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▶ ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-05
(54)【発明の名称】安定化された融合前ＲＳＶ ＦＢ抗原
(51)【国際特許分類】
C12N 15/45 20060101AFI20240227BHJP
C07K 14/115 20060101ALI20240227BHJP
C12N 15/861 20060101ALI20240227BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240227BHJP
A61P 11/00 20060101ALI20240227BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240227BHJP
A61K 39/155 20060101ALI20240227BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240227BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240227BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240227BHJP
【ＦＩ】
C12N15/45
C07K14/115 ZNA
C12N15/861 Z
C12N5/10
A61P11/00
A61P31/14
A61K39/155
A61K35/76
A61K31/7088
A61K48/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023549975
(86)(22)【出願日】2022-02-18
(85)【翻訳文提出日】2023-10-16
(86)【国際出願番号】 EP2022054128
(87)【国際公開番号】W WO2022175477
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】63/151,262
(32)【優先日】2021-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】21165577.4
(32)【優先日】2021-03-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】516257833
【氏名又は名称】ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー
【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＆ ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ Ｂ．Ｖ．
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100186897
【弁理士】
【氏名又は名称】平川 さやか
(72)【発明者】
【氏名】ランゲデイク，ヨハネス，ペトラス，マリア
(72)【発明者】
【氏名】リッチェル，ティナ
(72)【発明者】
【氏名】バッカーズ，マーク，ヨハネス，ジェラルドゥス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA95Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA45
4C084AA13
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZA591
4C084ZA592
4C084ZB331
4C084ZB332
4C085AA03
4C085BA57
4C085CC08
4C085CC21
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZA59
4C086ZB33
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA13
4C087NA14
4C087ZA59
4C087ZB33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、安定な融合前呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）ＦＢタンパク質、こうしたタンパク質をコードする核酸分子及びベクター、並びに当該タンパク質、核酸分子及び／又はベクターを含む組成物、並びにＲＳＶ感染の予防及び／又は処置のためのそれらの使用を提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＳＶ Ｂ株のＦタンパク質のＦ１及びＦ２ドメインのアミノ酸配列を含むＦ１及びＦ２ドメインを含み、１０１位のアミノ酸残基がＱであり、１５２位のアミノ酸残基がＭであり、２１５位のアミノ酸残基がＰであり、４８６位のアミノ酸残基がＮである、安定化された融合前ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質。
【請求項2】
４８９位のアミノ酸残基がＹである、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項3】
２０３位のアミノ酸残基がＩである、請求項１又は２に記載のタンパク質。
【請求項4】
２２６位のアミノ酸残基がＭである、請求項１、２又は３に記載のタンパク質。
【請求項5】
１０１位のアミノ酸残基がＱであり、１５２位のアミノ酸残基がＭであり、２０３位のアミノ酸残基がＩであり、２１５位のアミノ酸残基がＰであり、２２６位のアミノ酸残基がＭであり、且つ、４８６位のアミノ酸残基がＮである、請求項１、２又は３に記載のタンパク質。
【請求項6】
１０１位のアミノ酸残基がＱであり、１５２位のアミノ酸残基がＭであり、２０３位のアミノ酸残基がＩであり、２１５位のアミノ酸残基がＰであり、４８６位のアミノ酸残基がＮであり、且つ、４８９位のアミノ酸残基がＹである、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項7】
１７２位のアミノ酸残基がＱであり、且つ、１７２位のアミノ酸残基がＬである、請求項１～６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項8】
１９１位のアミノ酸残基がＲであり、２０６位のアミノ酸残基がＭであり、且つ、２０９位のアミノ酸残基がＲである、請求項１～７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項9】
フューリン切断部位が欠失している、請求項１～８のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項10】
切断型Ｆ１ドメインを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項11】
膜貫通及び細胞質ドメインが欠失しており、且つ、前記膜貫通及び細胞質ドメインがアミノ酸５１４～５７４を含む、請求項１０に記載のタンパク質。
【請求項12】
異種三量体化ドメインが前記切断型Ｆ１ドメインに連結されている、請求項１０又は１１に記載のタンパク質。
【請求項13】
前記異種三量体化ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含むフォルドンドメインである、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項14】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列、又はそれらの断片を含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項15】
シグナルペプチド、ｐ２７ペプチド又はタグ配列を含まない、請求項１～１４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項16】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸分子。
【請求項17】
前記核酸分子がＤＮＡ又はＲＮＡである、請求項１６に記載の核酸。
【請求項18】
配列番号１４、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３２及び配列番号３４からなる群から選択されるアミノ酸配列又はそれらの断片を含むタンパク質をコードする、請求項１６又は１７に記載の核酸。
【請求項19】
請求項１６、１７又は１８に記載の核酸を含むベクター。
【請求項20】
ベクターがヒト組換えアデノウイルスベクターである、請求項１９に記載のベクター。
【請求項21】
前記アデノウイルスベクターが、Ｅ１領域及びＥ３領域の欠失を有する複製不全Ａｄ２６アデノウイルスベクターである、請求項２０に記載のベクター。
【請求項22】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のタンパク質、請求項１６、１７若しくは１８に記載の核酸及び／又は請求項１９、２０若しくは２１に記載のベクターを含む組成物。
【請求項23】
請求項１～１５のいずれか一項に記載のタンパク質及び請求項１９、２０又は２１に記載のベクターを含む組成物。
【請求項24】
請求項２２又は２３に記載の組成物を含む、ＲＳＶに対するワクチン。
【請求項25】
ＲＳＶに対して対象にワクチン接種するための方法であって、請求項２４に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項26】
対象におけるＲＳＶの感染及び／又は複製を予防するための方法であって、請求項２４に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項27】
前記ＲＳＶの感染及び／又は複製の予防が、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）によって確認されるＲＳＶ媒介性下気道疾患（ＬＲＴＤ）の予防又は低減を特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項28】
前記ＲＳＶの感染及び／又は複製の予防が、前記対象の鼻腔及び／又は肺におけるＲＳＶウイルス量の非存在又は減少を特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項29】
前記ＲＳＶの感染及び／又は複製の予防が、ＲＳＶへの曝露時の前記対象におけるＲＳＶ臨床症状の非存在又は減少を特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【請求項30】
請求項１６、１７又は１８に記載の核酸を含む、単離された宿主細胞。
【請求項31】
請求項１６、１７又は１８に記載の核酸を含む血清型２６の組換えヒトアデノウイルスを含む、単離された宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、医学分野に関する。本発明は、特に、組換え融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質及びその断片、並びにＲＳＶ ＦＢタンパク質及びその断片をコードする核酸分子、並びに例えばワクチンにおけるその使用に関する。
【背景技術】
【0002】
１９５０年代に呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）が発見された後、このウイルスはすぐに、ヒトにおける下気道感染及び上気道感染に関連する、よく知られた病原体になった。世界中で、毎年６４００万件のＲＳＶ感染が起こり、１６０．０００人が死亡すると推定されている（ＷＨＯ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ Ｕｐｄａｔｅ ２００９年９月）。最も重篤な疾患は、特に未熟児、高齢者及び免疫無防備状態の個体において生じる。２歳未満の小児では、ＲＳＶは最も一般的な気道病原体であり、呼吸器感染による入院の約５０％を占め、入院のピークは２～４ヶ月齢で起こる。ほぼ全ての小児が２歳までにＲＳＶに感染していることが報告されている。生涯にわたる反復感染は、自然免疫が無効であることに起因する。高齢者において、ＲＳＶ疾患負荷は、非パンデミックＡ型インフルエンザ感染によって引き起こされるものと同様である。
【0003】
ＲＳＶはパラミクソウイルス（paramyxovirus）であり、ニューモウイルス科（Pneumoviridae）のサブファミリーに属する。そのゲノムは、中和抗体の主要な抗原標的であるＲＳＶ糖タンパク質（Ｇ）及びＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質として知られる膜タンパク質を含む、様々なタンパク質をコードする。Ｆタンパク質に対する抗体は、細胞へのウイルスの侵入を予防することができ、したがって中和効果を有する。
【0004】
ＲＳＶ Ｆは、不安定な融合前立体配座から安定した融合後立体配座へと不可逆的にタンパク質をリフォールディングすることで、ウイルスと宿主の細胞膜を融合させる。両方の立体配座の構造が、ＲＳＶ Ｆについて（ＭｃＬｅｌｌａｎ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．（２０１０，２０１３，２０１３）、Ｓｗａｎｓｏｎ ＫＡ，ｅｔ ａｌ．（２０１１））、並びに関連するパラミクソウイルス由来の融合タンパク質について決定されており、この融合タンパク質が受ける複雑な機構への洞察を提供する。他のクラスＩ融合タンパク質と同様に、不活性前駆体ＲＳＶ Ｆ０は、細胞内成熟の間にフューリン様プロテアーゼによる切断を必要とする。ＲＳＶ Ｆは、３つのタンパク質、Ｆ２、ｐ２７及びＦ１をもたらす２つのフューリン切断部位を含有する。ｐ２７断片は成熟Ｆタンパク質の一部ではなく、Ｆ２及びＦ１は２つのジスルフィド架橋によって会合しており、後者はそのＮ末端に疎水性融合ペプチド（ＦＰ）を含有する。融合前立体配座から融合後立体配座にリフォールディングするために、ＦＰ及び７アミノ酸繰り返しＡ（ＨＲＡ）を含む残基１３７と２１６との間のリフォールディング領域１（ＲＲ１）は、ヘリックス、ループ及びストランドのアセンブリから長い連続ヘリックスに変換しなければならない。続いて、ＲＲ１のＮ末端セグメントに配置されているＦＰは、ウイルス膜から離れて伸び、標的細胞の近位膜に挿入することが可能である。次に、融合前ＦスパイクのＣ末端ステムを形成し、７アミノ酸繰り返しＢ（ＨＲＢ）を含むリフォールディング領域２（ＲＲ２）は、ＲＳＶ Ｆヘッドの他方の側に再配置し、ＨＲＡコイルドコイル三量体をＨＲＢドメインと結合させて、６ヘリックスバンドルを形成する。６ヘリックスバンドルを完了するためのＲＲ１コイルドコイルの形成及びＲＲ２の再配置は、リフォールディングプロセス中に起こる最も劇的な構造変化である。
【0005】
ＲＳＶ感染を予防するワクチンは現在まだ利用可能ではないが、高い疾患負荷のために非常に望まれている。ＲＳＶ融合糖タンパク質（ＲＳＶ Ｆ）は、ヒト血清中の中和抗体の主要な標的であるため、魅力的なワクチン抗原である。ヒト血清中のほとんどの中和抗体は、融合前立体配座に対して指向されるが、その不安定性のために、融合前立体配座は、溶液中及びビリオンの表面上の両方で、融合後立体配座へと時期尚早にリフォールディングする傾向を有する。上記で示したように、結晶構造は、融合前状態と融合後状態との間の大きな立体配座の変化を明らかにした。再配列の大きさは、ＲＳＶ－Ｆの融合後立体配座に対する抗体の一部のみが、ウイルスの表面上の融合前スパイクの天然の立体配座と交差反応することが可能であることを示唆した。したがって、ＲＳＶに対するワクチンを生産する努力は、融合前形態のＲＳＶ Ｆタンパク質を含有するワクチンの開発に焦点を当ててきた（例えば、国際公開第２０１０１１４９７４５号、国際公開第２０１０／１１４９７４３号、国際公開第２００９／１０７９７９６号、国際公開第２０１２／１５８６１３号を参照）。これまでのこれらの努力は、ＲＳＶ Ａ株に由来するＲＳＶ Ｆタンパク質に焦点を当てており、今日まで、利用可能なワクチンはまだ存在しない。
【0006】
ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）は、２つの主なサブタイプに分けられる。ＨＲＳＶ Ａ及びＨＲＳＶ Ｂは、一般に、Ｇタンパク質における配列の違いに基づいて区別される。Ａ株のＦタンパク質（ＦＡ）及びＢ株のＦタンパク質（ＦＢ）は、高度の配列同一性（成熟外部ドメインにおいて約９５％）を示すが、抗Ｆ抗体の交差反応性が十分に広いかどうかは知られていない。
【発明の概要】
【0007】
ＲＳＶに対する有効なワクチンが依然として必要とされている。本発明は、ＲＳＶに対するワクチンにおいて使用するための安定化された融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質を得るための手段を提供することを目的とする。
【0008】
本発明は、ＲＳＶ Ｂ株のＦタンパク質（ＲＳＶ ＦＢタンパク質）のＦ１及びＦ２ドメインのアミノ酸配列並びにそれらの断片を含むＦ１及びＦ２ドメインを含む、安定化された組換え融合前ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質を提供する。
【0009】
本発明はまた、融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質又はそれらの断片をコードする核酸分子、並びにこうした核酸分子を含むベクター、例えばアデノベクターを提供する。
【0010】
本発明は更に、本明細書に記載のＲＳＶ ＦＢタンパク質、核酸分子及び／又はベクターを含む組成物、好ましくは免疫原性組成物又はワクチン、並びにＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答の誘導におけるその使用、特にＲＳＶに対するワクチンとしてのその使用を提供する。
【0011】
本発明はまた、対象において抗呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）免疫応答を誘導するための方法であって、本明細書に記載の有効量の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、当該ＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする核酸分子、及び／又は当該核酸分子を含むベクターを対象に投与することを含む、方法を提供する。好ましくは、誘導された免疫応答は、中和抗体の誘導及び／又はＲＳＶに対する細胞応答及び／又はＲＳＶ感染に対する防御免疫を特徴とする。
【0012】
本発明は特に、ＲＳＶに対して対象にワクチン接種するための方法であって、本明細書に記載の組成物又はワクチンを対象に投与することを含む方法を提供する。
【0013】
本発明は更に、対象におけるＲＳＶの感染及び／又は複製を予防するための方法であって、本明細書に記載の組成物又はワクチンを対象に投与することを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＲＳＶ Ｆタンパク質の概略図。Ｆ０は、２つの位置でフューリン様プロテアーゼによってＦ１及びＦ２サブユニットに酵素的にプロセシングされ、その結果、プロセシングされた成熟タンパク質においてｐ２７ペプチドが放出される。Ｆ１及びＦ２は、ジスルフィド結合（図示せず）によって一緒に連結される。
【図2-1】バイオレイヤー干渉法で測定されたトランスフェクション後の細胞培養上清の分析。上清中の実施例２に記載の非安定化及び安定化されたＦ変異体のＲＳＶ Ｆ濃度及び安定性を示す。総ポリペプチド含有量及び融合前含有量を、それぞれＣＲ９５０６及びＣＲ９５０１結合によって測定した。ポリペプチドの融合後含有量を、ＡＤＩ－１５６４４（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）結合によって測定した。非安定化Ｆタンパク質ＲＳＶ１８１１７７（配列番号３）を、回収日及び７日後の安定化された変異体と比較した（Ａ）。ＲＳＶ Ａ型（ＲＳＶ１８０８１６及びＲＳＶ１８０９１３）又はＲＳＶ Ｂ型（ＲＳＶ１８０９１０及びＲＳＶ１８０９０７）シグナルペプチドのいずれかを有し、Ｃ－タグを有するか又はタグを有さないＲＳＶ ＦＢ変異体の、回収日におけるＲＳＶ Ｆ発現レベル（Ｂ）。回収後０日目及び３０日目の、いくつかの安定化アミノ酸置換：ＲＳＶ１８０９１３（Ｉ１５２Ｍ＋Ｋ２２６Ｍ＋Ｄ４８６Ｎ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｌ２０３Ｉ＋Ｐ１０１Ｑ、配列番号１４）及び追加の安定化突然変異Ｄ４８９Ｙ（ＲＳＶ１９０４１７、配列番号１５）、２２６位の野生型アミノ酸残基（Ｋ２２６）（ＲＳＶ１９０４１４、配列番号１６）及びドリフト突然変異Ｌ１７２Ｑ＋Ｓ１７３Ｌ（ＲＳＶ１９０４２０、配列番号１７）を有するタグフリーＲＳＶ ＦＢ変異体の融合前Ｆ発現レベル（ｐｏｓｔ Ｆ評価のために、モックトランスフェクト細胞の上清にスパイクされた２０μｇのＲＳＶ ｐｏｓｔ Ｆタンパク質の陽性対照を採用した）（Ｃ）。図２Ａ及びＢは、２つの独立したトランスフェクションの平均及びエラーバーを示す。図２Ｃのデータは、１回のトランスフェクションに基づく。
【図2-2】バイオレイヤー干渉法で測定されたトランスフェクション後の細胞培養上清の分析。上清中の実施例２に記載の非安定化及び安定化されたＦ変異体のＲＳＶ Ｆ濃度及び安定性を示す。総ポリペプチド含有量及び融合前含有量を、それぞれＣＲ９５０６及びＣＲ９５０１結合によって測定した。ポリペプチドの融合後含有量を、ＡＤＩ－１５６４４（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）結合によって測定した。非安定化Ｆタンパク質ＲＳＶ１８１１７７（配列番号３）を、回収日及び７日後の安定化された変異体と比較した（Ａ）。ＲＳＶ Ａ型（ＲＳＶ１８０８１６及びＲＳＶ１８０９１３）又はＲＳＶ Ｂ型（ＲＳＶ１８０９１０及びＲＳＶ１８０９０７）シグナルペプチドのいずれかを有し、Ｃ－タグを有するか又はタグを有さないＲＳＶ ＦＢ変異体の、回収日におけるＲＳＶ Ｆ発現レベル（Ｂ）。回収後０日目及び３０日目の、いくつかの安定化アミノ酸置換：ＲＳＶ１８０９１３（Ｉ１５２Ｍ＋Ｋ２２６Ｍ＋Ｄ４８６Ｎ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｌ２０３Ｉ＋Ｐ１０１Ｑ、配列番号１４）及び追加の安定化突然変異Ｄ４８９Ｙ（ＲＳＶ１９０４１７、配列番号１５）、２２６位の野生型アミノ酸残基（Ｋ２２６）（ＲＳＶ１９０４１４、配列番号１６）及びドリフト突然変異Ｌ１７２Ｑ＋Ｓ１７３Ｌ（ＲＳＶ１９０４２０、配列番号１７）を有するタグフリーＲＳＶ ＦＢ変異体の融合前Ｆ発現レベル（ｐｏｓｔ Ｆ評価のために、モックトランスフェクト細胞の上清にスパイクされた２０μｇのＲＳＶ ｐｏｓｔ Ｆタンパク質の陽性対照を採用した）（Ｃ）。図２Ａ及びＢは、２つの独立したトランスフェクションの平均及びエラーバーを示す。図２Ｃのデータは、１回のトランスフェクションに基づく。
【図2-3】バイオレイヤー干渉法で測定されたトランスフェクション後の細胞培養上清の分析。上清中の実施例２に記載の非安定化及び安定化されたＦ変異体のＲＳＶ Ｆ濃度及び安定性を示す。総ポリペプチド含有量及び融合前含有量を、それぞれＣＲ９５０６及びＣＲ９５０１結合によって測定した。ポリペプチドの融合後含有量を、ＡＤＩ－１５６４４（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）結合によって測定した。非安定化Ｆタンパク質ＲＳＶ１８１１７７（配列番号３）を、回収日及び７日後の安定化された変異体と比較した（Ａ）。ＲＳＶ Ａ型（ＲＳＶ１８０８１６及びＲＳＶ１８０９１３）又はＲＳＶ Ｂ型（ＲＳＶ１８０９１０及びＲＳＶ１８０９０７）シグナルペプチドのいずれかを有し、Ｃ－タグを有するか又はタグを有さないＲＳＶ ＦＢ変異体の、回収日におけるＲＳＶ Ｆ発現レベル（Ｂ）。回収後０日目及び３０日目の、いくつかの安定化アミノ酸置換：ＲＳＶ１８０９１３（Ｉ１５２Ｍ＋Ｋ２２６Ｍ＋Ｄ４８６Ｎ＋Ｓ２１５Ｐ＋Ｌ２０３Ｉ＋Ｐ１０１Ｑ、配列番号１４）及び追加の安定化突然変異Ｄ４８９Ｙ（ＲＳＶ１９０４１７、配列番号１５）、２２６位の野生型アミノ酸残基（Ｋ２２６）（ＲＳＶ１９０４１４、配列番号１６）及びドリフト突然変異Ｌ１７２Ｑ＋Ｓ１７３Ｌ（ＲＳＶ１９０４２０、配列番号１７）を有するタグフリーＲＳＶ ＦＢ変異体の融合前Ｆ発現レベル（ｐｏｓｔ Ｆ評価のために、モックトランスフェクト細胞の上清にスパイクされた２０μｇのＲＳＶ ｐｏｓｔ Ｆタンパク質の陽性対照を採用した）（Ｃ）。図２Ａ及びＢは、２つの独立したトランスフェクションの平均及びエラーバーを示す。図２Ｃのデータは、１回のトランスフェクションに基づく。
【図3-1】実施例３に記載の選択されたタンパク質変異体の最後の精製工程のＳＥＣプロファイル。タンパク質画分を、２本の垂直破線の間で収集した。
【図3-2】実施例３に記載の選択されたタンパク質変異体の最後の精製工程のＳＥＣプロファイル。タンパク質画分を、２本の垂直破線の間で収集した。
【図4-1】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。非還元及び還元条件下でのＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）及びＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）のプールした画分のウェスタンブロット（Ａ）。Ｂ及びＣでは、ゲルをクーマシー染色する。非還元及び還元条件下でのＳＥＣクロマトグラムからのプールされたピークを含有するＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）タンパク質試料（Ｂ）。非還元（右パネル）及び還元（左パネル）条件下での、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の粗回収物（１）及び精製Ｆタンパク質（２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃ）。
【図4-2】ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析。非還元及び還元条件下でのＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）及びＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）のプールした画分のウェスタンブロット（Ａ）。Ｂ及びＣでは、ゲルをクーマシー染色する。非還元及び還元条件下でのＳＥＣクロマトグラムからのプールされたピークを含有するＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）タンパク質試料（Ｂ）。非還元（右パネル）及び還元（左パネル）条件下での、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の粗回収物（１）及び精製Ｆタンパク質（２）のＳＤＳ－ＰＡＧＥ（Ｃ）。
【図5-1】精製されたＦタンパク質の分析的ＳＥＣ分析。凝集体及び三量体を、それぞれＡ及びＴで示す。タンパク質をＨＰＬＣ又はＵＰＬＣで評価し、三量体保持時間はそれぞれ約６．５分又は４．５分であった。
【図5-2】精製されたＦタンパク質の分析的ＳＥＣ分析。凝集体及び三量体を、それぞれＡ及びＴで示す。タンパク質をＨＰＬＣ又はＵＰＬＣで評価し、三量体保持時間はそれぞれ約６．５分又は４．５分であった。
【図6】３７℃で３５日間保存した後の精製ＲＳＶ ｐｒｅＦ Ｂ型タンパク質（ｎ＝２）の分析的ＳＥＣ分析。凝集体及び三量体を、それぞれＡ及びＴで示す。タンパク質をＨＰＬＣ又はＵＰＬＣで評価し、三量体保持時間はそれぞれ約６．５分又は４．５分であった。
【図7】ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の精製ＲＳＶ ｐｒｅＦ Ｂ型ポリペプチドの低温安定性。異なる製剤緩衝液中での低速凍結プロセス後に分析ＳＥＣによって測定された、残留する融合前三量体のパーセンテージ。４℃で維持した対照試料の三量体含有量を１００％に設定した。平均データ±ＳＤ。
【図8】ＦＡＣＳにおける全長ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質。ｅｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞における２日間のポリペプチドの一過性発現、その後の３７℃又は５５℃での１０分間の熱ストレス。ＰｒｅＦタンパク質の表面発現を、ＲＳＶ Ｆの融合前立体配座に特異的なモノクローナル抗体ＣＲ９５０１を用いて測定した。
【図9-1】マウス及びコットンラットにおけるｐｒｅＦＢ ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）の免疫原性。ＲＳＶ ｐｒｅＦＢタンパク質を、０日目及び２８日目にマウス及びコットンラットに筋肉内免疫化として投与した。示されたＲＳＶ株に対するウイルス中和抗体力価を、最終免疫の２週間後（マウス）又は３週間後（コットンラット）に、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ａ）、プラーク減少中和試験（Ｂ）、又はマイクロ中和アッセイ（Ｃ）によって決定した。記号は個々の動物の中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図9-2】マウス及びコットンラットにおけるｐｒｅＦＢ ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）の免疫原性。ＲＳＶ ｐｒｅＦＢタンパク質を、０日目及び２８日目にマウス及びコットンラットに筋肉内免疫化として投与した。示されたＲＳＶ株に対するウイルス中和抗体力価を、最終免疫の２週間後（マウス）又は３週間後（コットンラット）に、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ａ）、プラーク減少中和試験（Ｂ）、又はマイクロ中和アッセイ（Ｃ）によって決定した。記号は個々の動物の中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図9-3】マウス及びコットンラットにおけるｐｒｅＦＢ ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）の免疫原性。ＲＳＶ ｐｒｅＦＢタンパク質を、０日目及び２８日目にマウス及びコットンラットに筋肉内免疫化として投与した。示されたＲＳＶ株に対するウイルス中和抗体力価を、最終免疫の２週間後（マウス）又は３週間後（コットンラット）に、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ａ）、プラーク減少中和試験（Ｂ）、又はマイクロ中和アッセイ（Ｃ）によって決定した。記号は個々の動物の中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図10-1】コットンラットにおけるｐｒｅＦ－Ｂ ＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の免疫原性及び防御効力。ＲＳＶ ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質を、０日目及び２８日目にコットンラットに筋肉内免疫化として投与し、動物を４９日目にＲＳＶ Ａ２で、又は５０日目にＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈで鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（Ａ）。チャレンジ前の血清試料を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ｂ）又はプラーク減少中和試験（Ｃ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図10-2】コットンラットにおけるｐｒｅＦ－Ｂ ＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の免疫原性及び防御効力。ＲＳＶ ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質を、０日目及び２８日目にコットンラットに筋肉内免疫化として投与し、動物を４９日目にＲＳＶ Ａ２で、又は５０日目にＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈで鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（Ａ）。チャレンジ前の血清試料を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ｂ）又はプラーク減少中和試験（Ｃ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図11-1】マウスにおけるｐｒｅＦ－Ｂのプロセシングされた変異体又は一本鎖変異体（配列番号３２及び３４）をコードするＡｄ２６の免疫原性。異なる用量レベルのプロセシング又は一本鎖のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ－Ｂでマウスを免疫化した。免疫後６週目に、示されたＲＳＶ株に対するウイルス中和抗体力価を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ａ）又はプラーク減少中和試験（Ｂ）によって決定した。免疫後６週目に単離した脾細胞において、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＲＳＶ Ｆ指向性細胞性免疫応答を決定した。記号は個々の動物の応答を表し、一方、平均応答を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図11-2】マウスにおけるｐｒｅＦ－Ｂのプロセシングされた変異体又は一本鎖変異体（配列番号３２及び３４）をコードするＡｄ２６の免疫原性。異なる用量レベルのプロセシング又は一本鎖のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ－Ｂでマウスを免疫化した。免疫後６週目に、示されたＲＳＶ株に対するウイルス中和抗体力価を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ａ）又はプラーク減少中和試験（Ｂ）によって決定した。免疫後６週目に単離した脾細胞において、ＩＦＮ－γＥＬＩＳＰＯＴアッセイによって、ＲＳＶ Ｆ指向性細胞性免疫応答を決定した。記号は個々の動物の応答を表し、一方、平均応答を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。ＦＢ：製剤緩衝液。
【図12-1】コットンラットにおけるｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の免疫原性及び防御効力。ＲＳＶ ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質（５０μｇ）を０日目及び２８日目にコットンラットに筋肉内免疫化として投与し、動物を４９日目にＲＳＶ Ｂ１７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（Ａ）。チャレンジ前の血清試料を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ｂ）又はマイクロ中和アッセイ（Ｃ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
【図12-2】コットンラットにおけるｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の免疫原性及び防御効力。ＲＳＶ ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質（５０μｇ）を０日目及び２８日目にコットンラットに筋肉内免疫化として投与し、動物を４９日目にＲＳＶ Ｂ１７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（Ａ）。チャレンジ前の血清試料を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（Ｂ）又はマイクロ中和アッセイ（Ｃ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
【図13】コットンラットにおけるプロセシングされたｐｒｅＦ－Ｂ（配列番号３２）をコードするＡｄ２６の免疫原性及び防御効力。Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦを０日目にコットンラットに筋肉内免疫化として投与し、動物を４９日目にＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（Ａ）。チャレンジ前の血清試料を、マイクロ中和アッセイ（Ｂ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
【発明を実施するための形態】
【0015】
ヒトＲＳＶ（ＨＲＳＶ）は、全ての年齢の人々において気管支炎、肺炎、及び慢性閉塞性肺疾患を引き起こす呼吸器感染の一般的な原因である。呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）は、ウイルス膜と宿主細胞膜との融合に関与しており、これは感染に必要である。ＲＳＶ Ｆ ｍＲＮＡは、Ｆ０と呼ばれる５７４アミノ酸前駆体タンパク質に翻訳される。これは、Ｎ末端（例えば、配列番号１のアミノ酸残基１～２５）に小胞体でシグナルペプチダーゼにより除去されるシグナルペプチド配列を含有する。Ｆ０は、細胞プロテアーゼ（特に、フューリン又はフューリン様プロテアーゼ）によって２つのフューリン切断部位（アミノ酸残基１０９／１１０及び１３６／１３７の間）で切断され、アミノ酸残基１１０～１３６を含む短いグリコシル化介在配列（ｐ２７領域とも呼ばれる）を除去し、且つ、Ｆ１及びＦ２と称される２つのドメイン（又はサブユニット）を生成する（図１）。
【0016】
Ｆ１ドメイン（アミノ酸残基１３７～５７４）は、そのＮ末端に疎水性融合ペプチドを含有し、Ｃ末端は、膜貫通（ＴＭ）（アミノ酸残基５３０～５５０）及び細胞質領域（アミノ酸残基５５１～５７４）を含有する。Ｆ２ドメイン（アミノ酸残基２６～１０９）は、２つのジスルフィド架橋によってＦ１に共有結合している。Ｆ１－Ｆ２ヘテロ二量体は、ビリオン中でホモ三量体として組み立てられる。本発明によれば、「プロセシングされたＲＳＶ Ｆタンパク質」は、フューリン切断部位で切断された後の、すなわちシグナルペプチド及びｐ２７領域を含まないＲＳＶ Ｆタンパク質を指す。
【0017】
上記のように、ＲＳＶ感染に対するワクチンは、現在のところはまだ利用可能ではない。ワクチンを製造するための１つの潜在的なアプローチは、精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質をベースとするサブユニットワクチンを提供することである。しかしながら、このアプローチのためには、精製されたＲＳＶ Ｆタンパク質が、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前状態の立体配座に似た立体配座であり、且つ、経時的に安定であることが望ましい。したがって、融合前立体配座に安定化されたＲＳＶ Ｆタンパク質に努力が集中されてきた。
【0018】
ヒトＲＳＶは、主にＧ糖タンパク質における遺伝的変異によって定義される２つの主要な抗原性グループの株、サブタイプＡ及びＢに分類される。これらのサブタイプは、不規則な交互の有病率パターンを示し、サブタイプＡはサブタイプＢよりも高い累積有病率を有する。Ｆタンパク質は、ＲＳＶ ＡとＢとの間で高度に保存されており、２つのグループにわたって中和抗体を誘導する。しかし、Ａ株及びＢ株のＦタンパク質は高度の配列同一性（成熟外部ドメインにおいて約９５％）を示すが、抗Ｆ抗体の交差反応性が十分に広いかどうか、及びＲＳＶ ＦＡタンパク質をベースとするワクチンがＲＳＶ Ｂ株による感染を防御し得るかどうかは知られていない。
【0019】
本発明は、１０１位のアミノ酸残基がＱであり、１５２位のアミノ酸残基がＭであり、２１５位のアミノ酸残基がＰであり、且つ、４８６位のアミノ酸残基がＮである、ＲＳＶ Ｂ株のＦタンパク質のＦ１及びＦ２ドメインのアミノ酸配列を含むＦ１及びＦ２ドメインを含む、新規の安定化された組換え融合前ＲＳＶ融合（Ｆ）タンパク質を提供する。したがって、本発明は、ＲＳＶサブグループＢの安定化された組換え融合前Ｆタンパク質（ＲＳＶ ＦＢ）タンパク質、又はその断片を提供する。アミノ酸残基の位置の番号付けの番号付けは、配列番号１におけるアミノ酸残基の番号付けに従う。本発明によれば、示された位置での特定のアミノ酸ジスルフィド架橋の存在は、融合前立体配座におけるタンパク質の安定性を増大させることが実証されている。本発明によれば、特定のアミノ酸は、ＲＳＶ ＦＢタンパク質のアミノ酸配列中に既に存在していてもよく、又はその位置の天然に存在するアミノ酸残基の置換（突然変異）によって本発明による特定のアミノ酸残基に導入されてもよい。したがって、本発明によれば、タンパク質は、野生型ＲＳＶ ＦＢタンパク質のアミノ酸配列と比較して、それらのアミノ酸配列中に１つ以上の突然変異を含み得る。
【0020】
本発明によれば、「安定化された融合前タンパク質」という用語は、融合前立体配座において安定化されているタンパク質、すなわち、例えば、融合前立体配座に特異的な抗体のタンパク質への特異的結合によって決定されるような、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前立体配座に特異的な少なくとも１つのエピトープを含み、且つ、十分な量で産生（発現）され得るタンパク質を指す。
【0021】
特定の実施形態では、２０３位のアミノ酸残基はＩである。本発明によれば、２０３位のＩの存在は、ＲＳＶ ＦＢタンパク質、特に可溶性ＲＳＶ ＦＢタンパク質の安定性を更に改善することが示された。
【0022】
或いは、又は更には、４８９位のアミノ酸残基はＹである。本発明によれば、示された位置にこのアミノ酸残基が存在することによってポリペプチドの安定性が改善されることが示された。
【0023】
特定の実施形態では、２２６位のアミノ酸残基はＭである。２２６位のアミノ酸Ｍは、タンパク質の安定性及び発現を増大させる。
【0024】
好ましい一実施形態では、１０１位のアミノ酸残基はＱであり、１５２位のアミノ酸残基はＭであり、２０３位のアミノ酸残基はＩであり、２１５位のアミノ酸残基はＰであり、４８６位のアミノ酸残基はＮであり、３５７位のアミノ酸はＲではなく、且つ／又は３７１位のアミノ酸残基はＹではない。
【0025】
好ましい一実施形態では、１０１位のアミノ酸残基はＱであり、１５２位のアミノ酸残基はＭであり、２０３位のアミノ酸残基はＩであり、２１５位のアミノ酸残基はＰであり、４８６位のアミノ酸残基はＮであり、且つ、４８９位のアミノ酸残基はＹである。
【0026】
好ましい一実施形態では、１０１位のアミノ酸残基はＱであり、１５２位のアミノ酸残基はＭであり、２０３位のアミノ酸残基はＩであり、２１５位のアミノ酸残基はＰであり、４８６位のアミノ酸残基はＮであり、４８９位のアミノ酸残基はＹであり、３５７位のアミノ酸はＲではなく、且つ／又は３７１位のアミノ酸残基はＹではない。
【0027】
Ｃｈｅｎら（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．８（１）：４４９１，２０１８）は、２０１５～２０１６年の循環ウイルス集団における新たなドリフト突然変異Ｌ１７２Ｑ及びＳ１７３Ｌを報告している。更には、Ｌｕら（Ｓｃｉ Ｒｅｐ．９（１）：３８９８，２０１９）は、Ｌ１７２Ｑ及びＳ１７３Ｌが固定されること、且つ、Ｋ１９１Ｒ、Ｉ２０６Ｍ及びＱ２０９Ｒが２０１５年～２０１８年の株について生じたことを記載している。ＶｉＰＲ及びＧＩＳＡＩＤに寄託された最近循環している株（２０１８年～２０１９年）の配列に基づくと、５つ全ての位置が現在固定されているようである。したがって、特定の実施形態では、１７２位のアミノ酸残基はＱであり、且つ、１７３位のアミノ酸残基はＬである。或いは、又は加えて、１９１位のアミノ酸残基はＲであり、２０６位のアミノ酸残基はＭであり、且つ、２０９位のアミノ酸残基はＲである。したがって、ＲＳＶ ＦＢタンパク質は、循環ＲＳＶ Ｂ株のＲＳＶ Ｆタンパク質とより密接に類似している。
【0028】
好ましい一実施形態では、１０１位のアミノ酸残基はＱであり、１５２位のアミノ酸残基はＭであり、１７２位のアミノ酸残基はＱであり、且つ、１７３位のアミノ酸残基はＬであり、２１５位のアミノ酸残基はＰであり、４８６位のアミノ酸残基はＮであり、且つ、４８９位のアミノ酸残基はＹであり、且つ、場合により２０３位のアミノ酸残基はＩである。
【0029】
別の好ましい実施形態では、１０１位のアミノ酸残基はＱであり、１５２位のアミノ酸残基はＭであり、１７２位のアミノ酸残基はＱであり、且つ、１７３位のアミノ酸残基はＬであり、１９１位のアミノ酸残基はＲであり、２０６位のアミノ酸残基はＭであり、且つ、２０９位のアミノ酸残基はＲであり、２１５位のアミノ酸残基はＰであり、４８６位のアミノ酸残基はＮであり、且つ、場合により２０３位のアミノ酸残基はＩであり、且つ／又は４８９位のアミノ酸残基はＹである。
【0030】
特定の実施形態では、本発明は、３５７位のアミノ酸残基がＲではなく、且つ、３７２位のアミノ酸残基がＹではない、本明細書に記載の組換え融合前Ｆタンパク質を提供する。
【0031】
本発明によるＲＳＶ ＦＢタンパク質は、天然に存在するフューリン切断部位を含み得る。特定の実施形態では、フューリン切断部位は欠失していてもよい。フューリン切断部位の欠失は、ｐ２７ペプチドの欠失を含み得る。これらの実施形態では、Ｆタンパク質は「一本鎖」タンパク質のままであり、すなわちフューリンによってＦ１及びＦ２にプロセシングされない。特定の実施形態では、フューリン切断部位は、アミノ酸１０９～１３５の欠失、且つ、場合により、１０６位のアミノ酸ＲのＱへの突然変異（Ｒ１０６Ｑ）及び１３７位のアミノ酸ＦのＳへの突然変異（Ｆ１３７Ｓ）と組み合わせた、Ｆ１ドメイン及びＦ２ドメインを連結するリンカー（又は連結配列、例えばＧＳＧＳＧ）による欠失ｐ ２７ペプチドの置換を含む、ｐ ２７ペプチドの欠失によって、欠失されている。
【0032】
特定の実施形態では、タンパク質は、切断型Ｆ１ドメインを含む。したがって、可溶性ＲＳＶ ＦＢタンパク質を得るために、膜貫通（ＴＭ）及び細胞質領域を欠失させて、可溶性分泌Ｆタンパク質（ｓＦタンパク質）を作製することができる。本明細書で使用される場合、「切断型」Ｆ１ドメインは、全長Ｆ１ドメインではない、すなわち、Ｎ末端又はＣ末端のいずれかの１つ以上のアミノ酸残基が欠失しているＦ１ドメインを指す。本発明によれば、少なくとも膜貫通ドメイン及び細胞質尾部は欠失して、可溶性外部ドメインとしての発現を可能にする。特定の実施形態では、Ｆ１ドメインは、５１３位のアミノ酸の後で切断されている、すなわち、５１４～５７４のアミノ酸が欠失している。
【0033】
特定の実施形態では、異種三量体化ドメインは、直接的に又はリンカー（例えば、連結配列ＳＡＩＧ）を使用することによって、切断型Ｆ１ドメインのＣ末端に連結されている。ＴＭ領域は膜固定を担い、且つ、安定性を増大させることから、可溶性のある固定されないＦタンパク質は全長タンパク質よりも非常に不安定であり、且つ、融合後の最終状態へと更により容易にリフォールディングする。したがって、高い発現レベルを示す融合前立体配座の安定化された可溶性ＦＢタンパク質を得るために、異種三量体化ドメインを、ＲＳＶ ＦＢタンパク質の切断型Ｆ１ドメインのＣ末端に直接的に又はリンカー（例えば、連結配列ＳＡＩＧ）を使用することによって融合させることができる。例えば、可溶性ＲＳＶ Ｆタンパク質の三量体化の場合、フィブリチンベースの三量体化ドメインは、外部ドメインのＣ末端に融合され得る（ＭｃＬｅｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１０，２０１３））。このフィブリチンドメイン又は「フォルドン」は、Ｔ４フィブリチンに由来し、且つ、異種三量体化ドメインとして前述された（Ｌｅｔａｒｏｖ ｅｔ ａｌ．，（１９９３）；Ｓ－Ｇｕｔｈｅ ｅｔ ａｌ．，（２００４））。
【0034】
好ましい実施形態では、異種三量体化ドメインは、アミノ酸配列ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号２）を含むフォルドンドメインである。
【0035】
特定の実施形態では、タンパク質は、可溶性タンパク質の発現を改善するために、ＲＳＶ ＦＡタンパク質のシグナルペプチドを含む。プロセシングされたＲＳＶ ＦＢタンパク質がシグナルペプチドを含まないことは、当業者によって理解されるであろう。
【0036】
再び、本発明によれば、アミノ酸残基の位置の番号付けは、配列番号１におけるアミノ酸の番号付けに従うことが理解されるべきである。
【0037】
本発明によれば、示された位置に特定の安定化されたアミノ酸が存在すると、融合前立体配座におけるタンパク質の安定性が増大することが実証された。本発明によれば、特定のアミノ酸は、アミノ酸配列中に既に存在していてもよく、又はその位置のアミノ酸の置換（突然変異）によって本発明による特定のアミノ酸に導入されてもよい。
【0038】
したがって、本発明は、新規の安定化された組換え融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、すなわち、融合前立体配座に安定化されたＲＳＶ ＦＢタンパク質、及び／又はその断片を提供する。本発明の安定な融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質又はその断片は、融合前立体配座であり、すなわち、それらは、融合前立体配座Ｆタンパク質に特異的な少なくとも１つのエピトープを含む（提示する）。融合前立体配座Ｆタンパク質に特異的なエピトープは、融合後立体配座には存在しないエピトープである。いかなる特定の理論にも束縛されることを望むものではないが、ＲＳＶ ＦＢタンパク質の融合前立体配座は、天然ＲＳＶビリオン上で発現されるＲＳＶ ＦＢタンパク質上のエピトープと同じエピトープを含有し、したがって、防御中和抗体を誘発する利点を提供し得ると考えられる。
【0039】
特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質又はその断片は、融合前特異的モノクローナル抗体、例えばＣＲ９５０１によって認識される少なくとも１つのエピトープを含む。ＣＲ９５０１は、抗体５８Ｃ５の重鎖及び軽鎖可変領域、したがって結合特異性を含み、抗体５８Ｃ５は、融合前特異的モノクローナル抗体、すなわち、その融合前立体配座においてＲＳＶ Ｆタンパク質に結合し、且つ、融合後立体配座には結合しない抗体であることが以前に示されている（国際公開第２０１２／００６５９６号を参照）。
【0040】
上記のように、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質の断片も本発明に包含される。断片は、アミノ末端欠失（例えば、シグナル配列を切断することによる）及びカルボキシ末端欠失（例えば、膜貫通領域及び／又は細胞質尾部を欠失させることによる）のいずれか又は両方から生じ得る。断片は、Ｆタンパク質の免疫学的に活性な断片、すなわち、対象において免疫応答を生じる部分を含むように選択され得る。これは、全ての当業者に慣習的であるｉｎ ｓｉｌｉｃｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及び／又はｉｎ ｖｉｖｏの方法を使用して容易に決定することができる。したがって、本明細書で使用される「断片」という用語は、アミノ末端及び／又はカルボキシ末端及び／又は内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、ＲＳＶ ＦＢタンパク質の配列の対応する位置、例えば、ＲＳＶ ＦＢタンパク質の全長配列と同一であるタンパク質を指す。免疫応答を誘導し、且つ、一般にはワクチン接種を目的とするためには、タンパク質は全長である必要も、その野生型の機能を全て有している必要もなく、且つ、タンパク質の断片（すなわち、シグナルペプチドなし）が同様に有用であるということが理解されよう。
【0041】
特定の実施形態では、本発明によるコードされたタンパク質又はその断片は、配列番号１のアミノ酸１～２５に対応する、リーダー配列又はシグナルペプチドとも呼ばれるシグナル配列を含む。シグナル配列は、典型的には、分泌経路に向かうことになる新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短い（例えば、５～３０アミノ酸長）アミノ酸配列であり、且つ、典型的には、シグナルペプチダーゼによって切断されて遊離シグナルペプチド及び成熟タンパク質を生成する。
【0042】
シグナル配列は、ＲＳＶ ＦＡ又はＲＳＶ ＦＢタンパク質のシグナル配列であってもよい。特定の実施形態では、本発明によるタンパク質又はその断片は、シグナル配列を含まない。
【0043】
特定の実施形態では、本発明の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質の発現レベルは、非安定化野生型ＲＳＶ ＦＢタンパク質（すなわち、安定化アミノ酸を含まないもの）と比較して増大する。
【0044】
特定の実施形態では、融合前含有量（融合前特異的ＣＲ９５０１抗体に結合するＦＢタンパク質の画分として定義される）は、当該安定化置換を有さないＦＢタンパク質と比較して、４℃で保存した後のタンパク質の回収から７日後に有意に高い。特定の実施形態では、融合前含有量は、当該安定化置換を有さないＦＢタンパク質と比較して、４℃で保存した後のタンパク質の回収から３０日後に有意に高かった。したがって、特定の実施形態では、本発明による精製された融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質は、定義された位置に安定化アミノ酸残基を有さないＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、４℃で保存した際に増大した安定性を有する。「保存した際の安定性」とは、特定の期間後に４℃で溶液（例えば、培養培地）中でタンパク質を保存した際に、タンパク質が、融合前特異的抗体（例えば、ＣＲ９５０１）に特異的な少なくとも１つのエピトープを依然として提示することを意味する。特定の実施形態では、タンパク質は、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を４℃で保存した際に、少なくとも１、２、３、４、５又は６ヶ月間、好ましくは少なくとも１年間、少なくとも１つの融合前特異的エピトープを提示する。
【0045】
本発明による融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質は、１つ以上の安定化アミノ酸（既に存在しているか、又は突然変異によって導入されているかのいずれか）の存在によって融合前立体配座に安定化されている、すなわち、例えば精製、凍結融解サイクル、及び／又は保存などのタンパク質の処理の際に融合後立体配座に容易に変化しない。
【0046】
特定の実施形態では、本発明による精製された融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、定義された位置に安定化アミノ酸残基を有さないＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、３７℃で保存した際に増大した安定性を有する。
【0047】
特定の実施形態では、本発明による融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質は、実施例４に記載されているように、融解温度を測定して決定される場合、定義された位置に異なる（例えば野生型）アミノ酸残基を有するＲＳＶ Ｆタンパク質と比較して、増大した熱安定性を有する。
【0048】
特定の実施形態では、タンパク質は、適切な製剤緩衝液中で凍結融解条件に供された後に、定義された位置に異なる（例えば、野生型）アミノ酸残基を有するＲＳＶ Ｆタンパク質と比較してより高い三量体含有量を示す。
【0049】
特定の好ましい実施形態では、ＲＳＶ ＦＢタンパク質は、配列番号１４、１６、１７、１８、２９、３０、３２及び３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。発現及びプロセシング後、タンパク質はシグナルペプチド及びｐ２７ペプチドをもはや含有しないことが理解されるべきである。したがって、特定の好ましい実施形態では、ＲＳＶ ＦＢタンパク質は、配列番号１４のアミノ酸２６～１０９を含むＦ２ドメイン及び配列番号１４のアミノ酸１３７～５１３を含むＦ１ドメイン、配列番号１６のアミノ酸２６～１０９を含むＦ２ドメイン及び配列番号１６のアミノ酸１３７～５１３を含むＦ１ドメイン、配列番号１７のアミノ酸２６～１０９を含むＦ２ドメイン及び配列番号１７のアミノ酸１３７～５１３を含むＦ１ドメイン、配列番号１８のアミノ酸２６～１０９を含むＦ２ドメイン及び配列番号１８のアミノ酸１３７～５１３を含むＦ１ドメイン、又は配列番号２９のアミノ酸２６～１０９を含むＦ２ドメイン及び配列番号２９のアミノ酸１３７～５７４を含むＦ１ドメイン、又は配列番号３２のアミノ酸２６～１０９を含むＦ２ドメイン及び配列番号３２のアミノ酸１３７～５７４を含むＦ１ドメインを含む、アミノ酸配列を含む。配列番号３０及び３４のタンパク質はプロセシングされず、且つ、配列番号３０又は３４のアミノ酸２６～５７４を含む一本鎖タンパク質のままであることに留意されたい。
【0050】
特定の実施形態では、タンパク質は、ＨＩＳ－タグ、ｓｔｒｅｐ－タグ又はｃ－タグを含む。Ｈｉｓ－タグ又はポリヒスチジン－タグは、少なくとも５つのヒスチジン（Ｈ）残基からなるタンパク質中のアミノ酸モチーフであり、ｓｔｒｅｐ－タグは、８個の残基からなるアミノ酸配列（ＷＳＨＰＱＦＥＫ（配列番号２７））であり、ｃ－タグは、４個の残基からなるアミノ酸モチーフ（ＥＰＥＡ、配列番号２８）である。タグは、タンパク質のＮ又はＣ末端にあることが多く、且つ、一般的に精製目的で使用される。
【0051】
上記のように、ＲＳＶは、２つの抗原サブグループ、Ａ及びＢを有する単一の血清型として存在することが知られている。２つのグループの成熟したプロセシングされたＦタンパク質外部ドメインのアミノ酸配列は、約９５％同一である。本出願を通して使用される場合、アミノ酸位置は、サブグループＢの臨床分離株のＦタンパク質のコンセンサス配列（配列番号１）を参照して与えられる。したがって、本発明において使用される場合、「ＲＳＶ Ｆタンパク質の「ｘ」位のアミノ酸残基」という表現は、配列番号１のＲＳＶ Ｆタンパク質における「ｘ」位のアミノ酸に対応するアミノ酸を意味する。本出願を通して使用される番号付けシステムにおいて、１は、未成熟Ｆ０タンパク質のコンセンサス配列（配列番号１）のＮ末端アミノ酸を指すことに留意されたい。別のＲＳＶ Ｂ株のＦタンパク質を使用する場合、Ｆタンパク質のアミノ酸位置は、必要に応じてギャップを挿入して、他のＲＳＶ Ｂ株の配列を配列番号１のＦタンパク質コンセンサスとアラインメントさせることによって、配列番号１のＦタンパク質の番号付けを参照して番号付けされる。配列アラインメントは、当技術分野で周知の方法を使用して、例えば、ＣＬＵＳＴＡＬＷ、Ｂｉｏｅｄｉｔ又はＣＬＣ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈによって行うことができる。
【0052】
本出願を通して使用される場合、当該技術分野における慣習として、ヌクレオチド配列は５’から３’方向に提供され、且つ、アミノ酸配列はＮ末端からＣ末端に提供される。
【0053】
本発明によるアミノ酸は、２０種の天然に存在するもの（又は「標準」アミノ酸）のいずれかであり得る。標準アミノ酸は、それらの特性に基づき、いくつかの群に分割することができる。重要な因子としては、電荷、親水性又は疎水性、サイズ及び官能基である。これらの特性は、タンパク質構造及びタンパク質－タンパク質間の相互作用にとって重要である。いくつかのアミノ酸は、他のシステイン残基と共有ジスルフィド結合（又はジスルフィド架橋）を形成することができるシステイン、タンパク質骨格のターンを誘導するプロリン、及び他のアミノ酸より柔軟なグリシンなどの特別な特性を有する。表１は、標準アミノ酸の略語及び特性を示す。
【0054】
通常の分子生物学手順によってタンパク質への突然変異が行われ得ることが、当業者には理解されるであろう。本発明による突然変異は、好ましくは、これらの突然変異を含まないＲＳＶ ＦＢタンパク質と比較して、融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質の発現レベルの増大及び／又は安定化の増大をもたらす。
【0055】
本発明は更に、本発明によるＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする核酸分子を提供する。本発明で使用される「核酸分子」という用語は、ポリマー形態のヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチド）を指し、且つ、ＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡの両方、並びに上記の合成形態及び混合ポリマーを含む。非常に多くの異なる核酸分子が、遺伝子コードの縮重結果として同一のタンパク質をコードすることができるということが理解される。また、当業者であれば、通常の技術を使用して、ここに記載されるポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質配列に影響を与えないヌクレオチド置換を行って、タンパク質が発現される任意の特定の宿主生物のコドンの使用を反映することができると理解することができる。したがって、別途記載のない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸分子」は、互いの縮重型であるヌクレオチド配列及び同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列全てを含む。タンパク質及びＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はイントロンを含むことができる。本明細書の配列は、当該技術分野における慣習として、５’から３’方向で提供されている。
【0056】
好ましい実施形態では、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子は、哺乳動物細胞、好ましくはヒト細胞、又は昆虫細胞における発現のためにコドン最適化される。コドン最適化の方法は既知であり、且つ、以前に記載されている（例えば、哺乳動物細胞については国際公開第９６／０９３７８号）。野生型配列と比較して、少なくとも１つの非好適なコドンがより好適なコドンに置き換えられている場合、配列はコドン最適化されていると考えられる。本明細書では、非好適なコドンは、同じアミノ酸をコードする別のコドンよりも生物中であまり頻繁に使用されないコドンであり、且つ、より好適なコドンは、非好適なコドンよりも生物においてより頻繁に使用されるコドンである。特定の生物のコドン使用頻度は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎなどのコドン頻度表に見出すことができる。好ましくは、２つ以上の非好適なコドン、好ましくは大部分の又は全ての非好適なコドンは、より好適なコドンに置き換えられる。好ましくは、生物中の最も頻繁に使用されるコドンが、コドン最適化配列で使用される。好適なコドンによる置換は、一般に、より高い発現をもたらす。
【0057】
核酸配列は、通常の分子生物学技術を使用してクローニングすることができ、又はＤＮＡ合成によって新たに生成することができ、ＤＮＡ合成及び／又は分子クローニングの分野で事業を有するサービス会社（例えば、ＧｅｎｅＡｒｔ、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｅｕｒｏｆｉｎ）による通常の手順を使用して実行することができる。
【0058】
特定の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号１４、１６、１７、１８、２９、３０、３２及び３４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする。
【0059】
特定の好ましい実施形態では、核酸は、配列番号３１及び３３からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【0060】
本発明はまた、上記のように核酸分子を含むベクターもまた提供する。特定の実施形態では、したがって、本発明による核酸分子は、ベクターの一部である。こうしたベクターは、当業者に周知の方法によって容易に操作することができ、例えば、原核細胞及び／又は真核細胞にて複製可能にするために設計することができる。使用されるベクターはＤＮＡをクローニングする上で好適であり、且つ、目的の核酸分子の発現にこれを使用することができる任意のベクターであってもよい。本発明による適切なベクターは、例えば、アデノベクター、アルファウイルス、パラミクソウイルス、ワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、レトロウイルスベクターなどである。
【0061】
本発明の特定の実施形態では、ベクターはアデノウイルスベクターである。本発明によるアデノウイルスは、アデノウイルス科に属し、且つ、好ましくは、マストアデノウイルス属に属するものである。これはヒトアデノウイルスであることができるだけでなく、限定されないが、ウシアデノウイルス（例えば、ウシアデノウイルス３、ＢＡｄＶ３）、イヌアデノウイルス（例えば、ＣＡｄＶ２）、ブタアデノウイルス（例えば、ＰＡｄＶ３又は５）、又はサルアデノウイルス（モンキーアデノウイルス及び類人猿アデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルス又はゴリラアデノウイルスを含む。）を含む他の種に感染するアデノウイルスであってもよい。好ましくは、アデノウイルスは、例えば、ヒトアデノウイルス（ＨＡｄＶ又はＡｄＨｕ）、又はチンパンジー若しくはゴリラアデノウイルス（ＣｈＡｄ、ＡｄＣｈ、又はＳＡｄＶ）などのサルアデノウイルス、又はアカゲザルアデノウイルス（ＲｈＡｄ）である。本発明において、ヒトアデノウイルスは、種の表示なしにＡｄと呼ばれる場合に意味され、例えば、簡単な表記「Ａｄ２６」は、ヒトアデノウイルス血清型２６であるＨＡｄＶ２６と同じことを意味する。また、本明細書中で使用される場合、表記「ｒＡｄ」は、組換えアデノウイルスを意味し、例えば、「ｒＡｄ２６」は、組換えヒトアデノウイルス２６を指す。
【0062】
最も進んだ研究は、ヒトアデノウイルスを使用して行われており、且つ、本発明の特定の態様によれば、ヒトアデノウイルスが好ましい。特定の好ましい実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルスをベースとする。好ましい実施形態では、組換えアデノウイルスは、ヒトアデノウイルス血清型５、１１、２６、３４、３５、４８、４９、５０、５２などをベースとする。本発明の特に好ましい実施形態によれば、アデノウイルスは、血清型２６のヒトアデノウイルスである。これらの血清型の利点としては、ヒト集団における低い血清有病率及び／又は低い既存の中和抗体力価、並びに臨床試験におけるヒト対象における使用経験が挙げられる。
【0063】
サルアデノウイルスはまた、一般に、ヒト集団において低い血清有病率及び／又は低い既存の中和抗体力価を有し、且つ、チンパンジーアデノウイルスベクターを使用してかなりの量の研究が報告されている（例えば、米国特許第６０８３７１６号、国際公開第２００５／０７１０９３号、国際公開第２０１０／０８６１８９号、国際公開第２０１００８５９８４号、Ｆａｒｉｎａ ｅｔ ａｌ，２００１，Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７５：１１６０３－１３；、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ，２００２，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８３：１５１－５５、Ｋｏｂｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ，２００６，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ３４６：３９４－４０１、Ｔａｔｓｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １５：６０８－１７、Ｂａｎｇａｒｉ ａｎｄ Ｍｉｔｔａｌ，２００６，Ｖａｃｃｉｎｅ ２４：８４９－６２による総説、Ｌａｓａｒｏ ａｎｄ Ｅｒｔｌ，２００９，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １７：１３３３－３９も参照）。したがって、他の実施形態では、本発明による組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス、例えばチンパンジーアデノウイルスをベースとする。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、サルアデノウイルス１、７、８、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７．１、２８．１、２９、３０、３１．１、３２、３３、３４、３５．１、３６、３７．２、３９、４０．１、４１．１、４２．１、４３、４４、４５、４６、４８、４９、５０型又はＳＡ７Ｐをベースとする。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＣｈＡｄＯｘ １（例えば、国際公開第２０１２／１７２２７７号を参照）又はＣｈＡｄＯｘ ２（例えば、国際公開第２０１８／２１５７６６号を参照）などのチンパンジーアデノウイルスをベースとする。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＢＺ２８などのチンパンジーアデノウイルスをベースとする（例えば、国際公開第２０１９／０８６４６６号を参照）。特定の実施形態では、組換えアデノウイルスは、ＢＬＹ６（例えば、国際公開第２０１９／０８６４５６号を参照）又はＢＺ１（例えば、国際公開第２０１９／０８６４６６号を参照）などのゴリラアデノウイルスをベースとする。
【0064】
本発明の好ましい一実施形態では、アデノウイルスベクターは、例えばＡｄ２６を含む稀な血清型由来のカプシドタンパク質を含む。典型的な実施形態では、ベクターはｒＡｄ２６ウイルスである。「アデノウイルスカプシドタンパク質」は、特定のアデノウイルスの血清型及び／又は向性の決定に関与するアデノウイルス（例えば、Ａｄ２６、Ａｄ３５、ｒＡｄ４８、ｒＡｄ５ＨＶＲ４８ベクター）のカプシド上のタンパク質を指す。アデノウイルスカプシドタンパク質は、典型的には、ファイバー、ペントン及び／又はヘキソンタンパク質を含む。本明細書中で使用される場合、特定のアデノウイルスについての「カプシドタンパク質」、例えば、「Ａｄ２６カプシドタンパク質」は、例えば、Ａｄ２６カプシドタンパク質の少なくとも一部を含むキメラカプシドタンパク質であり得る。特定の実施形態では、カプシドタンパク質は、Ａｄ２６の全カプシドタンパク質である。特定の実施形態では、ヘキソン、ペントン及びファイバーはＡｄ２６のものである。
【0065】
当業者は、複数の血清型に由来する要素が、単一の組換えアデノウイルスベクターにおいて組み合わせられ得ることを認識するであろう。したがって、異なる血清型由来の所望の特性を組み合わせたキメラアデノウイルスが産生され得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のキメラアデノウイルスは、第１の血清型の既存の免疫の不在を、温度安定性、アセンブリ、アンカリング、産生収率、再指向又は改善された感染、標的細胞におけるＤＮＡの安定性などの特徴と組み合わせることができる。例えば、Ａｄ４８由来の部分カプシドを有するＡｄ５骨格を含むキメラアデノウイルスＡｄ５ＨＶＲ４８については国際公開第２００６／０４０３３０号を参照。及びまた、例えば、それぞれＰｔｒ１、Ｐｔｒ１２、及びＰｔｒ１３の部分カプシドタンパク質を有するＡｄ２６ウイルス骨格を含むキメラアデノウイルスＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１、Ａｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１２、及びＡｄ２６ＨＶＲＰｔｒ１３については国際公開第２０１９／０８６４６１号を参照。
【0066】
特定の好ましい実施形態では、本発明において有用な組換えアデノウイルスベクターは、主に又は完全にＡｄ２６に由来する（すなわち、ベクターはｒＡｄ２６である）。いくつかの実施形態では、アデノウイルスは、例えば、ゲノムのＥ１領域に欠失を含むため、複製欠損である。Ａｄ２６又はＡｄ３５のような非Ｃグループアデノウイルスに由来するアデノウイルスについては、アデノウイルスのＥ４－ｏｒｆ６コード配列を、Ａｄ５のようなヒトサブグループＣのアデノウイルスのＥ４－ｏｒｆ６と交換することが典型的である。これにより、こうしたアデノウイルスを、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現する周知の相補性細胞株、例えば、２９３細胞及びＰＥＲ．Ｃ６細胞などにおいて増殖させることが可能となる（例えば、Ｈａｖｅｎｇａ，ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８７：２１３５－４３、国際公開第０３／１０４４６７号を参照されたい）。しかしながら、そのようなアデノウイルスは、Ａｄ５のＥ１遺伝子を発現しない非相補性細胞で複製することができない。
【0067】
組換えアデノウイルスベクターの調製は、当該分野で周知である。ｒＡｄ２６ベクターの調製は、例えば、国際公開第２００７／１０４７９２号及びＡｂｂｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，（２００７）Ｖｉｒｏｌ ８１（９）：４６５４－６３に記載されている。Ａｄ２６の例示的なゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＥＦ１５３４７４及び国際公開第２００７／１０４７９２号の配列番号１に見出される。本発明に有用なベクターの例としては、例えば、国際公開第２０１２／０８２９１８号に記載されているものが挙げられ、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0068】
典型的には、本発明において有用なベクターは、組換えアデノウイルスゲノム全体を含む核酸（例えば、プラスミド、コスミド、又はバキュロウイルスベクター）を用いて産生される。したがって、本発明はまた、本発明のアデノウイルスベクターをコードする単離された核酸分子を提供する。本発明の核酸分子は、ＲＮＡの形態又はクローニングによって得られる若しくは合成的に産生されるＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは、二本鎖又は一本鎖であり得る。
【0069】
本発明において有用なアデノウイルスベクターは、典型的には複製欠損である。これらの実施形態では、ウイルスは、Ｅ１領域などのウイルスの複製に重要な領域の欠失又は不活性化によって複製欠損にされる。領域は、例えば、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子（通常、プロモータに連結されている）、又はＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする遺伝子（通常、プロモータに連結されている）などの目的の遺伝子を領域内に挿入することによって、実質的に欠失又は不活性化することができる。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、他の領域、例えばＥ２領域、Ｅ３領域若しくはＥ４領域における欠失、又はこれらの領域のうちの１つ以上内のプロモータに連結された異種遺伝子の挿入を含み得る。Ｅ２及び／又はＥ４突然変異アデノウイルスについては、一般に、Ｅ２及び／又はＥ４相補細胞株が、組換えアデノウイルスを生成するために使用される。アデノウイルスのＥ３領域における突然変異は、Ｅ３が複製に必要とされないので、細胞株によって補完される必要はない。
【0070】
パッケージング細胞株は、典型的には、本発明における使用のための十分な量のアデノウイルスベクターを産生するために使用される。パッケージング細胞は、複製欠損ベクター中に欠失又は不活性化された遺伝子を含み、したがって、ウイルスが細胞内で複製することを可能にする細胞である。Ｅ１領域に欠失を有するアデノウイルスのための適切なパッケージング細胞株としては、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６、９１１、２９３、及びＥ１ Ａ５４９が挙げられる。
【0071】
本発明の好ましい一実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクター、及びより好ましくはｒＡｄ２６ベクター、最も好ましくはアデノウイルスゲノムのＥ１領域に少なくとも欠失を有するｒＡｄ２６ベクター、例えばＡｂｂｉｎｋ，Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００７．８１（９）：ｐ．４６５４－６３に記載されているものなどであり、これらは参照により本明細書に組み込まれる。典型的には、ＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸配列は、アデノウイルスゲノムのＥ１及び／又はＥ３領域にクローニングされる。
【0072】
融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする核酸分子を含む宿主細胞もまた、本発明の一部を形成する。融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質は、宿主細胞、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、腫瘍細胞株、ＢＨＫ細胞、ヒト細胞株、例えばＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、若しくは酵母、真菌、昆虫細胞など、又はトランスジェニック動物若しくは植物における分子の発現に関与する組換えＤＮＡ技術を通して産生され得る。特定の実施形態では、細胞は多細胞生物に由来するものであり、特定の実施形態では、細胞は脊椎動物又は無脊椎動物を起源とするものである。特定の実施形態では、細胞は哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞はヒト細胞である。一般に、宿主細胞における本発明の融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質などの組換えタンパク質の産生は、発現可能な形式のＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする異種核酸分子を宿主細胞に導入すること、核酸分子の発現に寄与する条件下で細胞を培養すること、及び当該細胞内のタンパク質の発現を可能にすることを含む。発現可能な形式でＲＳＶ Ｆタンパク質をコードする核酸分子は、発現カセット形態であってもよく、且つ、これは通常、エンハンサ（複数可）、プロモータ、ポリアデニル化シグナルなどといった核酸の発現を引き起こすことができる配列を必要とする。当業者は、様々なプロモータが宿主細胞で遺伝子の発現を得るために使用されることができるという点を認識している。プロモータは、常時発現型であるか又は調節されることができ、ウイルス、原核生物又は真核生物といった源を含む様々な源から得ることができ、又は人工的に設計することができる。
【0073】
細胞培養培地は、様々な供給業者から入手可能であり、且つ、好適な培地は、目的のタンパク質、ここでは融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を発現するために、宿主細胞について慣習的に選択することができる。好適な培地は血清を含有してもよく、又は血清を含有しなくてもよい。
【0074】
「異種核酸分子」（本明細書では「導入遺伝子」とも呼ばれる）は、宿主細胞内に天然では存在しない核酸分子である。この核酸分子は例えば、標準的な分子生物学技術によってベクターに導入される。導入遺伝子は、発現制御配列に一般的には操作可能に連結される。これは例えば、プロモータの制御下で導入遺伝子（複数可）をコードする核酸を配置することで行われ得る。更なる制御配列が加えられてもよい。多くのプロモータを、導入遺伝子（複数可）を発現するために使用することができ、且つ、これは当業者にとって既知であり、例えばこうしたプロモータは、ウイルスプロモータ、哺乳動物プロモータ、合成プロモータなどを含んでもよい。真核細胞において発現を得るための好適なプロモータの非限定的な例としては、ＣＭＶプロモータ（米国特許第５，３８５，８３９号）、例えば、ＣＭＶ即時初期遺伝子エンハンサ／プロモータからのｎｔ－７３５～＋９５を含むＣＭＶ即時初期プロモータが挙げられる。ポリアデニル化シグナル、例えば、ウシ成長ホルモンポリＡシグナル（米国特許第５，１２２，４５８号）は、導入遺伝子（複数可）の後ろに存在し得る。或いは、広範に使用されるいくつかの発現ベクターは当該技術分野で、且つ、商業的供給源から入手可能であるが、これは例えば、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのｐｃＤＮＡ及びｐＥＦベクターシリーズ、ＢＤ ＳｃｉｅｎｃｅによるｐＭＳＣＶ及びｐＴＫ－Ｈｙｇ、ＳｔｒａｔａｇｅｎｅによるｐＣＭＶ－Ｓｃｒｉｐｔなどであり、これらは目的のタンパク質を組換えで発現するために、又は好適なプロモータ及び／若しくは転写終結配列、ポリＡ配列などを得るために使用され得る。
【0075】
細胞培養は、例えば培養容器の表面若しくはマイクロキャリアに付着する細胞である付着細胞培養及び懸濁培養を含む任意の種類の細胞培養であり得る。ほとんどの大規模な懸濁培養は、操作及びスケールアップするために最も簡潔であることからバッチプロセス又は流加プロセスとして操作される。今日では、灌流方式に基づく連続プロセスは更に一般的なものとなり、且つ好適でもある。好適な培地もまた当業者に周知であり、且つ、これは一般には大量に商業的供給源から取得することができ、又は標準的なプロトコルに従って特別注文することができる。培養は、例えば、バッチ、フィードバッチ、連続システムなどを使用して、例えば、皿、ローラボトル、又はバイオリアクターで行うことができる。細胞を培養するのに好適な条件が知られている（例えば、Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｋｒｕｓｅ ａｎｄ Ｐａｔｅｒｓｏｎ、ｅｄｉｔｏｒｓ（１９７３）、及びＲ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ａｎｉｍａｌ ｃｅｌｌｓ：Ａ ｍａｎｕａｌ ｏｆ ｂａｓｉｃ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、第４版（Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ Ｉｎｃ．，２０００，ＩＳＢＮ０－４７１－３４８８９－９）を参照）。
【0076】
本発明は更に、本発明による核酸分子、タンパク質、その断片、及び／又はベクターを含む組成物を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ＲＳＶ Ｆタンパク質の融合前立体配座に存在するが、融合後立体配座には存在しないエピトープを提示する融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質及び／又はその断片を含む組成物を提供する。本発明はまた、こうした融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質及び／又はそのベクターをコードする核酸分子及び／又はベクターを含む組成物を提供する。好ましい一実施形態では、組成物は、ＲＳＶ ＦＢタンパク質及び／又は断片、並びに同時投与のための本発明によるベクターを含む。ヒトに投与するために、本発明は、核酸、タンパク質、及び／又はベクター並びに薬学的に許容される担体又は賦形剤を含む薬学的組成物を使用し得る。この文脈では、「薬学的に許容される」という用語は、使用される投与量及び濃度での担体又は賦形剤が、投与される対象でいかなる望ましくない、又は有害な効果も引き起こさないことを意味する。こうした薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当該技術分野で周知である（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］；Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ ａｎｄ Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］；及びＨａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照）。精製された核酸、タンパク質、及び／又はベクターは、好ましくは、滅菌溶液として製剤化及び投与されるが、凍結乾燥調製物を利用することも可能である。滅菌溶液は、滅菌濾過によって、又は当該技術分野でそれ自体が既知の他の方法によって調製される。続いてこの溶液を凍結乾燥、又は薬学的投与容器へと充填する。この溶液のｐＨは、一般にはｐＨ３．０～９．５の範囲、好ましくはｐＨ５．０～７．５の範囲である。核酸、タンパク質、及び／又はベクターは、典型的には、適切な薬学的に許容される緩衝液を有する溶液中にあり、且つ、溶液はまた、塩を含有し得る。場合により、アルブミンなどの安定化剤が存在し得る。特定の実施形態では、界面活性剤が加えられる。特定の実施形態では、核酸、タンパク質、及び／又はベクターは、注射可能な調製物に製剤化され得る。これらの製剤は、有効量の核酸、タンパク質、及び／又はベクターを含有し、滅菌液体溶液、液体懸濁液又は凍結乾燥バージョンのいずれかであり、且つ、場合により安定剤又は賦形剤を含有する。
【0077】
例えば、アデノウイルスは、Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ Ｗｏｒｌｄ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｈｏｇａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｓｔａｂｌｅ ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒ ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｍａｒｃｈ ２００２，ｐ．４３－４８）：２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ ８、２５ ｍＭ ＮａＣｌ、２．５％グリセロールにも使用される緩衝液中で保存され得る。ヒトへの投与に好適な別の有用な製剤緩衝液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ ＮａＣｌ、スクロース１０％ｗ／ｖ、ポリソルベート－８０ ０．０２％ｗ／ｖである。言うまでもなく、多くの他の緩衝液を使用することができ、且つ、精製された（アデノ）ウイルス調製物の保存及び薬学的投与のための適切な製剤のいくつかの例は、例えば、欧州特許第０８５３６６０号、米国特許第６，２２５，２８９号及び国際公開第９９／４１４１６号、国際公開第９９／１２５６８号、国際公開第００／２９０２４号、国際公開第０１／６６１３７号、国際公開第０３／０４９７６３号、国際公開第０３／０７８５９２号、国際公開第０３／０６１７０８号に見出すことができる。
【0078】
特定の実施形態では、組成物は、１つ以上のアジュバントを更に含んでもよい。アジュバントは、適用された抗原決定基に対する免疫応答を更に増大させることが当該分野で公知であり、且つ、アデノウイルス及び適切なアジュバントを含む薬学的組成物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／１１０４０９号に開示されている。「アジュバント」及び「免疫刺激剤」という用語は、互換的に使用されており、且つ、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質として定義されている。この文脈において、アジュバントは、本発明のアデノウイルスベクターに対する免疫応答を強化するために使用される。好適なアジュバントの例としては、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウムといったアルミニウム塩；ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号を参照）といったスクアレン－水エマルジョンを含む油エマルジョン組成物（又は水中油型組成物）；例えばＱＳ２１及び免疫刺激複合体（Immunostimulating Complex、ＩＳＣＯＭｓ）といったサポニン製剤（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号、国際公開第９０／０３１８４号、国際公開第９６／１１７１１号、国際公開第２００４／００４７６２号、国際公開第２００５／００２６２０号を参照）；細菌誘導体又は微生物誘導体であって、これらの例としては、モノホスホリル脂質Ａ（ＭＰＬ）、３－Ｏ－脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、オリゴヌクレオチドを含有するＣｐＧ－モチーフ、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性エンテロトキシンＬＴといったＡＤＰリボシル化細菌毒素又はその変異体、コレラ毒素ＣＴなどが挙げられる。例えば、目的の抗原へのＣ４結合タンパク質（Ｃ４ｂｐ）のオリゴマー化ドメインの融合物をコードする異種核酸を使用することによって、ベクターにコードされたアジュバントを使用することも可能である（例えば、Ｓｏｌａｂｏｍｉ ｅｔ ａｌ，２００８，Ｉｎｆｅｃｔ Ｉｍｍｕｎ ７６：３８１７－２３）。特定の実施形態では、本発明の組成物は、アジュバントとして例えば水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸アルミニウムカリウム、又はそれらの組み合わせといった形態のアルミニウムを、例えば用量あたり０．０７５～１．０ｍｇのアルミニウム含有量など、０．０５～５ｍｇの濃度で含む。
【0079】
他の実施形態では、組成物はアジュバントを含まない。
【0080】
本発明は更に、本明細書に記載の組成物を含む、ＲＳＶに対するワクチンを提供する。
【0081】
本発明はまた、対象におけるＲＳＶ Ｆタンパク質に対する免疫応答を誘導するための、本発明による安定化された融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、その断片、核酸分子及び／又はベクターの使用を提供する。
【0082】
本発明による融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターを対象に投与することを含む、対象においてＲＳＶ Ｆタンパク質、特にＲＳＶ ＦＢに対する免疫応答を誘導するための方法が更に提供される。対象においてＲＳＶ Ｆタンパク質、特にＲＳＶ ＢＦに対する免疫応答を誘導するのに使用するための、本発明による融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、核酸分子、及び／又はベクターも提供される。更に、対象においてＲＳＶ Ｆタンパク質、特にＲＳＶ ＦＢに対する免疫応答を誘導するのに使用するための医薬品を製造するための、本発明による融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、及び／又は核酸分子、及び／又はベクターの使用が提供される。
【0083】
更に、ＲＳＶ、特にＲＳＶ Ｂ株に対して対象にワクチン接種するための方法であって、本明細書に記載の組成物又はワクチンを対象に投与することを含む方法が提供される。
【0084】
本発明はまた、本明細書に記載の組成物又はワクチンを対象に投与することを含む、対象におけるＲＳＶの、特にＲＳＶ Ｂ株に対する感染及び／又は複製を予防する方法を提供する。
【0085】
本発明の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、断片、核酸分子、又はベクターは、ＲＳＶ感染、特にＲＳＶ Ｂ株によって引き起こされるＲＳＶ感染の予防（予防（prophylaxis））及び／又は処置のために使用することができる。特定の実施形態では、予防及び／又は処置は、ＲＳＶ感染に感受性である患者群を標的とし得る。こうした患者群には、例えば、高齢者（例えば、５０歳以上、６０歳以上、及び好ましくは６５歳以上）、若年者（例えば、５歳以下、１歳以下）、妊婦（母体免疫化のため）、入院患者及び抗ウイルス化合物で処置されたが不十分な抗ウイルス応答を示した患者が含まれるが、これらに限定されない。
【0086】
本発明による、融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、断片、核酸分子及び／又はベクターは、例えば、ＲＳＶによって引き起こされる疾患又は状態の独立した治療及び／若しくは予防に、又は（既存又は将来の）ワクチン、抗ウイルス剤及び／若しくはモノクローナル抗体などの他の予防的及び／若しくは治療的治療と組み合わせて使用することができる。
【0087】
本発明は更に、本発明による融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、断片、核酸分子及び／又はベクターを利用して、それを必要とする対象において、ＲＳＶ感染、特にＲＳＶ Ｂ株によって引き起こされるＲＳＶ感染を予防及び／又は処置するための方法を提供する。
【0088】
具体的な実施形態では、対象におけるＲＳＶ感染、特にＲＳＶ Ｂ株によって引き起こされるＲＳＶ感染を予防及び／又は処置するための当該方法は、それを必要とする対象に、有効量の本明細書に記載の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、断片、核酸分子及び／又はベクターを投与することを含む。治療有効量は、ＲＳＶによる感染に起因する疾患又は状態の予防、改善、及び／又は処置に有効なタンパク質、核酸分子、又はベクターの量を指す。予防は、ＲＳＶの伝播を阻害若しくは低減すること、又はＲＳＶによる感染に関連する１つ以上の症状の発症、発生若しくは進行を阻害若しくは低減することを包含する。本明細書で使用される場合、「寛解」は目に見える若しくは知覚できる疾患症状、ウイルス血症又はインフルエンザ感染の測定可能な任意の他の徴候の低減を指し得る。
【0089】
特定の実施形態では、当該方法は、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）により確認されるＲＳＶ媒介性下気道疾患（ＬＲＴＤ）の予防をもたらす。特定の実施形態では、当該方法は、ワクチンの組み合わせを投与されていない対象と比較して、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ ＰＣＲ）によって確認されるＲＳＶ媒介性下気道疾患（ＬＲＴＤ）の低減をもたらす。
【0090】
更には、又は或いは、当該方法は、ＲＳＶへの曝露時の対象の鼻腔及び／又は肺におけるＲＳＶウイルス量の非存在又は減少を特徴とする。
【0091】
更には、又は或いは、当該方法は、ＲＳＶへの曝露時の対象におけるＲＳＶ臨床症状の非存在又は低減を特徴とする。
【0092】
更には、又は或いは、当該方法は、ＲＳＶに対する中和抗体及び／又はＲＳＶ、特にＲＳＶ Ｂ株に対する防御免疫の存在を特徴とする。
【0093】
特定の好ましい実施形態では、本方法は、許容可能な安全性プロファイルを有する。
【0094】
特定の実施形態では、本発明は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対する、特にＲＳＶ Ｂに対するワクチンを作製するための方法であって、本発明によるＲＳＶ ＦＢタンパク質、断片、核酸又はベクターを提供するステップ、及びそれを薬学的に許容される組成物に製剤化するステップを含む方法を提供する。
【0095】
本発明によれば、「ワクチン」という用語は、ある特定の病原体又は疾患に対して対象にある程度の免疫を誘導するために有効である活性成分を含有し、病原体又は疾患による感染に関連する症状の重篤度、期間又は他の徴候について最低限の減少（最大で完全な欠如）を少なくとももたらす、薬剤又は組成物を指す。本発明では、ワクチンは、有効量の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質、断片、融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする核酸分子、及び／又は当該核酸分子を含むベクターを含み、ＲＳＶのＦタンパク質に対する免疫応答をもたらす。これは、入院につながる深刻な下気道疾患を予防する方法、並びに対象におけるＲＳＶ感染及び複製による肺炎及び細気管支炎といった合併症の頻度の減少を提供する。本発明に記載の「ワクチン」という用語は医薬組成物であることを意味しており、したがって薬学的に許容される希釈剤、担体又は賦形剤を典型的には含む。ワクチンは更なる活性成分を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、ワクチンは、例えば、ＲＳＶの他のタンパク質及び／又は他の感染因子に対する免疫応答を誘導する他の成分を更に含む混合ワクチンであってもよい。更なる活性成分の投与は例えば、個別投与によって、又は本発明のワクチンと更なる活性成分との混合製品の投与によって行われてもよい。
【0096】
組成物は例えばヒト対象といった対象に投与され得る。単回投与のための組成物中のＲＳＶ ＦＢタンパク質の総用量は、例えば、約０．０１μｇ～約１０ｍｇ、例えば、１μｇ～１ｍｇ、例えば、１０μｇ～１００μｇであり得る。単回投与のための組成物中のＲＳＶ Ｆタンパク質をコードするＤＮＡを含む（アデノ）ベクターの総用量は、例えば、約０．１×１０１０ｖｐ／ｍｌ及び２×１０１１、好ましくは約１×１０１０ｖｐ／ｍｌ～２×１０１１ｖｐ／ｍｌ、好ましくは５×１０１０ｖｐ／ｍｌ～１×１０１１ｖｐ／ｍｌであり得る。
【0097】
本発明に記載の組成物の投与は、標準的な投与経路を使用して実施されることができる。非限定的な実施形態としては、皮内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与又は粘膜投与（例えば経鼻内、経口など）といった非経口投与が挙げられる。一実施形態では、組成物は筋肉内注射により投与される。当業者は、ワクチンの抗原（複数可）に対する免疫応答を誘導するために、例えばワクチンといった組成物を投与する様々な可能性を理解している。
【0098】
本明細書で使用される対象は、好ましくは、哺乳動物、例えば、マウス、コットンラットなどの齧歯類、又は非ヒト霊長類、又はヒトである。対象はヒト対象であることが好ましい。
【0099】
タンパク質、核酸分子、ベクター及び／又は組成物はまた、同種又は異種プライム・ブーストレジメンではプライム又はブーストのいずれかで投与することができる。ブーストワクチン接種が実施される場合、通常はこうしたブーストワクチン接種は、初回に対象に組成物を投与した後（このような場合には「プライムワクチン接種」と呼ばれる）、１週間～１年の期間、好ましくは２週間～４ヶ月で同一の対象に投与される。特定の実施形態では、投与はプライム投与及び少なくとも１回のブースト投与を含む。
【0100】
更には、本発明のタンパク質は、例えば本発明のタンパク質に結合できるこうした個体の血清中に抗体が存在するかどうかを証明することでこうした個体の免疫状態を試験するための診断ツールとして使用され得る。したがって、本発明はまた、患者におけるＲＳＶ感染の存在を検出するための生体外診断方法であって、本方法は、ａ）当該患者から得られた生体試料を、本発明によるタンパク質と接触させるステップ、及びｂ）抗体－タンパク質複合体の存在を検出するステップを含む。
【実施例】
【0101】
実施例１：Ｃ末端フォルドン及び安定化点突然変異の導入による可溶性三量体タンパク質の設計。
いくつかの融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質変異体を作製した。可溶性候補をＲＳＶ Ｂ Ｆ１ドメインのアミノ酸５１３位で切断し、且つ、四アミノ酸リンカー（ＳＡＩＧ）でフィブリチン三量体化ドメイン（フォルドン）に融合する（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ；配列番号２）。融合タンパク質のＲＳＶ Ｂシグナルペプチド（配列番号２４）又はＲＳＶ Ａシグナルペプチド（配列番号２３）を、タンパク質の発現のために使用した。設計のいくつかは、アフィニティー精製を可能にするために、フォルドン配列のＣ末端にリンカー及びＣ－タグを有していた（例えば、配列番号３）。
いくつかの融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質変異体を作製した。可溶性候補をＲＳＶ Ｂ Ｆ１ドメインのアミノ酸５１３位で切断し、且つ、四アミノ酸リンカー（ＳＡＩＧ）でフィブリチン三量体化ドメイン（フォルドン）に融合する（ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ；配列番号２）。融合タンパク質のＲＳＶ Ｂシグナルペプチド（配列番号２４）又はＲＳＶ Ａシグナルペプチド（配列番号２３）を、タンパク質の発現のために使用した。設計のいくつかは、アフィニティー精製を可能にするために、フォルドン配列のＣ末端にリンカー及びＣ－タグを有していた（例えば、配列番号３）。
【0102】
タンパク質の融合前立体配座を安定化するために、点突然変異のいくつかの組み合わせ、例えば、突然変異Ｐ１０１Ｑ、Ｉ１５２Ｍ、Ｋ２２６Ｍ、Ｄ４８６Ｎ、Ｓ２１５Ｐ、Ｌ２０３Ｉ、及び／又はＤ４８９Ｙのうちの１つ以上を導入した。
【0103】
実施例２：ＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクション後のＲＳＶ Ｂ Ｆ変異体の発現及び安定性。
発現及び安定性の対照として使用したＲＳＶ Ｆ非安定化タンパク質（配列番号３）は、サブグループＢの短縮コンセンサス配列（配列番号１）をベースとし、且つ、フォルドンドメイン（配列番号２）及びＲＳＶ Ｆ Ａ型をベースとするＮ末端シグナルペプチド（配列番号２３）とのリンカーを介したＣ末端融合を含有する配列番号１のＲＳＶ ＦＢタンパク質の外部ドメインを含む。アフィニティー精製を可能にするために、選択された設計のためにＣ－タグを導入した。
発現及び安定性の対照として使用したＲＳＶ Ｆ非安定化タンパク質（配列番号３）は、サブグループＢの短縮コンセンサス配列（配列番号１）をベースとし、且つ、フォルドンドメイン（配列番号２）及びＲＳＶ Ｆ Ａ型をベースとするＮ末端シグナルペプチド（配列番号２３）とのリンカーを介したＣ末端融合を含有する配列番号１のＲＳＶ ＦＢタンパク質の外部ドメインを含む。アフィニティー精製を可能にするために、選択された設計のためにＣ－タグを導入した。
【0104】
本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ断片を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、且つ、ｐｃＤＮＡ２００４発現ベクター（増強されたＣＭＶプロモータを有する改変ｐｃＤＮＡ３プラスミド）にクローニングした。使用した発現プラットフォームは、２４ディープウェルプレート中の２９３ Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。細胞を、製造業者の指示に従って２９３ Ｆｅｃｔｉｎ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して一過性にトランスフェクトし、且つ、３７℃及び１０％ＣＯ２で５日間培養した。図２Ｂ及び図２ＣにおけるＲＳＶ１８０９１０（配列番号７）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９０７（配列番号１３）、ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１７（配列番号１５）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）及びＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）については、細胞を９：１の比のＲＳＶ Ｆプラスミド及びフューリンプラスミドで同時トランスフェクトして、フューリン切断効率を増大させた。培養上清を回収し、３００ｇで５分間回転させて細胞及び細胞片を除去した。続いて、０．２２μｍの真空フィルターを使用して、スピンさせた上清を滅菌濾過し、且つ、使用するまで４℃で保存した。
【0105】
定量的Ｏｃｔｅｔ（バイオレイヤー干渉法）を使用して、回収日及び４℃で７日又は３０日保存後の上清中のタンパク質濃度を測定した。ＣＲ９５０１（国際公開第２０１２／００６５９６号に記載されている抗体５８Ｃ５の可変領域を含む、融合前ＲＳＶ Ｆタンパク質を特異的に認識する抗体）及びＣＲ９５０６（融合前及び融合後ＲＳＶ Ｆタンパク質を認識し、且つ、配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域を含む）を標準的なプロトコルによってビオチン化し、且つ、ストレプトアビジンバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，ＵＫ）上に固定化した。融合後特異的抗体ＡＤＩ－１５６４４（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）抗ヒトＦｃセンサーを使用して、抗体をバイオセンサー上に固定化した。
【0106】
その後、コーティングされたバイオセンサーを模擬細胞培養上清中でブロックした。定量実験を以下のように行った。温度３０℃、振盪速度１０００ ｒｐｍ、アッセイ時間３００秒。タンパク質の濃度を、標準曲線を用いて計算した。模擬培地で希釈した融合前ＲＳＶ ＦＡタンパク質（配列番号１９、以前に国際公開第１７１７４５６８号に記載されている）を使用して、各被覆抗体ＣＲ９５０１及びＣＲ９５０６について標準曲線を作成した。ＡＤＩ－１５６４４については、平衡状態での結合（２Ａ）又は１秒当たりの初期結合速度を定義した（２Ｃ）。図２Ｃでは、抗ＲＳＶ ｐｏｓｔＦ結合についての陽性対照を採用し、したがって、２０μｇのＲＳＶ ｐｏｓｔＦタンパク質（配列番号２０）をモックトランスフェクト細胞の上清に添加し、且つ、測定した。データ分析は、ＦｏｒｔｅＢｉｏ Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ １０．０．１．６ソフトウェア（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いて行った。
【0107】
結果及び考察：
全ての変異体は、ＣＲ９５０６結合によって測定されるように、Ｆ発現を示した（図２）。非安定化ＲＳＶ Ｆ Ｂ型（ＲＳＶ１８１１７７、配列番号３）は、Ｍａｂ ＣＲ９５０１結合によって測定されるように、回収日に融合前タンパク質の非常に低い発現を示し、且つ、この融合前Ｆタンパク質はまた、４℃で７日間の上清の保存後のＣＲ９５０１への結合の喪失に基づいて、非常に不安定であった（図２Ａ）。更に、非安定化Ｆについては、Ｍａｂ ＡＤＩ－１５６４４を用いて、比較的高い量の融合後Ｆタンパク質が検出された。上清中のポリペプチドの総量及び融合前ポリペプチドの量は、突然変異Ｉ１５２Ｍ及びＫ２２６Ｍ（ＲＳＶ１８１１７８（配列番号４））を安定化することによって増大させることができた（図２Ａ）。７日間の上清における安定性は、突然変異Ｄ４８６Ｎ（ＲＳＶ１８１１７９、配列番号５）及びＳ２１５Ｐ（ＲＳＶ１８０９１５、配列番号６）を安定化することによって更に改善された。安定化突然変異Ｌ２０３Ｉ及びＰ１０１Ｑのその後の付加は、発現レベルを更に増大させ、且つ、融合後ポリペプチドの量をほぼ検出できないレベルまで減少させた（ＲＳＶ１８０９１６、配列番号８）（図２Ａ）。安定化突然変異Ｄ４８９Ｙ、Ｔ３５７Ｒ及びＮ３７１Ｙ（ＲＳＶ１８０９１７及び配列番号９）の導入は、発現レベルを減少させた。続いて、Ｐ１０１Ｑ（ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）及びＤ４８９Ｙ（ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）及びＴ３５７Ｒ＋Ｎ３７１Ｙ（ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）を、Ｉ１５２Ｍ、Ｋ２２６Ｍ、Ｄ４８６Ｎ及びＳ２１５Ｐ Ｆ変異体（ＲＳＶ１８０９１５）を有する安定化されたＦ変異体に添加した場合、発現レベルの増大は観察されなかったが、４℃で７日間の保存後に融合後Ｆが検出されなかったため、安定性は増大した。
全ての変異体は、ＣＲ９５０６結合によって測定されるように、Ｆ発現を示した（図２）。非安定化ＲＳＶ Ｆ Ｂ型（ＲＳＶ１８１１７７、配列番号３）は、Ｍａｂ ＣＲ９５０１結合によって測定されるように、回収日に融合前タンパク質の非常に低い発現を示し、且つ、この融合前Ｆタンパク質はまた、４℃で７日間の上清の保存後のＣＲ９５０１への結合の喪失に基づいて、非常に不安定であった（図２Ａ）。更に、非安定化Ｆについては、Ｍａｂ ＡＤＩ－１５６４４を用いて、比較的高い量の融合後Ｆタンパク質が検出された。上清中のポリペプチドの総量及び融合前ポリペプチドの量は、突然変異Ｉ１５２Ｍ及びＫ２２６Ｍ（ＲＳＶ１８１１７８（配列番号４））を安定化することによって増大させることができた（図２Ａ）。７日間の上清における安定性は、突然変異Ｄ４８６Ｎ（ＲＳＶ１８１１７９、配列番号５）及びＳ２１５Ｐ（ＲＳＶ１８０９１５、配列番号６）を安定化することによって更に改善された。安定化突然変異Ｌ２０３Ｉ及びＰ１０１Ｑのその後の付加は、発現レベルを更に増大させ、且つ、融合後ポリペプチドの量をほぼ検出できないレベルまで減少させた（ＲＳＶ１８０９１６、配列番号８）（図２Ａ）。安定化突然変異Ｄ４８９Ｙ、Ｔ３５７Ｒ及びＮ３７１Ｙ（ＲＳＶ１８０９１７及び配列番号９）の導入は、発現レベルを減少させた。続いて、Ｐ１０１Ｑ（ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）及びＤ４８９Ｙ（ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）及びＴ３５７Ｒ＋Ｎ３７１Ｙ（ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）を、Ｉ１５２Ｍ、Ｋ２２６Ｍ、Ｄ４８６Ｎ及びＳ２１５Ｐ Ｆ変異体（ＲＳＶ１８０９１５）を有する安定化されたＦ変異体に添加した場合、発現レベルの増大は観察されなかったが、４℃で７日間の保存後に融合後Ｆが検出されなかったため、安定性は増大した。
【0108】
次に、ＲＳＶ Ｆ発現に対するシグナルペプチドの効果を、ＲＳＶ Ｆ Ａ型シグナルペプチド（配列番号２３）をＲＳＶ Ｆ Ｂ型シグナルペプチド（配列番号２４）と比較することによって評価した。Ｃ末端Ｃ－タグを有するか又は有さないＲＳＶ ＦＢ変異体では、ＲＳＶ Ｆ Ａ型シグナルペプチドを発現に使用した場合（例えば、配列番号８及び１４におけるように）、発現レベル（ＣＲ９５０６結合）及び融合前含有量（ＣＲ９５０１結合）はより高かった（図２Ｂ）。
【0109】
図２Ｃに記載される変異体は、タグを含まない。安定化突然変異Ｉ１５２Ｍ、Ｋ２２６Ｍ、Ｄ４８６Ｎ、Ｓ２１５Ｐ、Ｌ２０３Ｉ及びＰ１０１Ｑを有する変異体ＲＳＶ１８００９１３（配列番号１４）は、融合前特異的Ｍａｂ ＣＲ９５０１への高い結合を示し、且つ、融合後Ｆの痕跡は回収日に検出されなかった。４℃で３０日間保存した後、融合前レベルは減少しなかった。
【0110】
Ｄ４８９Ｙ（ＲＳＶ１９０４１７、配列番号１５）の導入は、ＲＳＶ１８０９１３と類似のままである。コンセンサスＫ２２６（ＲＳＶ１９０４１４、配列番号１６）へのその後の復帰突然変異は、上清中の発現のわずかな減少を示す。これらの変異体を精製後に更に調査した（実施例４）。ドリフト突然変異Ｌ１７２Ｑ及びＳ１７３Ｌ（ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７））は、発現及び融合前含有量に影響を与えず、且つ、この変異体を精製後に更に調査した（実施例４）。上清を４℃で３０日間保存した後、ｐｏｓｔＦ結合は測定できなかった。
【0111】
実施例３：選択された変異体の産生及び精製
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、且つ、ｐｃＤＮＡ２００４発現ベクター（増強されたＣＭＶプロモータを有する社内改変ｐｃＤＮＡ３プラスミド）にクローニングした。
本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、且つ、ｐｃＤＮＡ２００４発現ベクター（増強されたＣＭＶプロモータを有する社内改変ｐｃＤＮＡ３プラスミド）にクローニングした。
【0112】
ＨＥＫ２９３細胞を、ＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）、ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）、ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）、ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の発現プラットフォームとして使用した。
【0113】
ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）を１０％フューリンコードプラスミドで同時トランスフェクトして、以前に観察された不完全なプロセシングを増大させた。
【0114】
細胞を、製造業者の指示に従って２９３ Ｆｅｃｔｉｎ（Life Technologies）を使用して一過性にトランスフェクトし、且つ、３７℃及び１０％ＣＯ２で５日間培養した。培養上清を回収し、３００ｇで５分間回転させて細胞及び細胞片を除去した。続いて、０．２２μｍの真空フィルターを使用して、スピンさせた上清を滅菌濾過し、且つ、使用するまで４℃で保存した。
【0115】
タンパク質を、Ｃ－タグ付きポリペプチドＲＳＶ １８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ １８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ １８０９１７（配列番号９）、ＲＳＶ １８１１８０（配列番号１０）、ＲＳＶ １８１１８１（配列番号１１）及びＲＳＶ １８１１８２（配列番号１２）についてのＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）Ｃ－タグ親和性カラム、又は非タグ付きタンパク質ＲＳＶ １９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ １９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ ２００１２５（配列番号１８）についてのｐＨ ５．０でのカチオン交換（ＨｉＴｒａｐ Ｃａｐｔｏ ＳＰ ＩｍｐＲｅｓカラム、ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）のいずれかを含む２段階の精製プロトコルを使用して精製した。全てのタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用するサイズ排除クロマトグラフィーによって更に精製した。
【0116】
ＨＥＫ２９３Ｅ ２５３細胞を、大規模なＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）の発現プラットフォームとして使用した。６日後、タンパク質を含有する培地を、低速遠心分離（１０分間、１０００ ｇ）、続いて高速遠心分離（１０分間、４０００ｇ）によって回収した。馴化培地を、３０ ｋＤａ Ｑｕｉｘｓｔａｎｄ中空繊維カードリッジを使用して濃縮した。次に、濃縮した培地を１ ＬのＰＢＳ及び１ Ｌの２０ ｍＭ ＮａＯＡｃ、１００ ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ ５．０に対して透析濾過した。凝集物を遠心分離によって除去し、且つ、濃縮し、透析濾過した培地を緩衝液２０ ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ ５．０で１：１に希釈した。次に、融合前Ｆタンパク質を、ｐＨ ５．０での陽イオン交換（ＸＫ１６カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）中の１０ ｍＬ Ｃａｐｔｏ ＳＰ－Ｉｍｐｒｅｓ）、続いてｐＨ ８でのＲｅｓｏｕｒｃｅ－Ｑカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用する陰イオン交換クロマトグラフィーを使用して更に精製した。最後に、タンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００ １６／６００カラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）を使用するゲル濾過によって更に精製した。
【0117】
結果及び考察：
いくつかの安定化されたＲＳＶ融合前Ｆ Ｂ型変異体（ＲＳＶ ＦＢタンパク質）を、イオン交換、続いてＳＥＣによって精製した（図３）。ＲＳＶ１８０９１５、ＲＳＶ１８０９１６及びＲＳＶ１８０９１７については約１１．５～１３ ｍｌ容量、ＲＳＶ１９０４２０、ＲＳＶ１８０９１３及びＲＳＶ２００１２５については６５ ｍｌ容量の主ピークは、三量体ＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質に対応する。
いくつかの安定化されたＲＳＶ融合前Ｆ Ｂ型変異体（ＲＳＶ ＦＢタンパク質）を、イオン交換、続いてＳＥＣによって精製した（図３）。ＲＳＶ１８０９１５、ＲＳＶ１８０９１６及びＲＳＶ１８０９１７については約１１．５～１３ ｍｌ容量、ＲＳＶ１９０４２０、ＲＳＶ１８０９１３及びＲＳＶ２００１２５については６５ ｍｌ容量の主ピークは、三量体ＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質に対応する。
【0118】
実施例４：ｐｒｅＦ Ｂ型三量体の特徴付け及び安定性
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロット
実施例３から選択された代表的な精製タンパク質を、４～１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、１×ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で還元及び非還元条件下で分析し、クーマシー染色した。フューリン同時トランスフェクションなしでトランスフェクトされたＦ変異体（ＲＳＶ１８０９１５、ＲＳＶ１８０９１６及びＲＳＶ１８０９１７）について、ウェスタンブロット分析を以下のように行った。製造業者の推奨に従ってセミドライブロッティングを行った。ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の５％ブロッティンググレードブロッカー（５％ブロッティンググレードブロッカー（ＢＧＢ））中で１時間のブロッキング、１次抗体（５％ＢＧＢ中のＣＲ９５０６ １：１０．０００）の終夜のインキュベーション、２次抗体（５％中のα－ヒトＩｇＧ ＣＷ８００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｍｅｒｉｃｋ，ＰＡ，ＵＳ）１：５０００）の１時間のインキュベーション。全てのインキュベーションは、室温でローラプラットフォーム上で行った。１次及び２次抗体の後、各洗浄について１０ ｍＬのＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５分間、ブロットを３回洗浄し、続いて１０ ｍｌのＰＢＳを用いて最終洗浄を行った。ブロットを、７００ ＣＷ及び８００ ＣＷチャネルの両方を使用して、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナーで走査することによって可視化した。７００ ＣＷ及び８００ ＣＷチャネルの走査強度は５に設定された。走査品質は中に設定される。
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析及びウェスタンブロット
実施例３から選択された代表的な精製タンパク質を、４～１２％（ｗ／ｖ）Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ ＮｕＰＡＧＥゲル、１×ＭＯＰＳ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で還元及び非還元条件下で分析し、クーマシー染色した。フューリン同時トランスフェクションなしでトランスフェクトされたＦ変異体（ＲＳＶ１８０９１５、ＲＳＶ１８０９１６及びＲＳＶ１８０９１７）について、ウェスタンブロット分析を以下のように行った。製造業者の推奨に従ってセミドライブロッティングを行った。ＴＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中の５％ブロッティンググレードブロッカー（５％ブロッティンググレードブロッカー（ＢＧＢ））中で１時間のブロッキング、１次抗体（５％ＢＧＢ中のＣＲ９５０６ １：１０．０００）の終夜のインキュベーション、２次抗体（５％中のα－ヒトＩｇＧ ＣＷ８００（Ｒｏｃｋｌａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｍｅｒｉｃｋ，ＰＡ，ＵＳ）１：５０００）の１時間のインキュベーション。全てのインキュベーションは、室温でローラプラットフォーム上で行った。１次及び２次抗体の後、各洗浄について１０ ｍＬのＴＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を用いて５分間、ブロットを３回洗浄し、続いて１０ ｍｌのＰＢＳを用いて最終洗浄を行った。ブロットを、７００ ＣＷ及び８００ ＣＷチャネルの両方を使用して、Ｏｄｙｓｓｅｙスキャナーで走査することによって可視化した。７００ ＣＷ及び８００ ＣＷチャネルの走査強度は５に設定された。走査品質は中に設定される。
【0119】
結果及び考察：
図４Ａでは、フューリン同時トランスフェクションなしの２９３ ＨＥＫ細胞で産生されたタンパク質について、Ｆ１及びＦ２への不完全なプロセシングが検出された。それぞれのバンドは、図４ＡにおいてＦ１＋ｐ２７で示されている。フューリンとの同時トランスフェクション後に得られた精製タンパク質は、還元ゲル及び非還元ゲルそれぞれについて、Ｆ１及びＦ１＋Ｆ２外部ドメインの予想された高さで単一バンドを示した（図４Ｂ及びＣ）。
図４Ａでは、フューリン同時トランスフェクションなしの２９３ ＨＥＫ細胞で産生されたタンパク質について、Ｆ１及びＦ２への不完全なプロセシングが検出された。それぞれのバンドは、図４ＡにおいてＦ１＋ｐ２７で示されている。フューリンとの同時トランスフェクション後に得られた精製タンパク質は、還元ゲル及び非還元ゲルそれぞれについて、Ｆ１及びＦ１＋Ｆ２外部ドメインの予想された高さで単一バンドを示した（図４Ｂ及びＣ）。
【0120】
ＲＳＶ ｐｒｅＦ Ｂ型タンパク質の三量体含有量
精製されたＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質を分析用ＳＥＣで分析して、純度及び三量体の性質を確認した。
精製されたＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質を分析用ＳＥＣで分析して、純度及び三量体の性質を確認した。
【0121】
ＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）、ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）、ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）及びＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）については、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０シリーズセットアップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて分析を行った。各精製タンパク質のうち、４０μｇをＴＳＫゲルＧ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）に流した（１ ｍＬ／分）。溶出を、ＵＶ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、μＤａｗｎ光散乱（ＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、μＴ－ｒＥｘ屈折率（ＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＮａｎｏｓｔａｒ動的光散乱（ＤＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってモニターした。三量体タンパク質は、約６．５分の保持時間を有する。ＳＥＣプロファイルをＡｓｔｒａ ７．３．２．１９ソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって分析した（図５）。
【0122】
ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）については、Ｓｅｐａｘ Ｕｎｉｘ－Ｃ ＳＥＣ－３００ ４．６×１５０ｍｍ １．８μｍカラム（Ｓｅｐａｘ（２３１３００－４６１５）、注入量２０μＬ、流速０．３ ｍＬ／分）を備えたＶａｎｑｕｉｓｈシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用する超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）を使用して分析を行った。溶出を、ＵＶ検出器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、μＤａｗｎ光散乱（ＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、μＴ－ｒＥｘ屈折率（ＲＩ）検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及びＮａｎｏｓｔａｒ動的光散乱（ＤＬＳ）検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によってモニターした。三量体タンパク質は、約４．５分の保持時間を有する。ＳＥＣプロファイルをＡｓｔｒａ ７．３．２．１９ソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって分析し、且つ、クロマトグラムをＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン８）を使用してプロットした（図５）。
【0123】
結果及び考察：
全てのＲＳＶ融合前ＦＢ変異体は、高い三量体含有量を示した。ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）及びＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）については、少量の凝集体が観察された（図５）。
全てのＲＳＶ融合前ＦＢ変異体は、高い三量体含有量を示した。ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）及びＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）については、少量の凝集体が観察された（図５）。
【0124】
３７℃で３５日間のＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質の安定性及び三量体含有量
３７℃で３５日間保存した後のＲＳＶ ＦＢタンパク質の三量体含有量を分析ＳＥＣによって評価して、異なる突然変異の安定化寄与を評価した。
３７℃で３５日間保存した後のＲＳＶ ＦＢタンパク質の三量体含有量を分析ＳＥＣによって評価して、異なる突然変異の安定化寄与を評価した。
【0125】
ＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）及びＲＳＶ１８１９１７（配列番号９）については、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いて分析を行った。詳細については、上記の方法の項を参照。
【0126】
ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）、ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）、及びＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）については、超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）を使用して分析を実施し、詳細については上記の方法の項を参照。
【0127】
結果及び考察：
精製されたＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質を３７℃で３５日間保存した後、ＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）及びＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）変異体は、分析用ＳＥＣによって評価して安定なままであった（図６）。ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）及びＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）は、非ストレス負荷物質と比較して増大した量の凝集体を含有し（図５）、これは、Ｌ２０３Ｉ突然変異が長期安定性に重要であることを示唆している。Ｄ４８９Ｙ（ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１））及びＴ３５７Ｒ及びＮ３７１Ｙ（ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２））の安定化効果は、ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）と比較して凝集量の減少によって示された。
精製されたＲＳＶ融合前ＦＢタンパク質を３７℃で３５日間保存した後、ＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）及びＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）変異体は、分析用ＳＥＣによって評価して安定なままであった（図６）。ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）及びＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）は、非ストレス負荷物質と比較して増大した量の凝集体を含有し（図５）、これは、Ｌ２０３Ｉ突然変異が長期安定性に重要であることを示唆している。Ｄ４８９Ｙ（ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１））及びＴ３５７Ｒ及びＮ３７１Ｙ（ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２））の安定化効果は、ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）と比較して凝集量の減少によって示された。
【0128】
融解温度に基づくＲＳＶ Ｆポリペプチドの温度安定性
精製ポリペプチドＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）、ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）、ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）、ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）、ＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の融解温度を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって決定した。精製した融合前Ｆタンパク質を、９６ウェル光学ｑＰＣＲプレート中でＳＹＰＲＯオレンジ蛍光色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５０）と混合した。最適な色素及びタンパク質濃度を実験的に決定した（データは示さず）。タンパク質希釈をＰＢＳ中で行い、且つ、色素のみを含有する陰性対照試料を参照減算として使用した。測定は、以下のパラメータを使用してｑＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７）で行った。０．０１５℃／秒の速度での２５－９５℃からの温度ランプ。データを連続的に収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア（バージョン８）を使用して融解曲線をプロットし、且つ、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ｓｕｉｔｅ（Ｔｉｂｃｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）によってＴｍ５０値を計算した。融解温度は、非線形ＥＣ５０シフト方程式を用いて蛍光の最大５０％で計算した。
精製ポリペプチドＲＳＶ１８０９１５（配列番号６）、ＲＳＶ１８０９１６（配列番号８）、ＲＳＶ１８０９１７（配列番号９）、ＲＳＶ１８１１８０（配列番号１０）、ＲＳＶ１８１１８１（配列番号１１）、ＲＳＶ１８１１８２（配列番号１２）、ＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の融解温度を、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）によって決定した。精製した融合前Ｆタンパク質を、９６ウェル光学ｑＰＣＲプレート中でＳＹＰＲＯオレンジ蛍光色素（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｓ６６５０）と混合した。最適な色素及びタンパク質濃度を実験的に決定した（データは示さず）。タンパク質希釈をＰＢＳ中で行い、且つ、色素のみを含有する陰性対照試料を参照減算として使用した。測定は、以下のパラメータを使用してｑＰＣＲ機器（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＶｉｉＡ ７）で行った。０．０１５℃／秒の速度での２５－９５℃からの温度ランプ。データを連続的に収集した。ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェア（バージョン８）を使用して融解曲線をプロットし、且つ、Ｓｐｏｔｆｉｒｅ ｓｕｉｔｅ（Ｔｉｂｃｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ．）によってＴｍ５０値を計算した。融解温度は、非線形ＥＣ５０シフト方程式を用いて蛍光の最大５０％で計算した。
【0129】
結果及び考察：
安定化突然変異の多様なセットを有するＲＳＶ融合前ＦＢ突然変異体の融解温度（Ｔｍ５０）は、二重又は単一の融解事象で６０～７１℃の範囲であった。表２を参照。
安定化突然変異の多様なセットを有するＲＳＶ融合前ＦＢ突然変異体の融解温度（Ｔｍ５０）は、二重又は単一の融解事象で６０～７１℃の範囲であった。表２を参照。
【0130】
【表1】
【0131】
一般に、定義された高い単一の融解事象が好ましい。最も高い安定性を有する単一の融解事象が、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）について示された。１７２位、１７３位（ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７））並びに１９１位、２０６位及び２０９位（ＲＳＶ２００１２５（配列番号１８））におけるドリフト突然変異の付加は、安定性を低下させなかった。
【0132】
ＲＳＶ ｐｒｅＦ Ｂ型三量体の低温安定性
ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）のＲＳＶ ＦＢ三量体を、製剤緩衝液１又は製剤緩衝液２に透析し、且つ、各製剤を０．３ ｍｇ／ｍｌのＲＳＶタンパク質に希釈した。製剤緩衝液１及び２は、それぞれＴＲＩＳベース又はリン酸塩ベースである。各配合物のうち、０．７５ ｍＬをゴム栓付きガラス注入バイアルに充填し、且つ、アルミニウムキャップで密封した。バイアルを２４時間かけて－７０℃までゆっくりと凍結させた。その後、試料を室温に解凍し、且つ、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＳＥＣ分析は、Ｖａｎｑｕｉｓｈシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）を使用して行い、方法の詳細については前の項の三量体含有量を参照。
ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）のＲＳＶ ＦＢ三量体を、製剤緩衝液１又は製剤緩衝液２に透析し、且つ、各製剤を０．３ ｍｇ／ｍｌのＲＳＶタンパク質に希釈した。製剤緩衝液１及び２は、それぞれＴＲＩＳベース又はリン酸塩ベースである。各配合物のうち、０．７５ ｍＬをゴム栓付きガラス注入バイアルに充填し、且つ、アルミニウムキャップで密封した。バイアルを２４時間かけて－７０℃までゆっくりと凍結させた。その後、試料を室温に解凍し、且つ、分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析した。ＳＥＣ分析は、Ｖａｎｑｕｉｓｈシステム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用した超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）を使用して行い、方法の詳細については前の項の三量体含有量を参照。
【0133】
結果及び考察：
製剤緩衝液１及び２において、ポリペプチドは凍結後に三量体のままである（図７）。ＲＳＶ１９０４２０及びＲＳＶ２００１２５は、両方の緩衝液中で非常に安定であった。ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）におけるような安定化突然変異Ｄ４８９Ｙの付加は、製剤緩衝液２中での凍結後の三量体喪失を減少させた。
製剤緩衝液１及び２において、ポリペプチドは凍結後に三量体のままである（図７）。ＲＳＶ１９０４２０及びＲＳＶ２００１２５は、両方の緩衝液中で非常に安定であった。ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）におけるような安定化突然変異Ｄ４８９Ｙの付加は、製剤緩衝液２中での凍結後の三量体喪失を減少させた。
【0134】
実施例５：好ましいポリペプチドの抗原性
抗体のポリペプチドＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）への結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。最初に、９６ウェルハーフエリアＨＢプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９０）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の異なる抗体（１μｇ／ｍＬ）５０μＬ／ウェルでコーティングし、且つ、プレートを４℃で一晩インキュベートした。使用した融合前特異的抗体：ＣＲ９５０１、ＡＤＩ－１８９３３、ＡＤＩ－１８８８２、ＡＤＩ－１８９３０、ＡＤＩ－１８９２８、ＡＤＩ－１５５９４、ＡＤＩ－１８８８９、ＡＤＩ－１８９１３、及びＡＤＩ－１５６１７（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ＲＳＤ５－ＧＬ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、及びｈＲＳＶ９０（Ｍｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。使用した融合前及び融合後の結合抗体：配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域を含むＣＲ ９５０６。使用した融合後抗体：ＡＤＩ－１５６４４（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）。一晩インキュベートした後、プレートを１００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。各ウェルに１００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを１００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。試料調製のために、タンパク質試料をまずアッセイ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で４μｇ／ｍＬに希釈した。４μｇ／ｍＬの試料を、２５０μＬの希釈液を７５０μＬのアッセイ緩衝液に添加することによって更に４倍に希釈した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識を有する５０μＬの融合前及び融合後結合抗体ＣＲ ９５０６を、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、且つ、各ウェルに２０μＬのＰＯＤ基質を添加した。基質の添加後５～１５分の間にプレートを測定した（ＥｎＳｉｇｈｔマルチモードプレートリーダー、ＨＨ３４００００００、発光を読み取る）。ＥＬＩＳＡ曲線（タンパク質希釈対ＲＬＵ）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットし、且つ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０値を計算した（表３）。
抗体のポリペプチドＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）への結合を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって測定した。最初に、９６ウェルハーフエリアＨＢプレート（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、カタログ番号６００２２９０）を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の異なる抗体（１μｇ／ｍＬ）５０μＬ／ウェルでコーティングし、且つ、プレートを４℃で一晩インキュベートした。使用した融合前特異的抗体：ＣＲ９５０１、ＡＤＩ－１８９３３、ＡＤＩ－１８８８２、ＡＤＩ－１８９３０、ＡＤＩ－１８９２８、ＡＤＩ－１５５９４、ＡＤＩ－１８８８９、ＡＤＩ－１８９１３、及びＡＤＩ－１５６１７（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ＲＳＤ５－ＧＬ（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１９）、及びｈＲＳＶ９０（Ｍｏｕｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。使用した融合前及び融合後の結合抗体：配列番号２１を含む重鎖可変領域及び配列番号２２を含む軽鎖可変領域を含むＣＲ ９５０６。使用した融合後抗体：ＡＤＩ－１５６４４（Ｇｉｌｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０１６）。一晩インキュベートした後、プレートを１００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。各ウェルに１００μＬのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ中２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を添加し、プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを１００μＬの洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄した。試料調製のために、タンパク質試料をまずアッセイ緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）中で４μｇ／ｍＬに希釈した。４μｇ／ｍＬの試料を、２５０μＬの希釈液を７５０μＬのアッセイ緩衝液に添加することによって更に４倍に希釈した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄した。各ウェルに、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）標識を有する５０μＬの融合前及び融合後結合抗体ＣＲ ９５０６を、０．０５μｇ／ｍＬの濃度で添加した。プレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレートを３００μＬの洗浄緩衝液で３回洗浄し、且つ、各ウェルに２０μＬのＰＯＤ基質を添加した。基質の添加後５～１５分の間にプレートを測定した（ＥｎＳｉｇｈｔマルチモードプレートリーダー、ＨＨ３４００００００、発光を読み取る）。ＥＬＩＳＡ曲線（タンパク質希釈対ＲＬＵ）をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍでプロットし、且つ、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用してＩＣ５０値を計算した（表３）。
【0135】
【表2】
【0136】
結果及び考察：
精製ＲＳＶ融合前ＦＢ三量体はいずれも、融合後特異的モノクローナル抗体ＡＤＩ－１５６４４への結合を示さなかったが、一方、融合後タンパク質ＲＳＶ１５００４３（配列番号２０）は結合した。ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質ＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）、ＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）及びＲＳＶ１５００４２（配列番号１９）のＩＣ５０値は、ＣＲ９５０１、ＣＲ９５０６、ＡＤＩ－１８８８２、ＡＤＩ－１８９３０、ＡＤＩ－１８９２８、ＡＤＩ－１５５９４、ＡＤＩ－１８８８９、ＡＤＩ－１５６１７及びＲＳＤ５－ＧＬについて同等であった。
精製ＲＳＶ融合前ＦＢ三量体はいずれも、融合後特異的モノクローナル抗体ＡＤＩ－１５６４４への結合を示さなかったが、一方、融合後タンパク質ＲＳＶ１５００４３（配列番号２０）は結合した。ＲＳＶ融合前Ｆタンパク質ＲＳＶ１９０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）、ＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）及びＲＳＶ１５００４２（配列番号１９）のＩＣ５０値は、ＣＲ９５０１、ＣＲ９５０６、ＡＤＩ－１８８８２、ＡＤＩ－１８９３０、ＡＤＩ－１８９２８、ＡＤＩ－１５５９４、ＡＤＩ－１８８８９、ＡＤＩ－１５６１７及びＲＳＤ５－ＧＬについて同等であった。
【0137】
融合前特異的抗体ＡＤＩ－１８９３３及びｈＲＳＶ９０について、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）との結合は観察されなかったが、これは、ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）及びＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）と比較した抗体フットプリントにおけるこれらのタンパク質の差異によって説明することができる。更に、融合前特異的モノクローナル抗体ＡＤＩ－１８９１３へのＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の結合は観察されず、これは、ＲＳＶ１８０９１３（配列番号１４）、ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）及びＲＳＶ１９０２４０（配列番号１７）と比較した抗体フットプリントの表面におけるこのタンパク質の差異によって説明することができる。
【0138】
実施例６：ｅｘｐｉＨＥＫ２９３Ｆ細胞における一過性トランスフェクション後の全長膜結合型ＲＳＶ Ｂ Ｆ変異体の発現及び安定性。
プロセシングされた形態（配列番号２５）又は一本鎖形態（配列番号２６）のいずれかの全長ＲＳＶ－ＦＢ非安定化タンパク質を、発現及び安定性のための対照として使用した。これらの配列は、ＲＳＶ Ｆ Ａ型（配列番号２３）をベースとするＮ末端シグナルペプチドを含有するサブグループＢのコンセンサス配列（配列番号１）をベースとした。配列番号１のＣ末端リジン残基を、ＲＳＶ Ｆ Ａ型タンパク質における対応する残基であるアスパラギンに変更して、Ｃ末端リジンクリッピングを予防した。これらのＲＳＶ Ｆ Ｂ型ポリペプチドの安定化された全長変異体は、プロセシングされた変異体については６つの安定化アミノ酸置換（すなわち、Ｐ１０１Ｑ、Ｉ１５２Ｍ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ及びＤ４８９Ｙ）（配列番号２９）、及び一本鎖変異体については５つの安定化アミノ酸置換（すなわち、Ｐ１０１Ｑ、Ｉ１５２Ｍ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、及びＤ４８６Ｎ）（配列番号３０）をそれぞれ含有した。
プロセシングされた形態（配列番号２５）又は一本鎖形態（配列番号２６）のいずれかの全長ＲＳＶ－ＦＢ非安定化タンパク質を、発現及び安定性のための対照として使用した。これらの配列は、ＲＳＶ Ｆ Ａ型（配列番号２３）をベースとするＮ末端シグナルペプチドを含有するサブグループＢのコンセンサス配列（配列番号１）をベースとした。配列番号１のＣ末端リジン残基を、ＲＳＶ Ｆ Ａ型タンパク質における対応する残基であるアスパラギンに変更して、Ｃ末端リジンクリッピングを予防した。これらのＲＳＶ Ｆ Ｂ型ポリペプチドの安定化された全長変異体は、プロセシングされた変異体については６つの安定化アミノ酸置換（すなわち、Ｐ１０１Ｑ、Ｉ１５２Ｍ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、Ｄ４８６Ｎ及びＤ４８９Ｙ）（配列番号２９）、及び一本鎖変異体については５つの安定化アミノ酸置換（すなわち、Ｐ１０１Ｑ、Ｉ１５２Ｍ、Ｌ２０３Ｉ、Ｓ２１５Ｐ、及びＤ４８６Ｎ）（配列番号３０）をそれぞれ含有した。
【0139】
全長ＲＳＶ ＦＢタンパク質（配列番号２５、２６、２９、３０、３２及び３４）をコードするＤＮＡ断片を合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、且つ、ｐｃＤＮＡ２００４発現ベクター（増強されたＣＭＶプロモータを有する改変ｐｃＤＮＡ３プラスミド）にクローニングした。使用した発現プラットフォームは、１００ｍＬ振盪フラスコ中のｅｘｐｉ２９３Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ細胞（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）であった。細胞を、製造業者の指示に従ってＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して一過性にトランスフェクトし、且つ、３７℃及び１０％ＣＯ２で２日間培養した。細胞を３００ｇで５分間の遠心分離によって回収し、且つ、ＰＢＳ中に再懸濁した。ｐｒｅＦタンパク質の安定性を測定するために、細胞を３７℃又は５５℃のいずれかで１０分間熱ストレスに供した。
【0140】
熱ストレス後の原形質膜上の融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質発現を測定するために、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した。ＣＲ９５０１を、標準的なプロトコルによってＡｌｅｘａ４８８で蛍光標識した。細胞を２．５ｕｇ／ｍｌのＣＲ９５０１で３０分間染色し、洗浄し、且つ、ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩで分析した。ＦｌｏｗＪｏバージョン１０．６．２ソフトウェアを用いてデータ分析を行った。
【0141】
結果及び考察：
プロセシング及び一本鎖野生型ＲＳＶ－ＦＢの両方（それぞれＰＲ＿野生型及びＳＣ＿野生型）は、Ｍａｂ ＣＲ９５０１との結合によって決定して、３７℃でのインキュベーション後に細胞表面上の融合前ＦＢタンパク質の発現を示した（図８）。Ｍａｂ ＣＲ９５０１の融合前Ｆへの結合は、５５℃でのインキュベーション後に減少し、野生型ＲＳＶ－ＦＢタンパク質の両方のバージョンが不安定であることを示した（図８）。本発明の安定化突然変異（それぞれ、ＰＲ＿安定化（配列番号３２）及びＳＣ＿安定化（配列番号３４））を含有するプロセシングされたＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質及び一本鎖ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質の両方は、野生型タンパク質と比較して、３７℃でのインキュベーション後に細胞表面上での融合前Ｆタンパク質の発現の増大を示した。更に、結合は５５℃でのインキュベーション後に減少せず、安定化ＲＳＶ ＦＢタンパク質の両方のバージョンが実際に増大した安定性を有することが確認された。
プロセシング及び一本鎖野生型ＲＳＶ－ＦＢの両方（それぞれＰＲ＿野生型及びＳＣ＿野生型）は、Ｍａｂ ＣＲ９５０１との結合によって決定して、３７℃でのインキュベーション後に細胞表面上の融合前ＦＢタンパク質の発現を示した（図８）。Ｍａｂ ＣＲ９５０１の融合前Ｆへの結合は、５５℃でのインキュベーション後に減少し、野生型ＲＳＶ－ＦＢタンパク質の両方のバージョンが不安定であることを示した（図８）。本発明の安定化突然変異（それぞれ、ＰＲ＿安定化（配列番号３２）及びＳＣ＿安定化（配列番号３４））を含有するプロセシングされたＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質及び一本鎖ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質の両方は、野生型タンパク質と比較して、３７℃でのインキュベーション後に細胞表面上での融合前Ｆタンパク質の発現の増大を示した。更に、結合は５５℃でのインキュベーション後に減少せず、安定化ＲＳＶ ＦＢタンパク質の両方のバージョンが実際に増大した安定性を有することが確認された。
【0142】
実施例７：ｐｒｅＦ Ｂ（ＲＳＶ１９０４２０、配列番号１７）は、マウス及びコットンラットにおいて免疫原性であり、且つ、ＲＳＶ Ａ株及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができる抗体を用量依存的に誘導する
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目及び２８日目に１５、５又は１．５ｕｇの非アジュバント化ＲＳＶ１９０４２０タンパク質で筋肉内免疫化した（ｎ＝６／群）。コットンラットを、０日目及び２８日目に、５０若しくは５ｕｇの非アジュバント化ＲＳＶ１９０４２０、又はＡｄｊｕＰｈｏｓでアジュバント化された５ｕｇのＲＳＶ１９０４２０で筋肉内免疫化した（ｎ＝１０／群）。対照群は、製剤緩衝液（ＦＢ）による筋肉内免疫化を受けた（マウスについてはｎ＝３、コットンラットについてはｎ＝７）。ウイルス中和抗体応答を、マウスについては４２日目に、コットンラットについては４９日目に測定した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目及び２８日目に１５、５又は１．５ｕｇの非アジュバント化ＲＳＶ１９０４２０タンパク質で筋肉内免疫化した（ｎ＝６／群）。コットンラットを、０日目及び２８日目に、５０若しくは５ｕｇの非アジュバント化ＲＳＶ１９０４２０、又はＡｄｊｕＰｈｏｓでアジュバント化された５ｕｇのＲＳＶ１９０４２０で筋肉内免疫化した（ｎ＝１０／群）。対照群は、製剤緩衝液（ＦＢ）による筋肉内免疫化を受けた（マウスについてはｎ＝３、コットンラットについてはｎ＝７）。ウイルス中和抗体応答を、マウスについては４２日目に、コットンラットについては４９日目に測定した。
【0143】
応答は、株ＲＳＶ Ａ ＣＬ５７又はＲＳＶ Ｂ１についてはホタルルシフェラーゼベースの（ＦＦＬ）アッセイを使用して、株ＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈについてはプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して、又は臨床分離株ＲＳＶ Ｂ １１－０５２０９９及びＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１についてはマイクロ中和（ＭＮ）アッセイを使用して測定した。
【0144】
結果及び考察：
ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ１９０４２０によるマウス又はコットンラットの筋肉内免疫化は、様々なタイプのウイルス中和アッセイを使用してアッセイした場合、異なるＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができる抗体の用量依存的誘導をもたらす（図９）。これらの結果は、ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質が齧歯類において免疫原性であり、且つ、交差中和抗体を誘導することを実証する。
ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ１９０４２０によるマウス又はコットンラットの筋肉内免疫化は、様々なタイプのウイルス中和アッセイを使用してアッセイした場合、異なるＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができる抗体の用量依存的誘導をもたらす（図９）。これらの結果は、ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質が齧歯類において免疫原性であり、且つ、交差中和抗体を誘導することを実証する。
【0145】
実施例８：ｐｒｅＦ Ｂ（ＲＳＶ２００１２５、配列番号１８）はコットンラットにおいて免疫原性であり、且つ、ＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈによるチャレンジに対する防御を誘導する
コットンラットを、０日目及び２８日目に、５０、５又は１ｕｇの非アジュバント化ＲＳＶ２００１２５で筋肉内免疫化した（ｎ＝７／群／チャレンジウイルス）。対照群は、製剤緩衝液（ＦＢ）による筋肉内免疫化を受けた（ｎ＝７）。動物を、４９日目にＲＳＶ Ａ２で鼻腔内チャレンジし、又は５０日目にＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈで鼻腔内チャレンジした。チャレンジの５日後に、肺及び鼻組織を単離し、且つ、肺及び鼻ホモジネート中のウイルス量をプラークアッセイによって決定した。チャレンジ前血清を４９日目又は５０日目に単離し、且つ、ウイルス中和抗体応答を、株ＲＳＶ Ａ ＣＬ５７若しくはＲＳＶ Ｂ１（４９日目の試料のみ）についてはホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（ＦＦＬ）を用いて、又は株ＲＳＶ Ａ２若しくはＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈ（４９日目及び５０日目の試料を合わせた）についてはプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を用いて測定した。
コットンラットを、０日目及び２８日目に、５０、５又は１ｕｇの非アジュバント化ＲＳＶ２００１２５で筋肉内免疫化した（ｎ＝７／群／チャレンジウイルス）。対照群は、製剤緩衝液（ＦＢ）による筋肉内免疫化を受けた（ｎ＝７）。動物を、４９日目にＲＳＶ Ａ２で鼻腔内チャレンジし、又は５０日目にＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈで鼻腔内チャレンジした。チャレンジの５日後に、肺及び鼻組織を単離し、且つ、肺及び鼻ホモジネート中のウイルス量をプラークアッセイによって決定した。チャレンジ前血清を４９日目又は５０日目に単離し、且つ、ウイルス中和抗体応答を、株ＲＳＶ Ａ ＣＬ５７若しくはＲＳＶ Ｂ１（４９日目の試料のみ）についてはホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（ＦＦＬ）を用いて、又は株ＲＳＶ Ａ２若しくはＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈ（４９日目及び５０日目の試料を合わせた）についてはプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を用いて測定した。
【0146】
結果及び考察：
いずれかの用量レベルのｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ２００１２５で筋肉内免疫化したコットンラットの大部分は、ＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈによるチャレンジ後に肺において検出可能なウイルス量を有さなかった。対照的に、鼻では、ＲＳＶ Ａ２に対する限定的な防御が観察され、一方、ＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈチャレンジに対して用量依存的な部分的防御が鼻で観察された（図１０Ａ）。様々なＦＦＬベースのウイルス中和アッセイ（図１０Ｂ）又はＰＲＮＴ（図１０Ｃ）を使用してアッセイした場合、ＲＳＶ抗体は、異なるＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができるチャレンジ前血清中で検出可能であった。これらの結果は、ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質が免疫原性であり、且つ、コットンラットのＲＳＶ Ａ２及びＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈチャレンジモデルにおいて防御を誘導することを実証する。
いずれかの用量レベルのｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ２００１２５で筋肉内免疫化したコットンラットの大部分は、ＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈによるチャレンジ後に肺において検出可能なウイルス量を有さなかった。対照的に、鼻では、ＲＳＶ Ａ２に対する限定的な防御が観察され、一方、ＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈチャレンジに対して用量依存的な部分的防御が鼻で観察された（図１０Ａ）。様々なＦＦＬベースのウイルス中和アッセイ（図１０Ｂ）又はＰＲＮＴ（図１０Ｃ）を使用してアッセイした場合、ＲＳＶ抗体は、異なるＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができるチャレンジ前血清中で検出可能であった。これらの結果は、ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質が免疫原性であり、且つ、コットンラットのＲＳＶ Ａ２及びＲＳＶ Ｂ Ｗａｓｈチャレンジモデルにおいて防御を誘導することを実証する。
【0147】
実施例９：アデノウイルスベクターがコードする一本鎖及びプロセシングされたＲＳＶ ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質は、マウスにおいて細胞性及び体液性免疫応答を誘導する
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目に、１０８、１０９又は１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ－Ｂ一本鎖（配列番号３４の安定化された融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする）、又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ－Ｂ処理変異体（配列番号３２の安定化されたＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする）で筋肉内免疫化した（ｎ＝５／群）。対照群は、製剤緩衝液（ＦＢ）による筋肉内免疫化を受けた（ｎ＝３）。免疫化の６週間後に単離された血清を、株ＲＳＶ Ａ２、ＲＳＶ Ａ ＣＬ５７又はＲＳＶ Ｂ１についてはホタルルシフェラーゼベースの（ＦＦＬ）アッセイを使用して、且つ、株ＲＳＶ Ａ２又は臨床分離株ＲＳＶ Ｂ １８－００６１７１についてはプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して、ウイルス中和抗体応答についてアッセイした。示されたベクター又は製剤緩衝液での免疫化の６週間後に単離された脾細胞を、ＲＳＶ Ａ２由来のＦ配列をカバーするペプチドプールで刺激し、且つ、ＲＳＶ－Ｆ指向性ＩＦＮ－γ応答をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。
Ｂａｌｂ／ｃマウスを、０日目に、１０８、１０９又は１０１０個のウイルス粒子（ｖｐ）のＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ－Ｂ一本鎖（配列番号３４の安定化された融合前ＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする）、又はＡｄ２６．ＲＳＶ．ｐｒｅＦ－Ｂ処理変異体（配列番号３２の安定化されたＲＳＶ ＦＢタンパク質をコードする）で筋肉内免疫化した（ｎ＝５／群）。対照群は、製剤緩衝液（ＦＢ）による筋肉内免疫化を受けた（ｎ＝３）。免疫化の６週間後に単離された血清を、株ＲＳＶ Ａ２、ＲＳＶ Ａ ＣＬ５７又はＲＳＶ Ｂ１についてはホタルルシフェラーゼベースの（ＦＦＬ）アッセイを使用して、且つ、株ＲＳＶ Ａ２又は臨床分離株ＲＳＶ Ｂ １８－００６１７１についてはプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）を使用して、ウイルス中和抗体応答についてアッセイした。示されたベクター又は製剤緩衝液での免疫化の６週間後に単離された脾細胞を、ＲＳＶ Ａ２由来のＦ配列をカバーするペプチドプールで刺激し、且つ、ＲＳＶ－Ｆ指向性ＩＦＮ－γ応答をＥＬＩＳＰＯＴによって測定した。
【0148】
結果及び考察：
プロセシングされた変異体又は一本鎖変異体のいずれかでの、ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質をコードするアデノウイルスベクターによるマウスの筋肉内免疫化は、ウイルス中和抗体の用量依存的誘導をもたらす。ＲＳＶ Ａ株に対する比較的低い応答が観察されたが、様々なＲＳＶ Ｂ株に対する明確な用量依存的応答が容易に検出可能であった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。両方のベクターによる単回免疫後に、高いＲＳＶ Ｆ指向性細胞応答が誘導された（図１１Ｃ）。
プロセシングされた変異体又は一本鎖変異体のいずれかでの、ｐｒｅＦ－Ｂタンパク質をコードするアデノウイルスベクターによるマウスの筋肉内免疫化は、ウイルス中和抗体の用量依存的誘導をもたらす。ＲＳＶ Ａ株に対する比較的低い応答が観察されたが、様々なＲＳＶ Ｂ株に対する明確な用量依存的応答が容易に検出可能であった（図１１Ａ及び１１Ｂ）。両方のベクターによる単回免疫後に、高いＲＳＶ Ｆ指向性細胞応答が誘導された（図１１Ｃ）。
【0149】
実施例１０：コットンラットにおけるｐｒｅＦ－Ｂタンパク質ＲＳＶ１９０４１４（配列番号１６）、ＲＳＶ１９０４２０（配列番号１７）及びＲＳＶ２００１２５（配列番号１８）の免疫原性及び防御効力
ＲＳＶ ｐｒｅＦＢタンパク質を、０日目及び２８日目にコットンラットに筋肉内免疫化によって５０μｇ用量で投与した（ｎ＝１０／群）。対照群を、製剤緩衝液（ＦＢ）で筋肉内免疫化し（ｎ＝７）、且つ、動物を、４９日目に最近の臨床分離株ＲＳＶ Ｂ株であるＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（図１２Ａを参照）。チャレンジ前の血清試料を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（図１２Ｂ）によって、又はマイクロ中和アッセイ（図１２Ｃ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
ＲＳＶ ｐｒｅＦＢタンパク質を、０日目及び２８日目にコットンラットに筋肉内免疫化によって５０μｇ用量で投与した（ｎ＝１０／群）。対照群を、製剤緩衝液（ＦＢ）で筋肉内免疫化し（ｎ＝７）、且つ、動物を、４９日目に最近の臨床分離株ＲＳＶ Ｂ株であるＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（図１２Ａを参照）。チャレンジ前の血清試料を、ホタルルシフェラーゼベースのアッセイ（図１２Ｂ）によって、又はマイクロ中和アッセイ（図１２Ｃ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
【0150】
結果及び考察：
異なるｐｒｅＦＢタンパク質のいずれかで筋肉内免疫化したコットンラットは、ＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１でのチャレンジ後に肺において検出可能なウイルス量を有さなかった。ＲＳＶ２０００１２５で免疫化した動物では鼻における完全な防御が観察されたのに対し、ＲＳＶ１９０４２０又はＲＳＶ１９０４１４で免疫化した群では、ブレークスルー鼻感染を有する数匹の動物が観察された（図１２Ａ）。ＦＦＬベースのウイルス中和アッセイ（図１２Ｂ）又はマイクロ中和アッセイ（図１２Ｃ）を使用してアッセイした場合、ＲＳＶ抗体は、異なるＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができるチャレンジ前血清中で検出可能であった。これらの結果は、異なるｐｒｅＦ－Ｂタンパク質が免疫原性であり、且つ、コットンラットにおけるＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１チャレンジモデルにおいて防御を誘導することを実証する。
異なるｐｒｅＦＢタンパク質のいずれかで筋肉内免疫化したコットンラットは、ＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１でのチャレンジ後に肺において検出可能なウイルス量を有さなかった。ＲＳＶ２０００１２５で免疫化した動物では鼻における完全な防御が観察されたのに対し、ＲＳＶ１９０４２０又はＲＳＶ１９０４１４で免疫化した群では、ブレークスルー鼻感染を有する数匹の動物が観察された（図１２Ａ）。ＦＦＬベースのウイルス中和アッセイ（図１２Ｂ）又はマイクロ中和アッセイ（図１２Ｃ）を使用してアッセイした場合、ＲＳＶ抗体は、異なるＲＳＶ Ａ及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができるチャレンジ前血清中で検出可能であった。これらの結果は、異なるｐｒｅＦ－Ｂタンパク質が免疫原性であり、且つ、コットンラットにおけるＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１チャレンジモデルにおいて防御を誘導することを実証する。
【0151】
実施例１１：コットンラットにおけるプロセシングされたｐｒｅＦ－Ｂ（配列番号３２）をコードするＡｄ２６の免疫原性及び防御効力。
Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦを、０日目に、コットンラットにおける筋肉内免疫化によって示された用量レベルで投与した（ｎ＝６又はｎ＝７／群）。対照群は、製剤緩衝液による筋肉内免疫化を受けた（ｎ＝７）。動物を、４９日目にＲＳＶ Ａ２又は最近の臨床分離株ＲＳＶ Ｂ株であるＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（図１３Ａを参照）。チャレンジ前の血清試料を、マイクロ中和アッセイ（図１３Ｂ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦを、０日目に、コットンラットにおける筋肉内免疫化によって示された用量レベルで投与した（ｎ＝６又はｎ＝７／群）。対照群は、製剤緩衝液による筋肉内免疫化を受けた（ｎ＝７）。動物を、４９日目にＲＳＶ Ａ２又は最近の臨床分離株ＲＳＶ Ｂ株であるＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１で鼻腔内チャレンジした。肺及び鼻のウイルス量を、チャレンジの５日後に単離された組織ホモジネートにおけるプラークアッセイによって決定した（図１３Ａを参照）。チャレンジ前の血清試料を、マイクロ中和アッセイ（図１３Ｂ）によって示されるＲＳＶ株に対する中和抗体について分析した。記号は個々の動物のウイルス量又は中和力価を表し、一方、平均力価を水平線で示す。検出又は適格性の下限を点線で示す。
【0152】
結果及び考察：
Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦで筋肉内免疫化したコットンラットは、ＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１でのチャレンジ後に肺において検出可能なウイルス量を有さず、最低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦで免疫化された動物においては、ブレークスルー肺感染の症例はわずかであった。また、１０７ｖｐ及びそれ以上のワクチン用量で、ＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１感染からの鼻における完全な防御が観察された。対照的に、Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦは、ＲＳＶ Ａ２チャレンジ後に完全な鼻の防御を提供しなかったが、ワクチン用量依存的な鼻ウイルス量の減少が観察された（図１３Ａ）。マイクロ中和アッセイを使用してアッセイした場合、ＲＳＶ Ａ株及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができるＲＳＶ抗体は、チャレンジ前血清中で検出可能であった（図１３Ｂ）。これらの結果は、Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦが免疫原性であり、且つ、コットンラットにおけるＲＳＶ Ａ２及びＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１チャレンジモデルにおいて防御を誘導することを実証する。
Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦで筋肉内免疫化したコットンラットは、ＲＳＶ Ａ２又はＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１でのチャレンジ後に肺において検出可能なウイルス量を有さず、最低用量のＡｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦで免疫化された動物においては、ブレークスルー肺感染の症例はわずかであった。また、１０７ｖｐ及びそれ以上のワクチン用量で、ＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１感染からの鼻における完全な防御が観察された。対照的に、Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦは、ＲＳＶ Ａ２チャレンジ後に完全な鼻の防御を提供しなかったが、ワクチン用量依存的な鼻ウイルス量の減少が観察された（図１３Ａ）。マイクロ中和アッセイを使用してアッセイした場合、ＲＳＶ Ａ株及びＲＳＶ Ｂ株を中和することができるＲＳＶ抗体は、チャレンジ前血清中で検出可能であった（図１３Ｂ）。これらの結果は、Ａｄ２６．ＲＳＶ－Ｂ．ｐｒｅＦが免疫原性であり、且つ、コットンラットにおけるＲＳＶ Ａ２及びＲＳＶ Ｂ １７－０５８２２１チャレンジモデルにおいて防御を誘導することを実証する。
【0153】
【表3】
【0154】
配列
ＲＳＶ Ｆ Ｂコンセンサス全長（配列番号１）
ＭＥＬＬＩＨＲＳＳＡＩＦＬＴＬＡＩＮＡＬＹＬＴＳＳＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＩＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ
ＲＳＶ Ｆ Ｂコンセンサス全長（配列番号１）
ＭＥＬＬＩＨＲＳＳＡＩＦＬＴＬＡＩＮＡＬＹＬＴＳＳＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＩＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＫ
【0155】
配列番号２（フィブリチン）
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ
【0156】
配列番号３ ＲＳＶ１８１１７７ ＲＳＶ Ｆ Ｂコンセンサス可溶性ポリペプチドであり、ＲＳＶ ＦＡシグナルペプチド及びフォルドンに下線を引き、ｐ２７を太字にし、且つ、下線を引き、リンカーをイタリック体とし、Ｃ－タグを太字にする。
【0157】
【0158】
配列番号４ ＲＳＶ１８１１７８
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＤＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
【0159】
配列番号５ ＲＳＶ１８１１７９
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＳＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
【0160】
配列番号６ ＲＳＶ１８０９１５
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＰＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
【0161】
配列番号７ ＲＳＶ１８０９１０（ＲＳＶ ＦＢシグナルに下線を引く）
【0162】
【0163】
配列番号８ ＲＳＶ１８０９１６
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＱＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＩＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＱＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＬＳＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＫＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＩＬＰＩＶＮＱＱＳＣＲＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＭＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＤＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＳＡＩＧＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬＧＧＳＥＰＥＡ
【0164】
配列番号９ ＲＳＶ１８０９１７
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【0165】
配列番号１０ ＲＳＶ１８１１８０
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【0166】
配列番号１１ ＲＳＶ１８１１８１
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配列番号１２ ＲＳＶ１８１１８２
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【0168】
配列番号１３ ＲＳＶ１８０９０７（タグフリー）
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【0171】
配列番号１６ ＲＳＶ１９０４１４（タグフリー）
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【0172】
配列番号：１７ ＲＳＶ１９０４２０（タグフリー）
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【0173】
配列番号：１８ ＲＳＶ２００１２５（タグフリー）
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【0174】
配列番号１９ ＲＳＶ１５００４２（ＰＲＰＭ）
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【0175】
配列番号２０ ＲＳＶ１５００４３（融合後）
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【0176】
配列番号２１ ＣＲ９５０６重鎖
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【0177】
配列番号２２ ＣＲ９５０６軽鎖
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【0178】
配列番号２３ ＲＳＶ Ａ融合タンパク質シグナルペプチド
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【0179】
配列番号２４ ＲＳＶ Ｂ融合タンパク質シグナルペプチド
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ＭＥＬＬＩＨＲＳＳＡＩＦＬＴＬＡＩＮＡＬＹＬＴＳＳ
【0180】
配列番号２５ ＰＲ＿野生型（プロセシングされた変異体としてのＲＳＶ－Ａシグナルペプチドを有する全長ＲＳＶ Ｂ融合タンパク質）
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【0181】
配列番号２６ ＳＣ＿野生型（一本鎖変異体としての、ＲＳＶ－Ａシグナルペプチドを有する全長ＲＳＶ Ｂ融合タンパク質）
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【0182】
配列番号２９ ＰＲ＿安定化（プロセシングされた変異体としての、ＲＳＶ－Ａシグナルペプチドを有する全長ＲＳＶ Ｂ融合タンパク質）
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【0183】
配列番号３０ ＳＣ＿安定化（一本鎖変異体としてのＲＳＶ－Ａシグナルペプチドを有する全長ＲＳＶ Ｂ融合タンパク質）
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【0184】
配列番号３１ Ａｄ２６ＲＳＶ０１９
ＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＡＧＴＡＣＡＴＧＡＡＣＴＡＣＡＣＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＡＡＣＧＴＧＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＡＧＡＡＧＣＧＧＡＡＧＣＧＧＡＧＡＴＴＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＡＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＡＧＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＴＣＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＴＡＣＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＣＧＣＡＧＡＴＣＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣ
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【0185】
配列番号３２
導入遺伝子のアミノ酸配列（ＲＳＶ－Ｂ ｐｒｅＦタンパク質、プロセシング）：
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＱＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＱＬＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＲＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＭＶＮＲＱＳＣＲＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＹＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ
導入遺伝子のアミノ酸配列（ＲＳＶ－Ｂ ｐｒｅＦタンパク質、プロセシング）：
ＭＥＬＬＩＬＫＡＮＡＩＴＴＩＬＴＡＶＴＦＣＦＡＳＧＱＮＩＴＥＥＦＹＱＳＴＣＳＡＶＳＲＧＹＬＳＡＬＲＴＧＷＹＴＳＶＩＴＩＥＬＳＮＩＫＥＴＫＣＮＧＴＤＴＫＶＫＬＩＫＱＥＬＤＫＹＫＮＡＶＴＥＬＱＬＬＭＱＮＴＱＡＡＮＮＲＡＲＲＥＡＰＱＹＭＮＹＴＩＮＴＴＫＮＬＮＶＳＩＳＫＫＲＫＲＲＦＬＧＦＬＬＧＶＧＳＡＩＡＳＧＭＡＶＳＫＶＬＨＬＥＧＥＶＮＫＩＫＮＡＬＱＬＴＮＫＡＶＶＳＬＳＮＧＶＳＶＬＴＳＲＶＬＤＬＫＮＹＩＮＮＱＬＬＰＭＶＮＲＱＳＣＲＩＰＮＩＥＴＶＩＥＦＱＱＫＮＳＲＬＬＥＩＴＲＥＦＳＶＮＡＧＶＴＴＰＬＳＴＹＭＬＴＮＳＥＬＬＳＬＩＮＤＭＰＩＴＮＤＱＫＫＬＭＳＳＮＶＱＩＶＲＱＱＳＹＳＩＭＳＩＩＫＥＥＶＬＡＹＶＶＱＬＰＩＹＧＶＩＤＴＰＣＷＫＬＨＴＳＰＬＣＴＴＮＩＫＥＧＳＮＩＣＬＴＲＴＤＲＧＷＹＣＤＮＡＧＳＶＳＦＦＰＱＡＤＴＣＫＶＱＳＮＲＶＦＣＤＴＭＮＳＬＴＬＰＳＥＶＳＬＣＮＴＤＩＦＮＳＫＹＤＣＫＩＭＴＳＫＴＤＩＳＳＳＶＩＴＳＬＧＡＩＶＳＣＹＧＫＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫＧＶＤＴＶＳＶＧＮＴＬＹＹＶＮＫＬＥＧＫＮＬＹＶＫＧＥＰＩＩＮＹＹＤＰＬＶＦＰＳＮＥＦＹＡＳＩＳＱＶＮＥＫＩＮＱＳＬＡＦＩＲＲＳＤＥＬＬＨＮＶＮＴＧＫＳＴＴＮＩＭＩＴＡＩＩＩＶＩＩＶＶＬＬＳＬＩＡＩＧＬＬＬＹＣＫＡＫＮＴＰＶＴＬＳＫＤＱＬＳＧＩＮＮＩＡＦＳＮ
【0186】
配列番号３３：Ａｄ２６ＲＳＶ０２０
ＡＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＴＧＡＡＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＡＴＣＡＣＣＡＣＡＡＴＣＣＴＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＡＣＣＴＴＴＴＧＣＴＴＣＧＣＣＡＧＣＧＧＣＣＡＧＡＡＣＡＴＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＴＴＣＴＡＣＣＡＧＡＧＣＡＣＣＴＧＴＡＧＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＧＧＡＴＡＴＣＴＧＴＣＴＧＣＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＧＧＣＴＧＧＴＡＣＡＣＣＡＧＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＡＧＣＡＡＣＡＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＧＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＡＡＧＣＴＧＡＴＣＡＡＧＣＡＡＧＡＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＡＣＡＡＧＡＡＴＧＣＣＧＴＧＡＣＣＧＡＡＣＴＧＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＴＡＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＡＡＣＡＡＴＣＡＧＧＣＣＡＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＴＣＴＧＧＣＡＧＡＡＧＣＣＴＧＧＧＡＴＴＴＣＴＧＣＴＣＧＧＣＧＴＧＧＧＡＴＣＴＧＣＣＡＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＴＧＧＣＣＧＴＧＴＣＴＡＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＧＡＡＧＧＣＧＡＡＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＣＣＴＧＣＡＧＣＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＡＡＴＧＧＣＧＴＧＴＣＣＧＴＧＣＴＧＡＣＣＡＧＣＡＧＡＧＴＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＡＴＣＡＡＣＡＡＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＡＡＣＣＧＧＣＡＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＴＣＣＣＣＡＡＣＡＴＣＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＴＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＡＣＣＣＧＣＧＡＧＴＴＴＴＣＴＧＴＧＡＡＴＧＣＣＧＧＣＧＴＧＡＣＡＡＣＣＣＣＴＣＴＧＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＴＧＣＴＧＡＣＣＡＡＴＡＧＣＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＣＣＴＧＡＴＣＡＡＣＧＡＣＡＴＧＣＣＣＡＴＣＡＣＣＡＡＣＧＡＣＣＡＧＡＡＡＡＡＧＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＧＧＣＡＧＣＡＧＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＴＣＡＴＧＡＧＣＡＴＴＡＴＣＡＡＡＧＡＡＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＡＣＧＴＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＣＧＴＧＡＴＣＧＡＴＡＣＣＣＣＴＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴＧＣＡＣＡＣＡＡＧＣＣＣＡＣＴＧＴＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＴＡＴＣＡＡＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＴＡＧＡＧＧＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＧＡＴＡＡＴＧＣＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＣＴＴＣＴＴＣＣＣＡＣＡＡＧＣＣＧＡＴＡＣＣＴＧＣＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＣＡＣＣＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＣＣＴＡＧＣＧＡＧＧＴＧＴＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＴＣＴＡＡＧＴＡＣＧＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＡＴＧＡＣＣＴＣＣＡＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＧＴＧＡＴＣＡＣＡＴＣＴＣＴＧＧＧＣＧＣＣＡＴＣＧＴＧＴＣＣＴＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＡＣＡＡＡＧＴＧＴＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＡＣＡＡＧＡＡＣＣＧＧＧＧＣＡＴＣＡＴＣＡＡＧＡＣＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＧＧＣＴＧＣＧＡＣＴＡＣＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＡＡＧＧＣＧＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＣＴＧＴＧＧＧＣＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＡＣＴＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＣＴＧＧＡＡＧＧＣＡＡＧＡＡＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＣＣＡＴＣＡＴＣＡＡＣＴＡＣＴＡＣＧＡＣＣＣＴＣＴＧＧＴＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＴＣＡＧＣＣＡＡＧＴＧＡＡＣＧＡＧＡＡＧＡＴＣＡＡＣＣＡＧＡＧＣＣＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＧＡＣＧＣＴＣＣＧＡＴＧＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＡＣＧＴＧＡＡＣＡＣＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＡＴＣＡＴＧＡＴＣＡＣＣＧＣＣＡＴＣＡＴＣＡＴＣＧＴＧＡＴＣＡＴＣＧＴＣＧＴＧＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＡＴＣＧＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＣＣＣＴＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＡＡＧＧＡＴＣＡＧＣＴＧＡＧＣＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＡＴＣＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣ
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【0187】
配列番号３４ Ａｄ２６ＲＳＶ０２０によってコードされるタンパク質（一本鎖）
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参考文献
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【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図2-3】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図9-3】
【図10-1】
【図10-2】
【図11-1】
【図11-2】
【図12-1】
【図12-2】
【図13】
【国際調査報告】