特表 2024-509890 プロテアーゼ切断可能なプロドラッグ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-05

(54)【発明の名称】プロテアーゼ切断可能なプロドラッグ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240227BHJP

   C07K 16/18 20060101ALI20240227BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240227BHJP

   C07K 14/725 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 15/115 20100101ALI20240227BHJP

   C07K 16/32 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240227BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240227BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240227BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240227BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/18 ZNA

C07K16/46

C07K14/725

C12N15/115 Z

C07K16/32

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C12N15/11 Z

A61K47/68

A61P35/00

A61K39/395 D

A61K39/395 N

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023554811

(86)(22)【出願日】2022-03-09

(85)【翻訳文提出日】2023-10-30

(86)【国際出願番号】 IB2022052118

(87)【国際公開番号】W WO2022190008

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】63/158,785

(32)【優先日】2021-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/159,043

(32)【優先日】2021-03-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＢＲＩＪ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515146556

【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ボスハート アンドレアス

(72)【発明者】

【氏名】グリム セバスチャン

(72)【発明者】

【氏名】アールスコグ ジュリア

(72)【発明者】

【氏名】シュレーレス ベルント

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG26

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064CE12

4B064DA01

4B065AA26X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE59

4C085AA13

4C085BB01

4C085BB11

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA21

4H045GA26

(57)【要約】

本出願は、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって結合剤に接続された薬物分子を含むプロドラッグであって、薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害するプロドラッグ、及び阻害性結合剤自体に関する。本明細書に記載される組換えタンパク質をコードする核酸、及び当該組換えタンパク質を作製する方法、並びに治療の方法及び組換えタンパク質の医学的使用も記載される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ｉ）結合部分と、（ｉｉ）薬物分子と、を含む、組換えタンパク質であって、
前記結合部分が、前記薬物分子に可逆的に結合し、
前記結合部分が、結合されると、前記薬物分子の生物学的活性を阻害し、前記結合部分及び前記薬物分子が、ペプチドリンカーによって接続され、前記ペプチドリンカーが、プロテアーゼ切断部位を含む、組換えタンパク質。

【請求項2】

前記結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項3】

前記結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質。

【請求項4】

前記結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、請求項１又は２に記載の組換えタンパク質。

【請求項5】

前記結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項6】

前記結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項7】

前記薬物分子の前記生物学的活性が、前記薬物分子の生物学的標的への結合である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項8】

前記薬物分子の前記生物学的活性が、酵素活性である、請求項１～７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項9】

前記組換えタンパク質の哺乳動物への投与時の前記プロテアーゼ切断部位における前記ペプチドリンカーの切断が、前記結合部分からの前記薬物分子の放出を可能にする、請求項１～８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項10】

前記哺乳動物が、ヒトである、請求項９に記載の組換えタンパク質。

【請求項11】

前記ペプチドリンカーの前記切断が、腫瘍組織において生じる、請求項９又は１０に記載の組換えタンパク質。

【請求項12】

前記プロテアーゼ切断部位が、腫瘍組織に存在するプロテアーゼによって認識される部位である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項13】

前記結合部分が、約１μＭ未満、例えば、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）で前記薬物分子を結合する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項14】

前記結合部分が、約１μＭ～約１０ｐＭ、例えば、約１μＭ～約１０ｐＭ、約１μＭ～約２０ｐＭ、約１μＭ～約５０ｐＭ、又は約１μＭ～約１００ｐＭの解離定数（Ｋ_D）で前記薬物分子を結合する、請求項１～１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項15】

前記解離定数（Ｋ_D）が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定される、請求項１３又は１４に記載の組換えタンパク質。

【請求項16】

前記結合部分が、設計されたアンキリン反復ドメインを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項17】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、請求項１６に記載の組換えタンパク質。

【請求項18】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１２及び（２）配列番号１～１２のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６又は１７に記載の組換えタンパク質。

【請求項19】

前記薬物分子が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項20】

前記薬物分子が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項21】

前記薬物分子が、非免疫グロブリン分子を含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項22】

前記薬物分子が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項23】

前記薬物分子が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項24】

前記薬物分子が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項25】

前記薬物分子が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインを含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項26】

前記薬物分子が、設計されたアンキリン反復ドメインを含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項27】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、請求項２６に記載の組換えタンパク質。

【請求項28】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項２６又は２７に記載の組換えタンパク質。

【請求項29】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）でＣＤ３に結合する、請求項２７又は２８に記載の組換えタンパク質。

【請求項30】

前記薬物分子が、抗体を含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項31】

前記抗体が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、請求項３０に記載の組換えタンパク質。

【請求項32】

前記薬物分子が、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である、請求項１～３１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項33】

前記ＴＣＥが、ＣＤ３に結合する結合ドメインを含み、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する結合ドメインを更に含む、請求項３２に記載の組換えタンパク質。

【請求項34】

前記結合部分の前記ＴＣＥ薬物分子への結合が、前記ＴＣＥ薬物分子のＴ細胞への結合及び／又はＴ細胞の活性化を阻害する、請求項３２又は３３に記載の組換えタンパク質。

【請求項35】

前記ＴＣＥが、二重特異性又は多重特異性抗体である、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項36】

前記ＴＣＥが、二重特異性又は多重特異性アンキリン反復タンパク質である、請求項３２～３４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項37】

ＣＤ３に結合する前記結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する前記結合ドメインのＣ末端側に位置する、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項38】

前記結合部分が、前記薬物分子の抗イディオタイプ結合剤である、請求項１～３７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項39】

前記結合部分が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する前記設計されたアンキリン反復ドメインの抗イディオタイプ結合剤である、請求項３８に記載の組換えタンパク質。

【請求項40】

前記結合部分が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する前記抗体の抗イディオタイプ結合剤である、請求項３８に記載の組換えタンパク質。

【請求項41】

前記結合部分、前記薬物分子、及び前記ペプチドリンカーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の形式：薬物分子－ペプチドリンカー－結合部分で配置されている、請求項１～４０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項42】

前記結合部分、ＣＤ３に結合する前記結合ドメイン、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する前記結合ドメイン、及び前記ペプチドリンカーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の形式：腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する結合ドメイン－ＣＤ３に結合する結合ドメイン－ペプチドリンカー－結合部分で配置されている、請求項１～４１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項43】

哺乳動物における前記組換えタンパク質の血清半減期を延長する薬剤を更に含む、請求項１～４２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項44】

哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する前記薬剤が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する、請求項４３に記載の組換えタンパク質。

【請求項45】

哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する前記薬剤が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む、請求項４４に記載の組換えタンパク質。

【請求項46】

血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号６５～６７及び（２）配列番号６５～６７のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項４５に記載の組換えタンパク質。

【請求項47】

哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する前記薬剤が、前記ペプチドリンカーの、前記結合部分と同じ側に位置する、請求項４３～４６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項48】

前記結合部分及び哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する前記薬剤が、両方とも前記ペプチドリンカーのＣ末端側に位置する、請求項４７に記載の組換えタンパク質。

【請求項49】

哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する前記薬剤が、前記結合部分のＣ末端側に位置する、請求項４３～４７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項50】

前記結合部分、ＣＤ３に結合する前記結合ドメイン、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する前記結合ドメイン、前記ペプチドリンカー、及び哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する前記薬剤が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の形式：腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する結合ドメイン－ＣＤ３に結合する結合ドメイン－ペプチドリンカー－結合部分－哺乳動物における前記組換えタンパク質の前記血清半減期を延長する薬剤で配置されている、請求項４３～４９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項51】

請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする、核酸。

【請求項52】

請求項５１に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項53】

前記組換えタンパク質が発現される条件下で、請求項５２に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を作製する方法。

【請求項54】

前記宿主細胞が、原核宿主細胞である、請求項５３に記載の方法。

【請求項55】

前記宿主細胞が、真核宿主細胞である、請求項５３に記載の方法。

【請求項56】

請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質又は請求項５１に記載の核酸を含み、薬学的に許容される担体又は賦形剤を追加的に含む、医薬組成物。

【請求項57】

療法に使用するための、請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５１に記載の核酸、又は請求項５６に記載の医薬組成物。

【請求項58】

増殖性疾患の治療において使用するためのものであり、前記増殖性疾患が、がんである、請求項５７に記載の使用するための組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物。

【請求項59】

治療の方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５１に記載の核酸、又は請求項５６に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、治療の方法。

【請求項60】

前記方法が、増殖性疾患を治療する方法であり、任意選択で、前記増殖性疾患が、がんである、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

Ｔ細胞活性化を必要とする対象におけるＴ細胞活性化の方法であって、請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５１に記載の核酸、又は請求項５６に記載の医薬組成物を前記対象に投与する工程を含む、方法。

【請求項62】

請求項１～５０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項５１に記載の核酸、又は請求項５６に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、インビボで活性薬物分子の放出を制御する方法。

【請求項63】

前記対象が、ヒトである、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項64】

薬物分子の生物学的活性を制御する方法であって、請求項１～６、１３～１８、及び３８～４０のいずれか一項に定義された結合部分を、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーを用いて、請求項１９～３７のいずれか一項に定義された薬物分子と接続して、組換えタンパク質を形成することと、前記組換えタンパク質を、それを必要とする患者に投与することと、を含み、前記プロテアーゼ切断部位が、腫瘍組織に存在するプロテアーゼによって認識される、方法。

【請求項65】

前記薬物分子の前記生物学的活性が、前記薬物分子の生物学的標的への結合である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記薬物分子の前記生物学的活性が、酵素活性である、請求項６４に記載の方法。

【請求項67】

薬物分子に対して結合特異性を有する結合部分であって、前記結合部分が、ペプチドリンカーによって前記薬物分子に接続されると、前記薬物分子の生物学的活性を阻害する、結合部分。

【請求項68】

前記結合部分の前記薬物分子への結合が、前記薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害する複合体を形成する、請求項６７に記載の結合部分。

【請求項69】

前記結合部分が、前記薬物分子の抗イディオタイプ結合剤である、請求項６７又は６８に記載の結合部分。

【請求項70】

前記薬物分子の前記生物学的活性が、前記薬物分子の生物学的標的への結合である、請求項６７又は６９に記載の結合部分。

【請求項71】

前記薬物分子の前記生物学的活性が、酵素活性である、請求項６７～６９のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項72】

約１μＭ未満、例えば、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満の、前記薬物分子に対する結合親和性（Ｋ_D）を有する、請求項６７～７１のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項73】

前記結合部分が、約１μＭ～約１０ｐＭ、例えば、約１μＭ～約１０ｐＭ、約１μＭ～約２０ｐＭ、約１μＭ～約５０ｐＭ、又は約１μＭ～約１００ｐＭの解離定数（Ｋ_D）で前記薬物分子を結合する、請求項６７～７２のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項74】

前記解離定数（Ｋ_D）が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定される、請求項７２又は７３に記載の結合部分。

【請求項75】

前記結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、請求項６７～７４のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項76】

前記結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、請求項６７～７５のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項77】

前記結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、請求項６７～７６のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項78】

前記結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、請求項６７～７７のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項79】

前記結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、請求項６７～７８のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項80】

前記結合部分が、設計されたアンキリン反復ドメインを含む、請求項６７～７９のいずれか一項に記載の結合部分。

【請求項81】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、請求項８０に記載の結合部分。

【請求項82】

前記設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１２及び（２）配列番号１～１２のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項８０又は８１に記載の結合部分。

【請求項83】

請求項６７～８２のいずれか一項に記載の結合部分をコードする、核酸。

【請求項84】

請求項８０～８２のいずれか一項に記載の設計されたアンキリン反復ドメインをコードする、核酸。

【請求項85】

請求項８３又は８４に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。

【請求項86】

前記結合部分が発現される条件下で、請求項８５に記載の宿主細胞を培養することを含む、請求項６７～８２のいずれか一項に記載の結合部分を作製する方法。

【請求項87】

前記宿主細胞が、原核宿主細胞である、請求項８６に記載の方法。

【請求項88】

前記宿主細胞が、真核宿主細胞である、請求項８６に記載の方法。

【請求項89】

請求項６７～８２のいずれか一項に記載の結合部分、又は請求項８３若しくは８４に記載の核酸を含み、薬学的に許容される担体又は賦形剤を追加的に含む、医薬組成物。

【請求項90】

療法に使用するための、請求項６７～８２のいずれか一項に記載の結合部分、請求項８３若しくは８４に記載の核酸、又は請求項８９に記載の医薬組成物。

【請求項91】

治療の方法であって、それを必要とする対象に、請求項６７～８２のいずれか一項に記載の結合部分、請求項８３若しくは８４に記載の核酸、又は請求項８９に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、治療の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年３月９日に出願された米国特許出願第６３／１５８，７８５号及び２０２１年０３月１０日に出願された米国特許出願第６３／１５９，０４３号に対して優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（発明の分野）
本出願は、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって結合剤に接続された薬物分子を含むプロドラッグであって、薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害するプロドラッグ、及び阻害性結合剤自体に関する。本明細書に記載される組換えタンパク質をコードする核酸、及び当該組換えタンパク質を作製する方法、並びに治療の方法及び組換えタンパク質の医学的使用も記載される。

【背景技術】

【0003】

薬物候補は、ある特定の有効性基準を満たさなければならないが、それらはまた、許容される安全性プロファイルを呈さなければならない。多くの薬物分子は、いくつかの有害なオフターゲット及び／又はオンターゲット副作用を有し、いくつかの薬物分子はまた、薬物分子の意図される標的における過剰な有害な薬理作用により、有害なオンターゲット作用を引き起こし得る。ある特定の薬物では、有害作用を回避することができないので、有害作用を軽減する必要がある。これにはいくつかの選択肢がある。例えば、非ステロイド性抗炎症薬（nonsteroidal anti-inflammatory drug、ＮＳＡＩＤ）は、胃の内膜を損傷し得るため、胃を保護する薬剤、例えば、プロトンポンプ阻害剤オメプラゾールと共投与されることが多い。他の薬物分子については、薬物が複数回用量で、又はより長い期間にわたって連続的に患者に投与されるような特定の投与レジメンを使用して、有害作用又はそのリスクを軽減することができる。これの例には、薬物を一日に複数回服用すること、又は薬物の静脈内（intravenous、ＩＶ）注入が含まれ得る。

【0004】

分割投与及び静脈内薬物注入は、認識され受け入れられている投薬の方法であるが、欠点がないわけではない。患者にとって面倒な投与レジメン（例えば、比較的短い期間にわたって複数回の投薬を必要とする投与レジメン）は、患者の服薬遵守不良に結びつき、その結果として治療結果がより悪くなる。静脈内注入法は、患者の服薬遵守不良に悩まされる可能性が低いが、患者は医療の下にいる必要がある。これは、患者にとって混乱を起こさせるものであり、医療制度に追加の負担をもたらす。結果として、有害な薬物作用を軽減する改善された方法が当該技術分野において必要とされている。

【0005】

典型的に副作用を伴う薬物の１つのクラスは、抗がん剤である。Ｔ細胞エンゲージャー薬（T-cell engager drug、ＴＣＥ）は、標的細胞上の腫瘍関連抗原（tumor-associated antigen、ＴＡＡ）及びＴ細胞上のＣＤ３受容体に同時に結合し、それによって人工免疫シナプスを形成することによって、腫瘍細胞に細胞傷害性Ｔ細胞応答を指向させる。ＴＣＥは、α－ＣＤ１９×α－ＣＤ３二重特異性抗体であるブリナツモマブによって例示されるように、非常に強力な抗腫瘍薬であることが示されている。しかしながら、血液学的腫瘍及び固形腫瘍のためのＴＣＥの開発は、いくつかの要因によって妨げられてきた。ＴＣＥは、その抗腫瘍活性に加えて、特に初回用量投与後に、全身性内皮活性化及び大量のリンパ球再分布、並びに神経毒性と関連する（Ｖｅｌａｓｑｕｅｚ，Ｂｌｏｏｄ，２０１８，１３１（１），３０－３８）。ＴＣＥはまた、Ｔ細胞のオンターゲット／オフ腫瘍動員、並びにサイトカイン放出症候群（cytokine release syndrome、ＣＲＳ）及び高サイトカイン血症（「サイトカインストーム」としても知られる）によって誘発される重度の毒性に関連する。

【0006】

ＣＲＳ又は高サイトカイン血症は、典型的には、薬物の初回投与後に急速に起こり、体内でのサイトカインの制御されない過剰な放出を特徴とする。サイトカイン放出は正常な免疫機能の重要な部分であるが、血中へのあまりに多くのサイトカインのあまりに急速な放出は、高熱、炎症、重度の倦怠感、吐気などの症状、及び時には更に多臓器不全及び死を引き起こし得る。Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病及びリウマチ性関節炎の治療を目的としたＴｈｅｒａｌｉｚｕｍａｂ（セラリズマブ）薬物の臨床治験は、参加者が重度の高サイトカイン血症を発症した後に断念する必要があった。症状の発症は、投薬の１時間以内に生じ、治験の参加者全員が緊急の入院治療を必要とした。ＣＲＳはまた、免疫療法によって影響を受けた免疫細胞から血液へのサイトカインの大量かつ急速な放出によって引き起こされる。ＣＲＳの症状としては、発熱、悪心、頭痛、発疹、動悸、低血圧、及び呼吸困難が挙げられる。場合により、ＣＲＳは重篤であるか、又は生命を脅かすことがある。

【0007】

オンターゲット／オフ腫瘍毒性による免疫療法の重篤な有害作用は、腫瘍及び健常組織の両方上で発現される標的抗原を有する患者において生じる。このような発現パターンは、例えば上皮成長因子受容体（epidermal growth factor receptor、ＥＧＦＲ）ファミリーのある特定のメンバーなど、標的がん療法に使用される多くの標的抗原に典型的である。このような抗原の一例はＨｅｒ２であり、これは腫瘍において４０～１００倍過剰発現され得るので、がん療法の魅力的な標的である。Ｈｅｒ２は、長い間、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））などのモノクローナル抗体を使用する治療の標的とされてきた。Ｈｅｒ２はまた、免疫療法の標的にもなっている。トラスツズマブ配列に基づくＨｅｒ２ ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、大腸がん患者を治療するために使用されていたが、残念なことに、患者の心肺系のオフ腫瘍標的化が致死毒性を引き起こした（Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．，２０１０；１８（４）：８４３－８５１）。細胞注入後の血清試料は、サイトカインストームと一致する様々なサイトカインの顕著な増加を示し、このサイトカインストームは、投与された細胞による肺上皮細胞上の低レベルのＨｅｒ２の認識によって引き起こされた可能性が高い。この有害作用は、トラスツズマブの臨床研究に基づいて、又は前臨床動物研究に基づいて予見されなかった。

【0008】

これらの毒性は、臨床治験設計及び用量漸増戦略に影響を与えることが多く、特に高い疾患負担を有する患者において、重症度により用量制限があることが証明されている。前投薬及び／又は積極的な治療介入も必要とされる場合があり、最終的に複雑な臨床治験設計につながる。Ｔ細胞エンゲージャー薬の投与に関連するＣＲＳの臨床管理のために、いくつかの戦略が考案されている。これらには、段階的投薬（段階的用量漸増）、ステロイド（特にデキサメタゾン）による前治療、又はトシリズマブ（抗ＩＬ６レセプター抗体）による治療が含まれる（例えば、Ａｌｄｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１９，２１：４を参照されたい）。ステロイドによる前治療は、治療の開始を遅らせ、これは侵攻的な疾患状態には推奨されず、ステロイドの使用は、高いボディマス指数（body mass index、ＢＭＩ）及び／又は血圧を有する患者において禁忌であることがある。ＣＲＳを回避するためのトシリズマブによる治療は、２０１７年にＦＤＡによって承認された。しかしながら、この薬物の免疫抑制作用により、患者は他の感染性疾患に罹患しやすくなることがある。

【0009】

総合すると、がんを含む疾患の治療に使用される薬物の有害作用又はそのリスクを回避、低減、又は軽減するための新規の又は改善されたアプローチが依然として必要とされている。

【発明の概要】

【0010】

本出願は、薬物分子の投与後の有害作用又はそのリスクを回避又は軽減するための新規アプローチを提供しようとするものである。本発明は、薬物分子に可逆的に結合し、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって薬物分子に連結される結合部分によって、薬物分子の生物学的活性を阻害する方法を提供する。結合部分によって阻害される薬物分子の生物学的活性は、例えば、生物学的標的への薬物分子の結合であり得る。プロテアーゼ（例えば、腫瘍組織において発現されるプロテアーゼ）によるペプチドリンカーの切断の際に、結合部分は、薬物分子から解離し、それによって、タンパク質分解切断の部位において活性薬物分子を体内に放出する。この方法は、投与直後の体内の活性薬物分子濃度のピークを回避し、活性薬物分子の放出を適切なプロテアーゼの発現部位に局在化させる。このアプローチの有益な適用例は、ＴＣＥ及びプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによってそれに接続された阻害性結合部分を含むプロドラッグＴＣＥタンパク質の投与後のオンターゲット／オフ腫瘍毒性及びＣＲＳのリスクの低減である。

【0011】

本出願は、（ｉ）結合部分と、（ｉｉ）薬物分子と、を含む、新規プロドラッグタンパク質であって、当該結合部分が、当該薬物分子に可逆的に結合し、当該結合部分が、結合されると、当該薬物分子の生物学的活性を阻害し、当該結合部分及び当該薬物分子が、ペプチドリンカーによって接続され、当該ペプチドリンカーが、１つ以上のプロテアーゼ切断部位を含む、新規プロドラッグタンパク質を記載する。優先的に、ペプチドリンカーを切断することができるプロテアーゼは、腫瘍組織などの薬物分子の標的組織において高レベルで発現する。種々の薬物分子と組み合わせてこのようなプロドラッグアプローチにおいて使用され得る特異的結合部分が、本出願において更に記載される。本発明の結合部分は、薬物分子の抗イディオタイプ結合剤であり得る。いくつかの実施形態では、本発明のプロドラッグタンパク質は、血清半減期延長部分を更に含む。優先的には、そのような半減期延長部分は、ペプチドリンカーのタンパク質分解性切断の際に、半減期延長部分が結合部分と一緒に薬物分子から切断されるように、阻害性結合部分に共有結合している。このようにして、プロドラッグタンパク質は延長された血清半減期を有するが、ペプチドリンカーのタンパク質分解性切断の際に放出される活性薬物分子は延長された血清半減期を有しない。したがって、薬物分子の生物学的活性は、持続時間が比較的短く、それによって、腫瘍組織から体内の他の部位への活性薬物分子の分布時に起こり得るオンターゲット／オフ腫瘍毒性の回避に更に寄与する。

【0012】

このプロドラッグアプローチの特定の適用において、本発明は、プロテアーゼ切断可能なリンカーを介して抗イディオタイプ抗ＣＤ３結合剤結合部分（以下、結合剤と呼ぶ）に連結されたＴＡＡ結合剤及びＣＤ３結合剤を含むＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＴＣＥプロドラッグ（ＣＤ３－ＰＤＤ）を提供する（図１を参照されたい）。このα－ＴＡＡ×α－ＣＤ３×結合剤プロドラッグは、その非切断状態ではＴ細胞を結合して動員することができないが、腫瘍関連プロテアーゼによるリンカーの切断時に腫瘍微小環境（tumor microenvironment、ＴＭＥ）において活性化されるように設計されている。

【0013】

そのようなプロテアーゼ活性化可能なプロドラッグの根底にある考えは、腫瘍微小環境におけるプロテアーゼの誤調節を利用することであり、すなわち、循環及び健常組織においては不活性であるが、腫瘍関連プロテアーゼによるプロテアーゼ感受性リンカーの切断によってＴＭＥに入ると活性化されるプロドラッグ分子を構築することによるものである（図１を参照されたい）。

【0014】

プロドラッグの遮断概念は、「強制近接」の現象、すなわち、ＣＤ３結合剤の近傍における結合剤の非常に高い濃度に依存する。これは、リンカーによって課される距離制約のためであり、結合剤がＣＤ３結合剤の周りのある特定の体積のみにアクセスすることを可能にする。腫瘍関連プロテアーゼによってリンカーが切断されると、強制近接がなくなり、結合剤は自由に拡散することができ、結合剤とＣＤ３結合剤との間のオフレートによってのみ制限される。

【0015】

１つの実施形態では、半減期延長部分（例えば、ＨＳＡ結合剤）は、ＴＣＥプロドラッグ分子の遮断部分（すなわち、結合剤）に結合される。これは、別の安全層を提供する：切断時に、Ｔ細胞エンゲージャーは活性にされるが、同時にその半減期延長部分を失う。したがって、ＴＭＥから循環中に漏出して戻る活性ＴＣＥは、サイズが小さく、半減期が短いために、系から迅速に除去される。

【0016】

要約すると、条件付きで活性化可能なＴＣＥプロドラッグであって、対応する構成的に活性な（すなわち、遮断されていない）ＴＣＥと同様の有効性を示すが、毒性は示さない、ＴＣＥプロドラッグが本明細書に記載される。記載されたプロドラッグアプローチは、将来のプロドラッグＴＣＥ治療剤の開発に有望であり、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）がいくつかの非標的組織（すなわち、健常組織）においても発現される場合でさえ、それらを非常に強力なＴＣＥの標的として利用することを可能にする。

【0017】

まとめると、本発明は、結合した場合に薬物分子の生物学的活性を阻害する結合部分にプロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって接続された薬物分子を含む、条件付きで活性化可能なプロドラッグを提供する。更に、本発明は、様々なプロドラッグにおいて使用することができる阻害性結合部分それ自体を提供する。本明細書に記載の組換えタンパク質をコードする核酸、及び宿主細胞を使用して当該組換えタンパク質を作製する方法、並びに組換えタンパク質を使用する医学的使用及び治療の方法も提供される。

【0018】

本明細書で提供される開示に基づいて、当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の実施形態（Ｅ）によって包含されることが意図される。

【0019】

第１の実施形態では、本発明は、（ｉ）結合部分と、（ｉｉ）薬物分子と、を含む、組換えタンパク質であって、
当該結合部分が、当該薬物分子に可逆的に結合し、
当該結合部分が、結合されると、当該薬物分子の生物学的活性を阻害し、当該結合部分及び当該薬物分子が、ペプチドリンカーによって接続され、当該ペプチドリンカーが、プロテアーゼ切断部位を含む、組換えタンパク質に関する。

【0020】

第２の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、実施形態１の組換えタンパク質に関する。

【0021】

第３の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、実施形態１又は２の組換えタンパク質に関する。

【0022】

第４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、実施形態１又は２の組換えタンパク質に関する。

【0023】

第５の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0024】

第６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）に由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態１～４のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0025】

第７の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、当該薬物分子の生物学的標的への結合である、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0026】

第８の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0027】

第９の実施形態では、本発明は、当該組換えタンパク質の哺乳動物への投与時の当該プロテアーゼ切断部位における当該ペプチドリンカーの切断が、当該結合部分からの当該薬物分子の放出を可能にする、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0028】

第１０の実施形態では、本発明は、当該哺乳動物が、ヒトである、実施形態９の組換えタンパク質に関する。

【0029】

第１１の実施形態では、本発明は、当該ペプチドリンカーの当該切断が、腫瘍組織において生じる、実施形態９又は１０の組換えタンパク質に関する。

【0030】

第１２の実施形態では、本発明は、当該プロテアーゼ切断部位が、腫瘍組織に存在するプロテアーゼによって認識される部位である、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0031】

第１３の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、約１μＭ未満、例えば、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）で当該薬物分子を結合する、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0032】

第１４の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、約１μＭ～約１０ｐＭ、例えば、約１μＭ～約１０ｐＭ、約１μＭ～約２０ｐＭ、約１μＭ～約５０ｐＭ、又は約１μＭ～約１００ｐＭの解離定数（Ｋ_D）で当該薬物分子を結合する、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0033】

第１５の実施形態では、本発明は、当該解離定数（Ｋ_D）が、リン酸緩衝生理食塩水（phosphate buffered saline、ＰＢＳ）中で測定される、実施形態１３又は１４の組換えタンパク質に関する。

【0034】

第１６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、設計されたアンキリン反復ドメインを含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0035】

第１７の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、実施形態１６の組換えタンパク質に関する。

【0036】

第１８の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１２及び（２）配列番号１～１２のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１６又は１７の組換えタンパク質に関する。

【0037】

第１９の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0038】

第２０の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0039】

第２１の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、非免疫グロブリン分子を含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0040】

第２２の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0041】

第２３の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0042】

第２４の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0043】

第２５の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対して結合特異性を有する少なくとも１つの結合ドメインを含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0044】

第２６の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、設計されたアンキリン反復ドメインを含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0045】

第２７の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、実施形態２６の組換えタンパク質に関する。

【0046】

第２８の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態２６又は２７の組換えタンパク質に関する。

【0047】

第２９の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）でＣＤ３に結合する、実施形態２７又は２８の組換えタンパク質に関する。

【0048】

第３０の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、抗体を含む、実施形態１～２５のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0049】

第３１の実施形態では、本発明は、当該抗体が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する、実施形態３０の組換えタンパク質に関する。

【0050】

第３２の実施形態では、本発明は、当該薬物分子が、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0051】

第３３の実施形態では、本発明は、当該ＴＣＥが、ＣＤ３に結合する結合ドメインを含み、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する結合ドメインを更に含む、実施形態３２の組換えタンパク質に関する。

【0052】

第３４の実施形態では、本発明は、当該結合部分の当該ＴＣＥ薬物分子への結合が、当該ＴＣＥ薬物分子のＴ細胞への結合及び／又はＴ細胞の活性化を阻害する、実施形態３２又は３３の組換えタンパク質に関する。

【0053】

第３５の実施形態では、本発明は、当該ＴＣＥが、二重特異性又は多重特異性抗体である、実施形態３２～３４のいずれか１つの組換えタンパク質に関する。

【0054】

第３６の実施形態では、本発明は、当該ＴＣＥが、二重特異性又は多重特異性アンキリン反復タンパク質である、実施形態３２～３４のいずれか１つの組換えタンパク質に関する。

【0055】

第３７の実施形態では、本発明は、ＣＤ３に結合する当該結合ドメインが、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する当該結合ドメインのＣ末端側に位置する、実施形態３３～３６のいずれか１つの組換えタンパク質に関する。

【0056】

第３８の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、当該薬物分子の抗イディオタイプ結合剤である、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0057】

第３９の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該設計されたアンキリン反復ドメインの抗イディオタイプ結合剤である、実施形態３８の組換えタンパク質に関する。

【0058】

第４０の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該抗体の抗イディオタイプ結合剤である、実施形態３８の組換えタンパク質に関する。

【0059】

第４１の実施形態では、本発明は、当該結合部分、当該薬物分子、及び当該ペプチドリンカーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の形式：薬物分子－ペプチドリンカー－結合部分で配置されている、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0060】

第４２の実施形態では、本発明は、当該結合部分、ＣＤ３に結合する当該結合ドメイン、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する当該結合ドメイン、及び当該ペプチドリンカーが、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の形式：腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する結合ドメイン－ＣＤ３に結合する結合ドメイン－ペプチドリンカー－結合部分で配置されている、実施形態１～４１のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0061】

第４３の実施形態では、本発明は、哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する薬剤を更に含む、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0062】

第４４の実施形態では、本発明は、哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する当該薬剤が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する、実施形態４３の組換えタンパク質に関する。

【0063】

第４５の実施形態では、本発明は、哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する当該薬剤が、血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計されたアンキリン反復ドメインを含む、実施形態４４の組換えタンパク質に関する。

【0064】

第４６の実施形態では、本発明は、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号６５～６７及び（２）配列番号６５～６７のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態４５の組換えタンパク質に関する。更なる実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、約１００ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）でヒト血清アルブミンに結合する、実施形態４６の組換えタンパク質に関する。

【0065】

第４７の実施形態では、本発明は、哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する当該薬剤が、当該ペプチドリンカーの、当該結合部分と同じ側に位置する、実施形態４３～４６のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0066】

第４８の実施形態では、本発明は、当該結合部分及び哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する当該薬剤が、両方とも当該ペプチドリンカーのＣ末端側に位置する、実施形態４７の組換えタンパク質に関する。

【0067】

第４９の実施形態では、本発明は、哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する当該薬剤が、当該結合部分のＣ末端側に位置する、実施形態４３～４７のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0068】

第５０の実施形態では、本発明は、当該結合部分、ＣＤ３に結合する当該結合ドメイン、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する当該結合ドメイン、当該ペプチドリンカー、及び哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する当該薬剤が、Ｎ末端からＣ末端に向かって、以下の形式：腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を結合する結合ドメイン－ＣＤ３に結合する結合ドメイン－ペプチドリンカー－結合部分－哺乳動物における組換えタンパク質の血清半減期を延長する薬剤で配置されている、実施形態４３～４９のうちのいずれかの組換えタンパク質に関する。

【0069】

第５１の実施形態では、本発明は、先行実施形態のうちのいずれかの組換えタンパク質をコードする、核酸に関する。

【0070】

第５２の実施形態では、本発明は、実施形態５１の核酸分子を含む、宿主細胞に関する。

【0071】

第５３の実施形態では、本発明は、当該組換えタンパク質が発現される条件下で、実施形態５２の宿主細胞を培養することを含む、実施形態１～５０のいずれか１つの組換えタンパク質を作製する方法に関する。

【0072】

第５４の実施形態では、本発明は、当該宿主細胞が、原核宿主細胞である、実施形態５３の方法に関する。

【0073】

第５５の実施形態では、本発明は、当該宿主細胞が、真核宿主細胞である、実施形態５３の方法に関する。

【0074】

第５６の実施形態では、本発明は、実施形態１～５０のいずれか１つの組換えタンパク質又は実施形態５１の核酸を含み、薬学的に許容される担体又は賦形剤を追加的に含む、医薬組成物に関する。

【0075】

第５７の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、実施形態１～５０のいずれか１つの組換えタンパク質、実施形態５１の核酸、又は実施形態５６の医薬組成物に関する。

【0076】

第５８の実施形態では、本発明は、増殖性疾患の治療において使用するための、実施形態５７による使用のための組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物であって、任意選択で、当該増殖性疾患が、がんである、組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物に関する。

【0077】

第５９の実施形態では、本発明は、治療の方法であって、それを必要とする対象に、実施形態１～５０のいずれか１つの組換えタンパク質、実施形態５１の核酸、又は実施形態５６の医薬組成物を投与する工程を含む、治療の方法に関する。

【0078】

第６０の実施形態では、本発明は、当該方法が、増殖性疾患を治療する方法であり、任意選択で、当該増殖性疾患が、がんである、実施形態５９の方法に関する。

【0079】

第６１の実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化を必要とする対象におけるＴ細胞活性化の方法であって、実施形態１～５０のいずれか１つの組換えタンパク質、実施形態５１の核酸、又は実施形態５６の医薬組成物を当該対象に投与する工程を含む、方法に関する。

【0080】

第６２の実施形態では、本発明は、実施形態１～５０のいずれか１つの組換えタンパク質、実施形態５１の核酸、又は実施形態５６の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、インビボで活性薬物分子の放出を制御する方法に関する。

【0081】

第６３の実施形態では、本発明は、当該対象が、ヒトである、実施形態５９～６２のいずれか１つの方法に関する。

【0082】

第６４の実施形態では、本発明は、薬物分子の生物学的活性を制御する方法であって、実施形態１～６、１３～１８及び３８～４０のうちのいずれか１つに定義された結合部分を、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーを用いて、実施形態１９～３７のうちのいずれか１つに定義された薬物分子と接続して、組換えタンパク質を形成することと、当該組換えタンパク質を、それを必要とする患者に投与することと、を含み、当該プロテアーゼ切断部位が、腫瘍組織に存在するプロテアーゼによって認識される、方法に関する。

【0083】

第６５の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、当該薬物分子の生物学的標的への結合である、実施形態６４の方法に関する。

【0084】

第６６の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、実施形態６４の方法に関する。

【0085】

第６７の実施形態では、本発明は、薬物分子に対して結合特異性を有する結合部分であって、当該結合部分が、ペプチドリンカーによって当該薬物分子に接続されると、当該薬物分子の生物学的活性を阻害する、結合部分に関する。

【0086】

第６８の実施形態では、本発明は、当該結合部分の当該薬物分子への結合が、当該薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害する複合体を形成する、実施形態６７の結合部分に関する。

【0087】

第６９の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、当該薬物分子の抗イディオタイプ結合剤である、実施形態６７又は６８の結合部分に関する。

【0088】

第７０の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、当該薬物分子の生物学的標的への結合である、実施形態６７又は６９の結合部分に関する。

【0089】

第７１の実施形態では、本発明は、当該薬物分子の当該生物学的活性が、酵素活性である、実施形態６７～６９のうちのいずれかの結合部分に関する。

【0090】

第７２の実施形態では、本発明は、約１μＭ未満、例えば、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満の、当該薬物分子に対する結合親和性（Ｋ_D）を有する、実施形態６７～７１のいずれか１つの結合部分に関する。

【0091】

第７３の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、約１μＭ～約１０ｐＭ、例えば、約１μＭ～約１０ｐＭ、約１μＭ～約２０ｐＭ、約１μＭ～約５０ｐＭ、又は約１μＭ～約１００ｐＭの解離定数（Ｋ_D）で当該薬物分子を結合する、実施形態６７～７２のいずれか１つの結合部分に関する。

【0092】

第７４の実施形態では、本発明は、当該解離定数（Ｋ_D）が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で測定される、実施形態７２又は７３の結合部分に関する。

【0093】

第７５の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、抗体、代替足場、又はポリペプチドを含む、実施形態６７～７４のいずれか１つの結合部分に関する。

【0094】

第７６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、免疫グロブリン分子又はその断片を含む、実施形態６７～７５のいずれか１つの結合部分に関する。

【0095】

第７７の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、非免疫グロブリン分子を含む、実施形態６７～７６のいずれか１つの結合部分に関する。

【0096】

第７８の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、単一ドメイン抗体、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、又は可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来する抗原結合ドメインを含む、実施形態６７～７７のいずれか１つの結合部分に関する。

【0097】

第７９の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、アドネクチン、モノボディー、アフィボディー、アフィリン、アフィマー、アプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、反復タンパク質ドメイン、アルマジロ反復ドメイン、アトリマー、アビマー、アンキリン反復ドメイン、フィノマー、ノッチン、クニッツドメイン、又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来するか又はそれに関連する抗原結合ドメインを含む、実施形態６７～７８のいずれか１つの結合部分に関する。

【0098】

第８０の実施形態では、本発明は、当該結合部分が、設計されたアンキリン反復ドメインを含む、実施形態６７～７９のいずれか１つの結合部分に関する。

【0099】

第８１の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が他のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、実施形態８０の結合部分に関する。

【0100】

第８２の実施形態では、本発明は、当該設計されたアンキリン反復ドメインが、（１）配列番号１～１２及び（２）配列番号１～１２のうちのいずれかとの少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態８０又は８１の結合部分に関する。

【0101】

第８３の実施形態では、本発明は、実施形態６７～８２のうちのいずれかの結合部分をコードする、核酸に関する。

【0102】

第８４の実施形態では、本発明は、実施形態８０～８２のいずれかの設計されたアンキリン反復ドメインをコードする、核酸に関する。

【0103】

第８５の実施形態では、本発明は、実施形態８３又は８４の核酸分子を含む、宿主細胞に関する。

【0104】

第８６の実施形態では、本発明は、当該結合部分が発現される条件下で、実施形態８５に記載の宿主細胞を培養することを含む、実施形態６７～８２のいずれか１つの結合部分を作製する方法に関する。

【0105】

第８７の実施形態では、本発明は、当該宿主細胞が、原核宿主細胞である、実施形態８６の方法に関する。

【0106】

第８８の実施形態では、本発明は、当該宿主細胞が、真核宿主細胞である、実施形態８６の方法に関する。

【0107】

第８９の実施形態では、本発明は、実施形態６７～８２のいずれか１つの結合部分、又は実施形態８３若しくは８４の核酸を含み、薬学的に許容される担体又は賦形剤を追加的に含む、医薬組成物に関する。

【0108】

第９０の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、実施形態６７～８２のうちのいずれか１つの結合部分、実施形態８３若しくは８４の核酸、又は実施形態８９の医薬組成物に関する。

【0109】

第９１の実施形態では、本発明は、治療の方法であって、それを必要とする対象に、実施形態６７～８２のいずれか１つの結合部分、実施形態８３若しくは８４の核酸、又は実施形態８９の医薬組成物を投与する工程を含む、治療の方法に関する。

【図面の簡単な説明】

【0110】

【図1】条件付きで活性化可能なプロドラッグアプローチのグラフ図。プロドラッグは、（１）薬物分子（図示された例では、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合ドメイン（α－ＴＡＡ）及びＣＤ３結合ドメイン（α－ＣＤ３）を含む）と、（２）薬物分子に可逆的に結合することができ、結合されると、薬物分子の生物学的活性を阻害する結合部分（図示された例では、α－ＣＤ３のパラトープに対する抗イディオタイプ結合ドメイン（結合剤））と、（３）任意選択で、半減期延長部分（図示された例では、インタクトなプロドラッグ分子の半減期延長のためのＨＳＡ結合ドメイン（α－ＨＳＡ））と、を含む。薬物分子と結合部分との間のリンカー（図示された例では、α－ＣＤ３と結合剤との間のリンカー）は、プロテアーゼによって（図示された例では、腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に存在する１つ以上のプロテアーゼによって）切断可能なペプチドリンカーを含む。プロドラッグ分子（図示された例では、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＴＣＥプロドラッグ（ＣＤ３－ＰＤＤ））は、薬物分子のその標的への結合（図示された例では、α－ＣＤ３を介したＴ細胞への結合）が共有結合した結合部分（図示された例では、結合剤）によって阻害されるので、循環への注入時には不活性である。薬物分子の標的組織（図示された例では、腫瘍組織）に到達すると、薬物分子と結合部分との間のペプチドリンカー（図示された例では、α－ＣＤ３と結合剤との間のペプチドリンカー）は、標的組織中に存在するプロテアーゼ（図示された例では、１つ以上の腫瘍関連プロテアーゼ）によって切断される。ペプチドリンカーが切断されると、結合部分は薬物分子から離れて拡散し、薬物分子はその生物学的活性を発揮することができる（図示した例では、そのα－ＴＡＡアームを介して腫瘍細胞上のＴＡＡに結合し、そのα－ＣＤ３アームを介してＴ細胞上のＣＤ３に結合し、Ｔ細胞媒介性死滅を引き起こす）。

【図2】室温での表面プラズモン共鳴（ＲＵ）によって決定した、５つの異なるＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１３～１７）（上）に対する４つの異なる結合部分（結合剤＃１～結合剤＃４；配列番号１～４、実施例１を参照されたい）の親和性（Ｋ_D（単位：ｎＭ））。Ｋ_D値（単位：ｎＭ）を、リガンドとしてビオチン化結合剤及び分析物としてＣＤ３特異的結合ドメインを使用することによって決定した。親結合剤＃１（配列番号１）が、５つの異なるＣＤ３結合ドメインに対して最も高い親和性を示し、続いて結合剤＃４（配列番号４）、２つの低親和性結合部分結合剤＃２（配列番号２）、及び結合剤＃３（配列番号３）の順で高い親和性を示した。

【図3】１人の代表的なドナー（３人のドナーのうち）からのＨＣＴ１１６腫瘍細胞及び汎Ｔ細胞を使用し、２つの異なる抗ＣＤ３結合ドメインを有する活性ＴＣＥ構築物（ＣＤ３に対してより低い親和性を有するＣ７ｖ１１９（配列番号１５）又はＣＤ３に対してより高い親和性を有するＣ７ｖ１２２（配列番号１６））を、それらの対応する切断不可能なＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ＣＤ３－プロドラッグ（ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ）対応物（すなわち、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーの代わりに切断不可能なペプチドリンカーを含む）と比較する標準的な腫瘍細胞死滅アッセイ。Ａ）切断不可能なリンカーを介してＣＤ３結合ドメインに連結された、活性ＴＣＥ（白四角）、結合剤＃３（配列番号３）を含むＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（下向きの白三角）、又は結合剤＃４（配列番号４）を含むＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（上向きの白三角）のいずれかを使用した、ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９の状況における汎Ｔ細胞によるＨＣＴ１１６腫瘍細胞のＴ細胞媒介性死滅。ＣＤ３結合ドメインに対してより高い親和性を有する結合剤＃４（図２を参照されたい）は、より低い親和性の結合剤＃３より高いマスキング効率を示す。ＢＡ）と同じ実験設定であるが、活性ＴＣＥ（黒四角）又はＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（上向き及び下向きの黒三角）を使用するＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１２２の状況である。Ｃ７ｖ１２２ ＣＤ３結合ドメインの状況における結合剤＃３及び＃４のマスキング効率は、図２に示される親和性と一致して、Ａ）に示される構築物よりも高い。

【図4】細胞当たり約２００ｋの抗原結合部位（antigen binding site、ＡＢＳ）を有するＥＧＦＲ高発現Ａ４３１腫瘍細胞（ＥＧＦＲ⁺⁺⁺）及び約２０ｋのＡＢＳ／細胞を有するＥＧＦＲ中発現ＨＣＴ１１６腫瘍細胞（ＥＧＦＲ⁺）を使用した、活性ＴＣＥ（Ｃ７ｖ１４ ＣＤ３結合ドメイン（配列番号１３）を含む）及びＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（Ｃ７ｖ１４ ＣＤ３結合ドメイン（配列番号１３）及び結合剤＃３（配列番号３）を含む）を用いた標準的なＴ細胞活性化アッセイ。活性ＴＣＥと比較したＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬのマスキング効率は、ＥＧＦＲ⁺⁺⁺Ａ４３１腫瘍細胞（黒三角対黒四角）と比較して、ＥＧＦＲ⁺ＨＣＴ１１６細胞（白三角対白四角）についてはるかに高い。

【図5】ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（三角）、並びにマトリプターゼの添加なし（ゲルの左部分）及びマトリプターゼの添加及び３７℃で２４時間のインキュベーション後（ゲルの右側）の異なる切断可能なリンカー（ＣＬ、それぞれ黒色及び灰色の円）を含む２つのＣＤ３－ＰＤＤ。切断不可能なリンカーを有するＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬは、マトリプターゼの添加によって影響を受けないが、２つのＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは、活性ＴＣＥ（２つのドメイン；２Ｄ）及び結合剤（１つのドメイン；１Ｄ）に実質的に完全に切断される。完全長３ドメインＣＤ３－ＰＤＤ（３Ｄ）、２ドメイン活性ＴＣＥ（２Ｄ）及び１ドメイン切断結合剤（１Ｄ）のバンドを示す。

【図6】切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ及び切断可能なリンカー配列が異なる３つの異なる切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬの切断速度。３７℃で、５つの異なる組換え腫瘍関連プロテアーゼ（マトリプターゼ、ウロキナーゼ、マトリックスメタロプロテイナーゼ－２（ＭＭＰ－２）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－７（ＭＭＰ－７）、マトリックスメタロプロテイナーゼ－９（ＭＭＰ－９）について、２．５μＭの基質濃度で切断速度を調べ、切断速度（１／分）として示す。

【図7】標的細胞としてのＨＣＴ１１６野生型（ｗｔ）又はＨＣＴ１１６ ＥＧＦＲノックアウト（ＫＯ）細胞に対する、活性ＴＣＥ（四角）、切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（三角）及び切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ（丸）を使用した標準的な腫瘍細胞死滅（Ａ）及びＴ細胞活性化（Ｂ）アッセイ法。強力な腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化が、ＨＣＴ１１６ ｗｔ細胞上の活性ＴＣＥについて観察され、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬについては、おそらくＨＣＴ１１６細胞によって分泌されるプロテアーゼによるＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬの切断に起因して、より少ない程度で観察される（図７を参照されたい）。切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬは、ＨＣＴ１１６ ｗｔ細胞による腫瘍細胞死滅又はＴ細胞活性化を示さない。ＴＡＡ（ＨＣＴ１１６ ＫＯ細胞）の非存在下では、腫瘍細胞死滅又はＴ細胞活性化は、構築物のうちのいずれについても観察することができなかった。

【図8】汎Ｔ細胞及びＡ４３１腫瘍細胞を使用したＴ細胞活性化アッセイ（４８時間）の終了時の切断不可能な及び切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ（２つの異なる切断可能なリンカー＃２及び＃３、図６も参照されたい）試料の免疫沈降－ウエスタンブロット。最も高い濃度の化合物（１０ｎＭ）を含む試料を免疫沈降させ、抗ＤＡＲＰｉｎ抗体による検出を用いてウエスタンブロット上で可視化した。ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬは、アッセイの終了時に切断を示さなかったが、２つの異なる切断可能な構築物は、異なる程度の切断を呈し、これは、左のグラフに示される２つの構築物のそれぞれのＴ細胞活性化マスキングウィンドウにほぼ対応する。

【図9】汎Ｔ細胞及びＨＣＴ１１６腫瘍細胞を使用する標準的な腫瘍細胞死滅アッセイによって決定される、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬのＣ末端に連結されたα－ＨＳＡ結合ドメインのマスキング効率に対する効果。活性ＴＣＥ（四角）とＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（三角）又は半減期延長（half-life extended、ＨＬＥ）ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（菱形）との間のマスキング効率は、図Ａ）に示す構築物においてほとんど変化していない。この図は、ＣＤ３結合ドメインに対して高い親和性を呈す（＜１ｎＭのＫ_D）結合剤＃１（配列番号１）を含むＣＤ３－ＰＤＤ構築物を示す。Ｂ）低親和性結合剤＃３（配列番号３）（＞１００ｎＭのＫ_D）を含む構築物は、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬのＣ末端へのα－ＨＳＡ結合ドメインの付加に際してマスキング効率のわずかな低下を示す。

【図10】インビボ実験に利用された構築物の腫瘍細胞結合（ＨＣＴ１１６細胞）、Ｔ細胞結合（Ｊｕｒｋａｔ細胞）、Ｔ細胞活性化、及び腫瘍細胞死滅のインビトロデータ（ＨＣＴ１１６細胞及び汎Ｔ細胞）（図１１に示す）。ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９（配列番号１５）（ＣＤ３に対する親和性がより低い）又はＣ７ｖ１２２（配列番号１６）（ＣＤ３に対する親和性がより高い）のいずれかを含む、活性ＴＣＥ（四角）、切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（三角）、切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ（丸）、及び切断前ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ（半黒丸）についてデータを生成した。全てのＣＤ３－ＰＤＤ構築物について、結合剤＃４（配列番号４）を使用して、ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９又はＣ７ｖ１２２をマスクした。切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬについてのＴ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅は、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬと比較してマスキングの低減を示し、これは、腫瘍細胞によって分泌されるプロテアーゼによる構築物の切断によるものである（図８を参照されたい）。示される活性化及び死滅データは、３人の個々のヒトドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて３回実行された代表的な実験である。

【図11-1】ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を生着させたヒト化マウスモデル（ヒト臍帯血由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋）を用いてヒト化）における活性ＴＣＥ、切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ、及び切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬのインビボ実験。構築物のＥＧＦＲ結合ドメインはヒト－マウス交差反応性であり、ｈＨＳＣヒト化マウスにおいて強い毒性を誘発することが示されたので、抗腫瘍有効性及び安全性の読み出しの両方についてモデルを選択した。Ａ）強い毒性所見に起因して毎日（ビヒクル対照、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ及びＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ）又は断続的に（活性ＴＣＥ）処置した各６匹のマウスを用いた４つの群の研究設計。全ての構築物は、半減期が延長されていない。Ｂ）４つの群についての平均腫瘍成長曲線であり、各群について、処置を黒い矢印で上部に示す。エラーバーは、強い毒性のために２匹のマウスが１２日目に失われ、１匹のマウスが１３日目に失われた群＃２（活性ＴＣＥ）を除いて、ｎ＝６でのＳＥＭ値を示す。Ｃ）４つの群の個々の腫瘍成長曲線であり、処置を各グラフの上に黒い矢印で示す。Ｄ）最初の注射の前日における各群の平均ＢＷを１００％に設定した、実験の過程にわたる体重（ＢＷ）変化。各群についての処置、並びに処置の開始及び終了をグラフの上部に示す。ハッシュ記号は、死亡したか、又は臨床スコアが悪いため人道的理由で屠殺しなければならなかった動物を示す。Ｅ）各群の平均臨床健康スコア（実験者によって観察された異なる臨床徴候のスコアリング）であり、各群の処置をグラフの上部に矢印で示す。より色の濃いフィールドは、より重度の（すなわち、より悪い）臨床健康スコアを示す。Ｆ）腫瘍細胞生着前（投薬前／基礎）及び最初の処置の４時間後のヒトサイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＩＬ－６）。サイトカインレベルの上昇は、活性ＴＣＥについてのみ観察されたが、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ及びＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは両方とも、サイトカインレベルの有意な上昇を示さなかった。各処置群をビヒクル対照と比較した（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

【図11-2】ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を生着させたヒト化マウスモデル（ヒト臍帯血由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋）を用いてヒト化）における活性ＴＣＥ、切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ、及び切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬのインビボ実験。構築物のＥＧＦＲ結合ドメインはヒト－マウス交差反応性であり、ｈＨＳＣヒト化マウスにおいて強い毒性を誘発することが示されたので、抗腫瘍有効性及び安全性の読み出しの両方についてモデルを選択した。Ａ）強い毒性所見に起因して毎日（ビヒクル対照、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ及びＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ）又は断続的に（活性ＴＣＥ）処置した各６匹のマウスを用いた４つの群の研究設計。全ての構築物は、半減期が延長されていない。Ｂ）４つの群についての平均腫瘍成長曲線であり、各群について、処置を黒い矢印で上部に示す。エラーバーは、強い毒性のために２匹のマウスが１２日目に失われ、１匹のマウスが１３日目に失われた群＃２（活性ＴＣＥ）を除いて、ｎ＝６でのＳＥＭ値を示す。Ｃ）４つの群の個々の腫瘍成長曲線であり、処置を各グラフの上に黒い矢印で示す。Ｄ）最初の注射の前日における各群の平均ＢＷを１００％に設定した、実験の過程にわたる体重（ＢＷ）変化。各群についての処置、並びに処置の開始及び終了をグラフの上部に示す。ハッシュ記号は、死亡したか、又は臨床スコアが悪いため人道的理由で屠殺しなければならなかった動物を示す。Ｅ）各群の平均臨床健康スコア（実験者によって観察された異なる臨床徴候のスコアリング）であり、各群の処置をグラフの上部に矢印で示す。より色の濃いフィールドは、より重度の（すなわち、より悪い）臨床健康スコアを示す。Ｆ）腫瘍細胞生着前（投薬前／基礎）及び最初の処置の４時間後のヒトサイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＩＬ－６）。サイトカインレベルの上昇は、活性ＴＣＥについてのみ観察されたが、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ及びＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは両方とも、サイトカインレベルの有意な上昇を示さなかった。各処置群をビヒクル対照と比較した（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

【図11-3】ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を生着させたヒト化マウスモデル（ヒト臍帯血由来の造血幹細胞（ＣＤ３４＋）を用いてヒト化）における活性ＴＣＥ、切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ、及び切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬのインビボ実験。構築物のＥＧＦＲ結合ドメインはヒト－マウス交差反応性であり、ｈＨＳＣヒト化マウスにおいて強い毒性を誘発することが示されたので、抗腫瘍有効性及び安全性の読み出しの両方についてモデルを選択した。Ａ）強い毒性所見に起因して毎日（ビヒクル対照、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ及びＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ）又は断続的に（活性ＴＣＥ）処置した各６匹のマウスを用いた４つの群の研究設計。全ての構築物は、半減期が延長されていない。Ｂ）４つの群についての平均腫瘍成長曲線であり、各群について、処置を黒い矢印で上部に示す。エラーバーは、強い毒性のために２匹のマウスが１２日目に失われ、１匹のマウスが１３日目に失われた群＃２（活性ＴＣＥ）を除いて、ｎ＝６でのＳＥＭ値を示す。Ｃ）４つの群の個々の腫瘍成長曲線であり、処置を各グラフの上に黒い矢印で示す。Ｄ）最初の注射の前日における各群の平均ＢＷを１００％に設定した、実験の過程にわたる体重（ＢＷ）変化。各群についての処置、並びに処置の開始及び終了をグラフの上部に示す。ハッシュ記号は、死亡したか、又は臨床スコアが悪いため人道的理由で屠殺しなければならなかった動物を示す。Ｅ）各群の平均臨床健康スコア（実験者によって観察された異なる臨床徴候のスコアリング）であり、各群の処置をグラフの上部に矢印で示す。より色の濃いフィールドは、より重度の（すなわち、より悪い）臨床健康スコアを示す。Ｆ）腫瘍細胞生着前（投薬前／基礎）及び最初の処置の４時間後のヒトサイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２、及びＩＬ－６）。サイトカインレベルの上昇は、活性ＴＣＥについてのみ観察されたが、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ及びＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは両方とも、サイトカインレベルの有意な上昇を示さなかった。各処置群をビヒクル対照と比較した（＊＊＊、ｐ＜０．００１）。

【発明を実施するための形態】

【0111】

概要
本出願は、プロテアーゼ切断可能なペプチドリンカーによって結合剤に接続された薬物分子を含むプロドラッグであって、薬物分子の生物学的活性を可逆的に阻害するプロドラッグ、及び阻害性結合剤自体に関する。本明細書に記載される組換えタンパク質をコードする核酸、及び当該組換えタンパク質を作製する方法、並びに治療の方法及び組換えタンパク質の医学的使用も記載される。

【0112】

本発明のプロテアーゼ切断可能なプロドラッグは、プロテアーゼ切断可能なリンカーによって連結された結合部分（例えば、抗イディオタイプ結合部分）及び薬物分子を含む。結合部分は、薬物分子に可逆的に結合し、結合されると、薬物分子の生物学的活性を阻害する。インビボ投与の際に、プロテアーゼ（例えば、腫瘍組織に存在するプロテアーゼ）は、結合部分と薬物分子との間のリンカーを切断し、薬物分子を体内に放出する（図１を参照されたい）。投与時に活性薬物分子を条件付きで放出することによって、そうでなければ薬物分子に関連する有害作用又はそのリスクを最小限に抑えることができる。

【0113】

理論に束縛されることを望むものではないが、本明細書に記載の結合部分は、薬物分子に結合されると（例えば、結合部分がペプチドリンカーによって薬物分子に接続されると）、その生物活性（すなわち、作用機序）を阻害することが理解される。患者に投与されると、腫瘍組織に存在するプロテアーゼなどのプロテアーゼは、結合部分と薬物分子との間のペプチドリンカーを切断することができ、薬物分子からの結合部分の解離及び拡散による活性薬物分子の放出をもたらす。

【0114】

本発明は、プロテアーゼ切断可能なリンカーによって接続された薬物分子及び結合部分を含む組換えタンパク質、並びに結合部分自体に関する。

【0115】

本発明は更に、当該プロドラッグを含む医薬組成物及び療法における当該組成物の使用に関する。例えば、本発明は、がんなどの増殖性疾患の治療における、そのような組成物の使用に関する。

【0116】

本発明は更に、当該結合部分をコードする核酸、及び宿主細胞を用いてこれらを作製する方法に関する。

【0117】

定義
本明細書で別途定義されない限り、本発明に関連して使用される科学的及び技術的用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学の技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

【0118】

用語「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有／収容する（containing）」は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様で、ある特徴について、「～を含む」と説明されている場合、実施形態では、その特徴について「～からなる」又は「～から本質的になる」も考えられる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲に制限を課さない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例以外、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、用語「約」が当業者によって解釈されるように、その用語によって修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の数値の±１０％に相当する。

【0119】

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0120】

本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。

【0121】

用語「薬物分子」（用語「薬物」と本明細書で相互交換可能に使用される）は、ポリペプチド又はタンパク質を含む治療剤を指し、当該ポリペプチド又はタンパク質は、結合部分によって結合することができる部位を含有する。本発明で使用するのに好ましい薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー又はＴＣＥ薬物分子である。

【0122】

組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって産生される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。組換えポリペプチド又は組換えタンパク質はまた、他の核酸分子（例えば、当該ポリペプチド又はタンパク質をコードするｍＲＮＡ）から発現され得る。

【0123】

本発明の文脈において、用語「結合部分」又は「結合剤」は、ポリペプチド又はタンパク質を含む結合剤を指し、当該ポリペプチド又はタンパク質は、薬物分子に非共有結合することができる。結合部分は、必ずしも薬物分子の活性部位に結合する必要はない。しかしながら、結合部分は、薬物の作用機序を阻害するような様式で結合する必要がある。これは、薬物の活性部位に結合することによるものであってもよいが、薬物分子上の別の部位に結合して、当該薬物の立体構造を変化させる（すなわち、アロステリック阻害）か、又は薬物分子の活性部位の立体障害になることによるものであってもよい。薬物分子の活性部位は、薬物分子の生物学的活性に関与する。生物学的活性は、酵素活性又は生物学的標的への結合であり得る。薬物分子への結合部分の結合は、薬物分子の生物学的活性を阻害する。例えば、薬物分子への結合部分の結合は、薬物分子の酵素活性を阻害するか、又は生物学的標的への薬物分子の結合を阻害する。薬物分子への結合部分の結合は、抗イディオタイプであってもよい。したがって、結合部分は、薬物分子の抗イディオタイプ結合剤であってもよい。

【0124】

本発明において使用される結合部分は、抗体、代替足場、及びポリペプチドを含む。本明細書で使用される場合、用語「抗体」は、免疫系が外来抗原を検出するときに典型的に生成されるものなどのインタクトな抗体分子だけでなく、抗原結合能力を保持する抗体分子の任意の断片、バリアント及び合成又は操作された類似体も指す。そのような断片及びバリアントもまた、当該技術分野で周知であり、インビトロ及びインビボの両方で正しく使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などの抗体断片、及び単鎖Ｖ領域断片（ｓｃＦｖ）、二重特異性又は多重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、抗体融合タンパク質、非従来型抗体、並びに免疫グロブリン分子由来の抗原結合ドメインを含むタンパク質を包含する。本明細書で使用される場合、用語「代替足場」は、タンパク質を含むか、又はタンパク質からなるが、抗体ではない任意の分子を指す。

【0125】

これらの異なる構造型のうちのいずれかの結合部分は、薬物分子に結合することができ、結合されると、薬物分子の作用様式を阻害する。好ましい一実施形態では、結合部分は、薬物分子に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。別の好ましい実施形態では、結合部分は、薬物分子に対して結合特異性を有する抗体を含む。別の好ましい実施形態では、結合部分は、薬物分子に対して結合特異性を有する代替足場を含み、代替足場は、アンキリン反復ドメインを含まない。好ましい一実施形態では、薬物分子は、抗体を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該抗体に対して結合特異性を有する抗イディオタイプ抗体である。別の好ましい実施形態では、薬物分子は、抗体を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該抗体に対して結合特異性を有する、例えばアンキリン反復ドメインなどの抗イディオタイプ代替足場である。別の好ましい実施形態では、薬物分子は、例えばアンキリン反復ドメインなどの代替足場を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該代替足場に対して結合特異性を有する抗イディオタイプ抗体である。別の好ましい実施形態では、薬物分子は、例えばアンキリン反復ドメインなどの代替足場を含み、結合部分は、当該薬物分子に含まれる当該代替足場に対して結合特異性を有する、例えばアンキリン反復ドメインなどの抗イディオタイプ代替足場である。

【0126】

用語「核酸」又は「核酸分子」は、リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）分子又は一本鎖若しくは二本鎖のいずれかのデオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）分子であることができるポリヌクレオチド分子を指し、ＤＮＡ又はＲＮＡの修飾形態及び人工形態を含む。核酸分子は、単離された形態で存在するか、又は組換え核酸分子若しくはベクターに含まれているかのいずれかであることができる。

【0127】

用語「生物学的標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。いくつかの実施形態では、生物学的標的は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）細胞、又は別のタイプの免疫細胞などの免疫細胞である。いくつかの他の実施形態では、生物学的標的は、腫瘍細胞である。

【0128】

本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。

【0129】

特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、当該反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインはまた、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールも含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２，４８９－５０３，２００３；Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１２／０６９６５５号）、高ロイシン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７－５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。

【0130】

用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリン反復モジュールを含む反復ドメインを指す。アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインとともに、より大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１６／１５６５９６号、国際公開第２０１８／０５４９７１号を参照されたい）。

【0131】

設計されたアンキリン反復タンパク質及び設計されたアンキリン反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工のものであり、自然界では生じないという特性を指す。本明細書に記載の設計された反復タンパク質は、少なくとも１つの設計された反復ドメインを含む。好ましくは、設計された反復ドメインは、設計されたアンキリン反復ドメインである。

【0132】

用語「標的相互作用残基」は、薬物分子との直接相互作用に寄与する結合部分のアミノ酸残基を指す。例えば、結合部分が設計されたアンキリン反復ドメインである場合、用語「標的相互作用残基」は、薬物分子との直接相互作用に寄与する設計されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸残基を指す。

【0133】

用語「フレームワーク残基」又は「フレームワーク位置」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、当該反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくはβ－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。

【0134】

用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位に由来する、設計された反復ドメインの反復アミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、好ましくは、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、標的上で選択された反復ドメインから得られた、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。

【0135】

したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。設計されたアンキリン反復タンパク質は、以前に記載されており、例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号、同第２０１０／０６０７４８号、同第２０１１／１３５０６７号、同第２０１２／０６９６５４号、同第２０１２／０６９６５５号、同第２０１４／００１４４２号、同第２０１４／１９１５７４号、同第２０１４／０８３２０８号、同第２０１６／１５６５９６号、及び同第２０１８／０５４９７１号を参照されたく、これらは全て、その全体が参照により組み込まれる。典型的には、アンキリン反復モジュールは、ループによって分離された２つのアルファヘリックスを形成する約３１～３３個のアミノ酸残基を含む。

【0136】

反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（本明細書で相互交換可能に使用される「非ランダム化された位置」又は「固定された位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化された位置」）を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。

【0137】

用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。

【0138】

用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は、複数のコピーに見出され、タンパク質の折り畳みを決定する全ての当該モチーフに共通の定義された折り畳みトポロジーを呈す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富むバリアント反復単位が挙げられる。

【0139】

結合部分は、代替標的（例えば、細胞又は物質）の場合よりも、特定の薬物分子とより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、より高い親和性及び／又はより高い親和力で反応又は会合する場合、薬物分子に「特異的に結合する」又は「優先的に結合する」（本明細書で互換的に使用される）。結合部分は、所与のセットの条件下で、適切な薬物分子への結合を代替の薬物分子への結合と比較することによって、結合の特異性について試験され得る。いくつかの実施形態では、結合分子が、代替の薬物分子に対するよりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、又は少なくとも１０００倍高い親和性で適切な薬物分子に結合する場合、それは特異的であるとみなされる。また、この定義を読むことにより、例えば、第１の薬物分子に特異的又は優先的に結合する結合部分が、第２の薬物分子に特異的又は優先的に結合してもしなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的な結合を必ずしも必要としない（しかし、それを含むことができる）。概して、結合部分は、指定されたアッセイ条件下で特定の薬物分子に優先的に結合し、試験試料中に存在する他の成分に有意な量で結合しない。

【0140】

様々なアッセイ形式を使用して、目的の薬物分子に特異的に結合する結合部分を選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及びウエスタンブロット分析は、標的薬物分子に特異的に結合する結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的結合は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル又はノイズ、より典型的には１０倍超のバックグラウンドシグナルである。より具体的には、結合部分は、平衡解離定数（Ｋ_D）値が＜１μＭ、例えば、＜５００ｎＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜１００ｐＭ、又は＜１０ｐＭである場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。

【0141】

結合親和性を測定する様々な方法は、技術分野で周知であり、それらのいずれも、本発明の目的のために使用することができる。例えば、本明細書に例示されるように、薬物分子標的に対する特定の結合部分の結合親和性は、Ｋ_D値として表すことができ、これは、結合部分及び薬物分子標的の解離定数を指す。Ｋ_Dは、「オフレート（ｋ_off）」とも呼ばれる解離速度と、会合速度又は「オンレート（ｋ_on）」との比率である。したがって、Ｋ_DはＫ_off／Ｋ_onに等しく、モル濃度（Ｍ）として表され、Ｋ_Dが小さいほど、結合の親和性が強くなる。

【0142】

Ｋ_D値は、任意の適切な方法を使用して決定することができる。Ｋ_Dを測定するための１つの例示的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１５ Ｍａｙ ５；１５（５）：１０４８１－５１０を参照されたい）。Ｋ_D値は、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用するＳＰＲによって測定されてもよい。ＢＩＡｃｏｒｅ動的分析は、例えば、それらの表面上の固定化分子（例えば、エピトープ結合ドメインを含む分子）を有するチップからの抗原の結合及び解離を分析することを含む。タンパク質のＫ_Dを決定するための別の方法は、Ｂｉｏ－Ｌａｙｅｒ Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｍｅｔｒｙを使用することである（例えば、Ｓｈａｈ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１４；（８４）：５１３８３を参照されたい）。Ｋ_D値は、ＯＣＴＥＴ（登録商標）テクノロジー（Ｏｃｔｅｔ ＱＫｅ ｓｙｓｔｅｍ、ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して測定することができる。代替的に又は追加的に、Ｓａｐｉｄｙｎｅ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（動的排除アッセイ）アッセイを使用することもできる。２つの結合パートナー間の結合親和性を評価するのに好適な任意の方法が本明細書に包含される。表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）が特に好ましい。最も好ましくは、Ｋ_D値は、ＰＢＳ中及びＳＰＲによって決定される。

【0143】

用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。

【0144】

用語「治療する」、並びにそれに関連する単語は、必ずしも１００％又は完全な治癒を意味するものではない。むしろ、当業者が潜在的な利益又は治療効果を有するものとして認識する治療の程度は様々である。この点で、本明細書に記載の治療方法及び医薬使用は、任意の量又は任意のレベルの治療を提供することができる。更に、本開示の方法によって提供される治療は、１つ又は複数の病態又は症状の治療（すなわち、緩和する）を含むことができる。例示的な態様では、本発明は、患者へのプロドラッグ分子の投与を含む、プロドラッグ分子による治療の方法であって、患者が体験する有害作用又はそのリスクが、同量の薬物分子がプロドラッグの形態（すなわち、プロテアーゼ切断可能なリンカーによって本発明の結合部分に接続されていない）で投与された場合に患者が体験する有害作用又はそのリスクと比較して低減される、治療の方法を提供する。したがって、プロドラッグ分子を形成するための、本発明の結合部分の使用は、低減された有害作用若しくは低減されたそのリスクを伴う治療方法、及び／又はより高用量の薬物分子若しくは短期間にわたる薬物分子の投与を伴う、治療方法を可能にする。

【0145】

任意の所与の疾患又は状態における治療応答は、その疾患又は状態に特異的な標準化された応答基準によって決定することができる。療法を受けている対象は、治療剤の投与に関連する有害作用又はそのリスクの低減とともに、疾患に関連する症状の改善という有益な効果を体験し得る。

【0146】

本明細書で使用される場合、用語「増殖性疾患」は、細胞の過剰産生を特徴とする疾患を指す。増殖性疾患の例としては、がん、アテローム性動脈硬化症、関節リウマチ、乾癬、特発性肺線維症、強皮症及び肝硬変が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、増殖性疾患は、がんである。

【0147】

結合部分
本明細書に記載の結合部分は、薬物分子に特異的に結合することができる、様々な異なる構造を有するポリペプチド又はタンパク質である。本発明で使用するための結合部分は、抗体、代替足場、及びポリペプチドを含む。

【0148】

抗体は、抗体又は免疫グロブリン分子に由来する抗原結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を含む。抗原結合ドメインは、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び例えば、ヒト又はラクダ科動物起源の可変ドメイン（ＶＨＨ）に由来し得る。いくつかの例では、抗原結合ドメインが、結合部分が最終的に使用されるのと同じ種に由来することが有益である。例えば、ヒトにおける使用のために、本明細書に記載の結合部分の抗原結合ドメインが、ヒト又はヒト化抗原結合ドメインを含むことは有益であり得る。抗体は、当該技術分野で周知の技術を用いて得ることができる。

【0149】

一実施形態では、結合部分は、ラクダ科ナノボディーである。ラクダ科ナノボディー（ラクダ科単一ドメイン抗体又はＶＨＨとしても知られる）は、ラマ、ラクダ、及びアルパカなどの哺乳動物のラクダ科に由来する。他の抗体とは異なり、ラクダ科抗体は軽鎖を欠き、２つの同一の重鎖から構成される。ラクダ科抗体は、典型的には、約１５ｋＤａの領域の比較的低い分子量を有する。

【0150】

一実施形態では、結合部分は、サメ抗体ドメインである。ラクダ科ナノボディーと同様に、サメ抗体ドメインも軽鎖を欠いている。

【0151】

抗原（薬物分子など）に結合することができ、抗体又は免疫グロブリン分子に由来しない結合ドメインを含む任意のポリペプチド又はタンパク質を、代替足場は含む。代替足場の結合ドメインは、様々な異なるポリペプチド又はタンパク質構造を含んでもよく、又はそれに由来してもよい。代替足場としては、アドネクチン（モノボディー）、アフィボディー、アフィリン、アフィマー及びアプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アルマジロ反復タンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、アンキリン反復タンパク質ベースの足場（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質）、フィノマー、ノッチン、及びクニッツドメインペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。代替足場は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ）．２０１７ Ｊｕｎｅ １２；１０（１）：２９３－３２０．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖａｎｃｈｅｍ－０６１５１６－０４５２０５に記載されている。

【0152】

アドネクチンは、元々はヒトフィブロネクチンＩＩＩ型タンパク質型タンパク質（１０Ｆｎ３）の１０番目の細胞外ドメインに由来する。フィブロネクチンＩＩＩ型ドメインは、７又は８個のβ鎖を有し、これらは２つのβシートの間に分布しており、βシート自体が互いにパッキングしてタンパク質のコアを形成し、更にループ（ＣＤＲに類似）を含み、ループはベータ鎖を互いに接続し、溶媒が露出している。βシートサンドイッチの各縁部には少なくとも３つのそのようなループが存在し、縁部は、β鎖の方向に垂直なタンパク質の境界である（米国特許第６，８１８，４１８号を参照されたい）。この構造のために、この非抗体足場は、抗体の抗原結合特性の性質及び親和性に類似した抗原結合特性を模倣する。これらの足場は、インビボでの抗体の親和性成熟のプロセスに類似するインビトロでのループ無作為化及びシャッフリング手法において使用することができる。

【0153】

アフィボディー親和性リガンドは、細菌Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ由来の表面タンパク質であるプロテインＡのＩｇＧ結合ドメインのうちの１つの足場に基づく３ヘリックスバンドルから構成される。この足場ドメインは５８個のアミノ酸からなり、そのうちの１３個を無作為化して、多数のリガンドバリアントを有するアフィボディーライブラリーを作製する（例えば、米国特許第５，８３１，０１２号を参照されたい）。アフィボディー分子は抗体を模倣しているが、抗体の場合の約１５０ｋＤａと比較して、約６ｋＤａの分子量を有し、かなり小さくなっている。サイズの違いにもかかわらず、アフィボディー分子の結合部位は抗体の結合部位と類似性を有する。

【0154】

アフィリンは、構造的にヒトユビキチンに由来する（歴史的にはγ－Ｂクリスタリンにも由来する）合成抗体模倣物である。アフィリンは、主にβシート構造及び約２０ｋＤａの総分子量を有する２つの同一のドメインからなる。アフィリンは、修飾に好適ないくつかの表面露出したアミノ酸を含有する。アフィリンは、抗原に対する親和性及び特異性において抗体に似ているが、構造においては似ていない。

【0155】

アフィマーは、ペプチドアプタマの一種であり、ＳＱＴ（Ｓｔｅｆｉｎ Ａ ｑｕａｄｒｕｐｌｅ ｍｕｔａｎｔ－Ｔｒａｃｙ）（ステフィンＡ四重変異体－トレイシー）として知られる構造を有する。アプタマー及びアフィマーは、結合ペプチドのＮ末端及びＣ末端両方が不活性な足場に埋め込まれた、構造上の制約のために不活性で剛性のあるタンパク質足場と親和的に結合する原因となる短いペプチドである。

【0156】

アフィチンは、特異的結合親和性を得るように操作されたＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄのバリアントである。Ｓａｃ７ｄは、元々は超好熱菌古細菌Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓに由来し、ＤＮＡと結合してそれの熱変性を防止する。アフィチンは、商業的にはＮａｎｏｆｉｔｉｎとして知られている。

【0157】

アルファボディーは、様々な抗原に結合するように操作された小さな（約１０ｋＤａ）タンパク質であり、したがって抗体模倣物である。アルファボディー足場は、コイルドコイル構造に基づいてコンピュータで設計される。標準的なアルファボディー足場は、高グリシン／セリンリンカーを介して連結された、各々４つのヘプタッド反復（７残基のストレッチ）から構成される３つのαヘリックスを含有する。標準的なヘプタッド配列は、「ＩＡＡＩＱＫＱ」である。細胞外及び細胞内タンパク質を標的とするアルファボディーの能力は、それらの高い結合親和性と組み合わせて、抗体では到達することができない標的にそれらが結合することを可能にし得る。

【0158】

アンチカリンは、リポカリンに見出される強固で保存的なβバレル構造を有する結合タンパク質の群である。リポカリンは、シグナル伝達分子などの様々な生物学的分子の認識、貯蔵、及び輸送を担う１つのペプチド鎖（１５０～１９０アミノ酸）を含む細胞外タンパク質の一種である。

【0159】

アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、真核生物において豊富であり、広範な生物学的プロセス、特に核輸送に関連するプロセスに関与する。アルマジロ反復タンパク質ベースの足場は、通常、３～５個の内部反復及び２個のキャッピングエレメントからなる。それらはまた、タンデム伸長スーパーヘリックス構造を有し、これは、伸長された立体構造で対応するペプチドリガンドと結合することが可能である。

【0160】

アトリマーは、テトラネクチンとして知られるトリマー血漿タンパク質に由来する足場であり、３つの同一の単位からなるＣ型レクチンのファミリーに属する。テトラネクチン内のＣ型レクチンドメイン（C-type lectin domain、ＣＴＬＤ）の構造は、標的化分子との相互作用を媒介する５つの柔軟なループを有する。

【0161】

アビマーは、ＨＥＲ３などの天然のＡドメイン含有タンパク質に由来し、アミノ酸リンカーを介して連結された多数の異なる「Ａドメイン」モノマー（２～１０）からなる。例えば、米国特許出願公開第２００４／０１７５７５６号、同第２００５／００５３９７３号、同第２００５／００４８５１２号、及び同第２００６／０００８８４４号に記載される方法論を使用して、標的抗原に結合することができるアビマーを作製することができる。

【0162】

一実施形態では、結合部分は、アンキリン反復タンパク質である。設計又は操作されたアンキリン反復タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質など）は、抗体模倣タンパク質のように機能することができ、典型的には、特異性の高いかつ高親和性の標的結合を呈す。設計されたアンキリン反復タンパク質は、１つ以上の設計されたアンキリン反復ドメインを含む。設計されたアンキリン反復ドメインは、天然アンキリン反復タンパク質に由来し、各設計されたアンキリン反復ドメインは、典型的には、高い特異性及び高親和性で標的タンパク質に結合する。設計されたアンキリン反復タンパク質は、その高い特異性、安定性、効力及び親和性により、並びに単一特異性、二重特異性又は多重特異性タンパク質を生成するためのフォーマッティングにおけるその柔軟性により、高親和性結合部分としての使用に特に好適である。設計されたアンキリン反復タンパク質薬物候補はまた、迅速、低コスト及び高収率製造並びに４℃での数年までの貯蔵寿命を含む好ましい開発特性を示す。設計されたアンキリン反復タンパク質は、本発明の結合部分の好ましい実施形態である。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ．所有の登録商標である。

【0163】

フィノマーは、ヒトＦｙｎチロシンキナーゼのＳｒｃ相同ドメイン３（ＳＨ３）のアミノ酸８３～１４５から進化した小さな球状タンパク質（約７ｋＤａ）である。フィノマーは、その高い熱安定性、システインを含まない足場、及びヒト起源により、潜在的な免疫原性を低減する、魅力的な結合分子である。

【0164】

システインノットミニタンパク質としても知られているノッチンは、典型的には、３つの逆平行βシートと、システインノットを作り出すジスルフィド結合によって縛られた拘束ループとを含む３０アミノ酸長のタンパク質である。このジスルフィド結合が高い熱安定性を与え、ノッチンを魅力的な抗体模倣物にしている。

【0165】

クニッツドメインペプチド又はクニッツドメイン阻害剤は、構造フレームワークを不安定化することなく変異され得る３つのジスルフィド結合及び３つのループを有する約６０個のアミノ酸を含む不規則な二次構造を有するプロテアーゼ阻害剤の一種である。

【0166】

一実施形態では、結合部分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）に由来する抗原結合ドメインを含むポリペプチド又はタンパク質である。

【0167】

結合部分の例
本発明で結合部分として使用するためのアンキリン反復ドメインの例が、配列番号１～１２によって提供される。

【0168】

配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１３～１７から選択されるアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。例えば、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列又は配列番号１４のアミノ酸配列又は配列番号１５のアミノ酸配列又は配列番号１６のアミノ酸配列又は配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。

【0169】

一実施形態では、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１３のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。別の実施形態では、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１４のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。別の実施形態では、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１５のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。別の実施形態では、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１６のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。別の実施形態では、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＣＤ３特異的結合分子に特異的に結合する。

【0170】

したがって、一実施形態では、本発明の結合部分は、配列番号１～１２からなる群から選択されるアンキリン反復ドメインとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアンキリン反復ドメインである

【0171】

一実施形態では、結合部分は、配列番号１～１２からなる群から選択されるアンキリン反復ドメインとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むアンキリン反復ドメインである

【0172】

一実施形態では、結合部分は、アンキリン反復ドメインであり、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～１２からなる群から選択される。

【0173】

一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号１～１２及び（２）配列番号１～１２のうちのいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む設計されたアンキリン反復ドメインである。

【0174】

一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける９個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける８個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける７個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける６個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける５個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける４個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける３個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける２個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。一実施形態では、結合部分は、（１）配列番号４５～６４及び（２）配列番号４５～６４のうちのいずれかにおける１個までのアミノ酸が別のアミノ酸によって置換されている配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むアンキリン反復モジュールを含む、設計されたアンキリン反復タンパク質である。

【0175】

本明細書に記載されるアミノ酸配列は、１つ以上のアミノ酸によって置換され得る。いくつかの実施形態では、１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個までの置換が、本明細書に記載の結合部分のいずれかにおいて行われる。

【0176】

いくつかの実施形態では、１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までの置換が、配列番号１～１２の配列のいずれかに対して、任意のアンキリン反復ドメインにおいて行われるいくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、１５個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、１４個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、１３個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、１２個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、１１個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、１０個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、９個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、８個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、７個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、６個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、５個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、４個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のうちのいずれかに対して、３個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のいずれかに対して、２個までの置換が行われる。いくつかの実施形態では、配列番号１～１２の配列のいずれかに対して、１個までの置換が行われる。

【0177】

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は全て、フレームワーク位置で行われる。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は全て、非無作為化位置で行われる。設計されたアンキリン反復ドメインにおける無作為化位置の場所は、例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）に開示されている。

【0178】

いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、非置換結合部分のＫ_D値と比較して、Ｋ_D値を約１０００倍超、約１００倍超、又は約１０倍超変化させない。例えば、いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号１～１２の配列のいずれかを含む結合部分を、配列番号１３～１７の配列のいずれかを含む薬物分子の結合のＫ_D値と比較して、Ｋ_D値を約１０００倍超、約３００倍超、約１００倍超、約５０倍超、約２５倍超、約１０倍超、又は約５倍超変化させない。

【0179】

ある特定の実施形態では、結合部分におけるアミノ酸置換は、以下の表１による保存的置換である。

【0180】

【表1】

【0181】

結合部分が、アンキリン反復ドメインである場合、いくつかの実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われ得る。他の実施形態では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われ得る。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘｌＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号６８）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表し、又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡＡｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（配列番号６９）を含んでもよく、式中、「ｘ」は、任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を表し、「ｚ」は、アスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される。一実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の実施形態では、置換は、「ｘ」として指定される残基の外側で行われる。

【0182】

加えて、結合部分の任意のアンキリン反復ドメインの最後から２番目の位置は、「Ａ」若しくは「Ｌ」であり得、かつ／又は最後の位置は、「Ａ」若しくは「Ｎ」であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列１～１２のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。例示的な実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列番号１～１２のいずれか１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、任意選択で、最後から２番目の位置のＡがＬで置換されており、かつ／又は最後の位置のＡがＮで置換されている。更に、結合部分の任意のアンキリン反復ドメインの配列は、任意選択で、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを含んでもよい（以下を参照されたい）。

【0183】

加えて、結合部分の各アンキリン反復ドメインは、任意選択で、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列１～１２のいずれか１つと少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸配列を含み、更に任意選択で、そのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを含む。例示的な実施形態では、結合部分のアンキリン反復ドメインは、配列番号１～１２のいずれか１つと少なくとも約９０％同一であるアミノ酸配列を含み、当該アンキリン反復ドメインは、任意選択で、そのＮ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。更に、結合部分の任意のアンキリン反復ドメインの配列は、任意選択で、Ｌで置換された最後から２番目の位置のＡ、及び／又はＮで置換された最後の位置のＡを有していてもよい（上記を参照されたい）。

【0184】

Ｎ末端及びＣ末端キャッピング配列
本明細書に記載の結合部分がアンキリン反復ドメインを含む場合、アンキリン反復ドメインは、Ｎ末端又はＣ末端キャッピング配列を含み得る。キャッピング配列は、アンキリン反復配列モチーフ又はモジュールのＮ末端又はＣ末端に融合された追加のポリペプチド配列を指し、当該キャッピング配列は、隣接アンキリン反復配列モチーフ又はアンキリン反復ドメインのモジュールとの強固な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、側面のアンキリン反復ドメインの疎水性コアを、溶媒に曝露することから遮蔽するキャップを提供する。

【0185】

Ｎ末端及び／又はＣ末端のキャッピング配列は、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第２００２／０２０５６５号及び同第２０１２／０６９６５５号、米国特許公開第２０１３／０２９６２２１号、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端アンキリンキャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号７０～７３が挙げられ、Ｃ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例としては、配列番号７４～７７が挙げられる。

【0186】

薬物分子
本発明の文脈内で、薬物分子は、ポリペプチド又はタンパク質を含む治療剤であり、当該ポリペプチド又はタンパク質は、結合部分によって結合することができる部位を含有する。本発明で使用するための薬物分子は、結合部分によって結合され得る限り、特に限定されない。これは、例えば、薬物分子が結合部分と同じ「クラス／種（class）」に属してもよく、結合部分と異なる「クラス／種」に属してもよいことを意味し、その結果、例えば、薬物分子及び結合部分の両方が抗体であり得るか、又は薬物分子及び結合部分の両方が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得るか、又は薬物分子が抗体であり得、結合部分が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得るか、又は薬物分子が代替足場（例えば、アンキリン反復タンパク質）であり得、結合部分が抗体であり得る。これは更に、例えば、薬物分子自体が異なる構造部分、例えば、抗体部分と代替足場部分との組み合わせ、又は異なる代替足場構造の部分の組み合わせを含み得ることを意味する。薬物分子及び結合部分の両方が抗体である場合、抗体が、結合特異性に関するものを含めて、互いに異なることは当業者には明らかであろう。同様に、薬物分子及び結合部分の両方が代替足場である場合、代替足場が、結合特異性に関するものを含めて、互いに異なることは当業者には明らかであろう。

【0187】

更に、本発明で使用するための薬物分子は、半減期延長部分を含有し得る。半減期延長部分は、半減期延長部分を有していない同じタンパク質と比較して、薬物分子のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（glutathione S transferase、ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（maltose binding protein、ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（human serum albumin、ＨＳＡ）結合ドメイン、又はポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、半減期延長部分は、ＨＳＡに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み得る。他の例では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメイン、例えば、Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ₁のＦｃドメイン、又はそのバリアント若しくは誘導体を含み得る。

【0188】

いくつかの実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、代替足場を含み、代替足場は、アドネクチン（モノボディー）、アフィボディー、アフィリン、アフィマー及びアプタマー、アフィチン、アルファボディー、アンチカリン、アルマジロ反復タンパク質ベースの足場、アトリマー、アビマー、アンキリン反復タンパク質ベースの足場（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質など）、フィノマー、ノッチン、及びクニッツドメインペプチドから選択される。代替足場は、例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ Ｃａｌｉｆ）．２０１７ Ｊｕｎｅ １２；１０（１）：２９３－３２０．ｄｏｉ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖａｎｃｈｅｍ－０６１５１６－０４５２０５に記載されている。

【0189】

本発明で使用するための薬物分子としてはまた、以下のものなどの臨床使用のために現在承認されている異なるカテゴリーの薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
（１）免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＩ）、
（２）二重特異性抗体、及び
（３）遺伝子改変された免疫細胞、例えばＴ細胞、特にキメラ抗原受容体（chimeric antigen receptor、ＣＡＲ）発現免疫細胞、例えばＣＡＲ－Ｔ細胞。

【0190】

本発明で使用するための薬物分子としてはまた、本明細書において「免疫チェックポイント調節因子」と呼ばれる、免疫チェックポイントの活性を上方制御又は下方制御する分子が挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイントは、免疫シグナルを増加させる（共刺激分子）又は減少させる（阻害分子）免疫系における分子である。がん患者において、腫瘍は、これらの免疫チェックポイントを使用して、特にＴ細胞による免疫系攻撃から自身を保護することがある。免疫チェックポイント療法において使用される薬物分子は、阻害性免疫チェックポイント分子を遮断するか、又は刺激性免疫チェックポイント分子を活性化し、それによって免疫系機能を回復させることができる。近年、免疫チェックポイント薬は、重要な新規のがん治療選択肢となっている。免疫チェックポイント分子としては、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、２Ｂ４、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ１５５、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＣＤ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＴＩＭ－１、ＯＸ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＤＮＡＭ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ８、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭＩ、ＣＤ４８、ＣＤ７０、Ａ２ＡＲ、ＣＤ３９、ＣＤ７３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、Ｃ５ＡＲ１、ＣＣＲ８、ＣＤ２２６、ＣＤ２８、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ３ｅ、ＣＤ４７、ＣＤ９４、ＥＴＡＲ、ＮＫＧ２Ａ、ＳＩＲＰα、ＴＬＲ８、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＩＤＯ１、ＩＤＯ２、ＴＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、ＴＩＭ－４及びＶＩＳＴＡが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、薬物分子は、免疫チェックポイント調節因子である。

【0191】

一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、抗体を含む。別の実施形態では、薬物分子は、二重特異性抗体を含む。別の実施形態では、薬物分子は、多重特異性抗体を含む。別の実施形態では、薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である抗体を含む。

【0192】

二重特異性抗体にはＴＣＥが含まれる。ＴＣＥである二重特異性抗体の例は、ＢｉＴＥ（商標）分子として知られる分子である。これらは、単一のペプチド鎖上の２つの単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）からなる抗がん薬である。そのようなＴＣＥは、ｓｃＦｖのうちの１つを介してＴ細胞の表面上のＣＤ３（表面抗原分類３）分子に結合し、一方、他のｓｃＦｖは、腫瘍細胞の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する。ＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結することによって、Ｔ細胞は、「活性化」され、腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を発揮することができる。ＴＣＥである二重特異性抗体の一例はブリナツモマブであり、これはＴ細胞の表面上のＣＤ３及びＢ細胞の表面上のＣＤ１９に結合する。ブリナツモマブは、急性リンパ芽球性白血病の治療での使用が承認されている。

【0193】

一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、二重特異性代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、多重特異性代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子（ＴＣＥ）である代替足場分子を含む。好ましい実施形態では、当該代替足場は、アンキリン反復ドメインである。更に好ましい実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、代替足場を含み、当該代替足場は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインであり、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１３～１７から選択されるアミノ酸配列を含む。更に好ましい実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１３～１７から選択されるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１３を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１４を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１６を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１７を含む。

【0194】

二重特異性又は多重特異性代替足場分子にはＴＣＥが含まれる。一実施形態では、薬物分子は、二重特異性又は多重特異性代替足場分子であり、当該代替足場分子は、（ｉ）アンキリン反復ドメインであるＣＤ３特異的結合ドメイン、及び（ｉｉ）アンキリン反復ドメインであるＴＡＡ特異的結合ドメインを含むＴＣＥである。ＢｉＴＥ（商標）分子として知られるＴＣＥと同様に、代替足場を含むそのようなＴＣＥは、結合ドメインの１つを介してＴ細胞の表面上のＣＤ３分子に結合する一方で、他の結合ドメインが腫瘍細胞の表面上の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に結合する抗がん薬である。ＣＤ３に結合し、Ｔ細胞を腫瘍細胞に連結することによって、Ｔ細胞は、「活性化」され、腫瘍細胞に対して細胞毒性活性を発揮することができる。

【0195】

薬物分子がＴＣＥである場合、本発明の結合部分の好ましい結合部位は、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインである。ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに結合することによって、結合部分は、ＴＣＥがＴ細胞に結合するのを妨げることによって、ＴＣＥの作用機序を遮断する。一実施形態では、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインへの結合部分の結合は、抗イディオタイプである。

【0196】

以下に列挙されるものを含む、ＴＣＥである多数の二重特異性抗体が記載されており、それらのそれぞれの結合標的が括弧内に提供されている。例えば、上記のように、ブリナツモマブ（ＣＤ１９ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）は、Ｔ細胞上のＣＤ３抗原、及びＢ細胞系統から生じた腫瘍細胞上のＣＤ１９抗原に結合する。ＴＣＥである他の二重特異性抗体としては、ＡＭＧ３３０（ＣＤ３３ｘＣＤ３）、フロテツズマブ（ＣＤ１２３ｘＣＤ３、Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ）、ＭＣＬＡ１１７（Ｃｌｅｃ１２ＡＸＣＤ３、Ｍｅｒｕｓ）、ＡＭＧ１６０（ＨＬＥ ＰＳＭＡｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ４２７（ＨＬＥ ＦＬＴ３ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ５６２（ＨＬＥ ＣＤ１９ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ５９６（ＨＬＥ ＥＧＦＲｖＩＩＩｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ６７３（ＨＬＥ ＣＤ３３ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ７０１（ＨＬＥ ＢＣＭＡｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ７５７（ＨＬＥ ＤＬＬ３ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、ＡＭＧ９１０（ＨＬＥ Ｃｌａｕｄｉｎ１８．２ｘＣＤ３、Ａｍｇｅｎ）、オドロンエクスタマブ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）、モスネツツズマブ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｒｏｃｈｅ）、ｇｌｏｆｉｔａｍａｂ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｒｏｃｈｅ）、及びエピコリタマブ（ＣＤ２０ｘＣＤ３、Ｇｅｎｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなＴＣＥのいずれも、本発明の組換え結合タンパク質中の薬物分子として使用され得る。

【0197】

一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、抗体及び代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、２つの異なる代替足場を含む。別の実施形態では、薬物分子は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）由来抗原認識ドメインを含む。

【0198】

一実施形態では、本発明で使用するための薬物分子は、遺伝子改変された免疫細胞を含む。好ましい実施形態では、当該遺伝子改変された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。一実施形態では、当該遺伝子改変された免疫細胞は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）などの遺伝子改変されたＴ細胞である。別の実施形態では、当該遺伝子改変された免疫細胞は、ＣＡＲ発現ＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ細胞）などの遺伝子改変されたナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。

【0199】

結合親和性
本発明の結合部分は、薬物分子に特異的に結合する。
ある特定の実施形態では、薬物分子に対する結合部分の結合親和性は、Ｋ_Dに関して記載される。例示的な実施形態では、Ｋ_Dは、約１０^-6Ｍ、約１０^-6Ｍ以下、約１０^-7Ｍ以下、約１０^-8Ｍ以下、約１０^-9Ｍ以下、約１０^-10Ｍ以下、又は約１０^-11Ｍ以下、約１０^-6Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-8Ｍ、約１０^-6Ｍ～約１０^-7Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-7Ｍ～約１０^-8Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-11Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-10Ｍ、約１０^-8Ｍ～約１０^-9Ｍ、約１０^-9Ｍ～約１０^-11Ｍ、又は約１０^-9Ｍ～約１０^-10Ｍ、又は約１０^-10Ｍ～約１０^-11Ｍである。

【0200】

例示的な実施形態では、結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ以下のＫ_D値で薬物分子に結合する。例示的な一実施形態では、結合部分は、約１μＭ以下のＫ_D値で薬物分子に結合する。別の例示的な実施形態では、結合部分は、約５００ｎＭ以下のＫ_D値で薬物分子に結合する。別の例示的な実施形態では、結合部分は、約１００ｐＭ以下のＫ_D値で薬物分子に結合する。更に別の例示的な実施形態では、結合部分は、約１０ｐＭ以下のＫ_D値で薬物分子に結合する。一実施形態では、結合部分は、約１μＭ未満、例えば、約１μＭ未満、約５００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、又は約５０ｎＭ未満の解離定数（Ｋ_D）で薬物分子を結合する。別の実施形態では、結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭ、例えば、約１μＭ～約１０ｐＭ、約１μＭ～約２０ｐＭ、約１μＭ～約５０ｐＭ、又は約１μＭ～約１００ｐＭの解離定数（Ｋ_D）で薬物分子を結合する。

【0201】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0202】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号２との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号２との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0203】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号３との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号３との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0204】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号４との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0205】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号５との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号５との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0206】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号６との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号６との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0207】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0208】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号８との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号８との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0209】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号９との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号９との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0210】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１０との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１０との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0211】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１１との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１１との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0212】

いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１２との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ、７５０ｎｍ、５００ｎｍ、２５０ｎｍ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約２５ｎＭ、約１０ｎＭ、約５ｎＭ、約２ｎＭ、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、約２５ｐＭ、又は約１０ｐＭ未満のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。いくつかの実施形態では、結合部分は、配列番号１２との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、薬物分子は、配列番号１３～１７との少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合部分は、約１μＭ～約１０ｐＭの範囲のＫ_D値で当該薬物分子に結合する。

【0213】

結合部分が薬物分子に結合される場合、薬物分子は、生物学的活性、例えば、生物学的標的分子への結合を発揮することができない。本発明の組換えタンパク質中の結合部分と薬物分子とを接続するペプチドリンカーのタンパク質分解切断の際に、活性薬物が対象中に放出される。

【0214】

組換え結合タンパク質
本発明の組換え結合タンパク質は、（ｉ）本明細書で定義される結合部分と、（ｉｉ）本明細書で定義される薬物分子と、を含む。当該結合部分は当該薬物分子に可逆的に結合し、結合の作用は当該薬物分子の生物学的活性を阻害する。本明細書に記載されるように、結合部分及び薬物分子は、プロテアーゼ切断部位を含むペプチドリンカーによって接続される。

【0215】

「リンカー」又は「連結部分」は、２つの別個の実体を接続する分子又は分子群である。２つのタイプのリンカーが本発明に包含される：プロテアーゼ切断可能なリンカー及びプロテアーゼ切断不可能なリンカー。本発明の組換えタンパク質において、結合部分と薬物分子との間のリンカーは、薬物分子が結合部分との結合から「放出」されることを可能にするために、プロテアーゼ切断可能なリンカーであるべきである。しかしながら、プロテアーゼ切断不可能なリンカーは、結合分子と半減期延長部分との間、及び／又はＣＤ３に対する特異性を有する結合ドメイン及び腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する特異性を有する結合ドメインなどの薬物分子の異なるドメイン間などのプロドラッグ分子中に存在し得る。これらの異なるタイプのリンカーの例を図１に示す。プロテアーゼ切断可能なリンカーは、図１において、結合剤とＣＤ３結合部分との間に示されている。図１に示すように、α－ＣＤ３と結合剤との間のリンカーは、腫瘍微小環境においてプロテアーゼによって切断可能なペプチドリンカーから構成される。プロドラッグＣＤ３－ＰＤＤは、そのα－ＣＤ３アームを介したＴ細胞への結合が共有結合した結合剤によって阻害されるため、循環への注入時には不活性である。腫瘍微小環境（ＴＭＥ）に入ると、α－ＣＤ３と結合剤との間のペプチドリンカーは、腫瘍関連プロテアーゼによって切断され、次いで、薬物分子は、そのα－ＴＡＡアームを介して腫瘍細胞上のＴＡＡに結合し、そのα－ＣＤ３アームを介してＴ細胞上のＣＤ３に結合することによって、その生物学的活性を発揮することができ、Ｔ細胞媒介性腫瘍死滅を引き起こす。

【0216】

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断可能なリンカーは、配列番号１８～２０からなる群から選択されるアミノ酸配列との少なくとも少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。

【0217】

プロテアーゼ切断不可能なリンカーは、ヘテロ二量体タンパク質を生成するために、共有結合リンカー（例えば、ジスルフィド結合、ポリペプチド結合、若しくは架橋剤）又は非共有結合リンカーを含み得る。プロテアーゼ切断不可能なリンカーは、例えば、結合部分と半減期延長部分との間に存在し得る。

【0218】

いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断不可能なリンカーは、ペプチドリンカーである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１～５０個のアミノ酸残基を含む。例示的なリンカーとしては、例えば、グリシンリッチペプチド；グリシン及びセリンを含むペプチド；配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_nを有し、式中、ｎが１、２、３、４、５又は６であるペプチド；又は配列［Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ］_n（配列番号８３）を有し、式中、ｎが、１、２、３、４、５、又は６であるペプチドが挙げられる。グリシンリッチペプチドリンカーはペプチドリンカーを含み、残基の少なくとも２５％はグリシンである。グリシンリッチペプチドリンカーは、技術分野において周知である（例えば、ｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２０１３ Ｆｅｂｒｕａｒｙ；２２（２）：１５３－１６７）。

【0219】

いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、プロリン－スレオニンリッチペプチドリンカーである。一実施形態では、リンカーは、配列番号７８～８２のいずれか１つのプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカーである。例示的な実施形態では、リンカーは、配列番号８１のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカーである。別の例示的な実施形態では、リンカーは、配列番号８２のプロリン－スレオニンリッチペプチドリンカーである。

【0220】

本発明の組換え結合タンパク質において、上に列挙した任意の結合部分は、結合部分が薬物分子に対する所望の結合親和性及び特異性を有するという条件で、上に列挙した任意の薬物分子と組み合わせてもよい。特に、上記の任意の結合部分及び薬物分子、特に、明示的に開示される結合係数（例えば、Ｋ_D）を有する具体的に開示される任意の組み合わせは、本発明に包含される。

【0221】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号１及び（２）配列番号１との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0222】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0223】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む

【0224】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0225】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0226】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0227】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号２及び（２）配列番号２との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0228】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0229】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0230】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号２の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0231】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号２の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号２の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0232】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号２を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0233】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号３及び（２）配列番号３との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0234】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0235】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0236】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号３の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0237】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号３の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号３の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0238】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号３を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0239】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号４及び（２）配列番号４との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0240】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0241】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0242】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号４の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0243】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号４の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号４の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２個まで、又は１個個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0244】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号４を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0245】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号５及び（２）配列番号５との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0246】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0247】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0248】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号５の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0249】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号５の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号５の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0250】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号５を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0251】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号６及び（２）配列番号６との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0252】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0253】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0254】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号６の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0255】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号６の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号６の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0256】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号６を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0257】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号７及び（２）配列番号７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0258】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0259】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0260】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号７の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0261】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号７の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号７の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0262】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号７を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0263】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号８及び（２）配列番号８との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0264】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0265】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0266】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号８の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0267】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号８の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号８の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0268】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号８を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0269】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号９及び（２）配列番号９との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0270】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0271】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0272】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号９の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0273】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号９の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号９の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0274】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号９を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0275】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号１０及び（２）配列番号１０との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0276】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0277】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0278】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１０の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0279】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１０の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１０の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0280】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１０を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0281】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号１１及び（２）配列番号１１との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0282】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0283】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0284】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１１の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0285】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１１の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１１の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0286】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１１を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0287】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（ｉ）（１）配列番号１２及び（２）配列番号１２との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（ｉｉ）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0288】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0289】

一実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２との少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0290】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１２の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）（ａ）配列番号１３～１７及び（２）配列番号１３～１７との少なくとも約８５％のアミノ酸配列同一性を有する配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0291】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１２の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかとの少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２のアミノ酸配列を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分であって、任意選択で、配列番号１２の１５個まで、１４個まで、１３個まで、１２個まで、１１個まで、１０個まで、９個まで、８個まで、７個まで、６個まで、５個まで、４個まで、３個まで、２、又は１個までのアミノ酸は、他のアミノ酸によって置換されている、結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含む薬物分子と、を含む。

【0292】

別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１３～１７のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。別の実施形態では、組換え結合タンパク質は、（１）配列番号１２を有するアンキリン反復ドメインを含む結合部分と、（２）配列番号１５～１６のいずれかを含むアンキリン反復ドメインを含む薬物分子と、を含む。

【0293】

一実施形態では、上記の当該組換え結合タンパク質のいずれかに含まれる当該薬物分子は、Ｔ細胞エンゲージャー薬物分子である。

【0294】

プロドラッグ分子
本発明のプロドラッグ分子は、本明細書に記載される組換え結合タンパク質を含む。したがって、本発明のプロドラッグ分子は、プロテアーゼ切断可能なリンカーによって連結された結合部分及び薬物分子を含む。一実施形態では、薬物分子は、ＣＤ３特異的結合ドメインと、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異的結合ドメインと、を含むＴ細胞エンゲージャー（ＴＣＥ）分子である。本発明のプロドラッグ分子は、半減期延長部分などの他の部分を更に含んでもよい。

【0295】

本発明のプロドラッグ分子において使用され得るＴＡＡ特異的結合ドメインの性質には特に制限はない。本発明のプロドラッグ分子において使用され得るＴＡＡ特異的結合ドメインは、ＴＡＡに対して結合特異性を有する任意の結合ドメインを含む。一例は、配列番号２７の結合ドメインなどのＥＧＦＲ特異的結合ドメインである。

【0296】

本発明で使用するためのプロドラッグ分子は、半減期延長部分を含有してもよい。半減期延長部分は、半減期延長部分を有していない同じタンパク質と比較して、薬物分子のインビボでの血清半減期を延長する。半減期延長部分の例としては、ポリヒスチジン、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン、プロテインＡ、プロテインＧ、免疫グロブリンドメイン、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメイン、又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、半減期延長部分は、ＨＳＡに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み得る。他の例では、半減期延長部分は、免疫グロブリンドメイン、例えば、Ｆｃドメイン、例えば、ヒトＩｇＧ₁のＦｃドメイン、又はそのバリアント若しくは誘導体を含み得る。一実施形態では、半減期延長部分は、ＨＳＡに対する結合特異性を持つアンキリン反復ドメインを含み、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６５～６７のいずれか１つとの少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0297】

プロドラッグ分子の成分は、結合部分及び薬物分子がプロテアーゼ切断可能なリンカーによって連結されるという条件で、任意の順序で組み合わせてもよい。一実施形態では、プロドラッグ分子中の異なる成分の配向は、Ｎ末端からＣ末端へ向かって、（ＴＡＡ結合ドメイン）－（ＣＤ３結合ドメイン）－（プロテアーゼ切断可能なリンカー）－（結合部分）－（半減期延長部分）である。

【0298】

核酸及び方法
本発明は更に、本明細書で定義される設計されたアンキリン反復ドメインを含む結合部分をコードする、核酸に関する。そのような核酸の例は、配列番号２１～２４によって提供される。本発明は更に、当該核酸を含む、宿主細胞に関する。

【0299】

本発明は更に、本明細書で定義される結合部分を作製する方法であって、当該組換え結合タンパク質が発現される条件下で本明細書で定義される宿主細胞を培養することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、当該宿主細胞は、真核宿主細胞である。他の実施形態では、当該宿主細胞は、原核宿主細胞である。一実施形態では、結合部分を作製する方法は、当該組換え結合タンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養することを含み、当該結合部分は、設計されたアンキリン反復ドメインを含み、当該宿主細胞は、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの原核宿主細胞である。別の実施形態では、結合部分を作製する方法は、当該組換え結合タンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養することを含み、当該結合部分は、抗体を含み、当該宿主細胞は、例えば、ＣＨＯ細胞などの真核宿主細胞である。

【0300】

医薬組成物
本発明は更に、本明細書に記載の結合部分、組換え結合タンパク質又はプロドラッグと、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、を含む、医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物はまた、本明細書中に記載される核酸と、薬学的に受容可能なキャリア又は賦形剤と、を含んでもよい。

【0301】

当該医薬組成物の使用及びそれを用いる治療方法も本明細書に記載されている。本発明に包含される方法及び使用は、以下により詳細に記載されている。医薬組成物、方法及び使用により、医薬組成物を作製するために使用される薬物分子によって治療される疾患適応症を治療することに留意されたい。

【0302】

本明細書に記載の医薬組成物は、当該技術分野で公知の方法を用いて調製することができる。

【0303】

医薬組成物は、薬学的に許容される担体又は賦形剤を含んでもよい。標準的な医薬担体としては、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、油／水又は水／油エマルジョンなどのエマルジョン、及び様々な種類の湿潤剤が挙げられる。

【0304】

医薬組成物は、例えば、酸性化剤、添加剤、吸着剤、エアロゾル推進剤、空気置換剤、アルカリ化剤、抗硬化剤、抗凝固剤、抗菌防腐剤、抗酸化剤、消毒剤、基材、結合剤、緩衝剤、キレート剤、コーティング剤、着色剤、乾燥剤、洗剤、希釈剤、消毒薬、崩壊剤、分散剤、溶解促進剤、染料、皮膚軟化剤、乳化剤、乳化安定剤、充填剤、フィルム形成剤、調味料、香味料、フローエンハンサー、ゲル化剤、造粒剤、保湿剤、潤滑剤、粘膜付着剤、軟膏基剤、軟膏、油性ビヒクル、有機基剤、パステル基剤、顔料、可塑剤、研磨剤、防腐剤、封鎖剤、皮膚浸透剤、可溶化剤、溶剤、安定剤、坐剤基剤、界面活性剤、界面活性物質、懸濁化剤、甘味剤、治療剤、増粘剤、張性剤、毒性剤、増粘剤、吸水性剤、水混和性共溶媒、軟水剤、又は湿潤剤を含む、任意の他の薬学的に許容される成分を含むことができる。例えば、参照によりその全体が組み込まれる、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｈ．Ｋｉｂｂｅ（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，２０００）を参照されたい。参照によりその全体が組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）。

【0305】

医薬組成物は、生理学的に適合性のあるｐＨを達成するように製剤化することができる。いくつかの実施形態では、医薬組成物のｐＨは、例えば、約４又は約５～約８．０、又は約４．５～約７．５、又は約５．０～約７．５であり得る。例示的な実施形態では、医薬組成物のｐＨは、約５．５～約７．５である。

【0306】

一実施形態では、本発明は、Ｔ細胞活性化又はＮＫ細胞活性化などの免疫細胞活性化を、それを必要とする対象において行う方法であって、本明細書に記載の医薬組成物を、当該対象に投与するステップを含む、方法に関する。

【0307】

別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、インビボで活性薬物分子の放出を制御する方法に関する。

【0308】

別の実施形態では、本発明は、対象を治療する方法であって、有効量の本明細書で定義される医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、本方法は、増殖性疾患を治療する方法である。いくつかの実施形態は、本方法は、がんを治療する方法である。

【0309】

別の実施形態では、本発明は、療法に使用するための、本明細書で定義される医薬組成物に関する。好ましくは、本明細書で定義される医薬組成物は、増殖性疾患の治療で使用するために提供される。より好ましい実施形態では、増殖性疾患は、がんである。

【0310】

本発明の医薬組成物は、典型的には、薬物分子に典型的に関連する有害作用に関して重大なリスクを有すると同定された対象に投与される。いくつかの実施形態では、対象は、哺乳動物である。好ましい実施態様では、対象は、ヒトである。

【0311】

いくつかの実施形態では、医薬組成物の単回投与が十分であり得る。他の実施形態では、反復投与が必要であり得る。対象の年齢及び全般的な健康状態、並びに薬物分子の性質及び典型的な投与レジメンなどの様々な因子が、投与の回数及び頻度に影響を及ぼす。

【0312】

本明細書に記載の医薬組成物は、非経口、経鼻、経口、肺、局所、膣内、又は直腸投与などの任意の好適な投与経路を介して対象に投与することができる。非経口投与に好適な製剤としては、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる水性及び非水性の等張滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び防腐剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。詳細については、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ ２３８－２５０（１９８２）、及びＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ，Ｔｏｉｓｓｅｌ，４ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ ６２２－６３０（１９８６））を参照されたい。

【実施例】

【0313】

材料及び方法
以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。

【0314】

材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現株は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質産生に使用した。ＳＰＲ測定のためのＮＬＣチップは、ＢｉｏＲａｄ（ＢｉｏＲａｄ、ＵＳＡ）製であった。ＨＴＲＦ試薬は、Ｃｉｓｂｉｏ（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）製であった。Ｐａｎ－Ｔ細胞単離キットは、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）製であった。細胞毒性検出（ＬＤＨ放出による）キットは、Ｒｏｃｈｅ製であった。組換えプロテアーゼは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ）又はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）製であった。

【0315】

分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ １９８９，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋを参照されたい）。

【0316】

設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，上記引用、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。したがって、例えば、そのようなライブラリーは、固定されたＮ末端キャッピングモジュール又はランダム化されたＮ末端キャッピングモジュール、１つ以上のランダム化された反復モジュール、及び固定されたＣ末端キャッピングモジュール又はランダム化されたＣ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができる。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有することがないように組み立てられる。

【0317】

更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ，Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ，Ｇｏｔｏ，Ｙ．，Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ，Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）。２個のアンキリン反復の境界近くに存在するベータターンの中に１０個のアミノ酸が挿入されているこのアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリンリピートタンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１個以上のベータターンの中に挿入された可変長（例えば、１個～２０個のアミノ酸）のランダム化されたループ（固定された位置及びランダム化された位置を有する）を含有することができる。

【0318】

アンキリン反復タンパク質ライブラリーのＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し、アンキリン反復タンパク質ライブラリーの任意のそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくはＫＬＮ、ＫＬＡ又はＫＡＡモチーフを有する。

【0319】

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。タンパク質構造データバンク（Protein Data Bank、ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。

【0320】

Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００３，上記引用、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。

【0321】

反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。

【0322】

ＥＧＦＲ特異的結合ドメイン
ＥＧＦＲを例示的なＴＡＡとして選択したのは、同じモデルにおける安全性及び有効性（すなわち、治療濃度域）のインビボでの同時試験を可能にするヒト－マウス交差反応性のアンキリン反復結合ドメインが利用可能であるからである。
ＥＧＦＲ特異的結合剤は、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用）によって記載されたものと同様の方法で、ヒトＥＧＦＲ（Ｌ２５－Ｓ６４５）のビオチン化全長細胞外ドメイン（extracellular domain、ＥＣＤ）に対するリボソームディスプレイによってＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。
ラウンド１からラウンド４まで、標的濃度を減少させた。得られたＤＡＲＰｉｎ分子のプールをＰＣＲ増幅し、細菌発現用ベクターにライゲーションした。
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅを、以前に記載されたようなプラスミドＤＮＡの単離のために、及び発現培養物の接種のために、得られたプラスミドプールで形質転換した。発現培養物を回収し、溶解し、得られたＤＡＲＰｉｎ粗抽出物を、ヒトＥＧＦＲ及びマウスＥＧＦＲ－Ｆｃ（Ｌ２５－Ｓ６４７、ＲｎＤ Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＥＣＤに結合する能力についてＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。０．１％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳを使用して、個々のインキュベーション工程の間に自動洗浄を実行した。
ＥＧＦＲのサブドメインＩＩＩ内のマスクされていないエピトープに対する結合剤を、均一時間分解蛍光（Homogeneous Time Resolved Fluorescence、ＨＴＲＦ）によって同定した。ビオチン化ｈＥＧＦＲ（最終４ｎＭ）を１０倍過剰のＥｒｂｉｔｕｘ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）とともに室温で１時間プレインキュベートした。検出試薬ｍＡｂ抗６ＨＩＳ－Ｔｂクリプテート及びストレプトアビジン－ｄ２（ＣｉｓＢｉｏ社製）を製造業者の推奨に従って希釈し、ＤＡＲＰｉｎ分子とともに最終１０ｎＭで添加した。結合シグナルを６６０ｎｍで測定し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００ Ｐｒｏ装置（Ｔｅｃａｎ）を用いて６２０ｎｍシグナルに対して正規化した。

【0323】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による組換えヒト及びマウスＥＧＦＲへのＥＧＦＲ特異的アンキリン反復ドメインの結合
全てのＳＰＲ測定は、ＰｒｏｔｅＯｎ（商標）ＸＰＲ３６ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ Ａｒｒａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して実行した。ビオチン化一価抗ＥＧＦＲ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）を、ｈＥＧＦＲに対する親和性測定のために約４８ＲＵ及び約５５ＲＵまで、又はｍＥＧＦＲ（ＡＣＲＯｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）に対する親和性測定のために約６６ＲＵ及び約１２７ＲＵまで、それぞれ、ＮＬＣニュートラアビジンセンサーチップ上に捕捉した。０．００５％ Ｔｗｅｅｎ－２０（Ｓｉｇｍａ）を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）をフロー緩衝液として使用し、ｍＥＧＦＲ標的の場合には１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡを更に補充した。０．７４ｎＭ～６０ｎＭのｈＥＧＦＲ又はｍＥＧＦＲの３倍希釈系列を１００μｌ／分の流速で１８０秒間注入し、解離を１８００秒間記録した。捕捉されたＤＡＲＰｉｎ分子を、１０ｍＭグリシン－ＨＣｌ、ｐＨ２．５＋１Ｍ ＮａＣｌの単一パルスによって再生した。インタースポット（表面参照）及びブランク注入（緩衝液参照）を使用して、データを二重参照した。各個々の希釈セットをＬａｎｇｍｕｉｒ－１：１モデルに適合させた。

【0324】

ヒト及びマウスＥＧＦＲ ＥＣＤに対するヒト－マウス交差反応性ＥＧＦＲ結合剤の親和性をＳＰＲによって測定した。表２は、一価形式のＥＧＦＲ結合ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）についての結合動態データを示し、これは、ヒトＥＧＦＲ ＥＣＤに対する約４７０ｐＭのＫＤ及びマウスＥＧＦＲ ＥＣＤに対する約４９０ｐＭのＫＤを示す。

【0325】

【表2】

【0326】

組換えプロテアーゼによる切断実験
マトリックスメタロプロテイナーゼ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を、使用前に製造業者によって記載されているようにｐ－アミノフェニル水銀アセテート（aminophenylmercuric acetate、ＡＰＭＡ）で活性化した。基質（ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ）を、ＴＢＳ－ＣＢ（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭ ＣａＣｌ２、０．０５％Ｂｒｉｊ－３５）中で、５μＭの２倍ストック濃度に希釈した。等容量のプロテアーゼ（反応速度に応じて１０ｎｇ／ｍＬ～１０００ｎｇ／ｍＬの濃度）の添加を使用して反応を開始し、この反応は、適切に調節したヒートブロック内で３７℃で実行した。規則的な間隔で、反応の試料を取り出し、直ちにＳＤＳを含有するＬａｂＣｈｉｐ緩衝液と混合して、混合物の全てのタンパク質を変性させ、したがって反応を停止させた。これらの試料を、ＬａｂＣｈｉｐ ＨＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓキャピラリー電気泳動システム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ，ＵＳＡ）を用いて、３ドメインＣＤ３－ＰＤＤの１ドメイン結合剤及び２ドメイン活性ＴＣＥへの切断について分析した。

【0327】

ＦＣによるＨＣＴ１１６腫瘍細胞上のヒトＥＧＦＲ及びＪｕｒｋａｔ ｗｔ細胞上のヒトＣＤ３への結合
Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔを使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞上のヒトＣＤ３を用いてＣＤ３結合の決定、及びＨＣＴ１１６腫瘍細胞を有する細胞上のｈＥＧＦＲへの結合の決定を実行した。プロドラッグＤＡＲＰｉｎ分子の滴定物を、ウェル当たり２００’０００細胞（Ｊｕｒｋａｔ及びＨＣＴ１１６細胞の両方について）とともに４℃で３０分間インキュベートした。洗浄後、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）分子のＣＤ３結合を、過剰な抗ＤＡＲＰｉｎ抗体を洗い流した後に添加した、対応する二次抗体抗ウサギＩｇＧ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８（４℃で３０分間のインキュベーション）との１：１０００希釈された抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体ミックス（４℃で１時間のインキュベーション）によって検出した。続いて、細胞を洗浄し、生死について染色し（ａｑｕａ、１：１０００、ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁した。生細胞上に結合するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８の平均蛍光強度の中央値をフローサイトメトリーで測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用してデータをプロットした。

【0328】

Ｔ細胞活性化
ＣＤ３エンゲージＤＡＲＰｉｎ分子の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカーを測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて評価した。故に、１ウェル当たり１００，０００個のヒト汎Ｔエフェクター細胞及び２０，０００個のＨＣＴ１１６標的細胞を、６００μＭヒト血清アルブミンの存在下、３７℃で４８時間、プロドラッグ試料の段階希釈物と２連で共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：５’０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２５０のマウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｓｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：２５０のマウス抗ヒト－ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ＢＣ９６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ Ａｔｔｕｎｅ Ｎｘｔ上で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８陽性ゲートＴ細胞上のＣＤ２５陽性細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。アッセイを、３人の個々のヒトドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて３回実行した。

【0329】

腫瘍細胞死滅：ＬＤＨ放出によるインビトロ短期細胞毒性アッセイ。
ＣＤ３エンゲージＤＡＲＰｉｎ分子の特異性及び効力を、ＬＤＨ放出によるインビトロ短期細胞毒性アッセイによって評価した。エフェクター細胞及び標的細胞を、６００μＭのヒト血清アルブミン（生理学的濃度を模倣するため）の存在下で、５：１のＥ：Ｔ比で９６ウェルプレート中、２連で共インキュベートした。ｐａｎ－Ｔ細胞単離キット（Miltenyi）を使用することによって、ヒトＰＢＭＣから付着していない（untouched）Ｔ細胞を単離した。１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎Ｔ細胞（エフェクター細胞）及び２０，０００個のＨＣＴ１１６細胞（標的細胞）を、選択されたプロドラッグＤＡＲＰｉｎ分子の段階希釈物とともにインキュベートした。様々な対照を含めた（すなわち、Ｔ細胞のみ、腫瘍細胞のみ、Ｔｒｉｔｏｎ対照、結合部分のみ）。４８時間インキュベートした後、細胞をスピンダウンし、１００μｌ／ウェルの上清及び１００μｌ／ウェルのＬＤＨ反応混合物（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を３０分間インキュベートした。吸光度を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏリーダーによって４９２ｎｍ～６２０ｎｍで測定した。バックグラウンド補正後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＯＤ値をプロットした。アッセイを、３人の個々のヒトドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて３回実行した。

【0330】

インビボ実験
インビボ実験は、雌ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ／ＩＬ－２Ｒγｎｕｌｌ免疫不全マウス系統（ＮＣＧ）を使用してＴｒａｎｓｃｕｒｅ ＳＡ（ＴＣＳ）（Ａｒｃｈａｍｐｓ，Ｆｒａｎｃｅ）によって実行した。マウスを、ヒト臍帯血から単離された造血幹細胞（ＣＤ３４＋、ＨＬＡ－Ｂ３５＋）を使用して、ＴＣＳ独自のヒト化プロトコルに従ってヒト化した（ｈｕ－マウス）。ヒト化マウスを選択し、腫瘍細胞生着の１週間前に、ヒトサイトカインＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－１５、Ｆｌｔ３－Ｌ及びＧＭ－ＣＳＦの一過性発現に基づく流体力学的ブーストを受けることによって、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及び骨髄細胞集団について増強した。２５％を超えるヒト化率（ｈＣＤ４５／総ＣＤ４５）を有するマウスのみを使用した。
ＡＴＣＣの推奨に従って、ＨＣＴ－１１６腫瘍細胞をインビトロで増殖させた。生存率チェックの後、対数増殖期の腫瘍細胞をＰＢＳ中で動物の右脇腹に皮下注射した（３×１０⁶個の細胞）。腫瘍生着を実験０日目（Ｄ０）として定義した。
全てのインビボ手順は、地方倫理委員会（ＣＥＬＥＡＧ）によって審査され、承認されている。

【0331】

実施例１：ＣＤ３特異的結合ドメインに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインの選択
概要
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，ＰＮＡＳ ９４，４９３７－４２，１９９７）を用いて、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子（ＴＣＥ）のＣＤ３特異的結合ドメインに対して結合特異性を有する複数のアンキリン反復ドメインを、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４（上記引用）によって説明されているものと同様の方法で、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択し、具体的な条件及び追加の選択解除ステップは以下であった。ＣＤ３特異的結合ドメインに対する選択されたクローンの結合及び特異性を、Ｅ．ｃｏｌｉ粗抽出物ホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）によって評価したところ、ＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する複数の結合タンパク質が首尾よく選択されたことが示された。これらの最初に同定された結合タンパク質を更に開発して、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに対して更に高い親和性及び／又はそれからの更に低いオフレートを有する結合タンパク質を得た。例えば、配列番号１～１２のアンキリン反復ドメインは、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー分子のＣＤ３特異的結合ドメインに対する結合特異性並びに高い結合親和性及び／又はそれからの低いオフレートを有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。

【0332】

標的及び選択材料としてのＣＤ３特異的結合ドメイン
二重特異的ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインを標的及び選択材料として使用した。そのような標的ドメインは、配列番号１３～１７のポリペプチドから選択された。標的タンパク質を、標準的な方法を用いてビオチン化した。

【0333】

リボソームディスプレイによるＣＤ３特異的結合ドメインに対して特異性を有するアンキリン反復タンパク質の選択
設計されたアンキリン反復タンパク質ライブラリー（Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃ）を、標的として使用されるＣＤ３特異的結合ドメイン（配列番号１３）に対するリボソームディスプレイ選択において使用した（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２，５７５－５８２（２００４）；Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４，２６９－２７９ （２００７）；Ｈａｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９５，１４１３０－１４１３５（１９９８）を参照されたい）。標的及びライブラリーごとに４回の選択ラウンドを行った。４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４，上記引用）。各選択ラウンドの後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数を、結合剤の濃縮により、収率に合わせて調整して、連続的に減少させた。次いで、得られた３つのプールを、結合剤スクリーニングに供した。

【0334】

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるように、ＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する。
溶液中でＴＣＥのＣＤ３特異的結合ドメインに特異的に結合する個々に選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって同定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、形式Ｈ－Ｃ－Ｘ（式中、Ｈはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）結合ドメインを示し、ＣはＣＤ３結合ドメイン（配列番号１３）を示し、Ｘは選択されたアンキリン反復タンパク質を示す）でｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。２００μｌの成長培地（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃で、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。５０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有する１５０μｌのＴＢ培地に、新鮮な９６深型ウェルプレートで１０μｌの一晩培養物を接種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、６時間続けた。プレートの遠心分離によって細胞を収集し、上清を廃棄し、ペレットを－２０℃で一晩凍結させた後、１０μｌのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μｌのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１０分間）。各溶解したクローンの抽出物を、１２．５ｎＭ（最終濃度）のビオチン化ＣＤ３結合ドメイン、１：３００（最終濃度）の抗ＦＬＡＧ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）及び１：３００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）と一緒に、ＰＢＳＴＢ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）で１：８００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルに加え、暗所にて室温で１２０分間インキュベートした。ＨＴＲＦを、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００上で、３４０ｎｍ励起波長、並びにバックグラウンド蛍光検出のための６２０±１０ｎｍ発光フィルター及び特異的結合について蛍光シグナルを検出するための６６５±１０ｎｍ発光フィルターを用いて読み取った。同じ溶解物を、１２．５ｎＭ（最終濃度）のビオチン化ＨＳＡ、１：３００（最終濃度）の抗ＦＬＡＧ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴアクセプターコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：３００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ、Ｆｒａｎｃｅ）と、３８４ウェルプレートのウェルに混合し、暗所にて室温で１２０分間インキュベートした。ＨＴＲＦを、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００上で、３４０ｎｍ励起波長、並びにバックグラウンド蛍光検出のための６２０±１０ｎｍ発光フィルター及び特異的結合について蛍光シグナルを検出するための６６５±１０ｎｍ発光フィルターを用いて読み取った。各溶解クローンの抽出物を、ビオチン化ＣＤ３結合標的ドメインへの結合の阻害及びビオチン化ＨＳＡへの妨害されない結合について試験して、ＣＤ３結合ドメインへの特異的結合を評価した。

【0335】

標的タンパク質に対してより低い親和性を有する結合タンパク質の更なる分析及び選択
合計７４４個の結合タンパク質が最初に同定された。結合プロファイルに基づいて、１７６個の候補を選択して９６ウェルフォーマットで発現させ、ＤＮＡ配列決定と並行して均質になるまで精製した。候補を、サイズ排除クロマトグラフィによって生物物理学的に特徴付けた。これらから、２４個の結合剤を選択し、クローニングし、Ｘ形式で作製した。一価の精製された結合剤を、サイズ排除クロマトグラフィ、Ｓｙｐｒｏ－Ｏｒａｎｇｅ熱安定性評価（Ｎｉｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ２，２２１２－２２２１，（２００７）を参照されたい）、ＰｒｏｔｅＯｎ表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）標的親和性評価、ＥＬＩＳＡ、標的タンパク質競合ＨＴＲＦ実験、及び／又はＳＤＳ－ＰＡＧＥによって生物物理学的に特徴付けた。特徴付けたこれら２４個の結合剤から、結合剤＃１（配列番号１）を親和性ダウンチューニングのために選択した。
ＣＤ３結合ドメインの同じエピトープを異なる親和性で結合するダウンチューニングされた結合剤のパネルを、結合剤＃１の選択されたアミノ酸残基をアラニンで置換することによって生成した。ダウンチューニングされた結合タンパク質の親和性を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって検証した。結合剤＃２～＃１２（配列番号２～１２）は、この方法によって生成され、親結合剤＃１に由来した。総合すると、このアプローチから得られた以下の１２個の結合タンパク質（配列番号１～１２）は、本発明の結合部分を構成する：
結合剤＃１（配列番号１）、結合剤＃２（配列番号２）、結合剤＃３（配列番号３）、結合剤＃４（配列番号４）、結合剤＃５（配列番号５）、結合剤＃６（配列番号６）、結合剤＃７（配列番号７）、結合剤＃８（配列番号８）、結合剤＃９（配列番号９）、結合剤＃１０（配列番号１０）、結合剤＃１１（配列番号１１）、及び結合剤＃１２（配列番号１２）。

【0336】

結合剤＃１～結合剤＃１２の生物物理学的特性の分析のため、及び標的タンパク質に対するそれらの結合親和性の決定のため（実施例２を参照されたい）、より容易な精製のために、Ｎ末端で融合されたＨｉｓタグ（配列番号２５）を有する結合部分をコードする発現ベクターを構築した。

【0337】

分析のために選択された結合タンパク質の高レベル及び可溶性発現。
更なる分析のために、結合剤をＥ．ｃｏｌｉ細胞において発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを使用して精製した。５０ｍＬの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、１０００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ５００（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理又はフレンチプレス）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理工程の前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。ＴＣＥ ＣＤ３結合ドメインに対して結合特異性を有する高可溶性アンキリン反復タンパク質は、４～１２％のＳＤＳ－ＰＡＧＥから推定される９５％超の純度で、Ｅ．ｃｏｌｉ培養物から精製した（培養物１リットル当たり２００ｍｇまでのアンキリン反復タンパク質）。

【0338】

実施例２：ＳＰＲ結合アッセイ
本発明の結合部分の重要な特徴は、薬物分子に対するその親和性である。関連する態様には、薬物分子からの結合部分のオフレート及び得られる遮断半減期が含まれる。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して、ＴＣＥ薬物分子のＣＤ３結合ドメインに対するアンキリン反復結合ドメインの結合親和性を決定した。全てのＳＰＲデータを、ランニングバッファーとしてＰＢＳ－Ｔ（０．００５％のＴｗｅｅｎ ２０）を用いてＢｉｏ－Ｒａｄ ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置を使用して生成した。新しいニュートラアビジンセンサーチップ（ＮＬＣ）を空気で初期化し、Ｂｉｏ－Ｒａｄマニュアルに従って調整した。ＳＰＲデータは、ＮＬＣチップ上に捕捉されたビオチン化結合剤＃１～＃４（上の実施例１に列挙されるような）及びそれぞれ分析物として用いた配列番号１３～１７を有するＣＤ３特異的結合ドメインへの結合について生成した。データは、２５℃で、５０ｎＭ（結合剤＃１）又は３００ｎＭ（結合剤＃２、＃３及び＃４）のいずれかで開始する標的の１：３希釈系列を用いて生成し、４０分間のオン速度（ｋ_on）、オフ速度（ｋ_off）を測定し、結合剤＃１及び＃２についての平衡解離定数（ＫＤ）を導出した。結合剤＃３及び＃４についての解離定数（ＫＤ）を、平衡適合によって得た。全ての結合剤－ＣＤ３特異的結合ドメインの組み合わせについて得られたＫＤ値を図２に示し、より詳細な情報を表３に示す。
全ての結合剤は、２桁のｐＭ～３桁のｎＭの範囲のＫＤ値を示した。したがって、これらの実験は、結合剤＃１～＃４が、ＴＣＥ薬物分子において使用されるＣＤ３特異的結合ドメインに対して広範な親和性を包含することを示した。

【0339】

【表3】

【0340】

実施例３：ＣＤ３－ＰＤＤは、抗ＣＤ３結合ドメイン及び互いに異なる親和性を有する結合剤を使用して構築することができる
ＣＤ３－ＰＤＤは、ＣＤ３に対する親和性が異なる抗ＣＤ３結合ドメイン及びこれらに対する異なる結合剤を使用して構築することができる。図３は、３人のドナーのうちの代表的な１人からのＨＣＴ１１６腫瘍細胞及び汎Ｔ細胞を使用する標準的な腫瘍細胞死滅アッセイを示す。ＣＤ３に対してより低い親和性を有する抗ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９又はＣＤ３に対してより高い親和性を有する抗ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１２２のいずれかを含む活性ＴＣＥ（抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３）を、抗ＣＤ３ドメインに対する２つの異なる結合剤（結合剤＃３又は＃４）を含むそれらの対応するＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ対応物と比較した。
図２に示されるそれぞれのＣＤ３結合ドメインに対する結合剤の測定された親和性と一致して、両方のＣＤ３結合ドメインに対してより高い親和性を有する結合剤＃４は、より低い親和性の結合剤＃３よりも全体的に高いマスキング効率を示した。加えて、Ｃ７ｖ１２２ ＣＤ３結合ドメイン（図３Ｂ）の状況における結合剤＃３及び＃４のマスキング効率は、ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９（図３Ａ）を有する構築物よりも高いことが見出された。ＥＣ５０値（単位：ｐＭ）を表４に示す。

【0341】

【表4】

ｎ．ａ．：該当なし

【0342】

実施例５：ＣＤ３－ＰＤＤのマスキング効率は、標的細胞上の抗原発現レベルに依存する
マスキング効率に対する腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）発現レベルの影響を理解するために、２つの異なるＥＧＦＲ発現腫瘍細胞株、すなわち、扁平上皮がん細胞株Ａ４３１及び結腸直腸がん細胞株ＨＣＴ１１６を用いてＴ細胞活性化アッセイを実行した。ＱＵＩＦＩＫＩＴによる定量の結果、Ａ４３１細胞上には約２３０ｋのＥＧＦＲ分子（ＥＧＦＲ⁺⁺⁺）が、ＨＣＴ１１６細胞上には約１８ｋのＥＧＦＲ分子（ＥＧＦＲ⁺）が存在した。これら２つの細胞株と活性ＴＣＥ又は切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ（いずれもＣＤ３結合ドメイン結合剤Ｃ７ｖ１４を含む）を使用したＴ細胞活性化実験を図４に示し、これは、ＥＧＦＲ中～低発現ＨＣＴ１１６細胞については、マスキングウィンドウ（すなわち、活性ＴＣＥとＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬとの間のＥＣ５０差）が非常に大きいのに対して、ＥＧＦＲ高発現Ａ４３１細胞については、マスキングウィンドウがわずか約２００倍であることを実証している。腫瘍抗原発現レベルに対するマスキング効率のこの依存性はまた、本明細書中に記載されるものと類似のプロドラッグ概念について、Ｇｅｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ，２０２０）によって記載されている。
表５は、Ｔ細胞活性化アッセイにおいて測定されたＥＣ５０値（単位：ｐＭ）をまとめたものである。

【0343】

【表5】

【0344】

実施例６：組換えプロテアーゼは、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬを効率的にインビトロで切断する
切断不可能なプロドラッグＣＤ３－ＰＤＤ（ＮＣＬ）並びに切断可能なリンカー＃２及びＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９又はＣ７ｖ１２２のいずれかを含有する切断可能なＣＤ３－ＰＤＤ（ＣＬ）を、マトリプターゼ（１：１０’０００酵素：基質比）の存在下又は非存在下でインキュベートし、３７℃で２０時間インキュベートした後、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）で切断を分析した（図５）。ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬは、マトリプターゼによって影響を受けなかったが、Ｃ７ｖ１１９又はＣ７ｖ１２２のいずれかを含む２つのＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは、主に１ドメイン（１Ｄ）結合剤及び２ドメイン（２Ｄ）活性ＴＣＥに切断された。次いで、切断されたＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬを、図１０に示されるように、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅アッセイにおいて切断前対照として利用し、活性ＴＣＥとほぼ同様に機能的であることが証明された。
次の工程において、３つの異なる切断可能なリンカー配列（リンカー＃１～＃３）を含有するＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ、並びにＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬを、５つの異なる腫瘍関連プロテアーゼ、すなわちマトリプターゼ、ウロキナーゼ、ＭＭＰ－２、－７、及び－９を用いて詳細に調査した。各プロテアーゼによる各構築物の切断速度は、切断進行曲線を記録し、得られた１Ｄ及び２Ｄ断片をキャピラリー電気泳動分離装置（ＬａｂＣｈｉｐ）で分析することによって決定した。切断速度（酵素分子及び１分当たりの切断されたＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ分子）を計算し、図６に示す。リンカー＃１はマトリプターゼ及びウロキナーゼによってのみ切断を呈し、マトリックスメタロプロテアーゼ（matrix-metalloprotease、ＭＭＰ）はこれらの構築物を切断することができなかった。対照的に、リンカー＃２は、ＭＭＰ－７を除く調査した全てのプロテアーゼによって効率的に切断されたが、リンカー＃３は、５つ全てのプロテアーゼによって切断された。リンカー＃２の全体的な切断速度はリンカー＃３よりも優れていたので、リンカー＃２を含有する構築物を更なる調査のために選択した。

【0345】

実施例７：ＣＤ３－ＰＤＤは、標的細胞上のＴＡＡと、リンカーの切断の両方の存在下でのみ活性である
条件付きで活性化されるＣＤ３－プロドラッグの概念は、論理ＡＮＤゲートの形態を構成する：事象１（ＴＡＡ結合ドメインがＴＡＡに結合する）、並びに事象２（腫瘍関連プロテアーゼがリンカーを切断することによってＣＤ３－結合剤を遮断しない）が存在する場合にのみ、薬物は、Ｔ細胞、薬物及び標的細胞の間で三分子複合体を形成することができる。したがって、事象１又は２のいずれかが欠けていると、ＣＤ３－ＰＤＤは、この三分子複合体を形成することができないはずである。
この仮説を調査するために、本発明者らは、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ及びＣＬが、腫瘍細胞上のＴＡＡの非存在下で（事象１）、又はマスクされたＣＤ３結合ドメインを用いて（事象２）、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅を示すかどうかを確認した。したがって、ＨＣＴ１１６のＥＧＦＲノックアウト細胞株を生成し、腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化について野生型細胞株と一緒に試験した（それぞれ図７Ａ及び図７Ｂを参照されたい）。ＴＡＡ ＥＧＦＲの非存在下では、いずれの構築物も腫瘍細胞死滅又はＴ細胞活性化を呈さず、事象１が活性の前提条件であることが確認された。ＣＤ３結合ドメインと結合剤との間に切断不可能なリンカーを含有するＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬについては、腫瘍細胞死滅又はＴ細胞活性化に関して活性は観察されなかった。対照的に、切断可能なリンカー＃２を含有するＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬについては、腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化を観察することができたが、効力及び有効性レベルはより低かった。この観察は、インビトロアッセイにおいて細胞によって分泌されるプロテアーゼによるＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ分子の部分的切断に起因するものである（図８を参照されたい）。
表６は、１人の代表的なドナーのＥＧＦＲ⁺又はＥＧＦＲ ＫＯ ＨＣＴ１１６腫瘍細胞及び汎Ｔ細胞のいずれかを使用する腫瘍細胞死滅及びＴ細胞活性化アッセイにおいて測定されたＥＣ５０値（単位：ｐＭ）をまとめたものである。

【0346】

【表6】

ｎ．ａ．：該当なし

【0347】

実施例８：インビトロ細胞アッセイにおいて分泌されるプロテアーゼは、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬの活性化をもたらす
ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは、切断不可能なＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬについて観察されたものよりも高いＴ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅活性を再現可能に呈したことが観察されている。優勢な仮説は、腫瘍細胞又はＴ細胞によって分泌されるプロテアーゼがＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬを切断し、したがってそれを活性化させるというものであった。この仮説を確認するために、汎Ｔ細胞及びＡ４３１腫瘍細胞のＴ細胞活性化実験の上清を実験の終了時（すなわち、４８時間のインキュベーション後）に回収し、免疫沈降及びウエスタンブロットによって分析した（図８）。実際、２つの異なるリンカー配列（リンカー＃２及び＃３）を有する構築物は、それぞれ３５ｋＤａ及び１７ｋＤａにおける１ドメイン（１Ｄ）及び２ドメイン（２Ｄ）バンドの存在によって例示されるように、有意な程度まで切断されることが見出された。切断の程度はまた、それぞれのＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ構築物のＥＣ５０と相関した。対照的に、切断不可能なリンカーを有するＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬは、いかなる切断も示さず、１００倍超のマスキングウィンドウを示した（活性ＴＣＥとＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬとの間のＥＣ５０差）。

【0348】

実施例９：ＣＤ３－ＰＤＤ構築物は、抗ＨＳＡ結合ドメインをそれらのＣ末端に結合させることによって半減期を延長できる
ＣＤ３－ＰＤＤ構築物は、抗ＨＳＡ結合ドメインをそれらのＣ末端に結合させることによって容易に半減期を延長（ＨＬＥ）することができる。これは、腫瘍関連プロテアーゼによるプロテアーゼ切断可能なリンカーの切断時に、長寿命のＣＤ３－ＰＤＤ分子を短寿命の活性ＴＣＥ（抗ＴＡＡ×抗ＣＤ３）に変換することができるという利点をもたらす。短寿命の活性ＴＣＥは、腫瘍から出て循環に入ると迅速に除去され、副作用が少なくなる。

【0349】

抗ＣＤ３ドメイン上の結合剤のマスキング効果に対するＨＳＡの潜在的に負の立体効果を調査するために、本発明者らは、活性ＴＣＥ、半減期延長されていないＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ、及び半減期延長されたＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬを、汎Ｔ細胞及びＨＣＴ１１６腫瘍細胞を用いた標準的な腫瘍死滅アッセイにおいて、６００μＭのＨＳＡの存在下で比較した。非ＨＬＥ及びＨＬＥ ＣＤ３－ＰＤＤ構築物の両方を、遮断相互作用をより緊密にすることによって立体障害に潜在的に対抗するために、２つの異なる結合剤に関して研究した。結合剤＃１はＣＤ３結合ドメインに対して高い親和性（＜１ｎＭのＫＤ）を呈し、結合剤＃３はＣＤ３結合ドメインに対してより低い親和性（＞１００ｎＭのＫＤ）を示す（それぞれ図９Ａ及び図９Ｂを参照されたい）。
より低い親和性の結合剤＃３（＞１００ｎＭのＫＤ）を含有するＣＤ３－ＰＤＤ構築物は、それらのＣ末端に結合した抗ＨＳＡ結合ドメインによるマスキング効果のわずかな低下を示すことが見出され、したがって、実際にＨＳＡの存在が結合剤－抗ＣＤ３ドメイン相互作用に対してわずかに負の立体効果を有し得ることが示された。しかしながら、マスキング効率におけるこのわずかな損失は、ＣＤ３－ＰＤＤ構築物に対してより高い親和性の結合剤を選択することによって克服することができる。

【0350】

実施例１０：細胞結合
ＨＣＴ１１６腫瘍細胞上のヒトＥＧＦＲ及びＪｕｒｋａｔ ｗｔ細胞上のヒトＣＤ３への結合をＦＣによって評価し、ここで、ＤＡＲＰｉｎ分子を蛍光標識抗ＤＡＲＰｉｎ抗体を用いて検出した。この目的のために、活性ＴＣＥ（抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３）及びＣＬ又はＮＣＬを有するＣＤ３－ＰＤＤ構築物を直接比較した。予想通り、ＨＣＴ１１６細胞への結合は、試験した全ての構築物について３５０～６００ｐＭの範囲のＥＣ５０値と同等であった（図１０、第１列及び表７を参照されたい）。
Ｊｕｒｋａｔ ｗｔ細胞への結合は、より低い親和性ＣＤ３結合剤Ｃ７ｖ１１９（配列番号１５）（ＥＣ５０＞１０ｎＭ、図１０、第２列を参照されたい）を含む活性ＴＣＥと比較して、より高い親和性のＣＤ３結合剤Ｃ７ｖ１２２（配列番号１６）（ＥＣ５０＝７．９ｎＭ）を含む活性ＴＣＥについてわずかに強いことが見出された。ＣＬ又はＮＣＬを有するＣＤ３－ＰＤＤ構築物は、ＣＤ３を介したＴ細胞への結合を示さず、したがって、マスキング概念の機能性が確認された。

【0351】

【表7】

【0352】

実施例１１：Ｔ細胞活性化／腫瘍細胞死滅アッセイ
Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅アッセイのために、標的腫瘍細胞及びエフェクターＴ細胞（健康な血液ドナーからの汎Ｔ細胞）を、５：１のエフェクター対標的細胞比で組み合わせ、プロドラッグ試料を添加し、混合物を３７℃で４８時間インキュベートした。死滅した腫瘍細胞のＬＤＨ放出について上清を分析し、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の活性化マーカー（ＣＤ２５）のレベルをＦＡＣＳ（ＣＤ２５モノクローナル抗体（ＢＣ９６）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙａｎｉｎｅ５．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（商標）を使用）によって決定した。様々な対照を含めた（すなわち、Ｔ細胞のみ、腫瘍細胞のみ、Ｔｒｉｔｏｎ対照、結合部分のみ）。
アッセイを、３人の個々のヒトドナー由来の汎Ｔ細胞を用いて３回実行した。
この目的のために、ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９（配列番号１５）（ＣＤ３に対してより低い親和性）又はＣ７ｖ１２２（配列番号１６）（ＣＤ３に対するより高い親和性）のいずれかを含む活性ＴＣＥ（抗ＥＧＦＲ×抗ＣＤ３）、ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ、及び予め切断されたＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬを直接比較した。全てのＣＤ３－ＰＤＤ構築物について、結合剤＃４（配列番号４）を使用して、ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９又はＣ７ｖ１２２をマスクした。

【0353】

活性ＴＣＥ及び切断前ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬは、Ｔ細胞活性化（図１０、第３列及び表８を参照されたい）及び腫瘍細胞死滅アッセイ（図１０、第４列及び表８を参照されたい）において、１桁～低い２桁のｐＭ範囲のＥＣ５０値を示した。活性ＴＣＥ及び予め切断されたＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬと比較して、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ構築物は、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅アッセイにおいて約１０～２０倍高いＥＣ５０値を示したが、これはおそらく、試験されたインビトロ条件下で存在するプロテアーゼによるそれらの制限された切断に起因する。
加えて、Ｃ７ｖ１２２ドメインを含む構築物（図１０、下列及び表８を参照されたい）と比較して、ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１１９を含むＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ構築物（図１０、上列及び表８を参照されたい）では、より低い効力及びより低い有効性が観察された。したがって、Ｃ７ｖ１２２ベースの構築物を、それぞれの対照とともにＰｏＣインビボ研究に移した。
ＣＤ３－ＰＤＤ ＮＣＬ構築物は、Ｔ細胞活性化も腫瘍細胞死滅も引き起こさなかった。

【0354】

【表8】

【0355】

実施例１２：切断可能なＣＤ３－ＰＤＤは、ＨＣＴ１１６腫瘍細胞を生着させたＣＤ３４＋ｈｕ－マウスにおいてインビボで有効であり、忍容性が良好である
Ｔ細胞結合、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞死滅について実施例１０及び１１で試験したより高い親和性ＣＤ３結合ドメインＣ７ｖ１２２（配列番号１６）を使用した構築物（図１０）を、概念実証インビボ試験のために選択した。このインビボ研究では、いずれの分子も半減期が延長されなかった。
インビボ研究の目的は、造血幹細胞（ＣＤ３４＋）でヒト化され、ヒト骨髄細胞の存在について最適化された免疫不全マウスを使用して、ヒト結腸がん異種移植モデル（ＨＣＴ１１６）における切断可能なＣＤ３－ＰＤＤの耐容性及び有効性を評価することであった。ＥＧＦＲ結合剤のマウス交差反応性に起因して、この動物モデルは、治療濃度域について、すなわち抗腫瘍有効性及び安全性の両方について同時に評価することを可能にした。２４匹のｈｕ－マウスに、Ｄ０に３×１０⁶個のＨＣＴ－１１６細胞を皮下生着させた。流体力学的プラスミド送達（ＩＬ－３、ＩＬ－４、Ｆｌｔ３Ｌ、ＩＬ－１５及びＧＭ－ＣＳＦのサイトカイン追加免疫）を、腫瘍細胞生着の７日前に実行した。腫瘍が３５ｍｍ³の平均容積に達したら、マウスを、それらの腫瘍体積、ｈＣＤ３ Ｔ血球数、ヒト型化率、及び臍帯血ドナーに従って、以下のように６匹のマウスの４群に無作為化した。
・第１群：ビヒクル対照（ＰＢＳ＋０．０５％ Ｔｗｅｅｎ－２０）
・第２群３０ｎｍｏｌ／ｋｇの活性ＴＣＥ対照
・第３群３０ｎｍｏｌ／ｋｇのプロテアーゼ切断可能なリンカー（ＣＬ）を有するＣＤ３－ＰＤＤ
・第４群３０ｎｍｏｌ／ｋｇの切断不可能なリンカー（non-cleavable linker、ＮＣＬ）を有するＣＤ３－ＰＤＤ
処置関連毒性の誘導のためにＤ８、Ｄ９、Ｄ１１、及びＤ１８に４回の注射のみを受けた活性Ｔ細胞エンゲージャー対照群を除いて、全ての群について、毎日の腹腔内注射をＤ８に１７日間開始した。血液を、血漿収集及び下流のサイトカイン測定のために、Ｄ－１に最初の処置から４時間後（Ｄ８）に腫瘍細胞生着の前に収集した。腫瘍体積を週に３回モニターした。体重及び臨床健康スコアを、処置開始まで週に３回、及び処置期間中は毎日測定した。
切断可能なＣＤ３－ＰＤＤは、活性な遮断されていないＴＣＥで観察されたものと同様の強い抗腫瘍活性を実証した（図１１Ｂ）。ＣＤ３－ＮＣＬの抗腫瘍有効性は、活性ＴＣＥとビヒクルとの中間であった。しかしながら、最も重要なことには、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ及びＮＣＬの両方を、毒性の徴候なしに毎日投与することができたのに対して、活性ＴＣＥの投与は、強い毒性のために停止しなければならず、３／６匹の動物の損失さえ引き起こした。この毒性は、２回の注射後に既に活性ＴＣＥで処置された群の体重（ＢＷ）の強い減少（図１１Ｄ）、並びにこの群の動物の臨床健康スコアの急速な低下（図１１Ｅ）に表される。注射前及び最初の用量の注射の４時間後のマウスの血清から決定されたサイトカインは、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬ及びＮＣＬで処置した群のマウスについてはサイトカインの上昇をほとんど示さなかったが、活性ＴＣＥで処置した動物については有意に上昇したレベルを示した。要約すると、ＣＤ３－ＰＤＤ ＣＬで処置された動物は、活性ＴＣＥの有害な毒性作用なしに強い抗腫瘍効力を示した。

【0356】

本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の実施形態は、本発明の実施形態の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の実施形態が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

【0357】

当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【0358】

【表9-1】

【0359】

【表9-2】

【0360】

【表9-3】

【0361】

【表9-4】

【0362】

【表9-5】

【0363】

【表9-6】

【0364】

【表9-7】

【0365】

【表9-8】

【0366】

【表9-9】

【0367】

【表9-10】

【0368】

【表9-11】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11-1】

【図11-2】

【図11-3】

【配列表】

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【国際調査報告】