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特表2024-509780チロシンが末端に位置するペプチドを有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防、改善または治療用組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-05
(54)【発明の名称】チロシンが末端に位置するペプチドを有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防、改善または治療用組成物
(51)【国際特許分類】
A23L 33/18 20160101AFI20240227BHJP
A61P 25/24 20060101ALI20240227BHJP
A61P 25/22 20060101ALI20240227BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240227BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240227BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240227BHJP
A61P 21/00 20060101ALI20240227BHJP
A61P 13/12 20060101ALI20240227BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240227BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240227BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240227BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240227BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20240227BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240227BHJP
A61P 39/06 20060101ALI20240227BHJP
A61K 38/04 20060101ALI20240227BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240227BHJP
C07K 2/00 20060101ALN20240227BHJP
【ＦＩ】
A23L33/18
A61P25/24
A61P25/22
A61P25/28
A61P25/08
A61P25/00
A61P21/00
A61P13/12
A61P3/10
A61P1/16
A61P3/04
A61P3/06
A61P39/02
A61P9/10
A61P39/06
A61K38/04
A61K38/16
C07K2/00 ZNA
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023551234
(86)(22)【出願日】2022-02-23
(85)【翻訳文提出日】2023-08-23
(86)【国際出願番号】 KR2022002673
(87)【国際公開番号】W WO2022182141
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】10-2021-0024072
(32)【優先日】2021-02-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．Ｗｉｔｅｐｓｏｌ
(71)【出願人】
【識別番号】516172857
【氏名又は名称】インダストリー－アカデミック コーオペレイション ファウンデーション キョンサン ナショナル ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100108453
【弁理士】
【氏名又は名称】村山 靖彦
(74)【代理人】
【識別番号】100110364
【弁理士】
【氏名又は名称】実広 信哉
(74)【代理人】
【識別番号】100133400
【弁理士】
【氏名又は名称】阿部 達彦
(72)【発明者】
【氏名】ヒュン・ジュン・キム
(72)【発明者】
【氏名】ヨン・ブム・キム
(72)【発明者】
【氏名】ジェ・スン・カン
(72)【発明者】
【氏名】スンウン・ジュン
(72)【発明者】
【氏名】ミヨン・ソン
(72)【発明者】
【氏名】ジ・ヒョン・ベク
(72)【発明者】
【氏名】サン・ウォン・パク
(72)【発明者】
【氏名】ファジン・キム
(72)【発明者】
【氏名】デ・ヨン・ユ
【テーマコード（参考）】
4B018
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B018LB01
4B018LB02
4B018LB06
4B018LB07
4B018LB08
4B018LB09
4B018LE01
4B018LE02
4B018LE03
4B018LE05
4B018MD19
4B018MD20
4B018ME01
4B018ME04
4B018ME10
4B018ME14
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA02
4C084BA14
4C084BA15
4C084BA16
4C084BA17
4C084BA18
4C084BA19
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA52
4C084MA55
4C084NA14
4C084ZA021
4C084ZA022
4C084ZA061
4C084ZA062
4C084ZA121
4C084ZA122
4C084ZA151
4C084ZA152
4C084ZA161
4C084ZA162
4C084ZA361
4C084ZA362
4C084ZA701
4C084ZA702
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZA811
4C084ZA812
4C084ZA941
4C084ZA942
4C084ZC331
4C084ZC332
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC371
4C084ZC372
4C084ZC411
4C084ZC412
4H045AA30
4H045BA11
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045EA01
4H045EA20
(57)【要約】
本発明のチロシンが末端に位置するペプチドは、タンパク質のニトロ化を抑制する効果に優れ、慢性身体拘束ストレス鬱病／認知機能障害誘導モデル、アルツハイマー型認知症モデル、てんかん発作モデル、脳卒中モデル、第２型糖尿病モデル、急性腎不全モデル、または高アンモニア血症モデルにおいて疾患の症状を予防、改善または治療する効果に優れている。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
チロシンが末端に位置するペプチドまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項2】
前記チロシンが末端に位置するペプチドは、チロシンが両側末端または一側末端に位置し、チロシンと連結されたアミノ酸は、１～２９個であることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項3】
前記タンパク質は、グルタミン合成酵素(glutamine synthetase)、インスリン受容体βサブユニット(insulin receptor β subunit)、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn Superoxide dismutase)、熱衝撃タンパク質６０(heat shock protein 60)、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn Superoxide dismutase)及びカタラーゼ(catalase)のうちから選択されたいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項4】
前記タンパク質のニトロ化によって発生する疾患は、鬱病(depressive disorder)、不安障害(anxiety disorder)、脳卒中(stroke)、てんかん(epilepsy)、発作(seizure)、認知機能障害(cognitive impairment)、アルツハイマー病(Alzheimer disease)、認知症(dementia)、第２型糖尿病(type 2 diabetes)、糖尿腎症、筋肉減少症、脂質異常血症(dyslipidemia)、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、急性腎障害(Acute kidney injury)、高アンモニア血症(Hyperammonemia)及び肝性脳症のうちから選択されたいずれか１つであることを特徴とする請求項１に記載のタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項5】
チロシンが末端に位置するペプチドまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項6】
チロシンが末端に位置するペプチドまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質内のチロシンのニトロ化阻害用組成物。
【請求項7】
ニトロ化チロシンを含むタンパク質にチロシンが末端に位置するペプチドを処理してニトロ化チロシンからニトロ基を除去する方法。
【請求項8】
チロシンが末端に位置するペプチドまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物。
【請求項9】
チロシンが末端に位置するペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物。
【請求項10】
前記活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患は、鬱病(depressive disorder)、不安障害(anxiety disorder)、脳卒中(stroke)、てんかん(epilepsy)、発作(seizure)、認知機能障害(cognitive impairment)、アルツハイマー病(Alzheimer disease)、認知症(dementia)、第２型糖尿病(type 2 diabetes)、糖尿腎症、筋肉減少症、脂質異常血症(dyslipidemia)、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、急性腎障害(Acute kidney injury)、高アンモニア血症(Hyperammonemia)及び肝性脳症のうちから選択されたいずれか１つであることを特徴とする請求項９に記載の活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドを有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防、改善または治療用組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
酸化ストレス(oxidative stress)は、新陳代謝過程で生成された酸素が自由ラジカル(free radical)として作用して細胞に損傷を与えてさまざまな疾病を誘発すると知られている。特に、細胞内に存在する活性酸素種(ROS)または活性窒素種(RNS)によってタンパク質のチロシン部位に過酸化窒素(peroxynitrite, ONOO-)が生成されれば、タンパク質がニトロ化(nitraion)される。そのようなタンパク質のニトロ化現象は、酸化過程に伴われる付随的な現象と知られており、特定タンパク質がニトロ化されれば、構造的変異によって活性が低下するか、正常な機能を行うことができず、これにより、さまざまな疾病が発生する。タンパク質のニトロ化は、細胞内信号伝達、炎症反応による疾病、退行性神経疾患、老化などに密接に関連していると報告されており、最近には、喘息、糖尿、癌、慢性ストレス鬱病、第２型糖尿病または、急性腎臓疾患などにも影響を与えると報告されている。したがって、タンパク質のニトロ化に対する研究は、生物学的、臨床学的に非常に重要な役割を遂行し、タンパク質のニトロ化を抑制する物質開発に対する研究が必要な実情である。
【0003】
一方、韓国登録特許第１８９７４００号には「チロシンデカルボキシラーゼの活性阻害用組成物及びそれを用いた発酵食品の製造方法」が開示されており、韓国公開特許第２０１８－００２１７４６号には「ニトロ化工程からニトロ化された芳香族化合物を錠剤する方法」が開示されているが、本発明の「チロシンが末端に位置するペプチドを有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防、改善または治療用組成物」については記載されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、前記のような要求によって導出されたものであって、本発明者らは、チロシンが末端に位置するペプチドを有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防、改善または治療用組成物を提供し、本発明の有効成分であるチロシンが末端に位置するペプチドがタンパク質のニトロ化を抑制し、慢性身体拘束ストレス鬱病／認知機能障害誘導モデル、アルツハイマー型認知症モデル、てんかん発作モデル、脳卒中モデル、第２型糖尿病モデル、急性腎不全モデルまたは、高アンモニア血症モデルにおいて疾病症状を予防、改善または治療することができることを確認することで、本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【0005】
前記課題を解決するために本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0006】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0007】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質内のチロシンのニトロ化阻害用組成物を提供する。
【0008】
また、本発明は、ニトロ化チロシンを含むタンパク質にチロシンが末端に位置するペプチドを処理してニトロ化チロシンからニトロ基を除去する方法を提供する。
【0009】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0010】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【発明の効果】
【0011】
本発明のチロシンが末端に位置するペプチドは、タンパク質のニトロ化を抑制する効果に優れ、ストレスによって増加したグルタミン合成酵素内のチロシンのニトロ化レベルを減少させ、ストレスによって減少したグルタミン合成酵素の活性を増加させ、慢性身体拘束ストレス鬱病／認知機能障害誘導モデル、アルツハイマー型認知症モデル、てんかん発作モデル、脳卒中モデル、第２型糖尿病モデル、急性腎不全モデルまたは、高アンモニア血症モデルにおいて疾病症状を予防、改善または治療効果が優秀である。
【図面の簡単な説明】
【0012】
【図1】本発明のペプチド食餌による動物の長期記憶能力を分析するために実施した事物認知技能検査(object recognition test, ORT)及び事物位置認知技能検査(object location recognition test, OLT)過程を示すものである。
【図2】本発明によるペプチドのタンパク質ニトロ化抑制効果を確認したものであって、Ａは、ＰＦＣ（前頭葉前部）組織内のニトロチロシンタンパク質に対するウェスタンブロット結果であり、Ｂは、肝組織内のニトロチロシンタンパク質に対するウェスタンブロット結果である。
【図3】本発明によるペプチドのタンパク質発現量調節効果を確認するための肝組織内のインスリン受容体β及びリン酸化インスリン受容体βタンパク質に対するウェスタンブロット結果である。
【図4】チロシンが末端に位置したペプチドによるCu/ZnSOD(A)及びMnSOD(B)のニトロ化抑制効果を確認した結果である。ＰＮは、タンパク質のニトロ化を誘導するペルオキシナイトライト(peroxynitrite)である。＊、＊＊＊は、ＰＮ単独処理群対比でペプチド処理群のCu/ZnSODまたはMnSODの活性が統計的に有意に増加したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。
【図5】チロシンが末端に位置したペプチドによるグルタミン合成酵素のニトロ化抑制効果を確認した結果である。ＰＮは、タンパク質のニトロ化を誘導するペルオキシナイトライト(peroxynitrite)である。＊＊は、ＰＮ単独処理群対比でペプチド処理群のグルタミン合成酵素の活性が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０１である。
【図6】チロシンが末端に位置したペプチドによるカタラーゼのニトロ化抑制効果を確認したウェスタンブロット結果である。
【図7】チロシンが末端に位置したペプチドによるＨＳＰ６０(heat shock protein 60)のリフォールディング(refolding)活性測定によるニトロ化抑制効果を確認した結果である。ＲＬＵは、Time0とTime60で測定された吸光度差値(relative light unit)を意味する。
【図8】慢性身体拘束ストレス誘導群（ＳＴＲ）におけるチロシン－グルタミンペプチド食餌（ＰＤ）によるＧＳ活性（Ａ）、ＧＳ発現量（Ｂ）及びＧＳに含まれたチロシンのニトロ化レベル（Ｃ及びＤ）を確認した結果である。
【図9】慢性身体拘束ストレス誘導群（ＳＴＲ）におけるグルタミン－チロシンペプチド食餌（ＰＤ）によるＧＳ活性（Ａ）、ＧＳ発現量（Ｂ）及びＧＳに含まれたチロシンのニトロ化レベル（Ｃ及びＤ）を確認した結果である。
【図10】慢性身体拘束ストレス誘導群（ＳＴＲ）におけるチロシン－グルタミンペプチド食餌（ＰＤ）による血漿内コルチコステロン濃度（Ａ）、ショ糖選好度（Ｂ）、血漿内ＲＯＳ／ＲＮＳ濃度（Ｃ）及びＰＦＣ組織内のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度（Ｄ）を確認した結果である。
【図11】慢性身体拘束ストレス誘導群（ＳＴＲ）におけるグルタミン－チロシンペプチド食餌（ＰＤ）による血漿内コルチコステロン濃度（Ａ）、ショ糖選好度（Ｂ）、血漿内ＲＯＳ／ＲＮＳ濃度（Ｃ）及びＰＦＣ組織内のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度（Ｄ）を確認した結果である。
【図12】慢性身体拘束ストレス動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）またはチロシン－トリプトファン（ＹＷ）ペプチド食餌による記憶能力分析結果を示した弁別力指数であって、Ａは、１ｘＹＱペプチド食餌による事物認知技能検査(object recognition test, ORT)結果であり、Ｂは、２ｘＹＱペプチド食餌による事物認知技能検査（ＯＲＴ）結果であり、Ｃは、１ｘＹＱまたは１ｘＹＷペプチド食餌による事物位置認知技能検査(object location recognition test, OLT)結果である。＊、＊＊は、対照群（ＣＴＬ）対比でストレス処理群（ＳＴＲ）の事物認知機能指数または事物位置認知機能指数が統計的に有意に減少したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。＃は、ストレス処理群において一般食餌群（ＮＤ）対比でペプチド食餌群（１ｘＹＱまたは２ｘＹＱ）の事物認知機能指数が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【図13】アルツハイマー型認知症動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド食餌による事物認知技能検査(object recognition test, ORT)結果であり、Ａは、２ヶ月齢の動物に実験した結果であり、Ｂは、８ヶ月齢の動物に実験した結果であり、Ｃは、２ヶ月齢及び８ヶ月齢の動物に実験した結果であり、Ｄは、６ヶ月間の認知機能減少幅に対する結果である。＊、＊＊は、正常群（ＷＴ）対比で認知症動物モデル（３ｘＴＧ）の事物認知機能指数が統計的に有意に減少したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。＃は、２ヶ月齢対比で８ヶ月齢の事物認知機能指数が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【図14】アルツハイマー型認知症動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド食餌によるＲＯＳ／ＲＮＳ濃度を示すものである。＊は、正常群（ＷＴ）対比で認知症動物モデル（３ｘＴＧ）のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５であり、＃は、認知症動物モデルにおいて一般食餌群（ＮＤ）対比でペプチド食餌群（ＹＱ）のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５である。ＤＣＦは、２’、７’－ジクロロフルオレセイン(2’,7’-Dichlorofluorescin)である。
【図15】グルタミン酸作動性ニューロン蛍光標識アルツハイマー型認知症動物モデルに関するものであって、Ａは、グルタミン酸作動性ニューロンを赤色標識することができる動物モデルであることを確認した結果であり、Ｂは、チロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド食餌によるグルタミン酸作動性ニューロンの活性度を示すものである。＊は、正常群（ＷＴ）対比でグルタミン酸作動性ニューロン蛍光標識アルツハイマー型認知症動物モデル(3xTG-vGluT2-Cre::tdTomato)のグルタミン酸作動性ニューロンの活性度が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５であり、＃は、グルタミン酸作動性ニューロン蛍光標識アルツハイマー型認知症動物モデルにおいて一般食餌群（ＮＤ）対比でペプチド食餌群（ＹＱ）のグルタミン酸作動性ニューロンの活性度が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【図16】てんかん発作動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）またはチロシン－トリプトファン（ＹＷ）ペプチド処理による発作レベル（Ａ、Ｂ）及びＡ、Ｂの曲線下部面積（Ｃ、Ｄ）を示すものである。＊、＊＊、＊＊＊は、一般食餌群（ＮＤ）対比でペプチド処理群(5xL-Tyr、3xYQ、YQi.p、1xYWまたは3xYQ)の発作レベルが統計的に有意に減少したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。
【図17】てんかん発作動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）またはチロシン－トリプトファン（ＹＷ）ペプチド処理によるＲＯＳ／ＲＮＳ濃度を示すものである。＊は、対照群（ＣＴＬ）対比でカイニン酸処理群のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５であり、＃は、カイニン酸処理群において一般食餌群（ＮＤ）対比でペプチド食餌群（３ｘＹＷまたは３ｘＹＱ）のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【図18】てんかん発作動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）またはチロシン－トリプトファン（ＹＷ）ペプチド処理によるグルタミン合成酵素の活性を示すものである。＊＊＊は、対照群（ＣＴＬ）対比でカイニン酸処理群のグルタミン合成酵素の活性が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．００１である。＃、＃＃は、カイニン酸処理群において一般食餌群（ＮＤ）対比でペプチド処理群（３ｘＹＱ、ＹＱｉ．ｐ、１ｘＹＷ、３ｘＹＷまたは３ｘＹＱ）のグルタミン合成酵素の活性が統計的に有意に増加したということを意味し、＃は、Ｐ＜０．０５、＃＃は、Ｐ＜０．０１である。
【図19】虚血性脳卒中動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による神経細胞の数（Ａ）、ＳＯＤ活性（Ｂ）及びカタラーゼ活性（Ｃ）を示すものである。shamは、偽手術群であり、vehicleは、０．９％サリン(saline)注入群である。＊、＊＊＊は、偽手術群（sham）対比で虚血性脳卒中動物モデル(ischemia)の神経細胞の数、ＳＯＤ活性またはカタラーゼ活性が統計的に有意に減少したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＃は、虚血性脳卒中動物モデルにおいて０．９％サリン注入群（vehicle）対比でペプチド処理群（ＹＱ）の神経細胞の数、ＳＯＤ活性またはカタラーゼ活性が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【図20】虚血性脳卒中動物モデルにおけるチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による神経細胞死滅を確認するための免疫組織化学染色結果を示すものである。shamは、偽手術群であり、vehicleは、０．９％サリン注入群であり、ischemiaは、虚血性脳卒中動物モデルである。NeuNは、錐体細胞を染色したものであり、Iba-1は、星状膠細胞を染色したものであり、ＧＦＡＰは、ミクログリア細胞を染色したものである。
【図21】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による体重変化（Ａ）及び飼料摂取量（Ｂ）を期間別に確認した結果である。ＮＤは、正常食餌群であり、ＨＦＤは、高脂肪食餌群である。
【図22】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による血糖を期間別に確認した結果である。ＮＤは、正常食餌群であり、ＨＦＤは、高脂肪食餌群である。＊＊＊、＊＊＊＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血糖が統計的に有意に増加したということを意味し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１である。＃＃、＃＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋１ｘＹＱまたはＨＦＤ＋３ｘＹＱ）の血糖が統計的に有意に減少したということを意味し、＃＃は、Ｐ＜０．０１、＃＃＃は、Ｐ＜０．００１である。
【図23】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による耐糖能(glucose tolerance test, GTT)を確認した結果である。Ａは、経時的な血液内グルコース含量を示したものであり、Ｂは、Ａにおいて曲線下部面積（ＡＵＣ）を示すものである。＊＊＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）のグルコース含量が統計的に有意に増加したということを意味し、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１である。＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋３ｘＹＱ）のグルコース含量が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０１である。
【図24】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理によるインスリン感受性(insulin tolerance test, ITT)を確認した結果である。Ａは、経時的な血液内グルコース含量を示したものであり、Ｂは、Ａにおいて曲線下部面積（ＡＵＣ）を示すものである。＊＊＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）のグルコース含量が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．００１である。＃＃＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋３ｘＹＱ）のグルコース含量が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０００１である。
【図25】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による排尿量（Ａ）及び脂肪量（Ｂ）を確認した結果である。＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の排尿量または脂肪量が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５である。＃＃、＃＃＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋３ｘＹＱ）の排尿量または脂肪量が統計的に有意に減少したということを意味し、＃＃は、Ｐ＜０．０１、＃＃＃＃は、Ｐ＜０．０００１である。
【図26】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による血漿内インスリン（Ａ）、ＡＬＴ（Ｂ）及びＲＯＳ／ＲＮＳ（Ｃ）の濃度を確認した結果である。＊＊、＊＊＊、＊＊＊＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の血漿内インスリン、ＡＬＴまたはＲＯＳ／ＲＮＳの濃度が統計的に有意に増加したということを意味し、＊＊は、Ｐ＜０．０１、＊＊＊は、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１である。＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋３ｘＹＱ）の血漿内インスリン、ＡＬＴまたはＲＯＳ／ＲＮＳの濃度が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０１である。
【図27】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による肝組織の変化を確認するためのＨ＆Ｅ染色結果である。ＮＤは、正常食餌群であり、ＨＦＤは、高脂肪食餌群である。
【図28】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理によるインスリン受容体β（ＩＲβ）の発現量を確認した結果である。＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）のインスリン受容体β（ＩＲβ）の発現量が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５である。＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋３ｘＹＱ）のインスリン受容体β（ＩＲβ）の発現量が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０１である。
【図29】高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による小便内のアルブミン／クレアチンの割合（Ａ）、肝組織内の中性脂肪量（Ｂ）及び血漿内の中性脂肪量（Ｃ）を確認した結果である。＊、＊＊は、正常食餌群（ＮＤ）対比で高脂肪食餌群（ＨＦＤ）の小便内のアルブミン／クレアチンの割合、肝組織内の中性脂肪量または血漿内の中性脂肪量が統計的に有意に増加したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。＃、＃＃は、高脂肪食餌群（ＨＦＤ）対比でＹＱペプチド添加高脂肪食餌群（ＨＦＤ＋１ｘＹＱまたはＨＦＤ＋３ｘＹＱ）の小便内のアルブミン／クレアチンの割合、肝組織内の中性脂肪量または血漿内の中性脂肪量が統計的に有意に減少したということを意味し、＃は、Ｐ＜０．０５、＃＃は、Ｐ＜０．０１である。
【図30】急性腎不全動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による腎臓損傷を評価するための血漿内クレアチニン濃度（Ａ）、腎臓組織内の炎症反応確認のためのＩＬ－１β（Ｂ）、ＩＬ－６（Ｃ）及びＭＣＰ－１（Ｄ）の発現量を確認した結果である。shamは、偽手術群であり、renal IRは、急性腎不全誘導群であり、ｖｅｈは、水投与群である。＊＊は、偽手術群（sham）対比で水投与した急性腎不全誘導群(veh+renal IR)のクレアチニン濃度、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、またはＭＣＰ－１の発現量が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０１である。＃、＃＃は、水投与した急性腎不全誘導群(veh+renal IR)対比でＹＱペプチド投与した急性腎不全誘導群(YQ+renal IR)のクレアチニン濃度、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、またはＭＣＰ－１の発現量が統計的に有意に減少したということを意味し、＃は、Ｐ＜０．０５、＃＃は、Ｐ＜０．０１である。
【図31】急性腎不全動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による腎臓組織でのニトロチロシン(nitrotyrosine)及び脂質過酸化産物(4-HNE)の発現量を確認した結果である。＊は、偽手術群（sham）対比で水投与した急性腎不全誘導群(veh+renal IR)のニトロチロシン(nitrotyrosine)及び脂質過酸化産物(4-HNE)の発現量が統計的に有意に増加したということを意味し、ｐ＜０．０５である。＃は、水投与した急性腎不全誘導群(veh+renal IR)対比でＹＱペプチド投与した急性腎不全誘導群(YQ+renal IR)のニトロチロシン(nitrotyrosine)及び脂質過酸化産物(4-HNE)の発現量が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【図32】高アンモニア血症動物モデルにおいてチロシン－グルタミン（ＹＱ）ペプチド処理による血中アンモニア濃度（Ａ）及び肝組織でのニトロチロシン(nitrotyrosine)発現量を確認した結果である。Controlは、正常対照群であり、ＡＯＭは、アゾキシメタン(Azoxymethane)による高アンモニア血症誘導群である。＊、＊＊は、正常対照群（Control）対比で水投与した高アンモニア血症(veh+AOM)の血中アンモニア濃度及び肝組織でのニトロチロシン(nitrotyrosine)発現量が統計的に有意に増加したということを意味し、＊は、Ｐ＜０．０５、＊＊は、Ｐ＜０．０１である。＃は、水投与した高アンモニア血症(veh+AOM)対比でＹＱペプチド投与した高アンモニア血症誘導群(YQ200+AOM)の血中アンモニア濃度及び肝組織でのニトロチロシン(nitrotyrosine)発現量が統計的に有意に減少したということを意味し、ｐ＜０．０５である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
本発明の目的を達成するために本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0014】
前記チロシンが末端に位置するペプチドは、チロシンが両側末端または一側末端に位置し、チロシンと連結されたアミノ酸は、極性／新水性（例えば、チロシン、グルタミン、スレオニン）、非極性／疎水性（例えば、トリプトファン、バリン）、電荷性（例えば、アルギニン）でもあり、連結されたアミノ酸の数は、１～２９個でもあるが、それに制限されない。
【0015】
本発明のタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物において、前記タンパク質は、グルタミン合成酵素(glutamine synthetase)、インスリン受容体βサブユニット(insulin receptor β subunit)、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn Superoxide dismutase)、熱衝撃タンパク質６０(heat shock protein 60)、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn Superoxide dismutase)及びカタラーゼ(catalase)のうちから選択されたいずれか１つであることが望ましいが、それらに限定しない。
【0016】
また、前記タンパク質のニトロ化によって発生する疾患は、鬱病(depressive disorder)、不安障害(anxiety disorder)、脳卒中(stroke)、てんかん(epilepsy)、発作(seizure)、認知機能障害(cognitive impairment)、アルツハイマー病(Alzheimer disease)、認知症(dementia)、第２型糖尿病(type 2 diabetes)、糖尿腎症、筋肉減少症、脂質異常血症(dyslipidemia)、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、急性腎障害(Acute kidney injury)、高アンモニア血症(Hyperammonemia)及び肝性脳症のうちから選択されたいずれか１つであることが望ましいが、それらに限定しない。
【0017】
前記タンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物は、丸、錠剤(tablet)、カプセル(capsule)、散剤、粉末、顆粒、キャンデー、シロップ及び飲料のうちから選択されたいずれか１つで製造するか、食品の成分として添加して製造され、通常の方法によって適切に製造されうる。
【0018】
本発明の有効成分を添加することができる食品の一例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤のうちから選択されたいずれか１つの形態でもあり、通常の意味での健康機能食品をいずれも含む。
前記健康機能食品は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成及び天然風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含む。その他、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。そのような成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。
前記健康機能食品は、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成及び天然風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調整剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含む。その他、天然果物ジュース及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。そのような成分は、独立してまたは組み合わせて使用することができる。
【0019】
本発明の健康機能食品組成物は、さまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含みうる。前記天然炭水化物は、葡萄糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、シクロデキストリンのようなポリサッカライド、キシリトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味剤としては、ソーマチン、ステビア抽出物のような天然甘味剤や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味剤などを使用することができる。
【0020】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは、薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0021】
本発明のタンパク質のニトロ化によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物において、前記タンパク質及びタンパク質のニトロ化によって発生する疾患は、前述した通りである。
【0022】
前記チロシンが末端に位置するペプチド以外にさらに薬剤学的に許容可能な担体、賦形剤または希釈剤をさらに含みうる。本発明の薬学組成物は、経口または非経口投与され、非経口投与時、皮膚外用または腹腔内、直腸、静脈、筋肉または皮下注射方式を選択することが望ましいが、それらに限定されない。
【0023】
本発明の薬学組成物は、充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤されうる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、そのような固形製剤は、１つ以上の化合物に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース(sucrose)またはラクトース(lactose)、ゼラチンなどを混合して調剤される。また、単なる賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤としては、懸濁液剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤及び懸濁溶剤としては、プロピレングリコール(propylene glycol)、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使用されうる。坐剤の基剤としては、ウイテプゾール(witepsol)、マクロゴ－ル、ツイン６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロール、ゼラチンなどが使用されうる。
【0024】
本発明による組成物は、薬剤学的に有効な量ほど投与する。本発明において、「薬剤学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な恵み／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、患者の疾患の種類、重度度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素及びその他医学分野によく知られた要素によって決定されうる。
【0025】
本発明の組成物は、個別治療剤として投与するか、他の治療剤と併用して投与され、従来の治療剤とは順次にまたは同時に投与され、単一または多重投与されうる。前記要素をいずれも考慮して副作用なしに最小限の量で最大効果が得られる量を投与することが重要であり、これは、当業者によって容易に決定されうる。
【0026】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様に使用されうる。
【0027】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有するタンパク質内のチロシンのニトロ化阻害用組成物を提供する。
【0028】
本発明のタンパク質内のチロシンのニトロ化阻害用組成物において、前記タンパク質は、前述した通りである。
【0029】
また、本発明は、ニトロ化チロシンを含むタンパク質にチロシンが末端に位置するペプチドを処理してニトロ化チロシンからニトロ基を除去する方法を提供する。
【0030】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは食品学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または改善用健康機能食品組成物を提供する。
【0031】
また、本発明は、チロシンが末端に位置するペプチドまたは薬学的に許容可能なその塩を有効成分として含有する活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【0032】
本発明の活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患の予防または治療用薬学組成物において、前記活性酸素種／活性窒素種増加によって発生する疾患は、鬱病(depressive disorder)、不安障害(anxiety disorder)、脳卒中(stroke)、てんかん(epilepsy)、発作(seizure)、認知機能障害(cognitive impairment)、アルツハイマー病(Alzheimer disease)、認知症(dementia)、第２型糖尿病(type 2 diabetes)、糖尿腎症、筋肉減少症、脂質異常血症(dyslipidemia)、肥満、非アルコール性脂肪肝疾患、急性腎障害(Acute kidney injury)、高アンモニア血症(Hyperammonemia)及び肝性脳症のうちから選択されたいずれか１つであることが望ましいが、それらに限定されない。
【0033】
以下、実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は、ただ本発明をさらに具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がそれらによって制限されないということは、当該技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なものである。
【0034】
材料及び方法
１．ペプチド合成
本発明によるペプチドの効果を分析するために、単独アミノ酸としては、グルタミン（Ｑ）、Ｌ－チロシン（Ｌ－Ｙ）またはＤ－チロシン（Ｄ－Ｙ）を利用し、チロシンが末端に位置するペプチドとしては、チロシン－グルタミン（ＹＱ）、グルタミン－チロシン（ＱＹ）、チロシン－トリプトファン（ＹＷ）、トリプトファン－チロシン（ＷＹ）、チロシン－スレオニン（ＹＴ）、スレオニン－チロシン（ＴＹ）、チロシン－アルギニン（ＹＲ）、アルギニン－チロシン（ＲＹ）、チロシン－バリン（ＹＶ）、バリン－チロシン（ＶＹ）、チロシン－チロシン－グルタミン（ＹＹＱ）、グルタミン－チロシン－チロシン（ＱＹＹ）、チロシン－スレオニン－グルタミン（ＹＴＱ）、グルタミン－スレオニン－チロシン（ＱＴＹ）、チロシン－トリプトファン－グルタミン（ＹＷＱ）、グルタミン－トリプトファン－チロシン（ＱＷＹ）、チロシン－グルタミン－グルタミン（ＹＱＱ）、グルタミン－グルタミン－チロシン（ＱＱＹ）、チロシン－チロシン－チロシン－グルタミン（ＹＹＹＱ）、グルタミン－チロシン－チロシン－チロシン（ＱＹＹＹ）、チロシン－トリプトファン－スレオニン－グルタミン（ＹＷＴＱ）、グルタミン－トリプトファン－スレオニン－チロシン（ＱＷＴＹ）、チロシン－ランダムアミノ酸 ８個－チロシン（Ｙ（Ａ）８Ｙ）、チロシン－ランダムアミノ酸 １８個－チロシン（Ｙ（Ａ）１８Ｙ）またはチロシン－ランダムアミノ酸 ２８個－チロシン（Ｙ（Ａ）２８Ｙ）を利用した。グルタミンは、ニュートリコスト(Nutricost)社の純度１００％製品を使用し、Ｌ－チロシンは、シグマ(Sigma-Aldrich, #93829, >99.0% BioUltra)製品を、Ｄ－チロシンは、シグマ(Sigma-Aldrich, #855456, >99.0% BioUltra)製品を使用し、in vitro実験に使用したペプチドは、ペブトロン（peptron、純度９８％以上）に依頼して合成して使用し、in vivo実験に使用したペプチドは、ＧＬバイオケム（GL Biochem、純度９５％以上）に依頼して合成して実験に使用した。
１．ペプチド合成
本発明によるペプチドの効果を分析するために、単独アミノ酸としては、グルタミン（Ｑ）、Ｌ－チロシン（Ｌ－Ｙ）またはＤ－チロシン（Ｄ－Ｙ）を利用し、チロシンが末端に位置するペプチドとしては、チロシン－グルタミン（ＹＱ）、グルタミン－チロシン（ＱＹ）、チロシン－トリプトファン（ＹＷ）、トリプトファン－チロシン（ＷＹ）、チロシン－スレオニン（ＹＴ）、スレオニン－チロシン（ＴＹ）、チロシン－アルギニン（ＹＲ）、アルギニン－チロシン（ＲＹ）、チロシン－バリン（ＹＶ）、バリン－チロシン（ＶＹ）、チロシン－チロシン－グルタミン（ＹＹＱ）、グルタミン－チロシン－チロシン（ＱＹＹ）、チロシン－スレオニン－グルタミン（ＹＴＱ）、グルタミン－スレオニン－チロシン（ＱＴＹ）、チロシン－トリプトファン－グルタミン（ＹＷＱ）、グルタミン－トリプトファン－チロシン（ＱＷＹ）、チロシン－グルタミン－グルタミン（ＹＱＱ）、グルタミン－グルタミン－チロシン（ＱＱＹ）、チロシン－チロシン－チロシン－グルタミン（ＹＹＹＱ）、グルタミン－チロシン－チロシン－チロシン（ＱＹＹＹ）、チロシン－トリプトファン－スレオニン－グルタミン（ＹＷＴＱ）、グルタミン－トリプトファン－スレオニン－チロシン（ＱＷＴＹ）、チロシン－ランダムアミノ酸 ８個－チロシン（Ｙ（Ａ）８Ｙ）、チロシン－ランダムアミノ酸 １８個－チロシン（Ｙ（Ａ）１８Ｙ）またはチロシン－ランダムアミノ酸 ２８個－チロシン（Ｙ（Ａ）２８Ｙ）を利用した。グルタミンは、ニュートリコスト(Nutricost)社の純度１００％製品を使用し、Ｌ－チロシンは、シグマ(Sigma-Aldrich, #93829, >99.0% BioUltra)製品を、Ｄ－チロシンは、シグマ(Sigma-Aldrich, #855456, >99.0% BioUltra)製品を使用し、in vitro実験に使用したペプチドは、ペブトロン（peptron、純度９８％以上）に依頼して合成して使用し、in vivo実験に使用したペプチドは、ＧＬバイオケム（GL Biochem、純度９５％以上）に依頼して合成して実験に使用した。
【0035】
２．動物実験
本発明では、７週齢C57BL/6雄マウス、アルツハイマー型認知症モデルである3xTG-ADマウス、４週齢ＩＣＲ雄マウスまたはモンゴルスナネズミ（６５～７５ｇ）を温度２２～２４℃、湿度５０～７０％、１２時間明暗周期で飼育し、この際、食餌療法と水を自由に摂取可能にした。
本発明では、７週齢C57BL/6雄マウス、アルツハイマー型認知症モデルである3xTG-ADマウス、４週齢ＩＣＲ雄マウスまたはモンゴルスナネズミ（６５～７５ｇ）を温度２２～２４℃、湿度５０～７０％、１２時間明暗周期で飼育し、この際、食餌療法と水を自由に摂取可能にした。
【0036】
本発明で使用した動物は、国立保健院(NIH, Bechesda, MD, USA)指針による慶尚大学校動物保護及び使用委員会(GNU IACUC)によって承認されたプロトコル(GNU-161128-M0068)によって実施した。
【0037】
３．マウスの脳と肝組織試料準備
ＣＯ２ガスで痲酔されたマウスから前頭葉前部(prefrontal cortex, PFC)及び肝(liver)組織をそれぞれ採取して重さをはかった後、組織破砕機を用いて組織を破砕し、４℃で１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を取ってＰＦＣ及び肝組織破砕物(lysate)を得た。
ＣＯ２ガスで痲酔されたマウスから前頭葉前部(prefrontal cortex, PFC)及び肝(liver)組織をそれぞれ採取して重さをはかった後、組織破砕機を用いて組織を破砕し、４℃で１２,０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した後、上澄み液を取ってＰＦＣ及び肝組織破砕物(lysate)を得た。
【0038】
４．チロシン含有ペプチドが添加された飼料準備
本発明のペプチド食餌による動物実験を遂行するために、チロシン含有ペプチドが添加されたマウス用飼料を製造した。チロシン含有ペプチドは、チロシン－グルタミン（ＹＱ）、グルタミン－チロシン（ＱＹ）またはチロシン－トリプトファン（ＹＷ）を使用し、分子量は、それぞれ３０９．３２ｇ／ｍｏｌまたは３６７．４０ｇ／ｍｏｌであり、一般飼料（ＡＩＮ－９３Ｇ）に添加して製造した（表１）。
本発明のペプチド食餌による動物実験を遂行するために、チロシン含有ペプチドが添加されたマウス用飼料を製造した。チロシン含有ペプチドは、チロシン－グルタミン（ＹＱ）、グルタミン－チロシン（ＱＹ）またはチロシン－トリプトファン（ＹＷ）を使用し、分子量は、それぞれ３０９．３２ｇ／ｍｏｌまたは３６７．４０ｇ／ｍｏｌであり、一般飼料（ＡＩＮ－９３Ｇ）に添加して製造した（表１）。
【表1】
【0039】
５．認知機能検査
本発明のペプチド食餌による動物の長期記憶能力を分析するために事物認知技能検査(object recognition test, ORT)と事物位置認知技能検査(object location recognition test, OLT)を実施した（図１）。適応(habituation)、親和(familiarization)及び検査(test)の三段階で構成され、試験箱に一日１０分ずつ２日間適応させ、３日目の親和段階には、２つの同じ事物を１０分間探索するようにした。以後、４日目の試験段階には、２つの事物のうち１つを新たな事物に交換し、１０分間探索するようにするが、初期５分間の記録をデータとして使用した。事物認知機能（ＯＲＴ）指数は、下記のような数式で算出した。
Discrimination index = (N-F)/(N+F)
Ｎ：新規事物探索時間
Ｆ：見慣れた事物探索時間
本発明のペプチド食餌による動物の長期記憶能力を分析するために事物認知技能検査(object recognition test, ORT)と事物位置認知技能検査(object location recognition test, OLT)を実施した（図１）。適応(habituation)、親和(familiarization)及び検査(test)の三段階で構成され、試験箱に一日１０分ずつ２日間適応させ、３日目の親和段階には、２つの同じ事物を１０分間探索するようにした。以後、４日目の試験段階には、２つの事物のうち１つを新たな事物に交換し、１０分間探索するようにするが、初期５分間の記録をデータとして使用した。事物認知機能（ＯＲＴ）指数は、下記のような数式で算出した。
Discrimination index = (N-F)/(N+F)
Ｎ：新規事物探索時間
Ｆ：見慣れた事物探索時間
【0040】
ＯＲＴ遂行２４時間後に見慣れた事物の位置を変更し、５分間探索するようにし、全体事物探索時間において、位置移動した事物を探索する時間の割合を計算して事物位置認知機能（ＯＬＴ）指数を算出した。
【0041】
実施例１ タンパク質のニトロ化(nitration)抑制効果分析
１－１ マウスの脳と肝組織内タンパク質のニトロ化抑制効果分析
本発明によるペプチドによるタンパク質のニトロ化抑制効果を分析するために、マウスの脳と肝組織破砕物(lysate)を利用した。前記組織破砕物にタンパク質のニトロ化を誘導するペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加し、本発明によるペプチドを２ｍＭの濃度でそれぞれ添加した後、５秒間ボルテックス(vortex)して混合し、氷で１０分間反応させた。以後、抗ニトロチロシン抗体（１：１,０００）、抗インスリン受容体β抗体（１：１，０００）または、抗リン酸化インスリン受容体β抗体（１：１，０００）を用いてウェスタンブロットを遂行した。
１－１ マウスの脳と肝組織内タンパク質のニトロ化抑制効果分析
本発明によるペプチドによるタンパク質のニトロ化抑制効果を分析するために、マウスの脳と肝組織破砕物(lysate)を利用した。前記組織破砕物にタンパク質のニトロ化を誘導するペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加し、本発明によるペプチドを２ｍＭの濃度でそれぞれ添加した後、５秒間ボルテックス(vortex)して混合し、氷で１０分間反応させた。以後、抗ニトロチロシン抗体（１：１,０００）、抗インスリン受容体β抗体（１：１，０００）または、抗リン酸化インスリン受容体β抗体（１：１，０００）を用いてウェスタンブロットを遂行した。
【0042】
その結果、ＰＮによってＰＦＣ及び肝組織内のチロシンニトロ化が増加したタンパク質が増加したことを確認し、グルタミン合成酵素（ＧＳ）とインスリン受容体βサブユニット（ＩＲｂ）以外の多くのタンパク質のニトロ化が増加したことを多くのバンドのウェスタンブロットの結果から確認しており、ＰＮによってチロシンニトロ化が増加したタンパク質は、チロシン（Ｙ）が末端に位置したペプチド処理によってニトロ化が減少したことを確認した（図２）。また、肝組織においてＩＲｂタンパク質は、ＰＮまたはチロシン（Ｙ）が末端に位置したペプチド処理によって発現差がなく、一方、リン酸化－ＩＲｂタンパク質は、ＰＮによってニトロ化されて発現が減少し、チロシン（Ｙ）が末端に位置したペプチド処理によって発現が増加することを確認した（図３）。
【0043】
１－２ Cu/ZnSOD及びMnSODのニトロ化抑制効果分析
本発明によるペプチドによるＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn Superoxide dismutase, SOD-1)及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn Superoxide dismutase, SOD-2)のニトロ化抑制効果を分析するために、ＳＯＤ比色反応活性キット(Thermo Scientific, #EIASODC)を利用した。ＰＣＲ用チューブに標準範囲内のヒト組換えCu/ZnSODまたはMnSODを入れ、本発明によるペプチドを１ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、キット提供のキサンチン酸化酵素２５μｌを入れ、常温で２０分間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。２次測定吸光度から１次測定吸光度を差し引いたデータを用いてCu/ZnSODまたはMnSODの活性を測定した。
本発明によるペプチドによるＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/Zn Superoxide dismutase, SOD-1)及びマンガンスーパーオキシドジスムターゼ(Mn Superoxide dismutase, SOD-2)のニトロ化抑制効果を分析するために、ＳＯＤ比色反応活性キット(Thermo Scientific, #EIASODC)を利用した。ＰＣＲ用チューブに標準範囲内のヒト組換えCu/ZnSODまたはMnSODを入れ、本発明によるペプチドを１ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、キット提供のキサンチン酸化酵素２５μｌを入れ、常温で２０分間反応させた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。２次測定吸光度から１次測定吸光度を差し引いたデータを用いてCu/ZnSODまたはMnSODの活性を測定した。
【0044】
その結果、ＰＮ処理によってCu/ZnSODまたはMnSODの活性は、急に低下するが、チロシンが末端に位置したペプチドによってCu/ZnSODまたはMnSODの活性が回復することを確認した（図４）。
【0045】
１－３ グルタミン合成酵素(glutamine synthetase)のニトロ化抑制効果分析
本発明によるペプチドによるグルタミン合成酵素(glutamine synthetase)のニトロ化抑制効果を分析するために、マウスの脳組織破砕物(lysate)を利用した。ＰＣＲ用チューブに前記ＰＦＣ組織破砕物を入れ、本発明によるペプチドを１ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、反応させたサンプル５０μｌを９６ウェルプレートに入れ、グルタミン合成酵素アッセイバッファー（５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２５ｍＭ Ｌ－グルタミン、１２．５ｍＭヒドロキシルアミン、１２．５ｍＭヒ酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０８ｍＭ ＡＤＰ）５０μｌを入れた後、３７℃で約４０分間反応させた後、５６０ｎｍで吸光度を測定した。γ－グルタミルヒドロキサム酸(γ-glutamylhydroxamate)を用いて作成された標準曲線からグルタミン合成酵素の活性を計算した。
本発明によるペプチドによるグルタミン合成酵素(glutamine synthetase)のニトロ化抑制効果を分析するために、マウスの脳組織破砕物(lysate)を利用した。ＰＣＲ用チューブに前記ＰＦＣ組織破砕物を入れ、本発明によるペプチドを１ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、反応させたサンプル５０μｌを９６ウェルプレートに入れ、グルタミン合成酵素アッセイバッファー（５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２５ｍＭ Ｌ－グルタミン、１２．５ｍＭヒドロキシルアミン、１２．５ｍＭヒ酸ナトリウム、１ｍＭ ＭｎＣｌ２、０．０８ｍＭ ＡＤＰ）５０μｌを入れた後、３７℃で約４０分間反応させた後、５６０ｎｍで吸光度を測定した。γ－グルタミルヒドロキサム酸(γ-glutamylhydroxamate)を用いて作成された標準曲線からグルタミン合成酵素の活性を計算した。
【0046】
その結果、ＰＮ処理によってグルタミン合成酵素の活性は、急に低下するが、チロシンが末端に位置したペプチドによってグルタミン合成酵素の活性が回復することを確認した。
特に、３０個のアミノ酸からなる長鎖ペプチドによってもＰＮ処理によってニトロ化されて活性が低下されたグルタミン合成酵素の活性を回復させる効果があることを確認した（図５）。
特に、３０個のアミノ酸からなる長鎖ペプチドによってもＰＮ処理によってニトロ化されて活性が低下されたグルタミン合成酵素の活性を回復させる効果があることを確認した（図５）。
【0047】
１－４ カタラーゼ(catalase)のニトロ化抑制効果分析
本発明によるペプチドによるカタラーゼのニトロ化抑制効果を分析するために、ヒト組換えカタラーゼを用いたウェスタンブロットを遂行した。ＰＣＲ用チューブに０．２μｇのヒト組換えカタラーゼを入れ、本発明によるペプチドを２ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、ＳＤＳサンプルバッファーを入れ、５分間沸かし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、抗ニトロチロシン抗体（１：１０００）を用いてウェスタンブロットを遂行した。
その結果、ＰＮ処理によってニトロ化されたカタラーゼの発現は増加したが、一方、チロシンが末端に位置したペプチドによってニトロ化されたカタラーゼの発現が減少することを確認した（図６）。
本発明によるペプチドによるカタラーゼのニトロ化抑制効果を分析するために、ヒト組換えカタラーゼを用いたウェスタンブロットを遂行した。ＰＣＲ用チューブに０．２μｇのヒト組換えカタラーゼを入れ、本発明によるペプチドを２ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、ＳＤＳサンプルバッファーを入れ、５分間沸かし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、抗ニトロチロシン抗体（１：１０００）を用いてウェスタンブロットを遂行した。
その結果、ＰＮ処理によってニトロ化されたカタラーゼの発現は増加したが、一方、チロシンが末端に位置したペプチドによってニトロ化されたカタラーゼの発現が減少することを確認した（図６）。
【0048】
１－５ ＨＳＰ６０(heat shock protein 60)のリフォールディング(refolding)活性測定によるニトロ化抑制効果分析
シャペロンタンパク質の一種であるＨＳＰ６０の活性度は、タンパク質ニトロ化によって阻害されるものと知られており、これに係わる様々な疾病が知られている。そこで、本発明によるペプチドによるＨＳＰ６０のニトロ化抑制効果を分析するために、HSP60/HSP10 Glow-Foldタンパク質リフォールディングキット(R&D Systems、#K-300)を利用した。ＰＣＲ用チューブにキット提供のＨＳＰ６０溶液を入れ、本発明によるペプチドを１ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、キット提供のＨＳＰ１０溶液、Mg2+-ATP溶液及びGlow-Fold基質タンパク質を入れ、常温で１５～３０分間反応させ、反応させたサンプルを４５℃で７分間加熱した後、直ちに氷に入れた。９６ウェルプレートにルシフェリン溶液５０μｌとサンプル４μｌを混合し、１～２分以内にマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定した(Time 0)。残りのサンプルを３０℃で６０分間反応させた後、９６ウェルプレートにルシフェリン溶液５０μｌとサンプル４μｌとを混合し、１～２分以内にマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定した(Time 60)。Time 0とTime 60で測定された吸光度差値(RLU, relative light unit)を用いて各サンプルのＨＳＰ６０リフォールディング活性を分析した。
シャペロンタンパク質の一種であるＨＳＰ６０の活性度は、タンパク質ニトロ化によって阻害されるものと知られており、これに係わる様々な疾病が知られている。そこで、本発明によるペプチドによるＨＳＰ６０のニトロ化抑制効果を分析するために、HSP60/HSP10 Glow-Foldタンパク質リフォールディングキット(R&D Systems、#K-300)を利用した。ＰＣＲ用チューブにキット提供のＨＳＰ６０溶液を入れ、本発明によるペプチドを１ｍＭの濃度でそれぞれ入れ、１ｍＭのペルオキシナイトライト(peroxynitrite, PN)を添加して混合した後、氷で１０分間反応させた。以後、キット提供のＨＳＰ１０溶液、Mg2+-ATP溶液及びGlow-Fold基質タンパク質を入れ、常温で１５～３０分間反応させ、反応させたサンプルを４５℃で７分間加熱した後、直ちに氷に入れた。９６ウェルプレートにルシフェリン溶液５０μｌとサンプル４μｌを混合し、１～２分以内にマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定した(Time 0)。残りのサンプルを３０℃で６０分間反応させた後、９６ウェルプレートにルシフェリン溶液５０μｌとサンプル４μｌとを混合し、１～２分以内にマイクロプレートリーダーを用いて発光を測定した(Time 60)。Time 0とTime 60で測定された吸光度差値(RLU, relative light unit)を用いて各サンプルのＨＳＰ６０リフォールディング活性を分析した。
【0049】
その結果、ＰＮ処理によってＨＳＰ６０のリフォールディング活性度は、急に低下するが、チロシンが末端に位置したペプチドによってＨＳＰ６０のリフォールディング活性度が回復することを確認した（図７）。前記結果に基づき、チロシンが末端に位置したペプチドを用いてＨＳＰ６０の活性低下に誘導される疾病を予防または改善させうると判断された。
【0050】
実施例２ 慢性身体拘束ストレス動物モデルにおけるＧＳニトロ化抑制効果及び抗うつ効果分析
７週齢C57BL/6雄マウス２８匹を２グループ（正常群、ストレス群）に分け、ストレス群は、１５日間毎日２時間（午後２～４時）個別的に拘束器に強制動員して慢性身体拘束ストレスを与えた。前記正常群（ＣＴＬ）及びストレス群（ＳＴＲ）は、栄養均衡が取れた一般食餌群（ＮＤ）とＹＱまたはＱＹペプチドが補充（３３０ｍｇ／kg）された食餌群（ＰＤ）に再び分類して給与した。１５日間の慢性身体拘束ストレスが完了したマウスは、ショ糖選好度試験(sucrose perference test, SPT)を遂行し、血液及びＰＦＣ組織を採取して後続実験を遂行した。
７週齢C57BL/6雄マウス２８匹を２グループ（正常群、ストレス群）に分け、ストレス群は、１５日間毎日２時間（午後２～４時）個別的に拘束器に強制動員して慢性身体拘束ストレスを与えた。前記正常群（ＣＴＬ）及びストレス群（ＳＴＲ）は、栄養均衡が取れた一般食餌群（ＮＤ）とＹＱまたはＱＹペプチドが補充（３３０ｍｇ／kg）された食餌群（ＰＤ）に再び分類して給与した。１５日間の慢性身体拘束ストレスが完了したマウスは、ショ糖選好度試験(sucrose perference test, SPT)を遂行し、血液及びＰＦＣ組織を採取して後続実験を遂行した。
【0051】
（１）ＧＳニトロ化抑制効果分析
慢性身体拘束ストレスが完了したマウスＰＦＣ破砕物を用いて前述したような方法でＧＳ活性及びＧＳ発現量を測定した。
慢性身体拘束ストレスが完了したマウスＰＦＣ破砕物を用いて前述したような方法でＧＳ活性及びＧＳ発現量を測定した。
【0052】
その結果、ＧＳ発現量は、類似していたが、ストレスによってＧＳ活性が減少したことを確認し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＱＹペプチド食餌群のＧＳ活性が統計的に有意に増加したことを確認した（図８Ａ、図８Ｂ、図９Ａ、図９Ｂ）。
【0053】
また、免疫沈降（ＩＰ）－ＷＢを用いてＧＳ内のチロシンがニトロ化されたレベルを測定した。Tyr-nitriation GSの免疫沈降分析は、抗ニトロチロシン抗体(ab61392、Abcam)及びタンパク質Ａ／Ｇプラスアガロース(Santa Cruz)を用いて製造社のプロトコルによって実施した。
【0054】
その結果、ストレスによってＧＳ内のチロシンがニトロ化されたレベルが統計的に有意に増加し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＱＹペプチド食餌群のＧＳ内のチロシンがニトロ化されたレベルが統計的に有意に減少したことを確認した（図８Ｃ、図８Ｄ、図９Ｃ、図９Ｄ）。
【0055】
（２）抗うつ効果分析
慢性身体拘束ストレスが完了したマウスから血液及びＰＦＣ組織を採取して抗うつ効果を分析した。マウスから採取した血液を４℃で１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を取って血漿(plasma)を分離してＰＢＳで１／２０希釈して準備した。コルチコステロンＥＩＡキット(Cayman)を用いて製造社の方法によって血漿内コルチコステロン(corticosterone)濃度を測定した。
慢性身体拘束ストレスが完了したマウスから血液及びＰＦＣ組織を採取して抗うつ効果を分析した。マウスから採取した血液を４℃で１，０００×ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を取って血漿(plasma)を分離してＰＢＳで１／２０希釈して準備した。コルチコステロンＥＩＡキット(Cayman)を用いて製造社の方法によって血漿内コルチコステロン(corticosterone)濃度を測定した。
【0056】
その結果、ストレスによって血漿内コルチコステロンの濃度が統計的に有意に増加し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＱＹペプチド食餌群の血漿内コルチコステロンの濃度が減少したことを確認した（図１０Ａ、１１Ａ）。
【0057】
また、ＰＢＳで１／３希釈した血漿及び５０μｇのＰＦＣ組織破砕物を準備した。ＲＯＳ／ＲＮＳアッセイキット(Cell Biolabs)を用いて製造社の方法によって血漿及びＰＦＣ組織内のROS/RNS(reactive oxygen species/reactive nitrogen species)濃度を測定した。
【0058】
その結果、ストレスによって血漿及びＰＦＣ組織内のＲＯＳ／ＲＮＳの濃度が統計的に有意に増加し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＱＹペプチド食餌群の血漿及びＰＦＣ組織内のＲＯＳ／ＲＮＳの濃度が減少したことを確認した（図１０Ｃ、図１０Ｄ、図１１Ｃ、図１１Ｄ）。
【0059】
また、１５日間の慢性身体拘束ストレスが完了したマウスのショ糖(sucrose)に対する選好度測定を通じて鬱病を評価した。ショ糖選好度試験は、総４日間行い、同一サイズと形状の飲水桶に同一量の０．１Ｍのショ糖及び水を供給した。１日目に、０．１Ｍのショ糖及び水を２４時間提供し、２日目に、ショ糖及び水の位置を交換して２４時間提供し、３日目には、０．１Ｍのショ糖及び水を提供しておらず、４日目に、再び同一量の０．１Ｍのショ糖及び水を３時間提供した後、位置を交換し、また３時間提供した。４日目に、６時間飲用したショ糖及び水の量を測定し、下記式によってショ糖選好度（％）を計算した。
【0060】
ショ糖選好度（％）＝ショ糖飲用量／（水飲用量＋ショ糖飲用量）×１００
その結果、ストレスによってショ糖選好度が減少し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＱＹペプチド食餌群のショ糖選好度が増加したことを確認した（図１０Ｂ、図１１Ｂ）。
その結果、ストレスによってショ糖選好度が減少し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＱＹペプチド食餌群のショ糖選好度が増加したことを確認した（図１０Ｂ、図１１Ｂ）。
【0061】
実施例３ 慢性身体拘束ストレス動物モデルにおける認知機能向上分析
７週齢C57BL/6雄マウス２８匹を２グループ（正常群、ストレス群）に分け、チロシン含有ペプチド（１ｘＹＱ、２ｘＹＱまたは１ｘＹＷ）が添加された飼料を１週間摂食させ、ストレス群に２週毎日２時間（午後２～４時）ずつ個別的に拘束器に強制動員して慢性身体拘束ストレスを与えた。以後、事物認知技能検査(object recognition test, ORT)を遂行した。
７週齢C57BL/6雄マウス２８匹を２グループ（正常群、ストレス群）に分け、チロシン含有ペプチド（１ｘＹＱ、２ｘＹＱまたは１ｘＹＷ）が添加された飼料を１週間摂食させ、ストレス群に２週毎日２時間（午後２～４時）ずつ個別的に拘束器に強制動員して慢性身体拘束ストレスを与えた。以後、事物認知技能検査(object recognition test, ORT)を遂行した。
【0062】
その結果、ストレスによって事物認知機能が減少し、ストレス群において一般食餌群対比でＹＱまたはＹＷペプチド食餌群の事物認知機能が増加したことを確認した（図１２）。
【0063】
実施例４ アルツハイマー型認知症動物モデルにおける認知機能向上分析
４－１ アルツハイマー型認知症遺伝子改変マウスモデル
アルツハイマー型認知症遺伝子改変マウスモデルである3xTG-AD２ヶ月齢及び正常マウスC57BL/6２ヶ月齢の認知機能を検査した後、それぞれ２グループに分け、一般飼料（ＮＤ）またはチロシン含有ペプチド(1xYQ)が添加された飼料を摂食するようにした。また、3xTG-ADマウスにおいて軽度認知障害が現われると知られた８ヶ月齢に認知機能をまた試してチロシンペプチドの認知機能保護効能を検査した。
４－１ アルツハイマー型認知症遺伝子改変マウスモデル
アルツハイマー型認知症遺伝子改変マウスモデルである3xTG-AD２ヶ月齢及び正常マウスC57BL/6２ヶ月齢の認知機能を検査した後、それぞれ２グループに分け、一般飼料（ＮＤ）またはチロシン含有ペプチド(1xYQ)が添加された飼料を摂食するようにした。また、3xTG-ADマウスにおいて軽度認知障害が現われると知られた８ヶ月齢に認知機能をまた試してチロシンペプチドの認知機能保護効能を検査した。
【0064】
その結果、正常マウス対比で認知症動物モデルの事物認知機能が減少し、２ヶ月齢よりは、８ヶ月齢の事物認知機能減少幅がさらに大きいことを確認した。また、正常マウス群では、ペプチド食餌による差がないが、一方、認知症動物モデルでは、ＹＱペプチド食餌によって事物認知機能が多少増加することを確認した（図１３）。
【0065】
また、脳組織のうち海馬を組織質量１０ｍｇ当たりＲＩＰＡ緩衝溶液１００μｌ（タンパク質加水分解酵素／リン酸加水分解酵素阻害剤を含む）を入れ、ガラスビード及びブレンダーを用いて１分間粉砕した。１２,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して上澄み液を分離し、ＰＢＳに１０倍希釈して活性酸素種／活性窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）測定に使用した。ＲＯＳ／ＲＮＳ濃度は、OxiSelectROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs)を使用しておすすめ実験方法によって測定した。
【0066】
その結果、認知症動物モデルの海馬組織のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度は、正常群対比で増加したが、ＹＱペプチドによって減少することを確認した（図１４）。
【0067】
４－２ グルタミン酸作動性ニューロン蛍光標識アルツハイマー型認知症モデル
グルタミン酸作動性ニューロンに蛍光標識されたvGluT2-IRES-Cre::tdTomatoマウスとアルツハイマー型認知症遺伝子改変マウスモデルである3xTG-ADマウスを交雑し、グルタミン酸作動性ニューロンに蛍光標識された認知症モデルである3xTG-vGluT2-Cre::tdTomatoを構築し、グルタミン酸作動性ニューロンを赤色標識することができる動物モデルであることを確認した（図１５Ａ）。
グルタミン酸作動性ニューロンに蛍光標識されたvGluT2-IRES-Cre::tdTomatoマウスとアルツハイマー型認知症遺伝子改変マウスモデルである3xTG-ADマウスを交雑し、グルタミン酸作動性ニューロンに蛍光標識された認知症モデルである3xTG-vGluT2-Cre::tdTomatoを構築し、グルタミン酸作動性ニューロンを赤色標識することができる動物モデルであることを確認した（図１５Ａ）。
【0068】
3xTG-vGluT2-Cre::tdTomatoマウス２ヶ月齢にチロシン含有ペプチド(1xYQ)が添加された飼料を摂食させ、６～８ヶ月齢に自発的興奮性シナプス後に電流(spontaneous excitatory postsynaptic current, sEPSC)を測定してグルタミン酸作動性ニューロンの活性度を測定した。膜電流を記録するために、２００μｍ厚さの横断面脳切片を１．５～２ｍｌ／分の人工脳脊髄液が注入された記録チャンバに入れ、－７０ｍＶの維持電位で内側前頭葉前部皮質（ｍＰＦＣ）の視覚化されたグルタミン酸作動性ニューロンから全細胞電圧クランプ記録を得た。グルタミン酸作動性電流は、ピクロトキシン（１００μＭ）の添加で分離された。全ての記録は、３０±２℃で行われ、ピペット溶液は、１３０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ２、１０ｍＭ ＥＧＴＡ、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ ＭｇＡＴＰ、０．５ｍＭ Ｎａ２ＧＴＰ及び５ｍＭホスホクレアチンからなる物質を利用した。
【0069】
その結果、認知症動物モデルのグルタミン酸作動性ニューロンの活性は、正常群対比で減少したが、ＹＱペプチドによって増加することを確認した（図１５Ｂ）。
【0070】
実施例５ てんかん発作動物モデルにおける興奮毒性及び酸化ストレス抑制効果分析
４週齢ＩＣＲ雄マウスに１週間正常食餌、チロシン（Ｌ－Ｔｙｒ）またはチロシン含有ペプチド（３ｘＹＱ、１ｘＹＷまたは３ｘＹＷ）が添加された飼料を摂食させ、２００ｍｇ／ｋｇ ＹＱを腹腔注射(YQ i.p)した。カイニン酸(Kainic acid, KA)を湯煎で加熱しながら、生理食塩水に溶解して４．５ｍｇ／ｍｌカイニン酸溶液を準備し、カイニン酸溶液を腹腔注射し（３６ｍｇ／ｋｇ）、２時間の間、発作レベルと症状を記録した。カイニン酸を注射し、１６時間または５日後、生存したマウスの脳組織（前頭葉前部皮質、海馬）を摘出した。
４週齢ＩＣＲ雄マウスに１週間正常食餌、チロシン（Ｌ－Ｔｙｒ）またはチロシン含有ペプチド（３ｘＹＱ、１ｘＹＷまたは３ｘＹＷ）が添加された飼料を摂食させ、２００ｍｇ／ｋｇ ＹＱを腹腔注射(YQ i.p)した。カイニン酸(Kainic acid, KA)を湯煎で加熱しながら、生理食塩水に溶解して４．５ｍｇ／ｍｌカイニン酸溶液を準備し、カイニン酸溶液を腹腔注射し（３６ｍｇ／ｋｇ）、２時間の間、発作レベルと症状を記録した。カイニン酸を注射し、１６時間または５日後、生存したマウスの脳組織（前頭葉前部皮質、海馬）を摘出した。
【0071】
５－１ 発作レベルの判断
発作レベルの判断は、下記表２の基準を適用して記録した。
発作レベルの判断は、下記表２の基準を適用して記録した。
【表2】
【0072】
その結果、一般食餌群対比でペプチド食餌群の発作レベルが顕著に減少することを確認した（図１６）。
【0073】
５－２ 活性酸素種／活性窒素種（ＲＯＳ／ＲＮＳ）測定
脳組織のうち海馬を組織質量１０ｍｇ当たりＲＩＰＡ緩衝溶液１００μｌ（タンパク質加水分解酵素／リン酸加水分解酵素阻害剤を含む）を入れ、ガラスビード及びブレンダーを用いて１分間粉砕した。１２,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して上澄み液を分離し、ＰＢＳに１０倍希釈してＲＯＳ／ＲＮＳ測定に使用した。ＲＯＳ／ＲＮＳ濃度は、OxiSelectROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs)を使用しておすすめ実験方法によって測定した。
脳組織のうち海馬を組織質量１０ｍｇ当たりＲＩＰＡ緩衝溶液１００μｌ（タンパク質加水分解酵素／リン酸加水分解酵素阻害剤を含む）を入れ、ガラスビード及びブレンダーを用いて１分間粉砕した。１２,０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離して上澄み液を分離し、ＰＢＳに１０倍希釈してＲＯＳ／ＲＮＳ測定に使用した。ＲＯＳ／ＲＮＳ濃度は、OxiSelectROS/RNSアッセイキット(Cell Biolabs)を使用しておすすめ実験方法によって測定した。
【0074】
その結果、カイニン酸を注射して生存したマウスの海馬組織のＲＯＳ／ＲＮＳ濃度は、カイニン酸によって増加したが、３ｘＹＱまたは３ｘＹＷペプチドによって減少することを確認した（図１７）。
【0075】
５－３ グルタミン合成酵素（ＧＳ）活性測定
９６ウェルプレートに海馬溶解物２μｌを入れ、５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ６．８）をさらに入れて５０μｌを合わせた。ＧＳ活性アッセイ緩衝溶液（５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２５ｍＭのＬ－グルタミン、１２．５ｍＭのヒドロキシルアミン、１２．５ｍＭのヒ酸ナトリウム(sodium arsenate)、１ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．０８ｍＭのＡＤＰ）５０μｌを入れ、３７℃で約４０分間反応させた。反応終了後、空ウェルに標準物質であるγ-グルタミルヒドロキサム酸(γ-glutamylhydroxamate)を０．３９１～２５．０ｍＭの濃度になるように添加した。試料と標準物質に１００μｌの反応停止液（９０ｍＭのＦｅＣｌ３、１．８ＮのＨＣｌ及び１．４５％（ｗ／ｖ）卜リクロロ酢酸(trichloroaceticacid)を添加し、５６０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
標準曲線との比較を通じて各サンプルのＧＳ活性を求めた。ＧＳ活性は、最終生産物であるγ-グルタミルヒドロキサム酸の生成量で表現し、単位は、μＭ／ｍｉｎ／ｕｇタンパク質である。
９６ウェルプレートに海馬溶解物２μｌを入れ、５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ６．８）をさらに入れて５０μｌを合わせた。ＧＳ活性アッセイ緩衝溶液（５０ｍＭイミダゾール－ＨＣｌ、ｐＨ６．８、２５ｍＭのＬ－グルタミン、１２．５ｍＭのヒドロキシルアミン、１２．５ｍＭのヒ酸ナトリウム(sodium arsenate)、１ｍＭのＭｎＣｌ２及び０．０８ｍＭのＡＤＰ）５０μｌを入れ、３７℃で約４０分間反応させた。反応終了後、空ウェルに標準物質であるγ-グルタミルヒドロキサム酸(γ-glutamylhydroxamate)を０．３９１～２５．０ｍＭの濃度になるように添加した。試料と標準物質に１００μｌの反応停止液（９０ｍＭのＦｅＣｌ３、１．８ＮのＨＣｌ及び１．４５％（ｗ／ｖ）卜リクロロ酢酸(trichloroaceticacid)を添加し、５６０ｎｍ波長で吸光度を測定した。
標準曲線との比較を通じて各サンプルのＧＳ活性を求めた。ＧＳ活性は、最終生産物であるγ-グルタミルヒドロキサム酸の生成量で表現し、単位は、μＭ／ｍｉｎ／ｕｇタンパク質である。
【0076】
その結果、カイニン酸を注射して生存したマウスの海馬組織のグルタミン合成酵素の活性は、カイニン酸によって減少したが、３ｘＹＱ、１ｘＹＷ、３ｘＹＷまたは３ｘＹＱペプチドによって増加することを確認した（図１８）。
【0077】
実施例６ 虚血性脳卒中動物モデルにおける神経細胞死滅抑制及び恒産化効果分析
３ヶ月齢雄モンゴルスナネズミを３％イソフルラン(isoflurane)で全身痲酔を誘導した後、２．５％のイソフルランガスで痲酔を維持した。首部分を消毒した後、切開して両方の総頸動脈(common carotid artery)を露出させ、小型血管クリップ(micro vessel clip)を用いて５分間血流を閉鎖して虚血を誘発して脳卒中を誘導した。血管クリップ適用時、体温は、３７．０±０．５℃に維持し、偽手術(sham operation)を遂行した動物を対照群として利用した。
３ヶ月齢雄モンゴルスナネズミを３％イソフルラン(isoflurane)で全身痲酔を誘導した後、２．５％のイソフルランガスで痲酔を維持した。首部分を消毒した後、切開して両方の総頸動脈(common carotid artery)を露出させ、小型血管クリップ(micro vessel clip)を用いて５分間血流を閉鎖して虚血を誘発して脳卒中を誘導した。血管クリップ適用時、体温は、３７．０±０．５℃に維持し、偽手術(sham operation)を遂行した動物を対照群として利用した。
【0078】
６－１ 神経細胞死滅抑制効果分析
虚血を誘発した後、再灌流させながら、ＹＱペプチドを２００ｍｇ／ｋｇの量で２４時間ごとに３回腹腔投与し、４日目に動物を犠牲させて脳組織を摘出して死滅された神経細胞の数を測定した。
虚血を誘発した後、再灌流させながら、ＹＱペプチドを２００ｍｇ／ｋｇの量で２４時間ごとに３回腹腔投与し、４日目に動物を犠牲させて脳組織を摘出して死滅された神経細胞の数を測定した。
【0079】
その結果、虚血性脳卒中動物モデルの神経細胞の数は、偽手術群対比で減少したが、ＹＱペプチドによって増加することを確認した（図１９Ａ）。
【0080】
６－２ ＳＯＤ及びＣＡＴ活性測定
虚血を誘導した後、再灌流させながらＹＱペプチドを２００ｍｇ／ｋｇの量で１回腹腔投与し、再灌流し、２時間または２４時間後に、アベルチン(avertin)を用いて全身痲酔させた後、頭蓋腔を開いて迅速に脳を取り出した後、海馬組織を摘出して液体窒素に急冷させて超低温冷凍庫に保管した。以後、ＳＯＤ比色反応活性キット及びカタラーゼ比色反応活性キットを用いてＳＯＤとＣＡＴ活性を測定した。
虚血を誘導した後、再灌流させながらＹＱペプチドを２００ｍｇ／ｋｇの量で１回腹腔投与し、再灌流し、２時間または２４時間後に、アベルチン(avertin)を用いて全身痲酔させた後、頭蓋腔を開いて迅速に脳を取り出した後、海馬組織を摘出して液体窒素に急冷させて超低温冷凍庫に保管した。以後、ＳＯＤ比色反応活性キット及びカタラーゼ比色反応活性キットを用いてＳＯＤとＣＡＴ活性を測定した。
【0081】
その結果、虚血性脳卒中動物モデルの再灌流２４時間後、ＳＯＤとＣＡＴ活性は、偽手術群対比で減少したが、ＹＱペプチドによって増加することを確認した（図１９Ｂ、Ｃ）。
【0082】
６－３ 神経細胞死滅確認のための免疫組織化学染色
虚血性脳損傷動物モデルの海馬における神経細胞とグルー細胞の変化及び関連因子の変化を確認するために免疫組織化学染色を実施した。虚血を誘発した後、再灌流させながら、ＹＱペプチドを２００ｍｇ／ｋｇの量で２４時間ごとに３回腹腔投与した。ペプチドの代わりに、vehicle（０．９％サリン）を投与して対照群として利用した。４日目に動物を犠牲させて脳組織を摘出して４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で固定した。以後、１０、２０、３０％スクロース溶液に沈積させた後、液体窒素を用いて組織を冷凍させた後、３０μｍ厚さの連続切片に作製し、冷凍保存溶液に入れ、－２０℃で保管した。
脳組織切片を０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して１０分ずつ３回洗浄し、組織内に存在する内因性過酸化酵素を無くすために、０．３％ Ｈ２Ｏ２に３０分間反応させた。非特異的な免疫反応を防止するために、切片をそれぞれの抗体に合う５％正常血清で３０分間反応させた後、抗-錐体細胞関連抗体（NeuN）、抗星状膠細胞関連抗体（Iba-1）及び抗ミクログリア細胞関連抗体(GFAP)をそれぞれの希釈倍数で希釈して常温で一晩中反応させた後、反応終了組織は、ビオチンが結合されている２次抗体で２時間反応させた後、ＡＢＣ溶液に１時間反応させた。反応済の組織は、３、３’－ＤＡＢキットを用いて発色を実施した後、スライドガラスに塗抹した後、室温で１２時間乾燥し、通常、脱水透明化過程を経てＤＰＸマウント溶液を用いて封入した後、顕微鏡(Olympus BX53)を用いて観察した。
虚血性脳損傷動物モデルの海馬における神経細胞とグルー細胞の変化及び関連因子の変化を確認するために免疫組織化学染色を実施した。虚血を誘発した後、再灌流させながら、ＹＱペプチドを２００ｍｇ／ｋｇの量で２４時間ごとに３回腹腔投与した。ペプチドの代わりに、vehicle（０．９％サリン）を投与して対照群として利用した。４日目に動物を犠牲させて脳組織を摘出して４％パラホルムアルデヒドを用いて４℃で固定した。以後、１０、２０、３０％スクロース溶液に沈積させた後、液体窒素を用いて組織を冷凍させた後、３０μｍ厚さの連続切片に作製し、冷凍保存溶液に入れ、－２０℃で保管した。
脳組織切片を０．０１Ｍ ＰＢＳを使用して１０分ずつ３回洗浄し、組織内に存在する内因性過酸化酵素を無くすために、０．３％ Ｈ２Ｏ２に３０分間反応させた。非特異的な免疫反応を防止するために、切片をそれぞれの抗体に合う５％正常血清で３０分間反応させた後、抗-錐体細胞関連抗体（NeuN）、抗星状膠細胞関連抗体（Iba-1）及び抗ミクログリア細胞関連抗体(GFAP)をそれぞれの希釈倍数で希釈して常温で一晩中反応させた後、反応終了組織は、ビオチンが結合されている２次抗体で２時間反応させた後、ＡＢＣ溶液に１時間反応させた。反応済の組織は、３、３’－ＤＡＢキットを用いて発色を実施した後、スライドガラスに塗抹した後、室温で１２時間乾燥し、通常、脱水透明化過程を経てＤＰＸマウント溶液を用いて封入した後、顕微鏡(Olympus BX53)を用いて観察した。
【0083】
その結果、対照群（０．９％サリン投与群）では、海馬ＣＡ１領域に神経細胞がほとんど観察されていないが、ＹＱペプチド投与群では、偽手術群（sham）と比べて、約６０．７％の細胞が生き残っていることを確認した。また、虚血性脳卒中動物モデルにおいて対照群（０．９％サリン投与群）では、拡張された細胞質と拡張された細胞突起を有するグリア細胞が観察されたが、ＹＱペプチド投与群では、グリア細胞の形態学的な変化が大きくなく、偽手術群（sham）とほぼ類似した形態を示すことを確認した（図２０）。
【0084】
前記結果に基づき、チロシンが末端に位置するペプチドが虚血による脳組織の酸化的損傷及び免疫反応を抑制させて神経細胞の死滅を防御することが分かった。
【0085】
実施例７ 高脂肪食餌第２型糖尿動物モデルｂにおけるインスリン敏感度増進効果分析
３週齢C57BL/6雄マウスをコアテックから購入して動物飼育室で恒温（２２±２℃）、恒湿（５０±５％）、１２時間おきの光周期で維持し、ケージ当たり２匹ずつ分離飼育した。１週間適応させた後、４グループに分けて正常食餌(normal diet, ND)、高脂肪食餌(high fat diet, HFD, 60% kcal fat)、ＹＱペプチド添加高脂肪食餌群(HFD+1xYQまたはHFD+3xYQ)で１７週間飼育した。
３週齢C57BL/6雄マウスをコアテックから購入して動物飼育室で恒温（２２±２℃）、恒湿（５０±５％）、１２時間おきの光周期で維持し、ケージ当たり２匹ずつ分離飼育した。１週間適応させた後、４グループに分けて正常食餌(normal diet, ND)、高脂肪食餌(high fat diet, HFD, 60% kcal fat)、ＹＱペプチド添加高脂肪食餌群(HFD+1xYQまたはHFD+3xYQ)で１７週間飼育した。
【0086】
７－１ 体重、飼料摂取量及び空腹血糖測定
一週間おきに各動物の体重と飼料摂取量を測定し、飼育開始後、１、５または８週には、１２時間絶食後、血糖測定検査機(Accu-Check)を用いて空腹血糖を測定した。
一週間おきに各動物の体重と飼料摂取量を測定し、飼育開始後、１、５または８週には、１２時間絶食後、血糖測定検査機(Accu-Check)を用いて空腹血糖を測定した。
【0087】
その結果、全実験群の体重は漸増し、同日付を基準に、ＮＤ群対比でＨＦＤ群の体重がさらに高いことを確認し、ＨＦＤ群対比でＨＦＤ＋３ｘＹＱ群の体重がさらに低いことを確認した（図２１Ａ）。飼料摂取量は、同日付を基準に、ＮＤ群対比でＨＦＤ群、ＨＦＤ＋１ｘＹＱ群またはＨＦＤ＋３ｘＹＱ群が低いことを確認し、ＨＦＤ群、ＨＦＤ＋１ｘＹＱ群またはＨＦＤ＋３ｘＹＱ群のグループ間の違いはほとんどないことを確認した（図２１Ｂ）。
【0088】
また、ＨＦＤ群の血糖がＮＤ群に比べて増加し、ＨＦＤ＋１ｘＹＱ群またはＨＦＤ＋３ｘＹＱ群の血糖がＨＦＤ群に比べて経時的に減少することを確認した（図２２）。
【0089】
７－２ 耐糖能(glucose tolerance test, GTT)及びインスリン感受性(insulin tolerance test, ITT)検査
飼育開始後、１５週にＧＴＴ検査を、１６週にＩＴＴ検査を遂行した。ＧＴＴは、１２時間絶食後、葡萄糖溶液２ｇ／ｋｇを腹腔注射した後、０、２０、６０、９０及び１２０分に静脈から採血して血糖を測定した。ＩＴＴは、６時間絶食後、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇを腹腔注射した後、０、１５、３０、６０及び１２０分に静脈から採血して血糖を測定した。
飼育開始後、１５週にＧＴＴ検査を、１６週にＩＴＴ検査を遂行した。ＧＴＴは、１２時間絶食後、葡萄糖溶液２ｇ／ｋｇを腹腔注射した後、０、２０、６０、９０及び１２０分に静脈から採血して血糖を測定した。ＩＴＴは、６時間絶食後、インスリン０．７５Ｕ／ｋｇを腹腔注射した後、０、１５、３０、６０及び１２０分に静脈から採血して血糖を測定した。
【0090】
耐糖能及びインスリン感受性検査結果において、ＮＤ群対比でＨＦＤ群の血液内グルコース含量が増加し、ＨＦＤ群対比でＨＦＤ＋３ｘＹＱ群の血液内グルコース含量が減少することを確認した（図２３、２４）。
【0091】
７－３ 排尿量及び脂肪量測定
排尿量(urine volume)は、１６時間の間、代謝ケージで収集した小便量（ｍｌ）を測定し、脂肪量(fat mass)は、EchoMRITM機械を使用して各マウスから測定して体重の％で示した。
排尿量(urine volume)は、１６時間の間、代謝ケージで収集した小便量（ｍｌ）を測定し、脂肪量(fat mass)は、EchoMRITM機械を使用して各マウスから測定して体重の％で示した。
【0092】
その結果、ＮＤ群対比でＨＦＤ群の排尿量及び脂肪量が増加し、ＨＦＤ群対比でＨＦＤ＋３ｘＹＱ群の排尿量及び脂肪量が減少することを確認した（図２５）。
【0093】
７－４ 血漿生化学的分析
痲酔後、下行大動脈から血液を採取し、３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離した。インスリンの濃度は、ＥＬＩＳＡキット(Crystal Chem, Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit)を使用して測定し、アラニンアミノ基転移酵素の濃度(ahlanine aminotransferase, ALT)は、アッセイキット(IVD Lab Co., ChemiLab GPT(ALT) assay kit)を使用して測定し、ＲＯＳ／ＲＮＳの濃度は、アッセイキット(Cell Biolabs, Inc., OxiSelectTM In Vitro ROS/RNS Assay Kit)を使用して測定した。
痲酔後、下行大動脈から血液を採取し、３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離した。インスリンの濃度は、ＥＬＩＳＡキット(Crystal Chem, Ultra Sensitive Mouse Insulin ELISA Kit)を使用して測定し、アラニンアミノ基転移酵素の濃度(ahlanine aminotransferase, ALT)は、アッセイキット(IVD Lab Co., ChemiLab GPT(ALT) assay kit)を使用して測定し、ＲＯＳ／ＲＮＳの濃度は、アッセイキット(Cell Biolabs, Inc., OxiSelectTM In Vitro ROS/RNS Assay Kit)を使用して測定した。
【0094】
その結果、ＮＤ群対比でＨＦＤ群の血漿内インスリン、ＡＬＴ及びＲＯＳ／ＲＮＳの濃度が増加し、ＨＦＤ群対比でＨＦＤ＋３ｘＹＱ群の血漿内インスリン、ＡＬＴ及びＲＯＳ／ＲＮＳの濃度が減少することを確認した（図２６）。
【0095】
前記結果に基づき、チロシンが末端に位置するペプチドが非アルコール性肝疾患及び活性酸素／活性窒素種による慢性代謝疾患の予防または治療に使用可能であるということが分かった。
【0096】
７－５ 組織学的分析
痲酔後の肝組織を摘出して液体窒素に急冷させ、一部は、１０％ホルマリンに固定した後、パラフィンブロック(paraffin block)で５μｍ厚さの組織スライドを作製した。次いで、組織をH&E(hematoxilyn & eosin)で染色し、顕微鏡(Olympus, CKX41)で観察してイメージ化した。
痲酔後の肝組織を摘出して液体窒素に急冷させ、一部は、１０％ホルマリンに固定した後、パラフィンブロック(paraffin block)で５μｍ厚さの組織スライドを作製した。次いで、組織をH&E(hematoxilyn & eosin)で染色し、顕微鏡(Olympus, CKX41)で観察してイメージ化した。
【0097】
その結果、ＨＦＤ群の肝は、肝細胞内の脂肪滴の跡と組織の纎維化が観察されたが、一方、ＨＦＤ＋３ｘＹＱ群は、ＮＤ群と類似した肝組織の形状を維持することを確認した（図２７）。
【0098】
７－６ インスリン受容体(insulin receptor)発現量測定
代謝疾患で筋肉のインスリン受容体の減少は、インスリン信号敏感度を減少させて筋肉におけるグルコースを使用する能力を制限させるようになり、筋肉減少症の原因になると知られている。肝組織をＲＩＰＡバッファーで均質化し、ＢＣＡ法でタンパク質を定量して抗インスリン受容体β(insulin receptor-β,IRβ)抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。
代謝疾患で筋肉のインスリン受容体の減少は、インスリン信号敏感度を減少させて筋肉におけるグルコースを使用する能力を制限させるようになり、筋肉減少症の原因になると知られている。肝組織をＲＩＰＡバッファーで均質化し、ＢＣＡ法でタンパク質を定量して抗インスリン受容体β(insulin receptor-β,IRβ)抗体を用いてウェスタンブロットを実施した。
【0099】
その結果、ＮＤ群対比でＨＦＤ群のインスリン受容体βの発現量が減少し、ＨＦＤ群対比でＨＦＤ＋３ｘＹＱ群のインスリン受容体βの発現量が増加することを確認した（図２８）。
【0100】
前記結果に基づき、チロシンが末端に位置するペプチドがインスリン受容体βの発現量を増加させることで、代謝疾患による筋肉減少症の予防効果があるということが分かった。
【0101】
７－７ アルブミン／クレアチン含量及び中性脂肪含量測定
腎臓の機能が低下すれば、小便内のアルブミン(albumin)の含量が増加し、クレアチン(creatinne)の含量が減少すると知られている。そこで、マウスアルブミンＥＬＩＳＡキット(Abcam)及びクレアチンアッセイキット(Abcam)を用いて各実験動物の小便からアルブミン及びクレアチンの含量を測定し、アルブミン／クレアチンの割合を計算した。また、血漿１０μｌまたは均質化した肝組織４０ｍｇを１０,０００ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を分離して中性脂肪(Triglyceride、TG)測定キット(Cayman)を用いて血漿または肝に存在する中性脂肪の量を測定した。
腎臓の機能が低下すれば、小便内のアルブミン(albumin)の含量が増加し、クレアチン(creatinne)の含量が減少すると知られている。そこで、マウスアルブミンＥＬＩＳＡキット(Abcam)及びクレアチンアッセイキット(Abcam)を用いて各実験動物の小便からアルブミン及びクレアチンの含量を測定し、アルブミン／クレアチンの割合を計算した。また、血漿１０μｌまたは均質化した肝組織４０ｍｇを１０,０００ｇで１０分間遠心分離した後、上澄み液を分離して中性脂肪(Triglyceride、TG)測定キット(Cayman)を用いて血漿または肝に存在する中性脂肪の量を測定した。
【0102】
その結果、ＮＤ群対比でＨＦＤ群のアルブミン／クレアチンの割合及び中性脂肪の量が増加し、ＨＦＤ群対比でＨＦＤ＋１ｘＹＱまたはＨＦＤ＋３ｘＹＱ群のアルブミン／クレアチンの割合及び中性脂肪の量が減少することを確認した（図２９）。
【0103】
前記結果に基づき、チロシンが末端に位置するペプチドが糖尿による腎臓機能の低下を抑制し、糖尿病合併症の１つである糖尿腎症予防に効果があることが分かり、血中中性脂肪の異常増加現象である脂質異常血症に対する予防または治療効果があることが分かった。
【0104】
実施例８ 腎臓虚血再灌流による急性腎不全動物モデルにおけるタンパク質のニトロ化抑制効果分析
２３～２５ｇの雄C57BL/6マウスを温度及び湿度が一定に維持される無菌飼育室で自由に水と飼料とを摂取するようにし、１）対照群（sham）、２）水投与した腎臓虚血再灌流誘発群(veh+renal IR)、３）ＹＱペプチド投与した腎臓虚血再灌流誘発群(YQ+renal IR)に分けた。ＹＱ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、４日間、一日１回経口投与し、４日目に経口投与３０分後、腎臓虚血を誘発した。腎臓虚血は、腹部を切開し、マイクロ血管クランプ(Muller atraumatic vascular clamp)を用いて両側腎血管茎(renal pedicle)をクランプして誘発し、２５分虚血後、クランプを除去して再灌流した。対照群（sham）は、クランプを介した虚血誘発を除いた全ての手術過程を同一に施行した。再灌流後、２４時間に、実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取して腎臓組織を摘出した。
２３～２５ｇの雄C57BL/6マウスを温度及び湿度が一定に維持される無菌飼育室で自由に水と飼料とを摂取するようにし、１）対照群（sham）、２）水投与した腎臓虚血再灌流誘発群(veh+renal IR)、３）ＹＱペプチド投与した腎臓虚血再灌流誘発群(YQ+renal IR)に分けた。ＹＱ（１００ｍｇ／ｋｇ）は、４日間、一日１回経口投与し、４日目に経口投与３０分後、腎臓虚血を誘発した。腎臓虚血は、腹部を切開し、マイクロ血管クランプ(Muller atraumatic vascular clamp)を用いて両側腎血管茎(renal pedicle)をクランプして誘発し、２５分虚血後、クランプを除去して再灌流した。対照群（sham）は、クランプを介した虚血誘発を除いた全ての手術過程を同一に施行した。再灌流後、２４時間に、実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取して腎臓組織を摘出した。
【0105】
８－１ 血中クレアチニン濃度測定
採取した血液を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離し、Jaffe法を用いて腎臓損傷に対する評価指標である血中クレアチニンの濃度を測定した。Jaffe法は、５１０ｎｍ波長で血漿試料をピクリン酸と反応して測定した吸光度と６０％酢酸で反応を終了させた後、測定した吸光度との差でクレアチニンの濃度を計算し、ｍｇ／ｄｌ単位で示した。
採取した血液を３,０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して血漿を分離し、Jaffe法を用いて腎臓損傷に対する評価指標である血中クレアチニンの濃度を測定した。Jaffe法は、５１０ｎｍ波長で血漿試料をピクリン酸と反応して測定した吸光度と６０％酢酸で反応を終了させた後、測定した吸光度との差でクレアチニンの濃度を計算し、ｍｇ／ｄｌ単位で示した。
【0106】
その結果、血漿クレアチニンは、腎臓虚血及び再灌流２４時間後、対照群（sham）に比べて、顕著に増加し、そのような増加は、ＹＱペプチド投与によって統計的に有意に抑制されることを確認した（図３０Ａ）。
【0107】
８－２ リアルタイムｑＰＣＲ分析
Trizol法で腎臓組織から総ＲＮＡを抽出し、RevertAid逆転写システム(Thermofisher)を使用してｃＤＮＡを合成した。 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を使用して CFX Connect Real-Time PCRシステム(Bio-Rad)で炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6及びMCP-1)に対する定量的 PCR(quantitative PCR, qPCR)を遂行した。GAPDHに補正されたターゲットｍＲＮＡの相対的な量は、2-△Ct法を使用して分析した。実験に使用したプライマーは、下記表３の通りである。
Trizol法で腎臓組織から総ＲＮＡを抽出し、RevertAid逆転写システム(Thermofisher)を使用してｃＤＮＡを合成した。 iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)を使用して CFX Connect Real-Time PCRシステム(Bio-Rad)で炎症性サイトカイン(IL-1β、IL-6及びMCP-1)に対する定量的 PCR(quantitative PCR, qPCR)を遂行した。GAPDHに補正されたターゲットｍＲＮＡの相対的な量は、2-△Ct法を使用して分析した。実験に使用したプライマーは、下記表３の通りである。
【表3】
【0108】
その結果、急性腎不全の主要発病メカニズムである炎症反応の指標であるＩＬ－１β、ＩＬ－６及びＭＣＰ－１の発現量は、腎臓虚血及び再灌流２４時間後、対照群（sham）に比べて顕著に増加し、そのような増加は、ＹＱペプチド投与によって統計的に有意に抑制されることを確認した（図３０Ｂ、Ｃ、Ｄ）。
【0109】
８－３ 腎臓組織におけるニトロ化タンパク質及び脂質過酸化産物発現量の測定
腎臓組織をＲＩＰＡバッファーで均質化し、ＢＣＡ法でタンパク質を定量した後、ニトロチロシン(nitrotyrosine)及び脂質過酸化の産物である4-hydroxynonenal(4-HNE)に対する抗体を用いてウェスタンブロットを遂行した。
その結果、腎臓虚血及び再灌流２４時間後、腎臓組織においてチロシンがニトロ化されたタンパク質の量が対照群（sham）に比べて増加し、そのような増加は、ＹＱペプチド投与によって顕著に減少することを確認した（図３１）。
腎臓組織をＲＩＰＡバッファーで均質化し、ＢＣＡ法でタンパク質を定量した後、ニトロチロシン(nitrotyrosine)及び脂質過酸化の産物である4-hydroxynonenal(4-HNE)に対する抗体を用いてウェスタンブロットを遂行した。
その結果、腎臓虚血及び再灌流２４時間後、腎臓組織においてチロシンがニトロ化されたタンパク質の量が対照群（sham）に比べて増加し、そのような増加は、ＹＱペプチド投与によって顕著に減少することを確認した（図３１）。
【0110】
実施例９ 高アンモニア血症動物モデルにおける血中アンモニア抑制効果分析
１３週齢の雄C57BL/6マウスを温度及び湿度が一定に維持される無菌飼育室で自由に水と飼料と摂取するようにし、（１）対照群（Control）、（２）水投与した高アンモニア血症群(veh+AOM)、（３）１００ｍｇ／ｋｇ ＹＱペプチド投与した高アンモニア血症群(YQ100+AOM)及び（４）２００ｍｇ／ｋｇ ＹＱペプチド投与した高アンモニア血症群(YQ200+AOM)に分けた。ＹＱペプチドを４日間、一日１回経口投与し、４日目に、経口投与２時間後、アゾキシメタン(Azoxymethane, AOM, 100mg/kg)を腹腔に注射して高アンモニア血症を誘導した。ＡＯＭ投与後、１２時間後、脱水を予防するために、０．５％グルコースを含む生理食塩水２００μｌを腹腔注射し、４時間後、実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取し、肝組織を摘出した。
１３週齢の雄C57BL/6マウスを温度及び湿度が一定に維持される無菌飼育室で自由に水と飼料と摂取するようにし、（１）対照群（Control）、（２）水投与した高アンモニア血症群(veh+AOM)、（３）１００ｍｇ／ｋｇ ＹＱペプチド投与した高アンモニア血症群(YQ100+AOM)及び（４）２００ｍｇ／ｋｇ ＹＱペプチド投与した高アンモニア血症群(YQ200+AOM)に分けた。ＹＱペプチドを４日間、一日１回経口投与し、４日目に、経口投与２時間後、アゾキシメタン(Azoxymethane, AOM, 100mg/kg)を腹腔に注射して高アンモニア血症を誘導した。ＡＯＭ投与後、１２時間後、脱水を予防するために、０．５％グルコースを含む生理食塩水２００μｌを腹腔注射し、４時間後、実験動物を犠牲させて心臓から血液を採取し、肝組織を摘出した。
【0111】
９－１ 血中アンモニア分析
アンモニアは、アミノ酸と核酸の主な代謝物であり、アンモニアをヨウ素に転換させるヨウ素回路の主要酵素が肝細胞にのみ存在し、アンモニアを濃度を低めるＧＳとＳＯＤ、活性酸素を除去するカタラーゼなども肝組織に豊かに存在するので、肝を経て脳に上がる血管の血中アンモニア濃度変化は、肝性脳症に重要な指標となる。そこで、血中アンモニア量を測定するために、単一波長反射測定法分析用測定器である PocketChem BA PA-4140(Arkray, Japan)を使用した。検査紙に血液２０μｌを室温で３分間反応させ、測定器に挿入して６３５ｎｍ（ＬＥＤ）波長で吸光度を測定し、結果をμｇ／ｄＬ単位で示した。
アンモニアは、アミノ酸と核酸の主な代謝物であり、アンモニアをヨウ素に転換させるヨウ素回路の主要酵素が肝細胞にのみ存在し、アンモニアを濃度を低めるＧＳとＳＯＤ、活性酸素を除去するカタラーゼなども肝組織に豊かに存在するので、肝を経て脳に上がる血管の血中アンモニア濃度変化は、肝性脳症に重要な指標となる。そこで、血中アンモニア量を測定するために、単一波長反射測定法分析用測定器である PocketChem BA PA-4140(Arkray, Japan)を使用した。検査紙に血液２０μｌを室温で３分間反応させ、測定器に挿入して６３５ｎｍ（ＬＥＤ）波長で吸光度を測定し、結果をμｇ／ｄＬ単位で示した。
【0112】
その結果、水投与した高アンモニア血症群(veh+AOM)は、対照群（Control）に比べて、血中アンモニア濃度が約３．６倍増加し、ＹＱペプチドの投与は、ＡＯＭによる血中アンモニア増加を統計的に有意に抑制することを確認した（図３２Ａ）。
【0113】
９－２ 肝組織でのニトロ化タンパク質発現量測定
肝組織をＲＩＰＡバッファーで均質化し、ＢＣＡ法でタンパク質を定量した後、ニトロチロシン(nitrotyrosine)に対する抗体を用いてウェスタンブロットを遂行した。
その結果、ＡＯＭ投与後の肝組織でニトロチロシンタンパク質が対照群に比べて増加し、そのような増加は、ＹＱペプチドの投与によって顕著に減少しており、その結果は、ＹＱペプチドが肝に存在するタンパク質のニトロ化を抑制し、肝に流入されたアンモニアを除去可能にするということが分かった（図３２）。
肝組織をＲＩＰＡバッファーで均質化し、ＢＣＡ法でタンパク質を定量した後、ニトロチロシン(nitrotyrosine)に対する抗体を用いてウェスタンブロットを遂行した。
その結果、ＡＯＭ投与後の肝組織でニトロチロシンタンパク質が対照群に比べて増加し、そのような増加は、ＹＱペプチドの投与によって顕著に減少しており、その結果は、ＹＱペプチドが肝に存在するタンパク質のニトロ化を抑制し、肝に流入されたアンモニアを除去可能にするということが分かった（図３２）。
【0114】
［統計処理］
本発明の全データは、平均±標準偏差で示し、Dunnetts Multiple Comparison Testを用いた一元配置分散分析(ANOVA)またはGraphPadプリズム5(GraphPad Software)を用いたスチューデントｔ検定で統計分析された。
本発明の全データは、平均±標準偏差で示し、Dunnetts Multiple Comparison Testを用いた一元配置分散分析(ANOVA)またはGraphPadプリズム5(GraphPad Software)を用いたスチューデントｔ検定で統計分析された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
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【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
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【図20】
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【図22】
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【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【配列表】
【国際調査報告】