特表 2024-509725 ポリマー色素－抗体コンジュゲート間の非特異的相互作用を阻止する組成物および方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-05

(54)【発明の名称】ポリマー色素－抗体コンジュゲート間の非特異的相互作用を阻止する組成物および方法

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/533 20060101AFI20240227BHJP

   G01N 33/48 20060101ALI20240227BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240227BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240227BHJP

   C09B 69/10 20060101ALI20240227BHJP

   C08G 61/12 20060101ALI20240227BHJP

   C08G 65/334 20060101ALI20240227BHJP

   C08L 65/00 20060101ALI20240227BHJP

   C08L 71/02 20060101ALI20240227BHJP

【ＦＩ】

G01N33/533

G01N33/48 P ZNA

G01N33/53 Y

C12Q1/02

C09B69/10 B

C08G61/12

C08G65/334

C08L65/00

C08L71/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548239

(86)(22)【出願日】2022-02-04

(85)【翻訳文提出日】2023-10-04

(86)【国際出願番号】 US2022015296

(87)【国際公開番号】W WO2022170084

(87)【国際公開日】2022-08-11

(31)【優先権主張番号】63/146,498

(32)【優先日】2021-02-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510005889

【氏名又は名称】ベックマン コールター， インコーポレイテッド

【氏名又は名称原語表記】Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ， Ｉｎｃ．

【住所又は居所原語表記】２５０ Ｓ． Ｋｒａｅｍｅｒ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ， Ｂｒｅａ， ＣＡ ９２８２１， Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ｏｆ Ａｍｅｒｉｃａ

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】モンソニス， フレデリック

(72)【発明者】

【氏名】サン， ボイ ホア

(72)【発明者】

【氏名】イーシュワラン， アルンクマール

(72)【発明者】

【氏名】トマスロ， マッシミリアーノ

(72)【発明者】

【氏名】グルニック， セルゲイ

(72)【発明者】

【氏名】ヴェンカテシュ， ラジェシュ

(72)【発明者】

【氏名】スリニバサン， シヴァ ランジニ

【テーマコード（参考）】

2G045

4B063

4J002

4J005

4J032

【Ｆターム（参考）】

2G045AA24

2G045CA01

2G045CA25

2G045CB01

2G045CB03

2G045CB04

2G045CB07

2G045CB30

2G045FA37

2G045FB03

2G045FB12

4B063QA01

4B063QA18

4B063QQ05

4B063QQ08

4B063QR48

4B063QR56

4B063QX02

4J002CE001

4J002CH022

4J002GE00

4J005AA04

4J005BB01

4J005BD06

4J032CA12

4J032CA36

4J032CB03

4J032CF01

4J032CG00

(57)【要約】

本開示は、例えば、生物学的試料のフローサイトメトリー分析における、ポリマー色素コンジュゲート同士の非特異的相互作用を低減するための、ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素および／または消光性部分を含むポリマー色素などのポリマー色素の非蛍光構成成分を含む組成物に関する。このような組成物を使用する方法、およびこのような組成物を含むキットもまた、提供される。ポリマー色素コンジュゲートは、その性質のため、互いに相互作用することができ、非特異的結合をもたらす。本開示は、ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を低減する、または阻止する組成物を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生物学的試料の染色に使用するための、結合パートナーにコンジュゲートされている少なくとも１種の蛍光ポリマー色素と共に使用する組成物であって、
第１のポリマー色素の少なくとも１種の非蛍光構成成分
非イオン性界面活性剤、および
生物学用緩衝液
を含み、
前記組成物の非存在下での前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートと比較した場合、前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートの非特異的結合を低減する組成物。

【請求項2】

第１のポリマー色素の前記非蛍光構成成分が、以下：
０．１以下、０．０６以下または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）
４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の任意蛍光単位（ＡＦＵ）、および
４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光
のうちの少なくとも１つを示す、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記第１のポリマー色素の前記非蛍光構成成分が、ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素、消光性部分を含むポリマー色素および非蛍光ポリマー色素からなる群から選択される、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

ポリマー色素のモノマー構成成分および光退色されたポリマー色素を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項5】

ポリマー色素のモノマー構成成分および消光性部分を含むポリマー色素を含む、請求項３に記載の組成物。

【請求項6】

前記非イオン性界面活性剤が、ポロキサマー非イオン性界面活性剤である、請求項１から５に記載の組成物。

【請求項7】

前記少なくとも１種のポリマー色素が、２種またはそれより多いポリマー色素を含み、各々が、結合パートナーにコンジュゲートされている、請求項１から５に記載の組成物。

【請求項8】

前記２種またはそれより多いポリマー色素コンジュゲートが、異なるポリマー色素を含むか、または同じポリマー色素を含む、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素が、式（Ｉ）による構造

【化59】

を有するポリマーであり、
式中、
Ａはそれぞれ、芳香族コモノマーおよび複素芳香族コモノマーからなる群から独立して選択され、
Ｌはそれぞれ、リンカー部分であり、
Ｍはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、
Ｇ^１およびＧ^２は、非修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から独立して選択され、
ａ、ｃおよびｄは、各々が、均等にまたはランダムに反復され得る、前記構造内の各単位のｍｏｌ％を独立して定義し、ａはそれぞれ、１０～１００％のｍｏｌ％であり、ｃはそれぞれ、０～９０％のｍｏｌ％であり、ｄはそれぞれ、０～２５％のｍｏｌ％であり、
ｂはそれぞれ、独立して、０または１であり、
ｍは、１～約１０，０００の整数である、
請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項10】

前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素が、式（ＸＸ）による構造：

【化60】

を有するポリマーであり、
式中、
Ａはそれぞれ、芳香族コモノマーおよび複素芳香族コモノマーからなる群から独立して選択され、
Ｂはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、
Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団、機能的部分または結合パートナーであり、
Ｇ^１およびＧ^２は、非修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から独立して選択され、
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、リンカー部分であり、
Ｗは、水可溶化部分であり、
下付き文字ｎおよびｍは、独立して、１～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｐは、０～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｎ、ｍおよびｐの合計は、２～１０，０００の範囲であり、
下付き文字ｑは、１、２、３または４であり、
下付き文字ｒは、１、２、３または４であり、
下付き文字ｓは、０、１、２または３であり、
下付き文字ｔは、１または２であり、
下付き文字ｒおよびｓの合計は、１～４の範囲であり、
ＡおよびＢは、前記コンジュゲートされているポリマー中に、ランダムにまたは非ランダムに分布されている、
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項11】

Ｌ^１が、スルホンアミド、スルホンアミド、サルタム、ジスルフィンアミド、アミド、ホスホンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミドおよび二級アミンからなる群から選択される、請求項１０に記載の組成物。

【請求項12】

前記少なくとも１種のポリマー色素にコンジュゲートされている前記結合パートナーが、標的分析対象に特異的に結合することができる分子または分子の複合体である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項13】

前記少なくとも１種のポリマー色素にコンジュゲートされている前記結合パートナーが、タンパク質、親和性リガンド、抗体、抗体断片およびオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項14】

前記結合パートナーが、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記結合パートナーが、免疫グロブリンまたは免疫グロブリンの免疫学的活性部分である、請求項１から１４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項16】

前記結合パートナーが、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片、ＦｖまたはＦａｂ発現ライブラリである、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項17】

少なくとも１種のポリマー色素のモノマー構成成分が、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）部分およびフルオレン部分からなる群から選択される部分を含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記少なくとも１種のポリマー色素の前記モノマー構成成分が、式（ＸＸＩＩ）による化学構造：

【化61】

を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）ベースの水溶性モノマーを含み、
式中、
Ｇ_１、Ｇ_２はそれぞれ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルおよびＰＥＧからなる群から独立して選択され、
Ｒ^２はそれぞれ、水可溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホロアミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド、

【化62】

からなる群から独立して選択され、
Ｒ^３はそれぞれ、水可溶化部分であり、
Ｒ^４はそれぞれ、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水可溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボキシルアミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒドもしくはチオール、またはそれらの保護された基からなる群から独立して選択され、
Ｒ^５はそれぞれ、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸およびＣ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステルからなる群から独立して選択され、
Ｑはそれぞれ、独立して、結合、ＮＲ^４または－ＣＨ_２であり、
Ｚはそれぞれ、独立して、ＣＨ_２、ＯまたはＮＲ^４であり、
ｆはそれぞれ、独立して、０～５０の整数であり、
ｎはそれぞれ、独立して、１～２０の整数である、
請求項３から１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

Ｇ_１およびＧ_２が、それぞれ、ハロであり、Ｚがそれぞれ、Ｏであり、Ｒ_２がそれぞれ、Ｈであり、ｎがそれぞれ、独立して、２～４であり、ｆがそれぞれ、独立して、５～２０であり、必要に応じて、ｎがそれぞれ３である、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記少なくとも１種のポリマー色素の前記モノマー構成成分が、式（ＸＸＩＩＩ）による化学構造：

【化63】

を有するフルオレンベースまたはカルバゾールベースの水溶性モノマーであり、
式中、
Ｇ１、Ｇ２はそれぞれ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルおよびＰＥＧからなる群から独立して選択され、
Ｘはそれぞれ、Ｃ、ＮまたはＳｉであり、
Ｒ^４はそれぞれ、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水可溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボキシルアミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒドもしくはチオール、またはそれらの保護された基からなる群から独立して選択され、
Ｒ５はそれぞれ、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステルおよびＣ_１～Ｃ_１２アルコキシからなる群から独立して選択され、
Ｚはそれぞれ、独立して、ＣＨ_２、ＯまたはＮＲ^４であり、
ｆはそれぞれ、独立して、０～５０の整数であり、
ｎはそれぞれ、独立して、１～２０の整数である、
請求項３から１９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項21】

Ｇ_１およびＧ_２が、それぞれ、ハロであり、Ｚがそれぞれ、Ｏであり、Ｒ_２がそれぞれ、Ｈであり、ｎがそれぞれ、独立して、２～４であり、ｆがそれぞれ、独立して、５～２０であり、必要に応じて、ｎがそれぞれ３である、請求項２０に記載の組成物。

【請求項22】

前記光退色されたポリマー色素が、以下：
０．１以下、０．０６以下または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）
必要に応じて、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）、および
４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光
のうちの少なくとも１つを示すよう、式（Ｉ）、（ＶＩＩＩ）、（ＩＸ）、（Ｘ）、（ＸＩ）、（ＸＩＩ）、（ＸＩＩＩ）、（ＸＩＶ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）または（ＸＸ）による蛍光ポリマー色素をＵＶ光の照射に曝露させることによって調製される、請求項３から２１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項23】

消光性部分を含む前記ポリマー色素が、式（ＸＸ）による構造：

【化64】

を含み、
式中、
Ａはそれぞれ、芳香族コモノマーおよび複素芳香族コモノマーからなる群から独立して選択され、
Ｂはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、
Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団、機能的部分または消光性部分であり、少なくとも１つまたは複数のＥは、消光性部分であり、
Ｇ^１およびＧ^２は、非修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から独立して選択され、
Ｌ^１、Ｌ^２およびＬ^３は、リンカー部分であり、
Ｗは、水可溶化部分であり、
下付き文字ｎは、１～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｍは、１～２５の範囲の整数であり、
下付き文字ｐは、０～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｎ、ｍおよびｐの合計は、２～１０，０００の範囲であり、
下付き文字ｑは、１、２、３または４であり、
下付き文字ｒは、１、２、３または４であり、
下付き文字ｓは、０、１、２または３であり、
下付き文字ｔは、１または２であり、
下付き文字ｒおよびｓの合計は、１～４の範囲であり、
ＡおよびＢは、前記コンジュゲートされているポリマー中に、ランダムにまたは非ランダムに分布されており、
Ｅは、消光性部分であり、
必要に応じて、
消光性部分を含む前記ポリマー色素が、０．１以下の量子収率を示し、さらに必要に応じて、消光性部分を含む前記ポリマー色素が、５０未満のＡＦＵとなる蛍光プロファイルを示す、
請求項３から２２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項24】

前記消光性部分が、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、ＤＹＱ４２５、ＤＹＱ５０５、ＢＨＱ１、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ３５およびＴＡＭＲＡ消光性部分からなる群から選択され、必要に応じて、ｍ＝２～２０、３～１５または５～８である、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記非イオン性界面活性剤が、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシド－ポリエチレンオキシドトリブロックコポリマーである、請求項５から２４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項26】

前記非イオン性界面活性剤が、式（ＸＸＩ）による構造

【化65】

を含み、ａはそれぞれ、独立して、２～１３０の範囲にあり、ｂは、１５～６７の範囲にある、請求項２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記組成物が、複数の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含み、前記組成物が、前記複数の蛍光ポリマー色素コンジュゲート間の前記非特異的結合を実質的に低減する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項28】

双性イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項29】

試料中の分析対象を検出する方法であって、
少なくとも１種のポリマー色素コンジュゲートを、請求項１から２８のいずれか一項に記載の組成物に添加して、ポリマー色素コンジュゲート組成物を形成させるステップ
分析対象を含有することが疑われる生物学的試料に前記ポリマー色素コンジュゲート組成物を接触させて、前記分析対象との蛍光ポリマー色素コンジュゲート複合体を形成させるステップ
少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲート複合体を励起させることができる光源を前記試料に適用するステップ、および
前記蛍光ポリマー色素コンジュゲート複合体から放射された光を検出するステップ
を含む、方法。

【請求項30】

前記生物学的試料が、血液、骨髄、脾臓細胞、リンパ細胞、骨髄穿刺液、尿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、間質液、便、粘液または組織からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記生物学的試料が血液試料である、請求項２９または３０に記載の方法。

【請求項32】

前記生物学的試料が全血である、請求項２９から３１のいずれか一項の記載の方法。

【請求項33】

前記生物学的試料が、全血の１種または複数種の細胞を含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

全血の前記１つまたは複数の細胞が、赤血球、白血球、リンパ球、食細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、好塩基球、好中球、好酸球、血小板、または１種もしくは複数種の検出可能なマーカーを含む任意の細胞である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記生物学的試料が細胞培養物に由来する、請求項２９から３４のいずれか一項の記載の方法。

【請求項36】

前記光源からの光が、約３４０ｎｍ～約８００ｎｍの間または約３４０ｎｍ～約４５０ｎｍの間の波長を有する、請求項２９から３５のいずれか一項の記載の方法。

【請求項37】

前記放射された光が、約４００ｎｍ～約８００ｎｍの間の波長を有する、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

光を検出する前記ステップが、フローサイトメトリーによって分析して、第１のフローサイトメトリープロットを得るステップをさらに含み、
前記生物学的試料を、前記非イオン性界面活性剤および前記第１のポリマー色素の前記非蛍光構成成分を含まない組成物に接触させるステップを含むことで得られる第２のフローサイトメトリープロットと比較した場合、前記第１のフローサイトメトリープロットが、
ポリマー色素コンジュゲートの非特異的相互作用の低減、および
ポリマー色素コンジュゲートの凝集の低減
からなる群のうちの１つまたは複数を示す、請求項２９から３７のいずれか一項の記載の方法。

【請求項39】

請求項１から２８のいずれか一項の記載の組成物を含むキットであって、第１のポリマー色素の前記１種または複数種の非蛍光構成成分；および前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含む個別の容器を含む、キット。

【請求項40】

前記１種または複数種の非蛍光構成成分を含む前記容器中に非イオン性界面活性剤をさらに含む、請求項３９に記載のキット。

【請求項41】

請求項１から２８のいずれか一項の記載の組成物を含むキットであって、１つの容器中に第１のポリマー色素の前記非蛍光構成成分を１種または複数種、および前記非イオン性界面活性剤；ならびに別の容器中に前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含む、キット。

【請求項42】

請求項１から２８のいずれか一項の記載の組成物を含むキットであって、１つの容器中に第１のポリマー色素の２種またはそれより多い前記非蛍光構成成分；および別の容器中に前記少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の引用
本出願は、ＰＣＴ国際特許出願として、２０２２年２月０４日に出願されており、その全体が参照により組み込まれている、２０２１年２月０５日に出願の米国仮出願第６３／１４６，４９８号の利益およびこれに対する優先権を主張する。

【背景技術】

【0002】

背景
ポリマー色素コンジュゲートは明るく、多色フローサイトメトリーアッセイにおいて利用することができる優れた性能をもたらす。一般に、ポリマー色素コンジュゲートは、その特有の複雑な構造のために、高い輝度を示す。しかし、そのような同じ特有の複雑な構造はまた、いくつかの深刻な制限をもたらす。

【0003】

ポリマー色素は、疎水性であり、大きな見かけ分子量を有しており、これによって、ポリマー色素は水性緩衝液中で凝集する傾向がある。したがって、ポリマー色素が抗体にコンジュゲートされると、得られたコンジュゲートもまた、相互に、および／または同一試料中に存在する他のポリマー色素コンジュゲートと相互作用する傾向を有することがある。同じ試料を染色するために１種より多いポリマー色素コンジュゲートを使用する場合、ポリマー色素同士の非特異的相互作用が起こることがあり、これによって、データの補正不十分（under-compensation）がもたらされる恐れがある。

【0004】

ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を排除することができる専用染色緩衝液が高度に望まれている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

要旨
ポリマー色素コンジュゲートは、その性質のため、互いに相互作用することができ、非特異的結合をもたらす。本開示は、ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を低減する、または阻止する組成物を提供する。

【0006】

本開示は、ポリマー色素の１種または複数種の非蛍光構成成分および緩衝液を含む、色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を低減することが可能な組成物を提供する。本組成物は、非イオン性界面活性剤を必要に応じてさらに含んでもよい。本組成物は、タンパク質安定剤を必要に応じてさらに含んでもよい。本組成物は、保存剤を必要に応じてさらに含んでもよい。

【0007】

本開示は、ポリマー色素の１種または複数種の非蛍光構成成分、非イオン性界面活性剤および緩衝液を含む染色用緩衝組成物であって、１種または複数種の蛍光ポリマー色素コンジュゲート間のポリマー－ポリマー相互作用などの非特異的結合を低減することが可能な、染色用緩衝組成物を提供する。

【0008】

ポリマー色素の非蛍光構成成分は、ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素、および消光されたポリマー色素などの消光性部分を含むポリマー色素のうちの１つまたは複数であってよい。

【0009】

本開示は、緩衝液中にポリマー色素のモノマー構成成分を含む組成物を提供する。

【0010】

本開示は、緩衝液中に光退色された色素を含む組成物を提供する。

【0011】

本開示は、緩衝液中に消光されたポリマー色素を含む組成物を提供する。

【0012】

本開示は、緩衝液中にポリマー色素のモノマー構成成分および消光されたポリマー色素を含む組成物を提供する。

【0013】

本開示は、緩衝液中にポリマー色素のモノマー構成成分および光退色された色素を含む組成物を提供する。

【0014】

本開示の組成物は、タンパク質安定剤、非イオン性界面活性剤および／または保存剤を必要に応じてさらに含んでもよい。例えば、本開示の作業濃度の組成物（１×）は、タンパク質安定剤を０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５～５ｍｇ／ｍＬ、１～３ｍｇ／ｍＬまたは約２ｍｇ／ｍＬでさらに含んでもよい。

【0015】

本開示の濃染色用緩衝組成物（１０×）は、タンパク質安定剤を１～１００ｍｇ／ｍＬ、２～５０ｍｇ／ｍＬ、５～４０ｍｇ／ｍＬ、１０～３０ｍｇ／ｍＬまたは約２０ｍｇ／ｍＬでさらに含んでもよい。一部の実施形態では、タンパク質安定剤は、０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．２～５０ｍｇ／ｍＬ、１～２０ｍｇ／ｍＬまたは１～１０ｍｇ／ｍＬで存在する。

【0016】

本開示の作業濃度の組成物（１×）は、非イオン性界面活性剤を０．０１～１０％、０．０１～４％、０．０１～２％、０．０１～０．４％または約０．０２％（重量／体積）で含んでよい。

【0017】

本開示の濃染色用緩衝組成物（１０×）は、非イオン性界面活性剤を０．１～４０％、０．５～２０％、１～１０％または約５％（重量／体積）で含んでよい。

【0018】

本開示の組成物は、保存剤を０．０１～０．５％、０．０３～０．３％または０．０５～０．２％または約０．１％（重量／体積）で必要に応じてさらに含んでよい。

【0019】

例えば、本開示は、０．０１～１０％または０．１～４％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤および必要に応じて０．１～１０ｍｇ／ｍＬまたは０．２～５ｍｇ／ｍＬのタンパク質安定剤を含む、ＰＢＳ緩衝液などの生物学用緩衝液中に、０．３～１．５ｍｇ／ｍＬ、０．５～１．２ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー色素を含む作業濃度の染色用緩衝組成物（１×）を提供する。

【0020】

本開示は、０．１～４０％または１～１０％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤および必要に応じて１～１００ｍｇ／ｍＬまたは２～５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質安定剤を含む、ＰＢＳ緩衝液などの生物学用緩衝液中に、３～１５ｍｇ／ｍＬ、５～１２ｍｇ／ｍＬまたは約１０ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー色素を含む濃染色用緩衝組成物（１０×）を提供する。この組成物は、多色色素コンジュゲートパネルにおいて、非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用を顕著に低減することが見出された。これは、消光されたポリマー色素を含まない同じ試料と比較した場合の、染色して溶解した血液試料のＦＣＡフローサイトメトリー分析において立証された。

【0021】

本開示は、生物学用緩衝液中に、２０～４０ｍｇ／ｍＬまたは約３０ｍｇ／ｍＬの、ポリマー色素のモノマー構成成分；０．２～０．８ｍｇ／ｍＬまたは０．３～０．７ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー色素；および０．０１～１０％または０．１～４％の非イオン性界面活性剤を含む、作業濃度の染色用緩衝組成物（１×）を提供する。作業濃度の組成物（１×）は、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５～５ｍｇ／ｍＬのタンパク質安定剤をさらに含んでもよい。

【0022】

本開示は、生物学用緩衝液中に、２００～４００ｍｇ／ｍＬまたは約３００ｍｇ／ｍＬの、ポリマー色素のモノマー構成成分；２～８ｍｇ／ｍＬまたは３～７ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー色素；および０．１～４０％または１～２０％の非イオン性界面活性剤を含む、濃染色用緩衝組成物（１０×）を提供する。この濃組成物（１０×）は、１～１００ｍｇ／ｍＬまたは５～５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質安定剤をさらに含んでもよい。

【0023】

この組成物は、多色色素コンジュゲートパネルにおいて、非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用を顕著に低減することが見出された。これは、モノマー構成成分を含まず、かつ消光されたポリマー色素を含まない同じ試料と比較した場合の、染色して溶解した全血試料のフローサイトメトリー分析（ＦＣＡ）において立証された。

【0024】

本開示は、生物学用緩衝液中に、２０～４０ｍｇ／ｍＬまたは約３０ｍｇ／ｍＬの、ポリマー色素のモノマー構成成分；０．２～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．３～０．７ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬの光退色されたポリマー色素；および０．０１～１０％または０．１～４％の非イオン性界面活性剤を含む、作業濃度の染色用緩衝組成物（１×）を提供する。作業濃度の組成物（１×）は、０．１～１０ｍｇ／ｍＬまたは０．５～５ｍｇ／ｍＬのタンパク質安定剤をさらに含んでもよい。

【0025】

本開示は、生物学用緩衝液中に、２００～４００ｍｇ／ｍＬまたは約３００ｍｇ／ｍＬの、ポリマー色素のモノマー構成成分、２～８ｍｇ／ｍＬ、３～７ｍｇ／ｍＬまたは約５ｍｇ／ｍＬの光退色されたポリマー色素および０．１～４０％または１～２０％の非イオン性界面活性剤を含む、濃染色用緩衝組成物（１０×）を提供する。この濃組成物（１０×）は、１～１００ｍｇ／ｍＬまたは２～５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質安定剤をさらに含んでもよい。

【0026】

この組成物は、多色色素コンジュゲートパネルにおいて、非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用を実質的に低減することが見出された。これは、モノマー構成成分を含まず、かつ光退色されたポリマー色素を含まない同じ試料と比較した場合の、染色して溶解した全血試料のＦＣＡ分析において立証された。

【0027】

生物学的試料の染色に使用するための、結合パートナーにコンジュゲートされている少なくとも１種の蛍光ポリマー色素と共に使用するための組成物であって、非イオン性界面活性剤；および生物学用緩衝液を含み、該組成物の非存在下での少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートと比較した場合、少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートの非特異的結合を低減する組成物が提供される。非イオン性界面活性剤は、ポロキサマーであってもよい。

【0028】

試料中の分析対象を検出する方法であって、本開示による染色用緩衝組成物に、少なくとも１種または少なくとも２種のポリマー色素コンジュゲートを添加して、ポリマー色素コンジュゲート組成物を形成させるステップ；分析対象を含有することが疑われる生物学的試料にポリマー色素コンジュゲート組成物を接触させて、分析対象との蛍光ポリマー色素コンジュゲート複合体を形成させるステップ；試料に少なくとも１種または少なくとも２種の蛍光ポリマー色素コンジュゲート複合体を励起させることができる光源を適用するステップ；および蛍光ポリマー色素コンジュゲート複合体から放射された光を検出するステップを含む、方法が提供される。光を検出するステップは、フローサイトメトリーによって分析して、第１のフローサイトメトリープロットを得るステップを含むことができ、生物学的試料を、非イオン性界面活性剤を含まず、かつ第１のポリマー色素の非蛍光構成成分を含まない組成物に接触させるステップを含むことで得られる第２のフローサイトメトリープロットと比較すると、第１のフローサイトメトリープロットが、ポリマー色素コンジュゲートの非特異的相互作用の低減；およびポリマー色素コンジュゲートの凝集の低減からなる群のうちの１つまたは複数を示す。

【0029】

生物学的試料は、血液、骨髄、脾臓細胞、リンパ細胞、骨髄穿刺液、尿、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、間質液、便、粘液、組織試料または細胞培養試料とすることができる。生物学的試料は、全血試料であってもよい。

【0030】

光源からの光は、約３４０ｎｍ～約８００ｎｍの間の範囲内の波長、または約３４０ｎｍ～約４５０ｎｍの間の範囲内の波長を有してよい。

【0031】

本開示は、本開示による染色用緩衝組成物を含むキットであって、第１のポリマー色素の１種または複数種の非蛍光構成成分；および少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含む個別の容器を含む、キットを提供する。本染色用緩衝組成物は、１種または複数種の非蛍光構成成分を含む同じ容器中に非イオン性界面活性剤を含んでもよい。本染色用緩衝組成物は、１つの容器中に第１のポリマー色素の２種またはそれより多い非蛍光構成成分および必要に応じて非イオン性界面活性剤；ならびに別の容器中に少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含むことができる。

【図面の簡単な説明】

【0032】

【図1】図１は、染色して溶解した全血を含み、試験染色用緩衝液を事前添加した、または事前添加していない、３種のＳｕｐｅｒＮｏｖａ（ＳＮｖ）色素抗体コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６の混合物を使用した、試験染色用緩衝液のＦＣＡドットプロットの比較を示す。ゲーティングは、リンパ球（ＬＹ）に対するものである。上側の３つのパネルに示されている通り、染色の異常は、試験染色用緩衝液の非存在下で起こり得、データは、補正不十分であるように見え得る。３つの下側のパネルに示されている通り、光退色されたポリマー、およびポリマー色素のモノマー構成成分を含む試験染色用緩衝液の存在下では、非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用の実質的な低減が起こる。

【0033】

【図2A】図２Ａは、染色用緩衝液構成成分を含まない、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８＋ＣＤ１９－ＳＮｖ６０５＋ＣＤ４－ＳＮｖ７８６を含む３種のＳｕｐｅｒＮｏｖａバイオレットポリマー色素コンジュゲートの混合物で染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロットを示す。このドットプロットにおける陽性および陰性細胞集団は並んでおらず、傾いて見え、非特異的なポリマー色素の相互作用であることを示している。

【0034】

【図2B】図２Ｂは、市販の比較染色用緩衝液を含む、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８＋ＣＤ１９－ＳＮｖ６０５＋ＣＤ４－ＳＮｖ７８６を含む３種のＳｕｐｅｒＮｏｖａバイオレットポリマー色素コンジュゲートの混合物で染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロットを示す。図２Ａと比較して、非特異的相互作用がいくらか低減していることが明らかである。

【0035】

【図2C】図２Ｃは、ポロキサマー非イオン性界面活性剤を含む生物学用緩衝液中に、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８＋ＣＤ１９－ＳＮｖ６０５＋ＣＤ４－ＳＮｖ７８６を含む３種のＳｕｐｅｒＮｏｖａバイオレットポリマー色素コンジュゲート、ならびにモノマーＡおよび光退色された色素４２８を含む本開示による試験染色用緩衝液の混合物で染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロットを示す。試験染色用緩衝組成物は、図２Ａと比較すると、漏れ込みが低減したこと、および図２Ｂにおける先行技術の比較緩衝液と比較して、非特異的なポリマー－ポリマー相互作用がいくらか低減したことを示す。

【0036】

【図3】図３は、消光されたポリマーの波長対ＡＦＵの蛍光プロファイルのグラフを示す。ポリマー１ Ｄａｂｃｙｌ（ＱＹ０．０１）、ポリマー２ Ｄａｂｃｙｌ（ＱＹ０．００５）、ポリマー２ ＤＹ４２５Ｑ（ＱＹ０．０１）、ポリマー３ Ｄａｂｃｙｌ（ＱＹ０．００５）、ポリマー３ Ｄａｂｃｙｌ ｐｌｕｓ（ＱＹ０．０１５）およびポリマー３ ＤＹ４２５Ｑ（ＱＹ０．００９）。図３の挿入図は、消光性部分にコンジュゲートする前、および４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に蛍光ＱＹの実質的な低下を示す消光されたポリマーを得るために消光性部分にコンジュゲートした後の、代表的な親蛍光ポリマー（ポリマー３ ＱＹ０．５４）のグラフを示す。ＱＹとは、量子収率を指す。

【0037】

【図4】図４は、染色用緩衝液添加剤である消光されたポリマーを使用しないで、リンパ球にゲーティングされた場合の、２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＵＶ励起性ポリマー色素（ＣＤ４－ＵＶＥＰＤ）およびＣＤ２０－バイオレット励起性ポリマー色素（ＣＤ２０－ＶＥＰＤ）（どちらも、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、左上側のパネル）からなる混合物、ならびに２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、右上側のパネル）からなる混合物で染色した後の、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロット（上側の行の左から右へ）を示す。２種の異なる色素コンジュゲートを消光されたポリマーなしに混合した場合、ドットプロットは、非特異的相互作用および関連漏れ込みを示す。ＣＤ４－ＵＶＥＰＤおよびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部左側のパネル）またはＢＵＶ３９５－ＣＤ４およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部右側のパネル）で染色している間に、本開示による消光されたポリマー（消光されたポリマー２－ＤＹＱ４２５）を添加すると、非特異的相互作用および漏れ込みが低減した。

【0038】

【図5】図５は、染色用緩衝液添加剤である消光されたポリマーを使用しないで、リンパ球にゲーティングされた場合の、２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＵＶ励起性ポリマー色素（ＣＤ４－ＵＶＥＰＤ）およびＣＤ２０－バイオレット励起性ポリマー色素（ＣＤ２０－ＶＥＰＤ）（どちらも、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、左上側のパネル）からなる混合物、ならびに２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、右上側のパネル）からなる混合物で染色した後の、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロット（上側の行の左から右へ）を示す。２種の異なる色素コンジュゲートを消光されたポリマーなしに混合した場合、ドットプロットは、非特異的相互作用および関連漏れ込みを示す。ＣＤ４－ＵＶＥＰＤおよびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部左側のパネル）またはＢＵＶ３９５－ＣＤ４およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部右側のパネル）で染色している間に、本開示による消光されたポリマー（消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌ）を添加すると、非特異的相互作用および漏れ込みが低減した。

【0039】

【図6】図６は、非効果的に光退色された色素（左側のパネル）を含む組成物を用いて調製し、コンジュゲートの望ましくない漏れ込みをもたらした試料中の、ＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８／ＣＤ４－ＳＮｖ７８６の二次元ＦＣＡドットプロットを示す。対照的に、右側のパネルは、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合の、１０ｕｇ／ｍＬにおいてＱＹ≦０．０５６および＜４７ＡＦＵを有する、正確に光退色された色素を含む、本開示による組成物の効果を示している。コンジュゲートの漏れ込みは、著しく低減している。

【0040】

【図7】図７は、生物学的試料中に添加する前の、モノマーＡ＋ポリ－Ｄａｂｃｙｌ添加剤を使用してまたはこれを使用しないで個々に予め配合した、２種のＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素コンジュゲートＣＤ３－ＳＮｖ４２８／ＣＤ１９－ＳＮｖ６０５の二次元ＦＣＡドットプロットを示す。添加剤を使用しない場合（左側のパネル）、非特異的相互作用があることが明白である。モノマーＡ＋ポリ－Ｄａｂｃｙｌ添加剤の存在下（右側のパネル）では、ポリマー色素コンジュゲート同士の非特異的相互作用が実質的に低減する。

【0041】

【図8】図８は、消光されたポリマーを含まない（上側の左）、１％のＰＦ－６８を含む（上側の右）、１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌを含む（下側の左）、１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌおよび１％のＰＦ－６８非イオン性界面活性剤を含む（下側の右）、血液試料中の色素コンジュゲートＣＤ１９－ＳＮｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＣＤ４－ＢＶ６５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との混合物で染色して溶解した細胞のＦＣＡドットプロットを示す。１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌ（ＭＦＩ ２１７２）および１％のＰＦ－６８（ＭＦＩ ２４００）を含む試験試料組成物は、緩衝液を含まない対照試料（ＭＦＩ ７８０４）と比較して、非特異的結合の低減を示した。１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌおよび１％のＰＦ－６８（ＭＦＩ １３２７）を含む試験試料組成物は、対照試料と比較して、ＭＦＩの低下の改善、非特異的結合の低減の改善、およびポリマー－ポリマー相互作用の低減の改善を示した。

【0042】

【図9】図９は、緩衝液を含まない（上部パネル）、０．１％の非イオン性界面活性剤を含む（下側の左パネル）、０．５％非イオン性界面活性剤を含む（下側の中央のパネル）、および１％の非イオン性界面活性剤（重量／体積）を含む（下側の右のパネル）、ＣＤ４－ＢＶ６５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＣＤ１９－ＳＮｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）との混合物で染色して溶解した細胞のＦＣＡドットプロットを示す。上昇した濃度の非イオン性界面活性剤（０．１～１％重量／体積）の存在により、非イオン性界面活性剤が存在しない場合と比較して分離が改善されたことによって立証される通り、混合物中の漏れ込みおよび非特異的相互作用の低減を伴う。

【0043】

【図10】図１０は、染色用緩衝組成物でのＦＣＡ分析における、非特異的相互作用および漏れ込みの低減に有用な、２種の非蛍光ポリマー色素の４１５～７００ｎｍの範囲の発光スペクトルのグラフ、および量子収率を示す。ＤＨＰ－ピロールポリマー（ＱＹ０．０４３）およびＤＨＰ－ニトロキャップポリマー（ＱＹ０．０９２）の構造もまた示す。

【発明を実施するための形態】

【0044】

説明
これより、開示されている主題のある特定の実施形態について詳細に述べ、それらの例を、添付の図面および実施例に一部を例示する。開示されている主題は、列挙されている特許請求の範囲と連携して記載されているが、例となる主題は、特許請求の範囲を開示されている主題に限定することを意図するものではないことが理解されよう。

【0045】

例えば、色素コンジュゲートの多重度を含む多色パネルにおける、ポリマー色素コンジュゲート同士の非特異的相互作用を低減する組成物および方法が、本明細書において提供される。本組成物および方法は、例えば、フローサイトメトリーにおいて、他のチャネルへの漏れ込みの増大をもたらす恐れのある、ポリマー－ポリマー相互作用を低減するために有用である。

【0046】

本開示は、概して、蛍光ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的相互作用を低減するよう設計された染色用緩衝液、このようなポリマーを含む組成物、および結合パートナーにコンジュゲートされている蛍光ポリマー（例えば、本明細書において「ポリマー色素コンジュゲート」と称される、抗体にコンジュゲートされているポリマー色素）を含む組成物を使用する、試料中の分析対象を検出する方法に関する。例えば、本開示による組成物は、ポリマー色素の少なくとも１種または少なくとも２種の非蛍光構成成分、緩衝液、および必要に応じて非イオン性界面活性剤を含む液状染色用緩衝液を含む。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素、および消光性部分を含むポリマー色素のうちの１つまたは複数であってよい。

【0047】

例えば、本明細書に記載されている組成物は、ポリマー色素のモノマー構成成分および光退色されたポリマー色素；ポリマー色素のモノマー構成成分および消光性部分を含むポリマー色素；または光退色されたポリマー色素および非イオン性界面活性剤を含んでもよい。本開示による組成物は、多色パネルにおける、様々なポリマー色素コンジュゲート間の非特異的なポリマー－ポリマー相互作用を低減することが可能である。

【0048】

ポリマー色素
本開示の染色用緩衝組成物は、ポリマー色素の１種または複数種の非蛍光構成成分を含んでよい。非蛍光構成成分は、非蛍光ポリマー色素であってよい。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、消光性部分を含むポリマー色素であってよい。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、光退色されたポリマー色素であってもよい。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、ポリマー色素のモノマー構成成分（「モノマー」）であってもよい。一部の実施形態では、ポリマー色素の非蛍光構成成分は、結合パートナーを含まない。一部の実施形態では、ポリマー色素はまた、ポリマータンデム色素を含む。一部の実施形態では、ポリマー色素はまた、機能的部分にコンジュゲートされているポリマー色素を含む。

【0049】

本開示の組成物は、１種または複数種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートと共に使用することができる。一部の実施形態では、ポリマー色素はまた、結合パートナーにコンジュゲートされているポリマー色素を含む。一部の実施形態では、ポリマー色素はまた、機能的部分にコンジュゲートされているポリマー色素を含む。
蛍光ポリマー色素は、化学的および生物的標的分析対象の分析に特に有用である。蛍光ポリマー色素は、高度に応答性の光学的リポーターであり、それらが含む複数の発色団のために、効率的な光吸収剤である。

【0050】

ポリマー色素は、任意の以前に開示されている蛍光ポリマー色素または市販の蛍光ポリマー色素を含むことができる。例えば、ポリマー色素は、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０２２／０１３１９８号；ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１７／１８０９９８号；米国出願第２０２１／００４７４７６号；米国出願第２０２０／０１９０２５３号；米国出願第２０２０／００４８４６９号；米国出願第２０２０／０１４７６１５号；米国出願第２０２１／０１０８０８３号；米国出願第２０１９／０１９４４６７号；米国出願第２０１８／０３６４２４５号；米国出願第２０１８／０２２４４６０号；米国特許第１１，０３４，８４０号；米国特許第１１，１１９，１０７号；米国特許第１０，９６２，５４６号；米国特許第１０，９２０，０８２号；米国特許第１０，００１，４７５号；米国特許第１０，１０７，８１８号；米国特許第１０，２２８，３７５号；米国特許第１０，８４４，２２８号；米国特許第１０，６０４，６５７号；米国特許第１０，５４５，１３７（Ｂ２）号；米国特許第１０，５３３，０９２号；米国特許第１０，４７２，５２１号；米国特許第１０，２４０，０００号；米国特許第９，７５８，６２５号；米国特許第９，７１９，９９８号；米国特許第７，２１４，４８９号；米国特許第９，０１２，６４３号；米国特許第８，６２３，３３２号；米国特許第８，４３１，４１６号；米国特許第８，３５４，２３９号；米国特許第８，５７５，３０３号；米国特許第８，９６９，５０９号に開示されている任意の色素とすることができ、それらの各々は、それらの全体が本明細書において完全に説明されているかのごとく、参照により組み込まれている。ポリマー色素は、その全体が、あたかも本明細書に完全に説明されているかのごとく、参照により組み込まれている、米国出願公開第２０２０／０１９０２５３（Ａ１）号に開示されている任意の水溶性蛍光ポリマー色素の構造を有することができる。ポリマー色素コンジュゲートは、その全体が、あたかも本明細書に完全に説明されているかのごとく、参照により組み込まれている、米国出願公開第２０１９／０１４４６０１号に開示されている任意の水溶性蛍光ポリマー色素の構造を有することができる。

【0051】

ポリマー色素は、任意の市販のポリマー色素とすることができる。一部の実施形態では、ポリマー色素は、例えば、紫外（例えば、３５１ｎｍ、３５５ｎｍ、３７５ｎｍ、３３４～３６４ｎｍ、３５１～３５６ｎｍ）、バイオレット（例えば、４０５ｎｍ、４０７ｎｍ、４１４ｎｍ、３９５～４２５ｎｍ）、ブルー（例えば、４３６ｎｍ、４５８ｎｍ）、ブルー－グリーン（例えば、４８８ｎｍ）、グリーン（例えば、５１４ｎｍ、５３２ｎｍ、５４１ｎｍ、５５２ｎｍ）、イエロー－グリーン（例えば、５６１ｎｍ、５６３ｎｍ）、イエロー（例えば、５６８ｎｍ）、レッド（例えば、６２７～６４０ｎｍ、６３３ｎｍ、６３７ｎｍ、６４０ｎｍ、６４７ｎｍ）および／または近赤外レーザー（例えば、６７３ｎｍ、７５０ｎｍ、７８０ｎｍ、または６６０～８００ｎｍの範囲）によって励起可能であり得る。ポリマー色素は、バイオレットレーザーによって励起可能なポリマー色素を含むことができる。ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、約３９５ｎｍ～約４２５ｎｍ、例えば、４０５ｎｍ、４０７ｎｍまたは４１４ｎｍの波長のバイオレットレーザーによって励起可能なポリマー色素を含んでもよい。ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、バイオレットレーザー（４０５ｎｍ）により励起可能なポリマー色素を含んでもよい。一部の実施形態では、ポリマー色素は、非蛍光ポリマー色素であってもよい。

【0052】

一部の実施形態では、ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、ＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素（ＳＮ）（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を含んでもよい。ＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素は、フローサイトメトリー用途に有用な、新世代ポリマー色素である。ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、ＳＮｖ４２８、ＳＮｖ６０５またはＳＮｖ７８６を含むことができる。ＳＮｖ４２８は、抗体または他の結合パートナーにコンジュゲートされている場合、かなり明るいコンジュゲートをもたらす、特有の光物理特性を有する。例えば、ＳＮｖ４２８は、４１４ｎｍの励起極大、４２８ｎｍの発光ピークを有するバイオレットレーザー（例えば、４０５ｎｍ）によって最適に励起されるポリマー色素であり、４５０／５０バンドパスフィルターまたは等価物を使用して検出することができる。

【0053】

ＳＮｖ４２８は、バイオレットレーザーによって励起可能な最高輝度の色素の１つであり、したがって、微かに発現されるマーカーの評価に特に適している。抗体とコンジュゲートされているＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素には、抗ＣＤ１９抗体－ＳＮｖ４２８、抗ＣＤ２２抗体－ＳＮｖ４２８、抗ＣＤ２５抗体－ＳＮｖ４２８および抗ＣＤ３８抗体－ＳＮｖ４２８である、抗体－ポリマー色素コンジュゲートが含まれ得る。

【0054】

ＳＮｖ６０５およびＳＮｖ７８６（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）は、コアＳＮｖ４２８から誘導されたタンデムポリマー色素である。どちらも、４１４ｎｍに極大励起を有する、同じ吸光度特徴を共有する。ＳＮｖ６０５およびＳＮｖ７８６は、それぞれ６０５ｎｍおよび７８６ｎｍに発光ピークを有するので、それらは、フローサイトメータの６１０／２０および７８０／６０ｎｍバンドパスフィルターを使用すると最適に検出される。ＳＮｖ６０５およびＳＮｖ７８６は、例えば、抗ＣＤ１９抗体、抗ＣＤ２２抗体、抗ＣＤ２５抗体または抗ＣＤ３８抗体などの結合パートナーとコンジュゲートされ得る。

【0055】

ポリマー色素は、紫外（「ＵＶ」）レーザーによって励起可能なポリマー色素を含んでもよい。ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、３２０ｎｍ～３８０ｎｍ、３４０ｎｍ～３６０ｎｍ、３４５ｎｍ～３５６ｎｍ、または３８０ｎｍ未満もしくはこれに等しいが、３２０ｎｍより長いまたはこれに等しい波長のＵＶレーザーによって励起可能なポリマー色素を含んでもよい。ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、ＵＶ励起可能なポリマー色素を含んでもよい。ＵＶ励起可能なポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、通常、３８０ｎｍ～４３０ｎｍ、４０６ｎｍ～４１５ｎｍ、または４３０ｎｍ未満もしくはこれに等しいが、３８０ｎｍより長いまたはこれに等しい波長において発光することができる。

【0056】

ポリマー色素は、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ４２１（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大４２１ｎｍ、４５０／５０フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５１０（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大５１０ｎｍ、５１０／５０フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ５７０（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大５７０ｎｍ、５８５／４２フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６０５（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大６０３ｎｍ、６１０／２０フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６５０（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大６４５ｎｍ、６６０／２０フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７１１（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大７１１ｎｍ、７１０／５０フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７５０（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大７５０ｎｍ、７８０／６０フィルター）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ７８５（商標）（励起極大４０５ｎｍ、発光極大７８５ｎｍ、７８０／６０フィルター）などのＢｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ（商標）色素（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）／Ｓｉｒｉｇｅｎ Ｇｒｏｕｐ Ｌｔｄ．）を含むことができる。

【0057】

ポリマー色素またはポリマー色素コンジュゲートは、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）Ｖｉｏｌｅｔ（「ＢＶ」）ポリマー色素（Ｂｅｃｔｏｎ、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ａｎｄ Ｃｏ．、ＢＤ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含んでよい。ポリマー色素は、ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ（商標）ＢＶ４２１（４５０／４０または４３１／２８フィルター）、ＢＶ４８０（５２５／４０フィルター）、ＢＶ５１０（５２５／４０フィルター）、ＢＶ６０５（６１０／２０フィルター）、ＢＶ６５０（６６０／２０フィルター）、ＢＶ７１１（７１０／５０フィルター）、ＢＶ７８６（７８６／６０フィルター）であってもよい。

【0058】

ポリマー色素は、モノマーの重合によって合成的に調製されてもよく、これによって、高度にコンジュゲートされた蛍光主鎖の形成がもたらされる。キャッピングは、適切な官能基を使用する活性化によりポリマー上に行われてよく、これによって、結合パートナーにコンジュゲートすることができるポリマーをもたらす。代替的に、ポリマーは、ポリマー主鎖からの適切な官能基を結合することによって、アクセプター色素をコンジュゲートまたは結合するために、活性化されてもよい。活性化ポリマーは、例えば、結合パートナー、アクセプター色素または消光性部分にコンジュゲートすることができる。任意の適切な結合パートナー、例えば、抗体が使用され得、次いで、例えば、標準手順を使用することにより精製されてよい。官能基は、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、および基質または結合パートナーにコンジュゲートするためのそれらの保護された基からなる群から選択することができる。

【0059】

ポリマー色素は、以下に限定されないが、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、フルオレンおよびそれらの組合せを含めた、アリールおよび／またはヘテロアリールモノマーサブユニットを有する蛍光ポリマー色素を含んでもよい。一部の実施形態では、ポリマー色素は、式Ｉの構造：

【化1】

を有することができ、
式中、
モノマーＡはそれぞれ、独立して、芳香族コモノマーまたは複素芳香族コモノマーであり、
必要に応じたＭはそれぞれ、芳香族コモノマーまたは複素芳香族コモノマーであり、必要に応じたＬはそれぞれ、リンカーであり、
Ｇ^１およびＧ^２は、それぞれ、修飾ポリマー末端または非修飾ポリマー末端であり、
ａはそれぞれ、１０～１００％のｍｏｌ％であり、ｃはそれぞれ、０～９０％のｍｏｌ％であり、ｄはそれぞれ、０～２５％のｍｏｌ％であり；ｂはそれぞれ、独立して、０または１であり；ｍはそれぞれ、１～約１０，０００の整数である。

【0060】

本開示全体を通して使用される場合、「ａ」、「ｂ」、「ｃ」および「ｄ」は、各単位のｍｏｌ％を定義し、これらはそれぞれ、均等にまたはランダムに反復され得る。

【0061】

モノマーＡはそれぞれ、水可溶化基、および／または例えば、アクセプター色素、結合パートナーもしくは消光性部分とコンジュゲートされ得る必要に応じた官能基により置換されていてもよい。式Ｉの構造を有するポリマー中のモノマーＡはそれぞれ、同じモノマーであってもよい。式Ｉの構造を有するポリマー色素中のモノマーＡはそれぞれ、異なるモノマーであってもよい。モノマーＡは、例えば、９，１０－フェナントレンジオンベースのモノマー（例えば、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）ベースのモノマー）、フルオレンベースのモノマー、フルオレノオキセピンベースのモノマーであってもよい。

【0062】

モノマーＡは、例えば、式（ＩＩ）の構造：

【化2】

を有する、ＤＨＰベースのモノマー、フルオレンベースのモノマーまたはカルバゾールモノマーであってもよい。

【0063】

本明細書において使用する場合、「Ｘ」はそれぞれ、独立して、Ｃ、ＮまたはＳｉとすることができる。

【0064】

本明細書において使用する場合、「Ｙ」はそれぞれ、ＣＨ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＳｉＲ^１Ｒ^２または結合からなる群から独立して選択される。Ｙが結合である場合、Ｘは、両方の環に直接、結合している。

【0065】

本開示全体で使用される場合、「Ｒ^１」はそれぞれ、独立して、水可溶化部分、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ、カルボン酸、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド

【化3】

である。

【0066】

本明細書において使用する場合、「Ｒ^２」はそれぞれ、独立して、水可溶化部分、リンカー部分、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、（ヘテロ）アリールオキシ、（ヘテロ）アリールアミノ、スルホンアミド－ＰＥＧ、ホスホロアミド－ＰＥＧ、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、スルホンアミド、スルフィンアミド、ホスホンアミデート、ホスフィンアミド

【化4】

である。

【0067】

本明細書において使用する場合、「Ｒ^３」はそれぞれ、独立して、水可溶化部分であってよい。「Ｒ^３」はそれぞれ、独立して、Ｈ、アルキル、アルケン、アルキン、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノまたはＰＥＧ基とすることができる。

【0068】

本明細書において使用する場合、「Ｒ^４」はそれぞれ、独立して、Ｈ、アルキル、ＰＥＧ、水可溶化部分、リンカー部分、発色団、カルボキシルアミン、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボン酸エステル、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒドもしくはチオール、またはそれらの保護された基である。

【0069】

本明細書において使用する場合、「Ｒ^７」はそれぞれ、Ｈ、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_１８（ヘテロ）アリールアミノ、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸、Ｃ_２～Ｃ_１２カルボン酸エステルまたはＣ_１～Ｃ_１２アルコキシである。

【0070】

本明細書において使用する場合、「Ｑ」はそれぞれ、独立して、結合、ＮＲ^４または－ＣＨ_２である。

【0071】

本明細書において使用する場合、「Ｚ」はそれぞれ、独立して、ＣＨ_２、ＯまたはＮＲ^４である。

【0072】

本明細書において使用する場合、一部の場合、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３またはＲ^４の少なくとも１つは、水可溶化部分を含む。

【0073】

本明細書において使用する場合、ｆはそれぞれ、独立して、０～５０、１～５０、２～４０、５～２０の整数であり、ｎはそれぞれ、独立して、１～２０の整数である。

【0074】

ＤＨＰベースのモノマーＡは、例えば、式（ＩＩＩ）の構造：

【化5】

を有することができる。

【0075】

ＤＨＰモノマーは、例えば、式（ＩＶ）の構造：

【化6】

を有することができる。

【0076】

式Ｉの構造を有するポリマー中のモノマーＡは、例えば、ＸがそれぞれＣまたはＮである式（Ｖａ）または（Ｖｂ）の構造：

【化7】

を有するフルオレンベースのモノマーまたはカルバゾールベースのモノマーであってもよい。

【0077】

モノマーＡはまた、架橋モノマーであってもよい。例えば、架橋モノマーは、式（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）または（ＶＩｃ）の構造：

【化8】

を有してもよい。

【0078】

式Ｉの構造を有するポリマー中のモノマーＡは、例えば、式（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）または（ＶＩＩｃ）の構造を有するオキセピンベースのモノマー（例えば、フルオレノオキセピンベースのモノマー）：

【化9】

であってもよい。

【0079】

式Ｉの構造を有するポリマー中のモノマーＡは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０２２／０１３１９８に記載されている、ビナフチニルモノマーであってもよい。ビナフチニルベースのモノマーは、式（ＶＩＩｄ）：

【化10】

を有してもよい。

【0080】

式Ｉの構造を有するポリマー中の必要に応じたＭはそれぞれ、ポリマー鎖に沿って均等にまたはランダムに分布されたポリマー修飾単位であってよく、本明細書において定義されている通り、１つまたは複数の必要に応じて置換されているＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３またはＲ^４基により必要に応じて置換されていてもよい。

【0081】

必要に応じたＭはそれぞれ、必要に応じて置換されているエチレンまたはエチニレンであってよい。Ｍはそれぞれ、必要に応じて置換されているエチレン部分、すなわち、式－ＣＲ＝ＣＲ－を有する炭素－炭素二重結合であってもよく、Ｒはそれぞれ、独立して、Ｈ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ハロアルキル、アルコキシ、（ヘテロ）アリールオキシ、アリール、（ヘテロ）アリールアミノ、ＰＥＧ基、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテルまたは部分

【化11】

である。Ｍはそれぞれ、エチニレン部分、すなわち、式－Ｃ≡Ｃ－を有する炭素－炭素三重結合であってもよい。

【0082】

必要に応じたＭはそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等に分布されていてもランダムに分布されていてもよい。必要に応じたＭはそれぞれ、バンドギャップ改変モノマーであってもよい。必要に応じたＭはそれぞれ、独立して、以下

【化12】

【化13】

【化14】

であってもよく、式中、Ｍはそれぞれ、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、アミド、スルホンアミド、エーテル、チオエーテル、チオカルバメート、ヒドロキシル、ヨードアセチル、ヒドラジド、ヒドラジノ、ケトン、ホスフィン、エポキシド、ウレア、チオウレア、チオエステル、イミン、ジスルフィド、および別の基質、アクセプター色素、分子または結合パートナーにコンジュゲートするためのそれらの保護された基から選択される官能基により置換され得る、および終端され得る。

【0083】

本明細書において使用する場合、「Ｒ^５」はそれぞれ、独立して、Ｈ、Ｃ_１～Ｃ_２０アルキル、Ｃ_２～Ｃ_２０アルケニル、Ｃ_２～Ｃ_２０アルキニル、Ｃ_３～Ｃ_２０シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_２０ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_２０アルコキシ、Ｃ_２～Ｃ_２６アリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_２６ヘテロアリールオキシ、Ｃ_２～Ｃ_２６アリールアミノまたはＣ_２～Ｃ_２６ヘテロアリールアミノである。

【0084】

式Ｉの構造を有するポリマー中の必要に応じたＬはそれぞれ、リンカーである。Ｌはそれぞれ、ポリマー主鎖に沿って均等にまたはランダムに分布されている、アリール基またはヘテロアリール基であってよい。Ｌは、ポリマー主鎖に沿って均等にまたはランダムに分布されているアリール基またはヘテロアリール基であってもよく、アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオール、および基質または結合パートナーにコンジュゲートするためのそれらの保護された基からなる群から選択される官能基により終端された１つまたは複数のペンダント鎖により必要に応じて置換されていてもよい。必要に応じたＬはそれぞれ、独立して、

【化15】

【化16】

であってもよい。

【0085】

本明細書において使用する場合、Ｒ^６はそれぞれ、独立して、Ｈ、ＯＨ、ＳＨ、ＮＨＣＯＯ－ｔ－ブチル、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ_２、（ＣＨ_２）_ｎＮＨ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＯ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯ－（ＣＨ_２）_ｎ－ＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯＯＣ（ＣＨ_３）_３、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（Ｃ_３～Ｃ_１２）シクロアルキル、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２ＣＨ_２Ｏ）_ｆ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｎＮＨＣＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＯＯ（ＣＨ_２）_ｎＣＨ_３、（ＣＨ_２）_ｎ（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３、Ｎ－マレイミド、ハロゲン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルケン、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキン、Ｃ_３～Ｃ_１２シクロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２ハロアルキル、Ｃ_１～Ｃ_１２（ヘテロ）アリール、Ｃ_１～Ｃ_１２（ヘテロ）アリールアミノ、ベンジル（１つまたは複数のハロゲン、ヒドロキシル、Ｃ_１～Ｃ_１２アルコキシまたは（ＯＣＨ_２ＣＨ_２）_ｆＯＣＨ_３により必要に応じて置換されている）

【化17】

である。

【0086】

Ｇ^１およびＧ^２はそれぞれ、独立して、水素、ハロゲン、アルキン、必要に応じて置換されているアリール、必要に応じて置換されているヘテロアリール、ハロゲン置換アリール、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、アジド、スルホネート、ホスフェート、ボロン酸置換アリール、ボロン酸エステル置換アリール、ボロン酸エステル、ボロン酸、必要に応じて置換されているジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、必要に応じて置換されているテトラヒドロピレン（ＴＨＰ）、必要に応じて置換されているフルオレン、またはアリールもしくはヘテロアリール（アミン、カルバメート、カルボン酸、カルボキシレート、マレイミド、活性化エステル、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドラゾン、アジド、アルキン、アルデヒド、チオールから選択される官能基で終端された１つもしくは複数のペンダント鎖により置換されている）、および基質または結合パートナーにコンジュゲートされていてもよいそれらの保護された基であってよい。Ｇ^１およびＧ^２はそれぞれ独立して、

【化18】

【化19】

であってもよい。

【0087】

キャッピング単位は、当分野で公知の機構により、ならびにこれらの両方の全体が本明細書において組み込まれている米国出願公開第２０１９／０１４４６０１号および米国出願公開第２０２０／０１９０２５３号に教示されている通りに本発明のポリマー主鎖にコンジュゲートされ得る。

【0088】

式（Ｉ）の構造を有するポリマー色素は、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、フルオレン、カルバゾールおよび／またはビナフチルモノマー、ならびにＤＨＰ、フルオレン、カルバゾールおよび／またはビナフチルモノマーの組合せ物を利用することができる。式（Ｉ）の構造を有するポリマー色素は、式（ＩＩ）による構造を有するモノマーＡを利用することができ、式中、「Ｘ」はそれぞれ、独立して、Ｃ、ＮまたはＳｉであってよく、「Ｙ」はそれぞれ独立して、ＣＨ_２、ＣＲ^１Ｒ^２、ＳｉＲ^１Ｒ^２または結合であってよい。Ｙが結合である場合、Ｘは、両方の環に直接、結合している。

【0089】

例えば、ポリマー色素は、式（ＶＩＩＩ）の構造：

【化20】

を有してもよい。

【0090】

ポリマー色素は、式（ＩＸ）の構造：

【化21】

を有してもよい。

【0091】

一部の場合、ポリマーは、式（Ｘ）の構造：

【化22】

を有してもよい。

【0092】

一部の場合、ポリマーは、式（ＸＩ）の構造：

【化23】

を有してもよい。

【0093】

一部の場合、ポリマーはコポリマーであり、式（ＸＩＩ）の構造：

【化24】

を有する。

【0094】

一部の場合、ポリマーはコポリマーであり、式（ＸＩＩＩ）の構造：

【化25】

を有する。

【0095】

一部の場合、ポリマーはコポリマーであり、式（ＸＩＶ）の構造：

【化26】

を有しており、
式中、
Ｂはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、
Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団、機能的部分または結合パートナーであり、
下付き文字ｎおよびｍは、独立して、１～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｐは、０～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｎ、ｍおよびｐの合計は、２～１０，０００の範囲であり、
ｔはそれぞれ、１～２０の範囲の整数である。

【0096】

本明細書に記載されているポリマーは、５，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、１０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、１５，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、２０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、２５，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、３０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、４０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、５０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、６０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、７０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、８０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、９０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、または１００，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、最小数平均分子量（Ｍｎ）を特徴とすることができる。

【0097】

本明細書に記載されているポリマーは、５，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、１０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、１５，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、２０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、２５，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、３０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、４０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、５０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、６０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、７０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、８０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、９０，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、または１００，０００ｇ／ｍｏｌより大きな、最小重量平均分子量（Ｍｗ）を特徴とすることができる。

【0098】

用語「Ｍｗ」とは、重量平均分子量を指し、「Ｍｎ」とは、数平均分子量を指す。数平均分子量および重量平均分子量の値は、ポリマー標準物質（例えば、ポリスチレンまたは同様の物質）を使用するゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によって求めることができる。

【0099】

コンジュゲートされているポリマー
式（Ｉ）の構造を有するポリマーは、アクセプター色素、消光性部分および／または結合パートナーを含めた官能基とコンジュゲートされ得る。コンジュゲートは、式（Ｉ）のポリマー構造中のモノマーＡ、Ｌ、Ｇ１またはＧ２などの、ポリマーの様々な位置で行われてよい。

【0100】

例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第２０１９／０１４４６０１号に開示されている通り、アクセプター色素は、リンカーＬを介してポリマーに結合することができる：

【化27】

【0101】

タンデムポリマー色素および他の官能基化ポリマーは、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第２０２０／０１９０２５３号に記載されている通り、重合後のポリマー中間体の修飾によって調製することができる。例えば、式（ＸＶＩ）を有するペンダント可溶化基が、モノマーＡに結合されていてもよく：

【化28】

式（ＸＶＩＩ）による官能基化可溶化基：

【化29】

に変換されてもよく、式中、Ｗは、水可溶化部分であり、Ｌ^１およびＬ^２は、連結部分である。一部の例では、式（ＸＶＩ）の構造を有するＬ１－Ｗ基は、Ｒ^１であってもよく、またはＲ^２であってもよい。一部の実施形態では、Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団、消光性部分などの機能的部分または結合パートナーである。一部の実施形態では、Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団（例えば、および独立して選択される発蛍光団）である。一部の実施形態では、ポリマー中のＥ部分はすべて、同じ構造を有する。一部の実施形態では、ポリマー中のＥ部分は、異なる構造を有する。式（ＸＶＩ）および式（ＸＶＩＩ）による基中の水可溶化部分Ｗは、例えば、アンモニウムアルキル塩、アンモニウムアルキルオキシ塩、アンモニウムオリゴエーテル塩、スルホネートアルキル塩、スルホネートアルコキシ塩、スルホネートオリゴエーテル塩、スルホンアミドオリゴエーテル、オリゴ（エチレングリコール）またはポリ（エチレングリコール）であってよい。

【0102】

連結部分Ｌ^１およびＬ^２は、独立して、以下に限定されないが、共有結合、Ｃ_１～８アルキレン、２～８員のヘテロアルキレンであってよい。一部の実施形態では、リンカーは、単一原子、線状鎖、分岐鎖、環式部分である。一部の実施形態では、リンカーは、長さが２～５０個の間の主鎖原子、または長さが２～２０個の間の主鎖原子などの、長さが２～１００個の主鎖原子（例えば、炭素原子）からなる鎖である。ある特定の場合、リンカー主鎖の１個、２個、３個、４個もしくは５個、またはそれより多くの炭素原子は、硫黄、窒素または酸素により必要に応じて置き換えられ得る。主鎖原子の間の結合は、飽和または不飽和であり得、通常、１個、２個または３個以下の不飽和結合が、リンカー主鎖に存在する。リンカーは、１つまたは複数の置換基（例えば、アルキル基またはアリール基）を含むことができる。リンカーは、非限定的に、オリゴ（エチレングリコール）；エーテル；チオエーテル；三級アミン；およびアルキレン基（すなわち、二価アルキルラジカル）を含むことができ、これらは、直鎖または分岐鎖であり得る。リンカー主鎖は、環式基、例えば、二価アリールラジカル、二価複素環式ラジカルまたは二価シクロアルキルラジカルを含むことができ、この場合、環式基の２個またはそれより多い原子、例えば、２個、３個または４個の原子が主鎖に含まれる。

【0103】

Ｌ^１は、スルホンアミド、スルフィンアミド、ジスルホンアミド、ジスルフィンアミド、サルタム、アミド、二級アミン、ホスホンアミド、ホスフィンアミド、ホスホンアミデート、セレノンアミドまたはセレニンアミドを含むことができる。一部の実施形態では、Ｌ^１は、スルホンアミド、アミド、二級アミンまたはホスホンアミドを含む。一部のこのような実施形態では、Ｌ^２は、線状または分岐状の、飽和または不飽和Ｃ_１～３０アルキレン基を含み、Ｃ_１～３０アルキレン基中の１個または複数の炭素原子は、Ｏ、Ｓ、ＮＲ^ａによって必要に応じておよび独立して、置き換えられており、Ｃ_１～３０アルキレン中の隣接炭素原子の２つまたはそれより多い団（grouping）は、必要に応じておよび独立して、－ＮＲ^ａ（ＣＯ）－または－（ＣＯ）ＮＲ^ａ－により置き換えられており、Ｒ^ａはそれぞれ、ＨおよびＣ_１～６アルキルから独立して選択される。

【0104】

ポリマーは、第１の工程において、式（ＸＶＩ）によるペンダント可溶化基中のＬ^１の内部位置をリンカー部分Ｌ^２の第１の末端に共有結合させて、次に、第２の工程において、色素または他の官能基または結合パートナーＥをリンカー部分Ｌ^２の第２の末端に共有結合させることによって官能基化することができる。一部の実施形態では、Ｌ^１中の窒素原子（例えば、アミド窒素、スルホンアミド窒素またはホスホンアミド窒素）は、好適な脱離基を有するリンカー部分Ｌ^２の第１の末端において、このリンカー部分Ｌ^２を使用してアルキル化される。一部の実施形態では、例えば、脱離基は、ハロゲン（例えば、クロロ、ブロモまたはヨード）である。一部の実施形態では、脱離基は、スルホン酸エステル（すなわち、－ＯＳ（Ｏ）_２Ｒであり、Ｒは、アルキル、ハロアルキル、アリールまたは置換アリールである）である。好適なスルホン酸エステルには、以下に限定されないが、メシレート（メタンスルホネート）、トリフレート（トリフルオロメタンスルホネート）、ベシレート（ベンゼン－スルホネート）、トシレート（ｐ－トルエンスルホネート）およびブロシレート（４－ブロモベンゼンスルホネート）が含まれる。

【0105】

任意の好適な溶媒が、Ｅ基によるポリマーの官能基化の間の、アルキル化工程に使用されてよい。好適な溶媒には、以下に限定されないが、トルエン、塩化メチレン、酢酸エチル、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、ベンゼン、クロロホルム、ジエチルエーテル、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、石油エーテルおよびそれらの混合物が含まれる。アルキル化反応は、通常、約２５℃～約１００℃の範囲の温度において、ポリマー中の１つまたは複数のペンダント基に連結部分Ｌ^２または連結された官能基－Ｌ^２－Ｅを導入するのに十分な期間で行われる。反応は、反応に使用されるポリマーおよび試薬に応じて、数分間から数時間の範囲、またはそれより長い間の期間に行うことができる。例えば、反応は、約１０分間、または約３０分間、または約１時間、または約２時間、または約４時間、または約８時間、または約１２時間、約４０℃、または約５０℃、または約６０℃、または約７０℃、または約８０℃で行うことができる。

【0106】

連結部分Ｌ^２の第２の末端は、第１の工程（例えば、アルキル化工程）の間に、保護形態で使用される官能基（例えば、アミンまたはカルボン酸）を含むことができ、この官能基は、次に、色素または他の官能基または結合パートナーＥを連結部分の第２の末端に共有結合する前に脱保護される。アミン保護基の例には、以下に限定されないが、ベンジルオキシカルボニル；９－フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）；ｔｅｒｔ－ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）；アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）；ｐ－トルエンスルホニル（Ｔｏｓ）；２，２，５，７，８－ペンタメチルクロマン－６－スルホニル（Ｐｍｃ）；２，２，４，６，７－ペンタメチル－２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）；メシチル－２－スルホニル（Ｍｔｓ）；４－メトキシ－２，３，６－トリメチルフェニルスルホニル（Ｍｔｒ）；アセトアミド；フタルイミドなどが含まれる。アミン、カルボン酸、アルコールおよびさらなる官能基のためのこのような保護基および他の保護基は、例えば、ＧｒｅｅｎおよびＷｕｔｓ（Protective Groups in Organic Synthesis, 4^th Ed 2007, Wiley-Interscience, New York）によって記載されている公知技法を使用して、本開示のポリマーに付加および除去することができる。

【0107】

例えば、消光性部分などの、色素、結合パートナーおよび官能基の付加は、任意の好適な方法を使用して行うことができる。例えば、アミド連結は、Ｌ^２の脱保護した一級アミン基とカルボキシレート官能基化色素との間で形成される。色素は、活性化型で使用されてもよく、例えば、試薬としてＥ－Ｃ（Ｏ）Ｘ’を使用することができ、ここでＸ’は脱離基である。活性化カルボキシレート官能基化試薬には、以下に限定されないが、酸無水物（対称な混合酸無水物または環式無水物を含む）、活性化エステル（例えば、ｐ－ニトロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、Ｎ－スクシンイミジルエステルなど）、アシルアゾール（例えば、カルボニルジイミダゾールを使用して調製されるアシルイミダゾールなど）、アシルアジドおよび酸ハロゲン化物（例えば、酸塩化物）が含まれる。代替的に、カップリング剤を使用して、Ｌ^２の脱保護した一級アミン基とカルボキシレート官能基化発色団Ｅ－Ｃ（Ｏ）ＯＨとの間でアミド連結結合を形成してもよい。カップリング剤は、ポリマーアミン基との反応前に、活性化された色素試薬を形成するために使用されてよい。任意の好適なカップリング剤が、使用されてよい。一部の実施形態では、カップリング剤は、カルボジイミド、グアニジニウム塩、ホスホニウム塩またはウロニウム塩である。カルボジイミドの例には、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）－カルボジイミド（ＥＤＣ）などが含まれる。ホスホニウム塩の例には、以下に限定されないが、（ベンゾトリアゾール－１－イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＰｙＢＯＰ）；ブロモトリス（ジメチルアミノ）ホスホニウムヘキサフルオロホスフェート（ＢｒｏＰ）などが含まれる。グアニジニウム／ウロニウム塩の例には、以下に限定されないが、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－Ｏ－（Ｎ－スクシンイミジル）ウロニウムテトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）；Ｏ－（ベンゾトリアゾール－１－イル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチル－ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）；２－（７－アザ－１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチル－ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）；１－［（１－（シアノ－２－エトキシ－２－オキソエチリデン－アミノオキシ）ジメチルアミノモルホリノ）］ウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＣＯＭＵ）などが含まれる。溶媒、反応時間および他の反応条件は、具体的なポリマーおよび色素／官能基の性質などの因子に応じて、上記の通り様々となり得る。

【0108】

例えば、色素、結合パートナー、官能基および消光性部分の付加は、式（ＸＶＩＩＩａ）によるポリマー

【化30】

を式（ＸＶＩＩＩ）によるポリマー

【化31】

に変換することを含むことができ、
式中、
Ａはそれぞれ、独立して、芳香族コモノマーまたは複素芳香族コモノマーであり、
Ｌ１^ａはそれぞれ、共有結合、Ｃ_１～８アルキレン、Ｃ_１～８アルコキシ、２～８員のヘテロアルキレン、－ＮＨＣ（Ｏ）Ｌ^ａ－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＬ^ａ－および－Ｃ（Ｏ）Ｌ^ａ－からなる群から独立して選択され、
Ｌ^２は、共有結合、Ｃ_１～８アルキレン、２～８員のヘテロアルキレン、－Ｌ^ｂＮＨＣ（Ｏ）－、－Ｌ^ｂＣ（Ｏ）ＮＨ－、－Ｌ^ｂＣ（Ｏ）－、－Ｃ（Ｏ）ＮＨＬ^ｂ－および－Ｃ（Ｏ）Ｌ^ｂ－からなる群から選択され、
Ｌ^ａおよびＬ^ｂは、Ｃ_１～８アルキレンおよび２～８員のヘテロアルキレンからなる群から独立して選択され、
Ｗは、水可溶化部分であり、
Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団、機能的部分、消光性部分または結合パートナーであり、
Ｂはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、
Ｇ^１およびＧ^２は、非修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から独立して選択され、
Ｒ^８は、本明細書の上に定義されているＲ^１、Ｈまたはアミン保護基からなる群から選択され、
下付き文字ｎおよびｍは、独立して、１～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｐは、０～１０，０００の範囲の整数であり、
下付き文字ｎ、ｍおよびｐの合計は、２～１０，０００の範囲であり、
下付き文字ｑは、１、２、３または４であり、
下付き文字ｒは、１、２、３または４であり、
下付き文字ｓは、０、１、２または３であり、
下付き文字ｔは、１または２であり、
ＡおよびＢは、蛍光ポリマー中に、ランダムにまたは非ランダムに分布している。

【0109】

式（ＸＶＩＩＩａ）のポリマーの式（ＸＶＩＩＩ）によるポリマーへの変換には、上記の通り、１つまたは複数のアルキル化工程あるいは１つまたは複数のアミド形成工程が含まれてもよい。

【0110】

一部の実施形態では、ポリマー色素コンジュゲートは、式（ＸＩＸ）によるタンデム色素コンジュゲート：

【化32】

である。

【0111】

任意の好適な発色団または発蛍光団は、ポリマーの官能基化使用することができる。一般に、好適な発色団および発蛍光団は、ペンダント可溶化基に共有結合することができる（例えば、上記の連結部分Ｌ^２を介する）、反応性基（例えば、カルボキシレート部分、アミノ部分、ハロアルキル部分など）を有する。好適な発色団および発蛍光団の例には、以下に限定されないが、米国特許第７，６８７，２８２号、同第７，６７１，２１４号、同第７，４４６，２０２号、同第６，９７２，３２６号、同第６，７１６，９７９号、同第６，５７９，７１８号、同第６，５６２，６３２号、同第６，３９９，３９２号、同第６，３１６，２６７号、同第６，１６２，９３１号、同第６，１３０，１０１号、同第６，００５，１１３号、同第６，００４，５３６号、同第５，８６３，７５３号、同第５，８４６，７３７号、同第５，７９８，２７６号、同第５，７２３，２１８号、同第５，６９６，１５７号、同第５，６５８，７５１号、同第５，６５６，４４９号、同第５，５８２，９７７号、同第５，５７６，４２４号、同第５，５７３，９０９号、および同第５，１８７，２８８号に記載されているものが含まれ、これらの特許は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれている。ポリマー色素およびモノマーはまた、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、ＵＳ２０２０／０１９０２５３に記載されている。

【0112】

例えば、Ｅは、ＦＩＴＣ、ＣＹ３Ｂ、Ｃｙ５５、Ａｌｅｘａ ４８８、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、Ｃｙ５、Ｃｙ７、Ａｌｅｘａ ７５０または８００ＣＷとすることができる。

【0113】

例えば、発色団Ｅは、以下の構造：

【化33】

を有する、ホウ素－ジピロメテン部分とすることができ、
式中、
Ｒ^６ａ、Ｒ^６ｂ、Ｒ^６ｃ、Ｒ^６ｄ、Ｒ^６ｅ、Ｒ^６ｆおよびＲ^６ｇのうちの６つは、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１～６アルキル、Ｃ_３～８シクロアルキル、Ｃ_６～１０アリール、Ｃ_７～１６アリールアルキル、Ｃ_１～６アシルおよび－ＳＯ_３Ｈから独立して選択され、Ｒ^６ａ、Ｒ^６ｂ、Ｒ^６ｃ、Ｒ^６ｄ、Ｒ^６ｅ、Ｒ^６ｆおよびＲ^６ｇのうちの１つは、連結部分－Ｌ^２－である。Ｒ^６ａおよびＲ^６ｃは、独立して選択されるＣ_１～６アルキル（例えば、メチルまたはエチル）であり、Ｒ^６ｅ、Ｒ^６ｆおよびＲ^６ｇのうちの１つは、連結部分－Ｌ^２－である。一部の実施形態では、Ｒ^６ａおよびＲ^６ｃはメチルであり、Ｒ^６ｇは連結部分－Ｌ^２－である。

【0114】

発色団Ｅは、以下の構造：

【化34】

を有する、シアニン部分とすることができ、
式中、
Ｒ^６ｈおよびＲ^６ｉは、Ｈ、Ｃ_１～６アルキル、（ＣＨ_２）_ｔＣＯＯＨ、（ＣＨ_２）_ｔＳＯ_３Ｈおよび連結部分Ｌ^２から独立して選択され、
下付き文字ｔはそれぞれ、独立して、１～１０の整数であり、
Ｒ^６ｊおよびＲ^６ｋは、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１～６アルキル、必要に応じて置換されている縮合Ｃ_６～１０アリール（例えば、必要に応じて置換されているベンゾ）、－ＳＯ_３Ｈ、－ＰＯ_３Ｈ_２、－ＯＰＯ_３Ｈ_２、－ＣＯＯＨおよび連結部分Ｌ^２から独立して選択され、
Ｙはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ^６ｌ）_２、－ＣＨ＝ＣＨ－およびＮＲ^６ｌから独立して選択され、Ｒ^６ｌはそれぞれ、独立して、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
下付き文字ｎは、１～６の整数であり、ただし、Ｒ^６ｈ、Ｒ^６ｉ、Ｒ^６ｊおよびＲ^６ｋの１つだけが、連結部分－Ｌ^２－であることを条件とする。

【0115】

発色団Ｅは、以下の構造：

【化35】

を有する、クマリン部分とすることができ、
式中、
Ｗは、ＮまたはＣＲ^６ｐであり、
Ｚは、Ｏ、ＳまたはＮＲ^６ｑであり、
Ｒ^６ｍ、Ｒ^６ｎ、Ｒ^６ｏ、Ｒ^６ｐはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１～６アルキル、－ＣＮ、－ＣＦ_３、－ＣＯＯＲ^３ｖ、－ＣＯＮ（Ｒ^３ｖ）_２、－ＯＲ^３ｖおよび連結部分－Ｌ^２－から独立して選択され、
Ｒ^６ｎは、－ＯＲ^３ｖおよび－Ｎ（Ｒ^３ｖ）_２から選択され、
Ｒ^６ｑはそれぞれ、Ｈ、Ｃ_１～６アルキルおよび連結部分－Ｌ^２－から独立して選択され、ただし、Ｒ^６ｍ、Ｒ^６ｎ、Ｒ^６ｏ、Ｒ^６ｐおよびＲ^６ｑのうちの１つだけが、連結部分－Ｌ^２－であることを条件とする。

【0116】

発色団Ｅは、以下の構造：

【化36】

を有する、キサンテン部分とすることができ、
式中、
Ｔは、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｒ^６ｕ）_２およびＮＲ^６ｕから選択され、Ｕは、ＯまたはＮ（Ｒ^６ｕ）_２であり、
Ｒ^６ｒはそれぞれ、Ｈ、ハロゲン、Ｃ_１～６アルキル、－ＳＯ_３Ｈおよび連結部分－Ｌ^２－から独立して選択され、
Ｒ^６ｓは、Ｈ、－ＯＨ、－ＯＲ^６ｕ、－Ｎ（Ｒ^６ｕ）_２および連結部分－Ｌ^２－から選択され、
Ｒ^６ｔは、Ｈ、Ｃ_１～６アルキル、Ｒ^６ｖおよび連結部分－Ｌ^２－から選択され、
Ｒ^６ｕはそれぞれ、独立して、ＨまたはＣ_１～６アルキルであり、
Ｒ^６ｖは、

【化37】

から選択され、
式中、
Ｒ^６ｗはそれぞれ、Ｈおよび連結部分－Ｌ^２－から独立して選択され、
ただし、Ｒ^６ｒ、Ｒ^６ｓ、Ｒ^６ｔおよびＲ^６ｖのうちの１つだけが、連結部分－Ｌ^２－であることを条件とする。

【0117】

キサンテン部分はフルオレセインとすることができ、ＴおよびＵはＯであり、Ｒ^６ｓはＯＨであり、Ｒ^６ｔは、

【化38】

である。

【0118】

キサンテン部分は、エオシンとすることができ、ＴおよびＵはＯであり、Ｒ^６ｓはＯＨであり、Ｒ^６ｒはそれぞれ、ハロゲン（例えば、ブロモ）であり、Ｒ^６ｔは、

【化39】

である。

【0119】

キサンテン部分はローダミンとすることができ、ＴはＯであり、ＵはＮ（Ｒ^６ｕ）_２（例えば、＝ＮＨ_２ ^＋）であり、Ｒは－Ｎ（Ｒ^６ｕ）_２（例えば、－ＮＨ_２）であり、Ｒ^６ｔは、

【化40】

である。

【0120】

キサンテン部分は、以下の構造：

【化41】

を有する、ローダミンとすることができ、
式中、Ｒ^６ｖは、

【化42】

から選択され、
Ｒ^６ｗの１つはＨであり、もう一方のＲ^６ｗは連結部分－Ｌ^２－である。

【0121】

発色団に加えて、他の機能性部分は、本明細書において提供される方法を使用して、官能基化ポリマーに結合され得る。例えば、機能的部分「Ｅ」は、ビオチン、ジゴキシゲニン、ペプチドタグ（ＦＬＡＧペプチドなど）、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとすることができる。本明細書において使用する場合、用語「ＦＬＡＧペプチド」とは、アミノ酸配列Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ｌｙｓ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ（すなわち、ＤＹＫＤＤＤＤＫ）を含有する、オリゴペプチドまたはポリペプチドを指す。ＦＬＡＧペプチドおよびそのバリアントは、例えば、Ｈｏｐｐらに対する米国特許第４，７０３，００４号に記載されており、この特許は参照により本明細書に組み込まれている。ＦＬＡＧペプチドの代わりに使用することができる他のペプチドには、以下に限定されないが、配列Ｔｙｒ－Ｐｒｏ－Ｔｙｒ－Ａｓｐ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｓｐ－Ｔｙｒ－Ａｌａ（すなわち、ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）を含有するＨＡペプチドタグ、配列Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ－Ｈｉｓ（すなわち、ＨＨＨＨＨＨ）を含有するＨｉｓ_６ペプチドタグ、および配列Ｇｌｕ－Ｇｌｎ－Ｌｙｓ－Ｌｅｕ－Ｉｌｅ－Ｓｅｒ－Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ａｓｐ－Ｌｅｕ（すなわち、ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）を含有するＭｙｃペプチドタグが含まれる。ペプチドタグは、都合のよい同定および／または定量のために、比色試薬、化学発光試薬などと使用するための抗体または他の結合部分によって認識され得る。ヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ）は、例えば、その公開公報が参照により本明細書に組み込まれている、ＷＯ２０１６／０１９９２９（Ｎａｖｒａｔｉｌら）に記載されている、相補性プライマーまたは他の相補性ヌクレオチドによって認識され得る。本明細書において使用する場合、用語「ジゴキシゲニン」とは、３－［（３Ｓ，５Ｒ，８Ｒ，９Ｓ，１０Ｓ，１２Ｒ，１３Ｓ，１４Ｓ，１７Ｒ）－３，１２，１４－トリヒドロキシ－１０，１３－ジメチル－１，２，３，４，５，６，７，８，９，１１，１２，１５，１６，１７－テトラデカヒドロシクロペンタ［ａ］－フェナントレン－１７－イル］－２Ｈ－フラン－５－オン（ＣＡＳ登録番号１６７２－４６－４）およびその置換アナログを指す。本明細書において使用する場合、用語「ビオチン」とは、５－［（３ａＳ，４Ｓ，６ａＲ）－２－オキソヘキサヒドロ－１Ｈ－チエノ［３，４－ｄ］イミダゾール－４－イル］ペンタン酸（ＣＡＳ登録番号５８－８５－５）およびその置換アナログを指す。

【0122】

ＣＤ１９－ＳＮ ｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮ ｖ６０５などの結合パートナー－色素コンジュゲートを合成するため、ポリマー色素は、異なる特異度の結合パートナー、例えば、標的分析対象特異的抗体にコンジュゲートされてもよい。

【0123】

本明細書において使用する場合、「結合パートナー」とは、標的分析対象に特異的に結合することができる、任意の分子または分子の複合体を指す。結合パートナーは、例えばタンパク質（例えば、抗体または抗原結合性抗体断片）、有機低分子、炭水化物（例えば、多糖）、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質、親和性リガンド、アプタマーなどとすることができる。一部の実施形態では、結合パートナーは、抗体またはその断片である。一部の実施形態では、結合パートナーは、標的分析対象に特異的に結合する、抗体またはその抗原結合性断片である。特異的結合とは、本発明の文脈では、不均一な集団の存在下、標的分析対象の存在を決定づける、結合反応を指す。したがって、ある特定のアッセイ条件下では、指定された結合パートナーは、特定のタンパク質、または特定のタンパク質のアイソフォームに優先的に結合し、試料中に存在する他のタンパク質または他のアイソフォームには有意な量で結合しない。

【0124】

一部の場合、抗体は、静注用免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）および／またはＩＶＩＧに由来する抗体（例えば、ＩＶＩＧから富化したもの、ＩＶＩＧから精製したもの、例えば、ＩＶＩＧから親和性精製したもの）を含む。ＩＶＩＧは、多数の（例えば、時に、１，０００～６０，０００に及ぶ）正常かつ健常な血液ドナーからの血漿（例えば、一部の場合、任意の他のタンパク質を含まない）からプールしたＩｇＧ（免疫グロブリンＧ）を含有する血液製剤である。ＩＶＩＧは、市販されている。ＩＶＩＧの態様は、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許出願公開第２０１０／０１５０９４２号；同第２００４／０１０１９０９号；同第２０１３／０１７７５７４号；同第２０１３／０１０８６１９号；および同第２０１３／００１１３８８号に記載されている。

【0125】

結合パートナーが、抗体である場合、それらは、モノクローナル抗体であってもポリクローナル抗体であってもよい。用語「抗体」とは、本明細書において使用する場合、免疫グロブリン分子、および例えば、標的分析対象中の抗原に特異的に結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子の免疫学的活性部分を指す。このような抗体には、以下に限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、単一特異的ポリクローナル抗体、抗体模倣体、キメラ、単鎖、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）_２断片、ＦｖおよびＦａｂ発現ライブラリが含まれる。一部の場合、抗体は、定義される部分クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３およびＩｇＭ）のモノクローナル抗体である。抗体の組合せ物が使用される場合、抗体は、同じ部分クラスまたは異なる部分クラスに由来し得る。例えば、抗体は、ＩｇＧ１抗体とすることができる。一部の実施形態では、モノクローナル抗体は、ヒト化される。抗体断片は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦａｂ’分子などの分子を含むことができる。抗体誘導体は、抗体、またはキメラ抗体などの付加もしくは置換を有するその断片を含む。抗体は、組換え方法により、または当分野で公知の任意の他の方法で、ヒトまたは動物源から、ハイブリドーマから誘導され得る。

【0126】

抗体、または標的分析対象特異的抗体断片もしくは誘導体以外の結合パートナーもまた、本システムおよび方法に使用することができる。例えば、結合パートナーは、核酸、またはオリゴヌクレオチドもしくはＰＮＡプローブなどの核酸アナログであってもよい。一実施形態では、アプタマーを特異的結合パートナーとして使用することができる。アプタマーは、タンパク質およびペプチドを含む予め選択された標的に、高い親和性および特異性で結合することができる、一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）分子である。標的分析対象に結合して一対の受容体－リガンド、酵素－基質、酵素－阻害剤および酵素－補因子の対を形成することができる他の結合パートナーもまた、使用することができる。このような結合パートナーの対の具体例には、炭水化物とレクチン、ビオチンとアビジンまたはストレプトアビジン、葉酸とフォレート結合タンパク質、ビタミンＢ１２と固有因子、プロテインＡと免疫グロブリン、およびプロテインＧと免疫グロブリンが含まれる。同様に、標的分析対象と共有結合を形成する結合パートナーが含まれる。

【0127】

ポリマー色素コンジュゲートは、当業者に公知の技法を使用して、結合パートナーにコンジュゲートされている任意の公知のポリマー色素を含むことができる。一部の実施形態では、ポリマー色素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第２０２０／０１９０２５３号に記載されている、コアポリマーの直接修飾の方法を使用して、結合パートナーにコンジュゲートさせて、ポリマー色素コンジュゲートを形成することができる。

【0128】

一部の例では、ポリマー色素は、その全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第２０１９／０１４４６０１号に記載されている方法を使用して、結合パートナーにコンジュゲートさせて、ポリマー色素コンジュゲートを形成することができる。その方法は、以下のように図示することができる：

【化43】

【0129】

標的分析対象
本開示はまた、試料中の標的分析対象を検出する方法であって、標的分析対象が、標的抗原を含み、その存在量／濃度が何らかの分析手順によって求められる物質、例えば分子とすることができる、方法に関する。本発明は、特定の標的分析対象の存在、および一部の場合、その量を検出するよう設計されている。用語「標的分析対象」とは、生物学的試料中で検出されるべき標的抗原を含有する標的分子、例えば、ペプチド、タンパク質、ポリヌクレオチド、有機分子、糖および他の炭水化物、脂質および低分子を指す。標的分析対象が液体試料中に含まれること、および本発明の標的分析対象特異的結合パートナーに結合するため、接近可能であることまたはある時点において接近可能にされることが、本開示の重要な態様である。標的分析対象は、血液試料、細胞系成長試料、組織培養試料などの、生物学的試料中に観察され得る。

【0130】

標的分析対象は、例えば、核酸（ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡまたはｒＲＮＡ）、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、脂質、イオン、単糖、オリゴ糖、多糖、リポタンパク質、グリコタンパク質、糖脂質またはそれらの断片とすることができる。標的分析対象は、タンパク質とすることができ、例えば、構造的マイクロフィラメント、微小管および中間体フィラメントタンパク質、細胞小器官特異的マーカー、プロテアソーム、膜貫通タンパク質、表面受容体、核膜孔タンパク質、タンパク質／ペプチドトランスロカーゼ、タンパク質フォールディングシャペロン、シグナル伝達足場、イオンチャネルなどとすることができる。タンパク質は、活性化可能なタンパク質、あるいは以下に限定されないが、転写因子、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ結合性タンパク質および修飾タンパク質、核内輸入および輸出受容体、アポトーシスまたは生存の調節因子などを含む、罹患細胞または異常細胞において識別的に発現または活性化されるタンパク質とすることができる。

【0131】

標的分析対象は、細胞の表面に存在することができ、接近可能であり得る。有用な分析対象の例示的な例は、以下に限定されないが、以下：１）特異的細胞表面マクロ分子および抗原（ホルモン、タンパク質複合体、および細胞受容体によって認識される分子を含む）、および２）異常なＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、または異常量のある特定のメッセンジャーＲＮＡを含めた、透過性細胞中の細胞タンパク質、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。これらの分析対象の検出は、分析対象が、様々ながんの早期に発見されるなどの、希少細胞中に含まれている、および／または希少細胞の識別子である状況において特に有用となることがある。

【0132】

一部の例では、標的分析対象は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ４５、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６４、ＣＤ９５、ＣＤ１０３、ＨＬＡ－ＤＲ、ＩＦＮ－アルファ、ＩＦＮ－ベータ、ＴＮＦ－アルファもしくはＺＡＰ－７０または目的の他の標的分析対象であってよい。

【0133】

ポリマー色素の非蛍光構成成分
本開示による組成物は、ポリマー色素の少なくとも１種または少なくとも２種の非蛍光構成成分を含むことができる。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、ポリマー色素のモノマー構成成分、非蛍光ポリマー色素、光退色されたポリマー色素、および消光性部分を含むポリマー色素からなる群から選択されてよい。一部の実施形態では、ポリマー色素の非蛍光構成成分は、結合パートナーを含まない。

【0134】

ポリマー色素のモノマー構成成分
本明細書に記載されている組成物は、他の構成成分のうち、本明細書に記載されているポリマー色素のモノマー構成成分（本明細書において、「モノマー」、例えば、モノマーＡおよび／またはモノマーＢとも称される）を含む。ポリマー色素のモノマー構成成分は、水溶性モノマーであってもよい。

【0135】

水溶性モノマーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含むモノマー単位であってよく、上記の単位の各々は、それらの単位に結合した水可溶化部分を必要に応じて有する。水可溶化部分は、１つまたは複数のポリ（エチレングリコール）部分であってもよい。

【0136】

ポリマー色素のモノマー構成成分は、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）ベースのモノマー、フルオレンベースのモノマーおよび／またはカルバゾールベースのモノマーを含んでよい。
例えば、水溶性モノマーは、アリール部分またはヘテロアリール部分を含むモノマー単位、例えば、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、（ＩＶ）、（Ｖａ）、（Ｖｂ）、（ＶＩａ）、（ＶＩｂ）、（ＶＩｃ）、（ＶＩＩａ）、（ＶＩＩｂ）、（ＶＩＩｃ）、（ＶＩＩｄ）、（ＸＸＩＩ）および／または（ＶＶＩＩＩ）による構造を有する本開示のモノマーであってよく、例えば、波線によって表されるモノマーの両末端は、独立して、またはどちらも、Ｐｄもしくはニッケル塩を触媒とする重合反応を受けることができる、ハロゲン原子、ボロン酸エステルまたはボロン酸、シリル、ジアゾニウム塩、トリフレート、アセチルオキシ、スルホネートまたはホスフェートである。本開示のＤＨＰモノマーは、それらの両方の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第２０１９／０１４４６０１号および米国出願公開第２０２０／０１９０２５３号に教示されている通りとすることができる。ポリマー色素のモノマー構成成分は、式（ＸＸＩＩ）による化学構造を有するジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）ベースのモノマー：

【化44】

であってもよく、
式中、
Ｇ_１、Ｇ_２はそれぞれ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルおよびＰＥＧからなる群から独立して選択され、Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ、ｎおよびｆはそれぞれ、本明細書において先に定義されている通りである。

【0137】

ポリマー色素のモノマー構成成分は、式（ＸＸＩＩＩ）による化学構造を有するフルオレンベースのモノマーまたはカルバゾールベースのモノマー：

【化45】

であってもよく、
式中、
Ｇ_１、Ｇ_２はそれぞれ、ハロ（Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ）、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルおよびＰＥＧからなる群から独立して選択され、
Ｘはそれぞれ、Ｃ、ＮまたはＳｉであり、
Ｒ^２、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｚ、ｎおよびｆはそれぞれ、本明細書において先に定義されている通りである。
一部の実施形態では、ｆは、１～５０、２～４０または５～２０である。
一部の実施形態では、ｎはそれぞれ、１～１０、２～５または３である。
一部の実施形態では、ｍはそれぞれ、１１～１２である。

【0138】

本明細書において、ポリマー色素のモノマー構成成分の例には、以下：

【化46】

【化47】

が含まれ、これらは、例示的な「モノマーＡ」および例示的な「モノマーＢ」と称される。

【0139】

様々なモノマーＡおよびＢ、ならびにそれらの誘導体は、例えば、それらの両方の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国出願公開第２０１９／０１４４６０１号または米国出願公開第２０２０／０１９０２５３号に提示されている、当分野で公知の任意の適切な方法によって調製することができる。

【0140】

例えば、２，７－ジブロモ－ｔｒａｎｓ－９，１０－ジヒドロフェナントレン－９，１０－ジオール（ＤＨＰ－ＯＨ）は、以下の通り調製することができる。コニカルフラスコ（２０００Ｌ）内で、約２６ｇのＮａＢＨ_４を撹拌した水－エタノール混合物（１２０ｍＬ＋７８０ｍＬ）に加える。この溶液に、約２４ｇの２，７－ジブロモフェナントレン，９，１０－ジオンを小分けであるが、素早く（５分間で）加える。この反応ミックスを１日間、撹拌した。反応の終了までに、溶液の色が、赤オレンジ色から淡黄色、淡黄色から白色に変化する。反応を停止し、希ＨＣｌ酸で反応混合物を中和する。中和後、白色沈殿物をろ過し、過剰の水で洗浄する。こうして得られた白色沈殿物を非常に冷えた（＜－１５℃）エタノール（１００ｍＬ）およびメタノール（１００ｍＬ）で洗浄した。

【0141】

ＤＨＰ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_３Ｈは、以下の通り調製することができる。２つ口丸底フラスコ内で、ＤＨＰ－ＯＨ（３．６ｇ）および１８Ｃ６（５００ｍｇ）を１２０ｍＬのＴＨＦに溶解した。この溶液に窒素をパージし（２０分間）、窒素のパージが継続している間に、ＮａＨ（２ｇ）を加えた。溶液の色が、１０～１５分間で、無色から淡ピンク色、暗ピンク色、褐色および暗緑色に変化する。別のＲＢで、２０ｍＬのＴＨＦに１２ｇの１，３ プロパンスルトンを溶解し、窒素をパージした。このスルトン溶液を２０～３０分間かけて、滴下漏斗によって、ＤＨＰ－ＯＨ溶液に加えた。この反応物を室温で４～５時間、撹拌した。溶媒を蒸発させて、沈殿物を水に溶解させた。アセトンを加えて、二ナトリウム塩の形態のＤＰＳの白色沈殿物を得た。沈殿物をろ過して、水（最小量）に再溶解して、ＨＣｌで中和し、アセトン中に再度、沈殿させた。沈殿を繰り返し（２～３回）、次いで遠心分離し、ＤＰＳを白色固体として得た。

【0142】

ＤＨＰ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_２Ｃｌは、以下の通り調製することができる。丸底フラスコ内に５ｇのＤＨＰ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_３Ｈをとり、２５ｍＬのＤＭＦと共に混合した。ここに、約１０ｍＬのＳＯＣｌ_２を滴下して加え、この混合物を一晩、撹拌した。翌朝、反応混合物を２００ｍＬの水に注ぎ入れて、沈殿物をろ過して乾燥した。

【0143】

ＤＨＰ－スルホンアミドＰＥＧは、以下の通り調製することができる。ジクロロメタン／ＴＥＡ混合物中で、ＤＨＰ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_２Ｃｌを２．２当量のＰＥＧアミンと混合した。３時間の超音波照射反応後、粗生成物をジクロロメタンに抽出し、次いで、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ－ＣＨＣｌ_３）を行った。

【0144】

ＤＨＰ－スルホンアミドＰＥＧのジボロン酸エステルは、以下の通り調製することができる。ジブロモ化合物を窒素下でＤＭＳＯと混合し、ここに３当量のビスピナコラトジボロンを加えた。試薬を１２当量の酢酸カリウムおよび４当量のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２触媒と、８０度で５時間、反応させた。反応混合物を冷却し、ＣＨＣｌ３／水で抽出した。有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ－ＣＨＣｌ_３）によって精製した。

【0145】

同様に、本開示のフルオレンモノマーは、以下に記載される通りに作製することができる。例えば、ＦＬ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_３Ｈは、以下の通り調製することができる。２つ口丸底フラスコ内で、５ｇのフルオレンを７０のＤＭＳＯ中で混合した。この溶液に窒素をパージし（２０分間）、窒素のパージが継続している間に、５０％ＮａＯＨ（１２当量）を加えた。溶液の色が無色から暗褐色に変化する。プロパンスルトン（３当量）を秤量し、ＤＭＳＯ中に溶解する。これをフルオレン反応混合物に５分間かけて、滴下して加えた。この反応物を室温で４～５時間、撹拌した。溶媒を蒸発させて、沈殿物を水に溶解させた。アセトンを加えて、二ナトリウム塩の形態のＤＰＳの白色沈殿物を得た。沈殿物をろ過して、水（最小量）に再溶解して、ＨＣｌで中和し、アセトン中に再度、沈殿させた。沈殿を繰り返し（２～３回）、次いで遠心分離し、ＦＬ－ＯＳＯ_３Ｈを白色固体として得た。

【0146】

ＦＬ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_２Ｃｌは、以下の通り調製することができる。丸底フラスコ内に５ｇのＦＬ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_３Ｈをとり、２５ｍＬのＤＭＦと共に混合した。ここに、約１０ｍＬのＳＯＣｌ_２を滴下して加え、この混合物を一晩、撹拌した。翌朝、反応混合物を２００ｍＬの水に注ぎ入れて、沈殿物をろ過して乾燥した。

【0147】

ＦＬ－スルホンアミドＰＥＧは、以下の通り調製することができる。ジクロロメタン／ＴＥＡ混合物中で、ＦＬ－Ｏ－アルキル－ＳＯ_２Ｃｌを２．２当量のＰＥＧアミンと混合した。３時間の超音波照射反応後、粗生成物をジクロロメタンに抽出し、次いで、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ－ＣＨＣｌ_３）を行った。

【0148】

ＦＬ－スルホンアミドＰＥＧのジボロン酸エステルは、以下の通り調製することができる。ジブロモ化合物を窒素下でＤＭＳＯと混合し、ここに３当量のビスピナコラトジボロンを加えた。これらの試薬を１２当量の酢酸カリウムおよび４当量のＰｄ（ｄｐｐｆ）Ｃｌ_２触媒と、８０度で５時間、反応させた。反応混合物を冷却し、ＣＨＣｌ_３／水で抽出した。有機層を濃縮し、カラムクロマトグラフィー（シリカゲル、ＭｅＯＨ－ＣＨＣｌ_３）によって精製した。

【0149】

生物学用緩衝液および非イオン性界面活性剤を含む試験染色用緩衝組成物に、１００～４００ｕｇ／試験で、例示的なモノマーＡおよび／または例示的なモノマーＢなどのポリマー色素のモノマー構成成分を添加することは、ポリマー色素コンジュゲートの間の非特異的相互作用を低減するのに非常に効率的であることが見出された。本開示の染色用緩衝組成物は、１０～５００ｍｇ／ｍＬ、２０～４００ｍｇ／ｍＬまたは３０～３００ｍｇ／ｍＬの蛍光色素のモノマー構成成分を含んでよい。作業濃度の染色用緩衝組成物（１×）は、１０～５０ｍｇ／ｍＬ、２０～４０ｍｇ／ｍＬまたは約３０ｍｇ／ｍＬの蛍光ポリマー色素のモノマー構成成分を含んでよい。濃縮された濃度（１０×）の染色用緩衝組成物は、１００～５００ｍｇ／ｍＬ、２００～４００ｍｇ／ｍＬまたは約３００ｍｇ／ｍＬの、蛍光ポリマー色素のモノマー構成成分を含んでよい。本開示の組成物は、１００～４００ｕｇ／試験、２００～４００ｕｇ／試験または約３００ｕｇ／試験を供給するのに十分な量で、蛍光ポリマー色素のモノマー構成成分を含むことができる。

【0150】

消光されたポリマー色素
ポリマー色素の非蛍光構成成分は、消光性部分を含むポリマー色素、すなわち消光されたポリマー色素（「消光されたポリマー」）であってよい。消光されたポリマーは、本開示によるポリマー色素であって、１つもしくは複数、または多数の消光性部分、例えば、１～５０、２～２５または５～８の消光性部分を含む、ポリマー色素を含んでもよい。一部の実施形態では、消光されたポリマーは、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下、０．０５以下、０．０２以下、または０．０１５以下のΦとなる量子収率（ＱＹ）を示す。消光されたポリマーは、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合、５０ＡＦＵ未満、４０ＡＦＵ未満、３０ＡＦＵの蛍光プロファイルを示し得る。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0151】

一部の実施形態では、消光されたポリマー色素は、１０マイクログラム／ｍＬの場合、４５０ｎｍにおいて、≦５０ＡＦＵを放射する（スリット励起／発光は６ｎｍ／４ｎｍである；１ｃｍのキュベット）。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素は、蛍光光度計ＬＳ５０Ｂ Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒにおいてＡＦＵスリット励起／発光６ｎｍ／４ｎｍを使用して、４０５ｎｍのレーザーで励起すると、１０ｕｇ／ｍＬで＜４７ＡＦＵを示す。

【0152】

消光性部分は、非蛍光消光性部分とすることができる。非蛍光消光性部分は、発蛍光団からの励起エネルギーを吸収して、熱として消散させることができる、ダーククエンチャーとすることができる。

【0153】

消光性部分は、例えば、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、ＤＹＱ４２５ブラックホールクエンチャー１（ＢＨＱ１）、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ３５およびＴＡＭＲＡ（カルボキシテトラメチルローダミン）部分から選択されてよい。消光性部分は、ポリマー色素にコンジュゲートするため、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから、例えばＮ－ヒドロキシスクシンイミド（N-hydroxysuccininide）活性エステル（ＮＨＳエステル）として市販されている（例えば、ＤＹＱ４２５；ＤｙＬｉｇｈｔ ４２５Ｑ ＮＨＳエステル）。他の消光性部分は、例えば、Ｄａｂｃｙｌ Ｑ、Ｄａｂｃｙｌ ｐｌｕｓ、Ａｎａｓｐｅｃ ４９０Ｑ、Ｄｙｏｍｉｃｓ ４２５Ｑ、Ｄｙｎｏｍｉｃｓ ５０５Ｑなどとして、活性エステルとして入手可能である。好ましくは、消光性部分は、約４００～５５０ｎｍ、約４８０～約５８０ｎｍまたは約５００～約６００ｎｍの範囲内の蛍光発光を消光することができる。消光性部分の例は、例えば、

【化48】

を含むことができる。

【0154】

例えば、本開示の消光されたポリマーは、式（Ｉ）による構造を有するポリマー色素：

【化49】

を利用することができ、
式中、Ａはそれぞれ、芳香族コモノマーおよび複素芳香族コモノマーからなる群から独立して選択され、Ｌはそれぞれ、リンカー部分であり、Ｍはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、Ｇ^１およびＧ^２は、非修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から独立して選択され、ａ、ｃおよびｄは、各々が均等にまたはランダムに反復され得る、構造内の各単位のｍｏｌ％を独立して定義し、ａはそれぞれ、１０～１００％のｍｏｌ％であり、ｃはそれぞれ、０～９０％のｍｏｌ％であり、ｄはそれぞれ、０～２５％のｍｏｌ％であり、ｂはそれぞれ、独立して、０または１であり、ｍは、１～約１０，０００の整数であり、消光されたポリマー色素は、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示す。

【0155】

一部の実施形態では、消光されたポリマー色素（Ｉ）は、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）；必要に応じて、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合に、５０ＡＦＵ未満、４０ＡＦＵ未満、または３０ＡＦＵ未満の蛍光プロファイルを示す。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素（Ｉ）は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。用語「親蛍光ポリマー」とは、消光性部分が存在しないポリマー色素を指す。

【0156】

例えば、本開示の消光されたポリマーは、例えば、式（ＶＩＩＩ）：

【化50】

に示されている、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、フルオレン、カルバゾール、ならびにＤＨＰ、カルバゾールおよびフルオレンモノマーの組合せ物を利用することができ、

【0157】

式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｘ、Ｙ、Ｍ、Ｌ、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｍは、本明細書においてこれまでに定義されており、ポリマーは、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示す。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素（ＶＩＩＩ）は、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合、９０ＡＦＵ未満、５０ＡＦＵ未満、４０ＡＦＵ未満、または３０ＡＦＵ未満の蛍光プロファイルを示す。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素（ＶＩＩＩ）は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0158】

式（ＶＩＩＩ）による消光されたポリマーは、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｌ、Ｇ^１またはＧ^２において、１～５０、２～２５または５～８の消光性部分を含んでよい。

【0159】

消光されたポリマーは、式（ＸＸ）による構造を含んでよく、消光性部分は、Ｌ^２に結合しており：

【化51】

式中、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｗ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔはそれぞれ、本明細書において先に定義されており、

【0160】

ＡおよびＢは、コンジュゲートされているポリマー中に、ランダムにまたは非ランダムに分布されており、ポリマーは、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示す。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素（ＸＸ）は、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合、９０ＡＦＵ未満、５０ＡＦＵ未満、４０ＡＦＵ未満、または３０ＡＦＵ未満の蛍光プロファイルを示す。一部の実施形態では、消光されたポリマー色素（ＸＸ）は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0161】

一部の実施形態では、Ｅはそれぞれ、独立して選択される発色団、機能的部分または消光性部分であってもよく、少なくとも１つもしくは複数のＥ、または少なくとも２つまたはそれより多いＥは、消光性部分である。

【0162】

一部の例では、本開示の消光されたポリマー色素は、式（Ｉ）、（ＸＶＩＩＩ）～（ＸＩＶ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）および／または（ＸＸＩＶ）による構造を有するポリマー色素を利用することができる。

【0163】

一部の実施形態では、消光されたポリマーは、２～２０、３～１５または５～８の消光性部分を含んでよい。一部の実施形態では、ｍ＝２～２０、３～１５または５～８である。

【0164】

一部の実施形態では、消光性部分は、Ｄａｂｃｙｌ、Ｄａｂｓｙｌ、ＢＨＱ１、ＤＹＱ４２５、ＤＹＱ５０５、ＱＳＹ７、ＱＳＹ９、ＱＳＹ３５またはＴＡＭＲＡ消光性部分から選択されてよい。

【0165】

一部の実施形態では、消光されたポリマーは、結合パートナーを含まない。

【0166】

消光されたポリマーは、任意の適切な方法に準拠して調製されてよく、例えば、消光性部分は、ＮＨＳエステルなどの活性エステルの形態で商業的に得られ、本開示の方法によりポリマー色素に曝露される。

【0167】

本開示の染色用緩衝液は、０．２～１５ｍｇ／ｍＬ、０．３～１２ｍｇ／ｍＬまたは０．５～１０ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマーを含んでよい。一部の実施形態では、本開示の作業濃度の（１×）染色用緩衝組成物は、０．２～２．０ｍｇ／ｍＬ、０．３～１．５ｍｇ／ｍＬ、０．５～１．２ｍｇ／ｍＬまたは約１ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー色素を含んでよい。一部の実施形態では、濃染色用緩衝組成物（１０×）は、３～１５ｍｇ／ｍＬ、５～１２ｍｇ／ｍＬまたは約１０ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマーを含んでよい。本開示の染色用緩衝組成物は、２～２０ｕｇ／試験、３～１５ｕｇ／試験または約１０ｕｇ／試験を供給するのに十分な量で、消光されたポリマー色素を含むことができる。

【0168】

光退色されたポリマー色素
本明細書に記載されている組成物は、本開示による構造を有する少なくとも１種の光退色されたポリマー色素を含んでよい。例えば、光退色されたポリマー色素は、本開示による式Ｉ、ＶＩＩＩ～ＸＩＶ、ＸＶＩＩＩ、ＸＩＸおよび／またはＸＸのいずれかによる構造を含んでよい。このような化合物は、それらの全体が本明細書においてあたかも完全に説明されているかのごとく、参照により組み込まれている、ＰＣＴ出願公開第ＷＯ２０１７／１８０９９８号および米国出願公開第２０２０／０１９０２５３（Ａ１）号において、これまでに記載されている。

【0169】

用語「光退色された色素」とは、もはや蛍光を発することができないか、または０．１以下の量子収率（ＱＹ）を示すよう、高強度照射を受けた発蛍光団を元々含む色素を指す。一部の実施形態では、光退色されたポリマーは、０．１Φ以下、０．０６Φ以下、０．０５６Φ以下、０．０２Φ以下、または０．０１５Φ以下の量子収率（ＱＹ）を示す。一部の実施形態では、光退色されたポリマー色素は、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ａｒｂｉｔｒａｒｙ ｕｎｉｔｓ ｏｆ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＡＦＵ）未満を示す。一部の実施形態では、光退色されたポリマー色素は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。用語「親蛍光ポリマー」とは、光退色前のポリマー色素を指す。

【0170】

発蛍光団は、蛍光過程を繰り返し受けることができる。このことは、発蛍光団分子は、理論的に複数回、シグナルを発生することができることを意味する。実際には、発蛍光団の励起寿命の間のその構造的不安定性により、発蛍光団は分解し易くなることがある。高強度照射により、発蛍光団にその構造を変化させることができ、その結果、発蛍光団は、蛍光をもはや発することができず、これが光退色と呼ばれるものである。

【0171】

本明細書において使用する場合、用語「光退色されたポリマー色素」とは、一般に、光退色された後に、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示す、ポリマー色素、例えば、バイオレット励起可能なポリマー色素を指す。一部の実施形態では、光退色された色素は、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）、約４５ＡＦＵ未満、約４０ＡＦＵ未満、約３５ＡＦＵ未満、約３０ＡＦＵ未満、約２５ＡＦＵ未満、約２０ＡＦＵ未満、約１５ＡＦＵ未満、約１０ＡＦＵ未満、約５ＡＦＵ未満、約１ＡＦＵ未満、約１ＡＦＵ～約５０ＡＦＵ、約５ＡＦＵ～約２５ＡＦＵ、約２０ＡＦＵ～約４０ＡＦＵ、約１５ＡＦＵ～約３０ＡＦＵ、約１５ＡＦＵ～約４０ＡＦＵまたは約２０ＡＦＵ～約３６ＡＦＵを示す。

【0172】

一部の実施形態では、光退色された色素は、１０マイクログラム／ｍＬの場合、４５０ｎｍにおいて、≦５０ＡＦＵを放射する（スリット励起／発光は６ｎｍ／４ｎｍである；１ｃｍのキュベット）。一部の実施形態では、光退色されたポリマー色素は、蛍光光度計ＬＳ５０Ｂ Ｐｅｒｋｉｎ ＥｌｍｅｒにおいてＡＦＵスリット励起／発光６ｎｍ／４ｎｍを使用して、４０５ｎｍのレーザーで励起すると、１０ｕｇ／ｍＬで＜４７ＡＦＵを示す。例えば、光退色されたポリマー色素は、もはや蛍光を発することができない、または０．１以下、もしくは０．０６以下、もしくは０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）；必要に応じて、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合、約５０の任意蛍光単位（ＡＦＵ）未満を示すよう、高強度ＵＶ照射を受けた発蛍光団を元々含む、バイオレット色素であり得る。一部の実施形態では、光退色されたポリマー色素は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0173】

例えば、本開示の光退色されたポリマー色素は、式（Ｉ）による構造を有するポリマー色素：

【化52】

を利用することができ、
式中、Ａはそれぞれ、芳香族コモノマーおよび複素芳香族コモノマーからなる群から独立して選択され、Ｌはそれぞれ、リンカー部分であり、Ｍはそれぞれ、芳香族コモノマー、複素芳香族コモノマー、バンドギャップ改変モノマー、必要に応じて置換されているエチレンおよびエチニレンからなる群から独立して選択され、Ｇ^１およびＧ^２は、非修飾ポリマー末端および修飾ポリマー末端から独立して選択され、ａ、ｃおよびｄは、各々が、均等にまたはランダムに反復され得る、構造内の各単位のｍｏｌ％を独立して定義し、ａはそれぞれ、１０～１００％のｍｏｌ％であり、ｃはそれぞれ、０～９０％のｍｏｌ％であり、ｄはそれぞれ、０～２５％のｍｏｌ％であり、ｂはそれぞれ、独立して、０または１であり、ｍは、１～約１０，０００の整数であり、光退色されたポリマー色素は、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示すよう、式（Ｉ）による蛍光ポリマー色素をＵＶ光の照射に曝露することによって調製され、必要に応じて、光退色されたポリマー色素は、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）を示し、およびまたは、必要に応じて、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示す。

【0174】

例えば、本開示の光退色されたポリマー色素は、例えば、式（ＶＩＩＩ）：

【化53】

に示されている、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ）、フルオレン、ならびにＤＨＰおよびフルオレンモノマーの組合せ物を利用することができ、
式中、Ｇ１、Ｇ２、Ｒ１、Ｒ２、Ｘ、Ｙ、Ｍ、Ｌ、ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｍは、本明細書の上に記載されており、光退色されたポリマー色素は、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）；必要に応じて、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）を示すよう、およびまたは必要に応じて、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示すよう、式（ＶＩＩＩ）による蛍光ポリマー色素をＵＶ光の照射に曝露することによって調製される。

【0175】

例えば、本開示の光退色されたポリマー色素は、式（ＸＸ）による構造を有するポリマー色素：

【化54】

を利用することができ、
式中、Ａ、Ｂ、Ｅ、Ｇ^１、Ｇ^２、Ｌ^１、Ｌ^２、Ｌ^３、Ｗ、ｎ、ｍ、ｐ、ｑ、ｒ、ｓ、ｔはそれぞれ、本明細書において先に定義されており、
ＡおよびＢは、コンジュゲートされているポリマー中にランダムにまたは非ランダムに分布されており、光退色されたポリマー色素は、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）；必要に応じて、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）を示すよう、式（ＸＸ）による蛍光ポリマー色素をＵＶ光の照射に曝露することによって調製される。一部の実施形態では、光退色されたポリマー色素は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0176】

例えば、本開示の光退色されたポリマー色素は、式（ＸＶＩＩＩ）による構造を有するポリマー色素を利用してもよく、このポリマー色素は、０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示し、必要に応じて、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）を示すよう、必要に応じて、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示すよう、式（ＸＶＩＩＩ）による蛍光ポリマー色素をＵＶ光の照射に曝露することによって調製される。

【0177】

例えば、本開示の光退色されたポリマー色素は、バイオレット励起可能な蛍光ポリマー色素などの蛍光ポリマー色素から調製されてもよく、例えば、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）（「ＳＮ」）ｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）は、バイオレットレーザー（４０５ｎｍ）によって最適に励起される蛍光ポリマー色素であり、光退色されたポリマー色素は、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）を示すよう、式（Ｉ）による蛍光ポリマー色素をＵＶ光の照射に曝露することによって調製される。一部の実施形態では、光退色された色素は、結合パートナーを含まない。

【0178】

本開示の組成物は、光退色された色素を、約０．２～０．８ｍｇ／ｍＬ、０．３～０．７ｍｇ／ｍＬまたは約０．５ｍｇ／ｍＬの作業濃度（１×）で含んでよい。本開示の組成物は、光退色された色素を、濃組成物（１０×）中に、約２～８ｍｇ／ｍＬ、３～７ｍｇ／ｍＬまたは約５ｍｇ／ｍＬで含んでよい。本開示の組成物は、光退色された色素を、約０．１～約１０ｍｇ／ｍＬ、０．２～８ｍｇ／ｍＬ、０．３～７ｍｇ／ｍＬまたは０．５～５ｍｇ／ｍＬの範囲で含んでよい。本開示の組成物は、光退色された色素を、２～８ｕｇ／試験、３～７ｕｇ／試験または約５ｕｇ／試験を供給するのに十分の量で含んでよい。

【0179】

非イオン性界面活性剤
本組成物は、１種または複数種の非イオン性界面活性剤を含んでもよい。ポリマー色素コンジュゲートの凝集を阻止するため、十分な量の非イオン性界面活性剤が含まれ得る。非イオン性界面活性剤の非限定例には、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（商標）Ｆ－６８（ＰＦ－６８）などのポロキサマー界面活性剤、ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０およびＴＷＥＥＮ（登録商標）８０を含むポリソルベート、および例えば、ポリオキシエチレングリコールアルキルエーテル（ＢＲＩＪ（登録商標））、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標））またはポリオキシエチレンノニルフェニルエーテル（ＩＧＥＰＡＬ）界面活性剤などのエーテル連結非イオン性界面活性剤が含まれる。一部の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー非イオン性界面活性剤である。

【0180】

ポロキサマー非イオン性界面活性剤という用語は、ポリエチレンオキシド－ポリプロピレンオキシド－ポリエチレンオキシド（ＰＥＧ－ＰＰＧ－ＰＥＧ）非イオン性トリブロックコポリマーを指す。ポロキサマー非イオン性界面活性剤という用語は、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）非イオン性界面活性剤を包含する。ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）界面活性剤の例には、例えば、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８、Ｆ７７、Ｆ８７、Ｆ９８、Ｆ１０８、Ｆ１２７、Ｐ１０３、Ｐ１０４、Ｐ１０５およびＰ１２３が含まれる。

【0181】

一部の実施形態では、界面活性剤は、ポロキサマー界面活性剤などのポリオキシプロピレン含有界面活性剤である。ポロキサマー界面活性剤は、ポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖がポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖によってはさまれていることを特徴とする、ポリオキシエチレンオキシド－ポリオキシプロピレンオキシド－ポリオキシエチレンオキシド（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）などの非イオン性トリブロックコポリマーを含む。例示的な非イオン性トリブロックコポリマーは、式（ＸＸＩ）による構造

【化55】

を含むことができ、
式中、ａはそれぞれ独立して、独立して２～１３０の範囲の整数であり、ｂは、１５～６７の範囲の整数である。一部の実施形態では、ａは、５０～１００の範囲にあり、ｂは、２０～４０の範囲にある。一部の実施形態では、ａは、７０～９０の範囲にあり、ｂは、２５～３０の範囲にある。非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー１８８であってもよい。ポロキサマーの非限定例には、例えば、ａ＝８０およびｂ＝２７を有する、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８またはＫＯＬＬＩＰＨＯＲ（登録商標）Ｐ１８８としてやはり知られている、ポロキサマー１８８を含んでもよい。他のポロキサマーには、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｆ１０８としても知られているポロキサマー３３８、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｆ１２７としても知られているポロキサマー４０７、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃ（商標）ＰＥ／Ｌ１０１としても知られているポロキサマー３３１が含まれる。

【0182】

ポロキサマー１８８としても知られている、用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ６８」、「Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８」または「ＰＦ－６８」とは、平均分子量すなわち平均Ｍｎが８３５０～８４００である、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロックポリ（エチレングリコール）コポリマーを指す。

【0183】

ポロキサマー４０７としても知られている、用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１２７」とは、ポリプロピレングリコールの中央の疎水性ブロックが２つの親水性ブロックのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）によってはさまれていることからなる、トリブロックコポリマーを指す。２つのＰＥＧブロックの長さの概数は、１０１個の繰り返し単位である一方、プロピレングリコールブロックの長さの概数は、５６個の繰り返し単位である。これはまた、平均１２，６００ｇ／ｍｏｌのＣｒｏｄａの商標名であるＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃ ＰＥ／Ｆ１２７によって知られている。

【0184】

用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｆ１０８」とは、平均Ｍｎが約１４，６００である、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロックポリ（エチレングリコール）を指す。

【0185】

用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｐ１０３」とは、平均Ｍｗが約４，９５０である、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロックポリ（エチレングリコール）を指す。

【0186】

用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｐ１０４」とは、平均Ｍｗが約５，９００である、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロックポリ（エチレングリコール）を指す。

【0187】

用語「ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）Ｐ１２３」とは、平均Ｍｎが約５，８００である、ポリ（エチレングリコール）－ブロック－ポリ（プロピレングリコール）－ブロックポリ（エチレングリコール）を指す。

【0188】

ポリマーブロックの長さは、カスタマイズすることができるので、わずかに特性が異なる多数の様々なポロキサマーが存在する。ポロキサマーコポリマーは、文字「Ｐ」（ポロキサマーを表す）、次いで３つの桁を用いて一般に命名され、最初の２桁×１００は、ポリオキシプロピレンコアの分子質量の概数を示し、最後の桁Ｘ１０は、ポリオキシエチレン含有量の百分率を示す（例えば、Ｐ４０７＝ポリオキシプロピレン分子質量が４，０００ｇ／ｍｏｌであり、７０％のポリオキシエチレン含有量のポロキサマーである）。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）およびＳｙｎｐｅｒｏｎｉｃポロキサマーの商標名の場合、これらのコポリマーのコード化は、室温におけるその物理形態を定義する文字（Ｌ＝液体、Ｐ＝ペースト、Ｆ＝フレーク（固体））で始まり、２つの桁または３つの桁が続く。数字指定における、最初の桁（３桁数では２桁）に３００を乗算したものは、疎水性鎖の分子量の概数を表し、最後の桁×１０は、ポリオキシエチレン含有量の百分率を示す（例えば、Ｆ－６８は、ポリオキシプロピレン分子質量が１，８００ｇ／ｍｏｌであり、８０％のポリオキシエチレン含有量であることを示す）。例示的なポロキサマー界面活性剤には、以下に限定されないが、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８が含まれる。ＰＦ－６８は、非イオン性トリブロックコポリマーポリオキシエチレンオキシド－ポリオキシプロピレンオキシド－ポリオキシエチレンオキシド（ＰＥＯ－ＰＰＯ－ＰＥＯ）である。使用される界面活性剤の濃度は、経験的に求めることができる（すなわち、コンジュゲートの沈殿が起こらないように滴定される）。一部の実施形態では、染色用緩衝組成物は、ポロキサマー界面活性剤などの非イオン性界面活性剤を含んでもよい。非イオン性界面活性剤は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８（ポロキサマー１８８）であってもよい。非イオン性界面活性剤は、０．０１～１０％、０．０２～８％、０．０５～７％、０．１～５％、０．２～２％、０．１～０．４％、または約０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、または１０％（重量／体積）、または間の任意の値の作業濃度（１×）で、染色用緩衝組成物中に存在してよい。非イオン性界面活性剤は、０．１～４０％、０．２～３０％、０．５～２５％または１０～２０％（重量／体積）で、濃染色用緩衝組成物（１０×）中に存在してよい。一部の実施形態では、本開示の染色用緩衝組成物は、０．０１～４０％、０．０１～２０％、０．０２～１０％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤を含んでよい。

【0189】

生物学用緩衝液
用語「生物学用緩衝液」とは、細胞不含系において、ｐＨ６～８、６．５～８または７～８の生物学的範囲のｐＨを維持する、１種または複数種の生物学用緩衝化剤を含む、生理学的に適合する水溶液を指す。ある特定の実施形態では、生物学用緩衝化剤は、いくつかの緩衝剤のうち、Ｎ－（２－アセトアミド）－アミノエタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、酢酸塩、Ｎ－（２－アセトアミド）－イミノ二酢酸（ＡＤＡ）、２－アミノエタンスルホン酸（ＡＥＳ）、アンモニア、２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール（ＡＭＰ）、２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、Ｎ－（１，１－ジメチル－２－ヒドロキシエチル）－３－アミノ－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）、Ｎ，Ｎ－ビス－（２－ヒドロキシエチル）－２－アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、炭酸水素塩、Ｎ，Ｎ’－ビス－（２－ヒドロキシエチル）－グリシン、［ビス－（２－ヒドロキシエチル）－イミノ］－トリス－（ヒドロキシメチルメタン）（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ）、１，３－ビス［トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］プロパン（ＢＩＳ－Ｔｒｉｓ－プロパン）、ホウ酸、ジメチルアルシン酸、３－（シクロヘキシルアミノ）－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、３－（シクロヘキシルアミノ）－２－ヒドロキシ－１－プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳＯ）、炭酸塩、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、クエン酸塩、３－［Ｎ－ビス（ヒドロキシエチル）アミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＤＩＰＳＯ）、ギ酸塩、グリシン、グリシルグリシン、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、乳酸塩、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－３－プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳ、ＥＰＰＳ）、Ｎ－（２－ヒドロキシエチル）－ピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯ）、イミダゾール、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、２－（Ｎ－モルホリノ）－エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）－プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳＯ）、リン酸塩、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、ピリジン、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コハク酸塩、３－｛［トリス（ヒドロキシメチル）－メチル］－アミノ｝－プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、２－アミノエタンスルホン酸、ＡＥＳ（タウリン）、トレハロース、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、２－［トリス（ヒドロキシメチル）－メチルアミノ］－エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）－メチル］－グリシン（トリシン）、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン（Ｔｒｉｓ）、グリセルアルデヒド、マンノース、グルコサミン、マンノヘプツロース、ソルボース－６－ホスフェート、トレハロース－６－ホスフェート、ヨード酢酸塩、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、酒石酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、マレイン酸ナトリウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、リン酸カリウム、リン酸マグネシウム、酢酸アンモニウム、クエン酸アンモニウム、リン酸アンモニウムのうちの１つまたは複数を含むことができる。代表的な緩衝化剤は、クエン酸、アスコルビン酸、グルコン酸、炭酸、酒石酸、コハク酸、酢酸またはフタル酸などの有機酸の塩；Ｔｒｉｓ、すなわちトロメタミン塩酸塩またはリン酸塩を含むことができる。慣用的な生物学用緩衝液の具体例は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－２－ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、２－（［２－ヒドロキシ－１，１－ビス（ヒドロキシメチル）エチル］アミノ）エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－［Ｎ－トリス（ヒドロキシ－メチル）エチルアミノ］－２－ヒドロキシエチル］－１－ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）、トリス［ヒドロキシメチル］－アミノメタン（ＴＨＡＭ）、１，４－ピペラジンジエタンスルホン酸（ＰＩＰＥＳ）およびトリス［ヒドロキシメチル］メチルアミノメタン（ＴＲＩＳ）の緩衝液を含むことができる。慣用的な生物学用緩衝液は、生理的範囲のｐＫを有することができ、この範囲で最も効率よく機能することができる。生物学用緩衝液は、例えば、１０～１００ｍＭまたは５～２５ｍＭの濃度で水溶液中に存在してよい。

【0190】

用語「ＰＢＳ」とは、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、塩化カリウムおよび／またはリン酸二水素カリウムを含有することができる水性緩衝液である、リン酸緩衝生理食塩水を指す。例えば、ＰＢＳは、ｍｉｌｌｉＱ水または脱イオン水、および１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含有してよい。ｐＨは、約ｐＨ７．０～７．４とすることができる。ＰＢＳは、アジ化ナトリウムなどのアジドと一緒に保存されてもよく、または保存されなくてもよい。ＰＢＳは、等張性溶液であってもよい。緩衝液は、ＰＢＡ緩衝液であってもよい。ＰＢＡ緩衝液は、ＰＢＳ、ＢＳＡおよびアジ化ナトリウムを含んでもよい。ＰＢＡ緩衝液は、１×ＰＢＳ、約２ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡおよび約０．１％アジ化ナトリウムを含んでもよい。

【0191】

追加の構成成分
本開示の組成物は、例えば、フローサイトメトリー試料分析において、染色用緩衝組成物として使用することができ、こうして、以下に限定されないが、任意の好適な担体、安定剤、塩、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、着色剤または保存剤のうちの１種または複数種を含む、追加の構成成分を含んでもよい。本組成物はまた、追加の１種または複数種の界面活性剤（例えば、イオン性界面活性剤および双性イオン性界面活性剤）を含むことができる。

【0192】

用語「タンパク質安定剤」とは、非特異的結合を低減するよう、例えば、細胞－細胞相互作用を低減するよう、または抗体と非標的分子との間の非特異的結合を阻止する一助となるよう働くタンパク質を指す。本開示による組成物は、タンパク質安定剤を含んでもよい。タンパク質安定剤は、血清アルブミン、例えば、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼインまたはゼラチンからなる群のうちの１つまたは複数から選択されてよい。タンパク質安定剤は、ＢＳＡであってもよい。一部の実施形態では、タンパク質安定剤は、０．１～１００ｍｇ／ｍＬ、０．２～５０ｍｇ／ｍＬ、１～２０ｍｇ／ｍＬまたは１～１０ｍｇ／ｍＬで存在する。タンパク質安定剤は、０．１～１０ｍｇ／ｍＬ、０．５～５ｍｇ／ｍＬ、１～３ｍｇ／ｍＬまたは約２ｍｇ／ｍＬの濃度で、本開示の作業用組成物（１×）中に存在してよい。タンパク質安定剤は、１～１００ｍｇ／ｍＬ、５～５０ｍｇ／ｍＬ、１０～３０ｍｇ／ｍＬまたは約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で、本開示の濃組成物（１０×）中に存在してよい。

【0193】

担体は、水、生理食塩水などの水溶液、アルコール、またはＰＢＳ、ハンクス溶液、リンゲル液もしくは生理食塩水緩衝液などの生物学用緩衝液とすることができる。

【0194】

担体は、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの配合作用剤を含むことができる。
例えば、染色用緩衝組成物は、水、または例えば、可溶化剤としてのＤＭＳＯなどの溶媒などの担体を含有することができる。

【0195】

本組成物はまた、適切な生物学用緩衝液および／またはｐＨ調節剤を含むことができ、通常、緩衝液は、有機酸または有機塩基から調製される塩である。

【0196】

本開示の組成物は、任意の適切な保存剤を含んでもよい。保存剤は、抗酸化剤、殺生物剤または抗微生物剤であってよい。保存剤は、無機塩であってもよい。例えば、保存剤は、アジ化ナトリウム、２－クロロアセトアミド、２－メチルイソチアゾリノン、サリチル酸、ＰｒｏＣｌｉｎ（商標）、Ｋａｔｈｏｎ（商標）ＣＧ、５－クロロ－２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オンまたは２－メチル－４－イソチアゾリン－３－オンとすることができる。保存剤は、０．０１～０．５％、０．０５～０．３％または約０．１％で、本開示の組成物中に存在してよい。

【0197】

本開示の組成物は、追加の界面活性剤を含んでもよい。本明細書に記載されている方法に準拠して、必要に応じて使用することができる好適な追加の界面活性剤は、アルキルベタイン、アルキルアミドベタイン（amidazoliniumbetaine）、アミダゾリニウムベタイン、スルホベタイン（ＩＮＣＩスルタイン）、およびホスホベタインなどのベタインなどの双性イオン性界面活性剤を含むことができる。好適な双性イオン性界面活性剤の例には、一般式Ｒ^１’［ＣＯ－Ｘ（ＣＨ_２）_ｊ］_ｇ－Ｎ^＋（Ｒ^２’）（Ｒ^３’）－（ＣＨ_２）_ｆ－［ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２］_ｈ－Ｙ^－の界面活性剤が含まれ、式中、Ｒ^１’は、Ｃ_８～１８アルキル、飽和Ｃ_{１０～１６}アルキルまたは飽和Ｃ_{１２～１４}アルキルなどの飽和または不飽和Ｃ_６～２２アルキルであり、Ｘは、ＮＨ、ＮＲ^４’であり、Ｒ^４’は、Ｃ_１～４アルキル、ＯまたはＳであり、ｊは、２～５および３などの１～１０の整数であり、ｇは、０または１であり、Ｒ^２’およびＲ^３’はそれぞれ、独立して、Ｃ_１～４アルキル、必要に応じてヒドロキシ（ヒドロキシエチル基またはメチルによって置換されている）であり、ｆは、１、２または３などの１～４の整数であり、ｈは、０または１であり、Ｙは、ＣＯＯ、ＳＯ_３、ＯＰＯ（ＯＲ^５’）ＯまたはＰ（Ｏ）（ＯＲ^５’）Ｏであり、Ｒ^５’は、ＨまたはＣ_１～４アルキルである。

【0198】

好適な双性イオン性界面活性剤の例には、以下の式：
Ｒ^１’－Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２－ＣＨ_２ＣＯＯ^－；
Ｒ^１’－ＣＯ－ＮＨ（ＣＨ_２）_３－Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２－ＣＨ_２ＣＯＯ^－；
Ｒ^１’－Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＳＯ_３ ^－；および
Ｒ^１’－ＣＯ－ＮＨ－（ＣＨ_２）_３－Ｎ^＋（ＣＨ_３）_２－ＣＨ_２ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ_２ＳＯ_３ ^－
のものなどのアルキルベタインを含む。

【0199】

好適なベタインおよびスルホベタインの例は、以下（ＩＮＣＩに準拠して示す）：アーモンドアミドプロピルベタイン、アプリコットアミドプロピルベタイン、アボカドアミドプロピルベタイン、ババスアミドプロピルベタイン、ベヘンアミドプロピルベタイン、ベヘニルベタイン、キャノーラアミドプロピルベタイン、カプリル／カプラミドプロピルベタイン、カルニチン、セチルベタイン、コカミドエチルベタイン、コカミドプロピルベタイン、コカミドプロピルヒドロキシスルタイン、ココベタイン、ココヒドロキシスルタイン、ココ／オレアミドプロピルベタイン、ココスルタイン、デシルベタイン、ジヒドロキシエチルオレイルグリシネート、ジヒドロキシエチル大豆グリシネート、ジヒドロキシエチルステアリルグリシネート、ジヒドロキシエチル獣脂グリシネート、ＰＧ－ベタインのジメチコンプロピル、ドルカミドプロピルヒドロキシスルタイン、水素化獣脂ベタイン、イソステアラミドプロピルベタイン、ラウラミドプロピルベタイン、ラウリルベタイン、ラウリルヒドロキシスルタイン、ラウリルサルタイン、ミルクアミドプロピルベタイン（milk amidopropyl betaine）、ミルクアミドプロピルベタイン（milkamidopropyl betaine）、ミリスタミドプロピルベタイン、ミリスチルベタイン、オレアミドプロピルベタイン、オレアミドプロピルヒドロキシスルタイン、オレイルベタイン、オリバミドプロピルベタイン、パルマミドプロピルベタイン、パルミタミドプロピルベタイン、パルミトイルカルニチン、パーム核アミドプロピルベタイン、ポリテトラフルオロエチレンアセトキシプロピルベタイン、リシノールアミドプロピルベタイン、セサミドプロピルベタイン、ソイアミドプロピルベタイン、ステアラミドプロピルベタイン、ステアリルベタイン、獣脂アミドプロピルベタイン、獣脂アミドプロピルヒドロキシスルタイン、獣脂ベタイン、獣脂ジヒドロキシエチルベタイン、ウンデシレンアミドプロピルベタインおよび小麦胚芽アミドプロピルベタインである。

【0200】

例えば、ココナッツジメチルベタインは、ＡＭＯＮＹＬ ２６５（登録商標）という商標名でＳｅｐｐｉｃから市販されており、ラウリルベタインは、商標名ＥＭＰＩＧＥＮ ＢＢ（登録商標）でＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈから市販されている。さらなる例のベタインは、商標名ＭＩＲＡＴＡＩＮＥ Ｈ２Ｃ－ＨＡ（登録商標）でＲｈｏｄｉａから販売されているラウリル－イミノ－ジプロピオネートである。染色用緩衝組成物中の必要に応じた双性イオン性界面活性剤の存在は、生物学的試料中の非特異的結合を低減することができ、例えば、単球への非特異的結合を低減することができる。必要に応じた双性イオン性界面活性剤は、０～０．５％、０．０５～０．３％で、組成物中に存在することができる。

【0201】

組成物
染色用緩衝組成物は、生物学的試料中のポリマー色素コンジュゲート間のポリマー－ポリマー相互作用を低減するため、および色素コンジュゲートの沈殿を低減するために提供される。染色用緩衝組成物は、２種またはそれより多くのポリマー色素コンジュゲートを含む多色パネル中のポリマー色素コンジュゲート間のポリマー－ポリマー相互作用を低減するため提供される。

【0202】

本開示による組成物は、色素コンジュゲート間のポリマー－ポリマー相互作用などの非特異的結合を低減するため、実質的に低減するため、および／または阻止するため、生物学的試料に添加する前に、添加と同時に、または添加後に、１種もしくは複数種、２種もしくはそれより多くの、または３種もしくはそれより多くのポリマー色素コンジュゲートを含む、色素コンジュゲートの混合物に添加されてよい。色素コンジュゲートの混合物は、例えば、フルオレセイン、クマリン、シアニン、ローダミン色素コンジュゲート、例えば、ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリスリン）、ＥＣＤ（フィコエリスリン－Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）－Ｘ）、ＰＣ５（フィコエリスリン－シアニン５．５）、ＰＣ５．５（フィコエリスリン－シアニン５．５）、ＰＣ７（フィコエリスリン－シアニン７）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、ＡＡ７００、ＡＡ７５０、ＰＢＥ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８（ＡＦ４８８）、ＡＦ５３２、ＡＦ６４７、ＡＦ７００、ＡＦ７５０、Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣＦ（登録商標）３５０色素、ＣＦ（登録商標）４０５Ｓ、ＣＦ（登録商標）４０５、ＣＦ（登録商標）４０５Ｌ、ＣＦ（登録商標）４３０、ＣＦ（登録商標）４４０、ＣＦ（登録商標）４５０、ＣＦ（登録商標）４８８Ａ、ＣＦ（登録商標）５１４、ＡＡＴ Ｂｉｏｑｕｅｓｔ ｉＦｌｕｏｒ（商標）４８８、ｉＦｌｕｏｒ（商標）３５０、ｉＦｌｕｏｒ（商標）４０５、ｍＦｌｕｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ５７０、ｍＦｌｕｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ５８０、ｍＦｌｕｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ５９０、ｍＦｌｕｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ６２０、ｍＦｌｕｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ６３０、ｍＦｌｕｏｒ（商標）Ｂｌｕｅ６６０、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ５１０、ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ５３０、ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ５５５、ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ５８５、ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ６１０／３０Ｓ、ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ６６０／４０Ｓ、ＮｏｖａＦｌｕｏｒ Ｂｌｕｅ６６０／１２０Ｓ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）Ｋｉｒａｖｉａ Ｂｌｕｅ５２０（商標）、ＫｒＯ色素コンジュゲートなどの、１種もしくは複数種の、２種もしくはそれより多くの、または３種またはそれより多くのポリマー色素コンジュゲート、および必要に応じて１種または複数種の、２種またはそれより多くの、３種またはそれより多くの従来の蛍光色素コンジュゲートを含むことができる。他の色素または色素コンジュゲートは、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔポリマー色素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むことができる。Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ色素は、バイオレットレーザー（４０５ｎｍ）によって励起され得る。Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ色素は、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ４３６（励起極大４１４ｎｍ、発光極大４３６ｎｍ、４５０／５０バンドパスフィルター）、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ６００（発光極大６００ｎｍ、６１０／２０バンドパスフィルター）、Ｓｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ６４５（発光極大６４５ｎｍ、６６０／２０バンドパスフィルター）またはＳｕｐｅｒ Ｂｒｉｇｈｔ ７０２（発光極大７０２ｎｍ、７１０／５０バンドパスフィルター）であってよい。

【0203】

本開示は、第１のポリマー色素の少なくとも１種の非蛍光構成成分；および生物学用緩衝液を含む組成物を提供する。本組成物は、第１のポリマー色素の少なくとも１種の非蛍光構成成分；生物学用緩衝液；および非イオン性界面活性剤を含むことができる。非イオン性界面活性剤は、ポロキサマー非イオン性界面活性剤であってよい。例えば、本組成物は、ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素、および消光性部分を含むポリマー色素のうちの１種または複数種から選択される第１のポリマー色素の非蛍光構成成分を含んでよい。

【0204】

ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素および生物学用緩衝液を含む染色用緩衝組成物が提供される。ポリマー色素のモノマー構成成分、光退色されたポリマー色素、非イオン性界面活性剤および生物学用緩衝液を含む染色用緩衝組成物が提供される。一部の実施形態では、１０～４０ｍｇ／ｍＬのモノマーＡ、０．２～１．５ｍｇ／ｍＬの光退色された色素および生物学用緩衝液の作業濃度（１×）を含み、必要に応じてタンパク質安定剤および保存剤を含む、染色用緩衝組成物が提供される。一部の実施形態では、１０～４０ｍｇ／ｍＬのモノマーＡ、０．２～１．５ｍｇ／ｍＬの光退色された色素、０．０１～１０％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤、および生物学用緩衝液の作業濃度（１×）を含み、必要に応じてタンパク質安定剤および保存剤を含む、染色用緩衝組成物が提供される。一部の実施形態では、染色用緩衝組成物は、２０～４０ｍｇ／ｍＬのモノマーＡ、０．２～０．８ｍｇ／ｍＬの光退色された色素、０．０１～４％（重量／体積）非イオン性界面活性剤、および生物学用緩衝液の作業濃度（１×）を含み、必要に応じてタンパク質安定剤および保存剤を含む、染色用緩衝組成物が提供される。

【0205】

ポリマー色素のモノマー構成成分、非イオン性界面活性剤および生物学用緩衝液を含む染色用緩衝組成物が提供される。一部の実施形態では、１０～４０ｍｇ／ｍＬのポリマー色素のモノマー構成成分、０．０１～４％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤および生物学用緩衝液の作業濃度（１×）を含み、必要に応じてタンパク質安定剤および保存剤を含む、染色用緩衝組成物が提供される。

【0206】

消光性部分を含むポリマー色素、生物学用緩衝液および非イオン性界面活性剤を含む染色用緩衝組成物が提供される。ポリマー色素のモノマー構成成分、消光性部分を含むポリマー色素、生物学用緩衝液および非イオン性界面活性剤を含む染色用緩衝組成物が提供される。必要に応じて、本組成物は、タンパク質安定剤を含んでもよい。必要に応じて、本組成物は、保存剤を含んでもよい。

【0207】

一部の実施形態では、１０～４０ｍｇ／ｍＬのモノマーＡ、０．２～１．５ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー、０．０１～４％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤および生物学用緩衝液を含み、必要に応じてタンパク質安定剤および保存剤を含む、染色用緩衝組成物が提供される。一部の実施形態では、２０～４０ｍｇ／ｍＬのモノマーＡ、０．５～１．５ｍｇ／ｍＬの消光されたポリマー、０．０１～１％（重量／体積）の非イオン性界面活性剤および生物学用緩衝液を含み、必要に応じてタンパク質安定剤および保存剤を含む、染色用緩衝組成物が提供される。

【0208】

本開示による染色用緩衝組成物は、該組成物の非存在下での蛍光ポリマー色素コンジュゲートと比較した場合に、蛍光ポリマー色素コンジュゲート間の非特異的なポリマー－ポリマー相互作用を低減する、実質的に低減する、またはこれを排除する。本開示による組成物は、該組成物の非存在下での少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートと比較した場合に、少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートの非特異的なポリマー－ポリマー相互作用を低減する、実質的に低減する、またはこれを排除する。

【0209】

方法
本開示はまた、分析対象を含有することが疑われる試料に本明細書に記載されている組成物を接触させるステップを含む、試料中の分析対象を検出するための方法に関する。例えば、本明細書に記載されているポリマー色素コンジュゲートに存在する結合パートナーは、分析対象と相互作用して、分析対象とのポリマー色素コンジュゲート複合体を形成することができる。分析対象とのポリマー色素コンジュゲート複合体を励起させることができる光源が試料に適用され、コンジュゲートされているポリマー複合体からの発光が検出される。一部の実施形態では、本明細書に記載されているポリマー色素コンジュゲートは、約３４０ｎｍ～約８００ｎｍ、約３４０ｎｍ～約４５０ｎｍの間（例えば、約３９５ｎｍ～約４１５ｎｍの間）の範囲内の波長を有する光を用いて励起可能である。一部の実施形態では、放射光は、通常、約４００ｎｍ～約８００ｎｍ（例えば、約４００ｎｍ～約５００ｎｍまたは約４１５ｎｍ～約４７５ｎｍ）の間である。代替的に、励起光は、約３４０ｎｍ～約３７０ｎｍの間の波長を有することができ、放射光は、約３９０ｎｍ～約４２０ｎｍの間であり得る。

【0210】

本開示の方法における試料は、例えば、血液、骨髄、脾臓細胞、リンパ細胞、骨髄穿刺液（または、骨髄から得られる任意の細胞）、尿（洗浄液）、血清、唾液、脳脊髄液、尿、羊水、間質液、便、粘液または組織（例えば、腫瘍試料、解凝集組織、解凝集固形腫瘍）であり得る。試料は、血液試料であり得る。血液試料は、全血とすることができる。標準的な臨床手順を使用して、全血を対象から得ることができる。試料は、全血の１種または複数種の細胞（例えば、赤血球、白血球、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞またはＮＫ細胞）、食細胞、単球、マクロファージ、顆粒球、好塩基球、好中球、好酸球、血小板、または１種もしくは複数種の検出可能なマーカーを含む任意の細胞）のサブセットであり得る。全血試料は、処理済み全血試料であってもよい。試料は、細胞培養物に由来してもよい。

【0211】

対象は、ヒト（例えば、疾患に罹患している患者）、商業的に重要な哺乳動物（例えば、サル、ウシまたはウマを含む）であり得る。試料は、例えば、イヌまたはネコを含めた家庭用ペットから得ることもできる。対象は、疾患の動物モデルまたは薬物スクリーニングのための動物モデルとして使用される実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギまたはモルモットであり得る。

【0212】

「分析対象」とは、本明細書において使用する場合、その存在量／濃度が、ある分析手順によって求められる、物質、例えば分子を指す。例えば、本発明において、分析対象は、タンパク質、ペプチド、核酸、脂質、炭水化物または低分子であり得る。

【0213】

結合した分子を定量するための結合パートナーおよび蛍光標識を利用するアッセイ系は周知である。このような系の例は、フローサイトメータ、スキャンサイトメータ、イメージングサイトメータ、蛍光顕微鏡および共焦点蛍光顕微鏡を含む。

【0214】

フローサイトメトリーを使用して、蛍光を検出する。このような使用に好適ないくつかのデバイスが、利用可能であり、当業者に公知である。例には、ＢＣＩ Ｎａｖｉｏｓ、Ｇａｌｌｉｏｓ、ＡｑｕｉｏｓおよびＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメータが含まれる。

【0215】

アッセイは、免疫アッセイであり得る。本発明において有用な免疫アッセイの例には、以下に限定されないが、フルオロ発光アッセイ（ＦＬＡ）などが含まれる。アッセイはまた、タンパク質アレイに行うこともできる。

【0216】

結合パートナーが抗体である場合、抗体または多重抗体サンドイッチアッセイもまた使用することができる。サンドイッチアッセイとは、特定の分析対象の存在の信号を発するための、様々な結合パートナーおよびリポーティングエレメントの層を構築する連続的認識事象の使用を指す。サンドイッチアッセイの例には、米国特許第４，４８６，５３０号、およびその中に記されている参照文献に開示されている。

【0217】

キット
本開示は、本開示による染色用緩衝組成物を含むキットを提供する。本キットは、ポリマー色素の１種または複数種の非蛍光構成成分、および生物学用緩衝液を含む染色用緩衝組成物を含む１つまたは複数の容器、ならびに必要に応じて、１種または複数種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含む１つまたは複数の個別の容器を備えることができる。本キットは、１つの容器中に第１のポリマー色素の非蛍光構成成分を１種または複数種、および非イオン性界面活性剤；ならびに別の容器中に少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含むことができる。本キットは、１つの容器中に第１のポリマー色素の２種またはそれより多い非蛍光構成成分；および別の容器中に少なくとも１種の蛍光ポリマー色素コンジュゲートを含むことができる。本キットは、本開示による染色用緩衝液を含む１つまたは複数の容器、および各々が、異なるポリマー色素コンジュゲートを含む、複数の個別の容器を含んでよい。

【0218】

本キットは、細胞を溶解するのに好適な、１種または複数種の構成成分を含んでよい。キットの１種または複数種の追加の構成成分は、個別の容器（例えば、個別の管、ボトル、または多重ウェルストリップもしくはプレートにおけるウェル）で供給されてよい。

【0219】

本キットはまた、パラホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、メタノール、アセトン、ホルマリン、またはそれらの任意の組合せもしくは緩衝液などの１種または複数種の細胞固定試薬を含んでもよい。さらに、本キットは、メタノール、アセトンなどの細胞透過性試薬、あるいはｔｒｉｔｏｎ（登録商標）、ＮＰ－４０、サポニン、ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、ジギトニン、ｌｅｕｃｏｐｅｒｍ、またはそれらの任意の組合せもしくは緩衝液などの洗剤を含んでもよい。
本キットは、例えば、ポリマー色素コンジュゲートの多色パネルと連携して、本開示の染色用緩衝組成物を使用するための使用説明書を含んでもよい。使用説明書は、印刷形態で、キットのパッケージングで、添付文書中で、またはウェブサイトアドレスに存在し得る。

【0220】

定義
本明細書において使用される略称は、その化学分野および生物学分野の範囲内の慣用的な意味を有する。

【0221】

本明細書において使用する場合、用語「アンモニウム」とは、式ＮＨＲ３＋を有する陽イオンを指し、Ｒ基はそれぞれ、独立して、水素、または置換もしくは無置換アルキル、アリール、アラルキルもしくはアルコキシ基である。好ましくは、Ｒ基はそれぞれ、水素である。

【0222】

本明細書において使用する場合、「オリゴエーテル」は、エーテル官能基を有する構造繰り返し単位を含む、オリゴマーを意味することが理解される。本明細書において使用する場合、「オリゴマー」は、同一または異なる式の１つまたは複数の特定可能な構造繰り返し単位を含む分子を意味することが理解される。

【0223】

用語「スルホネート官能基」または「スルホネート」とは、本明細書において使用する場合、遊離スルホン酸陰イオン（－Ｓ（＝Ｏ）_２Ｏ－）およびその塩の両方を指す。したがって、用語スルホネートは、スルホン酸ナトリウム、スルホン酸リチウム、スルホン酸カリウムおよびスルホン酸アンモニウムなどのスルホン酸塩を包含する。

【0224】

用語「スルホンアミド」とは、本明細書において使用する場合、式－ＳＯ_２ＮＲ－の基を指し、Ｒは、水素、アルキルまたはアリールである。

【0225】

用語「アルキル」は、本明細書において使用する場合、表示されている数の炭素原子を有する直鎖状または分岐状の飽和脂肪族ラジカルを指す。例えば、Ｃ_１～Ｃ_６アルキルには、以下に限定されないが、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル、ペンチル、イソペンチル、ヘキシルなどが含まれる。他のアルキル基には、以下に限定されないが、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどが含まれる。アルキルは、１～２個、１～３個、１～４個、１～５個、１～６個、１～７個、１～８個、１～９個、１～１０個、２～３個、２～４個、２～５個、２～６個、３～４個、３～５個、３～６個、４～５個、４～６個および５～６個などの任意の数の炭素を含むことができる。アルキル基は、通常、一価であるが、アルキル基が、２つの部分を一緒に連結した場合など、二価とすることができる。

【0226】

用語「コモノマー」または「コモノマー基」とは、それ自体が、ポリマーの繰り返し単位の部分であってよい、ポリマーの構造単位を指す。

【0227】

用語「シクロアルキル」とは、本明細書において使用する場合、３～１２個の環原子または表示されている数の原子を含有する、飽和もしくは部分不飽和な単環式、縮合二環式または架橋多環式環集合体を指し、単環式環には、例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびシクロオクチルが含まれる。二環式環および多環式環には、例えば、ノルボルナン、デカヒドロナフタレンおよびアダマンタンが含まれる。例えば、Ｃ_３～８シクロアルキルには、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロオクチルおよびノルボルナンが含まれる。

【0228】

用語「ハロアルキル」とは、本明細書において使用する場合、水素原子の一部またはすべてが、ハロゲン原子により置換されている、上で定義したアルキルを指す。ハロゲン（ハロ）は、クロロまたはフルオロを好ましくは表すが、ブロモまたはヨードであってもよい。例えば、ハロアルキルには、トリフルオロメチル、フルオロメチル（flouromethyl）、１，２，３，４，５－ペンタフルオロ－フェニルなどが含まれる。用語「パーフルオロ」は、少なくとも２個の利用可能な水素がフッ素により置換された、化合物またはラジカルと定義する。例えば、パーフルオロフェニルとは、１，２，３，４，５－ペンタフルオロフェニルを指し、パーフルオロメタンとは、１，１，１－トリフルオロメチルを指し、パーフルオロメトキシとは、１，１，１－トリフルオロメトキシを指す。

【0229】

本明細書において使用する場合、用語「ハロゲン」とは、フッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。

【0230】

用語「アルコキシ」とは、本明細書において使用する場合、アルキル基を結合点に連結する酸素原子を有する、上で定義したアルキル基を指す。アルコキシ基には、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソ－プロポキシ、ブトキシ、２－ブトキシ、イソ－ブトキシ、ｓｅｃ－ブトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシ、ペントキシ、ヘキソキシなどが含まれる。アルコキシ基は、本明細書内に記載されている様々な置換基によりさらに置換され得る。例えば、アルコキシ基は、ハロゲンにより置換されて、「ハロ－アルコキシ」基を形成することができる。

【0231】

用語「アルケン」とは、本明細書において使用する場合、少なくとも１つの二重結合を有する、直鎖状または分岐状炭化水素のどちらかを指す。アルケン基の例には、以下に限定されないが、ビニル、プロペニル、イソプロペニル、１－ブテニル、２－ブテニル、イソブテニル、ブタジエニル、１－ペンテニル、２－ペンテニル、イソペンテニル、１，３－ペンタジエニル、１，４－ペンタジエニル、１－ヘキセニル、２－ヘキセニル、３－ヘキセニル、１，３－ヘキサジエニル、１，４－ヘキサジエニル、１，５－ヘキサジエニル、２，４－ヘキサジエニルまたは１，３，５－ヘキサトリエニルが含まれる。アルケン基は、通常、一価であるが、アルケニル基が、２つの部分を一緒に連結している場合など、二価とすることができる。

【0232】

用語「アルキン」とは、本明細書において使用する場合、少なくとも１つの三重結合を有する、直鎖状または分岐状炭化水素のどちらかを指す。アルキニル基の例には、以下に限定されないが、アセチレニル、プロピニル、１－ブチニル、２－ブチニル、イソブチニル、ｓｅｃ－ブチニル、ブタジイニル、１－ペンチニル、２－ペンチニル、イソペンチニル、１，３－ペンタジイニル、１，４－ペンタジイニル、１－ヘキシニル、２－ヘキシニル、３－ヘキシニル、１，３－ヘキサジイニル、１，４－ヘキサジイニル、１，５－ヘキサジイニル、２，４－ヘキサジイニルまたは１，３，５－ヘキサトリイニルが含まれる。アルキニル基は、通常、一価であるが、アルキニル基が、２つの部分を一緒に連結している場合など、二価とすることができる。

【0233】

用語「アリール」または「芳香族」とは、本明細書において使用する場合、６～１６個の環炭素原子を含有する、単環式、または縮合した二環式、三環式もしくはそれより多い環式の芳香環集合体を指す。例えば、アリールは、フェニル、ベンジル、ナフチル、ジヒドロフェナントレニル（ＤＨＰ）、９，１０－ジヒドロフェナントレニルまたはフルオレニルとすることができる。「アリーレン」は、アリール基から誘導される二価のラジカルを意味する。アリール基は、アルキル、アルコキシ、アリール、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アミノ、アミノ－アルキル、トリフルオロメチル、アルキレンジオキシおよびオキシ－Ｃ_２～Ｃ_３－アルキレンから選択される、１つ、２つまたは３つのラジカルにより一置換され得、二置換され得、または三置換され得、これらはすべて、例えば、本明細書のこれ以前に定義されている通り、必要に応じてさらに置換されているか、または１－もしくは２－ナフチル；または１－もしくは２－フェナントレニルである。アルキレンジオキシは、フェニルの２個の隣接炭素原子に結合した二価の置換基（substitute）、例えば、メチレンジオキシまたはエチレンジオキシである。オキシ－Ｃ_２～Ｃ_３－アルキレンはまた、フェニルの２個の隣接炭素原子に結合した二価置換基、例えばオキシエチレンまたはオキシプロピレンである。オキシ－Ｃ_２～Ｃ_３－アルキレン－フェニルの例は、２，３－ジヒドロベンゾフラン－５－イルである。

【0234】

アリールとして好ましいものは、ジヒドロフェナントレニル（ＤＨＰ）、９，１０－ジヒドロフェナントレニル、ナフチル、フェニル、あるいはアルコキシ、フェニル、ハロゲン、アルキルもしくはトリフルオロメチルにより一置換もしくは二置換されたフェニル、とりわけフェニル、またはアルコキシ、ハロゲンもしくはトリフルオロメチルにより一置換または二置換されたフェニル、および特に、フェニルである。

【0235】

用語「アリールオキシ」とは、本明細書において使用する場合、アリールが上で定義されている通りであるＯ－アリール基を指す。アリールオキシ基は、無置換であり得るか、または好適な１個もしくは２個の置換基により置換され得る。用語「フェノキシ」とは、アリール部分がフェニル環である、アリールオキシ基を指す。用語「ヘテロアリールオキシ」は、本明細書において使用する場合、－Ｏ－ヘテロアリール基を意味し、ヘテロアリールは以下に定義されている通りである。用語「（ヘテロ）アリールオキシ」は、その部分がアリールオキシ基またはヘテロアリールオキシ基のどちらか一方であることを示すために使用される。

【0236】

用語「ＡＦＵ」とは、任意蛍光単位を指す。

【0237】

用語「ＡＵＦ」とは、蛍光の任意単位を指す。

【0238】

用語「ポリエチレングリコール」または「ＰＥＧ」とは、本明細書において使用する場合、エチレングリコールモノマー単位に基づく、生体適合性の水可溶化線状ポリマーのファミリーを指す。

【0239】

用語「ヘテロアリール」または「複素芳香族」とは、本明細書において使用する場合、５～１６個の環原子を含有し、環原子の１～４個がヘテロ原子であり、各々が、Ｎ、ＯまたはＳである、単環式、または縮合した二環式もしくは三環式の複素芳香環集合体を指す。例えば、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、インダゾリル、キノキサリニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、カルバゾリル、フラニル、ピロリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、あるいは例えば、アルキル、ニトロもしくはハロゲンによって置換されている、とりわけ一置換されているまたは二置換されている任意の他のラジカルを含む。ピリジルは、２－、３－または４－ピリジル、有利には、２－または３－ピリジルを表す。チエニルは、２－または３－チエニルを表す。キノリニルは、好ましくは、２－、３－または４－キノリニルを表す。イソキノリニルは、好ましくは、１－、３－または４－イソキノリニルを表す。ベンゾピラニル、ベンゾチオピラニルは、それぞれ、好ましくは３－ベンゾピラニルまたは３－ベンゾチオピラニルを表す。チアゾリルは、好ましくは２－または４－チアゾリル、および最も好ましくは４－チアゾリルを表す。トリアゾリルは、好ましくは１－、２－または５－（１，２，４－トリアゾリル）である。テトラゾリルは、好ましくは、５－テトラゾリルである。

【0240】

好ましくは、ヘテロアリールは、ピリジル、インドリル、キノリニル、ピロリル、チアゾリル、イソオキサゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、ピラゾリル、イミダゾリル、チエニル、フラニル、ベンゾチアゾリル、ベンゾフラニル、イソキノリニル、ベンゾチエニル、オキサゾリル、インダゾリル、または置換されている、とりわけ一置換されているもしくは二置換されているこれらのラジカルのいずれかである。

【0241】

同様に、アリール基およびヘテロアリール基の置換基は様々であり、０から芳香環系上の自由価数の総数までの範囲の数の、－ハロゲン、－ＯＲ’、－ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ’Ｒ”、－ＳＲ’、－Ｒ’、－ＣＮ、－ＮＯ_２、－ＣＯ_２Ｒ’、－ＣＯＮＲ’Ｒ”、－Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”、－ＮＲ”Ｃ（Ｏ）Ｒ’、－ＮＲ”Ｃ（Ｏ）_２Ｒ’、－ＮＲ’－Ｃ（Ｏ）ＮＲ”Ｒ’’’、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、－ＮＲ’Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＨ、－ＮＨ－Ｃ（ＮＨ_２）＝ＮＲ’、－Ｓ（Ｏ）Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２Ｒ’、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’Ｒ”、－Ｎ_３、－ＣＨ（Ｐｈ）_２、パーフルオロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルコキシおよびパーフルオロ（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルから選択され、Ｒ’、Ｒ”およびＲ’’’は、水素、（Ｃ_１～Ｃ_５）アルキルおよびヘテロアルキル、無置換アリールおよびヘテロアリール、（無置換アリール）－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルおよび（無置換アリール）オキシ－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルから独立して選択される。

【0242】

アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、必要に応じて、式－Ｔ－Ｃ（Ｏ）－（ＣＨ_２）_ｑ－Ｕ－の置換基により置き換えられていてもよく、ＴおよびＵは、独立して、－ＮＨ－、－Ｏ－、－ＣＨ_２－または単結合であり、ｑは、０～２の整数である。代替的に、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式－Ａ－（ＣＨ_２）_ｒ－Ｂ－である置換基により必要に応じて置き換えられていてもよく、ＡおよびＢは、独立して、－ＣＨ_２－、－Ｏ－、－ＮＨ－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－、－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－または単結合であり、ｒは、１～３の整数である。こうして形成された新しい環の単結合の１つは、必要に応じて、二重結合により置き換えられていてもよい。代替的に、アリール環またはヘテロアリール環の隣接原子上の置換基の２つは、式－（ＣＨ_２）_ｓ－Ｘ－（ＣＨ_２）_ｔ－の置換基により必要に応じて置き換えられていてもよく、ｓおよびｔは、独立して、０～３の整数であり、Ｘは、－Ｏ－、－ＮＲ’－、－Ｓ－、－Ｓ（Ｏ）－、－Ｓ（Ｏ）_２－または－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－である。－ＮＲ’－および－Ｓ（Ｏ）_２ＮＲ’－中の置換基Ｒ’は、水素または無置換（Ｃ_１～Ｃ_６）アルキルから選択される。

【0243】

用語「（ヘテロ）アリールアミノ」とは、本明細書において使用する場合、アリール基により置換されているアミンラジカル（例えば、－ＮＨ－アリール）を指す。アリールアミノはまた、アミン基により置換されているアリールラジカル（例えば、－アリール－ＮＨ_２）であってもよい。アリールアミノは、置換されていてもよく、または無置換であってもよい。

【0244】

用語「アミン」とは、本明細書において使用する場合、１つまたは複数のアミノ基を有する、本明細書内で定義されているアルキル基を指す。アミノ基は、一級、二級または三級とすることができる。アルキルアミンは、ヒドロキシ基によりさらに置換され得る。本発明において有用なアミンには、以下に限定されないが、エチルアミン、プロピルアミン、イソプロピルアミン、エチレンジアミンおよびエタノールアミンが含まれる。アミノ基は、アルキルアミンを化合物の残りとの結合点に連結させることができるか、アルキル基のオメガ位に存在し得るか、またはアルキル基の少なくとも２個の炭素原子を一緒に連結することができる。当業者は、他のアルキルアミンが本発明において有用であることを理解している。

【0245】

用語「カルバメート」とは、本明細書において使用する場合、構造－ＮＲ”ＣＯ_２Ｒ’を有する官能基を指し、Ｒ’およびＲ”は、水素、（Ｃ_１～Ｃ_８）アルキルおよびヘテロアルキル、無置換アリールおよびヘテロアリール、（無置換アリール）－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルおよび（無置換アリール）オキシ－（Ｃ_１～Ｃ_４）アルキルから独立して選択される。カルバメートの例には、ｔ－Ｂｏｃ、Ｆｍｏｃ、ベンジルオキシ－カルボニル、ａｌｌｏｃ、メチルカルバメート、エチルカルバメート、９－（２－スルホ）フルオレニルメチルカルバメート、９－（２，７－ジブロモ）フルオレニルメチルカルバメート、Ｔｂｆｍｏｃ、Ｃｌｉｍｏｃ、Ｂｉｍｏｃ、ＤＢＤ－Ｔｍｏｃ、Ｂｓｍｏｃ、Ｔｒｏｃ、Ｔｅｏｃ、２－フェニルエチルカルバメート、Ａｄｐｏｃ、２－クロロエチルカルバメート、１，１－ジメチル－２－ハロエチルカルバメート、ＤＢ－ｔ－ＢＯＣ、ＴＣＢＯＣ、Ｂｐｏｃ、ｔ－Ｂｕｍｅｏｃ、Ｐｙｏｃ、Ｂｎｐｅｏｃ、Ｖ－（２－ピバロイルアミノ）－１，１－ジメチルエチルカルバメート、ＮｐＳＳＰｅｏｃが含まれる。

【0246】

用語「カルボキシレート」とは、本明細書において使用する場合、カルボン酸の共役塩基を指し、これは、一般に、式ＲＣＯＯによって表すことができる。例えば、用語「カルボン酸マグネシウム」とは、カルボン酸のマグネシウム塩を指す。

【0247】

用語「活性化エステル」とは、本明細書において使用する場合、アミノ酸誘導体のカルボキシル基と遊離アミノ基との容易な縮合を促進するため、ペプチド化学において使用されるカルボキシル活性基を指す。これらのカルボキシル活性基の説明は、ペプチド化学の一般教書、例えばK. D. Kopple, ”Peptides and Amino Acids”, W. A. Benjamin, Inc., New York, 1966, pp. 50-51 and E. Schroder and K. Lubke, ”The Peptides”; Vol. 1, Academic Press, New York, 1965, pp. 77-128に見出される。

【0248】

用語「ヒドラジン」および「ヒドラジド」とは、単結合した窒素を含有し、窒素の１個が一級アミン官能基である化合物を指す。

【0249】

用語「アルデヒド」とは、本明細書において使用する場合、－ＣＨＯ基を有する化学化合物を指す。

【0250】

用語「チオール」とは、本明細書において使用する場合、硫黄－水素結合からなる官能基を含む化合物を指す。チオール官能基の一般的な化学構造は、Ｒ－ＳＨであり、Ｒは、アルキル、アルケン、アリールまたは他の炭素含有原子団を表す。

【0251】

用語「シリル」とは、本明細書において使用する場合、Ｓｉ（Ｒ^ｚ）_３を指し_、Ｒ^ｚはそれぞれ、独立して、アルキル アリールまたは他の炭素含有原子団である。

【0252】

用語「ジアゾニウム塩」とは、本明細書において使用する場合、Ｒ－Ｎ_２ ^＋Ｘ^－の構造を有する有機化合物の基を指し、Ｒは、任意の有機残基（例えば、アルキルまたはアリール）とすることができ、Ｘは、無機または有機陰イオン（例えば、ハロゲン）である。

【0253】

トリフルオロメタンスルホネートとも称される用語「トリフレート」は、式ＣＦ_３ＳＯ_３を有する基である。

【0254】

用語「ボロン酸」とは、本明細書において使用する場合、構造－Ｂ（ＯＨ）_２を指す。ボロン酸は、クエンチャーの合成の様々な段階において、ボロン酸エステルとして存在し得ることが当業者によって認識されている。ボロン酸は、このようなエステルを含むことが意図される。用語「ボロン酸エステル」または「ボロネートエステル」とは、本明細書において使用する場合、－Ｂ（Ｚ^１）（Ｚ^２）部分を含有する化学化合物を指し、Ｚ^１およびＺ^２は、一緒になって、各場合においてホウ素に結合している原子が酸素原子である部分を形成する。ボロン酸エステル部分は、５員環であり得る。ボロン酸エステル部分は、６員環であり得る。ボロン酸エステル部分は、５員環と６員環との混合物であり得る。

【0255】

用語「ＤＡＢＣＹＬ」とは、４－（ジメチルアミノアゾ）ベンゼン－４－カルボン酸の頭字語である。ＤＡＢＣＹＬは、消光性部分として使用されてもよい。ＤＡＢＣＹＬは、約４７４ｎｍの吸収極大を有する。

【0256】

用語「ＤＡＢＳＹＬ」とは、塩化４－（ジメチルアミノアゾ）ベンゼン－４”－スルホニルを指す。ＤＡＢＳＹＬは、消光性部分として使用されてもよい。

【0257】

用語「ブラックホールクエンチャー１」（ＢＨＱ－１）とは、約５３４ｎｍの吸収極大を有する消光性部分を指す。

【0258】

範囲形式で表される値は、その範囲の境界値として明示的に記載されている数値を含むだけでなく、各数値および部分範囲があたかも明示的に記載されているかのごとく、その範囲内に包含される個々の数値または部分範囲のすべても含むように柔軟に解釈されるべきである。例えば、「約０．１％～約５％」または「約０．１％～５％」の範囲は、ただ約０．１％～約５％だけではなく、表示された範囲内の個々の値（例えば、１％、２％、３％および４％）および部分範囲（例えば、０．１％～０．５％、１．１％～２．２％、３．３％～４．４％）も含むと解釈されるべきである。「約Ｘ～Ｙ」という記載は、他に示さない限り、「約Ｘ～約Ｙ」と同じ意味を有する。同様に、「約Ｘ、Ｙまたは約Ｚ」という記載は、他に示さない限り、「約Ｘ、約Ｙまたは約Ｚ」と同じ意味を有する。

【0259】

用語「ＣＤ」とは、分化抗原群を指す。

【0260】

フローサイトメトリーにおける用語「補正」とは、蛍光の漏れ込み（多重パラメータのフローサイトメトリーデータのスペクトル重なり）を補正する数学的処理のことである。例えば、補正は、所与の蛍光色素の測定に向けた検出器以外のすべての検出器から、そのような色素のいずれのシグナルも除去することによって行われ得る。蛍光色素は、幅広い範囲のスペクトルを有することがあるので、それらは、重なり得、データ分析の間に望ましくない混乱を引き起こす恐れがある。

【0261】

用語「ＭｄＦｌ」または「ＭＤＦｌ」とは、蛍光強度中央値を指す。

【0262】

用語ＭＦＩ＝平均蛍光強度である。

【0263】

用語「％動員」とは、関連集団のゲーティングされた細胞数を指す。

【0264】

用語「多色色素コンジュゲートパネル」または「多色抗体パネル」とは、血液を染色してフローサイトメータでこれを分析するために直接、使用することができる、複数の異なる蛍光色素コンジュゲート（例えば、ＣＤ４－ＦＩＴＣ、ＣＤ８－ＰＥ、ＣＤ２０－ＡＰＣ、ＣＤ３－ＰＣ５．５、ＣＤ１６－ＦＩＴＣ、ＣＤ２５－ＰＥ、ＣＤ３－ＥＣＤ、ＣＤ３８－ＰＣ５．５、ＣＤ２７－ＰＣ７、ＣＤ１０－ＡＰＣ、ＣＤ１４－ＡＰＣＡ７００、ＣＤ４５－ＡＡ７５０、ＣＤ８－ＫＲＯ、ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５、ＣＤ４－ＳＮｖ７８６など）を含むカクテルを指す。

【0265】

用語「多重化」とは、本明細書において、複数の分析対象を同時にアッセイすることができる、アッセイまたは他の分析方法を指す。

【0266】

水可溶化部分は、ポリマー色素中に含まれて、水溶解度の増大をもたらすことができる。溶解度の増大は、様々となり得るが、一部の例では、水可溶化部分を含まないポリマー色素と比較した場合の増大は、少なくとも２倍またはそれより高く、例えば、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍またはそれより高いことがある。

【0267】

用語「水可溶化部分」とは、水性環境中、例えば、生理的条件下で、十分に溶媒和された基であって、この基が結合している分子に、水溶解度の改善を付与する、基を指す。水可溶化部分は、水性環境において十分に溶媒和される、任意の適切な親水性基であり得る。一部の場合、親水性水可溶化基は、荷電しており、例えば、正または負に荷電している。ある特定の場合、親水性水可溶化基は、中性の親水性基である。一部の実施形態では、水可溶化部分は、親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、セルロース、キトサンまたはそれらの誘導体である。水可溶化部分は、以下に限定されないが、カルボキシレート、ホスホネート、ホスフェート、スルホネート、サルフェート、スルフィネート、スルホニウム、エステル、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および修飾ＰＥＧ、ヒドロキシル、アミン、アンモニウム、グアニジニウム、ピリジニウム、ポリアミンおよびスルホニウム、ポリアルコール、直鎖状または環状サッカライド、一級、二級、三級または四級アミンおよびポリアミン、ホスホネート基、ホスフィネート基、アスコルベート基、グリコールを含むことができる。一部の実施形態では、水可溶化部分は、ＰＥＧである。

【0268】

用語「ＰＥＧ」とは、式－（ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｏ－）_ｎ－またはその誘導体によって記載されるエチレングリコールモノマー単位に基づいた、生体適合性の水可溶化線状ポリマーのファミリーである、ポリエチレングリコールまたはポリ（エチレングリコール）を指す。水可溶化部分は、少なくとも１０ｍｇ／ｍＬの水への溶解度をもたらすことができる。ＰＥＧ部分は、水可溶化部分として使用されてもよい。一部の実施形態では、「ｎ」は、１０００またはそれ未満、５００またはそれ未満、２００またはそれ未満、１００またはそれ未満、５０またはそれ未満、４０またはそれ未満、３０またはそれ未満、２０またはそれ未満、１５またはそれ未満（３～１５または１０～１５など）である。ＰＥＧポリマー基は、任意の好都合な長さのものであってよく、以下に限定されないが、アルキル、アリール、ヒドロキシル、アミノ、アシル、カルボン酸、カルボン酸エステル、アシルオキシおよびアミドの末端基および／または置換基を含めた、様々な末端基および／またはさらなる置換基を含むことができることが理解される。「ＰＥＧ」の後の数は、平均分子量を指し、Ｍｗは、重量平均分子量を指し、Ｍｎは、数平均分子量を指す。

【0269】

用語「ポリマー色素の非蛍光構成成分」とは、ポリマー色素のモノマー単位、光退色されたポリマー色素、消光性部分を含むポリマー色素、または非蛍光ポリマー色素を指し、ポリマー色素の非蛍光構成成分は、光励起時に再発光する能力をほとんどまたは全く示さない。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、約０．１以下、０．０６以下または０．０５６以下の量子収率を示し得る。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、１０マイクログラム／ｍＬに対して、４５０ｎｍ（スリット励起／発光は６ｎｍ／４ｎｍである；１ｃｍのキュベット）において、≦５０ＡＦＵを放射することができる。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合、約５０ＡＦＵ未満を有し得る。ポリマー色素の非蛍光構成成分は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0270】

用語「非蛍光ポリマー色素」とは、光退色なしに、約０．１、０．０６または０．０５６以下の量子収率を示す、式（Ｉ）によるポリマー色素であって、消光性部分を含まない、ポリマー色素を指す。非蛍光ポリマー色素は、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合、約５０ＡＦＵ未満を有し得る。非蛍光ポリマー色素は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0271】

用語「非特異的結合」とは、本明細書において使用する場合、特異的結合によって引き起こされない任意の結合を一般に指し、より詳細には、標的分析対象への結合パートナーの特異的結合以外の手段による、ポリマー色素コンジュゲートの結合を指す。非特異的結合は、ポリマーの疎水性、免疫複合剤、荷電タンパク質、および染色用緩衝液または生物学的試料中に存在し得る抗体妨害性タンパク質を含めた、いくつかの因子に起因し得る。非特異的結合のタイプの１つは、１つもしくは複数、または２つもしくはそれより多い蛍光ポリマー色素コンジュゲートの間で起こり得る、ポリマー－ポリマー相互作用である。試験染色用緩衝組成物中の非特異的結合は、例えば、本明細書において提供される方法に準拠し、例えば、生物学的試料中の多色蛍光ポリマー色素コンジュゲートの混合物のＦＣＡドットプロットと、同じ試料中の混合物の個々の単色蛍光ポリマー色素コンジュゲートのＦＣＡドットプロットを比較することによって評価することができる。例えば、溶液が、非特異的結合するポリマー－ポリマー相互作用の阻止の効率が高い場合、個々の細胞集団は、個々に使用した単色コンジュゲートを用いて得られた染色と同様に十分に補正されているように思われる。対照的に、溶液の効率が不良である場合、その集団は、整列されておらず、傾いて見えるであろう。

【0272】

ポリマー－ポリマー相互作用などの非特異的結合を低減するための、本開示による染色用緩衝組成物の効率を測定する代替方法は、それらが個々に使用される場合と混合して使用される場合の、コンジュゲートの負の集団および正の集団のＭＦＩを使用する。

【0273】

用語「光退色された色素」とは、もはや蛍光を発することができないように、高強度照射を受けた発蛍光団を元々含む色素を指す。一部の実施形態では、光退色されたポリマーは、０．１Φ以下、または０．０６Φ以下、または０．０５６Φ以下、０．０５Φ以下、０．０２Φ以下、または０．０１５Φ以下の量子収率（ＱＹ）を示す。一部の実施形態では、光退色されたポリマーは、４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に、約５０未満の蛍光の任意単位（ＡＦＵ）を示す。光退色された色素は、４０５ｎｍで励起された場合に、親蛍光ポリマーと比較して、元の最大発光強度の＞９５％の消光、元の最大発光強度の＞９８％の消光、最大で１００％の消光を示し得る。

【0274】

発蛍光団は、蛍光過程を繰り返し受けることができる。このことは、発蛍光団分子は、複数回、シグナルを理論的に発生することができることを意味する。実際に、発蛍光団の励起寿命の間のその構造的不安定性により、発蛍光団は分解し易くなることがある。高強度照射により、発蛍光団にその構造を変化させることができ、その結果、発蛍光団は、蛍光をもはや発することができず、これが光退色と呼ばれるものである。

【0275】

用語「量子収率」（ＱＹ）（Φ）または「蛍光量子収率」とは、吸収されたフォトンの数に対する、放射されたフォトンの数の比を指す。量子収率は、機器設定に無関係であり、発蛍光団がどの程度効率的に励起エネルギーを蛍光に変換するかを説明するものである。実験により、相対蛍光量子収率は、試験色素と同じ実験パラメータ（励起波長、スリット幅、光電子増倍管電圧など）を用いて、既知の量子収率の発蛍光団の蛍光を測定することによって求めることができる。量子収率は、当分野において公知の任意の方法によって求めることができる。例えば、ＱＹは、選択した励起波長において、分光蛍光光度計または蛍光分光計で、製造業者の説明書に従って求めることができる。例えば、量子収率（ＱＹ）は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ Ｒｆ－６０００分光蛍光光度計において、４０５ｎｍに０．０５の吸光度（４０５ｎｍでの励起、励起スリット１．５、発光スリット３．０、１ｃｍの石英キュベット）を有する染色用緩衝液の希ＰＢＳ溶液から、４２８ｎｍの発光強度を測定することによって、求めることができる。量子収率は、例えば、同一実験条件下、試料から測定した強度と、ＮＨＳ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＰＢＳ １×中、ＱＹ＝０．７８）溶液から測定した強度とを比較することによって計算することができる。一部の実施形態では、ＱＹは、例えば、Lawson-Wood et al., Application Note-Fluorescence Spectroscopy, Determination of relative fluorescence quantum yield using the FL5600 fluorescence spectrometer, 2018, PerkinElmer, Incによって求めることができる。選択される励起波長は、例えば、４０５ｎｍであってよい。一部の実施形態では、消光されたポリマーまたは光退色されたポリマーのＱＹは、光退色の存在しない、および消光性部分を含まない親蛍光ポリマーと比較することができる。

【0276】

用語「蛍光色素」とは、光励起時に再発光することができる、光により励起可能な発蛍光団を含む色素を指す。用語「蛍光色素」とは、蛍光モノマーおよび他の従来的な蛍光色素を含めた、蛍光ポリマー色素と蛍光非ポリマー色素の両方を包含する。蛍光ポリマー色素は、例えば、本開示による構造を含む、任意の適切な蛍光ポリマー色素であってよい。蛍光ポリマー色素は、市販もされている。例えば、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）（「ＳＮ」）ｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）は、バイオレットレーザー（４０５ｎｍ）によって最適に励起され、４１４ｎｍの励起極大、４２８ｎｍの発光ピークを有する蛍光ポリマー色素であり、４５０／５０バンドパスフィルターまたは等価物を使用して検出することができる。ＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６は、コアＳＮ ｖ４２８ポリマー色素から誘導されるタンデムポリマー色素である。どちらも、４１４ｎｍに極大励起を有する、同じ吸光度特徴を共有する。ＳＮ ｖ６０５およびＳＮ ｖ７８６の発光ピークはそれぞれ６０５ｎｍおよび７８６ｎｍであるので、それらは、フローサイトメータの６１０／２および７８０／６０ｎｍバンドパスフィルターを使用して最適に検出される。

【0277】

用語「発蛍光団」とは、光励起時に再発光することができる、蛍光化学化合物を指す。発蛍光団は、いくつかの混合芳香族基、またはいくつかのｐパイ結合を有する平面および環式分子を通常、含有することができる。

【0278】

用語「患者」、「対象（単数）」または「対象（複数）」は、以下に限定されないが、ヒトを含み、この用語はまた、他の哺乳動物、または家畜動物もしくはエキゾチックアニマル、例えば、イヌ、ネコ、フェレット、ウサギ、ブタ、ウマ、ウシ、トリまたは爬虫類を包含することができる。

【0279】

別段の指定がない限り、用語「室温」という語句とは、１８～２７℃を指す。

【0280】

別段の指定がない限り、用語「パーセント」または「％」とは、重量パーセントを指す。

【0281】

語句「使用する用意が調っている試薬」、「使用する用意が調っている試薬組成物」、「作業濃度の試薬」および「作業濃度の試薬組成物」とは、例えば、フローサイトメトリー分析（ＦＣＡ）のために生物学的試料を染色するため、ポリマー色素コンジュゲートの混合物中で使用するのに適切な約１×作業濃度で生成した染色用緩衝組成物を指す。

【0282】

語句「濃厚な染色用緩衝液」または「濃染色用緩衝組成物」とは、フローサイトメトリー分析のために生物学的試料を染色する際に、多色パネルにおける非特異的なポリマー相互作用の低減に有用な作業濃度の染色用緩衝組成物が得られるよう、例えば、生物学用緩衝液または水などの希釈液を用いて希釈するための、例えば、約１０倍の濃縮係数（１０×）で生成した染色用緩衝組成物を指す。濃染色用緩衝組成物は、作業濃度の染色用緩衝組成物よりも、１倍（１×）から少なくとも１０倍（１０×）または少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍の濃厚な濃度で製造され得、安定な状態にあることができる。

【0283】

一部の実施形態では、作業濃度の染色用緩衝組成物は、２～８℃の範囲内の温度（１５～３７℃、または周囲温度１９～２７℃までの逸脱を伴う）で、密閉した元の容器中で保管した場合、製造日から少なくとも３か月、少なくとも６か月、少なくとも９か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月または少なくとも２４か月またはそれより長い間、安定である。一部の実施形態では、濃染色用緩衝組成物は、２～８℃の範囲内の温度（１５～３７℃、または周囲温度１９～２７℃までの逸脱を伴う）で、密閉した元の容器中で保管した場合、製造日から少なくとも３か月、６か月、９か月、１２か月、１８か月、２４か月、３０か月、または３６か月またはそれより長い間、安定である。

【0284】

頭字語「ＳＮ」は、ＳｕｐｅｒＮｏｖａ（商標）を指す。

【0285】

頭字語「ＳＳＣ」とは、側方散乱を指す。

【0286】

用語「ＷＢＣ」とは、白血球を指す。

【0287】

用語「約」は、例えば化合物の量、用量、時間、温度などの測定可能な値を指す場合、指定量の１０％、５％、１％、０．５％またはさらには０．１％もの変動、および値を測定するための試験方法における少なくとも工業標準偏差を包含することが意図される。

【0288】

本明細書において、用語「ａ」、「ａｎ」または「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に指示しない限り、１つまたは１つより多いことを含むよう使用される。用語「または」は、他に示さない限り、非排他的な「または」を指すよう使用される。さらに、本明細書において使用されており、特に定義されていない表現または専門用語は、説明目的に過ぎず、限定ではないことを理解されたい。項目の見出しのいずれの使用も、本明細書を読むことの手助けをすることが意図されており、限定として解釈されるべきではない。さらに、項目の見出しに関連する情報は、そのような特定の項目内または項目外に現れ得る。さらに、本明細書に言及されているすべての刊行物、特許および特許文書は、個々に参照により組み込まれているかのごとく、その全体が参照により本明細書により組み込まれている。本明細書と、参照によりそのように組み込まれている文書との間で、使用法が一致しない場合、組み込まれた参考文献での使用法は、本明細書の使用法を補足するものとみなされるべきであり、一致しない矛盾に関しては、本明細書における使用法が優先する。

【0289】

本明細書において使用する場合、ポリマー色素コンジュゲートの非特異的結合を「低減すること」または「排除すること」とは、第１のポリマー色素の非蛍光構成成分が使用されない場合と比較した％での、「負」（例えば、負の顆粒球、単球およびリンパ球集団）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９９％またはそれより高い；約５０％～約９５％、約５０％～約７５％、約６０％～約８０％または約６５％～約９０％）、低下する場合を指すことができる。言い換えると、界面活性剤を使用しない場合と比較した％での、単球、顆粒球およびリンパ球のうちの少なくとも１つのバックグラウンド染色の％低下は、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも９９％またはそれより高い；約５０％～約９５％、約５０％～約７５％、約６０％～約８０％または約６５％～約９０％）、低下する。

【0290】

本明細書に記載されている方法では、時間的順序または操作順序が明示的に記載されている場合を除き、本発明の原理から逸脱することなく、任意の順序で工程を実行することができる。さらに、特定の工程が個別に実施されると明示的な請求項の言語が記載していない限り、それらの工程は同時に実施することができる。例えば、Ｘを行うという特許請求されている工程、およびＹを行うという特許請求されている工程は、単一操作内で同時に実施することができ、結果としての過程は、特許請求されている過程の文言通りの範囲内にあることになる。

【0291】

上記の実施形態はそれぞれ、本明細書に記載されている他の実施形態との各組合せで適用可能であると想定される。例えば、式（Ｉ）に対応する実施形態は、式（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＶ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）に適用可能であると等しく想定される。別の例として、式（ＶＩＩＩ）～（ＸＩＶ）、（ＸＶＩＩＩ）、（ＸＩＸ）、（ＸＸ）のいずれかに対応する実施形態は、式（Ｉ）に適用可能であると等しく想定される。

【0292】

用語「実質的に」とは、本明細書において使用する場合、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％、９９．９９％または少なくとも約９９．９９９％、またはそれより高いような、大部分またはほとんどであることを指す。

【0293】

用語「実質的にない」または「実質的に不含である」とは、本明細書において使用する場合、約１％、０．５％、０．１％、０．０５％、０．００１％未満、または約０．０００５％もしくはこれ未満、約０％、定量限界値未満、検出可能な限界値未満、または０％を指す。

【0294】

当業者は、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている実施形態に対する多数の改変が可能であることを認識していよう。したがって、本記載は、示されている例に限定されると解釈されることを意図するものではなく、解釈されるべきでもなく、添付の特許請求の範囲およびその均等物によって与えられる全範囲の保護が付与されるべきである。さらに、他の特徴の対応する使用なしに、本開示の特徴の一部を使用することが可能である。したがって、例示的な実施形態の上の記載または例示的な実施形態は、本開示の原理を例示する目的で提供されており、その制限ではなく、それらの改変およびそれらの変形を含むことができる。

【実施例】

【0295】

本発明は、例示により提示される以下の実施例を参照することによってよりよく理解され得る。本発明は、本明細書に示されている実施例に限定されない。

【0296】

（実施例１）
ＤＨＰポリマー色素の調製

【化56】

方法１：丸底フラスコ内で、ジブロモＤＨＰおよびジボロンＤＨＰモノマーの両方（１：１）を（ＤＭＦ－水）混合物にとり、窒素を１０分間、パージした。窒素下、約２０当量のＣｓＦおよび１０％のＰｄ（ＯＡｃ）_２を混合し、摂氏８０度で加熱した。ＵＶ－Ｖｉｓ分光法およびＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合をモニタリングした。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0297】

方法２：代替的に、重合は、ＤＨＰ分子のブロモ－ボロン酸エステルを自己重合することによって行うことができる。丸底フラスコ内で、ＤＨＰブロモボロン酸エステルを（ＤＭＦ－水）混合物にとり、窒素を１０分間、パージした。窒素下、約１０当量のＣｓＦおよび５％のＰｄ（ＯＡｃ）_２を混合し、摂氏８０度に加熱した。ＵＶ－Ｖｉｓ分光法およびＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合をモニタリングした。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0298】

方法３：丸底フラスコ内に、ジブロモジヒドロフェナントレンおよびジボロンジヒドロフェナントレン（dihydrophanenthrene）モノマーの両方（１：１）をとり、１０当量のＫ_２ＣＯ_３および３％Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を含有するＴＨＦ－水（４：１）混合物に溶解した。反応混合物をシュレンクラインに取り付け、３回の凍結－真空－解凍サイクルで脱気し、次に、窒素下、１８時間、激しく撹拌しながら、摂氏８０度まで加熱した。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を窒素の過圧下でカニューレから加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0299】

方法４：代替的に、重合は、ジヒドロフェナントレン分子のブロモ－ボロン酸エステルを自己重合することによって行うことができる。丸底フラスコ内に、ジヒドロフェナントレンブロモボロン酸エステルをとり、１０当量のＫ_２ＣＯ_３および３％Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を含有するＴＨＦ－水（４：１）混合物に溶解した。反応混合物をシュレンクラインに取り付け、３回の凍結－真空－解凍サイクルで脱気し、次に、窒素下、１８時間、激しく撹拌しながら、摂氏８０度まで加熱した。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を窒素の過圧下でカニューレから加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0300】

（実施例２）
フルオレン－ＤＨＰコポリマー色素の調製

【化57】

方法１：丸底フラスコ内で、ジブロモＤＨＰおよびジボロンフルオレンモノマーの両方（１：１）を（ＤＭＦ－水）混合物にとり、窒素を１０分間、パージした。窒素下、約２０当量のＣｓＦおよび１０％のＰｄ（ＯＡｃ）２を混合し、摂氏８０度で加熱した。ＵＶ－Ｖｉｓ分光法およびＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合をモニタリングした。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0301】

方法２：丸底フラスコ内で、ジブロモフルオレンおよびジボロンＤＨＰモノマーの両方（１：１）を（ＤＭＦ－水）混合物にとり、窒素を１０分間、パージした。窒素下、約２０当量のＣｓＦおよび１０％のＰｄ（ＯＡｃ）２を混合し、摂氏８０度で加熱した。ＵＶ－Ｖｉｓ分光法およびＳＥＣクロマトグラフィーを使用して重合をモニタリングした。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0302】

方法３：丸底フラスコ内に、ジブロモジヒドロフェナントレンおよびジボロンフルオレンモノマーの両方（１：１）をとり、１０当量のＫ_２ＣＯ_３および３％Ｐｄ（ＰＰｈ_３）_４を含有するＴＨＦ－水（４：１）混合物に溶解した。反応混合物をシュレンクラインに取り付け、３回の凍結－真空－解凍サイクルで脱気し、次に、窒素下、１８時間、激しく撹拌しながら、摂氏８０度まで加熱した。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を窒素の過圧下でカニューレから加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0303】

方法４：丸底フラスコ内に、ジブロモフルオレンおよびジボロンジヒドロフェナントレンモノマー（１：１）をとり、１０当量のＫ_２ＣＯ_３および３％Ｐｄ（ＰＰｈ３）４を含有するＴＨＦ－水（４：１）混合物に溶解した。反応混合物をシュレンクラインに取り付け、３回の凍結－真空－解凍サイクルで脱気し、次に、窒素下、１８時間、激しく撹拌しながら、摂氏８０度まで加熱した。その後に、この反応混合物に、適切な官能基を含有するキャッピング剤（Ｇ１から選択される）を窒素の過圧下でカニューレから加え、３時間後、第２のキャッピング剤（Ｇ２から選択される）を加えた。反応後、粗製反応混合物を溶媒蒸発させて、ゲルろ過カラムに通して、有機低分子および低ＭＷオリゴマーを除去した。その後に、１００ＫのＭＷＣＯ膜を装備したタンジェンシャルフローろ過システムに、粗製ポリマーを通した。ろ液の吸収が減少するまで、２０％エタノールを使用して洗浄する。

【0304】

（実施例３）
蛍光発光スペクトルの比較
フルオレン（Ｆｌ－Ｆｌ）、ジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ－ＤＨＰ）およびフルオレン－ＤＨＰ（ＤＨＰ－Ｆｌ）ポリマーの蛍光発光スペクトルの比較を行った。ＤＨＰ含有ポリマーは、４２６～４２８ｎｍにあるその蛍光極大の顕著な差異を示す一方、フルオレンベースのポリマーは、４２１ｎｍの極大を示す。

【0305】

（実施例４）
吸収スペクトルの比較
フルオレン（Ｆｌ－Ｆｌ）ポリマーおよびジヒドロフェナントレン（ＤＨＰ－ＤＨＰ）ポリマーの両方の吸収スペクトルを測定した。グラフは、３９０および４１０ｎｍにＤＨＰ－ＤＨＰポリマーの吸収（黒色曲線）を示す一方、Ｆｌ－Ｆｌ（灰色曲線）ポリマーは、約４００ｎｍに極大を示す。試料は、異なる濃度下で測定した。

【0306】

（実施例５）
ＣＤ４シグナル対ノイズ比
新規なポリマーで標識した抗ヒトＣＤ４およびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ標識ＣＤ４で染色した溶解全血のフローサイトメトリー分析を行った。ポリマー色素の陽性シグナル強度は、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅよりもほぼ５倍、強かった。

【0307】

（実施例６）
フローサイトメトリーのための試料調製物中の同時固定化緩衝液による表面染色手順
この手順では、色素コンジュゲート間に経時的に起こり得る任意の考えられる非特異的相互作用を避けるため、本開示による染色用緩衝液を試験管に添加した後に、色素コンジュゲートを添加する。固定化は、蛍光抗体による染色後、劣化することなく数時間、白血球調製物を保管することを可能にする段階である。溶解溶液は、フローサイトメトリーのための生物学的試料の調製において、赤血球を溶解するために使用してもよい。

【0308】

１． ２５μＬの未希釈ＩＯＴｅｓｔ ３ １０Ｘ Ｆｉｘａｔｉｖｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＡＯ７８００、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）を１ｍＬのＶｅｒｓａＬｙｓｅ（商標）溶解溶液（ＡＯ９７７７、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）に添加することによって、「固定および溶解」混合物を速やかに調製する。溶解する生物学的試験試料の数に応じて、十分な量のこの「固定および溶解」混合物を調製する（管あたり１ｍＬの混合物）。
２． 各試験管に、１０μＬの本開示による染色用緩衝液を加える。この染色用緩衝液は、ポリマー色素コンジュゲートのミックスを含有しない試験管には必要としない。
３． 適切な分量の色素コンジュゲートを加える。管を穏やかにボルテックスする。
４． 各管に試験試料１００μＬを加える。管を穏やかにボルテックスする。
５． 光から保護して、室温（１８～２５℃）で１５～２０分間、インキュベートする。次に、赤血球の溶解を行う。
６． 速やかに調製した、「固定および溶解」混合物１ｍｌを加え、直ちに１秒間、ボルテックスする。
７． 光から保護して、室温で１０分間、インキュベートする。
８． 室温において、５分間、１５０×ｇで遠心分離する。
９． 上清を吸引によって除去する。
１０． ３ｍＬのＰＢＳを使用して、細胞ペレットを再懸濁する。
１１． 室温において、５分間、１５０×ｇで遠心分離する。
１２． 上清を吸引によって除去する。
１３． ０．５ｍＬのＰＢＳおよび０．１％ホルムアルデヒド（０．１％ホルムアルデヒドＰＢＳは、１ｍＬのＰＢＳ中、その１０×濃度で、１２．５μＬのＩＯＴｅｓｔ ３ Ｆｉｘａｔｉｖｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＰＮに関しては、カタログを参照されたい）を希釈することによって得ることができる）を使用して、細胞ペレットを再懸濁する。

【0309】

これらの調製物は、フローサイトメトリーによる分析前に、２～８℃の間で２４時間、光から保護して維持することができる。

【0310】

（実施例７）
光退色性ポリマー色素の手順
光退色されたポリマー色素は以下の通り調製した。手短に述べると、このプロセスは、バイオレットポリマー色素４２８を解凍すること、ＰＢＡ／ＰＦ－６８ ０．０２％中に１ｍｇ／ｍＬでポリマー色素を希釈すること、希釈した色素をＲｏｕｘガラス製フラスコに入れること、およびこのフラスコをＵＶチャンバ（Ｂｉｏ－Ｌｉｎｋ－ＢＬＸ）に入れることを含む。希釈したポリマー色素を、５０ＡＦＵ未満のまたはこれに等しい蛍光値に到達するまで、ＵＶ光に曝露させる。光退色された色素の残留蛍光を、蛍光分析法（蛍光光度計ＬＳ５０Ｂ、Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）によって測定する。光退色された色素は、１０マイクログラム／ｍＬの場合、４５０ｎｍにおいて、≦５０ＡＦＵを放射（スリット励起／発光は６ｎｍ／４ｎｍである；１ｃｍのキュベット）し、蛍光分析基準に合格する。ポリマー色素４２８は、血液試料のＦＣＡにおいて、本開示による組成物中で使用する場合、非特異的な染色が見えるのを回避するため、効果的に光退色させる必要があることが見出された。光退色された色素の残留蛍光は、コンジュゲートの漏れ込みに、したがってフローサイトメトリーの結果に、直接的な影響を及ぼすことが見出された。図６は、ポリマー色素コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８／ＣＤ４－ＳＮ７８６により処理した、染色して溶解した試料の２件のＦＣＡドットプロットを示している。左側のパネルは、コンジュゲートの望ましくない漏れ込みを示す（矢印）、不十分に光退色されたポリマー色素の影響を示している。右側のパネルは、２種のポリマー色素コンジュゲートＣＤ５６－ＳＮｖ４２８／ＣＤ４－ＳＮ７８６のフローサイトメトリーの二次元ドットプロットを示しており、試料は、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合（ＡＦＵスリット励起／発光６ｎｍ／４ｎｍ、蛍光光度計ＬＳ５０Ｂ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、１０ｕｇ／ｍＬでＱＹ０．０５６以下かつ＜４７ＡＦＵを示す効果的に光退色されたポリマー色素４２８を含む、本開示による組成物を用いて調製する。コンジュゲート同士の漏れ込みは、実質的に低減した。

【0311】

（実施例８）
ポリマー色素のモノマー構成成分および光退色されたポリマー色素を含む染色用緩衝組成物
染色用緩衝組成物を設計するための最初の取り組みは、２種のバイオレットポリマー色素コンジュゲートのミックスを使用して、ＰＦ－６８を含むＰＢＳ生物学用緩衝液中で、個々の候補構成成分の試験をすること、および性能を評価するためのＦＣＡドットプロットを得ることを含んだ。例示的なモノマーＡ（１００～８００ｕｇ／試験）、マレイミドバイオレットポリマー色素４２８（ｍ４２８）（３．１～１００ｕｇ／試験）、カルボキシルバイオレットポリマー色素４２８（３．１～１００ｕｇ／試験）、アミノポリマー色素４２８（３．１～１００ｕｇ／試験）、光退色されたマレイミド４２８（ｍ４２８）色素（システアミンＨＣｌを含むおよび含まない）、光退色されたカルボキシル４２８（ｃ４２８）色素、光退色されたアミノポリマー色素４２８（ａ４２８）、ＰＥＧ、またはＥｍｐｉｇｅｎ双性イオン性界面活性剤を個別に評価した。例示的なモノマーＡおよび光退色された色素は、色素コンジュゲート同士の非特異的相互作用の低減に有効であることが個々に見出された。

【0312】

個々の構成成分を用いた結果に基づき、実施例７による例示的なモノマーＡおよび光退色されたバイオレット色素４２８を使用して、試験染色用緩衝組成物を開発した。

【0313】

ＰＦ－６８洗剤をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ_３に速やかに加え、０．０２％の最終濃度に到達させた。緩衝液を配合するために使用するまで、このミックスを室温で保管した。構成成分を混合することによって、組成物を配合し、表１に示されている組成物を得た。

【0314】

【表1】

【0315】

（実施例９）
ポリマー色素のモノマー構成成分および光退色されたポリマー色素を含む試験染色用緩衝組成物の性能
ポリマー色素抗体コンジュゲートは、一緒に混合されると、非特異的に相互作用し得る、ポリマー色素にコンジュゲートされている抗体である。パネルにおける１種より多いポリマー色素コンジュゲートを使用して、顧客が多色実験を行うことができるよう、非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用を低減するため、実質的に低減するため、または排除するため、染色用緩衝組成物を設計した。

【0316】

本実施例では、他の染色用緩衝液の製造業者とは異なり、色素蛍光の消光は、本開示により、色素をＵＶ光に曝露することによって行う。手短に述べると、光退色は、ＵＶ光（３６５ｎｍ）への色素の曝露によって行った。

【0317】

光退色されたバイオレット色素４２８は、マレイミドバイオレット色素４２８を解凍し、これをＰＢＳ／ＰＦ－６８（０．０２％）中に１ｍｇ／ｍＬで希釈し、希釈した色素をＲｏｕｘガラス製フラスコに入れ、フラスコをＵＶチャンバ（Ｂｉｏ－Ｌｉｎｋ－ＢＬＸ）に入れて、１０時間のＵＶ曝露（３６５ｎｍ）を３サイクル施すことによって調製した。光退色された色素は、０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示した。光退色された色素の残留蛍光も同様に、蛍光分析によって測定し、４０５ｎｍのレーザーで励起された場合（１０ｕｇ／ｍＬ、ＡＦＵスリット励起／発光６ｎｍ／４ｎｍ、蛍光光度計ＬＳ５０Ｂ Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）、≦４７ＡＦＵであった。

【0318】

光退色されたバイオレット色素４２８、例示的なモノマーＡ（色素４２８のサブユニット）、ＰＦ－６８（０．０２％）、１×ＰＢＳ／ＢＳＡ（２ｍｇ／ｍＬ）／ＮａＮ_３（０．１％）を含む試験染色用緩衝組成物を調製した。

【0319】

試験染色用緩衝液を事前添加した、または事前添加しない３種のＳｕｐｅｒＮｏｖａ（ＳＮｖ）色素抗体コンジュゲートの混合物ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８、ＣＤ２０－ＳＮｖ６０５およびＣＤ４－ＳＮｖ７８６を使用する、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロット比較を図１に示す。ゲーティングは、リンパ球（ＬＹ）に対するものである。取得は、ＣｙｔＥｘｐｅｒｔアクイジションソフトウェアを使用して、ＣｙｔｏＦＬＥＸ ＬＸフローサイトメータによった。分析は、Ｋａｌｕｚａ分析ソフトウェアによる。図１の上側の３つのパネルに示されている通り、染色の異常は、試験染色用緩衝液の非存在下で起こる可能性があり、データは、補正不十分であるように見え得る。試験染色用緩衝液の存在下では、３つの下側のパネルに示されている通り、コンジュゲート同士の漏れ込みの実質的な低減が実証された。

【0320】

試験染色用緩衝液の効率は、陽性集団に関する漏れ込みの中央値をネガティブ集団の同じ軸上の中央値で除算するＦＣＡ分析によって評価することができる。図１の上部パネルは、染色用緩衝液のないミックスのＦＣＡドットブロットを示しており、ポリマー色素コンジュゲート同士の非特異的相互作用を示す漏れ込みがあることを示している。対照的に、ＦＣＡドットプロットは、試験染色用この緩衝液が非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用を低減するのに効率的であることを示していることが、この緩衝液を使用した図１の下側の３つのパネルにより示される。

【0321】

別の実験で、試験染色用緩衝液を、本明細書に記載されている、ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３／ＰＦ－６８の溶液中で、例示的なモノマーＡおよび光退色された色素４２８を混合することによって調製した（１００試験／バイアル；１０μＬ／試験）。ポリマー色素コンジュゲートを、全血生物学的試料を添加する前に、試験染色用緩衝液の上部に加えた。ＣＤ５６－ＳＮｖ４２８＋ＣＤ１９－ＳＮｖ６０５＋ＣＤ４－ＳＮｖ７８６を含む、３種のＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素コンジュゲートの混合物を含む多色パネルを使用した。図２Ａは、染色用緩衝液を含まない、多色パネルを使用した、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロットを示している。図２Ｂは、比較ＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いる、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロットおよび多色パネルを示す。図２Ｃは、試験染色用緩衝液を用いる、全血試料のＦＣＡドットプロットおよび多色パネルを示している。比較緩衝組成物および試験染色用緩衝組成物は、緩衝液を含まない多色パネルと比較して、漏れ込みの低減を示した。試験染色用緩衝組成物は、先行技術の比較緩衝液と比較した場合、ある低度の漏れ込みの低減を示し、非特異的なポリマー－ポリマー相互作用が低減されたことを示している。

【0322】

（実施例１０）
消光されたポリマー
様々な消光性部分を含むポリマー色素を調製し、非特異的なポリマー－ポリマー相互作用を阻止するため、染色用緩衝液の使用可能性について検討した。蛍光が低減または排除され、消光されたポリマーを形成するため、蛍光ポリマー色素を消光性部分にコンジュゲートした。２種またはそれより多いポリマー色素コンジュゲートの混合物に消光されたポリマーを添加すると、非特異的なポリマー－ポリマー相互作用が低減または排除されることが見出された。

【0323】

様々なバイオレット励起可能な蛍光ポリマー色素を、様々なクエンチャー部分にコンジュゲートした。本開示の方法に類似した方法によって、約１５種の異なる消光されたポリマーをバイオレット励起可能な蛍光ポリマー色素、および約１０～１５倍モル過剰の様々な市販のクエンチャー部分から調製した。本開示による構造を含む３種の異なるバイオレット励起可能な蛍光ポリマー（ポリマー１、ポリマー２、ポリマー３）は、８０～１５０ｋＤａまたは９０～１２０ｋＤａの様々なＭＷの範囲から選択した。市販の消光性部分は、Ｄａｂｃｙｌ Ｑ、Ｄａｂｃｙｌ ｐｌｕｓ、Ａｎａｓｐｅｃ ４９０Ｑ、Ｄｙｌｉｇｈｔ ４２５Ｑ、Ｄｙｏｍｉｃｓ ４２５ＱおよびＤｙｏｍｉｃｓ ５０５Ｑを含んだ。例示的な消光されたポリマーを、量子収率と共に表２に示す。

【0324】

【表2】

【0325】

図３は、消光されたポリマーの波長（ｎｍ）対ＡＦＵにおける蛍光プロファイルのグラフを示す：ポリマー１ Ｄａｂｃｙｌ（ＱＹ０．０１）、ポリマー２ Ｄａｂｃｙｌ（ＱＹ０．００５）、ポリマー２ ＤＹ４２５Ｑ（ＱＹ０．０１）、ポリマー３ Ｄａｂｃｙｌ（ＱＹ０．００５）、ポリマー３ Ｄａｂｃｙｌ ｐｌｕｓ（ＱＹ０．０１５）およびポリマー３ ＤＹ４２５Ｑ（ＱＹ０．００９）。図３の挿入図は、消光性部分にコンジュゲートする前、および４０５ｎｍのレーザーによって励起された場合に蛍光ＱＹの実質的な低下を示す消光されたポリマー３を得るために消光性部分にコンジュゲートした後の、代表的な親蛍光ポリマー（ポリマー３ ＱＹ０．５４）のグラフを示す。ＱＹとは、量子収率を指す。表２中の消光されたポリマーはそれぞれ、４０５ｎｍで励起された場合、消光されていないポリマー３（ＱＹ０．５４）とは対照的に、＜０．０２、≦０．０１５または≦０．０１の量子収率（ＱＹ）を示す。

【0326】

（実施例１１）
消光されたポリマーの評価
表２の消光されたポリマーを、以下の通りＦＣＡアッセイにおいて、単一色素コンジュゲートまたは色素コンジュゲートのパネル、および全血試料を使用して評価した。消光されたポリマーを全血１００ｕＬに対して１０ｕＬの分量（５００ｕｇ／ｍＬ）で加えた。

【0327】

ＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ３／ＰＦ－６８（必要な場合）を含む緩衝液中で、消光されたポリマーを１コンジュゲートの場合、５マイクログラム（５ｕｇ）、および２コンジュゲートの場合、１０マイクログラム（１０ｕｇ）で使用した。抗体コンジュゲート（それぞれ、１ｕｇ）を、全血を添加する前に、添加剤のミックスの上部に加えた。２０分間のインキュベート後、１ｍＬのＶｅｒｓａＦｉｘを加え、次いで１５分間、インキュベートした。最後に、３ｍＬの１×ＰＢＳによる洗浄を行った。ペレットを０．５ｍＬの１×ＰＢＳまたは１×ＰＢＳ／０．１％ ＦＡで再懸濁させた。

【0328】

消光されたポリマーが非特異的結合を低減する能力、および集団の広がりを低減する能力を検討した。

【0329】

図４は、染色用緩衝液添加剤である消光されたポリマーを使用しないで、リンパ球にゲーティングされた場合の、２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＵＶ励起性ポリマー色素（ＣＤ４－ＵＶＥＰＤ）およびＣＤ２０－バイオレット励起性ポリマー色素（ＣＤ２０－ＶＥＰＤ）（どちらも、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、左上側のパネル）からなる混合物、ならびに２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、右上側のパネル）からなる混合物で染色した後の、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロット（上側の行の左から右へ）を示す。２種の異なる色素コンジュゲートを消光されたポリマーなしに混合した場合、ドットプロットは、非特異的相互作用および関連漏れ込みを示す。ＣＤ４－ＵＶＥＰＤおよびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部左側のパネル）またはＢＵＶ３９５－ＣＤ４およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部右側のパネル）で染色している間に、本開示による消光されたポリマー（消光されたポリマー２ ＤＹＱ４２５）を添加すると、非特異的相互作用および漏れ込みが低減した。

【0330】

同様のＦＣＡの改善結果が、消光されたポリマー３ ＤＹＱ４２５（１０ｕＬ）を含む試験染色用緩衝液を用いて示された。（データは図示せず）。

【0331】

図５は、染色用緩衝液添加剤である消光されたポリマーを使用しないで、リンパ球にゲーティングされた場合の、２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＵＶ励起性ポリマー色素（ＣＤ４－ＵＶＥＰＤ）およびＣＤ２０－バイオレット励起性ポリマー色素（ＣＤ２０－ＶＥＰＤ）（どちらも、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、左上側のパネル）からなる混合物、ならびに２種のポリマー色素コンジュゲートであるＣＤ４－ＢＵＶ３９５（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、右上側のパネル）からなる混合物を用い、緩衝液なしに染色した後の、染色して溶解した全血試料のＦＣＡドットプロットを示す。２種の異なる色素コンジュゲートの混合物の各々を消光されたポリマーなしに混合した場合、ドットプロットは、非特異的相互作用および関連漏れ込みを示す。ＣＤ４－ＵＶＥＰＤおよびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部左側のパネル）またはＢＵＶ３９５－ＣＤ４およびＣＤ２０－ＶＥＰＤ（下部右側のパネル）での染色中に、本開示による消光されたポリマー（消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌ）を添加すると、非特異的相互作用および漏れ込みが低減した。

【0332】

類似のＦＣＡの改善結果が、他の消光されたポリマー、すなわちポリマー１－Ｄａｂｃｙｌ、Ｑ／Ｐ５．６（１０ｕＬ）、ポリマー３－Ｄａｂｃｙｌ、Ｑ／Ｐ７．１４（１０ｕＬ）およびポリマー３－Ｄａｂｃｙｌ ｐｌｕｓ、Ｑ／Ｐ５．４（１０ｕＬ）を用いた場合に示された（データは図示せず）。ポリマー－Ｄａｂｃｙｌの消光されたポリマーは、ポリマー色素コンジュゲートにおいて、漏れ込み、ポリマー－ポリマー相互作用を低減する非常に良好な能力があることを示したので、さらなる開発にポリマー－Ｄａｂｃｙｌの消光されたポリマーを選択した。

【0333】

（実施例１２）
消光されたポリマーを含む例示的な染色用緩衝組成物
実施例１０による消光されたポリマーを使用して、染色用緩衝組成物を開発した。実施例１０に示される通り、染色用緩衝組成物Ｂは、多色ポリマー色素コンジュゲートパネルにおいて、漏れ込み、非特異的なポリマー－ポリマー相互作用を低減するのに好適であることが見出された。

【0334】

ＰＦ－６８洗剤をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ_３に速やかに加え、０．０２％の最終濃度に到達させる。緩衝液を配合するために使用するまで、このミックスを室温で保管した。構成成分を混合することによって、組成物を配合し、表３に示されている組成物を得る。

【0335】

【表3】

【0336】

（実施例１３）
ポリマー色素のモノマー構成成分および消光されたポリマー色素を含む、例示的な染色用緩衝組成物
例示的なモノマーＡ（バイオレット４２８ＳｕｐｅｒＮｏｖａ色素の部分構成成分）およびポリ－Ｄａｂｃｙｌタンデム色素を含む組成物を開発した。ポリ－Ｄａｂｃｙｌタンデム色素は、バイオレット４２８色素モノマーをＤａｂｃｙｌ分子にコンジュゲートすることによって作製した。Ｄａｂｃｙｌは、４０５ｎｍのレーザーによって励起されると、バイオレット４２８ ＳｕｐｅｒＮｏｖａ色素によって放射された蛍光を吸収するクエンチャー分子である。結果として、ポリ－Ｄａｂｃｙｌタンデム色素は、蛍光をほとんど放射しない。

【0337】

一般的なポリｄａｂｃｙｌタンデム色素は、式（ＸＸＩＶ）による構造を有する。各ポリマー主鎖中に、およそ５～８つのｄａｂｃｙｌ色素が存在した。

【化58】

【0338】

生物学的試料に添加する前に、２種のＳｕｐｅｒＮｏｖａポリマー色素コンジュゲート（ＣＤ３－ＳＮ４２８およびＣＤ１９－ＳＮ６０５）を個別に、すなわち例示的なモノマーＡ＋ポリ－Ｄａｂｃｙｌ添加剤を含めないで予め配合した。その他の緩衝液およびプロトコルは、実施例１０と同様にした。図７は、添加剤なし（左側のパネル）に、および例示的なモノマーＡ＋ポリ－Ｄａｂｃｙｌ添加剤を含む（右側のパネル）、ＣＤ３－ＳＮ４２８／ＣＤ１９－ＳＮ６０５の二次元ＦＣＡドットプロットを示す。添加剤の存在下では、ポリマー色素コンジュゲート同士の非特異的相互作用が、実質的に低減したことが見出された。

【0339】

ポリ－Ｄａｂｃｙｌバイオレットポリマー－ｄａｂｃｙｌタンデム（ＸＸＩＶ）の消光されたポリマーは、様々なポリマー色素間の非特異的相互作用の低減に有効であることが見出された。

【0340】

ＰＦ－６８洗剤をＰＢＳ／ＢＳＡ／ＮａＮ_３に速やかに加え、０．０２％の最終濃度に到達させる。緩衝液を配合するために使用するまで、このミックスを室温で保管した。構成成分を混合することによって、染色用緩衝組成物Ｃを配合し、表４に示されている組成物を得る。

【0341】

【表4】

【0342】

（実施例１４）
タンパク質安定剤および非イオン性界面活性剤を含む消光されたポリマー組成物の性能
非イオン性界面活性剤Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｆ－６８（１％）の存在下および非存在下で、消光されたバイオレットポリマー２－Ｄａｂｃｙｌを含む消光されたポリマー色素組成物の性能を市販のＢＤ Ｈｏｒｉｚｏｎ（商標）Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ ｓｔａｉｎ ｂｕｆｆｅｒ Ｐｌｕｓと比較して評価した。ドナーＡ由来の染色して溶解した血液試料のＦＣＡを、色素コンジュゲートＳｕｐｅｒＮｏｖａ ＳＮ ｖ４２８－ＣＤ１９（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＢＶ６５０－ＣＤ４（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ Ｖｉｏｌｅｔ ６５０（商標）抗ヒトＣＤ４抗体、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ，Ｉｎｃ．）の、ドナーＡ由来の処理済み血液試料中の混合物を使用して行った。

【0343】

図８は、消光されたポリマーを含まない（上側の左）、１％のＰＦ－６８を含む（上側の右）、１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌを含む（下側の左）、１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌおよび１％のＰＦ－６８非イオン性界面活性剤を含む（下側の右）、血液試料中の色素コンジュゲートＳｕｐｅｒＮｏｖａ ＳＮ ｖ４２８－ＣＤ１９とＢＶ６５０－ＣＤ４との混合物のＦＣＡドットプロットを示す。１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌ（ＭＦＩ ２１７２）および１％のＰＦ－６８（ＭＦＩ ２４００）を含む試験試料組成物は、緩衝液を含まない対照試料（ＭＦＩ ７８０４）と比較すると、非特異的結合の低減を示した。１０ｕｇの消光されたポリマー２－Ｄａｂｃｙｌおよび１％のＰＦ－６８（ＭＦＩ １３２７）を含む試験試料組成物は、対照試料と比較すると、ＭＦＩの低下の改善、非特異的結合の低減という改善、およびポリマー－ポリマー相互作用の低減という改善を示した。

【0344】

（実施例１５）
２種の異なるポリマー色素コンジュゲートの混合物中の非イオン性界面活性剤単独のフローサイトメトリー性能
非イオン性界面活性剤は、染色用緩衝組成物において、非特異的なポリマー色素コンジュゲート相互作用を低減する望ましい添加剤であることが見出された。２種の異なるポリマー色素コンジュゲートの混合物を使用して、染色して溶解した血液細胞のＦＣＡに及ぼす様々な濃度の非イオン性界面活性剤単独の影響を評価した。図９は、緩衝液を含まない（上部パネル）、０．１％のＰＦ－６８を含む（下側の左パネル）、０．５％のＰＦ－６８を含む（下側の中央のパネル）、および１％のＰＦ－６８（重量／体積）を含む（下側の右のパネル）、ＣＤ４－ＢＶ６５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）とＣＤ１９－ＳＮｖ４２８（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）との混合物により染色して溶解した細胞のＦＣＡドットプロットを示す。上昇した濃度のＰＦ－６８（０．１～１％重量／体積）の存在により、ＰＦ－６８が存在しない場合と比較して分離が改善されたことによって立証される通り、混合物中の非特異的相互作用の低減を伴う。

【0345】

（実施例１６）
染色用緩衝組成物において使用するための非蛍光ポリマー
光退色されたポリマー色素、消光されたポリマー色素およびまたはポリマー色素のモノマー構成成分を含む、ポリマー色素の非蛍光構成成分を含む染色用緩衝組成物は、本開示において実証される通り、染色した生物学的試料のＦＣＡにおいて、より多くのポリマー色素コンジュゲートのうちの２つの多色パネルでは、漏れ込みおよび非特異的なポリマー－ポリマー相互作用の低減に効果的であることが示された。

【0346】

この実施例では、０．１以下のＱＹを有する非蛍光ポリマー色素を調製し、発光スペクトルおよびＱＹを測定し、染色用緩衝組成物中で試験した。図１０は、２種の非蛍光ポリマー色素の４１５～７００ｎｍの範囲の発光スペクトルのグラフ、および量子収率を示す。ＤＨＰ－ピロールポリマー（ＱＹ０．０４３）およびＤＨＰ－ニトロキャップポリマー（ＱＹ０．０９２）の構造も示す。少なくとも２つのポリマー色素コンジュゲートを使用する、溶解して染色した細胞のＦＣＡ検討では、ＤＨＰ－ピロールポリマーおよびＤＨＰ－ニトロキャップポリマーは、漏れ込みの低減に有効であることが見出された。（データは図示せず）。０．１以下、または０．０６以下、または０．０５６以下の量子収率（ＱＹ）を示す非蛍光ポリマー色素は、染色用緩衝組成物におけるＦＣＡ分析において、非特異的相互作用および漏れ込みの低減に有用であることが見出された。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【手続補正書】

【提出日】2023-11-08

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024509725000001.app

【国際調査報告】