特表 2024-509895 Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くない外因性タンパク質の産生のための遺伝子組換え糸状菌

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-05

(54)【発明の名称】Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くない外因性タンパク質の産生のための遺伝子組換え糸状菌

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20240227BHJP

   C12P 21/00 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 15/54 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240227BHJP

   C07K 14/435 20060101ALI20240227BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12P21/00 C ZNA

C12N15/54

C12N1/15

C07K14/435

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023554870

(86)(22)【出願日】2022-03-10

(85)【翻訳文提出日】2023-10-11

(86)【国際出願番号】 IB2022052138

(87)【国際公開番号】W WO2022190022

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】63/159,492

(32)【優先日】2021-03-11

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】522441574

【氏名又は名称】ダイアディク インターナショナル（ユーエスエー），インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】チェレット，ローネン

(72)【発明者】

【氏名】エマルファーブ，マーク アーロン

(72)【発明者】

【氏名】マキネン，マリ

(72)【発明者】

【氏名】サロヘイモ，マルク

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA05

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA16

4B065AA58X

4B065AA60X

4B065AA65X

4B065AA67X

4B065AA70X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4H045AA20

4H045BA10

4H045CA40

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

哺乳動物タンパク質のＮ－グリカンが少ないか全くないタンパク質を産生するように遺伝子組換えされた、ｓｔｔ３および／またはｃｗｈ８遺伝子の欠失または破壊を含む、子嚢菌門糸状菌が提供される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くない目的のタンパク質を産生することができる、遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌であって、ＳＴＴ３および／またはＣＷＨ８の発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む、遺伝子組換え糸状菌。

【請求項2】

前記少なくとも１つの細胞が、前記目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む、請求項１の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項3】

前記少なくとも１つの細胞が、ＳＴＴ３の発現および／または活性が低下している、請求項１または２のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項4】

前記ＳＴＴ３が、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＳＴＴ３のアミノ酸と少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項5】

前記サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＳＴＴ３が、配列番号２７のアミノ酸を含む、請求項４に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項6】

前記少なくとも１つの細胞が、ＣＷＨ８の発現および／または活性が低下している、請求項１から５のいずれか一項の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項7】

前記ＣＷＨ８が、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＣＷＨ８のアミノ酸と少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項8】

前記サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＣＨＷ８が、配列番号２８のアミノ酸を含む、請求項７に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項9】

ＳＴＴ３およびＣＷＨ８の発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項10】

オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の触媒サブユニットの産生に失敗するように、前記遺伝子組換えが、前記ｓｔｔ３遺伝子の欠失または破壊を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項11】

機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生に失敗するように、前記遺伝子組換えが、前記ｃｗｈ８遺伝子の欠失もしくは破壊を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項12】

チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の族内の属のものである、請求項１から１１のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項13】

サーモセロマイセス属（Thermothelomyces）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、トリコデルマ属（Trichoderma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、ラサムソニア属（Rasamsonia）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、コリナスカス属（Corynascus）、フザリウム属（Fusarium）、アカパンカビ属（Neurospora）、およびタラロマイセス属（Talaromyces）からなる群より選択される属のものである、請求項１２に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項14】

種サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）（ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）とも示される）のものである、請求項１３に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項15】

配列番号２９に記載の核酸配列と少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％または１００％の同一性を有するｒＤＮＡ配列を含む、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）株である、請求項１４に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項16】

サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）Ｃ１である、請求項１５に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項17】

前記目的のタンパク質が、抗原、治療用タンパク質、抗体、酵素、ワクチンおよび構造タンパク質からなる群より選択される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項18】

前記目的のタンパク質が、分泌タンパク質である、請求項１から１７のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項19】

内因性プロテアーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を欠失させるようにさらに修飾された株である、請求項１から１８のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項20】

少なくとも５個のプロテアーゼの発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む、請求項１から１９のいずれか一項に記載の遺伝子組換え糸状菌。

【請求項21】

Ｎ－グリカンが少ないか全くないタンパク質を産生することができる子嚢菌門糸状菌を生成するための方法であって：
ａ）前記子嚢菌門糸状菌のＳＴＴ３タンパク質の発現および／もしくは活性を低下させるステップ；ならびに／または
ｂ）前記子嚢菌門糸状菌のＣＨＷ８タンパク質の発現および／もしくは活性を低下させるステップ
を含む、方法。

【請求項22】

ａ）オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の機能的触媒サブユニットの産生を低下させるように、前記子嚢菌門糸状菌の前記ｓｔｔ３遺伝子を欠失させるまたは破壊するステップ；ならびに／または
ｂ）機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生を低下させるように、前記子嚢菌門糸状菌の前記ｃｈｗ８遺伝子を欠失させるまたは破壊するステップ
を含む、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

さらに、前記子嚢菌門糸状菌に、目的の異種タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入し、それによって前記真菌におけるＮ－グリカンが少ないか全くない前記目的の異種タンパク質を発現するステップを含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

Ｎ－グリカンが少ないか全くない異種タンパク質を産生するための方法であって：
ａ）請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子組換えされた子嚢菌門糸状菌であって、目的の異種タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを含む前記真菌を提供するステップ；
ｂ）前記異種タンパク質を発現するのに適した条件下で前記子嚢菌門糸状菌を培養するステップ；および
ｃ）前記異種タンパク質を回収するステップ
を含む、方法。

【請求項25】

前記異種タンパク質が、前記子嚢菌門糸状菌で組換え発現された異種哺乳動物タンパク質である、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

請求項１から２０のいずれか一項に記載の遺伝子組換えされた子嚢菌門糸状菌により産生された、組換えタンパク質。

【請求項27】

前記タンパク質が、医薬品等級のものである、請求項２６に記載の組換えタンパク質。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、ＳＴＴ３および／またはＣＷＨ８タンパク質の発現および／活性が低下している遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌に関する。遺伝子組換え糸状菌は、部分的にＮ－結合グリコシル化を有するか全く有していない組換えタンパク質の強力な産生のために使用される。

【背景技術】

【0002】

グリコシル化またはリン酸化などの翻訳後タンパク質修飾を有する組換えタンパク質の発現および精製は、真核生物発現システムを使用してのみ達成することができる。哺乳動物および昆虫細胞株、植物および真菌を含む、真核生物タンパク質発現システムは、機能的真核生物タンパク質の産生に必要不可欠になっている。

【0003】

真核生物として、酵母および真菌は、Ｎ－およびＯ－グリコシル化を含む翻訳後修飾を実行することができるが、酵母および真菌におけるタンパク質グリコシル化は、哺乳動物細胞のものとは異なる。これらの問題を克服するため、特に、異種タンパク質の産生に最も頻繁に使用される種（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、ヤロウイア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、およびアスペルギルス属（Aspergillus）およびトリコデルマ属（Trichoderma）の種）で、Ｎ－グリコシル化経路を再設計する可能性が調査されている。

【0004】

Ｐａｒｓａｉｅ Ｎａｓａｂ他（２０１３，Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，７９（３）：９９７－１００７）は、Ｓ．セレビシエ（S. cerevisiae）においてヒトＮ－グリカンを保持する組換えタンパク質を産生するための合成Ｎ－グリコシル化経路を説明している。Ｐａｒｓａｉｅ Ｎａｓａｂ他による研究はまた、米国特許出願公開第２０１１／０２０７２１４号明細書にも記載されており、ＥＲ膜において脂質結合オリゴ糖（ＬＬＯ）フリッパーゼ活性を発現するように修飾されている細胞を開示している。フリッパーゼは、ＥＲの細胞質側にある１個、２個または３個のマンノースを含むＬＬＯを内腔側にフリップすることを可能にする。研究は、さらに、Ｄｅ Ｗａｃｈｔｅｒ他（２０１８，Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ｙｅａｓｔ Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｉｎ：Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ／Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）の他の関連研究とともにレビューされる。

【0005】

米国特許第７，０２９，８７２号明細書、米国特許第７，３２６，６８１号明細書、米国特許第７，６２９，１６３号明細書、および米国特許第７，９８１，６６０号明細書は、ヒトにおける糖タンパク質の処理を模倣する、一連の酵素反応を実行することを可能にする、遺伝子組換えグリコシル化経路を有する細胞株を開示する。通常、高マンノース含有Ｎ－グリカンを産生する、単細胞および多細胞の真菌などの真核生物を修飾して、ヒトグリコシル化経路に沿ってＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２または他の構造などのＮ－グリカンを産生する。

【0006】

米国特許第９，３５９，６２８号明細書は、より小さいグリカンを有するタンパク質を産生することができるピキア属（Pichia）の遺伝子改変株を開示する。特に、遺伝子改変株は、α－１，２－マンノシダーゼおよびグルコシダーゼＩＩのいずれかまたは両方を発現することができる。ＯＣＨ１遺伝子が破壊されるように、遺伝子改変株をさらに修飾することができる。ピキア属（Pichia）のそのような遺伝子改変株を使用して、より小さいグリカンを有する糖タンパク質を産生する方法も提供される。

【0007】

本発明の出願人に対する米国特許第８，２６８，５８５号明細書および米国特許第８，８７１，４９３号明細書は、異種タンパク質またはポリペプチドを発現および分泌するための糸状菌宿主の分野における形質転換システムを開示する。また、経済的な方法で大量のポリペプチドまたはタンパク質を産生するためのプロセスも開示される。システムは、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、より具体的にはクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）およびその突然変異体または誘導体の形質転換またはトランスフェクトされた真菌株を含む。また、クリソスポリウム属（Chrysosporium）コード配列、同様にクリソスポリウム属（Chrysosporium）遺伝子の発現調節配列を含む形質転換体も開示される。

【0008】

サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）（Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. heterothallica））株Ｃ１（近年、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）から名前が変更されたミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）から名前が変更された）は、高レベルのセルラーゼを産生する耐熱性子嚢菌門糸状菌であり、商業規模でのこれらの酵素および他の酵素の産生にとって魅力的なものにする。

【0009】

野生型Ｃ１は、ブダペスト条約にしたがって、１９９６年８月２９日の寄託日に番号ＶＫＭ Ｆ－３５００ Ｄで寄託された。高セルロース（ＨＣ）株および低セルロース（ＬＣ）株はまた、例えば、米国特許第８，２６８，５８５号明細書に記載されているように寄託されている。

【0010】

米国特許第９，６９５，４５４号は、プロテアーゼ活性を低下させ、フコシル化経路を発現させている、トリコデルマ属（Trichoderma）真菌細胞などの糸状菌細胞を含む組成物を開示している。さらに開示されているものは、発現システムとして、遺伝子組換え糸状菌細胞、例えばトリコデルマ属（Trichoderma）真菌細胞を使用して、フコシル化Ｎ－グリカンを有する糖タンパク質を産生するための方法である。

【0011】

米国特許第７，４４９，３０８号明細書および米国特許第７，９３５，５１３号明細書は、哺乳動物、例えばヒトの治療用糖タンパク質の産生のための宿主株になるために、一連のグリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシダーゼの異種発現によりさらに修飾される場合がある、修飾されたオリゴ糖を有する真核宿主細胞を開示している。改変宿主細胞で作られるＮ－グリカンは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２コア構造を有し、ヒト様糖タンパク質を得るために、その後、１つまたは複数の酵素、例えばグリコシルトランスフェラーゼ、糖輸送体およびマンノシダーゼの異種発現によりさらに修飾される場合がある。

【0012】

米国特許第８，２６８，５８５号明細書および米国特許第８，８７１，４９３号明細書は、異種タンパク質またはポリペプチドを発現および分泌するための糸状菌宿主の分野における形質転換システムを開示している。また、経済的な方法で大量のポリペプチドまたはタンパク質を産生するためのプロセスも開示されている。システムは、形質転換またはトランスフェクトされたクリソスポリウム属（Chrysosporium）、より具体的にはクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）およびその突然変異体または誘導体の真菌株を含む。また、クリソスポリウム属（Chrysosporium）コード配列、同様にクリソスポリウム属（Chrysosporium）遺伝子の発現調節配列を含む形質転換体も開示される。

【0013】

米国特許第９，１７５，２９６号明細書は、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）の真菌宿主株を開示する。また、純度が７５％より高い純タンパク質の同種および／または異種産生のための方法、人工タンパク質ミクスの産生のための方法および所望の酵素を機能的に発現する株の単純化されたスクリーニングのための方法も開示される。米国特許第９，１７５，２９６号明細書は、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）（近年、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）に名前が変更された）における遺伝子発現の転写調節に適した単離されたプロモータ配列およびプロテアーゼ分泌がクリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）株ＵＶ１８－２５のプロテアーゼ分泌の２０％未満である、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）の真菌宿主株を単離するための方法をさらに開示している。

【0014】

タンパク質が、多種多様な工業的利用および製薬的利用に適しているように、部分的にＮ－結合グリコシル化を有するか全く有していないタンパク質を高収率で産生することができる組換えタンパク質を産生するための発現システムの必要性がある。

【発明の概要】

【0015】

本発明は、哺乳動物タンパク質のＮ－グリカン修飾が少ないか全くないタンパク質を産生するように遺伝子組換えされた遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌を提供する。特に、本発明は、Ｎ－グリカン修飾が少ないか全くない組換えタンパク質を産生するように遺伝子組換えされた代表的な子嚢菌門糸状菌としてサーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）株Ｃ１を提供する。いくらかの実施形態において、本明細書に開示されている真菌は、ｓｔｔ３および／またはｃｗｈ８遺伝子を欠失させるように修飾された。

【0016】

本発明は、一部が、本明細書に開示されているように遺伝子組換えされたＴｈ．ヘテロタリカ（Th. heterothallica）が、非修飾株と比較してグリカンが少ないか全くないタンパク質を産生するという知見に基づいている。これは、得られたＮ－グリカンでのばらつきが大きいタンパク質を産生する、従来説明されている発現システムとは対照的である。

【0017】

好都合には、本発明の組換え子嚢菌門糸状菌細胞は、部分的に翻訳後修飾を有する異種タンパク質の産生を可能にする。これらのタンパク質は、完全グリコシル化タンパク質が適していない多種多様の用途において使用される場合がある。例えば、タンパク質は、所望の溶解性および／または生物活性のために設計することができる。Ｎ－グリカンの量が少ないタンパク質は、完全グリコシル化タンパク質と比較して低下した免疫原性を示す場合がある。本発明の部分Ｎ－グリコシル化タンパク質は、追加または他のタンパク質修飾のための主要な物質として使用される場合がある。さらに、非Ｎ－グリコシル化タンパク質は、薬物動態／薬力学的研究において、種々のグリコシル化形態および混合物のための潜在的な制御タンパク質として使用される場合がある。さらに、治療効果が、多くの場合Ｎ－グリコシル化に依存されるので、本明細書に記載の部分グリコシル化タンパク質は、自然にグリコシル化されたタンパク質と比較して異なる治療効果を有する場合がある。

【0018】

好都合には、本発明の組換え子嚢菌門糸状菌細胞は、高い収率および安定性でタンパク質を産生する。本発明のＴｈ．ヘテロタリカ（Th. heterothallica）細胞を使用して得られたタンパク質レベルは、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞、または酵母を使用して得られるものよりも遥かに高い。

【0019】

そのため、本発明は、製薬工業および非製薬工業における多種多様の利用に適した、Ｎ－グリカンが少ないか全くない真核生物組換えタンパク質を産生するための効果的なシステムを提供する。

【0020】

一態様によれば、本発明は、Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くない目的のタンパク質を産生することができる遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌を提供し、遺伝子組換え糸状菌は、ＳＴＴ３および／またはＣＷＨ８の発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む。

【0021】

いくらかの実施形態によれば、少なくとも１つの細胞は、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0022】

いくらかの実施形態によれば、少なくとも１つの細胞は、ＳＴＴ３の発現および／または活性が低下している。

【0023】

いくらかの実施形態によれば、ＳＴＴ３は、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＳＴＴ３のアミノ酸と少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態によれば、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＳＴＴ３は、配列番号２７のアミノ酸を含む。

【0024】

いくらかの実施形態によれば、少なくとも１つの細胞は、ＣＷＨ８の発現および／または活性が低下している。

【0025】

いくらかの実施形態によれば、ＣＷＨ８は、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＣＷＨ８のアミノ酸と少なくとも７５％、または少なくとも８０％、または少なくとも８５％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の実施形態によれば、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）ＣＷＨ８は、配列番号２８のアミノ酸を含む。

【0026】

いくらかの実施形態によれば、組換え糸状菌は、ＳＴＴ３およびＣＷＨ８タンパク質の発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む。

【0027】

いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換えは、ｓｔｔ３遺伝子の欠失または破壊を含む。いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換えは、組換え糸状菌が、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の触媒サブユニットの量を少なく産生するように、ｓｔｔ３遺伝子の欠失または破壊を含む。いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換えは、組換え糸状菌が、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の触媒サブユニットの産生に失敗するように、ｓｔｔ３遺伝子の欠失または破壊を含む。

【0028】

いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換えは、ｃｗｈ８遺伝子の欠失または破壊を含む。いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換えは、組換え糸状菌が、機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの量を少なく産生するように、ｃｗｈ８遺伝子の欠失または破壊を含む。いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換えは、組換え糸状菌が、機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生に失敗するようにｃｗｈ８遺伝子の欠失または破壊を含む。

【0029】

いくらかの実施形態によれば、組換え糸状菌は、Ｎ－結合グリコシル化の量が少ないタンパク質を発現する。ある特定の実施形態によれば、組換え糸状菌は、非組換え真菌と比較してＮ－結合グリコシル化が２０％より少ないタンパク質を発現する。追加の実施形態によれば、組換え糸状菌は、Ｎ－結合グリコシル化がないタンパク質を発現する。

【0030】

いくらかの実施形態によれば、子嚢菌門糸状菌は、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の族内の属のものである。

【0031】

いくらかの実施形態によれば、子嚢菌門糸状菌は、サーモセロマイセス属（Thermothelomyces）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、トリコデルマ属（Trichoderma）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、ラサムソニア属（Rasamsonia）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、コリナスカス属（Corynascus）、フザリウム属（Fusarium）、アカパンカビ属（Neurospora）、およびタラロミセス属（Talaromyces）からなる群より選択される属のものである。

【0032】

いくらかの実施形態によれば、子嚢菌門糸状菌は、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）（ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）とも示される）、ミセリオフトラ・ルテア（Myceliophthora lutea）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ファニキュロサス（Aspergillus funiculosus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ニホンコウジカビ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ハルチアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、ラサムソニア・エメルソニイ（Rasamsonia emersonii）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・ベルコーサム（Penicillium verrucosum）、スポロトリカム・サーモフィル（Sporotrichum thermophile）、コリナスカス・フミモンタナス（Corynascus fumimontanus）、コリナスカス・サーモフィラス（Corynascus thermophilus）、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、およびタラロマイセス・ピニフィラス（Talaromyces piniphilus）からなる群より選択される種のものである。

【0033】

いくらかの実施形態によれば、子嚢菌門糸状菌は、配列番号２９に記載の核酸配列と少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも９９％または１００％の同一性を有するｒＤＮＡ配列を含むサーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）株である。

【0034】

いくらかの実施形態によれば、子嚢菌門糸状菌は、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）である。いくらかの実施形態によれば、子嚢菌門糸状菌は、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）Ｃ１である。

【0035】

いくらかの実施形態において、Ｃ１は、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ－Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δａｌｐ２Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１５３、ＵＶ１８－１００ｆ（ｐｒｔ－Δａｌｐ１，Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４７、Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ（ｐｒｔ－Δａｌｐ１Δｃｈｉ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４９、およびＵＶ１８－１００ｆ（ｐｒｔ－Δａｌｐ１Δｐｅｐ４Δａｌｐ２Δｐｒｔ１Δｐｙｒ５）寄託番号ＣＢＳ１４１１４３およびそれらの誘導体からなる群より選択される株である。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0036】

いくらかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、酵素、構造タンパク質、ワクチン抗原およびその成分からなる群より選択される。

【0037】

いくらかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、分泌タンパク質である。ある特定の実施形態によれば、目的のタンパク質は、リーダーペプチドである。他の実施形態によれば、目的のタンパク質は、細胞内タンパク質である。ある特定の実施形態によれば、細胞内タンパク質は、膜または小胞結合タンパク質である。

【0038】

いくらかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、抗体またはそのフラグメントである。ある特定の実施形態によれば、抗体は、ＩｇＧ４またはＩｇＧ１である。追加の実施形態によれば、抗体は、二重特異性抗体または多重特異性抗体である。

【0039】

いくらかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、治療用タンパク質である。

【0040】

いくらかの実施形態によれば、目的のタンパク質は、ワクチンタンパク質抗原である。

【0041】

目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ構築物または発現ベクターの一部を形成する場合がある。

【0042】

いくらかの実施形態によれば、少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドは、前記子嚢菌門糸状菌で実行可能な少なくとも１つの調節エレメントをさらに含むＤＮＡ構築物または発現ベクターである。ある特定の実施形態によれば、調節エレメントは、前記真菌に内在している調節エレメントおよび前記真菌に異種の調節エレメントからなる群より選択される。

【0043】

いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、分泌タンパク質を産生するように設計されている。

【0044】

いくらかの実施形態において、本発明による子嚢菌門糸状菌は、抗体を発現するように遺伝子組換えされている。

【0045】

いくらかの実施形態において、子嚢菌門糸状菌は、内因性プロテアーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を欠失させるようにさらに組換えられた株である。

【0046】

いくらかの実施形態によれば、遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、少なくとも５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のプロテアーゼの発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態によれば、組換え糸状菌は、少なくとも９個、１０個、１１個、１２個、１３個、または１４個のプロテアーゼの発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。

【0047】

別の態様によれば、本発明は：
（ａ）子嚢菌門糸状菌のＳＴＴ３タンパク質の発現および／もしくは活性を低下させるステップ；ならびに／または
（ｂ）子嚢菌門糸状菌のＣＨＷ８タンパク質の発現および／もしくは活性を低下させるステップ
を含む、Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くないタンパク質を産生することができる子嚢菌門糸状菌を生成するための方法を提供する。

【0048】

いくらかの実施形態によれば、方法は：
（ａ）オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の機能的触媒サブユニットの産生を低下させるように、子嚢菌門糸状菌のｓｔｔ３遺伝子を欠失させるまたは破壊するステップ；ならびに／または
（ｂ）機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生を低下させるように、子嚢菌門糸状菌のｃｈｗ８遺伝子を欠失させるまたは破壊するステップ
を含む。

【0049】

いくらかの実施形態によれば、真菌は、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の機能的触媒サブユニットの産生に失敗する。

【0050】

いくらかの実施形態によれば、真菌は、機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生に失敗する。

【0051】

いくらかの実施形態によれば、真菌は、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の機能的触媒サブユニットおよび機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生に失敗する。

【0052】

いくらかの実施形態によれば、方法はさらに、子嚢菌門糸状菌に、目的の異種タンパク質をコードする外因性ポリヌクレオチドを導入し、それによって、真菌におけるＮ－グリカンが少ないか全くない目的の異種タンパク質を発現するステップを含む。

【0053】

別の態様によれば、本発明は、Ｎ－グリカン修飾が少ないか全くない異種タンパク質を産生するための方法を提供し、その方法は：
（ｉ）本明細書に記載されるようにＳＴＴ３および／またはＣＷＨ８の発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞ならびに本発明による目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む遺伝子組換えされた子嚢菌門糸状菌を提供するステップ；
（ｉｉ）そのタンパク質を発現するのに適した条件下で子嚢菌門糸状菌を培養するステップ；ならびに
（ｉｉｉ）そのタンパク質を回収するステップ
を含む。

【0054】

いくらかの実施形態において、タンパク質は、子嚢菌門糸状菌で組換え発現された異種哺乳動物タンパク質である。いくらかの特定の実施形態において、タンパク質は、子嚢菌門糸状菌で組換え発現されたヒトタンパク質である。他の実施形態において、タンパク質は、子嚢菌門糸状菌で組換え発現されたコンパニオンアニマルおよび／または家畜のタンパク質である。

【0055】

さらなる態様によれば、本発明は、本発明による遺伝子組換えされた子嚢菌門糸状菌により産生される組換えタンパク質を提供する。

【0056】

いくらかの実施形態において、本発明による遺伝子組換えされた子嚢菌門糸状菌により産生された組換えタンパク質は、医薬品等級のタンパク質である。

【0057】

さらなる態様によれば、本発明は、目的の少なくとも１つのタンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、適切な培地中、本明細書に記載されるように遺伝子組換え糸状菌を培養するステップ；および少なくとも１つのタンパク質産物を回収するステップを含む。

【0058】

いくらかの実施形態によれば、回収ステップは、真菌塊またはブロスからの増殖培地からタンパク質を回収するステップを含む。

【0059】

いくらかの実施形態によれば、タンパク質は、増殖培地から回収される。ある特定の実施形態によれば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％のタンパク質が分泌される。

【0060】

本明細書に開示されている各態様および実施形態の任意の組み合わせが、本発明の開示の範囲内に明示的に包含されることが理解されるべきである。

【0061】

本発明のこれらおよびさらなる態様および特徴は、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明らかになるであろう。

【図面の簡単な説明】

【0062】

【図1】真核細胞における小胞体（ＥＲ）の膜での脂質結合オリゴ糖生合成経路およびオリゴ糖の新生ポリペプチドへの移動。

【図2】非糖変性Ｃ１株（２Ａ）およびｓｔｔ３欠失株Ｍ３２１０（２Ｂ）においてバイオリアクタ内で産生された真菌の天然タンパク質上のＮ－グリカンパターンおよび異なるグリカン形態の存在量。

【図3】非糖変性Ｃ１株（３Ａ）およびｃｗｈ８欠失株Ｍ３２１１（３Ｂ）においてバイオリアクタ内で産生された真菌の天然タンパク質上のＮ－グリカンパターンおよび異なるグリカン形態の存在量。

【図4】非糖変性Ｃ１株（４Ａ）およびｓｔｔ３欠失株Ｍ３４８０（４Ｂ）において産生されたモノクローナル抗体上のＮ－グリカンパターンおよび異なるグリカン形態の存在量。

【図5】非糖変性Ｃ１株（５Ａ）およびｃｗｈ８欠失株Ｍ３４８１（５Ｂ）において産生されたモノクローナル抗体上のＮ－グリカンパターンおよび異なるグリカン形態の存在量。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本発明は、Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くないタンパク質を産生するための代替の高効率システムを提供する。本発明のシステムは、一部が、タンパク質の天然の生物工場および二次代謝産物として以前から開発されている糸状菌サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）Ｃ１およびその特定の株に基づく。本発明は、いくらかの実施形態において、ＳＴＴ３および／またはＣＷＨ８タンパク質の発現および／または活性が低下している遺伝子組換え真菌を提供する。遺伝子組換え真菌は、いくらかの実施形態において、複数のプロテアーゼの発現および／または活性を低下しているか無効にしている。

【0064】

本明細書に記載されるように遺伝子組換え真菌により産生されたタンパク質は、多種多様の医薬用途および非医薬用途に適している。

【0065】

一態様によれば、本発明は、目的のタンパク質を産生する遺伝子組換え糸状菌を提供し、遺伝子組換え糸状菌は、ＳＴＴ３および／またはＣＷＨ８タンパク質の発現および／または活性が低下している少なくとも１つの細胞を含む。

【0066】

追加の態様によれば、本発明は、Ｎ－結合グリコシル化が低いか全くない組換えタンパク質を産生することができる遺伝子組換え糸状菌を提供し、遺伝子組換えは：
（ｉ）遺伝子組換え糸状菌が、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の触媒サブユニットの産生に失敗するような、ｓｔｔ３遺伝子の欠失もしくは破壊；
（ｉｉ）遺伝子組換え糸状菌が、機能的ドリコールピロリン酸ホスファターゼの産生に失敗するような、ｃｗｈ８遺伝子の欠失もしくは破壊；または
（ｉｉｉ）ｓｔｔ３およびｃｗｈ８遺伝子両方の欠失または破壊
を含む。

【0067】

用語「破壊」は、遺伝子が、少なくとも１つの突然変異または構造変化を含み、破壊された遺伝子が、完全長の完全な機能的遺伝子産物の効率的な発現を指示することが不可能であるように構造的に破壊される可能性があることを意味する。用語「破壊」はまた、遺伝子が完全長および／または完全な機能的遺伝子産物を発現しないか効率的な発現が不可能であるように、破壊された遺伝子またはその産物の１つが機能的に阻害または不活性化される可能性があることを包含する。機能的阻害または不活性化は、転写または翻訳のいずれかのレベルで、構造的破壊および／または発現の中断から生じる可能性がある。用語「破壊」はまた、遺伝子発現の減弱またはノックダウンも包含する。

【0068】

タンパク質グリコシル化、つまり細胞内で新規に合成されたポリペプチド鎖の側鎖へのオリゴ糖の共有結合は、順次糖類部分を付加および除去する一連の酵素を含む真核細胞内で順序づけられたプロセスである。Ｎ－グリコシル化は、オリゴ糖がアスパラギン残基の側鎖、特に配列Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ（式中、Ｘａａは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸を表す）で生じるアスパラギンに結合するプロセスである。

【0069】

Ｎ－グリコシル化は、小胞体（ＥＲ）内で開始し、オリゴ糖Ｇｌｃ_３Ｍａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２は、脂質担体、ドリコールピロリン酸上に組み立てられ、続いて、ＥＲの内腔に入っているポリペプチドの選択されたアスパラギン残基に移動される。図１は、脂質結合オリゴ糖の生合成経路および真核細胞におけるＥＲの膜でのオリゴ糖の新生ポリペプチドへの移動を例証する。脂質結合オリゴ糖の生合成は、いくつかの特定のグリコシルトランスフェラーゼの活性を必要とする。それは、ＥＲ膜の細胞質側で始まり、オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）が新生ポリペプチドのＮ－Ｘ－Ｓ／Ｔシークオンを選択してアスパラギンの側鎖アミドとオリゴ糖との間のＮ－グリコシド結合を生成する内腔で終了する。ＥＲの外側から内側への脂質結合オリゴ糖のフリッピングは、ＥＲ膜に位置するフリッパーゼにより実行される。新生ポリペプチドへの移動に続いて、オリゴ糖は、典型的に、グリコシダーゼおよびマンノシダーゼによりトリミングされ、その後、新生糖タンパク質は、さらなる処理のためにゴルジ体に移動される。

【0070】

ドリコールピロリン酸結合オリゴ糖の合成は、既知の真核生物で本質的に変換される。しかし、糖タンパク質としてのオリゴ糖のさらなる処理は、真菌または酵母などの下等真核生物と動物および植物などの高等真核生物との間で大いに異なる分泌経路に沿って移動する。したがって、糖側鎖の最終の組成は、種々の生物間で異なっており、宿主に依存する。

【0071】

酵母などの微生物において、典型的に追加のマンノースおよび／またはマンノースリン酸糖が付加され、結果として、３０～５０個以下のマンノース残基を含む可能性がある「ハイパーマンノシル化」型Ｎ－グリカンとなる。

【0072】

ヒト、コンパニオンアニマルおよび他の哺乳動物細胞を含む動物細胞において、新生糖タンパク質は、マンノース残基がゴルジ特異的１，２－マンノシダーゼにより除去されるゴルジ体に移動される。タンパク質が、特定の糖残基を付加および除去するＮ－アセチルグルコサミントランスフェラーゼ（ＧｎＴ Ｉ、ＧｎＴ ＩＩ、ＧｎＴ ＩＩＩ、ＧｎＴ ＩＶ、ＧｎＴ Ｖ、ＧｎＴ ＶＩ）、マンノシダーゼＩＩおよびフコシルトランスフェラーゼを含む多数の修飾酵素によりゴルジ体を通過するにつれて処理が継続する。最後に、Ｎ－グリカンは、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＧａｌＴ）およびシアリルトランスフェラーゼ（ＳＴ）により作用され、完成した糖タンパク質は、ゴルジ体から放出される。動物糖タンパク質のＮ－グリカンは、バイ－、トリ－、またはテトラ－アンテナリー構造を有し、典型的に、ガラクトース、マンノース、フコースおよびＮ－アセチルグルコサミンを含む場合がある。一般的に、Ｎ－グリカンの末端残基は、シアル酸からなる。

【0073】

Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. heterothallica）は、酵母とは異なり、ハイパーマンノシル化Ｎ－グリカンを有していないが、むしろ「オリゴマンノース」グリカン－Ｍａｎ_３～Ｍａｎ_８～９－ならびにＭａｎおよびＨｅｘＮＡｃ残基の両方を含むハイブリッド型グリカン（Ｍａｎ_３ＨｅｘＮａｃ－Ｍａｎ_８ＨｅｘＮａｃ）を有している。これらのハイブリッドグリカンの正確な構造は、完全に既知ではない。ハイブリッドグリカンは、典型的なマンノース残基を有しているが、さらにまだ特徴づけられていない結合を介して結合した既知ではないＨｅｘＮＡｃを有している。

【0074】

本発明は、Ｎ－グリカンの量を少なく産生するようにＮ－グリコシル化経路の遺伝子組換えに向けられる。

【0075】

本明細書で使用されるように、「グリカン」は、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、脂質または還元末端コンジュゲートなどの担体に結合することができるオリゴ糖鎖を指す。本発明は、特に、アスパラギン残基（Ａｓｎ）の側鎖アミド窒素へのＮ－結合により、－Ａｓｎ－Ｘａａ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ－（式中、Ｘａａは、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸残基である）などのポリペプチドＮ－グリコシル化部位にコンジュゲートしたＮ－結合グリカン（「Ｎ－グリカン」）を指す。本発明はさらに、真核細胞の小胞体におけるＮ－結合グリカンの前駆体である、ドリコール－リン－オリゴ糖（Ｄｏｌ－Ｐ－Ｐ－ＯＳ）前駆体脂質構造の一部としてのグリカンに関する場合がある。前駆体オリゴ糖は、それらの還元末端により、ドリコール脂質上の２個のリン酸残基に結合している。

【0076】

用語「ｓｔｔ３遺伝子」は、ドリコールジホスホオリゴ糖－タンパク質グリコシルトランスフェラーゼサブユニットをコードする遺伝子を指す。それは、脂質担体ドリコールピロリン酸から新生ポリペプチド鎖のＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒコンセンサスモチーフ内のアスパラギン残基への定義されたグリカン（真核生物内のＧｌｃ３Ｍａｎ９ＧｌｃＮＡｃ２）の初期の移動、タンパク質Ｎ－グリコシル化での第１のステップを触媒するオリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の触媒サブユニットである。ＳＴＴ３タンパク質は、その反応を触媒する：

【0077】

（数１）
ドリコールジホスホオリゴ糖－（１→４）－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニル－（１→４）－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニル） ＋ Ｌ－アスパラギニル－［タンパク質］→
ドリコールジホスフェート ＋ Ｈ＋ ＋ Ｎ４－（オリゴ糖－（１→４）－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニル－（１→４）－Ｎ－アセチル－β－Ｄ－グルコサミニル）－Ｌ－アスパラギニル－［タンパク質］

【0078】

本発明の遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、真菌がオリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体の機能的触媒サブユニットの産生に失敗するように、ｓｔｔ３遺伝子の欠失または破壊により遺伝子組換えされる。本発明の遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、検出可能なオリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）活性を提示しない。

【0079】

用語「ｃｗｈ８遺伝子」は、ドリコールジホスファターゼをコードする遺伝子を指す。ＣＷＨ８は、その反応を触媒する：

【0080】

（数２）
ドリコールジホスフェート ＋ Ｈ_２Ｏ＝ドリコールホスフェート＋ Ｈ＋ ＋ホスフェート

【0081】

本発明の遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、真菌が機能的ドリコールジホスファターゼの産生に失敗するように、ｃｗｈ８遺伝子の欠失または破壊により遺伝子組換えされる。本発明の遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、検出可能なドリコールジホスファターゼ活性を提示しない。

【0082】

本明細書に定義されるような子嚢菌門糸状菌は、チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）の族に属している任意の真菌株を指す。チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）は、以下の群：
属：
サーモセロマイセス（Thermothelomyces）（種：ヘテロタリカ（heterothallica）およびサーモフィラ（thermophila）を含む）、
ミセリオフトラ（Myceliophthora）（種ルテア（lutea）および無名の種を含む）、
コリナスカス（Corynascus）（種フミモンタナス（fumimontanus）を含む）、
アカパンカビ（Neurospora）（種クラッサ（crassa）を含む）
を含む、アカパンカビ目（Sordariales）；
属：
フザリウム（Fusarium）（種グラミネアラム（graminearum）およびベネナタム（venenatum）を含む）、
トリコデルマ（Trichoderma）（種リーゼイ（reesei）、ハルチアナム（harzianum）、ロンギブラキアタム（longibrachiatum）およびビリデ（viride）を含む）
を含む、ボタンタケ目（Hypocreales）；
属：
クリソスポリウム（Chrysosporium）（種ロックンオウンズ（lucknowense）を含む）
を含む、ホネタケ目（Onygenales）；
属：
ラサムソニア（Rasamsonia）（種エメルソニイ（emersonii）を含む）、
ペニシリウム（Penicillium）（種ベルコーサム（verrucosum）を含む）、
アスペルギルス（Aspergillus）（種ファニキュロサス（funiculosus）、ニデュランス（nidulans）、ニガー（niger）およびオリゼ（oryzae）を含む）、
タラロマイセス（Talaromyces）（種ピニフィラス（piniphilus）（以前はペニシリウム・フニクロサム（Penicillium funiculosum））を含む）
を含む、ユーロチウム目（Eurotiales）
を含むがこれらに限定されない。

【0083】

上記リストが決定的なものではなく、産業的に関連する子嚢菌門糸状菌種の不完全なリストを提供することを意味すると理解されるべきである。

【0084】

チャワンタケ亜門（Pezizomycotina）以外の子嚢菌門糸状菌種である可能性があるが、その族は、サッカロミケス亜門（Saccharomycotina）を含まず、サッカロミケス属（Saccharomyces）、コマガタエラ属（Komagataella）（以前のピキア・パストリス（Pichia pastoris）を含む）、クルイウェロマイセス属（Kluyveromyces）またはタフリナ菌亜門（Taphrinomycotina）などの最も一般的に既知の非糸状菌の産業的に関連する属を含み、シゾサッカロマイセス属（Schizosaccharomyces）などのいくらかの他の一般的に既知の非糸状菌の産業的に関連する属を含む。

【0085】

上記すべての分類上のカテゴリは、特許出願日現在のＮＣＢＩタクソノミーブラウザ（ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｔａｘｏｎｏｍｙ）にしたがって定義される。

【0086】

真菌分類学が常に動いており、分類群の名前づけおよび階層的位置が将来変更される可能性があることは認められる必要がある。しかし、当業者は、特定の真菌株が上で定義されたような群に属している場合、明白に決定することができる。

【0087】

ある特定の実施形態によれば、糸状菌属は、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、サーモセロマイセス属（Thermothelomyces）、アスペルギルス属（Aspergillus）、ペニシリウム属（Penicillium）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ラサムソニア属（Rasamsonia）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、コリナスカス属（Corynascus）、フザリウム属（Fusarium）、アカパンカビ属（Neurospora）、タラロマイセス属（Talaromyces）などからなる群より選択される。いくらかの実施形態によれば、真菌は、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）、サーモセロマイセス・サーモフィラ（Thermothelomyces thermophila）（以前はＭ．サーモフィラ（M. thermophila））、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）（以前はＭ．サーモフィラ（M. thermophilaおよびヘテロタリカ（heterothallica））、ミセリオフトラ・ルテア（Myceliophthora lutea）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ファニキュロサス（Aspergillus funiculosus）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、ニホンコウジカビ（Aspergillus oryzae）、ペニシリウム・クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）、ペニシリウム・ベルコーサム（Penicillium verrucosum）、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）、トリコデルマ・ハルチアナム（Trichoderma harzianum）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、トリコデルマ・ビリデ（Trichoderma viride）、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）、ラサムソニア・エメルソニイ（Rasamsonia emersonii）、スポロトリカム・サーモフィル（Sporotrichum thermophile）、コリナスカス・フミモンタナス（Corynascus fumimontanus）、コリナスカス・サーモフィラス（Corynascus thermophilus）、フザリウム・グラミネアラム（Fusarium graminearum）、フザリウム・ベネナタム（Fusarium venenatum）、アカパンカビ（Neurospora crassa）、およびタラロマイセス・ピニフィラス（Talaromyces piniphilus）からなる群より選択される。

【0088】

特に、本発明は、多量の安定タンパク質を産生することができる子嚢菌門糸状菌のためのモデルとしてサーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）株Ｃ１を提供する。

【0089】

用語「サーモセロマイセス（Thermothelomyces）」およびその種「サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）およびサーモフィラ（thermophila）」は、当技術分野で既知であるような最も広い範囲で、本明細書で使用される。属およびその種の説明は、例えば、Ｍａｒｉｎ－Ｆｅｌｉｘ Ｙ（２０１５．Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ １０７（３）：６１９－６３２ ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．３８５２／１４－２２８）およびｖａｎ ｄｅｎ Ｂｒｉｎｋ Ｊ ｅｔ ａｌ．（２０１２，Ｆｕｎｇａｌ Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ５２（１）：１９７－２０７）に認めることができる。本明細書で使用されるように、「Ｃ１」または「サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）Ｃ１」またはＴｈ．ヘテロタリカ（Th. heterothallica）Ｃ１、またはＣ１はすべて、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）株Ｃ１を指す。

【0090】

上記著者（Ｍａｒｉｎ－Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５）が、属ミセリオフトラ（Myceliophthora）を最適増殖温度、分生子の形態、および有性生殖サイクルの詳細における差異に基づいて分割することを提案したことが注目されている。提案された基準によれば、Ｃ１は、非耐熱性種を含むままである属ミセリオフトラ（Myceliophthora）よりも、以前の耐熱性ミセリオフトラ（Myceliophthora）種を含む新規に確立された属サーモセロマイセス（Thermothelomyces）に明らかに属している。Ｃ１が、反対の交配型を有するいくらかの他のサーモセロマイセス属（Thermothelomyces）（以前はミセリオフトラ属（Myceliophthora））の株と子嚢胞子を形成することができるので、Ｃ１は、Ｔｈ．サーモフィラ（Th. thermophila）Ｃ１よりもむしろ、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. heterothallica）株Ｃ１と分類されることが最良である。

【0091】

また、真菌分類学が過去にも絶えず変化しており、そのため上記にリスト化されている現在の名前の前に、今では同義語とみなされている、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Myceliophthora thermophila）以外の多種多様の古い名前が付いている場合があることも認められる必要がある（ｖａｎ Ｏｏｒｓｃｈｏｔ，１９７７．Ｐｅｒｓｏｏｎｉａ ９（３）：４０３）。例えば、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）（Ｍａｒｉｎ－Ｆｅｌｉｘ ｅｔ ａｌ．，２０１５．Ｍｙｃｏｌｏｇｉｃａ，３：６１９－６３）は、コリナスカス・ヘテロタリカス（Corynascus heterotchallicus）、チエラビア・ヘテロタリカ（Thielavia heterothallica）、クリソスポリウム・ロックンオウンズ（Chrysosporium lucknowense）およびサーモフィル（thermophile）ならびにスポロトリカム・サーモフィル（Sporotrichium thermophile）（Ａｌｐｉｎｉｓ １９６３．Ｎｏｖａ Ｈｅｄｗｉｇｉａ ５：７４）と同義語である。

【0092】

本発明が、配列番号２９と９９％またはそれより高い相同性を示すリボソームＤＮＡ（ｒＤＮＡ）配列を含む任意の株を包含し、それらの株すべてが、サーモセロマイセス・ヘテロタリカ（Thermothelomyces heterothallica）と同種であるとみなされることが、さらに明白に理解されるべきである。

【0093】

特に、用語Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）株Ｃ１は、ランダムまたは指向性アプローチを使用して、例えば、ＵＶ突然変異誘発を使用するか、１つもしくは複数の内因性遺伝子を欠失させることにより突然変異されている、野生型の株に由来する遺伝子組換えされた下位の株を包含する。例えば、Ｃ１株は、内因性プロテアーゼをコードする１つまたは複数の遺伝子を欠失させるように修飾された野生型の株を指す場合がある。例えば、本発明により包含されるＣ１株は、株ＵＶ１８－２５、寄託番号ＶＫＭ Ｆ－３６３１ Ｄ；株ＮＧ７Ｃ－１９、寄託番号ＶＫＭ Ｆ－３６３３ Ｄ；および株ＵＶ１３－６、寄託番号ＶＫＭ Ｆ－３６３２ Ｄを含む。さらに、本発明の教示にしたがって使用することができるＣ１株は、ＨＣ株ＵＶ１８－１００ｆ、寄託番号ＣＢＳ１４１１４７；ＨＣ株ＵＶ１８－１００ｆ、寄託番号ＣＢＳ１４１１４３；ＬＣ株Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ、寄託番号ＣＢＳ１４１１５３；およびＬＣ株Ｗ１Ｌ＃１００Ｉ、寄託番号ＣＢＳ１４１１４９およびそれらの誘導体を含む。

【0094】

本発明の教示にしたがって遺伝子組換えされる場合、これらの誘導体、子孫、およびクローンが、本発明の教示にしたがって少なくとも１つのタンパク質産物を産生することができる限り、本発明の教示が、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）Ｃ１株の突然変異体、誘導体、子孫、およびクローンを包含することが、明白に理解されるべきである。本明細書で使用されるように、用語「子孫」は、親真菌株から組換えられていないか部分的に組換えられた子孫、例えば細胞からの細胞を指す。用語「親株」は、本発明による特定のプロテアーゼの発現または活性が低下していない、対応する真菌株を指す。

【0095】

本発明の出願人により開発された、いくつかのＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）Ｃ１株は、従来の酵母株およびまたそれ以外の子嚢菌門糸状菌宿主よりも、炭素源として増殖培地中に存在するグルコースおよび他の発酵性糖によるフィードバック抑制に対して感度が低く、その結果、炭素源のより高い供給速度に耐えることができ、この真菌による高収率の産生につながる。

【0096】

いくらかの実施形態によれば、真菌増殖培地は、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、セロビオース、グリセロールおよびそれらの任意の組み合わせからなる群より選択される炭素源を含む。

【0097】

本発明は、特に、Ｎ－グリコシル化修飾が少ないか全くないように設計することに向けられる。Ｏ－グリカンが真菌のさらなる遺伝子組換えにより存在するか、除去されるか、変更される場合があることに注意する。

【0098】

本明細書に記載されるようなタンパク質の「発現が低い」または「発現が阻害されている」という用語は、交換可能に使用され、そのタンパク質をコードする遺伝子を欠失させるまたは破壊することを含むがこれらに限定されない。

【0099】

本明細書に記載されるようなタンパク質の「活性が低下している」または「活性が阻害されている」という用語は、交換可能に使用され、そのタンパクの活性の低下または消失をもたらす翻訳後修飾を含むがこれに限定されない。

【0100】

本発明による遺伝子組換えは、その遺伝子組換え真菌が、その目的とする使用に適した十分な速度で増殖することができるようなものであることが理解されるべきである。

【0101】

上記用語はまた、ランダムまたは指向性アプローチを使用して、例えば、ＵＶ突然変異誘発を使用するか、１つもしくは複数の内因性遺伝子を欠失させることにより突然変異されている、野生型の株に由来する遺伝子組換えされた下位の株も包含する。

【0102】

一般にＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）真菌および特に株Ｃ１は、適切な条件下で増殖させる場合、酵母株と比較して高いバイオマス産生を示す。Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）真菌は、大量の３次元（３Ｄ）液体培養および固体培地で増殖することができる。本発明の出願人により開発されたいくつかの株は、従来の酵母および他の真菌と比較して、炭素源として真菌増殖培地中に存在するグルコースおよび他の発酵性糖によるフィードバック抑制に対して感度が低く、炭素源のより高い供給速度に耐えることができ、高収率につながる。さらに、これらの株のいくらかは、非グルコース抑制野生型Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）真菌またはタンパク質産生に使用されることが既知である他の糸状菌で得られる高粘度と比較して、市販の発酵槽で増殖させた場合、有意に低下した培地粘度を与える。低粘度は、親株において長く高度に交絡した菌糸を有しているものから、開発された株において短くて少ない交絡した菌糸への株の形態学的変化に起因する可能性がある。低い培地粘度は、発酵槽での大規模工業生産において、非常に有利である。例えば、グルコース抑制に対して低い感度を示すＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）Ｃ１株ＵＶ１８－２５、寄託番号ＶＫＭ Ｆ－３６３１ Ｄは、１００，０００リットルを超える体積で組換え酵素を産生するように工業的に増殖されている。

【0103】

用語「異種」は、遺伝子、酵素、タンパク質またはペプチド配列を指す場合、子嚢菌門糸状菌で天然には見つけられないか発現しない遺伝子、酵素、タンパク質またはペプチド配列を記載するように本明細書で使用される。

【0104】

用語「内因性」は、細胞内局在化シグナルなどの遺伝子、酵素、タンパク質またはペプチド配列を指す場合、子嚢菌門糸状菌に天然に存在する遺伝子、酵素、タンパク質またはペプチド配列を指す。

【0105】

用語「外因性」は、ポリヌクレオチドを指す場合、形質転換を介して、子嚢菌門糸状菌に外因的に導入される合成ポリヌクレオチドを記載するように本明細書で使用される。外因性ポリヌクレオチドは、リボ核酸（ＲＮＡ）分子およびその後に続くポリペプチド分子を産生するように、安定したまたは一時的な方法で、子嚢菌門糸状菌に導入される場合がある。

【0106】

発現ベクター
いくらかの実施形態によれば、本明細書に記載の遺伝子組換え子嚢菌門糸状菌は、目的のタンパク質をコードする少なくとも１つの外因性ポリヌクレオチドを含む。

【0107】

目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＤＮＡ構築物または発現ベクターの一部を形成する場合がある。

【0108】

用語「発現構築物」、「ＤＮＡ構築物」または「発現カセット」は、本明細書において交換可能使用され、目的のタンパク質をコードする核酸配列を含み、目的のタンパク質が標的宿主細胞で発現されるように組み立てられている、人工的に組み立てたか単離された核酸分子を指す。発現構築物は、典型的に、目的のタンパク質をコードする核酸配列に実行可能に結合した適切な調節配列を含む。発現構築物はさらに、選択マーカーをコードする核酸配列を含む場合がある。

【0109】

用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ポリヌクレオチド」は、より大きい構築物の別個のフラグメントの形態で、または成分としてデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）のポリマーおよびそれらの修飾型を指すように本明細書で使用される。核酸配列は、コード配列、すなわち、タンパク質などの細胞での最終精製物をコードする配列である場合がある。核酸配列はまた、例えばプロモータなどの調節配列である場合がある。

【0110】

用語「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように本明細書で使用される。用語「ペプチド」は、典型的に、２～５０個のアミノ酸からなるアミノ酸配列を示すが、「タンパク質」は、５０個を超えるアミノ酸残基からなるアミノ酸配列を示す。

【0111】

参照配列に「相同」である配列（核酸配列およびアミノ酸配列など）は、本明細書では、配列間のパーセント同一性を指し、パーセント同一性は、少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％である。それぞれの可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書に記載の配列の相同性は、本発明に包含される。タンパク質相同性は、それらが元のタンパク質の活性を維持する限り包含される。相同な核酸配列は、コドン使用および遺伝暗号の変性に関連する変動を含む。配列同一性は、当技術分野で既知のヌクレオチド／アミノ酸配列の比較アルゴリズムを使用して決定される場合がある。

【0112】

目的のタンパク質をコードする核酸配列は、発現に最適化される場合がある。そのような配列修飾の例には、一般的にコドン最適化と呼ばれる、子嚢菌門糸状菌で典型的に認められるものにより近い、変更されたＧ／Ｃ含量、および真菌で典型的に認められるコドンの除去が含まれるがこれらに限定されない。

【0113】

成句「コドン最適化」は、目的の生物内でのコドン使用に近づく構造遺伝子またはそのフラグメント内での使用に適切なＤＮＡヌクレオチドの選択、および／または天然の配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０、または約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０を超える、またはそれより多くのコドン）を、その宿主細胞の遺伝子で天然アミノ酸配列を維持しながらより頻繁に、または最も頻繁に使用されるコドンで置換することにより目的の宿主細胞における発現を強化するために核酸配列を修飾するプロセスを指す。種々の種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに特定の偏りを示す。コドンの偏り（生物間でのコドン使用における差異）は、多くの場合、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率に相関しており、同様に、とりわけ、翻訳されるコドンの特性および特定の転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると思われる。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優位性は、一般に、タンパク質合成において最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物内での最適な遺伝子発現のために遺伝子を調節することができる。そのため、最適化された遺伝子または核酸配列は、天然または自然発生の遺伝子のヌクレオチド配列が、生物内で統計的に好まれるか統計的に好ましいコドンを利用するために修飾されている遺伝子を指す。

【0114】

用語「調節配列」は、コドン配列の発現（転写）を制御するＤＮＡ配列、例えばプロモータおよびターミネータを指す。

【0115】

用語「プロモータ」は、インビボまたはインビトロで別のＤＮＡ配列の転写を制御するか方向づける調節ＤＮＡ配列に向けられる。一般に、プロモータは、転写された配列の５’領域内に位置している（すなわち、先行する、上流に位置している）。プロモータは、天然の源からそれらの全体に送達される場合があるか、天然に認められる異なるプロモータに由来する異なる要素で構成される場合があるか、さらには合成ヌクレオチドセグメントを含む場合がある。プロモータは、構成的であり得る（すなわち、プロモータ活性化が誘導剤により調節されず、したがって転写の速度が一定である）か、誘導性であり得る（すなわち、プロモータ活性化が誘導剤により調節される）。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界線は、完全には定義されておらず、多くの場合、完全に定義することができず、このためいくらかの変形のＤＮＡ配列は、同一のプロモータ活性を有する場合がある。

【0116】

用語「ターミネータ」は、転写終結を調節する別の調節ＤＮＡ配列に向けられる。ターミネータ配列は、転写される核酸配列の３’末端に実行可能に結合している。

【0117】

いくらかの実施形態によれば、糸状菌は、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）であり、目的のタンパク質は、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）の調節エレメントを有する構築物内で発現される。特定の実施形態によれば、目的のタンパク質を発現する構築物は、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）プロモータおよび／またはＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）ターミネータを含む。

【0118】

用語「Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）プロモータ」および「Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）ターミネータ」は、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）での使用に適した、すなわち、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）の遺伝子発現を方向づけることができる、プロモータおよびターミネータ配列を示す。いくらかの特定の実施形態において、Ｃ１における遺伝子発現を方向づけることができるプロモータおよびターミネータ配列を示す、Ｃ１プロモータおよびＣ１ターミネータが使用される。

【0119】

いくらかの実施形態によれば、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）プロモータ／ターミネータは、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）の内因性遺伝子に由来する。他の実施形態によれば、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）プロモータ／ターミネータは、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）に外因性の遺伝子に由来する。

【0120】

適切な構成的プロモータおよびターミネータには、例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼ遺伝子（ＰＧＫ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｇ２ＱＬＤ８、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３６６５９６７）、グリセルアルデヒド３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＰＤ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｇ２ＱＰＱ８、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３６６６７６８）、ホスホフルクトキナーゼ（ＰＦＫ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｇ２Ｑ６０５、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３６５９８７９）などのＣ１糖分解遺伝子のもの；またはβ－グルコシダーゼ１遺伝子ｂｇｌ１（受入番号：ＸＭ＿００３６６２６５６）；またはトリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＰＩ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｇ２ＱＢＲ０、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３６６３２００）；またはアクチン（ＡＣＴ）（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｇ２Ｑ７Ｑ５、ＮＣＢＩ参照配列：ＸＭ＿００３６６２１１１）；またはＣ１ ｃｂｈ１プロモータ（ジェンバンクＡＸ２８４１１５）またはＣ１ ｃｈｉ１プロモータ（ジェンバンクＨＩ５５０９８６）が含まれる。使用することができる追加のプロモータは、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）ｇｐｄＡプロモータ；およびＲａｎｔａｓａｌｏ ｅｔ ａｌ．（２０１８ ＮＡＲ ４６（１８）：ｅ１１１）に記載の合成プロモータである。代表的なターミネータとして、Ｃ１キチナーゼ１遺伝子ｃｈｉ１（ジェンバンクＨＩ５５０９８６）、セロビオヒドロラーゼ１ ｃｂｈ１（ジェンバンクＡＸ２８４１１５）のターミネータ、または酵母ａｄｈ１ターミネータを使用することができる。

【0121】

用語「実行可能に結合」は、調節エレメントが選択された核酸配列の発現を調節することを可能にする調節エレメント（プロモータまたはターミネータ）に選択された核酸配列が近接していることを意味する。

【0122】

本発明のいくらかの実施形態による発現構築物は、タンパク質をコードする核酸配列に実行可能に結合したＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）プロモータ配列およびＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）ターミネータ配列を含む。いくらかの特定の実施形態において、本発明の発現構築物は、酵素をコードする核酸配列に実行可能に結合したＣ１プロモータ配列およびＣ１ターミネータ配列を含む。

【0123】

特定の発現構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限エンドヌクレアーゼ消化、インビトロおよびインビボ組立法、ならびに遺伝子合成法、またはそれらの組み合わせなどの従来の分子生物学的手法を含む、多種多様の異なる方法により組み立てることができる。以下の実施例のセクションに代表的な発現構築物およびそれらの構築のための方法を与える。

【0124】

ｓｔｔ３および／またはｃｗｈ８遺伝子の欠失
遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的または完全な除去を可能にし、それによって、その発現を排除する。そのような方法において、遺伝子の欠失は、遺伝子に隣接する５’および３’領域を近接して含むように構築されているプラスミドを使用する相同組換えにより達成することが可能である。

【0125】

遺伝子欠失はまた、遺伝子に本明細書では欠失構築物とも呼ばれる破壊核酸構築物を挿入することにより実行される場合がある。破壊構築物は、単に、遺伝子に相同な５’および３’領域を伴う選択可能なマーカー遺伝子であり得る。選択可能なマーカーは、破壊された遺伝子を含む形質転換体の同定を可能にする。代わりにまたはさらに、破壊核酸構築物は、宿主細胞で発現される異種タンパク質をコードする１つまたは複数のポリヌクレオチドを含む場合がある。

【0126】

以下の実施例のセクションにｓｔｔ３およびｃｗｈ８のための代表的な欠失構築物および欠失を実行するための手順を与える。本明細書に記載されるように、ｓｔｔ３およびｃｗｈ８遺伝子は、以下の実施例１に示すように、選択可能なマーカーを含む破壊構築物を使用して欠失される。

【0127】

欠失は、破壊構築物に隣接する適切なプライマを用いるＰＣＲを使用して確認することができる。

【0128】

遺伝子改変されたＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）
本発明による、Ｎ－結合グリカンが少ないか全くないタンパク質を産生するように遺伝子改変されたＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）細胞は、遺伝子が機能性タンパク質の産生に失敗するように、Ｔｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）の２つの内因性遺伝子、ｓｔｔ３およびｃｗｈ８の少なくとも１つを欠失させるなど、修飾することにより生成される。

【0129】

内因性遺伝子の欠失は、上述されており、また、以下の実施例のセクションにも示されている。

【0130】

さらに別の態様によれば、本発明は、外因性タンパク質を産生する方法を提供し、その方法は、遺伝子組換え真菌、特に本発明のＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）Ｃ１真菌を適切な培地中で培養するステップ；およびそのタンパク質産物を回収するステップを含む。

【0131】

ある特定の実施形態によれば、培地は、グルコース、スクロース、キシロース、アラビノース、ガラクトース、フルクトース、ラクトース、セロビオース、およびグリセロールからなる群より選択される炭素源を含む。ある特定の実施形態によれば、炭素源は、エタノール生産またはでんぷん、テンサイおよびサトウキビからの他の生物生産から得られる廃棄物、例えば発酵性糖を含む糖蜜、でんぷん、セルロースおよびヘミセルロースなどのポリマー炭水化物を含むリグノセルロース系バイオマスである。

【0132】

いくらかの実施形態によれば、外因性タンパク質は、真菌増殖培地から精製される。

【0133】

他の実施形態によれば、外因性タンパク質は、真菌塊から抽出される。植物組織からタンパク質を抽出および精製するための当技術分野で既知の方法はいずれも使用することができる。

【0134】

さらなる態様によれば、本発明は、遺伝子組換え真菌、特に本発明の遺伝子組換えＴｈ．ヘテロタリカ（Th. Heterothallica）Ｃ１により産生される外因性タンパク質を提供する。

【0135】

外因性ポリヌクレオチドの発現は、真菌細胞、特に核に、真菌で発現されるタンパク質をコードする核酸を含む発現構築物を導入することにより実行される。特に、本発明による遺伝子組換えは、宿主ゲノムへの発現構築物の組み込みを意味する。

【0136】

真菌細胞への発現構築物の導入、すなわち真菌の形質転換は、例えば以下の実施例のセクションで記載されるプロトプラスト形質転換法を使用する当技術分野に既知の方法により実行することができる。

【0137】

形質転換細胞の容易な選択を促進するため、選択マーカーは、真菌細胞に形質転換される場合がある。「選択マーカー」は、抗生物質耐性（耐性マーカー）、特定の資源を利用する能力（利用／栄養要求性マーカー）または例えばスペクトル測定により検出することができるレポータータンパク質の発現などの非形質転換細胞に存在しない特定の表現型を与える遺伝子産物をコードするポリヌクレオチドを示す。栄養要求性マーカーは、典型的に、食品産業または医薬品産業での選択の手段として好ましい。選択マーカーは、発現構築物で同時形質転換された別個のヌクレオチド上、または発現構築物の同じポリヌクレオチド上に存在することができる。形質転換に続いて、陽性形質転換体は、例えば選択された選択マーカーによる選択培地上で細胞を培養することにより選択される。いくらかの場合、スプリットマーカーシステムを使用し、そこで、選択マーカーは、２つのプラスミドに分割し、機能的選択マーカーは、２つのプラスミドが同時に形質転換され、相同組換えを介して一緒に結合する場合にのみ形成される。

【0138】

【表1】

【0139】

【表2】

【0140】

以下の実施例は、本発明のある特定の実施形態をより完全に例証するために表される。しかし、それらは、決して本発明の広い範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。

【0141】

実施例
実施例１－Ｃ１ ｓｔｔ３およびｃｗｈ８遺伝子の欠失
Ｃ１における分泌タンパク質のＮ－グリコシル化を低下させるか排除するため、ドリコールジホスホオリゴ糖タンパク質グリコシルトランスフェ触媒サブユニットＳＴＴ３およびドリコールジホスファターゼＣＷＨ８をコードする遺伝子を欠失させた。ＳＴＴ３は、多量体オリゴ糖転移酵素（ＯＳＴ）複合体のサブユニットであり、複合体の触媒活性に不可欠である（Ｚｕｆｆｅｒｅｙ ｅｔ ａｌ．１９９５，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ １４，４９４９－４９６０）。ＯＳＴ複合体は、脂質担体ドリコールピロリン酸からポリペプチド鎖の選択されたアスパラギン残基へのオリゴ糖の移動を触媒する。ドリコールピロリン酸ホスファターゼＣＷＨ８は、脂質担体ドリコールピロリン酸のリサイクルに関与していると推測される。ＣＷＨ８は、細胞の生存には不可欠ではないが、対応する遺伝子の欠失が、結果としてＮ－グリコシル化欠損となる（ｖａｎ Ｂｅｒｋｅｌ ｅｔ ａｌ．１９９９，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ９，２４３－２５３）。

【0142】

欠失は、ｓｔｔ３およびｃｗｈ８欠失構築物を個々に（１つの欠失／株）Ｃ１に形質転換することにより実行された。ｓｔｔ３またはｃｗｈ８を欠失させるためのＤＮＡ構築物は、２つの別個のプラスミドに構築された。５’配列のプラスミドは、統合のためのｓｔｔ３／ｃｗｈ８ ５’隣接領域フラグメントおよびｐｙｒ４マーカー遺伝子の最初の半分を含んでいた。３’群のプラスミドは、ｐｙｒ４マーカーの残りの半分および統合のためのｓｔｔ３／ｃｗｈ８ ３’隣接領域フラグメントを含んでいた。これらの２つのプラスミド内のｐｙｒ４マーカーフラグメントは、互いに重なっている。２つのプラスミドのＣ１への形質転換中、重なった領域がプラスミド間で相同組換えを実行するのと同時に５’および３’隣接領域フラグメントが欠失される遺伝子の両側でゲノムＤＮＡを用いて組換えられる。選択マーカーフラグメント間の組換えは、マーカー遺伝子が機能的であることが必須であり、そのため、選択下で形質転換体を増殖させるのを可能にする。５’隣接領域の末端からおよそ５００ｂｐは、必要であれば、マーカー遺伝子をループアウトすることを可能にするためにＰＹＲ４マーカーの残りの半分の後に追加された。ｓｔｔ３およびｃｗｈ８ ５’および３’配列のベクターの異なるフラグメントをＣ１ゲノムＤＮＡから増幅させ、酵母組換えクローニングによりマーカー遺伝子を用いてバックボーンベクター（ｐＲＳ４２６）にクローン化した（Ｃｏｌｏｔ ｅｔ ａｌ．２００６，ＰＮＡＳ １０３，１０３５２－１０３５７）。

【0143】

ｓｔｔ３欠失構築物の５’配列は、配列番号１に記載される。５’隣接配列は、配列番号１の１～９３０位に相当し、ｐｙｒ４マーカー遺伝子の最初の半分は、配列番号１の９３８～２，７１７位に相当する。ｓｔｔ３欠失構築物の３’配列は、配列番号２に記載される。ｐｙｒ４マーカー遺伝子の残りの半分は、配列番号２の１～１，２５７位に相当する。直接反復配列は、配列番号２の１，２６６～１，７７７位に相当する。３’隣接配列は、配列番号２の１，７８５～２，７１５位に相当する。

【0144】

ｃｗｈ８欠失構築物の５’配列は、配列番号３に記載される。５’隣接配列は、配列番号３の１～１，０００位に相当し、ｐｙｒ４マーカー遺伝子の最初の半分は、配列番号３の１，００８～２，７８７位に相当する。ｃｗｈ８欠失構築物の３’配列は、配列番号４に記載される。ｐｙｒ４マーカー遺伝子の残りの半分は、配列番号４の１～１，２５７位に相当する。直接反復配列は、配列番号４の１，２６６～１，７６５位に相当する。３’隣接配列は、配列番号４の１，７７４～２，９７３位に相当する。

【0145】

ｓｔｔ３／ｃｗｈ８欠失構築物の両配列は、プラスミドバックボーンから切り取られ、プロテアーゼ遺伝子の９個の欠失を有するＣ１株ＤＮＬ１３２に同時に形質転換される。１つの５’配列ベクターおよび１つの３’配列ベクターの対を、各形質転換に使用した。

【0146】

選択培地プレート上で増殖した形質転換体コロニーを、選択培地上の筋として培養した。欠失構築物の正確な統合を有する形質転換体の同定は、ＰＣＲにより実行された。形質転換体の筋からの菌糸体を２０ｍＭ ＮａＯＨに溶解し、１００℃でインキュベートして、細胞を溶解させた。Ｐｈｉｒｅ Ｐｌａｎｔ ＰＣＲキット（商標）（サーモフィッシャー）を用いるＰＣＲのテンプレートとしてこの溶菌液１～２μｌを使用した。使用したオリゴヌクレオチドプライマを表１に示す。

【0147】

欠失構築物のｓｔｔ３遺伝子座への統合は、２つのＰＣＲ反応により示された。配列番号５および配列番号６に記載のプライマを用いる反応により、遺伝子の５’末端での統合を検証した。１１５２ｂｐのフラグメントの増幅は、遺伝子の５’末端でのｓｔｔ３遺伝子座への統合の成功を示した。配列番号７および配列番号８に記載のプライマを用いてｓｔｔ３の３’末端での統合を検証した。１７５２ｂｐのフラグメントの増幅は、遺伝子の３’末端でのｓｔｔ３遺伝子座への統合の成功を示した。配列番号９および配列番号１０に記載のプライマならびに配列番号１１および配列番号１２に記載のプライマを用いる定量的ＰＣＲにより、ｓｔｔ３遺伝子座への統合に陽性の形質転換体をさらに分析し、ｓｔｔ３遺伝子がそれらから完全に欠失していることを示した。ｓｔｔ３遺伝子座への構築物の統合に陽性であり、ｓｔｔ３遺伝子の存在に陰性である形質転換体Ｃ１株を、－８０℃で貯蔵し、株番号Ｍ３２１０を与えた。

【0148】

欠失構築物のｃｗｈ８遺伝子座への統合は、２つのＰＣＲ反応により示された。配列番号１３および配列番号６に記載のプライマを用いる反応により、遺伝子の５’末端での統合を検証した。１２４３ｂｐのフラグメントの増幅は、遺伝子の５’末端でのｃｗｈ８遺伝子座への統合の成功を示した。配列番号１４および配列番号８に記載のプライマを用いて遺伝子の３’末端での統合を検証した。２００９ｂｐのフラグメントの増幅は、遺伝子の３’末端でのｃｗｈ８遺伝子座への統合の成功を示した。配列番号１５および配列番号１６に記載のプライマならびに配列番号１７および配列番号１８に記載のプライマを用いる定量的ＰＣＲにより、ｃｗｈ８遺伝子座への統合に陽性の形質転換体をさらに分析し、ｃｗｈ８遺伝子がそれらから完全に欠失していることを示した。ｃｗｈ８遺伝子座への構築物の統合に陽性であり、ｃｗｈ８遺伝子の存在に陰性である形質転換体Ｃ１株を－８０℃で貯蔵し、株番号Ｍ３２１１を与えた。

【0149】

【表3】

【0150】

Ｍ３２１０およびＭ３２１１株を、１Ｌのバイオリアクタで７日間、酵母エキスおよび炭素源としてグルコースを含む培地中、流加プロセスで培養した。７日目の上清試料を１３５００ｒｐｍで１５分間、３回遠心分離し、メーカーのプロトコルにしたがって、ＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓＴＭ ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳＴＭ Ｎ－グリカンキット（ウォーターズ）を用いて上清に存在する総タンパク質からのグリカン分析を実行した。９個のプロテアーゼ欠失を有する株Ｍ２８６４を、Ｎ－グリカン分析における対照として実行した。ｓｔｔ３欠失株の培養上清からＮ－グリカンを検出することができなかったが、対照株は、正常なＣ１グリカンパターンを示した（図２Ａおよび図２Ｂ）。ｃｗｈ８欠失株の培養上清から検出されたＮ－グリカンの量は、対照株のＮ－グリカン量のおよそ１０％であった（図３Ａおよび図３Ｂ）。

【0151】

実施例２－株Ｍ３２１０およびＭ３２１１におけるモノクローナル抗体の産生
Ｎ－グリコシル化がないモノクローナル抗体およびＮ－グリコシル化が低いモノクローナル抗体の産生を示すため、治療用抗体ニボルマブの重鎖および軽鎖を、それぞれｓｔｔ３またはｃｗｈ８欠失を有するＭ３２１０およびＭ３２１１株で発現させた。

【0152】

実施例１で説明したように、発現カセットを２対で２つの別個のプラスミドに構築した。構築物の５’配列は、統合のためのｃｂｈ１ ５’隣接領域フラグメントを含み、ニボルマブ軽鎖遺伝子がＣ１ ＣＢＨ１シグナル配列に融合した発現カセットは、ｂｇｌ８プロモータとｂｇｌ８ターミネータとの間、ｎｉａ１マーカー遺伝子とハイグロマイシンマーカー遺伝子の最初の１／２との間である。構築物の３’配列は、ハイグロマイシンマーカーの最後の１／２、ｂｇｌ８ターミネータからの直接反復配列を含み、ニボルマブ重鎖遺伝子がＣ１からのＣＢＨ１シグナル配列に融合した発現カセットは、ｂｇｌ８プロモータとｃｈｉ１ターミネータとの間、ならびに統合のためのｃｂｈ１ ３’隣接領域フラグメントである。

【0153】

ニボルマブ発現構築物の５’配列は、配列番号１９に記載される。ｃｂｈ１ ５’隣接配列は、配列番号１９の１～１，９５７位に相当する。ｂｇｌ８プロモータ配列は、配列番号１９の１，９６６～３，３５７位に相当する。Ｃ１ ＣＢＨ１シグナル配列に融合した軽鎖をコードする配列は、配列番号１９の３，３５８～４，０５３位に相当し、３，３５８～３，４０８位は、ＣＢＨ１シグナル配列をコードし、３，４０９～４，０５３位は、軽鎖をコードする。この配列は、Ｃ１についてのヒト軽鎖遺伝子のコドン最適化、およびジェンスクリプトによる合成により得られた。合成した配列は、ｂｇｌ８プロモータおよびターミネータのために４０ｂｐのフランクを含んでいた。ｂｇｌ８ターミネータ配列は、配列番号１９の４，０５４～４，５２０位に相当する。ｎｉａ１マーカー遺伝子は、配列番号１９の４，５３７～８，６５１位に相当する。ハイグロマイシンマーカー遺伝子の最初の１／２は、配列番号１９の８，６６０～１０，３６０位に相当する。上述したフラグメントおよびバックボーンベクターｐＲＳ４２６を、ギブソン・アセンブリにより一緒に組み立てて５’配列ベクターを得た。

【0154】

ニボルマブ発現構築物の３’配列は、配列番号２０に記載される。ハイグロマイシンマーカー遺伝子の１／２は、配列番号２０の１～１，７３２位に相当する。ｃｈｉ１ターミネータ配列は、配列番号２０の２，０８２～２，７２７位に相当する。Ｃ１ ＣＢＨ１シグナル配列に融合した重鎖をコードする配列は、配列番号２０の２，７３６～４，１０９位に相当し、４，０５９～４，１０９位は、ＣＢＨ１シグナル配列をコードし、２，７３６～４，０５８位は、重鎖をコードする。この配列は、Ｃ１についてのヒト重鎖遺伝子のコドン最適化、およびジェンスクリプトによる合成により得られた。それは、ｂｇｌ８プロモータおよびｃｈｉ１ターミネータのために４０ｂｐのフランクを含む。ｂｇｌ８プロモータ配列は、配列番号２０の４，１１０～５，５０１位に相当する。３’隣接配列は、配列番号２０の５，５１０～６，２６６位に相当する。上述したフラグメントおよびバックボーンベクターｐＲＳ４２６を、ギブソン・アセンブリにより一緒に組み立てて３’配列ベクターを得た。

【0155】

ニボルマブ発現プラスミドの、それぞれｓｔｔ３またはｃｗｈ８欠失を保持するＭ３２１０およびＭ３２１１株への形質転換、ならびに形質転換体の選択を、５０ｍｇ／ｌのハイグロマイシンを含む選択培地プレート上で行った。形質転換体をＰＣＲによりスクリーニングし、ｃｂｈ１遺伝子が、構築物により置き換えられているクローンを見つけた。スクリーニングに使用したプライマを表２に示す。配列番号２１および配列番号２２に記載のプライマを使用して、正確な統合がｃｂｈ１遺伝子の５’末端で生じたことを検証した。３５９２ｂｐのフラグメントの増幅は、遺伝子の５’末端でのｃｂｈ１遺伝子座への統合の成功を示した。配列番号２３および配列番号２４に記載のプライマを使用して、ｃｂｈ１遺伝子の３’末端での正確な統合を検証した。１４７７ｂｐのフラグメントの増幅は、遺伝子の３’末端でのｃｂｈ１遺伝子座への統合の成功を示した。配列番号２５および配列番号２６のプライマを使用して、ｃｂｈ１オープンリーディングフレームからの５００ｂｐのフラグメントの増幅がないことを示すことにより、ｃｂｈ１遺伝子の完全欠失を検証した。

【0156】

【表4】

【0157】

実施例１のように、構築されたＣ１株を、液体培地中、２４ウェルプレートで増殖させた。０．６５μｍ ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート（メルクミリポア）に通した２５０μｌの試料を３５００ＲＰＭで１０分間遠心分離することにより菌糸体を除去した。形質転換体によるニボルマブの産生を、ウェスタンブロット分析により確認した。ニボルマブを産生することを示す形質転換体を、以下のように選択培地プレート上でのシングルコロニープレーティングを通じて精製した。筋からの菌糸体を、０．９％ＮａＣｌ－０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液８００μｌに懸濁した。懸濁液の異なる希釈（１０^－１、１０^－２および１０^－３）を０．９％ＮａＣｌ－０．０２５％Ｔｗｅｅｎ２０溶液で調製し、希釈物１００μｌを選択培地にプレーティングすることにより、シングルコロニーを得た。精製された形質転換体によるニボルマブの産生を、実施例１のように行った２４ウェルプレート培養およびそれに続くウェスタンブロット分析により検証した。

【0158】

発現構築物のｃｂｈ１遺伝子座への統合に陽性であり、ニボルマブ重鎖および軽鎖の両方を産生するｓｔｔ３欠失株Ｍ３２１０の精製された形質転換体を－８０℃で貯蔵し、株番号Ｍ３４８０を与えた。発現構築物のｃｂｈ１遺伝子座への統合に陽性であり、ニボルマブの重鎖および軽鎖の両方を産生するｃｗｈ８欠失株Ｍ３２１１の精製された形質転換体を－８０℃で貯蔵し、株番号Ｍ３４８１を与えた。

【0159】

株Ｍ３４８０およびＭ３４８１を、１Ｌのバイオリアクタで７日間、酵母エキスおよび炭素源としてグルコースを含む培地中、流加プロセスで培養した。その株により産生されたニボルマブを、メーカーのプロトコルにしたがって、ＡＫＴＡ Ｓｔａｒｔタンパク質精製システム（ＧＥヘルスケア）を用いる１ｍｌのＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅプロテインＡカラム（ＧＥヘルスケア）に通して精製した。精製抗体からのグリカン分析を、メーカーのプロトコルにしたがってＧｌｙｃｏＷｏｒｋｓ（商標）ＲａｐｉＦｌｕｏｒ－ＭＳ（商標）Ｎ－グリカンキット（ウォーターズ）を用いて行った。非糖変性株Ｍ３２４２の発酵上清から精製したニボルマブを、グリカン分析における対照として使用した。Ｍ３４８０培養上清から精製されたニボルマブからＮ－グリカンを検出することができなかったが、対照株から精製されたニボルマブは、正常なＣ１グリカンパターンを示した（図４Ａおよび図４Ｂ）。ｃｗｈ８欠失株Ｍ３４８１培養上清から精製されたニボルマブから検出されたＮ－グリカンの量は、対照株から精製されたニボルマブのＮ－グリカン量のおよそ１１％であった（図５Ａおよび図５Ｂ）。

【0160】

精製されたニボルマブのペプチドマッピングを、以下の方法にしたがって行った。試料１００μｇを、Ｖｉｖａｓｐｉｎ５００（１０，０００ＭＷＣＯ、ＰＥＳ、ザルトリウス）により５０ｍＭ炭酸水素アンモニウムで第１の緩衝液交換を３回行った。Ｒａｐｉｇｅｓｔ ＳＦ（ウォーターズ）を０．１％の最終濃度まで添加し、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）を５ｍＭの最終濃度まで添加した。試料を６０℃で４０分間インキュベートした。次に、ヨードアセトアミド（ＩＡＭ）を１５ｍＭの最終濃度まで添加し、試料を室温で４０分間、暗所でインキュベートした。トリプシン（プロメガ）溶液を、最終のプロテアーゼ；タンパク質比１：５０（ｗ／ｗ）まで各試料に添加するか、タンパク質５０μｇにつき１μｌのトリプシン（１μｇ／ｍｌ）を添加した。試料を一晩３７℃でインキュベートした。２０％ＴＦＡ４μｌを添加することにより反応を停止し、その後、試料を３７℃で３０分間インキュベートし、１００００ｒｐｍで５分間遠心分離した。最後に、試料をＳｐｅｅｄＶａｃによりエバポレートし、５０μｌの水／ＡｃＣＮ／ＴＦＡ２０／８０／０．１（ｖ／ｖ／ｖ）で再構成した。以下のＬＣ－ＭＳ条件を使用した。機器：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＨＰＬＣシステム、ウォーターズ（ミルフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）およびウォーターズＳｙｎａｐｔ Ｇ２－Ｓ ＭＳシステム（ミルフォード、ＭＡ、ＵＳＡ）。カラム：６０℃で、ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ糖タンパク質アミド３００Ａ、１．７ｕｍ、２．１×１５０ｍｍ（ウォーターズ）。溶媒：Ａは水中０．１％ＴＦＡ、Ｂはアセトニトリル中０．１％ＴＦＡ。勾配プログラム：０分が１０％のＡ、７０分が５０％のＡ、流速０．２ｍｌ／分。使用した質量分析パラメータは、コーン電圧２５Ｖおよびキャピラリー電圧３ｋＶ、脱溶媒和温度３５０℃、ならびに源の温度１２０℃を使用する肯定極性であった。エネルギー傾斜２５～４０Ｖを使用してＭＳ^Ｅモードのｍ／ｚ範囲５０～２０００でデータを回収した。ＵＮＩＦＩソフトウェア（ウォーターズ）を使用してデータを処理した。

【0161】

非糖変性株Ｍ３２４２の発酵上清から精製したニボルマブをペプチドマッピング分析の対照として使用した。ペプチドマッピング結果によれば、ｓｔｔ３欠失株Ｍ３４８０で産生されたニボルマブの重鎖に結合したＮ－グリカンはなかった（表３）。ｃｗｈ８欠失株Ｍ３４８１で産生されたニボルマブの重鎖から、わずかに２６．６％のＮ－グリコシル化が検出された（表４）が、非糖変性Ｃ１株Ｍ３２４２で産生されたニボルマブの重鎖から、９５．８％のＮ－グリコシル化が検出された（表５）。

【0162】

【表5】

【0163】

【表6】

【0164】

【表7】

【0165】

具体的な実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質をそのように十分に明らかにし、他のものが、現在の知識を適用することにより、過度の実験なしで、一般的な概念から逸脱することなく、そのような具体的な実施形態を種々の用途のために容易に修正および／または適合させることが可能であり、そのため、そのような適合および修正は、開示された実施形態の意味および等価物の範囲内で理解されるべきであり、理解されることが意図される。本明細書で使用される表現または専門用語が説明の目的のためであり、限定するものではないことが理解されるべきである。種々の開示された化学構造および機能を実行するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、多種多様の代替形態をとることが可能である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-04

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024509895000001.app

【国際調査報告】