特表 2024-509742 相挙動を有するタンパク質を含む融合タンパク質

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-05

(54)【発明の名称】相挙動を有するタンパク質を含む融合タンパク質

(51)【国際特許分類】

   C07K 19/00 20060101AFI20240227BHJP

   C07K 1/14 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240227BHJP

   C07K 1/02 20060101ALI20240227BHJP

【ＦＩ】

C07K19/00 ZNA

C07K1/14

C12N15/12

C07K1/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023549080

(86)(22)【出願日】2022-02-18

(85)【翻訳文提出日】2023-10-11

(86)【国際出願番号】 US2022070727

(87)【国際公開番号】W WO2022178537

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】63/151,524

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】591163214

【氏名又は名称】ドナルドソン カンパニー，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】110003281

【氏名又は名称】弁理士法人大塚国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ルギンブール， ケリー エム．

(72)【発明者】

【氏名】デュリッキー， マイケル

【テーマコード（参考）】

4H045

【Ｆターム（参考）】

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045BA50

4H045CA40

4H045FA70

4H045FA72

4H045FA74

4H045GA45

(57)【要約】

第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質が本明細書で提供され、この第２のポリペプチドは、相挙動を有する。第１のポリペプチドは、治療上、美容上、及び／又は産業上重要なポリペプチドなど、望ましい生物学的活性を有するポリペプチドであり得る。第１のポリペプチドの相挙動を有するポリペプチドへの融合は、その精製を促進し、発現中、保存中、又はタンパク質のアンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている様々な条件への曝露後に第１のポリペプチドを安定化させるのにも役立ち得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

第１のポリペプチドを安定化させる方法であって、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、前記第２のポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドであり、前記融合タンパク質が、前記第１のポリペプチドを不安定化させることになる１つ又は複数の条件に曝露されても、前記第１のポリペプチドがその活性を実質的に保持する、方法。

【請求項2】

第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、及び／又はミスフォールディングする１つ又は複数の条件への曝露後、前記第１のポリペプチドの活性の喪失を実質的に防止する方法であって、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、前記第２のポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドである、方法。

【請求項3】

第１のポリペプチドのアンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを実質的に防止する方法であって、前記第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、前記第２のポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドであり、前記融合タンパク質が、アンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを引き起こすことになる１つ又は複数の条件に曝露される、方法。

【請求項4】

第１のポリペプチドの収量を向上させる方法であって：
（ｉ）前記第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップ；並びに
（ｉｉ）前記第１のポリペプチドを前記第２のポリペプチドから分離するステップを含み、
前記第１のポリペプチドの収量が、融合タンパク質として発現されない場合の前記第１のポリペプチドの収量と比較して、前記融合タンパク質として発現される場合に向上する、方法。

【請求項5】

前記融合タンパク質を前記条件から除外するステップ、及び前記第１のポリペプチドを前記第２のポリペプチドから切断するステップを含み、前記第１のポリペプチドが、前記条件に曝露されていない対照の第１のポリペプチドと比較してその活性を保持する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させる前記１つ又は複数の条件が：酸化剤への曝露、凍結乾燥、非生理的ｐＨへの曝露、カオトロピック剤への曝露、少なくとも５０℃の温度への曝露、有機溶媒への曝露、尿素への曝露、洗剤への曝露、オートクレーブへの曝露、凍結融解サイクル、熱ショック、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１、２、又は５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させる前記１つ又は複数の条件が：非生理的ｐＨへの曝露を含む、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

非生理的ｐＨへの曝露が、酸への曝露である、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記酸が、塩酸グアニジンである、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

非生理的ｐＨへの曝露が、塩基への曝露である、請求項７に記載の方法。

【請求項11】

前記塩基が、水酸化ナトリウム又は尿素である、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている前記１つ又は複数の条件が、塩酸グアニジンへの曝露、尿素への曝露、凍結乾燥、凍結融解サイクル、オートクレーブ処理、水酸化ナトリウムへの曝露、又は少なくとも９０℃の温度への曝露である、請求項６に記載の方法。

【請求項13】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている前記１つ又は複数の条件が、０．１Ｍ ＮａＯＨへの曝露である、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている前記１つ又は複数の条件が、０．１Ｍ ＮａＯＨへの３０分間の曝露である、請求項１、２、５、６、又は１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、又は不安定化させることが知られている前記１つ又は複数の条件が、６Ｍ塩酸グアニジンへの曝露である、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている前記１つ又は複数の条件が、６Ｍ塩酸グアニジンへの３０分間の曝露である、請求項１、２、５、６、又は１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている前記１つ又は複数の条件が、少なくとも９５℃に加熱することである、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記条件が、熱ショックであり、前記熱ショックが：
前記第１のポリペプチドを含む前記融合タンパク質を９５℃に３０分間加熱すること；
前記融合タンパク質を含む容器を氷上に置くこと；次いで
前記融合タンパク質を室温に戻すことを含む、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第１のポリペプチドを含む前記融合タンパク質が、前記１つ又は複数の条件に約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間曝露される、請求項１、２、又は５～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記１つ又は複数の条件への曝露が、少なくとも約３０分間行われる、請求項１、２、又は５～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記１つ又は複数の条件への曝露が、約３０分間～約１２時間、約３０分間～約１１時間、約３０分間～約１０時間、約３０分間～約９時間、約３０分間～約８時間、約３０分間～約７時間、約３０間分～約６時間、約３０分間～約５時間、約３０分間～約４時間、約３０分間～約３時間、約３０分間～約２時間、又は約３０分間～約１時間行われる、請求項１、２、６～１０、１３、１５、又は１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記第１のポリペプチドの前記活性が、前記第１のポリペプチドの結合パートナーに対するその親和性である、請求項１、２、又は５～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記第１のポリペプチドが酵素であり、前記活性がｋ_ｃａｔである、請求項１、２、又は５～２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記第１のポリペプチドの前記活性が、前記条件の１つ又は複数への曝露後、対照と比較して３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満喪失し、前記対照が、前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、又は不安定化させることが知られている条件に曝露されていない、請求項１、２、又は５～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記第１のポリペプチドが、前記条件の１つ又は複数への曝露後、対照と比較してその活性の６５％～１００％を保持する、請求項１、２、又は５～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記第１のポリペプチドが、前記条件の１つ又は複数への曝露後、対照と比較してその活性の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を保持する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記第１のポリペプチドの前記活性が、前記条件の１つ又は複数への曝露後、対照と比較して２０％未満又は２５％未満喪失し、前記対照が、前記第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、又は不安定化させることが知られている条件に曝露されていない、請求項２４に記載の方法。

【請求項28】

前記第１のポリペプチドが、前記条件の１つ又は複数への曝露後、対照と比較してその活性の少なくとも８０％を保持する、請求項２５に記載の方法。

【請求項29】

前記第１のポリペプチドが、４℃で約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、又は約１２ヶ月間、その活性を保持する、請求項１、２、又は５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記第１のポリペプチドが、－２０℃で約６ヶ月間、約９ヶ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、又は約１０年間、その活性を保持する、請求項１、２、又は５～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１のポリペプチドの前記収量が、宿主細胞懸濁液１リットル当たり１５ｍｇ超、１リットル当たり３０ｍｇ超、１リットル当たり５０ｍｇ超、１リットル当たり７５ｍｇ超、１リットル当たり１００ｍｇ超、１リットル当たり２００ｍｇ超、又は１リットル当たり３００ｍｇ超である、請求項４に記載の方法。

【請求項32】

前記融合タンパク質における前記第１のポリペプチドの前記収量が、融合タンパク質として発現されない場合の第１のポリペプチドの収量よりも少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３７５％、少なくとも約４００％、少なくとも約４２５％、少なくとも約４５０％、少なくとも約４７５％、少なくとも約５００％、少なくとも約５２５％、少なくとも約５５０％、少なくとも約５７５％、少なくとも約６００％、少なくとも約６２５％、少なくとも約６５０％、少なくとも約６７５％、少なくとも約７００％、少なくとも約７２５％、少なくとも約７５０％、少なくとも約７７５％、少なくとも約８００％、少なくとも約８２５％、少なくとも約８５０％、少なくとも約８７５％、少なくとも約９００％、少なくとも約９２５％、少なくとも約９５０％、少なくとも約９７５％、少なくとも約１，０００％、少なくとも約１，１００％、少なくとも約１，１２５％、少なくとも約１，１５０％、少なくとも約１，１７５％、少なくとも約１，２００％、少なくとも約１，２２５％、少なくとも約１，２５０％、少なくとも約１，２７５％、少なくとも約１，３００％、少なくとも約１，３２５％、少なくとも約１，３５０％、少なくとも約１，３７５％、少なくとも約１，４００％、少なくとも約１，４２５％、少なくとも約１，４５０％、少なくとも約１，４７５％、少なくとも約１，５００％、少なくとも約１，５２５％、少なくとも約１，５５０％、少なくとも約１，５７５％、少なくとも約１，６００％、少なくとも約１，６２５％、少なくとも約１，６５０％、少なくとも約１，６７５％、少なくとも約１，７００％、少なくとも約１，７２５％、少なくとも約１，７５０％、少なくとも約１，７７５％、少なくとも約１，８００％、少なくとも約１，８２５％、少なくとも約１，８５０％、少なくとも約１，８７５％、少なくとも約１，９００％、少なくとも約１，９２５％、少なくとも約１，９５０％、少なくとも約１，９７５％、又は少なくとも約２，０００％高い、請求項４に記載の方法。

【請求項33】

前記第１のポリペプチドの前記収量が、１リットル当たり７５ｍｇ超である、請求項４に記載の方法。

【請求項34】

前記第１のポリペプチドの前記収量が、融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの収量よりも約３００％高い、請求項４に記載の方法。

【請求項35】

前記融合タンパク質が、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選択される宿主細胞において発現される、請求項１～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

前記第１のポリペプチドが：
（ｉ）酵素又はその触媒断片；
（ｉｉ）抗体又はその抗原結合断片；
（ｉｉｉ）シグナル伝達分子又はその断片；
（ｉｖ）構造タンパク質又はその断片；
（ｖ）ホルモン又はその断片若しくは誘導体；
（ｖｉ）核酸結合タンパク質又はその断片若しくは誘導体；
（ｖｉｉ）治療薬又はその断片；
（ｖｉｉｉ）担体タンパク質又はその断片；
（ｉｘ）サイトカイン又はその断片：或いは
（ｘ）毒素又はその断片である、請求項１～３５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項37】

前記第１のポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

前記第１のポリペプチドが、ウイルスポリペプチドである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記第１のポリペプチドが、細菌ポリペプチドである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記第１のポリペプチドが、毒素である、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項41】

前記第１のポリペプチドが、抗原性ポリペプチドである、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記第１のポリペプチドが、タンパク質の合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記第１のポリペプチドが、ＤＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記第１のポリペプチドが、ＲＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記第１のポリペプチドが、分化クラスター４（ＣＤ４）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＺドメイン（ＳｐＡ Ｚドメイン）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＤ）、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、又はそれらの断片若しくは誘導体から選択される、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記第１のポリペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２からら単離されるか又はそれに由来するポリペプチドである、請求項１～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記第１のポリペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はその断片若しくは誘導体である、請求項４６に記載の方法。

【請求項48】

相挙動を有する前記第１のポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）又はレジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項49】

相挙動を有する前記ポリペプチドが、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）_ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチド反復又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を含み、式中、Ｘａａが、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得、ｎは、終点を含む１～３６０の整数である、請求項１～４７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項50】

相挙動を有する前記ポリペプチドが：
ａ．（ＧＲＧＤＳＰＹ）_ｎ（配列番号１）
ｂ．（ＧＲＧＤＳＰＨ）_ｎ（配列番号２）
ｃ．（ＧＲＧＤＳＰＶ）_ｎ（配列番号：３）
ｄ．（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号４）
ｅ．（ＲＰＬＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号：５）
ｆ．（ＲＰＡＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号６）
ｇ．（ＧＲＧＤＳＹＰ）_ｎ（配列番号７）
ｈ．（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）_ｎ（配列番号８）
ｉ．（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号９）
ｊ．（ＧＶＧＶＰ）_ｎ（配列番号１１）；
ｋ．（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）；
ｌ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１３）；
ｍ．（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４）；
ｎ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１５）；
ｏ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１６）；及び
ｐ．（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１７）から選択されたアミノ酸配列又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を含み、
式中：
ｎは、終点を含む２０～３６０の範囲の整数であり；且つ
ｍは、終点を含む４～２５の範囲の整数である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項51】

相挙動を有する前記ポリペプチドが：
（ＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４３）；
（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４８）；
（ＺＺＰＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４９）；
（ＺＺＰＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５０）；又は
（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５１）から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、
Ｘは、存在する場合は、プロリンとグリシンを除く任意のアミノ酸であり、且つ
Ｚは、存在する場合は、任意のアミノ酸である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項52】

相挙動を有する前記ポリペプチドが：
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）；又は
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４６）から選択されるアミノ酸配列を含み；
式中、ｍは、終点を含む２～３２の整数である、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項53】

相挙動を有する前記ポリペプチドが：
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）；
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、終点を含む５～８０の整数である）；又は
（ｃ）（ＧＸＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４７）から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、且つ
各反復のＸは、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から独立して選択される、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項54】

相挙動を有する前記ポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは、１６である）の配列を含む、請求項１～４８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項55】

前記融合タンパク質が、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとを連結するリンカーを含む、請求項１～５４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項56】

前記リンカーが、切断可能である、請求項５５に記載の方法。

【請求項57】

前記リンカーが、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項５５に記載の方法。

【請求項58】

前記リンカーが、自己切断ペプチドである、請求項５５に記載の方法。

【請求項59】

前記リンカーが：
（ｉ）（Ｇ_ｘＳ）_ｎ（配列番号１４１）、
（ｉｉ）（Ｓ_ｘＧ）_ｎ（配列番号１４２）、
（ｉｖ）（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１９）、及び
（ｖ）（Ｇ）_ｎ（配列番号４８）からなる群から選択され；
式中、ｘは、１～６の範囲の整数であり、且つ
ｎは、１～３０の範囲の整数である、請求項５５に記載の方法。

【請求項60】

前記リンカーが、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１５７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１５８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１６１）、ＳＲＳＳＧ（配列番号１６２）、及びＳＧＳＳＣ（配列番号１６３）から選択される、請求項５５に記載の方法。

【請求項61】

前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項62】

前記融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第２のポリペプチド及び前記第１のポリペプチドを含む、請求項１～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項63】

前記タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第１のポリペプチド、前記リンカー、及び前記第２のポリペプチドを含む、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

前記タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第２のポリペプチド、前記リンカー、及び前記第１のポリペプチドを含む、請求項５５～６０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項65】

前記第１のポリペプチドが、核酸結合タンパク質（ＮＢＰ）を含む、請求項１～４４又は４８～６４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項66】

前記ＮＢＰが、ＤＮＡに結合する、請求項６５に記載の方法。

【請求項67】

前記ＮＢＰが、ＲＮＡに結合する、請求項６５に記載の方法。

【請求項68】

前記ＤＮＡが、一本鎖である、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記ＤＮＡが、二本鎖である、請求項６６に記載の方法。

【請求項70】

前記ＲＮＡが、一本鎖である、請求項６５に記載の方法。

【請求項71】

前記ＲＮＡが、二本鎖である、請求項６５に記載の方法。

【請求項72】

前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）である、請求項６４に記載の方法。

【請求項73】

前記ＮＢＰが、ｍＲＮＡキャップ又はポリＡ尾部に結合する、請求項６５、６７、７０、又は７２に記載の方法。

【請求項74】

前記ＮＢＰが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、無機ピロホスファターゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＤＮアーゼＩ、仔ウシ腸ホスファターゼ、南極ホスファターゼ、ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニット、グアニン－７－メチルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、グアニリルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、ＲＮＡトリホスファターゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、及びワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１２サブユニット、ステムループ結合タンパク質、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＧｒｏＥＬ、Ｅｄｃ３、ＤＨＸ９、Ｘｒｎ１、Ｄｃｐ１、Ｄｃｐ２、ＬＡＦ－１、ＭＥＧ－１、ＭＥＧ－３、ＡＳＦ／ＳＦ２スプライシング因子、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子４（ＳＲｐ７５）、セリン及びアルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）、Ｌ３リボソームタンパク質、Ｌ４リボソームタンパク質、Ｌ１３リボソームタンパク質、Ｌ２０リボソームタンパク質、Ｌ２２リボソームタンパク質、Ｌ２４リボソームタンパク質、Ｌ２４ｅリボソームタンパク質、Ｓ１２リボソームタンパク質、Ｓ１４リボソームタンパク質、及び真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＲＳＧ－１．２ペプチド、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＤ（ｅＩＦ３Ｄ）、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡＲ１）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡＲ２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｓｐＢ（Ｂｓｃｓｃｐ）、Ｙボックスタンパク質１コールドショックドメイン（ＹＢ１－ＣＳＤ）、Ｆｏｘ－１タンパク質（ＦＯＸ１）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｓｔａｕｆｅｎタンパク質、ＴＩＳ１１ｄ、ジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様タンパク質、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ３）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、テトラトリコペプチド反復１を有するインターフェロン誘導性タンパク質（ＩＦＩＴ１）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、オリゴアデニル酸シンターゼ様（ＯＡＳＬ）タンパク質（例えば、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、又はＯＡＳＬ）、リボヌクレアーゼＥ（ＲＮＡＳＥ Ｅ）、ガンマインターフェロン誘導性タンパク質Ｉｆｉ－１６（ＩＦ１１６）、又は環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）である、請求項６５に記載の方法。

【請求項75】

前記ＮＢＰが、短鎖モチーフ（ＳＬｉＭ）、ＲＧ［Ｇ］反復、ＲＧＧ反復、ＲＳ／ＲＧリッチドメイン、Ｋ／Ｒ塩基性パッチ、分子認識機能、低複雑性配列、ＲＮＡ認識モチーフ、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン、Ｋ相同ドメイン、ジンクフィンガードメイン（例、ＣＣＨＨ ＺＦドメイン、ＣＣＣＣ（Ｒａｎ－ＢＰ２）ドメイン、ＣＣＣＨ ＺＦドメイン）、ＲＧＧドメイン、Ｐｕｍｉｌｌｏファミリードメイン、ペンタトリコペプチドドメイン、コールドショックドメイン、ヘリカーゼドメイン、Ｌａモチーフ、Ｐｉｗｉ－Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）ドメイン、ＰＩＷＩ（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）、プソイドウリジンシンターゼ及びＰＵＡ（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）、Ｐｕｍｉｌｌｏ様反復（ＰＵＭ）、リボソームＳ１様（Ｓ１）、Ｓｍ及びＬｉｋｅ－Ｓｍ（Ｓｍ／Ｌｓｍ）反復、チウリジンシンターゼ及びＲＮＡメチラーゼ及びプソイドウリジンシンターゼ（ＴＨＵＭＰ）、又はＹＴ５２１－Ｂ相同性を有するドメインのうちの１つ又は複数を含む、請求項６５に記載の方法。

【請求項76】

核酸基質上で酵素プロセスを実施する方法であって：
（ｉ）第１の酵素及び相挙動を有する第１のポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；並びに
（ｉｉ）前記第１の酵素が前記基質に接触するのを可能にする第１の環境因子を適用するステップを含む、方法。

【請求項77】

（ｉｉｉ）第２の酵素及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｖ）前記第２の酵素が前記基質に接触するのを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項78】

（ｉｉｉ）前記第１の酵素を前記基質から分離する第３の環境因子を適用するステップをさらに含む、請求項７６に記載の方法。

【請求項79】

（ｖ）前記第１の酵素を前記基質から分離する第３の環境因子を適用するステップ；
（ｖｉ）前記第２の酵素を前記基質から分離する第４の環境因子を適用するステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、請求項７７に記載の方法。

【請求項80】

前記第１の環境因子、前記第２の環境因子、前記第３の環境因子、及び前記第４の環境因子が：
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度、又は圧力のうちの１つ又は複数の変化；
ｂ．１つ又は複数の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波の印加から独立して選択される、請求項７６～７９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項81】

前記第１の酵素、前記第２の酵素、又は両方が、核酸結合タンパク質（ＮＢＰ）を含む、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項82】

前記第１の酵素が、ＤＮＡに結合するＮＢＰを含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項83】

前記第１の酵素が、ＲＮＡに結合するＮＢＰを含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項84】

前記第２の酵素が、ＤＮＡに結合するＮＢＰを含む、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項85】

前記第２の酵素が、ＲＮＡに結合するＮＢＰを含む、請求項８１～８３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項86】

前記第１の酵素が、ＤＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行することができる、請求項８１又は８２に記載の方法。

【請求項87】

前記第２の酵素が、ＤＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行することができる、請求項８１、８２、又は８６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項88】

前記第１の酵素が、ＲＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行することができる、請求項８１又は８３に記載の方法。

【請求項89】

前記第２の酵素が、ＲＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行することができる、請求項８１、８３、又は８８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項90】

前記ＤＮＡが、一本鎖である、請求項８１、８２、８４、８６、又は８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項91】

前記ＤＮＡが、二本鎖である、請求項８１、８２、８４、８６、又は８７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項92】

前記ＲＮＡが、一本鎖である、請求項８１、８３、８５、８８、又は８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項93】

前記ＲＮＡが、二本鎖である、請求項８１、８３、８５、８８、又は８９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項94】

前記ＲＮＡが、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、又はヘテロ核ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）である、請求項８１、８３、８５、８８、８９、９２、又は９３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項95】

前記ＮＢＰが、ｍＲＮＡキャップ又はポリＡ尾部に結合する、請求項８１に記載の方法。

【請求項96】

前記ＮＢＰが、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、無機ピロホスファターゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＤＮアーゼＩ、仔ウシ腸ホスファターゼ、南極ホスファターゼ、ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニット、グアニン－７－メチルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、グアニリルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、ＲＮＡトリホスファターゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、及びワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１２サブユニット、ステムループ結合タンパク質、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＧｒｏＥＬ、Ｅｄｃ３、ＤＨＸ９、Ｘｒｎ１、Ｄｃｐ１、Ｄｃｐ２、ＬＡＦ－１、ＭＥＧ－１、ＭＥＧ－３、ＡＳＦ／ＳＦ２スプライシング因子、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子４（ＳＲｐ７５）、セリン及びアルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）、Ｌ３リボソームタンパク質、Ｌ４リボソームタンパク質、Ｌ１３リボソームタンパク質、Ｌ２０リボソームタンパク質、Ｌ２２リボソームタンパク質、Ｌ２４リボソームタンパク質、Ｌ２４ｅリボソームタンパク質、Ｓ１２リボソームタンパク質、Ｓ１４リボソームタンパク質、及び真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＲＳＧ－１．２ペプチド、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＤ（ｅＩＦ３Ｄ）、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡＲ１）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡＲ２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｓｐＢ（Ｂｓｃｓｃｐ）、Ｙボックスタンパク質１コールドショックドメイン（ＹＢ１－ＣＳＤ）、Ｆｏｘ－１タンパク質（ＦＯＸ１）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｓｔａｕｆｅｎタンパク質、ＴＩＳ１１ｄ、ジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様タンパク質、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ３）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、テトラトリコペプチド反復１を有するインターフェロン誘導性タンパク質（ＩＦＩＴ１）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、オリゴアデニル酸シンターゼ様（ＯＡＳＬ）タンパク質（例えば、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、又はＯＡＳＬ）、リボヌクレアーゼＥ（ＲＮＡＳＥ Ｅ）、ガンマインターフェロン誘導性タンパク質Ｉｆｉ－１６（ＩＦ１１６）、又は環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）である、請求項８１～９５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項97】

前記ＮＢＰが、短鎖モチーフ（ＳＬｉＭ）、ＲＧ［Ｇ］反復、ＲＧＧ反復、ＲＳ／ＲＧリッチドメイン、Ｋ／Ｒ塩基性パッチ、分子認識機能、低複雑性配列、ＲＮＡ認識モチーフ、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン、Ｋ相同ドメイン、ジンクフィンガードメイン（例、ＣＣＨＨ ＺＦドメイン、ＣＣＣＣ（Ｒａｎ－ＢＰ２）ドメイン、ＣＣＣＨ ＺＦドメイン）、ＲＧＧドメイン、Ｐｕｍｉｌｌｏファミリードメイン、ペンタトリコペプチドドメイン、コールドショックドメイン、ヘリカーゼドメイン、Ｌａモチーフ、Ｐｉｗｉ－Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）ドメイン、ＰＩＷＩ（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）、プソイドウリジンシンターゼ及びＰＵＡ（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）、Ｐｕｍｉｌｌｏ様反復（ＰＵＭ）、リボソームＳ１様（Ｓ１）、Ｓｍ及びＬｉｋｅ－Ｓｍ（Ｓｍ／Ｌｓｍ）反復、チウリジンシンターゼ及びＲＮＡメチラーゼ及びプソイドウリジンシンターゼ（ＴＨＵＭＰ）、又はＹＴ５２１－Ｂ相同性を有するドメインのうちの１つ又は複数を含む、請求項８１に記載の方法。

【請求項98】

相挙動を有する前記第１のポリペプチドと相挙動を有する前記第２のポリペプチドが同じ配列を含む、請求項８１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項99】

相挙動を有する前記第１のポリペプチドと相挙動を有する前記第２のポリペプチドが異なる配列を含む、請求項８１～９７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項100】

相挙動を有する前記第１のポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）であり、相挙動を有する前記第２のポリペプチドが、レジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）である、請求項８１～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項101】

相挙動を有する前記第１のポリペプチドが、レジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）であり、相挙動を有する前記第２のポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）である、請求項８１～９９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項102】

相挙動を有する前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドが、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）_ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチド反復又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を独立して含み、式中、Ｘａａが、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得、ｎは、終点を含む１～３６０の整数である、請求項８１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項103】

相挙動を有する前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドが：
ａ．（ＧＲＧＤＳＰＹ）_ｎ（配列番号１）
ｂ．（ＧＲＧＤＳＰＨ）_ｎ（配列番号２）
ｃ．（ＧＲＧＤＳＰＶ）_ｎ（配列番号：３）
ｄ．（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号４）
ｅ．（ＲＰＬＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号：５）
ｆ．（ＲＰＡＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号６）
ｇ．（ＧＲＧＤＳＹＰ）_ｎ（配列番号７）
ｈ．（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）_ｎ（配列番号８）
ｉ．（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号９）
ｊ．（ＧＶＧＶＰ）_ｎ（配列番号１１）；
ｋ．（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）；
ｌ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１３）；
ｍ．（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４）；
ｎ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１５）；
ｏ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１６）；及び
ｐ．（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１７）から独立して選択されるアミノ酸配列又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を含み、
式中：
ｎは、終点を含む２０～３６０の範囲の整数であり；且つ
ｍは、終点を含む４～２５の範囲の整数である、請求項８１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項104】

相挙動を有する前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドが：
（ＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４３）；
（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４８）；
（ＺＺＰＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４９）；
（ＺＺＰＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５０）；又は
（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５１）から独立して選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、
Ｘは、存在する場合は、プロリン又はグリシンを除く任意のアミノ酸であり、且つ
Ｚは、存在する場合は、任意のアミノ酸である、請求項８１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項105】

相挙動を有する前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドが：
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）；又は
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４６）から独立して選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む２～３２の整数である、請求項８１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項106】

相挙動を有する前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドが：
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）；
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、終点を含む５～８０の整数である）；又は
（ｃ）（ＧＸＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４７）から独立して選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、且つ
各反復のＸは、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から独立して選択される、請求項８１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項107】

相挙動を有する前記第１及び／又は前記第２のポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは、１６である）の配列を含む、請求項８１～１０１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項108】

前記第１の融合タンパク質が、前記第１のポリペプチドと前記第２のポリペプチドとを連結するリンカーを含む、請求項８１～１０７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項109】

前記第２融合タンパク質が、前記第１ポリペプチドと前記第２ポリペプチドとを連結するリンカーを含む、請求項８２～１０８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項110】

前記リンカーが、切断可能である、請求項１０８又は１０９に記載の方法。

【請求項111】

前記リンカーが、プロテアーゼ切断部位を含む、請求項１０８又は１０９に記載の方法。

【請求項112】

前記リンカーが、自己切断ペプチドである、請求項１０８又は１０９に記載の方法。

【請求項113】

前記リンカーが：
（ｉ）（Ｇ_ｘＳ）_ｎ（配列番号１４１）、
（ｉｉ）（Ｓ_ｘＧ）_ｎ（配列番号１４２）、
（ｉｖ）（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１９）、及び
（ｖ）（Ｇ）_ｎ（配列番号４８）からなる群から独立して選択され、
式中、ｘは、１～６の範囲の整数であり、且つ
ｎは、１～３０の範囲の整数である、請求項１０８又は１０９に記載の方法。

【請求項114】

前記リンカーが、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１５７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１５８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１６１）、ＳＲＳＳＧ（配列番号１６２）、及びＳＧＳＳＣ（配列番号１６３）から選択される、請求項１０８又は１０９に記載の方法。

【請求項115】

前記第１の融合タンパク質及び／又は前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドを含む、請求項８１～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項116】

前記第１の融合タンパク質及び／又は前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第２のポリペプチド及び前記第１のポリペプチドを含む、請求項８１～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項117】

前記第１の融合タンパク質及び／又は前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第１のポリペプチド、前記リンカー、及び前記第２のポリペプチドを含む、請求項１０８～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項118】

前記第１の融合タンパク質及び／又は前記第２の融合タンパク質が、Ｎ末端からＣ末端にかけて、前記第２のポリペプチド、前記リンカー、及び前記第１のポリペプチドを含む、請求項１０８～１１４のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照
本出願は、２０２１年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１５１，５２４号の優先権を主張し、その全体があらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出されるテキストファイルの説明
本明細書と共に電子的に提出されるテキストファイルの内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ可読形式のコピー（ファイル名：ＩＳＯＬ＿００６＿００ＵＳ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ、記録日：２０２１年２月１９日、ファイルサイズ：１メガバイト）。

【0003】

本開示は、一般に、生物製剤の精製のための組成物及び方法に関する。より具体的には、本開示は、アデノ随伴ウイルス結合ポリペプチドを含む精製マトリックス及びそれを使用する方法に関する。

【背景技術】

【0004】

医学及び他の分野における生物製剤の使用は急速に増加している。生物製剤は、多くの場合、所与の標的に対して高い親和性及び特異性を有し、さらに毒性及び生分解性が低いことが特徴である。しかしながら、その製造及び精製は、非常に困難であり得る。治療用酵素、抗体、遺伝子送達ベクター、シグナル伝達分子、ホルモン、及びその他のタンパク質を含む生物製剤は、典型的には、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、又は哺乳動物宿主細胞での組換えによって製造される。許容される純度基準（例えば、ＦＤＡ又は他の規制機関によって設定された基準）を満たすために、多数の下流精製ステップが必要である。宿主細胞のタンパク質、核酸、エンドトキシン、及びウイルスは、多くの場合、生物学的製剤から除去しなければならない主な汚染物質である。

【0005】

加えて、生物製剤が活性を維持するには、その構造を維持しなければならない。塩、温度、凍結乾燥、酸化条件、ｐＨ、光、撹拌、保存中の生物製剤の向き、凍結融解、生物製剤の凝集傾向を含むいくつかの因子が、生物製剤の活性の喪失を引き起こし得る。

【0006】

当技術分野では、生物製剤の製造、精製、及び安定化のための改良された組成物及び方法が必要とされている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0007】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質が本明細書で提供され、この第２のポリペプチドは、相挙動を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、（ｉ）酵素又はその誘導体若しくは触媒断片；（ｉｉ）抗体又はその誘導体若しくは抗原結合断片；（ｉｉｉ）シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体；（ｉｖ）構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体；又は（ｖ）ホルモン又はその断片若しくは誘導体を含む。

【0008】

いくつかの実施形態では、基質上で多段階酵素プロセスを実施する方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。

【0009】

いくつかの実施形態では、基質と接触させる、基質を単離する、及び／又は基質を精製する方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。

【0010】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドを精製する方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第１の環境因子を融合タンパク質に適用するステップ；（ｉｉｉ）サイズ及び／又は密度に基づいて融合タンパク質凝集体を少なくとも１つの汚染物質から分離するステップ；並びに（ｉｖ）第２の環境因子を適用して融合タンパク質を脱凝集させるステップを含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、基質上で多段階酵素プロセスを実施する方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの収量を改善する方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップ；並びに（ｉｉ）第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから分離するステップであって、第１のポリペプチドの収量が、融合タンパク質として発現された場合、融合タンパク質として発現されない場合の第１のポリペプチドの収量と比較して向上する、ステップを含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、及び／又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件に曝露した後の第１のポリペプチドの活性の喪失を実質的に防止する方法が本明細書で提供され、この方法は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドである。

【0014】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドのアンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを実質的に防止する方法が本明細書で提供され、この方法は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドである。

【0015】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドを安定化させる方法が本明細書で提供され、この方法は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドであり、融合タンパク質は、第１のポリペプチドを不安定化させる１つ又は複数の条件に曝露された場合、第１のポリペプチドは、その活性を実質的に保持する。

【0016】

実施形態では、この方法は、融合タンパク質を条件から除外するステップ、及び第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから切断するステップを含み、第１のポリペプチドは、条件に曝露されていない対照の第１のポリペプチドと比較してその活性を保持する。

【0017】

実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させる１つ又は複数の条件は：酸化剤への曝露、凍結乾燥、非生理的ｐＨへの曝露、カオトロピック剤への曝露、少なくとも５０℃の温度への曝露、有機溶媒への曝露、尿素への曝露、洗剤への曝露、オートクレーブへの曝露、凍結融解サイクル、熱ショック、又はそれらの組み合わせを含む。

【0018】

実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させる１つ又は複数の条件は、非生理的ｐＨへの曝露を含む。実施形態では、非生理的ｐＨへの曝露は、酸への曝露である。実施形態では、酸は、塩酸グアニジンである。実施形態では、非生理的ｐＨへの曝露は、塩基への曝露である。実施形態では、塩基は、水酸化ナトリウム又は尿素である。

【0019】

実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件は、塩酸グアニジンへの曝露、尿素への曝露、凍結乾燥、凍結融解サイクル、オートクレーブ処理、水酸化ナトリウムへの曝露、又は少なくとも９０℃の温度への曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件は、０．１Ｍ ＮａＯＨへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件は、０．１Ｍ ＮａＯＨへの３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件は、６Ｍ塩酸グアニジンへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディング、分解、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件は、６Ｍ塩酸グアニジンへの３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件は、少なくとも９５℃に加熱することである。実施形態では、条件は、熱ショックであり、熱ショックは：第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を９５℃で３０分間加熱するステップ；融合タンパク質を含む容器を氷上に置くステップ、その後融合タンパク質を室温に戻すステップを含む。

【0020】

実施形態では、第１のポリペプチドを含む融合タンパク質が、１つ又は複数の条件に約１５分間、約３０分間、約４５分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間。約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間曝露される。実施形態では、１つ又は複数の条件への曝露は、少なくとも約３０分間行われる。実施形態では、１つ又は複数の条件への曝露は、約３０分～約１２時間、約３０分～約１１時間、約３０分～約１０時間、約３０分～約９時間、約３０分～約８時間、約３０分～約７時間、約３０分～約６時間、約３０分～約５時間、約３０分～約４時間、約３０分～約３時間、約３０分～約２時間、又は約３０分～約１時間行われる。

【0021】

実施形態では、第１のポリペプチドの活性は、第１のポリペプチドの結合パートナーに対するその親和性である。実施形態では、第１のポリペプチドは酵素であり、その活性はｋ_ｃａｔである。

【0022】

実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照と比較して、その活性の３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満が喪失し、対照は、第１のポリペプチドをアンフォールディング、分解、又は不安定化させることが知られている条件に曝露されていない。実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照と比較して、その活性の６５％～１００％を保持する。実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照と比較して、その活性の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％を保持する。実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件に曝露した後、対照と比較して、その活性の２０％未満又は２５％未満が喪失し、対照は、第１のポリペプチドのアンフォールディングする、分解する、又は不安定化させることが知られている条件に曝露されていない。実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照と比較して、その活性の少なくとも８０％を保持する。実施形態では、第１のポリペプチドは、４℃で約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、又は約１２ヶ月間その活性を保持する。実施形態では、第１のポリペプチドは、－２０℃で約６ヶ月間、約９ヶ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、又は約１０年間その活性を保持する。

【0023】

実施形態では、第１のポリペプチドの収量は、宿主細胞懸濁液１リットル当たり１５ｍｇ超、１リットル当たり３０ｍｇ超、１リットル当たり５０ｍｇ超、１リットル当たり７５ｍｇ超、１リットル当たり１００ｍｇ超、１リットル当たり２００ｍｇ超、又は１リットル当たり３００ｍｇ超である。実施形態では、融合タンパク質における第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない場合の第１のポリペプチドの収量よりも少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３７５％、少なくとも約４００％、少なくとも約４２５％、少なくとも約４５０％、少なくとも約４７５％、少なくとも約５００％、少なくとも約５２５％、少なくとも約５５０％、少なくとも約５７５％、少なくとも約６００％、少なくとも約６２５％、少なくとも約６５０％、少なくとも約６７５％、少なくとも約７００％、少なくとも約７２５％、少なくとも約７５０％、少なくとも約７７５％、少なくとも約８００％、少なくとも約８２５％、少なくとも約８５０％、少なくとも約８７５％、少なくとも約９００％、少なくとも約９２５％、少なくとも約９５０％、少なくとも約９７５％、少なくとも約１，０００％、少なくとも約１，１００％、少なくとも約１，１２５％、少なくとも約１，１５０％、少なくとも約１，１７５％、少なくとも約１，２００％、少なくとも約１，２２５％、少なくとも約１，２５０％、少なくとも約１，２７５％、少なくとも約１，３００％、少なくとも約１，３２５％、少なくとも約１，３５０％、少なくとも約１，３７５％、少なくとも約１，４００％、少なくとも約１，４２５％、少なくとも約１，４５０％、少なくとも約１，４７５％、少なくとも約１，５００％、少なくとも約１，５２５％、少なくとも約１，５５０％、少なくとも約１，５７５％、少なくとも約１，６００％、少なくとも約１，６２５％、少なくとも約１，６５０％、少なくとも約１，６７５％、少なくとも約１，７００％、少なくとも約１，７２５％、少なくとも約１，７５０％、少なくとも約１，７７５％、少なくとも約１，８００％、少なくとも約１，８２５％、少なくとも約１，８５０％、少なくとも約１，８７５％、少なくとも約１，９００％、少なくとも約１，９２５％、少なくとも約１，９５０％、少なくとも約１，９７５％、又は少なくとも約２，０００％高い。実施形態では、第１のポリペプチドの収量は、１リットル当たり７５ｍｇ超である。実施形態では、第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの収量より約３００％高い。

【0024】

実施形態では、核酸基質上で酵素プロセスを実施する方法が本明細書で提供され、この方法は：（ｉ）第１の酵素及び相挙動を有する第１のポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；並びに（ｉｉ）第１の酵素が基質に接触するのを可能にする第１の環境因子を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は：（ｉｉｉ）第２の酵素及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｖ）第２の酵素が基質に接触するのを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。実施形態では、この方法は：（ｖ）第３の環境因子を適用して第１の酵素を基質から分離するステップ；並びに（ｖｉ）第４の環境因子を適用して、第２の酵素を基質から分離するステップを含む。実施形態では、第１の酵素、第２の酵素、又は両方は、核酸結合タンパク質（ＮＢＰ）を含む。

【0025】

これら及び他の実施形態は、以下の詳細な説明、実施例、及び特許請求の範囲でさらに説明される。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】図１は、凍結乾燥、０．１Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）への曝露、さらには９５℃の加熱を含む、タンパク質をアンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている様々な条件で処理した後の融合タンパク質の活性パーセントを示すグラフである。

【図2】図２は、凍結乾燥及びＰＢＳ中での再懸濁（未処理）後、又は凍結乾燥、オートクレーブ処理、及びＰＢＳ中での再懸濁（オートクレーブ処理済み）後の融合タンパク質の活性パーセントを示す。

【図3】図３は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムに曝露し、９５℃に加熱し、そして低ｐＨ（即ち、ｐＨ４）で９５℃に加熱した後の融合タンパク質の喪失パーセントを示す。処理後、各曝露群の融合タンパク質を中和及び／又は冷却し、遠心分離して凝集体を除去し、市販のＥＬＩＳＡを使用して総タンパク質をアッセイした。各群で、出発タンパク質材料の２％未満が喪失した。データは、平均値及び標準誤差（ｎ＝３）を表す。

【図4A】、

【図4B】、

【図4C】図４Ａ～図４Ｃは、ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）のＰＫＤ２ドメイン及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質が、相挙動を有するポリペプチドの非存在下でのＡＡＶＲのＰＫＤ２ドメインの発現よりも優れた発現を有することを示す。図４Ａは、１リットル当たりの、ＰＫＤ２及び精製されたＰＫＤ２を含む融合タンパク質の濃度を示す。図４Ｂは、１リットル当たりの、ＰＫＤ２及び精製されたＰＫＤ２を含む融合タンパク質の量を示す。図４Ｃは、ゲル上のＰＫＤ２及びＰＫＤ２を含む融合タンパク質の発現を示す。

【図5】図５は、ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）のＣＲ３ドメイン及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質が、ポリペプチドを分解する、凝集させる、又は不活性化することが知られている条件（例えば、９５℃、０．１Ｍ ＮａＯＨインキュベーション、又は６Ｍ ＧｕＨＣｌインキュベーション）に曝露された後に、レンチウイルスを捕捉するその能力を保持することを示す。

【発明を実施するための形態】

【0027】

定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」、及び「ｔｈｅ（その）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「タンパク質」への言及は、１つのタンパク質又はそのようなタンパク質の混合物を指し、「方法」への言及は、当業者に公知の同等のステップ及び／又は方法への言及などを含む。

【0028】

本明細書で使用される場合、数値の前にある「約」又は「およそ」という用語は、値に１０％の範囲をプラス又はマイナスした値を示す。例えば、「約１００」は、９０と１１０を含む。

【0029】

また、本明細書で使用される場合、「及び／又は」は、関連する列挙された項目の１つ又は複数のあらゆる可能な組み合わせ、及び代替（「又は」）で解釈される場合の組み合わせの欠如を指し、包含する。

【0030】

文脈が別段の指示をしない限り、本明細書に記載の様々な特徴は任意の組み合わせで使用できることが明確に意図されている。

【0031】

さらに、本開示は、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の任意の特徴又は特徴の組み合わせが除外又は省略され得ることも企図する。さらに説明すると、例えば、特定のアミノ酸がＡ、Ｇ、Ｉ、Ｌ、及び／又はＶから選択できることが明細書で示されている場合、この文言はまた、アミノ酸がこれらのアミノ酸（複数可）の任意のサブセット、例えば、Ａ、Ｇ、Ｉ、又はＬ；Ａ、Ｇ、Ｉ、又はＶ；Ａ又はＧ；Ｌのみなどの任意のサブセットから、そのような各部分組み合わせが本明細書に明示的に記載されているかのように選択できることを示す。さらに、そのような文言は、指定のアミノ酸の１つ又は複数を除外できることも示す。例えば、特定の実施形態では、アミノ酸は、あたかもそのような考えられる除外がそれぞれ、本明細書に明示的に記載されているかのように、ＡでもＧでもＩでもない；Ａではない；ＧでもＶでもない；などである。

【0032】

「アデノ随伴ウイルス」（ＡＡＶ）は、小型の複製欠損パルボウイルスである。本明細書で使用される場合、ＡＡＶは、以下の血清型のいずれか１つの野生型又は変異型ＡＡＶを指し得る：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３（３Ａ型及び３Ｂ型を含む）、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶｒｈ３２．３３、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶｒｈ７４、ＡＡＶｈｕ．６８、トリＡＡＶ、ウシＡＡＶ、イヌＡＡＶ、ウマＡＡＶ、ヒツジＡＡＶ、ヘビＡＡＶ、フトアゴヒゲトカゲＡＡＶ、ＡＡＶ２ｉ８、ＡＡＶ２ｇ９、ＡＡＶ－ＬＫ０３、ＡＡＶ７ｍ８、ＡＡＶＡｎｃ８０、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ、及び現在知られているか又は今後発見されるその他のＡＡＶ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、一本鎖ゲノム又は二本鎖ゲノム（例えば、自己相補的ＡＡＶ）を有し得る。

【0033】

「ＡＡＶ粒子」は、典型的には、カプシド、及びタンパク質カプシドによってカプシド化された核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含む。「カプシド」は、Ｔ＝１正二十面体対称性で会合及び配置された個々の「カプシドタンパク質サブユニット」又は「カプシドタンパク質」（例えば、約６０個のカプシドタンパク質サブユニット）を含む、球形に近いタンパク質シェルである。従って、本明細書に記載のＡＡＶベクターのカプシドは、複数のカプシドタンパク質を含む。ＡＡＶ粒子がカプシドタンパク質を含むと記載される場合、ＡＡＶ粒子は、カプシドを含み、そのカプシドが、１つ又は複数のＡＡＶカプシドタンパク質を含むことを理解されよう。ＡＡＶ粒子が結合ドメインに結合すると記載される場合、結合ドメインが、カプシド内の１つ又は複数のカプシドタンパク質に結合し得ることを理解されたい。「空のＡＡＶ粒子」又は「空のカプシド」という用語は、発現カセット又は導入遺伝子を含むベクターゲノム又は核酸を一切含まないＡＡＶ粒子又はカプシドを指す。

【0034】

本明細書で使用される場合、本明細書では「ＡＡＶ組成物」と互換的に使用される「ＡＡＶサンプル」という用語は、ＡＡＶ粒子を含む組成物を指す。いくつかの実施形態では、「ＡＡＶサンプル」は、１つ又は複数の血清型のＡＡＶを含む組成物を指す。例えば、「ＡＡＶ８サンプル」は、ＡＡＶ８粒子を含む組成物を指す。

【0035】

「ウイルス粒子」は、典型的には、タンパク質シェル（例えば、カプシド又はエンベロープ）及びその中に含まれる核酸（例えば、導入遺伝子を含む核酸）を含む。

【0036】

本明細書で使用される場合、ポリペプチドを指す「断片」という用語には、ポリペプチドの切断型が含まれる。この断片は、完全長タンパク質又はポリペプチドと実質的に同じ活性を有する。例えば、核酸結合タンパク質の断片は、核酸に対するその結合親和性を実質的に保持する核酸結合タンパク質の切断型を指す。さらなる例として、断片は、全長タンパク質のアミノ酸の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、又は約９９％を含み得る。本明細書で使用される場合、結合親和性などの活性に関する「実質的に」という用語は、完全長タンパク質又はポリペプチドの少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の活性（例えば、結合親和性）である切断型を意味する。

【0037】

本明細書で使用される場合、「汚染物質」及び「不純物」という用語は互換的に使用される。汚染物質は、精製された組成物において望ましくない任意の物質を指し得る。いくつかの実施形態では、汚染物質は、精製されることが望ましい生物製剤以外の任意の物質である。汚染物質の非限定的な例としては、限定されるものではないが、溶媒、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、ウイルス、細胞（例えば、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞）、炭水化物、脂質、又はリポ多糖が挙げられる。いくつかの実施形態では、汚染物質は、エンドトキシン又はマイコトキシンである。

【0038】

本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質は、少なくとも２つのアミノ酸を含む必要があり、タンパク質の配列を構成できるアミノ酸の最大数に制限はない。「ペプチド」という用語は、例えば、天然ペプチド、組換えペプチド、合成ペプチド、又はそれらの組み合わせを含む短鎖アミノ酸を指し得る。タンパク質及びペプチドには、例えば、特に、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ポリペプチドの変異体、修飾ポリペプチド、誘導体、類似体、及び融合タンパク質などが含まれ得る。

【0039】

「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド塩基の配列であり、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド配列（天然に存在するヌクレオチド及び天然に存在しないヌクレオチドの両方を含む）であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、一本鎖又は二本鎖のＤＮＡ配列である。

【0040】

本明細書で使用される場合、ウイルス粒子を「単離する」又は「精製する」（又は文法的に等価物）とは、ウイルス粒子が、ウイルス粒子を含む出発物質（例えば、細胞溶解物）中の他の成分の少なくとも一部から少なくとも部分的に分離されていることを意味する。代表的な実施形態では、「単離された」又は「精製された」ウイルス粒子は、出発物質と比較して、少なくとも約１０倍、約１００倍、約１，０００倍、約１０，０００倍、又はそれ以上濃縮されている。

【0041】

本明細書で使用される場合、「アミノ酸」という用語は、任意の天然に存在するアミノ酸、その修飾型、及び合成アミノ酸を包含する。天然左旋性（Ｌ－）アミノ酸を表１に示す。

【0042】

【表1】

【0043】

或いは、アミノ酸は、修飾されたアミノ酸残基（非限定的な例を表２に示す）であり得、且つ／又は翻訳後修飾（例えば、アセチル化、アミド化、ホルミル化、ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、又は硫酸化）によって修飾されたアミノ酸であり得る。

【0044】

【表2】

【0045】

【表3】

【0046】

さらに、天然に存在しないアミノ酸は、「非天然」アミノ酸であり得る。

【0047】

本明細書で使用される場合、「環境因子」という用語は、タンパク質ベースの精製マトリックスを含む組成物に適用された場合に、その組成物の１つ又は複数の特性を変化させるあらゆる因子である。環境因子の非限定的な例としては、温度、ｐＨ、塩濃度、精製マトリックスの濃度、生物製剤の濃度、若しくは圧力のうちの１つ又は複数の変化；界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、変性剤、還元剤、若しくは酸化剤の１つ又は複数の添加；又は電磁波の印加が挙げられる。

【0048】

本明細書で使用される場合、「相挙動を有するポリペプチド」という用語は、相転移を受け得る任意のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、環境因子の適用により相転移を受ける。相挙動を有するポリペプチドの例としては、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）及びレジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）が挙げられる。

【0049】

本明細書で使用する場合、「融合タンパク質」という用語は、自然界では融合していることが見出されない２つ（又はそれ以上）の異なるポリペプチドをコードする２つの異種ヌクレオチド配列又はその断片が正しい翻訳リーディングフレームで互いに融合した場合に産生されるポリペプチドを指す。

【0050】

「抗体」という用語は、Ｉｇ分子の可変領域に位置する少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、又はポリペプチドなどの特定の標的に結合できる免疫グロブリン（Ｉｇ）分子を指す。本明細書で使用される場合、この用語は、完全なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体及びその抗原結合断片を包含する。例えば、天然の免疫グロブリン分子は、２つの重鎖ポリペプチド及び２つの軽鎖ポリペプチドから構成される。重鎖ポリペプチドのそれぞれは、重鎖ポリペプチドと軽鎖ポリペプチドの間の鎖間ジスルフィド結合によって軽鎖ポリペプチドと会合して、２つのヘテロ二量体タンパク質又はポリペプチド（即ち、２つの異種ポリペプチド鎖からなるタンパク質）を形成する。次に、２つのヘテロ二量体タンパク質は、重鎖ポリペプチド間の追加の鎖間ジスルフィド結合によって会合してＩｇ分子を形成する。「抗体」という用語には、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）も含まれる。

【0051】

本明細書で使用される場合、「抗原結合断片」という用語は、目的の抗原の少なくとも１つのエピトープに結合する免疫グロブリン重鎖及び／又は軽鎖の少なくとも１つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むポリペプチド断片を指す。これに関して、本明細書に記載の抗体の抗原結合断片は、標的分子に特異的に結合する抗体の可変重鎖（ＶＨ）配列及び可変軽鎖（ＶＬ）配列の１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つすべてのＣＤＲを含み得る。抗原結合断片には、完全長抗体の一部、一般にその抗原結合領域又は可変領域、例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆｖ断片、ミニボディ、ダイアボディ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、抗体断片から形成された多重特異性抗体、及び必要な特異性の抗原結合部位又は断片を含む免疫グロブリン分子のその他の修飾された構成を含むタンパク質が含まれる。

【0052】

本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、免疫グロブリン（抗体）分子を指す。可変ドメインごとに３つのＣＤＲ：軽鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、並びに重鎖の可変ドメインにおけるＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３が存在する。

【0053】

「Ｆ（ａｂ’）２」という用語は、酵素ペプシンによるタンパク質分解的切断によって生成されるＩｇＧのタンパク質断片を指す。各Ｆ（ａｂ’）２断片は、ヒンジ領域内のジスルフィド結合によって結合された２つのＦ（ａｂ’）断片を含むため、二価の抗原結合断片である。「Ｆａｂ’」という用語は、Ｆ（ａｂ’）２に由来する断片を指し、Ｆｃの小さな部分を含み得る。各Ｆａｂ’断片は、一価の抗原結合断片である。

【0054】

「Ｆ（ａｂ）」という用語は、酵素パパインによるＩｇＧ分子のタンパク質分解的切断から生じる２つのタンパク質断片を指す。各Ｆ（ａｂ）は、ＶＨ鎖とＶＬ鎖の共有結合ヘテロ二量体を含み、完全な抗原結合部位を含む。各Ｆ（ａｂ）は、一価の抗原結合断片である。

【0055】

「Ｆｖ断片」は、天然抗体分子の抗原認識及び結合能力の多くを保持するが、Ｆａｂ内に含まれるＣＨ１及びＣＬドメインを欠く抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を指す。Ｉｎｂａｒ ｅｔ ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６９：２６５９－２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ １５：２７０６－２７１０；ａｎｄ Ｅｈｒｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ １９：４０９１－４０９６。

【0056】

結合親和性（Ｋａ）は、１／Ｍ又はＭ^－１の単位で表される特定の相互作用の平衡会合を指す。或いは、親和性は、Ｍの単位での特定の結合相互作用の平衡解離定数（Ｋｄ）として定義することができる。親和性は、従来の技術を使用して容易に決定することができる（例えば、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９４９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５１：６６０；及び米国特許第５，２８３，１７３号明細書、同第５，４６８，６１４号明細書、又は同等物を参照）。

【0057】

融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本開示は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供し、第２のポリペプチドは相挙動を有する。実施形態では、第１のポリペプチドは酵素である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、治療上、美容上、又は産業上の目的を有する任意のポリペプチドである。また、本明細書では、第１のポリペプチドを安定化させる、精製する、及び作製する方法も提供される。

【0058】

第１のポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は、第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。第１のポリペプチドは、例えば、治療上、美容上、又は産業上の目的を有する任意のポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、（ｉ）酵素又はその触媒断片；（ｉｉ）抗体又はその抗原結合断片；（ｉｉｉ）シグナル伝達分子又はその断片；（ｉｖ）構造タンパク質又はその断片：（ｖ）ホルモン、（ｖｉ）核酸結合タンパク質（ＮＢＰ）又はその断片；（ｖｉｉ）治療薬又はその断片；（ｖｉｉｉ）担体タンパク質又はその断片；（ｉｘ）サイトカイン又はその断片；或いは（ｘ）毒素又はその断片である。

【0059】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、担体タンパク質である。実施形態では、担体タンパク質は：ヒト転写因子ＴＡＦ１２（ＴＡＦ１２）、ケトステロイドイソメラーゼ（ＫＳＩ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、β－ガラクトシダーゼ（β－Ｇａ１）、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）、キチン結合ドメイン（ＣＢＤ）、ＢＭＰ－２突然変異体（ＢＭＰＭ）、ＳＵＭＯ、ＣＡＴ、ＴｒｐＥ、ブドウ球菌プロテインＡ、レンサ球菌タンパク質、デンプン結合タンパク質、エンドグルカナーゼＡのセルロース結合ドメイン、エキソグルカナーゼＣｅｘのセルロース結合ドメイン、ビオチン結合ドメイン、ｒｅｃＡ、Ｆ１ａｇ、ポリ（Ｈｉｓ）、ポリ（Ａｒｇ）、ポリ（Ａｓｐ）、ポリ（Ｇ１ｎ）、ポリ（Ｐｈｅ）、ポリ（Ｃｙｓ）、緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、シアン蛍光タンパク質、ビオチン、抗ビオチン、ストレプトアビジン、抗体エピトープ、アルブミン、ウシ血清アルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン、並びに変異体及びその断片から選択される。実施形態では、担体タンパク質は、アルブミンである。実施形態では、担体タンパク質は、ウシ血清アルブミンである。

【0060】

実施形態では、第１のポリペプチドは治療薬である。治療薬の非限定的な例としては、抗体、サイトカイン、レピルジン、セツキシマブ、ドルナーゼアルファ、デニロイキンジフチトクス、エタネルセプト、ビバリルジン、ロイプロリド、アルテプラーゼ、インターフェロンアルファ－ｎ１、ダルベポエチンアルファ、レテプラーゼ、エポエチンアルファ、サケカルシトニン、インターフェロンアルファ－ｎ３、ペグフィルグラスチム、サルグラモスチム、セクレチン、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、アスパラギナーゼ、チロトロピンアルファ、抗血友病因子、アナキンラ、グラミシジンＤ、静脈内免疫グロブリン、アニストレプラーゼ、インスリン（レギュラー）、テネクテプラーゼ、メノトロピン、インターフェロンガンマ－１ｂ、インターフェロンアルファ－２ａ（組換え）、凝固因子Ｖｉｌａ、オプレルベキン、パリフェルミン、グルカゴン（組換え）、アルデスロイキン、Ｂ型ボツリヌス毒素、オマリズマブ、ルトロピンアルファ、インスリンリスプロ、インスリングラルギン、コラゲナーゼ、ラスブリカーゼ、アダリムマブ、イミグルセラーゼ、アブシキシマブ、α－１－プロテイナーゼ阻害剤、ペガスパルガーゼ、インターフェロンベータ－１ａ、ウシペグアデマーゼ、ヒト血清アルブミン、エプチフィバチド、ヨウ素化血清アルブミン、インフリキシマブ、フォリトロピンベータ、バソプレシン、インターフェロンベータ－１ｂ、ヒアルロニダーゼ、リツキシマブ、バシリキシマブ、ムロモナブ、ジゴキシン免疫Ｆａｂ（ヒツジ）、イブリツモマブ、ダプトマイシン、トシツモマブ、ペグビソマント、Ａ型ボツリヌス毒素、パンクレリパーゼ、ストレプトキナーゼ、アレムツズマブ、アルグルセラーゼ、カプロマブ、ラロニダーゼ、ウロフォリトロピン、エファリズマブ、血清アルブミン、コリオゴナドトロピンアルファ、抗胸腺細胞グロブリン、フィルグラスチム、凝固第ＩＸ因子、ベカプレルミン、アガルシダーゼベータ、インターフェロンアルファ－２ｂ、オキシトシン、エンフビルチド、パリビズマブ、ダクリズマブ、ベバシズマブ、アルシツモマブ、エクリズマブ、パニツムマブ、ラニビズマブ、イドゥルスルファーゼ、アルグルコシダーゼアルファ、エキセナチド、メカセルミン、プラムリンチド、ガルスルファーゼ、アバタセプト、コシントロピン、コルチコトロピン、インスリンアスパルト、インスリンデテミル、インスリングルリジン、ペガプタニブ、ネシリチド、チマルファシン、デフィブロチド、天然アルファインターフェロン／マルチフェロン、グラチラマー酢酸塩、プレオタクト（ｐｒｅｏｔａｃｔ）、テイコプラニン、カナキヌマブ、イピリムマブ、スロデキシド、トシリズマブ、テリパラチド、ペルツズマブ、リロナセプト、デノスマブ、リラグルチド、ゴリムマブ、ベラタセプト、ブセレリン、ベラグルセラーゼアルファ、テサモレリン、ブレンツキシマブベドチン、タリグルセラーゼアルファ、ベリムマブ、アフリベルセプト、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンセミ（Ｅｒｗｉｎｉａ ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ）、オクリプラスミン、グルカルピダーゼ、テドゥグルチド、ラキシバクマブ、セルトリズマブペゴル、インスリンイソファン（ｉｎｓｕｌｉｎ ｉｓｏｐｈａｎｅ）、エポエチンゼータ、オビヌツズマブ、フィブリノリジン別名プラスミン、フォリトロピンアルファ、ロミプロスチム、ルシナクタント、ナタリズマブ、アリスキレン、ブタクサ花粉抽出物、セクキヌマブ、ソマトトロピン（組換え）、ドロトレコギンアルファ、アレファセプト、ＯｓｐＡリポプロテイン、ウロキナーゼ、アバレリックス、セルモレリン、アプロチニン、ゲムツズマブオゾガマイシン、サツモマブペンデチド、アルビグルチド、アンチトロンビンアルファ、アンチトロンビンＩＩＩ（ヒト）、アスフォターゼアルファ（ａｓｆｏｔａｓｅ ａｌｆａ）、アテゾリズマブ、自家培養軟骨細胞、ベラクタント、ブリナツモマブ、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（ヒト）、凝固因子ＸＩＩＩＡサブユニット（組換え）、コネスタットアルファ、ダラツムマブ、デシルジン、デュラグルチド、エロスルファーゼアルファ、エボロクマブ、フィブリノゲン濃縮物（ヒト）、フィルグラスチム－ｓｎｄｚ、胃内因子、Ｂ型肝炎免疫グロブリン、ヒトカルシトニン、ヒトクロストリジウム破傷風（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）トキソイド免疫グロブリン、ヒト狂犬病ウイルス免疫グロブリン、ヒトＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン、ヒトＲｈｏ（Ｄ）免疫グロブリン、ヒアルロニダーゼ（ヒト、組換え体）、イダルシズマブ、免疫グロブリン（ヒト））、ベドリズマブ、ウステキヌマブ、ツロクトコグアルファ、ツベルクリン精製タンパク質誘導体、シモクトコグアルファ、シルツキシマブ、セベリパーゼアルファ、サクロシダーゼ、ラムシルマブ、プロトロンビン複合体濃縮物、ポラクタントアルファ、ペムブロリズマブ、ペグインターフェロンベータ－１ａ、オファツムマブ、オビルトキサキシマブ（ｏｂｉｌｔｏｘａｘｉｍａｂ）、ニボルマブ、ネシツムマブ、メトレレプチン、メトキシポリエチレングリコール－エポエチンベータ、メポリズマブ、イセキズマブ、インスリンデグルデク、インスリン（ブタ）、インスリン（ウシ）、サイログロブリン、炭疽菌免疫グロブリン（ヒト）、抗阻害剤凝固複合体、ブロダルマブ、Ｃ１エステラーゼ阻害剤（組換え）、絨毛性ゴナドトロピン（ヒト）、絨毛性ゴナドトロピン（組換え）、凝固因子Ｘ（ヒト）、ジヌツキシマブ、エフモロクトコグアルファ、第ＩＸ因子複合体（ヒト）、Ａ型肝炎ワクチン、ヒト水痘帯状疱疹免疫グロブリン、イブリツモマブチウキセタン、レノグラスチム、ペグロティカーゼ、硫酸プロタミン、プロテインＳ（ヒト）、シプロイセルＴ、ソマトロピン（組換え）、スソクトコグアルファ、及びトロンボモデュリンアルファが挙げられる。

【0061】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ１）、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、骨形成タンパク質２（ＢＭＰ２）、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、又はノギンなどの成長因子である。

【0062】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドはサイトカインである。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、インターロイキン－１（ＩＬ－１）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）、インターロイキン－４（ＩＬ－４）、インターロイキン－５（ＩＬ－５）、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－８（ＩＬ－８）、インターロイキン－９（ＩＬ－９）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１１（ＩＬ－１１）、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、インターロイキン－１４（ＩＬ－１４）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、インターロイキン－１６（ＩＬ－１６）、インターロイキン－１７（ＩＬ－１７）、インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）、インターロイキン－１９（ＩＬ－１９）、インターロイキン２０（ＩＬ－２０）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１）、インターロイキン２２（ＩＬ－２２）、インターロイキン２３（ＩＬ－２３）、インターロイキン２４（ＩＬ－２４）、インターロイキン２５（ＩＬ－２５）、インターロイキン２６（ＩＬ－２６）、インターロイキン２７（ＩＬ－２７）、インターロイキン－２８（ＩＬ－２８）、インターロイキン－２９（ＩＬ－２９）、インターロイキン－３０（ＩＬ－３０）、インターロイキン－３１（ＩＬ－３１）、インターロイキン－３２（ＩＬ－３２）、インターロイキン－３３（ＩＬ－３３）、インターロイキン－３４（ＩＬ－３４）、インターロイキン－３５（ＩＬ－３５）、インターロイキン－３６（ＩＬ－３６）、インターロイキン－３７（ＩＬ－３７）、インターロイキン－３８（ＩＬ－３８）、インターロイキン－３９（ＩＬ－３９）、又はインターロイキン－４０（ＩＬ－４０）などのインターロイキンである。いくつかの実施形態では、サイトカインは、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－α）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、又はトランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＶ－Ｂ）である。

【0063】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、受容体又は受容体断片である。例えば、第１のポリペプチドは、細胞表面受容体又はその細胞外部分（例えば、細胞外ドメイン）であり得る。いくつかの実施形態では、受容体は、イオンチャネル関連受容体、酵素結合受容体、又はＧタンパク質共役受容体である。いくつかの実施形態では、受容体は、受容体チロシンキナーゼ、チロシンキナーゼ関連受容体、受容体様チロシンホスファターゼ、受容体セリン－スレオニンキナーゼ、受容体グアニリルシクラーゼ、又はヒスチジンキナーゼ関連受容体であり得る。

【0064】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、酵素又はその誘導体若しくは触媒断片である。本明細書で使用される場合、「酵素」という用語には、それ自体は変化することなく他の物質の化学変化を触媒できるタンパク質又はその誘導体若しくは断片が含まれる。酵素の非限定的な例としては、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、プロテアーゼ、グルコ－アミラーゼ、アミラーゼ、アルカリ／酸ホスファターゼ、イソメラーゼ、オキシダーゼ、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラタナーゼ、レダクターゼ、フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、β－グルコシダーゼ、ラマリナーゼ（ｌａｍａｒｉｎａｓｅ）、キナーゼ、オキシドレクチュアーゼ（ｏｘｉｄｏｒｅｃｔｕａｓｅｓ）、リガーゼ、リゾチーム、ペントサナーゼ、マラナーゼ（ｍａｌａｎａｓｅ）、グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、デヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、キナーゼ、フィターゼ、ラッカーゼ、及びそれらの誘導体が挙げられる。

【0065】

いくつかの実施形態では、酵素又はその誘導体若しくは触媒断片は、細菌又は真菌から単離されるか又はそれに由来する。いくつかの実施形態では、酵素又はその誘導体若しくは触媒断片は、哺乳動物から単離されるか又はそれに由来する。

【0066】

いくつかの実施形態では、酵素又はその誘導体若しくは触媒断片は、天然に存在する酵素である。いくつかの実施形態では、酵素又はその誘導体若しくは触媒断片は、天然に存在する酵素と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態では、酵素又はその誘導体若しくは触媒断片は、天然に存在する酵素に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0067】

別段の指示がない限り、配列同一性は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能なＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）’ｓ Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ（登録商標））を使用して決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、比較される配列の全長にわたって計算される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、各比較配列の２０のアミノ酸、５０のアミノ酸、７５のアミノ酸、１００のアミノ酸、２５０のアミノ酸、５００のアミノ酸、７５０のアミノ酸、又は１０００のアミノ酸の断片にわたって計算される。

【0068】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、抗体又はその誘導体若しくは抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体は、リツキシマブ、トラスツズマブ、レチファンリマブ、アミバンタマブ、ウブリツキシマブ、アニフロルマブ、ロンカスツキシマブテシリン、バルスチリマブ、ビメキズマブ、トラロキヌマブ、エビナクマブ、スチムリマブ、アデュカヌマブ、テプリズマブ、ドスターリマブ、タネズマブ、イノリモマブ、オポルツズマブモナトックス、ナルソプリマブ、アンスビマブ、マルゲツキシマブ、ナキシタマブ、アトルチビマブ、マフティビマブ、及びオデシビマブ－ｅｂｇｎ、ベランタマブマフォドチン、タファシタマブ、サトラリズマブ、イネビリズマブ、サシツズマブゴビテカン、テプロツムマブ、イサツキシマブ、エプチネズマブ、［ｆａｍ］－トラスツズマブデルクステカン、エンフォルツマブベドチン、クリザンリズマブ、ブロルシズマブ、ポラツズマブベドチン、リサンキズマブ、ロモソズマブ、カプラシズマブ、ラブリズマブ、エマパルマブ、セミプリマブ、フレマネズマブ、モキセツモマブパスドトックス、ガルカネズマブ、ラナデルマブ、モガムイズマブ（ｍｏｇａｍｕｉｚｕｍａｂ）、エレヌマブ、チルドラキズマブ、イバリズマブ、ブロスマブ、デュルバルマブ、エミシズマブ、ベンラリズマブ、オクレリズマブ、グセルクマブ、イノツズマブ、オゾガマイシン、サリルマブ、デュピルマブ、アベルマブ、ブロダルマブ、アテゾリズマブ、ベズロトクスマブ、オララツマブ、レスリズマブ、オビルトキサキシマブ、イケキズマブ、ダラツムマブ、エロツズマブ、ネシツムマブ、イダルシズマブ、アリロクマブ、メポリズマブ、エボロクマブ、ジヌツキシマブ、セクキヌマブ、ニボルマブ、ブリナツモマブ、ペムブロリズマブ、ラムシルマブ、ベドリズマブ、シルツキシマブ、オビヌツズマブ、アド－トラスツズマブエムタンシン、ラキシバクマブ、ペルツズマブ、ブレンツキシマブベドチン、ベリムマブ、イピリムマブ、デノスマブ、トシリズマブ、オファツムマブ、カナキヌマブ、ゴリムマブ、ウステキヌマブ、セルトリズマブペゴル、カツマキソマブ、エクリズマブ、ラニビズマブ、パニツムマブ、ナタリズマブ、ベバシズマブ、セツキシマブ、エファリズマブ、オマリズマブ、トシツモマブ－ｉ１３１、イブリツモマブチウキセタン、アダリムマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、トラスツズマブ、インフリキシマブ、パリビズマブ、バシリキシマブ、ダクリズマブ、又は前述の抗体若しくはその抗原結合断片のいずれか１つと少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有するこれらの誘導体若しくは抗原結合断片である。いくつかの実施形態では、抗体又はその誘導体若しくは抗原結合断片は、前述の抗体又はその抗原結合断片のいずれか１つと比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する。

【0069】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体である。「シグナル伝達分子」という用語は、細胞内での規定された一連の生化学反応を伴うプロセスを細胞が受けるようにするタンパク質を指す。シグナル伝達分子の非限定的な例としては、受容体チロシンキナーゼ（例えば、Ｇタンパク質共役受容体）、核ホルモン受容体、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ワクシニアウイルス（ＶＨＲ）Ｈ１関連タンパク質、ホスファターゼのマイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＫＰ）ファミリーのメンバー、インターロイキン、サイトカイン、転写活性化因子、又は転写因子が挙げられる。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体は、天然に存在するシグナル伝達分子である。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体は、天然に存在するシグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態では、シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体は、天然に存在するシグナル伝達分子又はその断片又は誘導体に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0070】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体である。「構造タンパク質」という用語は、生物学的構造支持体として機能し得る非触媒タンパク質のクラスを指す。タンパク質は、それ自体で、他のタンパク質と組み合わせて生物学的構造支持体として、又は他の材料のマトリックス又は支持体として機能し得る。構造タンパク質の非限定的な例としては、クモの糸、ポリン（例えば、外膜ポリンＦ前駆体）、ケラチン、コラーゲン、アクチン、アクチニン、アグリカン、ビグリカン、カドヘリン、クラスリン、デコリン、エラスチン、フィブリノゲン、フィブリン、ヘパリン、ラミニン、ムチン、ミエリン関連糖タンパク質、ミエリン塩基性タンパク質、ミオシン、スペクトリン、トロポミオシン、トロポニン、チューブリン、ビメンチン、ビトロネクチン、及びレコグニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、前述の構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体は、天然に存在する構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体と比較して、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸変突然変異を有する。いくつかの実施形態では、構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体は、天然に存在する構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0071】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ホルモン又はその断片若しくは誘導体である。「ホルモン」という用語は、生物の一部の細胞、腺、又は器官によって放出され、生物の他の部分の細胞に影響を与えるメッセージを送る化学物質を指す。ホルモンの非限定的な例としては、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、ドーパミン、ソマトスタチン、バソプレシン、成長ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、メラノサイト刺激ホルモン（ＭＳＨ）、黄体形成ホルモン（ＬＨ）、プロラクチン、オキシトシン、チモポエチン、ＩＧＦ、ＴＨＰＯ、アンドロゲン、糖質コルチコイド、アルドステロン、アドレナリン、ノルアドレナリン、エストロゲン、プロゲステロン、プロラクチン、リラキシン、メラトニン、カルシトニン、ＰＴＨ、ガストリン、グレリン、ヒスタミン、神経ペプチドＹ、インスリン、グルカゴン、カルシトリオール、レニン、エリスロポエチン、インヒビン、及びカルシトニンが挙げられる。いくつかの実施形態では、ホルモンは成長因子である。

【0072】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、哺乳動物ポリペプチドである。哺乳動物ポリペプチドは、ヒトポリペプチド、ヤギポリペプチド、ウサギポリペプチド、マウスポリペプチド、ラットポリペプチド、霊長類ポリペプチド、又はヒヒポリペプチドであり得る。

【0073】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ウイルスポリペプチドである。ウイルスポリペプチドの非限定的な例としては、ｇａｇタンパク質、ＤＮＡポリメラーゼ、プロテアーゼ、カプシドタンパク質、エンベロープポリペプチド、融合ポリペプチド、及びスパイクタンパク質が挙げられる。いくつかの実施形態では、ウイルスポリペプチドは、カプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスポリペプチドは、エンベロープタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスポリペプチドは、スパイクタンパク質である。いくつかの実施形態では、カプシドタンパク質は、ＡＡＶカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスポリペプチドは、Ｔ７ポリメラーゼなどのバクテリオファージポリペプチドである。

【0074】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、細菌ポリペプチド又はその誘導体若しくは断片である。「細菌ポリペプチド」という用語は、細菌又は他の微生物によって自然に産生されるポリペプチド又はタンパク質を指す。いくつかの実施形態では、細菌ポリペプチドは、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、炭疽菌毒素、緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素Ａ、又は志賀毒素である。いくつかの実施形態では、細菌ポリペプチドは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡ（ＳＰＡ）又はプロテインＬである。

【0075】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは毒素である。毒素の非限定的な例としては、易熱性毒素（ＬＴ）、耐熱性毒素（ＳＴ）、ベロ毒素、志賀様毒素（Ｓｔｘｓ）、細胞毒素、エンドトキシン（例えば、リポ多糖（ＬＰＳ））、腸管凝集性ＳＴ毒素（ＥＡＳＴ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）エンテロトキシン１（ＳｈＥＴ１）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）エンテロトキシン２（ＳｈＥＴ２）、神経毒、細胞致死性膨張性毒素（Ｃｄｔ）、ＡｖｒＡ毒素、細胞傷害性壊死因子、マウス毒素、細胞致死性膨張性毒素、ＡｖｒＡ毒素、毒素複合体、細胞毒素壊死因子、Ｙｓｔ毒素、耐熱性毒素、志賀様毒素ＩＩ、ロイコトキシン、エンテロトキシン、耐熱様エンテロトキシン、細胞外毒素複合体、溶血素、膜孔形成毒素、α溶血素、耐熱様毒素、細胞外毒素複合体（ＥＴＣ）、アルファ毒素、ベータ毒素、神経毒、Ｃ２毒素、破傷風神経毒素、イプシロン毒素、テタノスパスミン、レシチナーゼ、コレラ毒素、コレラ菌副毒素（ａｃｃｅｓｓｏｒｙ ｃｈｏｌｅｒａ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ）、ＲＴＸ毒素、Ｃ３毒素、イオタ毒素、シータ毒素、δ溶血素、δ溶血素、γ溶血素、パントン－バレンタインロイコシジン、ブドウ球菌エンテロトキシン、毒素性ショック症候群毒素－１、Ｚｏｔ毒素（ｚｏｎａ ｏｃｃｌｕｄｅｎｓ ｔｏｘｉｎ）、胆汁毒素、コレラ毒素（ＣＴｘ）、副コレラエンテロトキシン（Ａｃｅ）、ＲＴＸ毒素、閉塞帯毒素（Ｚｏｔ）、Ｃｈｏｌｉｘ毒素、β－溶血素／細胞溶解素、ＣＡＭＰ因子、ストレプトリジンＯ、ストレプトリジンＳ、ニューモリシン、外毒素、空胞化致死毒素Ａ（ＶａｃＡ）、細胞溶解性毒素、外毒素Ａ、外毒素Ｓ、外毒素Ｔ、外毒素Ｕ、外毒素Ｙ、ホスホリパーゼＣ、Ｃｒｙ毒素、炭疽菌毒素、細胞致死性膨張毒素Ａ、細胞致死性膨張毒素Ｂ、細胞致死性膨張毒素Ｃ、コレラ様エンテロトキシン、アデニル酸シクラーゼ毒素、百日咳毒素、気管細胞毒素、皮膚壊死性毒素、ジフテリア毒素、バクテロイデス・フラジリス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｆｒａｇｉｌｉｓ）毒素、及びリステリオリシンＯが挙げられる。いくつかの実施形態では、毒素は、ボツリヌス毒素、ジフテリア毒素、炭疽菌毒素、シュードモナス外毒素Ａ、又は志賀毒素である。

【0076】

いくつかの実施形態では、毒素は、細菌、例えば、エルシニア（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）属、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、シゲラ属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、エシェリヒア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、エンテロバクター属（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）、セラチア属（Ｓｅｒｒａｔｉａ）、プロテウス属（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、シトロバクター属（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、ビブリオ属（Ｖｉｂｒｉｏ）、スタヒロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトコッカス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、ヘリコバクター属（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ）、シュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、カンピロバクター属（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、エロモナス属（Ａｅｒｏｍｏｎａｓ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｅｒｒｉａ）、ボルデテラ属（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ）、ヘモフィルス属（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ）、クラミジア属（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、バクテロイデス属（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉａ）、及びリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）のいずれか１つから選択される細菌から単離される。

【0077】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、抗原性ポリペプチドである。「抗原性ポリペプチド」という用語は、生物において免疫応答を誘発する任意のポリペプチドを指す。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、抗原性ポリペプチドに対する体液性及び／又は細胞性免疫応答の発生を引き起こす。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ワクチンの成分である。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、血液凝集素、スパイクタンパク質、ノイラミニダーゼ、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）、融合タンパク質、又はカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、抗原性ポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ由来のスパイクタンパク質又はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２由来のスパイクタンパク質である。

【0078】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、タンパク質合成に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である。タンパク質合成に関与する酵素の非限定的な例としては、以下の遺伝子のいずれか１つによってコードされるタンパク質などのリボソームタンパク質が挙げられる：ＲＰＳＡ、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４Ｘ、ＲＰＳ４Ｙ、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ １５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２７Ａ、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３ ＲＰＳｌ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７Ａ、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ２５、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ５０、ＲＰＰ０、ＲＰＰ１、ＲＰＰ１。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、シャペロンタンパク質などのタンパク質のフォールディングに関与する。シャペロンタンパク質の非限定的な例としては、Ｈｓｐ７０（ｃｐｎ６０、ＧｒｏＥＬ）、Ｈｓｐ６０（ＤＮＡＫ、ＢｉＰ）、Ｈｓｐ２５、ＨＳＰ９０（Ｃｌｐ）、カルネキシン、カルレティキュリン、ＰＤＩ、ＰＰＩ、α溶菌プロテアーゼ（ａｌｐｈａ－ｌｙｔｉｃ ｐｒｏｔｅａｓｅ）、又はサブチリシンなどの熱ショックタンパク質が挙げられる。

【0079】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、タンパク質修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である。例えば、第１のポリペプチドは、キナーゼ、ホスファターゼ、メチラーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、脂質を付加又は除去する酵素、キャッピング酵素、又はテーリング酵素（ｔａｉｌｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ）であり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、リン酸化、グリコシル化、Ｓ－ニトロシル化、メチル化、ｎ－アセチル化、パルミトイル化、ｎ－ミリストイル化、プレニル化、ＳＵＭＯ化、又はユビキチン化に関与する酵素などの翻訳後修飾に関与する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、リン酸化、メチル化、脂質化、キャッピング、又はテーリングに関与する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、キナーゼ又はホスホリラーゼである。いくつかの実施形態では、酵素は、ＡＭＡＮ１、ＭＧＡＴ／ＧＮＴ１、ＡＭＡＮ ＩＩ、ＭＧＡＴ２／ＧＮＴ ＩＩ、ＭＧＡＴ３／ＧＮＴ ＩＩＩ、ＭＧＡＴ４Ａ／ＧＮＴ ＩＶ、ＭＧＡＴ５／ＧＮＴ Ｖ、ＦＵＴ８、Ｂ４ＧＡＬＴ１、ＳＴ３ＧＡＬ３、ＳＴ３ＧＡＬ１、ＦＵＴ１１、ＸＹＬＴ、ＰＯＭＴ１、ＰＯＭＴ２、ＧＡＬＮＴ１、ＰＯＦＵＴ１、ＸＹＬＴ１、ＨＰＡＴ１、ＨＰＡＴ３、ＧＡＬＴ２、ＳＥＲＧＴ１、又はＲＲＡ１である。

【0080】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である。例えば、第１のポリペプチドは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼなどのポリメラーゼであり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ヘリカーゼであり得る。

【0081】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＤＮＡ又はＲＮＡ修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である。例えば、第１のポリペプチドは、Ｃａｓ９又はＣａｓ１２などのＣａｓ酵素であり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｚｎフィンガーヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＴＡＬＥＮであり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、メガヌクレアーゼであり得る。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、デアミナーゼであり得る。

【0082】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、核酸結合タンパク質（ＮＢＰ）である。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）である。いくつかの実施形態では、核酸結合タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＢＰ）である。ＲＢＰはＲＮＡに結合するが、ＤＢＰはＤＮＡに結合する。実施形態では、ＮＢＰは、ＤＮＡ、マイクロＲＮＡ、キャップ付きＲＮＡ、ＤＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、核内低分子ＲＮＡ、調節ＲＮＡ、リボザイム、転移ＲＮＡ、又はメッセンジャーＲＮＡに結合する。

【0083】

実施形態では、ＮＢＰは、ポリＡテール、二本鎖ＲＮＡ、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）、核酸の正に帯電した天然変性領域（ＩＤＲ）、又はｍＲＮＡキャップに結合する。

【0084】

実施形態では、ＲＢＰは、ＡＵリッチエレメントに結合する。ＡＵリッチエレメントは、本明細書では「ＡＲＥ」と呼ばれる。ＡＲＥは、ｍＲＮＡの５’又は３’非翻訳領域にあるアデニレート－ウリジレートリッチエレメントを指す。ＡＲＥは、コア配列ＡＵＵＵＡ（配列番号Ｘ）を含む。ＡＲＥは、ＲＮＡ安定性の決定因子であり、多くの場合、癌原遺伝子、核転写因子、サイトカインのｍＲＮＡで発生する。ＡＲＥに結合するタンパク質は、ＡＲＥ結合タンパク質（ＡＲＥ－ＢＰ）と呼ばれる。実施形態では、ＡＲＥ－ＢＰは、ｍＲＮＡを安定化させる。ＡＲＥ－ＢＰの非限定的な例としては、ヒト抗原Ｒ（ｈｕＲ、「ＥＬＡＶ」とも呼ばれる）、トリステトラポリン（ｔｒｉｓｔｅｔｒａｐｏｌｉｎ）（ＴＴＰ）、ＡＵリッチエレメントＲＮＡ結合タンパク質（ＡＵＦ）、及び脆弱Ｘ精神遅滞症候群関連タンパク質１（ｆｒａｇｉｌｅ Ｘ ｍｅｎｔａｌ ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ －ｒｅｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １）（ＦＸＲ１）が挙げられる。以下の論文は、ＡＲＥ－ＢＰについて説明しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｏｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，０２ Ｍａｙ ２０１９；Ｂｒｅｎｎａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００１ Ｆｅｂ；５８（２）：２６６－７７；Ｃａｒｂａｌｌｏ ｅｔ ａｌ．１９９８．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８１，１００１－１００５；Ｍａｚａｎ－Ｍａｍｃｚａｒｚ ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ｖｏｌｕｍｅ ２７，ｐａｇｅｓ ６１５１－６１６３（２００８）；Ｖａｓｕｄｅｖａｎ ａｎｄ Ｓｔｅｉｔｚ．Ｃｅｌｌ．２００７ Ｍａｒ ２３；１２８（６）：１１０５－１８；Ｃｕｒｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１９；１９（５）：３８２－３９９；Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１７ Ａｐｒ ２８；２９２（１７）：６８６９－６８８１．ｄｏｉ：１０．１０７４／ｊｂｃ．Ｍ１１６．７７２９４７．Ｅｐｕｂ ２０１７ Ｍａｒ １６；Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ．Ｊｕｌ－Ａｕｇ ２０１４；５（４）：５４９－６４．ｄｏｉ：１０．１００２／ｗｒｎａ．１２３０；及びＥｌｉｆｅ．２０１７ Ａｕｇ ２；６：ｅ２６１２９．ｄｏｉ：１０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．２６１２９；Ｍａｚａｎ－Ｍａｍｃｚａｒｚ ｅｔ ａｌ．２００８．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３７，２０４－２１４。実施形態では、ＮＢＰはＡＲＥに結合する。実施形態では、ＡＲＥに結合するＮＢＰには、ｈｕＲ、ＴＴＰ、ＡＵＦ、又はＦＸＲ１の結合要素が組み込まれる。

【0085】

実施形態では、ＮＢＰは、二本鎖ＲＮＡに結合する。実施形態では、ＮＢＰは、ｄｓＲＮＡ結合タンパク質（ｄｓＲＢＤ）又はその断片を含む。ｄｓＲＢＤは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載されている：Ｂａｎｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ Ｂｉｏｌ．２０１４ Ｏｃｔ；１１（１０）：１２２６－１２３２。

【0086】

実施形態では、ＮＢＰは、キャップ付きｍＲＮＡに結合する。実施形態では、キャップ付きｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＤ（ｅＩＦ３Ｄ）、又はそれらの組み合わせを含む。

【0087】

実施形態では、ＮＢＰは、ＤＮＡ又はＲＮＡの溝に結合する。ＤＮＡ又はＲＮＡの溝に結合する核酸結合タンパク質の非限定的な例としては、ヒト免疫不全ウイルス－１（ＨＩＶ－１）の転写のトランス活性化因子（Ｔａｔ）タンパク質、ＨＩＶ－１のＲＥＶタンパク質、及びＲＳＧ－１．２ペプチドが挙げられる。ＲＳＧ－１．２ペプチドは、ＨＩＶ－１ゲノムのｅｎｖ遺伝子内に存在するＲｅｖ応答エレメントに結合する合成ペプチドである。ＲＳＧ－１．２ペプチドは、以下の論文に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１１；６（８）：ｅ２３３００。

【0088】

実施形態では、ＮＢＰは、ｍＲＮＡに結合する。実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、リボソームタンパク質である。実施形態では、リボソームタンパク質は、７０Ｓリボソーム又は８０Ｓリボソームである。実施形態では、リボソームタンパク質は、８０Ｓリボソームの４０Ｓ又は６０Ｓサブユニットに由来する。実施形態では、リボソームタンパク質は、７０Ｓリボソームの３０Ｓ又は５０Ｓサブユニットに由来する。実施形態では、リボソームタンパク質は、Ｌ３リボソームタンパク質、Ｌ４リボソームタンパク質、Ｌ１３リボソームタンパク質、Ｌ２０リボソームタンパク質、Ｌ２２リボソームタンパク質、Ｌ２４リボソームタンパク質、Ｌ２４ｅリボソームタンパク質、Ｓ１２リボソームタンパク質、Ｓ１４リボソームタンパク質、及び真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）からなる群から選択される。

【0089】

実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、スプライセオソームの一部である。実施形態では、スプライセオソームの一部であるＮＢＰは、スプライシング因子である。実施形態では、スプライシング因子は、ＡＳＦ／ＳＦ２スプライシング因子、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子４（ＳＲｐ７５）、並びにセリン及びアルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）から選択される。

【0090】

実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、Ｐ顆粒に局在するタンパク質である。実施形態では、Ｐ顆粒に局在するタンパク質は、ＬＡＦ－１、ＭＥＧ－１、及びＭＥＧ－３からなる群から選択される。ＬＡＦ－１、ＭＥＧ－１、及びＭＥＧ－３は、以下の参考文献に記載されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｌｅａｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌｕｍｅ １７８，Ｉｓｓｕｅ １，１ Ｊａｎｕａｒｙ ２００８，Ｐａｇｅｓ ２９５－３０６；Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１９ Ｆｅｂ １；３０（３）：３３３－３４５；Ｅｌｂａｕｍ－Ｇａｒｆｉｎｋｌｅ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１５ Ｊｕｎ ９；１１２（２３）：７１８９－９４。

【0091】

実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、ｍＲＮＡの５’キャップを除去するか又はその除去を促進するタンパク質であり、本明細書では「デキャッピングタンパク質（ｄｅｃａｐｐｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ）」と呼ばれる。実施形態では、ｍＲＮＡの５’キャップを除去するか又はその除去を促進するタンパク質は、Ｄｃｐ１、Ｄｃｐ２、又はそれらの組み合わせである。Ｄｃｐ１及びＤｃｐ２は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載されている：Ｖａｌｋｏｖ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ＆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２３，ｐａｇｅｓ ５７４－５７９（２０１６）。

【0092】

実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、プロセシングボディ（ｐボディ）の構成要素である。実施形態では、ｐボディの構成要素は、Ｅｄｃ３、ＤＨＸ９、又はＸｒｎ１である。ｐボディの成分は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載されている：Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２０１８，５７，１７，２４２４－２４３１。

【0093】

実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、ステムループ結合タンパク質（ＳＬＢＰ）である。ＳＬＢＰは、複製依存性ヒストンｍＲＮＡのヒストン３’非翻訳領域（ＵＴＲ）ステムループ構造に結合する。実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰは、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）である。ｈｎＲＮＰは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の参考文献に記載されている：Ｇｅｕｅｎｓ ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅｔ．２０１６；１３５：８５１－８６７。

【0094】

実施形態では、ｍＲＮＡに結合するＮＢＰはＧｒｏＥＬである。

【0095】

実施形態では、ＮＢＰは、インビトロ転写に関与するタンパク質である。インビトロ転写に関与するＮＢＰの非限定的な例としては、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、無機ピロホスファターゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＤＮアーゼＩ、仔ウシ腸ホスファターゼ、南極ホスファターゼ（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニット、グアニン－７－メチルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、グアニリルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、ＲＮＡトリホスファターゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、及びワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１２サブユニットが挙げられる。以下の参考文献は、前述のタンパク質を記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｄｉｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００５；８０：３４９－３７４；Ｓｈｕｍａｎ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．１９８０ Ｄｅｃ １０；２５５（２３）：１１５８８－１１５９８；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９５ Ｊｕｎ；６９（６）：３８５２－３８５６；Ｋｏｂｏｒｉ ｅｔ ａｌ．ＰＮＡＳ Ｎｏｖｅｍｂｅｒ １，１９８４ ８１（２１）６６９１－６６９５。

【0096】

実施形態では、ＮＢＰは、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＤ（ｅＩＦ３Ｄ）、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡＲ１）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡＲ２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｓｐＢ（Ｂｓｃｓｃｐ）、Ｙボックスタンパク質１コールドショックドメイン（ＹＢ１－ＣＳＤ）、Ｆｏｘ－１タンパク質（ＦＯＸ１）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｓｔａｕｆｅｎタンパク質、ＴＩＳ１１ｄ、ジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様タンパク質、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ３）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、テトラトリコペプチド反復１を有するインターフェロン誘導性タンパク質（ＩＦＩＴ１）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、２’－５’－オリゴアデニレートシンテターゼ、オリゴアデニレートシンターゼ様（ＯＡＳＬ）タンパク質（例えば、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、又はＯＡＳＬ）、リボヌクレアーゼＥ（ＲＮＡＳＥ Ｅ）、ガンマインターフェロン誘導性タンパク質Ｉｆｉ－１６（ＩＦ１１６）、及び環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）からなる群から選択される。以下の参考文献は、選択された前述のタンパク質を記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｋｕｒｏｙａｎａｇｉ．Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉ．２００９；６６（２４）：３８９５－３９０７；Ｂａｏｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００９；２００９：６３４５２０；ａｎｄ Ｂｒｉｓｓｅ ａｎｄ Ｌｙ．Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７ Ｊｕｌｙ ２０１９；１０：１５８６；Ｒｅｈｗｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ｖｏｌｕｍｅ ２０，ｐａｇｅｓ５３７－５５１（２０２０）；ａｎｄ Ｂｒｉｓｓｅ ｅｔ ａｌ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１９；１０：１５８６；Ｌｕｏ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１１ Ｏｃｔ １４；１４７（２）：４０９－４２２。

【0097】

実施形態では、ＮＢＰは、１つ又は複数のＲＮＡ結合ドメイン（ＲＢＤ）及び１つ又は複数の天然変性領域（ＩＤＲ）を含む。実施形態では、ＩＤＲは、ＲＧ［Ｇ］反復、ＲＳ／ＲＧリッチドメイン、Ｋ／Ｒパッチ、分子認識機能、低複雑性配列（ｌｏｗ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ペンタトリコペプチドドメイン、又はそれらの組み合わせを含む。

【0098】

実施形態では、ＮＢＰは、以下のドメインのうちの１つ又は複数を含む：短鎖モチーフ（ＳＬｉＭ：ｓｈｏｒｔ ｌｉｎｅａｒ ｍｏｔｉｆ）、ＲＧ反復、ＲＧＧ反復、ＲＳ／ＲＧリッチドメイン、Ｋ／Ｒ塩基性パッチ、分子認識機能、低複雑性配列、ＲＮＡ認識モチーフ、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン、Ｋ相同ドメイン、ジンクフィンガードメイン（例えば、ＣＣＨＨ ＺＦドメイン、ＣＣＣＣ（Ｒａｎ－ＢＰ２）ドメイン、ＣＣＣＨ ＺＦドメイン）、ＲＧＧドメイン、Ｐｕｍｉｌｌｏファミリードメイン、ペンタトリコペプチドドメイン、コールドショックドメイン、ヘリカーゼドメイン、Ｌａモチーフ、Ｐｉｗｉ－Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）ドメイン、ＰＩＷＩ（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）、プソイドウリジンシンターゼ及びＰＵＡ（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）、Ｐｕｍｉｌｌｏ様反復（ＰＵＭ）、リボソームＳ１様（Ｓ１）、Ｓｍ及びＬｉｋｅ－Ｓｍ（Ｓｍ／Ｌｓｍ）反復、チウリジンシンターゼ及びＲＮＡメチラーゼ及びプソイドウリジンシンターゼ（ＴＨＵＭＰ）、及びＹＴ５２１－Ｂ相同性を有するドメイン。以下の参考文献は、これらのドメインの多くを記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｂａｌｃｅｒａｋ ｅｔ ａｌ．Ｏｐｅｎ Ｂｉｏｌ．２０１９ Ｊｕｎ；９（６）１９００９６；Ｊａｒｖｅｌｉｎ ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ Ｃｏｍｍｕｎ Ｓｉｇｎａｌ，２０１６：１４，９；Ｃｏｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０２０ Ａｐｒ ２；７８（１）：９－２９；Ｄｅ Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ：２０１９：９，２４８４；Ｓｈｏｔｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０２０．Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ Ｒｅｖ ＲＮＡ，１１，ｅ１５７３；Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．２０１９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，７５，６６－７５．ｅ５；Ｖａｒａｄｉ ｅｔ ａｌ，２０１５，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，１０，ｅ０１３９７３１；Ｚｅｋｅ ｅｔ ａｌ，２０２０，ＷＩＲＥｓ ＲＮＡ，ｎ／ａ，ｅ１７１４。

【0099】

実施形態では、ＮＢＰは、短鎖モチーフ（ＳＬｉＭ）を含む。ＳＬｉＭは、主にタンパク質ドメインの外側に位置する最大１０個のアミノ酸残基モチーフで構成される。ＳＬｉＭは、低い親和性でＲＮＡに非特異的に結合する。ＳＬｉＭは、多くの場合、タンパク質全体で複数回繰り返される。

【0100】

実施形態では、ＮＢＰは、ＲＳ／ＲＧリッチドメインを含む。ＲＳ／ＲＧリッチドメインは、アルギニン－セリン反復（ＲＳ）、アルギニン－グリシン反復（ＲＧ）、又はそれらの組み合わせを含む。ＲＳ／ＲＧリッチドメインは、ＲＮＡとの特異的又は非特異的相互作用を媒介する。ＲＳ／ＲＧリッチドメインを含むタンパク質の例としては、ＳＲタンパク質及びＳＲ様タンパク質様セリン／アルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）及びＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２３が挙げられる。

【0101】

実施形態では、ＮＢＰは、ＲＧ［Ｇ］反復を含む。ＲＧ［Ｇ］反復は、広範な縮重結合（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ ｂｉｎｄｉｎｇ）を有することが知られている。ＲＧ［Ｇ］反復は、１０個のアミノ酸残基によって分離された、少なくとも３つのＲＧ／ＲＧＧ反復（例えば、３～５００）からなるアルギニン及びグリシンリッチモチーフである。ＲＧ／ＲＧＧモチーフは、異なるアミノ酸のスペーサーが散在する様々な長さのＲＧＧ及び／又はＲＧ反復を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ｄｉ－ＲＧＧモチーフを含む。ｄｉ－ＲＧＧモチーフは、０～４個のアミノ酸によって分離された２つの反復ＲＧＧ配列を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ｄｉ－ＲＧモチーフを含む。ｄｉ－ＲＧモチーフは、０～４個のアミノ酸によって分離された２つの反復ＲＧ配列を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ｔｒｉ－ＲＧＧモチーフを含む。ｔｒｉ－ＲＧＧモチーフは、０～４個のアミノ酸によって分離された３つの反復ＲＧＧ配列を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ｔｒｉ－ＲＧモチーフを含む。ｔｒｉ－ＲＧモチーフは、０～４個のアミノ酸によって分離された３つの反復ＲＧ配列を含む。これらのモチーフは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の論文に記載されている：Ｔｈａｎｄａｐａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１３）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ，５０，６１３－６２３。

【0102】

実施形態では、ＮＢＰのアミノ酸配列は、１つ又は複数のＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、又はＲＧＧＧＲ、又はそれらの組み合わせを含む。実施形態では、ＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、ＲＧＧＧＲ、又はそれらの組み合わせを含むＮＢＰは、アルギニン部分を介してＤＮＡ及びＲＮＡとの水素結合及び塩基スタッキングを媒介する。実施形態では、ＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、ＲＧＧＧＲ、又はそれらの組み合わせを含むＮＢＰは、ＤＮＡ Ｇ四重鎖に結合する。ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、又はＲＧＧＧＲの反復を含む例示的なタンパク質は、ＲＮＡ結合タンパク質ＦＵＳである。実施形態では、ＮＢＰはＦＵＳを含む。実施形態では、ＮＢＰ配列は、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、ＲＧＧＧＲ、又はそれらの組み合わせの連続した反復を含む。ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、又はＲＧＧＧＲ反復の組み合わせを含む例示的なＮＢＰは、配列ＲＧＧＲＧＧＲＧＧＲＲＧＧＲＲＧＧＲＲＧＧＧＲＲＧＧを含み得る。実施形態では、ＮＢＰは、その配列全体に散在する１つ又は複数のＲＧＧ、ＲＧＧＲ、又はＲＧＧＧＲを含み得る。実施形態では、ＮＢＰは、１～１００のＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、又はＲＧＧＧＲ配列を含む。ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、及びＲＧＧＧＲは、配列全体に（１つ又は複数のアミノ酸で分離されて）散在してもよいし、又は連続してもよい。実施形態では、ＮＢＰは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、又は約１００のＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、又はＲＧＧＧＲ反復を含む。ＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、及びＲＧＧＧＲ反復は連続してもよいし、又は配列全体に散在してもよい。以下の論文は、例示的なＲＧＧ配列を記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｓｉｍｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ（２０１９），７５，６６－７５．ｅ５。

【0103】

実施形態では、ＮＢＰは、ＲＧドメインを含む。ＲＧドメインは、約２～約５００のＲＧ（アルギニン－グリシン）反復を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＲＧＧドメインを含む。ＲＧＧドメインは、約２～約５００のＲＧＧ（アルギニン－グリシン－グリシン）反復を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＲＧＧＲドメインを含む。ＲＧＧＲドメインは、約２～約５００のＲＧＧＲ（アルギニン－グリシン－グリシン－アルギニン）反復を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＲＧＧＧＲドメインを含む。ＲＧＧＧＲドメインは、約２～約５００のＲＧＧ（アルギニン－グリシン－グリシン－グリシン－アルギニン）反復を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＲＧ混合ドメインを含む。ＲＧ混合ドメインは、２～５００のＲＧ、ＲＧＧ、ＲＧＧＲ、及び／又はＲＧＧＧＲの同時反復を含む。例えば、ＲＧ混合ドメインは、ＲＧＧ、続いてＲＧ、続いてＲＧＧＲ、続いてＲＧ、続いてＲＧＧＧＲを含み得る。

【0104】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｋ／Ｒ塩基性パッチを含む。Ｋ／Ｒ塩基性パッチは、４～８個の連続したリジン、アルギニン、又はそれらの組み合わせを含む。Ｋ／Ｒ塩基性パッチは、ＲＮＡに結合する強い正の露出した界面を形成する。Ｋ／Ｒ塩基性パッチは、多くの場合、同じタンパク質上の複数のクラスターに含まれる。

【0105】

実施形態では、ＮＢＰは、分子認識機能（ＭｏＲＦ）を含む。実施形態では、ＭｏＲＦは、最大２５アミノ酸長、５０以上のアミノ酸長、又は２５～５０アミノ酸長である。ＭｏＲＦは、リガンド結合時に動的に不規則から規則的に移行する。

【0106】

実施形態では、ＮＢＰは、低複雑性（ＬＣ）配列を含む。実施形態では、ＬＣ配列は、最大１００のアミノ酸を含み、同じアミノ酸又はいくつかのアミノ酸の多数の反復から構成される。ＬＣ配列は、アミロイド様繊維に重合し、ヒドロゲル様状態への可逆的な相転移を受け得る。ＬＣ配列を含むタンパク質の例としては、ＦＵＳ及びｈｎＲＮＰＡ２が挙げられる。

【0107】

実施形態では、ＮＢＰは、ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含む。ＲＲＭは、ＲＮＡに結合する。典型的には、結合は、配列特異的である。実施形態では、ＲＲＭは、約７５～約１２５アミノ酸長、例えば、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、又は約１２５アミノ酸長を有する。実施形態では、ＲＲＭは、約８５のアミノ酸を含む。ＲＲＭは、典型的には、逆平行βシートに対して２つのαヘリックスを形成するβ_１α_１β_２β_３α_２β_４トポロジーを取り、中央のβ_１鎖とβ_３鎖に保存されたＲＮＡ結合ＲＮＰ１及びＲＮＰ２モチーフを収容する。

【0108】

実施形態では、ＮＢＰは、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含む。実施形態では、ｄｓＲＢＤは、約５５～約８０のアミノ酸又は約６５～約７０のアミノ酸を含む。実施形態では、ｄｓＲＢＤは、６８のアミノ酸を含む。ｄｓＲＢＤは、典型的には、αβββα構造を取る。実施形態では、ｄｓＲＢＤは、タンデム反復として、又は他のＲＮＡ結合ドメインとの組み合わせで存在する。ｄｓＲＢＤには、Ｂ型とＡ型の２つのサブクラスが存在する。Ａ型は、ｄｓＲＮＡに対してＢ型よりも良好に結合する。ｄｓＲＢＤは、典型的には、配列特異的ではなく形状依存的に結合する。しかしながら、ＡＤＡＲ２は、配列特異的結合を示すｄｓＲＢＤのまれな例である。

【0109】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｋ相同ドメインを含む。実施形態では、Ｋ相同ドメインは、６０～８０のアミノ酸を含む。実施形態では、Ｋ相同ドメインは、７０のアミノ酸を含む。Ｋ相同ドメインには、Ｉ型又は逆ＩＩ型の２つの型が存在する。Ｉ型Ｋ相同ドメインは、β_１α_１α_２β_２β’α’トポロジーを取る。逆ＩＩ型Ｋ相同ドメインは、α’β’β_１α_１α_２β_２トポロジーを取る。Ｋ相同ドメインは、結合に芳香族アミノ酸を使用せず、代わりに水素結合を使用する。Ｋ相同ドメインを含むＮＢＰは、その厳密な配列特異性により設計が困難である。

【0110】

実施形態では、ＮＢＰは、１つ又は複数のジンクフィンガー（ＺＦ）ドメインを含む。実施形態では、ＮＢＰは、１～１００のＺＦドメイン、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、又は約１００のＺＦドメインを含む。実施形態では、ジンクフィンガードメインは、以下のサブタイプのうちの１つから選択される：ＣＣＨＣ（ジンクナックル（ｚｉｎｃ ｋｎｕｃｋｌｅ））、ＣＣＣＨ、ＣＣＣＣ（ＲａｎＢＰ２）、及びＣＣＨＨ。Ｃ及びＨは、亜鉛原子に配位する、散在したシステイン残基及びヒスチジン残基を指す。実施形態では、ジンクフィンガードメインは、約２０～約４０のアミノ酸、例えば、約２０、約２２、約２４、約２６、約２８、約３０、約３２、約３４、約３６、約３８、又は約４０のアミノ酸を含む。ＣＣＨＨ ＺＦドメインは、２つの保存されたシステイン残基及び２つの保存されたヒスチジン残基を含む。ＣＣＨＨ ＺＦドメインは、構造特異的エレメント及び配列特異的エレメントの両方を認識する。現在までに、ＣＣＨＨ ＺＦドメインのエンジニアリングされたバージョンは存在しない。ＣＣＨＨ ＺＦドメインは、一本鎖及び二本鎖の両方のＤＮＡ及びＲＮＡに結合する。ＣＣＣＣ ＺＦは、結合に特定のＲＮＡ立体構造を必要としない可能性がある。典型的には、ＣＣＣＣ ＺＦは、短い３つのヌクレオチド反復を認識する。ＣＣＣＣ ＺＦのエンジニアリングされたバージョンは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる以下の文献に記載されている：Ｄｅ Ｆｒａｎｃｏ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ：２０１９：９，２４８４。

【0111】

実施形態では、ＮＢＰは、ペンタトリコペプチド反復（ＰＰＲ）を含む。ＰＰＲは、２０～５０のアミノ酸、例えば、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、又は約５０のアミノ酸を含む。実施形態では、ＰＰＲは、約３５のアミノ酸を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＮＢＰ配列内で約２～３０回反復しているＰＰＲを含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＮＢＰ配列内で約１０～３０回反復しているＰＰＲを含む。実施形態では、ＰＰＲは、ＮＢＰ内で約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、約２４回、約２５回、約２６回、約２７回、約２８回、約２９回、又は約３０回反復し得る。実施形態では、ＰＰＲは、少なくとも１０回反復している。ＰＰＲ反復は、連続していてもよいし、又は１つ又は複数のアミノ酸によって分離されていてもよい。ＰＰＲ反復は、２つの逆平行のαヘリックスを形成する。実施形態では、ＰＰＲを含むＮＢＰは、ソレノイド構造を形成する。実施形態では、ＰＰＲを含むＮＢＰは、一本鎖ＲＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、又はｍＲＮＡに結合する。実施形態では、ＰＰＲを含むＮＢＰは、ｍＲＮＡの５’キャップに結合する。実施形態では、ＰＰＲを含むＮＢＰは、ｍＲＮＡの３’ポリＡ尾部に結合する。

【0112】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｐｕｍｉｌｉｏ相同ドメイン（Ｐｕｍｉｌｉｏ様反復とも呼ばれ、「ＰＵＦ」と略される）を含む。ＰＵＦドメインは、凹面のＲＮＡ結合表面を形成する保存された３６のアミノ酸配列の８つのαヘリックス反復を含む。実施形態では、ＮＢＰは、ＰＵＦドメインの１～８つのαヘリックス反復、例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、又は８つのαヘリックス反復を含む。実施形態では、ＰＵＦを含むＮＢＰは、ポリＡ尾部に結合する。実施形態では、ＰＵＦを含むＮＢＰは、ｍＲＮＡに結合する。以下の論文は、ＰＵＦドメインについて記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０１８ Ｍａｙ １８；４６（９）：４７７１－４７８２。実施形態では、ＰＵＦドメインを含むＮＢＰは、ｍＲＮＡの３’非翻訳領域に結合する。

【0113】

実施形態では、ＮＢＰは、コールドショックドメイン（ＣＳＤ）を含む。ＣＳＤは、オリゴ糖／オリゴヌクレオチド結合フォールドとして知られるβバレル構造を形成する５本の逆平行β鎖を含む。ＣＳＤは、一本鎖ＲＮＡ及び一本鎖ＤＮＡに結合する。実施形態では、ＣＳＤは、６０～８０のアミノ酸、例えば、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、又は約８０のアミノ酸から構成される。実施形態では、ＣＳＤは、約７０のアミノ酸を含む。実施形態では、ＣＳＤは、細菌ＣＳＤである。実施形態では、細菌ＣＳＤは、ｓｓＤＮＡをｓｓＲＮＡよりも最大１０倍好む。

【0114】

実施形態では、ＮＢＰは、ヘリカーゼドメインを含む。ヘリカーゼは、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、及びＳＦ６を含む６つのスーパーファミリー（ＳＦ）を含む。実施形態では、ヘリカーゼドメインは、ＳＦ１又はＳＦ２スーパーファミリー由来の真核生物のＲＮＡ及びＤＮＡヘリカーゼである。ＳＦ１及びＳＦ２スーパーファミリー内のファミリーの非限定的な例としては、Ｕｐｆ１様ファミリー、ＤＥＡＤ－ボックスファミリー、ＤＥＡＨファミリー、ＲＩＧ－Ｉ様ファミリー、Ｓｋｉ２様ファミリー、及びＮＳ３ファミリーが挙げられる。実施形態では、ヘリカーゼドメインは、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、又はＳＦ６スーパーファミリー由来の細菌又はウイルスのヘリカーゼである。ＡＴＰがヘリカーゼに結合すると、ＲＮＡに対するヘリカーゼドメインのより高い親和性を促進する。ＡＴＰ加水分解は、ヘリカーゼの基質の巻き戻し及び／又は１つのヌクレオチドの移動を引き起こす立体構造変化を促進する。

【0115】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｌａモチーフを含む。Ｌａモチーフは、修飾された「翼状ヘリックス」フォールディングに対して小さな逆平行のβシートを形成する５つのαヘリックス及び３つのβ鎖からなる。実施形態では、Ｌａモチーフは、ポリメラーゼＩＩＩ転写低分子ＲＮＡ上の３’末端ＵＵＵ－ＯＨエレメントに結合する。Ｌａモチーフは、８０～１００のアミノ酸、例えば、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、又は約１００のアミノ酸を含む。実施形態では、Ｌａモチーフは、約９０のアミノ酸を含む。

【0116】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｐｉｗｉ－Ａｒｇｏｎａｕｔｒｅ－Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）ドメインを含む。実施形態では、ＰＡＺドメインは、低分子干渉ｍＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡガイドのｍＲＮＡ標的への結合を促進する。実施形態では、ＰＡＺドメインは、Ｄｉｃｅｒタンパク質又はＡｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質に由来する。ＰＡＺドメインは、上部に２つのαヘリックスがあり、反対側にはβヘアピン及び短いαヘリックスを含む特殊な付属物が隣接する６本鎖βバレルを示す。

【0117】

実施形態では、ＮＢＰは、ＰＩＷＩ（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）ドメインを含む。実施形態では、ＰＩＷＩドメインは、低分子干渉ｍＲＮＡ及び／又はマイクロＲＮＡガイドのｍＲＮＡ標的への結合を促進する。実施形態では、ＰＩＷＩドメインは、Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質上に見られる。ＰＩＷＩドメインの三次構造は、両面にαヘリックスが隣接した５本鎖βシートからなるＲＮアーゼＨ様フォールディングを形成する。

【0118】

実施形態では、ＮＢＰは、ＰＡＺドメイン及びＰＩＷＩドメインを含む。

【0119】

実施形態では、ＮＢＰは、プソイドウリジンシンターゼ及びＰＵＡ（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）ドメインを含む。ＰＵＡドメインは、６７～９４アミノ酸長の範囲であり、２つのαヘリックスで包まれた擬似バレルを形成するβ_１α_１β_２β_３β_４β_５α_２β_６構造を備える。実施形態では、ＰＵＡを含むＮＢＰは、二本鎖ＲＮＡに結合する。

【0120】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｓ１ ＲＮＡ結合ドメインを含む。実施形態では、Ｓ１ ＲＮＡ結合ドメインを含むＮＢＰは、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、又はｍＲＮＡと相互作用する。実施形態では、Ｓ１ ＲＮＡ結合ドメインは、約６０～約８０のアミノ酸、例えば、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、又は約８０のアミノ酸を含む。実施形態では、Ｓ１ ＲＮＡ結合ドメインは、約７０のアミノ酸を含む。

【0121】

実施形態では、ＮＢＰは、Ｓｍ ＲＮＡ結合モチーフを含む。Ｓｍ ＲＮＡ結合モチーフは、真核生物及び古細菌のＳｍ及びＬｉｋｅ－ｓｍ（Ｌｓｍ）タンパク質、並びに原核生物のＨｆｑタンパク質に見られる。Ｓｍモチーフは、湾曲した逆平行βシートを形成するα_１β_１β_２β_３β_４β_５トポロジーを有する約７０の残基からなる。Ｓｍ含有タンパク質は、２つのＳｍモチーフの鎖β_４と鎖β_５との間の相互作用を介して容易に多量体化する。実施形態では、ＮＢＰは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のＳｍモチーフを含む。実施形態では、ＮＢＰは、２つのＳｍモチーフを含む。実施形態では、Ｓｍ結合モチーフは、水素結合及び塩基スタッキング相互作用を介してＲＮＡに結合する。

【0122】

実施形態では、ＮＢＰは、チオウリジンシンターゼ及びＲＮＡメチラーゼ及びプソイドウリジンシンターゼ（ＴＨＵＭＰ）ドメインを含む。ＴＨＵＭＰドメインは、多くのｔＲＮＡ修飾酵素に見られる。ＴＨＵＭＰドメインは、ＲＮＡ修飾ドメインの近傍に見られ、場合によっては、Ｎ末端フェレドキシン様ドメインの近傍に見られる。ＴＨＵＭＰドメインは、βシートに隣接する平行なαヘリックスを形成するα_１α_２β_１α_３β_２β_２トポロジーを示す。実施形態では、ＴＨＵＭＰドメインを含むＮＢＰは、ｔＲＮＡに結合する。

【0123】

実施形態では、ＮＢＰは、ＹＴ５２１－Ｂ相同ドメインを含む。実施形態では、ＹＴ５２１－Ｂ相同ドメインは、１００～１５０のアミノ酸、例えば、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、又は約１５０のアミノ酸を含む。実施形態では、ＹＴ５２１－Ｂ相同ドメインを含むＮＢＰは、メチル化アデノシンに結合する。

【0124】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、分化クラスター４（ＣＤ４）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＺドメイン（ＳｐＡ Ｚドメイン）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＤ）、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、又はそれらの断片若しくは誘導体から選択される。

【0125】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の第１のポリペプチドは、分化クラスター４（ＣＤ４）又はその断片若しくは誘導体を含む。ＣＤ４は、レンチウイルス粒子、レトロウイルス粒子、及びヒト免疫不全ウイルスの糖タンパク質１２０（ｇｐ１２０）に結合する。

【0126】

ＣＤ４（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１７３０を参照）は、Ｔヘルパー細胞、単球、マクロファージ、及び樹状細胞などの免疫細胞の表面に見られる糖タンパク質である。ヒト由来のＣＤ４のアミノ酸配列は、

【化1】

である。

【0127】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号７８のアミノ酸配列を有し、且つアミノ酸１１２、１１３、１１６、及び１１７のグリシン、アラニン、リジン、アルギニン、ヒスチジンへの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの突然変異を有するＣＤ４を含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＣＤ４の細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号７９のアミノ酸配列を有するＣＤ４の細胞外ドメインを含む。

【0129】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号８０のアミノ酸配列を有するＣＤ４の細胞外ドメインの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号８１のアミノ酸配列を有するＣＤ４のドメイン１を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、アミノ酸８８、８９、９２、及び９３のグリシン、アラニン、リジン、アルギニン、又はヒスチジンへの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、又は少なくとも４つの突然変異を有するＣＤ４の細胞外ドメイン又はその断片若しくは誘導体（配列番号７９～８１）を含む。

【0130】

いくつかの実施形態では、ＣＤ４又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号７８～８１のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ４又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号７８～８１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ４又はその断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号７８～８１のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0131】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、プロテインＡ又はその誘導体若しくは断片を含む。プロテインＡ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ７０ＡＢ８を参照）は、ほとんどの免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する。いくつかの実施形態では、プロテインＡは、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ）プロテインＡである。プロテインＡのアミノ酸配列は、

【化2】

である。

【0132】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ａ１１７Ｇの変異を有する配列番号１３６のアミノ酸配列を有するプロテインＡを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１３７のアミノ酸配列を有する、プロテインＡのＢドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ａ２Ｇのアミノ酸突然変異を有する配列番号１３７のアミノ酸配列を有する、プロテインＡのＢドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１３８のアミノ酸配列を有する、プロテインＡのＣドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１８０のアミノ酸配列を有する、プロテインＡのＺドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。

【0133】

いくつかの実施形態では、プロテインＧ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１３６～１３８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチド又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１３６～１３８のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0134】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、プロテインＧ又はその誘導体若しくは断片を含む。プロテインＧ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１９９０９を参照）は、ほとんどの免疫グロブリンのＦｃ領域に結合する。プロテインＧのアミノ酸配列は：

【化3】

である。

【0135】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１５５のアミノ酸配列を有するプロテインＧのＧドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１５６のアミノ酸配列を有するプロテインＧの断片を含む。

【0136】

いくつかの実施形態では、プロテインＧ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１５４～１５６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチド又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１５４～１５６のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0137】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、カッパ軽鎖に結合する。いくつかの実施形態では、カッパ軽鎖は、抗体又はそのモノクローナル抗体の抗原結合部分の一部である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、プロテインＬを含む。プロテインＬは、カッパ軽鎖との相互作用を介して抗体又はその抗体結合断片に結合する。プロテインＬのアミノ酸配列は：

【化4】

である。

【0138】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１４０のアミノ酸配列を有するプロテインＬの断片を含む。

【0139】

いくつかの実施形態では、プロテインＬ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１３９～１４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチド又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１３９又は１４０に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される精製マトリックスの第１のポリペプチドは、ＬＤＬＲ又はその断片若しくは誘導体を含む。低密度リポタンパク質受容体ＬＤＬＲ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０１１３０を参照）は、コレステロールリッチ低密度リポタンパク質のエンドサイトーシスを媒介する細胞表面受容体である。ヒト由来のＬＤＬＲのアミノ酸配列は、

【化5】

である。

【0141】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１２７のアミノ酸配列を有するＬＤＬＲの細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１３０のアミノ酸配列を有するＬＤＬＲの細胞外ドメインの断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１２８のアミノ酸配列を有するＬＤＬＲのＣＲ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１２９のアミノ酸配列を有するＬＤＬＲのＣＲ３ドメインを含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、ＬＤＬＲ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２６～１２９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＤＬＲ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１２６～１２９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＬＤＬＲ又はその断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２６～１２９のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、アルブミン又はその誘導体若しくは融合体に結合する。いくつかの実施形態では、アルブミンは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又はオボアルブミンである。いくつかの実施形態では、アルブミンに結合する第１のポリペプチドは、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＰ）又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチドは、配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチド又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ポリペプチド又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１３５に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）又はその断片若しくは誘導体である。コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ７８３１０を参照）は、心臓、脳上皮、及び内皮細胞上で発現され、アデノウイルスカプシドの線維タンパク質に結合する。ヒト由来のコクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアミノ酸配列は：

【化6】

である。

【0145】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される精製マトリックスの第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体又はその断片若しくは誘導体を含む。

【0146】

いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体又はその断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１１７～１２５、２４、及び２５のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体又はその断片を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１１７～１２５、２４、及び２５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体又はその断片を含む第１のポリペプチドは、配列番号１１７～１２５、２４、及び２５のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体の細胞外ドメイン又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体の細胞外ドメインを含む第１のポリペプチドは、配列番号１１８又は１１９のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体又はその断片のドメイン１を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のドメイン１を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２０のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のドメイン２又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のドメイン２を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２１のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム３又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム３を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２２のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム４又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム４を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２３のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム５又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム５を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２４のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム７又はその断片を含む。いくつかの実施形態では、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体のアイソフォーム７を含む第１のポリペプチドは、配列番号１２５のアミノ酸配列を有する。

【0148】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｍ（ＲＡＩＶＦＲＶＱＷＬＲＲＹＦＶＮＧＳＲＳＧＧＧ）_ｎのアミノ酸配列を含み、式中、ｎは、１～８の整数であり（配列番号２４）、例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、又は８である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、（ＲＡＩＶＦＲＶＱＷＬＲＲＹＦＶＮＧＳＲＳＧＧＧ）_ｎのアミノ酸配列を含み、式中、ｎは、１～８の整数であり（配列番号２５）、例えば、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、又は８である。

【0149】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ｍＲＮＡ分解活性化因子タンパク質（ｍＲＮＡ ｄｅｃａｙ ａｃｔｉｖａｔｏｒ ｐｒｏｔｅｉｎ）ＺＦＰ３６Ｌ２（Ｔｉｓ１１ｄ）又はその断片若しくは誘導体を含む。Ｔｉｓ１１ｄ Ｇ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ４７９７４を参照）は、アデノシン及びウリジンリッチエレメント（ＡＲＥ）に結合する。Ｔｉｓ１１ｄのアミノ酸配列は：

【化7】

である。前述の配列又は本明細書に記載の他の配列における括弧で囲まれたメチオニン（Ｍ）は、開始メチオニンである。開始剤メチオニンの存在は任意である。

【0150】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＴｉｓ１１ｄ断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＴｉｓ１１ｄのＲＮＡ結合ドメインを含む。

【0151】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｅ１９５Ｄ、Ｅ１９５Ｈ、Ｅ１９５Ｇ、Ｅ１９５Ａ、Ｅ１９５Ｒ、及びＥ１９５Ｋから選択される少なくとも１つの突然変異を有する配列番号１６９のアミノ酸配列を有するＴｉｓ１１ｄを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｅ４６Ｄ、Ｅ４６Ｈ、Ｅ４６Ｇ、Ｅ４６Ａ、Ｅ４６Ｒ、及びＥ４６Ｋの少なくとも１つから選択される突然変異を有する配列番号１７０のアミノ酸配列を有するＴｉｓ１１ｄ断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｅ２７Ｄ、Ｅ２７Ｈ、Ｅ２７Ｇ、Ｅ２７Ａ、Ｅ２７Ｒ、及びＥ２７Ｋから選択される少なくとも１つの突然変異を有する配列番号１７１のアミノ酸配列を有するＴｉｓ１１ｄのＲＮＡ結合ドメインを含む。

【0152】

いくつかの実施形態では、Ｔｉｓ１１ｄ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１６９～１７１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｉｓ１１ｄ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１６９～１７１のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0153】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）又はその断片若しくは誘導体を含む。ｅＩＦ４Ｅ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０６７３０を参照）は、ｍＲＮＡキャップに結合する。ｅＩＦ４Ｅのアミノ酸配列は：

【化8】

である。

【0154】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７３のアミノ酸配列を有するｅＩＦ４Ｅ断片を含む。

【0155】

いくつかの実施形態では、ｅＩＦ４Ｅ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１７２又は１７３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｅＩＦ４Ｅ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１７２又は１７３のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）又はその断片若しくは誘導体を含む。ＰＡＢＰ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ１１９４０を参照）は、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）尾部に結合する。ＰＡＢＰのアミノ酸配列は：

【化9】

である。

【0157】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７５のアミノ酸配列を有するＰＡＢＰ断片を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７６のアミノ酸配列を有するＰＡＢＰのＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）１ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７７のアミノ酸配列を有するＰＡＢＰのＲＲＭ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７８のアミノ酸配列を有するＰＡＢＰのＲＲＭ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１７９のアミノ酸配列を有するＰＡＢＰのＲＲＭ４ドメインを含む。

【0158】

いくつかの実施形態では、ＰＡＢＰ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１７４～１７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＢＰ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１７４～１７９のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）又はその断片若しくは誘導体を含む。ＺＢＰ１（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ９Ｈ１７１を参照）は、二本鎖ＤＮＡに結合する。ＺＢＰ１のアミノ酸配列は：

【化10】

である。

【0160】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１８２のアミノ酸配列を有するＺＢＰ１のＺ結合ドメイン１を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号１８３のアミノ酸配列を有するＺＢＰ１のＺ結合ドメイン２を含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、ＺＢＰ１又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１８１～１８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＺＢＰ１又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１８１～１８３のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＰＵＭ－ＨＤドメイン含有タンパク質（ＰＵＭ－ＨＤ）又はその断片若しくは誘導体を含む。ＰＵＭ－ＨＤ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｂ２ＢＸＸ４を参照）は、ｍＲＮＡに結合する。ＰＵＭ－ＨＤのアミノ酸配列は：

【化11】

である。

【0163】

いくつかの実施形態では、ＰＵＭ－ＨＤ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号１８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＵＭ－ＨＤ又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号１８４に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0164】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、フィブロネクチン（ＦＮ）である。いくつかの実施形態では、フィブロネクチンは、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）反復である。ＦＮ３反復は、フィブロネクチンのサブドメインの中で最大であり、且つ最も一般的である。ＦＮ３反復に相同なドメインは、他の細胞外マトリックス分子、細胞表面受容体、酵素、及び筋肉タンパク質を含む様々な動物タンパク質ファミリーで見つかっている。ＦＮ３ドメインは、４本の鎖を含む１つのベータシート及び３本の鎖を含むもう１つのシートを備える、保存されたベータサンドイッチフォールド（ｂｅｔａ ｓａｎｄｗｉｃｈ ｆｏｌｄ）を有する。例示的なフィブロネクチンのアミノ酸配列（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ０２７５１を参照）は：

【化12】

【化13】

である。

【0165】

いくつかの実施形態では、フィブロネクチン又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号２６のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、フィブロネクチン又はその断片若しくは誘導体を含む第１のポリペプチドは、配列番号２６に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。

【0166】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、アデノ随伴ウイルス受容体（ＡＡＶＲ）又はその断片若しくは誘導体である。ＫＩＡＡ０３１９Ｌとも呼ばれるＡＡＶＲ（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｑ８ＩＺＡ０を参照）は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９を含む複数のＡＡＶ血清型のカプシドに結合する１５０ｋＤａの糖タンパク質である。以下の参考文献は、ＡＡＶＲについて記載しており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる：Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１９ Ａｐｒ；４（４）：６７５－６８２；Ｐｉｌｌａｙ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１６ Ｆｅｂ ４；５３０（７５８８）：１０８－１２；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．２０１９ Ａｕｇ ２１；１０（１）：３７６０；Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１６ Ａｐｒ；２４（４）：６６３－６。

【0167】

ＡＡＶＲの細胞外ドメインは、８つのシステイン（ＭＡＮＥＣ）を有するＮ末端のモチーフ、及び多発性嚢胞腎（ＰＫＤ）ドメインとして知られる５つの免疫グロブリンドメインを含む。ＡＡＶ粒子は、ＰＫＤドメインに結合して形質導入を促進する。従って、いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ断片又はその誘導体は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つのＰＫＤドメイン又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、ヒトＡＡＶＲ（配列番号３５）、マウスＡＡＶＲ（配列番号３６）、又はオランウータンＡＡＶＲ（配列番号４２）、又はそれらの断片若しくは誘導体である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、配列番号３５、３６、又は４２のいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、又は少なくとも９９％の同一性を有する配列を含む。別段の指示がない限り、配列同一性は、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉで入手可能な全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢＬＡＳＴ（登録商標）（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）を使用して決定される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、比較される配列の全長にわたって計算される。いくつかの実施形態では、配列同一性は、比較される各配列の２０アミノ酸断片、５０アミノ酸断片、７５アミノ酸断片、１００アミノ酸断片、２５０アミノ酸断片、５００アミノ酸断片、７５０アミノ酸断片、又は１０００アミノ酸断片にわたって計算される。

【0168】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ断片又はその誘導体は、ＡＡＶＲの細胞外ドメイン又はその断片又は誘導体を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、配列番号３３又は配列番号３４のアミノ酸配列、又はそれらと少なくとも約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％同一である配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、又はそれ以上のアミノ酸突然変異を有する配列番号３３又は配列番号３４の配列を含む。

【0169】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数のＰＫＤ、例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のＰＫＤを含む。いくつかの実施形態では、ＰＫＤは、表３に列挙されるＰＫＤからそれぞれ個別に選択される。例えば、いくつかの実施形態では、ＰＫＤは、配列番号２８～３２、３７～４１、及び４３～４７からそれぞれ個別に選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、複数のＰＫＤを含み、ＰＫＤは、リンカーによって互いに接続されている。リンカーの非限定的な例は、本開示全体にわたって記載される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、複数のＰＫＤドメインを含み、各ＰＫＤドメインは、同じ又は実質的に同じ配列を有する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、複数のＰＫＤドメインを含み、各ＰＫＤは、異なる配列を有する。

【0170】

【表4】

【0171】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、多発性嚢胞腎１（ＰＫＤ１）ドメイン、多発性嚢胞腎２（ＰＫＤ２）ドメイン、多発性嚢胞腎３（ＰＫＤ３）ドメイン、多発性嚢胞腎４（ＰＫＤ４）ドメイン、多発性嚢胞腎５（ＰＫＤ５）ドメイン、又はそれらの組み合わせを含む。

【0172】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ１及びＰＫＤ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号９２のアミノ酸配列を有するＰＫＤ１及びＰＫＤ２ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ１及びＰＫＤ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ１及びＰＫＤ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ１及びＰＫＤ５ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ２及びＰＫＤ３ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ２及びＰＫＤ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ２及びＰＫＤ５ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ３及びＰＫＤ４ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ３及びＰＫＤ５ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＰＫＤ４及びＰＫＤ５ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、３つのＰＫＤドメインを含み、各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立して選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、４つのＰＫＤドメインを含み、各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立して選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、５つのＰＫＤドメインを含み、各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立して選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、６つ以上のＰＫＤドメインを含み、各ＰＫＤドメインは、ＰＫＤ１～５のいずれか１つから独立して選択される。

【0173】

前の段落の実施形態のいずれにおいても、ＰＫＤドメインのそれぞれは、野生型又は突然変異型ＰＫＤドメインから独立して選択され得る。いくつかの実施形態では、各ＰＫＤは、野生型ＰＫＤに対して少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は少なくとも１００％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、野生型ＰＫＤに対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数のＰＫＤを使用してＡＡＶに結合する。

【0174】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、野生型ＡＡＶＲ又はそのＰＫＤと比較して、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約６つ、少なくとも約７つ、少なくとも約８つ、少なくとも約９つ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５のアミノ酸突然変異を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、野生型ＡＡＶＲ又はそのＰＫＤと比較して、最大約２５以上のアミノ酸突然変異を含む。例えば、ＡＡＶ結合ポリペプチドは、野生型ＡＡＶＲと比較して、約２５～３５、約３５～４５、約４５～５５，約５５～６５、又は約６５～７５のアミノ酸突然変異を含み得る。

【0175】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、野生型ＡＡＶＲ又はそのＰＫＤと比較して、少なくとも約１つ、少なくとも約２つ、少なくとも約３つ、少なくとも約４つ、少なくとも約５つ、少なくとも約６つ、少なくとも約７つ、少なくとも約８つ、少なくとも約９つ、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５のアミノ酸突然変異を含み、各突然変異は、天然アミノ酸残基のヒスチジンへの変化を含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２９の配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２９の配列を含み、少なくとも１つのアミノ酸（即ち、非ヒスチジンアミノ酸）がヒスチジンに突然変異している。

【0177】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異を有する配列番号３５を含む。いくつかの実施形態では、各突然変異は、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から個別に選択される。

【0178】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異を有する配列番号３５のアミノ酸４１１～４９９を含み、各突然変異は、Ｖ４４０Ｈ、Ｓ４３１Ｈ、Ｑ４３２Ｈ、Ｔ４３４Ｈ、Ｙ４４２Ｈ、Ｉ４６２Ｈ、Ｄ４３５Ｈ、Ｄ４３６Ｈ、Ｋ４３８Ｈ、及びＩ４３９Ｈからなる群から個別に選択される。

【0179】

いくつかの実施形態では、配列番号３５のアミノ酸配列を有するＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、表４の突然変異の組み合わせのうちの１つ又は複数を有する。表４の各行は、突然変異の組み合わせを表す。

【0180】

【表5】

【0181】

【表6】

【0182】

【表7】

【0183】

【表8】

【0184】

【表9】

【0185】

【表10】

【0186】

【表11】

【0187】

【表12】

【0188】

【表13】

【0189】

【表14】

【0190】

【表15】

【0191】

【表16】

【0192】

【表17】

【0193】

【表18】

【0194】

【表19】

【0195】

【表20】

【0196】

【表21】

【0197】

【表22】

【0198】

【表23】

【0199】

【表24】

【0200】

【表25】

【0201】

【表26】

【0202】

【表27】

【0203】

【表28】

【0204】

【表29】

【0205】

【表30】

【0206】

【表31】

【0207】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異を有する配列番号２９を含み、各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｖ３２Ｈ及びＶ３４Ｈ突然変異を有する配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｓ２３Ｈ及びＱ２４Ｈ突然変異を有する配列番号２９を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異を有する配列番号２９を含み、各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号７６～８６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0208】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２９、Ｎ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号５２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異（各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される）を有する配列番号２９、及びＮ末端におけるＧＮＲＰＰのアミノ酸配列（配列番号８９）を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端にＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異を有する配列番号５２を含み、各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される。

【0209】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号９３～１１６のいずれか１つの核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｖ３２Ｈ及びＶ３４Ｈ突然変異を有する配列番号２９、Ｎ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｓ２３Ｈ及びＱ２４Ｈ突然変異を有する配列番号２９、及びＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異（各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される）を有する配列番号２９、及びＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有するＮ末端の追加の５つのアミノ酸、及びＶＤＹＰＧ（配列番号９０）のアミノ酸配列を有するＣ末端の追加の５つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号５３～６３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２９のアミノ酸配列に加えて、Ｎ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異（各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される）を有する配列番号２９、及びＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２９に加えて、Ｖ３２Ｈ及びＶ３４Ｈ突然変異、及びＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｓ２３Ｈ及びＱ２４Ｈ突然変異を有する配列番号２９、及びＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、又は少なくとも５つの突然変異（各突然変異は、Ｓ２３Ｈ、Ｑ２４Ｈ、Ｔ２６Ｈ、Ｄ２９Ｈ、Ｋ３０Ｈ、Ｉ３１Ｈ、Ｖ３２Ｈ、Ｙ３４Ｈ、及びＩ５４Ｈからなる群から個別に選択される）を有する配列番号２９のアミノ酸配列、及びＮ末端におけるＧＮＲＰＰ（配列番号８９）のアミノ酸配列を有する追加の５つのアミノ酸、及びＣ末端におけるＶＤＹＰ（配列番号９１）のアミノ酸配列を有する追加の４つのアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号６５～７５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0211】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数のＭＡＮＥＣモチーフ（例えば、配列番号４９～５１を参照）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数の組換えＭＡＮＥＣモチーフを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、野生型ＭＡＮＥＣモチーフに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５、又は少なくとも約９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号４９～５１のいずれか１つに対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％の同一性を有するＭＡＮＥＣモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数のＭＡＮＥＣモチーフを介してＡＡＶ粒子に結合する。

【0212】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｎ末端メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端メチオニンは、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体の翻訳を開始する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｎ末端メチオニンを欠いている。

【0213】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、以下の血清型のＡＡＶ粒子に結合する：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、及び／又はＡＡＶｒｈ７４。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、以下の血清型のうちの１つ又は複数のＡＡＶ粒子に結合する：ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、及びＡＡＶ９。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ１粒子に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ２粒子に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ３Ｂ粒子に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ５粒子に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ６粒子に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ８粒子に結合する。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、ＡＡＶ９粒子に結合する。

【0214】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、ヒトＡＡＶＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、霊長類ＡＡＶＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、野生型ＡＡＶＲである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、突然変異ＡＡＶＲである。

【0215】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲは、糖タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数のグリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｏ結合型グリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、Ｎ結合型グリコシル化部位を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、１つ又は複数のアスパラギン残基及び／又はグルタミン残基でグリコシル化される。

【0216】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、約１～約１００のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質内のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体の数は、約１つ、約５つ、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、又は約１００である。いくつかの実施形態では、相挙動を有する単一の第２のポリペプチドは、複数のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体、例えば約１～１００のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体に結合され得る。

【0217】

いくつかの実施形態では、ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２８～３４、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６のいずれか１つの配列を含む。相挙動を有する単一のポリペプチドが複数のＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体に結合されるいくつかの実施形態では、各ＡＡＶＲ又はその断片若しくは誘導体は、配列番号２８～３４、３７～４１、４３～４７、及び５２～８６から独立して選択され得る。

【0218】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から単離されるか又はそれに由来するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から単離されるか又はそれに由来するポリペプチドは、スパイクタンパク質、膜タンパク質、エンベロープタンパク質、又はヌクレオカプシドタンパク質である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はその断片若しくは誘導体である。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質（例えば、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ０ＤＴＣ２を参照）は、ヒトアンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）を介して、宿主の細胞膜へのビリオンの融合を媒介する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質の例示的な配列は：

【化14】

である。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、配列番号２７のアミノ酸配列又は配列番号２７と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、若しくは約９９％同一のアミノ酸配列を有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ Ｓタンパク質である。

【0219】

第２のポリペプチド
いくつかの実施形態では、本開示は、相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質を提供する。

【0220】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、レジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）である。レジリン様ポリペプチドは、望ましい弾性、圧縮弾性率、引張弾性率、せん断弾性率、破断までの伸長、最大引張強さ、硬度、反発、及び圧縮永久歪みを含む機械的特性を有する弾性ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレジリン様ポリペプチドは、１つ又は複数の反復を含むポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマー反復は、配列番号１～９のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を有し得る。

【0221】

いくつかの実施形態では、レジリン様ポリペプチドは、２種類以上の反復、例えば、配列番号１の反復及び配列番号３の反復を含む。

【0222】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のレジリン様ポリペプチドは、所与のＲＬＰ内で最大５００回現れる反復を含む。いくつかの実施形態では、反復は、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約２０回、約３０回、約４０回、約５０回、約６０回、約７０回、約８０回、約９０回、約１００回、約１１０回、約１２０回、約１３０回、約１４０回、約１５０回、約１６０回、約１７０回、約１８０回、約１９０回、約２００回、約２１０回、約２２０回、約２３０回、約２４０回、約２５０回、約２６０回、約２７０回、約２８０回、約２９０回、約３００回、約３１０回、約３２０回、約３３０回、約３４０回、約３５０回、約３６０回、約３７０回、約３８０回、約３９０回、約４００回、約４５０回、又は約５００回現れる。

【0223】

いくつかの実施形態では、ＲＬＰは、１つ又は複数の部分反復を含む。いくつかの実施形態では、部分反復の長さは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＲＬＰは、反復の一部ではない、ＲＬＰのＮ末端又はＣ末端に１つ又は複数の追加のアミノ酸を含む。

【0224】

いくつかの実施形態では、１つ又は複数のＲＬＰ反復は、スクランブルされている、即ち、それらは異なるアミノ酸配列を含むが、同じアミノ酸組成を保持している。例えば、反復は、配列番号８とは異なるアミノ酸配列を有し得るが、同じアミノ酸組成を保持し得る。

【0225】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、エラスチン様ポリペプチドである。エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）は、トロポエラスチンに由来する生体高分子である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のエラスチン様ポリペプチドは、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）_ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチド反復を含むポリマーであり、式中のＸａａは、本明細書で定義される。

【0226】

いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００（それらの間のすべての値及び範囲を含む）である。

【0227】

いくつかの実施形態では、ペンタペプチド反復は、スクランブルされており、例えば、異なるアミノ酸配列を含むが、同じアミノ酸組成を維持している。例えば、ＥＬＰは、配列番号１０とは異なるアミノ酸配列を含み得るが、同じアミノ酸組成を維持する、例えば、配列の４０％がグリシンであり、配列の２０％がＸａａ（例えば、プロリンを除く任意のアミノ酸）であり、配列の２０％がプロリンであり、配列の２０％がバリンである。

【0228】

いくつかの実施形態では、ＥＬＰは、１つ又は複数の部分反復を含む。いくつかの実施形態では、部分反復の長さは、１つ、２つ、３つ、又は４つのアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＥＬＰは、ＥＬＰのＮ末端又はＣ末端に、反復の一部ではない１つ又は複数の追加のアミノ酸を含む。

【0229】

いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰは、３０～約１５０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰは、約５０～約１００のアミノ酸を含む。実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰは、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約５１、約５２、約５３、約５４、約５５、約５６、約５７、約５８、約５９、約６０、約６１、約６２、約６３、約６４、約６５、約６６、約６７、約６８、約６９、約７０、約７１、約７２、約７３、約７４、約７５、約７６、約７７、約７８、約７９、約８０、約８１、約８２、約８３、約８４、約８５、約８６、約８７、約８８、約８９、約９０、約９１、約９２、約９３、約９４、約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０１、約１０２、約１０３、約１０４、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、約１１０、約１１１、約１１２、約１１３、約１１４、約１１５、約１１６、約１１７、約１１８、約１１９、約１２０、約１２１、約１２２、約１２３、約１２４、約１２５、約１２６、約１２７、約１２８、約１２９、約１３０、約１３１、約１３２、約１３３、約１３４、約１３５、約１３６、約１３７、約１３８、約１３９、約１４０、約１４１、約１４２、約１４３、約１４４、約１４５、約１４６、約１４７、約１４８、約１４９、又は約１５０のアミノ酸を含む。実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰは、少なくとも約３０、少なくとも約３１、少なくとも約３２、少なくとも約３３、少なくとも約３４、少なくとも約３５、少なくとも約３６、少なくとも約３７、少なくとも約３８、少なくとも約３９、少なくとも約４０、少なくとも約４１、少なくとも約４２、少なくとも約４３、少なくとも約４４、少なくとも約４５、少なくとも約４６、少なくとも約４７、少なくとも約４８、少なくとも約４９、少なくとも約５０、少なくとも約５１、少なくとも約５２、少なくとも約５３、少なくとも約５４、少なくとも約５５、少なくとも約５６、少なくとも約５７、少なくとも約５８、少なくとも約５９、少なくとも約６０、少なくとも約６１、少なくとも約６２、少なくとも約６３、少なくとも約６４、少なくとも約６５、少なくとも約６６、少なくとも約６７、少なくとも約６８、少なくとも約６９、少なくとも約７０、少なくとも約７１、少なくとも約７２、少なくとも約７３、少なくとも約７４、少なくとも約７５、少なくとも約７６、少なくとも約７７、少なくとも約７８、少なくとも約７９、少なくとも約８０、少なくとも約８１、少なくとも約８２、少なくとも約８３、少なくとも約８４、少なくとも約８５、少なくとも約８６、少なくとも約８７、少なくとも約８８、少なくとも約８９、少なくとも約９０、少なくとも約９１、少なくとも約９２、少なくとも約９３、少なくとも約９４、少なくとも約９５、少なくとも約９６、少なくとも約９７、少なくとも約９８、少なくとも約９９、少なくとも約１００、少なくとも約１０１、少なくとも約１０２、少なくとも約１０３、少なくとも約１０４、少なくとも約１０５、少なくとも約１０６、少なくとも約１０７、少なくとも約１０８、少なくとも約１０９、少なくとも約１１０、少なくとも約１１１、少なくとも約１１２、少なくとも約１１３、少なくとも約１１４、少なくとも約１１５、少なくとも約１１６、少なくとも約１１７、少なくとも約１１８、少なくとも約１１９、少なくとも約１２０、少なくとも約１２１、少なくとも約１２２、少なくとも約１２３、少なくとも約１２４、少なくとも約１２５、少なくとも約１２６、少なくとも約１２７、少なくとも約１２８、少なくとも約１２９、少なくとも約１３０、少なくとも約１３１、少なくとも約１３２、少なくとも約１３３、少なくとも約１３４、少なくとも約１３５、少なくとも約１３６、少なくとも約１３７、少なくとも約１３８、少なくとも約１３９、少なくとも約１４０、少なくとも約１４１、少なくとも約１４２、少なくとも約１４３、少なくとも約１４４、少なくとも約１４５、少なくとも約１４６、少なくとも約１４７、少なくとも約１４８、少なくとも約１４９、又は少なくとも約１５０のアミノ酸を含む。実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、本明細書に記載のＥＬＰ又はＲＬＰの任意の３０～１５０のアミノ酸の断片又は任意の５０～１００のアミノ酸の断片を含み得る。

【0230】

ＥＬＰ及びＲＬＰは、環境因子に応答して相転移する。ＥＬＰ及びＲＬＰは、１つ又は複数のポリペプチド（１つ又は複数のＡＡＶ結合ポリペプチドなど）と結合した場合、又は１つ又は複数の他のポリペプチド（１つ又は複数のＡＡＶ結合ポリペプチドなど）との融合タンパク質として発現した場合、相転移する能力を保持する。ＥＬＰ及びＲＬＰのようなポリマーは、曇点温度（Ｔ_ｃ）とも呼ばれる転移温度（Ｔ_ｔ）を示す。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及びＲＬＰは、Ｔ_ｔで可溶相から不溶相への可逆的に相転移する。加熱又は塩濃度の増加により可溶相から不溶相に転移するＥＬＰは、下限臨界溶液温度（ＬＣＳＴ）と呼ばれるＴ_ｔを有する。冷却又は塩濃度の低下により可溶相から不溶相に転移するＲＬＰは、下限臨界溶液温度（ＵＣＳＴ）と呼ばれるＴ_ｔを有する。いくつかの実施形態では、相転移は、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰの二次構造の変化によって生じる。例えば、ＥＬＰの相転移は、ランダムコイル（Ｔ_ｔ未満）からＩＩ型βターンへの二次構造の変化によって生じる。いくつかの実施形態では、二次構造の変化は、円偏光二色性分光偏光分析（ｃｉｒｃｕｌａｒ ｄｉｃｈｒｏｉｓｍ ｓｐｅｃｔｒｏｐｏｌａｒｉｍｅｔｒｙ）、小角Ｘ線散乱、紫外可視分光光度法、静的光散乱、動的光散乱、核磁気共鳴分光法、固体核磁気共鳴分光法、赤外分光法、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、小角中性子散乱、顕微鏡法、及び低温電子顕微鏡法から選択される方法によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、ＥＬＰの相転移は、二次構造の変化に起因しない。

【0231】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及びＥＬＰは、約０℃～約１００℃の転移温度を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、約１０℃～約５０℃の転移温度を有する。いくつかの実施形態では、転移温度は、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、約４０℃、約４１℃、約４２℃、約４３℃、約４４℃、約４５℃、約４６℃、約４７℃、約４８℃、約４９℃、約５０℃、約５１℃、約５２℃、約５３℃、約５４℃、約５５℃、約５６℃、約５７℃、約５８℃、約５９℃、約６０℃、約６１℃、約６２℃、約６３℃、約６４℃、約６５℃、約６６℃、約６７℃、約６８℃、約６９℃、約７０℃、約７１℃、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、約７８℃、約７９℃、約８０℃、約８１℃、約８２℃、約８３℃、約８４℃、約８５℃、約８６℃、約８７℃、約８８℃、約８９℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、約９９℃又は約１００℃である。いくつかの実施形態では、転移温度は、少なくとも約０℃、少なくとも約１℃、少なくとも約２℃、少なくとも約３℃、少なくとも約４℃、少なくとも約５℃、少なくとも約６℃、少なくとも約７℃、少なくとも約８℃、少なくとも約９℃、少なくとも約１０℃、少なくとも約１１℃、少なくとも約１２℃、少なくとも約１３℃、少なくとも約１４℃、少なくとも約１５℃、少なくとも約１６℃、少なくとも約１７℃、少なくとも約１８℃、少なくとも約１９℃、少なくとも約２０℃、少なくとも約２１℃、少なくとも約２２℃、少なくとも約２３℃、少なくとも約２４℃、少なくとも約２５℃、少なくとも約２６℃、少なくとも約２７℃、少なくとも約２８℃、少なくとも約２９℃、少なくとも約３０℃、少なくとも約３１℃、少なくとも約３２℃、少なくとも約３３℃、少なくとも約３４℃、少なくとも約３５℃、少なくとも約３６℃、少なくとも約３７℃、少なくとも約３８℃、少なくとも約３９℃、少なくとも約４０℃、少なくとも約４１℃、少なくとも約４２℃、少なくとも約４３℃、少なくとも約４４℃、少なくとも約４５℃、少なくとも約４６℃、少なくとも約４７℃、少なくとも約４８℃、少なくとも約４９℃、少なくとも約５０℃、少なくとも約５１℃、少なくとも約５２℃、少なくとも約５３℃、少なくとも約５４℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約５６℃、少なくとも約５７℃、少なくとも約５８℃、少なくとも約５９℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６１℃、少なくとも約６２℃、少なくとも約６３℃、少なくとも約６４℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約６６℃、少なくとも約６７℃、少なくとも約６８℃、少なくとも約６９℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７１℃、少なくとも約７２℃、少なくとも約７３℃、少なくとも約７４℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約７６℃、少なくとも約７７℃、少なくとも約７８℃、少なくとも約７９℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８１℃、少なくとも約８２℃、少なくとも約８３℃、少なくとも約８４℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約８６℃、少なくとも約８７℃、少なくとも約８８℃、少なくとも約８９℃、少なくとも約９０℃、少なくとも約９１℃、少なくとも約９２℃、少なくとも約９３℃、少なくとも約９４℃、少なくとも約９５℃、少なくとも約９６℃、少なくとも約９７℃、少なくとも約９８℃、少なくとも約９９℃、又は少なくとも約１００℃である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰは、約１０℃～約１００℃の転移温度を有する。

【0232】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及びＥＬＰのＴ_ｔは、ＲＬＰ及びＥＬＰの一次構造（例えば、アミノ酸配列）を操作することによって調節される_。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの疎水性が調節される。いくつかの実施形態では、ＥＬＰの疎水性は、ゲスト残基（ｇｕｅｓｔ ｒｅｓｉｄｕｅ）Ｘａａの性質を変更することによって修飾される。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの疎水性が増加し、その結果、Ｔ_ｔが低下する。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの疎水性が低下し、その結果、Ｔ_ｔが上昇する。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの極性が調節される。いくつかの実施形態では、ＥＬＰの極性は、ゲスト残基Ｘａａの性質を変更することによって調節される。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの極性が増加し、その結果、Ｔ_ｔが上昇する。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ又はＲＬＰの極性が低下し、その結果、Ｔ_ｔが低下する。

【0233】

いくつかの実施形態では、ＥＬＰペンタペプチド反復数（ｎ）を調節して、Ｔ_ｔを変更する。いくつかの実施形態では、ペンタペプチド反復（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）_ｎ（配列番号１０）のｎは、終点を含む１～５００までの整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、又は５００（それらの間のすべての値及び範囲を含む）である。

【0234】

いくつかの実施形態では、Ｘａａは、「ゲスト残基」、即ち、ＥＬＰの相挙動を排除しない任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘａａは、各反復のために独立して選択される。例えば、所与のＥＬＰは、ゲスト残基であるアラニン、グリシン、及びバリンを８：７：１の比率で含み得る。いくつかの実施形態では、Ｘａａは、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プラリン（ｐｒａｌｉｎｅ）、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、Ｘａａは、表２、並びに／又は２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、アロイソロイシン、４－アミノ酪酸、２－アミノ酪酸（Ａｂｕ）、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、２－アミノイソ酪酸（Ａｉｂ）、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、β－メチルアミノ酸、Ｃα－メチルアミノ酸、Ｎａ－メチルアミノ酸、及びアミノ酸類似体全般からなる群から選択される非古典的アミノ酸である。いくつかの実施形態では、Ｘａａは、天然アミノ酸又は非古典的アミノ酸のＤ異性体である。

【0235】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及びＥＬＰのＴ_ｔは、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰを含む組成物に１つ又は複数の環境因子を導入することによって調節される_。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴ_ｔは、溶媒のイオン強度を調整することによって調節される。いくつかの実施形態では、溶媒のイオン強度は、塩を添加することによって調整される。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、コスモトロープ（ｋｏｓｍｏｔｒｏｐｅ）として分類されるアニオンを含む溶媒中でより低いＴ_ｔを有する。コスモトロープであるアニオンは高度に水和されており、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのウォーターシールドに影響を与える。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴ_ｔは、カオトロープであるアニオンの添加によって調整することができる。低濃度では、カオトロープの添加により、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴ_ｔが上昇する。高濃度では、カオトロープの添加により、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴ_ｔが低下する。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰのＴ_ｔは、水素結合を破壊する１つ又は複数の試薬を導入することによって調整することができる。水素結合を破壊する試薬の非限定的な例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び尿素が挙げられる。いくつかの実施形態では、水素結合の形成を促進する試薬を利用してＴ_ｔが調節される。いくつかの実施形態では、疎水性相互作用を促進する試薬を利用してＴ_ｔが調節される。トリフルオロエタノールは、疎水性相互作用と水素結合の形成の両方を促進し、Ｔ_ｔの低下を引き起こす試薬である。

【0236】

いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰの濃度を調整して、Ｔ_ｔを調節することができる。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰ濃度が高いと、Ｔ_ｔが低下する。いくつかの実施形態では、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰ濃度が低いと、Ｔ_ｔが上昇する。

【0237】

加えて、ｐＨ、光、及びイオン濃度の調節を利用しても、Ｔ_ｔを調節することができる。

【0238】

いくつかの実施形態では、荷電アミノ酸（例えば、ヒスチジン、リジン、アルギニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、オルニチン、又は他の非天然荷電アミノ酸）の数（例えば、付加又は除去）及び性質（例えば、正又は負に帯電）の調節により、ｐＨ調節によるＴ_ｔの調整が可能になる。

【0239】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、ブロックコポリマーである。ブロックコポリマーは、２つ以上の配列ドメイン又はブロックを含み、２つ以上のブロックは、異なる特性を有する。調整できる特性の非限定的な例としては、親水性、疎水性、極性、及び二次構造が挙げられる。いくつかの実施形態では、ブロックコポリマーは、両親媒性物質であり、例えば、少なくとも１つの疎水性ブロックと少なくとも１つの親水性ブロックを含む。

【0240】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、様々な形態に形成される。形態の非限定的な例としては、球状凝集体、ミセル、小胞、フィブリル、ナノフィブリル、ナノチューブ、及びヒドロゲルが含まれる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、環境因子の添加後に様々な形態を形成する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、環境因子の添加後に、ある形態から別の形態に変化する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、ＡＡＶ粒子の添加後に、ある形態から別の形態に変化する。

【0241】

いくつかの実施形態では、環境因子の追加により、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰが相転移する。いくつかの実施形態では、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰの相転移において、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰは、ある形態から別の形態に変換される。

【0242】

いくつかの実施形態では、ＲＬＰ及び／又はＥＬＰの相転移により、高密度の液滴を形成する。

【0243】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは：
（ａ）（ＧＲＧＤＳＰＹ）_ｎ（配列番号１）
（ｂ）（ＧＲＧＤＳＰＨ）_ｎ（配列番号２）
（ｃ）（ＧＲＧＤＳＰＶ）_ｎ（配列番号３）
（ｄ）（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号４）
（ｅ）（ＲＰＬＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号５）
（ｆ）（ＲＰＡＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号６）
（ｇ）（ＧＲＧＤＳＹＰ）_ｎ（配列番号７）
（ｈ）（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）_ｎ（配列番号８）
（ｉ）（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号９）
（ｊ）（ＧＶＧＶＰ）_ｎ（配列番号１１）；
（ｋ）（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）；
（ｌ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１３）；
（ｍ）（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４）；
（ｎ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１５）；
（ｏ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１６）；及び
（ｐ）（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１７）からなる群から選択されるアミノ酸配列又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を含み；
式中；
ｎは、終点を含む１～５００の整数であり；且つ
ｍは、終点を含む４～２５の整数である。

【0244】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）であり、式中、ｍは１６である。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは１６であり、且つＮ末端又はＣ末端に最大１０個のさらなるアミノ酸が存在する。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは１６であり、且つ追加のＣ末端グリシンが存在する。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは１６であり、且つ追加のＮ末端メチオニンが存在する。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは１６であり、且つ追加のＣ末端グリシン及び追加のＮ末端メチオニンが存在する。

【0245】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、配列番号８８のアミノ酸配列を有する。

【0246】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）又は（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４６）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、終点を含む２～３２の整数である。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、８又は１６である。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４５）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、終点を含む５～８０までの整数である。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＸＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４７）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、各反復のＸは、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から独立して選択される。

【0247】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、
（ａ）（ＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４３）；
（ｂ）（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４８）；
（ｃ）（ＺＺＰＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４９）；
（ｄ）（ＺＺＰＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５０）；又は
（ｅ）（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５１）から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０までの整数であり、Ｘは、存在する場合はプロリンとグリシンを除く任意のアミノ酸であり、Ｚは、存在する場合は任意のアミノ酸である。

【0248】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４３）のアミノ酸配列を含み、式中、ｍは、２０、４０、又は８０である。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、（ＧＲＧＤＸＰＺＸ）_ｍ（配列番号１５２）又は（ＸＺＰＸＤＧＲＧ）_ｍ（配列番号１５３）のアミノ酸配列を含み、式中、Ｘは、グルタミン又はセリンであり、Ｚは、チロシン又はバリンであり、且つｍは、終点を含む１０～１６０の整数である。

【0249】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、反復配列の第１のセット及び反復配列の第２のセットを含む。反復配列の第１のセット及び反復配列の第２のセットはそれぞれ、１回以上反復される配列を個別に含み得る。いくつかの実施形態では、反復配列の第１のセット及び／又は反復配列の第２のセットは、配列番号１～１７及び１４３～１５３のいずれか１つを含む反復配列を含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、反復配列の第１のセット及び反復配列の第２のセットを含み、反復配列の第１のセットは、（ＧＲＧＤＸＰＺＸ）_４０（配列番号１８５）のアミノ酸配列を含み、反復配列の第２セットは、アミノ酸配列（ＧＶＧＶＰ）_８０（配列番号１８６）を含み、式中、Ｘはグルタミンであり、Ｚはチロシンである。いくつかの実施形態では、反復配列の第１のセットは、配列番号１８７の配列を含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０の異なる反復配列のセットを含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチド内の反復配列の各セットは、約５～約４００回、例えば、約５回、約１０回、約１５回、約２０回、約２５回、約３０回、約３５回、約４０回、約４５回、約５０回、約５５回、約６０回、約６５回、約７０回、約７５回、約８０回、約８５回、約９０回、約９５回、約１００回、約１０５回、約１１０回、約１１５回、約１２０回、約１２５回、約１３０回、約１３５回、約１４０回、約１４５回、約１５０回、約１５５回、約１６０回、約１６５回、約１７０回、約１７５回、約１８０回、約１８５回、約１９０回、約１９５回、約２００回、約２０５回、約２１０回、約２１５回、約２２０回、約２２５回、約２３０回、約２３５回、約２４０回、約２４５回、約２５０回、約２５５回、約２６０回、約２６５回、約２７０回、約２７５回、約２８０回、約２８５回、約２９０回、約２９５回、約３００回、約３０５回、約３１０回、約３１５回、約３２０回、約３２５回、約３３０回、約３３５回、約３４０回、約３４５回、約３５０回、約３５５回、約３６０回、約３６５回、約３７０回、約３７５回、約３８０回、約３８５回、約３９０回、約３９５回、又は約４００回反復する配列を含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、配列番号１～１７、８８、及び１４３～１５３のいずれか１つから選択されるアミノ酸配列を含む相挙動を有するポリペプチドは、最大１０の追加のＮ末端及び／又はＣ末端アミノ酸も含む。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７、８８、及び１４３～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む相挙動を有するポリペプチドは、追加のＮ末端メチオニンも含む。いくつかの実施形態では、配列番号１～１７、８８、及び１４３～１５３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む相挙動を有するポリペプチドは、追加のＣ末端グリシンも含む。

【0251】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと同じアミノ酸組成を有するが、反復は含まない。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸組成を有する。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、ＥＬＰ及び／又はＲＬＰと約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％同一である疎水性アミノ酸組成を有する。

【0252】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、非反復非構造化ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、非反復非構造化ポリペプチドは、少なくとも５０のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、非反復非構造化ポリペプチドは、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、又は少なくとも１００のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、非反復非構造化ポリペプチドの配列は、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、又は少なくとも８０％）がプロリンであり、少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％）がグリシンである。いくつかの実施形態では、非反復非構造化ポリペプチドは、バリン、アラニン、ロイシン、リジン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、セリン、及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を少なくとも約４０％含む配列を有する。

【0253】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、３つの連続する同一アミノ酸を含まない配列を含み、任意の５～１０のアミノ酸サブ配列は、相挙動を有するポリペプチド中に複数回出現せず、相挙動を有するポリペプチドは、プロリンで始まりプロリンで終わるサブ配列を含み、サブ配列は、少なくとも１つのグリシンをさらに含む。

【0254】

本明細書に記載のＥＬＰ及び／又はＲＬＰは、融合タンパク質、例えば、第２のポリペプチドの成分として発現され、第２のポリペプチドは、相挙動を有する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドを含む。第１のポリペプチドの例は、この例を通じて提供される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、（ｉ）酵素又はその誘導体若しくは触媒断片；（ｉｉ）抗体又はその誘導体若しくは抗原結合断片；（ｉｉｉ）シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体；（ｉｖ）構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体；又は（ｖ）ホルモン又はその断片若しくは誘導体である。

【0255】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、細菌細胞又は哺乳動物細胞で発現される。

【0256】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で発現される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、昆虫細胞で発現される。いくつかの実施形態では、非反復非構造化ポリペプチドの配列は、少なくとも約１０％（例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％）がプロリンであり、少なくとも２０％（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、又は少なくとも５０％）がグリシンであり、少なくとも４０％（例えば、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、又は少なくとも７０％）がバリン、アラニン、ロイシン、リジン、スレオニン、イソロイシン、チロシン、セリン、及びフェニルアラニンからなる群から選択されるアミノ酸である。

【0257】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、３つの連続する同一のアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドのアミノ酸配列中に一回のみ出現するサブ配列（例えば、相挙動を有するポリペプチドの断片）を含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、プロリンで始まりプロリンで終わるサブ配列を含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、少なくとも１つのグリシンを含むサブ配列を含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、シグナルペプチドを含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを含む。いくつかの実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを欠いている。本明細書で使用される場合、「（Ｍ）」は、任意選択のＮ末端メチオニンを指す。

【0259】

リンカー
いくつかの実施形態では、リンカーは、融合タンパク質の第１のポリペプチドと第２のポリペプチドを分離する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の機能を妨げない任意のリンカーを利用することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、柔軟性であり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、剛性であり得る。

【0260】

いくつかの実施形態では、リンカーは、相挙動を有するポリペプチドの相挙動を維持する。いくつかの実施形態では、リンカーは、相挙動を有するポリペプチドのＴ_ｔを維持する。いくつかの実施形態では、リンカーは、第１のポリペプチドの構造を保存する。いくつかの実施形態では、リンカーは、１～５０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、又は５０のアミノ酸を含む。

【0261】

いくつかの実施形態では、リンカーの剛性は、リンカーのアミノ酸配列にプロリンを含めることによって向上する。

【0262】

いくつかの実施形態では、リンカーの柔軟性は、スレオニン、セリン、及びグリシンを含む小さな極性アミノ酸を含めることによって向上する。

【0263】

いくつかの実施形態では、リンカーは、限定されるものではないが、αヘリックス、β鎖、及びランダムコイルを含む、様々な二次構造を取り得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、αヘリックス構造を取り、（ＥＡＡＡＫ）_ｎ（配列番号１８）のアミノ酸反復を含み、ｎは、１～２０の反復数である。

【0264】

いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｇ_４Ｓ）_ｎ（配列番号１９）から構成され、式中、ｎは、１～３０の反復数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）であり得る。実施形態では、リンカーは、（ＳＧＧＧ）ｎ（配列番号２０）の反復を有し、式中、ｎは、１～５０の整数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０）である。実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号２１）の反復を有し、ｎは、１～２０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０）の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｇ_ｘＳ）_ｎ（配列番号１４１）の反復を有し、式中、ｘは、１～６（例えば、１、２、３、４、５、又は６）の整数であり、ｎは、１～３０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）の整数である。いくつかの実施形態では、リンカーは、（Ｓ_ｘＧ）_ｎ（配列番号１４２）の反復を有し、ｘは、１～６の（例えば、１、２、３、４、５、又は６）整数であり、ｎは、１～３０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０）の整数である。

【0265】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号２２）のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴ（配列番号２３）のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシンのみを含む。

【0266】

いくつかの実施形態では、リンカーは切断可能である。例えば、リンカーは、プロテアーゼによって切断され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、プロテアーゼ切断部位を含む。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、フューリン切断部位である。

【0267】

いくつかの態様では、リンカーは、ポリ－（Ｇｌｙ）_ｎリンカーであり、式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０である（配列番号４８）。他の実施形態では、リンカーは、ジペプチド、トリペプチド、及びクアドリペプチド（ｑｕａｄｒｉｐｅｐｔｉｄｅ）からなる群から選択される。実施形態では、リンカーは、アラニン－セリン（ＡＳ）、ロイシン－グルタミン酸（ＬＥ）、及びセリン－アルギニン（ＳＲ）からなる群から選択されるジペプチドである。

【0268】

いくつかの実施形態では、リンカーは、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１５７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１５８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１６１）、ＳＲＳＳＧ（配列番号１６２）、及びＳＧＳＳＣ（配列番号１６３）から選択される。

【0269】

いくつかの実施形態では、リンカーは、自己切断ペプチドである。いくつかの実施形態では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである。２Ａペプチドは、細胞内のタンパク質の翻訳中にリボソームスキッピングを誘導する１８～２２のアミノ酸長のペプチドのクラスである。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１６４）のアミノ酸配列を有するＴ２Ａペプチド、ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号１６５）のアミノ酸配列を有するＰ２Ａペプチド、ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１６６）のアミノ配列を有するＥ２Ａペプチド、又はＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１６７）のアミノ酸配列を有するＦ２Ａペプチドである。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、配列番号１６４～１６７のいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の同一性を有する。いくつかの実施形態では、２Ａペプチドは、Ｎ末端にＧＳＧ（配列番号１６８）をさらに含む。

【0270】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１のポリペプチド、リンカー、及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、相挙動を有する第２のポリペプチド、リンカー、及び第１のポリペプチドを含む。

【0271】

融合タンパク質の第１のポリペプチドを安定化させる方法、その収量を改善する方法、並びにその活性の喪失、アンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを防止する方法
本発明者らは、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質としての第１のポリペプチドの発現が、予想外にも、第１のポリペプチドの産生、精製、及び／又は保存中に第１のポリペプチドを安定化させるのに役立ち得ることを見出した。第１のポリペプチドに関して本明細書で使用される場合、「安定化させる」又は「安定化させること」という用語は、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現して、複数の第１のポリペプチドを含むサンプルの分解又は凝集を低減する能力、第１のポリペプチドが他のタンパク質又はそれ自体に結合するのを防止する能力、産生細胞による第１のポリペプチドの合成を促進する能力、第１のポリペプチドのアンフォールディングを防止する能力、及び第１のポリペプチドのミスフォールディングを防止する能力を指す。

【0272】

従って、いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドを安定化させる方法が本明細書で提供され、この方法は、第１のポリペプチドを、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現させるステップを含み、第２のポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドである。実施形態では、第１のポリペプチドは、融合タンパク質が第１のポリペプチドを不安定化させることになる１つ又は複数の条件への曝露後も、その活性を実質的に保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドのアンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを実質的に防止する方法が本明細書で提供され、この方法は、第１のポリペプチドと相挙動を有する第２のポリペプチドの融合タンパク質として第１のポリペプチドを発現させるステップを含み、融合タンパク質は、アンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを引き起こすことになる１つ又は複数の条件に曝露される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、及び／又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件に曝露した後の第１のポリペプチドの活性の喪失を実質的に防止する方法が本明細書で提供され、この方法は、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドは、相挙動を有するポリペプチドである。実施形態では、前述の方法のいずれも、第１のポリペプチドを不安定化させることが知られている条件、又は第１のポリペプチドをアンフォールド、分解、及び／又はミスフォールディングすることが知られている条件から融合タンパク質を除外するステップを含み、第１のポリペプチドは、対照の第１のポリペプチドと比較してその活性を保持する。「対照の第１のポリペプチド」は、相挙動を有するポリペプチドに融合しておらず、活性の喪失、ミスフォールディング、アンフォールディング、又は分解を引き起こす条件に曝露されていない第１のポリペプチドを指す。

【0273】

「活性」という用語は、その結合パートナーに対する第１のポリペプチドの結合親和性を指し得る。例えば、第１のポリペプチドがＡＡＶＲのＰＫＤ２である場合、結合パートナーは、ＡＡＶウイルス粒子のカプシドであり得る。第１のポリペプチドがプロテインＡである場合、結合パートナーは、免疫グロブリンのＦｃ領域であり得る。酵素に言及する場合、「活性」という用語は、本明細書では「ターンオーバー数」とも呼ばれるｋ_ｃａｔを指し得る。ｋ_ｃａｔは、式Ｖ_ｍａｘ／Ｅ_ｔを使用して計算され、式中、Ｖ_ｍａｘは、すべての酵素触媒部位が基質で飽和したときの最大反応速度であり、Ｅ_ｔは、全酵素濃度又は全酵素触媒部位の濃度である。「ｋ_ｃａｔ」及び「Ｖ_ｍａｘ」のような酵素速度論パラメータを決定するために、複数の技術、例えば、表面プラズモン共鳴、Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、等温滴定熱量測定、比色分析、又は蛍光分析技術を利用することができる。

【0274】

第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件には、以下のうちの１つ又は複数の導入が含まれる：塩、塩基（例えば、ブレンステッド・ローリー塩基又はルイス塩基）への曝露、酸（例えば、ブレンステッド・ローリー酸又はルイス酸）への曝露、少なくとも５０℃の温度への曝露、凍結乾燥、凍結融解サイクル、オートクレーブ、酸化剤、還元剤、カオトロピック剤、界面活性剤、有機溶媒、尿素、塩酸グアニジン。いくつかの実施形態では、オートクレーブ処理、熱ショック、ｐＨの変化、光への曝露、撹拌、混合、温度変化（例えば、凍結融解）、非理想的な配向での第１のポリペプチドの保存、又は第１のポリペプチドの凝集傾向が、第１のポリペプチドのアンフォールディング、分解、又はミスフォールディングが引き起こす。実施形態では、本明細書に記載のいずれの環境因子も、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングする条件であり得る。

【0275】

実施形態では、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている条件は、塩酸グアニジンへの曝露、凍結乾燥、凍結融解サイクル、水酸化ナトリウムへの曝露、オートクレーブ処理、少なくとも５０℃の温度への曝露、又はそれらの組み合わせである。

【0276】

実施形態では、融合タンパク質は、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件に約５分間～約１日間曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件に、約１０分間～約３０分間、約１５分間～約３０分間、約１５分間～１時間、約３０分間～約１２時間、約３０分間～約１１時間、約３０分間～約１０時間、約３０分間～約９時間、約３０分間～約８時間、約３０分間～約７時間、約３０分間～約６時間、約３０分間～約５時間、約３０分間～約４時間、約３０分間～約３時間、約３０分間～約２時間、約３０分間～約１時間、又は約４５分～１時間曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、約１分間、約２分間、約３分間、約４分間、約５分間、約６分間、約７分間、約８分間、約９分間、約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、約２０分間、約２１分間、約２２分間、約２３分間、約２４分間、約２５分間、約２６分間、約２７分間、約２８分間、約２９分間、約３０分間、約３１分間、約３２分間、約３３分間、約３４分間、約３５分間、約３６分間、約３７分間、約３８分間、約３９分間、約４０分間、約４１分間、約４２分間、約４３分間、約４４分間、約４５分間、約４６分間、約４７分間、約４８分間、約４９分間、約５０分間、約５１分間、約５２分間、約５３分間、約５４分間、約５５分間、約５６分間、約５７分間、約５８分間、約５９分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）条件に曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、少なくとも約１分間、少なくとも約２分間、少なくとも約３分間、少なくとも約４分間、少なくとも約５分間、少なくとも約６分間、少なくとも約７分間、少なくとも約８分間、少なくとも約９分間、少なくとも約１０分間、少なくとも約１１分間、少なくとも約１２分間、少なくとも約１３分間、少なくとも約１４分間、少なくとも約１５分間、少なくとも約１６分間、少なくとも約１７分間、少なくとも約１８分間、少なくとも約１９分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約２１分間、少なくとも約２２分間、少なくとも約２３分間、少なくとも約２４分間、少なくとも約２５分間、少なくとも約２６分間、少なくとも約２７分間、少なくとも約２８分間、少なくとも約２９分間、少なくとも約３０分間、少なくとも約３１分間、少なくとも約３２分間、少なくとも約３３分間、少なくとも約３４分間、少なくとも約３５分間、少なくとも約３６分間、少なくとも約３７分間、少なくとも約３８分間、少なくとも約３９分間、少なくとも約４０分間、少なくとも約４１分間、少なくとも約４２分間、少なくとも約４３分間、少なくとも約４４分間、少なくとも約４５分間、少なくとも約４６分間、少なくとも約４７分間、少なくとも約４８分間、少なくとも約４９分間、少なくとも約５０分間、少なくとも約５１分間、少なくとも約５２分間、少なくとも約５３分間、少なくとも約５４分間、少なくとも約５５分間、少なくとも約５６分間、少なくとも約５７分間、少なくとも約５８分間、少なくとも約５９分間、少なくとも約１時間、少なくとも約２時間、少なくとも約３時間、少なくとも約４時間、少なくとも約５時間、少なくとも約６時間、少なくとも約７時間、少なくとも約８時間、少なくとも約９時間、少なくとも約１０時間、少なくとも約１１時間、少なくとも約１２時間、少なくとも約１３時間、少なくとも約１４時間、少なくとも約１５時間、少なくとも約１６時間、少なくとも約１７時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約１９時間、少なくとも約２０時間、少なくとも約２１時間、少なくとも約２２時間、少なくとも約２３時間、又は少なくとも約２４時間条件に曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件に約３０分間曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件に少なくとも約３０分間曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、ミスフォールディングする、又は不安定化させることが知られている１つ又は複数の条件に約１０分間～約３０分間曝露される。

【0277】

実施形態では、融合タンパク質は、約５０℃～約９９℃の範囲の温度、例えば、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、約８０℃、約８５℃、約９０℃、約９１℃、約９２℃、約９３℃、約９４℃、約９５℃、約９６℃、約９７℃、約９８℃、又は約９９℃（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）に曝露される。実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも約５０℃、少なくとも約５５℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約６５℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約７５℃、少なくとも約８０℃、少なくとも約８５℃、少なくとも約９０℃、少なくとも約９１℃、少なくとも約９２℃、少なくとも約９３℃、少なくとも約９４℃、少なくとも約９５℃、少なくとも約９６℃、少なくとも約９７℃、少なくとも約９８℃、又は少なくとも約９９℃に曝露される。

【0278】

実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、塩酸グアニジンへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドは、１Ｍ～約１０Ｍ塩酸グアニジンに曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、約１Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、約２Ｍ、約２．１Ｍ、約２．２Ｍ、約２．３Ｍ、約２．４Ｍ、約２．５Ｍ、約２．６Ｍ、約２．７Ｍ、約２．８Ｍ、約２．９Ｍ、約３Ｍ、約３．１Ｍ、約３．２Ｍ、約３．３Ｍ、約３．４Ｍ、約３．５Ｍ、約３．６Ｍ、約３．７Ｍ、約３．８Ｍ、約３．９Ｍ、約４Ｍ、約４．１Ｍ、約４．２Ｍ、約４．３Ｍ、約４．４Ｍ、約４．５Ｍ、約４．６Ｍ、約４．７Ｍ、約４．８Ｍ、約４．９Ｍ、約５Ｍ、約５．１Ｍ、約５．２Ｍ、約５．３Ｍ、約５．４Ｍ、約５．５Ｍ、約５．６Ｍ、約５．７Ｍ、約５．８Ｍ、約５．９Ｍ、約６Ｍ、約６．１Ｍ、約６．２Ｍ、約６．３Ｍ、約６．４Ｍ、約６．５Ｍ、約６．６Ｍ、約６．７Ｍ、約６．８Ｍ、約６．９Ｍ、約７Ｍ、約７．１Ｍ、約７．２Ｍ、約７．３Ｍ、約７．４Ｍ、約７．５Ｍ、約７．６Ｍ、約７．７Ｍ、約７．８Ｍ、約７．９Ｍ、約８Ｍ、約８．１Ｍ、約８．２Ｍ、約８．３Ｍ、約８．４Ｍ、約８．５Ｍ、約８．６Ｍ、約８．７Ｍ、約８．８Ｍ、約８．９Ｍ、約９Ｍ、約９．１Ｍ、約９．２Ｍ、約９．３Ｍ、約９．４Ｍ、約９．５Ｍ、約９．６Ｍ、約９．７Ｍ、約９．８Ｍ、約９．９Ｍ、又は約１０Ｍ（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）塩酸グアニジンに曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、少なくとも約１．５Ｍ、少なくとも約１．６Ｍ、少なくとも約１．７Ｍ、少なくとも約１．８Ｍ、少なくとも約１．９Ｍ、少なくとも約２Ｍ、少なくとも約２．１Ｍ、少なくとも約２．２Ｍ、少なくとも約２．３Ｍ、少なくとも約２．４Ｍ、少なくとも約２．５Ｍ、少なくとも約２．６Ｍ、少なくとも約２．７Ｍ、少なくとも約２．８Ｍ、少なくとも約２．９Ｍ、少なくとも約３Ｍ、少なくとも約３．１Ｍ、少なくとも約３．２Ｍ、少なくとも約３．３Ｍ、少なくとも約３．４Ｍ、少なくとも約３．５Ｍ、少なくとも約３．６Ｍ、少なくとも約３．７Ｍ、少なくとも約３．８Ｍ、少なくとも約３．９Ｍ、少なくとも約４Ｍ、少なくとも約４．１Ｍ、少なくとも約４．２Ｍ、少なくとも約４．３Ｍ、少なくとも約４．４Ｍ、少なくとも約４．５Ｍ、少なくとも約４．６Ｍ、少なくとも約４．７Ｍ、少なくとも約４．８Ｍ、少なくとも約４．９Ｍ、少なくとも約５Ｍ、少なくとも約５．１Ｍ、少なくとも約５．２Ｍ、少なくとも約５．３Ｍ、少なくとも約５．４Ｍ、少なくとも約５．５Ｍ、少なくとも約５．６Ｍ、少なくとも約５．７Ｍ、少なくとも約５．８Ｍ、少なくとも約５．９Ｍ、少なくとも約６Ｍ、少なくとも約６．１Ｍ、少なくとも約６．２Ｍ、少なくとも約６．３Ｍ、少なくとも約６．４Ｍ、少なくとも約６．５Ｍ、少なくとも約６．６Ｍ、少なくとも約６．７Ｍ、少なくとも約６．８Ｍ、少なくとも約６．９Ｍ、少なくとも約７Ｍ、少なくとも約７．１Ｍ、少なくとも約７．２Ｍ、少なくとも約７．３Ｍ、少なくとも約７．４Ｍ、少なくとも約７．５Ｍ、少なくとも約７．６Ｍ、少なくとも約７．７Ｍ、少なくとも約７．８Ｍ、少なくとも約７．９Ｍ、少なくとも約８Ｍ、少なくとも約８．１Ｍ、少なくとも約８．２Ｍ、少なくとも約８．３Ｍ、少なくとも約８．４Ｍ、少なくとも約８．５Ｍ、少なくとも約８．６Ｍ、少なくとも約８．７Ｍ、少なくとも約８．８Ｍ、少なくとも約８．９Ｍ、少なくとも約９Ｍ、少なくとも約９．１Ｍ、少なくとも約９．２Ｍ、少なくとも約９．３Ｍ、少なくとも約９．４Ｍ、少なくとも約９．５Ｍ、少なくとも約９．６Ｍ、少なくとも約９．７Ｍ、少なくとも約９．８Ｍ、少なくとも約９．９Ｍ、又は少なくとも約１０Ｍ塩酸グアニジンに曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、６Ｍ塩酸グアニジンへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、６Ｍ塩酸グアニジンへの３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、６Ｍ塩酸グアニジンへの少なくとも３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、６Ｍ塩酸グアニジンへの１０～３０分間の曝露である。

【0279】

実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、水酸化ナトリウムへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドは、０．００１Ｍ～約１０Ｍ水酸化ナトリウムに曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、約０．００１Ｍ、約０．０１Ｍ、約０．０２Ｍ、約０．０３Ｍ、約０．０４Ｍ、約０．０５Ｍ、約０．０６Ｍ、約０．０７Ｍ、約０．０８Ｍ、約０．０９Ｍ、約０．１Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、約２Ｍ、約２．１Ｍ、約２．２Ｍ、約２．３Ｍ、約２．４Ｍ、約２．５Ｍ、約２．６Ｍ、約２．７Ｍ、約２．８Ｍ、約２．９Ｍ、約３Ｍ、約３．１Ｍ、約３．２Ｍ、約３．３Ｍ、約３．４Ｍ、約３．５Ｍ、約３．６Ｍ、約３．７Ｍ、約３．８Ｍ、約３．９Ｍ、約４Ｍ、約４．１Ｍ、約４．２Ｍ、約４．３Ｍ、約４．４Ｍ、約４．５Ｍ、約４．６Ｍ、約４．７Ｍ、約４．８Ｍ、約４．９Ｍ、約５Ｍ、約５．１Ｍ、約５．２Ｍ、約５．３Ｍ、約５．４Ｍ、約５．５Ｍ、約５．６Ｍ、約５．７Ｍ、約５．８Ｍ、約５．９Ｍ、約６Ｍ、約６．１Ｍ、約６．２Ｍ、約６．３Ｍ、約６．４Ｍ、約６．５Ｍ、約６．６Ｍ、約６．７Ｍ、約６．８Ｍ、約６．９Ｍ、約７Ｍ、約７．１Ｍ、約７．２Ｍ、約７．３Ｍ、約７．４Ｍ、約７．５Ｍ、約７．６Ｍ、約７．７Ｍ、約７．８Ｍ、約７．９Ｍ、約８Ｍ、約８．１Ｍ、約８．２Ｍ、約８．３Ｍ、約８．４Ｍ、約８．５Ｍ、約８．６Ｍ、約８．７Ｍ、約８．８Ｍ、約８．９Ｍ、約９Ｍ、約９．１Ｍ、約９．２Ｍ、約９．３Ｍ、約９．４Ｍ、約９．５Ｍ、約９．６Ｍ、約９．７Ｍ、約９．８Ｍ、約９．９Ｍ、又は約１０Ｍ（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）水酸化ナトリウムに曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドは、少なくとも約０．００１Ｍ、少なくとも約０．０１Ｍ、少なくとも約０．０２Ｍ、少なくとも約０．０３Ｍ、少なくとも約０．０４Ｍ、少なくとも約０．０５Ｍ、少なくとも約０．０６Ｍ、少なくとも約０．０７Ｍ、少なくとも約０．０８Ｍ、少なくとも約０．０９Ｍ、少なくとも約０．１Ｍ、少なくとも約０．２Ｍ、少なくとも約０．３Ｍ、少なくとも約０．４Ｍ、少なくとも約０．５Ｍ、少なくとも約０．６Ｍ、少なくとも約０．７Ｍ、少なくとも約０．８Ｍ、少なくとも約０．９Ｍ、少なくとも約１Ｍ、少なくとも約１．１Ｍ、少なくとも約１．２Ｍ、少なくとも約１．３Ｍ、少なくとも約１．４Ｍ、少なくとも約１．５Ｍ、少なくとも約１．６Ｍ、少なくとも約１．７Ｍ、少なくとも約１．８Ｍ、少なくとも約１．９Ｍ、少なくとも約２Ｍ、少なくとも約２．１Ｍ、少なくとも約２．２Ｍ、少なくとも約２．３Ｍ、少なくとも約２．４Ｍ、少なくとも約２．５Ｍ、少なくとも約２．６Ｍ、少なくとも約２．７Ｍ、少なくとも約２．８Ｍ、少なくとも約２．９Ｍ、少なくとも約３Ｍ、少なくとも約３．１Ｍ、少なくとも約３．２Ｍ、少なくとも約３．３Ｍ、少なくとも約３．４Ｍ、少なくとも約３．５Ｍ、少なくとも約３．６Ｍ、少なくとも約３．７Ｍ、少なくとも約３．８Ｍ、少なくとも約３．９Ｍ、少なくとも約４Ｍ、少なくとも約４．１Ｍ、少なくとも約４．２Ｍ、少なくとも約４．３Ｍ、少なくとも約４．４Ｍ、少なくとも約４．５Ｍ、少なくとも約４．６Ｍ、少なくとも約４．７Ｍ、少なくとも約４．８Ｍ、少なくとも約４．９Ｍ、少なくとも約５Ｍ、少なくとも約５．１Ｍ、少なくとも約５．２Ｍ、少なくとも約５．３Ｍ、少なくとも約５．４Ｍ、少なくとも約５．５Ｍ、少なくとも約５．６Ｍ、少なくとも約５．７Ｍ、少なくとも約５．８Ｍ、少なくとも約５．９Ｍ、少なくとも約６Ｍ、少なくとも約６．１Ｍ、少なくとも約６．２Ｍ、少なくとも約６．３Ｍ、少なくとも約６．４Ｍ、少なくとも約６．５Ｍ、少なくとも約６．６Ｍ、少なくとも約６．７Ｍ、少なくとも約６．８Ｍ、少なくとも約６．９Ｍ、少なくとも約７Ｍ、少なくとも約７．１Ｍ、少なくとも約７．２Ｍ、少なくとも約７．３Ｍ、少なくとも約７．４Ｍ、少なくとも約７．５Ｍ、少なくとも約７．６Ｍ、少なくとも約７．７Ｍ、少なくとも約７．８Ｍ、少なくとも約７．９Ｍ、少なくとも約８Ｍ、少なくとも約８．１Ｍ、少なくとも約８．２Ｍ、少なくとも約８．３Ｍ、少なくとも約８．４Ｍ、少なくとも約８．５Ｍ、少なくとも約８．６Ｍ、少なくとも約８．７Ｍ、少なくとも約８．８Ｍ、少なくとも約８．９Ｍ、少なくとも約９Ｍ、少なくとも約９．１Ｍ、少なくとも約９．２Ｍ、少なくとも約９．３Ｍ、少なくとも約９．４Ｍ、少なくとも約９．５Ｍ、少なくとも約９．６Ｍ、少なくとも約９．７Ｍ、少なくとも約９．８Ｍ、少なくとも約９．９Ｍ、又は少なくとも約１０Ｍ水酸化ナトリウムに曝露される。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムへの約３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムへの少なくとも約３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、０．１Ｍ水酸化ナトリウムへの１０～３０分間の曝露である。

【0280】

実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、凍結融解サイクルである。実施形態では、凍結融解サイクルは、第１のポリペプチドを含む溶液を凍結し、次いで溶液を氷点以上の温度にすることを含む。実施形態では、第１のポリペプチドは、複数回の凍結融解サイクルに供される。実施形態では、第１のポリペプチドは、２～１０回、２～２０回、２～３０回、２～４０回、又は２～５０回の凍結融解サイクルに供される。実施形態では、第１のポリペプチドは、約１回、約２回、約３回、約４回、約５回、約６回、約７回、約８回、約９回、約１０回、約１１回、約１２回、約１３回、約１４回、約１５回、約１６回、約１７回、約１８回、約１９回、約２０回、約２１回、約２２回、約２３回、約２４回、約２５回、約２６回、約２７回、約２８回、約２９回、約３０回、約３１回、約３２回、約３３回、約３４回、約３５回、約３６回、約３７回、約３８回、約３９回、約４０回、約４１回、約４２回、約４３回、約４４回、約４５回、約４６回、約４７回、約４８回、約４９回、約５０回、約５１回、約５２回、約５３回、約５４回、約５５回、約５６回、約５７回、約５８回、約５９回、約６０回、約６１回、約６２回、約６３回、約６４回、約６５回、約６６回、約６７回、約６８回、約６９回、約７０回、約７１回、約７２回、約７３回、約７４回、約７５回、約７６回、約７７回、約７８回、約７９回、約８０回、約８１回、約８２回、約８３回、約８４回、約８５回、約８６回、約８７回、約８８回、約８９回、約９０回、約９１回、約９２回、約９３回、約９４回、約９５回、約９６回、約９７回、約９８回、約９９回、又は約１００回の凍結融解サイクルに供され得る。実施形態では、第１のポリペプチドは、少なくとも約１回、少なくとも約２回、少なくとも約３回、少なくとも約４回、少なくとも約５回、少なくとも約６回、少なくとも約７回、少なくとも約８回、少なくとも約９回、少なくとも約１０回、少なくとも約１１回、少なくとも約１２回、少なくとも約１３回、少なくとも約１４回、少なくとも約１５回、少なくとも約１６回、少なくとも約１７回、少なくとも約１８回、少なくとも約１９回、少なくとも約２０回、少なくとも約２１回、少なくとも約２２回、少なくとも約２３回、少なくとも約２４回、少なくとも約２５回、少なくとも約２６回、少なくとも約２７回、少なくとも約２８回、少なくとも約２９回、少なくとも約３０回、少なくとも約３１回、少なくとも約３２回、少なくとも約３３回、少なくとも約３４回、少なくとも約３５回、少なくとも約３６回、少なくとも約３７回、少なくとも約３８回、少なくとも約３９回、少なくとも約４０回、少なくとも約４１回、少なくとも約４２回、少なくとも約４３回、少なくとも約４４回、少なくとも約４５回、少なくとも約４６回、少なくとも約４７回、少なくとも約４８回、少なくとも約４９回、少なくとも約５０回、少なくとも約５１回、少なくとも約５２回、少なくとも約５３回、少なくとも約５４回、少なくとも約５５回、少なくとも約５６回、少なくとも約５７回、少なくとも約５８回、少なくとも約５９回、少なくとも約６０回、少なくとも約６１回、少なくとも約６２回、少なくとも約６３回、少なくとも約６４回、少なくとも約６５回、少なくとも約６６回、少なくとも約６７回、少なくとも約６８回、少なくとも約６９回、少なくとも約７０回、少なくとも約７１回、少なくとも約７２回、少なくとも約７３回、少なくとも約７４回、少なくとも約７５回、少なくとも約７６回、少なくとも約７７回、少なくとも約７８回、少なくとも約７９回、少なくとも約８０回、少なくとも約８１回、少なくとも約８２回、少なくとも約８３回、少なくとも約８４回、少なくとも約８５回、少なくとも約８６回、少なくとも約８７回、少なくとも約８８回、少なくとも約８９回、少なくとも約９０回、少なくとも約９１回、少なくとも約９２回、少なくとも約９３回、少なくとも約９４回、少なくとも約９５回、少なくとも約９６回、少なくとも約９７回、少なくとも約９８回、少なくとも約９９回、又は少なくとも約１００回の凍結融解サイクルに供され得る。

【0281】

実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、熱ショックである。実施形態では、第１のポリペプチドは、この第１のポリペプチドを少なくとも９０℃、少なくとも９１℃、少なくとも９２℃、少なくとも９３℃、少なくとも９４℃、又は少なくとも９５℃に約１０分間、約１１分間、約１２分間、約１３分間、約１４分間、約１５分間、約１６分間、約１７分間、約１８分間、約１９分間、約２０分間、約２１分間、約２２分間、約２３分間、約２４分間、約２５分間、約２６分間、約２７分間、約２８分間、約２９分間、約３０分間、又はそれ以上の期間加熱すること；第１のポリペプチドを含む容器を氷上に置き、次いで、融合タンパク質を室温に戻すことによって熱ショックが与えられる。実施形態では、第１のポリペプチドは、この第１のポリペプチドを少なくとも９０℃、少なくとも９１℃、少なくとも９２℃、少なくとも９３℃、少なくとも９４℃、又は少なくとも９５℃に少なくとも約１０分間、少なくとも約１１分間、少なくとも約１２分間、少なくとも約１３分間、少なくとも約１４分間、少なくとも約１５分間、少なくとも約１６分間、少なくとも約１７分間、少なくとも約１８分間、少なくとも約１９分間、少なくとも約２０分間、少なくとも約２１分間、少なくとも約２２分間、少なくとも約２３分間、少なくとも約２４分間、少なくとも約２５分間、少なくとも約２６分間、少なくとも約２７分間、少なくとも約２８分間、少なくとも約２９分間、少なくとも約３０分間、又はそれ以加熱すること；第１のポリペプチドを含む容器を氷上に置き、次いで、融合タンパク質を室温に戻すことによって熱ショックが与えられる。

【0282】

実施形態では、少なくとも９０℃、少なくとも９１℃、少なくとも９２℃、少なくとも９３℃、少なくとも９４℃、又は少なくとも９５℃に加熱することが、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件は、少なくとも９０℃に加熱することである。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件は、少なくとも９５℃に加熱することである。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件は、少なくとも９０℃で少なくとも３０分間加熱することである。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件は、少なくとも９５℃に少なくとも３０分間加熱することである。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件は、少なくとも９５℃に１０～３０分間加熱することである。

【0283】

実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、非生理的ｐＨへの曝露である。非生理的ｐＨという用語は、７．２～約７．４ではないｐＨを指す。実施形態では、非生理的ｐＨは、酸性ｐＨである。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、酸性ｐＨへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、約０．５～約７、約０．５～約６、約０．５～約５、約０．５～約４、約０．５～約３、約０．５～約２、又は約０．５～約１の酸性ｐＨへの曝露である。実施形態では、酸性ｐＨは、約１、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、約２、約２．１、約２．２、約２．３、約２．４、約２．５、約２．６、約２．７、約２．８、約２．９、約３、約３．１、約３．２、約３．３、約３．４、約３．５、約３．６、約３．７、約３．８、約３．９、約４、約４．１、約４．２、約４．３、約４．４、約４．５、約４．６、約４．７、約４．８、約４．９、約５、約５．１、約５．２、約５．３、約５．４、約５．５、約５．６、約５．７、約５．８、約５．９、約６、約６．１、約６．２、約６．３、約６．４、約６．５、約６．６、約６．７、約６．８、約６．９、約７、又は約７．１（それらの間のすべての部分範囲及び範囲を含む）である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、約４のｐＨへの曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、約４のｐＨへの約１０～３０分間の曝露である。実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、約４のｐＨへの約３０分間の曝露である。

【0284】

実施形態では、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、約４のｐＨ及び少なくとも９５℃の温度への少なくとも３０分間の曝露である。実施形態で、第１のポリペプチドを不安定化させる、アンフォールディングする、分解する、又はミスフォールディングすることが知られている条件は、約４のｐＨ及び少なくとも９５℃の温度への１０～３０分間の曝露である。

【0285】

実施形態では、非生理的ｐＨは、塩基性ｐＨである。実施形態では、塩基性ｐＨは、約７．５～約１４、約７．５～約１３、約７．５～約１２、約７．５～約１１、約７．５～約１０、約７．５～約９、又は約７．５～約８．５である。実施形態では、塩基性ｐＨは、約８、約８．１、約８．２、約８．３、約８．４、約８．５、約８．６、約８．７、約８．８、約８．９、約９、約９．１、約９．２、約９．３、約９．４、約９．５、約９．６、約９．７、約９．８、約９．９、約１０、約１０．１、約１０．２、約１０．３、約１０．４、約１０．５、約１０．６、約１０．７、約１０．８、約１０．９、約１１、約１１．１、約１１．２、約１１．３、約１１．４、約１１．５、約１１．６、約１１．７、約１１．８、約１１．９、約１２、約１２．１、約１２．２、約１２．３、約１２．４、約１２．５、約１２．６、約１２．７、約１２．８、約１２．９、約１３、約１３．１、約１３．２、約１３．３、約１３．４、約１３．５、約１３．６、約１３．７、約１３．８、約１３．９、又は約１４（それらの間のすべての部分範囲及び範囲を含む）である。

【0286】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの活性は、１つ又は複数の条件への曝露後、対照ポリペプチドと比較して約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約３％未満、約２％未満、又は１％未満喪失する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの活性は、１つ又は複数の条件への曝露後、対照ポリペプチドと比較して約２５％未満喪失する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの活性は、１つ又は複数の条件への曝露後、対照ポリペプチドと比較して約２０％未満喪失する。

【0287】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現される第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照ポリペプチドと比較してその活性の約５０％～約１００％、約５５％～約１００％、約６０％～約１００％、約６５％～約１００％、約７０％～約１００％、約７５％～約１００％、約８０％～約１００％、約８５％～約１００％、約９０％～約１００％、又は約９５％～約１００％を保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照と比較してその活性の少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％を保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、１つ又は複数の条件への曝露後、対照と比較してその活性の少なくとも８０％を保持する。第１のポリペプチドの活性は、機能アッセイ、酵素結合免疫吸着アッセイ、又はフローサイトメトリーを使用して測定することができる。

【0288】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、約－２０℃～約３５℃（例えば、約－２０℃、約－１９℃、約－１８℃、約－１７℃、約－１６℃、約－１５℃、約－１４℃、約－１３℃、約－１２℃、約－１１℃、約－１０℃、約－９℃、約－８℃、約－７℃、約－６℃、約－５℃、約－４℃、約－３℃、約－２℃、約－１℃、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃（それらの間の任意の値及び部分範囲を含む）の温度への約１週間～約１０年間（例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、又は約１０年間（その間のすべての部分範囲及び値を含む））の曝露後、その活性を保持する。実施形態では、第１のポリペプチドは、約１週間～１０週間（例えば、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、少なくとも約５年間、少なくとも約６年間、少なくとも約７年間、少なくとも約８年間、少なくとも約９年間、又は少なくとも約１０年間（それらの間の任意の値又は部分範囲を含む）、－２０℃～約３５℃（例えば、約－２０℃、約－１９℃、約－１８℃、約－１７℃、約－１６℃、約－１５℃、約－１４℃、約－１３℃、約－１２℃、約－１１℃、約－１０℃、約－９℃、約－８℃、約－７℃、約－６℃、約－５℃、約－４℃、約－３℃、約－２℃、約－１℃、約０℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）の温度への曝露後、その活性を保持する。

【0289】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、約４℃に約１週間～約１０年間の曝露後、その活性を保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、約４℃で約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１ヶ月間、約２ヶ月間、約３ヶ月間、約４ヶ月間、約５ヶ月間、約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、又はそれ以上の期間（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）その活性を保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、少なくとも約４℃で少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、少なくとも約７週間、少なくとも約８週間、少なくとも約９週間、少なくとも約１０週間、少なくとも約１１週間、少なくとも約１２週間、少なくとも約１月、少なくとも約２月間、少なくとも約３月間、少なくとも約４月間、少なくとも約５月間、少なくとも約６月間、少なくとも約７月間、少なくとも約８月間、少なくとも約９月間、少なくとも約１０月間、少なくとも約１１月間、少なくとも約１２月間、少なくとも約１年間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、少なくとも約５年間、少なくとも約６年間、少なくとも約７年間、少なくとも約８年間、少なくとも約９年間、少なくとも約１０年間、又はそれ以上の期間（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）その活性を保持する。

【0290】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、－２０℃に約６ヶ月～約１０年間の曝露後、その活性を保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、約４℃で約６ヶ月間、約７ヶ月間、約８ヶ月間、約９ヶ月間、約１０ヶ月間、約１１ヶ月間、約１２ヶ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、又はそれ以上の期間（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）その活性を保持する。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、少なくとも約４℃で少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、少なくとも約１２ヶ月間、少なくとも約１年間、少なくとも約２年間、少なくとも約３年間、少なくとも約４年間、少なくとも約５年間、少なくとも約６年間、少なくとも約７年間、少なくとも約８年間、少なくとも約９年間、少なくとも約１０年間、又はそれ以上の期間（それらの間のすべての部分範囲及び値を含む）その活性を保持する。

【0291】

いくつかの実施形態では、以下の技術のうちの１つ又は複数を使用して、本開示の方法が第１のポリペプチドを安定化させる能力を評価する：サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換及び逆相高速液体クロマトグラフィー、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、力価アッセイ、動的光散乱、分光法、顕微鏡法、並びに外観、ｐＨ、及び粒径の物理化学的測定。

【0292】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質としての第１のポリペプチドの発現は、保存（例えば冷凍）中に第１のポリペプチドを分解から保護する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、特に複数回の凍結融解サイクル中に第１のポリペプチドを分解から保護する。第１のポリペプチドの凝集は、顕微鏡法によって、及び／又はＸ線散乱、レーザー回折、分析用超遠心分離、動的光散乱、ナノ粒子追跡分析、共鳴質量測定、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、光遮蔽法、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される技術によって視覚的に観察することができる。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として、約－８０℃～約４０℃、例えば、約－８０℃、約－７５℃、約－７０℃、約－６５℃、約－６０℃、約－５５℃、約－５０℃、約－４５℃、約－４０℃、約－３５℃、約－３０℃、約－２５℃、約－２０℃、約－１５℃、約－１０℃、約－５℃、約０℃、約４℃、約５℃、約１０℃、約１５℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃、又は約４０℃の温度で凍結及び保存することができる。

【0293】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドが、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として保存される場合、第１のポリペプチドの貯蔵寿命は、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドと比較して、少なくとも約１０％長い。例えば、いくつかの実施形態では、貯蔵寿命は、同じ温度で保存される相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの貯蔵寿命よりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、又は少なくとも約５００％長い。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドが、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として保存される場合、第１のポリペプチドの貯蔵寿命は、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドと比較して少なくとも１ヶ月長い。例えば、いくつかの実施形態では、この貯蔵寿命は、同じ温度で保存される相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの貯蔵寿命よりも少なくとも約１ヶ月間、少なくとも約２ヶ月間、少なくとも約３ヶ月間、少なくとも約４ヶ月間、少なくとも約５ヶ月間、少なくとも約６ヶ月間、少なくとも約７ヶ月間、少なくとも約８ヶ月間、少なくとも約９ヶ月間、少なくとも約１０ヶ月間、少なくとも約１１ヶ月間、又は少なくとも約１２ヶ月間長い。

【0294】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、約－８０℃で保存される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、約－２０℃で保存される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、約４℃で保存される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合ポリペプチドは、約３７℃で保存される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合ポリペプチドが、約－８０℃、約－２０℃、約４℃、又は約３７℃で保存される場合、第１のポリペプチドの貯蔵寿命は、第１のポリペプチドが融合タンパク質として発現されず、同じ条件下で保存された場合よりも少なくとも約１０％長い。例えば、第１のポリペプチドの貯蔵寿命は、同じ温度での、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの貯蔵寿命よりも少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、又は少なくとも約５００％長いであろう。本明細書で使用される場合、貯蔵寿命の延長は、第１のポリペプチドが保存されてその機能を依然として保持する時間の増加を指し得る。例えば、その機能を保持するプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１）に結合するモノクローナル抗体を含む第１のポリペプチドは、ＰＤ１に対して同じ親和性を保持する。

【0295】

第１のポリペプチドの産生を改善する方法
いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの収量を改善する方法が本明細書で提供され、この方法は：（ｉ）第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップ；並びに（ｉｉ）第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから分離するステップであって、融合タンパク質として発現される場合の第１のポリペプチドの収量が、第１のポリペプチドが融合タンパク質として発現されない場合の第１のポリペプチドの収量と比較して改善される、ステップを含む。

【0296】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、プロテアーゼ切断によって第２のポリペプチドから分離される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼはフューリンである。

【0297】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選択される宿主細胞内で発現される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。

【0298】

いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの産生中に第１のポリペプチドの収量を増加させる方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として産生される第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない（即ち、相挙動を有する第２のポリペプチドに融合されていない）第１のポリペプチドの収量よりも多い。実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現される場合の第１のポリペプチドの収量は、約１ｍｇ／リットル～約１，０００ｍｇ／リットルである。実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現される場合の第１のポリペプチドの収量は、宿主細胞懸濁液１リットル当たり約１ｍｇ、約２ｍｇ、約３ｍｇ、約４ｍｇ、約５ｍｇ、約６ｍｇ、約７ｍｇ、約８ｍｇ、約９ｍｇ、約１０ｍｇ、約１１ｍｇ、約１２ｍｇ、約１３ｍｇ、約１４ｍｇ、約１５ｍｇ、約１６ｍｇ、約１７ｍｇ、約１８ｍｇ、約１９ｍｇ、約２０ｍｇ、約２１ｍｇ、約２２ｍｇ、約２３ｍｇ、約２４ｍｇ、約２５ｍｇ、約２６ｍｇ、約２７ｍｇ、約２８ｍｇ、約２９ｍｇ、約３０ｍｇ、約３１ｍｇ、約３２ｍｇ、約３３ｍｇ、約３４ｍｇ、約３５ｍｇ、約３６ｍｇ、約３７ｍｇ、約３８ｍｇ、約３９ｍｇ、約４０ｍｇ、約４１ｍｇ、約４２ｍｇ、約４３ｍｇ、約４４ｍｇ、約４５ｍｇ、約４６ｍｇ、約４７ｍｇ、約４８ｍｇ、約４９ｍｇ、約５０ｍｇ、約５１ｍｇ、約５２ｍｇ、約５３ｍｇ、約５４ｍｇ、約５５ｍｇ、約５６ｍｇ、約５７ｍｇ、約５８ｍｇ、約５９ｍｇ、約６０ｍｇ、約６１ｍｇ、約６２ｍｇ、約６３ｍｇ、約６４ｍｇ、約６５ｍｇ、約６６ｍｇ、約６７ｍｇ、約６８ｍｇ、約６９ｍｇ、約７０ｍｇ、約７１ｍｇ、約７２ｍｇ、約７３ｍｇ、約７４ｍｇ、約７５ｍｇ、約７６ｍｇ、約７７ｍｇ、約７８ｍｇ、約７９ｍｇ、約８０ｍｇ、約８１ｍｇ、約８２ｍｇ、約８３ｍｇ、約８４ｍｇ、約８５ｍｇ、約８６ｍｇ、約８７ｍｇ、約８８ｍｇ、約８９ｍｇ、約９０ｍｇ、約９１ｍｇ、約９２ｍｇ、約９３ｍｇ、約９４ｍｇ、約９５ｍｇ、約９６ｍｇ、約９７ｍｇ、約９８ｍｇ、約９９ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約２５０ｍｇ、約２６０ｍｇ、約２７０ｍｇ、約２８０ｍｇ、約２９０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３１０ｍｇ、約３２０ｍｇ、約３３０ｍｇ、約３４０ｍｇ、約３５０ｍｇ、約３６０ｍｇ、約３７０ｍｇ、約３８０ｍｇ、約３９０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４１０ｍｇ、約４２０ｍｇ、約４３０ｍｇ、約４４０ｍｇ、約４５０ｍｇ、約４６０ｍｇ、約４７０ｍｇ、約４８０ｍｇ、約４９０ｍｇ、約５００ｍｇ、約５１０ｍｇ、約５２０ｍｇ、約５３０ｍｇ、約５４０ｍｇ、約５５０ｍｇ、約５６０ｍｇ、約５７０ｍｇ、約５８０ｍｇ、約５９０ｍｇ、約６００ｍｇ、約６１０ｍｇ、約６２０ｍｇ、約６３０ｍｇ、約６４０ｍｇ、約６５０ｍｇ、約６６０ｍｇ、約６７０ｍｇ、約６８０ｍｇ、約６９０ｍｇ、約７００ｍｇ、約７１０ｍｇ、約７２０ｍｇ、約７３０ｍｇ、約７４０ｍｇ、約７５０ｍｇ、約７６０ｍｇ、約７７０ｍｇ、約７８０ｍｇ、約７９０ｍｇ、約８００ｍｇ、約８１０ｍｇ、約８２０ｍｇ、約８３０ｍｇ、約８４０ｍｇ、約８５０ｍｇ、約８６０ｍｇ、約８７０ｍｇ、約８８０ｍｇ、約８９０ｍｇ、約９００ｍｇ、約９１０ｍｇ、約９２０ｍｇ、約９３０ｍｇ、約９４０ｍｇ、約９５０ｍｇ、約９６０ｍｇ、約９７０ｍｇ、約９８０ｍｇ、約９９０ｍｇ、又は約１，０００ｍｇである。実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として発現される場合の第１のポリペプチドの収量は、宿主細胞懸濁液１リットル当たり少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約２ｍｇ、少なくとも約３ｍｇ、少なくとも約４ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約６ｍｇ、少なくとも約７ｍｇ、少なくとも約８ｍｇ、少なくとも約９ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約１１ｍｇ、少なくとも約１２ｍｇ、少なくとも約１３ｍｇ、少なくとも約１４ｍｇ、少なくとも約１５ｍｇ、少なくとも約１６ｍｇ、少なくとも約１７ｍｇ、少なくとも約１８ｍｇ、少なくとも約１９ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約２１ｍｇ、少なくとも約２２ｍｇ、少なくとも約２３ｍｇ、少なくとも約２４ｍｇ、少なくとも約２５ｍｇ、少なくとも約２６ｍｇ、少なくとも約２７ｍｇ、少なくとも約２８ｍｇ、少なくとも約２９ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約３１ｍｇ、少なくとも約３２ｍｇ、少なくとも約３３ｍｇ、少なくとも約３４ｍｇ、少なくとも約３５ｍｇ、少なくとも約３６ｍｇ、少なくとも約３７ｍｇ、少なくとも約３８ｍｇ、少なくとも約３９ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約４１ｍｇ、少なくとも約４２ｍｇ、少なくとも約４３ｍｇ、少なくとも約４４ｍｇ、少なくとも約４５ｍｇ、少なくとも約４６ｍｇ、少なくとも約４７ｍｇ、少なくとも約４８ｍｇ、少なくとも約４９ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約５１ｍｇ、少なくとも約５２ｍｇ、少なくとも約５３ｍｇ、少なくとも約５４ｍｇ、少なくとも約５５ｍｇ、少なくとも約５６ｍｇ、少なくとも約５７ｍｇ、少なくとも約５８ｍｇ、少なくとも約５９ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約６１ｍｇ、少なくとも約６２ｍｇ、少なくとも約６３ｍｇ、少なくとも約６４ｍｇ、少なくとも約６５ｍｇ、少なくとも約６６ｍｇ、少なくとも約６７ｍｇ、少なくとも約６８ｍｇ、少なくとも約６９ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約７１ｍｇ、少なくとも約７２ｍｇ、少なくとも約７３ｍｇ、少なくとも約７４ｍｇ、少なくとも約７５ｍｇ、少なくとも約７６ｍｇ、少なくとも約７７ｍｇ、少なくとも約７８ｍｇ、少なくとも約７９ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約８１ｍｇ、少なくとも約８２ｍｇ、少なくとも約８３ｍｇ、少なくとも約８４ｍｇ、少なくとも約８５ｍｇ、少なくとも約８６ｍｇ、少なくとも約８７ｍｇ、少なくとも約８８ｍｇ、少なくとも約８９ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約９１ｍｇ、少なくとも約９２ｍｇ、少なくとも約９３ｍｇ、少なくとも約９４ｍｇ、少なくとも約９５ｍｇ、少なくとも約９６ｍｇ、少なくとも約９７ｍｇ、少なくとも約９８ｍｇ、少なくとも約９９ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１１０ｍｇ、少なくとも約１２０ｍｇ、少なくとも約１３０ｍｇ、少なくとも約１４０ｍｇ、少なくとも約１５０ｍｇ、少なくとも約１６０ｍｇ、少なくとも約１７０ｍｇ、少なくとも約１８０ｍｇ、少なくとも約１９０ｍｇ、少なくとも約２００ｍｇ、少なくとも約２１０ｍｇ、少なくとも約２２０ｍｇ、少なくとも約２３０ｍｇ、少なくとも約２４０ｍｇ、少なくとも約２５０ｍｇ、少なくとも約２６０ｍｇ、少なくとも約２７０ｍｇ、少なくとも約２８０ｍｇ、少なくとも約２９０ｍｇ、少なくとも約３００ｍｇ、少なくとも約３１０ｍｇ、少なくとも約３２０ｍｇ、少なくとも約３３０ｍｇ、少なくとも約３４０ｍｇ、少なくとも約３５０ｍｇ、少なくとも約３６０ｍｇ、少なくとも約３７０ｍｇ、少なくとも約３８０ｍｇ、少なくとも約３９０ｍｇ、少なくとも約４００ｍｇ、少なくとも約４１０ｍｇ、少なくとも約４２０ｍｇ、少なくとも約４３０ｍｇ、少なくとも約４４０ｍｇ、少なくとも約４５０ｍｇ、少なくとも約４６０ｍｇ、少なくとも約４７０ｍｇ、少なくとも約４８０ｍｇ、少なくとも約４９０ｍｇ、少なくとも約５００ｍｇ、少なくとも約５１０ｍｇ、少なくとも約５２０ｍｇ、少なくとも約５３０ｍｇ、少なくとも約５４０ｍｇ、少なくとも約５５０ｍｇ、少なくとも約５６０ｍｇ、少なくとも約５７０ｍｇ、少なくとも約５８０ｍｇ、少なくとも約５９０ｍｇ、少なくとも約６００ｍｇ、少なくとも約６１０ｍｇ、少なくとも約６２０ｍｇ、少なくとも約６３０ｍｇ、少なくとも約６４０ｍｇ、少なくとも約６５０ｍｇ、少なくとも約６６０ｍｇ、少なくとも約６７０ｍｇ、少なくとも約６８０ｍｇ、少なくとも約６９０ｍｇ、少なくとも約７００ｍｇ、少なくとも約７１０ｍｇ、少なくとも約７２０ｍｇ、少なくとも約７３０ｍｇ、少なくとも約７４０ｍｇ、少なくとも約７５０ｍｇ、少なくとも約７６０ｍｇ、少なくとも約７７０ｍｇ、少なくとも約７８０ｍｇ、少なくとも約７９０ｍｇ、少なくとも約８００ｍｇ、少なくとも約８１０ｍｇ、少なくとも約８２０ｍｇ、少なくとも約８３０ｍｇ、少なくとも約８４０ｍｇ、少なくとも約８５０ｍｇ、少なくとも約８６０ｍｇ、少なくとも約８７０ｍｇ、少なくとも約８８０ｍｇ、少なくとも約８９０ｍｇ、少なくとも約９００ｍｇ、少なくとも約９１０ｍｇ、少なくとも約９２０ｍｇ、少なくとも約９３０ｍｇ、少なくとも約９４０ｍｇ、少なくとも約９５０ｍｇ、少なくとも約９６０ｍｇ、少なくとも約９７０ｍｇ、少なくとも約９８０ｍｇ、少なくとも約９９０ｍｇ、又は少なくとも約１，０００ｍｇである。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドの収量は、宿主細胞懸濁液１リットル当たり１５ｍｇ超、１リットル当たり３０ｍｇ超、１リットル当たり５０ｍｇ超、１リットル当たり１００ｍｇ超、１リットル当たり２００ｍｇ超、又は１リットル当たり２００ｍｇ超である。実施形態では、第１のポリペプチドの収量は、宿主細胞懸濁液１リットル当たり７５ｍｇ超である。細胞懸濁液は、細胞培養物と互換的に呼ばれ得る。

【0299】

いくつかの実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として産生される第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない（即ち、相挙動を有する第２のポリペプチドに融合されずに発現される）第１のポリペプチドの収量の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、又はそれ以上である。実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として産生される第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの収量よりも約３倍多い。

【0300】

いくつかの実施形態では、相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として産生される第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない場合の第１のポリペプチドの収量よりも少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２５％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１７５％、少なくとも約２００％、少なくとも約２２５％、少なくとも約２５０％、少なくとも約２７５％、少なくとも約３００％、少なくとも約３２５％、少なくとも約３５０％、少なくとも約３７５％、少なくとも約４００％、少なくとも約４２５％、少なくとも約４５０％、少なくとも約４７５％、少なくとも約５００％、少なくとも約５２５％、少なくとも約５５０％、少なくとも約５７５％、少なくとも約６００％、少なくとも約６２５％、少なくとも約６５０％、少なくとも約６７５％、少なくとも約７００％、少なくとも約７２５％、少なくとも約７５０％、少なくとも約７７５％、少なくとも約８００％、少なくとも約８２５％、少なくとも約８５０％、少なくとも約８７５％、少なくとも約９００％、少なくとも約９２５％、少なくとも約９５０％、少なくとも約９７５％、少なくとも約１，０００％、少なくとも約１，１００％、少なくとも約１，１２５％、少なくとも約１，１５０％、少なくとも約１，１７５％、少なくとも約１，２００％、少なくとも約１，２２５％、少なくとも約１，２５０％、少なくとも約１，２７５％、少なくとも約１，３００％、少なくとも約１，３２５％、少なくとも約１，３５０％、少なくとも約１，３７５％、少なくとも約１，４００％、少なくとも約１，４２５％、少なくとも約１，４５０％、少なくとも約１，４７５％、少なくとも約１，５００％、少なくとも約１，５２５％、少なくとも約１，５５０％、少なくとも約１，５７５％、少なくとも約１，６００％、少なくとも約１，６２５％、少なくとも約１，６５０％、少なくとも約１，６７５％、少なくとも約１，７００％、少なくとも約１，７２５％、少なくとも約１，７５０％、少なくとも約１，７７５％、少なくとも約１，８００％、少なくとも約１，８２５％、少なくとも約１，８５０％、少なくとも約１，８７５％、少なくとも約１，９００％、少なくとも約１，９２５％、少なくとも約１，９５０％、少なくとも約１，９７５％、又は少なくとも約２，０００％（それらの間のすべての範囲及び値を含む）多い。実施形態では、第１のポリペプチドの収量は、融合タンパク質として発現されない第１のポリペプチドの収量より約３００％高い。

【0301】

融合タンパク質の第１のポリペプチドを精製する方法
本明細書では、第１のポリペプチドを精製する方法も提供され、この方法は、（ｉ）第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第１の環境因子を適用して、融合タンパク質を可逆的に凝集させるステップ；（ｉｉｉ）融合タンパク質凝集体を少なくとも１つの汚染物質から分離するステップ；並びに（ｉｖ）第２の環境因子を適用して、融合タンパク質を脱凝集させるステップを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、本明細書に記載の任意の融合タンパク質である。

【0302】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの汚染物質は、溶媒、タンパク質、ペプチド、炭水化物、核酸、ウイルス、細胞（例えば、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞）、炭水化物、脂質、又はリポ多糖である。いくつかの実施形態では、汚染物質は、エンドトキシン又はマイコトキシンである。

【0303】

理論に束縛されるものではないが、第１の環境因子の適用は、相挙動を有するポリペプチド間の分子間相互作用を介した融合タンパク質の凝集を引き起こし、融合タンパク質凝集体が生じる。いくつかの実施形態では、環境因子は、環境因子の導入前の融合タンパク質のサイズよりも大きい融合タンパク質凝集体の形成を引き起こす。本明細書で使用される場合、「サイズの増加」という語句は、融合タンパク質の直径の増加又は融合タンパク質の質量の増加を指し得る。いくつかの実施形態では、サイズの増加は、融合タンパク質のモル質量の増加である。いくつかの実施形態では、サイズの増加は、融合タンパク質の流体力学的半径の増加である。

【0304】

いくつかの実施形態では、サイズの増加は、相挙動を有するポリペプチド間の非共有結合相互作用によって安定化される。いくつかの実施形態では、非共有結合相互作用は、双極子間力、ファンデルワールス力、ロンドン分散力、水素結合、疎水性相互作用、及び／又は静電相互作用である。

【0305】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体のサイズは、環境因子の導入前の融合タンパク質のサイズよりも少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約３５倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約４５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約５５倍、少なくとも約６０倍、少なくとも約６５倍、少なくとも約７０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約８０倍、少なくとも約８５倍、少なくとも約９０倍、少なくとも約９５倍、少なくとも約１００倍大きい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体のサイズは、環境因子の導入前の融合タンパク質のサイズより少なくとも２倍大きい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体のサイズは、環境因子の導入前の融合タンパク質のサイズより少なくとも５倍大きい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体のサイズは、環境因子の導入前の融合タンパク質のサイズより少なくとも１０倍大きい。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体のサイズは、環境因子の導入前の融合タンパク質のサイズより少なくとも２５倍大きい。

【0306】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質と比較した融合タンパク質凝集体のサイズの増加は、肉眼で視覚的に観察することができる。例えば、サイズの増加により、複合体を含む組成物の色、透明度、粘度が変化する可能性があり、且つ／又は複合体の溶解度が変化する（例えば、溶液から沈殿する）可能性があり、そのような変化は、特別な機器を一切使用しなくても人間が観察可能である。

【0307】

いくつかの実施形態では、当業者は、当技術分野で公知の方法に従って、融合タンパク質凝集体のサイズの増加を測定することができる。いくつかの実施形態では、サイズの増加は、Ｘ線散乱、小角Ｘ線散乱、広角Ｘ線散乱、動的光散乱、分析用超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、及び光子相関分光法からなる群から選択される技術を利用して測定することができる。

【0308】

いくつかの実施形態では、環境因子は、本明細書に記載の環境因子である。例えば、いくつかの実施形態では、環境因子は、（ａ）温度、ｐＨ、塩濃度、又は圧力のうちの１つ又は複数の変化；（ｂ）１つ又は複数の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、酵素、変性剤の添加；又は（ｃ）電磁波の印加である。

【0309】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、その洗浄によって１つ又は複数の不純物から分離される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体の洗浄は、融合タンパク質の凝集を妨げない。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、緩衝液で洗浄される。緩衝液の非限定的な例としては、酢酸ナトリウム、生理食塩水、グリシン－ＨＣＬ、カコジル酸緩衝液、トリス－ＨＣｌ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、クエン酸塩、リン酸緩衝液、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（Ｔｒｉｓ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニン、ヒスチジン、尿素、プルロン酸、及びトリトン－Ｘ－１００のうちの１つ又は複数を含む。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ－精製マトリックス複合体は、溶媒で洗浄される。溶媒の非限定的な例としては、アセトン、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、水、エタノール、トルエン、酢酸メチル、及び酢酸エチルが挙げられる。

【0310】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、サイズに基づいて少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、直径に基づいて少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、半径に基づいて少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、質量に基づいて少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、モル質量に基づいて少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ精製マトリックスは、遠心分離、接線流ろ過、分析用超遠心分離、膜クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、全量ろ過、音波分離、遠心分離、向流遠心分離、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技術を使用することによって、サイズに基づいて少なくとも１つの不純物から分離される融合タンパク質凝集体である。

【0311】

いくつかの実施形態では、分離は、音波分離を使用して達成される。いくつかの実施形態では、音波は、約１Ｈｚ～２，０００ｋＨｚの周波数を有する。いくつかの実施形態では、音波は、約１Ｈｚ、約５Ｈｚ、約１０Ｈｚ、約２０Ｈｚ、約３０Ｈｚ、約４０Ｈｚ、約５０Ｈｚ、約６０Ｈｚ、約７０Ｈｚ、約８０Ｈｚ、約９０Ｈｚ、約１００Ｈｚ、約２００Ｈｚ、約３００Ｈｚ、約４００Ｈｚ、約５００Ｈｚ、約６００Ｈｚ、約７００Ｈｚ、約８００Ｈｚ、約９００Ｈｚ、約１ｋＨｚ、約１００ｋＨｚ、約２００ｋＨｚ、約３００ｋＨｚ、約４００ｋＨｚ、約５００ｋＨｚ、約６００ｋＨｚ、約７００ｋＨｚ、約８００ｋＨｚ、約９００ｋＨｚ、約１，０００ｋＨｚ、約１，１００ｋＨｚ、約１，２００ｋＨｚ、約１，３００ｋＨｚ、約１，４００ｋＨｚ、約１，５００ｋＨｚ、約１，６００ｋＨｚ、約１，７００ｋＨｚ、約１，８００ｋＨｚ、約１，９００ｋＨｚ、又は約２，０００ｋＨｚの周波数を有する。

【0312】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、遠心分離を使用して、サイズに基づいて少なくとも１つの不純物から分離する。いくつかの実施形態では、約１００相対遠心力（ＲＣＦ）～約１６，０００ＲＣＦ、例えば、約５００～約１６，０００ＲＣＦ、約１，０００ＲＣＦ～１６，０００ＲＣＦが適用されて、融合タンパク質凝集体が少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、少なくとも５００の相対遠心力（ＲＣＦ）、例えば、少なくとも約５００ＲＣＦ、少なくとも約６００ＲＣＦ、少なくとも約７００ＲＣＦ、少なくとも約８００ＲＣＦ、少なくとも約９００ＲＣＦ、少なくとも約１，０００ＲＣＦ、少なくとも約２，０００ＲＣＦ、少なくとも約３，０００ＲＣＦ、少なくとも約３，５００ＲＣＦ、少なくとも約４，０００ＲＣＦ、少なくとも約５，０００ＲＣＦ、少なくとも約６，０００ＲＣＦ、少なくとも約７，０００ＲＣＦ、少なくとも約８，０００ＲＣＦ、少なくとも約９，０００ＲＣＦ、少なくとも約１０，０００ＲＣＦ、少なくとも約１１，０００ＲＣＦ、少なくとも約１２，０００ＲＣＦ、少なくとも約１３，０００ＲＣＦ、少なくとも約１４，０００ＲＣＦ、少なくとも約１５，０００ＲＣＦ、少なくとも約１６，０００ＲＣＦ、少なくとも約１７，０００ＲＣＦ、少なくとも約１８，０００ＲＣＦ、少なくとも約１９，０００ＲＣＦ、又は少なくとも約２０，０００ＲＣＦが適用されて、融合タンパク質凝集体が少なくとも１つの不純物から分離れる。

【0313】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、ＴＦＦを使用することによって、サイズに基づいて少なくとも１つの不純物から分離される。いくつかの実施形態では、ＴＦＦを使用して、融合タンパク質凝集体をサイズに基づいて少なくとも１つの不純物から分離することができ、このプロセスは、本明細書では「ダイアフィルトレーション」とも呼ばれる。ダイアフィルトレーションは、洗浄ステップ及び溶出ステップの両方を含む。洗浄により、融合タンパク質凝集体を含む組成物に含まれる不純物が除去される。溶出により、精製された第１のポリペプチドが第２のポリペプチドから分離される。いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体は、ＴＦＦを使用して濃縮される。いくつかの実施形態では、ＴＦＦを使用して、組成物内の融合タンパク質凝集体の濃度を増加させることができ、このプロセスは、本明細書では「濃縮」とも呼ばれる。

【0314】

接線流ろ過は、分子を分離及び／又は濃縮するために精密ろ過膜及び限外ろ過膜の両方を使用する。精密ろ過膜は、典型的には、０．１μｍ～１０μｍの孔径を有する。限外ろ過膜は、典型的には、精密ろ過膜よりも孔径が小さく、０．００１μｍ～０．１μｍの孔径を有する。いくつかの実施形態では、約０．００１μｍ～約１０μｍの孔径を有する膜が、本開示の方法で利用される。いくつかの実施形態では、膜は、約０．００１μｍ、約０．０１μｍ、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．２μｍ、約０．３μｍ、約０．４μｍ、約０．５μｍ、約０．６μｍ、約０．７μｍ、約０．８μｍ、約０．９μｍ、約１．０μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、又は約１０μｍ（それらの間のすべての値及び範囲を含む）の孔径を有する。いくつかの実施形態では、膜は、約０．１μｍの孔径を有する。いくつかの実施形態では、膜は、約０．２μｍの孔径を有する。

【0315】

いくつかの実施形態では、膜は、親水化ポリ（フッ化ビニリデン）（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、リン酸セルロース、ジエチルアミノエチルセルロース、ポリスルホン、再生セルロース、ナイロン、硝酸セルロース、酢酸セルロース、ＰＥＧ化ＰＥＳ、及びスルホン化ＰＥＳから形成される。

【0316】

ＴＦＦでは、膜は、流体混合物の流れに対して接線方向に配置され、流体混合物が膜の第１の側を接線方向に流れるようにする。同時に、流体媒体が、膜の第２の表面と接触して配置される。膜貫通圧力は、流体を膜に押し込んで透過性分子を運ぶ力である。

【0317】

いくつかの実施形態では、サイズに基づく１つ又は複数の汚染物質又は不純物からの融合タンパク質凝集体の分離は、約０．１バール～約３バールの膜貫通圧でＴＦＦを使用して行われる。いくつかの実施形態では、膜間圧力は、約０．１バール、約０．２バール、約０．３バール、約０．４バール、約０．５バール、約０．６バール、約０．７バール、約０．８バール、約０．９バール、約１．０バール、約１．１バール、約１．２バール、約１．３バール、約１．４バール、約１．５バール、約１．６バール、約１．７バール、約１．８バール、約１．９バール、約２．０バール、約２．１バール、約２．２バール、約２．３バール、約２．４バール、約２．５バール、約２．６バール、約２．７バール、約２．８バール、約２．９バール、又は約３．０バール（それらの間のすべての値及び範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、膜間圧力は、約１．５バールである。

【0318】

いくつかの実施形態では、クロスフロー流量を調製して、本明細書の融合タンパク質凝集体の１つ又は複数の汚染物質からの分離を改善する。クロスフロー流量は、供給チャネルを通って膜を通過する溶液の流量である。これは、濾液の流れを制限できる分子を一掃する力を提供する。いくつかの実施形態では、クロスフロー流量は、約５００Ｌ／ｍ２／ｈ～約２，０００Ｌ／ｍ２／ｈである。いくつかの実施形態では、クロスフロー流量は、約５００Ｌ／ｍ２／ｈ、約６００Ｌ／ｍ２／ｈ、約７００Ｌ／ｍ２／ｈ、約８００Ｌ／ｍ２／ｈ、約９００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，０００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，１００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，２００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，３００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，４００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，５００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，６００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，７００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，８００Ｌ／ｍ２／ｈ、約１，９００Ｌ／ｍ２／ｈ、又は約２，０００Ｌ／ｍ２／ｈ（それらの間のすべての値及び範囲を含む）である。いくつかの実施形態では、クロスフロー流量は、約９６０Ｌ／ｍ２／ｈである。いくつかの実施形態では、ＴＦＦ分離は、汚染物質を通過させながら融合タンパク質凝集体を保持する膜を使用することによって行われる。

【0319】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体の少なくとも１つの汚染物質からの分離後、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドから分離される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、アミド結合を切断する酵素を導入してこの第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから分離することによって第２のポリペプチドから分離される。いくつかの実施形態では、酵素は、プロテアーゼである。

【0320】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体の分離が少なくとも１つの汚染物質から分離された後、環境因子を適用して、融合タンパク質凝集体を脱凝集させる。融合タンパク質凝集体を脱凝集させるために適用される環境因子は、本明細書に記載の任意の環境因子であり得る。

【0321】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質凝集体が少なくとも１つの不純物から分離された後、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質として溶出される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、第１のポリペプチドと相挙動を有する第２のポリペプチドを含む脱凝集された融合タンパク質として溶出される。

【0322】

いくつかの実施形態では、環境因子は、第１のポリペプチドを含む組成物のｐＨを変更することを含む。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約０．１単位、約０．２単位、約０．３単位、約０．４単位、約０．５単位、約０．６単位、約０．７単位、約０．８単位、約０．９単位、約１．０単位、約１．１単位、約１．２単位、約１．３単位、約１．４単位、約１．５単位、約１．６単位、約１．７単位、約１．８単位、約１．９単位、約２．０単位、約２．１単位、約２．２単位、約２．３単位、約２．４単位、約２．５単位、約２．６単位、約２．７単位、約２．８単位、約２．９単位、約３．０単位、約３．１単位、約３．２単位、約３．３単位、約３．４単位、約３．５単位、約３．６単位、約３．７単位、約３．８単位、約３．９単位、約４．０単位、約４．１単位、約４．２単位、約４．３単位、約４．４単位、約４．５単位、約４．６単位、約４．７単位、約４．８単位、約４．９単位、約５．０単位、約５．１単位、約５．２単位、約５．３単位、約５．４単位、約５．５単位、約５．６単位、約５．７単位、約５．８単位、約５．９単位、又は約６．０単位上げられる。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約０．１単位、約０．２単位、約０．３単位、約０．４単位、約０．５単位、約０．６単位、約０．７単位、約０．８単位、約０．９単位、約１．０単位、約１．１単位、約１．２単位、約１．３単位、約１．４単位、約１．５単位、約１．６単位、約１．７単位、約１．８単位、約１．９単位、約２．０単位、約２．１単位、約２．２単位、約２．３単位、約２．４単位、約２．５単位、約２．６単位、約２．７単位、約２．８単位、約２．９単位、約３．０単位、約３．１単位、約３．２単位、約３．３単位、約３．４単位、約３．５単位、約３．６単位、約３．７単位、約３．８単位、約３．９単位、約４．０単位、約４．１単位、約４．２単位、約４．３単位、約４．４単位、約４．５単位、約４．６単位、約４．７単位、約４．８単位、約４．９単位、約５．０単位、約５．１単位、約５．２単位、約５．３単位、約５．４単位、約５．５単位、約５．６単位、約５．７単位、約５．８単位、約５．９単位、又は約６．０単位下げられる。いくつかの実施形態では、精製された融合タンパク質は、約２のｐＨで凝集する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、約３のｐＨで精製される。

【0323】

いくつかの実施形態では、環境因子は、融合タンパク質を含む組成物の温度を変更することを含む。いくつかの実施形態では、温度は、０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃上げられる。いくつかの実施形態では、温度は、約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃下げられる。

【0324】

いくつかの実施形態では、環境因子は、融合タンパク質を含む組成物のイオン強度を変更することを含む。いくつかの実施形態では、イオン強度の変更は、塩の濃度を高めることによってもたらされる。いくつかの実施形態では、イオン強度の変更は、塩の濃度を減少させることによってもたらされる。塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グリシン、アルギニン、硫酸銅、ヨウ化ナトリウム、硫酸アンモニウム、及び硫酸ナトリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質を含む組成物、汚染物質、及び／又は分子の塩の濃度を変更するために透析が使用される。

【0325】

いくつかの実施形態では、環境因子は、融合タンパク質を含む組成物への還元剤の添加を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ヒドラジン、水素化ホウ素、アミンボラン、低級アルキル置換アミンボラン、トリエタノールアミン、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる群から選択される。

【0326】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の第１のポリペプチドを含む融合タンパク質を精製する方法は、約３０分～約２４時間で完了する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、約３０分～約２４時間で完了する。いくつかの実施形態では、この方法は、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間で完了する。いくつかの実施形態では、本明細書の融合タンパク質及び／又は第１のポリペプチドを精製する方法は、約２時間～約１０時間で完了する。

【0327】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質の精製後、第１のポリペプチドが、第２のポリペプチドから分離される。いくつかの実施形態では、第１のポリペプチドは、アミド結合を切断する酵素を導入してこの第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから分離することによって、第２のポリペプチドから分離される。いくつかの実施形態では、酵素はプロテアーゼである。

【0328】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質及び／又は第１のポリペプチドの精製収率は、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％である。

【0329】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質及び／又は第１のポリペプチドは、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の純度まで精製される。

【0330】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、１日当たり少なくとも０．１ｋｇ、少なくとも約０．２ｋｇ、少なくとも約０．３ｋｇ、少なくとも約０．４ｋｇ、少なくとも約０．５ｋｇ、少なくとも約０．６ｋｇ、少なくとも約０．７ｋｇ、少なくとも約０．８ｋｇ、少なくとも約０．９ｋｇ、少なくとも約１ｋｇ、少なくとも約２ｋｇ、少なくとも約３ｋｇ、少なくとも約４ｋｇ、少なくとも約５ｋｇ、少なくとも約６ｋｇ、少なくとも約７ｋｇ、少なくとも約８ｋｇ、少なくとも約９ｋｇ、少なくとも約１０ｋｇ、又はそれ以上（それらの間のすべての値及び範囲を含む）の融合タンパク質及び／又は第１のポリペプチドの精製を可能にする。

【0331】

核酸基質上で酵素プロセスを実施する方法
融合タンパク質を使用して、制御された方法で、核酸基質上で酵素プロセスを実施することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の第１のタンパク質は、酵素又はその触媒断片若しくは誘導体である。例えば、このプロセスは、二相組成物で実施することができる。このような組成物では、基質は、第１の相に存在し得、融合タンパク質は、第２の相に存在し得る。必要に応じて、融合タンパク質を第１の相に入れ、それによって基質と接触するようにする環境因子を適用することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質を第１の相から出るようにし、融合タンパク質がもはや基質と接触できないようにする第２の環境因子を適用することができる。このプロセスを使用して、制御された方法で、基質上で多段階酵素プロセスを実施することができる。例えば、基質が第１の相に存在し、複数の融合タンパク質が第２の相に存在し得る二相組成物を提供することができる。複数の融合タンパク質は、異なる相挙動を含む融合タンパク質を含む。必要に応じて、１つ又は複数の融合タンパク質を基質に接触させ、且つ／又は基質から分離する第１の環境因子を適用することができる。加えて、１つ又は複数の追加の融合タンパク質を基質に接触させ、且つ／又は基質から分離する第２の環境因子を適用することができる。このようなプロセスは、ＲＮＡのインビトロ転写などの目的の生物製剤の合成に役立ち得る。

【0332】

実施形態では、核酸基質は、ＤＮＡ又はＲＮＡである。実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは、一本鎖である。実施形態では、ＤＮＡ又はＲＮＡは、二本鎖である。実施形態では、核酸は、ＲＮＡであり、ＲＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、又はリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）から選択される。実施形態では、ｍＲＮＡは低分子ＲＮＡである。低分子ＲＮＡは、約１８～約３０のヌクレオチド、例えば、約１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、又は３０のヌクレオチドを含む。

【0333】

実施形態では、酵素は、本明細書に記載のＮＢＰのいずれか１つである。実施形態では、ＮＢＰは、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、無機ピロホスファターゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＤＮアーゼＩ、仔ウシ腸ホスファターゼ、南極ホスファターゼ、ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニット、グアニン－７－メチルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、グアニリルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、ＲＮＡトリホスファターゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１２サブユニット、ステムループ結合タンパク質、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＧｒｏＥＬ、Ｅｄｃ３、ＤＨＸ９、Ｘｒｎ１、Ｄｃｐ１、Ｄｃｐ２、ＬＡＦ－１、ＭＥＧ－１、ＭＥＧ－３、ＡＳＦ／ＳＦ２スプライシング因子、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子４（ＳＲｐ７５）、セリン及びアルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）、Ｌ３リボソームタンパク質、Ｌ４リボソームタンパク質、Ｌ１３リボソームタンパク質、Ｌ２０リボソームタンパク質、Ｌ２２リボソームタンパク質、Ｌ２４リボソームタンパク質、Ｌ２４ｅリボソームタンパク質、Ｓ１２リボソームタンパク質、Ｓ１４リボソームタンパク質、及び真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＲＳＧ－１．２ペプチド、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＤ（ｅＩＦ３Ｄ）、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡＲ１）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡＲ２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｓｐＢ（Ｂｓｃｓｃｐ）、Ｙボックスタンパク質１コールドショックドメイン（ＹＢ１－ＣＳＤ）、Ｆｏｘ－１タンパク質（ＦＯＸ１）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｓｔａｕｆｅｎタンパク質、ＴＩＳ１１ｄ、ジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様タンパク質、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ３）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、テトラトリコペプチド反復１を有するインターフェロン誘導性タンパク質（ＩＦＩＴ１）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、オリゴアデニル酸シンターゼ様（ＯＡＳＬ）タンパク質（例えば、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、又はＯＡＳＬ）、リボヌクレアーゼＥ（ＲＮＡＳＥ Ｅ）、ガンマインターフェロン誘導性タンパク質Ｉｆｉ－１６（ＩＦ１１６）、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、又はそれらの触媒断片から選択される。

【0334】

実施形態では、ＮＢＰは、短鎖モチーフ（ＳＬｉＭ）、ＲＧ［Ｇ］反復、ＲＧＧ反復、ＲＳ／ＲＧリッチドメイン、Ｋ／Ｒ塩基性パッチ、分子認識機能、低複雑性配列、ＲＮＡ認識モチーフ、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン、Ｋ相同ドメイン、ジンクフィンガードメイン（例、ＣＣＨＨ ＺＦドメイン、ＣＣＣＣ（Ｒａｎ－ＢＰ２）ドメイン、ＣＣＣＨ ＺＦドメイン）、ＲＧＧドメイン、Ｐｕｍｉｌｌｏファミリードメイン、ペンタトリコペプチドドメイン、コールドショックドメイン、ヘリカーゼドメイン、Ｌａモチーフ、Ｐｉｗｉ－Ａｒｇｏｎａｕｔｅ－Ｚｗｉｌｌｅ（ＰＡＺ）ドメイン、ＰＩＷＩ（Ｐ－ｅｌｅｍｅｎｔ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｍｐｙ ｔｅｓｔｉｓ）、プソイドウリジンシンターゼ及びＰＵＡ（ａｒｃｈａｅｏｓｉｎｅ ｔｒａｎｓｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅ）、Ｐｕｍｉｌｌｏ様反復（ＰＵＭ）、リボソームＳ１様（Ｓ１）、Ｓｍ及びＬｉｋｅ－Ｓｍ（Ｓｍ／Ｌｓｍ）反復、チウリジンシンターゼ及びＲＮＡメチラーゼ及びプソイドウリジンシンターゼ（ＴＨＵＭＰ）、又はＹＴ５２１－Ｂ相同性を有するドメインのうちの１つ又は複数を含む。

【0335】

実施形態では、相挙動を有するポリペプチドは、本明細書に記載の相挙動を有する任意のポリペプチドである。

【0336】

いくつかの実施形態では、基質上で酵素プロセスを実施する方法は、（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；並びに（ｉｉ）第１の酵素が基質と接触することを可能にする第１の環境因子を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の酵素を基質から分離する追加の環境因子をさらに含む。

【0337】

いくつかの実施形態では、基質上で多段階酵素プロセスを実施する方法は、（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｖ）第３の環境因子を適用して、第１の酵素を基質から分離するステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、この方法は、（ｖｉ）第４の環境因子を適用して、第２の酵素を基質から分離するステップをさらに含む。

【0338】

いくつかの実施形態では、この方法は、追加の融合タンパク質、例えば、第３の融合タンパク質、第４の融合タンパク質、及び第５の融合タンパク質などを用意するステップをさらに含む。追加の各融合タンパク質は、追加の酵素及び相挙動を有するポリペプチドを含む。例えば、第３の融合タンパク質は、第３の酵素及び第３の相挙動を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数の融合タンパク質が提供され、各融合タンパク質は、異なる酵素を含むが、融合タンパク質のうちの少なくとも２つは、同じ相挙動を有するポリペプチドを含む。

【0339】

いくつかの実施形態では、基質上で多段階酵素プロセスを実施する方法が本明細書で提供され、この方法は：（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、基質と接触させ、基質を単離し、且つ／又は基質を精製する方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、融合タンパク質及び基質を含む濃縮された液滴の形成を可能にする。例えば、いくつかの実施形態では、（ｉ）酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼ及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質、（ｉｉ）ｍＲＮＡ基質、並びに（ｉｉｉ）ポリ（アデニル酸）ヌクレオチドを含む組成物への塩の添加により、濃縮された液滴が形成される。いくつかの実施形態では、ポリアデニル酸ポリメラーゼは、濃縮された液滴中のｍＲＮＡ基質にポリ（アデニル酸）ヌクレオチドを付加する。

【0340】

いくつかの実施形態では、この方法は、酵素及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質を基質と共にインキュベートするステップを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、約１０分間～約２４時間、例えば、約１０分間、約１５分間、約２０分間、約２５分間、約３０分間、約３５分間、約４０分間、約４５分間、約５０分間、約５５分間、又は約６０分間、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約１３時間、約１４時間、約１５時間、約１６時間、約１７時間、約１８時間、約１９時間、約２０時間、約２１時間、約２２時間、約２３時間、又は約２４時間（それらの間のすべての範囲を含む）基質と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、約１時間～約４時間基質と共にインキュベートされる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、約１０分～約１時間基質と共にインキュベートされる。

【0341】

いくつかの実施形態では、インキュベーションは、約１０℃～約８０℃の温度、例えば、約１０℃、１５℃、１６℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、３７℃、約４０℃、約４５℃、約５０℃、約５５℃、約６０℃、約６５℃、約７０℃、約７５℃、又は約８０℃で行われる。

【0342】

いくつかの実施形態では、環境因子の導入により、相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質の酵素の基質へのアクセスが可能になる。例えば、環境因子の導入により、融合タンパク質が可溶化され、酵素と基質との間の反応を起こすことができる。いくつかの実施形態では、環境因子の導入により、酵素の基質へのアクセスが妨げられる。例えば、環境因子の導入により、融合タンパク質を沈殿させることができる。

【0343】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、基質から分離される。いくつかの実施形態では、分離は、サイズ及び／又は密度に基づいて、例えば、分子量又は直径に基づいて行われる。いくつかの実施形態では、サイズに基づいて分子を分離するための本明細書に記載の技術のいずれかを適用して、融合タンパク質を基質から分離することができる。いくつかの実施形態では、連続遠心分離、接線流ろ過、又は遠心分離を使用して、サイズに基づいて融合タンパク質を基質から分離する。

【0344】

いくつかの実施形態では、多段階酵素プロセスは、インビトロ転写であり、基質は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、直鎖状ＤＮＡ又は環状ＤＮＡである。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質の第１の酵素は、ＲＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、Ｔ７、Ｔ３、又はＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼである。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質は、ＤＮＡ基質を含む組成物に添加される。いくつかの実施形態では、組成物はまた、リボヌクレオチド三リン酸及び／又は緩衝液（例えば、ジチオスレイトール及びマグネシウムを含む緩衝液）を含む。いくつかの実施形態では、環境因子が添加され、第１の酵素（例えば、ＲＮＡポリメラーゼ）のＤＮＡ基質へのアクセスが可能になる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質及びＤＮＡ基質は、約１０分間～約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼとＤＮＡ基質とのインキュベーションにより、ＲＮＡが産生される。いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質は、環境因子の適用によって基質から分離される。いくつかの実施形態では、サイズに基づいて分子を分離するための本明細書に記載の任意の方法を使用して、ＲＮＡを第１の融合タンパク質から分離する。

【0345】

いくつかの実施形態では、第１の融合タンパク質の第１の酵素との反応後に産生されるＲＮＡは、さらなる酵素反応の基質として使用される。例えば、いくつかの実施形態では、第２の酵素ｍＲＮＡ Ｃａｐ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及び相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質がＲＮＡに添加される。この反応により、５’末端にメチル基を含むＲＮＡが産生される。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質及びＲＮＡ基質は、約１０分間～約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質は、環境因子の適用によって基質から分離される。いくつかの実施形態では、サイズに基づいて分子を分離するための本明細書に記載の任意の方法を使用して、キャップ付きｍＲＮＡを第２の融合タンパク質から分離する。

【0346】

いくつかの実施形態では、第２の酵素ポリアデニル酸ポリメラーゼを含む第２の融合タンパク質がＲＮＡ基質に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ基質を含む組成物は、ポリ（アデニル酸）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む組成物は、ポリアデニル酸ポリメラーゼを含む。ポリアデニル酸ポリメラーゼは、ポリ（Ａ）尾部のＲＮＡへの付加を触媒する。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質及びＲＮＡ基質は、約１０分間～約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質は、環境因子の適用によって基質から分離される。いくつかの実施形態では、サイズに基づいて分子を分離するための本明細書に記載の任意の方法を使用して、ポリ（Ａ）尾部を含むＲＮＡを第２の融合タンパク質から分離する。

【0347】

いくつかの実施形態では、第２の酵素ＰＡＢＰを含む第２の融合タンパク質がＲＮＡ基質に添加される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ基質を含む組成物は、ポリ（アデニル酸）ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡを含む組成物は、ポリアデニル酸ポリメラーゼを含む。ＰＡＢＰは、ポリ（Ａ）尾部のＲＮＡへの付加を助ける。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質及びＲＮＡ基質は、約１０分間～約２４時間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、第２の融合タンパク質は、環境因子の適用によって基質から分離される。いくつかの実施形態では、サイズに基づいて分子を分離するための本明細書に記載の任意の方法を使用して、ポリ（Ａ）尾部を含むＲＮＡを第２の融合タンパク質から分離する。

【0348】

環境因子
いくつかの実施形態では、本開示の方法は、本明細書の融合タンパク質を含む組成物に対する１つ又は複数の環境因子を提供する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の環境因子を適用して、融合タンパク質を可逆的に凝集させる。環境因子の適用は、融合タンパク質を含む組成物に変化を引き起こす。いくつかの実施形態では、環境因子を使用して、融合タンパク質を可逆的に凝集させる。いくつかの実施形態では、環境因子を使用して、融合タンパク質を可逆的に脱凝集させる。いくつかの実施形態では、環境因子を使用して、融合タンパク質を含む組成物中の１つ又は複数の不純物から融合タンパク質を分離する。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の環境因子は、融合タンパク質凝集体のサイズを増加させる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の環境因子は、融合タンパク質の第１のポリペプチドがその構造、機能、及び活性を保持することを可能にする。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の環境因子は、融合タンパク質の第１のポリペプチドがその天然の構造、機能、及び活性を増強することを可能にする。

【0349】

いくつかの実施形態では、本開示の方法は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０の環境因子を少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、又は少なくとも１０の融合タンパク質を含む組成物に適用するステップを含む。

【0350】

いくつかの実施形態では、環境因子は、温度の変化である。いくつかの実施形態では、温度は、約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃上げられる。いくつかの実施形態では、温度は、約０．５℃、約１℃、約２℃、約３℃、約４℃、約５℃、約６℃、約７℃、約８℃、約９℃、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、約１５℃、約１６℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３１℃、約３２℃、約３３℃、約３４℃、約３５℃、約３６℃、約３７℃、約３８℃、約３９℃、又は約４０℃下げられる。

【0351】

いくつかの実施形態では、環境因子は、ｐＨの変化である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約０．１単位、約０．２単位、約０．３単位、約０．４単位、約０．５単位、約０．６単位、約０．７単位、約０．８単位、約０．９単位、約１．０単位、約１．１単位、約１．２単位、約１．３単位、約１．４単位、約１．５単位、約１．６単位、約１．７単位、約１．８単位、約１．９単位、約２．０単位、約２．１単位、約２．２単位、約２．３単位、約２．４単位、約２．５単位、約２．６単位、約２．７単位、約２．８単位、約２．９単位、約３．０単位、約３．１単位、約３．２単位、約３．３単位、約３．４単位、約３．５単位、約３．６単位、約３．７単位、約３．８単位、約３．９単位、約４．０単位、約４．１単位、約４．２単位、約４．３単位、約４．４単位、約４．５単位、約４．６単位、約４．７単位、約４．８単位、約４．９単位、約５．０単位、約５．１単位、約５．２単位、約５．３単位、約５．４単位、約５．５単位、約５．６単位、約５．７単位、約５．８単位、約５．９単位、又は約６．０単位上げられる。

【0352】

いくつかの実施形態では、ｐＨは、約０．１単位、約０．２単位、約０．３単位、約０．４単位、約０．５単位、約０．６単位、約０．７単位、約０．８単位、約０．９単位、約１．０単位、約１．１単位、約１．２単位、約１．３単位、約１．４単位、約１．５単位、約１．６単位、約１．７単位、約１．８単位、約１．９単位、約２．０単位、約２．１単位、約２．２単位、約２．３単位、約２．４単位、約２．５単位、約２．６単位、約２．７単位、約２．８単位、約２．９単位、約３．０単位、約３．１単位、約３．２単位、約３．３単位、約３．４単位、約３．５単位、約３．６単位、約３．７単位、約３．８単位、約３．９単位、約４．０単位、約４．１単位、約４．２単位、約４．３単位、約４．４単位、約４．５単位、約４．６単位、約４．７単位、約４．８単位、約４．９単位、約５．０単位、約５．１単位、約５．２単位、約５．３単位、約５．４単位、約５．５単位、約５．６単位、約５．７単位、約５．８単位、約５．９単位、又は約６．０単位下げられる。

【0353】

いくつかの実施形態では、環境因子は、イオン強度の変化である。いくつかの実施形態では、イオン強度の変化は、塩の濃度を増加させることによってもたらされる。いくつかの実施形態では、イオン強度の変化は、塩の濃度を低下させることによってもたらされる。塩の非限定的な例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、塩化アンモニウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硫酸銅、ヨウ化ナトリウム、及び硫酸ナトリウムが挙げられる。いくつかの実施形態では、塩は、約０．１Ｍ～約５Ｍ、例えば、約０．１Ｍ、約０．２Ｍ、約０．３Ｍ、約０．４Ｍ、約０．５Ｍ、約０．６Ｍ、約０．７Ｍ、約０．８Ｍ、約０．９Ｍ、約１Ｍ、約１．１Ｍ、約１．２Ｍ、約１．３Ｍ、約１．４Ｍ、約１．５Ｍ、約１．６Ｍ、約１．７Ｍ、約１．８Ｍ、約１．９Ｍ、約２Ｍ、約２．１Ｍ、約２．２Ｍ、約２．３Ｍ、約２．４Ｍ、約２．５Ｍ、約２．６Ｍ、約２．７Ｍ、約２．８Ｍ、約２．９Ｍ、約３Ｍ、約３．１Ｍ、約３．２Ｍ、約３．３Ｍ、約３．４Ｍ、約３．５Ｍ、約３．６Ｍ、約３．７Ｍ、約３．８Ｍ、約３．９Ｍ、約４Ｍ、約４．１Ｍ、約４．２Ｍ、約４．３Ｍ、約４．４Ｍ、約４．５Ｍ、約４．６Ｍ、約４．７Ｍ、約４．８Ｍ、約４．９Ｍ、又は約５Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、塩は、０．６Ｍの濃度を有する。いくつかの実施形態では、透析を使用して、タンパク質ベースの精製マトリックス及び生物製剤を含む組成物、汚染物質、並びに／又は分子の塩の濃度を変更する。

【0354】

いくつかの実施形態では、環境因子は、補因子の添加である。補因子の非限定的な例としては、カルシウム、マグネシウム、コバルト、銅、亜鉛、鉄、マンガン、セレン、モリブデン、カリウム、補酵素Ａ（ＣｏＡ）、ヌクレオシド三リン酸、及びビタミン（例えば、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、又はＦ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、補因子は、カルシウムである。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド三リン酸は、アデノシン三リン酸、ウリジン三リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン三リン酸、又はチミジン三リン酸である。いくつかの実施形態では、ビタミンは、脂溶性である。いくつかの実施形態では、ビタミンは、水溶性である。ビタミンの非限定的な例としては、ビタミンＡ、ビタミンＢ１（チアミン）、ビタミンＢ２（リボフラビン）、ビタミンＢ３（ナイアシン又はナイアシンアミド）、ビタミンＢ５（パントテン酸）、ビタミンＢ６（ピリドキシン、ピリドキサール、又はピリドキサミン、又は塩酸ピリドキシン）、ビタミンＢ７（ビオチン）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、Ｋ１、及びＫ２、葉酸、並びにビオチンが挙げられる。

【0355】

いくつかの実施形態では、環境因子は、タンパク質ベースの精製マトリックスの濃度の変化である。いくつかの実施形態では、環境因子は、生物製剤、汚染物質、及び／又は分子の濃度の変化である。

【0356】

いくつかの実施形態では、環境因子は、タンパク質ベースの精製マトリックス及び生物製剤を含む組成物、汚染物質、及び／又は分子の圧力の変化である。いくつかの実施形態では、圧力の変化は、組成物の体積を増加又は減少させることによってもたらされ得る。

【0357】

いくつかの実施形態では、環境因子は、１つ又は複数の界面活性剤の添加である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の界面活性剤は、遊離脂肪酸塩、石鹸、脂肪酸スルホン酸塩、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、エトキシル化化合物、例えば、エトキシル化プロピレングリコール、レシチン、ポリグルコン酸塩、第四級アンモニウム塩、リグニンスルホン酸塩、３－（（３－コールアミドプロピル）ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、スクロース及びグルコースを含む糖類、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００、並びにＮＰ－４０である。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、アニオン性、非イオン性、又は両性である。

【0358】

いくつかの実施形態では、環境因子は、１つ又は複数の分子密集剤の添加である。分子密集剤の非限定的な例としては、ポリエチレングリコール、デキストラン、及びフィコールが挙げられる。ＰＥＧＳは、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ３０００、ＰＥＧ８０００、及びＰＥＧ１００００を含み得る。

【0359】

いくつかの実施形態では、環境因子は、１つ又は複数の酸化剤の添加である。酸化剤の非限定的な例としては、過酸化水素、親水性又は疎水性活性化過酸化水素、事前形成された過酸（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ ｐｅｒａｃｉｄ）、一過硫酸塩、又は次亜塩素酸塩が挙げられる。

【0360】

いくつかの実施形態では、環境因子は、１つ又は複数の還元剤の添加である。いくつかの実施形態では、１つ又は複数の還元剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２－メルカプトエタノール（ＢＭＥ）、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ヒドラジン、水素化ホウ素、アミンボラン、低級アルキル置換アミンボラン、トリエタノールアミン、及びＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、環境因子は、１つ又は複数の変性剤の添加である。変性剤の非限定的な例としては、尿素、塩酸グアニジン、グアニジン、サリチル酸ナトリウム、ジメチルスルホキシド、及びプロピレングリコールが挙げられる。

【0361】

いくつかの実施形態では、環境因子は、１つ又は複数の酵素の添加である。酵素の非限定的な例としては、プロテアーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、シンテターゼ、トランスフェラーゼ、ヌクレアーゼ、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、デヒドロゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、及びリパーゼが挙げられる。

【0362】

いくつかの実施形態では、環境因子は、電磁波の印加である。いくつかの実施形態では、環境因子は、光の適用である。いくつかの実施形態では、電磁波は、約０．０００１ｎｍ～約１００ｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、電磁波は、ガンマ線、Ｘ線、紫外線、可視光線、赤外線、及び電波からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、電磁波は、ガンマ線である。いくつかの実施形態では、ガンマ線は、約０．０００１ｎｍ～約０．０１ｎｍ、例えば、０．０００１ｎｍ、０．０００５ｎｍ、０．００１ｎｍ、０．００２ｎｍ、０．００３ｎｍ、０．００４ｎｍ、０．００５ｎｍ、０．００６ｎｍ、０．００７ｎｍ、０．００８ｎｍ、０．００９ｎｍ、及び０．０１ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、Ｘ線は、約０．０１ｎｍ～約１０ｎｍ、例えば、約０．０１ｎｍ、０．０２ｎｍ、０．０３ｎｍ、０．０４ｎｍ、０．０５ｎｍ、０．０６ｎｍ、０．０７ｎｍ、０．０８ｎｍ、０．０９ｎｍ、０．１０ｎｍ、０．２ｎｍ、０．３ｎｍ、０．４ｎｍ、０．５ｎｍ、０．６ｎｍ、０．７ｎｍ、０．８ｎｍ、０．９ｎｍ、１ｎｍ、２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、又は約１０ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、紫外線は、約１０ｎｍ～約４００ｎｍ、例えば、約１０ｎｍ、約２０ｎｍ、約３０ｎｍ、約４０ｎｍ、約５０ｎｍ、約６０ｎｍ、約７０ｎｍ、約８０ｎｍ、約９０ｎｍ、約１００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２８０ｎｍ、約３００ｎｍ、約３５０ｎｍ、又は約４００ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、可視波は、約４００ｎｍ～約８００ｎｍ、例えば、約４００ｎｍ、約４５０ｎｍ、約５００ｎｍ、約５５０ｎｍ、約６００ｎｍ、約６５０ｎｍ、約７００ｎｍ、約７５０ｎｍ、又は約８００ｎｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、赤外線は、約８００ｎｍ～約０．１ｃｍ、例えば、約８００ｎｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ、約２００μｍ、約３００μｍ、約４００μｍ、約５００μｍ、約６００μｍ、約７００μｍ、約８００μｍ、約９００μｍ、又は約０．１ｃｍの波長を有する。いくつかの実施形態では、電波は、約０．１ｃｍ～１００ｍ、例えば、約０．１ｃｍ、約１ｃｍ、約１０ｃｍ、約１００ｃｍ、約１，０００ｃｍ、約２，０００ｃｍ、約３，０００ｃｍ、約４，０００ｃｍ、約５，０００ｃｍ、約６，０００ｃｍ、約７，０００ｃｍ、約８，０００ｃｍ、約９，０００ｃｍ、又は約１００ｍの波長を有する。

【0363】

本開示で引用されるすべての特許、特許出願、参考文献、及び雑誌記事は、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に明示的に組み込まれる。

【実施例】

【0364】

実施例１．ＡＡＶ受容体の結合ドメイン及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現
ＡＡＶ受容体（ＡＡＶＲ）の細胞外ドメインをコードする核酸を、相挙動を有するポリペプチド（（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_１６（配列番号８７））をコードする核酸に融合して、ｐＥＴ２４プラスミドにクローニングした。このプラスミドをＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、この細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で維持した。

【0365】

融合タンパク質を精製し、アリコートしてＰＢＳ中で製剤化するか（対照として）、又はタンパク質の機能に影響を与えることが知られている以下の条件に供した：（１）凍結乾燥及びＰＢＳ中での再懸濁、（２）０．１Ｍ ＮａＯＨ中での３０分間のインキュベーション、それに続く中和、及びＰＢＳへの緩衝液交換、（３）６Ｍ塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）での３０分間のインキュベーション、それに続くＰＢＳへ緩衝液交換、（４）９５℃のＰＢＳでの３０分間のインキュベーション、それに続く氷上での冷却、及び室温に戻すこと。次いで、各サンプルの活性（即ち、ＡＡＶＲがその標的に結合する能力）を、ＡＡＶ８捕捉についてのアッセイによって測定した。簡単に述べると、活性を、捕捉したＡＡＶ８のパーセンテージとして定義し、Ｐｒｏｇｅｎ ＡＡＶ８ ｔｏｔａｌ ｃａｐｓｉｄ ＥＬＬＩＳＡを使用して定量化した。

【0366】

結果を図１に示す。すべての処理条件において、融合タンパク質の活性は、未処理対照の８０％以内に維持された。

【0367】

実施例２：ブドウ球菌プロテインＡのＺドメイン及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現
抗体に結合することが知られているブドウ球菌プロテインＡ由来のＺドメインをコードする核酸（配列番号１８０）を、相挙動を有するポリペプチド（（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_１６（配列番号８７））をコードする核酸に融合して、ｐＥＴ２４プラスミドにクローニングした。このプラスミドを、ＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、この細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で維持した。次いで、融合タンパク質を精製し、凍結乾燥させた。

【0368】

融合タンパク質を、重力サイクルでオートクレーブ処理し、ＰＢＳに再懸濁した。次に、プロテインＡの活性を試験した。具体的には、抗体捕捉についてのアッセイを使用して活性を測定した。結果を図２に示す。相挙動を有するポリペプチドへの融合が、オートクレーブ処理していない対照と比較して、オートクレーブ処理／ＰＢＳでの再懸濁後にプロテインＡが少なくとも８５％の活性を保持するのに役立った。

【0369】

タンパク質はまた、相挙動を有するポリペプチドへの融合により、０．１Ｍ ＮａＯＨでの処理、ＰＢＳ中での９５℃への加熱、又はｐＨ４の酸性緩衝液中での加熱後に、可溶性の折り畳みプロテインＡの喪失を防止できるかどうかを決定するために試験した。所与の処理条件では、サンプルを、１０～３０分間インキュベートし、次いで中和又は冷却し、遠心分離して凝集したタンパク質をすべて除去した。処理によるタンパク質の喪失率を測定するために、プロテインＡ ＥＬＩＳＡアッセイを使用して総タンパク質を測定し、未処理の対照と比較した。図３に示すように、これらの条件への曝露では、喪失は２％未満であった。

【0370】

実施例３．ＡＡＶ受容体の結合ドメイン及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現
ＡＡＶ受容体のＰＫＤ２をコードする核酸（Ｃｙｓ－Ｈｉｓ－ＰＫＤ２）を、相挙動を有するポリペプチド（ＥＬＰ）をコードする核酸に融合して、ｐＥＴ２４プラスミドにクローニングした。対照として、ＡＡＶ受容体のＰＫＤ２をコードする核酸をｐＥＴ２４プラスミドにクローニングした。ＡＡＶ受容体のＰＫＤ２の核酸配列及びタンパク質配列、並びに相挙動を有するポリペプチドは、以下の表５に含まれる。

【0371】

【表32】

【0372】

【表33】

【0373】

【表34】

【0374】

【表35】

【0375】

５ｍＬのＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の一晩培養物を増殖させて、単独で、又はＥＬＰとの融合体として、Ｈｉｓタグ付きＰＫＤ２タンパク質を発現させた。２５０μＬのこの培養物を使用して、５０ｍＬの培養物に播種し、９時間後に０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導した。２４時間のインキュベーション後、各培養物からの細胞を遠心分離し、１０ｍＬのＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、超音波処理した。溶解物を遠心分離によって清澄化した。１．５ｍＬの清澄化した各溶解物を、ＨｉｓＬｉｎｋタンパク質精製キット（Ｐｒｏｍｅｇａ）及び２００μＬの溶出画分を使用して精製した。溶出した物質は、２８０ｎｍの吸光度を測定することによって定量した。次いで、ベールの法則を使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞培養物１リットル当たりの精製されたタンパク質及び融合タンパク質のグラム数とモル数を計算した。純度及び正確な分子量も、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及びクーマシィー染色を使用して定性的に評価した。

【0376】

ＰＫＤ２を含む融合タンパク質の発現を、相挙動を有するポリペプチドの非存在下でのＰＫＤ２の発現と比較した。

【0377】

図４Ａは、１リットル当たりの精製されたＰＫＤ２及びＰＫＤ２を含む融合タンパク質の濃度を示す。図４Ｂは、１リットル当たりの精製されたＰＫＤ２及びＰＫＤ２を含む融合タンパク質の量を示す。図４Ｃは、ゲル上のＰＫＤ２及びＰＫＤ２を含む融合タンパク質の発現を示す。これらの結果は、相挙動を有するポリペプチドにＰＫＤ２ドメインが融合されている場合、相挙動を有するポリペプチドなしでＰＫＤ２が発現される場合と比較して１０倍多い可溶性タンパク質（融合タンパク質）の質量及び３倍超多いＰＫＤ２（第１のポリペプチド）を抽出できることを示している。

【0378】

実施例４．ＡＡＶ受容体の結合ドメイン及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現
ＬＤＬ受容体（ＬＤＬＲ）のＣＲ３ドメインをコードする核酸を、相挙動を有するポリペプチドをコードする核酸に融合して、ｐＥＴ２４プラスミドにクローニングした。このプラスミドを、ＢＬ２１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞に形質転換し、この細胞を、融合タンパク質の発現を可能にする条件下で維持した。この融合タンパク質は、この実施例ではＩｓｏＴａｇ－ＬＶと呼ばれる。ＩｓｏＴａｇ－ＬＶのアミノ酸配列を以下の表６に示す。

【0379】

【表36】

【0380】

ＩｓｏＴａｇ－ＬＶの安定性を、ポリペプチドを分解する、凝集させる、又は不活性化することが知られている極端な条件に曝露した融合タンパク質に対する融合タンパク質対照のレンチウイルス（ＬＶ）捕捉活性を測定することによって評価した。

【0381】

２０μＭ ＩｓｏＴａｇ－ＬＶを、６Ｍグアニジン－ＨＣＬ（６Ｍ ＧｕＨＣｌ）又は０．１Ｍ ＮａＯＨ（０．１Ｍ ＮａＯＨ）中で３０分間インキュベートし、続いて３０ｋＤａ Ａｍｉｃｏｎスピンフィルターにおいて５００μＬのＰＢＳで６回洗浄した。２０μＭ ＩｓｏＴａｇ－ＬＶを９５℃で３０分間インキュベートし、続いて氷上で３０分間インキュベートした。

【0382】

説明したインキュベーションから得た１０μＭ ＩｓｏＴａｇ及び未処理のＩｓｏＴａｇ（対照ＩｓｏＴａｇ－ＬＶ）を５００μＬのレンチウイルスに添加し、氷上で５分間インキュベートし、次いで３７℃で５分間インキュベートしてから、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心して、レンチウイルス標的を捕捉してペレット化した。採取した上清（未捕捉のＬＶ標的を表す）をｐ２４アッセイ（ＶＰＫ－１０７，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して分析し、レンチウイルス力価の代替測定値としてＬＶエンベロープｐ２４タンパク質を測定した。捕捉活性なしの対照として、ＩｓｏＴａｇを添加していないレンチウイルスも二重に測定した（対照（ＩｓｏＴａｇ－ＬＶなし））。吸光度値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ Ｖ９を使用してプロットした。エラーバーは、平均値の標準誤差を表す。対照融合タンパク質のＬＶ捕捉活性には、９５℃に加熱して処理し、０．１Ｍ ＮａＯＨ又は６Ｍ ＧｕＨＣｌでインキュベーションした融合体と比較して統計学的に有意差は存在しない。これは、ＬＤＬＲのＣＲ３ドメインを、相挙動を有するポリペプチドとの融合タンパク質として発現させると、ＬＤＬＲのＣＲ３ドメインが分解から保護されることを示している。結果を図５に示す。

【0383】

実施例５：第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む追加の融合タンパク質の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における推定収量
生物学的機能を有する様々なタンパク質（本明細書では標的タンパク質と呼ぶ）をコードする核酸を、相挙動を有するポリペプチド（（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_１６（配列番号８７）をコードする核酸配列に融合して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞において組換え融合タンパク質として発現させた。より具体的には、融合タンパク質をコードする核酸をｐＥＴ２４プラスミドにクローニングし、これを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞にトランスフェクトした。細胞を入れた振盪フラスコにイソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することにより、融合タンパク質の発現を誘導した。融合タンパク質は、相分離を使用して精製すると、収量が少なくとも１０ｍｇ／Ｌであることが示された。表７は、融合に使用する標的タンパク質のリストを示す。各精製タンパク質の収量は１リットル当たり少なくとも１５ｍｇであり得、一部の収量は、１リットル当たり３００ｍｇにも達すると推定される。

【0384】

【表37】

【0385】

実施例６：核酸の修飾での融合タンパク質の使用
この実施例は、本明細書の融合タンパク質がＤＮＡ及びＲＮＡの修飾を促進する能力を評価する。核酸結合タンパク質（ＮＢＰ）及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質を、可溶型又は相分離型のいずれかのＮＢＰが産物を生成するか又は親和性結合複合体を生成するのに十分な時間、核酸基質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と共にインキュベートする。続いて、環境因子（例えば、０．６Ｍ ＮａＣｌ）を溶液に添加して、融合タンパク質を相分離する。この相分離は、核酸標的の酵素反応、濃度、及び／又は純度を高めるのに役立つ。融合タンパク質は、接線流ろ過、深層ろ過、又は遠心分離によって産物から分離する。産物を追加の融合タンパク質と共にインキュベートし、最初の融合タンパク質についての記載と同じ手順を行って、核酸に追加の修飾を行う。前述の各ステップでは、追加の試薬（例えば、補因子、リボヌクレオチド三リン酸、デオキシヌクレオシド三リン酸、塩など）を添加して、融合タンパク質の機能を促進することができる。

【0386】

任意の時点で、サンプルを遠心分離又はろ過して、融合タンパク質及びそれに結合したあらゆる親和性物質を可溶相の成分から分離することができる。任意の時点で、第２の環境因子（例えば、低ｐＨ、補因子、塩）を添加して、産物又は基質と、可溶性状態又は相分離状態にあるＮＢＰ融合タンパク質との結合を破壊することができる。

【0387】

ＤＮＡをｍＲＮＡに転写するための例示的なプロセスを以下に記載する。ＮＢＰ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ及び相挙動を有するポリペプチドをコードする核酸（例えば、ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_１６（配列番号８７））を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１細胞において組換え融合タンパク質として発現させ、精製する。精製された融合タンパク質を、ＤＮＡ基質及びｒＮＴＰを含む組成物と共に、融合タンパク質が可溶性となる条件で、３７℃で約１時間インキュベートしてＲＮＡを形成する。塩（０．６Ｍ ＮａＣｌ）を添加して、ＲＮＡ産物に結合している融合タンパク質を組成物から分離する。ＲＮＡ産物を、連続遠心分離によって融合タンパク質から分離する。

【0388】

後続の反応を実施して、ポリ（Ａ）尾部をＲＮＡ産物の３’末端に付加し、メチル基をＲＮＡ産物の５’末端に付加する。ポリ（Ａ）尾部は、ＰＡＢＰ及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質を介して付加される。メチル基は、ｍＲＮＡ Ｃａｐ２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ及び相挙動を有するポリペプチドを含む融合タンパク質を介してＲＮＡ産物の５’末端に付加される。最終産物は、５’メチル基及び３’ポリ（Ａ）尾部を含むｍＲＮＡである。

【0389】

ＤＮＡ及びＲＮＡに対する追加の修飾を、本明細書に記載のＮＢＰのいずれかを使用して同様の方法で実施することができる。例えば、ＮＢＰは、以下のタンパク質のいずれかであり得る：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮアーゼ阻害剤、２’－Ｏ－メチルトランスフェラーゼ、無機ピロホスファターゼ、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、ＤＮアーゼＩ、仔ウシ腸ホスファターゼ、南極ホスファターゼ、ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニット、グアニン－７－メチルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、グアニリルトランスフェラーゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、ＲＮＡトリホスファターゼ（ワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１サブユニットに存在）、及びワクシニアウイルスｍＲＮＡキャッピング酵素のＤ１２サブユニット、ステムループ結合タンパク質、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＧｒｏＥＬ、Ｅｄｃ３、ＤＨＸ９、Ｘｒｎ１、Ｄｃｐ１、Ｄｃｐ２、ＬＡＦ－１、ＭＥＧ－１、ＭＥＧ－３、ＡＳＦ／ＳＦ２スプライシング因子、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子４（ＳＲｐ７５）、セリン及びアルギニンリッチスプライシング因子１（ＳＲＳＦ１）、Ｌ３リボソームタンパク質、Ｌ４リボソームタンパク質、Ｌ１３リボソームタンパク質、Ｌ２０リボソームタンパク質、Ｌ２２リボソームタンパク質、Ｌ２４リボソームタンパク質、Ｌ２４ｅリボソームタンパク質、Ｓ１２リボソームタンパク質、Ｓ１４リボソームタンパク質、及び真核生物開始因子４Ｅ結合タンパク質１（４ＥＢＰ１）、Ｔａｔ、Ｒｅｖ、ＲＳＧ－１．２ペプチド、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、真核生物翻訳開始因子４Ｅ（ｅＩＦ４Ｅ）、真核生物翻訳開始因子３サブユニットＤ（ｅＩＦ３Ｄ）、ヘテロ核リボ核タンパク質（ｈｎＲＮＰ）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ１（ＡＤＡＲ１）、ＲＮＡ特異的アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡＲ２）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来のＣｓｐＢ（Ｂｓｃｓｃｐ）、Ｙボックスタンパク質１コールドショックドメイン（ＹＢ１－ＣＳＤ）、Ｆｏｘ－１タンパク質（ＦＯＸ１）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｓｔａｕｆｅｎタンパク質、ＴＩＳ１１ｄ、ジンクフィンガータンパク質（ＺＮＦ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、レチノイン酸誘導性遺伝子－Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）様タンパク質、トール様受容体７（ＴＬＲ７）、トール様受容体８（ＴＬＲ３）、トール様受容体８（ＴＬＲ８）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ－Ｉ）、黒色腫分化関連タンパク質５（ＭＤＡ５）、テトラトリコペプチド反復１を有するインターフェロン誘導性タンパク質（ＩＦＩＴ１）、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、オリゴアデニル酸シンターゼ様（ＯＡＳＬ）タンパク質（例えば、ＯＡＳ１、ＯＡＳ２、ＯＡＳ３、又はＯＡＳＬ）、リボヌクレアーゼＥ（ＲＮＡＳＥ Ｅ）、ガンマインターフェロン誘導性タンパク質Ｉｆｉ－１６（ＩＦ１１６）、環状ＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ）、又はそれらの触媒断片。

【0390】

本開示の付番された実施形態
添付の特許請求の範囲にかかわらず、本開示は、以下の付号された実施形態を記載する：
１．第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質であって、第２のポリペプチドが相挙動を有する、融合タンパク質。
２．第１のポリペプチドが：
（ｉ）酵素又はその誘導体若しくは触媒断片；
（ｉｉ）抗体又はその誘導体若しくは抗原結合断片；
（ｉｉｉ）シグナル伝達分子又はその断片若しくは誘導体；
（ｉｖ）構造タンパク質又はその断片若しくは誘導体；或いは
（ｖ）ホルモン又はその断片若しくは誘導体である、実施形態１の融合タンパク質。
３．第１のポリペプチドが、哺乳動物ポリペプチドである、実施形態１の融合タンパク質。
４．第１のポリペプチドが、ウイルスポリペプチドである、実施形態１の融合タンパク質。
５．第１のポリペプチドが、細菌ポリペプチドである、実施形態１の融合タンパク質。
６．第１のポリペプチドが、毒素である、実施形態１の融合タンパク質。
７．第１のポリペプチドが、抗原性ポリペプチドである、実施形態１の融合タンパク質。
８．第１のポリペプチドが、タンパク質の合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である、実施形態１の融合タンパク質。
９．第１のポリペプチドが、ＤＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である、実施形態１の融合タンパク質。
１０．第１のポリペプチドが、ＲＮＡの合成又は修飾に関与する１つ又は複数のステップを実行できる酵素である、実施形態１の融合タンパク質。
１１．第１のポリペプチドが、分化クラスター４（ＣＤ４）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）プロテインＡのＺドメイン（ＳｐＡ Ｚドメイン）、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）、アルブミン結合ポリペプチド（ＡＢＤ）、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）、フィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）、ポリ（Ａ）結合タンパク質（ＰＡＢＰ）、Ｚ－ＤＮＡ結合タンパク質１（ＺＢＰ１）、又はそれらの断片若しくは誘導体から選択される、実施形態１の融合タンパク質。
１２．第１のポリペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２から単離されるか又はそれに由来するポリペプチドである、実施形態１の融合タンパク質。
１３．第１のポリペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質又はその断片若しくは誘導体である、実施形態１２の融合タンパク質。
１４．相挙動を有する第１のポリペプチドが、エラスチン様ポリペプチド（ＥＬＰ）又はレジリン様ポリペプチド（ＲＬＰ）である、実施形態１～１３の融合タンパク質。
１５．相挙動を有するポリペプチドが、配列（Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ｇｌｙ－Ｘａａ－Ｇｌｙ）_ｎ（配列番号１０）を有するペンタペプチド反復又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を含み、式中、Ｘａａは、プロリンを除く任意のアミノ酸であり得、ｎは、終点を含む１～３６０の整数である、実施形態１～１３のいずれか１つの融合タンパク質。
１６．相挙動を有するポリペプチドが：
ａ．（ＧＲＧＤＳＰＹ）_ｎ（配列番号１）
ｂ．（ＧＲＧＤＳＰＨ）_ｎ（配列番号２）
ｃ．（ＧＲＧＤＳＰＶ）_ｎ（配列番号：３）
ｄ．（ＧＲＧＤＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号４）
ｅ．（ＲＰＬＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号：５）
ｆ．（ＲＰＡＧＹＤＳ）_ｎ（配列番号６）
ｇ．（ＧＲＧＤＳＹＰ）_ｎ（配列番号７）
ｈ．（ＧＲＧＤＳＰＹＱ）_ｎ（配列番号８）
ｉ．（ＧＲＧＮＳＰＹＧ）_ｎ（配列番号９）
ｊ．（ＧＶＧＶＰ）_ｎ（配列番号１１）；
ｋ．（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）；
ｌ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１３）；
ｍ．（ＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰＧＷＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４）；
ｎ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＥＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１５）；
ｏ．（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＫＧＶＰＧＦＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１６）；及び
ｐ．（ＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１７）から選択されるアミノ酸又はランダム化されてスクランブルされたその類似体を含み、
式中：
ｎは、終点を含む２０～３６０の範囲の整数であり；且つ
ｍは、終点を含む４～２５の範囲の整数である、実施形態１～１３のいずれか１つの融合タンパク質。
１７．相挙動を有するポリペプチドが：
（ＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４３）；
（ＺＺＰＸＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４８）；
（ＺＺＰＸＧＺ）_ｍ（配列番号１４９）；
（ＺＺＰＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５０）；又は
（ＺＺＰＸＸＸＧＺ）_ｍ（配列番号１５１）から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、
Ｘは、存在する場合は、プロリンとグリシンを除く任意のアミノ酸であり、且つ
Ｚは、存在する場合は、任意のアミノ酸である、実施形態１～１３のいずれか１つの融合タンパク質。
１８．相挙動を有するポリペプチドが：
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）；又は
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４６）から選択されるアミノ酸配列を含み；
式中、ｍは、終点を含む２～３２の整数である、実施形態１～１３のいずれか１つの融合タンパク質。
１９．相挙動を有するポリペプチドが：
（ａ）（ＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４４）（式中、ｍは、８又は１６である）；
（ｂ）（ＧＶＧＶＰＧＡＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４５）（式中、ｍは、終点を含む５～８０の整数である）；又は
（ｃ）（ＧＸＧＶＰ）_ｍ（配列番号１４７）から選択されるアミノ酸配列を含み、
式中、ｍは、終点を含む１０～１６０の整数であり、且つ
各反復のＸは、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、リジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びセリンからなる群から独立して選択される、実施形態１～１３のいずれか１つの融合タンパク質。
２０．相挙動を有するポリペプチドが、配列番号８８のアミノ酸又は（ＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰＧＬＧＶＰＧＶＧＶＰ）_ｍ（配列番号１２）（式中、ｍは、１６である）の配列を含む、実施形態１の融合タンパク質。
２１．第１のポリペプチドと第２のポリペプチドとを連結するリンカーを含む、実施形態１～２０のいずれか１つの融合タンパク質。
２２．リンカーが、切断可能である、実施形態２１の融合タンパク質。
２３．リンカーが、プロテアーゼ切断部位を含む、実施形態２１の融合タンパク質。
２４．リンカーが、自己切断ペプチドである、実施形態２１の融合タンパク質。
２５．リンカーが：
（ｉ）（Ｇ_ｘＳ）_ｎ（配列番号１４１）、
（ｉｉ）（Ｓ_ｘＧ）_ｎ（配列番号１４２）、
（ｉｖ）（ＧＧＧＧＳ）_ｎ（配列番号１９）、及び
（ｖ）（Ｇ）_ｎ（配列番号４８）からなる群から選択され；
式中、ｘは、１～６の範囲の整数であり、且つ
ｎは、１～３０の範囲の整数である、実施形態２１の融合タンパク質。
２６．リンカーが、ＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳ（配列番号１５７）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号１５８）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＳＳＥＧＳＧＳＴＫＧ（配列番号１５９）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１６０）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＥＦ（配列番号１６１）、ＳＲＳＳＧ（配列番号１６２）、及びＳＧＳＳＣ（配列番号１６３）から選択される、実施形態２１の融合タンパク質。
２７．Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む、実施形態１～２６のいずれか１つの融合タンパク質。
２８．Ｎ末端からＣ末端にかけて、第２のポリペプチド及び第１のポリペプチドを含む、実施形態１～２６のいずれか１つの融合タンパク質。
２９．Ｎ末端からＣ末端にかけて、第１のポリペプチド、リンカー、及び第２のポリペプチドを含む、実施形態２１～２６のいずれか１つの融合タンパク質。
３０．Ｎ末端からＣ末端にかけて、第２のポリペプチド、リンカー、及び第１のポリペプチドを含む、実施形態２１～２６のいずれか１つの融合タンパク質。
３１．第１のポリペプチドを安定化させる方法であって、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドである、方法。
３２．融合タンパク質が、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態３１の方法。
３３．第１のポリペプチドのアンフォールディング、分解、及び／又はミスフォールディングを実質的に防止する方法であって、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドである、方法。
３４．融合タンパク質が、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態３３の方法。
３５．第１のポリペプチドをアンフォールディングする、分解する、及び／又はミスフォールディングすることが知られている１つ又は複数の条件への曝露後の第１のポリペプチドの活性の喪失を実質的に防止する方法であって、第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップを含み、第２のポリペプチドが、相挙動を有するポリペプチドである、方法。
３６．融合タンパク質が、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態３５の方法。
３７．第１のポリペプチドの活性が、条件の１つ又は複数への曝露後、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満喪失する、実施形態３５又は３６の方法。
３８．第１のポリペプチドを作製する方法であって：
（ｉ）第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を発現させるステップ；並びに
（ｉｉ）第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから分離するステップを含む、方法。
３９．融合タンパク質が、哺乳動物細胞、細菌細胞、真菌細胞、酵母細胞、及び植物細胞から選択される宿主細胞において発現される、実施形態３８の方法。
４０．第１のポリペプチドの収量が、宿主細胞懸濁液１リットル当たり１５ｍｇ超、１リットル当たり３０ｍｇ超、１リットル当たり５０ｍｇ超、１リットル当たり１００ｍｇ超、１リットル当たり２００ｍｇ超、又は１リットル当たり２００ｍｇ超である、実施形態３９の方法。
４１．第１のポリペプチドを精製する方法であって、
（ｉ）第１のポリペプチド及び相挙動を有する第２のポリペプチドを含む融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉ）第１の環境因子を融合タンパク質に適用するステップ；
（ｉｉｉ）サイズ及び／又は密度に基づいて融合タンパク質凝集体を少なくとも１つの汚染物質から分離するステップ；
（ｉｖ）第２の環境因子を適用して、融合タンパク質を脱凝集させるステップを含む、方法。
４２．融合タンパク質が、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態４１の方法。
４３．第１の環境因子及び第２の環境が：
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度、若しくは圧力のうちの１つ又は複数の変化；
ｂ．１つ又は複数の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波若しくは音波の適用を含む、実施形態４１又は４２の方法。
４４．融合タンパク質凝集体を少なくとも１つの汚染物質から分離するステップが、サイズに基づいた分離を含む、実施形態４１～４３のいずれか１つの方法。
４５．サイズに基づいた分離が、接線流ろ過、分析用超遠心分離、膜クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、全量ろ過、深層ろ過、音波分離、遠心分離、向流遠心分離、及び高速タンパク質液体クロマトグラフィーからなる群から選択される技術を使用して達成される、実施形態４４の方法。
４６．（ｖ）第１のポリペプチドを第２のポリペプチドから分離するステップを含む、実施形態４１～４５のいずれか１つの方法。
４７．第１の環境因子と第２の環境因子が同じである、実施形態４１～４６のいずれか１つの方法。
４８．第１の環境因子及び第２の環境因子が同時に適用される、実施形態４１～４６のいずれか１つの方法。
４９．基質上で多段階酵素プロセスを実施する方法であって：
（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに
（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む、方法。
５０．第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質の少なくとも１つが、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態４９の方法。
５１．（ｖ）第３の環境因子を適用して、第１の酵素を基質から分離するステップ；
（ｖｉ）第４の環境因子を適用して、第２の酵素を基質から分離するステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、実施形態４９又は５０の方法。
５２．第１の環境因子及び第２の環境因子がそれぞれ：
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度、又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ又は複数の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波の印加を含む、実施形態４９～５１のいずれか１つの方法。
５２．基質上で多段階酵素プロセスを実施する方法であって：
（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに
（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む、方法。
５３．第１の融合タンパク質及び第２の融合タンパク質のうちの少なくとも１つが、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態５２の方法。
５４．（ｖ）第３の環境因子を適用して、第１の酵素を基質から分離するステップ；
（ｖｉ）第４の環境因子を適用して、第２の酵素を基質から分離するステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、実施形態５２又は５３の方法。
５５．第１の環境因子及び第２の環境因子がそれぞれ：
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度、又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ又は複数の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波の印加を含む、実施形態５２～５４のいずれか１つの方法。
５６．基質に接触させ、基質を単離し、且つ／又は基質を精製する方法であって：
（ｉ）第１の酵素及び第１の相挙動を有するポリペプチドを含む第１の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉ）第２の酵素及び第２の相挙動を有するポリペプチドを含む第２の融合タンパク質を用意するステップ；
（ｉｉｉ）第１の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第１の環境因子を適用するステップ；並びに
（ｉｖ）第２の酵素が基質と接触し、基質を単離し、且つ／又は基質を濃縮することを可能にする第２の環境因子を適用するステップを含む、方法。
５７．第１融合タンパク質及び第２融合タンパク質の少なくとも１つが、実施形態１～３０のいずれか１つの融合タンパク質である、実施形態５６の方法。
５８．（ｖ）第１の酵素を基質から分離する第３の環境因子を適用するステップ；
（ｖｉ）第２の酵素を基質から分離する第４の環境因子を適用するステップのうちの少なくとも１つをさらに含む、実施形態５６又は５７の方法。
５９．第１の環境因子及び第２の環境因子がそれぞれ：
ａ．温度、ｐＨ、塩濃度、又は圧力のうちの１つ以上の変化；
ｂ．１つ又は複数の界面活性剤、補因子、ビタミン、分子密集剤、酵素、変性剤の添加；又は
ｃ．電磁波の印加を含む、実施形態５６～５９のいずれか１つの方法。

【0391】

参照による組み込み
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【図1】

【図2】

【図3】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5】

【配列表】

2024509742000001.app

【国際調査報告】