特表 2024-509557 ＮＫｐ４６に対する抗体とその応用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-04

(54)【発明の名称】ＮＫｐ４６に対する抗体とその応用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240226BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240226BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240226BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240226BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240226BHJP

   C07K 14/705 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240226BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240226BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240226BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 51/10 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 49/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 31/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 37/06 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 39/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240226BHJP

   A61K 51/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 47/22 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 47/02 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 47/18 20170101ALI20240226BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240226BHJP

   A61K 9/08 20060101ALI20240226BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240226BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240226BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C07K16/46

C07K19/00

C07K14/725

C07K14/705

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12N15/62

C12N15/12

C12P21/00 C

A61K51/10 200

A61K49/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 121

A61P31/00

A61P29/00

A61P37/06

A61K45/00

A61K39/00 H

A61K39/395 E

A61K39/395 T

A61K39/395 C

A61K39/395 L

A61K47/68

A61K51/00 100

A61K48/00

A61K39/395 U

A61K39/395 G

A61K47/22

A61K47/02

A61K47/18

A61K47/26

A61K9/08

A61P37/04

G01N33/53 Y

G01N33/53 D

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553738

(86)(22)【出願日】2022-03-04

(85)【翻訳文提出日】2023-09-04

(86)【国際出願番号】 CN2022079236

(87)【国際公開番号】W WO2022184162

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】202110243601.5

(32)【優先日】2021-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523172132

【氏名又は名称】上海齊魯制藥研究中心有限公司

【氏名又は名称原語表記】ＳＨＡＮＧＨＡＩ ＱＩＬＵ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＤＥＶＥＬＯＰＭＥＮＴ ＣＥＮＴＲＥ ＬＴＤ．

(74)【代理人】

【識別番号】110000729

【氏名又は名称】弁理士法人ユニアス国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】楊 柳青

(72)【発明者】

【氏名】顧 津明

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG20

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA05

4B064DA13

4B064DA14

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA87X

4B065AA90Y

4B065AA94Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA12

4C076AA95

4C076CC03

4C076CC04

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC31

4C076CC41

4C076DD09

4C076DD23Z

4C076DD49Z

4C076DD60Z

4C076EE23

4C076EE59

4C084AA12

4C084AA13

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB021

4C084ZB081

4C084ZB091

4C084ZB111

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZB271

4C084ZB311

4C084ZC751

4C085AA06

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA16

4C085AA25

4C085AA26

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB12

4C085BB36

4C085BB42

4C085BB50

4C085CC03

4C085CC05

4C085CC31

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C085HH03

4C085HH11

4C085HH13

4C085KA03

4C085KA05

4C085KA26

4C085KA27

4C085KA29

4C085KB82

4C085LL18

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA70

4H045BA71

4H045BA72

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045DA83

4H045EA22

4H045EA28

4H045EA51

4H045FA74

(57)【要約】

ＮＫｐ４６受容体に対する抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む誘導物、医薬組成物及びそれらのがん治療における関連応用を提供する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４～１３３配列で示されるＣＤＲから選ばれる３つのＣＤＲを含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

重鎖可変領域を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１からなる群から選ばれるＨＣＤＲ１；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２からなる群から選ばれるＨＣＤＲ２；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３からなる群から選ばれるＨＣＤＲ３を含み、
好ましくは、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３から選ばれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４～４３、１３６～１５２で示される重鎖可変領域に由来し、好ましくは、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４～４３、１３６～１５２で示される配列と少なくとも８０％～１００％の配列同一性を有する、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項4】

前記抗体は、組換え抗体であり、好ましくは、アルパカ由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり、より好ましくは、前記抗体がナノボディであり、さらに好ましくは、前記抗体は、ヒト化ラクダ科ＶＨＨである、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項5】

さらに重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ又は変異体Ｆｃを含み、Ｆｃは、マウス又はヒトに由来し、及び／又は、
前記抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４形態である、
前記の請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項6】

前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片と捕捉マーカー又は検出マーカーとをカップリングして形成されるコンジュゲートであって、前記検出マーカーが放射性核種、発光物質、着色物質又は酵素を含むコンジュゲート。

【請求項7】

抗原結合ドメインの１つが、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体又は多重特異性抗体。

【請求項8】

前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含み、抗体、リンカー及び毒物を互いに接続させることで形成される、抗体－薬物複合体。

【請求項9】

キメラ抗原受容体であって、その細胞外認識ユニットが、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項10】

前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、或いは、前記核酸を含む組換えベクター、或いは、前記組換えベクターを含む宿主細胞又は前記核酸がゲノムに組み込まれている宿主細胞。

【請求項11】

適切な条件で請求項１０に記載の宿主細胞を培養こと、及び前記細胞から発現産物を精製することを含む、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を調製する方法。

【請求項12】

ＮＫｐ４６を発現する細胞を特異的に標的とする薬物の調製における、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用、又は、ＮＫｐ４６を特異的に発現する疾患の治療、予防又は検出における前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用であって、好ましくは、前記細胞がＮＫ細胞である、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用。

【請求項13】

がん、感染症、炎症性又は自己免疫性疾患の薬物の調製における、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用、又は、がん、感染症、炎症性又は自己免疫性疾患の治療における、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用であって、好ましくは、前記がんは、白血病、侵襲性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経膠腫、子宮頸がん、頭頸部がん、直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん等を含む、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用。

【請求項14】

ＮＫｐ４６を発現する診断試薬の調製における、前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用。

【請求項15】

前記請求項のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片と緩衝液を含む、抗ＮＫｐ４６抗体含有溶液製剤。

【請求項16】

細胞を含む生体から生体サンプルを取得すること、前記細胞を請求項１～５に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片と接触させること、及び、抗体が細胞に結合するかどうかを評価することを含む、生体におけるＮＫｐ４６発現細胞の存在を同定する方法。

【請求項17】

有効量の前記の請求項１～５のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含み、或いは、有効量の請求項６に記載のコンジュゲートを含み、或いは、有効量の請求項７に記載の二重特異性抗体又は多重特異性抗体を含み、或いは、有効量の請求項８に記載の抗体－薬物複合体を含み、或いは、有効量の請求項９に記載のキメラ抗原受容体を含み、或いは、有効量の請求項１０に記載の核酸、組換えベクター又は宿主細胞を含み、
好ましくは、薬学的に許容可能な担体をさらに含み、
より好ましくは、１種又は複数種の他の追加の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記１種又は複数種の他の追加の治療剤は、化学治療剤、細胞毒性剤、放射性療法剤、がんワクチン、腫瘍減量剤、標的抗癌剤、抗血管新生剤、生物学的応答修飾剤、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤及び免疫治療剤を含む、医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、免疫学分野に属し、具体的に、本開示は、ＮＫｐ４６受容体に対する抗体又はその抗原結合断片、前記抗体又はその抗原結合断片を含む誘導物、医薬組成物及びそのがん治療における関連応用に関する。

【背景技術】

【0002】

ＮＫ細胞は、先天性免疫系におけるエフェクターリンパ球に属し、ウイルス感染を抵抗し、並びに腫瘍の発生を防止する身体の防御の最前線である。獲得免疫系における細胞毒性Ｔ細胞と類似する役割を果たすが、それらの相違点は次のとおりである。即ち、通常の場合、細胞毒性Ｔ細胞は、サイトカインの放出を引き起こし、さらに標的細胞の溶解又はアポトーシスを引き起こすためにウイルス細胞の表面にあるＭＨＣを検出する必要がある。一方、ＮＫ細胞は、抗体やＭＨＣがない場合でも、これらの細胞を認識して迅速な免疫応答を実行することができる。自身のマーカーを失ったＭＨＣクラスＩ細胞に対して、ＮＫ細胞は、活性化せずに殺傷することができ、これらの細胞は、通常、有害であるが、他の免疫細胞に認識され破壊されることはできない。

【0003】

ＮＫ細胞は、表面の活性化受容体と抑制性受容体とのバランスにより、ＮＫ細胞の活性を調節する。ＮＫ細胞表面の活性化受容体は、ヒト白血球抗原－Ｉ（ｈｕｍａｎ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ－Ｉ、ＨＬＡ－Ｉ）系分子関連受容体及び非関連受容体に分けられ、前者には、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、２つのＩｇドメイン、及び短い細胞質尾部（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ，２ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｈｏｒｔ，ＫＩＲ２ＤＳ）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体、３つのＩｇドメイン、及び短い細胞質尾部（ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ－ｌｉｋｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ、３ ｄｏｍａｉｎｓ ｓｈｏｒｔ、ＫＩＲ３ＤＳ）及びナチュラルキラー群２Ｃ（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｕｐ ２Ｃ、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ｃ）が含まれ、後者には主としてナチュラルキラー群２Ｄ（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｇｒｏｕｐ ２Ｄ，ＮＫＧ２Ｄ）、天然細胞毒性受容体（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ、ＮＣＲであり、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４を含む）及びＤＮＡＸアクセサリー分子１（ＤＮＡＸ ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ－１、ＤＮＡＭ－１）があり、対応する阻害性受容体は、ＫＩＲ２ＤＬ、ＫＩＲ３ＤＬ、及び、ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａなどである。

【0004】

Ｓｉｖｏｒｉらは、１９９７年、ＮＫｐ４６受容体を発見し、当該受容体は、最も早く発見された天然細胞毒性受容体であり、最も重要な天然細胞毒性受容体でもあり、すべてのＮＫ細胞（成熟、未熟、休止及び活性化ＮＫ細胞を含む）の表面に発現され、自然殺戮において重要な役割を果たす。ＮＫ細胞の表面に特異的に発現され、分子量が４６ｋＤであるため、ＮＫｐ４６と名付けられた。ＮＫｐ４６遺伝子は、１９番染色体に位置し、Ｉ型膜貫通型糖タンパク質であり、ＮＫｐ４６の細胞外領域には、Ｄ１及びＤ２という２つのＩｇ様ドメインが含まれ、Ｄ２（細胞膜に近い領域）は腫瘍やウイルス感染細胞のリガンドに結合する領域である。膜貫通領域には、１つの正に荷電したアルギニンと、１つの免疫受容体のチロシンベース活性化配列の欠如する細胞質尾部があり、ＣＤ３ζ及びＦｃγＲ膜貫通領域にあるアスパラギン酸残基と塩橋を形成することができ、後者は、受容体結合を介してチロシンをリン酸化し、ＮＫｐ４６シグナル伝達を媒介する。これまで同定されているＮＫｐ４６のリガンドは、インフルエンザウイルスのヘマグルチニン及びパラインフルエンザウイルスのヘマグルチニンしかなく、細胞のリガンドはまだ知られていない。

【0005】

ＮＫ細胞が標的細胞を殺傷する場合、有毒な顆粒が漿膜表面に到達し、そして、細胞膜と融合し、顆粒内容物の放出を引き起こし、最終的に標的細胞の死をもたらす。脱顆粒の発生に伴い、ＣＤ１０７ａ分子が細胞膜の表面に輸送され、ＣＤ１０７ａ分子の発現アップレギュレーションは、パーフォリンの分泌と一致する。したがって、ＣＤ１０７ａ分子の発現が陽性であるＮＫ細胞は、殺傷活性を有するＮＫ細胞を表すことができる。

【0006】

ＮＫｐ４６の抗腫瘍における役割について、活性化されたＮＫ細胞は、腫瘍細胞を殺傷する強力な効果があり、ＮＫｐ４６受容体が活性化刺激を伝達するために必要な組成である。ＮＫｐ４６の発現の低下は、子宮頸がん及びその前駆病変の免疫回避に関与していることが知られ、ＮＫｐ４６／ＮＣＲ１発現の喪失は、リンパ腫の増殖を増加させる。Ｙａｓｓｅｒらは、すべてのＭＭ細胞株を殺傷するためにＮＫｐ４６が必要であることを実証した。また、ＮＫｐ４６は、中枢神経系におけるミクログリアの除去にも重要な役割を果たし、Ｌｕｎｅｍａｎｎらは、脳に浸潤したＮＫ細胞がＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄを介して認識され、活性化されたＮＫ細胞がミクログリアとシナプス結合を形成し、ミクログリアのパーフォリンが細胞界面に極性化して殺傷の役割を果たすことを実証した。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、ヒト及びカニクイザルのＮＫｐ４６に特異的に結合する抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0008】

いくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４～１３３配列で示されるＣＤＲから選ばれる３つのＣＤＲを含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0009】

いくつかの実施形態において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０４、１０７、１１０、１１３、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１から選ばれるＨＣＤＲ１、及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： ４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０５、１０８、１１１、１１４、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２から選ばれるＨＣＤＲ２；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０６、１０９、１１２、１１５、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３から選ばれるＨＣＤＲ３を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0010】

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０；又は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３からなる群から選ばれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0011】

いくつかの実施形態において、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４～４３、１３６～１５２で示される重鎖可変領域に由来する、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【0012】

いくつかの実施形態において、重鎖可変領域を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４～４３、１３６～１５２で示される配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有する、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0013】

いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、組換え抗体であり、好ましくは、アルパカ抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体である、前記抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0014】

いくつかの実施形態において、前記モノクローナル抗体は、ナノボディであり、好ましくは、ヒト化ラクダ科ＶＨＨである、本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0015】

いくつかの実施形態において、重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域をさらに含み、好ましくは、前記重鎖定常領域がＦｃ又は変異体Ｆｃを含み、Ｆｃがラット又はヒトに由来する、本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態において、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４形態である、本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を提供する。

【0017】

いくつかの実施形態において、前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片が捕捉マーカー又は検出マーカーにカップリングして形成される、本開示に係るコンジュゲートであって、前記検出マーカーが、放射性核種、発光物質、着色物質又は酵素を含む、コンジュゲートを提供する。

【0018】

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの１つが、前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体を提供する。

【0019】

いくつかの実施形態において、抗原結合ドメインの１つが、前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、多重特異性抗体を提供する。

【0020】

いくつかの実施形態において、前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含み、抗体、リンカー及び毒物を互いに接続させることで形成される、抗体－薬物複合体を提供する。

【0021】

いくつかの実施形態において、キメラ抗原受容体であって、その細胞外認識ユニットが、前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体を提供する。

【0022】

いくつかの実施形態において、前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。

【0023】

いくつかの実施形態において、本開示に係る核酸の組換えベクターを提供する。

【0024】

いくつかの実施形態において、本開示に係る組換えベクターを含む宿主細胞又は本開示に係る核酸がゲノムに組み込まれている宿主細胞を提供する。

【0025】

いくつかの実施形態において、適切な条件で本開示に係る宿主細胞を培養こと、及び、前記細胞から発現産物を精製することを含む、本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の方法。

【0026】

いくつかの実施形態において、ＮＫｐ４６を発現する細胞を特異的に標的とする薬物の調製における本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用であって、好ましくは細胞がＮＫ細胞である、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。

【0027】

いくつかの実施形態において、がん、感染症、或いは、炎症性又は自己免疫性疾患の薬物の調製における本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用であって、好ましくは、前記腫瘍は、白血病、侵襲性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経膠腫、子宮頸がん、頭頸部がん、直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん等を含む、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。

【0028】

いくつかの実施形態において、ＮＫｐ４６を発現するＮＫの診断試薬の調製における、本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片の使用を提供する。

【0029】

いくつかの実施形態において、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片及び緩衝液を含む、抗ＮＫｐ４６抗体含有溶液製剤を提供する。

【0030】

いくつかの実施形態において、細胞を含む生体から生体サンプルを取得すること、前記細胞を本開示に係る抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片に接触させること、及び、前記抗体が前記細胞に結合するかどうかを評価することを含む、生体におけるＮＫｐ４６発現細胞の存在を検測する方法を提供する。

【0031】

いくつかの実施形態において、有効量の前記のいずれか１項に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含み、或いは、有効量の二重特異性抗体を含み、或いは、有効量の多重特異性抗体を含み、或いは、有効量の抗体－薬物複合体を含み、或いは、有効量のキメラ抗原受容体を含み、或いは、有効量の核酸を含み、或いは、有効量の組換えベクターを含み、或いは、有効量の宿主細胞を含む、薬物組成物を提供する。

【0032】

いくつかの実施形態において、薬学的に許容可能な担体をさらに含む、本開示に係る医薬組成物を提供する。

【0033】

いくつかの実施形態において、１種又は複数種の他の追加の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記１種又は複数種の他の追加の治療剤は、化学治療剤、細胞毒性剤、放射性療法剤、がんワクチン、腫瘍減量剤、標的抗癌剤、抗血管新生剤、生物学的応答修飾剤、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤及び免疫治療剤を含む、本開示に係る医薬組成物を提供する。

【0034】

いくつかの実施形態において、容器及び容器に収容された本開示に係る医薬組成物を含む、カートリッジ又はキットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0035】

図面は、本明細書に開示の新特徴をさらに説明する。これらの図面を参照すると、本明細書に開示された特性及び利点がよりよく理解されるが、これらの図面は、本明細書に開示された原理の具体的な実施形態のみを説明するために使用され、添付の特許請求の範囲を限定することを意図するものではない。

【0036】

【図1】フローサイトメトリー検出による抗ＮＫｐ４６陽性コントロール抗体により実証されたＣＨＯＫ１細胞におけるヒトＮＫｐ４６の発現状況を示し、図面における実線は、プラスミドのトランスフェクトされていないＣＨＯＫ１親細胞におけるヒトＮＫｐ４６の発現状況を示し、図面における点線は、ＣＨＯＫ１親細胞にヒトＮＫｐ４６プラスミドをトランスフェクトした後、ヒトＮＫｐ４６タンパク質の過剰発現状況を示す。

【図2】フローサイトメトリー検出による抗ＮＫｐ４６陽性コントロール抗体により検証されたＣＨＯＫ１細胞におけるカニクイザルＮＫｐ４６の発現状況を示し、図面における実線は、プラスミドのトランスフェクトされていないＣＨＯＫ１親細胞におけるカニクイザルＮＫｐ４６の発現状況を示し、図面における点線は、ＣＨＯＫ１親細胞にカニクイザルＮＫｐ４６プラスミドをトランスフェクトした後、カニクイザルＮＫｐ４６タンパク質の過剰発現状況を示す。

【図3-6】本開示に係る抗ＮＫｐ４６キメラ抗体のＮＫｐ４６発現細胞（ヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１）への結合状況を示す。

【図7-10】本開示に係る抗ＮＫｐ４６キメラ抗体のＮＫｐ４６発現細胞（カニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１）への結合状況を示す。

【図11-12】本開示に係る抗ＮＫｐ４６キメラ抗体によるインビトロでのＮＫ細胞活性化の結果を示す。

【図13-16】本開示に係る抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体のＮＫｐ４６発現細胞（ヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１）への結合状況を示す。

【図17-20】本開示に係る抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体のＮＫｐ４６発現細胞（カニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１）への結合状況を示す。

【図21-24】本開示に係る抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体によるインビトロでのＮＫ細胞活性化の結果を示す。

【発明を実施するための形態】

【0037】

＜用語＞
本明細書に記載されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、各々の刊行物、特許又は特許出願が特定にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。

【0038】

以下に本発明を詳細に説明する前に、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、解決手段及び試薬に限定されるものではなく、これらが変化することができることを理解すべきである。また、本明細書において使用される用語は、発明を実施するための実施形態を説明するためだけであり、本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解すべきである。別途定義しない限り、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、いずれも当業者が一般的に理解する意味と同じ意味を有する。

【0039】

本明細書に開示されるいくつかの実施形態は、数値範囲を含み、かつ本発明のいくつかの態様は、範囲形式で記載することができる。他の説明がない限り、数値範囲又は範囲で記載される形式は、単に便宜性及び簡潔性のためであることを理解すべきであり、本発明の範囲を厳密に限定するものと見なすべきではない。従って、範囲形式の記載は、本明細書にすでに明示されているとおり、取りうる全ての部分範囲と該範囲内で取りうる全ての特定の数値が具体的に開示するものと考えるべきである。例えば、１～６の範囲の表記について、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲、及び、このような範囲における特定の数値点、例えば１、２、３、４、５、６などが具体的に開示されていると考えるべきである。上記原則は、いずれも同様に適用される。範囲を用いて記載する場合、該範囲は、範囲の端点を含む。

【0040】

量、時間的持続時間などの測定可能な値を指す場合、「約」という用語は、指定された値の±２０％、又は場合によっては±１０％、又は場合によっては±５％、又は場合によっては±１％、又は場合によっては±０．１％を含む変化を意味する。

【0041】

本明細書において使用されるアミノ酸の３文字記号及び１文字記号は、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ、２４３、ｐ３５５８（１９６８）に記載されている。

【0042】

従来型イムノグロブリンは、２つの重鎖及び２つの軽鎖から構成されるヘテロ四量体であり、合わせた分子量は約１５０ｋＤａである。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）のメンバーにおいて、血清抗体の相当な割合が分子量約８０ｋＤのホモ二量体ＩｇＧである（Ｈａｍｅｒｓ－Ｃａｓｔｅｒｍａｎ Ｃ．ら，１９９３， Ｎａｔｕｒｅ，３６３：４４６－４４８）。これらの重鎖イムノグロブリン（Ｉｇ）は３つのドメインを含有し、その可変領域はＶＨＨ（ｖａｒｉａｂｌｅ ｄｏｍａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｅａｖｙ－ｃｈａｉｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ）と呼ばれる。組換えＶＨＨ（サイズ１２～１４ｋＤ程度）は、インタクトな抗原結合ドメインを構成し、広範な抗原結合レパートリを示す。その超可変領域は拡張しており、特有の特徴（例えば、３～４の疎水性フレームワーク残基（これは従来型抗体においてはＶＬと相互作用する）の、より親水性のアミノ酸での置換）を示す。拡がったＣＤＲを安定させるため、ＶＨＨは、標準的なジスルフィド結合に加え、ヒトコブラクダのＣＤＲ１とＣＤＲ３との間、ラマのＣＤＲ２とＣＤＲ３との間に余分のジスルフィド結合を有し得る（Ｈａｒｍｓｅｎ，Ｍ．Ｍ．ａｎｄ Ｄｅ Ｈａａｒｄ Ｈ．Ｊ．， ２００７，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７７：１３－２２；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４：２７７－３０２）。拡張ＣＤＲ３ループは凸面状立体構造を採用することができる。一方、従来型パラトープは凹面状又は平面状構造に限られている（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ Ｓ．，２００１，Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４：２７７－３０２）。これら特徴により、ＶＨＨは、従来型抗体には免疫原性が乏しい独特なエピトープを認識することが可能である（Ｌａｆａｙｅ Ｐ．ら，２００９，Ｍｏｌ Ｉｍｍｕｎｏ．，４６：６９５－７０４；Ｗｅｒｎｅｒｙ Ｕ．， ２００１，Ｊ Ｖｅｔ Ｍｅｄ Ｂ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ Ｖｅｔ Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ．，４８：５６１－５６８）。ＶＨＨは、定義によれば、単価抗体（本来、アビディティ効果は排除される）であるが、インビトロでＩＣ_５０として測定される生物学的活性は、通常の二価抗体分子に類似することもある（Ｔｈｙｓ Ｂ．ら，２０１０，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．，８７：２５７－２６４）

【0043】

「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に相同な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、集団に含まれる個々の抗体（微量に存在する可能性のある天然の変異を除く）は同一である。モノクローナル抗体は、単一の抗原部位に対して高い特異性を持っている。さらに、（通常、抗原における異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含む）従来のポリクローナル抗体製剤と異なり、各モノクローナル抗体は抗原における単一の決定基又はエピトープのみを対象とする。

【0044】

いくつかの態様において、本開示は、ラクダ科／ヒトのキメラ抗体、特に、ＶＨ及び／又はＶＬドメインの全体がラクダ科配列（例えば、ラマ又はアルパカ）であり、残部が完全にヒト配列からなるキメラ抗体に関する。さらに、いくつかの好ましい態様において、本開示は、ＶＨ及び／又はＶＬドメインが、能動免疫により得られるラクダ科ＶＨ及び／又はＶＬドメインと比較して、フレームワーク領域において１つ又はそれ以上のアミノ酸置換を含む、「ヒト化」又は「生殖細胞系列化」ラクダ科抗体及びラクダ科／ヒトのキメラ抗体に関する。ヒト生殖細胞系列ＶＨ又はＶＬドメインに対する配列同一性パーセントは、そのような「ヒト化」プロセス、即ち、元のラクダ科ＶＨ又はＶＬドメイン中に存在するミスマッチアミノ酸残基の、ヒト生殖細胞系列ＶＨ又はＶＬドメイン中の対応する残基による置換、によって高められる。

【0045】

本開示は、天然、組換えＶＨＨ又はＶＨを含む。

【0046】

「組換え」は、遺伝子工学的方法（クローニング、増幅）を採用して前記ＶＨＨ又はＶＨを生成することに関する。

【0047】

本開示に係るＶＨＨによれば、単量体の形態又はホモ多量体の形態は、例えば、ホモ二量体又はホモ三量体でありうる。

【0048】

本開示に係る抗体は、アルパカ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、好ましくは、ヒト化抗体を含む。

【0049】

「キメラ抗体（ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、アルパカ由来抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域（又はＦｃ領域）との融合によって形成される抗体であり、キメラ抗体では、アルパカ由来抗体に誘導される免疫反応が低減される。キメラ抗体を作製するために、まず、特定のアルパカ由来特異的なモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマ又は抗体ライブラリーを構築し、次いで、アルパカ由来可変領域遺伝子をヒト定常領域遺伝子（又はＦｃ領域遺伝子）と連結してキメラ遺伝子を作製し、これを発現ベクターに挿入し、最後、原核生物又は真核生物系においてキメラ抗体分子を発現させる。

【0050】

「ヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、アルパカのＣＤＲ配列をヒトの抗体可変領域フレームワーク、即ち、異なるタイプのヒト生殖系列抗体フレームワーク配列に移植することで産生される抗体を指す。ヒト化抗体は、多量のアルパカタンパク質成分を含むキメラ抗体に誘発される異種反応の欠点を克服する。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公のＤＮＡデータベース又は公開された刊行物から入手できる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖の可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ２．ｍｒｃ－ｌｍｂ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅ／）から取得できし、また、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ第５版に記載される。免疫原性の低下及びそれに引き起こされる活性の低下を回避するために、前記ヒト抗体可変領域フレームワーク配列は、活性維持のために、最小限の逆転突然変異又は復帰突然変異を実行してすることができる。

【0051】

「ＶＨＨ」は、ラクダ科（ラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、アルパカ等）重鎖抗体に由来する可変抗原結合ドメイン（Ｎｇｕｙｅｎら，２０００ ＥＭＢＯ Ｊ．，１９，９２１－９３０；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ ２００１ Ｊ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７４，２７７－３０２及びレビューＶａｎｌａｎｄｓｃｈｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，２０１１ Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．９２，３８９－４０７を参照）に関する。

【0052】

一般に、ナノボディとは、下記（一般）構造：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４を有するアミノ酸配列として定義され得、ここで、ＦＲ１～ＦＲ４はそれぞれ、フレームワーク領域１～４を指し、ＣＤＲ１～ＣＤＲ３はそれぞれ、相補性決定領域１～３を指す。

【0053】

当分野では、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭの５つの主な種類の抗体が知られ、対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれ、ＩｇＧ及びＩｇＡは、さらに異なるサブクラスに分けることができ、例えば、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４に分けられ、ＩｇＡは、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に分けられる。いかなる脊椎動物種に由来する抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる、２種類の明らかに異なるタイプの１つに分類され得る。

【0054】

ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤ抗体の場合、当該定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３と呼ばれる３つのドメインを含む（ＩｇＭ及びＩｇＥは、第４のドメインＣＨ４を有する）。ＩｇＧ、ＩｇＡ及びＩｇＤクラスにおいて、ＣＨ１及びＣＨ２ドメインは、プロリン及びシステインに富む、可変長のセクションである柔軟性ヒンジ領域に分離される。各クラスの抗体は、対のシステイン残基によって形成される鎖間及び鎖内ジスルフィド結合をさらに含む。

【0055】

「Ｆｃ」という用語は、本明細書において、少なくとも定常領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語には、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域が含まれる。本明細書において別途指定されていない限り、Ｆｃ領域又は定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ、 Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、１９９１に記載されているような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号システムに従う。

【0056】

なお、本発明のモノクローナル抗体可変領域のＣＤＲ及びＦＲの区分は、Ｋａｂａｔに基づいて特定される。他の命名及び番号付けシステム、例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ、ＩＭＧＴ又はＡＨｏなども当業者に知られている。従って、本発明のモノクローナル抗体配列を基礎とし、任意の命名システムから誘導された１種以上のＣＤＲを含むヒト化抗体は、いずれも本発明の範囲内に明確的に保持される。

【0057】

「配列同一性」又は「配列類似性」又は「配列相同性」という用語は、前記配列をアラインメントする（必要な場合にギャップを導入する）ことにより最大のパーセント配列同一性を取得し、かつ任意の保存的置換を配列同一性の一部と見なさない場合、候補配列中のアミノ酸残基と参照ポリペプチド配列中の同じアミノ酸残基のパーセントを指す。当分野の様々な方法を用いて配列をアラインメントすることで、アミノ酸配列同一性パーセントを測定することができ、例えば、公衆が入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアを使用する。当業者は、比較する配列の全長にわたって最大のアラインメントを実現するために必要な任意のアルゴリズムを含める、アラインメントを測定するための適切なパラメーターを決定することができる。

【0058】

「抗体断片」という用語は、完全抗体の少なくとも一部を含む。本明細書において使用されるとき、抗体分子の「断片」は、抗体の「抗原結合断片」を含み、かつ「抗原結合断片」という用語は、免疫グロブリン又は抗体における、選択された抗原又はその抗原エピトープに特異的に結合又は反応するポリペプチド断片、又はこの断片からさらに誘導された融合タンパク質産物、例えば、一本鎖抗体、キメラ抗原受容体中の細胞外結合領域などを指す。例示的な抗体断片又はその抗原結合断片は、可変軽鎖断片（ＶＬ）、可変重鎖断片（ＶＨ）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、単一ドメイン抗体、線形抗体、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）及び抗体断片で形成された二重特異性抗体又は多重特異性抗体などを含むが、これらに限定されない。

【0059】

「多重特異性抗体」という用語は、抗体を１つ又は複数の他の結合分子に機能的に連結する（例えば、化学カップリング、遺伝子融合、非共有結合又はその他の方法）ことにより形成された、２つ以上の異なる部位及び／又は標的部位に結合する新たな抗体構築物を指す。ここで、よく使用される「二重特異性抗体」は、特に２つの異なる抗原及び／又はエピトープに対して特異性を有する抗体構築体を指す。通常、二重特異性抗体又は多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原結合ドメインを含む。

【0060】

「抗原」という用語は、抗体又は抗体結合断片に認識され、抗体又は抗体結合断片に特異的に結合する物質を指し、広義には、抗原は、単一のエピトープ、複数のエピトープ、単一のドメイン、複数のドメイン、又は完全な細胞外ドメイン（ＥＣＤ）又はタンパク質を含む、選択された標的の任意の免疫原性断片又は決定基を含むことができる。ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖及び脂質、これらの一部及びこれらの組み合わせが、いずれも抗原を構成することができる。非限定的な例示的抗原は、腫瘍抗原又は病原体抗原などを含む。「抗原」とは、免疫応答を引き起こす分子であってもよい。任意の形式の抗原又は該抗原を含む細胞又は製剤は、いずれも抗原決定基に対して特異性を有する抗体を生成するために用いることができる。抗原は、単離された全長タンパク質、細胞表面タンパク質（例えば、その表面に少なくとも一部の抗原を発現させる細胞で免疫化される）、又は可溶性タンパク質（例えば、当該タンパク質のＥＣＤ部分のみで免疫化される）、又はタンパク質構築物（例えば、Ｆｃ抗原）であってもよい。当該抗原は、遺伝子修飾された細胞において産生することができる。前記任意の抗原は、単独で使用してもよく、本分野で周知の１種以上の免疫原性増強アジュバントと組み合わせて使用してもよい。当該抗原をコードするＤＮＡは、ゲノムであっても非ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってもよく、免疫原性応答を引き起こすのに十分なＥＣＤの少なくとも一部をコードすることができる。任意のベクターを使用してその中に抗原を発現させる細胞を形質転換することができ、前記ベクターは、アデノウイルススベクター、レンチウイルスベクター、プラスミド及びカチオン性脂質のような非ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。

【0061】

「エピトープ」という用語とは、抗原における、免疫グロブリン又は抗体に特異的に結合する部位を指す。エピトープは、隣接するアミノ酸、又はタンパク質の三次折り畳みにより並列するが隣接しないアミノ酸で形成することができる。隣接するアミノ酸からなるエピトープは、通常に、変性溶媒への暴露の際に保持される一方で、三次折り畳みにより形成されるエピトープは、通常に、変性溶媒での処理によって失われる。エピトープは、通常に、独特の空間的コンフォメーションで少なくとも３～１５個のアミノ酸を含む。特定の抗体によりそれの結合するエピトープを決定する方法は、本分野で周知であり、免疫ブロット及び免疫沈殿検出分析などを含む。エピトープの空間的コンフォメーションを決定する方法は、例えば、Ｘ線結晶分析法、二次元核磁気共鳴などの本分野における技術及び本明細書に記載の技術を含む。

【0062】

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸残基のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖、環状又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸、特に保存的に修飾されたアミノ酸を含むことができ、また、非アミノ酸に中断されてもよい。当該用語は、変性されたアミノ酸ポリマー、例えば、硫酸化、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、ヨウ化、メチル化、酸化、タンパク質加水分解加工、プレニル化、ラセミ化、セレネニル化、転移－ＲＮＡ媒介のアミノ付加、例えば、アルギニン化、遍在化、又は任意の他の操作、例えば、標識成分との複合などにより変性されたアミノ酸ポリマーをさらに含む。本明細書において使用されるとき、「アミノ酸」という用語は、天然及び／又は非天然又は合成アミノ酸を指し、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体、及び、アミノ酸類似体及びペプチド模倣物を含む。指定されたタンパク質「に誘導された」ポリペプチド又はアミノ酸配列とは、ポリペプチドの由来を指す。当該用語は、指定された核酸配列に発現されたポリペプチドをさらに含む。

【0063】

「アミノ酸修飾」（又は「修飾されたアミノ酸」）という用語は、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を含む。本明細書における「アミノ酸置換」又は「置換」は、親ポリペプチド配列の特定の位置のアミノ酸を別のアミノ酸に置き換えることを意味する。例えば、置換Ｓ３２Ａとは、３２位のセリンがアラニンに置き換えられることを意味する。

【0064】

ヒト化抗体可変領域とヒト受容体可変領域との配列同一性又は相同性は、本明細書に述べられるように測定することができ、このような測定をすると、好ましくは、少なくとも６０％又は６５％の配列同一性、より好ましく、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％の配列同一性、さらに好ましくは、少なくとも９３％、９５％、９８％又は９９％の配列同一性を共有することになる。好ましくは、異なる残基の位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。「保守的置換」とは、１つのアミノ酸残基が、類似の化学的特性（例えば、電荷又は疎水性）の側鎖（Ｒ基）を有する他のアミノ酸残基に置き換えられたアミノ酸置換である。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の機能的特性を実質的に変化させない。当分野では、類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーが定義されている。これらファミリーは、塩基性側鎖を含むアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、帯電していない極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。従って、本発明の抗体のＣＤＲ領域又はフレームワーク領域の１つ又は複数のアミノ酸残基を、他の類似した側鎖のアミノ酸残基に置き換えることができる。２つ又は２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なる場合、配列同一性のパーセンテージ又は類似度を上方に調整して、この置換の保存的な性質を補正することができる。

【0065】

「親和性」又は「結合親和性」という用語は、分子（例えば、抗体）の単一の結合部位とそれに結合するパートナー（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の総和の強度を指す。「Ｋ_Ｄ」という用語は、特定の抗体－抗原相互作用の解離定数を指す。結合親和性は、本分野で公知の様々な技術、例えば、表面プラズモン共鳴、バイオレイヤー干渉法、二面偏波式干渉法、静的光散乱法、動的光散乱法、等温滴定型カロリメトリー、ＥＬＩＳＡ、超遠心分析法及びフローサイトメトリーなどを使用して決定することができる。

【0066】

「結合競合」又は「競合的抗体」という用語は、一般に、本開示に係る抗体と同じエピトープに結合する抗体を指し、その結合は、本開示に係る抗体の結合の阻害又は遮断をもたらし、競合アッセイにより競合阻害の程度を得ることができる。

【0067】

「医薬組成物」という用語は、その中に有効で含有される活性成分の生物学的活性を許容するような形態であって、製剤を投与する被験体にとって許容できない毒性である他の成分を含まない、製剤を指す。

【0068】

「薬学的担体」又は「薬学的に許容可能な担体」という用語は、治療剤とともに投与される希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全及び不完全））、賦形剤又は媒体を意味する。

【0069】

「有効量」という用語は、本発明の有効成分を含む医薬製剤の投与量であって、患者に単一又は複数の投与量で投与された後に、治療された患者において予期の効果をもたらす投与量を意味する。有効量は、当業者である主治医が、例えば、人種の違い、体重、年齢や健康状態、関連する具体的な疾患、疾患の重症度、個々の患者の応答、投与された具体的な抗体、適用モード、投与された製剤の生物学的利用特性、選択された投与スキーム、及び、それに伴うあらゆる治療法の使用という、複数の要因を考慮することで容易に決定することができる。

【0070】

「宿主細胞」、「宿主細胞系」及び「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外因性核酸が導入されている細胞を指し、このような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、一次形質転換された細胞及びそれに由来する子孫を含み、継代の数を考慮しない。子孫は、親細胞と核酸含量で完全に同一ではないかもしれないが、突然変異が含まれる場合がある。本明細書において、最初に形質転換された細胞からスクリーニングされるか、或いは、選択されるものと同じ機能又は生物学的活性を有する突然変異体の子孫が含まれる。

【0071】

本明細書において使用される「トランスフェクション」という用語は、外因性核酸を真核細胞に導入することを指す。トランスフェクションは、リン酸カルシウム－ＤＮＡ共沈法、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介トランスフェクション、ポリブレン媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、脂質トランスフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染及び微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）を含む、本分野で公知の様々な手段により実現することができる。

【0072】

「安定なトランスフェクション」又は「安定的トランスフェクション」という用語は、外因性核酸、ＤＮＡ又はＲＮＡをトランスフェクション細胞のゲノムに導入し組み込むことを指す。「安定なトランスフェクタント」（ｓｔａｂｌｅ ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｎｔ）という用語は、外因性ＤＮＡを安定的にゲノムＤＮＡに組み込む細胞を指す。

【0073】

「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」及び「をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順を指す。これらデオキシリボヌクレオチドの順は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順を決める。従って、核酸配列は、アミノ酸配列をコードする。

【0074】

抗体及び抗原結合断片を生産・精製する方法は、コールド・スプリング・ハーバー研究所の抗体実験技術ガイドにおける第５～８章及び第１５章のような従来技術でよく知られており、発見されている。本発明に係る抗体又はその抗原結合断片は、遺伝子操作方法で非ヒト由来ＣＤＲ領域に１つ又は複数のヒトＦＲ領域を加えたものである。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）のウェブサイトｈｔｔｐ：／／ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒから取得されるか、或いは、免疫グロブリン雑誌、（２００１）ＩＳＢＮ：０１２４４１３５１から取得される。

【0075】

本発明の工学的抗体又はその抗原結合断片は、従来の方法を用い、調製・精製することができる。例えば、重鎖及び軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列を、発現ベクターにクローニング・組み換えることができる。組換え免疫グロブリンの発現ベクターは、ＣＨＯ細胞を安定的にトランスフェクションすることができる。より推奨される従来技術としては、哺乳類発現系は、抗体のグリコシル化、特にＦｃ領域中の高度に保存されたＮ末端のグリコシル化を招致する。安定クローンは、ヒト由来抗原に特異的に結合する抗体を発現させることで得られる。陽性クローンは、抗体を産生するためにバイオリアクターの無血清培地で拡大培養される。抗体が分泌される培養液は、従来技術により精製・採取される。抗体は、従来の方法によりろ過、濃縮される。可溶性混合物と多量体も、分子篩、イオン交換のような従来の方法により除去されてもよい。

【0076】

本明細書において使用される「個体」又は「被験体」という用語は、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本発明の個体は、ヒト、非ヒト霊長類動物（例えば、カニクイザル、アカゲザル又は他の種類のマカックザル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。

【0077】

本明細書において使用される「腫瘍」という用語は、細胞又は組織の病理学的な増殖を特徴とする疾患、及び、その後の他の組織又は器官への遊走又は浸潤を指す。腫瘍増殖は、一般的に、制御されず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘発・阻害しない。腫瘍は、膀胱、骨、脳、乳腺、軟骨、神経膠細胞、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、尿道、子宮、膣器官、又は組織又は対応する細胞から選択されるものを含むが、これらに限定されない、様々な細胞、組織又は器官に影響を与えることができる。腫瘍は、例えば、肉腫、がん、又は細胞腫瘍（形質細胞の悪性腫瘍）のようながんを含む。本発明に係る腫瘍は、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、急性顆粒球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、慢性白血病、慢性顆粒球性白血病、慢性リンパ球性白血病、真性赤血球増加症）、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、原発性マクログロブリン血症、重鎖病、固形腫瘍、例えば、肉腫及びがん（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸がん、膵臓がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮がん、基底細胞がん、腺がん、汗腺がん、皮脂腺がん、乳頭がん、乳頭腺がん、気管支がん、髄様がん、腎臓細胞がん、肝がん、ナイル管がん、絨毛膜がん、精上皮腫、胚性がん、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、睾丸がん、肺がん、小細胞肺がん、膀胱がん、上皮がん、神経膠腫、星状細胞腫瘍、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴覚神経腫、乏突起神経膠腫、神経鞘腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫）、食道がん、胆嚢がん、腎臓がん、多発性骨髄腫を含むが、これらに限定されない。好ましくは、前記「腫瘍」は、膵臓がん、肝がん、肺がん、胃がん、食道がん、頭頸部扁平上皮がん、前立腺がん、結腸がん、乳がん、リンパ腫、胆嚢がん、腎臓がん、白血病、多発性骨髄腫、卵巣がん、子宮頸がん及び神経膠腫を含むが、これらに限定されない。

【0078】

本明細書において使用される「疾患」又は「病症」又は「障害」などという用語は、細胞、組織又は器官の正常な機能を損傷・妨害する任意の変化又は失調を指す。例えば、前記「疾患」は、腫瘍、病原体感染、自己免疫疾患、Ｔ細胞機能障害性疾患、又は免疫寛容の欠陥（例えば、移植拒絶）を含むが、これらに限定されない。

【0079】

本明細書において使用される「治療」という用語は、個人又は処理細胞に起因する疾患を変化させようとする過程での臨床的介入を指し、予防してもよいし、臨床病理上で介入してもよい。治療効果は、疾患の発生又は再発の防止、症状の軽減、何らかの疾患による直接的又は間接的な病理結果の減少、転移の防止、疾患の進行速度の低下、病状の改善又は緩和、予後の緩和又は改善などを含むが、これらに限定されない。

【0080】

「カートリッジ」又は「キット」という用語は、有効量の１種以上の単位投与形態の本発明の医薬組成物を含む。いくつかの実施形態において、「カートリッジ」又は「キット」は、滅菌容器を含むことができ、このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、ブリスターパック又は本分野に既知の他の適切な容器の形態であってもよい。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔、又は薬物を保持するのに適切な他の材料から作ることができる。また、カートリッジは、本発明の医薬組成物を個体に投与する説明書をさらに含む。説明書には、一般的に、本発明の医薬組成物を用いて疾患を治療する方法が含まれる。

【0081】

＜実施例＞

【0082】

以下、具体的な実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。これら実施例は、本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことに留意されたい。以下の実施例において具体的な条件を明記していない実験方法は、一般的に、分子クローニング試験ガイド（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．編、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ Ｇｕｉｄｅ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｒｅｓｓ， ２００２）に記載されているような従来の条件に従い、或いは、製造元に推奨される条件に従った。

【0083】

実施例１ ヒトＮＫｐ４６及びカニクイザルＮＫｐ４６抗原の情報

【表1】

【0084】

実施例２ ヒトＮＫｐ４６及びカニクイザルＮＫｐ４６細胞株の調製
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１で示されるヒトＮＫｐ４６アミノ酸をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶ３（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ、商品番号ＣＶ０１１）ベクターにクローニングし、ヒトＮＫｐ４６細胞株の構築に用いられるベクターが得られた。得られたベクターをＣＨＯＫ１細胞（ＡＴＣＣ、商品番号ＣＣＬ－６１）にトランスフェクトし、ヒトＮＫｐ４６を発現するＣＨＯＫ１細胞株（「ヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１細胞株」と略称される）が得られた。

【0085】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２で示されるカニクイザルＮＫｐ４６アミノ酸をコードするヌクレオチド配列をｐＣＭＶ３ベクターにクローニングし、カニクイザルＮＫｐ４６細胞株の構築に用いられるベクターが得られた。得られたベクターをＣＨＯＫ１細胞にトランスフェクトし、カニクイザルＮＫｐ４６を発現するＣＨＯＫ１細胞株（「カニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１細胞株」と略称される）が得られた。

【0086】

陽性対照抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，商品番号ｓｃ－５９３４３）を使用し、ＦＡＣＳ測定方法で上記の得られたヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１細胞株におけるヒトＮＫｐ４６の発現状況を検出し、試験において、陰性対照としてａｎｔｉ－ＨＥＬ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、商品番号Ｂ１０９８０２）を設けた。

【0087】

陽性対照抗体（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、商品番号ｓｃ－５９３４３）を使用し、ＦＡＣＳ測定方法で上記の得られたカニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１細胞株におけるカニクイザルＮＫｐ４６の発現状況を検出し、試験において、陰性対照としてａｎｔｉ－ＨＥＬ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ１ ＬＡＬＡ（Ｂｉｏｉｎｔｒｏｎ、商品番号Ｂ１０９８０２）を設けた。

【0088】

結果を以下に示した：
ヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１細胞株におけるヒトＮＫｐ４６の発現状況は、図１に示されているように、結果として、ＣＨＯＫ１細胞において、ヒトＮＫｐ４６は、良好な過剰発現現象を有し、続く実験において細胞レベルでのＮＫｐ４６モノクローナル抗体のヒトＮＫｐ４６への結合状況を検証することに用いられると示された。

【0089】

カニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１細胞系株におけるカニクイザルＮＫｐ４６の発現状況は、図２に示されたように、結果として、ＣＨＯＫ１細胞において、カニクイザルＮＫｐ４６は、良好な過剰発現現象を有し、続く実験において細胞レベルでのＮＫｐ４６ モノクローナル抗体のカニクイザルＮＫｐ４６への結合状況を検証するために用いられると示された。

【0090】

実施例３ アルパカ／ラクダＶＨＨ重鎖抗体免疫ライブラリーの構築
それぞれＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３で示されるヒトＮＫｐ４６抗原及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４で示されるカニクイザルＮＫｐ４６抗原を使用し、アルパカ／ラクダを交替で免疫化した。免疫時期はそれぞれ０日目、１４日目、２８日目、４２日目であり、合計４回の免疫を行った。それぞれ２８日目、４２日目、及び５６日目に血液サンプルを採取し、血清を分離し、フローサイトメトリーで血清における免疫応答反応状況を検出した。検出された血清力価が１：１００００を超えると免疫化を終了させた。免疫されたアルパカ／ラクダから再度血液サンプル１００ｍＬを採取し、以下の手順を行った。

【0091】

１．リンパ球分離液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社）を用い、プロトコールに従い、ラクダ／アルパカＰＢＭＣをそれぞれ分離した。

【0092】

２．細胞トータルＲＮＡ抽出キット（ＯＭＥＧＡ社）を使用し、プロトコールに従い、ラクダ／アルパカのトータルＲＮＡをそれぞれ抽出した。

【0093】

３．ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ^ＴＭ逆転写キット（Ｔａｋａｒａ社）を用い、プロトコールに従い、ラマ／アルパカのｃＤＮＡをそれぞれ合成した。

【0094】

４．上記で得られたｃＤＮＡを鋳型とし、以下のＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５～ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３で示される特異的なプライマーを用い、ネステッドＰＣＲ増幅を行った。
サイクル１のＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５（フォワードプライマー）：ＧＴＣＣＴＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＣＴＡＣＡＡＧＧ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６（リバースプライマー）：ＧＧＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＴＧＡＡＣＴＧＴＴＣＣ。
サイクル２のＰＣＲ
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７（フォワードプライマー）：
ＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８（フォワードプライマー）：
ＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＣＡＧＧＴＲＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９（フォワードプライマー）：
ＡＣＴＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＴＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０（リバースプライマー）：
ＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＫＧＡＧＡＣＲＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１（リバースプライマー）：
ＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＧＣＴＫＧＡＧＡＣＲＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２（リバースプライマー）：
ＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＫＧＡＧＡＣＲＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴ；
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３（リバースプライマー）：
ＧＧＴＧＴＴＧＧＣＣＴＣＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＴＴＧＡＫＧＡＧＡＣＲＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴ。

【0095】

５．増幅してラクダ／アルパカＶＨＨ遺伝子断片が得られた。
上記の増幅により得られたラクダ／アルパカＶＨＨ断片を回収し、Ｓｆｉ Ｉ酵素消化により、ｐＡＤＬ－２３ｃ（Ｂｉｏｖｅｃｔｏｒ）ファージベクターにライゲーションし、ＴＧ１大腸菌コンピテント細胞を電気形質転換し、アルパカ／ラクダＶＨＨ重鎖抗体免疫ライブラリーを構築した。そのうち、ＮＫｐ４６ラクダ免疫ライブラリーの容量サイズは、５．２Ｅ７であり、アルパカ免疫ライブラリーの容量サイズは、７．８Ｅ７であった。

【0096】

実施例４ ＮＫｐ４６に特異的に結合する陽性クローンのスクリーニング
ヒトＮＫｐ４６とカニクイザルＮＫｐ４６に交差結合できる陽性抗体を得るために、前記ライブラリーを増幅し、Ｍ１３Ｋ０７ヘルパーファージを添加し、ファージを組み立てた。その後、それぞれ１×１０^１２ｐｆｕのラクダとアルパカ免疫ライブラリーに投入し、ファージが磁気ビーズに結合したビオチン化ヒトＮＫｐ４６タンパク質（８μｇ／ｍＬ）とともに室温で１時間インキュベートし、結合していないファージを０．０５％ＰＢＳＴで洗い流した後、ＮＫｐ４６に特異的に結合したファージを１００ｍＭのトリエチルアミンで溶出し、勾配希釈した後、対数増殖期に増殖した大腸菌ＳＳ３２０を感染させ、アンピシリンプレートに３７℃で一晩培養し、単一クローンを選択し、ＩＰＴＧ誘導発現を行い、上清をＥＬＩＳＡ検出に用いられた。ＥＬＩＳＡプレートをそれぞれ２μｇ／ｍＬのヒトＮＫｐ４６又はカニクイザルＮＫｐ４６抗原で４℃、一晩コーティングし、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄し後、５％スキムミルクで室温、１ｈブロックし、０．０５％ＰＢＳＴで３回洗浄した後、各ウェルに誘導された上清３０μＬを加え、陰性対照ウェルに培地を加え、室温で１ｈインキュベートし、最後にａｎｔｉ－Ｍｙｃ ＨＲＰで検出し（ＩＰＴＧに誘導・発現されたＶＨＨは、ｈｉｓタグ及びｃ－Ｍｙｃタグが付いていた）、ＥＬＩＳＡ試験により得られたヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６に結合するＯＤ４５０値が１．０を超え、培地陰性対照に結合するＥＬＩＳＡ ＯＤ４５０比値がいずれも３を超えるクローンをシーケンシングして、本開示の３０つの重鎖抗体可変領域のアミノ酸を取得し、結果を表２に示す。

【表2】

【0097】

上記のアミノ酸配列に基づき、Ｋａｂａｔの番号付け規則に従い、抗体の可変領域のＣＤＲ及びＦＲを区分し、各抗体における３つのＣＤＲ配列の構成を以下の表３に示す。表３の括弧内の数字は、配列番号を表し、例えば、（４４）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４を表す。

【表3】

【表4】

【0098】

実施例５ 抗ＮＫｐ４６キメラ抗体の構築及びその真核細胞における一過性トランスフェクション発現
シーケンシングの完了した本開示に係るモノクローナルの可変領域とアミノ酸配列、例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３４で示されるヒトＩｇＧ１定常領域をスプライシングして生成する標的遺伝子断片をｐＴＴ５発現ベクター（Ｎｏｖａ ｌｉｆｅｔｅｃｈ）にクローニングし、トランスフェクショングレードの発現プラスミドを調製した。

【0099】

無血清培地にＥｘｐｉ２９３Ｆ^ＴＭ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を培養し、細胞を振盪フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ社）に接種し、３７°Ｃ、８％ ＣＯ_２環境でシェーカーに置いて培養した。細胞密度を調整し、標的遺伝子断片を含むｐＴＴ５組換え発現ベクター及びＰＥＩトランスフェクション試薬を適切な割合で混合し、細胞培養用振盪フラスコに加え、細胞を６日間培養した後、発現上清を回収し、高速遠心して細胞破片を除去し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラムによりアフィニティー精製をした。Ａ２８０読み取り値がベースラインに低下するまでカラムをＰＢＳでリンスした。ｐＨ３．０～ｐＨ３．５の酸性溶離液で目標タンパク質を溶離し、１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０～９．０で中和した。溶出したサンプルを適切に濃縮した後、培地をＰＢＳに交換し、分注して置いた。最終的に精製されたキメラ抗体に対して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣ純度分析及びＡ２８０濃度測定を実施した。

【0100】

実施例６ 抗ＮＫｐ４６キメラ抗体のＮＫｐ４６発現細胞への結合
実施例２で調製されたヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１安定細胞株及びカニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１安定細胞株を培養し、細胞を０．２５％トリプシン（ＥＤＴＡ含有）で約５分間消化し、完全培地を加えて反応を終了させた。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳに再懸濁してカウンティングした。細胞を密度１Ｅ６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＣｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３７９９ ９６ウェル培養プレートに接種し、３７℃、８％ＣＯ_２環境で一晩培養し、その後、９６ウェル培養プレートを１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、４℃で静置しておいた。

【0101】

上記の実施例で得られた抗ＮＫｐ４６キメラ抗体を２４個選択し、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで抗ＮＫｐ４６キメラ抗体溶液を調製し、初期濃度は１００ｎＭで、１０倍希釈で１０^－４ｎＭ、１０^－３ｎＭ、１０^－２ｎＭ、１０^－１ｎＭ、１０^０ｎＭ、１０^１ｎＭ及び１０^２ｎＭの７つの勾配が得られた。

【0102】

調製された抗体（１００μＬ／ウェル）を細胞培養プレートに再懸濁した。再懸濁した細胞培養プレートを４°Ｃ冷蔵庫で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１６０μＬで１回洗浄し、上清を捨てて保管した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ）を調製し、１：２００という比例で希釈した。調製した二次抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、冷蔵庫、４℃で０．５時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１６０μＬで１回洗浄し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬで細胞を再懸濁し、細胞を３００メッシュのガーゼで濾過し、フローサイトメーターで抗体と細胞との結合の平均蛍光強度を分析した。フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ＦｌｏｗｊｏソフトウェアでＰＥチャネルの平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称する）を解析し、解析で得られた平均蛍光強度をＧｒａｐｈｐａｄにインポートし、抗体の細胞に対する半数結合濃度（以下、ＥＣ_５０と略称する）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を解析し、結果を表４及び図３～１０に示す。抗ＮＫｐ４６キメラ抗体は、過剰発現したヒト及びカニクイザルＮＫｐ４６細胞に対していずれも良好な結合を示した。

【表5】

【表6】

【0103】

実施例７ 抗ＮＫｐ４６キメラ抗体によるインビトロでのＮＫ細胞活性化試験
新鮮なヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、ＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）でＮＫ細胞を分離し、それをカウンティングした。α－ＭＥＭ培地で細胞を培養し、１５％熱不活化ＦＢＳ、０．２ｍＭイノシトール、０．１ｍＭβ－メルカプトエタノール、０．０２ｍＭ葉酸、２００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した。ＮＫ細胞を密度１Ｅ６／ｍＬに調整し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで６～８日間培養した。抗体をＰＢＳで希釈し、最高濃度は２０ｎＭになり、３倍希釈で２０ｎＭ、６．６７ｎＭ、２．２３ｎＭ、０．７４ｎＭ、０．２４７ｎＭ、０．０８３ｎＭ及び０．０２７ｎＭの７つの勾配濃度が得られた。希釈した抗体をＣｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３５９９である９６ウェル培養プレートに１００μＬ／ウェルに被覆させ、４℃で一晩コーティングした。９６ウェルプレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。完全培地で活性化ＮＫ細胞を密度１Ｅ６／ｍＬに調整し、そして１００μＬ／ウェルで洗浄した９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４時間培養した。細胞をｃｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３５９９培養プレートからｃｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３７９９培養プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てて保管した。

【0104】

取扱説明書の要求に従い、ＣＤ３－ＡＰＣ（ＢＤ＠５５５３３５）、ＣＤ５６－ＢＶ４２１（ＢＤ＠５６２７５１）、ＣＤ１０７ａ－ＰＥ（ＢＤ＠５６０９４８）をそれぞれ希釈した。上記で得られた予備細胞を再懸濁し、上記で希釈したＣＤ３－ＡＰＣ、ＣＤ５６－ＢＶ４２１、ＣＤ１０７ａ－ＰＥ抗体を５０μＬ／ウェルの濃度で添加し、４℃で０．５時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１６０μＬで１回洗浄し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬで１回洗浄し、細胞を３００メッシュのガーゼで濾過した。そして、フローサイトメーターでＮＫにおけるＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合を解析した。フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ＦｌｏｗｊｏソフトウェアでＮＫ（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）細胞におけるＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合を解析し、Ｇｒａｐｈｐａｄにインポートし、ＮＫ活性化の半数効果濃度（以下、ＥＣ_５０と略称する）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を解析し、結果を表５及び図１１～１２に示した。抗ＮＫｐ４６キメラ抗体は、異なるインビトロでのＮＫ細胞活性化能力を示した。

【表7】

【表8】

【0105】

実施例８ 抗ＮＫｐ４６抗体のヒト化設計
上記の番号がＮＫｐ４６－ＰＣ１１、ＮＫｐ４６－ＰＡ２７、ＮＫｐ４６－ＰＡ３１及びＮＫｐ４６－ＰＡ４５である抗ＮＫｐ４６キメラ抗体を選択し、ヒト化を行った。

【0106】

実施例８．１ ＮＫｐ４６－ＰＣ１１のヒト化
（１）ＮＫｐ４６－ＰＣ１１ヒト化フレームワークの選択
配列アライメントによりクローン番号ＮＫｐ４６－ＰＣ１１と高い同一性を有する生殖系列遺伝子配列、即ち、ＩＧＨＶ３－２３＊０４（配列同一性６４．３％）及びＩＧＨＪ４＿０１（配列同一性７３．３％）をＶＨＨ移植フレームワークの鋳型として選択した。ＮＫｐ４６－ＰＣ１１ ＣＤＲ領域を選択されたヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトした後、ヒト化抗体ｈＰＣ１１が得られ、ヒト化可変領域ｈＰＣ１１ ＶＨＨ－ＣＤＲ グラフト 配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３５に示した。

【0107】

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＰＹＳＡＮＳＦＳＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＣＩＱＡＥＳＧＳＴＮＶＡＰＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＦＫＲＮＶＧＧＣＥＬＲＰＥＨＷＲＦＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３５）

【0108】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１３５において、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列において斜体にしたのは、ＦＲ配列であり、下線を引いたのは、ＣＤＲ配列であり、グラフトはキメラ抗体のＣＤＲをヒト生殖系列ＦＲ領域に移植した後、得られたヒト化可変領域ＶＨＨ配列を表した。

【0109】

ｈＰＣ１１に対して復帰突然変異を行い、Ｈ１－ＰＣ１１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３６に示す）、Ｈ２－ＰＣ１１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３７に示す）、Ｈ３－ＰＣ１１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８に示す）、Ｈ４－ＰＣ１１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３９に示す）及びＨ５－ＰＣ１１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０に示す）の５つのヒト化抗体が得られた。

【0110】

実施例８．２ ＮＫｐ４６－ＰＡ２７のヒト化
（１）ＮＫｐ４６－ＰＡ２７ヒト化フレームワークの選択
配列アライメントによりクローン番号ＮＫｐ４６－ＰＡ２７と高い同一性を有する生殖系列遺伝子配列、即ち、ＩＧＨＶ３－３０＊１５（配列同一性：７４．５％）及びＩＧＨＪ４＿０１（配列一致性：８０％）をＶＨＨ移植フレームワークの鋳型として選択した。ＮＫｐ４６－ＰＡ２７ ＣＤＲ領域を選択されたたヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトした後、ヒト化抗体ｈＰＡ２７が得られ、ヒト化可変領域ｈＰＡ２７ ＶＨＨ－ＣＤＲ グラフト配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１に示した。

【0111】

ＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＥＳＷＹＲＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＲＩＳＧＤＴＮＩＫＹＹＡＧＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＳＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＤＲＴＧＡＴＷＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１）

【0112】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４１において、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列において斜体にしたのは、ＦＲ配列であり、下線を引いたのは、ＣＤＲ配列であり、グラフトはキメラ抗体のＣＤＲをヒト生殖系列ＦＲ領域に移植した後得られたヒト化可変領域ＶＨＨ配列を表した。

【0113】

ｈＰＡ２７に対して復帰突然変異を行い、Ｈ１－ＰＡ２７（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４１に示し、元のグラフトした配列）、Ｈ２－ＰＡ２７（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２に示す）、Ｈ３－ＰＡ２７（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４３に示す）、Ｈ４－ＰＡ２７（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４に示す）の４つのヒト化抗体が得られた。

【0114】

実施例８．３ ＮＫｐ４６－ＰＡ３１のヒト化
（１）ＮＫｐ４６－ＰＡ３１ヒト化フレームワークの選択
配列アライメントによりクローン番号ＮＫｐ４６－ＰＡ３１と高い同一性を有する生殖系列遺伝子配列、即ち、ＩＧＨＶ３－２３＊０４（配列同一性７４．５％）及びＩＧＨＪ４＿０１（配列一致性７３．３％）をＶＨＨ移植フレームワークの鋳型として選択した。ＮＫｐ４６－ＰＡ３１ ＣＤＲ領域を選択されたヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトした後、ヒト化抗体ｈＰＡ３１が得られ、ヒト化可変領域ｈＰＡ３１ ＶＨＨ－ＣＤＲグラフト配列を、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５に示した。

【0115】

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＬＰＭＧＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＳＳＳＴＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＧＧＳＬＤＹＳＡＴＶＶＹＴＡＡＲＡＹＡＤＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５）

【0116】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４５において、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列において斜体にしたのは、ＦＲ配列であり、下線を引いたのは、ＣＤＲ配列であり、グラフトはキメラ抗体のＣＤＲをヒト生殖系列ＦＲ領域に移植した後、得られたヒト化可変領域ＶＨＨ配列を表した。

【0117】

ｈＰＡ２７に対して復帰突然変異を行い、Ｈ１－ＰＡ３１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４５に示し、元のグラフト配列）、Ｈ２－ＰＡ３１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４６に示す）、Ｈ３－ＰＡ３１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７に示す）、Ｈ４－ＰＡ３１（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４８に示す）の４つのヒト化抗体が得られた。

【0118】

実施例８．４ ＮＫｐ４６－ＰＡ４５のヒト化
（１）ＮＫｐ４６－ＰＡ４５ヒト化フレームワークの選択
配列アライメントによりクローン番号ＮＫｐ４６－ＰＡ４５と高い同一性を有する生殖系列遺伝子配列、即ち、ＩＧＨＶ３－２３＊０４（配列同一性７９．６％）及びＩＧＨＪ４＿０１（配列同一性７３．３％）をＶＨＨ移植フレームワークの鋳型として選択した。ＮＫｐ４６－ＰＡ４５ ＣＤＲ領域を選択されたヒト抗体可変領域フレームワークにグラフトした後、ヒト化抗体ｈＰＡ４５が得られ、ヒト化可変領域ｈＰＡ４５ ＶＨＨ－ＣＤＲグラフト配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９に示した。

【0119】

ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＴＦＳＲＬＰＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＡＩＳＷＳＧＧＳＴＹＹＡＤＳＭＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＡＶＧＤＳＡＰＹＳＡＴＩＶＹＴＤＡＲＡＹＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９）

【0120】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ１４９において、順にＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４であり、配列において斜体にしたのは、ＦＲ配列であり、下線を引いたのは、ＣＤＲ配列であり、グラフトはキメラ抗体のＣＤＲがヒト生殖系列ＦＲ領域に移植された後、得られるヒト化可変領域ＶＨＨ配列を表した。

【0121】

ｈＰＡ４５に対して復帰突然変異を行い、Ｈ１－ＰＡ４５（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９に示し、元のグラフト配列）、Ｈ２－ＰＡ４５（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５０に示す）、Ｈ３－ＰＡ４５（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５１に示す）、Ｈ４－ＰＡ４５（配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５２に示す）の４つのヒト化抗体が得られた。

【0122】

実施例９ ＮＫｐ４６に特異的に結合するヒト化抗体の調製
当業者に知られている標準的な方法により、ヒト化抗体の可変領域とヒトＩｇＧ１定常領域とをスプライシングした目的遺伝子断片をｐＴＴ５発現ベクター（Ｎｏｖａ ｌｉｆｅｔｅｃｈ）にサブクローニングし、対数増殖期にあるＥｘｐｉ２９３Ｆ^ＴＭ細胞をＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ^ＴＭ ２９３トランスフェクション試薬で一過的にトランスフェクトし、培養上清を回収し、アフィニティー精製を行い、最終に精製されたヒト化抗体に対して、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びＨＰＬＣによる純度分析及びＡ２８０濃度測定を行った。

【0123】

実施例１０ ＮＫｐ４６に特異的に結合するヒト化抗体のインビトロでの細胞結合検証
実施例２で得られたヒトＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１安定細胞株及びカニクイザルＮＫｐ４６－ＣＨＯＫ１安定細胞株を培養し、細胞を０．２５％トリプシンＥＤＴＡで約５分間消化し、完全培地で終了した。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで再懸濁してカウンティングした。細胞を密度１Ｅ６／ｍＬに調整し、１００μＬ／ウェルでＣｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３７９９ ９６ウェル培養プレートに接種し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、４℃で保管した。１％ＢＳＡを含むＰＢＳで抗体を調製し、初期濃度は、１００ｎＭであり、１０倍希釈でそれぞれ１０^－４ｎＭ、１０^－３ｎＭ、１０^－２ｎＭ、１０^－１ｎＭ、１０^０ｎＭ、１０^１ｎＭ及び１０^２ｎＭの７つの勾配が得られた。調製された抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁した。再懸濁した細胞培養プレートを４℃冷蔵庫で１時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで１回洗浄し、上清を捨てて保管した。

【0124】

１％ＢＳＡを含むＰＢＳで二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ ｈｕｍａｎ ＩｇＧ Ｆｃ ＰＥ）を調製し、１：２００という比で希釈した。調製された二次抗体（１００μＬ／ウェル）で細胞を再懸濁し、４℃冷蔵庫で０．５時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１６０μＬで１回洗浄し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬで細胞を再懸濁し、細胞を３００メッシュのガーゼで濾過した。そして、フローサイトメーターで抗体と細胞との結合の平均蛍光強度を解析した。フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ＦｌｏｗｊｏソフトウェアでＰＥチャネルの平均蛍光強度（以下、ＭＦＩと略称する）を解析し、解析により得られた平均蛍光強度をＧｒａｐｈｐａｄにインポートし、抗体の細胞に対する半数結合濃度（以下、ＥＣ_５０と略称する）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を解析し、結果を表６及び図１３～図２０に示した。抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体は、過剰発現したヒト及びカニキザルＮＫｐ４６細胞への結合能力において、対応するキメラ抗体に相当した。

【表9】

【0125】

実施例１１ 抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体によるインビトロでのＮＫ細胞活性化試験
新鮮なヒト末梢血細胞（ＰＢＭＣ）を採取し、ＥａｓｙＳｅｐ^ＴＭ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ＫｉｔでＮＫ細胞を分離し、カウンティングした。α－ＭＥＭ培地で細胞を培養し、１５％熱不活化ＦＢＳ、０．２ｍＭイノシトール、０．１ｍＭ β－メルカプトエタノール、０．０２ｍＭ葉酸、２００Ｕ／ｍＬ ＩＬ－２を添加した。ＮＫ細胞を密度１Ｅ６／ｍＬに調整し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで６～８日間培養した。抗体をＰＢＳで希釈し、最高濃度は２０ｎＭであり、それぞれ２０ｎＭ、６．６７ｎＭ、２．２３ｎＭ、０．７４ｎＭ、０．２４７ｎＭ、０．０８３ｎＭ及び０．０２７ｎＭの７つの勾配濃度が得られた。希釈された抗体（１００μＬ／ウェル）をＣｏｒｎｉｎｇ－ Ｎｏ．３５９９である９６ウェル培養プレートに被覆させ、４℃で一晩被覆した。９６ウェルプレートを１５０μＬ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。完全培地で活性化ＮＫ細胞を密度１Ｅ６／ｍＬに調整し、そして、１００μＬ／ウェルで洗浄した９６ウェルプレートに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで４時間培養した。細胞をｃｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３５９９培養プレートからｃｏｒｎｉｎｇ－Ｎｏ．３７９９培養プレートに移し、１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨てて保管した。

【0126】

取扱説明書に従い、抗体（ＣＤ３－ＡＰＣ，ＣＤ５６－ＢＶ４２１，ＣＤ１０７ａ－ＰＥ）を希釈し、５０μＬ／ウェルで細胞を再懸濁し、４℃で０．５時間インキュベートした。１５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１６０μＬで１回洗浄し、上清を捨て、１％ＢＳＡを含むＰＢＳ１００μＬで再懸濁し、細胞を３００メッシュのガーゼで濾過した。そして、フローサイトメーターでＮＫ（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）細胞におけるＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合を解析した。フローサイトメーターからＦＣＳファイルをエクスポートし、ＦｌｏｗｊｏソフトウェアでＮＫ（ＣＤ３^－ＣＤ５６^＋）細胞におけるＣＤ１０７ａ陽性細胞の割合を解析し、ＧｒａｐｈｐａｄにインポートしてＮＫ活性化の半数効果濃度（以下、ＥＣ_５０と略称する）及び最高平均蛍光強度（Ｔｏｐ ＭＦＩ）を解析し、結果を表７及び図２１～２４に示した。抗ＮＫｐ４６ヒトイル化抗体は、対応するキメラ抗体と比較して、インビトロでのＮＫ細胞の活性化能力が維持されたか、或いは、わずかに弱いと示す。

【表10】

【0127】

実施例１２ ＮＫｐ４６に特異的に結合するヒト化抗体のＢｉａｃｏｒｅ親和性試験
ＮＫｐ４６に特異的に結合するヒト化抗体とヒトＮＫｐ４６（Ｋａｃｔｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＮＫＰ－ＨＭ１４６）及びカニクイザルＮＫｐ４６（Ｋａｃｔｕｓ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、ＮＫＰ－ＣＭ１４６）との親和性及び動力学的特性を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ機器により分析した。まず、エチル－ジメチルアミノプロピル－カルボジイミド（ＥＤＣ）及びヒドロキシスクシンイミドＮＨＳでＢｉａｃｏｒｅ機器ＣＭ５チップを活性化させ、次に抗ヒトＦｃマウスモノクローナルを固定化し、さらにエタノールアミンでブロックした。

【0128】

ヒトＮＫｐ４６への親和性及び動力学的特性を測定するために、ＮＫｐ４６ヒト化抗体をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｐ２０）で０．８μｇ／ｍＬに希釈し、流速１０μＬ／ｍｉｎで６０ｓ捕捉した。ヒトＮＫｐ４６を一連の濃度（４００ｎＭ～３．１２５ｎＭ）まで連続的に２倍希釈し、流速５０μＬ／ｍｉｎで９０ｓ結合させ、５００ｓ解離させた。

【0129】

カニクイザルＮＫｐ４６との親和性及び動力学的特性を測定するために、ＮＫｐ４６ヒト化抗体をＨＢＳ－ＥＰ＋緩衝液（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．０５％Ｐ２０）で０．８μｇ／ｍＬに希釈し、流速１０μＬ／ｍｉｎで６０ｓ捕捉した。カニクイザルＮＫｐ４６を一連の濃度（４００ｎＭ～３．１２５ｎＭ）まで連続的に２倍希釈し、流速５０μＬ／ｍｉｎで９０ｓ結合させ、５００ｓ解離させた。

【0130】

各サイクルの試験が終了した後、３Ｍ ＭｇＣｌ_２溶液を使用し、流速３０μＬ／ｍｉｎで３０ｓ洗浄し、捕捉された抗体を抗原とともに除去し、チップの再生を完了した。原始データを、Ｂｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｉｇｈｔ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン３．０．１２．１５６５５）で分析し、（１：１）のラングミュアモデルにフィッティングさせた。結果を表８に示した。抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体は、対応するキメラ抗体と比較して、基本的にヒトＮＫｐ４６抗原タンパク質との親和性が維持されていた。

【表11】

【表12】

【0131】

実施例１３ 抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体の物理的安定性測定
異なる抗体のｐＨ７．４、ＰＢＳ緩衝液における熱安定性は、ＮａｎｏＤＳＦ（示差蛍光走査技術）により検出された。サンプル濃度は、約１ ｍｇ／ｍＬであり、Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ ＮＴ．Ｐｌｅｘ機器により検出された。検出する前、各サンプルを１０，０００ｇで１０分間遠心分離した。サンプル４０μＬをサンプルプレートの各ウェルに添加した（機器のローディング容量は１０μＬで、各サンプルは１つの複製ウェルがある）。走査温度は３０°Ｃ以上、９５°Ｃ以下である。スキャン速度は０．５℃／ｍｉｎであった。試験結果を表９に示した。

【表13】

【0132】

ＳＥＣ－ＨＰＬＣでサンプルの純度をモニタリングし、特定の濃度条件下でのサイクル安定性を調べた。例示的な条件として、例えば、サンプル濃度を１０ｍｇ／ｍＬに制御し、１０ｍＭ酢酸塩、９％トレハロース（ｐＨ ５．５）の緩衝液において、並びに、濃度を１ｍｇ／ｍＬＰＢＳ（ＰＨ７．４）緩衝液に制御し、４０℃で０日間、７日間、１４日間保存した後の安定性状況を比較した。Ｗａｔｅｒｓ Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ ＢＥＨ ＳＥＣ ３．５μｍ ７．８＊３００ｍｍカラムで検出し、移動相は、ＰＢＳ緩衝液であり、Ｈ_３ＰＯ_４でｐＨ ６．８に調整し、流速は、０．５ ｍＬ／ｍｉｎであった。試験結果を表１０に示した。

【表14】

【0133】

ＣＥ－ＳＤＳによりサンプルの分子完全性をモニタリングし、特定の濃度条件でサイクル安定性を調べた。サンプル濃度を１０ｍｇ／ｍＬ、１０ｍＭ 酢酸塩、９％トレハロース（ｐＨ ５．５）の緩衝液において、４０℃で０日間、７日間及び１４日間を保存した後、還元条件及び非還元条件での分子完全性状況を比較した。サンプル２００μｇ（還元１００μｇ、非還元１００μｇ）を採取し、サンプル緩衝液を加え、９７μＬにし、還元サンプルに２－メルカプトエタノール ５μＬを添加し、非還元サンプルに２５０ｍＭ ヨードアセトアミド ５μＬを添加し、すべてのサンプルを７０℃で１０分間加熱した。ＰＡ ８００ Ｐｌｕｓ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｓｃｉｅｘ）により検出し、電気泳動時間は４０分間であり、試験結果を表１１に示した。

【表15】

【0134】

実施例１４ 抗ＮＫｐ４６ヒト化抗体の化学的安定性測定
ｃＩＥＦによりサンプル分子の電荷不均一性をモニタリングした。抗体は、脱アミド化作用、異性化、末端の変化、グリコシル化、酸化、断片化、重合などを含む多くの翻訳後修飾がある。これらの修飾により抗体の表面電荷変化を引き起こし、電荷の不均一性が生じる可能性がある。ｃＩＥＦは、抗体が持つ電荷に基づいて抗体を分離し、さらに抗体の電荷不均一性を分析するものである。サンプル濃度を１０ｍｇ／ｍＬに制御し、１０ｍＭ酢酸塩、９％トレハロース（ｐＨ５．５）の緩衝液において、４０℃で０日間、７日間、１４日間を保存した後、電荷不均一性状況を比較した。サンプル２０ｕｇを取り、Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｍｉｘ緩衝液に添加し、Ｍａｕｒｉｃｅ．Ｃ（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ）で７分間に集束され、抗体サンプルの電荷分布を検出した。試験結果を表１２に示した。

【表16】

【0135】

ＬＣ－ＭＳ技術により抗体サンプルの翻訳後修飾を検出した。脱アミド化修飾は、後期安定性に影響を与える可能性がある抗体の一般的な化学修飾、特にＣＤＲ領域のアミノ酸の一部を高度に脱アミド化する修飾を、通常、可能な限り回避し、或いは、変異を低減する。例示的な条件として、例えば、測定する抗体の濃度を１０ｍｇ／ｍＬに制御し、１０ｍＭ酢酸塩、９％トレハロース（ｐＨ５．５）緩衝液において、並びに、濃度を１ｍｇ／ｍＬ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液に制御し、４０℃で、インキュベーターで保管し、それぞれ０日目、７日目、１４日目にサンプルを採取し、酵素加水分解実験に用いた。抗体サンプル３０μｇを取り、８Ｍ塩酸グアニジン ６μＬ及び２００ｍＭ ＤＴＴ ３μＬを添加し、６０℃で水浴において２０ｍｉｎ放置し、そして２０ｍＭ Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ緩衝液（ｐＨ６．０） ４６μＬ及びＰＮＧａｓｅ Ｆ酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｖ５１１１）２μＬを添加し、３７℃で水浴おいて１６ｈ放置した。Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｐｌｕｓ機器でＬＣ－ＭＳにより脱アミド化修飾を検出した。試験結果を表１３に示した。

【表17】

【0136】

上記の実験データから、Ｈ１－ＰＣ１１、Ｈ２－ＰＡ２７、Ｈ２－ＰＡ３１及びＨ２－ＰＡ４５などの４つのヒト化抗体は、比較的に高い熱変形温度を示し、４０℃の高温条件で１４日間保存した後、多量体及び断片の割合の変化が少なく、化学修飾を発生する割合の変化も低く、これらの４つのヒト化抗体の物理的安定性及び化学的安定性は、共に比較的に良好であった。

【0137】

上記の本発明の形態は、例示的なものにすぎず、当業者であれば、従来とは異なる実験を行う必要なしに、無数の特定の化合物、材料、及び操作の同等物を認識・決定することができる。全てのこれらの同等物は、本発明の範囲内にあり、特許請求の範囲に含まれる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【配列表】

2024509557000001.app

【手続補正書】

【提出日】2023-09-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】特許請求の範囲

【補正対象項目名】全文

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４～１０６、１１３～１１５、４４～１０３、１０７～１１２、１１６～１３３配列で示されるＣＤＲから選ばれる３つのＣＤＲを含み、
好ましくは、重鎖可変領域を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、１１３、４４、４７、５０、５３、５６、５９、６２、６５、６８、７１、７４、７７、８０、８３、８６、８９、９２、９５、９８、１０１、１０７、１１０、１１６、１１９、１２２、１２５、１２８、１３１からなる群から選ばれるＨＣＤＲ１；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０５、１１４、４５、４８、５１、５４、５７、６０、６３、６６、６９、７２、７５、７８、８１、８４、８７、９０、９３、９６、９９、１０２、１０８、１１１、１１７、１２０、１２３、１２６、１２９、１３２からなる群から選ばれるＨＣＤＲ２；及び、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １０６、１１５、４６、４９、５２、５５、５８、６１、６４、６７、７０、７３、７６、７９、８２、８５、８８、９１、９４、９７、１００、１０３、１０９、１１２、１１８、１２１、１２４、１２７、１３０、１３３からなる群から選ばれるＨＣＤＲ３を含み、
好ましくは、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１５；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４６；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５２；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５５；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５８；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６１；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６４；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６７；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７０；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７３；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７６；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７９；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８２；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８４及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８５；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８８；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９１；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９４；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９７；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１００；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０３；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０８及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０９；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１２；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１６、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１７及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１８；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１９、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２１；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２４；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２５、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２６及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２７；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２９及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０；或いは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３から選ばれるＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含み、
好ましくは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３を含む、ＮＫｐ４６に特異的に結合できる抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、前記ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２及びＨＣＤＲ３は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４２、１４６、１４～４３、１３６～１４１、１４３～１４５、１４７～１５２で示される重鎖可変領域に由来し、好ましくは、前記重鎖可変領域は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ： １４２、１４６、１４～４３、１３６～１４１、１４３～１４５、１４７～１５２で示される配列と少なくとも８０％～１００％の配列同一性を有する、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項2】

前記抗体は、組換え抗体であり、好ましくは、アルパカ由来抗体、キメラ抗体又はヒト化抗体であり、より好ましくは、前記抗体がナノボディであり、さらに好ましくは、前記抗体は、ヒト化ラクダ科ＶＨＨであり、
好ましくは、さらに重鎖定常領域及び／又は軽鎖定常領域を含み、好ましくは、前記重鎖定常領域は、Ｆｃ又は変異体Ｆｃを含み、Ｆｃは、マウス又はヒトに由来し、及び／又は、
前記抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４形態である、
前記の請求項１に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項3】

前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片と捕捉マーカー又は検出マーカーとをカップリングして形成されるコンジュゲートであって、前記検出マーカーが放射性核種、発光物質、着色物質又は酵素を含むコンジュゲート。

【請求項4】

抗原結合ドメインの１つが、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、二重特異性抗体又は多重特異性抗体。

【請求項5】

前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含み、抗体、リンカー及び毒物を互いに接続させることで形成される、抗体?薬物複合体。

【請求項6】

キメラ抗原受容体であって、その細胞外認識ユニットが、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含む、キメラ抗原受容体。

【請求項7】

前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸、或いは、前記核酸を含む組換えベクター、或いは、前記組換えベクターを含む宿主細胞又は前記核酸がゲノムに組み込まれている宿主細胞。

【請求項8】

適切な条件で請求項７に記載の宿主細胞を培養こと、及び前記細胞から発現産物を精製することを含む、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を調製する方法。

【請求項9】

ＮＫｐ４６を発現する細胞を特異的に標的とすることに使用されるための、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片、又は、ＮＫｐ４６を特異的に発現する疾患の治療、予防又は検出に使用されるための、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、好ましくは、前記細胞がＮＫ細胞である、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片、
好ましくは、がん、感染症、炎症性又は自己免疫性疾患の治療に使用されるための、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片であって、好ましくは、前記がんは、白血病、侵襲性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、神経膠腫、子宮頸がん、頭頸部がん、直腸がん、腎臓がん、肝臓がん、肺がん、膵臓がん、胃がん等を含む、抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項10】

ＮＫｐ４６を発現する疾患への診断に使用されるための、前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片。

【請求項11】

前記請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片と緩衝液を含む、抗ＮＫｐ４６抗体含有溶液製剤。

【請求項12】

細胞を含む生体から生体サンプルを取得すること、前記細胞を請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片と接触させること、及び、抗体が細胞に結合するかどうかを評価することを含む、生体におけるＮＫｐ４６発現細胞の存在を同定する方法。

【請求項13】

有効量の前記の請求項１又は２に記載の抗ＮＫｐ４６抗体又はその抗原結合断片を含み、或いは、有効量の請求項３に記載のコンジュゲートを含み、或いは、有効量の請求項４に記載の二重特異性抗体又は多重特異性抗体を含み、或いは、有効量の請求項５に記載の抗体?薬物複合体を含み、或いは、有効量の請求項６に記載のキメラ抗原受容体を含み、或いは、有効量の請求項７に記載の核酸、組換えベクター又は宿主細胞を含み、
好ましくは、薬学的に許容可能な担体をさらに含み、
より好ましくは、１種又は複数種の他の追加の治療剤をさらに含み、好ましくは、前記１種又は複数種の他の追加の治療剤は、化学治療剤、細胞毒性剤、放射性療法剤、がんワクチン、腫瘍減量剤、標的抗癌剤、抗血管新生剤、生物学的応答修飾剤、サイトカイン、ホルモン、抗転移剤及び免疫治療剤を含む、医薬組成物。

【国際調査報告】