。さらに、いくつかの実施形態では、各Ｔオリゴヌクレオチドは、その対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドだけにハイブリダイズし、該セット群内の他のセットのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（複数可）にはハイブリダイズしない。蛍光動態プロファイル、Ｔオリゴヌクレオチド、及び結合剤の間の相関関係が維持されるように、クロスハイブリダイゼーションは避けるべきである。
【0174】
複数のセット群による多重化
上記で説明したように、本方法は、ステップａが、サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセット群であって、各セット群が、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含み、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、複数のセット群と接触させることを含み、サンプルの動態蛍光プロファイルを観察するステップが、各セット群に対するチャネルで動態蛍光プロファイルを観察することを含む、実施形態を含み得る。
上記で説明したように、本方法は、ステップａが、サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセット群であって、各セット群が、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第１のセット、及び結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の後続のセットを含み、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、複数のセット群と接触させることを含み、サンプルの動態蛍光プロファイルを観察するステップが、各セット群に対するチャネルで動態蛍光プロファイルを観察することを含む、実施形態を含み得る。
【0175】
これは、単一のセットまたはセット群と比較して、さらなるレベルの多重化を達成するために有用である。このようにして、例えば、異なるチャネルで検出され得る蛍光動態プロファイルを生成するために、異なる発光スペクトルを有するフルオロフォアを含むＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用して、蛍光動態シグナルが観察される異なるチャネルの数を増加させる。
【0176】
このような場合、生成される蛍光動態プロファイルの各々は異なり得るが、複数のチャネル（すなわち、異なる波長の蛍光を放出するエミッター分子、またはそれらは異なるエミッター分子を含み得る）を使用することは、所定の蛍光動態プロファイルがセット群間で複製され得ることを意味する。言い換えれば、類似またはさらには同一の蛍光動態プロファイルを生成する２つ以上のペアが、異なるチャネルで観察される蛍光放出としての蛍光動態プロファイルを生成すれば、非常に類似またはさらには同一の蛍光動態プロファイルを生成するこれら２つ以上のペアを使用することができる。
【0177】
このタイプの多重化では、各Ｔオリゴヌクレオチドは依然として、それがコンジュゲートされている結合剤に特有の異なる配列を有し、セット内の異なる各ペアは、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する。複数のセット群が使用され、異なるセット群のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、異なるチャネルで検出され得る蛍光放出としての蛍光動態プロファイルを生成するため、これは、１つのセット（または１つのセット群）のペアが、異なるセット（または異なるセット群）のペアと類似または同一の蛍光動態プロファイルを有する場合、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド上のエミッター分子が区別可能な発光を生じさせる限り、両方のペアが使用され得ることを意味する。
【0178】
各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのエミッター分子の励起を引き起こすためには、１つ以上の波長でサンプルを照射する必要がある。使用される特定のエミッター分子またはそれらの組み合わせ次第では、異なる照射源、例えば異なる波長を使用してエミッター分子を励起する必要がある場合もあれば、エミッター分子のすべてを励起するのに単一の光源で十分である場合もある。例として、ＵＶ照射を使用して、Ａｔｔｏ ５９４、Ａｔｔｏ ７００、及びＡｔｔｏ ４６５の各々の励起を引き起こすことができる。
【0179】
例として、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第３のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができる。
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第３のセット群に対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができる。
【0180】
複数のセットによる代替的な多重化
本方法の他の実施形態では、ステップａは、サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットと接触させることを含み、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの発光スペクトルは、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る。このような実施形態では、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットが使用され、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セットは、単一のチャネルで検出可能な蛍光放出を生じさせる対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを有し、例えば、各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、他の各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとは異なる波長の蛍光を放出するエミッター分子を有し、例えば、各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、異なるエミッター分子を有する。
本方法の他の実施形態では、ステップａは、サンプルを、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットと接触させることを含み、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの発光スペクトルは、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る。このような実施形態では、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの複数のセットが使用され、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セットは、単一のチャネルで検出可能な蛍光放出を生じさせる対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを有し、例えば、各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、他の各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとは異なる波長の蛍光を放出するエミッター分子を有し、例えば、各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、異なるエミッター分子を有する。
【0181】
例として、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第３のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができる。
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができるか、
結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つのセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ５５０であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第２のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ４８８であるエミッター分子を含むことができ、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの第３のセットに対するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、Ａｔｔｏ６４７であるエミッター分子を含むことができる。
【0182】
セット及びセット群の混合物を使用した多重化
本方法の他の実施形態では、セット及びセット群の混合物が使用され得る。例えば、
ステップａは、サンプルを、
ｉ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、１つまたは複数のセット、及び
ｉｉ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、１つまたは複数のセット群
と接触させることを含み得、
サンプルの動態蛍光プロファイルを観察するステップは、各励起／発光スペクトルに対するチャネルで、サンプルの動態蛍光プロファイルを観察することを含む。
本方法の他の実施形態では、セット及びセット群の混合物が使用され得る。例えば、
ステップａは、サンプルを、
ｉ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セットについての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセットに特異的なチャネルで検出され得る、１つまたは複数のセット、及び
ｉｉ． 結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つまたは複数のセット群であって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドの各セット群についての対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド中のエミッター分子の発光スペクトルが、そのセット群に特異的なチャネルで検出され得る、１つまたは複数のセット群
と接触させることを含み得、
サンプルの動態蛍光プロファイルを観察するステップは、各励起／発光スペクトルに対するチャネルで、サンプルの動態蛍光プロファイルを観察することを含む。
【0183】
キット
多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、該セットと、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを備え、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、キットも提供される。このキットの構成要素を使用して、本発明の方法を行うことができる。キットは、方法ステップを行うための適切なバッファー及び溶液、例えば、本明細書で定義される固定試薬及び／または本明細書で定義される透過処理試薬、及び／または洗浄ステップのための好適な溶液及び液体をさらに備えていてもよい。
多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットであって、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットであって、該セットが、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、該Ｔオリゴヌクレオチドの配列が、それがコンジュゲートされている該結合剤に特有である、該セットと、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを備え、該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、該セット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、そのセット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する、キットも提供される。このキットの構成要素を使用して、本発明の方法を行うことができる。キットは、方法ステップを行うための適切なバッファー及び溶液、例えば、本明細書で定義される固定試薬及び／または本明細書で定義される透過処理試薬、及び／または洗浄ステップのための好適な溶液及び液体をさらに備えていてもよい。
【0184】
キットは、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上の追加のセット、及び１つ以上の追加のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドをさらに備えていてもよく、さらなる該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの各々は、その対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、各セット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する。
【0185】
したがって、キットは、例えば本方法の文脈で本明細書の他の箇所で定義されるように、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つもしくは複数のセット、または１つもしくは複数のセット群と、対応する数のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとを備えていてもよい。各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、その対応するセット内の複数のＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして複数のペアを形成することができ、異なる各ペアの間の解離及び再会合は、各セット内でそのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成する。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの発光スペクトルは、そのセットまたはそのセット群に特異的であり得、セット間及びセット群間で異なり得る。
【0186】
本発明はまた、Ｔオリゴヌクレオチドの１つ以上のセット、及び１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを含む、多重化蛍光顕微鏡検査のためのキットを作製するための結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの１つ以上のセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、Ｔオリゴヌクレオチドのセット、及び１つ以上のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、本明細書の他の箇所で定義されているとおりである。
【0187】
好ましいＴオリゴヌクレオチドのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる：
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号１（５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）及び
配列番号２（５’－ＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）の一方または両方、
ならびに
ｏ配列番号７（５’－ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号３（５’－ＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＴ－３’）、
配列番号４（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴ－３’）、
配列番号５（５’－ＧＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴ－３’）及び
配列番号６（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、列挙されたＴオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２、３、または４つすべて）、
ならびに
ｏ配列番号８（５’－ＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号１（５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）及び
配列番号２（５’－ＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）の一方または両方、
ならびに
ｏ配列番号７（５’－ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号３（５’－ＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＴ－３’）、
配列番号４（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴ－３’）、
配列番号５（５’－ＧＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴ－３’）及び
配列番号６（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）のうちの少なくとも１つ（例えば、列挙されたＴオリゴヌクレオチドのうちの少なくとも２、３、または４つすべて）、
ならびに
ｏ配列番号８（５’－ＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
【0188】
上記の２つのセットは、例えば、２つの対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、オーバーラップする発光スペクトルを有するエミッター分子を含み、場合により同じエミッター分子を有する場合、セット群として一緒に使用され得る。
【0189】
キットを調製する方法
本発明はまた、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが提供される、上記で言及したキットを調製する方法を提供する。本方法は、Ｔオリゴヌクレオチドのセットを結合剤のセットとコンジュゲートして、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを形成することをさらに含み、ここで、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、そのセット内で、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。コンジュゲーションステップは、上記のものなどの当技術分野で知られている任意の好適な手段によって行うことができる。
本発明はまた、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの各セット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが提供される、上記で言及したキットを調製する方法を提供する。本方法は、Ｔオリゴヌクレオチドのセットを結合剤のセットとコンジュゲートして、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットを形成することをさらに含み、ここで、結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのセットは、異なる特異性を有する複数の結合剤を含み、Ｔオリゴヌクレオチドの配列は、そのセット内で、それがコンジュゲートされている結合剤に特有である。コンジュゲーションステップは、上記のものなどの当技術分野で知られている任意の好適な手段によって行うことができる。
【0190】
本発明の方法で使用するためのＴオリゴヌクレオチドのセット及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを設計する方法
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの生成：
概して、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが最初に生成され、続いてＴオリゴヌクレオチド配列が生成される。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、概して、本方法が適用されるサンプル中に見出されるいかなる配列にも相補的ではないヌクレオチド配列を有する。これは、サンプル中の標的分子に結合する結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの非存在下で蛍光放出を生じさせる、サンプル中の核酸物質とのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを回避するためである。
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの生成：
概して、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが最初に生成され、続いてＴオリゴヌクレオチド配列が生成される。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、概して、本方法が適用されるサンプル中に見出されるいかなる配列にも相補的ではないヌクレオチド配列を有する。これは、サンプル中の標的分子に結合する結合剤－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートの非存在下で蛍光放出を生じさせる、サンプル中の核酸物質とのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを回避するためである。
【0191】
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを生成するための好適なプロセスを以下に示す。単純なヌクレオチドからより複雑なヌクレオチドの組み合わせを含んでランダムに生成され、いかなる既知のゲノム配列ともマッチしないように事前にフィルター処理された配列から、初期配列を選択する。好適な配列は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの非結合状態において、例えば電子移動または電子交換に関与するために、末端を近接させるのに十分な柔軟性を提供する。
【0192】
本方法で使用されるペアの蛍光動態プロファイルには多様性がある必要があるため、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの長さは、それが結合状態（すなわち、Ｔオリゴヌクレオチドと会合した状態）を保つ所望の時間の長さに基づいて選択され得る。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの長さを伸ばすと塩基ペアリングが強化されるため、解離にはより長い時間がかかるか、またはより多くのエネルギーが必要になる。そのＧＣ含有量を増加させると塩基ペアリングが強化されるため、解離にはより長い時間がかかるか、またはより多くのエネルギーが必要になる。
【0193】
ｉｎ ｓｉｌｉｃｏでＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに好適な配列が生成されたら、その配列を試験して、二次構造が存在しないこと、ならびにセルフライゲーション及び／または本方法で使用される他のＦＲＥＴオリゴとの交差二量化の可能性がないことを確認する。これは、大抵のオリゴヌクレオチド供給業者によって提供されている標準的なソフトウェアツールなど、当技術分野で知られている方法によって行うことができる。市販のツールの例には、例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈの「Ｏｌｉｇｏ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｔｏｏｌ」、Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒの「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｐｒｉｍｅｒ Ａｎａｌｙｚｅｒ」、ＩＤＴの「ＯｌｉｇｏＡｎａｌｙｚｅｒ（商標）Ｔｏｏｌ」が含まれる。
【0194】
Ｔオリゴヌクレオチドの生成：
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列が生成されたら、次いで好適なＴオリゴヌクレオチドを生成することができる。概して、これは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの全部または一部に完全に相補的な配列から出発することによって行われる。
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列が生成されたら、次いで好適なＴオリゴヌクレオチドを生成することができる。概して、これは、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの全部または一部に完全に相補的な配列から出発することによって行われる。
【0195】
完全に相補的な配列にミスマッチを導入することにより、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで可能なＴオリゴヌクレオチドが生成される。例えば、ミスマッチは、可能な塩基ペアの２０～４０％に導入され得る。ミスマッチは、上記で説明したように、異なるパターンで導入され得る。
【0196】
所定のペアについて可能な蛍光プロファイル動態は、ミスマッチの数及び位置から推測され得る（例えば、一連のミスマッチがあるペアは、同数のミスマッチを有するが配列全体に均等に分布しているペアとは異なるプロファイルを有する）。必要な蛍光動態プロファイルを生じさせる可能性が高い配列が合成され、それらの点滅プロファイルについて試験される。
【0197】
これは、例えば図２に示されている。ＦＲＥＴ／Ｔオリゴペアの蛍光原性プロファイルは、溶液中で評価することができる。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを溶液中で異なるＴオリゴヌクレオチドと接触させ、様々なＴオリゴヌクレオチド濃度で蛍光放出を測定し、場合により、完全にマッチする配列と比較する。図２Ａに見られるように、完全にマッチするオリゴヌクレオチドは、ミスマッチするＴオリゴヌクレオチドとは異なるプロファイルを生成し、異なるミスマッチペアは、溶液中で異なる蛍光原性プロファイルを有する。ＦＲＥＴオリゴが、ＦＲＥＴオリゴとＴオリゴヌクレオチドとの間の適切な塩基ペアリングに干渉するミスマッチを含む異なるＴオリゴヌクレオチドの存在下にあるとき、これらの独特の動態プロファイルが生成される。各ＴオリゴヌクレオチドへのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、より破壊的なミスマッチが蛍光原性の見かけの低減をもたらす、独特の蛍光原性プロファイルが生成される。
【0198】
溶液中で試験すると、全体の蛍光量のみが測定され得る。プロファイルに関するさらなる情報は、今回は表面上に固定化されている同じＴオリゴヌクレオチドにＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを加えることによって生成され得る（Ｔオリゴヌクレオチドを結合剤にコンジュゲートさせ、これをサンプルに結合させることで、Ｔオリゴヌクレオチドがサンプル上に効果的に固定化されるようにする、本発明の方法において起こることを模倣している）。この構成におけるＦＲＥＴオリゴは、断続的な蛍光を放出する。図２Ｂは、試験したオリゴヌクレオチドペアの代表的な結果を示しており、ペアごとに１秒当たりの点滅事象の数（例えば、指定された秒の時間枠内の蛍光放出の発生回数）が示されている。上記で説明したように、指定された時間枠内の蛍光放出の発生回数は、蛍光動態プロファイルの１成分である。点滅動態は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの蛍光原性プロファイルを低減させる破壊的なミスマッチなど、Ｔオリゴヌクレオチドに導入されたミスマッチの性質を含む要因に影響される。図２Ｂに示すように、異なるペアでは、指定された時間枠内での蛍光放出の発生回数が異なる。
【0199】
この試験形式で所定のペアの蛍光動態プロファイルを観察できるということは、ペアを設計するときに、所定の用途に必要な範囲のプロファイルをもたらすために適切な配列を選択できることを意味する。
【0200】
したがって、本発明は、本発明の方法で使用するためのＴオリゴヌクレオチドのセット及びＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを設計する方法を提供し、該方法は、
ａ． 少なくとも１２ヌクレオチドの長さのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列を選択することと、
ｂ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に相補的である少なくとも８ヌクレオチドの長さの１つ以上の配列を取得することと、
ｃ． 各々が該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに相補的な該配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる、複数の潜在的なＴオリゴヌクレオチド配列を生成することと、
ｄ． 互いに異なる蛍光動態プロファイルを生成する少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列の能力に基づいて、該少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列を選択することとを含む。
ａ． 少なくとも１２ヌクレオチドの長さのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列を選択することと、
ｂ． 該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に相補的である少なくとも８ヌクレオチドの長さの１つ以上の配列を取得することと、
ｃ． 各々が該ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに相補的な該配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる、複数の潜在的なＴオリゴヌクレオチド配列を生成することと、
ｄ． 互いに異なる蛍光動態プロファイルを生成する少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列の能力に基づいて、該少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列を選択することとを含む。
【0201】
少なくとも１２ヌクレオチドの長さのＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列を選択するステップａは、上記のように行うことができ、（ｉ）潜在的なＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、本方法が適用されるサンプル中に見出されるいかなる配列にも相補的ではないヌクレオチド配列を有するかどうかを決定すること、（ｉｉ）該配列が、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの非結合状態において、例えば電子移動または電子交換に関与するために、末端を近接させるのに十分な柔軟性を有するかどうかを決定すること、（ｉｉ）潜在的なＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが、本発明の方法で使用される別のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのいかなる配列にも相補的ではないヌクレオチド配列を有するかどうかを決定することのうちの１つ以上を含み得る。
【0202】
ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド配列に相補的である少なくとも８ヌクレオチドの長さの１つ以上の配列を取得するステップｂは、単に、相補的ペアを作ることによって行われる。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは概して少なくとも１２ヌクレオチド単位の長さであり、Ｔオリゴヌクレオチドはそれより短い場合があるため、このステップは、長さの異なる複数の可能な相補的配列を作製することを必要とし得る。
【0203】
各々がＦＲＥＴオリゴヌクレオチドに相補的な配列とは少なくとも１ヌクレオチド異なる、複数の潜在的なＴオリゴヌクレオチド配列を生成するステップｃは、ステップｂと同様に、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏまたは手作業で行うことができる。
【0204】
互いに異なる蛍光動態プロファイルを生成する少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列の能力に基づいて、少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチド配列を選択するステップｄは、配列、例えばミスマッチの性質、数、及び位置からこれらの特性を推測すること、または分子を合成してそれらを試験することによって行うことができる。それらを試験するステップは、溶液中の各ペアのメンバー同士を接触させ、蛍光放出を観察すること、例えば発光の量を決定することを含み得る。これは、例えば図２Ａに示すような蛍光原性プロファイルを生成するために、潜在的なＴオリゴヌクレオチドの複数の濃度で行われ得る。さらに、潜在的なＴオリゴヌクレオチドを固体表面上に固定化し、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドと接触させ、各ペアの蛍光動態プロファイルを観察してもよい。
【0205】
次いで、少なくとも２つのＴオリゴヌクレオチドを選択して、セットを形成する。これらのＴオリゴヌクレオチドは、セット内で特有の蛍光動態プロファイルを生じさせる。
【0206】
第２もしくは後続のセットに含まれる、またはセット群で使用するためのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを設計する際に、同じ原理を適用することができる。第２または後続のセットに関する追加の考慮事項には、（ｉ）ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド（複数可）が他のセット内のいずれのＴオリゴヌクレオチドにもハイブリダイズしない必要性、及び（ｉｉ）他のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドにハイブリダイズしない必要性が含まれる。
【0207】
好ましいＴオリゴヌクレオチドのセット及び対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドには、以下が含まれる：
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号１（５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）及び
配列番号２（５’－ＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）の一方または両方、
ならびに
ｏ配列番号７（５’－ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号３（５’－ＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＴ－３’）、
配列番号４（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴ－３’）、
配列番号５（５’－ＧＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴ－３’）及び
配列番号６（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’）
の配列の１つ以上のＴオリゴヌクレオチド（複数可）、
ならびに
ｏ配列番号８（５’－ＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号１（５’－ＴＴＣＣＡＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）及び
配列番号２（５’－ＡＴＣＣＣＣＡＴＴＡＣＴＴＣＴ－３’）
の配列のＴオリゴヌクレオチド（複数可）の一方または両方、
ならびに
ｏ配列番号７（５’－ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド、
－ 以下を含む（場合によりそれらからなる）セット：
ｏ配列番号３（５’－ＧＧＧＴＧＧＣＧＴＡＴＧＡＴＡＧＣＴＡＴ－３’）、
配列番号４（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＴＡＴＧＡＴＡＧＴＴＡＴ－３’）、
配列番号５（５’－ＧＧＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＧＴＡＧＴＴＡＴ－３’）及び
配列番号６（５’－ＡＧＧＴＴＡＡＧＣＧＴＴＡＴＡＴＴＴＡＴ－３’）
の配列の１つ以上のＴオリゴヌクレオチド（複数可）、
ならびに
ｏ配列番号８（５’－ＡＴＡＡＣＴＡＴＣＡＴＡＣＴＴＡＡＣＣＴ－３’）の配列の対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチド。
【0208】
通則
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなる場合もあれば、何らかの追加要素を含む、例えばＸ＋Ｙである場合もある。
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含する。例えば、Ｘを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなる場合もあれば、何らかの追加要素を含む、例えばＸ＋Ｙである場合もある。
【0209】
数値ｘに関する「約」という用語は、例えば、ｘ±１０％を意味する。
【0210】
「実質的に」という言葉は「完全に」を除外しない。例えば、Ｙを「実質的に含まない」組成物は、Ｙを完全に含まなくてもよい。必要に応じて、「実質的に」という言葉は本発明の定義から省略されてもよい。
【0211】
本発明が、複数の連続ステップを含むプロセスを提供する場合、これらのステップは、示された順序、すなわち番号順またはアルファベット順で行われる。しかし、当業者であれば、ステップの順序を変更しても依然として有用な結果を達成できることを理解するであろう。本発明は、総数未満のステップを含むプロセスを提供することもできる。
【図面の簡単な説明】
【0212】
【図1】フェルスター共鳴エネルギー移動オリゴヌクレオチド（ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド）－Ｔオリゴヌクレオチドペアを使用した、ＤＮＡに基づく確率的蛍光を示す。（Ａ）ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドが溶液中にあるとき、エミッターの励起波長を照射すると、消光体への効率的なエネルギー移動のために、蛍光は観察されない。（Ｂ）しかし、固定化されたＴオリゴヌクレオチドとのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションにより、エミッター及び消光体が物理的に分離され、ＦＲＥＴの速度が低下して、エミッターフルオロフォアからの発光がハイブリダイゼーション部位で検出できるようになる。
【図2A】ＦＲＥＴ／Ｔオリゴペアの蛍光原性及び点滅プロファイルを示す。ＦＲＥＴ／Ｔオリゴペアの蛍光原性プロファイルが、溶液中で評価されている。ＦＲＥＴオリゴが、ＦＲＥＴオリゴとＴオリゴヌクレオチドとの間の適切な塩基ペアリングに干渉するミスマッチを含む異なるＴオリゴヌクレオチドの存在下にあるとき、独特の動態プロファイルが生成される。各ＴオリゴヌクレオチドへのＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションによって、より破壊的なミスマッチが蛍光原性の見かけの低減をもたらす、独特の蛍光原性プロファイルが生成される。点滅動態は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの蛍光原性プロファイル（Ａ）を低減させる破壊的なミスマッチが、その点滅速度（Ｂ）を増加させるように、Ｔオリゴヌクレオチドに導入されるミスマッチの性質を含む要因に影響される。
【図2B】ＦＲＥＴ／Ｔオリゴペアの蛍光原性及び点滅プロファイルを示す。今回は抗体コンジュゲーションを介して表面上または細胞中に固定されている同じＴオリゴヌクレオチドにＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを加えると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの断続的な蛍光を直接観察することができる。点滅動態は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの蛍光原性プロファイル（Ａ）を低減させる破壊的なミスマッチが、その点滅速度（Ｂ）を増加させるように、Ｔオリゴヌクレオチドに導入されるミスマッチの性質を含む要因に影響される。
【図3A】様々な蛍光動態プロファイルの例を示す。
【図3B】様々な蛍光動態プロファイルの例を示す。
【図3C】様々な蛍光動態プロファイルの例を示す。
【図3D】様々な蛍光動態プロファイルの例を示す。
【図4A】細胞サンプル中の固定化されたＴオリゴヌクレオチド＋ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの結合からの放出シグナルの表現を示す。特定の細胞成分の構造を認識する一次抗体が、異なるＴオリゴヌクレオチドに共有結合しており、固定され透過処理された細胞の免疫標識に使用される。ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの一時的なハイブリダイゼーションにより、所定の焦点で断続的な蛍光が生じる。
【図4B】細胞サンプル中の固定化されたＴオリゴヌクレオチド＋ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの結合からの放出シグナルの表現を示す。結合ハイブリダイゼーション（したがって蛍光）の動態を区別することにより、各焦点のアイデンティティを数十のＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴヌクレオチドペアのうちの１つまたはバックグラウンドに割り当てることができる。
【図5A】Ｔオリゴヌクレオチドのデコンボリューションを行ったチャネル画像の構築を示す。細胞サンプルが、異なる分子エピトープを認識する抗体で標識されている。各抗体種は、異なるＴオリゴヌクレオチドにコンジュゲートされている。次に、コンジュゲートされたＴオリゴヌクレオチドに対応するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドがサンプルに加えられる。各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドのペアは、同じエミッターフルオロフォア及び蛍光クエンチャーを用いる。Ｔオリゴヌクレオチドから結合解除されると、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドは、ＦＲＥＴに基づく消光のために蛍光を発することができない。対応するＴオリゴヌクレオチドとハイブリダイズすると、ハイブリダイゼーション部位で蛍光が発生する。経時的な画像捕捉により、各ピクセルの蛍光を測定し、プロファイルを作成することができる。
【図5B】Ｔオリゴヌクレオチドのデコンボリューションを行ったチャネル画像の構築を示す。各ＦＲＥＴオリゴヌクレオチド／Ｔオリゴヌクレオチドペアは特有の動態結合プロファイルを有するため、これを使用して、ピクセルの蛍光プロファイルを、そのＴオリゴヌクレオチドのアイデンティティ、ひいては細胞標的に関連付けることができる。
【図5C】Ｔオリゴヌクレオチドのデコンボリューションを行ったチャネル画像の構築を示す。各ピクセルは、特定のＴオリゴヌクレオチドのアイデンティティ、またはバックグラウンドに割り当てられている。
【図5D】Ｔオリゴヌクレオチドのデコンボリューションを行ったチャネル画像の構築を示す。単一のレーザー励起波長を使用した実験にもかかわらず、この割り当てから、各イメージングモダリティに対する別個のチャネル画像を生成することができる。
【図6】異なるＴオリゴヌクレオチドの存在下でのＣｙ５－ＢＨＱ－３ ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドの用量応答を示す。ウェルの底から約１０μｍ上でキャプチャされた５０×１０ｍｓ画像のスタック全体で算定された生のピクセルの総数または平均数のいずれかを使用して、３つの反復試験の蛍光強度を平均した。Ｃｙ５標識対照オリゴ（すなわち、消光されていないエミッター）について取得された平均蛍光値に対して値を正規化した。ＦＲＥＴオリゴ／完全マッチＴオリゴペア（０ミスマッチ）については、すべてのサンプルプレートの平均値を算定した。ここに示されているのは、各群内で取得された様々なプロファイルの９５％ ＣＩを包含する各陰影領域を含む、ミスマッチの数によって集計されたプロットである。
【図7A】広範囲の蛍光原性プロファイルが、３つのミスマッチを有するＴオリゴの存在下のＦＲＥＴオリゴについて取得されることを示す。これは、ミスマッチが等しくなく、一部がその他よりも高コストであることを示唆する。各ハイブリダイゼーションについて、位置及び塩基置換が示されている。
【図7B】広範囲の蛍光原性プロファイルが、３つのミスマッチを有するＴオリゴの存在下のＦＲＥＴオリゴについて取得されることを示す。これは、ミスマッチが等しくなく、一部がその他よりも高コストであることを示唆する。各ハイブリダイゼーションについて、位置及び塩基置換が示されている。
【図8A】Ｔオリゴへの４つのミスマッチの導入は、概してコストが高くなり、ＦＲＥＴオリゴの蛍光原性プロファイルに劇的に影響することを示す（正規化された蛍光が０．１未満に留まる用量応答曲線）。しかし、ＦＲＥＴオリゴは、いくつかの選択されたＴオリゴにはより良好にハイブリダイズするように見受けられる（正規化された蛍光が０．１～０．２に達する曲線）。比較すると、Ｔオリゴが４つのミスマッチを含む高速点滅ペア（点線）は、蛍光原性が低いものに含まれる。
【図8B】Ｔオリゴへの４つのミスマッチの導入は、概してコストが高くなり、ＦＲＥＴオリゴの蛍光原性プロファイルに劇的に影響することを示す（正規化された蛍光が０．１未満に留まる用量応答曲線）。しかし、ＦＲＥＴオリゴは、いくつかの選択されたＴオリゴにはより良好にハイブリダイズするように見受けられる（正規化された蛍光が０．１～０．２に達する曲線）。比較すると、Ｔオリゴが４つのミスマッチを含む高速点滅ペア（点線）は、蛍光原性が低いものに含まれる。
【図9A】Ｔオリゴにおける単一のミスマッチの導入が、ミスマッチの位置及びそのアイデンティティに応じて、ＦＲＥＴオリゴの溶液中の蛍光プロファイルに異なる影響を与えることを示す。各ハイブリダイゼーションについて、位置及び塩基置換が示されている。漸増濃度の完全に相補的なＴオリゴと共にＦＲＥＴオリゴをインキュベートしたときに取得される蛍光プロファイルが含まれている。同じ位置だが異なるミスマッチを有するハイブリダイゼーションパートナーが示されている。例えば、１４位の置換を比較すると、ＴからＡへの置換はＦＲＥＴオリゴの蛍光原性に実質的に影響を与えないが、ＴからＣへの置換は蛍光原性の低下をもたらすことが示される。
【図9B】Ｔオリゴにおける単一のミスマッチの導入が、ミスマッチの位置及びそのアイデンティティに応じて、ＦＲＥＴオリゴの溶液中の蛍光プロファイルに異なる影響を与えることを示す。各ハイブリダイゼーションについて、位置及び塩基置換が示されている。漸増濃度の完全に相補的なＴオリゴと共にＦＲＥＴオリゴをインキュベートしたときに取得される蛍光プロファイルが含まれている。同じ位置だが異なるミスマッチを有するハイブリダイゼーションパートナーが示されている。例えば、１４位の置換を比較すると、ＴからＡへの置換はＦＲＥＴオリゴの蛍光原性に実質的に影響を与えないが、ＴからＣへの置換は蛍光原性の低下をもたらすことが示される。
【図10】４０秒の合計捕捉期間にわたる点滅事象の累積数及び分布を示す、相補的な「マッチ」及びミスマッチＴオリゴについての最大強度Ｚ投影を示す。スポットの数の増加は、点滅事象の数の増加を示す。ミスマッチＴオリゴヌクレオチド（右）は、マッチＴオリゴヌクレオチド（左）よりも、露光中に多くの点滅を生じる。
【図11】異なるＴオリゴとペアにしたＦＲＥＴオリゴの蛍光動態プロファイリングを表すワークフローを示す。各実験群について、２０００枚の画像を２０ｍｓのフレームレートで捕捉し、合計捕捉時間を４０秒とした。蛍光強度の時間トレース（四角で囲ったトレース）は、画像スタック内の特定の関心領域の動態プロファイルを示す（これにそれらが関連付けられる）。右側のヒストグラムプロットは、２つの異なるＴオリゴ設計の合計捕捉時間にわたるフレーム当たりの点滅事象の累積頻度を示す。
【図12A】ビオチン／ストレプトアビジン被覆ガラスカバースリップ上の固定化されたＴオリゴにＦＲＥＴオリゴを加えた際に取得された焦点動態プロファイルを示す。各測定では、１０００×２０ｍｓの露光で個々の焦点を記録した。完全マッチＴオリゴヌクレオチド（Ａ）及びミスマッチＴオリゴヌクレオチド（Ｂ）について、サンプル蛍光動態プロファイルが示されている。露光の総持続時間中の点滅事象の平均数は、マッチＴオリゴヌクレオチド（１．８）の方が、ミスマッチＴオリゴヌクレオチド（４．６）と比較して少ない。さらに、所定の点滅事象の平均オン時間は、ミスマッチ（３０ｍｓ）に対し、マッチＴオリゴヌクレオチドの方が長い（９５ｍｓ）。これらは、Ｔオリゴヌクレオチドのアイデンティティをデコンボリューションするために使用され得る２つの例示的なメトリックである。
【図12B】ビオチン／ストレプトアビジン被覆ガラスカバースリップ上の固定化されたＴオリゴにＦＲＥＴオリゴを加えた際に取得された焦点動態プロファイルを示す。各測定では、１０００×２０ｍｓの露光で個々の焦点を記録した。完全マッチＴオリゴヌクレオチド（Ａ）及びミスマッチＴオリゴヌクレオチド（Ｂ）について、サンプル蛍光動態プロファイルが示されている。露光の総持続時間中の点滅事象の平均数は、マッチＴオリゴヌクレオチド（１．８）の方が、ミスマッチＴオリゴヌクレオチド（４．６）と比較して少ない。さらに、所定の点滅事象の平均オン時間は、ミスマッチ（３０ｍｓ）に対し、マッチＴオリゴヌクレオチドの方が長い（９５ｍｓ）。これらは、Ｔオリゴヌクレオチドのアイデンティティをデコンボリューションするために使用され得る２つの例示的なメトリックである。
【図13】ＦＲＥＴオリゴを加えた際の、ミスマッチ及び相補的な「マッチ」Ｔオリゴのスペクトル非依存多重化イメージングＳＩＭＩを示す。１００ｎＭのＦＲＥＴオリゴの存在下のＴオリゴ被覆ビーズ。画像は、１０ｍｓの露光１０００回の最大強度Ｚ投影を表す。丸印は、相補的Ｔオリゴ（Ａ）及びミスマッチＴオリゴ（Ｂ）を含むビーズ、ならびにそれらの対応する動態プロファイル（右パネル＋）を示す。丸印Ｃは、バックグラウンドを測定するために使用した等面積領域を示す。丸で囲った領域内で測定された平均シグナルが、露光時間に対してプロットされている。ミスマッチＴオリゴヌクレオチドで被覆されたビーズは、マッチＴオリゴヌクレオチドで被覆されたビーズよりも少ない全体的蛍光を呈する。これは単一のＦＲＥＴオリゴヌクレオチドを使用した同じサンプルであるため、この差異は、ミスマッチＴオリゴヌクレオチドにおける点滅のオン時間がより短いことに起因する。
【図14A】固定細胞上の６つの細胞標的のスペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）を示す。標的は、２つの異なるＴオリゴセットから導出された異なるＴオリゴに各々がコンジュゲートされている、固定細胞上の６つの異なる抗体を固定化することによってイメージングした。各々がＴオリゴのセットの一方に会合した２つのＦＲＥＴオリゴを同時に加え、イメージングバッファーに５ｎＭで希釈した。露光各１０ｍｓの１００００フレームをＮｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズで捕捉し、Ｃｙ５フィルターセットでフィルター処理し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＭＯＳカメラを使用してイメージングした。Ｐｉｃａｓｓｏ及びＱＣ－ＳＴＯＲＭソフトウェアを使用して、累積されたフレームから超解像度画像を再構成した。各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する蛍光動態プロファイルから導出されたメトリックを使用して、超解像画像の逆多重化を行った。個々の分子の空間的位置を含む超解像度画像が、数千枚の生画像から再構成されている（経時的連続画像を形成している）。
【図14B】固定細胞上の６つの細胞標的のスペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）を示す。標的は、２つの異なるＴオリゴセットから導出された異なるＴオリゴに各々がコンジュゲートされている、固定細胞上の６つの異なる抗体を固定化することによってイメージングした。各々がＴオリゴのセットの一方に会合した２つのＦＲＥＴオリゴを同時に加え、イメージングバッファーに５ｎＭで希釈した。露光各１０ｍｓの１００００フレームをＮｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズで捕捉し、Ｃｙ５フィルターセットでフィルター処理し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＭＯＳカメラを使用してイメージングした。Ｐｉｃａｓｓｏ及びＱＣ－ＳＴＯＲＭソフトウェアを使用して、累積されたフレームから超解像度画像を再構成した。各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する蛍光動態プロファイルから導出されたメトリックを使用して、超解像画像の逆多重化を行った。再構成された画像の逆多重化により、個々の細胞標的を別個のチャネルに割り当てることが可能になる。６つの個々のグレースケールチャネル画像が示され、サンプル上の６つの異なる細胞標的の位置が特定される。
【図14C】固定細胞上の６つの細胞標的のスペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）を示す。標的は、２つの異なるＴオリゴセットから導出された異なるＴオリゴに各々がコンジュゲートされている、固定細胞上の６つの異なる抗体を固定化することによってイメージングした。各々がＴオリゴのセットの一方に会合した２つのＦＲＥＴオリゴを同時に加え、イメージングバッファーに５ｎＭで希釈した。露光各１０ｍｓの１００００フレームをＮｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズで捕捉し、Ｃｙ５フィルターセットでフィルター処理し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＭＯＳカメラを使用してイメージングした。Ｐｉｃａｓｓｏ及びＱＣ－ＳＴＯＲＭソフトウェアを使用して、累積されたフレームから超解像度画像を再構成した。各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する蛍光動態プロファイルから導出されたメトリックを使用して、超解像画像の逆多重化を行った。定義された数のフレームにわたって算定されるピクセルワイズの関連メトリックを使用して、ピクセルがＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペア（ひいては細胞標的）に割り当てられる。これらのメトリックのいくつかは、ここで３つの例示的なピクセルについて示すように、時間的トレース（蛍光動態プロファイル）から算定され得る。
【図14D】固定細胞上の６つの細胞標的のスペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）を示す。標的は、２つの異なるＴオリゴセットから導出された異なるＴオリゴに各々がコンジュゲートされている、固定細胞上の６つの異なる抗体を固定化することによってイメージングした。各々がＴオリゴのセットの一方に会合した２つのＦＲＥＴオリゴを同時に加え、イメージングバッファーに５ｎＭで希釈した。露光各１０ｍｓの１００００フレームをＮｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズで捕捉し、Ｃｙ５フィルターセットでフィルター処理し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＭＯＳカメラを使用してイメージングした。Ｐｉｃａｓｓｏ及びＱＣ－ＳＴＯＲＭソフトウェアを使用して、累積されたフレームから超解像度画像を再構成した。各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する蛍光動態プロファイルから導出されたメトリックを使用して、超解像画像の逆多重化を行った。各ピクセルから抽出された時空間情報を含む特徴をプロットして、ピクセルを分類し、標的の割り当て（逆多重化）を行うことができる。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【0213】
実施例１
細胞内の異なるエピトープを認識する様々な抗体に、Ｔオリゴを共有結合させる。標準的な細胞生物学プロトコルを用いて、細胞を固定し、透過処理する。一次抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを、固定され透過処理されたサンプルと接触させ、それぞれのエピトープ部位に結合させる。細胞を洗浄して、非結合状態の抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを取り除く。次いで、エミッターフルオロフォアの励起波長での照射下で、ＦＲＥＴオリゴをサンプルと共にインキュベートする。ＦＲＥＴオリゴがそれぞれのＴオリゴとハイブリダイズしていないとき、消光体は、エミッターフルオロフォアからの蛍光放出を抑制する。ハイブリダイゼーションすると、この消光が解除され、ハイブリダイゼーション部位での蛍光の検出が可能になる。
細胞内の異なるエピトープを認識する様々な抗体に、Ｔオリゴを共有結合させる。標準的な細胞生物学プロトコルを用いて、細胞を固定し、透過処理する。一次抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを、固定され透過処理されたサンプルと接触させ、それぞれのエピトープ部位に結合させる。細胞を洗浄して、非結合状態の抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを取り除く。次いで、エミッターフルオロフォアの励起波長での照射下で、ＦＲＥＴオリゴをサンプルと共にインキュベートする。ＦＲＥＴオリゴがそれぞれのＴオリゴとハイブリダイズしていないとき、消光体は、エミッターフルオロフォアからの蛍光放出を抑制する。ハイブリダイゼーションすると、この消光が解除され、ハイブリダイゼーション部位での蛍光の検出が可能になる。
【0214】
高速ＣＭＯＳセンサーは、数秒から数分でサンプルの画像を捕捉する。各焦点の蛍光が経時的にモニターされ、動態蛍光プロファイルが生成される。特定の焦点における蛍光プロファイル（またはそのメトリック）を使用することで、その焦点の蛍光動態プロファイルが決定される。
【0215】
各ピクセルのアイデンティティは、ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの１つ、またはバックグラウンドに割り当てられる。
【0216】
各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアのピクセルは、個々のチャネルに分離され、同じ照射波長の光の下でキャプチャされた数十の異なるイメージングモダリティを表す。
【0217】
実施例２
実施例２－スペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）で使用するための独特の焦点動態プロファイルを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとトランス活性化オリゴヌクレオチドのペアの生成
序論
目的は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドまたはＦＲＥＴオリゴと呼ばれるプローブを使用した超解像度顕微鏡検査による多重イメージングのためのプラットフォームを開発することである。これらのＦＲＥＴオリゴは、指定されたＤＮＡ標的への一時的な結合、及びその結果としての可視状態と不可視状態との間の切り替え（すなわち、点滅）を可能にするように設計されている。この設計は、ＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動）による消光を利用しており、ＦＲＥＴオリゴの末端は、非蛍光クエンチャーアクセプターなどのクエンチャー及びエミッター（例えば、フルオロフォアドナー）とコンジュゲートされている。プローブのヌクレオチド配列は、高い構造的柔軟性を提供し、エミッター及びクエンチャーを近接させて、強力な消光及びバックグラウンド蛍光の抑制をもたらすことができる。ＦＲＥＴオリゴがトランス活性化オリゴヌクレオチドまたはＴオリゴに結合すると、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を妨げるコンフォメーション変化が起こり、ドナーの蛍光が検出される。
実施例２－スペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）で使用するための独特の焦点動態プロファイルを有するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドとトランス活性化オリゴヌクレオチドのペアの生成
序論
目的は、ＦＲＥＴオリゴヌクレオチドまたはＦＲＥＴオリゴと呼ばれるプローブを使用した超解像度顕微鏡検査による多重イメージングのためのプラットフォームを開発することである。これらのＦＲＥＴオリゴは、指定されたＤＮＡ標的への一時的な結合、及びその結果としての可視状態と不可視状態との間の切り替え（すなわち、点滅）を可能にするように設計されている。この設計は、ＦＲＥＴ（フェルスター共鳴エネルギー移動）による消光を利用しており、ＦＲＥＴオリゴの末端は、非蛍光クエンチャーアクセプターなどのクエンチャー及びエミッター（例えば、フルオロフォアドナー）とコンジュゲートされている。プローブのヌクレオチド配列は、高い構造的柔軟性を提供し、エミッター及びクエンチャーを近接させて、強力な消光及びバックグラウンド蛍光の抑制をもたらすことができる。ＦＲＥＴオリゴがトランス活性化オリゴヌクレオチドまたはＴオリゴに結合すると、ドナーからアクセプターへのエネルギー移動を妨げるコンフォメーション変化が起こり、ドナーの蛍光が検出される。
【0218】
スペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）は、原理上、ナノメートル長スケールで無制限の数の細胞内標的をイメージングすることができる。ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴのペアを使用するＳＩＭＩは、様々なオリゴヌクレオチド配列設計に関連する点滅速度の動態プロファイリングを目的としている。これにより、単回の超解像度画像捕捉で複数の標的マーカーを識別することが可能になり、ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに基づくＳＩＭＩのフェノミクスプロファイリング能力の大幅な向上につながる可能性がある。この目標を実現するには、異なるＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの動態プロファイルが、同じ視野で正確に識別されるように互いに十分に異なっている必要がある。
【0219】
材料及び方法
オリゴ
例示的なＦＲＥＴオリゴは、５’末端及び３’末端でそれぞれＣｙ５フルオロフォア及びＢＨＱ－３ダーククエンチャーとコンジュゲートさせた、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＲｘｉｖ ２０２０（Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．ＫＨ，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｋｉｄｄ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＮＤ．，Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，Ｂａｄｄｅｌｅｙ，Ｄ．ａｎｄ Ｂｅｗｅｒｓｄｏｒｆ，Ｂ．（２０２０）．Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｆａｓｔ ３Ｄ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ．ＢｉｏＲｘｉｖ）に由来する１５ヌクレオチド長の配列（５’ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ（配列番号７））である。我々はＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、ミスマッチをランダムな位置で導入することにより、Ｔオリゴを生成した。すべてのオリゴ（すなわち、ＦＲＥＴオリゴ及びＴオリゴ）は、ＩＤＴから購入し、１００μＭ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。凍結融解サイクルの数を制限するためにアリコートを調製し、－２０℃で貯蔵した。
オリゴ
例示的なＦＲＥＴオリゴは、５’末端及び３’末端でそれぞれＣｙ５フルオロフォア及びＢＨＱ－３ダーククエンチャーとコンジュゲートさせた、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏＲｘｉｖ ２０２０（Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．ＫＨ，Ｚｈａｎｇ，Ｚ．，Ｋｉｄｄ，Ｐ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｗｉｌｌｉａｍｓ，ＮＤ．，Ｒｏｌｌｉｎｓ，Ｂ．，Ｙａｎｇ，Ｙ．，Ｌｉｎ，Ｃ．，Ｂａｄｄｅｌｅｙ，Ｄ．ａｎｄ Ｂｅｗｅｒｓｄｏｒｆ，Ｂ．（２０２０）．Ｆｌｕｏｒｏｇｅｎｉｃ ｐｒｏｂｅ ｆｏｒ ｆａｓｔ ３Ｄ ｗｈｏｌｅ－ｃｅｌｌ ＤＮＡ－ＰＡＩＮＴ．ＢｉｏＲｘｉｖ）に由来する１５ヌクレオチド長の配列（５’ＡＧＡＡＧＴＡＡＴＧＴＧＧＡＡ（配列番号７））である。我々はＰｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、ミスマッチをランダムな位置で導入することにより、Ｔオリゴを生成した。すべてのオリゴ（すなわち、ＦＲＥＴオリゴ及びＴオリゴ）は、ＩＤＴから購入し、１００μＭ ＴＥバッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ及び１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に再懸濁した。凍結融解サイクルの数を制限するためにアリコートを調製し、－２０℃で貯蔵した。
【0220】
蛍光原性プロファイリング
ＴＥバッファー中で１００μＭ、１０μＭ、または１μＭのＴオリゴを調製し、イメージングバッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌを含む１×ＰＢＳ）で５、５０、５００、または５０００ｎＭに希釈した。ＦＲＥＴオリゴは、総量５０μＬ中で５０ｎＭの最終濃度で使用した。
ＴＥバッファー中で１００μＭ、１０μＭ、または１μＭのＴオリゴを調製し、イメージングバッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌを含む１×ＰＢＳ）で５、５０、５００、または５０００ｎＭに希釈した。ＦＲＥＴオリゴは、総量５０μＬ中で５０ｎＭの最終濃度で使用した。
【0221】
バッファー単独、Ｃｙ５もしくはＢＨＱ－３で標識したオリゴヌクレオチド単独、またはＦＲＥＴオリゴ単独を対照として使用した。さらに、上記で定義したような漸増濃度の完全に相補的なＴオリゴと共にインキュベートしたＦＲＥＴオリゴを含むサンプルを追加の対照として使用して、ＦＲＥＴオリゴの固有の蛍光原性プロファイルを定義した。
【0222】
プローブからの蛍光放出は、Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５０倒立顕微鏡を使用して測定した。５３０～５５０ｎｍのバンドパスフィルターでフィルター処理した水銀アークランプを使用してサンプルを照射した。サンプルからの蛍光放出を５９０ｎｍのロングパスフィルターに通し、ｓＣＭＯＳカメラチップ上にイメージングした。各ウェルに４０倍０．６ＮＡ対物レンズを使用して１０ｍｓ露光の５０枚の画像を捕捉し（２回目の積分時間は５００ｍｓ）、ｉｍａｇｅ Ｊを使用してスタック画像すべてのピクセル強度を平均または合計した。各サンプルは９６ウェルプレートに三連でロードした。
【0223】
バッファーまたはＢＨＱ－３標識オリゴのみを含むイメージングウェルからのバックグラウンド蛍光（値は同等であった）を、各サンプルについて取得された蛍光強度値から差し引いた。報告値は３つの反復試験の平均として算定し、Ｃｙ５標識オリゴ（すなわち、消光されていないエミッター）で取得された蛍光強度値に対して正規化した。
【0224】
ＳＩＭＩ
Ｔオリゴ点滅プロファイリング
各Ｔオリゴについて、１μＭのビオチン化Ｔオリゴを、１８ウェルのＩｂｉｄｉスティッキースライドにマウントされたＢＳＡ－ビオチン－ストレプトアビジン被覆ガラスカバースリップに加え、３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベートした。次いで、洗浄したカバースリップを５０μＬのイメージングバッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＥバッファー）に浸し、顕微鏡下に置いた。次いで、１０ｎＭのＣｙ５／ＢＨＱ－３ ＦＲＥＴオリゴＦｒｅｔプローブをサンプルに加えた。全出力（１５０ｍＷ）で動作する６３９ｎｍレーザーで励起した後、Ｎｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズを使用して蛍光を収集し、Ｃｙ５フィルターセットでフィルター処理し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＭＯＳカメラを使用してイメージングした。捕捉された画像の画像分析及び後処理はＩｍａｇｅＪで行い、オープンソースプラグインｔｒａｃｋｍａｔｅを使用して単一粒子検出を行った。
Ｔオリゴ点滅プロファイリング
各Ｔオリゴについて、１μＭのビオチン化Ｔオリゴを、１８ウェルのＩｂｉｄｉスティッキースライドにマウントされたＢＳＡ－ビオチン－ストレプトアビジン被覆ガラスカバースリップに加え、３７℃で１時間または４℃で一晩インキュベートした。次いで、洗浄したカバースリップを５０μＬのイメージングバッファー（５００ｍＭ ＮａＣｌを含むＴＥバッファー）に浸し、顕微鏡下に置いた。次いで、１０ｎＭのＣｙ５／ＢＨＱ－３ ＦＲＥＴオリゴＦｒｅｔプローブをサンプルに加えた。全出力（１５０ｍＷ）で動作する６３９ｎｍレーザーで励起した後、Ｎｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズを使用して蛍光を収集し、Ｃｙ５フィルターセットでフィルター処理し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ＣＭＯＳカメラを使用してイメージングした。捕捉された画像の画像分析及び後処理はＩｍａｇｅＪで行い、オープンソースプラグインｔｒａｃｋｍａｔｅを使用して単一粒子検出を行った。
【0225】
Ｔオリゴ焦点動態プロファイリング
５μＬのストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ（Φ＝３μｍ）を５０μＬの結合／洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。次いで、洗浄したビーズを１μＭのビオチン化Ｔオリゴと混合し、４℃で一晩インキュベートした。
５μＬのストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズ（Φ＝３μｍ）を５０μＬの結合／洗浄バッファー（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５；１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に再懸濁した。次いで、洗浄したビーズを１μＭのビオチン化Ｔオリゴと混合し、４℃で一晩インキュベートした。
【0226】
ミスマッチ及び完全に相補的なＴオリゴがコンジュゲートされたビーズの混合物１μＬを、１８ウェルのＩｂｉｄｉスティッキースライドのＢＳＡ／ビオチン被覆ガラスカバースリップ上に固定化し、上記と同じ顕微鏡セットアップを用い、１００ｎＭのＦＲＥＴオリゴの存在下でイメージングした。
【0227】
１０００回の１０ｍｓ露光のスタックを使用して、高速及びマッチＴオリゴの点滅動態プロファイルを生成した。
【0228】
結果
我々は、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏｒＸｉｖ ２０１９によって公開されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、ＦＲＥＴ実験で一般的に使用される色素／クエンチャーペアであるＣｙ５及びＢＨＱ－３で５’末端及び３’末端をそれぞれ標識することにより、ＦＲＥＴオリゴを設計した。
我々は、Ｃｈｕｎｇ ｅｔ ａｌ．ＢｉｏｒＸｉｖ ２０１９によって公開されたオリゴヌクレオチド配列を使用して、ＦＲＥＴ実験で一般的に使用される色素／クエンチャーペアであるＣｙ５及びＢＨＱ－３で５’末端及び３’末端をそれぞれ標識することにより、ＦＲＥＴオリゴを設計した。
【0229】
漸増濃度の分解されたＴオリゴの存在下で、Ｃｙ５／ＢＨＱ－３ ＦＲＥＴオリゴの溶液中の蛍光を測定した。これらを生成するために、完全に相補的なＴオリゴのランダムな位置で１～６ヌクレオチドを改変するＰｙｔｈｏｎスクリプトを設計した。１～６つのミスマッチの各カテゴリーで１５個のＴオリゴを、ＦＲＥＴオリゴへの結合時の蛍光の放出について試験した。
【0230】
ハイブリダイゼーションパートナーに導入されたミスマッチの数と、各プローブ／パートナーペアについて取得された用量応答曲線（図６）との間には、導入されるミスマッチが多いほど、プローブの蛍光原性及び飽和蛍光レベル（ＳＦＬ）値が低くなるような、一般的相関関係があることが観察された。さらに、いくつかの注目すべき例外を除いて、２つ以上のミスマッチを有するＴオリゴは、完全に相補的なＴオリゴよりも３～４０倍高い活性化濃度５０（ＡＣ５０）を示した。これは、ＦＲＥＴオリゴを活性化させるには、より高い濃度の部分的に相補的なハイブリダイゼーションパートナーが必要であることを示唆している。概して、５つ以上のミスマッチの導入は、ＦＲＥＴオリゴプローブの蛍光原性を大幅に減少させた。これは、場合によっては完全に消失する可能性がある（図６）。蛍光原性プロファイルの最も広い範囲は、３つのミスマッチの導入で得られたが（図７）、４つのミスマッチを有するいくつかのＴオリゴは、大多数よりも優れた性能を示すように見受けられた（図８）。
【0231】
特にミスマッチが４つ以下のＴオリゴについて、特定のミスマッチが蛍光原性プロファイルにおいて観察された差異を説明し得るかどうかをさらに調査するために、置換の位置及びアイデンティティを分析した。単一のミスマッチを有するＴオリゴとＦＲＥＴオリゴプローブの分析は、ある特定の位置が他の位置よりも用量応答及びＳＦＬに大きく影響することを示した（図９）。概して、配列における最初の残基及び中央に位置する残基は、ＦＲＥＴオリゴがＴオリゴに結合するのに重要であるが、下流の位置はさほど重要ではないと見受けられた。同様の位置だが異なる置換を伴うミスマッチの比較は、一部の残基が他の残基よりもＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴのハイブリダイゼーション及び蛍光の放出にとって有害であり得ることを示唆した。
【0232】
次のステップでは、ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの蛍光原性とその点滅特性との間に相関関係が存在するという仮説を検証するために、独特の蛍光原性プロファイルを有するＴオリゴのセットを選択した。
【0233】
点滅事象を記録するためのロバストな測定プロトコルを確立するために、「マッチ」と表される完全に相補的なＴオリゴと、「ミスマッチ」と表される４つのヌクレオチドミスマッチを有するＴオリゴとの２つのＴオリゴ設計についてまず研究した。表面に固定化されたＴオリゴを含む各ウェルの３つの異なる領域で、２０００×２０ｍｓの露光からなる画像スタックを捕捉した。２つのＴオリゴに関する２０００×２０ｍｓのカメラ露光の最大強度ｚ投影の分析により、完全に相補的なＴオリゴと比較すると４ミスマッチＴオリゴにおける事象の数が大幅に増加した、事象の密度における質的変化が明らかになった（図１０）。関心領域を選択し、画像スタック全体で蛍光強度を測定することにより（図１１）、点滅が発生する関心領域の個々の時間トレースを可視化した（緑及び紫の線プロット）。フレームごとに検出された事象の総数の累積分布の分析により、フレーム当たりの点滅頻度が増加するにつれて分布が右にシフトし、２つのＴオリゴについて異なる動態プロファイルを識別できることが実証された。
【0234】
この実験プラットフォーム及び分析ワークフローを使用して、異なる配列設計及び蛍光原性プロファイルを有するＴオリゴのセットに結合したＣｙ５－ＢＨＱ３／Ｆｒｅｔプローブによって生成された点滅事象を検出した。異なるＴオリゴ間の動態点滅プロファイルにおける変化が、溶液中の対応するＴオリゴの逆の蛍光原性プロファイルに対応する、すなわち、高速点滅動態を有するＴオリゴは溶液中の蛍光原性プロファイルが低く、その逆も同様であることが観察された（図２）。
【0235】
次いで、Ｔオリゴをカバースリップ表面から解離させることなく、捕捉期間（１０００フレーム、２０ｍｓ／フレーム）の全体で個々の焦点から複数の点滅事象をキャプチャできるように、ビオチン－ストレプトアビジン被覆カバースリップ上に固定化された相補的Ｔオリゴ及びミスマッチＴオリゴについて、８つの焦点それぞれの焦点動態プロファイルを分析した。焦点を測定すると、オン時間τｏｎが１００ｍｓを超えることはめったにないミスマッチＴオリゴと比較して、点滅する相補的Ｔオリゴではτｏｎが数十ミリ秒から数秒の範囲であった（図１２）。露光の総持続時間中の点滅事象の平均数も、マッチＴオリゴヌクレオチド（１．８）の方が、ミスマッチＴオリゴヌクレオチド（４．６）と比較して少ない。これは、Ｔオリゴヌクレオチドのアイデンティティをデコンボリューションするために使用され得る２つの例示的なメトリックを示す。
【0236】
最後に、ミスマッチ及び相補的Ｔオリゴとコンジュゲートされたストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズの混合物を、ＢＳＡ／ビオチン被覆ガラス上の単一ウェルで固定化し、１００ｎＭ ＦＲＥＴオリゴプローブの存在下で、ＴＩＲＦモードでイメージングした。各測定では、単焦点からの蛍光を２０ｍｓの露光で１，０００回記録した。ガラスカバースリップ上に固定化されたＴオリゴで以前に見られたように、ビーズ表面上の固定化されたＴオリゴを表す、捕捉中の複数の点滅事象があった焦点が識別された。ミスマッチＴオリゴで被覆されたビーズ上で検出された短いτｏｎと比較して、τｏｎが長い焦点は、相補的Ｔオリゴで被覆されたビーズ上で識別できた（図９）。
【0237】
結論
完全に相補的なＴオリゴのランダムな位置に１～６つのミスマッチを導入することによって生成された、溶液中の９０個のＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの体系的な蛍光原性プロファイリングは、ミスマッチの数がペアの蛍光原性と相関することを示した。すなわち、Ｔオリゴが含むミスマッチが多いほど、Ｔオリゴへのハイブリダイゼーション時のＦＲＥＴオリゴの蛍光原性は低くなり、これはおそらく、ＦＲＥＴオリゴとＴオリゴとの間の結合を不安定にすることによるものと考えられる。また、ＦＲＥＴオリゴの蛍光原性プロファイルが影響を受ける程度に、ミスマッチの位置が影響することも分かった。Ｔオリゴ配列の中央部分におけるミスマッチは、ＦＲＥＴオリゴの蛍光原性により大きな影響を与えると見受けられた。さらに、隣接するミスマッチは、より強い影響を及ぼした。これはおそらく、より大きな隆起を作り出し、したがってハイブリダイゼーションペアをさらに不安定にすることによると考えられる。
完全に相補的なＴオリゴのランダムな位置に１～６つのミスマッチを導入することによって生成された、溶液中の９０個のＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの体系的な蛍光原性プロファイリングは、ミスマッチの数がペアの蛍光原性と相関することを示した。すなわち、Ｔオリゴが含むミスマッチが多いほど、Ｔオリゴへのハイブリダイゼーション時のＦＲＥＴオリゴの蛍光原性は低くなり、これはおそらく、ＦＲＥＴオリゴとＴオリゴとの間の結合を不安定にすることによるものと考えられる。また、ＦＲＥＴオリゴの蛍光原性プロファイルが影響を受ける程度に、ミスマッチの位置が影響することも分かった。Ｔオリゴ配列の中央部分におけるミスマッチは、ＦＲＥＴオリゴの蛍光原性により大きな影響を与えると見受けられた。さらに、隣接するミスマッチは、より強い影響を及ぼした。これはおそらく、より大きな隆起を作り出し、したがってハイブリダイゼーションペアをさらに不安定にすることによると考えられる。
【0238】
我々は次に、指定されたペアのオン／オフレートが溶液中のその蛍光をプロファイリングするだけで予測できるような、ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの蛍光原性プロファイルと点滅速度との間の相関関係を確立することが可能かどうかを評価した。固定化されたＴオリゴにＦＲＥＴオリゴがハイブリダイズした際に生成された点滅プロファイルを分析した。ＦＲＥＴオリゴとのペアリングにより独特の蛍光原性プロファイルをもたらす６つの異なるＴオリゴを選択した。ＦＲＥＴオリゴとのペアリングの際に溶液中で低蛍光原性プロファイルを生成するＴオリゴは、表面に固定化されると高い高速点滅速度を示すのに対し、蛍光原性が高いペアは低い点滅速度を示すことが観察された。これは、蛍光原性プロファイルと点滅動態プロファイルとの間の逆相関関係を示唆した。これは、潜在的な非特異的点滅を回避するために今回はビーズ上に固定化された完全に相補的なＴオリゴまたはミスマッチＴオリゴに加えたときのＦＲＥＴオリゴの焦点動態プロファイルを分析することにより、さらに確認された。τｏｎが長い焦点と、τｏｎが短い焦点の、２つの異なるタイプの焦点が識別され、これらはそれぞれ、完全に相補的及びミスマッチな固定化されたＴオリゴへのＦＲＥＴオリゴのハイブリダイゼーションに対応する。これらの結果は、同時にイメージングされる異なるＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアについて焦点動態プロファイルが確立され得ることを実証するのに成功した。
【0239】
実施例３
実施例３－固定細胞上の６つの細胞標的のスペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）
細胞内の６つの異なるエピトープを認識する６つの一次抗体にＴオリゴ（１～６、表３参照）を共有結合させ、６つの一次抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを形成した。
実施例３－固定細胞上の６つの細胞標的のスペクトル非依存多重化イメージング（ＳＩＭＩ）
細胞内の６つの異なるエピトープを認識する６つの一次抗体にＴオリゴ（１～６、表３参照）を共有結合させ、６つの一次抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを形成した。
【表4】
【0240】
市販のヒトがん細胞を固定し、透過処理した（材料及び方法を参照のこと）。次いで、固定され透過処理されたサンプルと一次抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを接触させた。細胞を洗浄して、非結合状態の抗体－Ｔオリゴコンジュゲートを除去した。次いで、両方とも５’末端でＣｙ５フルオロフォアと、３’末端でＢＨＱ－３ダーククエンチャーとコンジュゲートされた２つのＦＲＥＴオリゴ（Ａ及びＢ、表３参照）を、サンプルと共にインキュベートした。
【0241】
２つのＦＲＥＴオリゴは各々、そのセット内の抗体－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートと可逆的にハイブリダイズすることができ、すなわち、Ｔオリゴａ～ｂは、セット１内のＦＲＥＴオリゴＡとハイブリダイズすることができ、Ｔオリゴｃ～ｆは、セット２内のＦＲＥＴオリゴＢとハイブリダイズすることができる。
【0242】
サンプルをＣｙ５の励起波長で照射した。各ＦＲＥＴオリゴについて、それがそれぞれのＴオリゴのうちの１つとハイブリダイズしていないとき、消光体ＢＨＱ－３は、エミッターフルオロフォアＣｙ５からの蛍光放出を抑制する。ハイブリダイゼーションすると、この消光が解除され、ハイブリダイゼーション部位での蛍光の検出が可能になる。
【0243】
高速ＣＭＯＳセンサーは、数秒から数分でサンプルの画像を経時的連続画像として捕捉する（図１４Ａ）。焦点の各々の蛍光が経時的にモニターされ、動態蛍光プロファイルが生成される。特定の焦点における蛍光プロファイル（またはその１つ以上のメトリック）を使用することで、その焦点の蛍光動態プロファイルが決定される。この実施例では、焦点の直径は２～３ピクセルである。各ピクセルのアイデンティティは、ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴペアの１つ、またはバックグラウンドに割り当てられる。
【0244】
各々の異なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドＴオリゴヌクレオチドペアが、そのペアに特有の蛍光動態プロファイルを生成するため、各ピクセルにおける蛍光動態プロファイル（トレース例は図１４Ｃに示されている）に、アイデンティティを（例えば、それを生成した特定のＴオリゴヌクレオチドに対して）割り当てることができる。このようにして、ピクセルにおけるサンプルの蛍光動態プロファイル（例えば、その少なくとも１つのメトリックに関して定義されるもの）に基づいて、そのピクセルにアイデンティティが割り当てられる。
【0245】
ＴｈｕｎｄｅｒＳＴＯＲＭ（Ｏｖｅｓｎｙ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２０１４））、ＱＣ－ＳＴＯＲＭ（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｏｐｔ．Ｅｘｐｒｅｓｓ ２０１９）、及びＰｉｃａｓｓｏ（Ｓｃｈｎｉｔｚｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１７）のソフトウェアに見出されるものなどの標準的な位置特定アルゴリズムを使用して、累積フレームから超解像度画像を再構成した（図１４Ａ）。この実施例では、超解像画像に逆多重化を行った（図１４Ｂ）。しかし、逆多重化は超解像度再構成の有無にかかわらず可能である。各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する点滅プロファイルから導出された時空間メトリックに対し、標準的なクラスターベースの数学的アプローチを使用して、標的の割り当てを行った。図１４Ｄは、逆多重化を行うことができる２つの抽出された特徴（例えば、点滅持続時間、及びオフ時間）の散布図を示す（図１４Ｄ）。
【0246】
この実施例では、１種類のフルオロフォア（Ｃｙ５）のみを使用してＦＲＥＴオリゴを標識しているため、表３に示すＦＲＥＴオリゴ及び抗体－Ｔオリゴヌクレオチドコンジュゲートのペアのセットは、同じ「色」を持つペアのセット群１つ（第１群）を形成する（すなわち、これらは単一のチャネルを介して観察される）。他の例では、追加の群のＦＲＥＴオリゴが異なる「色」で発光する場合、例えば、ＦＲＥＴオリゴを標識するためのフルオロフォアとしてＣｙ３を使用することにより、ペアが第１群に見られるものと類似または同一のプロファイルを生成する、さらなるセット群（例えば、第２群、第３群…）を追加してもよい。この追加のレベルの多重化は、複数の異なるイメージングチャネルを使用して画像を捕捉することによってデコンボリューションされる。
【0247】
材料及び方法
オリゴ
それぞれ１５ヌクレオチド及び２０ヌクレオチドの長さであり、両方とも５’末端でＣｙ５フルオロフォアと、３’末端でＢＨＱ－３ダーククエンチャーとコンジュゲートされた、２つのＦＲＥＴオリゴを使用した。Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、さもなければ完全に相補的な配列にランダムな位置でミスマッチを導入することにより、Ｔオリゴを生成した。Ｔオリゴの配列を表３に示す。Ｔオリゴ及びＦＲＥＴオリゴは、ＩＤＴから購入し、１００μＭ ＴＥバッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁し、アリコートとして－２０℃で貯蔵した。
オリゴ
それぞれ１５ヌクレオチド及び２０ヌクレオチドの長さであり、両方とも５’末端でＣｙ５フルオロフォアと、３’末端でＢＨＱ－３ダーククエンチャーとコンジュゲートされた、２つのＦＲＥＴオリゴを使用した。Ｐｙｔｈｏｎスクリプトを使用して、さもなければ完全に相補的な配列にランダムな位置でミスマッチを導入することにより、Ｔオリゴを生成した。Ｔオリゴの配列を表３に示す。Ｔオリゴ及びＦＲＥＴオリゴは、ＩＤＴから購入し、１００μＭ ＴＥバッファー（１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ ＥＤＴＡ ｐＨ８．０）に再懸濁し、アリコートとして－２０℃で貯蔵した。
【0248】
一次抗体コンジュゲーション
各標的について、１）α－チューブリン、２）カルネキシン、３）ゴルジン－９７、４）Ｋｉ－６７、５）ミオシンＩＩＢ、及び６）Ｔｏｍｍ－２０に対する市販の一次抗体１５μｇを異なるＴオリゴとのコンジュゲーションのために使用して、コンジュゲーションごとに８００ｐｍｏｌのオリゴを補充した。次いで、抗体コンジュゲートを５０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５カラムで精製した後、４℃で貯蔵した。
各標的について、１）α－チューブリン、２）カルネキシン、３）ゴルジン－９７、４）Ｋｉ－６７、５）ミオシンＩＩＢ、及び６）Ｔｏｍｍ－２０に対する市販の一次抗体１５μｇを異なるＴオリゴとのコンジュゲーションのために使用して、コンジュゲーションごとに８００ｐｍｏｌのオリゴを補充した。次いで、抗体コンジュゲートを５０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ－０．５カラムで精製した後、４℃で貯蔵した。
【0249】
免疫標識
１８ウェルガラス底マイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ）に細胞を播種し、約８０％コンフルエントになったときに４％ ＰＦＡで固定した。ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、０．２ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ）中で、細胞を６０分間室温でインキュベートし、次いでＴオリゴ－抗体ミックスと共に４℃で一晩インキュベートし、各Ｔオリゴ－抗体コンジュゲートは、１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％硫酸デキストランで１／１００～１／２００に希釈した。
１８ウェルガラス底マイクロスライド（Ｉｂｉｄｉ）に細胞を播種し、約８０％コンフルエントになったときに４％ ＰＦＡで固定した。ブロッキングバッファー（１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、０．２ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ）中で、細胞を６０分間室温でインキュベートし、次いでＴオリゴ－抗体ミックスと共に４℃で一晩インキュベートし、各Ｔオリゴ－抗体コンジュゲートは、１×ＰＢＳ、１％ＢＳＡ、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％硫酸デキストランで１／１００～１／２００に希釈した。
【0250】
イメージング
イメージングバッファー（１×ＰＢＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、５ｍｇ／ｍｌグルコース、０．０４ｍｇ／ｍｌカタラーゼ、１ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ）で希釈した５ｎＭのＦＲＥＴオリゴと共に免疫標識細胞をインキュベートした。１０ｍｓ／フレーム、１６ビット、２－ＣＭＳゲインモードで１００００枚の画像をＮｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズで捕捉し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓＣＭＯＳカメラを備えたＣｙ５フィルターセットでフィルター処理した。ＱＣ－ＳＴＯＲＭまたはＰｉｃａｓｓｏソフトウェアを使用して、最終的な超解像度画像を再構成した。次いで、各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する点滅プロファイルから導出された時空間メトリックに対し、標準的なクラスターベースの数学的アプローチを使用して、各チャネルから個々の標的のアイデンティティを取得するための逆多重化を行った。
イメージングバッファー（１×ＰＢＳ、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ ｐＨ８、５００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍｇ／ｍｌグルコースオキシダーゼ、５ｍｇ／ｍｌグルコース、０．０４ｍｇ／ｍｌカタラーゼ、１ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ）で希釈した５ｎＭのＦＲＥＴオリゴと共に免疫標識細胞をインキュベートした。１０ｍｓ／フレーム、１６ビット、２－ＣＭＳゲインモードで１００００枚の画像をＮｉｋｏｎの６０倍１．４９ＮＡ ＴＩＲＦ対物レンズで捕捉し、Ｐｒｉｍｅ ＢＳＩ Ｅｘｐｒｅｓｓ ｓＣＭＯＳカメラを備えたＣｙ５フィルターセットでフィルター処理した。ＱＣ－ＳＴＯＲＭまたはＰｉｃａｓｓｏソフトウェアを使用して、最終的な超解像度画像を再構成した。次いで、各ＦＲＥＴオリゴ／Ｔオリゴに関連する点滅プロファイルから導出された時空間メトリックに対し、標準的なクラスターベースの数学的アプローチを使用して、各チャネルから個々の標的のアイデンティティを取得するための逆多重化を行った。
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12A-1】
【図12A-2】
【図12B-1】
【図12B-2】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図14C-1】
【図14C-2】
【図14D】
【配列表】
【国際調査報告】