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▶ インテリファージ・ソシエテ・ア・レスポンサビリテ・リミテの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-05
(54)【発明の名称】自動式ファーゴグラム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/70 20060101AFI20240227BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240227BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240227BHJP
C12Q 1/06 20060101ALI20240227BHJP
C12Q 1/66 20060101ALI20240227BHJP
C12Q 1/6851 20180101ALI20240227BHJP
C12N 7/00 20060101ALI20240227BHJP
C12N 5/071 20100101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/70
C12M1/00 A
C12M1/34 B
C12Q1/06
C12Q1/66
C12Q1/6851 Z
C12N7/00
C12N5/071
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023547541
(86)(22)【出願日】2022-02-04
(85)【翻訳文提出日】2023-09-26
(86)【国際出願番号】 EP2022052743
(87)【国際公開番号】W WO2022167597
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】BE2021/5084
(32)【優先日】2021-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】BE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523295811
【氏名又は名称】インテリファージ・ソシエテ・ア・レスポンサビリテ・リミテ
【氏名又は名称原語表記】ＩＮＴＥＬＩＰＨＡＧＥ ＳＲＬ
(74)【代理人】
【識別番号】110001195
【氏名又は名称】弁理士法人深見特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ライナート・ファン・リッド・デ・ジュード，ジェハン
(72)【発明者】
【氏名】クインテンス，ヨハン
(72)【発明者】
【氏名】ブラズデル，ボブ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA07
4B029BB02
4B029BB13
4B029FA02
4B029FA10
4B029GA03
4B029GB06
4B063QA01
4B063QA18
4B063QA19
4B063QQ06
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QQ63
4B063QR02
4B063QR08
4B063QR56
4B063QR62
4B063QS25
4B063QS39
4B063QX02
4B065AA01X
4B065AA90X
4B065AA98X
4B065BA25
4B065BA30
4B065CA46
(57)【要約】
複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステムであって、上記システムは、複数のウェルを備えるマイクロウェルプレートであって、上記複数のウェルの各々は複数のファージのうちの１つを含有するように構成され、上記マイクロウェルプレートは、上記細菌を備える試料が上記複数のウェルの中に分注されるように構成される、マイクロウェルプレートと、上記細菌を備える上記試料と上記複数のファージのうちの１つのファージとの混合物に添加されるように構成される少なくとも１種の試薬および／または添加剤と、測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、上記測定は少なくとも１つの分析デバイスによって提供され、上記少なくとも１つの分析デバイスは上記複数のファージの各々と上記細菌の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備える、システム。また、本発明は、これにおいて使用するための対応する方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステム（１００）であって、前記システム（１００）は、複数のウェル（１２０）を備えるマイクロウェルプレート（１１０）であって、前記複数のウェル（１２０）の各々は複数のファージのうちの１つを含有するように構成され、前記マイクロウェルプレート（１１０）は、さらに、前記細菌を備える試料が前記複数のウェル（１２０）の各々の中に分注されるように構成される、マイクロウェルプレート（１１０）と、
前記細菌を備える前記試料と前記複数のファージのうちの１つのファージとの少なくとも１つの混合物に添加されるように構成される、少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）と、
測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、前記測定は少なくとも１つの分析デバイス（１８０）によって提供され、前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備え、
前記少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）は、プライマー分子、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、蛍光を発することのできる分子ビーコンプローブ、バッファー、ならびにｑＰＣＲ増幅適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備え、かつ
前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は、さらに、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することによって、前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、または
前記少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）は、ＡＴＰの枯渇と付随するフルオレセインの発光とによって細菌細胞溶解を検出できるように構成されるルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体、ならびにルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備え、かつ
前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は、さらに、前記発光を測定することによって前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、システム（１００）。
【請求項2】
前記試料は患者からのそのままの試料である、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記マイクロウェルプレート（１１０）は使い捨てである、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項4】
前記複数のウェル（１２０）は、さらに、少なくとも一群の選択されたファージを含有するように構成され、前記一群の選択されたファージの各々は、１種の特定の細菌種およびその株に対して相互作用および／または不活性化する能力によって選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項5】
前記コントロールユニットは、さらに、前記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を提供するように構成され、前記ファージの組成物は、前記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項6】
複数のファージに対する細菌の感受性を測定するための方法であって、前記方法は、前記細菌を備える第１の組成物（１３０）と、複数のウェル（１２０）を備える第１のマイクロウェルプレート（１１０）とを提供する工程であって、前記複数のウェル（１２０）の各々は前記複数のファージのうちの１つを含有する、工程と、
前記第１の組成物（１３０）の第１の試料（１３１）を前記複数のウェル（１２０）のうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する工程と、
前記少なくとも１つのウェルの各々について、前記細菌を備える前記第１の試料（１３１）と前記ウェル中に含有されるバクテリオファージとの混合物を、第１の期間にわたってインキュベートさせる工程と、
各混合物に少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）を添加する工程と、
少なくとも１つの混合物を分析デバイス（１８０）中に移動および導入し、前記分析デバイス（１８０）によって、前記少なくとも１つの混合物について細菌とファージの相互作用を測定する工程と、
コントロールユニットによって、前記分析デバイス（１８０）で前記測定を解釈してファーゴグラムの形態で提示する工程とを有する、方法。
【請求項7】
前記方法は、前記少なくとも１種の試薬を添加する工程よりも前に、前記混合物の第２の試料（１４１）を第２のマイクロウェルプレート（１５０）に移す工程をさらに備え、前記第２のマイクロウェルプレートは前記分析デバイス（１８０）と適合するように構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第１の組成物（１３０）は患者からのそのままの試料である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
前記分析デバイス（１８０）によって細菌とファージの相互作用を測定する工程は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することを含意する、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記分析デバイス（１８０）によって細菌とファージの相互作用を測定する工程は、ルシフェラーゼの添加により生物発光を測定することによって細胞溶解を検出することを含意する、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記方法は、さらに、前記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を選択する工程を備え、前記ファージの組成物のファージは、前記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する能力によって選択される、請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
請求項１～５に記載のシステムおよび請求項６～１１に記載の方法において使用するための、複数のファージのうちの１つをそれぞれ含有するための複数のウェル（１２０）を備えるマイクロウェルプレート（１１０）。
【請求項13】
コントロールユニットのプロセッサに請求項１～５に記載のシステムおよび請求項６～１１に記載の方法の機能を実行させるように構成されるコード手段を備えるコンピュータプログラムプロダクト。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するため、および上記感受性と生じ得る溶解効果とを自動化されたファーゴグラムの形態で報告するためのシステムに関する。また、本発明は、これにおいて使用するための対応する方法にも関する。
本発明は、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するため、および上記感受性と生じ得る溶解効果とを自動化されたファーゴグラムの形態で報告するためのシステムに関する。また、本発明は、これにおいて使用するための対応する方法にも関する。
【背景技術】
【0002】
背景
抗菌剤耐性（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＡＭＲ）の問題は世界的に深刻化しており、人間および動物の健康にとって、現代の獣医学および臨床学の両環境において大きな脅威である。今日、市販されている抗菌剤の事実上すべてに対して耐性のある病原性細菌が出現しており、新しいクラスの抗菌剤を開発する目的で現在開発段階にある分子は非常に少ない。Ｍａｒｓｔｏｎらによる文献（“Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ”，ＪＡＭＡ ３１６（１１）ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａ．２０１６．１１７６）において、ＡＭＲに関連する因子が特定されている。世界保健機関（ＷＨＯ）は、抗菌剤耐性が、世界における健康、食料安全保障、および発展にとっての最も大きな脅威の１つであるとしており、毎年少なくとも７００，０００人が薬剤耐性疾患によって死亡していると推定している（ＷＨＯ、Ｊｏｉｎｔ Ｎｅｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１９年４月）。ＡＭＲは初期にはいくつかの地域に限定されていたが、現在では、臨床微生物学者や感染性疾患専門家から獣医にわたるまで、世界中の保険専門家にとっての課題となっている。多剤耐性細菌を保有する患者についての昨今の状況は、臨床上のコンテクストだけでなく、このような細菌の脅威によって生じ得る結果を際立たせるものである。
抗菌剤耐性（ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＡＭＲ）の問題は世界的に深刻化しており、人間および動物の健康にとって、現代の獣医学および臨床学の両環境において大きな脅威である。今日、市販されている抗菌剤の事実上すべてに対して耐性のある病原性細菌が出現しており、新しいクラスの抗菌剤を開発する目的で現在開発段階にある分子は非常に少ない。Ｍａｒｓｔｏｎらによる文献（“Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ”，ＪＡＭＡ ３１６（１１）ｄｏｉ：１０．１００１／ｊａｍａ．２０１６．１１７６）において、ＡＭＲに関連する因子が特定されている。世界保健機関（ＷＨＯ）は、抗菌剤耐性が、世界における健康、食料安全保障、および発展にとっての最も大きな脅威の１つであるとしており、毎年少なくとも７００，０００人が薬剤耐性疾患によって死亡していると推定している（ＷＨＯ、Ｊｏｉｎｔ Ｎｅｗｓ Ｒｅｌｅａｓｅ、２０１９年４月）。ＡＭＲは初期にはいくつかの地域に限定されていたが、現在では、臨床微生物学者や感染性疾患専門家から獣医にわたるまで、世界中の保険専門家にとっての課題となっている。多剤耐性細菌を保有する患者についての昨今の状況は、臨床上のコンテクストだけでなく、このような細菌の脅威によって生じ得る結果を際立たせるものである。
【0003】
抗菌剤としてのバクテリオファージの使用が抗菌剤よりも優れている点については、以前から知られている。ファージの大きな利点は、種（またはその株）および属に対する特異性であり、これによって、ファージ治療により、局所的なマイクロバイオームを乱すことなく標的生物を除去して、日和見感染の可能性を低減することができる。ファージは、投与期間を比較的短くする必要があり、抗菌剤と併用して使用することによって耐性を遅延させ得る可能性がある。抗菌治療薬としてのファージの使用における利点と、いくつかの制約および課題とについての詳細な概説が、Ｎｉｋｏｌｉｃｈら “Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ａｎｄ Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ”Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ，２０２０，９，１３５，ｄｏｉ：１０．３３９０／ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃｓ９０３０１３５中に提示されており、その序文を引用により本明細書に援用する。
【0004】
とはいうものの、ファージの挙動が主として種特異的または株特異的である点、および宿主域が特に狭い点は、抗菌剤と比較して大きな欠点ともみなされ得る。
【0005】
こうした欠点を克服するために、ファージ療法のための広く一般的なアプローチは、現在のところ患者および／または動物および／または環境に感染する株のうち可能な限り多くのものに感染するように選択された複数のファージ成分の静的混合物または「カクテル」に焦点をあてている。しかしながら、いずれの静的ファージカクテルであっても、治療できる患者は一部であると考えられ、こうしたカクテルは、細菌の集団が変化を続けるにつれて急速に妥当性を失い得ると考えられている。さらなる情報がＲｏｈｄｅらによる文献（“Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｏｎ Ｔｈｒｅｅ Ｐｈａｇｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｔｏｐｉｃｓ：Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｈａｇｅ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ，Ｐｈａｇｅ Ｔｒａｉｎｉｎｇ ａｎｄ Ｐｒｏｐｈａｇｅｓ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｓｔｒａｉｎｓ”，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１８，１０（４），１７８；ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３３９０／ｖ１００４０１７８）中に提示されている。
【0006】
また、個別化されたファージ療法計画というものは、カクテル中に集めることのできるものよりも大きなファージライブラリを集めて、患者の株に対する活性が確認されているファージでその患者だけを治療し、個々の患者の感染に対してオーダーメイドの治療薬を作ろうとするものである。よって、個々の患者の感染に直接的に応じて治療薬が開発されるものであり、当該治療薬は、当該感染における病原体に対する溶解活性を有する１種または複数種のファージを含有する。Ｐｉｒｎａｙらによる文献（“Ｔｈｅ Ｍａｇｉｓｔｒａｌ Ｐｈａｇｅ”，Ｖｉｒｕｓｅｓ ２０１８，１０（２），６４；ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１００２００６４）は、特別処方によるオーダーメイドファージ医薬品の調製についての法律上および規制上のフレームワークの実施について議論している。
【0007】
さらなる欠点は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおけるファージ感受性試験についての現行の診断方法論が、患者が広く利用できる臨床試験環境というよりもむしろアカデミックな研究室の環境に合わせたものであるという点である。
【0008】
Ｋｏｎｏｐａｃｋｉらは、“ＰｈａｇｅＳｃｏｒｅ：Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅｓ ｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ”，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｊｏｕｒｎａｌ，１６１，２０２０，ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｅｊ．２０２０．１０７６５２において、少なくとも４時間にわたってＯＤ６００ｎｍを用いて細菌の増殖曲線を測定することによるバクテリオファージの効率の評価方法を開示している。Ｘｉｅらは、“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ Ｐｌａｔｅ－ｂａｓｅｄ Ａｓｓａｙ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ Ｈｏｓｔ Ｒａｎｇｅ ａｎｄ Ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ”，Ｖｉｒｕｓｅｓ １０，１８９，ｄｏｉ：１０．３３９０／ｖ１００４０１８９において、スポットアッセイおよびマイクロタイタープレート液体アッセイを使用して２通りの初期ファージ濃度にて、ＯＤ５５０ｎｍにより少なくとも１２時間にわたってサルモネラ菌２０株からなるパネルに対するサルモネラ菌ファージ１５種のファージ宿主域および病原性を測定するための研究を開示している。
【0009】
いずれの研究においても、ファージライブラリに対する細菌性病原体試料の感受性の試験は時間がかかると考えられ、有資格スタッフによる商業的に実現不可能な量の手作業が必要とされる。
【0010】
実際のところ、現在使用されている技術には、純粋培養分離株から得られる指数増殖培養物が必要とされ、これを発生させるためには典型的には１日かかり、実施に少なくともさらに１日必要とされ、さらには高度な訓練を受けたスタッフも必要とされるが、後者は職業的臨床環境においては実現不可能である。
【0011】
細菌性病原体により引き起こされた感染は、特定できる時点よりも前に、数日のうちに、さらには２～３時間のうちにも危険な状態または命にかかわる状態になりかねない。よって、治療効果を有する可能性のあるバクテリオファージに対して特定の細菌株が感受性を有するか否かを迅速に確かめる方法が必要とされている。
【0012】
ＷＯ９９／５７３０４は、試料中に存在する細菌を特定するためのアッセイ、および細菌感染を治療するための方法に関する。当該文献中に開示されるプロトコールは、細菌分離株を一晩増殖させ、マイクロタイタープレート上に試料を分注し、プレートを一晩インキュベートすることを含む。そして、ファージとともにインキュベートした後の細菌の増殖程度を測定することによって、ファージと細菌の相互作用について判断している。
【0013】
ＷＯ２００４／０４１１５６は、細菌を特定して、治療効果を有するバクテリオファージを選択するための方法に関する。レポーター分子の発現は、試料中の細菌細胞にバクテリオファージが感染できるか否かを示す。患者から採取した試料を４～１２時間インキュベートしている。
【0014】
ＷＯ２０１７２２３１０１は、細菌性病原体に向けたファージカクテルを調合する方法に関し、この方法は、同一細菌種の様々な株を備える細菌多様性セットを構築する工程と、続いて、保存用ファージライブラリおよび作業用ファージライブラリを構築して、後者を細菌増殖の遅延および／またはファージ耐性細菌の増殖欠如についてスクリーニングする工程とを備える。
【0015】
Ｆｉｓｃｈｅｒらは、“Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ－Ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｏｎ ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ－Ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ Ｉｓｏｌａｔｅｓ－Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ”，ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（１），ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００５３８９９において、カンピロバクター分離株のバクテリオファージ感受性を迅速に判断するためのマイクロプレート感受性試験を開示しており、この簡略的な試験と従来の寒天被覆プレートアッセイとを比較している。プレートを１８時間にわたって固化した後で微好気的条件下においてインキュベートしている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0016】
したがって、特定の細菌感染の治療に好適なバクテリオファージを迅速かつ容易に判断できることが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0017】
発明の概要
本発明の一態様によれば、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステムが提供され、当該細菌は好ましくは細菌性病原体であり、当該システムは、
複数のウェルを備えるマイクロウェルプレートであって、上記複数のウェルの各々は複数のファージのうちの１つを含有するように構成され、上記マイクロウェルプレートは、さらに、上記細菌を備える試料が上記複数のウェルの各々の中に分注されるように構成される、マイクロウェルプレートと、
上記細菌を備える上記試料と上記複数のファージのうちの１つのファージとの少なくとも１つの混合物に添加されるように構成される、少なくとも１種の試薬および／または添加剤と、
測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、上記測定は少なくとも１つの分析デバイスによって提供され、上記少なくとも１つの分析デバイスは上記複数のファージの各々と上記細菌性病原体の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備える。
本発明の一態様によれば、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステムが提供され、当該細菌は好ましくは細菌性病原体であり、当該システムは、
複数のウェルを備えるマイクロウェルプレートであって、上記複数のウェルの各々は複数のファージのうちの１つを含有するように構成され、上記マイクロウェルプレートは、さらに、上記細菌を備える試料が上記複数のウェルの各々の中に分注されるように構成される、マイクロウェルプレートと、
上記細菌を備える上記試料と上記複数のファージのうちの１つのファージとの少なくとも１つの混合物に添加されるように構成される、少なくとも１種の試薬および／または添加剤と、
測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、上記測定は少なくとも１つの分析デバイスによって提供され、上記少なくとも１つの分析デバイスは上記複数のファージの各々と上記細菌性病原体の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備える。
【0018】
より具体的には、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステムが提供され、当該細菌は好ましくは細菌性病原体であり、当該システムは、
複数のファージのうちの１つをそれぞれ含有できかつその中に上記細菌を備える試料を分注できるような複数のウェルを備えるマイクロウェルプレートと、
上記細菌を備える上記試料と上記複数のファージのうちの１つのファージとの少なくとも１つの混合物に添加するための、少なくとも１種の試薬および／または添加剤と、
測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、上記測定は少なくとも１つの分析デバイスによって提供され、上記少なくとも１つの分析デバイスは上記複数のファージの各々と上記細菌性病原体の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備える。
複数のファージのうちの１つをそれぞれ含有できかつその中に上記細菌を備える試料を分注できるような複数のウェルを備えるマイクロウェルプレートと、
上記細菌を備える上記試料と上記複数のファージのうちの１つのファージとの少なくとも１つの混合物に添加するための、少なくとも１種の試薬および／または添加剤と、
測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、上記測定は少なくとも１つの分析デバイスによって提供され、上記少なくとも１つの分析デバイスは上記複数のファージの各々と上記細菌性病原体の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備える。
【0019】
本発明の利点は、複数のバクテリオファージに対する細菌の感受性を、１つのマイクロウェルプレートまたは規定プレートアレイを使用して試験できる点である。よって、上記細菌と相互作用するファージを比較的迅速に特定することができる。マイクロウェルプレートは好ましくは使い捨てであり、好ましくは、特定の種もしくは属の細菌もしくは細菌性病原体および／もしくはその株に対して、または特定の種もしくは属の細菌もしくは細菌性病原体およびその株の集まりに対して、細胞不活性化と、好ましくは細胞溶解と、好ましくはファージ増殖とを引き起こす能力によって選択される、１セットのまたは複数のバクテリオファージを備えている。有利にも、当該細菌に及ぼす当該一群の選択されたバクテリオファージの効果を、１つの実験技術を使用して、１つの分析デバイスおよび／またはソフトウェアパッケージを用いて検出することができる。
【0020】
さらなる利点は、測定が、自動式ファーゴグラムの形態で提示され、これによって、ファージと細菌の相互作用について直接的な概要がもたらされ、当該細菌種において細胞不活性化と、細胞溶解と、好ましくはファージ増殖とを引き起こす細菌種および／またはファージの特定が可能になるという点である。
【0021】
本発明のさらなる利点は、このようなファーゴグラムを、特にこうした情報を得るための既存の方法と比較して、比較的短期間で得ることができる点である。実際、患者由来の使用可能な試料の採取から当該ファーゴグラムの取得までに要する時間を数時間に短縮することもでき、そのままの試料を使用できる場合にはおよそ１～２時間から４時間とすることもできる。
【0022】
本発明に係るシステムの実施形態において、上記試料は患者からのそのままの試料である。
【0023】
この実施形態の利点は、本明細書中において記載されるシステムおよび方法を、典型的には患者、動物、感染集団、または環境から直接得られるそのままの試料と組み合わせて、直接適用できるという点である。ファージと細菌の相互作用が特異的であるため、目的の細菌または細菌性病原体を分離および精製する必要がない場合がある。したがって、試料中の目的の細菌と相互作用する能力によって選択される複数のファージは、当該試料中に存在し得る関連のない細菌と反応しないと考えられる。また、患者試料から目的の細菌性病原体の純粋培養分離株を得たり、および／または、複数のバクテリオファージと接触させるのに十分であると考えられる数のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を増殖させるために、患者から採取した試料をインキュベートしたりする必要もない場合がある。したがって、細菌感染の発生源を特定し、かつ細菌もしくは細菌性病原体と相互作用するおよび／またはその細胞溶解を引き起こすファージを特定するための研究において、非常に貴重な時間を節約できる。
【0024】
比較として、アンチバイオグラムを得るためのプロトコールが以前に開発されており、これは、感染病原体の純粋培養分離株を得るために患者試料を採取することを含む。この手順では、典型的には、純粋培養分離株のコロニーが増殖するまで１８時間待つ必要がある。その後で初めて、典型的には１時間以内で、現代のアンチバイオグラムは、当該分離株の抗菌剤感受性についての実行可能な診断を生成することができる。
【0025】
本発明に係るシステムの実施形態において、マイクロウェルプレートは使い捨てである。
【0026】
本明細書中において使用される「使い捨て」という用語は、１回だけ使用するように設計されていて、その後で廃棄するということを指す。
【0027】
これらの実施形態の利点は、事前に準備して密閉してあって、使用時にすぐに使用できる状態になっているマイクロプレートを使用できる点である。このようなマイクロプレートには使用についてのプロトコールがついていてもよく、これは、マイクロプレートの各ウェルに適切な（量の）試薬および／または添加剤を供給するためのコンピュータプログラムプロダクト、またはプロセッサのためのスクリプトを含んでいてよい。このようなマイクロプレートは、特定の細菌およびその株において細胞溶解を誘発できる複数のバクテリオファージを備えた標準プレートであってよく、試料中に当該特定の細菌が存在するかどうか調べることができるように構成されていてよい。
【0028】
本発明に係るシステムの実施形態において、複数のウェルは、さらに、少なくとも一群の選択されたファージを含有するように構成され、上記一群の選択されたファージの各々は、１種の特定の細菌種およびその株に対して相互作用および／または不活性化する能力によって選択される。
【0029】
本発明に係るシステムの実施形態において、複数のウェルは、少なくとも一群の選択されたファージを含有するための複数のウェルに関連し、当該一群の選択されたファージの各々は、１種の特定の細菌種およびその株に対して相互作用および／または不活性化する能力によって選択される。
【0030】
これらの実施形態の利点は、特定の細菌種、典型的には特定の細菌性病原体の異なる株および／または異なる受容体型を標的とするファージを１つのマイクロプレート上に組み合わせることによって、当該種または病原体を特徴づけることができ、これによって、細菌性病原体がファージ耐性を獲得するリスクを大幅に低減できる療法またはファージカクテルの開発が可能となる点である。好ましくは、細菌種の最大数の株との相互作用を調べることができるように、当該選択された一群は、ファージの組み合わせを備える。
【0031】
本発明に係るシステムの実施形態において、上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤は、プライマー分子、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、蛍光を発することのできる分子ビーコンプローブ、バッファー、ならびにｑＰＣＲ増幅適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備える。さらに、上記少なくとも１つの分析デバイスは、上記細菌を上記複数のファージの各々と共にインキュベートした後で、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することによって、上記複数のファージの各々と上記細菌の相互作用を測定するように構成される。よって、上記少なくとも１つの分析デバイスは、好ましくは、上記細菌を上記複数のファージの各々と共にインキュベートした後で、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することによって、上記複数のファージの各々に対する上記細菌の感受性を測定するように構成される。
【0032】
これらの実施形態の利点は、細菌とファージの相互作用を、現時点で利用可能な方法と比較してより迅速に測定できるという点である。有利にも、いくつかの試料を同時に測定することができる。細菌とファージとの混合物を含有するマイクロプレートのｑＰＣＲ測定は、２時間未満で測定できる。さらに、その他の検出方法では細菌細胞の死についての情報に限定されることが多いところ、ファージ増殖についての詳細な情報を計算することができる。このような情報によれば、特定のファージの病原性をその他のものと比較して定量化することが可能となる。
【0033】
本発明に係るシステムの実施形態において、上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤は、ファージ介在性の溶解により放出されるＡＴＰの枯渇と付随するフルオレセインの発光とによって細菌細胞溶解を検出できるように構成されるルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体、ならびにルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備える。さらに、上記少なくとも１つの分析デバイスは、上記発光を測定することによって上記複数のファージの各々と上記細菌の相互作用を測定するように構成される。
【0034】
これらの実施形態の利点は、細菌とファージの相互作用を、現時点で利用可能な方法と比較してより迅速に測定できるという点である。有利にも、いくつかの試料を同時に測定することができる。細菌とファージとの混合物を含有するマイクロプレートの、ルシフェラーゼ／ルシフェリン複合体を用いた生物発光測定は、数分以内で、典型的には約１～２分以内で、さらには１分未満で測定することができる。さらに、ルシフェラーゼ／ルシフェリン複合体を添加することによって生物発光を測定すれば正確な結果を得ることができ、この技術は感受性が高く、実施が相当に容易である。
【0035】
本発明に係るシステムの実施形態において、上記コントロールユニットは、さらに、上記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を提供するように構成され、上記ファージの組成物は、目的の細菌または細菌種における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する。好ましくは、上記組成物は、異なるファージ種を３種を超えて含有しない。好ましくは、各ファージ種は、目的の細菌種における異なる型の結合受容体と相互作用する。
【0036】
これらの実施形態の利点は、当該細菌または細菌性病原体によって引き起こされる細菌感染の治療にとって好適であり得るファージの組成物を得ることができる点である。細菌は、その結合カスケードおよび吸着カスケードに介在している１つ以上の特定の受容体モチーフを、その表面上に並んで有し得る。こうした受容体モチーフは、糖、糖タンパク質、タンパク質、脂質、およびリポタンパク質を含むがこれらに限定されない細胞表面分子において見いだされ得る。ファージは、１つ以上の特定の受容体モチーフを検出することができ、そのため、これらの受容体モチーフが見いだされる特定の分子に応じて、まとめて「受容体グループ」としてもよい。これらの実施形態のさらなる利点は、１つのシステムで、当該システムに提供された試料中の細菌性病原体によって引き起こされる細菌感染についての予想されるコンパニオン診断を得ることができる点である。
【0037】
本発明に係るシステムの実施形態において、コントロールユニットは、さらに、中央データベースに接続されて、そこに、得られるファーゴグラムを含む結果を報告する。
【0038】
これらの実施形態の利点は、多様な臨床環境において実施された多数のファーゴグラムの結果により、関連する多くの細菌について、ファージの宿主域を特定できる点である。よって、地域、時間変化、保険制度、および兆候（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）により、宿主域の傾向を差別化することができ、これによって疾患の突発的大発生を特定することができる。こうした突発的大発生は、「ファージ型」、つまり、特定可能な固有のシグニチャを形成してファーゴグラムによって追跡できる特定の株に対して感染できる特定のファージの集団によって特定することができる。
【0039】
本発明の一態様によれば、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するための方法が提供され、この方法は、
上記細菌を備える第１の組成物と、複数のウェルを備える第１のマイクロウェルプレートとを提供する工程であって、上記複数のウェルの各々は上記複数のファージのうちの１つを含有する、工程と、
上記第１の組成物の第１の試料を上記複数のウェルのうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する工程と、
上記少なくとも１つのウェルの各々について、上記細菌を備える上記第１の試料と上記ウェル中に含有されるバクテリオファージとの混合物を、第１の期間にわたってインキュベートさせる工程と、
各混合物に少なくとも１種の試薬および／または添加剤を添加する工程と、
少なくとも１つの混合物を分析デバイス中に移動および導入し、上記分析デバイスによって、上記少なくとも１つの混合物について細菌とファージの相互作用を測定する工程と、
コントロールユニットによって、上記分析デバイスで上記測定を解釈してファーゴグラムの形態で提示する工程とを有する。
上記細菌を備える第１の組成物と、複数のウェルを備える第１のマイクロウェルプレートとを提供する工程であって、上記複数のウェルの各々は上記複数のファージのうちの１つを含有する、工程と、
上記第１の組成物の第１の試料を上記複数のウェルのうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する工程と、
上記少なくとも１つのウェルの各々について、上記細菌を備える上記第１の試料と上記ウェル中に含有されるバクテリオファージとの混合物を、第１の期間にわたってインキュベートさせる工程と、
各混合物に少なくとも１種の試薬および／または添加剤を添加する工程と、
少なくとも１つの混合物を分析デバイス中に移動および導入し、上記分析デバイスによって、上記少なくとも１つの混合物について細菌とファージの相互作用を測定する工程と、
コントロールユニットによって、上記分析デバイスで上記測定を解釈してファーゴグラムの形態で提示する工程とを有する。
【0040】
本発明に係る方法の実施形態において、上記方法は、上記少なくとも１種の試薬を添加する工程よりも前に、上記混合物の第２の試料を第２のマイクロウェルプレートに移す工程をさらに備え、上記第２のマイクロウェルプレートは上記分析デバイスと適合するように構成される。
【0041】
これらの実施形態の利点は、第２のマイクロウェルプレートを使用することによって、特定の分析デバイスと適合するように構成されたマイクロプレートを利用できるという点である。さらに、上記第２のマイクロプレートは、当該分析デバイスによって分析するよりも前に追加の試薬および／または添加剤を添加しやすくするように構成される。
【0042】
本発明に係る方法の実施形態において、上記第１の組成物は、患者からのそのままの試料である。
【0043】
本発明に係る方法の実施形態において、当該分析デバイスによって細菌とファージの相互作用を測定する工程は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することを含意する。
【0044】
本発明に係る方法の実施形態において、当該分析デバイスによって細菌とファージの相互作用を測定する工程は、ルシフェラーゼ活性の添加により生物発光を測定することによって細胞溶解を検出することを含意する。
【0045】
本発明に係る方法の実施形態において、上記方法は、さらに、上記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を選択する工程を備え、上記ファージの組成物のファージは、上記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する。
【0046】
本発明の一態様によれば、本明細書中において記載されるシステムおよび方法において使用するための、複数のファージのうちの１つをそれぞれ含有するための複数のウェルを備えるマイクロウェルプレートが提供される。
【0047】
本発明の一態様によれば、上記システムおよび方法の機能をプロセッサに実行させるように構成されるコード手段を備えるコンピュータプログラムプロダクトが提供される。
【0048】
図面の簡単な説明
本発明の実施形態についての上述されるおよびその他の特徴および利点が、添付の図面を参照してより詳細に記載される。
本発明の実施形態についての上述されるおよびその他の特徴および利点が、添付の図面を参照してより詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】本発明の実施形態に係る、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステムおよび方法を概略的に説明する。
【発明を実施するための形態】
【0050】
実施形態の詳細な説明
定義
「バクテリオファージ」または「ファージ」という用語は、本明細書中において、細菌を宿主とする任意のウイルスまたはウイルス様の存在物を指す。ファージは、非常に多様なウイルスの群を形成している。
定義
「バクテリオファージ」または「ファージ」という用語は、本明細書中において、細菌を宿主とする任意のウイルスまたはウイルス様の存在物を指す。ファージは、非常に多様なウイルスの群を形成している。
【0051】
「ファーゴグラム」という用語は、本明細書中において、個々の細菌性病原体または混合試料環境のいずれかに対して複数種の個々のバクテリオファージが及ぼす効果の概要を示すデータ集合を、好ましくは表の形態としたものを指す。いくつかの点において、アンチバイオグラムと同様にして、ファーゴグラムは、ファージのパネルに対して生物が有する耐性または感受性についてのプロファイルをもたらす。
【0052】
「そのままの試料」という用語は、細菌（典型的には病原性細菌または感染性細菌病原体）を含有する試料を指し、この試料は、特定の疾患の病態が形成される間またはこれが徐々に増悪する間にヒト、動物、または環境から採取する。当該試料は、特定の病原体の単離および単一培養を行なっていないものである。
【0053】
本明細書中において、細菌は、あるファージと相互作用すると当該細菌の死または不活性化が生じる場合に、このファージに対して感受性を有するとみなされる。好ましくは、この相互作用は当該細菌内における当該ファージの増殖をも導き、これによって細胞溶解および子孫ファージの放出が導かれる。
【0054】
「受容体」という用語は、細胞表面上または細胞内部に存在していて、特定の化学基、分子、またはウイルスに対して親和性を有する、タンパク質または糖などの化学基または分子（部位）を指す。受容体は、吸着の特異的誘導に関与するウイルス粒子によって認識される細胞の化学的部位である。
【0055】
本明細書中において記載されるシステムおよび方法の用途および／または目的は、
・患者からのそのままの試料もしくはその純粋培養分離株である試料中における、細菌、典型的には細菌性病原体の特定、
・当該試料中の当該細菌において細胞不活性化、より好ましくは細胞溶解、さらにより好ましくはファージ増殖を引き起こす任意のファージの特定、および／または
・当該細菌によって引き起こされる細菌感染を治療するための、ファージの組成物もしくはカクテルの開発を含む。
・患者からのそのままの試料もしくはその純粋培養分離株である試料中における、細菌、典型的には細菌性病原体の特定、
・当該試料中の当該細菌において細胞不活性化、より好ましくは細胞溶解、さらにより好ましくはファージ増殖を引き起こす任意のファージの特定、および／または
・当該細菌によって引き起こされる細菌感染を治療するための、ファージの組成物もしくはカクテルの開発を含む。
【0056】
本明細書中において細菌性病原体または病原性細菌（これらの用語は本明細書中において区別なく使用される）について言及されている場合があるが、本明細書中において記載されるシステムおよび方法は、バリアント、株、種、属、または科のレベルで分類学的に定義された任意の細菌または細菌混合物に対して適用することができる。
【0057】
特定の場合において、患者は既に細菌感染と診断されていてよく、特定の種または属の細菌性病原体が当該感染を引き起こしたことが疑われていてよい。次いで、試料中の当該細菌性病原体またはその純粋培養分離株に対して一群の選択されたバクテリオファージを接触させることによって、当該細菌性病原体に対して当該一群の選択されたファージの各々が有する有効性の研究および測定を試みることができる。当該一群の選択されたバクテリオファージの各々は、好ましくは、疑われている病原体種の少なくとも１つの株に影響を及ぼす能力に基づいて選択されたものである。
【0058】
本発明の実施形態において、バクテリオファージは、特定の細菌性病原体種に対して有効であり得るという理由で選択されてよい。よって、バクテリオファージは、当該種において細胞溶解を引き起こす場合に、好ましくは当該細菌宿主において増殖して宿主細胞内で自身のバクテリオファージＤＮＡを複製できる場合に、有効であるとみなされる。具体的な実施形態において、バクテリオファージは、当該細菌性病原体の様々な株のうちの１つに対して有効であり得るという理由で選択され得る。
【0059】
したがって、当該システムの用途は、どのような細菌であるかを推定して検証すること、および／または１つ以上の株を有する細菌性病原体に対して一群の選択されたバクテリオファージが有する有効性についての結果をもたらすファーゴグラムを提供することであってよい。本明細書中において記載されるシステムおよび方法の利点は、取り扱いおよび手順を迅速化することにより、患者の有効な治療の探求において貴重な時間を無駄にしないようにすることである。
【0060】
ファージは、抗菌剤と同様に、細菌において耐性を生じさせ、耐性を得た変異体は、多くの場合、当該ファージが標的細菌を特定する際に使用する結合受容体が欠如している。病原性細菌にとって、こうした結合受容体は、多くの場合、病態形成の非常に重要な局面に関与する病原性因子でもある。
【0061】
本発明の実施形態において、バクテリオファージは、さらに、細菌性病原体における最大数の異なる受容体をまとめて使用できる能力によって選択されてよい。よって、複数の病原性因子を同時に標的とすることができる。
【0062】
治療の設計を目的とした当該システムの典型的な用途は、試料中の細菌性病原体に対して一群の選択されたファージが有する有効性を測定することに関与し、当該ファージは、最大数の宿主受容体および当該細菌性病原体の様々な株のうちの少なくとも１つを標的とし、当該試料は患者からのそのままの試料またはその純粋培養分離株である。
【0063】
本発明は、ファージと細菌の間の高度に特異的な相互作用を、細菌試料と接触させた際のファージ発現についての様々な結果を測定することによって判断できるという原理に基づく。宿主細菌に及ぼすファージの効果は様々で有り得て、ファージ増殖に関与する細菌が完全に溶解するケースから、はっきりとした効果が見られないケースまである。このような特定の宿主細菌種または株において高い効率で細胞死を引き起こし、好ましくはファージ増殖を伴うようなファージを特定することによって、細菌感染患者のための治療を開発することができる。
【0064】
本発明者らは、このようなファージ発現を、当該ファージがそのサイクルの異なる段階にある際に測定できることを見いだした。
【0065】
バクテリオファージは以下の段階を経て増殖することが知られている。
（１）特定の感受性の宿主細胞に付着し、
（２）宿主の代謝をファージの代謝で置き換えて、細胞増殖を停止させ、
（３）バクテリオファージＤＮＡを複製し、
（４）このバクテリオファージＤＮＡをファージ粒子中にパッケージングして感染性とし、
（５）当該細胞を溶解して感染粒子を放出させ、これが新たな宿主を見つけることができる。
（１）特定の感受性の宿主細胞に付着し、
（２）宿主の代謝をファージの代謝で置き換えて、細胞増殖を停止させ、
（３）バクテリオファージＤＮＡを複製し、
（４）このバクテリオファージＤＮＡをファージ粒子中にパッケージングして感染性とし、
（５）当該細胞を溶解して感染粒子を放出させ、これが新たな宿主を見つけることができる。
【0066】
今回、上述されるサイクルの段階（３）および（５）においてファージの増殖を測定する技術を用いて、ファージと宿主細菌の相互作用を迅速かつ信頼性をもって測定できるということが分かった。
【0067】
図１は、上記細菌において少なくとも細胞不活性化を引き起こす任意のファージを特定する目的を有する、および／または上記細菌によって引き起こされる細菌感染を治療するためのファージの組成物を開発する目的を有する、本発明の実施形態に係る、試料中の細菌を特定するためのシステム１００および方法を、概略的に説明する。よって、本明細書中において記載されるシステム１００および方法は、複数のファージに対する細菌の感受性を測定する。
【0068】
本発明の一態様によれば、システム１００が提供される。システム１００は、複数のウェル１２０を備えるマイクロウェルプレート１１０を備え、上記複数のウェルの各ウェルは複数のファージのうちの１つを含有するように構成され、上記マイクロウェルプレート１１０は、さらに、細菌、好ましくは病原性細菌を備える試料が上記複数のウェルの各ウェルの中に分注されるように構成される。
【0069】
本発明の実施形態によれば、マイクロウェルプレート１１０は、少なくとも６個のウェル、好ましくは少なくとも１２個のウェル、より好ましくは少なくとも２４個のウェル、さらにより好ましくは少なくとも４８個のウェルを備える。さらに、マイクロウェルプレート１１０は、最大で９０００個のウェル、好ましくは最大で５０００個のウェル、より好ましくは最大で１０００個のウェル、さらにより好ましくは最大で５００個のウェル、最も好ましくは最大で２００個のウェルを含有できるということが理解される。典型的には、上記マイクロウェルプレート１１０は、およそ９６個のウェルを含有できる。当該ウェルは、通常、２：３の長方形のマトリックスに配列される。
【0070】
本発明の目的のために、「マイクロウェルプレート」という用語は、「マイクロプレート」または「マイクロタイタープレート」という用語と区別なく使用される。
【0071】
実施形態によれば、ウェルの内容物を保持するため、およびウェルの内容物を環境から分離するために、マイクロプレート１１０の各ウェルの上部が密閉される。このシール（図示せず）は、１つ１つのウェルのための個別のシールであってもよい。好ましくは、上記複数のウェル１２０のすべてのウェルを密閉するために、１つのシールを共通して使用する。
【0072】
好ましくは、ウェルは、１つの透明なポリマーシートによって密閉され、このシートは、たとえば液体分注ロボットにより使用される使い捨てピペットの先端で、穴を開けることができる。
【0073】
マイクロプレート１１０は、ウェルの内容物と実質的に反応しない任意の材料を使用してよいが、好ましくは、ポリカーボネート、ポリプロピレン、もしくはポリスチレンなどのポリマー材料で形成される、またはこれを含有する。マイクロプレートは、ルミネセンスまたは蛍光を測定しやすくするために、黒色または白色などに着色されてもよい。また、マイクロプレートは異なる構造要素を備えていてもよく、そのうちの少なくとも１種は、上述される材料の１種で形成される、またはこれを含有する。９６ウェルマイクロプレートは、典型的には、使用体積が１００μｌ～３６０μｌである。
【0074】
本発明の好ましい実施形態によれば、マイクロプレート１１０のウェルは、各ウェルが１つの型または種のファージを含有するように構成される。
【0075】
バクテリオファージは、１つの特定のファージ型のファージを含有する液体をウェル中に分注することによって挿入されてよく、この液体が続いて蒸発または凍結乾燥により除去されて、固体状のファージがウェルの底に残る。
【0076】
また、ファージは、ウェル中で、たとえば多孔質担体などの担体の一部としての、固体マトリックス中に保持されてもよい。どのような方法が使用されるかにかかわらず、ファージは、液体培地中に、典型的には目的の細菌種を含有する水性培地中に数秒間で溶解し得る。
【0077】
重要なことは、細菌種と近隣ウェルから移動してきたファージとが相互作用することによるウェル間での目立った交差汚染が生じないという点である。
【0078】
好ましい実施形態によれば、マイクロプレート１１０の各ウェルは、最大で１つのファージ型を含有し、このファージは、細菌ドメインの種に影響を及ぼす能力によって選択されたものである。有利にも、これによって、特定種の細菌の存在についての特定を、当該種を含有する試料をすべての使用ウェルに投与して、選択されたファージが当該細菌種に及ぼす効果を観察し、かつ、マイクロプレート１１０上に存在する複数のファージのうちの任意のファージに対する当該細菌の感受性の度合いを観察することによって行なうことができる。
【0079】
細菌種は、当該種の複数の異なる株のうちの１つ以上の形態であってよい。細菌種と相互作用するファージは、その細菌種の複数の株に対して異なる度合いで影響を及ぼすことが知られている。ある細菌種に影響を及ぼすことが知られている選択された一群のファージについて、当該ファージと細菌宿主の相互作用を測定することによって、有利にも、投与された細胞をどのファージがより良好に溶解できるかを導き出すことができる。また、特定の細菌種に対して効果を有する可能性のあることがそれぞれ知られている様々なファージを試験することによって、当該株に対して最も著しい効果を有し得る少なくとも１種のファージを、治療における使用を目的として選択することができる。
【0080】
本発明の実施形態によれば、マイクロプレート１１０は、少なくとも一群の選択されたファージを含有し、一群の選択されたファージとは、特定の細菌性病原体種の少なくとも１つの株に影響を及ぼす能力を有する２つ以上のファージからなる群を指す。
【0081】
好ましくは、当該一群の選択されたバクテリオファージのうちの少なくとも１つとの相互作用を通して、１つの細菌種についてのできるだけ多くの株およびその変異体を、感受性ありと特定できるようにするために、当該選択された一群はできる限り完全なものである。
【0082】
好ましくは、当該特定の細菌性病原体種における最大数の宿主受容体（結合受容体を意味する）を標的とすることができるように、一群の選択されたバクテリオファージはできる限り完全なものであってよい。
【0083】
本発明の実施形態によれば、ファージの数は、試料中の細菌のコロニー形成単位（ＣＦＵ）の数値に対して最適化および適合化されてよい。実際、ウェル中のファージの数が標的細菌細胞の数に対して少な過ぎると、感染する細胞数が少なくなって、生じる複製も少ないために、定量下限を必要以上に低くしないと試験が機能しない。しかしながら、ウェル中のファージ濃度が標的細菌の濃度に対して高過ぎると、検出される子孫ファージが、試料チャンバに添加されるファージの数に埋もれてしまいかねないため、感受性を必要以上に高くする必要がある。好ましくは、ファージの型または種を問わず、マイクロプレート１１０の各ウェル中のファージの数は本質的に同じであって、すべてのウェル中のファージの平均数の偏差は２０％、好ましくは１５％、より好ましくは１０％、さらにより好ましくは５％、最も好ましくは２％を超えない。好ましくは、マイクロプレート１１０の各ウェル中のファージの数は同じである。
【0084】
本発明の実施形態によれば、マイクロプレート１１０のウェルは、プラーク形成単位（ＰＦＵ）が少なくとも１０６である、好ましくはＰＦＵが少なくとも１０７である、ＰＦＵが最大で１０１１である、好ましくはＰＦＵが最大で１０１０である、より好ましくはＰＦＵが最大で１０９であるファージを含有してよい。典型的には、マイクロプレート１１０の１つのウェルのみを占拠しているファージについて、１つのウェルは約１０８ＰＦＵのファージを含有してよい。
【0085】
本発明の実施形態によれば、マイクロプレート１１０は、１つの細菌種の複数の株を標的とする一群の選択されたファージを含有する。代替的には、マイクロプレート１１０は、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる細菌種をそれぞれ標的とする２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の群の選択されたファージを含有する。有利にも、これによって、少なくとも２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の異なる細菌種の存在を特定することができる。
【0086】
１つのマイクロプレートにおいて２つ、３つ、４つ、またはそれ以上の群の選択されたファージを使用することによって、いくつかの細菌種を同時に推定的に特定することができ、複数のファージに対するこれらの種の感受性を試験することができる。
【0087】
よって、そのままの（混合したものであってもよい）試料を試験することができる。次いで、ファージとそのままの試料との間で測定される相互作用を推定して、目的の細菌の存在を正確に示すことができる。
【0088】
本発明の実施形態において、目的の細菌性病原体において細胞不活性化を引き起こす任意のファージの特定が、１つのマイクロプレート１１０の能力を超える場合がある。このような場合には、アレイ状のまたは複数のマイクロプレート１１０が使用される。
【0089】
好ましくは、一群の選択されたバクテリオファージは、マイクロプレート１１０上の隣り合う１セットのウェルを物理的に占有する。
【0090】
その結果として、ファーゴグラムは、有利にも、細菌種が何であると推定されるかと、複数のファージに対する当該種の感受性とを、一目で明らかにすることができる。
【0091】
実施形態によれば、上記マイクロウェルプレート１１０は、複数のファージを備え、そのウェルを密閉するプロテクションを有する、事前に準備したプレートである。この事前に準備したプレートは、液体分注ロボットなどの典型的なラボ用ロボット中に導入できるように構成されたものであり、細菌種を含有する試料を、当該ウェルに分配してその中に分注することによって、当該シールに穴を開けることができる。上記事前に準備したプレートは、典型的には、使い捨てのマイクロウェルプレートである。
【0092】
このような事前に準備したマイクロウェルプレートは、温度２０℃および湿度５０％に保つと、少なくとも１２か月間保管できることが分かった。
【0093】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記複数のウェルのうちの少なくとも１つのウェルには「ブランク」組成物を充填することができ、当該ブランク組成物は、バックグラウンド濃度を上回る任意の濃度の特定のファージ型を含有しない。有利にも、ブランク組成物の測定とその他のファージ含有ウェルの測定とを比較することによって、細菌種に対するファージの効果を調べることができる。
【0094】
本発明の一態様によれば、複数のファージに対する細菌の感受性を測定するための方法が提供される。
【0095】
当該方法は、
上記細菌を備える第１の組成物１３０と、複数のウェル１２０を備える第１のマイクロウェルプレート１１０とを提供する工程であって、上記複数のウェル１２０の各々は上記複数のファージのうちの１つを含有する工程と、
上記第１の組成物１３０の第１の試料１３１を上記複数のウェル１２０のうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する工程と、
上記少なくとも１つのウェルの各々について、上記細菌を備える上記第１の試料１３１と上記ウェル中に含有されるバクテリオファージとの混合物を、第１の期間にわたってインキュベートさせる工程と、
任意に、上記混合物の第２の試料１４１を第２のマイクロウェルプレート１５０に移す工程と、
上記第１のマイクロウェルプレート１１０または第２のマイクロウェルプレート１５０上の各混合物に少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０を添加する工程と、
上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０を入れた後で、少なくとも１つの混合物または上記少なくとも１つの混合物の最終の試料１７１を分析デバイス１８０の中に移動および導入し、上記分析デバイスによって、上記最終の試料について細菌とファージの相互作用を測定する工程と、
コントロールユニット（図示せず）によって、上記分析デバイス１８０で当該測定を解釈してファーゴグラムの形態で提示する工程とを備える。
上記細菌を備える第１の組成物１３０と、複数のウェル１２０を備える第１のマイクロウェルプレート１１０とを提供する工程であって、上記複数のウェル１２０の各々は上記複数のファージのうちの１つを含有する工程と、
上記第１の組成物１３０の第１の試料１３１を上記複数のウェル１２０のうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する工程と、
上記少なくとも１つのウェルの各々について、上記細菌を備える上記第１の試料１３１と上記ウェル中に含有されるバクテリオファージとの混合物を、第１の期間にわたってインキュベートさせる工程と、
任意に、上記混合物の第２の試料１４１を第２のマイクロウェルプレート１５０に移す工程と、
上記第１のマイクロウェルプレート１１０または第２のマイクロウェルプレート１５０上の各混合物に少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０を添加する工程と、
上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０を入れた後で、少なくとも１つの混合物または上記少なくとも１つの混合物の最終の試料１７１を分析デバイス１８０の中に移動および導入し、上記分析デバイスによって、上記最終の試料について細菌とファージの相互作用を測定する工程と、
コントロールユニット（図示せず）によって、上記分析デバイス１８０で当該測定を解釈してファーゴグラムの形態で提示する工程とを備える。
【0096】
本発明の実施形態によれば、第１の組成物１３０は、細菌性病原体または感染病原体であってよい少なくとも１つの目的の細菌種を備える。
【0097】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記第１の組成物１３０は、上記細菌性病原体を含有する患者試料（患者からのそのままの試料）を指し得る、またはこれを含有し得る。上記細菌種とは、本明細書中において、上記方法によって特定されかつ治療が所望され得る、細菌ドメインの目的の種または属を指すことが理解される。患者試料は、その他の種の細菌を含んでいてもよくかつその可能性が非常に高いが、ただ、バクテリオファージと宿主細菌の相互作用の特異性が高いために、当該その他の種が、生じ得るファージ発現の検出を妨げることはないと考えられる。
【0098】
本発明の他の実施形態によれば、上記第１の組成物１３０は、患者のそのままの試料の純粋培養分離株を指す、またはこれを含有する。
【0099】
本明細書中において記載されるシステムおよび方法においてそのままの試料と純粋培養分離株のいずれを使用するかとは独立して、第１の組成物１３０は、さらに、ＭｃＦａｒｌａｎバッファーまたは先行技術において知られている任意のその他の好適なバッファーなどのバッファーを少なくとも含有してもよい。
【0100】
典型的には、第１の組成物１３０は、少なくとも２００ｍｌの体積を有していてよい。
細菌種の試料は、患者（ヒトまたは動物）から得たものであってよい。当該動物は、ウシまたは家畜であってよい。典型的には、当該試料は、細菌感染が疑われる患者から得たものであってよい。
細菌種の試料は、患者（ヒトまたは動物）から得たものであってよい。当該動物は、ウシまたは家畜であってよい。典型的には、当該試料は、細菌感染が疑われる患者から得たものであってよい。
【0101】
当該試料は、対象から得た細胞、組織、生検、分泌物または滲出物、液体、または胃内容物を含んでいてよい。試料の例は、血液、リンパ液、尿、皮膚をこそげ取ったものまたはスワブ、鼻からの分泌物、耳垢、血清、表面洗浄液、血漿、脳脊髄液、唾液、痰、便、嘔吐物、乳汁、涙、汗、生検組織、寝具、敷き藁、または卵洗浄液を含むが、これらに限定されない。
【0102】
しかしながら、特に、環境の一部において細菌汚染が疑われていてさらに生物に感染する可能性がある場合には、当該試料は、当該環境中から得たものであってもよい。別の実施形態において、当該試料は、食物供給源、水源、土壌領域、または建造物などの、環境における場所から得たものである。
【0103】
当該試料の採取元が様々であり得ることを考えれば、その結果として、当該試料中の目的細菌種の濃度も様々であってよい。目的の細菌種を単離せずに、第１の組成物１３０中において直接使用されるそのままの試料について、濃度は少なくとも１０５ＣＦＵ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０６ＣＦＵ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０７ＣＦＵ／ｍｌである必要があることが分かった。しかしながら、このような低濃度は、当該試料の全般的な質による。
【0104】
本発明の好ましい実施形態において、第１の組成物１３０はそのままの患者試料を含有し、組成物１３０中における目的の細菌種の濃度は、少なくとも１０５ＣＦＵ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０６ＣＦＵ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０７ＣＦＵ／ｍｌである。
【0105】
これらの実施形態においては、目的の細菌種を単離し、続いて、上記分析技術の検出限界に起因して要求される所定の濃度まで、上記種を増殖させる必要がない。そのため、患者試料中における特定細菌株の特定から、当該細菌集団に影響を及ぼす少なくとも１つのバクテリオファージの特定までにわたる、患者試料中の感染性細菌の分析を、迅速に実施することができる。このようなバクテリオファージの特定は、次いで、当該患者のための治療へとつながり得る。反応する複数のファージを同時に検出することによって、感染源である細菌種を正確に特定できる。
【0106】
代替的には、細菌種の純粋培養分離株をまず得て、続いてこれを所定の濃度まで増殖させることができる。これは、典型的には、目的の細菌種を好適な培地で増幅することによって行なう。
【0107】
本発明のこれらの他の実施形態において、第１の組成物１３０は、そのままの患者試料から得た純粋分離株を含有し、組成物１３０中における目的細菌種の濃度は、少なくとも１０５ＣＦＵ／ｍｌ、好ましくは少なくとも１０６ＣＦＵ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１０７ＣＦＵ／ｍｌである。
【0108】
本発明に係る方法の一工程において、上記第１の組成物１３０の第１の試料１３１を、マイクロプレート１１０の上記複数のウェル１２０のうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する。好ましくは、マイクロプレート１１０は、本明細書中において上述されるとおりに構成されている。
【0109】
当該細菌およびファージは、好ましくは、上記ウェル中において液体培地中に混合する。当該液体培地をもたらすための液体は、典型的には第１の試料１３１に由来し、少なくとも目的の細菌種とバッファーとを備える。ゲルを使用しないことによって、当該液体培地は、有利にも、上記混合物の試料をさらなる分析の目的でデバイスへと移しやすくする。
【0110】
本発明の好ましい実施形態によれば、液体培地は、本質的にバクテリオファージの集団の全体を２、３秒間で溶解できるように選択される。
【0111】
本発明によれば、ファージがウェル中に入れてあり、細菌種を含有する第１の試料１３１を当該ウェル中のファージに添加する。
【0112】
本発明に係る方法の一工程において、上記ウェル中に含有されるバクテリオファージと混合した上記細菌性病原体を備える上記第１の試料１３１を、第１の期間にわたってインキュベートさせる。
【0113】
本発明の実施形態において、上記第１の期間は、少なくとも３０分間、好ましくは少なくとも４０分間、より好ましくは少なくとも５０分間である。上記第１の期間は、好ましくは２時間を超えず、より好ましくは９０分を超えない。典型的には、上記第１の期間は約１時間である。バクテリオファージと細菌種との間に相互作用が生じ得る場合には、当該期間においてバクテリオファージが細菌種の結合受容体と結合できるということが分かった。
【0114】
上記第１の期間において、当該ファージと目的の細菌種との混合が、少なくとも３０℃、好ましくは少なくとも３３℃、最も好ましくは少なくとも３６℃の温度において生じる。さらに、両成分の混合は高くて４０℃、好ましくは高くて３９℃、最も好ましくは高くて３８℃の温度において生じるということが理解される。典型的には、当該ファージと目的の細菌種とを、ウェル中において約３７℃の温度において混合する。
【0115】
次の工程において、上記混合物の第２の試料１４１を、測定のために分析デバイス１８０中に移して、さらなる特徴づけを行なう。
【0116】
任意に、各ウェルについて、バクテリオファージと細菌種との混合物を含有する第２の試料１４１を第２のマイクロウェルプレート１５０に移し、上記第２のマイクロウェルプレート１５０は、上記混合物を上記分析デバイス１８０中に導入して、そのウェル中の試料をデバイス１８０によって測定できるように構成される。よって、上記第２のマイクロウェルプレート１５０は、分析デバイス１８０（多くの場合には、試料の体積を比較的小さくする必要が有り得る）と適合するように構成される。上記第１のマイクロプレート１１０の第２の試料１４１を上記第２のマイクロプレート１５０に移す際、典型的には、液体ピペッティングロボットを使用することによって行なう。分析デバイス１８０は、次いで、本発明に係る方法の一工程において、第２のマイクロプレート１５０上の試料を分析および測定することができる。本発明に係る方法の次の工程において、次いで、計算手段またはコントロールユニットが、デバイス１８０によってもたらされた測定を処理して、当該測定の解釈およびファーゴグラムの形態での提示のために提供してもよい。
【0117】
本発明に係るシステムおよび方法の実施形態において、計算手段またはコントロールユニットは、上記ファーゴグラムを自動で得ることができるように、本明細書中において提供されるシステムの一部および同方法の工程を誘導するように構成される。
【0118】
コントロールユニットは、マイクロプレート間における試料の移動、混合物およびマイクロプレートの温度の制御、さらなる試薬および／もしくは添加剤１６０の添加の制御、分析デバイス１８０による試料もしくは混合物の分析、ならびに／または測定の結果のファーゴグラムの形態での取得などの当該方法の工程を、誘導、評価、および処理するためのコントローラであってよい、またはこれを含有していてよい。
【0119】
本発明の実施形態において、コントロールユニットは、さらに、上記ファーゴグラムの結果を中央サーバに伝達して、有利にも当該ファーゴグラムを複数のシステム使用者と共有できるように構成されていてよい。
【0120】
本発明の好ましい実施形態において、上記分析デバイス１８０での測定よりも前に、ファージ／細菌混合物にさらなる試薬および／または添加剤１６０を添加する。測定前の投与時間、このような少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０の性質および数は、選択される分析技術に依存する。上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０は、第２のマイクロプレート１５０上にあるファージ／細菌混合物に添加してよい。
【0121】
代替的には、第１のマイクロプレート１１０のウェル中にある混合物を、分析デバイス１８０によって分析する。任意の少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０を、デバイス１８０と適合するように構成されている第１のマイクロプレート１１０のウェル中にあるファージ／細菌混合物に添加し、よって、当該ウェル中の試料をデバイス１８０によって測定することができる。
【0122】
本発明の実施形態において、当該さらなる分析は、
第２の試料１４１中におけるファージＤＮＡの存在量を、ｑＰＣＲおよび蛍光を使用して測定すること、
ルシフェラーゼの添加により生物発光を測定することによって細胞溶解を検出すること、のうちの少なくとも一方を備える。
第２の試料１４１中におけるファージＤＮＡの存在量を、ｑＰＣＲおよび蛍光を使用して測定すること、
ルシフェラーゼの添加により生物発光を測定することによって細胞溶解を検出すること、のうちの少なくとも一方を備える。
【0123】
本発明は、とりわけ、上述される２通りの技術はいずれも、患者試料中におけるファージと宿主細菌細胞の相互作用を妥当な時間内で測定および特定して、最終的に、上記細菌の影響を受ける患者の治療にとって好適である適切なファージまたはファージ組み合わせを選択することができる、という本発明者らの洞察に基づく。
【0124】
いずれも、バクテリオファージと宿主細菌の相互作用を確実に測定できることが分かった。典型的には、一度に、上記２通りの技術のうちの一方のみを使用できる。
【0125】
本発明の実施形態において、上記少なくとも１つの分析デバイス１８０は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）の使用によってファージＤＮＡの濃度勾配を測定することによって、上記複数のファージの各々と上記細菌性病原体の相互作用を測定するように構成される。したがって、ファージと宿主細菌の相互作用は、ポリメラーゼ連鎖反応に基づく周知の実験技術であるｑＰＣＲの使用によって評価する。
【0126】
ＰＣＲのプロセスは、一般的に、
（１）試料を約９４℃～９６℃の温度に加熱して、試料中の二本鎖ＤＮＡの水素結合を切断し、２つの一本鎖ＤＮＡ分子を得ることからなる、変性と、
（２）試料の温度を下げて約５０℃～６５℃として、上記一本鎖ＤＮＡ分子の各々に一本鎖プライマーを結合させることによる、アニーリング（典型的には、各鎖の３’末端が一本鎖ＤＮＡ分子の標的領域とそれぞれ相補的である２つの異なるプライマーを使用）と、
（３）遊離ｄＮＴＰ（デオキシリボースを含有するヌクレオシド三リン酸）を添加して、ＤＮＡポリメラーゼにより反応混合物から新たなＤＮＡ二本鎖を合成させることによる、伸長とを含む、一連の工程からなる。
（１）試料を約９４℃～９６℃の温度に加熱して、試料中の二本鎖ＤＮＡの水素結合を切断し、２つの一本鎖ＤＮＡ分子を得ることからなる、変性と、
（２）試料の温度を下げて約５０℃～６５℃として、上記一本鎖ＤＮＡ分子の各々に一本鎖プライマーを結合させることによる、アニーリング（典型的には、各鎖の３’末端が一本鎖ＤＮＡ分子の標的領域とそれぞれ相補的である２つの異なるプライマーを使用）と、
（３）遊離ｄＮＴＰ（デオキシリボースを含有するヌクレオシド三リン酸）を添加して、ＤＮＡポリメラーゼにより反応混合物から新たなＤＮＡ二本鎖を合成させることによる、伸長とを含む、一連の工程からなる。
【0127】
最適な条件の下で、ＤＮＡ配列の数は、伸長工程を１回行なう毎に２倍になる。連続する各サイクルによって、元の鋳型鎖と新たに生じたすべての鎖とが次の伸長工程のための鋳型鎖となり、これによって、特定のＤＮＡ標的領域が指数関数的に増幅される。変性プロセス、アニーリングプロセス、および伸長プロセスが、１つのサイクルを構成する。標的ＤＮＡを数百万コピー増幅するためには、複数のサイクルが必要である。
【0128】
ＰＣＲプロセスはＤＮＡを増幅させるための高速で安価な方法であるが、ｑＰＣＲまたはリアルタイムＰＣＲは、増幅プロセスをリアルタイムで測定および追従可能であるために、蛍光分光学の使用によりＤＮＡの濃度勾配を測定できるという利点を有する。蛍光分光学または蛍光定量は、本明細書中において、試料中の蛍光を検出および分析するための分析技術を指す。
【0129】
本発明の実施形態において、分子ビーコンプローブを使用して、ファージと宿主細菌との混合物中におけるバクテリオファージの濃度を、当該混合物中の蛍光を測定することによって測定する。
【0130】
本発明の具体的な実施形態において、このような分子ビーコンプローブは、ＴａｑＭａｎプローブである。
【0131】
本明細書中において使用される分子ビーコンプローブは、当該プローブの５’末端に共有結合的に結合したフルオロフォアと、同３’末端におけるクエンチャーとからなる。フルオロフォアとクエンチャーとが近接している限り、クエンチャー分子が、フルオロフォアから放射される蛍光を消失させる。
【0132】
本明細書中において使用される分子ビーコンプローブは、典型的には、当該プローブの配列と相補的である一本鎖ＤＮＡ分子の特定領域内においてアニールするように設計され、特定の１セットのプライマーによって増幅される。
【0133】
伸長工程においてポリメラーゼがプライマーを伸長させて新しい二本鎖を合成するときに、アニールしている分子ビーコンプローブが分解されてフルオロフォアを放出し、フルオロフォアとクエンチャーとが近接でなくなる。これによって、蛍光が検出され、その量は、放出されるフルオロフォアの量と正比例している。得られる蛍光シグナルにより、バクテリオファージＤＮＡ物質の蓄積を定量的に測定することができる。
【0134】
ｑＰＣＲプロセスでは、本質的に、細菌宿主と混合するバクテリオファージを考慮してプライマー、核酸ポリメラーゼ、および分子プローブを選択する。よって、当該分析デバイス１８０によって分析するよりも前に、第１のマイクロプレート１１０または第２のマイクロプレート１５０のウェル中のバクテリオファージと細菌宿主との特定の混合物の各々を、マイクロプレート１１０のウェル中または当該混合物中に存在する特定のバクテリオファージに関連するプライマー、核酸ポリメラーゼ、および分子プローブのうちの少なくとも１つを含有する選択された特定の組成物によってもたらすことができる。
【0135】
本発明の実施形態によれば、当該分析デバイス１８０によって分析するよりも前に試料に添加する上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０は、
・少なくとも１つのプライマー分子と、
・ＤＮＡポリメラーゼと、
・ｄＮＴＰと、
・蛍光を発することのできる分子ビーコンプローブと、
・バッファーと、
・先行技術において知られているｑＰＣＲ増幅適合溶媒および酵素とのうちの少なくとも１種を備える。
・少なくとも１つのプライマー分子と、
・ＤＮＡポリメラーゼと、
・ｄＮＴＰと、
・蛍光を発することのできる分子ビーコンプローブと、
・バッファーと、
・先行技術において知られているｑＰＣＲ増幅適合溶媒および酵素とのうちの少なくとも１種を備える。
【0136】
上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０は、バクテリオファージと宿主細菌との１つの組み合わせに対して固有であってよい。典型的には、上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０は、混合物中のバクテリオファージに対して固有であってよい。
【0137】
本発明者らは、ｑＰＣＲを用いることによって、患者から得た試料中に存在し得る目的の細菌種に対して生産的に感染できるファージとそうでないファージとを区別できることを見い出した。これは、感染細胞中のファージＤＮＡの存在量を直接測定することによって行なう。言い換えると、感染細胞中のファージＤＮＡの複製（またはその欠如）を、目的の細菌に対するファージの感染能力を評価するための指標および比較点として使用する。次いで、その他のファージ／細菌混合物中において、周囲の非感染細胞中で依然として封入されているＤＮＡと、ネガティブコントロールとに対しても、このような比較を行なう。
【0138】
本発明は、ｑＰＣＲは感受性が非常に高いため標的の存在量における小さな変化でさえも測定でき、そのために、複製によって生じるファージＤＮＡ存在量における比較的小さな変化でさえも検出できるという洞察に基づくものである。有利にも、標的に対して特異的であるために、ｑＰＣＲ技術を純粋培養分離株に対してではなく患者試料に対して直接使用することができ、これによって時間を大幅に節約できる。
【0139】
そして、本明細書中において上述される実施形態において、分析デバイス１８０は、ファージＤＮＡの濃度差をリアルタイムで測定することができるｑＰＣＲ分析ツールまたは機器を指し得る。有利にも、このような機器は評価と測定とを平行して実施できるように構成されており、これは、いくつかのウェル中におけるファージＤＮＡの濃度勾配を同時に得ることが可能であるということを意味する。典型的には、当該機器は、９６ウェルマイクロプレートのウェル中における蛍光を測定するように構成される。
【0140】
本発明の実施形態において、上記少なくとも１つの分析デバイス１８０は、ルシフェラーゼ／ルシフェリン複合体の添加によって生じる生物発光を測定することで上記病原体の細胞溶解を検出することにより、上記複数のファージの各々と上記細菌または細菌性病原体の相互作用を測定するように構成される。
【0141】
ルシフェラーゼは、様々な用途で使用される。ルシフェラーゼ介在性の細菌ＡＴＰの酸化を使用することによって微生物が存在するかしないかを判断するアッセイは、ずっと以前から行なわれている。このアッセイは、現在、細菌汚染を検出するための様々な診断および市販キットにおいて使用されている。
【0142】
ルシフェラーゼ酵素によって触媒されて発光する反応は、以下の通りである（式（１））：
【0143】
【化1】
【0144】
式中、ＰＰｉはピロホスフェートに関する。当該ルシフェラーゼ反応において、ルシフェラーゼが適切なルシフェリン基質に対して作用すると発光が生じる。光子の放出を、ルミノメーターまたは改変光学顕微鏡などの光反応式装置によって検出できる。ルシフェラーゼ反応によって、生物学的プロセスを観察することができる。
【0145】
本発明は、ルシフェラーゼがＡＴＰセンサタンパク質として作用し得るという従来からの洞察に基づく。よって、ルシフェラーゼを使用して溶解細胞からのＡＴＰの流出を検出し、これによって、生物発光を通してＡＴＰの放出をリアルタイムで有効に表示する。ルシフェラーゼは、ＡＴＰに駆動されて生物発光を生じて、溶液中のＡＴＰ量が非常に低濃度であっても、これを非常に高い感受性で検出することができる。
【0146】
健康な細菌細胞のほとんどは、細胞１個あたりＡＴＰを約２×１０－１８ｍｏｌ含有しており、市販されるキットおよび分析ツールは、典型的には、検出限界がＡＴＰ １×１０－１７ｍｏｌ～ＡＴＰ １×１０－１３ｍｏｌである。結果として、この原理に基づくアッセイによって、約５～約５０，０００個の範囲の健康な細菌細胞を検出できると考えてよい。本発明者らは、検出限界範囲の上限であっても、適合するルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせによって生じる生物発光の測定という原理に基づく試験は、非常に少量の純粋培養分離株中に存在する生細胞の２％が溶解して放出されるＡＴＰを確実に検出することを見い出した。
【0147】
ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせは使用するバクテリオファージに固有ではないことが分かった。よって、好適なルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせを、バクテリオファージと宿主細菌とのすべての混合物に対して使用してよい。
【0148】
さらに有利にも、ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせが高濃度であっても生物発光測定に影響を及ぼさないということが分かった。
【0149】
本発明の実施形態によれば、当該分析デバイス１８０によって分析するよりも前に試料に添加する上記少なくとも１種の試薬および／または添加剤１６０は、
・ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせまたは複合体であって、これにより、溶解細胞のＡＴＰ枯渇と付随する発光とにより細菌細胞溶解を検出できる、ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせまたは複合体と、
・先行技術において知られているルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体適合溶媒および酵素と、のうちの少なくとも１種を備える。
・ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせまたは複合体であって、これにより、溶解細胞のＡＴＰ枯渇と付随する発光とにより細菌細胞溶解を検出できる、ルシフェリンとルシフェラーゼの組み合わせまたは複合体と、
・先行技術において知られているルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体適合溶媒および酵素と、のうちの少なくとも１種を備える。
【0150】
そして、本明細書中において上述される実施形態において、分析デバイス１８０は、式（１）中に記載される反応によって放射されるルミネセンスを測定することができるルミノメーターまたは光学顕微鏡などの光反応式装置を指し得る。
【0151】
本発明の好ましい実施形態において、このような機器は評価と測定とを平行して実施できるように構成されており、これは、いくつかのウェル中における混合物の生物発光を同時に測定できることを意味する。
【0152】
当該機器は、９６ウェルマイクロプレートのウェル中における生物発光を測定するように構成されていてよい。
【0153】
代替的には、当該機器は、複数の混合物を順次測定できるように構成される。
本発明に係る方法の実施形態において、上記方法は、さらに、コントロールユニットにより提示された上記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を選択する工程を備え、上記ファージの組成物のファージは、上記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する能力によって選択される。
本発明に係る方法の実施形態において、上記方法は、さらに、コントロールユニットにより提示された上記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を選択する工程を備え、上記ファージの組成物のファージは、上記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する能力によって選択される。
【0154】
【0155】
好ましくは、このような組成物は１～３つのファージからなっていてよく、これらの１～３つのファージの各々は、受容体型または受容体ファミリー、好ましくは異なる受容体型を標的とする。ファージ型の組み合わせは、上記細菌によって引き起こされる感染を治療するために使用することができる。
【0156】
実施形態によれば、コントロールユニットは、本明細書中において上述されるシステムを使用し本明細書中において上述される方法に従って上記少なくとも１つの分析デバイスによってファーゴグラムの形態で提供される測定の結果に基づいて、本明細書中において上述される方法の工程を実行するように構成される。
【0157】
コントロールユニットは、得た結果の解釈を、ファージを受容体グループに割り当てることによって（ここで、１つの受容体グループにおける複数のファージは、特定の結合受容体型を介して細菌と相互作用する）、および、当該グループにおける複数のファージを、細菌種と相互作用できたかどうかに基づいてランク付けすることによって行なうことができる。
【0158】
図２ａ～図２ｂについて説明する。特定の場合において、目的の細菌種における５つの異なる受容体ファミリーまたは結合受容体型を認識する１４のファージが、当該種に対して活性を有することが分かる。５つのファージが当該細菌種のα受容体ファミリーを標的とすることが分かり、β受容体ファミリーを標的とする３つのファージと、δ受容体ファミリーを標的とする２つのファージと、γ受容体ファミリーを標的とする１つのファージと、ε受容体ファミリーを標的とする３つのファージとが、当該細菌との相互作用が最大であって当該細菌によって引き起こされる感染を阻止できるとみなすのに適切であるとして特定される。
【0159】
続いて、各受容体ファミリーについて、コントロールユニットは、各受容体グループから、当該関連する受容体ファミリーを標的とするのに最も適切である１つのファージを選択して、当該グループ内において最も良いファージを特定するように構成される。
【0160】
３つのファージからなるカクテルを作製するために、標的とする３つの受容体ファミリーを選択する必要がある。これは、各受容体ファミリー標的を、抗菌剤感受性を示し得るものについては最大から最小まで、そして抗菌剤感受性のないものまで、ランク付けすることによって行ない得る。図２ｂを参照して、α受容体ファミリー、β受容体ファミリー、およびε受容体ファミリーが保持される。
【0161】
受容体グループ内においてファージを選択するために、図２ｃを参照して、コントロールユニットは、ファーゴグラムによって提供される情報を使用することができ、典型的には、当該細菌種と最もよく相互作用したファージを選択することができる、すなわち、当該細菌が最も高い感受性を示したファージを選択する。
【0162】
このプロセスによれば、患者の細菌株の感受性と当該患者の感染についての臨床コンテクストとに合わせてオーダーメイドされ得たカクテルを、医師が処方できるように、自動で提示することができる。
【0163】
ここまで具体的な実施形態を参照して本発明を説明してきたが、これは本発明を説明するためであって限定するためではなく、その範囲は特許請求の範囲によって規定される。熟練した人であれば、請求される発明の範囲から逸脱することなく、本明細書中に記載のものとは異なる特徴組み合わせが有り得るということを容易に理解できる。
【図1】
【図2】
【手続補正書】
【提出日】2022-12-05
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
複数のファージに対する細菌の感受性を測定するためのシステム（１００）であって、前記システム（１００）は、複数のウェル（１２０）を備えるマイクロウェルプレート（１１０）であって、前記複数のウェル（１２０）の各々は複数のファージのうちの１つを含有するのに適しており、前記マイクロウェルプレート（１１０）は、さらに、前記細菌を備える試料が前記複数のウェル（１２０）の各々の中に分注されるのに適している、マイクロウェルプレート（１１０）と、
前記細菌を備える前記試料と前記複数のファージのうちの１つのファージとの少なくとも１つの混合物に添加されるのに適している、少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）と、
測定の結果を解釈してファーゴグラムの形態で提示するように構成されるコントロールユニットであって、前記測定は少なくとも１つの分析デバイス（１８０）によって提供され、前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、コントロールユニットとを備え、
前記少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）は、プライマー分子、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、蛍光を発することのできる分子ビーコンプローブ、バッファー、ならびにｑＰＣＲ増幅適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備え、かつ
前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は、さらに、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することによって、前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、または
前記少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）は、ＡＴＰの枯渇と付随するフルオレセインの発光とによって細菌細胞溶解を検出できるように構成されるルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体、ならびにルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備え、かつ
前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は、さらに、前記発光を測定することによって前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、システム（１００）。
【請求項2】
前記試料は患者からのそのままの試料である、請求項１に記載のシステム。
【請求項3】
前記マイクロウェルプレート（１１０）は使い捨てである、請求項１または２に記載のシステム。
【請求項4】
前記複数のウェル（１２０）は、さらに、少なくとも一群の選択されたファージを含有するように構成され、前記一群の選択されたファージの各々は、１種の特定の細菌種およびその株に対して相互作用および／または不活性化する能力によって選択される、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項5】
前記コントロールユニットは、さらに、前記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を提供するように構成され、前記ファージの組成物は、前記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する、先行する請求項のいずれか１項に記載のシステム。
【請求項6】
複数のファージに対する細菌の感受性を測定するための方法であって、前記方法は、前記細菌を備える第１の組成物（１３０）と、複数のウェル（１２０）を備える第１のマイクロウェルプレート（１１０）とを提供する工程であって、前記複数のウェル（１２０）の各々は前記複数のファージのうちの１つを含有する、工程と、
前記第１の組成物（１３０）の第１の試料（１３１）を前記複数のウェル（１２０）のうちの少なくとも１つのウェルの中に分注する工程と、
前記少なくとも１つのウェルの各々について、前記細菌を備える前記第１の試料（１３１）と前記ウェル中に含有されるバクテリオファージとの混合物を、第１の期間にわたってインキュベートさせる工程と、
各混合物に少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）を添加する工程と、
少なくとも１つの混合物を分析デバイス（１８０）中に移動および導入し、前記分析デバイス（１８０）によって、前記少なくとも１つの混合物について細菌とファージの相互作用を測定する工程と、
コントロールユニットによって、前記分析デバイス（１８０）で前記測定を解釈してファーゴグラムの形態で提示する工程とを有し、
前記少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）は、プライマー分子、ＤＮＡポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、蛍光を発することのできる分子ビーコンプローブ、バッファー、ならびにｑＰＣＲ増幅適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備え、かつ
前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は、さらに、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することによって、前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、または
前記少なくとも１種の試薬および／または添加剤（１６０）は、ＡＴＰの枯渇と付随するフルオレセインの発光とによって細菌細胞溶解を検出できるように構成されるルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体、ならびにルシフェリン／ルシフェラーゼ複合体適合溶媒および／または酵素のうちの少なくとも１種を備え、かつ
前記少なくとも１つの分析デバイス（１８０）は、さらに、前記発光を測定することによって前記複数のファージの各々と前記細菌の相互作用を測定するように構成される、方法。
【請求項7】
前記方法は、前記少なくとも１種の試薬を添加する工程よりも前に、前記混合物の第２の試料（１４１）を第２のマイクロウェルプレート（１５０）に移す工程をさらに備え、前記第２のマイクロウェルプレートは前記分析デバイス（１８０）と適合するように構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
前記第１の組成物（１３０）は患者からのそのままの試料である、請求項６または７に記載の方法。
【請求項9】
前記分析デバイス（１８０）によって細菌とファージの相互作用を測定する工程は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応の使用によってファージＤＮＡの存在量および／または濃度差を測定することを含意する、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記分析デバイス（１８０）によって細菌とファージの相互作用を測定する工程は、ルシフェラーゼの添加により生物発光を測定することによって細胞溶解を検出することを含意する、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記方法は、さらに、前記ファーゴグラムに基づいてファージの組成物を選択する工程を備え、前記ファージの組成物のファージは、前記細菌における最大数の異なる結合受容体型と相互作用する能力によって選択される、請求項６～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
コントロールユニットのプロセッサに請求項１～５に記載のシステムおよび請求項６～１１に記載の方法の機能を実行させるように構成されるコード手段を備えるコンピュータプログラムプロダクト。
【国際調査報告】