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特表2024-509896プロテオミクスプロファイルマッチングを使用して組織試料を分析するためのエクスビボ方法、並びに病理の診断、予後及び治療に対する応答の予測のためのその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-05
(54)【発明の名称】プロテオミクスプロファイルマッチングを使用して組織試料を分析するためのエクスビボ方法、並びに病理の診断、予後及び治療に対する応答の予測のためのその使用
(51)【国際特許分類】
G01N 33/68 20060101AFI20240227BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240227BHJP
C12Q 1/02 20060101ALN20240227BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240227BHJP
【ＦＩ】
G01N33/68
G01N27/62 V
C12Q1/02
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554879
(86)(22)【出願日】2022-03-08
(85)【翻訳文提出日】2023-09-07
(86)【国際出願番号】 EP2022055792
(87)【国際公開番号】W WO2022189378
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】21305275.6
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506424209
【氏名又は名称】ユニベルシテ ドゥ ボルドー
(71)【出願人】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】516324917
【氏名又は名称】サントル・オスピタリエ・ユニベルシテール・ドゥ・ボルドー
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】サルテル，フレデリク
(72)【発明者】
【氏名】レイモンド，アンヌ－オーレリー
(72)【発明者】
【氏名】ディ トマソ，シルヴェーヌ
(72)【発明者】
【氏名】ドゥルト，シリル
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041EA04
2G041FA12
2G041GA08
2G041GA09
2G041LA07
2G041LA08
2G045AA25
2G045AA26
2G045CB01
2G045DA36
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA19
4B063QQ02
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QS10
4B063QS39
4H045AA10
4H045AA50
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
本発明は、対象における病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法であって、－組織の病理的状態の診断が以前に確立されている少なくとも１人の対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、試料が非病理的及び病理組織を含有する、無標識定量化ステップと、－各タンパク質について、非病理組織中のタンパク質に対する病理組織中のタンパク質の相対存在量の比を計算することによる、試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、－少なくとも２つの対象群の間で確立された統計的検定によって、以前に診断された病理的状態についての参照プロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法に関する。本発明はまた、本発明の方法を実施するための手段を含むデータ処理装置、対象において病理的である可能性が高い組織を分析するためのエクスビボ方法、組織のプロテオミクスプロファイリングのエクスビボ方法、対象における良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクを評価するためのエクスビボ方法、対象における良性及び悪性腫瘍の鑑別診断のためのエクスビボ方法、並びに対象における病理の治療の有効性を予測するためのエクスビボ方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象における病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法であって、－組織の病理的状態の診断が以前に確立されている少なくとも１人の対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、前記試料が、非病理組織と、病理組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、前記非病理組織中の前記タンパク質に対する前記病理組織中の前記タンパク質の前記相対存在量の比を計算することによる、前記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－少なくとも２つの対象群間で確立された統計的検定によって、前記以前に診断された病理的状態についての参照プロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法。
【請求項2】
前記試料が、ホルマリン固定パラフィン包埋若しくは凍結組織のマクロダイセクション又はレーザーマイクロダイセクションによって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記相対タンパク質存在量の前記無標識定量化が、質量分析によって実現される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記病理的状態が、がん、自己免疫疾患、血栓症、炎症性疾患、感染症、移植片若しくはプロテーゼ拒絶、又は良性腫瘍の中から選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
請求項１～４のいずれか一項に記載の方法を実施するための手段を備える、データ処理装置。
【請求項6】
対象において病理的である可能性が高い組織を分析するためのエクスビボ方法であって、－前記対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化ステップであって、前記試料が、非病理組織と、病理組織である可能性が高い組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、前記非病理組織中の前記タンパク質の量に対する、病理的である可能性が高い前記組織中の前記タンパク質の前記相対量の比を計算することによる、前記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－前記試料のプロテオミクスプロファイルと、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法によって得られた少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを計算するステップと、を含む、エクスビボ方法。
【請求項7】
前記分析が、参照プロファイルに対する、病理的である可能性が高い前記組織におけるタンパク質発現調節解除のプロファイルの分析である、請求項６に記載のエクスビボ方法。
【請求項8】
対象における病理を診断するエクスビボ方法であって、請求項６又は７に記載の分析のエクスビボ方法を実施することを含み、前記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと、病理の参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアが、前記病理を示す、方法。
【請求項9】
組織のプロテオミクスプロファイリングのエクスビボ方法であって、－前記組織の試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標
識定量化であって、前記試料が、非病理組織と、病理組織である可能性が高い組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、前記非病理組織中の前記タンパク質の量に対する病理的である可能性が高い前記組織中の前記タンパク質の前記相対量の比を計算することによる、前記組織のプロテオミクスプロファイル全体の決定ステップと、を含む、方法。
【請求項10】
対象における良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクを評価するためのエクスビボ方法であって、請求項６又は７に記載の組織の分析のエクスビボ方法を実施することを含み、前記対象の試料のプロテオミクスプロファイルと、がんの参照プロテオミクスプロファイルとの類似性スコアが、前記良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクを示す、方法。
【請求項11】
前記良性腫瘍が、肝細胞腺腫であり、前記がんが、肝臓がん、特に肝細胞がんである、請求項１０に記載のエクスビボ方法。
【請求項12】
対象における良性及び悪性腫瘍の鑑別診断のためのエクスビボ方法であって、請求項８に記載のエクスビボ診断方法を実施することを含み、前記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと、腫瘍の参照プロテオミクスプロファイルとの類似性スコアが、前記腫瘍、並びに任意選択でそのサブタイプ及び悪性形質転換状態を示す、方法。
【請求項13】
前記腫瘍が、肝臓腫瘍である、請求項１２に記載のエクスビボ方法。
【請求項14】
前記良性腫瘍が、肝細胞腺腫であり、悪性腫瘍が、肝細胞がんである、請求項１２に記載のエクスビボ方法。
【請求項15】
前記肝細胞腺腫が、Ｈ－ＨＣＡ、ＩＨＣＡ、ｂ－ＨＣＡ、ｂ－ＩＨＣＡ及びｓｈ－ＨＣＡから選択される少なくとも１つのサブタイプに属する、請求項１４に記載のエクスビボ方法。
【請求項16】
病理の少なくとも１つのバイオマーカーを同定するためのエクスビボ方法であって、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法を実施することを含む、方法。
【請求項17】
対象における病理の治療の有効性を予測するためのエクスビボ方法であって、請求項８に記載のエクスビボ診断方法を実施することを含み、前記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと、前記病理の参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアが、前記病理の治療に対する応答又は非応答を予測する、方法。
【請求項18】
前記病理が、肝臓がん、特に肝細胞がんである、請求項１７に記載のエクスビボ方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、対象における病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法、並びに特に対象における状態の診断及び管理のための、組織試料のエクスビボ分析におけるその使用に関する。
【0002】
したがって、本発明は、医療分野、より具体的には、診断、予後、及びセラノスティック（theranostic）分野において有用性を有する。
【0003】
以下の説明では、角括弧（［］）内の参照は、本文書の終わりの参照文献のリストを指す。
【背景技術】
【0004】
病理の診断及び管理は、特に腫瘍については、異なる臨床的専門知識を必要とする。今日、医用イメージングは非常に進歩しており、診断及び腫瘍予後に関して有効な結果を提供している。しかしながら、主要な課題の１つは、腫瘍が悪性であるか否かを決定することに残っていることが多い。それが良性である場合、がんへの悪性形質転換を含む臨床的リスクを依然として提示するかどうかを認識することが重要である。がんが同定された場合、可能な限り最良の患者管理、より正確には、腫瘍に適合した治療アプローチを提案するために、最大限の生物学的情報が得られなければならない。
【0005】
生検は、一般に診断を確立するために必要とされる最初の避けられないステップである侵襲的処置である。生検の組織学的解析は、医用イメージングを補完する診断のための必須のツールである。病理学者は、組織の形態学的特徴を解析し、免疫組織化学（immunohistochemistry、ＩＨＣ）によってバイオマーカー発現を可視化して、腫瘍の性質を決定することができる。今日、様々なバイオマーカーが、診断及び予後を支援するために現在利用可能であり、セラノスティクス及び病理学者は、連続免疫染色を使用して、増加する数のバイオマーカーの存在量を調査及び評価する。ＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ：ポリメラーゼ連鎖応答）及びＦＩＳＨ（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｉｎ ｓｉｔｕ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：蛍光インサイチュハイブリダイゼーション）は、ヒト試料に対して日常的に行われる。最近の技術的進歩により、現在、凍結組織、さらにはホルマリン固定パラフィン包埋（formalin-fixed and paraffin-embedded、ＦＦＰＥ）組織から、非常に高度なゲノム（次世代配列決定）及びトランスクリプトーム（ＲＮＡ配列決定）解析を実施することが可能になっている。
【0006】
それにもかかわらず、後者は、遺伝物質の分解を考慮すると、そのような解析に完全には適していない。これらの分子解析は、変異解析のために、又は日常治療試料中の特定の転写物の存在を検出するために使用することができる。しかしながら、実施されるＩＨＣ解析に加えて、それらは生物学的試料を使い果たすことが多い。翻訳の下流で、プロテオミクス解析は、疾患の機能的状態に関するかなりの量の情報の抽出を可能にし、潜在的なバイオマーカータンパク質（Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．：「ＡＳＳ１ Ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｈａｌｌｍａｒｋ ｏｆ Ｓｏｎｉｃ Ｈｅｄｇｅｈｏｇ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｅｎｏｍａｓ」．Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，８０９－８２４（２０２０）（［１］））及び臨床診療において使用可能な薬理学的標的（Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ Ｏ，ｅｔ ａｌ．「Ｐ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎ
ｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｔｉｓｓｕｅ」．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ＢＢＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １８５４，５５９－５８０（２０１５）（［２］））を直接同定及び定量化する。しかしながら、今日まで、プロテオミクスは、良性対悪性腫瘍の診断において有効ではない。
ｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ ｔｉｓｓｕｅ」．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ＢＢＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １８５４，５５９－５８０（２０１５）（［２］））を直接同定及び定量化する。しかしながら、今日まで、プロテオミクスは、良性対悪性腫瘍の診断において有効ではない。
【0007】
ＦＦＰＥ組織プロテオームの詳細な解析は、トランスレーショナルリサーチにおいて現在一般的に使用されている技術である（Ｃｏｓｃｉａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．「Ａ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｌａｒｇｅｓｃａｌｅ ＦＦＰＥ ｔｉｓｓｕｅ ａｎａｌｙｓｉｓ」．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２５１，１００－１１２（２０２０）（［３］）、Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．「Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １（ＡＳＳ１）：Ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｅｎｏｍａ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｒｉｓｋ」．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ ６６，２０１６－２０２８（２０１７）（［４］））。レーザーマイクロダイセクションを伴うＦＦＰＥ組織プロテオミクスは、関心組織領域の正確な選択を可能にするために既に組み合わされており、この技術は、ニードルによるマイクロ生検などの非常に少量の材料との適合性のために最適化されている（Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］））。実際、５μｍ厚のＦＦＰＥ切片の１ｍｍ２の面積は、病理組織対健常組織における１０００個のタンパク質のタンパク質発現の調節解除を比較するのに十分である。以前に、探索的アプローチにおいてこの方法を使用して、肝細胞腺腫（hepatocellular adenomas、ＨＣＡ）の特徴的なサブタイプについての新しい診断バイオマーカーが同定された（Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］）、Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。特に小肝生検において、ＩＨＣ染色の解釈に疑問がある場合、質量分析によるＨＣＡバイオマーカー定量化は、実際に、診断支援における情報の貴重な補足であり得ることも示されている（Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］））。
【0008】
組織プロテオミクスの専門家は、プロテオミクス解析が近い将来に外科病理学者の分野を統合することに同意する（Ｃｏｓｃｉａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（［３］）、Ａｈｍｅｄ Ｍ，ｅｔ ａｌ．「Ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ」．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐａｔｈｏｌ．７３、１－６（２０２０）（［５］）、Ｊｉｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．「Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐａｔｈｗａｙ ｔｏ ｐｅｒｓｏｎａｌｉｓｅｄ ｍｅｄｉｃｉｎｅ」．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．１５，２３１－２４３（２０１８）（［６］））。質量分析は、バイオマーカー同定のためのいくつかの特定の要件を既に満たしている。しかしながら、専門家は、単一のバイオマーカーが決して１００％特異的ではなく、診断、予後又はセラノスティックアプローチに十分ではあり得ないことに同意することが多い。
【0009】
したがって、患者の管理を可能にし、治療に対する応答を予測してその効率を改善する代替的な診断ツールが必要とされている。本発明は、上記及び他の必要性を満たす。
【発明の概要】
【0010】
本出願人は、組織におけるタンパク質発現調節解除のプロファイル、特にタンパク質発現調節解除の全プロファイルが、単一のバイオマーカーよりもはるかに完全な方法での病理的実体の診断及び管理であり得ることを見出した。
【0011】
本出願人は、組織からの診断のためにプロテオミクスパターンマッチングを使用して先駆的な研究を行った。広範な研究の後、本出願人は、診断、したがって患者管理を改善す
るためにプロテオミクスプロファイリングを開発した。
るためにプロテオミクスプロファイリングを開発した。
【0012】
本出願者は、生検又は外科標本から抽出されたプロテオミクスプロファイルと、完全に特徴付けられた患者からのプロテオミクスプロファイルから構成される参照データベースとの比較に基づく新規ツールを開発した。
【0013】
本出願人の広範な研究は、動作日常分析のための解析プロセスにつながる。さらに、この解析には少量の組織しか必要とせず、したがって試料を枯渇させることがなく、再使用することができる。このプロセスの別の印象的な利点は、完全な解析を１週間以内に達成することができるので、臨床診療によって課される期限に適合したままであることである。さらに、生成されたプロテオミクスデータは、さらなる適用（予後、セラノスティクス）のために再利用され得るリソースのままである。
【0014】
本出願人は、タンパク質調節解除のプロファイル（病理的対非病理的）に作用する主な利点は、個人間の変動を減少させることによって病理組織同一性に直接アクセスする能力であり、患者のコレクションが少ないにもかかわらず解析を効率的にすることを実証した。これはまた、機能的生物学的パスウェイとのプロテオミクスプロファイルマッチングの関連付け、生物学的関連性の制御、及び新しい標的の同定を可能にする。スペクトル強度プロファイルに対するタンパク質発現調節解除のプロファイルに作用するさらなる利点は、参照データベースの構築が質量分析計のタイプに依存しないことである。実際に、本発明の方法は、画像取得に使用されるデバイス間の異質性に関する主要な障害に直面するラジオミクスとは対照的に、異なる機器を有する現場で実施することができる。
【0015】
さらに、本出願人は、日常的な臨床診療において動作可能であり、患者診断の進行を提供することができるプロテオミクスベースの機械学習解析を開発した。
【0016】
したがって、本発明は、対象における病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法であって、
－組織の病理的状態の診断が以前に確立されている少なくとも１人の対象由来の組織試料の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、上記試料が、非病理組織と、病理組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質に対する病理組織中の上記タンパク質の相対存在量の比を計算することによる、上記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－少なくとも２つの対象群間で確立された統計的検定によって、以前に診断された病理的状態についての参照プロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
－組織の病理的状態の診断が以前に確立されている少なくとも１人の対象由来の組織試料の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、上記試料が、非病理組織と、病理組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質に対する病理組織中の上記タンパク質の相対存在量の比を計算することによる、上記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－少なくとも２つの対象群間で確立された統計的検定によって、以前に診断された病理的状態についての参照プロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
【0017】
したがって、第１の態様において、本発明は、病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法であって、
－組織の病理的状態の診断が以前に確立されている少なくとも１人の対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、上記試料が、非病理組織と、病理組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質に対する病理組織中の上記タンパク質の相対存在量の比を計算することによる、上記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－少なくとも２つの対象群間で確立された統計的検定によって、以前に診断された病理的状態についての参照プロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法を提供する。
－組織の病理的状態の診断が以前に確立されている少なくとも１人の対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、上記試料が、非病理組織と、病理組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質に対する病理組織中の上記タンパク質の相対存在量の比を計算することによる、上記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－少なくとも２つの対象群間で確立された統計的検定によって、以前に診断された病理的状態についての参照プロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法を提供する。
【0018】
「参照プロテオミクスプロファイル」は、本明細書において、診断された病理的状態について確立されたタンパク質発現のプロファイルを指し、診断されていない組織を分析するための比較参照として使用することができる。
【0019】
本発明によれば、「病理的状態」は、本明細書において、任意の疾患、疾患に起因する身体状態、又は疾患に発展する可能性がある身体状態を指す。それは、例えば、がん、自己免疫疾患、血栓症、炎症性疾患、感染症、移植片若しくはプロテーゼ拒絶、又は良性腫瘍であってもよいが、これらに限定されない。
【0020】
本発明の方法は、質量分析によって分析される可能性がある任意の種類のものであり得る組織試料に対して実現され得る。それは、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、ホルマリン固定パラフィン包埋若しくは凍結組織のマクロダイセクション又はレーザーマイクロダイセクションによって得ることができる。組織切片の調製、タンパク質抽出、質量分析のための試料の調製、及びレーザーマイクロダイセクションカッティング、ホルマリン固定反転及び凍結（もしあれば）のステップは、例えば、Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］）、及びＨｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［２］）によって記載されるような、当技術分野で知られている方法に従って実現され得る。
【0021】
組織は、例えば、乳房、肝臓、腎臓、肺、子宮、前立腺、精巣、舌、皮膚、骨髄、結腸、気管支、及び／又は筋肉組織、膵臓、内分泌組織、脳、眼、膀胱、胆嚢、唾液腺又はリンパ系組織などの、組織分析のための最新技術において一般的に使用される任意の種類のヒト又は動物組織であり得る。
【0022】
上記のように、本発明の方法において使用される組織試料は、非病理組織と、病理組織との両方を含有する。「病理組織」は、本明細書において、以前に確立された病理的状態によって影響を受けた組織領域を指し、一方、「非病理組織」は、病理的状態によって影響を受けていない組織領域を指す。組織の病理的領域又は組織の非病理的領域の同定は、当技術分野で知られている任意の方法によって、例えば、組織の形態学的特徴の視覚的同定によって実現され得るか、又は連続切片に対する免疫組織学的解析によって同定され得る。
【0023】
病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するための方法において、組織試料は、少なくとも１人（匹）の対象から得ることができる。有利には、組織試料は、少なくとも５、又は少なくとも１０、又は少なくとも１５、又は少なくとも２０、又は少なくとも３０、又は少なくとも４０、又は少なくとも５０、又は少なくとも６０、又は少なくとも７０、又は少なくとも１００、又は少なくとも１５０、又は少なくとも２００人（匹）、又はそれよりも多い対象から得ることができる。有利には、より多くの対象が存在するほど、プロファイルはより「ロバスト」である。
【0024】
「無標識定量化」は、本明細書において、タンパク質を標識する安定同位体含有化合物を使用することなく、少なくとも２つの組織試料中の同定されたタンパク質の抽出及び相対存在量の比較を可能にする質量分析における方法を指す。方法は、例えば、Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］）、Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［２］）によって記載されるような、最新技術において知られる任意の方法であってもよい。定量データは、最新技術においてこの目的のために一般的に使用される任意のデータ解析ソフトウェア、例えばＲソフトウェアを使用して解析されてもよい。この技術分野において一般的に実現されるように、複製は、病理組織及び非病理組織に関して、各対象について実現され得る。あるいは、無標識定量化は、同重体又は同位体標識によって置き換えられてもよい。例えば、ＴＭＴ（Ｔａｎｄｅｍ Ｍａｓｓ Ｔａｇ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）システムにおけるような同重体標識であってもよい。
【0025】
本発明によれば、相対タンパク質存在量は、組織試料中で同定された全タンパク質について、又はこれらのタンパク質の一部について決定することができる。本発明によれば、相対的タンパク質存在量は、組織試料の非病理的領域と病理的領域との間で比較される。
【0026】
病理組織／非病理組織比は、各タンパク質について、又はもしあれば技術的反復中央値から計算することができる。有利なことに、特徴付けられた対象からのプロテオミクスプロファイルは、参照データベースを構成し得る。
【0027】
「対象群」は、本明細書において、それらのプロテオミクスプロファイルを通して比較されるべき群又は対象を指す。有利には、それは、上述の試料のプロテオミクスプロファイルを少なくとも別の対象群の１つ又は少なくとも別の対象と比較することに対応し得る。例えば、
－健康な組織と病理組織とを比較することと、
－処置に対する良好な応答者及び不良な応答者を有する患者の２つの群を比較することと、
－２つ又は３つの治療を受けた良好な応答者である患者を比較すること（これもまた、いくつかの群の比較を可能にする）と、
－再発した群と再発していない群とを比較することと、
－メールフォームを作成したグループとメールフォームを作成しなかったグループとを比較することと、のために使用されてもよい。
－健康な組織と病理組織とを比較することと、
－処置に対する良好な応答者及び不良な応答者を有する患者の２つの群を比較することと、
－２つ又は３つの治療を受けた良好な応答者である患者を比較すること（これもまた、いくつかの群の比較を可能にする）と、
－再発した群と再発していない群とを比較することと、
－メールフォームを作成したグループとメールフォームを作成しなかったグループとを比較することと、のために使用されてもよい。
【0028】
このようにして得られた比の統計解析は、最新技術において同様の目的で知られている任意の方法によって実現することができる。それは、例えば、ウィルコクソン－マン－ホイットニー Ｕ検定又はｔ検定であり得る。当業者は、この技術分野の知識に関する統計解析の１つ以上を選択することができる。
【0029】
有利には、本発明のコンピュータ実装方法は、この技術分野で一般的に使用されるツール、例えば、特に各試料について、以前に確立された病理的状態診断に関連するプロテオミクスプロファイルを記録するための記録コンポーネントと、データを記憶するための記憶コンポーネントと、データを処理するためのコンピュータプロセッサであって、記憶コンポーネントに結合され、データを受信し、１つ以上のアルゴリズムに従ってデータを解析するために記憶コンポーネントに記憶された命令を実行するように構成されたコンピュータプロセッサと、参照プロテオミクスプロファイルに関する情報を表示するための表示コンポーネントとの使用を含む。
【0030】
したがって、本発明の別の目的は、上記で定義された病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法を実行するための手段を含むデータ処理デバイスに関する。
【0031】
本発明はまた、上述の方法といくつかのステップを共有し、上述の一般的な発明概念に基づくいくつかの方法に関する。したがって、本発明の以下の説明では、同じ用語は、必要な変更を加えて、上で与えられたものと同じ意味を有する。
【0032】
したがって、本発明の別の目的は、組織のプロテオミクスプロファイリングのエクスビボ方法であって、
－上記組織の試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、上記試料が、非病理組織と、病理組織である可能性が高い組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質の量に対する病理的である可
能性が高い組織中の上記タンパク質の相対量の比を計算することによる、上記組織のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
－上記組織の試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化であって、上記試料が、非病理組織と、病理組織である可能性が高い組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質の量に対する病理的である可
能性が高い組織中の上記タンパク質の相対量の比を計算することによる、上記組織のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、を含む、方法に関する。
【0033】
本発明の別の目的は、対象において病理的である可能性が高い組織を分析するためのエクスビボ方法であって、
－上記対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化ステップであって、上記試料が、非病理組織と、病理組織である可能性が高い組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質の量に対する、病理的である可能性が高い組織中の上記タンパク質の相対量の比を計算することによる、上記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－上記試料のプロテオミクスプロファイルと、上記で定義された病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法によって得られた少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを計算するステップと、を含む、方法に関する。
－上記対象由来の組織試料において同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化ステップであって、上記試料が、非病理組織と、病理組織である可能性が高い組織とを含有する、無標識定量化ステップと、
－各タンパク質について、非病理組織中の上記タンパク質の量に対する、病理的である可能性が高い組織中の上記タンパク質の相対量の比を計算することによる、上記試料のプロテオミクスプロファイルを決定するステップと、
－上記試料のプロテオミクスプロファイルと、上記で定義された病理的状態の参照プロテオミクスプロファイルを決定するためのコンピュータ実装方法によって得られた少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを計算するステップと、を含む、方法に関する。
【0034】
有利には、類似性スコアは、当業者によって一般的に使用される任意の知られている方法によって計算されてもよい。それは、類似性の計算のための任意の方法、例えば、単純化されたデータに対するカイ二乗検定、ＰＣＡ後のユークリッド距離計算、又はＰＣＡによって削減されたデータに対するランダムフォレストでもよい。
【0035】
既に上で説明したように、本発明の分析のためのエクスビボ方法は、参照プロファイルに対する、病理的である可能性が高い上記組織におけるタンパク質発現調節解除のプロファイルの分析、すなわちプロテオミクスプロファイルマッチングによる分析に基づく。
【0036】
本発明の別の目的は、対象における病理を診断するエクスビボ方法であって、上記で定義されたエクスビボ分析方法を実施することを含み、上記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと病理の参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアが、上記病理を示す、方法に関する。
【0037】
有利には、本発明の診断のエクスビボ方法は、プロテオミクスパターンマッチングに基づき、臨床的な日常診療の間に実現することができる。この診断方法は、この技術分野において一般的に実行される以下のような段階を含むことができる。
（ｉ）データの収集を含む検査段階。有利には、このステップは、少なくとも、上記の対象由来の組織試料中で同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化、及び上記で定義されたような、上記試料のプロテオミクスプロファイルの決定を含み得る。
（ｉｉ）これらのデータと標準値との比較。このステップは、上記試料のプロテオミクスプロファイルと、上記で定義された少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを少なくとも計算することを含み得る。
（ｉｉｉ）比較中の何らかの有意な偏差、すなわち症状の発見。
（ｉｖ）特定の臨床像、すなわち演繹的医療決定段階（厳密には治療目的のための診断）への偏差の帰属。
（ｉ）データの収集を含む検査段階。有利には、このステップは、少なくとも、上記の対象由来の組織試料中で同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化、及び上記で定義されたような、上記試料のプロテオミクスプロファイルの決定を含み得る。
（ｉｉ）これらのデータと標準値との比較。このステップは、上記試料のプロテオミクスプロファイルと、上記で定義された少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを少なくとも計算することを含み得る。
（ｉｉｉ）比較中の何らかの有意な偏差、すなわち症状の発見。
（ｉｖ）特定の臨床像、すなわち演繹的医療決定段階（厳密には治療目的のための診断）への偏差の帰属。
【0038】
本発明の別の目的は、対象における良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクを評価するためのエクスビボ方法であって、上記で定義された組織のエクスビボ分析方法を実施することを含み、上記対象の試料のプロテオミクスプロファイルとがんの参照プロテオミクスプロファイルとの類似性スコアが、上記良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクを示す、方法に関する。
【0039】
本発明によれば、良性腫瘍は、がんに形質転換するリスクがある任意の腫瘍であり得る。それは、例えば、肝細胞がん、特に肝細胞がんに発達し得る肝細胞腺腫であり得る。良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクを評価するためのこの方法は、この技術分野において一般的に実施される以下のような段階を含み得る。
（ｉ）データの収集を含む検査段階。有利には、このステップは、少なくとも、上記の対象由来の組織試料中で同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化、及び上記で定義されたような、上記試料のプロテオミクスプロファイルの決定を含み得る。
（ｉｉ）これらのデータと標準値との比較。このステップは、上記試料のプロテオミクスプロファイルと、がんの少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを少なくとも計算することを含み得る。
（ｉｉｉ）比較中の何らかの有意な偏差、すなわち症状の発見。
（ｉｖ）良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクの臨床像への偏差の帰属。
（ｉ）データの収集を含む検査段階。有利には、このステップは、少なくとも、上記の対象由来の組織試料中で同定された全てのタンパク質の相対タンパク質存在量の無標識定量化、及び上記で定義されたような、上記試料のプロテオミクスプロファイルの決定を含み得る。
（ｉｉ）これらのデータと標準値との比較。このステップは、上記試料のプロテオミクスプロファイルと、がんの少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを少なくとも計算することを含み得る。
（ｉｉｉ）比較中の何らかの有意な偏差、すなわち症状の発見。
（ｉｖ）良性腫瘍のがんへの形質転換のリスクの臨床像への偏差の帰属。
【0040】
本発明の別の目的は、対象における良性及び悪性腫瘍の鑑別診断のためのエクスビボ方法であって、上記で定義されたエクスビボ診断方法を実施することを含み、上記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと、腫瘍の参照プロテオミクスプロファイルとの類似性スコアが、上記腫瘍、並びに任意選択でそのサブタイプ及び悪性形質転換状態を示す、方法に関する。
【0041】
良性腫瘍及び悪性腫瘍の鑑別診断のためのこの方法は、この技術分野において一般的に実施される段階を含み得る。
【0042】
（ｉ）データの収集を含む検査段階。
有利には、このステップは、少なくとも、上記対象由来の組織試料の相対タンパク質存在量の無標識定量化、及び、上記で定義されたような、上記試料のプロテオミクスプロファイルの決定を含み得る。
（ｉｉ）これらのデータと標準値との比較。このステップは、上記試料のプロテオミクスプロファイルと、がん又は良性若しくは悪性腫瘍のサブタイプの少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを少なくとも計算することを含み得る。
（ｉｉｉ）比較中の何らかの有意な偏差、すなわち症状の発見。
（ｉｖ）がん又は良性若しくは悪性腫瘍のサブタイプの臨床像への偏差の帰属。
有利には、このステップは、少なくとも、上記対象由来の組織試料の相対タンパク質存在量の無標識定量化、及び、上記で定義されたような、上記試料のプロテオミクスプロファイルの決定を含み得る。
（ｉｉ）これらのデータと標準値との比較。このステップは、上記試料のプロテオミクスプロファイルと、がん又は良性若しくは悪性腫瘍のサブタイプの少なくとも１つの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアを少なくとも計算することを含み得る。
（ｉｉｉ）比較中の何らかの有意な偏差、すなわち症状の発見。
（ｉｖ）がん又は良性若しくは悪性腫瘍のサブタイプの臨床像への偏差の帰属。
【0043】
上述したように、腫瘍は任意の腫瘍、例えば肝腫瘍であり得る。より具体的には肝細胞がんであってもよく、良性腫瘍は肝細胞腺腫であってもよい。有利には、肝細胞腺腫が、Ｈ－ＨＣＡ、ＩＨＣＡ、ｂ－ＨＣＡ、ｂ－ＩＨＣＡ及びｓｈ－ＨＣＡから選択される少なくとも１つのサブタイプに属し得る。
【0044】
本発明の別の目的は、病理の少なくとも１つのバイオマーカーを同定するためのエクスビボ方法であって、コンピュータ実装方法を実行することを含む方法に関する。
【0045】
本発明の別の目的は、対象における病理の治療の有効性を予測するためのエクスビボ方法であって、上記で定義したエクスビボ診断方法を実施することを含み、上記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと病理の参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアが、上記病理の治療に対する応答又は非応答を予測する、方法に関する。
【0046】
有利には、対象は悪性腫瘍、例えば肝腫瘍を有する。有利には、病理は肝臓がん、特に肝細胞がん（hepatocellular carcinoma、ＨＣＣ）である。有利には、ＨＣＣの治療はソラフェニブ治療である。
【0047】
特に、本発明は、対象における肝臓がんの治療の有効性を予測するためのエクスビボ方法であって、上記で定義されたエクスビボ診断方法を実施することを含み、上記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと肝細胞がんの参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアが、上記肝細胞がんの治療に対する応答を予測する方法に関する。
【0048】
特に、本発明は、対象における病理の治療の有効性を予測するためのエクスビボ方法であって、上記で定義されたエクスビボ診断方法を実施することを含み、上記対象由来の試料のプロテオミクスプロファイルと病理の参照プロテオミクスプロファイルとの間の類似性スコアが、上記病理の治療に対する非応答を予測する方法に関する。病理は、任意の種類の病理、例えばがん、特に肝細胞がんであり得る。
【0049】
本発明は、限定として解釈されるべきではない添付の図面に関して以下の実施例によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【0050】
【図1-1】ＨＣＡデータベース検証及びプロテオミクスプロファイルとＨＣＡサブタイプを定義する変異との関連付けを表す図である。ａ：プロテオミクスデータベースを構成する６０症例における各サブタイプ（Ｈ－ＨＣＡ、ＩＨＣＡ、ｂ－ＨＣＡ ｅｘ３ ｎＳ４５、ｂ－ＨＣＡ ｅｘ３ Ｓ４５、ｂ－ＨＣＡ ｅｘ７／８、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ ｎＳ４５、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ Ｓ４５、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ７／８、ｓｈ－ＨＣＡ及びＦＮＨ）についてのＨＣＡバイオマーカー（Ｌ－ＦＡＢＰ、ＧＳ、ＣＲＰ／ＳＡＡ及びＡＳＳ１）の調節解除。各点は、症例の腫瘍対非腫瘍（Tumoral vs Non-Tumoral、Ｔ／ＮＴ）比を表す。Ｔ／ＮＴ比の中央値を各サブタイプについて示す。線は、Ｔ肝臓とＮＴ肝臓との間で同一の発現レベルを示す（Ｔ／ＮＴ＝１）。ｂ～ｄ：ＨＮＦ１Ａ、ＣＴＮＮＢ１、及びＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイの遺伝子について、各ＨＣＡサブタイプ（Ｈ－ＨＣＡ、ＩＨＣＡ、ｂ－ＨＣＡ ｅｘ３ ｎＳ４５、ｂ－ＨＣＡ ｅｘ３ Ｓ４５、ｂ－ＨＣＡ ｅｘ７／８、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ ｎＳ４５、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ Ｓ４５、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ７／８、ｓｈ－ＨＣＡ）における変異遺伝子と頻繁に機能的に関連するタンパク質の調節解除。各サブタイプの免疫マーカーが強調されている。ＨＮＦ１Ａ若しくはＣＴＮＮＢ１（それぞれＡＬＢ及びＯＡＴ）における変異に関連する発現を有するタンパク質、又はＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイに関連する炎症性サイトカイン（ＭＩＦ）の例が強調されている。各ＨＣＡ分子サブタイプを特徴付けるために使用されたＮａｕｌｔ ｅｔ ａｌ（「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｅｎｏｍａ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｂｌｅｅｄｉｎｇ，ａｎｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１５２，８８０－８９４．ｅ６（２０１７）（［１２］））によって列挙されたパスウェイ及び機能障害についてプロテオミクスによって同定されたタンパク質発現データ（データは示さず）から行われた、遺伝子セットエンリッチメント解析（Gene set enrichment analysis、ＧＳＥＡ）。
【図2-1】ＨＣＡ対ＦＮＨ（ａ）及び異なるＨＣＡサブタイプ間（ｂ：Ｈ－ＨＣＡ ｓｈ－ＨＣＡ；ｃ：ＩＨＣＡ＋ｂ－ＩＨＣＡ；ｄ：ｂ－ＨＣＡ；ｅ：ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡ；ｆ：ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ Ｓ４５及びｂ－ＨＣＡ ｅｘ３ ｎＳ４５；ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ ７／８、ｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ ｎＳ４５及びｂ－ＩＨＣＡ ｅｘ３ Ｓ４５）におけるタンパク質発現調節解除のプロファイルを比較する主成分解析（Principal Component Analysis、ＰＣＡ）を表す。生物学的パスウェイは、ＨＣＡサブタイプ特異的プロファイルに関連する。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）データベース（カノニカルパスウェイ）で実施した（データは示さず）。
【図3-1】ａ：逐次プロテオミクスパターンマッチングに基づく診断アルゴリズム、ｂ～ｄ：プロテオミクスパターンマッチングを使用して得ることができる結果の例（ｂ（Ｒ＿０１）はｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５に対応し、ｃ（ＢＰ＿０１）はｓｈ－ＨＣＡに対応し、ｄ（ＢＰ＿０２）はＨ－ＨＣＡに対応する）を表す。参照データベースからのＰＣＡに関する各症例の位置は、赤色の矢印によって示される。
【図4-1】ａ：分子サブタイプによって分類された形質転換ＨＣＡ症例の同定、ｂ：Ｂｏｒｄｅａｕｘでの２６０症例の本発明者らのコレクションにおいて、男性対女性で診断されたＨＣＡで発生したＨＣＣ又は「ボーダーライン」のパーセンテージ、ｃ及びｄ：分子サブタイプ（ｃ）に従って病理レポート（ｄ）から抽出された細胞学的異型性及び／又は構造的異常を有する本発明者らのＢｏｒｄｅａｕｘコレクションにおけるＨＣＡ症例のパーセンテージを表す。
【図5-1】ＨＣＡ（ＨＣＣ／ＨＣＡ）及び対応するＨＣＡ（ｂ）上で開発されたＨＣＣについてのタンパク質発現調節解除のプロファイルを比較する階層的クラスタリング（ａ）及び主成分解析（ＰＣＡ）を表す。１０個のタンパク質が同定され、ＨＣＡ悪性腫瘍のシグネチャーを構成した。それらの調節解除のレベル（Ｔ／ＮＴ比）は、ヒートマップの形態で表される（データは示さず）。Ｒｅａｃｔｏｍｅデータベースから抽出された機能アノテーションを表ｃに列挙する。
【図6-1】１２症例における悪性腫瘍シグネチャー検証を表す。ａ～ｂ：疑わしい悪性腫瘍を提示する２つの症例の組織学的ヘマトキシリンエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色：症例２１７（左）「ボーダーラインＨＣＡ」の診断につながる減少したレチクリンネットワークの病巣（ここでは図示せず）に関連する軽度の細胞学的異型性、及び症例２８０（右）明らかな細胞学的及び構造的異型性を有する十分に分化したＨＣＣであると疑われ、これらの２つの症例は、主成分解析（ＰＣＡ）上に位置する。（ｂ）検証症例のためのＰＣＡ上の例示的位置である。ＰＣＡ上のテストされた症例の位置は、緑色の矢印によって示される。
【図7】本発明の方法において実施される段階の概要を表す。
【図8-1】ソラフェニブ処置に対する進行ＨＣＣ患者の応答を予測するプロテオミクスシグネチャーの同定を表す。ａ：ソラフェニブに対する良好な応答者（ＧＲ ｎ＝５）又は不十分な応答者（ＢＲ ｎ＝９）における腫瘍対非腫瘍（Ｔ／ＮＴ）発現調節解除のプロテオミクスプロファイルの階層的クラスタリング。データセットは、２つの群の間で有意に異なる発現を有する７７個のタンパク質のシグネチャーに削減された。左側の値は、近似的に不偏なｐ値（approximately unbiased p-value、ＡＵ）を表し、右側の値はブートストラップ確率（boot-strap probability、ＢＰ）に対応する。ｂ：ソラフェニブに対する良好な応答者（ＧＲ ｎ＝５）又は不十分な応答者（ＢＲ ｎ＝９）における腫瘍対非腫瘍（Ｔ／ＮＴ）発現調節解除のプロテオミクスプロファイルの主成分解析。データセットは、２つの群の間で有意に異なる発現を有する７７個のタンパク質のシグネチャーに削減された。ＧＲ患者はオレンジ色の三角形で表され、ＢＲは青色の点で表される。ｃ：各患者についてＧＲとＢＲとの間で有意に差次的に発現される７７個のタンパク質のヒートマップ。ｄ：セラノスティックシグネチャーの７７個のタンパク質間の機能的相互作用の表現（Ｓｔｒｉｎｇデータベースｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ／）から作成される。
【図9-1】セラノスティックシグネチャー（Ingenuity Pathway（ＩＰＡ）データベースから作成）の７７個のタンパク質間の機能的相互作用を表す。色は、良好な応答者（ａ）及び不良な応答者（ｂ）についての腫瘍組織と非腫瘍組織との間のタンパク質発現の差（赤色＝上方制御及び緑色＝下方制御）に対応する。
【図10-1】遺伝子セットエンリッチメント解析を表す。遺伝子オントロジー（分子機能）から得られた結果。ａ：及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓ（ＩＰＡ）（カノニカルパスウェイ）。ｂ：ＧＲとＢＲとの間で有意に差次的に発現された７７個のタンパク質を用いたデータベース。ｙ軸は負のｌｏｇ１０ｐ値を表す。オレンジ色の線は最小レベルの有意性（ｐ＜０．０５）を表す。各バーの上部の数字は、各生物学的機能のエンリッチメントを計算するために使用されたタンパク質の数に対応する。
【実施例】
【0051】
実施例１：プロテオミクスパターンマッチングによる肝細胞腺腫の診断及び悪性腫瘍判定
ＨＣＡは、上記文献（Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．：「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１４９，１２２６－１２３９．ｅ４（２０１５）（［１３］）、Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（［１２］））において、広範かつ正確な遺伝的、免疫病理的、及び臨床学的特徴付けを受けた稀な肝臓腫瘍である。ＨＣＡは、主に中年の女性に影響を及ぼし、男性にはより少ない程度で影響を及ぼす。ＨＣＡの主な危険因子は、エストロゲン又はアンドロゲンへのホルモン曝露であるが、代謝疾患、血管疾患、糖原病、及びいくつかの他の稀な遺伝性疾患もまた、ＨＣＡの発症に関連している。出血及び肝細胞がん（ＨＣＣ）への悪性形質転換は、２つの主要な合併症であり、両方とも腺腫のサイズ及びその分子病理学的サブタイプに強く関連する。切除は、通常、ＨＣＡが５ｃｍに達し、β－カテニンパスウェイが活性化されたときに推奨される。有意な臨床リスクを有する症例を特定するために、ＨＣＡは、変異の同定並びに対応する臨床特性、組織学的特性及び免疫組織学的特性に基づいて４つの群に分類されている（Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（［１２］））。
（１）ＨＮＦ１Ａの不活性化変異を有するＨ－ＨＣＡ。その発現がＨＮＦ１ Ａによって調節されるＬ－ＦＡＢＰは、Ｈ－ＨＣＡ腫瘍細胞において免疫検出されない。
（２）炎症性ＨＣＡ（ＩＨＣＡ）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイを活性化する様々な変異（ＩＬ６ＳＴ、ＦＲＫ、ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ１、ＧＮＡＳ）又は染色体変化を示す（Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ（［８］））。腫瘍性肝細胞は、急性期炎症性タンパク質ＳＡＡ及びＣＲＰに対して強力かつびまん性の免疫応答性を示す。
（３）β－カテニンをコードするＣＴＮＮＢ１遺伝子（Ｓ４５又はエクソン７／８を含む、様々なホットスポットにおけるエクソン３）の活性化変異を有するｂ－ＨＣＡ。グルタミンシンセターゼ（Glutamine Synthetase、ＧＳ）をコードするβ－カテニン標的であるＧＬＵＬ遺伝子は、非Ｓ４５エクソン３ ｂ－ＨＣＡ腫瘍において強く検出される。ＢＨＣＡエクソン３非Ｓ４５腫瘍は、特にそれらがテロメラーゼ逆転写酵素（Telomerase Reverse Transcriptase、ＴＥＲＴ）プロモーターにおける変異に関連する場合、ＨＣＣへの悪性形質転換のリスクが高い。加えて、β－カテニン変異ＨＣＡの半分も炎症性の特徴を示す（ｂ－ＩＨＣＡ）。
（４）最後のグループは、ｓｈ－ＨＣＡに対応し、ＩＮＨＢＥプロモーターをＧＬＩ遺伝子と融合させる微小欠失によって定義される。Ｓｈ－ＨＣＡは、ＡＳＳ１の過剰発現によって同定され、主要な臨床問題である高い出血リスクを有する（Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（［１２］））。
ＨＣＡは、上記文献（Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．：「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１４９，１２２６－１２３９．ｅ４（２０１５）（［１３］）、Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（［１２］））において、広範かつ正確な遺伝的、免疫病理的、及び臨床学的特徴付けを受けた稀な肝臓腫瘍である。ＨＣＡは、主に中年の女性に影響を及ぼし、男性にはより少ない程度で影響を及ぼす。ＨＣＡの主な危険因子は、エストロゲン又はアンドロゲンへのホルモン曝露であるが、代謝疾患、血管疾患、糖原病、及びいくつかの他の稀な遺伝性疾患もまた、ＨＣＡの発症に関連している。出血及び肝細胞がん（ＨＣＣ）への悪性形質転換は、２つの主要な合併症であり、両方とも腺腫のサイズ及びその分子病理学的サブタイプに強く関連する。切除は、通常、ＨＣＡが５ｃｍに達し、β－カテニンパスウェイが活性化されたときに推奨される。有意な臨床リスクを有する症例を特定するために、ＨＣＡは、変異の同定並びに対応する臨床特性、組織学的特性及び免疫組織学的特性に基づいて４つの群に分類されている（Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（［１２］））。
（１）ＨＮＦ１Ａの不活性化変異を有するＨ－ＨＣＡ。その発現がＨＮＦ１ Ａによって調節されるＬ－ＦＡＢＰは、Ｈ－ＨＣＡ腫瘍細胞において免疫検出されない。
（２）炎症性ＨＣＡ（ＩＨＣＡ）は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイを活性化する様々な変異（ＩＬ６ＳＴ、ＦＲＫ、ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ１、ＧＮＡＳ）又は染色体変化を示す（Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ（［８］））。腫瘍性肝細胞は、急性期炎症性タンパク質ＳＡＡ及びＣＲＰに対して強力かつびまん性の免疫応答性を示す。
（３）β－カテニンをコードするＣＴＮＮＢ１遺伝子（Ｓ４５又はエクソン７／８を含む、様々なホットスポットにおけるエクソン３）の活性化変異を有するｂ－ＨＣＡ。グルタミンシンセターゼ（Glutamine Synthetase、ＧＳ）をコードするβ－カテニン標的であるＧＬＵＬ遺伝子は、非Ｓ４５エクソン３ ｂ－ＨＣＡ腫瘍において強く検出される。ＢＨＣＡエクソン３非Ｓ４５腫瘍は、特にそれらがテロメラーゼ逆転写酵素（Telomerase Reverse Transcriptase、ＴＥＲＴ）プロモーターにおける変異に関連する場合、ＨＣＣへの悪性形質転換のリスクが高い。加えて、β－カテニン変異ＨＣＡの半分も炎症性の特徴を示す（ｂ－ＩＨＣＡ）。
（４）最後のグループは、ｓｈ－ＨＣＡに対応し、ＩＮＨＢＥプロモーターをＧＬＩ遺伝子と融合させる微小欠失によって定義される。Ｓｈ－ＨＣＡは、ＡＳＳ１の過剰発現によって同定され、主要な臨床問題である高い出血リスクを有する（Ｎａｕｌｔ ｅｔ ａｌ．（［１２］））。
【0052】
ＨＣＡの遺伝子型／表現型分類は、現在、科学的観点からほぼ完全であると考えられている。しかし、悪性形質転換及び出血の根底にある機構は未知のままである。加えて、ＨＣＡ患者の日常管理は、多くの外科医及び肝臓病専門医にとって依然として難題である。第１の課題は、他の良性肝臓「腫瘍」からのＨＣＡの鑑別である。これらの他の腫瘍は、本質的に過形成性、すなわち、限局性結節性過形成（Focal Nodular Hyperplasia、ＦＮ
Ｈ）として特徴付けられる。いくつかの症例について、ＨＣＡとＦＮＨとの間の鑑別診断は、肝臓病理学者の専門家であっても、画像化及び生検解析によって困難なままである。これは特に、ＧＳがＦＮＨにおいても上方調節されるためである。ＦＮＨは出血も悪性形質転換もしないので、切除は指示されず、モニタリングは必須ではない。ＨＣＡ診断後、第２の課題は、手術に関連するリスク－ベネフィット比を考慮して、適切な場合に切除（稀な症例では移植）を提案するために、ＨＣＣへの形質転換及び出血のリスクの判定にある。
Ｈ）として特徴付けられる。いくつかの症例について、ＨＣＡとＦＮＨとの間の鑑別診断は、肝臓病理学者の専門家であっても、画像化及び生検解析によって困難なままである。これは特に、ＧＳがＦＮＨにおいても上方調節されるためである。ＦＮＨは出血も悪性形質転換もしないので、切除は指示されず、モニタリングは必須ではない。ＨＣＡ診断後、第２の課題は、手術に関連するリスク－ベネフィット比を考慮して、適切な場合に切除（稀な症例では移植）を提案するために、ＨＣＣへの形質転換及び出血のリスクの判定にある。
【0053】
この研究の目的は、ＨＣＡをモデルとして使用して、プロテオミクスベースの機械学習解析が日常的な臨床診療において動作可能であり、患者診断の進行を提供することができるという概念の証拠を確立することであった。最後に、このタイプのアプローチは、他の病理に転移可能な画期的なものである。
【0054】
材料及び方法
患者
全ての患者はインフォームドコンセントを提出し、この研究は、本発明者らの地域委員会である、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの「Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ ｄｅ Ｉ’Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｌｉｖｅｒ Ｂｉｏｂａｎｋ ＢＢ－００３３－０００３６によって承認された。
患者
全ての患者はインフォームドコンセントを提出し、この研究は、本発明者らの地域委員会である、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの「Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ ｄｅ Ｉ’Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｌｉｖｅｒ Ｂｉｏｂａｎｋ ＢＢ－００３３－０００３６によって承認された。
【0055】
ＨＣＡデータベース構築
２６０の切除されたＨＣＡの本発明者らのコホートにおいて、２４８症例が、Ｈ－ＨＣＡ（７７）、ＩＨＣＡ（８２）、ｂ－ＨＣＡ（２８）、ｂ－ＩＨＣＡ（３５）、ｓｈ－ＨＣＡ（２５）ＨＣＡに対応した。１症例のみが未分類のＨＣＡであった。１２症例において、サブタイプ分けは技術的理由のために評価できなかった。本発明者らは、ＨＣＡの外科的切除であり、２０１９年のＷＨＯ分類２０（６ Ｈ－ＨＣＡ、５ ＩＨＣＡ、１６ ｂ－ＨＣＡ（４ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、５ ｂ－ＨＣＡエクソン３ Ｓ４５、５ ｂ－ＨＣＡエクソン７／８＋分類のために送られた２症例のｂ－ＨＣＡ（１エクソン３ Ｓ４５及び１エクソン７／８）をこのコレクションに加えた）、１６ ｂ－ＩＨＣＡ（６ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、４ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３ Ｓ４５、６ ｂ－ＩＨＣＡエクソン７／８）、９ ｓｈ－ＨＣＡ）によって定義される全ての異なるサブタイプの代表である５２個の試料を選択した。ＨＣＡ及びＨＣＡサブタイプの診断は、形態学及び免疫染色に従って病理学者によって特徴的であると考えられ、結果は常に遺伝子型決定によって確認された。
２６０の切除されたＨＣＡの本発明者らのコホートにおいて、２４８症例が、Ｈ－ＨＣＡ（７７）、ＩＨＣＡ（８２）、ｂ－ＨＣＡ（２８）、ｂ－ＩＨＣＡ（３５）、ｓｈ－ＨＣＡ（２５）ＨＣＡに対応した。１症例のみが未分類のＨＣＡであった。１２症例において、サブタイプ分けは技術的理由のために評価できなかった。本発明者らは、ＨＣＡの外科的切除であり、２０１９年のＷＨＯ分類２０（６ Ｈ－ＨＣＡ、５ ＩＨＣＡ、１６ ｂ－ＨＣＡ（４ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、５ ｂ－ＨＣＡエクソン３ Ｓ４５、５ ｂ－ＨＣＡエクソン７／８＋分類のために送られた２症例のｂ－ＨＣＡ（１エクソン３ Ｓ４５及び１エクソン７／８）をこのコレクションに加えた）、１６ ｂ－ＩＨＣＡ（６ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、４ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３ Ｓ４５、６ ｂ－ＩＨＣＡエクソン７／８）、９ ｓｈ－ＨＣＡ）によって定義される全ての異なるサブタイプの代表である５２個の試料を選択した。ＨＣＡ及びＨＣＡサブタイプの診断は、形態学及び免疫染色に従って病理学者によって特徴的であると考えられ、結果は常に遺伝子型決定によって確認された。
【0056】
プロテオミクス解析
組織切片の調製、レーザーマイクロダイセクションカッティング、タンパク質抽出、ホルマリン固定反転、質量分析用試料の調製、質量分析、生質量分析データの処理、及び無標識定量化を、上述したように行った（Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］）、Ｃｏｓ
ｃｉａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（［３］））。質量分析プロテオミクスデータは、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている。
組織切片の調製、レーザーマイクロダイセクションカッティング、タンパク質抽出、ホルマリン固定反転、質量分析用試料の調製、質量分析、生質量分析データの処理、及び無標識定量化を、上述したように行った（Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．（［１］）、Ｃｏｓ
ｃｉａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．（［３］））。質量分析プロテオミクスデータは、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている。
【0057】
質量分析データ処理
フリーＲソフトウェアを用いて定量データを分析した。２未満の特異的ペプチドを有する質量分析によって同定されたタンパク質を除外した。各患者について、３つの技術的腫瘍（ｔｕｍｏｕｒ、Ｔ及び非腫瘍（non tumour、ＮＴ）複製（連続切片から）を実施した。技術的反復中央値からのＴ／ＮＴ比を、各タンパク質について計算した。各群において有意に異なり、したがって特異的プロテオミクスプロファイルに対応した発現（ｐ＜０．０５）を有するタンパク質を特異的に同定するために、Ｒパッケージを使用してＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を実施した。
フリーＲソフトウェアを用いて定量データを分析した。２未満の特異的ペプチドを有する質量分析によって同定されたタンパク質を除外した。各患者について、３つの技術的腫瘍（ｔｕｍｏｕｒ、Ｔ及び非腫瘍（non tumour、ＮＴ）複製（連続切片から）を実施した。技術的反復中央値からのＴ／ＮＴ比を、各タンパク質について計算した。各群において有意に異なり、したがって特異的プロテオミクスプロファイルに対応した発現（ｐ＜０．０５）を有するタンパク質を特異的に同定するために、Ｒパッケージを使用してＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を実施した。
【0058】
距離計算及びパターンマッチング
フリーＲソフトウェアを使用して解析を行った。階層的クラスタリングは、Ｒパッケージ及びその「ｈｃｌｕｓｔ」関数によって表された。凝集法として「ｗａｒｄ．Ｄ」法を使用し、ユークリッド距離を距離計算のために使用した。主成分解析（ＰＣＡ）のために、ＶＩＭパッケージからｋ－最近傍（k-Nearest Neighbor、ＫＮＮ）インピュテーション法を使用して欠損値をインピュテーションした。ＰＣＡデータを計算し、ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ及びＦａｃｔｏＭｉｎｅＲパッケージ内のＰＣＡ及びｆｖｉｚ＿ｐｃａ＿ｉｎｄ関数によってフォーマットした。ユークリッド距離は、ｄｉｓｔ関数及びｃｈｉｓｑ．ｔｅｓｔ関数を使用する独立のカイ二乗検定を使用して計算した（両方ともＲパッケージ内）。ランダムフォレストは、ランダムフォレストパッケージ内のランダムフォレスト関数を使用して生成された。最適パラメータは、カレットパッケージ内のトレイン関数によって計算された。
フリーＲソフトウェアを使用して解析を行った。階層的クラスタリングは、Ｒパッケージ及びその「ｈｃｌｕｓｔ」関数によって表された。凝集法として「ｗａｒｄ．Ｄ」法を使用し、ユークリッド距離を距離計算のために使用した。主成分解析（ＰＣＡ）のために、ＶＩＭパッケージからｋ－最近傍（k-Nearest Neighbor、ＫＮＮ）インピュテーション法を使用して欠損値をインピュテーションした。ＰＣＡデータを計算し、ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ及びＦａｃｔｏＭｉｎｅＲパッケージ内のＰＣＡ及びｆｖｉｚ＿ｐｃａ＿ｉｎｄ関数によってフォーマットした。ユークリッド距離は、ｄｉｓｔ関数及びｃｈｉｓｑ．ｔｅｓｔ関数を使用する独立のカイ二乗検定を使用して計算した（両方ともＲパッケージ内）。ランダムフォレストは、ランダムフォレストパッケージ内のランダムフォレスト関数を使用して生成された。最適パラメータは、カレットパッケージ内のトレイン関数によって計算された。
【0059】
統合的生物学的解析
パスウェイ解析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）データベースを使用して行った。１０個の最も有意にエンリッチされたカノニカルパスウェイを各群（ＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨ）から選択し、比較した。機能アノテーションは、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント解析）ウェブツールを使用して遺伝子オントロジー（生物学的機能）及びＲｅａｃｔｏｍｅデータベースから抽出した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）。
パスウェイ解析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）データベースを使用して行った。１０個の最も有意にエンリッチされたカノニカルパスウェイを各群（ＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨ）から選択し、比較した。機能アノテーションは、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント解析）ウェブツールを使用して遺伝子オントロジー（生物学的機能）及びＲｅａｃｔｏｍｅデータベースから抽出した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）。
【0060】
プロテオミクスプロファイルの検証のための症例の選択
本発明者らが同定したプロテオミクスプロファイルの診断適用性を検証するために、本発明者らは、試料分類のために１１症例の生検及び１切除、並びに悪性腫瘍状態のために４切除のパネルを選択した。
本発明者らが同定したプロテオミクスプロファイルの診断適用性を検証するために、本発明者らは、試料分類のために１１症例の生検及び１切除、並びに悪性腫瘍状態のために４切除のパネルを選択した。
【0061】
グラフィカル表現
グラフィカル表現は、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージ及びその全ての依存性を使用してフォーマットされた。
グラフィカル表現は、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージ及びその全ての依存性を使用してフォーマットされた。
【0062】
結果
本発明者らのセンターにおける最先端のＨＣＡ診断
最初に、ＨＣＡ診断を評価し、それを改善するために、本発明者らは、本発明者らの三次施設（Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）においてＨＣＡ管理を検討した。全てのＨＣＡは、組織病理的解析及びＩＨＣによって機械的に分類される。１９８４年から２０２０年の間の研究に含まれた合計２６０例の切除された症例（２２７例が女性／３３例が男性
）のうち、７１％（１８５／２６０症例）の症例も、遺伝子変異を同定するために、主に切除された標本について分子生物学によって解析された。
本発明者らのセンターにおける最先端のＨＣＡ診断
最初に、ＨＣＡ診断を評価し、それを改善するために、本発明者らは、本発明者らの三次施設（Ｂｏｒｄｅａｕｘ，Ｆｒａｎｃｅ）においてＨＣＡ管理を検討した。全てのＨＣＡは、組織病理的解析及びＩＨＣによって機械的に分類される。１９８４年から２０２０年の間の研究に含まれた合計２６０例の切除された症例（２２７例が女性／３３例が男性
）のうち、７１％（１８５／２６０症例）の症例も、遺伝子変異を同定するために、主に切除された標本について分子生物学によって解析された。
【0063】
臨床データ及び患者管理履歴を全ての症例について収集した。症例の２７パーセント（７０／２６０症例）はまた、手術前に生検を受けていた。本発明者らは、これら全ての症例の病歴を抽出した。７０個の生検のうち、２７個（３８．６％）のみがＨＣＡ及びＨＣＡサブタイプの診断に寄与した。これらは両方とも、外科的切除の後に判定された。生検解釈が正式でなかった場合、それは、解釈可能な材料の欠如（８症例）などの技術的に寄与しない要因、又は標準的な病理的ツールを用いて高度に分化されたＨＣＣ（１５症例）若しくはＦＮＨ（３症例）で標準的な鑑別診断を行うことが不可能であったことのいずれかによるものであった。これらのデータは、Ｂｏｒｄｅａｕｘでの本発明者らの三次施設における本発明者らの経験に基づいて、ＨＣＡなどの十分に特徴付けられた腫瘍及びこの分野の専門病理学者に対してさえ、さらなる診断支援ツールが、これらの診断生検の６０％に有用であり得ることを明らかにした。
【0064】
参照ＨＣＡプロテオミクスデータベースの作成
本発明者らの収集物からロバストなデータベースを構築するために、本発明者らは、全てのＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨを代表する５２例のＨＣＡ外科的切除症例を選択した。これらの切除の診断は、病理学者によって典型的であると考えられ、遺伝子解析によって確認された。
本発明者らの収集物からロバストなデータベースを構築するために、本発明者らは、全てのＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨを代表する５２例のＨＣＡ外科的切除症例を選択した。これらの切除の診断は、病理学者によって典型的であると考えられ、遺伝子解析によって確認された。
【0065】
プロテオミクス解析のために本発明者らの最適化された方法を適用して、本発明者らは、各患者由来の腫瘍性（Ｔ）肝臓組織と非腫瘍性（ＮＴ）肝臓組織との間で相対的タンパク質存在量を比較した。本発明者らは、各患者について平均１６０４個のタンパク質を同定及び定量化した。最初に、本発明者らのデータベースのロバスト性を検証するために、本発明者らは、日常的な臨床診断において使用されるＨＣＡバイオマーカーＴ／ＮＴ比を定量化した。本発明者らは、対応する腫瘍：それぞれｂ－ＨＣＡ／ｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、ＩＨＣＡ／ｂ－ＩＨＣＡ、及びｓｈ－ＨＣＡ（図１ａ、図ｂ、及び図ｃ）におけるＧＳ、ＣＲＰ／ＳＡＡ、及びＡＳＳ１マーカーの特異的かつ予測された調節解除を確認した。Ｌ－ＦＡＢＰの喪失は、Ｈ－ＨＣＡ（中央値Ｔ／ＮＴ＝０．０４）とのみ関連していたが、本発明者らは、ｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５（中央値Ｔ／ＮＴ＝０．４９）、ｂ－ＩＨＣＡエクソン７／８（中央値Ｔ／ＮＴ＝０．５９）、及びｓｈ－ＨＣＡ（中央値Ｔ／ＮＴ＝０．５０）の減少も認めた（図１ａ）。
【0066】
本発明者らは、最初に、各ＨＣＡサブタイプについてのタンパク質シグネチャーが、それらを定義する根底にある変異を反映すると仮定した。したがって、本発明者らは、各ＨＣＡサブタイプ（ＨＮＦ１Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイ）を定義する根底にある変異遺伝子に機能的に関連するタンパク質を調べた。驚くべきことに、免疫マーカーとして現在使用されている検証された標的タンパク質（Ｌ－ＦＡＢＰ、ＧＳ、ＣＲＰ／ＳＡＡ）を除いて、本発明者らは、各変異に関連して頻繁に見出される他のタンパク質の主要な調節解除を観察しなかった。本発明者らは、これをＡＬＢ３０、ＯＡＴ３１、及びＭＩＦ３２の例で示す（図１ｂ、図１ｃ及び図１ｄ）。さらに、本発明者らは、トランスクリプトームアプローチ１３（ＩＨＣＡ及びｓｈ－ＨＣＡにおいて主に見出されるエストロゲン関連経口避妊薬パスウェイ、Ｈ－ＨＣＡにおける腫瘍脂肪症、ｂ－ＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡにおける胆汁うっ滞、ｂ－ＨＣＡにおけるＨＣＣの発症）から各ＨＣＡ群について上述した典型的／特異的パスウェイを調査した。本発明者らは、教師なし解析によって、全てのＨＣＡサブタイプにおいてこれらのパスウェイの全てが有意に調節解除されていることを見出した（データは示さず）。本発明者らは、これらの結果内において、ＨＣＣ発生に関連するタンパク質が全てのＨＣＡサブタイプにおいて有意に調節解除されたことに注目し、したがって、全てのサブタイプが潜在的に形質転換され得ることを示唆した。この段階で、本発明者らは、変異及び関連マーカーがＨＣＡのサブタイプを同定することができるとしても、これだけでは表現型を定義することができないと結論付けた。
【0067】
したがって、本発明者らは、調節解除されたタンパク質発現に関する各ＨＣＡサブタイプの特異性を調査した。本発明者らは、ＨＣＡとＦＮＨとの間のタンパク質発現における有意な変動、及び各ＨＣＡ群についての有意な変動の両方を選択した（図２）。本発明者らは、各特異的タンパク質発現プロファイルからのＨＣＡ群間の距離を解析した。ＨＣＡ及びＦＮＨのプロテオミクスプロファイルは全く異なっていた（図２ａ）。ＨＣＡ及びＦＮＨプロテオミクスプロファイルを鑑別することができたら、次に、異なるＨＣＡサブタイププロテオミクスプロファイルを鑑別することが可能であるかどうかを試験した。本発明者らは、最初に、最も類似していないプロファイル、すなわちＨ－ＨＣＡ及びｓｈ－ＨＣＡを分離した（図２ｂ）。興味深いことに、炎症性タンパク質発現プロファイルは、炎症性ＨＣＡ（ＩＨＣＡ及びｂ ＩＨＣＡ）によって共有される強いシグネチャーであり、その２つの群は、他のＨＣＡとは異なっていた（図２ｃ）。ｂ－ＨＣＡのプロテオミクスプロファイルは、ｂ－ＨＣＡの階層的クラスタリング後であっても、ＰＣＡによって他のＨＣＡと十分に区別されなかった（図２ｄ）。しかし、ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡを特異的に比較した場合、それらのプロテオミクスプロファイルは著しく異なっていた（図２ｅ）。さらに、それらのタンパク質発現プロファイルは、ｂ－ＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡの両方について、ＣＴＮＮＢ１変異のタイプ（エクソン３非Ｓ４５、エクソン３ Ｓ４５、又はエクソン７／８）に従って明確に分類された（図２ｆ）。
【0068】
これらの結果は、プロテオミクスプロファイルと遺伝子型／表現型分類との間の優れた相関を実証し、優性（ｓｈ－ＨＣＡ、炎症性Ｈ－ＨＣＡ）及びあまり明らかでないプロファイル（ＣＴＮＮＢ１変異）の両方の存在を明らかにした。
【0069】
次いで、本発明者らは、各特異的プロフィールに関連する生物学的機能を試験した。遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）は、ＦＮＨとＨＣＡとの間の主要な差異を明らかにした。これは、ＦＮＨにおいて有意でなかったアミノ酸代謝の破壊を含む、ＨＣＡにおけるミトコンドリア障害の存在であった（データは示さず）。各ＨＣＡサブタイプに関連するプロテオミクス調節解除のプロファイルの解析は、遺伝的分類よりも正確でない特異性を明らかにした。対照的に、本発明者らは、プロテオミクス調節解除のほとんどが異なるＨＣＡサブタイプによって共有されることを見出した（データは示さず）。予想通り、Ｈ－ＨＣＡの最も有意に調節解除されたパスウェイは、脂肪症に関連する脂肪酸ベータ酸化パスウェイであり、これはこれらの腫瘍において特徴的に観察されるが、炎症性ＨＣＡにおいても見出された。これらのデータは、ＩＨＣＡの８０症例中２３症例が本発明者らの収集において脂肪症であったという事実と一致している可能性がある（１１症例が肝臓の３分の２より多い脂肪症を示し、１２症例が３分の１と３分の２の間である）。Ｈ－ＨＣＡはまた、アミノ酸代謝及び異物代謝における強い調節解除、ｓｈ－ＨＣＡと共有される有意なパスウェイ調節解除を示し、これに対して、本発明者らは上述した尿素サイクル調節解除も見出した（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。
【0070】
炎症性ＨＣＡ（ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡ）について最も有意にエンリッチされたパスウェイは、予想通り、炎症応答の活性化（ＦＸＲ／ＲＸＲ活性化、急性期応答シグナル伝達）に関連していた。Ｅｉｆ２シグナル伝達パスウェイに関連するｍＲＮＡ翻訳を調節するストレス関連シグナルもまた、ｓｈ－ＨＣＡ特異的プロテオミクスプロファイルと同様に、炎症性ＨＣＡにおいて有意にエンリッチされた（データは示さず）。対照的に、ｓｈ－ＨＣＡとは異なり、ＨＨＣＡ特異的プロテオミクスプロファイルは、エストロゲンシグナル伝達パスウェイに関連する有意なタンパク質発現調節解除、炎症性ＨＣＡと共有され、より低い程度でｂ－ＨＣＡと共有される特徴（データは示さず）を示した。ｂ－ＨＣＡサブタイプは、β－カテニンパスウェイさえも含む特異的パスウェイのエンリッチメントによって区別することができなかった（データは示さず）。この統合的解析は、遺伝子変異がタンパク質レベルで厳密に明確な機能分類に翻訳されないことを明らかにした。
【0071】
ＨＣＡ及びＦＮＨ診断のための機械学習ツール
本発明者らのプロテオミクスデータベースの統計解析により、本発明者らがそれぞれの異なるＨＣＡサブタイプを区別することが可能になったことを考慮して、本発明者らは、診断ツールを設定することに決めた。臨床応用のための第１の重要なステップは、試料がＨＣＡ又はＦＮＨに対応し、別のタイプの高分化型肝腫瘍に対応しないかどうかを定義することであった。これを調べるために、本発明者らのプロテオミクスプロファイル同定方法を使用して、本発明者らは、本発明者らのデータベースに含まれておらず、したがって本発明者らが参照プロテオミクスプロファイルを有していなかった２つの他のタイプの高分化型肝腫瘍、すなわち肝硬変肝臓における低グレード異形成結節及び高分化型ＨＣＣを解析した。両方の場合について、ＨＣＡ又はＦＮＨとの類似性スコアは非常に低く、誤った帰属の可能性を除外し、腫瘍がＨＣＡでもＦＮＨでもないことを示した。次に、本発明者らは、最初に、同定された主なＨＣＡ群（ｓｈ－ＨＣＡ、ＨＨＣＡ、炎症（ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡ）、次いで二次プロテオミクスプロファイル（異なるＣＴＮＮＢ１変異によるｂ－ＨＣＡ）を統合するアルゴリズムを構築した（図３ａ）。したがって、その原理は、それらのＨＣＡサブタイプを診断するために、ＨＣＡサブタイプ参照プロテオミクスプロファイルを新しい症例と逐次比較することである（図３ｂ、図３ｃ、及び図３ｄ）。本発明者らは、類似性を計算するために３つのアプローチ、すなわち（１）異なる参照プロテオミクスプロファイル間で、上方調節されたタンパク質（Ｔ／ＮＴ比＞１．５）、下方調節されたタンパク質（Ｔ／ＮＴ比＜０．６７）、及び非調節タンパク質（Ｔ／ＮＴ比＞０．６７及び＜１．５）を比較するためのカイ二乗検定、（２）ＰＣＡからの各グループ間のユークリッド距離の計算、（３）ＰＣＡ削減データセットに対するランダムフォレスト解析、を使用した。本発明者らは、それらを、ＦＮＨ及びＨＣＡ（任意のサブタイプ）の１１の生検及び１つの切除のパネルに適用して、各解析の利点及び限界を試験した。
本発明者らのプロテオミクスデータベースの統計解析により、本発明者らがそれぞれの異なるＨＣＡサブタイプを区別することが可能になったことを考慮して、本発明者らは、診断ツールを設定することに決めた。臨床応用のための第１の重要なステップは、試料がＨＣＡ又はＦＮＨに対応し、別のタイプの高分化型肝腫瘍に対応しないかどうかを定義することであった。これを調べるために、本発明者らのプロテオミクスプロファイル同定方法を使用して、本発明者らは、本発明者らのデータベースに含まれておらず、したがって本発明者らが参照プロテオミクスプロファイルを有していなかった２つの他のタイプの高分化型肝腫瘍、すなわち肝硬変肝臓における低グレード異形成結節及び高分化型ＨＣＣを解析した。両方の場合について、ＨＣＡ又はＦＮＨとの類似性スコアは非常に低く、誤った帰属の可能性を除外し、腫瘍がＨＣＡでもＦＮＨでもないことを示した。次に、本発明者らは、最初に、同定された主なＨＣＡ群（ｓｈ－ＨＣＡ、ＨＨＣＡ、炎症（ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡ）、次いで二次プロテオミクスプロファイル（異なるＣＴＮＮＢ１変異によるｂ－ＨＣＡ）を統合するアルゴリズムを構築した（図３ａ）。したがって、その原理は、それらのＨＣＡサブタイプを診断するために、ＨＣＡサブタイプ参照プロテオミクスプロファイルを新しい症例と逐次比較することである（図３ｂ、図３ｃ、及び図３ｄ）。本発明者らは、類似性を計算するために３つのアプローチ、すなわち（１）異なる参照プロテオミクスプロファイル間で、上方調節されたタンパク質（Ｔ／ＮＴ比＞１．５）、下方調節されたタンパク質（Ｔ／ＮＴ比＜０．６７）、及び非調節タンパク質（Ｔ／ＮＴ比＞０．６７及び＜１．５）を比較するためのカイ二乗検定、（２）ＰＣＡからの各グループ間のユークリッド距離の計算、（３）ＰＣＡ削減データセットに対するランダムフォレスト解析、を使用した。本発明者らは、それらを、ＦＮＨ及びＨＣＡ（任意のサブタイプ）の１１の生検及び１つの切除のパネルに適用して、各解析の利点及び限界を試験した。
【0072】
１２症例のうち３症例は、典型的なｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、ｓｈ－ＨＣＡ及びＨ－ＨＣＡ（それぞれ、Ｒ＿０１、ＢＰ＿０１、及びＢＰ＿０２）であり、分類においていかなる困難も示さなかった（図３ｂ、図３ｃ、図３ｄ及び図３ｅ）。他の９症例は、本発明者らの三次施設において形態及びＩＨＣについて診断された生検の代表的なパネルからなった。単一ＨＣＡバイオマーカーの質量分析による定量化は、これらの症例のうちのいずれのサブタイプ分けにも寄与しなかった。しかしながら、３つの異なる数学的アプローチによって同定されたプロテオミクスプロファイルは、３症例（ＢＰ＿０３、＿０４及び＿０５）についての臨床病理的解釈と一致した。他の２症例（ＢＰ＿０６及び＿０７）については、ランダムフォレスト及びユークリッド距離（ＢＰ＿０６）又はカイ二乗検定（ＢＰ＿０７）が病理診断と一致した。しかしながら、１回の試験では、各症例について異なる結果が得られた。これらの２症例について、ランダムフォレストは正しい診断を与えたが、これらの症例はあまり典型的ではなく、データベース中のＨＣＡと完全に一致しなかった。別の症例（ＢＰ＿０８）は、ｂ－ＨＣＡエクソン７／８サブタイプであり、その後、切除に関する遺伝子解析によって同定された。ランダムフォレスト及びユークリッド距離は、それをｂ－ＨＣＡエクソン７／８サブタイプとして確実に認識したが、カイ二乗検定は、それを非常に類似したｂ－ＨＣＡエクソン３ Ｓ４５群と分類した。最後に、その後の切除を伴わない３つの生検（ＢＰ＿０９、＿１０、及び＿１１）であって、病理学者がＩＨＣＡをｂ－ＩＨＣＡ（エクソン７／８又はエクソン３ Ｓ４５）から区別することができなかった３つの生検は、ｂ－ＩＨＣＡエクソン７／８又はエクソン３ Ｓ４５プロファイルを有する群であることが見出された。
【0073】
結論として、これらの結果は、プロテオミクスパターンマッチングがＨＣＡをＦＮＨか
ら鑑別し、分子ＨＣＡサブタイプを割り当てることができることを実証している。異型症例に関して困難な場合、プロテオミクスプロファイリングは、診断を支持するさらなる手がかりをもたらし得る。
ら鑑別し、分子ＨＣＡサブタイプを割り当てることができることを実証している。異型症例に関して困難な場合、プロテオミクスプロファイリングは、診断を支持するさらなる手がかりをもたらし得る。
【0074】
形質転換されたＨＣＡの悪性度のプロテオミクスプロファイルの同定
十分に確立された分子病理学的分類にもかかわらず、ＨＣＡ管理は、多くの外科医にとって繊細なままである。１９９６年に、Ａｕｌｔ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ａｄｅｎｏｍａｓ」．Ａｍ．Ｓｕｒｇ．６２，８２５－８２９（１９９６）（［１４］））は、症候性ＨＣＡ又は５ｃｍより大きいＨＣＡの切除を既に提案しているが、分子的及び免疫病理的分類の出現にもかかわらず、これらの臨床勧告以来、実質的に何も変化していない。実際、外科的切除を悪性の可能性のあるＨＣＡのみに限定することは、それが実際に同定することが非常に困難であるため、現在のところ依然として不可能である。これを確認するために、本発明者らは、分子分類の出現が、本発明者らの三次施設の臨床診療においてサブグループタイプに従ってＨＣＡ管理を改変しなかったことに気付いた。これは、より多くの術前生検を行う傾向がわずかであるにもかかわらずである。
十分に確立された分子病理学的分類にもかかわらず、ＨＣＡ管理は、多くの外科医にとって繊細なままである。１９９６年に、Ａｕｌｔ Ｇ．Ｔ．，ｅｔ ａｌ．（「Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｃ ａｄｅｎｏｍａｓ」．Ａｍ．Ｓｕｒｇ．６２，８２５－８２９（１９９６）（［１４］））は、症候性ＨＣＡ又は５ｃｍより大きいＨＣＡの切除を既に提案しているが、分子的及び免疫病理的分類の出現にもかかわらず、これらの臨床勧告以来、実質的に何も変化していない。実際、外科的切除を悪性の可能性のあるＨＣＡのみに限定することは、それが実際に同定することが非常に困難であるため、現在のところ依然として不可能である。これを確認するために、本発明者らは、分子分類の出現が、本発明者らの三次施設の臨床診療においてサブグループタイプに従ってＨＣＡ管理を改変しなかったことに気付いた。これは、より多くの術前生検を行う傾向がわずかであるにもかかわらずである。
【0075】
したがって、分類を改善することは、ＨＣＡ患者の管理を変更するのに十分ではない。しかしながら、悪性形質転換はＨＣＡの主要な合併症であり、本発明者らは、本発明者らのプロテオミクスプロファイルに基づくツールがこの問題に対処するのに役立ち得るかどうかを決定したいと考えた。本発明者らの症例の収集からの臨床データの解析は、ＨＣＡサブグループの大部分が悪性形質転換を受け得（図４ａ）、ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５サブタイプが悪性形質転換の最も高いリスクを示したとしても、他のサブグループからの症例の無視できない割合が関係し得る（ｓｈ－ＨＣＡについて１３．６％まで）（図４ａ）ことを判定した。悪性腫瘍の組織学的特徴の解釈は困難であり得、病理学者の専門知識に依存し、観察者に依存し得ることは注目に値する。これらの症例の半分において、本発明者らは、病理学者のための留保に気付いた。これは、「ボーダーライン」という用語によって説明され、もはやＨＣＡの特徴ではないが、同時に、明確なＨＣＣのいくつかの特徴を欠く異型病巣を提示する腫瘍として定義された（図４ａ及び図４ｂ）。臨床及びイメージングの状況に加えて、組織学におけるＨＣＣ診断の主張は、形態学的基準、例えば、細胞核異型（図４ｃ及び図４ｄ）、偽腺形成、骨梁肥厚、間質浸潤、レチクリンネットワーク崩壊／減少を含むが、免疫組織化学的基準（免疫マーカー陽性、例えば、グリピカン３（ＧＰＣ３）、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、及びＴＥＲＴプロモーター変異を含む分子特徴を含む）も含む一連の特徴に基づく。これらの基準は、完全に特異的かつ繊細なものではなく、むしろかなり主観的である。
【0076】
さらに、これらの基準は、ＨＣＡで発症したＨＣＣの症例において、それらがデノボＨＣＣ又は肝硬変肝臓における異形成結節で生じるＨＣＣにおいて主に定義されたことを考慮すると、異なる可能性がある（図４ｃ）。これが、高分化型ＨＣＣとＨＣＡとの間の差異をＨＣＡ関連悪性病巣の診断と対比して識別することが、特にいくつかの高分化型β－カテニン活性化腫瘍に関して困難であり得る理由である。ＨＵＭＰ（Hepatocellular Neoplasm of Uncertain Malignant potential）という用語は、これらを分類するために提案されている。したがって、患者管理を改善するために、悪性腫瘍のプロテオミクスシグネチャーを同定することが実際的であると思われた。
【0077】
ＨＣＡ悪性腫瘍プロファイルで発症したＨＣＣの同定
ＨＣＡにおける悪性疾患に関連するタンパク質を同定するために、本発明者らは、異なるＨＣＡサブタイプ（２ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、１ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３
Ｓ４５、１ ＵＨＣＡ、２ ｓｈ－ＨＣＡ）から、ＨＣＡで発症した明確なＨＣＣ（本発明者らはこれを「ＨＣＣ／ＨＣＡ」と呼ぶ）を示した外科的切除の６つの症例を選択し
た。上述したように、本発明者らは、６つのＨＣＡ及びそれらの対応するＨＣＣ／ＨＣＡのＴ／ＮＴ比を比較し、１０個のタンパク質からなる有意なプロテオミクスプロファイルを単離した。これらのタンパク質は、階層的クラスタリング（図５ａ）及びＰＣＡ（図５ｂ）の両方によって、悪性組織及び良性組織の完全な分離を可能にした。さらに、各群内のタンパク質発現調節解除は均一であった（データは示さず）。他の臨床病理的状況において悪性腫瘍を同定するために日常的に使用されるバイオマーカー（ＧＰＣ３、ＨＳＰ７０）は、このシグネチャーの一部ではなかったことに留意されたい。ＧＰＣ３は、ＨＣＡで発症したＨＣＣのいずれの症例においてもプロテオミクス解析によって同定されなかった。プロテオミクス解析によって同定されたＨＳＰ７０は、ＨＣＡで発症したＨＣＣのいずれの症例においても上方調節されなかった。
ＨＣＡにおける悪性疾患に関連するタンパク質を同定するために、本発明者らは、異なるＨＣＡサブタイプ（２ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、１ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３
Ｓ４５、１ ＵＨＣＡ、２ ｓｈ－ＨＣＡ）から、ＨＣＡで発症した明確なＨＣＣ（本発明者らはこれを「ＨＣＣ／ＨＣＡ」と呼ぶ）を示した外科的切除の６つの症例を選択し
た。上述したように、本発明者らは、６つのＨＣＡ及びそれらの対応するＨＣＣ／ＨＣＡのＴ／ＮＴ比を比較し、１０個のタンパク質からなる有意なプロテオミクスプロファイルを単離した。これらのタンパク質は、階層的クラスタリング（図５ａ）及びＰＣＡ（図５ｂ）の両方によって、悪性組織及び良性組織の完全な分離を可能にした。さらに、各群内のタンパク質発現調節解除は均一であった（データは示さず）。他の臨床病理的状況において悪性腫瘍を同定するために日常的に使用されるバイオマーカー（ＧＰＣ３、ＨＳＰ７０）は、このシグネチャーの一部ではなかったことに留意されたい。ＧＰＣ３は、ＨＣＡで発症したＨＣＣのいずれの症例においてもプロテオミクス解析によって同定されなかった。プロテオミクス解析によって同定されたＨＳＰ７０は、ＨＣＡで発症したＨＣＣのいずれの症例においても上方調節されなかった。
【0078】
悪性腫瘍タンパク質プロファイルの抽出された機能アノテーションの半分は、免疫応答及び免疫関連細胞活性化（ＭＰＯ、ＰＲＤＸ２、ＬＣＰ１、ＰＰＩＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＰＬＤ３）、インターロイキン－１２シグナル伝達（ＰＰＩＡ、ＬＣＰ１）、並びに好中球脱顆粒（ＰＰＩＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＰＯ）と関連していた（図５ｃ）。これらの１０個のタンパク質のうち、既知のβ－カテニン機能環境の一部であるものはなかった。
【0079】
次いで、本発明者らは、いくつかの新しい症例のセットを用いて、ＨＣＡ形質転換のこのプロテオミクスプロファイルを検証しようとした。カイ二乗スコアリング法は、１０個のタンパク質のみからなるプロファイルには適用できなかった。ユークリッド距離間の差が小さくても、それらは適用可能であると思われたので、本発明者らは、ＰＣＡによる削減後にランダムフォレストに加えて距離計算を使用した。検証のために、本発明者らは、最初に、ＨＣＡで発症したＨＣＣの１つの陽性対照及び本発明者らのデータベースからの良性ＨＣＡの７症例に対する形質転換の本発明者らの１０個のタンパク質プロテオミクスプロファイルを試験した。
【0080】
ＨＣＡで発症した調節ＨＣＣによる検証
症例１６７は、ＨＣＡで発症したＨＣＣを有するてんかん男性であり、組織学的曖昧性はなかった。ＨＣＣは、腫瘍細胞におけるいくつかの核異型及び胆汁色素、並びに不規則かつ減少したレチクリンネットワークを伴う、高分化肝細胞増殖を示した。ＩＨＣは、強くびまん性のＧＳ染色、類洞におけるびまん性のＣＤ３４染色を示し、細胞の５～１０％は、いくつかの領域においてＭＩＢ１陽性であり、ＧＰＣ３染色は病巣特異的であった。分子解析は、ＣＴＮＮＢ１遺伝子のエキソン３（ホットスポットＴ４１）における変異を同定した。この症例のプロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定及びＨＣＣ群についてのより小さいユークリッド距離（ＨＣＡについて５．１８対ＨＣＣについて５．４３）によって確認された、形質転換症例の信頼楕円により近かった（図６ｂ及び図６ｃ）。したがって、本発明者らのプロテオミクスプロファイルは、形質転換ＨＣＡのこの症例の悪性度の確認を可能にした。
症例１６７は、ＨＣＡで発症したＨＣＣを有するてんかん男性であり、組織学的曖昧性はなかった。ＨＣＣは、腫瘍細胞におけるいくつかの核異型及び胆汁色素、並びに不規則かつ減少したレチクリンネットワークを伴う、高分化肝細胞増殖を示した。ＩＨＣは、強くびまん性のＧＳ染色、類洞におけるびまん性のＣＤ３４染色を示し、細胞の５～１０％は、いくつかの領域においてＭＩＢ１陽性であり、ＧＰＣ３染色は病巣特異的であった。分子解析は、ＣＴＮＮＢ１遺伝子のエキソン３（ホットスポットＴ４１）における変異を同定した。この症例のプロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定及びＨＣＣ群についてのより小さいユークリッド距離（ＨＣＡについて５．１８対ＨＣＣについて５．４３）によって確認された、形質転換症例の信頼楕円により近かった（図６ｂ及び図６ｃ）。したがって、本発明者らのプロテオミクスプロファイルは、形質転換ＨＣＡのこの症例の悪性度の確認を可能にした。
【0081】
良性対照による検証
次に、本発明者らは、組織学的検査による良性腫瘍の診断に関して疑わしくなかったＨＣＡの７症例を選択した（図６ｂ、図６ｃ）。全てのこれらの腫瘍のプロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定によって確認されたＰＣＡ及びＨＣＡ群についての最小ユークリッド距離の両方によって、良性ＨＣＡと関連していた（図６ｂ及び図６ｃ）。プロテオミクスプロファイルは、悪性形質転換の組織学的特徴を欠くＨＣＡの全ての症例の良性の性質の確認を可能にした。
次に、本発明者らは、組織学的検査による良性腫瘍の診断に関して疑わしくなかったＨＣＡの７症例を選択した（図６ｂ、図６ｃ）。全てのこれらの腫瘍のプロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定によって確認されたＰＣＡ及びＨＣＡ群についての最小ユークリッド距離の両方によって、良性ＨＣＡと関連していた（図６ｂ及び図６ｃ）。プロテオミクスプロファイルは、悪性形質転換の組織学的特徴を欠くＨＣＡの全ての症例の良性の性質の確認を可能にした。
【0082】
悪性腫瘍の診断に関して疑いのある症例
次いで、本発明者らは、悪性腫瘍の診断に関して疑いが生じた管理歴を有する症例を選
択した。第１の症例は、生検解析時に疑われ、線維性非アルコール性脂肪性肝炎（fibrotic non-alcoholic steatohepatitis、ＮＡＳＨ）で発症した偶発的に発見されたＨＣＡに対応する。病理学者による術前生検の解釈は、ＨＣＡを高分化型グレード１ ＨＣＣから明確に区別することができなかった。外科的切除の最終的な組織学的解析は、後にｓｈ－ＨＣＡとして同定されたこのＨＣＡの良性の性質について明らかであった。臨床状況を再現するために、本発明者らは、最初に疑いが生じた術前生検のプロテオームを解析した。明らかに、プロテオミクスプロファイルは、ＨＣＡの信頼楕円により近かった。これは、ランダムフォレスト検定及びＨＣＡについての最小ユークリッド距離（ＨＣＡについて２．９９対ＨＣＣについて５．０１）によって確認された（図６ｂ及び図６ｃ）。
次いで、本発明者らは、悪性腫瘍の診断に関して疑いが生じた管理歴を有する症例を選
択した。第１の症例は、生検解析時に疑われ、線維性非アルコール性脂肪性肝炎（fibrotic non-alcoholic steatohepatitis、ＮＡＳＨ）で発症した偶発的に発見されたＨＣＡに対応する。病理学者による術前生検の解釈は、ＨＣＡを高分化型グレード１ ＨＣＣから明確に区別することができなかった。外科的切除の最終的な組織学的解析は、後にｓｈ－ＨＣＡとして同定されたこのＨＣＡの良性の性質について明らかであった。臨床状況を再現するために、本発明者らは、最初に疑いが生じた術前生検のプロテオームを解析した。明らかに、プロテオミクスプロファイルは、ＨＣＡの信頼楕円により近かった。これは、ランダムフォレスト検定及びＨＣＡについての最小ユークリッド距離（ＨＣＡについて２．９９対ＨＣＣについて５．０１）によって確認された（図６ｂ及び図６ｃ）。
【0083】
次に、本発明者らは、増殖中の未分類のＨＣＡにおける画像化によって腫瘍内出血を示した「ボーダーライン」症例を選択した。２０１６年には、組織学における知識の状態は、この高度に血管化されたＨＣＡの分類を可能にせず、脂肪性ＨＣＡについても炎症性ＨＣＡについても可能にしなかった。腫瘍内血腫の存在は解釈を困難にし、細胞学的異型性及び異常な類洞（ＣＤ３４陽性及び減少したレチクリン染色）の存在に起因して、ＨＣＡとＨＣＣとを区別することは困難であった。ＩＨＣは、既知のサブタイプを示さなかった（Ｌ－ＦＡＢＰ（通常、ｓｈ－ＨＣＡの場合である）の減少であるが、喪失ではなく、ＧＳ陰性、及び弱いＣＲＰ陽性）。分子生物学解析は、事後診断がｓｈ－ＨＣＡであることを見出した。プロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定によって確認されるように、ＨＣＣ群と非常に明確に関連していた。しかしながら、ユークリッド距離計算は、２群間の決定を可能にしなかった（ＨＣＡについて４．５５対ＨＣＣについて４．６５）。この特異的症例について、プロテオミクスは、ＨＣＡとＨＣＣとの間の進行性スケールでのこの腫瘍の位置付けを可能にするさらなる定量的特徴を提供した（図６ａ、図６ｂ及び図６ｃ）。
【0084】
最後の症例（図６ｂ及び図６ｃ）は、良性の１０ｃｍ肝腫瘍について最初に遠隔管理された女性であった。切除標本の組織学的解析は、病理学者にとって難題であり、すなわち、びまん性の細胞学的異型性及び異常なレチクリンネットワークと組み合わされた、全ての日常的に使用されるＩＨＣマーカーの陰性を有するＨＣＡが分類不可能であった。したがって、これは、推定ＨＣＣの診断をもたらしたが、ＨＣＣに有利なＩＨＣマーカー（ＧＰＣ３陰性及びＭＩＢ１陰性）及び陰性分子解析（ＴＥＲＴ陰性）はなかった。プロテオミクスプロファイルは、明らかに、ＨＣＡ群で発症したＨＣＣを有するこの症例の分類を可能にした（ＨＣＡについて４．２７対ＨＣＣについて４．９９）。
【0085】
この検証患者セットに関するこれらの結果を考慮すると、プロテオミクス悪性プロファイルは、形質転換のプロセスに関与するＨＣＡの判定に有効であった。
【0086】
この研究において、本発明者らは、ＨＣＡサブタイプ及び悪性形質転換のそのレベルを反映するスコアを判定することができるＨＣＡ診断のための完全なツールを提供する。
【0087】
結論
プロテオミクス解析は、患者管理を改善するためのゲノミクス及びトランスクリプトミクスに続く次の「オミクス」ステップである。現在まで、ＦＦＰＥ組織のプロテオミクスプロファイリングは、臨床診療において、特に腫瘍病理分野において使用されたことがなかった。
プロテオミクス解析は、患者管理を改善するためのゲノミクス及びトランスクリプトミクスに続く次の「オミクス」ステップである。現在まで、ＦＦＰＥ組織のプロテオミクスプロファイリングは、臨床診療において、特に腫瘍病理分野において使用されたことがなかった。
【0088】
本発明者らは、ＦＦＰＥ組織からの診断のためにプロテオミクスパターンマッチングを使用して先駆的研究を行った。本発明者らのツールの主な原理は、生検又は外科標本から抽出されたプロテオミクスプロファイルと、完全に特徴付けられた患者からのプロテオミクスプロファイルから構成される参照データベースとの比較に基づく。本発明者らは、動
作日常解析のための解析プロセスを開発し、適合させた。本発明者らは、３×５μｍの切片切断で１ｍｍ２に相当する少量の組織を使用し、したがって試料を枯渇させず、それを再使用することができる。完全な解析は、１週間以内に達成することができるので、臨床診療によって課される期限に適合したままである。さらに、生成されたプロテオミクスデータは、さらなる適用（予後、セラノスティクス）のために再利用され得るリソースのままである。
作日常解析のための解析プロセスを開発し、適合させた。本発明者らは、３×５μｍの切片切断で１ｍｍ２に相当する少量の組織を使用し、したがって試料を枯渇させず、それを再使用することができる。完全な解析は、１週間以内に達成することができるので、臨床診療によって課される期限に適合したままである。さらに、生成されたプロテオミクスデータは、さらなる適用（予後、セラノスティクス）のために再利用され得るリソースのままである。
【0089】
タンパク質調節解除のプロファイル（腫瘍対非腫瘍）に作用する主な利点は、個人間の変動を減少させることによって腫瘍同一性に直接アクセスする能力であり、患者のコレクションが少ないにもかかわらず解析を効率的にする。これはまた、機能的生物学的パスウェイとのプロファイルの関連付け、生物学的関連性の制御、及び新しい標的の同定を可能にする。スペクトル強度プロファイルに対するタンパク質発現調節解除のプロファイルに作用するさらなる利点は、参照データベースの構築が質量分析計のタイプに依存しないことである。実際に、本発明の方法は、画像取得に使用されるデバイス間の異質性に関する主要な障害に直面するラジオミクスとは対照的に、異なる機器を有する現場で実施することができる。
【0090】
ＨＣＡの分子分類は、過去１０年間にわたって多くの更新を受けてきており、現在ではほぼ確立されたと考えられているＮａｕｌｔ Ｊ－Ｃ，ｅｔ ａｌ（［１２］）。分子分類の強化はＨＣＡ生理病理学のより良い理解をもたらしたが、それは患者の管理を変更していないことに留意しなければならない。本発明者らは、２つの主要な問題、すなわち、（１）生検に基づく分類、及び（２）悪性腫瘍状態の同定、を認識した。実際、いくつかの理由から、古典的なアプローチを用いた生検の診断は明白ではない。さらに、潜在的に全てのＨＣＡが形質転換し得るという事実は、特に良性肝臓腫瘍が専門でない病理学者にとって、診断時に疑いを引き起こし得る。ＨＣＣの疑いは、医学的及び外科的処置並びに追跡調査を劇的に変化させる。実際、外科的戦略は同じようには考えられておらず、ＨＣＡを扱う場合、腫瘍の単純な摘出で十分である。これに反して、ＨＣＣの外科的管理は、せいぜい、解剖学的切除（対応する門脈枝を除去すること）からなり、これが可能でない場合、外科医は、２ｃｍの最適マージンを有するように努力しなければならない。
【0091】
これら全ての理由から、本発明者らは、最初に、ＨＣＡサブタイププロテオミクス分類のためのＨＣＡデータベースを生成した。第二に、本発明者らは、ＨＣＡサブタイプにかかわらず悪性形質転換を直接診断するタンパク質プロファイルを同定した。このプロファイルは、細胞変性に応答した免疫活性化と相関しており、活性な抗腫瘍免疫を有する腫瘍形質転換又は分化した腫瘍にとって意味がある。β－カテニンパスウェイは、全てのＨＣＡサブタイプにわたって同定されたことを考慮すると、本発明者らの悪性腫瘍シグネチャーに現れなかった可能性が高い。この検証されたシグネチャーにより、本発明者らは、ＨＣＡ形質転換状態を定義することができる。機械学習は、臨床データ解釈のための新たな有望な専門分野である。本発明者らの研究において、本発明者らは、類似性の計算のために異なる統計解析を試験した（差異スコア計算：単純化されたデータに対するカイ二乗検定、ＰＣＡ後のユークリッド距離計算、ＰＣＡによって削減されたデータに対するランダムフォレスト）。先入観なしに、本発明者らは、本発明者らが参照群に関して試験したプロテオミクスプロファイルの類似性に関する証拠を提供するために、解析のいくつかを使用したいと考えた。ランダムフォレストが最も信頼できることが証明されたが、これらの方法は全て成功した。これを解釈するために、３つの数学的アプローチが同じ結論を導く場合、それはロバスト性の証拠である。一方、それらが非定型症例に関して矛盾する場合、より慎重である必要があり、解析を診断における追加の特徴として考慮する必要がある。本発明者らのＨＣＡデータベースへの進行中の症例追加は、診断をますます正確にする。
【0092】
その後、本発明者らの方法論は、一般的な臨床状況において鑑別診断が紛らわしい可能性がある高分化型ＨＣＣなどの肝臓分野における他の重要な臨床上の疑問に答えるために実施することができる。これは、本発明者らが同定した悪性腫瘍シグネチャーが、ＨＣＡに厳密に関連しているか、又は他のより頻繁な病因及びバックグラウンドに共通であるかを定義し得る。
【0093】
より広い観点から、肝腫瘍及び腫瘍周囲組織に肝生検を実施するための臨床勧告は系統的ではなく、リスク評価よりも論理的利益に従わなければならない。実際、この侵襲的処置は取るに足らないものではなく、出血及び腫瘍細胞拡散などの合併症、ときには重篤な合併症を引き起こす可能性がある。生検性能の価値もまた、画像化の進歩を考慮して議論されている。実際に、放射線専門医は、排除によってさえ、ますます正確な診断を行うことができる。これは既に、管理、特に切除の決定に役立つ。これらの理由から、肝疾患を有する患者に対する生検の役割は、肝臓病専門医の間で最も重要な考慮事項の１つである。それにもかかわらず、プロテオミクスプロファイルによって提供される情報は、肝生検を行うことのベネフィット－リスク比を逆転させ、臨床診療において真の差異を作り、個別化医療への道を開くことができる。例えば、悪性腫瘍は、移植に対する患者の適格性を条件付けるため、悪性腫瘍診断は、実際に、肝硬変の肝臓に見出される異形成性肝臓結節に非常に有用であり得る。将来、プロテオミクスプロファイルを使用して、例えば、治療手段が最近拡大された進行性ＨＣＣを有する患者において、抗がん治療に対する応答又は非応答の要素を同定することもできる。肝臓以外では、プロテオミクスプロファイリングは、腫瘍学分野、すなわち肺がん、低悪性度神経膠腫、利用可能な生検材料が非常に少なく、ＩＨＣの解釈が困難である乳がんにおけるセンチネルリンパ節における生検の性能を改善することができる。
【0094】
結論として、本発明者らは、プロテオミクスプロファイリングが患者管理プロセスにおいてより重要な状態を生検に与え得ることを示す。本発明者らは、ＨＣＡの診断及びサブタイピング並びにその悪性形質転換の評価を用いて概念実証を示し、これは日常的な臨床ケアへの移行に利用可能である。これは、プロテオミクス解析を診療現場に統合し、エビデンスベースのケアバンドルの一部としてプロテオミクス結果を患者の病理報告に追加することを意味する。プロテオミクス解析は、病理学サービスを新しい解析時代にもたらすであろう。
【0095】
実施例２：生検プロテオームプロファイリングを使用した進行性ＨＣＣにおけるセラノスティックアプローチ：概念実証としてのソラフェニブ
肝臓がんは主要な健康問題であり、世界中で２番目に多いがん死亡の原因であり、毎年８５０，０００件を超える新たな症例がある。西洋諸国では、過去２０年にわたって症例数が増加している。原発性肝臓がんの中で、肝細胞がん（ＨＣＣ）が最も一般的であり（Ｆｅｒｌａｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．「Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｓｏｕｒｃｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ＧＬＯＢＯＣＡＮ」．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１３６：Ｅ３５９－３８６（２０１２）（［７］））、これは通常肝硬変に発症し、例外的に健康な肝臓に発症する。肝硬変監視プログラムは、治癒的処置（外科的切除、経皮的破壊、肝臓移植）が利用可能である多数の初期段階ＨＣＣを検出することができるが、がんの５０～７０％は後期に診断される。その極めて不良な予後で知られている、進行性ＨＣＣは、局所的（動脈化学塞栓術）又は全身的緩和療法でのみ治療することができる。
肝臓がんは主要な健康問題であり、世界中で２番目に多いがん死亡の原因であり、毎年８５０，０００件を超える新たな症例がある。西洋諸国では、過去２０年にわたって症例数が増加している。原発性肝臓がんの中で、肝細胞がん（ＨＣＣ）が最も一般的であり（Ｆｅｒｌａｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．「Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｓｏｕｒｃｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ＧＬＯＢＯＣＡＮ」．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１３６：Ｅ３５９－３８６（２０１２）（［７］））、これは通常肝硬変に発症し、例外的に健康な肝臓に発症する。肝硬変監視プログラムは、治癒的処置（外科的切除、経皮的破壊、肝臓移植）が利用可能である多数の初期段階ＨＣＣを検出することができるが、がんの５０～７０％は後期に診断される。その極めて不良な予後で知られている、進行性ＨＣＣは、局所的（動脈化学塞栓術）又は全身的緩和療法でのみ治療することができる。
【0096】
ＨＣＣの診断及び管理における肝生検の役割は、常に長い間疑問視されてきた。腫瘍播種及び出血などの合併症のリスク、並びに画像化による実行可能な非侵襲的診断の利用可能性は、これまで、ＨＣＣの管理における肝生検の使用を制限してきた。しかしながら、現在では、これらのリスクは稀であり、管理可能であり、疾患の経過に影響せず、したが
って、生検を避ける理由として考慮されるべきではないことが広く受け入れられている。一方、不十分なサンプリングのリスクも多くの研究によって強調されている。これはおそらく、正確な技術の欠如によるものであり、また、ＤＮＡ及びＲＮＡ解析が、日常的な臨床使用における材料に対応する固定された生検材料よりも凍結試料においてより効率的であるためである。しかしながら、これらの腫瘍試料は、固定された生検が現在のリスク／ベネフィット比を逆転させ得る有益な情報を含むので、明らかに過小評価されており、十分に使用されない（Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．「Ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｙ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｗｏｒｌｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２５：６０４１－６０５２（２０１９）（［８］）。
って、生検を避ける理由として考慮されるべきではないことが広く受け入れられている。一方、不十分なサンプリングのリスクも多くの研究によって強調されている。これはおそらく、正確な技術の欠如によるものであり、また、ＤＮＡ及びＲＮＡ解析が、日常的な臨床使用における材料に対応する固定された生検材料よりも凍結試料においてより効率的であるためである。しかしながら、これらの腫瘍試料は、固定された生検が現在のリスク／ベネフィット比を逆転させ得る有益な情報を含むので、明らかに過小評価されており、十分に使用されない（Ｄｉ Ｔｏｍｍａｓｏ Ｌ，ｅｔ ａｌ．「Ｒｏｌｅ ｏｆ ｌｉｖｅｒ ｂｉｏｐｓｙ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｗｏｒｌｄ．Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２５：６０４１－６０５２（２０１９）（［８］）。
【0097】
ほとんどの国において、ソラフェニブは、非常に少数の応答者及び有意な副作用にもかかわらず、その実証された生存利益のために、進行性ＨＣＣのための標準的な第一選択療法として承認されている（Ｈｏｌｌｅｂｅｃｑｕｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．「Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｆｒｏｍ ｄｉｓｉｌｌｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ｎｅｗ ｈｏｒｉｚｏｎｓ」．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．５１：３２７－３３９（２０１５）（［９］）。進行性ＨＣＣにおけるソラフェニブの承認以来、いくつかの第ＩＩＩ相臨床試験は、優れた生存利益を実証することができなかった（Ｈｏｌｌｅｂｅｃｑｕｅ，ｅｔ ａｌ．（［９］））。さらに、第ＩＩＩ相試験は、全生存期間においてソラフェニブと比較してレンバチニブの非劣性を示し、同等の安全及び忍容性プロファイルにより、第一選択治療における今日のその使用が正当化されている（Ｋｕｄｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．「Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ ｖｅｒｓｕｓ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｕｎｒｅｓｅｃｔａｂｌｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｐｈａｓｅ ３ ｎｏｎ－ｉｎｆｅｒｉｏｒｉｔｙ ｔｒｉａｌ」．Ｌａｎｃｅｔ．３９１：１１６３－１１７３（２０１８）（［１０］）。臨床勧告によれば、ソラフェニブ又はレンバチニブが無効であるか、又は忍容性がなかった患者は、最近出現した第２選択肢（カボザンチニブ、ラムシルマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブを含む）から利益を得ることができる。有効性が証明されたこれらの新薬の市場への到達は、ＨＣＣ緩和ケアにおける真の革命であった。
【0098】
加えて、免疫療法処置（ニボルマブ、ペンブロリズマブ）の初期の有望な結果の後、アンゾリズマブ（抗プログラム死リガンド１（ＰＤＬ１））及びベバシズマブ（抗血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ））の組み合わせは、最近、標準治療（ソラフェニブ）と比較して第一選択において劇的な利益を示しており、近い将来、第一選択における新しい標準となるであろう。この強化された治療手段は、進行性ＨＣＣを有する患者において全生存期間中央値を６ヶ月から２６ヶ月超まで増加させ、肝機能を保存することを既に可能にしており、かなりの進歩である。しかしながら、第一選択の治療及び／又は治療順序の選択に対応する治療戦略は明確ではない。
【0099】
ソラフェニブは、腫瘍細胞（細胞増殖阻害）及び内皮細胞（血管新生阻害）の両方を直接標的とする多標的キナーゼ阻害剤（Ｒａｆキナーゼ、ＶＥＧＦ－Ｒ１及びＲ３、ｃ－ｋｉｔ及びＲＥＴ）である（Ｆｅｒｌａｙ，ｅｔ ａｌ．（［７］））。１０年よりも多くの年月にわたって、ＨＣＣにおけるソラフェニブに対する応答の遺伝子プロファイル、臨床パラメータ、予後又は予測血液又は組織バイオマーカーを同定するための研究が増えてきた（Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ，ｅｔ ａｌ．
［（１３］））（Ｍａｒｉｓｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．「Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａｒｅ ｔｈｅｒｅ ａｎｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｄ／ｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍ
ａｒｋｅｒｓ？」．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２４：４１５２－４１６３（２０１８）（［１５］）、Ｐｉｎｙｏｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ＨＣＣ ｗｉｔｈ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ３ ＳＴＯＲＭ ｔｒｉａｌ」．Ｇｕｔ．６８：１０６５－１０７５（２０１９）（［１６］））。いくつかの結果は有望であった（より長い遅延進行時間に関連するより高い治療前リン酸化ＥＲＫレベル（Ａｂｏｕ－Ａｌｆａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．「Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：４２９３－４３００（２００６）（［１７］））、治療有効性を予測するｃ－Ｍｅｔの高発現（Ｃｈｕ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＶＥＧＦＲ－２，ＰＤＧＦＲ－β，ａｎｄ ｃ－Ｍｅｔ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２：１６（２０１３）（［１８］））、治療に応答しない患者におけるｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｊｕｎのより高い発現（Ｈａｇｉｗａｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＮＫ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＣＤ１３３ ｐｒｅｄｉｃｔ ａ ｐｏｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０６：１９９７－２００３（２０１２）（［１９］））。しかしながら、今日まで検証されたものはない。
［（１３］））（Ｍａｒｉｓｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．「Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａｒｅ ｔｈｅｒｅ ａｎｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｄ／ｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍ
ａｒｋｅｒｓ？」．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２４：４１５２－４１６３（２０１８）（［１５］）、Ｐｉｎｙｏｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ＨＣＣ ｗｉｔｈ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ３ ＳＴＯＲＭ ｔｒｉａｌ」．Ｇｕｔ．６８：１０６５－１０７５（２０１９）（［１６］））。いくつかの結果は有望であった（より長い遅延進行時間に関連するより高い治療前リン酸化ＥＲＫレベル（Ａｂｏｕ－Ａｌｆａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．「Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２４：４２９３－４３００（２００６）（［１７］））、治療有効性を予測するｃ－Ｍｅｔの高発現（Ｃｈｕ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＶＥＧＦＲ－２，ＰＤＧＦＲ－β，ａｎｄ ｃ－Ｍｅｔ ｉｎ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２：１６（２０１３）（［１８］））、治療に応答しない患者におけるｐｈｏｓｐｈｏ－ｃ－Ｊｕｎのより高い発現（Ｈａｇｉｗａｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＮＫ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＣＤ１３３ ｐｒｅｄｉｃｔ ａ ｐｏｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０６：１９９７－２００３（２０１２）（［１９］））。しかしながら、今日まで検証されたものはない。
【0100】
本発明者らは以前に、レーザー捕捉と質量分析とを組み合わせて、腫瘍プロテオミクスプロファイルを徹底的に解析した（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］）、Ｖｉａｌ Ｇ，ｅｔ ａｌ．「Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｍｉｍｉｃｒｙ ｉｎ Ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ」．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５２３（２０１９）（［２０］））。ホルマリン固定及びパラフィン包埋組織（formalin-fixed and paraffin-embedded tissues、ＦＦＰＥＴ）の解析並びに診断生検などの非常に少量の材料と適合するこの技術的プロセスにより、出血リスクに関連するソニックヘッジホッグ肝細胞腺腫の診断に現在使用されているバイオマーカーを同定することが既に可能になっている（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］）、Ｎａｕｌｔ Ｊ－Ｃ，ｅｔ ａｌ．（［１２］）、Ｓａｌａ Ｍ，ｅｔ ａｌ．，（［１］））。
【0101】
この研究では、診断生検を用いて、このインサイチュウプロテオミクス戦略を適用して、セラノスティック戦略を開発した。目的は、ソラフェニブ治療前の固定生検におけるＨＣＣプロテオミクスプロファイリングの解析、並びにソラフェニブに対する良好な応答者及び不良な応答者の腫瘍と隣接組織との間のタンパク質発現調節解除の比較を使用して、治療に対する進行性ＨＣＣの応答を予測するマーカーを同定することであった。ソラフェニブを用いて実施されたこのプロセス及び概念実証は、他のＨＣＣ治療に適用可能であり、他の病理にも転用可能である。
【0102】
材料及び方法
患者
この研究を実施するために必要とされる生物学的資源へのアクセスは、Ｍａｇｅｌｌａｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）の存在によって保証され、ＢｏｒｄｅａｕｘのＣｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓと提携した（２０１７／０６／０９にＣＲＢに対してなされた要求番号１６０、割り当て番号６７６）。
患者
この研究を実施するために必要とされる生物学的資源へのアクセスは、Ｍａｇｅｌｌａｎ Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ（Ｐｅｓｓａｃ，Ｆｒａｎｃｅ）の存在によって保証され、ＢｏｒｄｅａｕｘのＣｅｎｔｒｅ ｄｅ Ｒｅｓｓｏｕｒｃｅｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｑｕｅｓと提携した（２０１７／０６／０９にＣＲＢに対してなされた要求番号１６０、割り当て番号６７６）。
【0103】
ソラフェニブで処置された進行性ＨＣＣを有する患者を選択し、処置に対するそれらの応答に従って２つの群に分けた（以下の表１を参照されたい）。
【0104】
【表1】
【0105】
応答は、放射線応答基準及び／又は処置開始後の最初の２ヶ月で評価されたアルファ－フェトプロテイン（alpha-fetoprotein、ＡＦＰ）レベルに基づいた。良好な応答は、＞
３０％の放射線学的腫瘍退縮及び／又は＞５０％のＡＦＰの減少に対応した。＞２０％の放射線学的腫瘍進行は、不十分な応答に対応した。
３０％の放射線学的腫瘍退縮及び／又は＞５０％のＡＦＰの減少に対応した。＞２０％の放射線学的腫瘍進行は、不十分な応答に対応した。
【0106】
各患者は、処置の開始前に、質量分析によるその後のプロテオミクス解析のために十分な腫瘍及び非腫瘍組織（＞１ｍｍ２）を含む生検を有していなければならない。
【0107】
レーザー捕捉
各患者からのスライドを再解析し、ヘマトキシリンエオシンサフラン染色を組織病理的検査に使用して、解剖されるべき関心領域を決定した。次いで、同じ表面積及び均質な構成（線維症の不在）の腫瘍性（Ｔ）及び非腫瘍性（ＮＴ）肝臓を、解剖病理学者の監督下で選択した（ＢＬＢ；ＰＢＳ）。
各患者からのスライドを再解析し、ヘマトキシリンエオシンサフラン染色を組織病理的検査に使用して、解剖されるべき関心領域を決定した。次いで、同じ表面積及び均質な構成（線維症の不在）の腫瘍性（Ｔ）及び非腫瘍性（ＮＴ）肝臓を、解剖病理学者の監督下で選択した（ＢＬＢ；ＰＢＳ）。
【0108】
Ｈ＆Ｅ染色スライド上で予め選択された１平方ミリメートルの腫瘍組織及び非腫瘍組織を、ＰＡＬＭタイプ４（Ｚｅｉｓｓ）レーザー顕微解剖器を用いてＦＦＰＥ ５μｍ厚切片から顕微解剖した。同領域を連続切片に切断し、同じ方法で処置して３つの技術的複製を形成した。
【0109】
プロテオミクス解析のための試料調製
固定復帰及び組織切片からのタンパク質抽出、ゲルタンパク質消化、ゲルからのペプチド抽出及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析のためのペプチド試料調製を、上述したように行った（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。
固定復帰及び組織切片からのタンパク質抽出、ゲルタンパク質消化、ゲルからのペプチド抽出及びＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析のためのペプチド試料調製を、上述したように行った（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。
【0110】
質量分析
オンラインナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を、ナノスプレーＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器又はナノスプレーＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に連結されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ Ｎａｎｏ－ＵＰＨＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して、上述したように実施した（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。
オンラインナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ解析を、ナノスプレーＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅハイブリッド四重極－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析器又はナノスプレーＯｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ（商標）Ｌｕｍｏｓ（商標）Ｔｒｉｂｒｉｄ（商標）質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）に連結されたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ＲＳＬＣ Ｎａｎｏ－ＵＰＨＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を使用して、上述したように実施した（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。
【0111】
データベース検索、ＭＳ結果処理及び定量化
タンパク質同定のために、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で利用可能なＭａｓｃｏｔ ２．５アルゴリズムを使用した。ＵｎｉＰｒｏｔ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓデータベース（７１ ５２５エントリ、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ
Ｓｅｔ、リリース２０１７＿１２）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂｓｉｔｅに対して検索することにより、バッチモードで使用した。２つの欠落した酵素切断が許容された。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳにおける質量許容差を１０ｐｐｍ及び０．０２Ｄａに設定した。メチオニンの酸化、リシンのアセチル化並びにアスパラギン及びグルタミンの脱アミド化を、動的修飾について検索した。システイン上のカルバミドメチル化を静的修飾として検索した。生のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータをＰｒｏｌｉｎｅ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｏｕｙｓｓｉｅ Ｄ，ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｌｉｎｅ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．３６，３１４８－３１５５（２０２０）（［１１］））に、特徴検出、位置合わせ、及び定量化のためにインポートした。タンパク質同定は、少なくとも２つの特異的ペプチドについてのみ受け入れられ、かなりのランク＝１であり、Ｍａｓｃｏｔ １における「デコイ」オプションを用いて計算されたタンパク質ＦＤＲ値は１．０％未満であった。抽出イオンクロマトグラム（extracted ion chromatograms、ＸＩＣ）によるＭＳ１レベルの無標識定量化を、上述したパラメータ（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））を用いて行った。タンパク質存在量を、Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｓｔｕｄｉｏの「中央値比」オプションを使用して正規化した。
タンパク質同定のために、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ １．４ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）で利用可能なＭａｓｃｏｔ ２．５アルゴリズムを使用した。ＵｎｉＰｒｏｔ Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓデータベース（７１ ５２５エントリ、Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ
Ｓｅｔ、リリース２０１７＿１２）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｗｅｂｓｉｔｅに対して検索することにより、バッチモードで使用した。２つの欠落した酵素切断が許容された。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳにおける質量許容差を１０ｐｐｍ及び０．０２Ｄａに設定した。メチオニンの酸化、リシンのアセチル化並びにアスパラギン及びグルタミンの脱アミド化を、動的修飾について検索した。システイン上のカルバミドメチル化を静的修飾として検索した。生のＬＣ－ＭＳ／ＭＳデータをＰｒｏｌｉｎｅ Ｓｔｕｄｉｏ（Ｂｏｕｙｓｓｉｅ Ｄ，ｅｔ ａｌ．「Ｐｒｏｌｉｎｅ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ」．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．３６，３１４８－３１５５（２０２０）（［１１］））に、特徴検出、位置合わせ、及び定量化のためにインポートした。タンパク質同定は、少なくとも２つの特異的ペプチドについてのみ受け入れられ、かなりのランク＝１であり、Ｍａｓｃｏｔ １における「デコイ」オプションを用いて計算されたタンパク質ＦＤＲ値は１．０％未満であった。抽出イオンクロマトグラム（extracted ion chromatograms、ＸＩＣ）によるＭＳ１レベルの無標識定量化を、上述したパラメータ（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））を用いて行った。タンパク質存在量を、Ｐｒｏｌｉｎｅ Ｓｔｕｄｉｏの「中央値比」オプションを使用して正規化した。
【0112】
バイオインフォマティック解析
各患者についての腫瘍試料と非腫瘍試料との間のタンパク質差次的発現を、腫瘍／非腫瘍試料の各対についての正規化タンパク質存在量の中央値の対数比を計算することによって解析した。
各患者についての腫瘍試料と非腫瘍試料との間のタンパク質差次的発現を、腫瘍／非腫瘍試料の各対についての正規化タンパク質存在量の中央値の対数比を計算することによって解析した。
【0113】
ソラフェニブに対する良好な応答者（good responder、ＧＲ）と不良な応答者（bad responder、ＢＲ）とを区別する潜在的なバイオマーカーを明らかにするために、ｔ検定（等集団分散を仮定しないウェルチのｔ検定）を適用した。調整された確率値（ｐ値）の有意性についての閾値を０．００５に設定し、７７個のタンパク質によって構成される予測シグネチャーをもたらした。
【0114】
この関連するデータセットを使用して、主成分解析（ＰＣＡ）を、Ｒにおいて利用可能なＦａｃｔｏＭｉｎｅＲ及びＦａｃｔｏｅｘｔｒａを使用して実施した。階層的クラスタリングもまた、Ｒパッケージｐｖｃｌｕｓｔにおいて利用可能なマルチスケールブートストラップアルゴリズム、並びにユークリッド距離及び二乗非類似度を用いるウォード最小分散クラスタリング法に設定されたパラメータを使用して実施した。ｐｖｃｌｕｓｔは、ブートストラップ再サンプリング技術を使用して各クラスタについてのｐ値を計算する。それは、クラスタ信頼度が解釈されることを可能にする２つのタイプのｐ値、すなわち近似的に不偏なｐ値についての「ＡＵ」及びブートストラップ確率についての「ＢＰ」を提供する。ＡＵは、マルチスケールブートストラップリサンプリングを使用して計算され、ＢＰは、通常のブートストラップリサンプリングを使用して生成される。
【0115】
ＧＲとＢＲとの間で有意に調節解除されたパスウェイを見出すために、７７個のタンパク質シグネチャーに関する遺伝子セットエンリッチメント解析を、遺伝子オントロジー（Gene Ontology、ＧＯ）生物学的プロセスデータベースに対して実施し、文字列（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｔｒｉｎｇ－ｄｂ．ｏｒｇ）及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓ（Ｑｉａｇｅｎ）データベースに列挙された機能的相互作用を解析した。
【0116】
結果
患者における臨床病理的特徴及び解析戦略
ソラフェニブに対する良好な応答者の割合が非常に低く（ＳＨＡＲＰ試験において２％の客観的応答）、全ての患者が処置前に生検されるわけではないという事実を考慮すると、この研究の最初の課題は、腫瘍及び非腫瘍肝臓組織を処置前に比較することができる十分な応答者を収集することであった。５人の良好な応答者（Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから３症例、Ｂａｙｏｎｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから１症例、及びＰａｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから１症例）を収集し、９人の不良な応答者（Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから）と比較した。ソラフェニブ治療の開始日は、２０１２年８月から２０１７年１２月であった。解析は、ソラフェニブ処置を開始する前に採取したＦＦＰＥＴ肝生検に対して行った。変動性を制限するように設計された３つの技術的反復に加えて、個体間変動性に起因するバックグラウンドノイズを平滑化し、したがってより多くの統計的検出力を得るために、腫瘍対非腫瘍タンパク質発現比を各患者について解析した。この方法論により、小さなコホートであってもロバストなデータを得ることができた（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。選択された患者の臨床的特徴を上の表１に詳述する。解析戦略は、この避けられない変動性による偏りを制限するように設計されている（表１）。
患者における臨床病理的特徴及び解析戦略
ソラフェニブに対する良好な応答者の割合が非常に低く（ＳＨＡＲＰ試験において２％の客観的応答）、全ての患者が処置前に生検されるわけではないという事実を考慮すると、この研究の最初の課題は、腫瘍及び非腫瘍肝臓組織を処置前に比較することができる十分な応答者を収集することであった。５人の良好な応答者（Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから３症例、Ｂａｙｏｎｎｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから１症例、及びＰａｕ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから１症例）を収集し、９人の不良な応答者（Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌから）と比較した。ソラフェニブ治療の開始日は、２０１２年８月から２０１７年１２月であった。解析は、ソラフェニブ処置を開始する前に採取したＦＦＰＥＴ肝生検に対して行った。変動性を制限するように設計された３つの技術的反復に加えて、個体間変動性に起因するバックグラウンドノイズを平滑化し、したがってより多くの統計的検出力を得るために、腫瘍対非腫瘍タンパク質発現比を各患者について解析した。この方法論により、小さなコホートであってもロバストなデータを得ることができた（Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．（［４］））。選択された患者の臨床的特徴を上の表１に詳述する。解析戦略は、この避けられない変動性による偏りを制限するように設計されている（表１）。
【0117】
腫瘍プロテオームは、良好な患者と不良な応答者とを鑑別する
【0118】
症例当たり平均９８２±３２９個のタンパク質を同定し、同定された合計２７９０個のタンパク質（２個を超える特異的ペプチドを有する）について定量化した。良好な応答者について、平均して、同定されたタンパク質の１２．９％が上方調節され（Ｔ／ＮＴ比＞２）、１９．７％が下方調節された（Ｔ／ＮＴ比＜０．５）。不良な応答者については、同定されたタンパク質の１８．９％が上方調節され、２４．３％が下方調節された（以下の表２参照）。
【0119】
【表2】
【0120】
良好な応答者と不良な応答者を鑑別するプロテオミクスシグネチャーを同定するために、２つの群のＴ／ＮＴ比を比較する調整されたウィルコクソンｔ検定を適用した。調整されたｐ値の有意性についての閾値を０．００５に設定し、７７個のタンパク質シグネチャーをもたらした（以下の表３を参照）。
【0121】
【表3-1】
【0122】
【表3-2】
【0123】
【表3-3】
【0124】
２群の患者は、差次的タンパク質発現プロファイルの半教師あり階層解析及び主成分解析の両方において、十分に分離されているようであった。（図８ａ、図８ｂ及び図８ｃ）タンパク質の４分の３が、ｓｔｒｉｎｇタンパク質及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓデータベース（図８ｄ及び図９）に従って、機能的に結合した。
【0125】
このセラノスティックシグネチャーに関連する生物学的パスウェイを、ＧＯデータベース（分子機能）に対する、及びＩｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙｓデータベース（カノニカルパスウェイ）に対する遺伝子セットエンリッチメント解析によって調査した（図１０ａ）。これらの２つの統計解析は相補的であり、以下のパスウェイのエンリッチメン
トを明らかにした：（１）ＥＩＦ２パスウェイ（ＥＩＦ２のリン酸化がＵＰＲにおいて必要とされる）、タンパク質ユビキチン化パスウェイ及びＢＡＧ２シグナル伝達パスウェイを含むストレス応答を含む小胞体ストレス応答（Unfolded Protein Response、ＵＰＲ）
、（２）急性期シグナル伝達、（３）酸化ストレス及び（４）細胞接着（図８ｃ）。
トを明らかにした：（１）ＥＩＦ２パスウェイ（ＥＩＦ２のリン酸化がＵＰＲにおいて必要とされる）、タンパク質ユビキチン化パスウェイ及びＢＡＧ２シグナル伝達パスウェイを含むストレス応答を含む小胞体ストレス応答（Unfolded Protein Response、ＵＰＲ）
、（２）急性期シグナル伝達、（３）酸化ストレス及び（４）細胞接着（図８ｃ）。
【0126】
ＵＰＲ関連パスウェイのより高い発現が、不良な応答者並びに酸化ストレスに関連するタンパク質において観察された一方で、良好な応答者は、急性炎症応答期に関連するタンパク質を発現する可能性がより高かった（図１０ｂ）。
【0127】
結論
多くの研究にもかかわらず、進行性ＨＣＣにおけるソラフェニブに対する応答についての予測マーカーの欠如は、依然として大きな課題のままである。これらの予測マーカーは、特に新しい治療の利用可能性に起因して、患者が治療される方法を変化させる可能性がある（Ｍａｒｉｓｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（［１５］）、Ｐｉｎｙｏｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（［１６］））。これまで、３つの異なる治療選択肢が、進行性ＨＣＣの第一選択において利用可能であり、それは、ソラフェニブ、レンバチニブ、及びより最近ではアテゾリズマブ／ベバシズマブの組み合わせである。患者がこれらの治療に対して異なって応答することは明らかである。考慮すべき他の点は、この薬物の有害作用及び公衆衛生のためのそれらの著しい費用である。その結果、各患者に最適な治療を決定するためには、精密医療に到達することが必要である。このセラノスティック戦略に必要な全ての情報は、固定診断生検において利用可能である。
多くの研究にもかかわらず、進行性ＨＣＣにおけるソラフェニブに対する応答についての予測マーカーの欠如は、依然として大きな課題のままである。これらの予測マーカーは、特に新しい治療の利用可能性に起因して、患者が治療される方法を変化させる可能性がある（Ｍａｒｉｓｉ Ｇ，ｅｔ ａｌ．（［１５］）、Ｐｉｎｙｏｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．（［１６］））。これまで、３つの異なる治療選択肢が、進行性ＨＣＣの第一選択において利用可能であり、それは、ソラフェニブ、レンバチニブ、及びより最近ではアテゾリズマブ／ベバシズマブの組み合わせである。患者がこれらの治療に対して異なって応答することは明らかである。考慮すべき他の点は、この薬物の有害作用及び公衆衛生のためのそれらの著しい費用である。その結果、各患者に最適な治療を決定するためには、精密医療に到達することが必要である。このセラノスティック戦略に必要な全ての情報は、固定診断生検において利用可能である。
【0128】
レーザー捕捉と質量分析とを組み合わせた本発明者らの技術的プロセスを使用して、本発明者らは、臨床で利用可能なこの日常的な生物学的試料からタンパク質発現調節解除プロファイルにアクセスすることができた。本発明者らの解析は、処置前に不良な応答者においてＵＰＲタンパク質の過剰発現の傾向があったことを明らかにした。いくつかの研究は、ソラフェニブが、ＨＣＣ細胞におけるＵＰＲのＰＥＲＫ及びＩＲＥ１α分枝を活性化し得るが、内因性活性化は、進行性ＨＣＣにおけるソラフェニブの応答の指標ではないことを以前に示している。しかしながら、ＵＰＲは、様々ながん治療に対するがん細胞応答の決定因子として既に記載されている。本発明者らの結果は、処置前のＵＰＲの内因性活性化が、ソラフェニブ処置に対するＨＣＣ感受性の欠如に寄与し得ることを示す。これは、さらなる解析及び検証を必要とするが、新たな薬理学的選択肢を提供し得る。
【0129】
セラノスティック指標であり得るパスウェイの中で、本発明者らはまた、酸化ストレスに関連するタンパク質を同定した。これらのタンパク質の上方調節は、不良な応答者におけるソラフェニブ処置に対する感受性を低下させ得る。患者において得られた本発明者らの結果は、ソラフェニブがＨＣＣ細胞による活性酸素種（reactive oxygen species、Ｒ
ＯＳ）産生を増強することを示した以前のインビトロ研究を確証する。これらの先天的な調節解除は、腫瘍に直接的な利点を与え、治療中に獲得され得る耐性機構に対抗する。
ＯＳ）産生を増強することを示した以前のインビトロ研究を確証する。これらの先天的な調節解除は、腫瘍に直接的な利点を与え、治療中に獲得され得る耐性機構に対抗する。
【0130】
本発明者らはまた、最も特徴的なタンパク質のうちのＢＧＮを含む、細胞接着に関連するタンパク質を見出した。実際、ＢＧＮ発現は、良好な応答者においてより高い。ソラフェニブは、インビトロでとりわけ細胞接着に関連する遺伝子の発現の有意な減少を誘導することが知られている（Ｃｅｒｖｅｌｌｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ」．Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．１１：２８４３－２８５５（２０１２）（［２５］））。さらに、非応答者コホートにおける処置前後のタンパク質発現を比較する腫瘍プロテオミクス解析は、接着パスウェイの有意なエンリッチメントを明らかにした。ビメンチンなどのタンパク質、並びにフィブロネクチン及びビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質が上方調節された。加えて、接着結合分子は、治療中にむしろ負の調節を受けた（Ｄａｚｅｒｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｎ ｓｅｒｉａｌ ｔｕｍｏｒ ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ－ｔｒｅａｔｅｄ ＨＣＣ ｐａｔｉｅｎｔ」．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１３：１３８１－１３８６（２０１６）（［２６］））。本発明者らの結果はこれを支持しない。しかし、細胞接着がソラフェニブに対するＨＣＣの応答に関連するという一連の証拠が存在するが、接着タンパク質が関与する正確な機構は依然として特徴付けられる。
【0131】
ソラフェニブに応答するこの予測タンパク質シグネチャーの中で、本発明者らは、ＴＫＴが、不良な応答者において最も反復的に過剰発現されるタンパク質であることを見出した。この結果は、マーカー及び重要な治療標的としてのＴＫＴを強調する。以前の研究は、ＴＫＴ枯渇を、ソラフェニブ処置に対するＨＣＣ細胞のインビトロ感受性と既に関連付けていた（Ｘｕ ＩＭ－Ｊ，ｅｔ ａｌ．（［２３］））。本発明者らは、患者におけるこれらの結果を確認及び補完し、このことは、本発明者らのセラノスティックシグネチャーの関連性を強調する。さらに、ＴＫＴは、ＨＣＣのソラフェニブ治療に対する応答の予測因子として提案されたことはなかったが、本発明者らは、このリードを強化するために、患者解析から強い議論を提供する。対照的に、ＴＫＴは、レンバチニブ療法に対する感受性に関与していないようであり、２つの第一選択のマルチキナーゼ阻害剤の間で選択するための良好なマーカーとなった。
【0132】
進行性ＨＣＣに対して二重併用療法が高度に探求された戦略であるときには、ＴＫＴ阻害剤の使用が探求されるべきである。以前に、ＴＫＴに特異的でないＰＰＰの阻害剤であるオキシチアミンは、ＨＣＣ細胞において有効なインビトロ及びインビボであることが既に示されている（Ｘｕ ＩＭ－Ｊ，ｅｔ ａｌ．（［２３］））。本発明者らは、ＨＵＨ７細胞の増殖に対するオキシチアミンの効果を確認しなかった。しかし、本発明者らは、肝細胞中のＴＫＴが主に細胞核で発現されるのに対して、ＰＰＰは細胞質であることを示した。最近の研究は、ＴＫＴの核転座及び異なるキナーゼ及び転写コレギュレーターとのその相互作用を強調する、ＨＣＣにおける代謝再プログラミングを記載した（Ｑｉｎ Ｚ，ｅｔ ａｌ．（［２２］））。これに関連して、核ＴＫＴ機能とソラフェニブ感受性との関係は完全に理解されたままであるが、核におけるＴＫＴ活性の特異的阻害は薬理学的に関連しており、従うべき手段である。
【0133】
ソラフェニブに対する応答を予測するバイオマーカーとしてのＴＫＴの使用が検証されると、治療前のＴＫＴの定量化は、２つの第一選択マルチキナーゼ阻害剤間の治療の現在の選択のための貴重な指標となるであろう。これに対処するために、質量分析によるＴＫＴの定量化は、ソラフェニブに対する応答を予測し、ＩＨＣ欠陥に対処するための第１の選択肢であり得る。本発明者らは、統計的に最も強いプロテオミクスプロファイル全体を解析することが、日常的な臨床診療において使用され得る有望な方法論的選択肢であると考える。この解析戦略は、第一又は第二選択において現在使用されているマルチキナーゼ阻害剤、及び第一選択処置のための暫定認可を有する免疫療法のために拡張され得る。さらに、ソラフェニブ応答の予測シグネチャーにおいて、本発明者らは、その発現レベルが良好な応答者においてより高かった腫瘍関連免疫に関与するタンパク質（Ａ２Ｍ及びＩＧＨＧ１）を同定した。これらの同定は、併用抗ＶＥＧＦ／抗ＰＤＬ１免疫療法に対する応答を予測する腫瘍プロテオミクスプロファイルを探索することを促している。さらに、レーザーマイクロダイセクションのおかげで、本発明者らはまた、免疫原性領域をより正確に標的化して、免疫療法に対する応答に関与する細胞型に関する情報により正確にアクセスすることができる。
【0134】
本発明者らのプロセスの利点は、通常の治療で使用される日常的な針生検に適用できることである。本発明者らの研究は、ＨＣＣにおけるセラノティックアプローチのために肝
生検を行うことを促進する。ＨＣＣ生検に関する活発な議論が依然として存在する。病理的解析は、ＨＣＣのサブタイプ、分化の程度、胆管又は前駆細胞表現型及び増殖指数などのロバストなヒストプログノスティックマーカーを提供することができる。非侵襲性セラノスティックバイオマーカー（血液バイオマーカー、循環ＤＮＡ、循環細胞、エキソソーム）を同定することに大きな努力が注ぎ込まれる。しかしながら、これらの異なる戦略は、ダイナミックレンジが非常に可変である血液中で希釈された腫瘍の小さな部分を同定することを伴う。特に、この小さな部分はまた、処置に対する応答の予測値を有さなければならない。非侵襲的戦略はまだ利用可能ではなく、生検が全体のごく一部を占める場合であっても、本発明者らは大量の情報に容易にアクセスすることができる。将来、進行性ＨＣＣの各処置について同定されたセラノスティックプロテオミクスプロファイルは、参照として使用され得、処置を待っているあらゆる新規患者と統計的に比較され得る。したがって、機械学習を使用するプロテオミクスプロファイリングは、個人化された管理及び精密医療を可能にする。さらに、固定された生検についてのホスホプロテオミクス解析は、シグナル伝達パスウェイの活性化状態へのアクセスを提供し得、これは、より正確な機能的情報を提供する。
生検を行うことを促進する。ＨＣＣ生検に関する活発な議論が依然として存在する。病理的解析は、ＨＣＣのサブタイプ、分化の程度、胆管又は前駆細胞表現型及び増殖指数などのロバストなヒストプログノスティックマーカーを提供することができる。非侵襲性セラノスティックバイオマーカー（血液バイオマーカー、循環ＤＮＡ、循環細胞、エキソソーム）を同定することに大きな努力が注ぎ込まれる。しかしながら、これらの異なる戦略は、ダイナミックレンジが非常に可変である血液中で希釈された腫瘍の小さな部分を同定することを伴う。特に、この小さな部分はまた、処置に対する応答の予測値を有さなければならない。非侵襲的戦略はまだ利用可能ではなく、生検が全体のごく一部を占める場合であっても、本発明者らは大量の情報に容易にアクセスすることができる。将来、進行性ＨＣＣの各処置について同定されたセラノスティックプロテオミクスプロファイルは、参照として使用され得、処置を待っているあらゆる新規患者と統計的に比較され得る。したがって、機械学習を使用するプロテオミクスプロファイリングは、個人化された管理及び精密医療を可能にする。さらに、固定された生検についてのホスホプロテオミクス解析は、シグナル伝達パスウェイの活性化状態へのアクセスを提供し得、これは、より正確な機能的情報を提供する。
【0135】
結論として、この研究を通して、本発明者らは、進行性ＨＣＣにおいて発現されるタンパク質の定量化が、処置に対する応答の予測を可能にすることを示した。この概念実証は、外科的実践において生検試料を収集することを促進し、精密医療を実施することを可能にし、最終的に、治療有効性の有意な増加、したがって患者の生存をもたらし得る。
【0136】
実施例３：肝細胞腺腫のプロテオミクスプロファイルの特徴付けは、新しい診断アプローチへの道を開く
本発明者らは、全タンパク質発現調節解除パターンが、単一バイオマーカーよりもはるかに完全な方法で診断的であり得ると仮定した。本発明者らは、全ＨＣＡプロテオミクスプロファイルの特徴付けを用いて本発明者らの解析を進め、確立された分子分類とのそれらの対応を評価し、それらがさらなる診断的価値を提供し得るかどうかを評価した。
本発明者らは、全タンパク質発現調節解除パターンが、単一バイオマーカーよりもはるかに完全な方法で診断的であり得ると仮定した。本発明者らは、全ＨＣＡプロテオミクスプロファイルの特徴付けを用いて本発明者らの解析を進め、確立された分子分類とのそれらの対応を評価し、それらがさらなる診断的価値を提供し得るかどうかを評価した。
【0137】
２６０症例のコレクションから、本発明者らは、最初のＨＣＡプロテオミクスデータベースを構築した５２の典型的な症例を選択した。レーザーマイクロダイセクション及び質量分析に基づくプロテオミクス解析を組み合わせて、本発明者らは、各患者由来の腫瘍（Ｔ）肝臓組織と非腫瘍（ＮＴ）肝臓組織との間の相対的タンパク質存在量を比較し、本発明者らは、各ＨＣＡサブグループの特異的プロテオミクスパターンを規定した。次に、本発明者らは、診断される生検又は外科標本から抽出されたプロテオミクスパターンを本発明者らの参照ＨＣＡデータベースと比較するマッチングアルゴリズムを構築した。
【0138】
実験手順
患者
全ての患者はインフォームドコンセントを提出し、この研究は、本発明者らの地域委員会である、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの「Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ ｄｅ Ｉ’Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｌｉｖｅｒ Ｂｉｏｂａｎｋ ＢＢ－００３３－０００３６によって承認された。
患者
全ての患者はインフォームドコンセントを提出し、この研究は、本発明者らの地域委員会である、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌの「Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎ ｄｅ ｌａ Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ Ｃｌｉｎｉｑｕｅ ｅｔ ｄｅ Ｉ’Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ」、Ｂｏｒｄｅａｕｘ Ｌｉｖｅｒ Ｂｉｏｂａｎｋ ＢＢ－００３３－０００３６によって承認された。
【0139】
ＨＣＡデータベース構築
２６０の切除されたＨＣＡの本発明者らのコホートにおいて、２４８症例が、Ｈ－ＨＣＡ（７７）、ＩＨＣＡ（８２）、ｂ－ＨＣＡ（２８）、ｂ－ＩＨＣＡ（３５）、ｓｈ－ＨＣＡ（２５）ＨＣＡに対応した。１症例のみが未分類のＨＣＡであった。１２症例において、サブタイプ分けは技術的理由のために評価できなかった。
２６０の切除されたＨＣＡの本発明者らのコホートにおいて、２４８症例が、Ｈ－ＨＣＡ（７７）、ＩＨＣＡ（８２）、ｂ－ＨＣＡ（２８）、ｂ－ＩＨＣＡ（３５）、ｓｈ－ＨＣＡ（２５）ＨＣＡに対応した。１症例のみが未分類のＨＣＡであった。１２症例において、サブタイプ分けは技術的理由のために評価できなかった。
【0140】
本発明者らは、ＨＣＡの外科的切除であり、２０１９年のＷＨＯ分類２０（６ Ｈ－ＨＣＡ、５ ＩＨＣＡ、１６ ｂ－ＨＣＡ（４ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、５ ｂ－ＨＣＡエクソン３ Ｓ４５、５ ｂ－ＨＣＡエクソン７／８＋分類のために送られた２症例のｂ－ＨＣＡ（１エクソン３ Ｓ４５及び１エクソン７／８）をこのコレクションに加えた）、１６ ｂ－ＩＨＣＡ（６ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、４ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３ Ｓ４５、６ ｂ－ＩＨＣＡエクソン７／８）、９ ｓｈ－ＨＣＡ）によって定義される全ての異なるサブタイプの代表である５２個の試料を選択した。ＨＣＡ及びＨＣＡサブタイプの診断は、形態学及び免疫染色に従って病理学者によって特徴的であると考えられ、結果は常に遺伝子型決定によって確認された。ＦＮＨの５切除症例も対照として含めた。
【0141】
プロテオミクス解析
組織切片の調製、レーザーマイクロダイセクションカッティング、タンパク質抽出、ホルマリン固定反転、質量分析用試料の調製、質量分析、生質量分析データの処理、及び無標識定量化を、上述したように行った。質量分析プロテオミクスデータは、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている（識別名ＰＸＤ０２２８３５、ＰＸＤ０２２８３７、ＰＸＤ０２２８３９、ＰＸＤ０２２８４４及びＰＸＤ０２３０００）２９。
組織切片の調製、レーザーマイクロダイセクションカッティング、タンパク質抽出、ホルマリン固定反転、質量分析用試料の調製、質量分析、生質量分析データの処理、及び無標識定量化を、上述したように行った。質量分析プロテオミクスデータは、ＰＲＩＤＥパートナーリポジトリを介してＰｒｏｔｅｏｍｅＸｃｈａｎｇｅ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍに寄託されている（識別名ＰＸＤ０２２８３５、ＰＸＤ０２２８３７、ＰＸＤ０２２８３９、ＰＸＤ０２２８４４及びＰＸＤ０２３０００）２９。
【0142】
質量分析データ処理
フリーＲソフトウェアを用いて定量データを解析した。２未満の特異的ペプチドを有する質量分析によって同定されたタンパク質を除外した。各患者について、３つの技術的腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（ＮＴ）複製（連続切片から）を実施した。技術的反復中央値からのＴ／ＮＴ比を、各タンパク質について計算した。各群において有意に異なり、したがって特異的プロテオミクスパターンに対応した発現（ｐ＜０．０５）を有するタンパク質を特異的に同定するために、Ｒパッケージを使用してＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を実施した。
フリーＲソフトウェアを用いて定量データを解析した。２未満の特異的ペプチドを有する質量分析によって同定されたタンパク質を除外した。各患者について、３つの技術的腫瘍（Ｔ）及び非腫瘍（ＮＴ）複製（連続切片から）を実施した。技術的反復中央値からのＴ／ＮＴ比を、各タンパク質について計算した。各群において有意に異なり、したがって特異的プロテオミクスパターンに対応した発現（ｐ＜０．０５）を有するタンパク質を特異的に同定するために、Ｒパッケージを使用してＷｉｌｃｏｘｏｎ－Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を実施した。
【0143】
距離計算及びパターンマッチング
フリーＲソフトウェアを使用して解析を行った。階層的クラスタリングは、Ｒパッケージ及びその「ｈｃｌｕｓｔ」関数によって表された。凝集法として「ｗａｒｄ．Ｄ」法を使用し、ユークリッド距離を距離計算のために使用した。主成分解析（ＰＣＡ）のために、ＶＩＭパッケージからｋ－最近傍（k-Nearest Neighbor、ＫＮＮ）インピュテーション法を使用して欠損値をインピュテーションした。ＰＣＡデータを計算し、ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ及びＦａｃｔｏＭｉｎｅＲパッケージ内のＰＣＡ及びｆｖｉｚ＿ｐｃａ＿ｉｎｄ関数によってフォーマットした。ユークリッド距離は、ｄｉｓｔ関数及びｃｈｉｓｑ．ｔｅｓｔ関数を使用する独立のカイ二乗検定を使用して計算した（両方ともＲパッケージ内）。ランダムフォレストは、ランダムフォレストパッケージ内のランダムフォレスト関数を使用して生成された。最適パラメータは、カレットパッケージ内のトレイン関数によって計算された。
フリーＲソフトウェアを使用して解析を行った。階層的クラスタリングは、Ｒパッケージ及びその「ｈｃｌｕｓｔ」関数によって表された。凝集法として「ｗａｒｄ．Ｄ」法を使用し、ユークリッド距離を距離計算のために使用した。主成分解析（ＰＣＡ）のために、ＶＩＭパッケージからｋ－最近傍（k-Nearest Neighbor、ＫＮＮ）インピュテーション法を使用して欠損値をインピュテーションした。ＰＣＡデータを計算し、ｆａｃｔｏｅｘｔｒａ及びＦａｃｔｏＭｉｎｅＲパッケージ内のＰＣＡ及びｆｖｉｚ＿ｐｃａ＿ｉｎｄ関数によってフォーマットした。ユークリッド距離は、ｄｉｓｔ関数及びｃｈｉｓｑ．ｔｅｓｔ関数を使用する独立のカイ二乗検定を使用して計算した（両方ともＲパッケージ内）。ランダムフォレストは、ランダムフォレストパッケージ内のランダムフォレスト関数を使用して生成された。最適パラメータは、カレットパッケージ内のトレイン関数によって計算された。
【0144】
統合的生物学的解析
パスウェイ解析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）データベースを使用して行った。１０個の最も有意にエンリッチされたカノニカルパスウェイを各群（ＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨ）から選択し、比較した。機能アノテーションは、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント解析）ウェブツールを使用して遺伝子オントロジー（生物学的機能）及びＲｅａｃｔｏｍｅデータベースから抽出した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）。
パスウェイ解析は、Ｉｎｇｅｎｕｉｔｙ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＩＰＡ）（Ｑｉａｇｅｎ）データベースを使用して行った。１０個の最も有意にエンリッチされたカノニカルパスウェイを各群（ＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨ）から選択し、比較した。機能アノテーションは、ＧＳＥＡ（遺伝子セットエンリッチメント解析）ウェブツールを使用して遺伝子オントロジー（生物学的機能）及びＲｅａｃｔｏｍｅデータベースから抽出した（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｇｓｅａ－ｍｓｉｇｄｂ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ／ｉｎｄｅｘ．ｊｓｐ）。
【0145】
プロテオミクスパターンの検証のための症例の選択
本発明者らが同定したプロテオミクスパターンの診断適用性を検証するために、本発明者らは、試料分類のために１１症例の生検及び１切除、並びに悪性腫瘍状態のために４切除のパネルを選択した。
本発明者らが同定したプロテオミクスパターンの診断適用性を検証するために、本発明者らは、試料分類のために１１症例の生検及び１切除、並びに悪性腫瘍状態のために４切除のパネルを選択した。
【0146】
グラフィカル表現
グラフィカル表現は、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージ及びその全ての依存性を使用してフォーマットされた。
グラフィカル表現は、ｇｇｐｌｏｔ２パッケージ及びその全ての依存性を使用してフォーマットされた。
【0147】
結果
参照ＨＣＡプロテオミクスデータベースの作成
本発明者らの収集物からロバストなデータベースを構築するために、本発明者らは、全てのＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨを代表する５２例のＨＣＡ外科的切除症例を選択した。これらの切除の診断は、病理学者によって典型的であると考えられ、遺伝子解析によって確認された。
参照ＨＣＡプロテオミクスデータベースの作成
本発明者らの収集物からロバストなデータベースを構築するために、本発明者らは、全てのＨＣＡサブタイプ及びＦＮＨを代表する５２例のＨＣＡ外科的切除症例を選択した。これらの切除の診断は、病理学者によって典型的であると考えられ、遺伝子解析によって確認された。
【0148】
本発明者らは、各患者由来の腫瘍性（Ｔ）肝臓組織と非腫瘍性（ＮＴ）肝臓組織との間の相対的タンパク質存在量を比較した。最初に、本発明者らは、対応する腫瘍：ｂ－ＨＣＡ／ｂ－ＩＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、ＩＨＣＡ／ｂ－ＩＨＣＡ、ｓｈ－ＨＣＡ及びＨ－ＨＣＡそれぞれにおけるＧＳ、ＣＲＰ／ＳＡＡ、ＡＳＳ１、及びＬＦＡＢＰマーカーの特異的かつ予想された調節解除を確認し（図１）、本発明者らのデータベースのロバスト性を検証した。
【0149】
本発明者らは、各ＨＣＡサブタイプについてのタンパク質シグネチャーが、それらを定義する根底にある変異を反映すると仮定した。したがって、本発明者らは、各ＨＣＡサブタイプ（ＨＮＦ１Ａ、ＣＴＮＮＢ１、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達パスウェイ）を定義する根底にある変異遺伝子に機能的に関連するタンパク質を調べた。驚くべきことに、免疫マーカーとして現在使用されている検証された標的タンパク質（Ｌ－ＦＡＢＰ、ＧＳ、ＣＲＰ／ＳＡＡ）を除いて、本発明者らは、ＡＬＢ３０、ＯＡＴ３１、及びＭＩＦ３２で示されるように、各変異に関連して頻繁に見出される他のタンパク質の主要な調節解除を観察しなかった（図１ｅ、図１ｆ及び図１ｇ）。加えて、本発明者らは、トランスクリプトームアプローチ１８から各ＨＣＡ群について上述した典型的／特異的パスウェイを調査した。本発明者らは、教師なし解析によって、全てのＨＣＡサブタイプにおいてこれらのパスウェイの全てが有意に調節解除されていることを見出した。本発明者らは、これらの結果内において、ＨＣＣ発生に関連するタンパク質が全てのＨＣＡサブタイプにおいて有意に調節解除されたことに注目し、したがって、全てのサブタイプが潜在的に形質転換され得ることを示唆した。
【0150】
次いで、本発明者らは、ＨＣＡとＦＮＨとの間の有意差を調査した（図２）。ＨＣＡ及びＦＮＨのプロテオミクスパターンは全く異なっていた（図２ａ）。次いで、本発明者らは、異なるＨＣＡサブタイプのプロテオミクスパターンを鑑別することが可能であるかどうかを試験した。本発明者らは、最初に、最も類似していないパターン、すなわちＨ－ＨＣＡ及びｓｈ－ＨＣＡを分離した（図２ｂ）。興味深いことに、炎症性タンパク質発現パターンは、他のＨＣＡとは異なっていた炎症性ＨＣＡ（ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡ）によって共有される強いシグネチャーであった（図２ｃ）。ｂ－ＨＣＡのプロテオミクスパターンは、ｂ－ＨＣＡの階層的クラスタリング後であっても、主成分解析（ＰＣＡ）によって他のＨＣＡと十分に区別されなかった（図２ｄ）。しかし、ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡを特異的に比較した場合、それらのプロテオミクスパターンは著しく異なっていた（図２ｅ）。さらに、それらのタンパク質発現パターンは、ｂ－ＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡの両方について、ＣＴＮＮＢ１変異のタイプ（エクソン３非Ｓ４５、エクソン３ Ｓ４５、又は
エクソン７／８）に従って明確に分類された（図２ｆ）。
エクソン７／８）に従って明確に分類された（図２ｆ）。
【0151】
これらの結果は、プロテオミクスパターンと遺伝子型／表現型分類との間の優れた相関を実証し、優性（ｓｈ－ＨＣＡ、炎症性Ｈ－ＨＣＡ）及びあまり明らかでないパターン（ＣＴＮＮＢ１変異）の両方の存在を明らかにした。
【0152】
ＨＣＡ及びＦＮＨ診断のための機械学習ツール
本発明者らのプロテオミクスデータによる、本発明者らがそれぞれの異なるＨＣＡサブタイプを区別することを可能にしたことを考慮して、本発明者らは、診断ツールを設定することを決めた。第１の重要なステップは、試料がＨＣＡ又はＦＮＨに対応し、別のタイプの高分化型肝腫瘍に対応しないかどうかを定義することであった。これを調べるために、本発明者らは、肝硬変肝臓及び高分化型ＨＣＣにおける低悪性度異形成結節を解析した。両方の場合について、ＨＣＡ又はＦＮＨとの類似性スコアは非常に低く、誤った帰属の可能性を除外し、腫瘍がＨＣＡでもＦＮＨでもないことを示した。
本発明者らのプロテオミクスデータによる、本発明者らがそれぞれの異なるＨＣＡサブタイプを区別することを可能にしたことを考慮して、本発明者らは、診断ツールを設定することを決めた。第１の重要なステップは、試料がＨＣＡ又はＦＮＨに対応し、別のタイプの高分化型肝腫瘍に対応しないかどうかを定義することであった。これを調べるために、本発明者らは、肝硬変肝臓及び高分化型ＨＣＣにおける低悪性度異形成結節を解析した。両方の場合について、ＨＣＡ又はＦＮＨとの類似性スコアは非常に低く、誤った帰属の可能性を除外し、腫瘍がＨＣＡでもＦＮＨでもないことを示した。
【0153】
次に、本発明者らは、最初に、同定された主要なＨＣＡ群（ｓｈ－ＨＣＡ、Ｈ－ＨＣＡ、炎症性（ＩＨＣＡ及びｂ－ＩＨＣＡ）、次いで二次プロテオミクスパターン（異なるＣＴＮＮＢ１変異によるｂ－ＨＣＡ）を統合するアルゴリズムを構築した（図３ａ）。したがって、その原理は、それらのＨＣＡサブタイプを診断するために、ＨＣＡサブタイプ参照プロテオミクスパターンを新しい症例と逐次比較することである（図３ｂ、図３ｃ、及び図３ｄ）。本発明者らは、類似性を計算するために、以下の３つのアプローチを使用した。（１）Ｔ／ＮＴ調節解除を異なる参照プロテオミクスパターンと比較するためのカイ二乗検定、（２）各グループ間のユークリッド距離の計算、（３）ＰＣＡ削減データセットに対するランダムフォレスト解析、を使用した。本発明者らは、それらを、ＦＮＨ及びＨＣＡ（任意のサブタイプ）の１１の生検及び１つの切除のパネルに適用して、各解析の利点及び限界を試験した。
【0154】
１２症例のうち３症例は、典型的なｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、ｓｈ－ＨＣＡ及びＨ－ＨＣＡ（それぞれ、Ｒ＿０１、ＢＰ＿０１、及びＢＰ＿０２）であり、分類においていかなる困難も示さなかった（図３ｂ、図３ｃ、図３ｄ及び図３ｅ）。他の９症例は、本発明者らの三次施設において診断された生検の代表的なパネルからなった。ＨＣＡバイオマーカーは、これらの症例のうちのいずれのサブタイプ分けにも寄与しなかった。しかしながら、プロテオミクスパターンは、３つの症例（ＢＰ＿０３、＿０４及び＿０５）についての臨床病理的解釈と一致した。他の２つの症例（ＢＰ＿０６及び＿０７）については、ランダムフォレストが正しい診断を与え、もう１つの試験が病理診断と一致し、最後の１つの試験が異なる結果を与えた。これらの症例はあまり典型的ではなく、データベース中のＨＣＡと完全に一致しなかった。症例ＢＰ＿０８は、ｂ－ＨＣＡエクソン７／８サブタイプであり、その後、切除に対する遺伝子解析によって同定された。ランダムフォレスト及びユークリッド距離は、それをｂ－ＨＣＡエクソン７／８サブタイプとして確実に認識したが、カイ二乗検定は、それを非常に類似したｂ－ＨＣＡエクソン３ Ｓ４５群と分類した。最後に、その後の切除を伴わない３つの生検（ＢＰ＿０９、＿１０、及び＿１１）であって、病理学者がＩＨＣＡをｂ－ＩＨＣＡ（エクソン７／８又はエクソン３ Ｓ４５）から区別することができなかった３つの生検は、ｂ－ＩＨＣＡエクソン７／８又はエクソン３ Ｓ４５パターンを有する群であることが見出された。
【0155】
結論として、これらの結果は、プロテオミクスパターンマッチングがＨＣＡをＦＮＨから鑑別し、分子ＨＣＡサブタイプを割り当てることができることを実証している。異型症例に関して困難な場合、プロテオミクスプロファイリングは、診断を支持するさらなる手がかりをもたらし得る。
【0156】
形質転換されたＨＣＡについての悪性度のプロテオミクスパターンの同定
十分に確立された分子病理学的分類にもかかわらず、臨床診療は実質的に変化せず、ＨＣＡ管理は多くの外科医にとって繊細なままである。本発明者らの中心でこれを説明するために、分子分類は、サブグループタイプに従ってＨＣＡ管理を改変していない。これは、より多くの術前生検を行う傾向がわずかであるにもかかわらずである。
十分に確立された分子病理学的分類にもかかわらず、臨床診療は実質的に変化せず、ＨＣＡ管理は多くの外科医にとって繊細なままである。本発明者らの中心でこれを説明するために、分子分類は、サブグループタイプに従ってＨＣＡ管理を改変していない。これは、より多くの術前生検を行う傾向がわずかであるにもかかわらずである。
【0157】
しかしながら、悪性形質転換はＨＣＡの主要な合併症であり、本発明者らは、本発明者らのプロテオミクスパターンに基づくツールがこの問題に対処するのに役立ち得るかどうかを決定したいと考えた。
【0158】
本発明者らのコレクションにおけるＨＣＡ症例は、ＨＣＡサブタイプにかかわらず、ＨＣＣに形質転換され得る（図４ａ）。ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５サブタイプが悪性形質転換の最も高いリスクを示したとしても、他のサブグループからの症例の無視できない割合が関係し得る（ｓｈ－ＨＣＡについては１３．６％まで）（図４ａ）。悪性腫瘍の組織学的特徴の解釈は困難であり得、病理学者の専門知識に依存し、観察者に依存し得ることは注目に値する。
【0159】
これらの症例の半分において、本発明者らは、病理学者のための留保に気付いた。これは、「ボーダーライン」という用語によって説明され、もはやＨＣＡの特徴ではないが、同時に、明確なＨＣＣのいくつかの特徴を欠く異型病巣を提示する腫瘍として定義された（図４ａ及び図４ｂ）。臨床及びイメージングの状況に加えて、組織学におけるＨＣＣ診断の主張は、細胞核異型（図４ｃ及び図４ｄ）などの形態学的基準だけでなく、免疫組織化学的陽性（例えば、グリピカン３（ＧＰＣ３）及び熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０））３３、及びＴＥＲＴプロモーター変異３４も含む特徴のセットに基づく。これらの基準は、完全に特異的かつ繊細なものではない。したがって、患者管理を改善するために、悪性腫瘍のプロテオミクスシグネチャーを同定することが実際的であると思われた。
【0160】
ＨＣＡ悪性腫瘍パターンで発症したＨＣＣの同定
ＨＣＡにおける悪性疾患に関連するタンパク質を同定するために、本発明者らは、異なるＨＣＡサブタイプ（２ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、１ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３
Ｓ４５、１ ＵＨＣＡ、２ ｓｈ－ＨＣＡ）から、ＨＣＡで発症した明確なＨＣＣ（本発明者らはこれを「ＨＣＣ／ＨＣＡ」と呼ぶ）を示した外科的切除の６つの症例を選択した（補足表３）。上述したように、本発明者らは、６つのＨＣＡ及びそれらの対応するＨＣＣ／ＨＣＡのＴ／ＮＴ比を比較し、１０個のタンパク質からなる有意なプロテオミクスパターンを単離した。これらのタンパク質は、階層的クラスタリング（図５ａ）及びＰＣＡ（図５ｂ）の両方によって、悪性組織及び良性組織の完全な分離を可能にした。さらに、各群内のタンパク質発現調節解除は均一であった（図５）。
ＨＣＡにおける悪性疾患に関連するタンパク質を同定するために、本発明者らは、異なるＨＣＡサブタイプ（２ ｂ－ＨＣＡエクソン３非Ｓ４５、１ ｂ－ＩＨＣＡエクソン３
Ｓ４５、１ ＵＨＣＡ、２ ｓｈ－ＨＣＡ）から、ＨＣＡで発症した明確なＨＣＣ（本発明者らはこれを「ＨＣＣ／ＨＣＡ」と呼ぶ）を示した外科的切除の６つの症例を選択した（補足表３）。上述したように、本発明者らは、６つのＨＣＡ及びそれらの対応するＨＣＣ／ＨＣＡのＴ／ＮＴ比を比較し、１０個のタンパク質からなる有意なプロテオミクスパターンを単離した。これらのタンパク質は、階層的クラスタリング（図５ａ）及びＰＣＡ（図５ｂ）の両方によって、悪性組織及び良性組織の完全な分離を可能にした。さらに、各群内のタンパク質発現調節解除は均一であった（図５）。
【0161】
悪性腫瘍タンパク質パターンの抽出された機能アノテーションの半分は、免疫応答及び免疫関連細胞活性化（ＭＰＯ、ＰＲＤＸ２、ＬＣＰ１、ＰＰＩＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＰＬＤ３）、インターロイキン－１２シグナル伝達（PPIA、ＬＣＰ１）、並びに好中球脱顆粒（ＰＰＩＡ、ＳＥＲＰＩＮＡ１、ＭＰＯ）と関連していた（図５ｃ）。これらの１０個のタンパク質のうち、既知のβ－カテニン機能環境の一部であるものはなかった。
【0162】
次いで、本発明者らは、新しい症例のセットを用いて、ＨＣＡ形質転換のこのプロテオミクスパターンを検証しようとした。カイ二乗スコアリング法は、１０個のタンパク質からなるパターンには適用できなかった。ユークリッド距離及びランダムフォレストを用いて、本発明者らは、最初に、ＨＣＡで発症したＨＣＣの１つの陽性対照及び本発明者らのデータベースからの良性ＨＣＡの７症例に対する形質転換の本発明者らの１０個のタンパク質プロテオミクスパターンを試験した。
【0163】
ＨＣＡで発症した調節ＨＣＣによる検証
症例１６７は、ＨＣＡで発症したＨＣＣであり、組織学的曖昧性はなく、分子解析によって確認された。プロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定及びＨＣＣ群についてのより小さいユークリッド距離（ＨＣＡについて５．１８対ＨＣＣについて５．４３）によって確認された、形質転換症例により近かった（図６ｂ及び図６ｃ）。本発明者らのプロテオミクス悪性パターンは、ＨＣＣ診断の確認を可能にした。
症例１６７は、ＨＣＡで発症したＨＣＣであり、組織学的曖昧性はなく、分子解析によって確認された。プロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定及びＨＣＣ群についてのより小さいユークリッド距離（ＨＣＡについて５．１８対ＨＣＣについて５．４３）によって確認された、形質転換症例により近かった（図６ｂ及び図６ｃ）。本発明者らのプロテオミクス悪性パターンは、ＨＣＣ診断の確認を可能にした。
【0164】
良性対照による検証
次に、本発明者らは、組織学的検査による良性腫瘍の診断に関して疑わしくなかったＨＣＡの７症例（症例１０５、１１６、１２１、１３５、１１９、８３、２１８）を選択した（図６）。これら全ての腫瘍のプロテオミクスプロファイルにより、これら全ての症例の良性の性質が確認された（図６）。
次に、本発明者らは、組織学的検査による良性腫瘍の診断に関して疑わしくなかったＨＣＡの７症例（症例１０５、１１６、１２１、１３５、１１９、８３、２１８）を選択した（図６）。これら全ての腫瘍のプロテオミクスプロファイルにより、これら全ての症例の良性の性質が確認された（図６）。
【0165】
悪性腫瘍の診断に関して疑いのある症例
次いで、本発明者らは、悪性腫瘍の診断に関して疑いが生じた管理歴を有する症例を選択した。第１の症例（１７８）は、生検解析時に悪性であると疑われた。外科的切除の最終的な組織学的解析は、後にｓｈ－ＨＣＡとして同定されたこのＨＣＡの良性の性質について明らかであった。臨床状況を再現するために、本発明者らは、最初に疑いが生じた術前生検のプロテオームを解析した。明白に、プロテオミクスパターンは、より近い良性ＨＣＡであり、ランダムフォレスト検定及びＨＣＡについての最小ユークリッド距離（ＨＣＡについて２．９９対ＨＣＣについて５．０１）によって確認された（図６ｆ及び図６ｉ）。
次いで、本発明者らは、悪性腫瘍の診断に関して疑いが生じた管理歴を有する症例を選択した。第１の症例（１７８）は、生検解析時に悪性であると疑われた。外科的切除の最終的な組織学的解析は、後にｓｈ－ＨＣＡとして同定されたこのＨＣＡの良性の性質について明らかであった。臨床状況を再現するために、本発明者らは、最初に疑いが生じた術前生検のプロテオームを解析した。明白に、プロテオミクスパターンは、より近い良性ＨＣＡであり、ランダムフォレスト検定及びＨＣＡについての最小ユークリッド距離（ＨＣＡについて２．９９対ＨＣＣについて５．０１）によって確認された（図６ｆ及び図６ｉ）。
【0166】
次に、我々は「ボーダーライン」症例を選択した。症例２１７は、増殖中及び未分類のＨＣＡにおける画像化によって腫瘍内出血を示した。腫瘍内血腫の存在は解釈を困難にし、細胞学的異型性及び異常な類洞（ＣＤ３４陽性及び減少したレチクリン染色）の存在に起因して、ＨＣＡとＨＣＣとを区別することは困難であった。分子生物学解析は、事後診断がｓｈ－ＨＣＡであることを見出した。プロテオミクスプロファイルは、ランダムフォレスト検定によって確認されるように、ＨＣＣ群と非常に明確に関連していた。しかしながら、ユークリッド距離計算は、２群間の決定を可能にしなかった（ＨＣＡについて４．５５対ＨＣＣについて４．６５）。この特異的症例について、プロテオミクスは、ＨＣＡとＨＣＣとの間の進行性スケールでのこの腫瘍の位置付けを可能にするさらなる定量的特徴を提供した（図１６ａ、図１６ｇ及び図１６ｉ）。
【0167】
最後の症例（症例２８０、図６）は、良性の１０ｃｍ肝腫瘍について最初に遠隔管理された女性であった。切除標本の組織学的解析は、病理学者にとって難題であり、すなわち、びまん性の細胞学的異型性及び異常なレチクリンネットワークと組み合わされたＨＣＡが分類不可能であった。したがって、これは、推定ＨＣＣの診断をもたらしたが、ＨＣＣに有利なＩＨＣマーカー（ＧＰＣ３陰性及びＭＩＢ１陰性）及び陰性分子解析（ＴＥＲＴ陰性）はなかった。プロテオミクスパターンは、明らかに、ＨＣＡ群で発症したＨＣＣを有するこの症例の分類を可能にした（ＨＣＡについて４．２７対ＨＣＣについて４．９９）。
【0168】
この検証患者セットに関するこれらの結果を考慮すると、プロテオミクス悪性パターンは、形質転換のプロセスに関与するＨＣＡの判定に有効であった。
【0169】
この研究において、本発明者らは、ＨＣＡサブタイプ及び悪性形質転換のそのレベルを反映するスコアを判定することができるＨＣＡ診断のための完全なツールを提供する。
【0170】
参照リスト
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１３．Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．：「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４９，１２２６－１２３９．ｅ４（２０１５）．
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ｄｒｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１３：Ｅ７２５－７３４（２０１６）．
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ｏｆ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆａｒｎｅｓｏｉｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＨＤＡＣ３ ｔｏ ＦＸＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏ
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ
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Ｐｒａｃｔｉｃｅ．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｃｏｍｍｕｎ．４，８０９－８２４（２０２０）．
２．Ｇｕｓｔａｆｓｓｏｎ Ｏ，ｅｔ ａｌ．Ｐ．Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ ｉｎ ｔｈｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｆｏｒｍａｌｉｎ－ｆｉｘｅｄ
ｔｉｓｓｕｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ ＢＢＡ－Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ １８５４，５５９－５８０（２０１５）．
３．Ｃｏｓｃｉａ Ｆ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅｄ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ－ｂａｓｅｄ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｗｏｒｋｆｌｏｗ ｆｏｒ ｌａｒｇｅｓｃａｌｅ ＦＦＰＥ ｔｉｓｓｕｅ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２５１，１００－１１２（２０２０）．
４．Ｈｅｎｒｉｅｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．：「Ａｒｇｉｎｉｎｏｓｕｃｃｉｎａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ １（ＡＳＳ１）：Ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄ
ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ａｄｅｎｏｍａ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｂｌｅｅｄｉｎｇ ｒｉｓｋ」．Ｈｅｐａｔｏｌ．Ｂａｌｔｉｍ．Ｍｄ ６６，２０１６－２０２８（２０１７）．
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７．Ｆｅｒｌａｙ Ｊ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅ：ｓｏｕｒｃｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｍａｊｏｒ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ＧＬＯＢＯＣＡＮ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１３６：Ｅ３５９－３８６（２０１２）．
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９．Ｈｏｌｌｅｂｅｃｑｕｅ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：ｆｒｏｍ ｄｉｓｉｌｌｕｓｉｏｎｓ ｔｏ ｎｅｗ ｈｏｒｉｚｏｎｓ．Ｅｕｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．５１：３２７－３３９（２０１５）．
１０．Ｋｕｄｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｌｅｎｖａｔｉｎｉｂ ｖｅｒｓｕｓ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｆｉｒｓｔ－ｌｉｎｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｐａｔｉｅｎｔｓ
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ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ．３９１：１１６３－１１７３（２０１８）．
１１．Ｂｏｕｙｓｓｉｅ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｌｉｎｅ：ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｕｓｅｒ－ｆｒｉｅｎｄｌｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｓｕｉｔｅ ｆｏｒ ｌａｒｇｅ－ｓｃａｌｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．Ｏｘｆ．Ｅｎｇｌ．３６，３１４８－３１５５（２０２０）．
１２．Ｎａｕｌｔ Ｊ－Ｃ，ｅｔ ａｌ：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ａｄｅｎｏｍａ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ Ｗｉｔｈ Ｒｉｓｋ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｂｌｅｅｄｉｎｇ，ａｎｄ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １５２，８８０－８９４．ｅ６（２０１７）．
１３．Ｚｕｃｍａｎ－Ｒｏｓｓｉ Ｊ，ｅｔ ａｌ．：「Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ」．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １４９，１２２６－１２３９．ｅ４（２０１５）．
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１５．Ｍａｒｉｓｉ Ｇ，Ｃｕｃｃｈｅｔｔｉ Ａ，Ｕｌｉｖｉ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａｒｅ ｔｈｅｒｅ ａｎｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｄ／ｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｍａｒｋｅｒｓ？．Ｗｏｒｌｄ Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２４：４１５２－４１６３（２０１８）．
１６．Ｐｉｎｙｏｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｅｄｉｃｔｏｒｓ ｏｆ ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ ｏｆ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ｉｎ ＨＣＣ ｗｉｔｈ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｓ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｉｎ ｔｈｅ ｐｈａｓｅ ３ ＳＴＯＲＭ ｔｒｉａｌ．Ｇｕｔ．６８：１０６５－１０７５（２０１９）．
１７．Ａｂｏｕ－Ａｌｆａ ＧＫ，ｅｔ ａｌ．Ｐｈａｓｅ ＩＩ ｓｔｕｄｙ ｏｆ
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１８．Ｃｈｕ ＪＳ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｖａｌｕｅ ｏｆ ＶＥＧＦＲ－２，ＰＤＧＦＲ－β，ａｎｄ ｃ－Ｍｅｔ ｉｎ
ａｄｖａｎｃｅｄ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３２：１６（２０１３）．
１９．Ｈａｇｉｗａｒａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ＪＮＫ ａｎｄ ｈｉｇｈ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ＣＤ１３３ ｐｒｅｄｉｃｔ ａ ｐｏｏｒ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ｉｎ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．１０６：１９９７－２００３（２０１２）．
２０．Ｖｉａｌ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ Ｍｉｍｉｃｒｙ ｉｎ Ｐａｒａｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｅ Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：５２３（２０１９）．
２１．Ｌｉ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓ
ｔｏ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ｉｎｖａｓｉｏｎ，ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７：１－９（２０１８）．
２２．Ｑｉｎ Ｚ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ（ＴＫＴ）ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｍｏｔｅ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｉｎ ａ ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ａｎｄ ａ ｎｏｎ－ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｍａｎｎｅｒ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ
Ｒｅｓ．３８：１５４（２０１９）．
２３．Ｘｕ ＩＭ－Ｊ，Ｌａｉ ＲＫ－Ｈ，Ｌｉｎ Ｓ－Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｃｏｕｎｔｅｒａｃｔｓ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｔｏ
ｄｒｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１３：Ｅ７２５－７３４（２０１６）．
２４．Ｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｒａｎｓｋｅｔｏｌａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｆａｒｎｅｓｏｉｄ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｔｈｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ＨＤＡＣ３ ｔｏ ＦＸＲ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｈｅｐａｔｏ
ｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ
Ｄｉｓ．１１：３１（２０２０）．
２５．Ｃｅｒｖｅｌｌｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ ａｃｔｉｏｎ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ，Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ．１１：２８４３－２８５５（２０１２）．
２６．Ｄａｚｅｒｔ Ｅ，ｅｔ ａｌ．Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｈｏｓｐｈｏｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ ｏｎ ｓｅｒｉａｌ ｔｕｍｏｒ
ｂｉｏｐｓｉｅｓ ｆｒｏｍ ａ ｓｏｒａｆｅｎｉｂ－ｔｒｅａｔｅｄ ＨＣＣ ｐａｔｉｅｎｔ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１１３：１３８１－１３８６（２０１６）．
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図1-4】
【図1-5】
【図1-6】
【図1-7】
【図2-1】
【図2-2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4-1】
【図4-2】
【図5-1】
【図5-2】
【図6-1】
【図6-2】
【図6-3】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図8-3】
【図8-4】
【図9-1】
【図9-2】
【図10-1】
【図10-2】
【国際調査報告】