(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-05
(54)【発明の名称】非終端抗体創製方法及び単一細胞アッセイ
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240227BHJP
G01N 33/543 20060101ALI20240227BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N33/543 501A
G01N33/53 M
C12P21/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547076
(86)(22)【出願日】2022-02-04
(85)【翻訳文提出日】2023-09-29
(86)【国際出願番号】 US2022015279
(87)【国際公開番号】W WO2022170071
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】63/146,135
(32)【優先日】2021-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
(71)【出願人】
【識別番号】500049716
【氏名又は名称】アムジエン・インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】マクファデン，カリン・イー
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ブライアン・エム
(72)【発明者】
【氏名】ムロースキー，クリストファー
(72)【発明者】
【氏名】ウィンターズ，アーロン・ジョージ
(72)【発明者】
【氏名】サントス，ダニエル
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AG26
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA13
(57)【要約】
本明細書においては、（ａ）非ヒト動物を免疫原で免疫することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の生成のために血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることを含む、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターする方法が提供される。選択抗体の産生のために非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法もまた提供される。例示的な実施形態では、方法は、上記のように（ａ）～（ｃ）のサイクルを実施し、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合にサイクルを繰り返すことを含む。様々な態様において、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上になるまで、サイクルを繰り返す。単一細胞アッセイが、本明細書においてさらに提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターする方法であって、ａ．非ヒト動物を免疫原により免疫化するステップと、
ｂ．前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得るステップと、
ｃ．選択抗体の産生について、前記血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイするステップと
を含む方法。
【請求項2】
選択抗体の生成のために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法であって、ａ．免疫原により非ヒト動物に初回免疫化を実施するステップと、
ｂ．前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得るステップと、
ｃ．選択抗体の産生について、前記血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイするステップと、
ｄ．選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、ステップのサイクルを実施するステップと
を含み、前記サイクルは、
ｉ．選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原により前記非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、
ｉｉ．前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、
ｉｉｉ．選択抗体の産生について、前記血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることと
を含む方法。
【請求項3】
前記アッセイするステップは、単一細胞生細胞アッセイを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
複数のＡＳＣが同時にアッセイされる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記血液試料又はその画分をマトリックスに適用し、前記マトリックスの固有のアドレスを各ＡＳＣに割り当てることを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記アッセイするステップの結果は、選択抗体を産生する各ＡＳＣの特定である、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記結果は、選択抗体を産生する各ＡＳＣの固有のアドレスの特定を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記サイクルは、少なくとも１回行われる、請求項２～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記サイクルは、（ｉｉｉ）のアッセイで、選択抗体を産生するＡＳＣの数が閾値以上になるまで繰り返される、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記サイクルは、少なくとも２回繰り返される、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
その後の免疫化の免疫原は、初回の免疫の免疫原とは異なる、請求項２～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
各その後の免疫化は、（Ａ）異なる免疫原、アジュバント、及び／若しくは免疫調節剤が非ヒト動物に投与される、（Ｂ）異なる用量の免疫原が非ヒト動物に投与される、（Ｃ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤の各投与間の時間が異なる、並びに／又は（Ｄ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤の各投与の経路が異なるという点で、それ以前の免疫化とは異なる、請求項２～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記非ヒト動物が免疫化される都度、異なる免疫原が使用される、請求項２～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
非ヒト動物において選択抗体を生成する方法であって、ａ．免疫原により非ヒト動物に初回免疫化を実施するステップと、
ｂ．前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得るステップと、
ｃ．選択抗体の産生について、前記血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイするステップと、
ｄ．選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、ステップのサイクルを実施するステップと、ここで、前記サイクルは、
ｉ．選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原により前記非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、
ｉｉ．前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、
ｉｉｉ．選択抗体の産生について、前記血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることと
を含む、
ｅ．前記選択抗体及び／又は前記選択抗体を産生するＡＳＣを単離するステップと
を含む方法。
【請求項15】
ＡＳＣによって産生される前記選択抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＡＳＣによって産生される前記選択抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を決定するステップと、前記選択抗体の前記重鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド配列を含む第１のベクター、及び前記選択抗体の前記軽鎖可変領域をコードする前記ヌクレオチド配列を含む第２のベクターを宿主細胞に導入するステップと、
前記宿主細胞によって産生される抗体を単離するステップと
を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記アッセイするステップは、ａ．前記マトリックス内の前記ＡＳＣを、（ｉ）前記選択抗体に結合し、固体支持体を含む捕捉試薬、（ｉｉ）前記選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）前記選択抗体が結合する標識標的と組み合わせるステップと、ここで、前記標識標的は、前記第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を含む、
ｂ．前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識についてアッセイするステップと、
ｃ．前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識の両方が検出される前記マトリックス内の位置を特定するステップと、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、
を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記捕捉剤は、固体支持体に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記検出剤は、第１の検出可能な標識に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項19】
前記捕捉剤の抗体Ｆｃドメインに結合する前記抗体は、前記検出剤の同じ抗体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記組み合わせるステップはウェル中で行われ、前記捕捉剤は前記ウェル中で単層を形成し、任意選択により、前記ＡＳＣは前記捕捉試薬、検出試薬及び／又は標識標的に前記ウェル中で最初に曝露されるか、又は前記ウェルに添加される直前に曝露される、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識の両方が検出される前記ウェル内の位置を特定するステップを含み、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記組み合わせるステップは、マイクロ流体チャンバー若しくはナノ流体チャンバー、マイクロウェルデバイス若しくはナノウェルデバイス、マイクロ毛細管若しくはナノ毛細管、又はナノ流体チップのナノペン内で行われる、請求項１６～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記組み合わせるステップは、ナノ流体チップのナノペン内で行われる、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識の両方が検出される前記ナノ流体チップ内の各ペンの位置を特定するステップを含み、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記血液試料の単一ＡＳＣは、ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰ）によって前記ナノ流体チップのペン内に移動される、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項26】
前記選択抗体は、前記非ヒト動物を免疫化するために使用される前記免疫原と同じか又は類似している標的に結合する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記選択抗体は、１つ以上の競合結合剤の存在下で前記標的に結合する、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記競合結合剤は、前記アッセイ中に、前記ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされる、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
前記選択抗体は、標的親和性をもって標的に結合し、任意選択により、前記標的に対する前記選択抗体のＫＤは約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍである、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記アッセイするステップは、第１ラウンドにおいては、第１の量の前記標識標的で実施され、第２ラウンドにおいては、第２の量の前記標識標的で実施され、ここで、前記第１の量は前記第２の量よりも多く、任意選択により、前記アッセイするステップはさらに、第３ラウンドにおいて、第３の量の前記標識標的で実施され、前記第３の量は前記第２の量未満であり、各ラウンドにおいて前記ＡＳＣが前記標識標的に結合すると、前記ＡＳＣは選択抗体を産生する、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記選択抗体は標的及びそのオルソログ又はパラログに結合し、任意選択により、前記標的はヒトタンパク質であり、前記オルソログはカニクイザルタンパク質である、請求項１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
第２の標識標的が、前記ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ、ここで、前記第２の標識標的は、前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合されたオルソログを含み、前記方法は、前記第３の検出可能な標識についてアッセイするステップと、前記第１の検出可能な標識、前記第２の検出可能な標識、及び前記第３の検出可能な標識が検出される位置を特定するステップとをさらに含み、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記選択抗体は標的に結合し、そのオルソログ又はパラログには結合しない、請求項１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
第２の標識標的が、前記ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ、ここで、前記第２の標識標的は、前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合されたオルソログを含み、前記方法は、前記第３の検出可能な標識についてアッセイするステップと、前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識のみが検出され、前記第３の検出可能な標識は検出されない位置を特定するステップとをさらに含み、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、請求項３３に記載の方法。
【請求項35】
前記選択抗体は、前記標的の一部に結合する、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項36】
第２の標識標的が、前記ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ、ここで、前記第２の標識標的は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合された前記標的の一部を含み、前記方法は、前記第３の検出可能な標識についてアッセイするステップと、前記第１の検出可能な標識、前記第２の検出可能な標識、及び前記第３の検出可能な標識が検出される位置を特定するステップとをさらに含み、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、請求項３５に記載の方法。
【請求項37】
前記標的は、複数のドメインを含むタンパク質であり、前記選択抗体は、前記標的の１つのドメインのみに結合し、前記標識標的は、前記第２の検出可能な標識に結合した前記標的の細胞外ドメインを含み、前記第２の標識標的は、第３の検出可能な標識に結合した１つのドメインを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記選択抗体は、前記標的の二量体化又は多量体化の際に形成される立体構造エピトープに結合し、前記標的は、二量体化ドメイン又は多量体化ドメインを含む、請求項１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
前記標識標的は、前記第２の検出可能な標識に結合した前記免疫原の細胞外ドメインを含み、前記第２の標識標的は、前記ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ、前記第２の標識標的は、前記第１の検出可能な標識及び前記第２の検出可能な標識とは異なる前記第３の検出可能な標識に結合した前記免疫原の前記二量体化ドメイン又は多量体化ドメインを含み、前記方法は、前記第３の検出可能な標識についてアッセイするステップと、前記第１の検出可能な標識、前記第２の検出可能な標識、及び前記第３の検出可能な標識が検出される位置を特定するステップとをさらに含み、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、請求項３８に記載の方法。
【請求項40】
前記血液試料は、前記免疫化ステップの約３日～約７日後に前記非ヒト動物から得られる、請求項１～３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項41】
前記非ヒト動物から得られる前記血液試料は、約５００μＬ以下である、請求項１～４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項42】
前記血液試料は、約１００μＬ～約２５０μＬである、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記ＡＳＣは、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞である、請求項１～４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項44】
前記ＡＳＣは、遊走形質芽球を含む、請求項１～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
アッセイの前に、前記非ヒト動物から得られた前記血液試料の１つ以上の成分を除去するステップをさらに含む、請求項１～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
赤血球、血漿、及び／又は血小板が、前記血液試料から除去される、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記血液試料の前記画分は、ＣＤ１３８＋細胞を選択することによって調製される、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項48】
前記非ヒト動物は、１つ以上の二次リンパ器官の除去にも安楽死にも供されることはない、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記血液試料からのＡＳＣは、ハイブリドーマの作製に使用されない、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記非ヒト動物は、一連の非ヒト動物の１つであり、前記アッセイの結果は、選択抗体を産生するＡＳＣの数が閾値未満であり、且つ／又はさらに免疫化を必要とする非ヒト動物の特定である、請求項２～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記方法のステップが一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに前記血液試料のＢ細胞レパトアをプロファイリングするステップと、標的Ｂ細胞プロファイルを有する一連のサブセットを選択するステップとを含む、請求項２～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合に、前記非ヒト動物を致死させ、前記非ヒト動物から組織を採取するステップを含む、請求項１～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記非ヒト動物から脾臓を採取することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項54】
前記脾臓のＢ細胞をスクリーニングするステップ、及び／又は前記脾臓の細胞からハイブリドーマを生成するステップを含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
選択抗体を産生する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）について一連の非ヒト動物をスクリーニングする方法であって、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法に従って一連の非ヒト動物中の非ヒト動物抗体において選択抗体の産生をモニターするステップ
を含み、
前記一連の各非ヒト動物について、前記選択抗体を産生するＡＳＣの数を特定する方法。
【請求項56】
動物について、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その後の免疫化を行うステップを含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項57】
動物について、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、前記動物から二次リンパ器官を採取するステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
その後の免疫化のために免疫された非ヒト動物を選択する方法であって、請求項１～５７のいずれか一項に記載の方法に従って非ヒト動物において選択抗体の産生をモニターするステップと、ここで、各非ヒト動物について、前記選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定される、
動物について、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、前記動物をその後の免疫のために選択するステップと
を含む方法。
【請求項59】
致死及び二次リンパ採取のために非ヒト動物を選択する方法であって、請求項１～５８のいずれか一項に記載の方法に従って非ヒト動物において選択抗体の産生をモニターするステップと、ここで、各非ヒト動物について、前記選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定される、
動物について、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、前記動物を致死及び二次リンパ採取のために選択するステップと
を含む方法。
【請求項60】
選択抗体を産生するＡＳＣをアッセイする方法であって、ａ．ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分、ここで、前記血液試料は抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む、（ｉｉ）前記選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）前記選択抗体が結合する標的を組み合わせるステップと
ここで、
（Ａ）前記標的は、前記第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を含む標識標的であり、前記選択抗体に結合し、固体支持体を含む捕捉試薬が、前記ウェル内でさらに組み合わされて、前記ウェル内で単層を形成する、又は
（Ｂ）前記標的は、前記細胞の表面で発現され、前記細胞がウェル内で組み合わされて、前記ウェル内で単層を形成する、
ｂ．前記第１の検出可能な標識についてアッセイし、任意選択により、前記標的が標識標的である場合、前記第２の検出可能な標識についてアッセイするステップと、
ｃ．前記第１の検出可能な標識が検出される前記ウェル内の位置、又は前記第１及び第２の検出可能な標識が検出される前記ウェル内の位置を特定するステップと、ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す、
を含む方法。
【請求項61】
前記ＡＳＣは前記検出試薬及び／又は標的に前記ウェル中で最初に曝露されるか、又は前記ウェルに添加される直前に曝露される、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記選択抗体は、前記非ヒト動物を免疫化するために使用される前記免疫原と同じか又は類似している標的に結合する、請求項６０又は６１に記載の方法。
【請求項63】
前記検出試薬は、固体支持体に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含み、且つ／又は前記検出試薬は、第１の検出可能な標識に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む、請求項６０～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記捕捉剤の抗体Ｆｃドメインに結合する前記抗体は、前記検出剤の同じ抗体である、請求項６３に記載の方法。
【請求項65】
前記血液試料は、前記免疫化ステップの約３日～約７日後に前記非ヒト動物から得られる、請求項６０～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記非ヒト動物から得られる前記血液試料は、約５００μＬ以下であり、任意選択により、約１００μＬ～約２５０μＬである、請求項１～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記ＡＳＣは、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞である、請求項６０～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記ＡＳＣは、遊走形質芽球を含む、請求項６０～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記ウェル内での組み合わせの前に、前記非ヒト動物から得られた前記血液試料の１つ以上の成分を除去するステップをさらに含む、請求項６０～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
赤血球、血漿、及び／又は血小板が、前記血液試料から除去される、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記血液試料の前記画分は、ＣＤ１３８＋細胞を選択することによって調製される、請求項６９又は７０に記載の方法。
【請求項72】
前記選択抗体は、１つ以上の競合結合剤の存在下で前記標的に結合する、請求項６０～７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記競合結合剤は、前記アッセイ中に、前記ＡＳＣ、検出試薬、及び前記標的を発現する細胞と組み合わされる、請求項７２に記載の方法。
【請求項74】
前記選択抗体は、標的親和性をもって標的に結合し、任意選択により、前記標的に対する前記選択抗体のＫＤは約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍである、請求項６０～７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
前記アッセイは、第１ラウンドにおいては、第１の量の前記標的を発現する前記細胞で実施され、第２ラウンドにおいては、第２の量の前記標的発現する前記細胞で実施され、ここで、前記第１の量は前記第２の量よりも多く、任意選択により、前記アッセイはさらに、第３ラウンドにおいて、第３の量の前記標的を発現する前記細胞で実施され、前記第３の量は前記第２の量未満であり、各ラウンドにおいて前記ＡＳＣが前記標識標的に結合すると、前記ＡＳＣは選択抗体を産生する、請求項７４に記載の方法。
【請求項76】
前記選択抗体は標的及びそのオルソログ又はパラログに結合し、任意選択により、前記標的はヒトタンパク質であり、前記オルソログはカニクイザルタンパク質である、請求項６０～７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
前記細胞は、前記標的、及びそのオルソログ又はパラログを発現する、請求項７６に記載の方法。
【請求項78】
前記選択抗体は標的に結合し、そのオルソログ又はパラログには結合しない、請求項６０～７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項79】
前記選択抗体は、前記標的の一部に結合する、請求項６０～７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項80】
前記標的は、複数のドメインを含むタンパク質であり、前記選択抗体は、前記標的の１つのドメインのみに結合し、前記標識標的は、前記第２の検出可能な標識に結合した前記標的の細胞外ドメインを含み、前記第２の標識標的は、第３の検出可能な標識に結合した１つのドメインを含む、請求項７９に記載の方法。
【請求項81】
前記選択抗体は、前記標的の二量体化又は多量体化の際に形成される立体構造エピトープに結合し、前記標的は、二量体化ドメイン又は多量体化ドメインを含む、請求項６０～８０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本願は、２０２１年２月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１４６，１３５号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
本願は、２０２１年２月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１４６，１３５号の優先権を主張するものであり、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0002】
従来の動物に基づく抗体創製方法には、様々な複雑さを有するタンパク質標的に対するポリクローナル血清力価に基づいて動物を致死させることが含まれる。抗体創製キャンペーンのなかには単純な設計目標（例えば、標的への結合）を有するものもあるが、ほとんどはより複雑であり、所望の抗体に様々な特徴（例えば、交差反応性、特定のエピトープへの結合、特異的親和性を有する結合など）を求める。従来の抗体創製のアプローチは、Ｂ細胞の採取及び抗体生成用の動物を選択するためにポリクローナル分泌抗体（血清）反応を調べることに依存している。「血清力価」によるアプローチは、分泌された全ての抗体（すなわち、それはポリクローナル混合物である）の総反応性を測定し、検出された抗体のＢ細胞供給源を特定するために使用することができない（すなわち、ソースＢ細胞からの物理的に切り離されたもの及び一時的に切り離されたものの両方が存在する）ので、理想的とは言えない。表現型（抗体力価測定）と遺伝子型（抗体をコードする重要なＢ細胞供給源）との間に直接的な関連性がないことは、Ｂ細胞応答の質の解釈を困難にする。可溶性の抗原特異的抗体が血清中に存在するかどうかを決定すること以外に、このポリクローナル分析から動物選択に役立つことができるさらなる有用な情報を得ることは困難である。
【0003】
さらに、従来の方法論は動物に関しては最終的なものであり、したがって、動物の関連するＢ細胞レパトアを捕捉する「１回限りの」試みである。技術的な問題、抗体産生が最適ではない動物の選択、及び／又はレパトアのサンプリング深度の欠如（すなわち、非常に少ないＢ細胞レパトア（０．１％未満）の融合をもたらす従来のウイルス不死化及びハイブリドーマプロセスの効率の低さ）によって引き起こされ得る、このレパトアを捕捉することができないことは、貴重な資源の浪費をもたらし、代替の免疫動物又は完全に新しい免疫化キャンペーンの使用を強いる。さらに、従来の方法は、同じ動物の免疫系を利用して抗体反応を進化させる連続プロセスの可能性を排除する。
【0004】
こうした制限にもかかわらず、従来の方法は、免疫レパトアの許容可能な画分の捕捉を可能にし、下流のアッセイに適合するように容易にスケーリングすることができる抗体の再生可能な供給源を提供するため、部分的に広く使用されている。
【0005】
これらの従来の方法では、時間がかかりすぎてプロジェクトのスケジュールに対応できない、間違ったＢ細胞集団を捕捉する、Ｂ細胞レパトアを十分にサンプリングすることができない、又は進化するＢ細胞応答のリアルタイムのモニタリングができないという状況が増えている。加えて、多くの抗体標的クラス（例えば、複合膜タンパク質、最小エピトープ空間を有する標的、オルソログに非常に類似するタンパク質など）の困難な性質が、強固な免疫原性の欠如のために、動物におけるＢ細胞応答を惹起することを困難にし得る。一部の抗体設計目標の極端な複雑さと相まって、所望の免疫プロファイル（すなわち、Ｂ細胞レパトア）を有する免疫動物を作製することは困難であり得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上記を考慮すると、より効率的な抗体創製方法が必要とされている。例えば、従来の動物免疫化をより良好に位置づけることができる抗体創製方法、及び抗体創製が成功するためのＢ細胞法は、動物に基づく抗体創製を大きく増強させるであろう。
【課題を解決するための手段】
【0007】
抗体創製に有用な技術を実証する理論的根拠、実験方法、及びデータが初めて提供される。例示的な態様では、方法は、生きている非ヒト動物の末梢血から直接抗原特異的抗体を特定することを含む。有利には、そのような本明細書で提供される方法により、動物安楽死後に免疫臓器を採取する（例えば、脾臓、リンパ節、及び骨髄）従来の方法とは異なり、動物を致死させる必要がない抗体創製が可能になる。このような方法は非終端である（例えば、抗体産生動物の安楽死を伴わない）ため、方法は、例えば、目的の抗体が得られるまで、同じ動物で何回も繰り返すことができる。同じ動物で方法を繰り返すことが可能であることは、従来の方法に比べていくつかの利点がある。例えば、同じ動物で方法を繰り返すことにより、抗体創製プロセス全体に要するコストが低減される。また、本開示の方法では、動物は生存しているので、抗体レパトアのリアルタイム、インライフのサンプリングが可能であり、例えば、動物が目的の標的抗体を発現するＢ細胞を産生しない場合、（前の免疫で）観察されたＢ細胞応答に基づいて、（その後の免疫化に使用する）免疫化プロトコルに対して戦略的調整を行うことができる。それによって、本発明の方法では、合理的なレパトア形成及び／又は抗体設計目標に適合する意図を持った免疫応答のステアリングが可能になる。本開示の例示的なプロセスを図１Ｂ～１Ｅに示す。図１Ｂは、免疫化した動物の血液試料から得た単一細胞をスクリーニングすることを含む、免疫応答をモニターするための例示的な非終端方法を示す。単一細胞スクリーニングの結果に基づいて、動物は免疫化の反復ラウンド（例えば、別の免疫化）に供し、続いて、免疫化した動物から得られた血液試料からの細胞を単一細胞スクリーニングに供するか、又は、動物が所望の表現型を示すことがスクリーニングによって決定された場合、組織を採取し得る。図１Ｃは、選択抗体の産生をモニターする例示的な非終端方法を示し、この方法では、免疫化動物から得られた血液試料から精製された抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を単一細胞レベルでスクリーニングする。設計目標を達成し、且つ／又は選択抗体が産生されるまで、プロセスを繰り返す。図１Ｄは、選択抗体を産生するための抗体産生を誘導する例示的な非終端方法を示し、この方法では、一次戦略を用いて動物を免疫化し、免疫化された動物から単離されたＰＢＭＣから得られたＡＳＣを所望の表現型についてスクリーニングする。スクリーニングで設計目標が達成されていないと決定された場合、動物を（例えば、一次戦略とは異なる）別の戦略で免疫化し、この免疫化された動物から単離したＰＢＭＣから得られたＡＳＣを所望の表現型についてスクリーニングする。設計目標が達成されたとスクリーニングで決定されるまで、このプロセスを繰り返す。設計目標が達成された場合、ハイブリドーマ、単一細胞プラットフォーム、又は配列ベースの創製を使用して、抗体レスキューのために最終の組織を採取することができる。図１Ｅは、動物をスクリーニングし、Ｂ細胞プロファイリングする例示的な非終端方法を示し、この方法では、一連の動物を免疫原で免疫化し、各動物から得られた血液試料から得られたＡＳＣをスクリーニングし、Ｂ細胞レパトアをプロファイリングする。例示的なプロセスの様々な態様では、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）、例えば、形質芽球を、免疫化したマウスの末梢血から精製し、次いで、関連する活性又は表現型について単一細胞解像度でスクリーニングする。典型的には約８週間を必要とし、高度の技術的熟練を必要とする従来のハイブリドーマ作製プロセス（図１Ａに示す）と比較して、本開示のプロセスは、労働集約度が低く、要する時間は少ない。
【0008】
したがって、本開示は、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターする方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、（ａ）非ヒト動物を免疫原で免疫化することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする、例えば個々にアッセイすることとを含む。様々な例において、本方法は、設計目標が達成されるまで、例えば、選択抗体が産生されるまで、（ｂ）及び（ｃ）を１回以上繰り返すことをさらに含む。図１Ｃは、本開示のこの例示的な態様を示す。本開示はまた、選択抗体の生成のために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）免疫原で非ヒト動物に初回免疫化を実施することと、（ｂ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする、例えば個々にアッセイすることと、（ｄ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合にステップのサイクルを実施することとを含み、サイクルは（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする、例えば個々にアッセイすることとを含む。
【0009】
様々な態様において、アッセイすることは、単一細胞生細胞アッセイを含む。本明細書で使用される場合、「ＡＳＣを個々にアッセイする」という語句は、ＡＳＣを単一細胞レベル又は単一細胞解像度でアッセイ又は分析することを意味する。例示的な例において、「ＡＳＣを個々にアッセイする」ことにより、単一のＡＳＣに関連する結果が得られる。任意選択により、複数のＡＳＣが同時にアッセイされる。様々な態様において、複数のＡＳＣが同時に個々にアッセイされる。例示的な態様では、血液試料は非ヒト動物から非終端方法で得られ、例えば、非ヒト動物は血液試料採取中に殺されることはない。例示的な例では、本方法は、非ヒト動物からの非終端採血を実施することを含む。様々な例では、本方法は、血液試料又はその画分をマトリックスに適用し、マトリックスの固有のアドレスを各ＡＳＣに割り当てることを含む。アッセイの結果は、任意選択により、選択抗体を産生する各ＡＳＣの特定である。特定の態様では、アッセイの結果は、選択抗体を産生する各ＡＳＣの固有のアドレスの特定である。例示的な例では、本方法は、（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする、例えば個々にアッセイすることとの少なくとも１サイクルを含む。任意選択により、サイクルは、（ｉｉｉ）のアッセイで、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上になるまで繰り返される。様々な例において、サイクルは少なくとも２回繰り返される。
【0010】
その後の免疫化の免疫原は、例示的な態様において、初回免疫化の免疫原とは異なり得る。例えば、例示的な態様では、各その後の免疫化は、（Ａ）異なる免疫原、アジュバント、及び／若しくは免疫調節剤が非ヒト動物に投与される、（Ｂ）異なる用量の免疫原が非ヒト動物に投与される、（Ｃ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤の各投与間の時間が異なる、並びに／又は（Ｄ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤の各投与の経路が異なるという点で、それ以前の免疫化とは異なる。任意選択により、非ヒト動物が免疫化される都度、異なる免疫原が使用される。図１Ｄは、選択抗体の産生のために抗体産生を誘導する例示的な方法を示す。
【0011】
本開示はさらに、非ヒト動物において選択抗体を生成する方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、抗体産生を誘導する本開示の方法に従って選択抗体の産生のために非ヒト動物において抗体産生を誘導し、次いで、選択抗体及び／又は選択抗体を産生するＡＳＣを単離することを含む。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）免疫原で非ヒト動物に初回免疫化キャンペーンを実施することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする、例えば個々にアッセイすることと、（ｄ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合にステップのサイクルを実施すること（ここで、サイクルは（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする、例えば個々にアッセイすることとを含む）と、（ｅ）選択抗体及び／又は選択抗体を産生するＡＳＣを単離することとを含む。様々な態様において、本方法は、（ｆ）ＡＳＣ（例えば、選択抗体を産生する単離されたＡＳＣ）によって産生される選択抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＡＳＣによって産生される選択抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を決定することと、（ｇ）選択抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、及び選択抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２のベクターを宿主細胞に導入することと、（ｈ）宿主細胞によって産生される抗体を単離することとを含む。
【0012】
例示的な態様において、本開示の方法のアッセイは、（ａ）マトリックス内のＡＳＣを、選択抗体に結合し、選択抗体に結合すると検出可能なシグナル、例えば蛍光シグナルを生じる試薬と組み合わせることを含む。様々な態様において、本開示の方法のアッセイは、（ａ）マトリックス内のＡＳＣを、選択抗体のＦｃドメインに結合する少なくとも１つの試薬、及び選択抗体が結合する少なくとも１つの試薬（例えば、選択抗体の抗原結合ドメインに結合する試薬）と組み合わせることを含み、これらの試薬の少なくとも１つは、検出可能な標識に結合している。例示的な例において、ＡＳＣは、選択抗体のＦｃドメインに結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び選択抗体が結合する標的（例えば、選択抗体の抗原結合ドメインに結合する試薬）と組み合わされる。図２Ａ～２Ｃは、本開示の方法の文脈における例示的なアッセイを示す。様々な例において、標的は、第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識によって標識されている。いくつかの例では、選択抗体のＦｃドメインに結合し、固体支持体を含む捕捉試薬が、ＡＳＣ、検出試薬及び標識標的とさらに組み合わされる。様々な例において、本方法は、（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識についてアッセイすること；並びに（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識が検出されるマトリックス内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）をさらに含む。図２Ａ及び図２Ｂは、このような標識標的及び捕捉試薬を用いた例示的なアッセイを示している。図２Ａは、マトリックスをウェルとして示す。図２Ｂは、マトリックスをマルチペンチップ又はマルチウェルプレートとして示し、各ＡＳＣは、単一のペン又はウェル内に配置される。様々な例において、標的は細胞によって発現され、標的を発現する細胞がＡＳＣ及び検出試薬と組み合わされる。例示的な態様において、本方法は、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイすること、及び（ｃ）第１の検出可能な標識が検出されるマトリックス内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）をさらに含む。図２Ｃは、このような標的を発現する細胞を用いた例示的なアッセイを示している。例示的な例において、本開示の方法のアッセイは、（ａ）マトリックス内のＡＳＣを、（ｉ）選択抗体に結合し、固体支持体を含む捕捉試薬、（ｉｉ）選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）選択抗体が結合する標識標的（ここで、標識標的は、第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を含む）と組み合わせることと、（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるマトリックス内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。任意選択により、捕捉剤は、固体支持体に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む。検出剤は、例示的な例において、第１の検出可能な標識に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む。様々な態様において、捕捉剤の抗体Ｆｃドメインに結合する抗体は、検出剤と同じ抗体である。例示的な例において、組み合わせることはウェル中で行われ、捕捉剤はウェル中で単層を形成する。様々な態様において、本方法は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）を含む。
【0013】
本開示はさらに、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための単一細胞アッセイを提供する。本開示は、選択抗体を産生するＡＳＣについてアッセイする方法を提供する。例示的な実施形態において、アッセイ又は方法は、（ａ）ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分（ここで、血液試料はＡＳＣを含む）、（ｉｉ）選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）選択抗体が結合する標的を組み合わせること（ここで、（Ａ）標的は、第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を含む標識標的であり、選択抗体に結合し、固体支持体を含む捕捉試薬が、ウェル内でさらに組み合わされて、ウェル内で単層を形成するか、又は（Ｂ）標的は細胞の表面で発現され、細胞がウェル内で組み合わされて、ウェル内で単層を形成する）と、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイし、任意選択により、標的が標識標的である場合、第２の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第１の検出可能な標識が検出されるか、又は第１及び第２の検出可能な標識が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。様々な態様において、アッセイ又は方法は、（ａ）ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分、（ｉｉ）固体支持体に結合した抗体のＦｃに結合する、抗体を含む捕捉試薬、（ｉｉｉ）第１の検出可能な標識に結合した抗体のＦｃに結合する、抗体を含む検出試薬、及び（ｉｖ）第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識に結合した、免疫原又はその一部を含む標識標的とを組み合わせること（ここで、捕捉剤は、ウェル内で単層を形成する）と、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第２の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｄ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。様々な態様において、アッセイ又は方法は、（ａ）ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分、（ｉｉ）選択抗体に結合する検出試薬、及び（ｉｉｉ）選択抗体が結合する標的を細胞表面で発現する細胞であって、ウェル内で組み合わされてウェル内に単層を形成する細胞を組み合わせることと、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。
【0014】
本開示の方法の様々な態様において、非ヒト動物は、１つ以上の二次リンパ器官の除去も安楽死も受けない。また、様々な例において、血液試料からのＡＳＣは、ハイブリドーマの作製には使用されない。例示的な態様において、非ヒト動物は、一連の非ヒト動物の１つであり、アッセイの結果は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満であり、且つ／又はさらなる免疫化を必要とする非ヒト動物の特定である。別の態様では、方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、非ヒト動物を致死させ、非ヒト動物から組織を採取することを含む。様々な例において、本方法のステップは、一連の非ヒト動物に対して実施され、方法は、一連の非ヒト動物ごとに血液試料のＢ細胞レパトアをプロファイリングすることと、標的Ｂ細胞プロファイルを有する一連のサブセットを選択することとを含む。図１Ｅは、このようなステップを示す。
【0015】
合理的な免疫レパトアの生成及び選択は、動物に基づく抗体創製技術における重要な構成要素である。従来のＢ細胞不死化から、ＮａｎＯＢＬＡＳＴ（ナノ流体Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）機器による抗体創製プロセス）及びマイクロカプセル化など（これらに限定されない）の直接的なＢ細胞プラットフォームへの進歩にもかかわらず、入力Ｂ細胞の多様性及び品質は、引き続き抗体設計目標を達成する上で必須の決定因子である。免疫動物を評価するための従来のアプローチは、免疫応答を評価し、Ｂ細胞の採取及び抗体生成用の動物を選択するためにポリクローナル分泌抗体（血清）調べることに依存している。「血清力価」によるアプローチは、分泌された全ての抗体の総反応性を測定し、検出された抗体の個々のＢ細胞供給源の質を測定しないので、理想的とは言えない。抗体力価測定と重要なＢ細胞供給源との間に直接的な関連性がないことは、Ｂ細胞応答の質の解釈を困難にする。可溶性の抗原特異的抗体が血清中に存在するかどうかを決定すること以外に、このポリクローナル分析から動物選択又は免疫ステアリング戦略に役立つさらなる有用な情報を得ることは困難である。これらの課題に対処する、非終端末梢血に由来する試料を使用して、免疫動物のＢ細胞応答を調べるためのＡＳＣアッセイが、本明細書において提供される。したがって、本開示は、選択抗体を産生する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）について非ヒト動物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）一連の非ヒト動物を免疫原で免疫化することと、（ｂ）一連の各非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとを含み、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が決定される。様々な態様において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、その非ヒト動物を致死及び／又は組織採取のために選択することをさらに含む。様々な態様において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その非ヒト動物をその後の免疫化のために選択することをさらに含む。したがって、様々な実施形態において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合に基づいて、致死対象の動物とその後の免疫化対象の動物とを識別する。
【0016】
上記と一致して、その後の免疫化のために、免疫化された非ヒト動物を選択する方法が提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示の方法のいずれか１つに従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、この方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定され、動物に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その動物をその後の免疫化のために選択する。また、安楽死及び二次リンパ系採取のために、免疫化された非ヒト動物を選択する方法が本明細書において提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示の方法のいずれか１つに従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、この方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定され、動物に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、その動物を安楽死及び二次リンパ系採取のために選択する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1A】図１Ａは、従来のトランスジェニックマウスハイブリドーマ作製方法を説明する図である。図１Ｂは、免疫応答をモニターするための非終端方法を説明する図である。図１Ｃは、選択抗体の産生をモニターする非終端方法を説明する図である。図１Ｄは、選択抗体産生のために抗体産生を誘導する非終端方法を説明する図である。図１Ｅは、動物のスクリーニング及びＢ細胞プロファイリングの非終端方法を説明する図である。
【図1B】図１Ａは、従来のトランスジェニックマウスハイブリドーマ作製方法を説明する図である。図１Ｂは、免疫応答をモニターするための非終端方法を説明する図である。図１Ｃは、選択抗体の産生をモニターする非終端方法を説明する図である。図１Ｄは、選択抗体産生のために抗体産生を誘導する非終端方法を説明する図である。図１Ｅは、動物のスクリーニング及びＢ細胞プロファイリングの非終端方法を説明する図である。
【図1C】図１Ａは、従来のトランスジェニックマウスハイブリドーマ作製方法を説明する図である。図１Ｂは、免疫応答をモニターするための非終端方法を説明する図である。図１Ｃは、選択抗体の産生をモニターする非終端方法を説明する図である。図１Ｄは、選択抗体産生のために抗体産生を誘導する非終端方法を説明する図である。図１Ｅは、動物のスクリーニング及びＢ細胞プロファイリングの非終端方法を説明する図である。
【図1D】図１Ａは、従来のトランスジェニックマウスハイブリドーマ作製方法を説明する図である。図１Ｂは、免疫応答をモニターするための非終端方法を説明する図である。図１Ｃは、選択抗体の産生をモニターする非終端方法を説明する図である。図１Ｄは、選択抗体産生のために抗体産生を誘導する非終端方法を説明する図である。図１Ｅは、動物のスクリーニング及びＢ細胞プロファイリングの非終端方法を説明する図である。
【図1E】図１Ａは、従来のトランスジェニックマウスハイブリドーマ作製方法を説明する図である。図１Ｂは、免疫応答をモニターするための非終端方法を説明する図である。図１Ｃは、選択抗体の産生をモニターする非終端方法を説明する図である。図１Ｄは、選択抗体産生のために抗体産生を誘導する非終端方法を説明する図である。図１Ｅは、動物のスクリーニング及びＢ細胞プロファイリングの非終端方法を説明する図である。
【図2A】図２Ａは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための例示的な単一細胞アッセイの適用を説明する図である。図２Ｂは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための別の例示的な単一細胞アッセイを説明する図である。図２Ｃは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するためのさらに別の例示的な単一細胞アッセイを説明する図である。
【図2B】図２Ａは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための例示的な単一細胞アッセイの適用を説明する図である。図２Ｂは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための別の例示的な単一細胞アッセイを説明する図である。図２Ｃは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するためのさらに別の例示的な単一細胞アッセイを説明する図である。
【図2C】図２Ａは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための例示的な単一細胞アッセイの適用を説明する図である。図２Ｂは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための別の例示的な単一細胞アッセイを説明する図である。図２Ｃは、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するためのさらに別の例示的な単一細胞アッセイを説明する図である。
【図5A】図５Ａは、例示的な単一細胞スクリーニングの構成要素を説明する図であり、図５Ｂは、抗原に結合する抗体の存在下で、単一細胞アッセイの構成要素がどのように相互作用するかを説明する図である。図５Ｃは、蛍光「ブルーム」を作り出すためにポリスチレンビーズと相互作用するＡＳＣ分泌抗体を保持する個々のペンを説明する図である。ＩｇＧ分泌及び抗原特異的抗体は、アッセイによって検出される。
【図5B】図５Ａは、例示的な単一細胞スクリーニングの構成要素を説明する図であり、図５Ｂは、抗原に結合する抗体の存在下で、単一細胞アッセイの構成要素がどのように相互作用するかを説明する図である。図５Ｃは、蛍光「ブルーム」を作り出すためにポリスチレンビーズと相互作用するＡＳＣ分泌抗体を保持する個々のペンを説明する図である。ＩｇＧ分泌及び抗原特異的抗体は、アッセイによって検出される。
【図5C】図５Ａは、例示的な単一細胞スクリーニングの構成要素を説明する図であり、図５Ｂは、抗原に結合する抗体の存在下で、単一細胞アッセイの構成要素がどのように相互作用するかを説明する図である。図５Ｃは、蛍光「ブルーム」を作り出すためにポリスチレンビーズと相互作用するＡＳＣ分泌抗体を保持する個々のペンを説明する図である。ＩｇＧ分泌及び抗原特異的抗体は、アッセイによって検出される。
【図7A-C】図７Ａは、適切な抗体対を選択するために使用されるサンドイッチＥＬＩＳＡフォーマットを説明する図である。図７Ｂは、抗体１の濃度の関数としてプロットしたＥＬＩＳＡシグナルのグラフである。図７Ｃは、抗体濃度の関数としてプロットしたＰＤ１機能のグラフである。
【図8A-D】図８Ａは、抗体を分泌するＡＳＣが単一のウェルに位置する緑色蛍光スポットの画像である。図８Ｂは、ＡＳＣによって分泌される抗原特異的抗体が単一のウェルに位置する赤色蛍光スポットの画像である。図８Ｃは、ＡＳＣ分泌抗体が単一ウェルに位置する着色スポット、ＡＳＣによって分泌される抗原特異的抗体が単一ウェルに位置するスポット、及び抗原特異的抗体を分泌するＡＳＣが単一ウェルに位置するスポットの画像である。図８Ｄは、２９３Ｔ細胞によって発現された抗原が、Ｂ細胞によって産生され、Ａｌｅｘａ ４８８で標識されたヤギ抗ヒトＦｃ抗体で標識された抗体に結合する、複数の蛍光スポットを有する標識されたトランスフェクト細胞の例示的な画像である。
【図9】図９は、示されたハイブリドーマクローン（又は無関係なクローン）の単一細胞の一連の画像であり、緑色チャネル（上）のＲＦＵは抗体分泌を表し、又は赤色チャネル（下）のＲＦＵは抗原（ＥＧＦＲ）結合を表す。
【図13】図１３は、ヒト抗原結合を示す赤色チャネル（左）、カニクイザル抗原結合を示す緑色チャネル（中央）、及びヒト抗原及びカニクイザル抗原の結合を示す複合チャネル（右）上のＲＦＵを有する単一細胞の一連の画像である。採血１から得られた血清のデータ。
【図14】図１４は、ヒト抗原のみ、カニクイザル抗原のみ、又はヒト抗原及びカニクイザル抗原の両方に反応する第１群（黒丸）及び第２群（白丸）のマウスの抗原陽性ＡＳＣのパーセントのグラフである。単一細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅスクリーニングによって得られた採血１からの細胞のデータ。
【図15】図１５は、ヒト抗原のみ、カニクイザル抗原のみ、又はヒト抗原及びカニクイザル抗原の両方に反応する第１群（黒丸）及び第２群（白丸）の抗原陽性ＡＳＣのパーセントのグラフである。単一細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅスクリーニングによって得られた採血２からの細胞のデータ。
【図16】図１６は、ヒト抗原のみ、カニクイザル抗原のみ、又はヒト抗原及びカニクイザル抗原の両方に反応する第１Ａ群（ヒトブースト）及び第１Ｂ群（カニクイザルブースト）の抗原陽性ＡＳＣのパーセントのグラフである。採血２からの細胞のデータを黒丸で示し、採血３からの細胞のデータを白丸で示す。単一細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅスクリーニングによって得られたデータ。
【図17】図１７は、第１Ａ群（ヒトブースト）及び第１Ｂ群（カニクイザルブースト）の（採血１に対する）交差反応性ＡＳＣ頻度の変化のグラフである。単一細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅスクリーニングによって得られたデータ。
【図18】図１８は、ヒト抗原に対する反応性の血清力価の関数としてプロットされたカニクイザル抗原に対する反応性の血清力価のグラフである。交差反応性ＡＳＣのパーセントを記す。採取のために選択する目的動物を赤色で囲む。
【図19】図１９は、マルチドメインタンパク質（抗原）のヒトサブドメインオルソログ及びカニクイザルサブドメインオルソログの両方に結合するヒト／カニクイザル交差反応性抗体の産生に向けた免疫ステアリングを伴う免疫化キャンペーンの概略図である。
【図21】図２１は、ヒトのみの結合剤、カニクイザルのみの結合剤、及びヒト／カニクイザル交差反応性結合剤について、ｔ＝０時間（下）及びｔ＝２３時間（上）での緑色及び赤色のチャネル上のＲＦＵでの単一細胞の一連の画像である。単一細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅスクリーニングを用いて採血１から得られた血清のデータ。
【図22】図２２は、ヒト抗原のみ、カニクイザル抗原のみ、又はヒト抗原及びカニクイザル抗原の両方に反応する抗原陽性ＡＳＣのパーセントのグラフである。採血１からの細胞のデータを示す。単一細胞Ｉｎｃｕｃｙｔｅスクリーニングによって得られたデータ。
【発明を実施するための形態】
【0018】
Ｂ細胞機能並びに抗体産生の非終端モニタリング及びステアリング
二次リンパ器官（例えば、脾臓及びリンパ節）の胚中心（ＧＣ）において抗原に最近遭遇した抗原特異的Ｂ細胞は、刺激されて分裂し、複数の経路で分化するようになる。例えば、Ｋｌｅｉｎ ａｎｄ Ｄａｌｌａ－Ｆａｖｅｒａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：２２－３３（２００８）を参照されたい。抗原のチャレンジに応答して血清中に抗体を分泌する主なＢ細胞系統はプラズマ細胞である。プラズマ細胞の分化は二次リンパ器官で始まり、そこでＧＣ内の細胞－細胞相互作用が、抗原に特異的な抗体を表面に発現するＢ細胞を、形質芽球として知られる未成熟プラズマ細胞に分化させる。形質芽球は、可溶性抗体を産生し分泌する急速に分裂するＢ細胞である。しかしながら、形質芽球は本質的に一過性であり、生存し、増殖し続けるために、かなりの栄養サポートを必要とする。形質芽球の主な生存ニッチは二次リンパ器官であるが、これらのキューは暫定的であり、同族抗原の存在に依存する。
二次リンパ器官（例えば、脾臓及びリンパ節）の胚中心（ＧＣ）において抗原に最近遭遇した抗原特異的Ｂ細胞は、刺激されて分裂し、複数の経路で分化するようになる。例えば、Ｋｌｅｉｎ ａｎｄ Ｄａｌｌａ－Ｆａｖｅｒａ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：２２－３３（２００８）を参照されたい。抗原のチャレンジに応答して血清中に抗体を分泌する主なＢ細胞系統はプラズマ細胞である。プラズマ細胞の分化は二次リンパ器官で始まり、そこでＧＣ内の細胞－細胞相互作用が、抗原に特異的な抗体を表面に発現するＢ細胞を、形質芽球として知られる未成熟プラズマ細胞に分化させる。形質芽球は、可溶性抗体を産生し分泌する急速に分裂するＢ細胞である。しかしながら、形質芽球は本質的に一過性であり、生存し、増殖し続けるために、かなりの栄養サポートを必要とする。形質芽球の主な生存ニッチは二次リンパ器官であるが、これらのキューは暫定的であり、同族抗原の存在に依存する。
【0019】
Ｂ細胞は、抗原に対する長期の体液性記憶を維持するために次の２つの主要な戦略を使用する：ＩｇＧ＋記憶Ｂ細胞の形成及び長寿命の成熟プラズマ細胞の形成。記憶Ｂ細胞は、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）として知られる、それらの同族抗体の細胞表面結合型を発現するが、可溶性抗体を分泌しない。これらの細胞は体内の様々な場所に存在し、二次リンパ器官内に豊富に存在する。抗原と再遭遇すると、記憶Ｂ細胞は増殖し（すなわち、それら自身のクローンを生成し）、抗体分泌プラズマ細胞に分化するように誘導され得る。長期記憶への他の経路は、長寿命の成熟プラズマ細胞の形成を介する。成熟プラズマ細胞は、栄養サポートを提供し、炎症組織内、腸管に関連する特殊構造（腸管関連リンパ組織－ＧＡＬＴ）内、及び骨髄内に見出すことができる非常に特殊な生存ニッチを必要とする。例えば、Ｆａｉｒｆａｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２０（１）：４９－５８（２００８）を参照されたい。ニッチ間質細胞によって作り出される局所環境は、最終分化プラズマ細胞の寿命を維持するために必要なシグナルを提供する。
【0020】
Ｂ細胞が長期的に間質ニッチに定住するには、血液によってこれらの目的地に移動しなければならない。実際、ＧＣにおける抗原への曝露、形質芽球への分化、及び続く二次リンパ器官内の増殖の後、遊走形質芽球の波が循環血液中に検出され得る。マウスにおいて、血液中の形質芽球のこのうねりは抗原曝露の３～７日後に起こり、適切なニッチに定住し、長命のプラズマ細胞に分化するにつれて、時間とともに減少する。
【0021】
最近の抗原により刺激された形質芽細胞及びプラズマ細胞（抗体分泌細胞、（ＡＳＣ））を、それらが血液中を移動する際に捕捉し、目的の抗体、例えば、選択抗体を産生するそれらの細胞を特定することを含む方法が、本明細書において提供される。本開示の方法は血液試料を利用するものであり、血液の細胞環境は、特にＢ細胞系統の観点から、二次リンパ器官のものよりも実質的に複雑ではないので、本開示の方法は、有利にはより複雑ではない。本開示の方法は、このＡＳＣ集団へのアクセスの困難性に対処するものであり、これは、それらの全体的な存在量が相対的に低いために歴史的に困難なものであった。
【0022】
したがって、本開示は、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターする方法を提供する。例示的な実施形態において、方法は、（ａ）非ヒト動物を免疫原で免疫化することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする（任意選択により、個々にアッセイする）こととを含む。本開示はまた、選択抗体の生成のために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）免疫原で非ヒト動物に初回免疫化キャンペーンを実施することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣをアッセイする（任意選択により。個々にアッセイする）ことと、（ｄ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合にステップのサイクルを実施すること（ここで、サイクルは（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとを含む）とを含む。例示的な態様では、閾値は、約１％～約１０％、例えば、約１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約６％、約７％、約８％、約９％、又は約１０％である。例示的な態様では、閾値は、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、又は５０％である。別の態様では、閾値は、５０％超、例えば５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又はそれ以上である。
【0023】
このような方法の例示的な態様では、非ヒト動物は、安楽死も１つ以上の二次リンパ器官の除去も受けないか、又は目的の抗体、例えば選択抗体を産生する十分な数のＡＳＣを有すると動物がみなされた後にのみ、二次リンパ器官のために安楽死され、採取される。例示的な態様では、方法は、一連の非ヒト動物を用いて実施される。様々な例において、アッセイの結果は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満であり、且つ／又はさらなる免疫化を必要とする一連の非ヒト動物の特定である。このような非ヒト動物は、その後、例えば、選択抗体の産生を増加させるために、ステップのサイクル（（ｄ）、上記）に供され得る。
【0024】
別の例では、アッセイの結果は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である一連の非ヒト動物の特定である。このような非ヒト動物は、その後、殺され、このような非ヒト動物から組織が採取され得る。別の態様では、アッセイされたＡＳＣの総数に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、方法は、非ヒト動物を殺し、非ヒト動物から組織を採取することを含む。
【0025】
したがって、選択抗体の産生をモニターし、誘導又はステアリングする本開示の方法は、不必要に殺される動物（例えば、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満の動物）の数が少なく、最終的に選択抗体を産生する免疫化動物の割合がより高くなるので、非常に効率的である。また、様々な例において、そのような本開示の方法はハイブリドーマを作製することを含まず、したがって、有利には消費する時間及び材料がより少なくてすむ。
【0026】
免疫化
本開示の様々な態様において、方法は、非ヒト動物を免疫原で免疫化することを含む。本明細書で使用される場合、「免疫化」という用語は、前記免疫原に対する免疫応答を開始させるために「免疫化キャンペーン」又は「免疫化プロトコル」又は「キャンペーン」を実施乃至実行することを指す。例示的な態様では、免疫応答は、前記免疫原に対するＢ細胞免疫応答及び／又は体液性免疫応答を含む。例示的な態様では、非ヒト動物において開始される免疫応答には、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）、例えば、抗体分泌プラズマ細胞、形質芽球、プラズマ細胞（例えば、高レベルの可溶性抗体を産生し分泌する急速に分裂するＢ細胞）の産生が含まれる。様々な例において、免疫応答には、血液中を移動し二次リンパ器官に至る移動性ＡＳＣ（例えば、プラズマ細胞、形質芽球）が含まれる。様々な態様において、二次リンパ器官は、（例えば、膝窩、鼠径、腸間膜、及び上腕の）リンパ節、脾臓、パイアー斑、又は粘膜組織である。例示的な例において、ＡＳＣは、抗原曝露の約１～７日後に産生される。場合により、ＡＳＣ、例えば、遊走形質芽球は抗原曝露の約３日～約７日（例えば、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日）後に血液中に見出される。いくつかの例では、ＡＳＣ、例えば、遊走形質芽球は、抗原曝露の約８日後、約９日後、又は約１０日後に血液中に見出される。
本開示の様々な態様において、方法は、非ヒト動物を免疫原で免疫化することを含む。本明細書で使用される場合、「免疫化」という用語は、前記免疫原に対する免疫応答を開始させるために「免疫化キャンペーン」又は「免疫化プロトコル」又は「キャンペーン」を実施乃至実行することを指す。例示的な態様では、免疫応答は、前記免疫原に対するＢ細胞免疫応答及び／又は体液性免疫応答を含む。例示的な態様では、非ヒト動物において開始される免疫応答には、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）、例えば、抗体分泌プラズマ細胞、形質芽球、プラズマ細胞（例えば、高レベルの可溶性抗体を産生し分泌する急速に分裂するＢ細胞）の産生が含まれる。様々な例において、免疫応答には、血液中を移動し二次リンパ器官に至る移動性ＡＳＣ（例えば、プラズマ細胞、形質芽球）が含まれる。様々な態様において、二次リンパ器官は、（例えば、膝窩、鼠径、腸間膜、及び上腕の）リンパ節、脾臓、パイアー斑、又は粘膜組織である。例示的な例において、ＡＳＣは、抗原曝露の約１～７日後に産生される。場合により、ＡＳＣ、例えば、遊走形質芽球は抗原曝露の約３日～約７日（例えば、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日）後に血液中に見出される。いくつかの例では、ＡＳＣ、例えば、遊走形質芽球は、抗原曝露の約８日後、約９日後、又は約１０日後に血液中に見出される。
【0027】
非ヒト動物の免疫化に好適な技術は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，３ｒｄ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９６を参照されたい。例えば、Ｂａｒｒｙ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．１６（４）：６１６－８，６２０（１９９４）；Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１２；３５６（６３６５）：１５２－４（１９９２）；Ｂｅｒｇｍａｎｎ－Ｌｅｉｔｎｅｒ ａｎｄ Ｌｅｉｔｎｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３２５：２８９－３０２（２０１５）；Ａｒａｖｉｎｄａｒａｍ ａｎｄ Ｙａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ５４２：１６７－１７８（２００９）；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ ａｎｄ Ｔａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ４３ ＰｔＡ：３５３－３６５（１９９４）；及びＤｉｌｅｏ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １４（１）：７９－８７（２００３）に記載される遺伝子銃法もまた、非ヒト動物の免疫化に使用し得る。さらに、本明細書に例示されるように、免疫化は、非ヒト動物に抗原を発現する細胞を投与すること、又は抗原負荷樹状細胞、腫瘍細胞ワクチン、若しくは免疫細胞ベースのワクチンを投与することを含み得る。例えば、Ｓａｂａｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２７（１）：７４－９５（２０１７）、Ｂｏｔ ｅｔ ａｌ．，“Ｃａｎｃｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅｓ”ｉｎ Ｐｌｏｔｋｉｎ’ｓ Ｖａｃｃｉｎｅｓ，７ｔｈ ｅｄ．，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｐｌｏｔｋｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．，２０１８、及びＬｅｅ ａｎｄ Ｄｙ，“Ｔｈｅ Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｓｔａｔｕｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｔｈｏｒａｉｃ Ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”ｉｎ Ｉｍｍｕｎｅ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ，Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｉｔｏ ａｎｄ Ｅｒｎｓｔｏｆｆ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｉｎｃ．，２０１９を参照されたい。様々な例において、免疫化は、マイクロニードル送達（例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ Ｖａｃｃｉｎｅ Ｉｍｍｕｎｏｌ １７（９）：１３８１－１３８９（２０１０）を参照されたい）、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）（例えば、Ｔｅｍｃｈｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ ６（８）：３３３４－３３４７（２０１４）を参照されたい）、又は当該技術分野で知られる任意の手段によって実施され得る。例えば、Ｓｈａｋｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３３（３３）：４０６０－４０６４（２０１５）及びＣａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ ３１（９）：１３５３－１３５６（２０１３）を参照されたい。例えば、抗原へのＴ細胞エピトープの付加を含む、免疫化及び免疫原調製のためのさらなる戦略は、Ｃｈｅｎ ａｎｄ Ｍｕｒａｗｓｋｙ，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：４６０（２０１８）に記載されている。
【0028】
様々な態様において、方法は、非ヒト動物を免疫原で免疫することを含み、前記免疫原は非ヒト動物に１回以上（例えば、２回、３回、４回、５回、又はそれ以上）投与される。様々な態様において、免疫原は、注射、例えば、腹腔内、皮下、筋肉内、皮内、又は静脈内注射によって投与される。様々な態様において、方法は、免疫原の一連の注射を投与することによって非ヒト動物を免疫することを含む。例示的な態様において、各投与、例えば、注射は、約１０日～約１８日間隔で、任意選択により、約１２日～約１６日間隔で、又は約１４日間隔で、非ヒト動物に対し実施される。例示的な態様において、各投与、例えば、注射は、約１０日～約１８日間隔よりも頻繁に非ヒト動物に実施される。例えば、例示的な態様において、免疫原の非ヒト動物への投与間隔は、約１日～約９日間隔、任意選択により、約１日～約８日間隔、約１日～約７日間隔、約１日～約６日間隔、約１日～約５日間隔、約１日～約４日間隔、約１日～約３日間隔、約１日～約２日間隔、約２日～約９日間隔、約３日～約９日間隔、約４日～約９日間隔、約５日～約９日間隔、約６日～約９日間隔、約７日～約９日間隔、約８日～約９日間隔、約４日～約８日間隔、約５日～約８日間隔、又は約６日～約８日間隔である。非ヒト動物への免疫原の投与間隔は、様々な態様において、さらに長くてもよい。例えば、非ヒト動物への免疫原の投与間隔は、約１週～約２０週以上、例えば、約１か月～約２０か月であり得る。任意選択により、免疫原の非ヒト動物への投与間隔は、約１週～約１９週、約１週～約１８週、約１週～約１７週、約１週～約１６週、約１週～約１５週、約１週～約１４週、約１週～約１３週、約１週～約１２週、約１週～約１１週、約１週～約１０週、約１週～約９週、約１週～約８週、約１週～約７週、約１週～約６週、約１週～約５週、約１週～約４週、約１週～約３週、約１週～約２週、約２週～約２０週、約３週～約２０週、約４週～約２０週、約５週～約２０週、約６週～約２０週、約７週～約２０週、約８週～約２０週、約９週～約２０週、約１０週～約２０週、約１１週～約２０週、約１２週～約２０週、約１３週～約２０週、約１４週～約２０週、約１５週～約２０週、約１６週～約２０週、約１７週～約２０週、約１８週～約２０週、又は約１９週～約２０週である。様々な態様において、免疫原の投与間隔は、８日又は９日より長くてもよい。任意選択により、免疫原の投与間隔は、約１か月～約８か月、約１か月～約７か月、約１か月～約６か月、約１か月～約５か月、約１か月～約４か月、約１か月～約３か月、約１か月～約２か月、約２か月～約９か月、約３か月～約９か月、約４か月～約９か月、約５か月～約９か月、約６か月～約９か月、約７か月～約９か月、約８か月～約９か月、約４か月～約８か月、約５か月～約８か月、又は約６か月～約８か月である。
【0029】
様々な例において、免疫化の間、免疫原の各投与（例えば、注射）は、同じ（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｄ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｅ）これらの組み合わせで行われる。或いは、免疫化の間、免疫原の各投与（例えば、注射）は、異なる（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｄ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｅ）これらの組み合わせで行われる。任意選択により、免疫原の量は、その後の投与、例えば注射によって減少又は増加される。いくつかの態様では、１回おきの投与、例えば注射は、１回目及び３回目の注射と比較して、減少又は増加された量の免疫原を含む。例示的な免疫化は、本明細書に提供される実施例に記載される。
【0030】
非ヒト動物
有利には、本開示の方法は、任意の特定の非ヒト動物に限定されない。例示的な態様における非ヒト動物は、任意の非ヒト哺乳動物である。例示的な実施形態では、非ヒト動物は、限定されるものではないが、マウス、ラット、モルモット、スナネズミ及びハムスターなどのげっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の哺乳動物、及びウサギなどの兎形目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳動物、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）の哺乳動物、ウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物、又はウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物を含む哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄｓ）若しくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル）の哺乳動物、又は類人猿目（類人猿）の哺乳動物である。様々な態様において、非ヒト動物は、ヤギ、ラマ、アルパカ、ニワトリ、アヒル、魚（例えば、サケ）、ヒツジ、又はラムである。
有利には、本開示の方法は、任意の特定の非ヒト動物に限定されない。例示的な態様における非ヒト動物は、任意の非ヒト哺乳動物である。例示的な実施形態では、非ヒト動物は、限定されるものではないが、マウス、ラット、モルモット、スナネズミ及びハムスターなどのげっ歯目（Ｒｏｄｅｎｔｉａ）の哺乳動物、及びウサギなどの兎形目（Ｌｏｇｏｍｏｒｐｈａ）の哺乳動物、ネコ科（ネコ）及びイヌ科（イヌ）を含む食肉目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）の哺乳動物、ウシ科（ウシ）及びイノシシ科（ブタ）を含む偶蹄目（Ａｒｔｉｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物、又はウマ科（ウマ）を含む奇蹄目（Ｐｅｒｓｓｏｄａｃｔｙｌａ）の哺乳動物を含む哺乳動物である。いくつかの態様では、哺乳動物は、霊長目（Ｐｒｉｍａｔｅｓ）、セボイド目（Ｃｅｂｏｉｄｓ）若しくはシモイド目（Ｓｉｍｏｉｄｓ）（サル）の哺乳動物、又は類人猿目（類人猿）の哺乳動物である。様々な態様において、非ヒト動物は、ヤギ、ラマ、アルパカ、ニワトリ、アヒル、魚（例えば、サケ）、ヒツジ、又はラムである。
【0031】
例示的な例において、本開示の方法において使用される非ヒト動物は、キメラ又は完全ヒト抗体を産生するように、改変、例えば、遺伝子改変されている。このような非ヒト動物は、トランスジェニック動物と称される。トランスジェニック動物におけるヒト抗体の産生は、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｈｅｒ Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）６３（２）：１０１－１０８（２０１５）に記載されている。本発明においては、以下に限定はされないが、トランスジェニックニワトリ（例えば、ＯｍｎｉＣｈｉｃｋｅｎ（登録商標））、トランスジェニックラット（例えば、ＯｍｎｉＲａｔ（登録商標））、トランスジェニックラマ、及びトランスジェニックウシ（例えば、Ｔｃ Ｂｏｖｉｎｅ（商標））を含む任意のトランスジェニック動物を使用することができる。特定の実施形態では、非ヒト動物は、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）、Ａｌｌｏｙ ｍｏｕｓｅ、Ｔｒｉａｎｎｉ ｍｏｕｓｅ、ＯｍｎｉＭｏｕｓｅ（登録商標）、及びＨｕＭＡｂ－Ｍｏｕｓｅ（登録商標）などのトランスジェニックマウスである。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、完全ヒト抗体を産生するトランスジェニックマウスの種である。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）の概要は、Ｆｏｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ ２７０（１）：５１－６４（２０１６）及び米国特許第５，９３９，５９８号明細書によって提供されている。例示的な態様では、非ヒト動物は、トランスジェニックラットである。様々な態様におけるトランスジェニックラットは、Ｕｎｉｒａｔ（登録商標）又はＯｍｎｉＦｌｉｃ（登録商標）であり、これらはそれぞれＣｌａｒｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：３０３７（２０１９）；ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０３０３７及びＨａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ９：８８９（２０１８）：ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．００８８９に記載されている。
【0032】
例示的な例において、本開示の方法は、非ヒト動物に関して非終端である。本明細書で使用される場合、非ヒト動物の文脈における「非終端」という用語は、方法が実施されている間、非ヒト動物の生命が終結しない（例えば、安楽死させられることも、他の方法で殺されることも、死に至らされることもない）ことを意味する。例示的な態様では、非ヒト動物は、１つ以上の二次リンパ器官の除去にも安楽死にも供されることはないが、本発明ではそのような器官（例えば、脾臓）を生検するなどの処置は可能である。
【0033】
免疫原
有利には、本開示の方法は、任意の特定の免疫原に限定されない。様々な態様における免疫原は、任意の抗原、任意選択により、タンパク質、又はその断片、融合体、若しくはバリアントであり得る。様々な例において、免疫原は、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、腫瘍関連抗原、チェックポイント阻害剤分子、細胞表面受容体、又はそのリガンドである。例示的な免疫原を単に説明することを目的として、非ヒト動物の免疫化に使用される免疫原は、以下の抗体のいずれか１つが結合する標的又は抗原であり得る：ムロモナブ－ＣＤ３（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ Ｏｋｔ３（登録商標）で市販の製品）、アブシキシマブ（商品名Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）で市販の製品）、リツキシマブ（商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）で市販の製品）、バシリキシマブ（商品名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）で市販の製品）、ダクリズマブ（商品名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）で市販の製品）、パリビズマブ（商品名Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で市販の製品）、インフリキシマブ（商品名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で市販の製品）、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、アレムツズマブ（商品名ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標）で市販の製品）、アダリムマブ（商品名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシツモマブ－Ｉ１３１（商品名Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）で市販の製品）、エファリズマブ（商品名Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）で市販の製品）、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）で市販の製品）、イブリツモマブチウキセタン（商品名Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）で市販の製品）、オマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販の製品）、ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、ナタリズマブ（商品名Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）で市販の製品）、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販の製品）、パニツムマブ（商品名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）で市販の製品）、エクリズマブ（商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、セルトリズマブペゴル（商品名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）で市販の製品）、ゴリムマブ（商品名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）で市販の製品）、カナキヌマブ（商品名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、カツマキソマブ（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）で市販の製品）、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシリズマブ（商品名ＲｏＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）で市販の製品）、オファツムマブ（商品名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）で市販の製品）、デノスマブ（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）で市販の製品）、ベリムマブ（商品名Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）で市販の製品）、ラキシバクマブ、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）で市販の製品）、及びペルツズマブ（商品名Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）で市販の製品）。例示的な実施形態では、抗体は、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴルなどの抗ＴＮＦアルファ抗体；カナキヌマブなどの抗ＩＬ１β抗体；ウステキヌマブ及びブリアキヌマブなどの抗ＩＬ１２／２３（ｐ４０）抗体；並びにダクリズマブなどの抗ＩＬ２Ｒ抗体のうちの１つである。
有利には、本開示の方法は、任意の特定の免疫原に限定されない。様々な態様における免疫原は、任意の抗原、任意選択により、タンパク質、又はその断片、融合体、若しくはバリアントであり得る。様々な例において、免疫原は、サイトカイン、リンホカイン、ホルモン、成長因子、細胞外マトリックスタンパク質、腫瘍関連抗原、チェックポイント阻害剤分子、細胞表面受容体、又はそのリガンドである。例示的な免疫原を単に説明することを目的として、非ヒト動物の免疫化に使用される免疫原は、以下の抗体のいずれか１つが結合する標的又は抗原であり得る：ムロモナブ－ＣＤ３（商品名Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ Ｏｋｔ３（登録商標）で市販の製品）、アブシキシマブ（商品名Ｒｅｏｐｒｏ（登録商標）で市販の製品）、リツキシマブ（商品名ＭａｂＴｈｅｒａ（登録商標）、Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）で市販の製品）、バシリキシマブ（商品名Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（登録商標）で市販の製品）、ダクリズマブ（商品名Ｚｅｎａｐａｘ（登録商標）で市販の製品）、パリビズマブ（商品名Ｓｙｎａｇｉｓ（登録商標）で市販の製品）、インフリキシマブ（商品名Ｒｅｍｉｃａｄｅ（登録商標）で市販の製品）、トラスツズマブ（商品名Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、アレムツズマブ（商品名ＭａｂＣａｍｐａｔｈ（登録商標）、Ｃａｍｐａｔｈ－１Ｈ（登録商標）で市販の製品）、アダリムマブ（商品名Ｈｕｍｉｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシツモマブ－Ｉ１３１（商品名Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）で市販の製品）、エファリズマブ（商品名Ｒａｐｔｉｖａ（登録商標）で市販の製品）、セツキシマブ（商品名Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）で市販の製品）、イブリツモマブチウキセタン（商品名Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標）で市販の製品）、オマリズマブ（商品名Ｘｏｌａｉｒ（登録商標）で市販の製品）、ベバシズマブ（商品名Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）で市販の製品）、ナタリズマブ（商品名Ｔｙｓａｂｒｉ（登録商標）で市販の製品）、ラニビズマブ（商品名Ｌｕｃｅｎｔｉｓ（登録商標）で市販の製品）、パニツムマブ（商品名Ｖｅｃｔｉｂｉｘ（登録商標）で市販の製品）、エクリズマブ（商品名Ｓｏｌｉｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、セルトリズマブペゴル（商品名Ｃｉｍｚｉａ（登録商標）で市販の製品）、ゴリムマブ（商品名Ｓｉｍｐｏｎｉ（登録商標）で市販の製品）、カナキヌマブ（商品名Ｉｌａｒｉｓ（登録商標）で市販の製品）、カツマキソマブ（商品名Ｒｅｍｏｖａｂ（登録商標）で市販の製品）、ウステキヌマブ（商品名Ｓｔｅｌａｒａ（登録商標）で市販の製品）、トシリズマブ（商品名ＲｏＡｃｔｅｍｒａ（登録商標）、Ａｃｔｅｍｒａ（登録商標）で市販の製品）、オファツムマブ（商品名Ａｒｚｅｒｒａ（登録商標）で市販の製品）、デノスマブ（商品名Ｐｒｏｌｉａ（登録商標）で市販の製品）、ベリムマブ（商品名Ｂｅｎｌｙｓｔａ（登録商標）で市販の製品）、ラキシバクマブ、イピリムマブ（商品名Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）で市販の製品）、及びペルツズマブ（商品名Ｐｅｒｊｅｔａ（登録商標）で市販の製品）。例示的な実施形態では、抗体は、アダリムマブ、インフリキシマブ、エタネルセプト、ゴリムマブ、及びセルトリズマブペゴルなどの抗ＴＮＦアルファ抗体；カナキヌマブなどの抗ＩＬ１β抗体；ウステキヌマブ及びブリアキヌマブなどの抗ＩＬ１２／２３（ｐ４０）抗体；並びにダクリズマブなどの抗ＩＬ２Ｒ抗体のうちの１つである。
【0034】
免疫化ステップで使用するための免疫原を調製する方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｆｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，Ｃｈａｐｔｅｒ １１，Ｕｎｉｔ １１．４，（２００１）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｏｓｓｉｐｏｗ ｅｔ ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ ２０１４を参照されたい。様々な例において、免疫原は、非ヒト動物への投与の前に、アジュバント又は他の溶液と混合される。当該技術分野では多くのアジュバントが知られており、例示的な例では、油、ミョウバン、アルミニウム塩、又はリポ多糖を含む。様々な態様では、アジュバントは無機物である。別の態様では、アジュバントは有機物である。様々な態様では、アジュバントは以下を含む：ミョウバン、アルミニウム塩（例えば、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム）、完全フロイントアジュバント、不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩアジュバント系（ＲＡＳ）、リピドＡ、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｃｌａｓｓｉｃ、ＴｉｔｅｒＭａｘ（登録商標）Ｇｏｌｄ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅワクチンアジュバント（例えば、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ １０３、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ７２０、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ不完全Ｓｅｐｐｉｃアジュバント、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ ＩＳＡ５１）、ＡＦ０３アジュバント、ＡＳ０３アジュバント、Ｓｐｅｃｏｌ、ＳＰＴ、ナノエマルション、ＶＳＡ３、油又は脂質ベース溶液（例えば、スクアレン、ＭＦ５９（登録商標）、ＱＳ２１、サポニン、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ））、ジコリノ酸ミコール酸トレハロース（ＴＤＭ）、ｓＴＤＭアジュバント、ビロソーム、及びＰＲＲリガンド。例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｒｅｖｉｅｗ－ｖａｃｃｉｎｅ－ａｄｊｕｖａｎｔｓの“Ｖａｃｃｉｎｅ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ Ｒｅｖｉｅｗ”、及びｈｔｔｐｓ：／／ｉｎｆｏ．ｇｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ／ｂｌｏｇ／ｒｏｌｅ－ｏｆ－ａｄｊｕｖａｎｔｓ－ｉｎ－ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎに２０１６年６月２日に投稿された“Ｒｏｌｅ ｏｆ Ａｄｊｕｖａｎｔｓ ｉｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ”，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍａｎ’ｓ Ｂｌｏｇ：Ａ Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈを参照されたい。様々な例において、アジュバントは、リゾレシチン、ｐｌｕｒｏｎｉｃポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニン、及びジニトロフェノールなどの界面活性物質を含む。ＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）。
【0035】
血液試料及びその画分
非ヒト動物の免疫化の後、前記免疫化された非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得る。ＡＳＣは体液性免疫応答の最終分化細胞であり、ＡＳＣはリンパ節中の活性化Ｂ細胞から分化し、血液中を一時的に循環する。例示的な態様では、血液試料は非ヒト動物から非終端方法で得られ、例えば、非ヒト動物は血液試料採取中に殺されることはない。例示的な例では、本方法は、非ヒト動物からの非終端採血を実施することを含む。例示的な態様では、血液試料は、非ヒト動物が免疫化されてから約１日～約２日後に非ヒト動物から得られる。様々な例において、血液試料は、免疫化の約３日～約７日（例えば、３、４、５、６、又は７日）後に非ヒト動物から得られる。免疫化の間に免疫原を２回以上投与される場合、血液試料は、いくつかの態様では、免疫原の最後の投与から約３日～約７日後に動物から得られる。様々な態様では、血液試料は、非ヒト動物を免疫化した約８～約１２日後に非ヒト動物から得られるが、いくつかの態様では、前記血液試料中に存在するＡＳＣはより少ないと予想される。
非ヒト動物の免疫化の後、前記免疫化された非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得る。ＡＳＣは体液性免疫応答の最終分化細胞であり、ＡＳＣはリンパ節中の活性化Ｂ細胞から分化し、血液中を一時的に循環する。例示的な態様では、血液試料は非ヒト動物から非終端方法で得られ、例えば、非ヒト動物は血液試料採取中に殺されることはない。例示的な例では、本方法は、非ヒト動物からの非終端採血を実施することを含む。例示的な態様では、血液試料は、非ヒト動物が免疫化されてから約１日～約２日後に非ヒト動物から得られる。様々な例において、血液試料は、免疫化の約３日～約７日（例えば、３、４、５、６、又は７日）後に非ヒト動物から得られる。免疫化の間に免疫原を２回以上投与される場合、血液試料は、いくつかの態様では、免疫原の最後の投与から約３日～約７日後に動物から得られる。様々な態様では、血液試料は、非ヒト動物を免疫化した約８～約１２日後に非ヒト動物から得られるが、いくつかの態様では、前記血液試料中に存在するＡＳＣはより少ないと予想される。
【0036】
例示的な態様では、血液試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。任意選択により、血液試料は、Ｂ細胞としても知られるＢリンパ球を含む。様々な例において、血液試料は、プラズマ系統、プラズマ細胞及び／又は形質芽球、例えば、遊走形質芽球のＡＳＣを含む。様々な態様において、ＡＳＣはＣＤ１３８＋Ｂ細胞である。任意選択により、ＡＳＣは、遊走形質芽球を含む。
【0037】
採取できる血液試料の量は、非ヒト動物に依る。様々な例では、非ヒト動物から得られる血液試料は、１Ｌ、５００ｍＬ又は１００ｍＬ未満であり、任意選択により、約５０ｍＬ未満、約２５ｍＬ未満、約１５ｍＬ若しくは１０ｍＬ未満、又は約５ｍＬ未満（例えば、約４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ若しくはそれ以下）である。いくつかの例では、非ヒト動物から得られる血液試料は、約１Ｌ、５００ｍＬ又は１００ｍＬであり、任意選択により、約５０ｍＬ未満、約２５ｍＬ未満、約１５ｍＬ若しくは１０ｍＬ未満、又は約５ｍＬ未満（例えば、約４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ若しくはそれ以下）である。いくつかの例では、５００μＬ以下の血液が、非ヒト動物から得られる。非ヒト動物がマウスである実施形態では、得られる血液試料は、２００μＬ未満、１９０μＬ未満、１８０μＬ未満、１７０μＬ未満、１６０μＬ未満、１５０μＬ未満、１４０μＬ未満、１３０μＬ未満、１２０μＬ未満、１１０μＬ未満、１００μＬ未満、９０μＬ未満、８０μＬ未満、７０μＬ未満、６０μＬ未満、５０μＬ未満、４０μＬ未満、３０μＬ未満、２０μＬ未満、１０μＬ未満、５μＬ未満、４μＬ未満、３μＬ未満、２μＬ未満、又は１μＬ未満である。非ヒト動物がマウスである他の実施形態では、得られる血液試料は、約２００μＬ、１９０μＬ、１８０μＬ、１７０μＬ、１６０μＬ、１５０μＬ、１４０μＬ、１３０μＬ、１２０μＬ、１１０μＬ、１００μＬ、９０μＬ、８０μＬ、７０μＬ、６０μＬ、５０μＬ、４０μＬ、３０μＬ、２０μＬ、１０μＬ、５μＬ、４μＬ、３μＬ、２μＬ、又は１μＬである。例示的な例において、非ヒト動物から得られる血液試料は、約５００μＬ以下である。任意選択により、血液試料の容量は、約１００μＬ～約２５０μＬである。様々な例において、血液試料の容量は、その動物において循環する血液の総量の１０％以下である。様々な態様において、血液試料の容量は、その動物において循環する血液量の１０％を超えない。例示的な態様において、動物の血液の総容量の約１０％以下が採取される。様々な例において、血液試料の容量は、動物内に循環する血液容量の約９％以下、約８％以下、約７％以下、約６％以下、又は約５％以下である。様々な例において、血液試料は、動物の体重の１０％以下である。様々な態様において、血液試料は、動物の体重の９％以下、８％以下、又は７％以下である。
【0038】
例示的な態様では、血液試料を非ヒト動物から得た後、血液試料を処理、例えば濃縮又は分画する。様々な例において、本方法は、例えば、血液検体から赤血球、血漿及び／又は血小板を枯渇させることによって、ＡＳＣについて血液検体を濃縮することを含む。特定の態様では、本方法は、抗ＩｇＭ抗体を用いて、細胞表面ＩｇＭを含むＢ細胞を除去する枯渇ステップを含む。例示的な例において、本方法は、目的の特異的Ｂ細胞集団を特定する１つ以上の細胞表面マーカーを発現する細胞を実行する選択ステップを含む。いくつかの態様では、細胞表面マーカーは、ＣＤ１３８、ＣＤ１９、Ｂ２２０、ＩｇＧ、ＴＡＣＩ、ＳＬＡＭ７、ＢＣＭＡ、ＣＤ９８、ＳＣＡ－１、Ｌｙ６Ｃ１／２などである。ＰＢＭＣ由来Ｂ細胞が所望される場合、本方法は、ＣＤ１３８陽性細胞を選択することを含む。例示的な態様では、本方法は、アッセイの前に、非ヒト動物から得られた血液試料の１つ以上の成分を除去することを含む。任意選択により、赤血球、血漿、及び／又は血小板が、血液試料から除去される。いくつかの態様では、血液試料の画分が、ＣＤ１３８＋細胞を選択することによって調製される。
【0039】
単一細胞アッセイ
本開示の方法の様々な態様では、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを、選択抗体の産生について個々にアッセイする。様々な例において、アッセイは、１つ以上の個々の細胞を分析する単一細胞アッセイを含む。様々な例において、アッセイは、１つ以上の生細胞を分析する生細胞アッセイを含む。例示的な態様において、免疫化した非ヒト動物から得られた血液試料中に存在する複数の細胞、例えばＡＳＣを、同時にアッセイする。例示的な態様において、約１０超、約１００超、約５００超、約１０００超、約２０００超、約３０００超、約４０００超、約５０００超、約６０００超、約７０００超、約８０００超、約９０００超、又は約１０，０００超のＡＳＣを、単一細胞生細胞アッセイによって同時にアッセイする。
本開示の方法の様々な態様では、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを、選択抗体の産生について個々にアッセイする。様々な例において、アッセイは、１つ以上の個々の細胞を分析する単一細胞アッセイを含む。様々な例において、アッセイは、１つ以上の生細胞を分析する生細胞アッセイを含む。例示的な態様において、免疫化した非ヒト動物から得られた血液試料中に存在する複数の細胞、例えばＡＳＣを、同時にアッセイする。例示的な態様において、約１０超、約１００超、約５００超、約１０００超、約２０００超、約３０００超、約４０００超、約５０００超、約６０００超、約７０００超、約８０００超、約９０００超、又は約１０，０００超のＡＳＣを、単一細胞生細胞アッセイによって同時にアッセイする。
【0040】
様々な例において、本方法は、血液試料又はその画分をマトリックスに適用し、マトリックスの固有のアドレスを各ＡＳＣに割り当てることを含む。マトリックスは２次元であってもよく（この場合、マトリックスの各一意のアドレスは水平（Ｘ）軸及び垂直（Ｙ）軸に沿った位置で定義される）、又はマトリックスは例えば多孔質のフォーム、ゲル若しくはポリマーを含む３次元マトリックスである（この場合、マトリックスの各一意のアドレスは幅（Ｘ）軸、高さ（Ｙ）軸、及び深さ（Ｚ）軸に沿った位置で定義される）。様々な態様では、アッセイの結果は、各ＡＳＣ産生選択抗体の特定であり、特定の態様では、結果は、各ＡＳＣ産生選択抗体の一意のアドレスの特定である。
【0041】
例示的な態様では、本開示の方法のアッセイは、（ａ）マトリックス内のＡＳＣを、選択抗体に結合し、選択抗体に結合すると検出可能なシグナル、例えば蛍光シグナルを生じる試薬と組み合わせることを含む。様々な態様において、本開示の方法のアッセイは、（ａ）マトリックス内のＡＳＣを、選択抗体のＦｃドメインに結合する少なくとも１つの試薬、及び選択抗体が結合する少なくとも１つの試薬（例えば、選択抗体の抗原結合ドメインに結合する試薬）と組み合わせることを含み、これらの試薬の少なくとも１つは、検出可能な標識に結合している。例示的な例において、ＡＳＣは、選択抗体のＦｃドメインに結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び選択抗体が結合する標的（例えば、選択抗体の抗原結合ドメインに結合する試薬）と組み合わされる。様々な例において、標的は細胞によって発現され、標的を発現する細胞がＡＳＣ及び検出試薬と組み合わされる。例示的な態様において、本方法は、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイすること、及び（ｃ）第１の検出可能な標識が検出されるマトリックス内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）をさらに含む。
【0042】
例示的な例において、本開示の方法のアッセイは、（ａ）マトリックス内のＡＳＣを、（ｉ）選択抗体に結合し、固体支持体を含む捕捉試薬、（ｉｉ）選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）選択抗体が結合する標識標的（ここで、標識標的は、第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を含む）と組み合わせることと、（ｂ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるマトリックス内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。任意選択により、捕捉剤は、固体支持体に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む。固体支持体は、抗Ｆｃドメイン抗体及び抗Ｆｃドメイン抗体が結合する抗体を固定する、ポリマービーズ、フィルム、スライド、ウェル底部などの任意の固体支持材料であってよい。検出剤は、例示的な例において、第１の検出可能な標識に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む。様々な態様において、捕捉剤の抗体Ｆｃドメインに結合する抗体は検出剤の同じ抗体であるが、捕捉試薬の抗Ｆｃ抗体は検出可能な標識に結合せず、検出試薬の抗体は固体支持体に結合しない。
【0043】
例示的な例において、組み合わせることはウェル中で行われ、捕捉剤はウェル中で単層を形成する。様々な態様において、本方法は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）を含む。
【0044】
例示的な例では、組み合わせは、マイクロ流体チャンバー若しくはナノ流体チャンバー、マイクロウェルデバイス若しくはナノウェルデバイス、マイクロ毛細管若しくはナノ毛細管、又はナノ流体チップのナノペン内で行われる。例示的な例では、組み合わせは、ナノ流体チップのナノペン内で行われる。例示的な例では、本方法は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるナノ流体チップ内の各ペンの位置を特定することを含む（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）。任意選択により、血液試料の単一ＡＳＣは、ｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰ）によってナノ流体チップのペン内に移動される。このような技術は、Ｗｉｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ＭＡｂｓ １１（６）：１０２５－１０３５（２０１６）に記載されている。
【0045】
二次リンパ器官（例えば、脾臓及びリンパ節）の胚中心（ＧＣ）において抗原に最近遭遇した抗原特異的Ｂ細胞は、刺激されて分裂し、複数の経路で分化するようになる。抗原のチャレンジに応答して血清中に抗体を分泌する主なＢ細胞系統はプラズマ細胞である。プラズマ細胞の分化は二次リンパ器官で始まり、そこでＧＣ内の細胞－細胞相互作用が、抗原に特異的な抗体を表面に発現するＢ細胞を、形質芽球として知られる未成熟プラズマ細胞に分化させる。形質芽球は、高レベルの可溶性抗体を産生し分泌する急速に分裂するＢ細胞である。ＧＣにおける抗原への曝露、形質芽球への分化、及び続く増殖の後、遊走形質芽球の波が循環血液中に検出され得る。マウスにおいて、血液中の形質芽球は抗原曝露の３～７日後に起こり、適切なニッチに定住し、長命のプラズマ細胞に分化するにつれて、時間とともに減少する。最近刺激された抗原特異的形質芽球の血液中の移動は、ポリクローナル血清力価による調査よりもむしろ、動物免疫応答及び特徴を単一細胞レベルで評価するために使用することができる。例示的な実施形態では、非終端採血をマウスから採取し、洗浄して血漿及び可溶性抗体を除去し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＡＳＣについて直接アッセイする。小抗体捕捉ビーズを添加して、ＡＳＣから分泌された抗体を捕捉し、局在化させ、それによって単一細胞レベルでの特徴付けを可能にする。赤血球（ＲＢＣ）混入物は蛍光プラーク形成を妨害するが、アッセイをより多い容量に希釈することによって軽減することができる。しかしながら、これにより、プレーティング容量が多くなり、アッセイスループットの低下がもたらされる。或いは、プレーティング前に、ＲＢＣを直接除去するか、又は所望の細胞を血液試料から単離することができ、したがって、プレーティング容量を減少させ、アッセイスループットを高めることができる。好適な方法としては、以下に限定されるものではないが、ＲＢＣ溶解、密度勾配遠心分離（例えば、ＨｅｔａＳｅｐ、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標））、及び自動洗浄器具（例えば、Ｃｕｒｉｏｘ Ｌａｍｉｎａｒ Ｗａｓｈ（商標））の使用の有無にかかわらず、陰性選択（例えば、抗マウスＴＥＲ１１９ ＲＢＣ枯渇）又は陽性選択（例えば、マウスＣＤ１３８＋単離）細胞分離キットの使用が挙げられる。目的の標的を発現する細胞を、ビーズの代わりに使用することもできる。このような技術は、マウスにおいて種反応性抗体を生成するための戦略を調べるために使用することができる。
【0046】
例示的な実施形態では、ヒト－カニクイザル交差反応性抗体は、抗原のヒト型及びカニクイザル型の交互ブーストで動物を免疫することによって産生され得る。各抗原に対する反応性は、免疫化した動物からのポリクローナル血清を用いる簡単な結合アッセイを使用して容易にモニターすることができる。しかしながら、動物は両抗原で免疫化されており、個々の抗原は共通のエピトープと固有のエピトープの両方を有するので、ポリクローナル血清には両方のタイプのエピトープに反応する抗体が含まれる。残念ながら、この分析のみからは、両抗原に対して観察された血清反応性が真に交差反応性抗体に起因するか、又はいずれかの抗原のみに特異性を有する複数の抗体に由来するかを決定することはできない。しかしながら、ＰＢＭＣ集団に由来するＡＳＣを用いたＢ細胞応答の調査は、抗体創製のためのさらなる免疫レパトア形成又は動物選択を導くことができる単一細胞からの抗体特異性を局在化しスクリーニングすることによって、この問題を克服する。免疫レパトアの形成には、（以下に限定されないが）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、抗原の用量、免疫化のタイミング、及び投与経路を異なる形態へ切り替えるなどの免疫化戦略に対する変更が含まれ得る。
【0047】
したがって、本開示はさらに、選択抗体を産生するＡＳＣを特定するための単一細胞アッセイを提供する。本開示は、選択抗体を産生するＡＳＣについてアッセイする方法を提供する。例示的な実施形態において、アッセイ又は方法は、（ａ）ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分（ここで、血液試料はＡＳＣを含む）、（ｉｉ）選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）選択抗体が結合する標的を組み合わせること（ここで、（Ａ）標的は、第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識を含む標識標的であり、選択抗体に結合し、固体支持体を含む捕捉試薬が、ウェル内でさらに組み合わされて、ウェル内で単層を形成するか、又は（Ｂ）標的は、細胞の表面で発現され、細胞がウェル内で組み合わされて、ウェル内で単層を形成する）と、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイし、任意選択により、標的が標識標的である場合、第２の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第１の検出可能な標識が検出されるか、又は第１及び第２の検出可能な標識が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。
【0048】
様々な態様において、アッセイ又は方法は、（ａ）ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分、（ｉｉ）固体支持体に結合した抗体のＦｃに結合する、固体を含む捕捉試薬、（ｉｉｉ）第１の検出可能な標識に結合した抗体のＦｃに結合する、抗体を含む検出試薬、及び（ｉｖ）第１の検出可能な標識とは異なる第２の検出可能な標識に結合した、免疫原又はその一部を含む標識標的とを組み合わせること（ここで、捕捉剤は、ウェル内で単層を形成する）と、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第２の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｄ）第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識の両方が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。
【0049】
様々な態様において、アッセイ又は方法は、（ａ）ウェル内で、（ｉ）免疫原で免疫化された非ヒト動物から得られた血液試料、又はその画分、（ｉｉ）選択抗体に結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬、及び（ｉｉｉ）選択抗体が結合する標的を細胞表面で発現する細胞であって、ウェル内で組み合わされてウェル内に単層を形成する細胞を組み合わせることと、（ｂ）第１の検出可能な標識についてアッセイすることと、（ｃ）第１の検出可能な標識が検出されるウェル内の位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とを含む。
【0050】
例示的な態様において、第１の検出可能な標識、及び／又は標識標的の第２の検出可能な標識は、発色団又はフルオロフォアを含む。任意選択により、フルオロフォアは、キサンテン誘導体（例えば、フルオレセイン、ローダミン、Ｏｒｅｇｏｎ ｇｒｅｅｎ、エオシン及びＴｅｘａｓ ｒｅｄ）、シアニン誘導体（例えば、シアニン、インドカルボシアニン、オキサカルボシアニン、チアカルボシアニン、及びメロシアニン）、スクアライン誘導体（例えば、Ｓｅｔａ色素及びＳｑｕａｒｅ色素）、スクアラインロタキサン誘導体（例えば、Ｔａｕ色素）、ナフタレン誘導体（例えば、ダンシル誘導体及びプロダン誘導体）、クマリン誘導体、オキサジアゾール誘導体（例えば、ピリジルオキサゾール、ニトロベンゾオキサジアゾール及びベンゾオキサジアゾール）、アントラセン誘導体（例えば、ＤＲＡＱ５、ＤＲＡＱ７及びＣｙＴＲＡＫ Ｏｒａｎｇｅを含むアントラキノン）、ピレン誘導体（例えば、ｃａｓｃａｄｅ ｂｌｕｅ）、オキサジン誘導体（例えば、ナイルレッド、ナイルブルー、クレシルバイオレット、オキサジン１７０）、アクリジン誘導体（例えば、プロフラビン、アクリジンオレンジ、アクリジンイエロー）、アリールメチン誘導体（例えば、オーラミン、クリスタルバイオレット、マラカイトグリーン）、テトラピロール誘導体（例えば、ポルフィン、フタロシアニン、ビリルビン）、又はジピロメテン誘導体（例えば、ＢＯＤＩＰＹ、ａｚａ－ＢＯＤＩＰＹ）を含む。様々な例において、第１の検出可能な標識、及び／又は標識標的の第２の検出可能な標識は、ＣＦ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ）、ＤＲＡＱ若しくはＣｙＴＲＡＫプローブ（ＢｉｏＳｔａｔｕｓ）、ＢＯＤＩＰＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ＥｖｅｒＦｌｕｏｒ（Ｓｅｔａｒｅｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、Ｂｅｌｌａ Ｆｌｕｏｒ（Ｓｅｔａｒｅｈ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、ＣｙＬｉｇｈｔ Ｆｌｕｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｐｉｅｒｃｅ）、Ａｔｔｏ若しくはＴｒａｃｙ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅ（Ｉｎｔｅｒｃｈｉｍ）、Ａｂｂｅｒｉｏｒ色素（Ａｂｂｅｒｉｏｒ）、ＤＹ若しくはＭｅｇａＳｔｏｋｅｓ色素（Ｄｙｏｍｉｃｓ）、Ｓｕｌｆｏ Ｃｙ色素（Ｃｙａｎｄｙｅ）、ＨｉＬｙｔｅ Ｆｌｕｏｒ（ＡｎａＳｐｅｃ）、Ｓｅｔａ、ＳｅＴａｕ、Ｓｑｕａｒｅ色素（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、Ｑｕａｓａｒ若しくはＣａｌ Ｆｌｕｏｒ色素（ＳＥＴＡ ＢｉｏＭｅｄｉｃａｌｓ）、ＳｕｒｅＬｉｇｈｔ色素（ＡＰＣ、ＲＰＥＰｅｒＣＰ、フィコビオリソーム（Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＡＰＣ、ＡＰＣＸＬ、ＲＰＥ、ＢＰＥ（Ｐｈｙｃｏ－Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｇｒｅｅｎｓｅａ、Ｐｒｏｚｙｍｅ、Ｆｌｏｇｅｎ）、又はＶｉｏ色素（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を含む。例示的な態様では、フルオロフォアは、３－ヒドロキシイソニコチンアルデヒド、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）、アミノクマリン、ＡＰＣ－Ｃｙ７コンジュゲート、ＢＯＤＩＰＹ－ＦＬ、Ｃａｓｃａｄｅ Ｂｌｕｅ、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３Ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、フルオレセイン、ＦｌｕｏｒＸ、Ｇ－Ｄｙｅ１００、Ｇ－Ｄｙｅ２００、Ｇ－Ｄｙｅ３００、Ｇ－Ｄｙｅ４００、ヒドロキシクマリン、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、ルシファーイエロー、メトキシクマリン、ＮＢＤ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｏｒａｎｇｅ、ＰＥ－Ｃｙ５コンジュゲート、ＰＥ－Ｃｙ７コンジュゲート、ＰｅｒＣＰ、Ｒ－フィコエリスリン（ＰＥ）、Ｒｅｄ６１３、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、ＴＲＩＴＣ、ＴｒｕＲｅｄ、又はＸ－ローダミンを含む。様々な態様において、第１の検出可能な標識及び／又は第２の検出可能な標識についてアッセイすることは、第１の検出可能な標識及び／又は第２の検出可能な標識からのシグナルを検出することを含む。例示的な例では、シグナルは蛍光シグナルである。例示的な態様において、第１の検出可能な標識及び／又は第２の検出可能な標識についてアッセイすることは、第１の検出可能な標識及び／又は第２の検出可能な標識からのシグナルを定量することを含む。様々な例において、本方法は、第１の検出可能な標識及び／又は第２の検出可能な標識からのシグナルを定量し、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識からのシグナルを比として表すことによってシグナルを正規化することを含む。様々な態様において、この比は、（第１の検出可能な標識からのシグナルの相対蛍光単位（ＲＦＵ））／（第２の検出可能な標識からのシグナルのＲＦＵ）、又はその逆数である。
【0051】
例示的な態様において、ＡＳＣは検出試薬及び／又は標的にウェル中で最初に曝露されるか、又はウェルに添加される直前に曝露される。様々な態様において、ＡＳＣは、検出試薬及び標的とともに、少なくとも３０分間、少なくとも６０分間、少なくとも９０分間、又は少なくとも１２０分間インキュベートされる。任意選択により、選択抗体は、非ヒト動物を免疫化するために使用される免疫原と同じか又は類似している標的に結合する。例示的な例において、検出試薬は、第１の検出可能な標識に結合した抗体Ｆｃドメインに結合する抗体を含む。任意選択により、捕捉剤の抗体Ｆｃドメインに結合する抗体は、検出剤と同じ抗体である。様々な態様において、血液試料は、免疫化ステップの約３日～約７日後に非ヒト動物から得られる。様々な例において、非ヒト動物から得られる血液試料は、約５００μＬ以下であり、任意選択により、約１００μＬ～約２５０μＬである。特定の態様において、ＡＳＣはＣＤ１３８＋Ｂ細胞である。任意選択により、ＡＳＣは、遊走形質芽球を含む。例示的な態様では、本方法は、ウェル中での組み合わせの前に、非ヒト動物から得られた血液試料の１つ以上の成分を除去することをさらに含む。いくつかの例では、赤血球、血漿、及び／又は血小板が、血液試料から除去される。様々な態様において、血液試料の画分は、ＣＤ１３８＋細胞を選択することによって調製される。様々な例において、選択抗体は、１つ以上の競合結合剤の存在下で標的に結合する。任意選択により、競合結合剤は、アッセイ中に、ＡＳＣ、検出試薬、及び標的を発現する細胞と組み合わされる。例示的な態様では、選択抗体は、標的親和性をもって標的に結合し、任意選択により、標的に対する選択抗体のＫＤは約１０－１１Ｍ～約１０－９Ｍである。任意選択により、アッセイは、第１ラウンドにおいては、標的を発現する第１の量の細胞で実施され、第２ラウンドにおいては、標的を発現する第２の量の細胞で実施される（ここで、第１の量は第２の量よりも多い）。いくつかの態様では、アッセイは、第３ラウンドにおいては、標的を発現する第３の量でさらに実施され、第３の量は第２の量未満であり、各ラウンドにおいてＡＳＣが標識標的に結合すると、ＡＳＣは選択抗体を産生する。
【0052】
本開示の方法のアッセイは、個々のＡＳＣによる選択抗体の産生を試験する。「選択抗体」という用語は、設計目標を満たし、且つ／又は標的表現型を示す抗体を指す。様々な例において、選択抗体は、非ヒト動物を免疫化するために使用される免疫原と同じか又は類似している可能性のある標的に結合する。標的は、本明細書に列挙される免疫原のいずれかであり得る。例示的な例において、選択抗体は、標的特異的抗体、例えば抗原特異的抗体である。様々な例において、選択抗体は、標的（又は抗原）に対し、少なくとも約１０－９ＭのＫＤによって表される結合親和性を示す。様々な態様において、選択抗体は、ピコモル範囲のＫＤ（例えば、約１×１０－１２Ｍ～９．９×１０－１２ＭのＫＤ）を示す。様々な態様において、選択抗体は、１つ以上の競合結合剤の存在下で標的に結合する。様々な例において、競合結合剤は、ヒト血液、例えばヒトの血漿又は血清内の成分である。このような例では、競合結合剤、例えばヒト血清は、アッセイの間、ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされる。例えば、実施例１を参照されたい。様々な態様において、競合結合剤は、ヒト又は非ヒト動物体内の標的に結合する天然リガンドであり、標的に結合する選択抗体は、天然リガンドの標的への結合を阻止又は阻害する。例えば、選択抗体は抗ＰＤ－１抗体であり、競合結合剤はＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２である。このような例では、競合結合剤、例えばＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２は、アッセイの間、ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされる。例えば、実施例７を参照されたい。
【0053】
本開示の方法のスクリーニングは、選択抗体を産生するＡＳＣのその後の分子レスキューのために、より大きなウェル（例えば、４ウェルプレート又はＯｍｎｉＴｒａｙ（商標））で完了することができる。ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ又はＦｌｕｏｒｏＳｐｏｔアッセイとは異なり、本開示の方法は、当該技術分野で知られるマイクロマニピュレーション又は自動蛍光単一細胞ピッキングシステム（例えば、ＣｅｌｌＣｅｌｅｃｔｏｒ（商標））を備えたマイクロマニピュレーションに修正可能な均質生細胞アッセイである。ＩｇＧ捕捉ビーズのコンフルエントな単層は、明確に定義された蛍光プラークを可能にする場所にＡＳＣを固定し、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を特定する。
【0054】
本開示の方法は、抗体創製のための選択抗体を産生する動物の選択及び採取を誘導することができる。動物を選択するための従来のアプローチは、個々の抗体の品質ではなく、分泌された全ての抗体の全体的な反応性及び品質を測定するポリクローナル血清力価を調査するものである。ＰＢＭＣ集団に由来するＡＳＣを用いたＢ細胞応答の調査は、さもなければ解釈が困難であるか、又はポリクローナル血清力価に隠れてしまう選択抗体を産生する個々のＡＳＣを特定することによって、この問題を克服することができる。終端組織採取のための動物選択の例示的な方法は、図１Ｄ及び１Ｅ、並びに実施例１２及び１３に記載されている。
【0055】
例示的な態様では、選択抗体は、標的親和性で標的に結合し、任意選択により、標的に対する選択抗体のＫＤは、１０－１１Ｍ～１０－９Ｍの範囲内である。様々な例において、標的に対する選択抗体のＫＤは、ピコモル範囲内又は約１０－１２Ｍ内である。様々な例において、標的に対する選択抗体のＫＤは、サブピコモルの範囲、例えば＜１０－１２Ｍである。様々な態様において、アッセイは、第１ラウンドでは、第２の検出可能なラベルに結合した免疫原又はその一部を含む第１の量の標識標的を、ＡＳＣ、捕捉試薬、及び検出試薬と組み合わせ、第２ラウンドでは、第２の検出可能なラベルに結合した免疫原又はその一部を含む第２の量の標識標的と、ＡＳＣ、捕捉試薬、及び検出試薬と組み合わせることを含む（ここで、第１の量は第２の量よりも多い）。いくつかの例では、アッセイは、第３の量の標識標的を使用する第３のラウンドを含むことができる（ここで、第３の量は第２の量よりも少ない）。各ラウンドを通して第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識を検出することによって特定されるＡＳＣは、標的に対して高い親和性を有する選択抗体を産生するＡＳＣであり得る。例えば、実施例８を参照されたい。
【0056】
選択抗体は、標的親和性で標的に結合する。様々な態様において、アッセイは、ＡＳＣを、選択抗体のＦｃドメインに結合し、第１の検出可能な標識を含む検出試薬と、選択抗体が第２の標識として結合する標的と組み合わせることを含む。これに続いて、蛍光シグナルの定量、及びＩｇＧ分泌第１標識ＲＦＵ（相対蛍光単位）と標的第２標識ＲＦＵとの比を決定することによる分泌の正規化が行われる。最小比（ＩｇＧ ＲＦＵ／標的ＲＦＵ）で特定されたＡＳＣが、標的に対して高い親和性を有する選択抗体を産生するＡＳＣであり得る。ＡＳＣ ＩｇＧ正規化ＲＦＵを、検証されたハイブリドーマ又は細胞株において発現された組換え抗体からの既知の標的親和性のＡＳＣと比較して、大まかな相対的親和性ランキングを提供することができる。例えば、実施例１１を参照されたい。
【0057】
様々な態様において、選択抗体は標的及びそのオルソログ又はパラログに結合し、任意選択により、標的はヒトタンパク質であり、オルソログはカニクイザルタンパク質である。様々な例において、アッセイ中に、第２の標識標的が、ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ（ここで、第２の標識標的は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合されたオルソログを含む）、方法は、第３の検出可能な標識についてアッセイすることと、第１の検出可能な標識、第２の検出可能な標識、及び第３の検出可能な標識が検出される位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とをさらに含む。
【0058】
様々な例において、選択抗体は標的に結合し、そのオルソログ又はパラログには結合しない。任意選択により、アッセイ中に、第２の標識標的が、ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ（ここで、第２の標識標的は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合されたオルソログを含む）、方法は、第３の検出可能な標識についてアッセイすることと、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識のみが検出され、第３の検出可能な標識は検出されない位置を特定することとをさらに含む（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）。例えば、実施例６を参照されたい。
【0059】
様々な態様において、選択抗体は、標的の一部に結合する。任意選択により、アッセイ中に、第２の標識標的が、ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ（ここで、第２の標識標的は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合された標的の一部を含む）、方法は、第３の検出可能な標識についてアッセイすることと、第１の検出可能な標識、第２の検出可能な標識、及び第３の検出可能な標識が検出される位置を特定すること（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）とをさらに含む。様々な例において、標的は、複数のドメインを含むタンパク質であり、選択抗体は、標的の１つのドメインのみに結合する。様々な態様において、アッセイ中、標識標的は、第２の検出可能な標識に結合した標的の細胞外ドメインを含み、第２の標識標的は、第３の検出可能な標識に結合した１つのドメインを含む。例えば、実施例９を参照されたい。様々な態様において、選択抗体は、標的の二量体化又は多量体化の際に形成される立体構造エピトープに結合し、標的は、二量体化ドメイン又は多量体化ドメインを含む。任意選択により、アッセイ中、標識標的は、第２の検出可能な標識に結合した免疫原の細胞外ドメインを含み、第２の標識標的は、ＡＳＣ、捕捉試薬、検出試薬、及び標識標的と組み合わされ、第２の標識標的は、第１の検出可能な標識及び第２の検出可能な標識とは異なる第３の検出可能な標識に結合した免疫原の二量体化ドメイン又は多量体化ドメインを含み、方法は、第３の検出可能な標識についてアッセイすることと、第１の検出可能な標識、第２の検出可能な標識、及び第３の検出可能な標識が検出される位置を特定することとをさらに含む（ここで、各特定された位置は、選択抗体を産生する個々のＡＳＣの位置を示す）。例えば、実施例１０を参照されたい。
【0060】
反復免疫による抗体産生の誘導
様々な態様において、方法は、非ヒト動物を繰り返し免疫化することを含む。本明細書に例示されるように、様々な態様において、方法は、非ヒト動物を２回以上免疫化することを含む。様々な態様において、方法は、初期免疫化及び１回以上のその後の免疫化を行うことを含む。様々な例において、非ヒト動物から血液試料を得て、選択抗体を産生するＡＳＣについてアッセイした後、各その後の免疫化を繰り返す。様々な態様において、非ヒト動物は、少なくとも２回以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、又はそれ以上免疫化される。様々な態様において、方法は、初回免疫化、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回のその後の免疫化を行うことを含む。任意選択により、免疫化は、選択抗体を産生するＡＳＣが特定されるか、又は選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上になるまで繰り返される。様々な例において、各免疫化は、それより前の免疫化又は初回免疫化と比較して、同じ（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫化のタイミング、（Ｄ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｅ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｆ）これらの組み合わせで繰り返される。或いは、各免疫化は、それより前の免疫化又は初回免疫化と比較して、異なる（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫化のタイミング、（Ｄ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｅ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｆ）これらの組み合わせで繰り返される。例示的な態様において、動物は毎回、それより前の免疫化又は初回免疫化と比較して、異なる（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫化のタイミング、（Ｄ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｅ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｆ）これらの組み合わせを使用して免疫化される。様々な態様では、免疫化によって非ヒト動物に誘発される免疫応答が事前の免疫化によって引き起こされる事前の免疫応答と比較して変化するように、行われるたびに免疫化が変化する。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、同じ動物に対して複数の異なる免疫化キャンペーンを実施することにより、選択抗体の産生に向けて免疫応答を誘導する。
様々な態様において、方法は、非ヒト動物を繰り返し免疫化することを含む。本明細書に例示されるように、様々な態様において、方法は、非ヒト動物を２回以上免疫化することを含む。様々な態様において、方法は、初期免疫化及び１回以上のその後の免疫化を行うことを含む。様々な例において、非ヒト動物から血液試料を得て、選択抗体を産生するＡＳＣについてアッセイした後、各その後の免疫化を繰り返す。様々な態様において、非ヒト動物は、少なくとも２回以上、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、又はそれ以上免疫化される。様々な態様において、方法は、初回免疫化、及び１、２、３、４、５、６、７、８、９、又は１０回のその後の免疫化を行うことを含む。任意選択により、免疫化は、選択抗体を産生するＡＳＣが特定されるか、又は選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上になるまで繰り返される。様々な例において、各免疫化は、それより前の免疫化又は初回免疫化と比較して、同じ（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫化のタイミング、（Ｄ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｅ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｆ）これらの組み合わせで繰り返される。或いは、各免疫化は、それより前の免疫化又は初回免疫化と比較して、異なる（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫化のタイミング、（Ｄ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｅ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｆ）これらの組み合わせで繰り返される。例示的な態様において、動物は毎回、それより前の免疫化又は初回免疫化と比較して、異なる（Ａ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせ、（Ｂ）免疫原、アジュバント、免疫調節剤、若しくはこれらの組み合わせの量若しくは用量、（Ｃ）免疫化のタイミング、（Ｄ）免疫原を送達する投与経路又は方法、（Ｅ）非ヒト動物への投与部位、又は（Ｆ）これらの組み合わせを使用して免疫化される。様々な態様では、免疫化によって非ヒト動物に誘発される免疫応答が事前の免疫化によって引き起こされる事前の免疫応答と比較して変化するように、行われるたびに免疫化が変化する。いかなる特定の理論にも拘束されるものではないが、同じ動物に対して複数の異なる免疫化キャンペーンを実施することにより、選択抗体の産生に向けて免疫応答を誘導する。
【0061】
例示的な例において、選択抗体の産生のために非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、ステップのサイクルを実施することを含み、そのサイクルは（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、免疫原を用いて非ヒト動物に対してその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとを含む。
【0062】
例示的な例では、方法は、（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとのサイクルを含む。様々な例において、サイクルは、少なくとも１回、２回、又は３回若しくはそれ以上繰り返される。様々な態様において、サイクルは、（ｉｉｉ）のアッセイで、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上になるまで繰り返される。例示的な態様において、反復サイクル後に、免疫化された非ヒト動物の１０％超、２０％超、３０％超、４０％超、又は５０％超が、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上となる。様々な態様において、免疫化された非ヒト動物の７５％超、又は８５％超、又は９０％超が、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上となる。例示的な態様において、その後の免疫化の免疫原は、初回免疫化の免疫原と異なる。例えば、例示的な態様において、（Ａ）異なる免疫原、アジュバント、及び／若しくは免疫調節剤が非ヒト動物に投与される、（Ｂ）初回免疫化と異なる用量の免疫原が非ヒト動物に投与される、（Ｃ）初回免疫化に使用される免疫原、アジュバント、及び／若しくは免疫調節剤の各投与の間の時間が異なる、及び／又は（Ｄ）初回免疫化に使用される免疫原、アジュバント、及び／又は免疫調節剤の各投与の投与経路が異なるという点で、各その後の免疫化が事前の免疫化とは異なる。任意選択により、非ヒト動物が免疫化される都度、異なる免疫原が使用される。
【0063】
本明細書で論じられるように、免疫化は、（任意選択により、アジュバントとともに調製された）免疫原が非ヒト動物に１回以上投与することを含む。本発明の方法は、異なる免疫化条件による複数の免疫化ステップを含み得、これは、免疫化された非ヒト動物が最終的に所望の表現型を有する抗体を生成するように、免疫応答をステアリングするために使用することができる。目的の表現型、又は表現型の組み合わせに応じて、免疫応答が所望の表現型を有する抗体を生成するようにステアリングされるように、連続する免疫化ステップ中に免疫化条件を変化させることができる。例示的な実施形態では、ヒト－カニクイザル交差反応性抗体を産生するために、抗原のヒト型及びカニクイザル型の交互ブーストで非ヒト動物を免疫することができる。例えば、免疫化は、合計４回の注射を含むことができ、１回目及び３回目の注射で、組換えヒト抗原を使用し、２回目及び４回目の注射で、組換えカニクイザル抗原を使用することができる。例示的な免疫化は、本明細書の実施例４に記載されている。実施例５には、異なる免疫化が使用される、ヒト－カニクイザル交差反応性抗体を作製するさらなる方法を記載する。例示的な実施形態では、マルチドメインタンパク質のドメインに特異的な抗体を産生するために、免疫化は次の３つのタイプの免疫原の１つ以上で起こり得る：マルチドメインタンパク質の完全細胞外ドメイン、ドメイン、及び／又は完全長タンパク質。例えば、実施例９を参照されたい。例示的な実施形態では、二量体又は多量体タンパク質の二量体化又は多量体化の際に形成されるエピトープに特異的な抗体を産生するために、免疫化は次の３つのタイプの免疫原の１つ以上で起こり得る：二量体又は多量体タンパク質の完全細胞外ドメイン、多量体化ドメイン及び／又は完全長タンパク質。例えば、実施例１０を参照されたい。さらなる例示的な免疫化を本明細書に提供する。実施例の項を参照されたい。
【0064】
追加のステップ
本明細書に開示される方法は、さらなるステップを含み得る。例示的な例において、方法は、血液試料が得られた後に、免疫原に対する抗体応答をアッセイすることを含む。例示的な例において、方法は、血液試料が得られた後、試料の抗体力価をアッセイすることを含む。例示的な例において、方法は、血液試料中に存在する抗体の抗原特異性をアッセイすること、任意選択により、免疫原を使用する結合アッセイを含む。
本明細書に開示される方法は、さらなるステップを含み得る。例示的な例において、方法は、血液試料が得られた後に、免疫原に対する抗体応答をアッセイすることを含む。例示的な例において、方法は、血液試料が得られた後、試料の抗体力価をアッセイすることを含む。例示的な例において、方法は、血液試料中に存在する抗体の抗原特異性をアッセイすること、任意選択により、免疫原を使用する結合アッセイを含む。
【0065】
様々な態様において、方法は、選択抗体を産生するＡＳＣを単離すること、又は選択抗体を単離することを含む。様々な例において、抗体の単離は、選択抗体を産生する単一ＡＳＣを単離することによって達成される。様々な態様において、ＡＳＣを単離することは、希釈ステップ、任意選択により連続希釈ステップを含み、細胞濃度が、統計的に、１つの細胞が所与の計算された体積中に存在するように減少し、計算された体積がマルチウェルプレートの個別の容器又はウェル中に配置される。様々な態様において、血液試料のＡＳＣを単離することは、単一のＡＳＣをウェル内又は気泡内にマイクロ流体で移動させることを含む。そこでは、選択抗体が培養培地中に分泌され、且つ／又はＡＳＣが細胞分裂を受けるまで、ＡＳＣは培養物中に維持される。任意選択により、少なくとも又は約３分～約３０分、６時間、２４時間、又はそれ以上の間、維持される。様々な態様において、ＡＳＣの単離は、マイクロ流体、磁気、毛管作用、重力、ＦＡＣＳ、又はｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰ）によって行われる。
【0066】
様々な態様において、本開示の方法は、標的表現型を有する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を決定することを含む。任意選択により、配列決定は、ＲＴ－ＰＣＲによって行われる。任意選択により、本方法は、標的表現型を有する抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域をコードする核酸で細胞をトランスフェクトすること、トランスフェクトされた細胞を培養すること、及び培養物から抗体を採取することをさらに含む。いくつかの態様において、本方法のステップは、一連の非ヒト動物に対して実施され、本方法は、一連の非ヒト動物ごとに血液試料のＢ細胞レパトアをプロファイリングすること、及び標的Ｂ細胞プロファイルを有する一連のサブセットを選択することを含む。このような方法は、実施例１に記載されている。
【0067】
また、様々な態様において、本方法は、抗体を産生し、精製し、製剤化することに関与する１つ以上の上流ステップ又は下流ステップを含む。任意選択により、下流ステップは、本明細書に記載されるか、又は当該技術分野で知られる下流プロセスステップのいずれか１つである。例示的な実施形態では、本方法は、標的表現型を有する抗体を発現する宿主細胞を作製するためのステップを含む。宿主細胞は、いくつかの態様では、原核宿主細胞、例えばＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）若しくはバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）であるか、又は宿主細胞は、いくつかの態様では、真核宿主細胞、例えば、酵母細胞、糸状菌細胞、原生動物細胞、昆虫細胞、若しくは哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）である。このような宿主細胞は、当該技術分野で記載されている。例えば、Ｆｒｅｎｚｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４：２１７（２０１３）を参照されたい。例えば、いくつかの例において、本方法は、抗体、又はその軽鎖若しくは重鎖をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することを含む。例示的な態様では、方法は、細胞を細胞培養物中に維持することを含む。任意選択により、このようなステップには、特定の温度、ｐＨ、浸透圧、溶存酸素、湿度、又はグルコース、フコース、乳酸塩、アンモニア、グルタミン及び／若しくはグルタミン酸塩の１つ以上を含む培養培地中を維持することが含まれ得る。
【0068】
例示的な実施形態では、本明細書に開示の方法は、選択抗体を産生するＡＳＣを単離及び／若しくは精製するステップ、又は培養物から選択抗体を単離及び／若しくは精製するステップを含む。例示的な態様では、本方法は、以下に限定されないが、例えば、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー）、イオン交換クロマトグラフィー、及び／又は疎水性相互作用クロマトグラフィーを含む１つ以上のクロマトグラフィーステップを含む。例示的な態様では、本方法は、組換えグリコシル化タンパク質を含む溶液から結晶性生体分子を生成させるステップを含む。
【0069】
本開示の方法は、様々な態様において、組成物、例えば、いくつかの態様では、精製選択抗体を含む医薬組成物、を調製するための１つ以上のステップを含む。
【0070】
例示的な実施形態では、本方法は、（ａ）標準的なプロトコルを用いて動物を免疫化すること、及び（ｂ）抗原特異的抗体応答について血清を評価することを含む。例示的な態様では、本方法は、抗原によるブーストのために免疫動物を選択すること、及びこれらの動物から血液を採取する（例えば、ブーストの約４日後）ことをさらに含む。様々な例において、本方法は、Ｂ細胞について血液を濃縮するために、動物から採取した血液から赤血球、血漿、及び血小板を除去することを含む。例示的な例において、本方法は、抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を特定し、個々のＡＳＣによって産生される抗体の解明及び／又は特徴付けを可能にするためにＡＳＣを単一細胞として単離することを含む。任意選択により、単一細胞の単離及びスクリーニングは、当該技術分野で知られた方法、例えば、ＮａｎＯＢＬＡＳＴ（例えば、ナノ流体Ｂｅａｃｏｎ機器による）、マイクロカプセル化を使用して達成される。様々な態様において、個々のＡＳＣによって産生され、分泌される抗体が、標的表現型について評価される。任意選択により、標的表現型の評価は、様々な異なるスクリーニング戦略を使用することによって達成され、標的表現型を有する１つ以上の抗体、及び抗体を産生及び分泌するＡＳＣが特定される。様々な例において、本方法は、（標的表現型を示す抗体を産生し分泌する）ＡＳＣから抗体ＶＨ及びＶＬ遺伝子を、例えば、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによって単離すること、並びに組換え産生のために対合したＶＨ及びＶＬ遺伝子の配列を細胞にクローニングすることをさらに含む。
【0071】
スクリーニング、選択、及びプロファイリング方法
本開示は、選択抗体を産生する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）について非ヒト動物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、本開示のモニターする方法に従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、本方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定される。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）一連の非ヒト動物を免疫原で免疫化することと、（ｂ）一連の各非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとを含み、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が決定される。様々な態様において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、その非ヒト動物を致死及び／又は組織採取（例えば、二次リンパ組織採取）のために選択することをさらに含む。本開示はさらに、その後の免疫化のために免疫化された非ヒト動物を選択する方法を提供する。様々な態様において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その非ヒト動物をその後の免疫化のために選択することをさらに含む。したがって、様々な実施形態において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合に基づいて、致死対象の動物とその後の免疫化対象の動物とを識別する。例示的な実施形態では、本方法は、本開示のモニターする方法に従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、この方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定され、動物に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その後の免疫化のための動物を選択する。安楽死及び二次リンパ系採取のための選択抗体を産生する免疫化非ヒト動物を選択する方法もまた、本明細書においてさらに提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示のモニターする方法に従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、この方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定され、動物に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、その動物を安楽死及び二次リンパ系採取のために選択する。
本開示は、選択抗体を産生する抗体分泌細胞（ＡＳＣ）について非ヒト動物をスクリーニングする方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、本開示のモニターする方法に従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、本方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定される。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）一連の非ヒト動物を免疫原で免疫化することと、（ｂ）一連の各非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとを含み、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が決定される。様々な態様において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、その非ヒト動物を致死及び／又は組織採取（例えば、二次リンパ組織採取）のために選択することをさらに含む。本開示はさらに、その後の免疫化のために免疫化された非ヒト動物を選択する方法を提供する。様々な態様において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その非ヒト動物をその後の免疫化のために選択することをさらに含む。したがって、様々な実施形態において、スクリーニング方法は、選択抗体を産生するＡＳＣの割合に基づいて、致死対象の動物とその後の免疫化対象の動物とを識別する。例示的な実施形態では、本方法は、本開示のモニターする方法に従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、この方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定され、動物に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合、その後の免疫化のための動物を選択する。安楽死及び二次リンパ系採取のための選択抗体を産生する免疫化非ヒト動物を選択する方法もまた、本明細書においてさらに提供される。例示的な実施形態では、本方法は、本開示のモニターする方法に従って、非ヒト動物における選択抗体の産生をモニターすることを含み、この方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、一連の非ヒト動物ごとに、選択抗体を産生するＡＳＣの数が特定され、動物に対する選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合、その動物を安楽死及び二次リンパ系採取のために選択する。
【0072】
本開示はさらに、非ヒト動物のＢ細胞レパトアをプロファイリングする方法を提供する。例示的な実施形態では、方法は、（ａ）非ヒト動物を免疫原で免疫化することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとを含む。様々な例において、本方法は、一連の非ヒト動物に対して実施され、方法は、一連の非ヒト動物ごとに血液試料のＢ細胞レパトアをプロファイリングすることと、標的Ｂ細胞プロファイルを有する一連のサブセットを選択することとを含む。例示的な例において、サブセットは、再免疫化のために選択される。別の例において、サブセットは、安楽死及び二次リンパ器官の採取のために選択される。
【0073】
したがって、本明細書に記載のスクリーニング及び選択方法は、選択抗体を産生している非ヒト動物の特定を可能にする。このような方法の例示的な利点は、そのような抗体を産生する非ヒト動物を、致死及びＢ細胞採取の前に特定することができることである。これは、選択抗体を産生する非ヒト動物、したがってＢ細胞プールを濃縮し、したがって、従来の下流抗体創製方法の非効率性をいくらか軽減するのに役立つ。
【0074】
抗体の生成
本開示はさらに、非ヒト動物において選択抗体を生成する方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、抗体産生を誘導する本開示の方法に従って選択抗体の産生のために非ヒト動物において抗体産生を誘導し、次いで、選択抗体及び／又は選択抗体を産生するＡＳＣを単離することを含む。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）免疫原で非ヒト動物に初回免疫化キャンペーンを実施することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることと、（ｄ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｅ）選択抗体及び／又は選択抗体を産生するＡＳＣを単離することとを含む。様々な態様において、本方法は、（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとからなるサイクルを、選択抗体を産生するＡＳＣのパーセンテージが閾値以上になるまで繰り返すことを含む。選択抗体を産生するＡＳＣを単離するか、又は選択抗体を単離する方法は、本明細書に記載されている。例えば、追加のステップの項を参照されたい。
本開示はさらに、非ヒト動物において選択抗体を生成する方法を提供する。例示的な実施形態において、本方法は、抗体産生を誘導する本開示の方法に従って選択抗体の産生のために非ヒト動物において抗体産生を誘導し、次いで、選択抗体及び／又は選択抗体を産生するＡＳＣを単離することを含む。例示的な実施形態において、本方法は、（ａ）免疫原で非ヒト動物に初回免疫化キャンペーンを実施することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることと、（ｄ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｅ）選択抗体及び／又は選択抗体を産生するＡＳＣを単離することとを含む。様々な態様において、本方法は、（ｉ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値未満である場合に、免疫原で非ヒト動物にその後の免疫化を実施することと、（ｉｉ）前記非ヒト動物からＡＳＣを含む血液試料を得ることと、（ｉｉｉ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることとからなるサイクルを、選択抗体を産生するＡＳＣのパーセンテージが閾値以上になるまで繰り返すことを含む。選択抗体を産生するＡＳＣを単離するか、又は選択抗体を単離する方法は、本明細書に記載されている。例えば、追加のステップの項を参照されたい。
【0075】
様々な態様において、本方法はさらに、（ｆ）ＡＳＣ（例えば、選択抗体を産生する単離されたＡＳＣ）によって産生される選択抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列、及びＡＳＣによって産生される選択抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を決定することと、（ｇ）選択抗体の重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第１のベクター、及び選択抗体の軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含む第２のベクターを宿主細胞に導入することと、（ｈ）宿主細胞によって産生される抗体を単離することとを含む。抗体の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の配列を決定する方法は当該技術分野において知られており、例えば、単一細胞ＰＣＲが挙げられる。例えば、Ｔｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３５０：１８９－１９３（２００９）；及びＷｉｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９（前掲）を参照されたい。ヌクレオチド配列を含むベクターを作製することは知られている。例えば、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，（２０１２）を参照されたい。様々な態様において、選択抗体を生成する方法は、重鎖配列及び／又は軽鎖配列を操作して、操作された選択抗体を得ることを含む。様々な態様において、操作された選択抗体は、非操作選択抗体と比較して、例えば、貯蔵若しくは製造中、製剤化中、充填中、輸送若しくは投与中、又はインビボ条件下で、より高い安定性を示す。様々な態様において、操作された選択抗体は、非操作選択抗体と比較して、標的又はそのオルソログ若しくはパラログに対してより高い親和性を示す。宿主細胞によって産生された抗体を単離するための好適な技術は本明細書に記載されており、当該技術分野において知られている。例えば、本明細書中の追加のステップの項、及びＬｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ Ｂ ８４８（１）：４８－６３（２００７）；Ｎｇｏ ｅｔ ａｌ．，米国特許第４，９３３，４３５号明細書；及びＡｙｙａｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ５６（２）：１１６－１２９（２０１２）を参照されたい。
【0076】
本開示の選択抗体を生成する方法の例示的な実施形態では、方法は、（ａ）免疫原で非ヒト動物に初回免疫化を実施することと、（ｂ）前記非ヒト動物から抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を含む血液試料を得ることと、（ｃ）選択抗体の産生について、血液試料又はその画分中に存在するＡＳＣを個々にアッセイすることと、（ｄ）選択抗体を産生するＡＳＣの割合が閾値以上である場合に、非ヒト動物から１つ以上の二次リンパ器官を採取することとを含む。様々な態様において、採取された二次リンパ器官から免疫細胞が得られ、それらの免疫細胞、例えばＩｇＧ陽性記憶Ｂ細胞の少なくとも一部を使用してハイブリドーマを作製する。ハイブリドーマを作製する方法は、当該技術分野において知られており、本明細書に記載されている。例えば、本明細書中のハイブリドーマ作製の強化の項、並びにＺｈａｎｇ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｃｉｏｌ ０１：１１７－１３５（２０１２）；Ｔｏｍｉｔａ ａｎｄ Ｔｓｕｍｏｔｏ，Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ３（３）：３７１－３８０（２０１１）；Ｈｎａｓｋｏ ａｎｄ Ｓｔａｎｋｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １３１８：１５－２８（２０１５）；及びＺａｒｏｆｆ ａｎｄ Ｔａｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ６７（３）：９０－９２（２０１９）を参照されたい。特定の態様において、本開示の方法は、ハイブリドーマを作製することをさらに含む。
【0077】
抗体
抗体構造は種によって異なるが、本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、典型的には、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン型を有するタンパク質を指す。本方法によって得られた又は単離された抗体は、様々な用途を有することができる。例えば、本発明の方法によって得られた抗体は、治療薬として使用することができる。本方法によって得られた抗体はまた、例えば、診断アッセイ、例えば画像診断アッセイにおいて、及び他のインビトロ又はインビボイムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムナンアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥｌｉＳｐｏｔアッセイなどのために使用される試薬のような非治療的抗体として使用することができる。様々な態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。例示的な例では、抗体は、哺乳動物抗体、例えばマウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ブタ抗体、ヒト抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体などである。いくつかの態様では、抗体は、任意選択によりトランスジェニック動物によって産生されるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。このような実施形態では、産生される抗体は、２つ以上の種の配列を含むキメラ抗体である。様々な例において、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアの「Ｙ型」構造であるヒトＩｇＧを有し、各ペアは、１本の「軽」鎖（典型的には、分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（典型的には、分子量が約５０～７０ｋＤａ）を有する。ヒト抗体は、可変領域と定常領域とを有する。ヒトＩｇＧ型では、可変領域は、一般に約１００～１１０個以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に異なる。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。簡潔に説明すると、ヒト抗体の骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこで抗原結合及び抗原認識に大きい役割を果たす領域を構成している。ヒト抗体可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照されたい）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７（前掲）も参照されたい）内にある。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとそれぞれ定義される。ＩｇＧはいくつかのサブクラスを有し、それにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない。ＩｇＭはサブクラスを有し、それにはＩｇＭ１及びＩｇＭ２が含まれるが、これらに限定されない。本開示の実施形態は、ヒト抗体のこのようなクラス又はアイソタイプを全て含む。ヒト軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、又はミュー型の重鎖定常領域であり得る。したがって、例示的な実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つである。
抗体構造は種によって異なるが、本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、典型的には、重鎖及び軽鎖を含み、且つ可変領域及び定常領域を含む、従来の免疫グロブリン型を有するタンパク質を指す。本方法によって得られた又は単離された抗体は、様々な用途を有することができる。例えば、本発明の方法によって得られた抗体は、治療薬として使用することができる。本方法によって得られた抗体はまた、例えば、診断アッセイ、例えば画像診断アッセイにおいて、及び他のインビトロ又はインビボイムノアッセイ、例えば、ウェスタンブロット、ラジオイムナンアッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥｌｉＳｐｏｔアッセイなどのために使用される試薬のような非治療的抗体として使用することができる。様々な態様において、抗体は、モノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。例示的な例では、抗体は、哺乳動物抗体、例えばマウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ウマ抗体、ニワトリ抗体、ハムスター抗体、ブタ抗体、ヒト抗体、アルパカ抗体、ラクダ抗体、ラマ抗体などである。いくつかの態様では、抗体は、任意選択によりトランスジェニック動物によって産生されるモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体であり得る。このような実施形態では、産生される抗体は、２つ以上の種の配列を含むキメラ抗体である。様々な例において、抗体は、ポリペプチド鎖の２つの同一のペアの「Ｙ型」構造であるヒトＩｇＧを有し、各ペアは、１本の「軽」鎖（典型的には、分子量が約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（典型的には、分子量が約５０～７０ｋＤａ）を有する。ヒト抗体は、可変領域と定常領域とを有する。ヒトＩｇＧ型では、可変領域は、一般に約１００～１１０個以上のアミノ酸であり、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含み、主に抗原認識に関与し、異なる抗原に結合する他の抗体間で実質的に異なる。例えば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ ａｎｄ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇｅｎｅｓ”，Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｅ Ｓｙｓｔｅｍ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，４ｔｈ ｅｄ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．／Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，（１９９９）を参照されたい。簡潔に説明すると、ヒト抗体の骨格において、ＣＤＲは、重鎖及び軽鎖の可変領域中のフレームワーク内に埋め込まれており、そこで抗原結合及び抗原認識に大きい役割を果たす領域を構成している。ヒト抗体可変領域は、少なくとも３つの重鎖又は軽鎖のＣＤＲを含み（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｎ．Ｉ．Ｈ．，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－９１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７－８８３も参照されたい）、それらは、フレームワーク領域（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１によってフレームワーク領域１～４、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４と呼ばれている；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７（前掲）も参照されたい）内にある。ヒト軽鎖は、カッパ及びラムダ軽鎖として分類される。重鎖は、ミュー、デルタ、ガンマ、アルファ、又はイプシロンとして分類され、抗体のアイソタイプはＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＥとそれぞれ定義される。ＩｇＧはいくつかのサブクラスを有し、それにはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４が含まれるが、これらに限定されない。ＩｇＭはサブクラスを有し、それにはＩｇＭ１及びＩｇＭ２が含まれるが、これらに限定されない。本開示の実施形態は、ヒト抗体のこのようなクラス又はアイソタイプを全て含む。ヒト軽鎖定常領域は、例えば、カッパ型又はラムダ型の軽鎖定常領域であり得る。重鎖定常領域は、例えば、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、又はミュー型の重鎖定常領域であり得る。したがって、例示的な実施形態では、抗体は、アイソタイプＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ又はＩｇＭの抗体、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれか１つである。
【0078】
抗原結合タンパク質は、ヒト抗体の構造とは異なる構造を有し得る。例示的な例において、抗原結合タンパク質は、重鎖断片、例えば重鎖可変領域、重鎖定常領域ＣＨ２、重鎖定常領域ＣＨ３のみを含む。様々な例において、抗原結合タンパク質は、ナノボディの構造、例えばヒトコブラクダ、ラマ、及びサメによって作製されるものなどを含む。例えば、ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｓｃｉｅｎｃｅｍａｇ．ｏｒｇ／ｎｅｗｓ／２０１８／０５／ｍｉｎｉ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ－ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ－ｓｈａｒｋｓ－ａｎｄ－ｃａｍｅｌｓ－ｃｏｕｌｄ－ｌｅａｄ－ｄｒｕｇｓ－ｃａｎｃｅｒ－ａｎｄ－ｏｔｈｅｒ－ｄｉｓｅａｓｅｓにおけるＬｅｓｌｉｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，“Ｍｉｎｉ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ ｉｎ ｓｈａｒｋｓ ａｎｄ ｃａｍｅｌｓ ｃｏｕｌｄ ｌｅａｄ ｔｏ ｄｒｕｇｓ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｄｉｓｅａｓｅｓ”，２０１８を参照されたい。
【0079】
以下の実施例は、本発明を単に例証するために示され、決してその範囲を限定するものではない。
【実施例】
【0080】
実施例１
この実施例では、マウスにおける選択抗体の産生をモニターする例示的な方法を記載する。
この実施例では、マウスにおける選択抗体の産生をモニターする例示的な方法を記載する。
【0081】
この実施例において、選択抗体は、ＰＤ－１に特異的な治療用ヒトＩｇＧ抗体のイディオトープに結合する抗イディオタイプ抗体（抗ＩＤ ａｂ）であった（以下、「抗体１」と称する）。イディオトープは、抗原への結合に通常関与する抗体の可変領域（パラトープ）によって形成される固有の構造である。図３は、抗体１のイディオトープ及びパラトープ、並びに抗ＩＤ抗体を示す。
【0082】
免疫化プロトコル
抗体１の可溶性形態をアジュバント（完全フロイントアジュバント、続いてＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＳＡＳ、カタログ番号Ｓ６３２２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））中で乳化した。次いで、抗体－アジュバント混合物を、Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ１及びＢ６／１２９マウスを含む野生型マウスの複数の系統に送達した。完全免疫化キャンペーンは、３８日間にわたって２週間隔で送達した３回の注射から構成された。最初の免疫は、１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化した５０μｇの抗体１からなり、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射された。１４日後、２５μｇの抗体１を２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。３回目の免疫化は１４日後に送達され、抗体１の総量を１５μｇに減少させた以外は、２回目と同じ経路及びアジュバントとした。
抗体１の可溶性形態をアジュバント（完全フロイントアジュバント、続いてＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（ＳＡＳ、カタログ番号Ｓ６３２２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））中で乳化した。次いで、抗体－アジュバント混合物を、Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＤ１及びＢ６／１２９マウスを含む野生型マウスの複数の系統に送達した。完全免疫化キャンペーンは、３８日間にわたって２週間隔で送達した３回の注射から構成された。最初の免疫は、１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化した５０μｇの抗体１からなり、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射された。１４日後、２５μｇの抗体１を２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。３回目の免疫化は１４日後に送達され、抗体１の総量を１５μｇに減少させた以外は、２回目と同じ経路及びアジュバントとした。
【0083】
各マウスからの血清力価のブリッジングＥＬＩＳＡ分析を、実質的にＷｉｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，ｍＡｂｓ １１（６）：１０２５－１０３５（２０１９）に記載されているように実施して、抗原反応性を確認し、最終ブースト用の動物選択を知らせた。図４に示すように、血清力価レベルはＣＤ１マウスで最も高かったが、Ｂａｌｂ／ｃ及びＢ６／１２９マウスを含む全ての免疫化マウスが、対照（血清なし）よりも高い血清力価レベルを示した。非終端末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）採取の４日前に、１５０μｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁した５０μｇの抗体１を、腹腔内経路によって各動物（Ｎ＝１２）に注射して、抗原特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を刺激した。
【0084】
採血及び濃縮
各動物から血液を採取し、単一細胞単離及びスクリーニングのために処理した。表１に、各マウスから採取したマウス系統及び血液量を列挙する。
各動物から血液を採取し、単一細胞単離及びスクリーニングのために処理した。表１に、各マウスから採取したマウス系統及び血液量を列挙する。
【0085】
【表1】
【0086】
次いで、採取した採血を処理して、Ｂ細胞プールを濃縮した。まず、赤血球（ＲＢＣ）、血小板、及び血清血漿を、ＲｅｄＳｉｆｔ細胞プロセッサー機器（Ａｖｉｖａ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｒｐ．、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を用いて、採取した血液から除去した。次いで、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＢ細胞単離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）を、製造業者の手順に従って実行し、Ｂ細胞をさらに濃縮した。細胞表面ＩｇＭを発現するナイーブＢ細胞を効果的に除去するために、社内で作製したラットの抗マウスＩｇＭ ｍＡｂ（クローン８Ｍ３．１）を使用する追加のステップを行った。この追加のステップにより、ＡＳＣ集団内の抗原に特異的なクラススイッチＩｇＧ分泌細胞のさらなる濃縮が可能になった。
【0087】
濃縮Ｂ細胞プールを蛍光標識した抗ＣＤ１３８抗体とともにインキュベートして、プラズマＢ細胞系統の細胞を標識した。高レベルのＣＤ１３８発現がＰＢＭＣ由来のＢ細胞からのＩｇＧ分泌の最も信頼できる指標であることが証明されているが、本明細書では他の細胞表面マーカー（例えば、Ｂ２２０、ＣＤ１９、ＩｇＧ．ＴＡＣＩ、ＳＬＡＭ７、ＢＣＭＡ、ＣＤ９８、ＳＣＡ－１、Ｌｙ６Ｃ１／２など）又はマーカーの組み合わせを、目的の特異的Ｂ細胞集団を特定するために使用し得ることが企図されている。Ｔｅｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ４７（８）：１２７６－１２７９（２０１７）。
【0088】
単一細胞スクリーニングアッセイ
次に、蛍光標識された細胞を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォーム（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いてＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）にロードした。プラットフォームは、個々のＢ細胞をｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰ）によりＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップの個別のペンへと操作する。チップは３５１３個の個々のペンを有し、各ペンは、約７４０ピコリットルの容量と固有のペン識別番号を有する。チップにロードしたＡＳＣを、ＣＤ１３８の発現によって、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームのオンボード光学系を用いて特定した。この技術を用いて、個々のＢ細胞によって分泌された抗体が単離されるように、個々のＢ細胞をチップの別個のペンに隔離した。１つのＢ細胞によって産生及び分泌された抗体は、別のＢ細胞によって産生及び分泌された抗体と混合されなかった。この「１つペンに１つのＡＳＣ」という関係により、単一のＢ細胞によって産生された抗体の表現型特徴付けが可能になり、ＡＳＣは特定の遺伝子型を有するので、表現型と遺伝子型の関連付けを行うことができる。ペンの容積が極めて小さく、形質芽球及びプラズマ細胞の分泌速度が速いため（ＷｅｎｅｒＦａｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３（８）：２０３８－２０４０（１９９３））、各ペン内のＡＳＣ由来の抗体濃度は急速に上昇した。選択抗体の所望の特徴（例えば、表現型）のスクリーニングに十分に可能なレベルの抗体は、５～１５分以内に到達した。
次に、蛍光標識された細胞を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォーム（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）を用いてＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）にロードした。プラットフォームは、個々のＢ細胞をｏｐｔｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ（ＯＥＰ）によりＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップの個別のペンへと操作する。チップは３５１３個の個々のペンを有し、各ペンは、約７４０ピコリットルの容量と固有のペン識別番号を有する。チップにロードしたＡＳＣを、ＣＤ１３８の発現によって、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームのオンボード光学系を用いて特定した。この技術を用いて、個々のＢ細胞によって分泌された抗体が単離されるように、個々のＢ細胞をチップの別個のペンに隔離した。１つのＢ細胞によって産生及び分泌された抗体は、別のＢ細胞によって産生及び分泌された抗体と混合されなかった。この「１つペンに１つのＡＳＣ」という関係により、単一のＢ細胞によって産生された抗体の表現型特徴付けが可能になり、ＡＳＣは特定の遺伝子型を有するので、表現型と遺伝子型の関連付けを行うことができる。ペンの容積が極めて小さく、形質芽球及びプラズマ細胞の分泌速度が速いため（ＷｅｎｅｒＦａｖｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２３（８）：２０３８－２０４０（１９９３））、各ペン内のＡＳＣ由来の抗体濃度は急速に上昇した。選択抗体の所望の特徴（例えば、表現型）のスクリーニングに十分に可能なレベルの抗体は、５～１５分以内に到達した。
【0089】
関連する抗原特異的抗体（選択抗体）を発現するＡＳＣは、一連の反復均質スクリーニングを用いて特定され得る。選択抗体の所望の抗体特性に応じて、これらのスクリーニングは、簡単な結合アッセイ（例えば、抗原結合、種交差反応性など）であっても、さらなる設計目標（例えば、リガンド遮断、競合、機能など）を達成する抗体を特定するように設計されてもよい。ここでは、抗体１（選択抗体）に対する抗ＩＤ ａｂを分泌するＡＳＣを特定するために、均質なビーズベースの競合アッセイを行った。アッセイを図５Ａ～５Ｃに示す。このアッセイでは、３．２μｍポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）に結合させた抗マウスＩｇＧ抗体（抗ｍｕ ＩｇＧ）を含む捕捉試薬を、蛍光Ａで標識した抗マウスＩｇＧを含む検出試薬、蛍光Ｂで標識した抗体１を含む標識標的、及び過剰のヒト血清（１０％正常ヒト血清）と混合した。図５Ａを参照されたい。血清は、競合的結合条件を提供するために含めた。特定の理論に束縛されるものではないが、そのような競合的結合条件下では、所望の治療用ＩｇＧパラトープの外側のエピトープに特異的な抗体が標識標的（蛍光Ｂ標識抗体１）に結合しない。
【0090】
次いで、このアッセイ混合物を、個々に隔離されたＡＳＣを含有する各ペンの口にビーズが配置されるように、チップマイクロ流体チャネルに流した（図５Ｂ）。次いで、抗体を分泌した細胞を含有するペンを、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォーム（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）の蛍光撮像機能、及び蛍光Ａを検出可能なフィルターを用いて検出した。ＡＳＣ由来の抗体レベルが増加するにつれて、それらは、ペンの口から拡散し、そこで捕捉試薬によって捕捉（及び濃縮）された。ビーズに結合した抗体の量が増加すると、次に、蛍光Ａに結合した抗マウスＩｇＧ抗体が濃縮され、目的のペン（ＩｇＧ抗体を分泌するＡＳＣを含有するペン；図５Ｃ）の口に集中した特徴的な蛍光「ブルーム」パターンが生じる。ＩｇＧ抗体を分泌するＡＳＣを保持する８２個のペンが、蛍光Ａブルームによって特定され、それらのペン識別番号を記録した。抗体１（選択抗体）に特異的な抗体を分泌するＡＳＣを特定するために、第２の蛍光フィルターキューブを使用して、蛍光Ｂシグナルを検出した。ヒト血清の存在下で標識標的に結合する抗体１に特異的な選択抗体を発現する２３個のＡＳＣを、蛍光Ｂブルームによって示された（図５Ｃ）。
【0091】
配列決定、クローニング、及び組換え発現
選択抗体を検証するために、ＯＥＰを使用して２３個のＡＳＣをＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップのペンから個々に移動させ、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームの統合マイクロ流体を使用して、細胞溶解緩衝液を含有する標準的な９６ウェルプレートの別々のウェルにエクスポートした（図６）。各ウェルのＡＳＣによって産生された抗体について、対応する抗体重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変領域の配列を、Ｗｉｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９（前掲）に実質的に記載されているプロトコルに従って、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。次いで、配列を、抗体定常領域を有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。１つのベクターはＨＣ可変領域及び抗体定常領域を担持し、第２のベクターはＬＣ可変領域及び抗体定常領域を担持した。次いで、組換え抗体ＨＣ／ＬＣ対を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、可溶性抗体として培養上清中に発現させた。
選択抗体を検証するために、ＯＥＰを使用して２３個のＡＳＣをＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップのペンから個々に移動させ、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームの統合マイクロ流体を使用して、細胞溶解緩衝液を含有する標準的な９６ウェルプレートの別々のウェルにエクスポートした（図６）。各ウェルのＡＳＣによって産生された抗体について、対応する抗体重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）可変領域の配列を、Ｗｉｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９（前掲）に実質的に記載されているプロトコルに従って、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによって決定した。次いで、配列を、抗体定常領域を有する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。１つのベクターはＨＣ可変領域及び抗体定常領域を担持し、第２のベクターはＬＣ可変領域及び抗体定常領域を担持した。次いで、組換え抗体ＨＣ／ＬＣ対を２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、可溶性抗体として培養上清中に発現させた。
【0092】
次いで、培養上清中の抗体を、Ｗｉｎｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９（前掲）に実質的に記載され、図７Ａに示されているように、ヒト血清の存在下で、サンドイッチＥＬＩＳＡによって、抗体１への結合について試験した。この方法を用いて、所望の特徴を有し、抗体１に対し抗ＩＤ抗体として作用し得る９つの抗体を特定した。９つの抗ＩＤ候補のうち、単一抗体（Ａｂ２８７）が、臨床患者試料において０．５ｎｇ／ｍｌの潜在的な定量下限（ＬＬＯＱ）を示す最良のプロファイルを有した。異なる供給源からの血清の存在下でのサンドイッチＥＬＩＳＡにおけるＡｂ２８７の能力を図７Ｂに示す。抗体１のパラトープに結合する抗ＩＤについて予想されるように、抗ＩＤ抗体Ａｂ２８７は、抗体１がその標的（ＰＤ－１）に結合するのを、２３３．９ｎＭのＥＣ５０で阻止した（図７Ｃ）。Ａｂ２８７は、臨床試料中の遊離生物活性抗体１を測定すると予想され、したがって、さらなる開発のために選択された。
【0093】
実施例２
この実施例では、マウスにおける選択抗体の産生をモニターする別の例示的な方法を記載する。
この実施例では、マウスにおける選択抗体の産生をモニターする別の例示的な方法を記載する。
【0094】
免疫化プロトコル
この実施例では、選択抗体は抗ヒトＥＧＦＲ抗体であった。ＣＤ１マウスを、ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）の可溶性細胞外ドメインで、２週間隔で合計４回の免疫化を行った。最初の免疫は、１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化した５０μｇのヒトｈｕＥＧＦＲからなり、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射された。１４日後、２５μｇのｈｕＥＧＦＲを２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。３回目の免疫化は１４日後に送達され、ｈｕＥＧＦＲの総量を１５μｇに減少させた以外は、２回目と同じ経路及びアジュバントとした。４回目のブーストは、アジュバントの非存在下で５０μｇのｈｕＥＧＦＲを含有し、皮下経路及び腹腔内経路の両方で送達された。
この実施例では、選択抗体は抗ヒトＥＧＦＲ抗体であった。ＣＤ１マウスを、ヒトＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）の可溶性細胞外ドメインで、２週間隔で合計４回の免疫化を行った。最初の免疫は、１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化した５０μｇのヒトｈｕＥＧＦＲからなり、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射された。１４日後、２５μｇのｈｕＥＧＦＲを２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。３回目の免疫化は１４日後に送達され、ｈｕＥＧＦＲの総量を１５μｇに減少させた以外は、２回目と同じ経路及びアジュバントとした。４回目のブーストは、アジュバントの非存在下で５０μｇのｈｕＥＧＦＲを含有し、皮下経路及び腹腔内経路の両方で送達された。
【0095】
採血及び濃縮
最終ブーストの１～８日後に血液を採取した。製造業者の手順に従って、磁気ＣＤ１３８陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、ＡＳＣを濃縮した。
最終ブーストの１～８日後に血液を採取した。製造業者の手順に従って、磁気ＣＤ１３８陽性選択キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｃａｎａｄａ）を用いて、ＡＳＣを濃縮した。
【0096】
単一細胞スクリーニングアッセイ
濃縮したＢ細胞を、ビーズに結合させたヤギ抗ヒトＦｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ４８８で標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体を含む検出試薬、及び赤色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ５９４で標識したＥＧＦＲを含む標識標的と混合した。次いで、この混合物を３８４ウェルプレートの単一ウェルに移し、混合物の成分を約１０分間、ウェル中に静置させた。
濃縮したＢ細胞を、ビーズに結合させたヤギ抗ヒトＦｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ４８８で標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体を含む検出試薬、及び赤色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ５９４で標識したＥＧＦＲを含む標識標的と混合した。次いで、この混合物を３８４ウェルプレートの単一ウェルに移し、混合物の成分を約１０分間、ウェル中に静置させた。
【0097】
特異的ＡＳＣを特定するために、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて、細胞の撮像を行った。図８Ａは、抗体分泌を示す緑色蛍光シグナルの例示的な画像を提供し、図８Ｂは、抗体の抗原特異性を実証する赤色蛍光シグナルの例示的な画像を提供する。図８Ｃは、図８Ａ～８Ｂに示した同じウェルの例示的な分析合成画像を提供し、抗体分泌を示す緑色蛍光シグナルはマゼンタで示され、赤色蛍光シグナルはシアンで示され、緑色及び赤色シグナルの重なりはロイヤルブルーで示されている。この撮像アッセイから、１０個の細胞が抗体分泌を示すことがわかり、１個の細胞のみが抗原（ＥＧＦＲ）特異的である分泌抗体として示された。
【0098】
実施例３
この実施例では、選択ＡＳＣを特定するための別の単一細胞撮像アッセイを記載し、標的は、その天然の構造で細胞により発現される。
この実施例では、選択ＡＳＣを特定するための別の単一細胞撮像アッセイを記載し、標的は、その天然の構造で細胞により発現される。
【0099】
抗ＣＢ－１抗体を産生させるために、マウスをＣＢ－１で免疫化した。免疫化したマウスから血液試料を採取し、次いで、実質的に実施例２に記載されるように、ＩｇＧ分泌Ｂ細胞を濃縮した。２９３ｆｅｃｔｉｎを用いて完全長ＣＢ１をコードするベクターでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を、培養培地で洗浄し、次いで、４０μｍストレーナーに通した。次いで、濃縮Ｂ細胞、ＣＢ－１発現２９３Ｔ細胞、及びＡｌｅｘａ ４８８で標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体の混合物をウェルに添加し、単層として定着させた。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ撮像システムを用いて、トランスフェクトされた細胞表面の蛍光シグナルを検出し、特異的ＡＳＣを特定した。図８Ｄは、２９３Ｔ細胞によって発現された抗原が、Ｂ細胞によって産生され、Ａｌｅｘａ ４８８で標識されたヤギ抗ヒトＦｃ抗体で標識された抗体に結合する、複数の蛍光スポットを有する標識されたトランスフェクト細胞の例示的な画像である。これらの結果により、濃縮Ｂ細胞プールがＣＢ－１に特異的な抗体を分泌する細胞を含有することが実証された。
【0100】
実施例４
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する例示的な方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、ＴＮＦ－アルファに特異的なヒト－カニクイザル交差反応性ＩｇＧ抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する例示的な方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、ＴＮＦ－アルファに特異的なヒト－カニクイザル交差反応性ＩｇＧ抗体である。
【0101】
ヒト－カニクイザル交差反応性抗体を産生するために、動物を、抗原のヒト及びカニクイザルバージョンの交互ブーストで免疫化する。この免疫化方法は、ヒト抗原とカニクイザル抗原との間で共有されるエピトープが各ブースト中に免疫系に一貫して提示され、交差反応性抗体をコードする関連するＢ細胞の持続的刺激を可能にするという仮定に基づいている。各抗原に対する反応性は、簡単な結合アッセイと、免疫化した動物からのポリクローナル血清とを用いて、容易にモニターすることができる。しかしながら、動物は両抗原で免疫されており、個々の抗原は共通のエピトープと固有のエピトープの両方を有するので、ポリクローナル血清は、ヒト抗原に反応する抗体、カニクイザル抗原に反応する抗体、並びに／又はヒト抗原及びカニクイザル抗原に反応する抗体を含有する。ポリクローナル血清のアッセイにより、交差反応性抗体の存在を決定することはできない。ＰＢＭＣ集団に由来する単離された単一ＡＳＣを調べることにより、この問題は克服される。単一細胞アッセイは、真に交差反応性を示す抗体を分泌するＡＳＣをスクリーニングする。
【0102】
免疫化プロトコル
完全な免疫化キャンペーンは４回の注射からなり、５０日間にわたって２週間隔で送達される。１回目及び３回目の注射には、完全フロイントアジュバント、続いてＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（カタログ番号Ｓ６３２２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で乳化した組換えヒトＴＮＦ－アルファ（カタログ番号３００－０１Ａ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）；Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を使用する。２回目及び４回目の注射には、完全フロイントアジュバント、続いてＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（カタログ番号Ｓ６３２２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で乳化した組換えカニクイザルＴＮＦ－アルファ（カタログ番号ＲＰ１０２１Ｙ－００５、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を使用する。１回目の注射では、約５０μｇのヒトＴＮＦをアジュバントに懸濁し、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射する。１４日後、アジュバントに懸濁した５０μｇのカニクイザルＴＮＦを用いた２回目の注射を、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射した。２回目の注射の１４日後、２５μｇのヒトＴＮＦを含む３回目の注射を２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。１４日後、２５μｇのカニクイザルＴＮＦを含む４回目の注射を２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。抗原反応性を確認し、非終端抗体創製のための動物選択を知らせるために、各マウスからの血清力価のブリッジングＥＬＩＳＡ分析を行う。非終端末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）採取の４日前に、１５０μｌのＰＢＳ中に懸濁させた２５μｇのヒトＴＮＦ及び２５μｇのカニクイザルＴＮＦを含む溶液を、各動物（Ｎ＝１２）に腹腔内経路により注射して、抗原特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を刺激する。
完全な免疫化キャンペーンは４回の注射からなり、５０日間にわたって２週間隔で送達される。１回目及び３回目の注射には、完全フロイントアジュバント、続いてＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（カタログ番号Ｓ６３２２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で乳化した組換えヒトＴＮＦ－アルファ（カタログ番号３００－０１Ａ；ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ（登録商標）；Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、ＮＪ）を使用する。２回目及び４回目の注射には、完全フロイントアジュバント、続いてＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）（カタログ番号Ｓ６３２２；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）で乳化した組換えカニクイザルＴＮＦ－アルファ（カタログ番号ＲＰ１０２１Ｙ－００５、Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．、Ｓｔ．Ｐａｕｌ、ＭＮ）を使用する。１回目の注射では、約５０μｇのヒトＴＮＦをアジュバントに懸濁し、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射する。１４日後、アジュバントに懸濁した５０μｇのカニクイザルＴＮＦを用いた２回目の注射を、各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射した。２回目の注射の１４日後、２５μｇのヒトＴＮＦを含む３回目の注射を２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。１４日後、２５μｇのカニクイザルＴＮＦを含む４回目の注射を２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍに懸濁し、この混合物の１００μｌを各マウスの背側の２つのスポットに皮下注射し、残りの１００μｌを腹腔内注射した。抗原反応性を確認し、非終端抗体創製のための動物選択を知らせるために、各マウスからの血清力価のブリッジングＥＬＩＳＡ分析を行う。非終端末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）採取の４日前に、１５０μｌのＰＢＳ中に懸濁させた２５μｇのヒトＴＮＦ及び２５μｇのカニクイザルＴＮＦを含む溶液を、各動物（Ｎ＝１２）に腹腔内経路により注射して、抗原特異的抗体分泌細胞（ＡＳＣ）を刺激する。
【0103】
採血及び濃縮及び単一細胞スクリーニングアッセイ
血液を各マウスから採取し、実質的に実施例１に記載されているようにＢ細胞を濃縮する。標識した細胞を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームを使用してＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）にロードし、個々のＢ細胞によって分泌される抗体が単離されるように、個々のＢ細胞をチップの個別のペンに隔離する。
血液を各マウスから採取し、実質的に実施例１に記載されているようにＢ細胞を濃縮する。標識した細胞を、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームを使用してＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ Ｌｉｇｈｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ、ＣＡ）にロードし、個々のＢ細胞によって分泌される抗体が単離されるように、個々のＢ細胞をチップの個別のペンに隔離する。
【0104】
選択抗体（ヒトＴＮＦ及びカニクイザルＴＮＦに反応する抗ＴＮＦ抗体）を分泌するＡＳＣを特定するために、実施例１に記載の均質なビーズベースの競合アッセイを実施する。まず、抗マウスＩｇＧに結合したビーズを含む捕捉試薬を、蛍光Ａ標識抗マウスＩｇＧを含む検出試薬、蛍光Ｂで標識したヒトＴＮＦを含む標識標的、及び過剰のヒト血清と混合する。次いで、このアッセイ混合物を、個々に隔離されたＡＳＣを含有する各ペンの口にビーズが配置されるように、チップマイクロ流体チャネルに流す。蛍光Ａブルームは、ＩｇＧ抗体を分泌するＡＳＣを保持するペンを示し、一方、蛍光Ｂブルームは、ヒトＴＮＦに結合する抗体を分泌するＡＳＣを保持するペンを示す。各ブルームタイプによって示されたペンのペンＩＤ番号を確認し、記録する。
【0105】
ビーズベースのアッセイの第２部では、蛍光Ｃで標識したカニクイザルＴＮＦを含む検出試薬を添加する。蛍光Ｃブルームは、カニクイザルＴＮＦに結合する抗体を分泌するＡＳＣを保持するペンを示す。蛍光Ｃブルームで示されたペンドのペンＩＤ番号を記録する。
【0106】
３つ全てのブルーム（蛍光Ａブルーム、蛍光Ｂブルーム、及び蛍光Ｃブルーム）が陽性であると記載されたペンを、選択抗体を分泌する候補ＡＳＣとして選択する。候補ＡＳＣを、ＯＥＰを使用してＯｐｔｏＳｅｌｅｃｔ（商標）チップのペンから個別に移動させ、実質的に実施例１に記載されるように、Ｂｅａｃｏｎ（登録商標）オプトフルイディックプラットフォームの統合マイクロ流体を使用して、細胞溶解緩衝液を含有する標準的な９６ウェルプレートの個別のウェルにエクスポートする。各候補ＡＳＣによって産生された抗体のＨＣ及びＬＣ可変領域を、単一細胞ＲＴ－ＰＣＲによって決定する。配列をベクターにクローニングし、次いで、ベクターを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。培養上清中の抗体を回収し、次いで、機能アッセイにおいてヒトＴＮＦ及びカニクイザルＴＮＦに対する交差反応性を試験する。
【0107】
３つのブルームの全てが陽性であるペンがない場合、蛍光Ａブルーム及び蛍光Ｂブルームについて二重陽性であるペンを特定する。或いは、蛍光Ａブルーム及び蛍光Ｃブルームについて二重陽性であるペンを特定する。血液が二重陽性ペンのＡＳＣを含有するマウスを、第２の免疫化キャンペーンのために選択する。蛍光Ａ及び蛍光Ｂの二重陽性ＡＳＣが得られたマウスでは、第２の免疫化キャンペーンは第１のキャンペーン（上記）と同じ免疫化キャンペーンを含むが、１回目及び３回目の注射は半分の量のヒトＴＮＦで実施される。
【0108】
蛍光Ａ及び蛍光Ｃの二重陽性ＡＳＣが得られたマウスでは、第２の免疫化キャンペーンは第１のキャンペーン（上記）と同じ免疫化キャンペーンを含むが、２回目及び４回目の注射は半分の量のカニクイザルＴＮＦで実施される。
【0109】
免疫化に続く全てのステップ（血液採取からビーズベースのアッセイまで）を、その後、この実施例に記載されるように実施する。３つのブルームの全て（蛍光Ａブルーム、蛍光Ｂブルーム、及び蛍光Ｃブルーム）が陽性であると記載されたペンを、標的表現型を有する抗体を分泌する候補ＡＳＣとして選択する。可変領域を配列決定し、ベクターにクローニングし、ベクターを組換え抗体産生のために細胞にトランスフェクトし、組換えにより産生された抗体を標的表現型について試験する。
【0110】
三重陽性ペンが依然として確認されない場合、第３の免疫化キャンペーンを設計し、第２の免疫化キャンペーンを受けた同じマウスに対して実施する。第３の免疫化キャンペーンでは、蛍光Ａ／蛍光Ｂ二重陽性のマウスに対して、２回目及び４回目の注射をカニクイザルＴＮＦの量を増加させて実施し、１回目及び３回目の注射をヒトＴＮＦの量を半分又は４分の１にして実施し、蛍光Ａ／蛍光Ｃ二重陽性のマウスに対して、１回目及び３回目の注射をヒトＴＮＦの量を増加させて実施し、２回目及び４回目の注射をカニクイザルＴＮＦの量を半分又は４分の１にして実施する。第３のキャンペーンに続いて、免疫化に続く全てのステップ（血液採取からビーズに基づくアッセイまで）を、その後、この実施例に記載されるように続いて実施する。３つのブルームの全て（蛍光Ａブルーム、蛍光Ｂブルーム、及び蛍光Ｃブルーム）が陽性であると記載されたペンを、標的表現型を有する抗体を分泌する候補ＡＳＣとして選択する。第３のキャンペーン後に三重陽性ペンが依然として確認されない場合、第４の免疫化キャンペーンを設計し、実施する。このプロセスを、標的表現型を有する抗体が確認されるまで繰り返す。
【0111】
この方法は、有利には、長期の生Ｂ細胞プロファイリングの能力を提供し、レパトアステアリングを可能にする。免疫動物の発達中のＢ細胞応答をリアルタイムでモニターし、この情報を用いて免疫化戦略を反復的に改変する。この方法は非終端であるため、動物を殺さずに、免疫系の力を活用して、望ましい結果に向けてＢ細胞応答を進化させ続けることができる。免疫化戦略の改変には、（以下に限定されないが）異なる形態の免疫原、アジュバント、免疫調節剤、抗原の用量、免疫化のタイミング、及び投与経路が含まれる。このシナリオでは、ヒト抗原を使用する最初の免疫化の試みは、ＰＢＭＣの非終端ＡＳＣスクリーニングによって決定されるように、カニクイザル抗原と交差反応する抗体を産生するＢ細胞を誘発することができなかった。この方法は、レパトア品質情報を提供するので、免疫化戦略の改変に使用することができる。この実施例では、免疫原をヒト抗原からカニクイザルオルソログに切り替えることができ、交差反応性抗体を発現するＢ細胞が特定されるまで免疫化キャンペーンを継続した。所望のＢ細胞レパトアを誘発した動物は、従来の戦略又は本明細書に記載されるような非終端ＡＳＣ法を使用して、抗体生成のために使用することができる。
【0112】
実施例５
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する別の方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、抗原Ｘに特異的なヒト－カニクイザル交差反応性ＩｇＧ抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する別の方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、抗原Ｘに特異的なヒト－カニクイザル交差反応性ＩｇＧ抗体である。
【0113】
この実施例では、抗原Ｘのヒトオルソログ及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ）（カニクイザル（ｃｙｎｏ））オルソログの両方に交差反応する抗体の特定を記載する。オルソログは低い配列相同性を有し、したがって、交差反応性抗体の生成は稀である。１つの抗原による免疫化は、いくらかの交差反応性抗体を産生し得るが、それらは標準血清力価の検出レベル未満であろう。或いは、ヒト抗原及びカニクイザル抗原の両方による同時免疫化は、主にヒトオルソログ又はカニクイザルオルソログに結合する抗体を生成するが、交差反応するものはほとんどない。標準的な血清力価は、交差反応性抗体を生成したマウスと、ヒト抗原又はカニクイザル抗原に独立して結合する抗体を生成したマウスとを区別しない。したがって、応答マウスにおける真の交差反応性抗体を特定するために、単一細胞スクリーニングが必要である。これは、効率的な回収のために、目的のＢ細胞の選択的増幅と組み合わせられる。
【0114】
ヒト型の抗原Ｘを用い、２週間隔で合計４回の注射で、マウスを免疫する。最初のブーストでは、５０μｇのヒト抗原Ｘを１００μｌの完全フロイントアジュバント中に乳化し、混合物を皮下投与する。１４日後、２５μｇのヒト抗原Ｘを２００μｌのＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ中に懸濁し、１００μｌを皮下注射し、１００μｌを腹腔内注射する。３回目の注射では、１５μｇのヒト抗原ＸをＳｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎ ｓｙｓｔｅｍ中に乳化し、２回目のブーストについて記載したように、皮下及び腹腔内の両方に注射する。５０μｇのヒト抗原Ｘの最終ブーストを、アジュバントなしで腹腔内注射する。
【0115】
血液を、最終ブーストの４日後にげっ歯類体重の１０％の最終体積で採取する。ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を磁気的に単離し、ビーズに結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を含む捕捉試薬、Ａｌｅｘａ４８８で標識した抗ヒトＩｇＧ抗体を含む検出試薬、並びに別個に標識した蛍光ヒト抗原Ｘ及びカニクイザル抗原Ｘの混合物に加える。この混合物をマイクロタイタープレートに単層としてプレーティングし、次いで、インキュベートして、抗体及び抗原捕捉を可能にする。抗原特異的交差反応性ＡＳＣを、実質的に実施例２に記載されるように、細胞撮像を用いて二重染色蛍光プラークとして特定する。
【0116】
次いで、交差反応性抗体を分泌するＢ細胞を産生した動物を、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と組み合わせたカニクイザル抗原及びヒト抗原の皮下への交互投与で、さらに４週間、１週間に１回、免疫化する。最後のブーストの３日後に血液を採取し、ヒト抗原及びカニクイザル抗原に対するスクリーニングのためにＢ細胞を単離する。
【0117】
交差反応性抗体の数が増加したと確認された動物を、組織採取及び抗体生成のために安楽死させる。対単反応性抗体に対する交差反応性抗体の比率が低い動物を、抗原Ｘのヒトオルソログ及びカニクイザルオルソログの別の用量でさらに３週間免疫化し、その後、交差反応性抗体について単一細胞スクリーニングする。このプロセスを、選択抗体（ヒト－カニクイザル交差反応性抗体）を産生するＡＳＣの閾値％が満たされるまで継続する。
【0118】
記載したこの方法は、タンパク質の複数のオルソログ又はパラログに対する交差反応性を必要とする任意の抗体創製キャンペーンに適用し得る。異なる種に交差反応する抗体を生成することを必要とすることは、有効性及び安全性の研究のためにはよくあることである。単一Ｂ細胞スクリーニングは、一般的な例として、ラット、ウサギ、モルモット、イヌ、ネコ又はブタに対する交差反応性を必要とするプログラムに適用することができる。
【0119】
実施例６
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、タンパク質、抗原Ｘの１つのパラログのみに結合するが、密接に関連するファミリーメンバー、抗原Ｙには結合しない抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、タンパク質、抗原Ｘの１つのパラログのみに結合するが、密接に関連するファミリーメンバー、抗原Ｙには結合しない抗体である。
【0120】
抗原Ｘと抗原Ｙとの間の類似性により、抗原Ｘで免疫化された動物は、両タンパク質に対してポリクローナル血清交差反応性を示す。したがって、目的のファミリーメンバーに対し偏った抗体応答を生じる可能性のあるマウスを特定するために、直接単一細胞スクリーニングが必要とされる。抗原Ｘのみに反応する抗体を産生するＢ細胞の生成が最大になるように免疫応答をステアリングするために、選択された動物を、別の免疫化プロトコルを用いてさらに免疫化する。
【0121】
げっ歯類に抗原Ｘを週２回４週間にわたって皮下投与することにより免疫化する。プライミング免疫原複合体は、フロイント完全アジュバントと組み合わされた１０μｇの抗原を含有し、一方、ブースティング複合体は、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と組み合わされた５μｇの抗原を含有する。最後のブーストの４日後、血液を採取し、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を血清から分離する。
【0122】
細胞を、実施例１に記載されるように単一細胞アッセイによってアッセイし、蛍光Ａタグ付き抗原Ｘを使用して抗原Ｘへの結合についてスクリーニングし、且つ／又は蛍光Ｂ標識抗原Ｙを使用して抗原Ｙへの結合についてスクリーニングする。抗原Ａブルームは、抗原Ｘに特異的な抗体を分泌するＡＳＣ分泌抗体を含有するペンを示し、蛍光Ｂブルームは抗原Ｙに結合する抗体を分泌するＡＳＣを含有するペンを示す。蛍光Ａブルームのみが陽性である（蛍光Ｂブルームは陽性ではない）ペンを、実質的に実施例１に記載されるように、ＯＥＰによりペンから、単一細胞ＰＣＲ用のウェルにエクスポートする。ＡＳＣによって産生された抗体を、抗原Ｘへの結合及び抗原Ｙへの非結合についてアッセイする。
【0123】
ペンが蛍光Ａブルームに対して単一陽性でない場合、抗原Ｘの保存されたドメインはバイオインフォマティクス的に特定される。動物を、保存された抗原Ｘドメインで、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と組み合わせて、週１回、皮下免疫し、３回のさらなるブーストを行う。最後のブーストの３日後にげっ歯類から採血し、実質的に実施例１に記載されるように、Ｂ細胞を濃縮する。細胞を単一細胞レベルでスクリーニングして、抗原Ｘにのみ結合し、抗原Ｙには結合しない抗体を分泌するＢ細胞を特定する。単一細胞アッセイにおいては、蛍光Ｃで標識された保存抗原Ｘドメインを標識標的として使用する。蛍光Ｃブルームは、選択抗体（抗原Ｘに特異的で、抗原Ｙと交差反応しない抗体）を分泌するＡＳＣを含有するペンを示す。
【0124】
選択抗体を発現するＢ細胞の数が改善されたげっ歯類を、組織採取のために安楽死させる。数が改善されないマウスに対し、３回目の免疫化を行う。
【0125】
実施例７
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、ヒトＰＤ－１への結合について、天然ヒトＰＤ－Ｌ１及び天然ヒトＰＤ－Ｌ２との競合に勝つ抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、ヒトＰＤ－１への結合について、天然ヒトＰＤ－Ｌ１及び天然ヒトＰＤ－Ｌ２との競合に勝つ抗体である。
【0126】
実施例６に記載されるように、ＰＤ－１抗原の用量を減少させながら、げっ歯類を週２回免疫化する。
【0127】
個々のＢ細胞をチップのペンに移し、１細胞対１ペンの比を達成する。ビーズベースのアッセイを、抗マウスＩｇＧに結合したビーズを含む捕捉試薬、蛍光Ａ標識抗マウスＩｇＧ抗体を含む検出試薬、蛍光Ｂで標識されたヒトＰＤ－１を含む標識標的、及び過剰のヒト血清を用いて実施する。次いで、このアッセイ混合物を、個々に隔離されたＡＳＣを含有する各ペンの口にビーズが配置されるように、チップマイクロ流体チャネルに流す。蛍光Ａブルームは、ＩｇＧ抗体を分泌するＡＳＣを保持するペンを示し、蛍光Ｂブルームは、ＰＤ－１に結合する抗体を分泌するＡＳＣを保持するペンを示す。蛍光Ａブルーム、蛍光Ｂブルーム、又は二重陽性蛍光Ａ及び蛍光Ｂブルームが示されたペンのペンＩＤ番号を記録する。
【0128】
ビーズベースのアッセイを２回目に実施し、今回のみ、アッセイに添加するＰＤ－Ｌ１の量を増加させる。蛍光Ａ／蛍光Ｂ二重ブルームにより、ＰＤ－１特異的抗体を産生するＡＳＣを含有するペンを特定することができ、ＰＤ－Ｌ１の存在下でのシグナル強度の維持は、組換えにより産生された抗体がＰＤ－１への結合についてＰＤ－Ｌ１との競合に勝ったことを示す。ＰＤ－Ｌ１の存在下で維持された信号強度で二重ブルームを示すペンのペン番号を記録する。
【0129】
ビーズベースのアッセイを３回目に実施し、今回のみ、アッセイに添加するＰＤ－Ｌ２の量を増加させる。蛍光Ａ／蛍光Ｂ二重ブルームにより、ＰＤ－１特異的抗体を産生するＡＳＣを含有するペンを特定することができ、ＰＤ－Ｌ２の存在下でのシグナル強度の維持は、組換えにより産生された抗体がＰＤ－１への結合についてＰＤ－Ｌ２との競合に勝ったことを示す。ＰＤ－Ｌ２の存在下で維持された信号強度で二重ブルームを示すペンのペン番号を記録する。望ましくは、ＰＤ－１への結合についてＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２の両方に勝つことができるＰＤ－１特異的抗体を産生するＡＳＣを含有すると特定されるペンが存在する。
【0130】
蛍光Ａ及び蛍光Ｂのブルームに対して二重陽性であるペンに注目し、これらのペンからの抗体のＨＣ及びＬＣの可変領域の配列を決定する。配列をベクターにクローニングし、このベクターを、組換え抗体の産生のために、２９３Ｔ細胞にトランスフェクトする。抗体を２９３Ｔ細胞培養物の上清から回収し、次いで、ＰＤ－Ｌ１の量を増加させながら、組換えＰＤ－１への結合について試験する。ここで、ＰＤ－１は、所与の波長でシグナルを発するフルオロフォアで標識されており、組換えにより産生された抗体は免疫沈降アッセイにおけるようにビーズに結合する。標識されたＰＤ－１は、ビーズに結合した抗体と混合される。ビーズを非特異的結合のために洗浄する。標識されたＰＤ－１及び組換え産生された抗体を含む免疫複合体は、所与の波長でシグナルを検出することにより、検出される。次いで、この手順を、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２の量を増加させながら実施する。ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２の存在下でのシグナル強度の維持は、組換えにより産生された抗体がＰＤ－１への結合についてＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２との競合に勝ったことを示す。
【0131】
ＰＤ１に結合するが、ＰＤ－Ｌ１又はＰＤ－Ｌ２と完全には競合しないＢ細胞を産生する動物を、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と組み合わせた２．５μｇのＰＤ１で免疫し、３回のさらなるブーストを行う。最後のブーストの３日後にマウスから採血し、単離されたＢ細胞を上記のようにスクリーニングする。
【0132】
実施例８
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この例では、選択抗体は、抗原Ｘに特定の結合親和性を有する抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この例では、選択抗体は、抗原Ｘに特定の結合親和性を有する抗体である。
【0133】
この実験の目的は、ピコモル未満の親和性で抗原Ｘに結合する抗体を特定することである。親和性は、抗体のクローン源でのみ測定することができ、したがって、血清は、高親和性抗体を生成したマウスを特定するために使用することはできない。従来、マウスを安楽死させて、ハイブリドーマ融合及び特徴付けのためのＢ細胞を得て、さらなる免疫ステアリングを全て排除している。リアルタイムの非終端Ｂ細胞採取及び調査を適応免疫化戦略と組み合わせることは、競合的なインビボ環境を利用して、より高い親和性のＢ細胞クローンを進化させ誘導するので、高親和性抗体を生成するための従来の方法を超える大きな利点を提供する。
【0134】
げっ歯類を、２週間ごとに合計４回のブーストで、抗原Ｘの投与量を減少させて皮下免疫する。プライミング免疫原は、フロイント完全アジュバントと組み合わされた４０μｇの抗原Ｘを含有する。その後の３回のブーストは、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍｓ（登録商標）と組み合わせて、２０μｇ、１０μｇ又は５μｇの抗原Ｘを含有する。最終ブーストの４日後、血液をげっ歯類から採取し、この採取した血液試料のＢ細胞を、実質的に実施例１に記載されるように濃縮する。実質的に実施例１に記載されているように、マイクロ流体デバイスを用いて細胞をペンニングし、蛍光標識された抗原Ｘへの結合についてスクリーニングする。抗抗原Ｘ抗体を産生するＡＳＣを特定し、続いて、分子回収のために、ペンからウェルに移し、組換えクローンの親和性を、実質的に実施例１に記載されているように決定する。
【0135】
ＫｉｎＥｘＡ（Ｓａｐｉｄｙｎｅ）又はＣａｒｔｅｒｒａハイスループットスクリーニングデバイス（Ｃａｒｔｅｒｒａ）によって、親和性を決定する。
【0136】
次いで、高親和性抗体を発現するＢ細胞を生成した動物を、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と組み合わせた２．５μｇの抗原で週１回ブーストし、３回のさらなるブーストを行う。最後のブーストの３日後にマウスから採血し、単離されたＢ細胞を、実質的に実施例１に記載されているように、抗原Ｘへの結合についてスクリーニングする。
【0137】
次いで、配列決定、クローニング、発現、及び親和性特徴付けの別のラウンドのために、Ｂ細胞をエクスポートする。親和性バーに合致するＢ細胞を有するげっ歯類を組織採取のために安楽死させる。親和性要件を満たさないＢ細胞を生成したげっ歯類を、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）と組み合わせた２．５μｇの抗原で週１回ブーストし、３回のさらなるブーストを行う。設計目標が達成されるまで、動物をスクリーニングし、ブーストする。１回のスクリーニングのラウンドにおいて、濃縮されたＢ細胞を、標識標的がＥＧＦＲの代わりにＡｌｅｘａ ５９４で標識した抗原Ｘを含むことを除いて、実施例２に記載の単一細胞アッセイに供する。シグナルの重なりを示すスポットは、抗原Ｘに特異的な抗体を分泌するＡＳＣを特定する。単一細胞撮像アッセイを、Ａｌｅｘａ ５９４で標識した抗原Ｘの量未満の約１０分の１の、Ａｌｅｘａ ４８８で標識した抗原Ｘの量で繰り返す。（Ａｌｅｘａ ５９４及びＡｌｅｘａ ４８８からの）シグナルの重なりを保持するスポットは、抗原Ｘに対してより高い親和性を示し、したがって、標的に対して所望の高い親和性を示す。
【0138】
実施例９
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体はドメイン特異的抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体はドメイン特異的抗体である。
【0139】
この実施例は、マルチドメインヒトタンパク質、プロテインＺのドメイン１に対する抗体の特定を記載する。プロテインＺの完全細胞外ドメインによる免疫化は、不均衡な免疫応答を生じ、一部のドメインは非常に過剰に発現し、ドメイン１抗体はポリクローナル血清力価レベルで検出不能である。ドメイン１単独での免疫化は、天然の細胞外ドメインを認識することができる抗体を生成しない。タンパク質の天然の細胞外ドメインでの免疫化の後に稀なドメイン１抗体を生成したマウスを特定するには、単一細胞スクリーニングが必要とされる。これらのＢ細胞は、ドメイン１反応性Ｂ細胞を増殖させるために、ドメイン１ペプチド及び全長タンパク質のその後のブースティングで増幅されるが、ペプチド単独に対するデノボ応答を生じない。
【0140】
マウスをプロテインＺで２週間の間隔をあけて合計４回のブーストで免疫化する。プライミングブーストは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中に乳化させた抗原５０μｇを含有し、皮下投与される。その後のブーストは、それぞれ２５μｇ及び１５μｇの抗原がＳＡＳ中に乳化され、半分が腹腔内に、半分が皮下に投与される。次いで、ＰＢＳ中の５０μｇの抗原でマウスをブーストし、４日後に血液を採取する。ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を単離し、ＩｇＧ捕捉ビーズと、別個に標識した蛍光ドメイン１ペプチドと、完全細胞外ドメインとの混合物に添加する。この混合物をマイクロタイタープレートに単層としてプレーティングし、次いで、実質的に実施例２に記載されるように、インキュベートして、抗体及び抗原捕捉を可能にする。ドメイン１特異的抗体を産生するＡＳＣを、細胞撮像を用いて二重染色蛍光プラークとして特定する（実施例２）。
【0141】
ドメイン１特異的Ｂ細胞を生成したマウスを、５μｇのドメイン１ペプチドで週２回、２週間にわたってブーストする。次いで、ＰＢＳ中の５０μｇの完全可溶性細胞外ドメインでマウスをブーストし、４日後に血液を採取する。マウスを、ドメイン１及び完全長タンパク質の両方への結合についてスクリーニングする。目的の動物を組織処理及びスクリーニングのために安楽死させる。このプロセスを、設計目標を達成するまで、他のマウスについて繰り返す。
【0142】
この記載の方法は、免疫応答が主に関心の低いタンパク質の領域に対するものである抗体創製キャンペーンに適用され得る。一般的な例は、抗体レパトアにおいて過剰発現する免疫優性領域を有するタンパク質である。免疫応答は、そのドメインから離れ、目的領域にステアリングする必要がある。
【0143】
実施例１０
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、多量体抗原の多量体化ドメインに結合する抗体である。
この実施例では、選択抗体を生成するために、非ヒト動物において抗体産生を誘導する方法を記載する。この実施例では、選択抗体は、多量体抗原の多量体化ドメインに結合する抗体である。
【0144】
この実験は、ヘテロ三量体膜貫通タンパク質に結合する抗体の特定を記載する。天然タンパク質による免疫化では、免疫応答を誘発することができない。可溶性ドメインのみで免疫されたマウスは免疫応答を生じるが、抗体はタンパク質の天然の立体構造を認識しない。マウスを、次第に天然の構造に近くなるように作製された以下の一連の免疫原でマウスを免疫する：免疫原１は抗原Ｘの細胞外ドメインから構成されるタンパク質を含有し、免疫原２は多量体化ドメインに結合してヘテロ三量体複合体を形成するタンパク質を含有し、免疫原３は、完全複合体をコードするＤＮＡを含有する。
【0145】
げっ歯類を、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）との複合体中の５μｇの免疫原１で皮下免疫する。動物を週２回、合計６回ブーストする。最後のブーストの４日後にマウスから血液を採取し、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を磁気的に単離する。細胞を、ＩｇＧ捕捉ビーズと、別個に標識した蛍光免疫原１及び免疫原２との混合物に添加する。この混合物をマイクロタイタープレートに単層としてプレーティングし、次いで、実質的に実施例２に記載されるように、インキュベートして、抗体及び抗原捕捉を可能にする。抗原特異的ＡＳＣを、細胞撮像を用いて二重染色蛍光プラークとして特定する（実施例２）。免疫原２と天然に交差反応する稀な抗体を生成するマウスを、さらなるステアリングのために特定する。これらのマウスに、Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）との複合体中の５μｇの免疫原２によるブーストをさらに週２回、合計６回受けさせ、応答を増幅する。最後のブーストの４日後にげっ歯類を採血し、免疫原２及び免疫原３に対する単一細胞スクリーニングのためにＢ細胞を単離する。免疫原３を認識する抗体をコードするＢ細胞を保有する動物を、完全複合体をコードするプラスミドで遺伝的に免疫する。これらのげっ歯類を、遺伝子銃弾で週２回、合計６回ブーストする。単一細胞スクリーニングのためにマウスから血液を採取し、目的のマウスを安楽死させ、組織を採取する。より弱い応答を生じるマウスをブーストし、設計目標を達成するまでスクリーニングする。
【0146】
実施例１１
この実施例では、ＡＳＣによって分泌される抗体の親和性によってＡＳＣをランク付けするための単一細胞アッセイの例示的な適用を記載する。
この実施例では、ＡＳＣによって分泌される抗体の親和性によってＡＳＣをランク付けするための単一細胞アッセイの例示的な適用を記載する。
【0147】
ＥＧＦＲ特異的抗体を産生するハイブリドーマクローンを単離し、各クローンのＥＧＦＲ結合特性を、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉プラットフォーム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）で決定した。ＥＧＦＲ結合親和性の範囲（ＫＤ４．７×１０－１０～１．１×１０－８）の抗体を産生する５つのハイブリドーマクローンを、単一細胞アッセイにおける評価のために選択した。選択されたハイブリドーマクローン及びそれぞれによって産生された抗体の結合特性を表２に列挙する。
【0148】
【表2】
【0149】
実施例２に記載されるように、表２のハイブリドーマクローンを用いて単一細胞スクリーニングアッセイを実施した。簡潔に記載すると、ハイブリドーマ１２Ｂ４．１クローンを、ビーズに結合させたヤギ抗ヒトＦｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ４８８で標識したヤギ抗ヒトＦｃ抗体を含む検出試薬、及び赤色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ５９４で標識したＥＧＦＲを含む標識標的と混合した。次いで、この捕捉試薬、検出試薬、標識標的及び１２Ｂ４．１クローンを含む混合物を、３８４ウェルプレートの単一ウェルに移した。これらのステップは、プレートの各ウェルが単一ハイブリドーマのクローンを含む混合物を含むように（例えば、１つのウェルがハイブリドーマ１Ｃ２．１クローン、１つのウェルがハイブリドーマ７Ｃ１１．１クローン、１つのウェルがハイブリドーマ２Ｇ８．１クローン、１つのウェルがハイブリドーマ１２Ｂ４．１クローン、及び１つのウェルがハイブリドーマ７．３５．４クローン）、表２のハイブリドーマクローンのそれぞれのクローンを用いて行った。混合物の成分をウェルに静置させた後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて、細胞の撮像を行い、各ウェルの６個の個々の細胞（ＡＳＣ）について、緑色蛍光及び赤色蛍光の相対蛍光単位（ＲＦＵ）値を決定した。実施例の画像を図９に示す。ＲＦＵ値を記録し、赤色ＲＦＵ（ＥＧＦＲ結合を示す）に対する緑色ＲＦＵ（ＩｇＧ分泌を示す）の比を、データの正規化のために決定した（表３）。ＩｇＧ分泌レベルは、細胞の健康、細胞周期、及びＡＳＣの他の特性によって影響され得るので、ＲＦＵの正規化は重要である。単一ハイブリドーマの６つのクローンのＲＦＵ比を平均し、比の平均として記録した（表３）。
【0150】
【表3】
【0151】
【表4】
【0152】
次いで、各ハイブリドーマの比の平均を、表２からのそのＫＤ値の関数としてプロットした（図１０）。図１０に示すように、比の平均及びＫＤ値（Ｏｃｔｅｔ（登録商標）バイオレイヤー干渉プラットフォーム（Ｓａｔｏｒｉｕｓ）で決定）は、統計的有意性（Ｒ２＝０．９３２）をもって相関した。まとめると、これらの結果は、単一クローンの正規化ＲＦＵが抗体親和性のランク付けに有用であることを示している。さらに、これらの結果は、本開示の単一細胞アッセイを使用して個々のＡＳＣのランク付けをそれらが分泌する抗体の親和性によってランク付けし得ることを示唆している。
【0153】
実施例１２
この実施例では、マウスにおける免疫応答を誘導して、抗原のヒトオルソログ及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（カニクイザル（ｃｙｎｏ））オルソログの両方に交差反応する抗体を生成する方法を記載する。この実施例では、交差反応性抗体の形成に対する異なる免疫化戦略の影響、及びそれらの変化を検出する単一細胞スクリーニング戦略の能力を調査する。この実施例はまた、免疫ステアリングにおける単一細胞アッセイの適用を実証する。
この実施例では、マウスにおける免疫応答を誘導して、抗原のヒトオルソログ及びカニクイザル（ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）（カニクイザル（ｃｙｎｏ））オルソログの両方に交差反応する抗体を生成する方法を記載する。この実施例では、交差反応性抗体の形成に対する異なる免疫化戦略の影響、及びそれらの変化を検出する単一細胞スクリーニング戦略の能力を調査する。この実施例はまた、免疫ステアリングにおける単一細胞アッセイの適用を実証する。
【0154】
免疫化
ＣＤ１マウスを、抗原のヒトオルソログで２週間ごとに免疫した。最初のブーストでは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の２５μｇのヒト抗原でマウスを皮下免疫した。２回目のブーストは、２５μｇのヒト抗原を５０％ Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）と組み合わせて含有し、半分を皮下に、半分を腹腔内に投与した。３回目の用量は、５０％ ＳＡＳと組み合わせた１５μｇのヒト抗原を含み、半分を皮下に、半分を腹腔内に投与した。マウスを１４週間休ませた後、アジュバントなしで２５μｇのヒト抗原（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）で腹腔内にブーストした。血清検査及び単細胞スクリーニングのために、ブーストの４日後に血液を採取した（図１１、採血１）。
ＣＤ１マウスを、抗原のヒトオルソログで２週間ごとに免疫した。最初のブーストでは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）中の２５μｇのヒト抗原でマウスを皮下免疫した。２回目のブーストは、２５μｇのヒト抗原を５０％ Ｓｉｇｍａ Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（ＳＡＳ）と組み合わせて含有し、半分を皮下に、半分を腹腔内に投与した。３回目の用量は、５０％ ＳＡＳと組み合わせた１５μｇのヒト抗原を含み、半分を皮下に、半分を腹腔内に投与した。マウスを１４週間休ませた後、アジュバントなしで２５μｇのヒト抗原（リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中）で腹腔内にブーストした。血清検査及び単細胞スクリーニングのために、ブーストの４日後に血液を採取した（図１１、採血１）。
【0155】
次いで、マウスを以下の２つの群に分けた：第２群は、週に１回、皮下にカニクイザル抗原でブーストすることによって、ヒト／カニクイザル交差反応性抗体の産生に向けて免疫ステアリングし、一方、第１群は、対照群として機能させ、ヒト抗原でブーストした。両群のマウスから、８回目のブーストの４日後に採血し（図１１、採血２）、血液を分析のために調製した。
【0156】
８回目のブースト後、第１群のマウスを２つのサブグループ（第１Ａ群及び第１Ｂ群）に分け、カニクイザル抗原（第１Ｂ群）又はヒト抗原（第１Ａ群）のアジュバントなしの単一のブーストを与えた。ブーストの４日後に両サブグループのマウスから採血し（図１１、採血３）、血液を分析のために調製した。
【0157】
血液調製及び細胞濃縮
図１１に示された時間に血液を採取した（採血１、採血２及び採血３）。各場合において、血液を遠心分離して、血液細胞から血清を分離した。血清を以下に記載の血清力価分析に使用し、血液細胞は、ＣＤ１３８濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の標準プロトコルの改変版を使用して、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を濃縮することによって、ＡＳＣを濃縮した。
図１１に示された時間に血液を採取した（採血１、採血２及び採血３）。各場合において、血液を遠心分離して、血液細胞から血清を分離した。血清を以下に記載の血清力価分析に使用し、血液細胞は、ＣＤ１３８濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の標準プロトコルの改変版を使用して、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を濃縮することによって、ＡＳＣを濃縮した。
【0158】
単一細胞スクリーニングアッセイ
実施例２に記載のように、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を用いて単一細胞スクリーニングアッセイを行った。簡潔に記載すると、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を、３．４μｍポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）に結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ４８８で標識したカニクイザル抗原、赤色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ５９４で標識したヒト抗原と混合し、希釈剤としてＢ細胞培地を用いて最終濃度にした。異なる蛍光シグナル（カニクイザル抗原については緑色、ヒト抗原については赤色）を使用することで、単一細胞アッセイが、ヒトオルソログのみに結合する単一細胞、カニクイザルオルソログのみに結合する単一細胞、及び両方のオルソログに結合する単一細胞を区別することが可能になった。混合物を３８４ウェルプレートの単一ウェルに移し、最終濃縮Ｂ細胞濃度は、１ウェルあたり約２～３μＬの細胞混合物とした。混合物の成分をウェルに約１０分間静置した後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて細胞の撮像を行った。緑色蛍光及び赤色蛍光のＲＦＵ値を決定した。
実施例２に記載のように、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を用いて単一細胞スクリーニングアッセイを行った。簡潔に記載すると、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を、３．４μｍポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）に結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ４８８で標識したカニクイザル抗原、赤色蛍光シグナルを生成するＡｌｅｘａ ５９４で標識したヒト抗原と混合し、希釈剤としてＢ細胞培地を用いて最終濃度にした。異なる蛍光シグナル（カニクイザル抗原については緑色、ヒト抗原については赤色）を使用することで、単一細胞アッセイが、ヒトオルソログのみに結合する単一細胞、カニクイザルオルソログのみに結合する単一細胞、及び両方のオルソログに結合する単一細胞を区別することが可能になった。混合物を３８４ウェルプレートの単一ウェルに移し、最終濃縮Ｂ細胞濃度は、１ウェルあたり約２～３μＬの細胞混合物とした。混合物の成分をウェルに約１０分間静置した後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて細胞の撮像を行った。緑色蛍光及び赤色蛍光のＲＦＵ値を決定した。
【0159】
血清力価分析
採血１及び３からの血清を、１：１００、１：１０００及び１：１０，０００の最終濃度に希釈し、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートにプレーティングした捕捉ビオチン化抗原を有するビーズに添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、３０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中に再懸濁して、最終濃度５μｇ／ｍＬとした。１５分間のインキュベーション後、ビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、再懸濁した。次いで、プレートをフローサイトメトリー用に調製した。
採血１及び３からの血清を、１：１００、１：１０００及び１：１０，０００の最終濃度に希釈し、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートにプレーティングした捕捉ビオチン化抗原を有するビーズに添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、３０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中に再懸濁して、最終濃度５μｇ／ｍＬとした。１５分間のインキュベーション後、ビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、再懸濁した。次いで、プレートをフローサイトメトリー用に調製した。
【0160】
結果及び考察
第１群及び第２群のマウスを最初に同じ方法でブーストし、血清力価分析は全てのマウスがヒトオルソログ及びカニクイザルオルソログの両方に対して強い免疫応答を生じたが、力価データではカニクイザルのみの結合体をヒト－カニクイザル交差反応性結合剤と区別することができないことを示した（図１２、採血１）。単一細胞スクリーニングを用いて、各個々のマウスにおいてヒトのみ、カニクイザルのみ、又はカニクイザルオルソログ－ヒトオルソログの両方に結合した抗体の割合を特定した（図１３及び１４、採血１）。優性な免疫応答はヒトオルソログに対するものであったが、一部のマウスでは交差反応性抗体を容易に特定できた（図１４）。
第１群及び第２群のマウスを最初に同じ方法でブーストし、血清力価分析は全てのマウスがヒトオルソログ及びカニクイザルオルソログの両方に対して強い免疫応答を生じたが、力価データではカニクイザルのみの結合体をヒト－カニクイザル交差反応性結合剤と区別することができないことを示した（図１２、採血１）。単一細胞スクリーニングを用いて、各個々のマウスにおいてヒトのみ、カニクイザルのみ、又はカニクイザルオルソログ－ヒトオルソログの両方に結合した抗体の割合を特定した（図１３及び１４、採血１）。優性な免疫応答はヒトオルソログに対するものであったが、一部のマウスでは交差反応性抗体を容易に特定できた（図１４）。
【0161】
次いで、免疫条件をシフトさせて、単一細胞スクリーニングが免疫ステアリング後の抗体レパトアの変化を検出できるかどうかを決定した。第１群のマウスはヒトオルソログによるブーストを受け続け、第２群のマウスはカニクイザルオルソログでブーストされた（図１１、採血２）。単一細胞スクリーニングアッセイは、第２群マウスにおいて、カニクイザルオルソログとヒトオルソログに結合した抗体の割合の大きな変化を検出することができ（図１５）、現在カニクイザルのみの抗体の免疫応答が優勢である。第１群の対照マウスは、採血１及び２で同様の応答を有した（図１４対１５）。いずれの群も交差反応性抗体の生成に大きな変化はなかった。これらのデータは、単一細胞スクリーニングアッセイが、免疫応答の変化を検出する分解能を有しており、免疫化戦略の小さな変化が抗体レパトアを形成し得ることを示している。
【0162】
次いで、第１群のマウスに最後に１回ブーストして、免疫応答を、カニクイザルのみの応答が最小の交差反応性抗体の増加に向け得るかどうかを決定した。以前のデータは、カニクイザル抗原に対する強いデノボ応答があり、複数回のブーストが必要な応答を生じないことを示した。したがって、デノボ応答を最小限に抑えるために、第１群のマウスに２５μｇのタンパク質をアジュバントなしで単回ブーストした。第１Ａ群はヒトオルソログによるブーストを受け、第１Ｂ群はカニクイザルオルソログによるブーストを受けた。ヒトブーストを受けたマウス（第１Ａ群）では、採血１と比較して交差反応性抗体の割合に変化はなかった（図１６～１７）。ヒト抗原でのみブーストしたマウスにおける変動の欠如は、単一細胞スクリーニングの再現性を強調する。対照的に、カニクイザルでブーストした群（第１Ｂ群）は、交差反応性抗体の割合が大きく増加し（図１６）、交差反応性抗体は２～１６倍の範囲で増加した（図１７）。カニクイザルのみに結合した抗体の割合は最小であり、単回ブーストによりカニクイザルのみの抗体のデノボ産生が最小限に抑えられることが示された。カニクイザルブースト群（第１Ｂ群）の全てのマウスが今や設計目標を達成したが、標準的なポリクローナル血清学では上位の動物は識別できなかった（図１８）。これはおそらく、血清が免疫化キャンペーンによって生成された全ての抗体のポリクローナル混合物を含有しており、新たに形成されたＡＳＣがレパトアに寄与する割合は非常にわずかに過ぎないからと考えられる。
【0163】
まとめると、これらの結果は、異なる免疫応答が、免疫ステアリングによって、例えば異なるオルソログ抗原によるブースティングによって、達成され得ることを示唆している。これらの結果はさらに、ヒトオルソログのみに結合する抗体と、カニクイザルオルソログにのみ結合する抗体と、両方のオルソログに結合する（ヒトオルソログ及びカニクイザルオルソログの両方に交差反応する）抗体とを区別することができないポリクローナル血清力価分析とは異なり、本開示の単一細胞スクリーニングアッセイは、免疫化戦略において生じる変化が小さな変化に過ぎない場合であっても、抗体産生の追跡又はモニタリングを可能にする、免疫応答及び免疫レパトアにおける変化を検出するために必要な分解能及び感度を有することを支持する。
【0164】
実施例１３
この実施例では、マルチドメインタンパク質のヒトオルソログ及びカニクイザルオルソログの両方に交差反応する抗体の割合を増加させるように免疫応答をステアリングする方法を記載する。
この実施例では、マルチドメインタンパク質のヒトオルソログ及びカニクイザルオルソログの両方に交差反応する抗体の割合を増加させるように免疫応答をステアリングする方法を記載する。
【0165】
マルチドメインタンパク質である抗原に対するヒト／カニクイザル交差反応性抗体を産生するという以前の試みが行われた。カニクイザルオルソログ及びヒトオルソログの相同性は、８０％未満である。以前の試みでは、ヒト抗原のブーストとカニクイザル抗原のブーストが交互に行われ、このアプローチは各オルソログタンパク質に対する強いデノボ応答をもたらしたが、交差反応性の抗体はほとんど産生されなかった。この実施例では、マウスを、最初に、ヒトタンパク質の完全細胞外ドメイン（抗原１）でブーストし、続いて、タンパク質のサブドメイン（抗原２）でブーストした。カニクイザルサブドメイン及びヒトサブドメインは、８０％を超える相同性を有する。
【0166】
免疫化
ＣＤ－１マウスを抗原１で２週間ごとに合計４回のブーストで免疫化した（図１９）。最初のブーストは、ＣＦＡ中に乳化させた５０μｇの抗原１であり、皮下注射した。２回目のブーストは、５０％ＳＡＳと組み合わせた２５μｇの抗原１であり、半分を皮下に送達し、残りの半分を腹腔内に送達した。３回目のブーストは、５０％ＳＡＳと組み合わせた１５μｇの抗原１であり、半分を皮下注射し、半分を腹腔内注射した。４回目のブーストは、アジュバントなしの２５μｇの抗原１であった。４日後に、単細胞スクリーニングのために血液を採取した（採血１）。２回の追加ブーストを、採血１の後に投与した。それぞれ２５μｇの抗原２を用い、それぞれの４日後に血液を採取した（採血２及び採血３）。
ＣＤ－１マウスを抗原１で２週間ごとに合計４回のブーストで免疫化した（図１９）。最初のブーストは、ＣＦＡ中に乳化させた５０μｇの抗原１であり、皮下注射した。２回目のブーストは、５０％ＳＡＳと組み合わせた２５μｇの抗原１であり、半分を皮下に送達し、残りの半分を腹腔内に送達した。３回目のブーストは、５０％ＳＡＳと組み合わせた１５μｇの抗原１であり、半分を皮下注射し、半分を腹腔内注射した。４回目のブーストは、アジュバントなしの２５μｇの抗原１であった。４日後に、単細胞スクリーニングのために血液を採取した（採血１）。２回の追加ブーストを、採血１の後に投与した。それぞれ２５μｇの抗原２を用い、それぞれの４日後に血液を採取した（採血２及び採血３）。
【0167】
血液調製及び細胞濃縮
図１９に示したように、免疫化キャンペーンを通して血液を３回採取した（採血１、採血２、採血３）。各場合において、血液を遠心分離して、血液細胞から血清を分離した。血清を以下に記載の血清力価分析に使用し、血液細胞は、ＣＤ１３８濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の標準プロトコルの改変版を使用して、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を濃縮することによって、ＡＳＣを濃縮した。
図１９に示したように、免疫化キャンペーンを通して血液を３回採取した（採血１、採血２、採血３）。各場合において、血液を遠心分離して、血液細胞から血清を分離した。血清を以下に記載の血清力価分析に使用し、血液細胞は、ＣＤ１３８濃縮キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｃｏｌｕｍｂｉａ）の標準プロトコルの改変版を使用して、ＣＤ１３８＋Ｂ細胞を濃縮することによって、ＡＳＣを濃縮した。
【0168】
単一細胞スクリーニングアッセイ
実施例２に記載のように、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を用いて単一細胞スクリーニングアッセイを行った。簡潔に記載すると、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を、３．４μｍポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）に結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生じるＡｌｅｘａ ４８８で標識したカニクイザル抗原、赤色蛍光シグナルを生じるＡｌｅｘａ ５９４で標識したヒト抗原、Ｈｉｓタグ特定力価と競合するために少なくとも１００倍モル過剰のＨｅｘａＨｉｓタンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＲＰ１１７３７）と混合し、希釈剤としてＢ細胞培地を使用して最終濃度にした。異なる蛍光シグナル（カニクイザル抗原については緑色、ヒト抗原については赤色）を使用することで、単一細胞アッセイが、ヒトオルソログのみに結合する単一細胞、カニクイザルオルソログのみに結合する単一細胞、及び両方のオルソログに結合する単一細胞を区別することが可能になった。混合物を３８４ウェルプレートの単一ウェルに移し、最終濃縮Ｂ細胞濃度を、１ウェルあたり約２～３μＬの細胞混合物とした。混合物の成分をウェルに約１０分間静置した後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて細胞の撮像を行った。緑色蛍光及び赤色蛍光のＲＦＵ値を決定した。
実施例２に記載のように、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を用いて単一細胞スクリーニングアッセイを行った。簡潔に記載すると、濃縮したＣＤ１３８＋Ｂ細胞集団を、３．４μｍポリスチレンビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ、Ｌａｋｅ Ｆｏｒｅｓｔ、ＩＬ）に結合させたヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃを含む捕捉試薬、緑色蛍光シグナルを生じるＡｌｅｘａ ４８８で標識したカニクイザル抗原、赤色蛍光シグナルを生じるＡｌｅｘａ ５９４で標識したヒト抗原、Ｈｉｓタグ特定力価と競合するために少なくとも１００倍モル過剰のＨｅｘａＨｉｓタンパク質（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ ＲＰ１１７３７）と混合し、希釈剤としてＢ細胞培地を使用して最終濃度にした。異なる蛍光シグナル（カニクイザル抗原については緑色、ヒト抗原については赤色）を使用することで、単一細胞アッセイが、ヒトオルソログのみに結合する単一細胞、カニクイザルオルソログのみに結合する単一細胞、及び両方のオルソログに結合する単一細胞を区別することが可能になった。混合物を３８４ウェルプレートの単一ウェルに移し、最終濃縮Ｂ細胞濃度を、１ウェルあたり約２～３μＬの細胞混合物とした。混合物の成分をウェルに約１０分間静置した後、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞分析システムを用いて細胞の撮像を行った。緑色蛍光及び赤色蛍光のＲＦＵ値を決定した。
【0169】
血清力価分析
血清を、１：１００、１：１０００及び１：１０，０００の最終濃度に希釈し、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートにプレーティングした捕捉ビオチン化抗原を有するビーズに添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、３０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中に再懸濁して、最終濃度５μｇ／ｍＬとした。１５分間のインキュベーション後、ビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、再懸濁した。次いで、プレートをフローサイトメトリー用に調製した。
血清を、１：１００、１：１０００及び１：１０，０００の最終濃度に希釈し、次いで、Ｖ底９６ウェルプレートにプレーティングした捕捉ビオチン化抗原を有するビーズに添加した。混合物を室温で１時間インキュベートした。次いで、ビーズを洗浄し、３０μｇのヤギ抗マウスＩｇＧ Ｆｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）中に再懸濁して、最終濃度５μｇ／ｍＬとした。１５分間のインキュベーション後、ビーズをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、再懸濁した。次いで、プレートをフローサイトメトリー用に調製した。
【0170】
結果及び考察
採血１の血清力価は、ヒト抗原に対する強固な免疫応答を検出することができ、カニクイザル抗原に対する結合は低いが検出可能であった（図２０）。しかし、ポリクローナル力価データは、カニクイザル抗原にのみ結合した抗体と、ヒト及びカニクイザルの両方に交差反応し得る抗体とを区別することができなかった。対照的に、単一細胞スクリーニングは、ヒトのみ、カニクイザルのみ、並びにヒト及びカニクイザル両方の交差反応性抗体への結合を検出することができた（図２１～２２）。血清力価及び単一細胞スクリーニングはいずれも、優勢な免疫応答がヒトオルソログにのみ結合する抗体に限定されることを示した。いくらかの交差反応性抗体は生成されたが、カニクイザル応答の大部分はヒトオルソログに結合することができず、さらなる免疫化が必要であった。
採血１の血清力価は、ヒト抗原に対する強固な免疫応答を検出することができ、カニクイザル抗原に対する結合は低いが検出可能であった（図２０）。しかし、ポリクローナル力価データは、カニクイザル抗原にのみ結合した抗体と、ヒト及びカニクイザルの両方に交差反応し得る抗体とを区別することができなかった。対照的に、単一細胞スクリーニングは、ヒトのみ、カニクイザルのみ、並びにヒト及びカニクイザル両方の交差反応性抗体への結合を検出することができた（図２１～２２）。血清力価及び単一細胞スクリーニングはいずれも、優勢な免疫応答がヒトオルソログにのみ結合する抗体に限定されることを示した。いくらかの交差反応性抗体は生成されたが、カニクイザル応答の大部分はヒトオルソログに結合することができず、さらなる免疫化が必要であった。
【0171】
次いで、マウスを、完全長タンパク質と比較してヒト／カニクイザルの相同性の程度が高いヒト抗原のサブドメイン（抗原２）でブーストした。マウスは最初に、腹腔内にアジュバントなしで２５μｇの抗原２の注射を受けた。次いで、マウスを採血し（採血２）、この試料をカニクイザルオルソログ及びヒトオルソログへの結合についてスクリーニングした。このブーストにより、交差反応性抗体を確実に特定することができるだけの十分に強い免疫応答は得られなかった。したがって、５０％ ＳＡＳと組み合わせた２５μｇの抗原２で、マウスをさらに１回ブーストした。ブーストの４日後にマウスから採血し（採血３）、ＣＤ１３８＋ＡＳＣを単離し、上記のようにスクリーニングした。この実験は、必要なときに、調整及びブースト拡大を可能にするために、非終端試料採取を使用することの価値を強調する。
【0172】
抗原２によるブースティングは、抗原のカニクイザルオルソログに対する血清力価を強力に増加させた（図２３）。この観察と一致して、単一細胞アッセイもまた、採血１と比較して、採血３におけるカニクイザルのみの抗体及びカニクイザル－ヒト交差反応性抗体の両方の増加を検出した（図２４）。次いで、ヒト及びカニクイザルの両方のオルソログへの結合に対するカニクイザルのみの結合の割合をプロットすることによって、目的の動物を特定することができた。このプロットにより、一部のマウスはカニクイザルオルソログのみに応答するが、他のマウスは強い交差反応性を有することが明らかになった。これは、標準的なポリクローナル血清学を用いても、識別することはできない。
【0173】
本明細書で引用される刊行物、特許出願及び特許などの全ての参考文献は、それぞれの参考文献が、あたかも個々に且つ具体的に参照により本明細書に組み込まれることが示されており、また本明細書においてその全体が記載されているかのように同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【0174】
本開示の説明に関する（とりわけ以下の特許請求の範囲に関する）「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」という用語、並びに類似の指示対象の使用は、本明細書中に別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、単数及び複数の両方を包含するものと解釈されるべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、特記しない限り、オープンエンドの用語（すなわち「含むが、限定されない」を意味する）と解釈されなければならない。
【0175】
本明細書における値の範囲の記載は、本明細書で別段の指示がない限り、単にその範囲及び各端点にある別個の値の各々を個々に指す簡略法の役割を果たすものに過ぎず、別個の値及び端点の各々は、それが個々に本明細書に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0176】
本明細書で説明されている方法の全ては、本明細書で別段の指示がない限り又は文脈と明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で提供されるありとあらゆる例又は例示的な言語（例えば、「など」）の使用は、本開示をより明らかにすることが意図されているに過ぎず、別途特許請求されない限り、本開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書におけるいかなる言語も、任意の特許請求されていない要素を、本開示を実施するのに必要不可欠なものとして示すものと解釈されるべきではない。
【0177】
本明細書には、本開示の好ましい実施形態が記載されており、それは、本開示を実行するために本発明者らに知られている最良の形態を含む。それらの好ましい実施形態の変形形態は、上記の記載を読むことで当業者に明らかになるであろう。本発明者らは、当業者が必要に応じてこのような変形形態を採用することを期待し、本発明者らは、本明細書中で具体的に記載されている形態以外で本開示が実施されることを意図する。したがって、本開示は、適用される法により認められるとおり、本明細書に添付される特許請求の範囲に列挙されている主題の全ての変更形態及び均等物を含む。さらに、上記の要素の任意の組み合わせは、別途本明細書で指示されない限り又は文脈と明らかに矛盾しない限り、その全ての可能な変形形態で本開示に包含される。
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図1D】
【図1E】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図6】
【図7A-C】
【図8A-D】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【国際調査報告】