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2024-509904新規なDARPinに基づく多重特異性T細胞エンゲージャ
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-05
(54)【発明の名称】新規なDARPinに基づく多重特異性T細胞エンゲージャ
(51)【国際特許分類】
   C12N 15/62 20060101AFI20240227BHJP
   C07K 16/46 20060101ALI20240227BHJP
   C12N 15/13 20060101ALI20240227BHJP
   A61P 35/00 20060101ALI20240227BHJP
   A61P 37/04 20060101ALI20240227BHJP
   A61P 35/02 20060101ALI20240227BHJP
   A61K 47/64 20170101ALI20240227BHJP
   A61K 47/68 20170101ALI20240227BHJP
   A61K 38/16 20060101ALI20240227BHJP
   A61K 39/395 20060101ALI20240227BHJP
   A61K 47/65 20170101ALI20240227BHJP
   A61K 48/00 20060101ALI20240227BHJP
   C07K 16/28 20060101ALN20240227BHJP
   C07K 16/30 20060101ALN20240227BHJP
【FI】
C12N15/62 Z
C07K16/46 ZNA
C12N15/13
A61P35/00
A61P37/04
A61P35/02
A61K47/64
A61K47/68
A61K38/16
A61K39/395 T
A61K39/395 E
A61K47/65
A61K48/00
C07K16/28
C07K16/30
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554922
(86)(22)【出願日】2022-03-09
(85)【翻訳文提出日】2023-09-07
(86)【国際出願番号】 IB2022052126
(87)【国際公開番号】W WO2022190016
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】63/158,539
(32)【優先日】2021-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/172,973
(32)【優先日】2021-04-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/265,184
(32)【優先日】2021-12-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
(特許庁注:以下のものは登録商標)
1.TRITON
(71)【出願人】
【識別番号】515146556
【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ビアンキ マッテオ
(72)【発明者】
【氏名】レシュケ ニーナ
(72)【発明者】
【氏名】グリム セバスティアン
(72)【発明者】
【氏名】ライヒェン クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】シュレーレス ベルント
(72)【発明者】
【氏名】レヴィツキー ヴィクター
【テーマコード(参考)】
4C076
4C084
4C085
4H045
【Fターム(参考)】
4C076AA95
4C076CC07
4C076CC27
4C076CC41
4C076EE41
4C076EE59
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA13
4C084BA44
4C084DC50
4C084NA05
4C084NA13
4C084ZB091
4C084ZB092
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB31
4C085CC22
4C085CC23
4C085EE01
4C085GG02
4C085GG08
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA22
4H045EA28
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、例えばCD3、CD33、CD123、及びCD70などの異なる標的に対して結合特異性を有する結合剤を含む組換え多重特異性タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような多重特異性タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌など、例えば急性骨髄性白血病(AML)、の疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
(1)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、及び(2)腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも2つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、前記2つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、組換えタンパク質。
【請求項2】
前記2つの結合剤によって特異的に結合される前記腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞において共発現される、請求項1に記載の組換えタンパク質。
【請求項3】
(1)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、及び(2)腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも3つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、前記3つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、組換えタンパク質。
【請求項4】
前記3つの結合剤によって特異的に結合される前記腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞において共発現される、請求項3に記載の組換えタンパク質。
【請求項5】
前記腫瘍細胞が、液性腫瘍由来の腫瘍細胞である、請求項2及び4のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項6】
前記腫瘍細胞が、白血病由来である、請求項2、4、及び5のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項7】
前記白血病が、急性骨髄性白血病(AML)である、請求項6に記載の組換えタンパク質。
【請求項8】
前記組換えタンパク質が、腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤のうちの1つのみを含む組換えタンパク質と比較した場合に、前記腫瘍関連抗原を提示する表面に、より低い解離定数(KD)で結合することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項9】
前記腫瘍関連抗原を提示する前記表面が、腫瘍細胞の表面である、請求項8に記載の組換えタンパク質。
【請求項10】
前記より低い解離定数(KD)が、腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤のうちの1つのみを含む前記組換えタンパク質の対応する解離定数に対しよりも少なくとも約2分の1、少なくとも約4分の1、少なくとも約10分の1、少なくとも約20分の1、少なくとも約40分の1、又は少なくとも約100分の1である、請求項8及び9のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項11】
前記免疫細胞が、T細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項12】
前記T細胞が、CD8+細胞障害性T細胞である、請求項11に記載の組換えタンパク質。
【請求項13】
免疫細胞の表面上に発現する前記タンパク質が、前記T細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項14】
免疫細胞の表面上に発現される前記タンパク質がCD3である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項15】
前記第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項16】
前記第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される前記タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項17】
前記第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項18】
CD3に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項17に記載の組換えタンパク質。
【請求項19】
CD3に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、請求項17及び18のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項20】
腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤が、(i)第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤、(ii)第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤、及び(iii)第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項21】
前記第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、請求項20に記載の組換えタンパク質。
【請求項22】
前記第2の結合剤が、前記TAA1に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項20及び21のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項23】
前記TAA1が、CD33である、請求項20~22のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項24】
前記第2の結合剤が、CD33に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項20~23のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項25】
CD33に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項24に記載の組換えタンパク質。
【請求項26】
CD33に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項24及び25のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項27】
前記第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、請求項20~26のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項28】
前記第3の結合剤が、前記TAA2に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項20~27のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項29】
前記TAA2が、CD123である、請求項20~28のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項30】
前記第3の結合剤が、CD123に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項20~29のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項31】
CD123に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項30に記載の組換えタンパク質。
【請求項32】
CD123に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項30及び31のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項33】
前記第4の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、請求項20~32のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項34】
前記第4の結合剤が、前記TAA3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項20~33のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項35】
前記TAA3が、CD70である、請求項20~34のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項36】
前記第4の結合剤が、CD70に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項20~35のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項37】
CD70に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項36に記載の組換えタンパク質。
【請求項38】
CD70に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項36及び37のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項39】
CD3に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2又は3のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、及び/又はCD70に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項36及び37のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項40】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第3の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第3の結合剤)-(第2の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項41】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第3の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第2の結合剤)-(第3の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項42】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第3の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第2の結合剤)-(第3の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項43】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第3の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第3の結合剤)-(第2の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項44】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第4の結合剤)-(第2の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項45】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第2の結合剤)-(第4の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項46】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第2の結合剤)-(第4の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項47】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第4の結合剤)-(第2の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項48】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第3、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第4の結合剤)-(第3の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項49】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第3、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第3の結合剤)-(第4の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項50】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第3、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第3の結合剤)-(第4の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項51】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第3、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第4の結合剤)-(第3の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項52】
前記組換えタンパク質が、前記第1、第2、第3、及び第4の結合剤を含み、前記第1、第2、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第4の結合剤)-(第3の結合剤)-(第2の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、請求項20~39のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項53】
前記第1、第2、第3、及び/又は第4の結合剤が、ペプチドリンカーと共有結合している、請求項20~52のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項54】
前記ペプチドリンカーが、プロリン-トレオニンに富むペプチドリンカーである、請求項53に記載の組換えタンパク質。
【請求項55】
前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、1~50個のアミノ酸の長さを有する、請求項53又は54に記載の組換えタンパク質。
【請求項56】
配列番号1~4、6、15、64~70、及び102~112のいずれか1つの最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4、6、及び15のいずれか1つの最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている、請求項18~55のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項57】
前記アンキリン反復ドメインのいずれかが、N末端にG、S、又はGSを更に含む、請求項18~56のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項58】
前記組換えタンパク質が、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号7~10及び58~62のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項59】
前記組換えタンパク質が、10-6M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項60】
前記組換えタンパク質が前記第2の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合する、請求項20~59のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項61】
前記組換えタンパク質が前記第3の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合する、請求項20~60のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項62】
前記組換えタンパク質が前記第4の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合する、請求項20~61のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項63】
前記組換えタンパク質が、1~400nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項64】
前記組換えタンパク質が、前記第2及び第3の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA1に結合し、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA2に結合する、請求項20~63のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項65】
前記組換えタンパク質が、前記第2及び第4の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA1に結合し、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA3に結合する、請求項20~64のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項66】
前記組換えタンパク質が、前記第3及び第4の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA2に結合し、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA3に結合する、請求項20~65のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項67】
前記組換えタンパク質が、前記第2、第3、及び第4の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA1に結合し、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA2に結合し、前記組換えタンパク質が、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)でPBS中の前記TAA3に結合する、請求項20~63のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項68】
前記組換えタンパク質が、半減期延長部分を更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項69】
前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する結合剤である、請求項68に記載の組換えタンパク質。
【請求項70】
ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記結合剤が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項69に記載の組換えタンパク質。
【請求項71】
ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、請求項70に記載の組換えタンパク質。
【請求項72】
ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列を含む、請求項70及び71のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項73】
前記組換えタンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに結合する、請求項69~72のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項74】
前記組換えタンパク質が、配列番号11~14、78~86、及び95~101のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号11~14、78~86、及び95~101のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項1~39、53~57、及び59~73のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項75】
前記組換えタンパク質が、配列番号95~101のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号95~101のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項1~39、53~57、及び59のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項76】
前記組換えタンパク質が、配列番号95のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号95のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項1~39、53~57、及び59~73のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項77】
前記組換えタンパク質が、配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号96のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項1~39、53~57、及び59~73のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項78】
前記半減期延長部分が、前記第1の結合剤及び腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤のN末端側に位置する、請求項68~73のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項79】
前記組換えタンパク質が、前記第1の結合剤によって特異的に結合される免疫細胞の表面上に発現される前記タンパク質と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記少なくとも2つの結合剤又は腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記少なくとも3つの結合剤によって特異的に結合される前記腫瘍関連抗原とに同時に結合することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項80】
先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸。
【請求項81】
請求項16~78のいずれか一項に記載のアンキリン反復ドメインをコードする核酸。
【請求項82】
請求項1~79のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、又は請求項80及び81のいずれか一項に記載の核酸、並びに薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤を含む、医薬組成物。
【請求項83】
ヒトを含む哺乳動物の腫瘍組織における免疫細胞活性化の方法であって、請求項1~79のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。
【請求項84】
前記免疫細胞が、T細胞である、請求項83に記載の方法。
【請求項85】
医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の請求項1~79のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項80及び81のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項82に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。
【請求項86】
前記医学的状態が、癌である、請求項85に記載の方法。
【請求項87】
前記医学的状態が、液性腫瘍を特徴とする癌である、請求項85に記載の方法。
【請求項88】
前記医学的状態が、白血病である、請求項85に記載の方法。
【請求項89】
前記医学的状態が、急性骨髄性白血病である、請求項85に記載の方法。
【請求項90】
治療に使用するための、請求項1~79のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項80及び81のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項82に記載の医薬組成物。
【請求項91】
癌の治療に使用するための、任意選択で液性腫瘍を特徴とする癌の治療に使用するための、請求項1~79のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項80及び81のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項82に記載の医薬組成物。
【請求項92】
前記癌が白血病であり、任意選択で前記癌が急性骨髄性白血病である、請求項91に記載の使用のための組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、2021年3月9日に出願された米国特許仮出願第63/158,539号、2021年4月9日に出願された米国特許第63/172,973号、及び2021年12月9日に出願された米国特許出願第63/265,184号に対して優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、例えば、CD3、CD33、CD70、及びCD123などの異なる標的に対して結合特異性を有する結合剤を含む組換え多重特異性タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような多重特異性タンパク質、医薬組成物をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病(AML)などの疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。
【背景技術】
【0003】
急性骨髄性白血病(AML)は、急速な細胞増殖、侵攻性の臨床経過、及び一般的に高い死亡率を特徴とする、不均一かつ複雑な悪性疾患である。AML治療抵抗性は、急性白血病関連死の未だに主要な原因である(Winer & Stone,Ther Adv Hematol;2019;10)。化学療法を用いる標準プロトコルは、依然として世界的に適用される主要な治療アプローチであるが、免疫療法における最近の進歩は、化学療法抵抗性AMLに対して有効な治療選択肢を提供している。そのような免疫療法アプローチには、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、及びキメラ抗原受容体発現T細胞(CAR-T細胞)が含まれる。
【0004】
モノクローナル抗体ベースの療法は、主に、抗CD 33抗体又は抗CD 123抗体を、単剤療法として、又は細胞毒性剤とコンジュゲートさせて含む(Winer & Stone,Ther Adv Hematol;2019;10)。しかしながら、これらの薬物は、有意な有害作用又は低い有効性のいずれかを示している。例えば、抗生物質カリケアマイシンにコンジュゲートしたヒト化抗CD33モノクローナル抗体であるゲムツズマブオゾガマイシンによる治療は、有意な血液学的及び肝毒性をもたらしたが、ヒト化抗CD123モノクローナル抗体であるタルコツズマブによる治療は、有効な治療上の利益を提供することができなかった。現在、CD70を標的とする別のヒトモノクローナル抗体が臨床試験中であり(クサツズマブ)、最初の知見は有望であるように思われるが、専門家は依然として、その潜在的な安全プロファイルに関する懸念を表明している(例えば、www.clinicaltrialsarena.com/comment/argenxs-cusatuzumab-in-previously-untreated-aml-draws-varied-expert-forecastsを参照されたい)。
【0005】
CAR-T細胞療法は、リンパ系悪性腫瘍の管理に強く影響してきたアプローチである。この技術をAMLにも適用することに大きな関心が寄せられているが、実際には、これは困難であることが証明されている。モノクローナル抗体に関して、CD33及びCD123は、AMLにおけるCAR-T細胞療法のための最も有望な標的であると考えられている。しかしながら、これらの標的についての前臨床モデルは、非AML細胞に対して広範な副作用(オンターゲット/オフ腫瘍毒性)を示し、サイトカイン放出症候群(CRS)は、別の認識されている副作用である。
【0006】
二重特異性抗体を使用した腫瘍細胞のT細胞指向性殺傷は、AMLを含む様々な癌型の治療に利用されている別の最近の治療ツールである。これらのT細胞エンゲージャ(TCE)二重特異性抗体は、2つの異なる可変領域を含み、一方はT細胞受容体複合体サブユニットCD3に結合し、他方は腫瘍細胞表面抗原に結合する。これらの2つの標的へのTCEの結合は、細胞間の機能的接続を提供し、T細胞活性化及び腫瘍細胞に対して細胞傷害活性をもたらし、正常なTCR-MHC相互作用を回避する(Ellerman、Methods;154:102~117(2019年))。AMG330は、AML細胞に対してT細胞の細胞障害性を引き起こすことができる、CD3及びCD33に対して二重特異性抗体である。同様に、フロテツズマブは、2つの独立したポリペプチドを用いて、一方の抗体の重鎖可変ドメインを他方の抗体の軽鎖可変ドメインに融合させて、T細胞上のCD3及びAML細胞上のCD123を接続する二重親和性再標的化抗体(DART(登録商標))である。
【0007】
しかしながら、これらの抗体ベースのTCE治療薬は、製造コストが高いこと、複数の病気関連抗原を標的とすることができないことなどのいくつかの欠点を提示し、サイトカイン放出症候群(CRS)などの重篤な副作用(Shimabukuro-Vornhagenら、J Immunother Cancer;6(1):56(2018年);Labrjinら、Nat Rev Drug Discov;18(8):585~608(2019年))及び/又はオンターゲット/オフ腫瘍毒性(Weiner et al,Cancer Res.;55(20):4586~4593(1995年);Weinerら、Cancer Immunol.Immunother.;42(3);141-150(1996))を引き起こすリスクを抱えている。抗体ベースのT細胞エンゲージャは、天然のTCR-MHC相互作用と比較して、CD3に対して1000倍超高い親和性を示すことが多い((Wuら、Pharmacol Ther;182:161~75(2018年);国際公開第2014/167022号;Junntila et al,Cancer Res.;19:5561~71(2014年);Yangら、J Immunol Aug.;15(137):1097~100(1986年))。この高い親和性は、T細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷の点でより低い効率と相関している(Bortoletto et al,Eur.J.Immunol.32;11:3102-3107(2002年);Ellerman,Methods;154:102~117(2019年);Mandikianら,Mol.Cancer Ther.;17(4):776 LP-785(2018);Vafaら,Frontiers in Oncology;10:446(2020))。更に、TCEによって標的化される腫瘍表面マーカのダウンレギュレーションは、TCE治療に対して腫瘍の耐性をもたらし得る。
【0008】
急性骨髄性白血病(AML)は、上述したように、多くの点で癌療法の課題及び現在利用可能な癌療法の欠点を例示する癌の一種である。AMLについては、高い死亡率による医学的必要性が高いままであり、再発性又は難治性AMLの処置は、未だに治療が困難である。現在、多量の抗体薬物コンジュゲート(ADC)及び標的化T細胞エンゲージャ療法がAMLにおける臨床開発に入っているが、これらの療法は、用量制限毒性を伴うことが多い。最大の課題は、例えば、それぞれ骨髄毒性及びサイトカイン放出症候群(CRS)をもたらす、限定された標的特異性及び免疫系の過剰刺激であると思われる。更に、標的癌療法に対する耐性は、腫瘍細胞における個々の標的のダウンレギュレーションに起因して進化し得る。したがって、AMLに例示されるように、癌療法のこれらの課題及び現在利用可能な癌療法の欠点に対処するために、新規のアプローチ又は薬物分子が必要とされる。
【0009】
したがって、上述の治療用タンパク質の1つ以上の欠点に対処する有益な特性を有する、免疫細胞エンゲージャ、例えばTCEタンパク質などの新しい分子が依然として必要とされている。そのような新規分子は、腫瘍性疾患、例えば急性骨髄性白血病の治療のための治療アプローチに有用であり得る。
【発明の概要】
【0010】
本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも2つの結合剤とを含む組換えタンパク質であって、当該2つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する組換えタンパク質を提供する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、及びそのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、腫瘍環境におけるT細胞などの免疫細胞の局所的活性化のため、及びヒトを含む哺乳動物における急性骨髄性白血病などの疾患を治療及び診断するための方法における、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用を提供する。
【0011】
本発明の組換えタンパク質は、少なくとも2つの異なる腫瘍関連抗原(TAA)を標的とする。本発明の組換えタンパク質は、少なくとも2つのTAAが腫瘍細胞中に同時に存在する場合、アビディティ獲得による実質的に増加した腫瘍特異性を示し得る。また、そのようなアビディティ獲得に起因して、本発明の多重特異性タンパク質は、それぞれの単一標的特異性対照と比較してより大きな効果領域を有し得る。更に、本発明のタンパク質は、現在の治療分子と比較して、有意に少ないサイトカイン放出を誘導し得、改善された治療領域を示す。また、少なくとも2つの異なるTAAを標的化することによって、本発明のタンパク質は、標的ダウンレギュレーションに起因する腫瘍耐性の発生に対してより高い耐性を有し得る。
【0012】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも2つの結合剤とを含み、当該2つの結合剤が、異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現された当該タンパク質及び当該2つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0013】
一態様では、本発明は、当該2つの結合剤によって特異的に結合される当該腫瘍関連抗原が腫瘍細胞において共発現される、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0014】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも3つの結合剤とを含み、当該3つの結合剤が、異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現された当該タンパク質及び当該3つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0015】
一態様では、本発明は、当該3つの結合剤によって特異的に結合される当該腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞において共発現される、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0016】
一態様では、本発明は、当該腫瘍細胞が液性腫瘍由来の腫瘍細胞であり、好ましくは当該液性腫瘍が白血病であり、より好ましくは当該白血病が急性骨髄性白血病(AML)である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0017】
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤のうちの1つのみを含む組換えタンパク質と比較した場合に、当該腫瘍関連抗原を提示する表面に、より低い解離定数(KD)で結合することができる、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0018】
一態様では、本発明は、当該腫瘍関連抗原を提示する当該表面が当該腫瘍細胞の表面である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0019】
一態様では、本発明は、当該免疫細胞がT細胞である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0020】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質が、T細胞受容体複合体の一部であるタンパク質であり、好ましくは、T細胞受容体複合体の当該一部がCD3である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0021】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0022】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0023】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0024】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0025】
一態様では、本発明は、そのような組換えタンパク質であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤が、(i)第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤、(ii)第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤、及び(iii)第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤からなる群から選択される組換えタンパク質を提供する。
【0026】
一態様では、本発明は、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0027】
一態様では、本発明は、当該第2の結合剤が、当該TAA1に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはTAA1が、CD33である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0028】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15及び67~70のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112、好ましくは配列番号111のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0029】
一態様では、本発明は、当該第3の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0030】
一態様では、本発明は、当該第3の結合剤が、当該TAA2に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはTAA2が、CD123である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0031】
一態様では、本発明は、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6及び65~66のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106、好ましくは配列番号105のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0032】
一態様では、本発明は、当該第4の結合剤が、当該TAA3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはTAA3が、CD70である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0033】
一態様では、本発明は、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110、好ましくは配列番号109のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0034】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15及び67~70のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号3のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112、好ましくは配列番号111のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、当該CD123に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106、好ましくは配列番号105のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0035】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15及び67~70のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号3のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112、好ましくは配列番号111のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110、好ましくは配列番号109のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0036】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6及び65~66のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号3のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106、好ましくは配列番号105のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、当該CD70に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110、好ましくは配列番号109のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0037】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15及び67~70のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6及び65~66のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号3のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112、好ましくは配列番号111のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、当該CD123に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号6、65~66、及び102~106、好ましくは配列番号105のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含み、当該CD70に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110、好ましくは配列番号109のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含みそのような組換えタンパク質を提供する。
【0038】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び/又は第3の結合剤がペプチドリンカーと共有結合している、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0039】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、当該タンパク質は、配列番号7~10及び58~62のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、当該タンパク質が、配列番号11~14、78~86、及び95~101のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号11~14、78~86、及び95~101のアミノ酸配列のいずれか1つを有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、当該タンパク質が、配列番号95~101、好ましくは配列番号95又は配列番号96のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、当該タンパク質が、配列番号95~101、好ましくは配列番号95又は配列番号96のアミノ酸配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0040】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、10-6M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0041】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0042】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0043】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0044】
一態様では、本発明は、当該結合タンパク質が、1~400nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0045】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、半減期延長部分を更に含み、好ましくは、当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する結合剤である、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0046】
一態様では、本発明は、当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0047】
一態様では、本発明は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0048】
一態様では、本発明は、当該組換えタンパク質が、10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。
【0049】
一態様では、本発明は更に、そのような組換えタンパク質をコードする核酸を提供する。
【0050】
一態様では、本発明は更に、組換えタンパク質、又はそのような組換えタンパク質をコードする核酸、並びに薬学的に許容される担体及び/若しくは希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。
【0051】
一態様では、本発明は更に、必要とする患者に、治療有効量のそのような組換えタンパク質、又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を投与する工程を含む、医学的状態を治療する方法を提供する。
【0052】
一態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、当該医学的状態が癌、好ましくは液性腫瘍、より好ましくは白血病、更により好ましくは急性骨髄性白血病である、方法を提供する。
【0053】
一態様では、本発明は、治療に使用するための、本明細書で定義される組換えタンパク質又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【0054】
一態様では、本発明は、癌の治療に使用するための、好ましくは液性腫瘍の治療に使用するための、本明細書で定義される組換えタンパク質又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を提供する。
【0055】
一態様では、本発明は、癌の治療に使用するための、本明細書で定義される組換えタンパク質又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を提供し、当該癌は白血病であり、好ましくは当該癌は急性骨髄性白血病である。
【図面の簡単な説明】
【0056】
図1A】雌BALB/cマウスにおけるCD3特異性設計アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析図は、1mg/kgの単回静脈内ボーラス投与後の、雌BALB/cマウスにおけるDARPin(登録商標)タンパク質#16、DARPin(登録商標)タンパク質#17、DARPin(登録商標)タンパク質#18、及びDARPin(登録商標)タンパク質#19の群平均血清濃度-時間プロファイルを示す(平均±最大/分、群当たりN=3)。
図1B】雌BALB/cマウスにおける例示的な特異的設計アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析図は、1mg/kgの単回静脈内ボーラス投与後の、雌BALB/cマウスにおけるDARPin(登録商標)タンパク質#51、DARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#54、DARPin(登録商標)タンパク質#54、及びDARPin(登録商標)タンパク質#55の群平均血清濃度-時間プロファイルを示す(平均±最大/分、群当たりN=3)。
図2A】DARPin(登録商標)タンパク質#53(図2A)、DARPin(登録商標)タンパク質#54(図2B)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#9(図2C)によって例示される、ヒトCD3に対してアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴(SPR)分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトCD3を有するGLCチップに適用した。得られたSPRトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質CD3相互作用を決定した。RU、共鳴単位;s、時間(秒)。
図2B】DARPin(登録商標)タンパク質#53(図2A)、DARPin(登録商標)タンパク質#54(図2B)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#9(図2C)によって例示される、ヒトCD3に対してアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴(SPR)分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトCD3を有するGLCチップに適用した。得られたSPRトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質CD3相互作用を決定した。RU、共鳴単位;s、時間(秒)。
図2C】DARPin(登録商標)タンパク質#53(図2A)、DARPin(登録商標)タンパク質#54(図2B)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#9(図2C)によって例示される、ヒトCD3に対してアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴(SPR)分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトCD3を有するGLCチップに適用した。得られたSPRトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質CD3相互作用を決定した。RU、共鳴単位;s、時間(秒)。
図2D】DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57について得られたSPRトレースを示す。
図3A】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにMOLM-13細胞に結合する(半減期延長を伴わない)選択された組換えタンパク質(図3A)、1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質40及びDARPin(登録商標)タンパク質41)と比較した、CD123及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるDARPin(登録商標)タンパク質#27、(図3B)1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質42及びDARPin(登録商標)タンパク質43)と比較した、CD70及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるDARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29、(図3C)1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質44、DARPin(登録商標)タンパク質45、及びDARPin(登録商標)タンパク質46)と比較した、CD70、CD123、及びCD33に対して結合特異性を有する3つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#30、を示す。
図3B】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにMOLM-13細胞に結合する(半減期延長を伴わない)選択された組換えタンパク質(図3A)、1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質40及びDARPin(登録商標)タンパク質41)と比較した、CD123及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるDARPin(登録商標)タンパク質#27、(図3B)1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質42及びDARPin(登録商標)タンパク質43)と比較した、CD70及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるDARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29、(図3C)1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質44、DARPin(登録商標)タンパク質45、及びDARPin(登録商標)タンパク質46)と比較した、CD70、CD123、及びCD33に対して結合特異性を有する3つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#30、を示す。
図3C】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにMOLM-13細胞に結合する(半減期延長を伴わない)選択された組換えタンパク質(図3A)、1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質40及びDARPin(登録商標)タンパク質41)と比較した、CD123及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるDARPin(登録商標)タンパク質#27、(図3B)1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質42及びDARPin(登録商標)タンパク質43)と比較した、CD70及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるDARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29、(図3C)1つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質44、DARPin(登録商標)タンパク質45、及びDARPin(登録商標)タンパク質46)と比較した、CD70、CD123、及びCD33に対して結合特異性を有する3つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#30、を示す。
図4A】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにMOLM-13細胞に結合する選択された組換えタンパク質、(図4A)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#47)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図4B)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#50)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#29、(図4C)N末端に位置する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#53)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#31、を示す。
図4B】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにMOLM-13細胞に結合する選択された組換えタンパク質、(図4A)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#47)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図4B)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#50)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#29、(図4C)N末端に位置する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#53)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#31、を示す。
図4C】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにMOLM-13細胞に結合する選択された組換えタンパク質、(図4A)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#47)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図4B)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#50)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#29、(図4C)N末端に位置する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#53)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#31、を示す。
図5A】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに2つ又は3つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、(図5A)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質40及びDARPin(登録商標)タンパク質41)と比較した、CD123及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図5B)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質42及びDARPin(登録商標)タンパク質43)と比較した、CD70及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29、(図5C)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質44、DARPin(登録商標)タンパク質45、及びDARPin(登録商標)タンパク質46)と比較した、CD70、CD123、及びCD33に対して結合特異性を有する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#30、を示す。
図5B】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに2つ又は3つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、(図5A)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質40及びDARPin(登録商標)タンパク質41)と比較した、CD123及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図5B)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質42及びDARPin(登録商標)タンパク質43)と比較した、CD70及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29、(図5C)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質44、DARPin(登録商標)タンパク質45、及びDARPin(登録商標)タンパク質46)と比較した、CD70、CD123、及びCD33に対して結合特異性を有する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#30、を示す。
図5C】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに2つ又は3つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、(図5A)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質40及びDARPin(登録商標)タンパク質41)と比較した、CD123及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図5B)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質42及びDARPin(登録商標)タンパク質43)と比較した、CD70及びCD33に対して結合特異性を有する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29、(図5C)1つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質44、DARPin(登録商標)タンパク質45、及びDARPin(登録商標)タンパク質46)と比較した、CD70、CD123、及びCD33に対して結合特異性を有する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、DARPin(登録商標)タンパク質#30、を示す。
図6A】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに2つ又は3つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、(図6A)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#47)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図6B)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#50)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#29、(図6C)N末端に位置する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#63)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#31、を示す。
図6B】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに2つ又は3つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、(図6A)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#47)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図6B)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#50)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#29、(図6C)N末端に位置する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#63)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#31、を示す。
図6C】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに2つ又は3つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、(図6A)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#47)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#27、(図6B)N末端に位置する2つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#50)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#29、(図6C)N末端に位置する3つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#63)、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した、DARPin(登録商標)タンパク質#31、を示す。
図7】標的細胞殺傷。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)及びDARPin(登録商標)タンパク質#31を示す。データは、腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて、DARPin(登録商標)タンパク質#5が、臨床ベンチマークと比較した場合に同様の効力及び有効性を発揮することを示す。
図8】標的細胞殺傷。曲線7は、3つ全ての標的(CD70、CD123、及びCD33)を発現するMolm13親細胞を表す。DARPin(登録商標)タンパク質#31は、完全な効力を示す。曲線4~6は、2つの標的のみが依然として発現されていることを意味する単一KO細胞を表す。ここで、DARPin(登録商標)タンパク質#5は依然として活性であり、腫瘍不均一性に対抗する可能性を示唆している。曲線1~3は、二重KO細胞を表し、1つのみの標的が健常組織区画を模倣するために依然として発現されていることを意味する。ここで、DARPin(登録商標)タンパク質#31は、活性が有意に低く、健常組織に対する選択性が改善されていることを意味する。
図9A】IFNγのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図9Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図9Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図9Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図9Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図9B】IFNγのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図9Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図9Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図9Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図9Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図9C】IFNγのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図9Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図9Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図9Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図9Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図9D】IFNγのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図9Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図9Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図9Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図9Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図10A】IL-2のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図10Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図10Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図10Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図10Dに示す。
図10B】IL-2のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図10Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図10Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図10Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図10Dに示す。
図10C】IL-2のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図10Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図10Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図10Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図10Dに示す。
図10D】IL-2のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図10Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図10Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図10Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図10Dに示す。
図11A】IL-6のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図11B】IL-6のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図11C】IL-6のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図11D】IL-6のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図12A】IL-8のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図12B】IL-8のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図12C】IL-8のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図12D】IL-8のレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図11Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図11Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図11Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図11Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図13A】TNFαのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図13Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図13Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図13Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図13Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図13B】TNFαのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図13Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図13Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図13Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図13Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図13C】TNFαのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図13Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図13Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図13Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図13Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図13D】TNFαのレベル(3人のドナーの平均)。血液ループ系における全3人のドナー(D1~3)についてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。計算されたLLOQは点線で示されている。各点は3人のドナーの平均であり、エラーバーはSDである。フロテツズマブを図13Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図13Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図13Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図13Dに示す。データ及び値はULOQ超である。
図14A】血小板数。血液を時間0(ゼロ試料)、2、4、8、及び24時間でループから抽出し、Sysmex Hematology Analyzerを用いてPLT数を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブを図14Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図14Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図14Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図14Dに示す。
図14B】血小板数。血液を時間0(ゼロ試料)、2、4、8、及び24時間でループから抽出し、Sysmex Hematology Analyzerを用いてPLT数を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブを図14Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図14Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図14Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図14Dに示す。
図14C】血小板数。血液を時間0(ゼロ試料)、2、4、8、及び24時間でループから抽出し、Sysmex Hematology Analyzerを用いてPLT数を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブを図14Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図14Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図14Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図14Dに示す。
図14D】血小板数。血液を時間0(ゼロ試料)、2、4、8、及び24時間でループから抽出し、Sysmex Hematology Analyzerを用いてPLT数を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブを図14Aに、DARPin(登録商標)タンパク質#27を図14Bに、DARPin(登録商標)タンパク質#29を図14Cに、DARPin(登録商標)タンパク質#31を図14Dに示す。
図15A】選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質27、DARPin(登録商標)タンパク質40、及びDARPin(登録商標)タンパク質41について測定した、CD33標的についてのオン速度/オフ速度定数。
図15B】選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質27、DARPin(登録商標)タンパク質40、及びDARPin(登録商標)タンパク質41について測定した、CD33標的についてのオン速度/オフ速度定数。
図16A】選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質27、DARPin(登録商標)タンパク質40、及びDARPin(登録商標)タンパク質41について測定した、CD123標的についてのオン速度/オフ速度定数。
図16B】選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質27、DARPin(登録商標)タンパク質40、及びDARPin(登録商標)タンパク質41について測定した、CD123標的についてのオン速度/オフ速度定数。
図17】組換えタンパク質とヒトCD33との相互作用のKD
図18】組換えタンパク質とヒトCD123との相互作用のKD
図19】ヒトCD3、DARPin(登録商標)タンパク質#1、DARPin(登録商標)タンパク質#2、DARPin(登録商標)タンパク質#3、及びDARPin(登録商標)タンパク質#4に対して結合特異性を有する、4つの選択されたアンキリン反復タンパク質の精製物のSDS-PAGEゲル分析である。Mは、タンパク質サイズマーカ(還元SDS-PAGE、NuPAGE4~12%、Bis Tris(invitrogen)ゲル;5μg/レーン;MES緩衝液;インスタントブルー染色)。マーカタンパク質の分子量(kDa)を示す。レーン1:タンパク質サイズマーカ;レーン2:精製DARPin(登録商標)タンパク質#1;レーン3:精製DARPin(登録商標)タンパク質#2;レーン4:精製DARPin(登録商標)タンパク質#3;レーン5:精製DARPin(登録商標)タンパク質#4。
図20A図20A及び図20B.例示したアンキリン反復タンパク質のT細胞へのCD3結合Pan-T細胞上のCD3への結合を、Mirrorballによって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図20A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図20B)を示す。半減期延長タンパク質(B)は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して同様の結合を示す。5人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。図20Cは、Molm-13 N1細胞に対して、選択された多重特異性結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、DARPin(登録商標)タンパク質#61、及びDARPin(登録商標)タンパク質#62の腫瘍細胞結合を示す。
図20B図20A及び図20B.例示したアンキリン反復タンパク質のT細胞へのCD3結合Pan-T細胞上のCD3への結合を、Mirrorballによって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図20A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図20B)を示す。半減期延長タンパク質(B)は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して同様の結合を示す。5人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。図20Cは、Molm-13 N1細胞に対して、選択された多重特異性結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、DARPin(登録商標)タンパク質#61、及びDARPin(登録商標)タンパク質#62の腫瘍細胞結合を示す。
図20C図20A及び図20B.例示したアンキリン反復タンパク質のT細胞へのCD3結合Pan-T細胞上のCD3への結合を、Mirrorballによって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図20A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図20B)を示す。半減期延長タンパク質(B)は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して同様の結合を示す。5人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。図20Cは、Molm-13 N1細胞に対して、選択された多重特異性結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、DARPin(登録商標)タンパク質#61、及びDARPin(登録商標)タンパク質#62の腫瘍細胞結合を示す。
図21】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化。汎T細胞及びMOLM-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びに2つの腫瘍特異的結合ドメイン(DARPin(登録商標)タンパク質8)又は1つのみの腫瘍特異的結合ドメイン(DARPin(登録商標)タンパク質23及びDARPin(登録商標)タンパク質24)のいずれかでMOLM-13細胞に結合する選択された組換えタンパク質を示す。DARPin(登録商標)タンパク質8によって誘導されるT細胞活性化はベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質23及びDARPin(登録商標)タンパク質24はより低い効力を示した。1人のドナーからの汎T細胞を使用した代表的なデータを示す。
図22A】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図22A)、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図22B)を示す。(図22A)半減期延長を伴わないタンパク質について、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導される腫瘍細胞殺傷は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質10及びDARPin(登録商標)タンパク質7は、細胞障害性においてより低い効力を示す。(図22B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において4~70倍の減少を示す。5人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。
図22B】短期標的細胞殺傷(LDH)。汎T細胞及びMolm-13細胞を5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での48時間の共培養後の上清中のLDH放出によって評価した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図22A)、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図22B)を示す。(図22A)半減期延長を伴わないタンパク質について、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導される腫瘍細胞殺傷は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質10及びDARPin(登録商標)タンパク質7は、細胞障害性においてより低い効力を示す。(図22B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において4~70倍の減少を示す。5人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。
図23A】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化である。汎T細胞及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図23A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図23B)を示す。(図23A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞活性化は、ベンチマークに匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質10及びDARPin(登録商標)タンパク質7は、より低い効力を示す。(図23B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において4-100倍の減少を示す。7人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。
図23B】活性化マーカCD25によって測定される短期T細胞活性化である。汎T細胞及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での24時間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図23A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図23B)を示す。(図23A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞活性化は、ベンチマークに匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質10及びDARPin(登録商標)タンパク質7は、より低い効力を示す。(図23B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において4-100倍の減少を示す。7人の異なるドナーからの汎T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。
図24A】IFNγ分泌によって測定される短期T細胞活性化。汎T及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートした。示された分子の段階希釈物の存在下で24時間共培養した後、培養上清中のIFNγ分泌をELISAによって分析した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図24A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図24B)を示す。(図24A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質10及びDARPin(登録商標)タンパク質7は、より低い効力を示す。(図24B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において3-20倍の減少を示す。4人の異なるドナーからのPan-T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。
図24B】IFNγ分泌によって測定される短期T細胞活性化。汎T及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートした。示された分子の段階希釈物の存在下で24時間共培養した後、培養上清中のIFNγ分泌をELISAによって分析した。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図24A)又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14(図24B)を示す。(図24A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質10及びDARPin(登録商標)タンパク質7は、より低い効力を示す。(図24B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において3-20倍の減少を示す。4人の異なるドナーからのPan-T細胞を試験し、1人の代表的なドナーをここに示す。(*陰性対照:それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないCD33及びCD123のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質)。
図25】長期腫瘍細胞死滅である。汎T細胞及びMolm-13細胞を、5:1のE:T比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での6日間にわたる共培養で、IncuCyteによって評価した。腫瘍細胞死滅を、アネキシンV染色の曲線下面積と細胞増殖との間の比として計算する。2つのベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14を示す。データは、半減期延長とは無関係に、ほとんどの試験されたタンパク質で、ベンチマーク分子に匹敵する強力かつ特異的な腫瘍細胞死滅を示す。より低い親和性のDARPin(登録商標)タンパク質7のみが、死滅効力の顕著な低下を示す。濃度は、左から右に、ベンチマーク及び試験タンパク質については1/10に希釈した2nMであり、半減期延長分子については1/10に希釈した20nMである。5人の異なるドナーからのPan-T細胞を使用し、1人の代表的なドナーをここに示す。
図26A】長期T細胞活性化である。汎T細胞及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での5日間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14を示す。(図26A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質7及びDARPin(登録商標)タンパク質10は、効力において100倍超の減少を示す。(図26B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において10倍超の減少を示す。2人の異なるドナーからの汎T細胞を使用し、1人の代表的なドナーをここに示す。
図26B】長期T細胞活性化である。汎T細胞及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での5日間の共培養後に、FACSによって評価した。活性化したT細胞を、生存CD8+/CD25+細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14を示す。(図26A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質7及びDARPin(登録商標)タンパク質10は、効力において100倍超の減少を示す。(図26B)半減期延長タンパク質は、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において10倍超の減少を示す。2人の異なるドナーからの汎T細胞を使用し、1人の代表的なドナーをここに示す。
図27A】長期T細胞増殖。汎T細胞及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞増殖を、示された分子の段階希釈物の存在下での5日間の共培養後に、FACSによって評価した。増殖T細胞を、少なくとも1回の細胞分裂を示すCellTrace Violet陽性細胞としてゲーティングした。2つのベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14を示す。(図27A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞増殖は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質7及びDARPin(登録商標)タンパク質10は、効力において100倍超の減少を示す。(図27B)半減期延長DARPinは、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において30倍超の減少を示す。2人の異なるドナーからの汎T細胞を使用し、1人の代表的なドナーをここに示す。
図27B】長期T細胞増殖。汎T細胞及びMolm-13細胞を、1:1のE:T比でインキュベートし、T細胞増殖を、示された分子の段階希釈物の存在下での5日間の共培養後に、FACSによって評価した。増殖T細胞を、少なくとも1回の細胞分裂を示すCellTrace Violet陽性細胞としてゲーティングした。2つのベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長(HLE)を伴わないDARPin(登録商標)タンパク質7、DARPin(登録商標)タンパク質8、DARPin(登録商標)タンパク質9、及びDARPin(登録商標)タンパク質10、又は半減期延長(HLE)を伴うDARPin(登録商標)タンパク質11、DARPin(登録商標)タンパク質12、DARPin(登録商標)タンパク質13、及びDARPin(登録商標)タンパク質14を示す。(図27A)半減期延長を伴わない、DARPin(登録商標)タンパク質8及びDARPin(登録商標)タンパク質9によって誘導されるT細胞増殖は、ベンチマーク分子に匹敵するが、DARPin(登録商標)タンパク質7及びDARPin(登録商標)タンパク質10は、効力において100倍超の減少を示す。(図27B)半減期延長DARPinは、(A)に示される対応する非HLE分子と比較して、効力において30倍超の減少を示す。2人の異なるドナーからの汎T細胞を使用し、1人の代表的なドナーをここに示す。
図28A】IFNγのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図28A)、フロテツズマブ類似物(図28B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図28C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図28D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図28E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図28F)について経時的に示す。0値は示されていない。点線は、定量下限(LLOQ)を表す。全ての値は定量化の上限未満である(ULOQ未満)。
図28B】IFNγのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図28A)、フロテツズマブ類似物(図28B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図28C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図28D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図28E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図28F)について経時的に示す。0値は示されていない。点線は、定量下限(LLOQ)を表す。全ての値は定量化の上限未満である(ULOQ未満)。
図28C】IFNγのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図28A)、フロテツズマブ類似物(図28B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図28C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図28D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図28E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図28F)について経時的に示す。0値は示されていない。点線は、定量下限(LLOQ)を表す。全ての値は定量化の上限未満である(ULOQ未満)。
図28D】IFNγのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図28A)、フロテツズマブ類似物(図28B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図28C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図28D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図28E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図28F)について経時的に示す。0値は示されていない。点線は、定量下限(LLOQ)を表す。全ての値は定量化の上限未満である(ULOQ未満)。
図28E】IFNγのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図28A)、フロテツズマブ類似物(図28B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図28C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図28D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図28E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図28F)について経時的に示す。0値は示されていない。点線は、定量下限(LLOQ)を表す。全ての値は定量化の上限未満である(ULOQ未満)。
図28F】IFNγのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図28A)、フロテツズマブ類似物(図28B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図28C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図28D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図28E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図28F)について経時的に示す。0値は示されていない。点線は、定量下限(LLOQ)を表す。全ての値は定量化の上限未満である(ULOQ未満)。
図29A】TNFαのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図29A)、フロテツズマブ類似物(図図29B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図29C)、DARPin(登録商標)タンパク質8(図29D)、DARPin(登録商標)タンパク質9(図29E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図29F)について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はLLOQを表す。全ての値はULOQ未満である。
図29B】TNFαのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図29A)、フロテツズマブ類似物(図図29B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図29C)、DARPin(登録商標)タンパク質8(図29D)、DARPin(登録商標)タンパク質9(図29E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図29F)について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はLLOQを表す。全ての値はULOQ未満である。
図29C】TNFαのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図29A)、フロテツズマブ類似物(図図29B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図29C)、DARPin(登録商標)タンパク質8(図29D)、DARPin(登録商標)タンパク質9(図29E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図29F)について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はLLOQを表す。全ての値はULOQ未満である。
図29D】TNFαのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図29A)、フロテツズマブ類似物(図図29B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図29C)、DARPin(登録商標)タンパク質8(図29D)、DARPin(登録商標)タンパク質9(図29E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図29F)について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はLLOQを表す。全ての値はULOQ未満である。
図29E】TNFαのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図29A)、フロテツズマブ類似物(図図29B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図29C)、DARPin(登録商標)タンパク質8(図29D)、DARPin(登録商標)タンパク質9(図29E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図29F)について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はLLOQを表す。全ての値はULOQ未満である。
図29F】TNFαのレベル。血漿試料を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、及び48時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。2人のドナーの平均を、AMG330類似物(図29A)、フロテツズマブ類似物(図図29B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図29C)、DARPin(登録商標)タンパク質8(図29D)、DARPin(登録商標)タンパク質9(図29E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図29F)について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はLLOQを表す。全ての値はULOQ未満である。
図30A】T細胞活性化(%CD25陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。%CD25陽性T細胞は、AMG330類似物(図30A)、フロテツズマブ類似物(図30B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図30C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図30D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図30E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図30F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図30B】T細胞活性化(%CD25陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。%CD25陽性T細胞は、AMG330類似物(図30A)、フロテツズマブ類似物(図30B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図30C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図30D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図30E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図30F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図30C】T細胞活性化(%CD25陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。%CD25陽性T細胞は、AMG330類似物(図30A)、フロテツズマブ類似物(図30B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図30C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図30D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図30E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図30F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図30D】T細胞活性化(%CD25陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。%CD25陽性T細胞は、AMG330類似物(図30A)、フロテツズマブ類似物(図30B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図30C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図30D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図30E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図30F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図30E】T細胞活性化(%CD25陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。%CD25陽性T細胞は、AMG330類似物(図30A)、フロテツズマブ類似物(図30B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図30C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図30D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図30E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図30F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図30F】T細胞活性化(%CD25陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。%CD25陽性T細胞は、AMG330類似物(図30A)、フロテツズマブ類似物(図30B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図30C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図30D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図30E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図30F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図31A】T細胞活性化(%CD69陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD69陽性T細胞%は、AMG330類似物(図31A)、フロテツズマブ類似物(図31B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図31C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図31D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図31E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図31F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図31B】T細胞活性化(%CD69陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD69陽性T細胞%は、AMG330類似物(図31A)、フロテツズマブ類似物(図31B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図31C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図31D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図31E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図31F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図31C】T細胞活性化(%CD69陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD69陽性T細胞%は、AMG330類似物(図31A)、フロテツズマブ類似物(図31B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図31C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図31D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図31E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図31F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図31D】T細胞活性化(%CD69陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD69陽性T細胞%は、AMG330類似物(図31A)、フロテツズマブ類似物(図31B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図31C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図31D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図31E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図31F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図31E】T細胞活性化(%CD69陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD69陽性T細胞%は、AMG330類似物(図31A)、フロテツズマブ類似物(図31B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図31C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図31D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図31E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図31F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図31F】T細胞活性化(%CD69陽性細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。CD69陽性T細胞%は、AMG330類似物(図31A)、フロテツズマブ類似物(図31B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図31C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図31D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図31E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図31F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図32A】T細胞生存性(全CD3+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図32A)、フロテツズマブ類似物(図32B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図32C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図32D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図32E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図32F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図32B】T細胞生存性(全CD3+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図32A)、フロテツズマブ類似物(図32B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図32C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図32D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図32E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図32F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図32C】T細胞生存性(全CD3+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図32A)、フロテツズマブ類似物(図32B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図32C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図32D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図32E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図32F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図32D】T細胞生存性(全CD3+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図32A)、フロテツズマブ類似物(図32B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図32C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図32D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図32E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図32F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図32E】T細胞生存性(全CD3+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図32A)、フロテツズマブ類似物(図32B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図32C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図32D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図32E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図32F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図32F】T細胞生存性(全CD3+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図32A)、フロテツズマブ類似物(図32B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図32C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図32D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図32E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図32F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図33A】CD33+細胞生存性(全CD33+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD33+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図33A)、フロテツズマブ類似物(図33B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図33C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図33D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図33E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図33F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図33B】CD33+細胞生存性(全CD33+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD33+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図33A)、フロテツズマブ類似物(図33B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図33C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図33D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図33E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図33F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図33C】CD33+細胞生存性(全CD33+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD33+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図33A)、フロテツズマブ類似物(図33B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図33C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図33D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図33E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図33F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図33D】CD33+細胞生存性(全CD33+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD33+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図33A)、フロテツズマブ類似物(図33B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図33C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図33D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図33E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図33F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図33E】CD33+細胞生存性(全CD33+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD33+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図33A)、フロテツズマブ類似物(図33B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図33C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図33D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図33E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図33F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図33F】CD33+細胞生存性(全CD33+の死細胞%)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD33+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図33A)、フロテツズマブ類似物(図33B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図33C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図33D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図33E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図33F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図34A】CD123+細胞生存性(全CD123+の死細胞%)。血液細胞を、0(0)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD123+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図34A)、フロテツズマブ類似物(図34B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図34C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図34D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図34E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図34F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図34B】CD123+細胞生存性(全CD123+の死細胞%)。血液細胞を、0(0)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD123+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図34A)、フロテツズマブ類似物(図34B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図34C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図34D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図34E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図34F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図34C】CD123+細胞生存性(全CD123+の死細胞%)。血液細胞を、0(0)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD123+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図34A)、フロテツズマブ類似物(図34B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図34C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図34D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図34E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図34F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図34D】CD123+細胞生存性(全CD123+の死細胞%)。血液細胞を、0(0)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD123+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図34A)、フロテツズマブ類似物(図34B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図34C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図34D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図34E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図34F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図34E】CD123+細胞生存性(全CD123+の死細胞%)。血液細胞を、0(0)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD123+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図34A)、フロテツズマブ類似物(図34B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図34C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図34D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図34E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図34F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図34F】CD123+細胞生存性(全CD123+の死細胞%)。血液細胞を、0(0)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性CD123+細胞%(すなわち、死細胞%)は、AMG330類似物(図34A)、フロテツズマブ類似物(図34B)、DARPin(登録商標)タンパク質7(図34C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図34D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図34E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図34F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図35A】T細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図35A)、フロテツズマブ類似物(図35B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図35C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図35D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図35E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図35F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図35B】T細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図35A)、フロテツズマブ類似物(図35B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図35C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図35D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図35E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図35F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図35C】T細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図35A)、フロテツズマブ類似物(図35B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図35C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図35D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図35E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図35F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図35D】T細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図35A)、フロテツズマブ類似物(図35B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図35C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図35D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図35E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図35F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図35E】T細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図35A)、フロテツズマブ類似物(図35B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図35C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図35D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図35E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図35F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図35F】T細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図35A)、フロテツズマブ類似物(図35B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図35C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図35D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図35E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図35F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図36A】CD33+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図36A)、フロテツズマブ類似(図36B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図36C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図36D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図36E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図36F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図36B】CD33+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図36A)、フロテツズマブ類似(図36B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図36C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図36D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図36E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図36F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図36C】CD33+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図36A)、フロテツズマブ類似(図36B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図36C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図36D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図36E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図36F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図36D】CD33+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図36A)、フロテツズマブ類似(図36B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図36C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図36D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図36E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図36F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図36E】CD33+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図36A)、フロテツズマブ類似(図36B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図36C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図36D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図36E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図36F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図36F】CD33+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図36A)、フロテツズマブ類似(図36B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図36C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図36D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図36E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図36F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図37A】CD123+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図37A)、フロテツズマブ類似物(図37B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図37C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図37D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図37E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図37F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図37B】CD123+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図37A)、フロテツズマブ類似物(図37B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図37C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図37D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図37E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図37F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図37C】CD123+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図37A)、フロテツズマブ類似物(図37B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図37C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図37D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図37E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図37F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図37D】CD123+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図37A)、フロテツズマブ類似物(図37B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図37C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図37D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図37E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図37F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図37E】CD123+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図37A)、フロテツズマブ類似物(図37B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図37C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図37D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図37E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図37F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図37F】CD123+細胞の細胞数(10000ビーズ当たりの細胞)。血液細胞を、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間、48時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。10000個のビーズ当たりの細胞数は、AMG330類似物(図37A)、フロテツズマブ類似物(図37B)、DARPin(登録商標)タンパク質#7(図37C)、DARPin(登録商標)タンパク質#8(図37D)、DARPin(登録商標)タンパク質#9(図37E)、及びDARPin(登録商標)タンパク質10(図37F)について2人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。
図38A】CD33標的についてのオン速度(図38A)及びオフ速度(図38B)定数、選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質20、DARPin(登録商標)タンパク質21、及びDARPin(登録商標)タンパク質22について測定。
図38B】CD33標的についてのオン速度(図38A)及びオフ速度(図38B)定数、選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質20、DARPin(登録商標)タンパク質21、及びDARPin(登録商標)タンパク質22について測定。
図39A】CD123標的についてのオン速度(図39A)及びオフ速度(図39B)定数、選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質20、DARPin(登録商標)タンパク質21、及びDARPin(登録商標)タンパク質22について測定。
図39B】CD123標的についてのオン速度(図39A)及びオフ速度(図39B)定数、選択された組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質20、DARPin(登録商標)タンパク質21、及びDARPin(登録商標)タンパク質22について測定。
図40】組換えタンパク質とヒトCD33との相互作用のKD
図41】組換えタンパク質とヒトCD123との相互作用のKD
図42A】腫瘍体積の平均及びSD。
図42B】腫瘍体積の平均及びSD。
図42C】腫瘍体積の平均及びSD。
図43A】単一の腫瘍成長曲線。
図43B】単一の腫瘍成長曲線。
図43C】単一の腫瘍成長曲線。
図43D】単一の腫瘍成長曲線。
図43E】単一の腫瘍成長曲線。
図43F】単一の腫瘍成長曲線。
図43G】単一の腫瘍成長曲線。
図43H】単一の腫瘍成長曲線。
図43I】単一の腫瘍成長曲線。
図43J】単一の腫瘍成長曲線。
図43K】単一の腫瘍成長曲線。
図43L】単一の腫瘍成長曲線。
図44A】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44B】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44C】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44D】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44E】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44F】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44G】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図44H】IFNγのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIFNγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図44A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図44B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図44C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図44D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図44E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図44F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図44G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45A】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45B】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45C】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45D】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45E】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45F】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45G】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図45H】IL-2のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-2の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図45A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図45B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図45C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図45D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図45E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図45F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図45G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図45H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46A】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46B】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46C】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46D】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46E】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46F】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46G】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図46H】IL-6のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-6の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図46A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図46B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図46C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図46D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図46E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図46F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図46G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図46H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47A】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47B】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47C】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47D】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47E】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47F】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47G】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図47H】IL-8のレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのIL-8の平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図47A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図47B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図47C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図47D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図47E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図47F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図47G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図47H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48A】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48B】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48C】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48D】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48E】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48F】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48G】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図48H】TNFαのレベル。血液ループ系における全3人のドナーについてのTNFαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間で血液ループ系から収集した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図48A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図48B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図48C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図48D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図48E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図48F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図48G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図44H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49A】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49B】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49C】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49D】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49E】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49F】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49G】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図49H】血小板数。時間0(ゼロ)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology(H)を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図49A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図49B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図49C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図49D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図49E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図49F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図49G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図49H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50A】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50B】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50C】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50D】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50E】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50F】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50G】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図50H】白血球数。時間0(0)、並びに2、4、8、及び24時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Sysmex XN-L350 Hematology Analyzerを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、3人のドナーの平均(及びエラーバーはSD)を表す。フロテツズマブ(図50A)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(図50B)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(図50C)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(図50D)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(図50E)、DARPin(登録商標)タンパク質#56(図50F)、DARPin(登録商標)タンパク質#61(図50G)、DARPin(登録商標)タンパク質#74(図50H)。計算されたLLOQは点線で示されている。
図51A図51A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51D.Molm13野生型又は様々なTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51E.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#57の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。
図51B図51A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51D.Molm13野生型又は様々なTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51E.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#57の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。
図51C図51A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51D.Molm13野生型又は様々なTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51E.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#57の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。
図51D図51A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51D.Molm13野生型又は様々なTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51E.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#57の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。
図51E図51A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51D.Molm13野生型又は様々なTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の効力滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図51E.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#57の力価滴定曲線(T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。
図52A図52A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330-類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52D.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞に対して、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。
図52B図52A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330-類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52D.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞に対して、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。
図52C図52A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330-類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52D.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞に対して、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。
図52D図52A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330-類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52D.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞に対して、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。
図52E図52A.ヒト培養汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の効力滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52B.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、並びに対応する陰性対照であるDARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、DARPin(登録商標)タンパク質#76、DARPin(登録商標)タンパク質#77の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52C.ヒト汎T細胞と共培養したMolm13腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び既知のベンチマーク対照分子であるAMG330-類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。図52D.Molm13野生型又は種々のTAAノックアウト腫瘍細胞に対して、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。EC50値をpMで示す。
図53A図53A.AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(同種及び自己T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図53B.フロテツズマブ及びAMG330と比較した、AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。
図53B図53A.AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(同種及び自己T細胞活性化)。EC50値をpMで示す。図53B.フロテツズマブ及びAMG330と比較した、AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的とするDARPin(登録商標)タンパク質#56の力価滴定曲線(細胞殺傷)。
図54A図5Aフロテツズマブと比較した、AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的化する選択された多重特異性DARPin(登録商標)タンパク質の力価滴定曲線(T細胞活性化)。図54B.フロテツズマブと比較した、AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的化する選択された多重特異性DARPin(登録商標)タンパク質の力価滴定曲線(腫瘍細胞殺傷)。
図54B図5Aフロテツズマブと比較した、AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的化する選択された多重特異性DARPin(登録商標)タンパク質の力価滴定曲線(T細胞活性化)。図54B.フロテツズマブと比較した、AML患者BMMC腫瘍細胞上の、CD123-CD33-CD70を標的化する選択された多重特異性DARPin(登録商標)タンパク質の力価滴定曲線(腫瘍細胞殺傷)。
図55】デルタMFIとして表される、異なるLSC及びHSC試料にわたる発現中央値。
図56】DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57による、HSC(白抜きの棒)よりもLSC(黒塗りの棒)の優先的な殺傷は、LSCとHSCとの間の治療機会の存在を確認する。
図57A】Molm-13細胞殺傷対IFNγの放出。Molm-13細胞殺傷を黒い四角/曲線で示し、IFNγの濃度を黒い丸/曲線で示す。図57A.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図57B.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図57C.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#59の影響。図57D.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#62の影響。図57E.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図57F.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するAMG330の影響。
図57B】Molm-13細胞殺傷対IFNγの放出。Molm-13細胞殺傷を黒い四角/曲線で示し、IFNγの濃度を黒い丸/曲線で示す。図57A.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図57B.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図57C.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#59の影響。図57D.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#62の影響。図57E.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図57F.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するAMG330の影響。
図57C】Molm-13細胞殺傷対IFNγの放出。Molm-13細胞殺傷を黒い四角/曲線で示し、IFNγの濃度を黒い丸/曲線で示す。図57A.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図57B.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図57C.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#59の影響。図57D.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#62の影響。図57E.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図57F.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するAMG330の影響。
図57D】Molm-13細胞殺傷対IFNγの放出。Molm-13細胞殺傷を黒い四角/曲線で示し、IFNγの濃度を黒い丸/曲線で示す。図57A.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図57B.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図57C.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#59の影響。図57D.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#62の影響。図57E.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図57F.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するAMG330の影響。
図57E】Molm-13細胞殺傷対IFNγの放出。Molm-13細胞殺傷を黒い四角/曲線で示し、IFNγの濃度を黒い丸/曲線で示す。図57A.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図57B.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図57C.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#59の影響。図57D.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#62の影響。図57E.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図57F.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するAMG330の影響。
図57F】Molm-13細胞殺傷対IFNγの放出。Molm-13細胞殺傷を黒い四角/曲線で示し、IFNγの濃度を黒い丸/曲線で示す。図57A.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図57B.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図57C.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#59の影響。図57D.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#62の影響。図57E.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図57F.細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するAMG330の影響。
図58A図58A.hPBMCを腹腔内注射し、hPBMC注射の2日後、MOLM-13腫瘍細胞を皮下異種移植し、PBS 1×(黒丸)、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56(黒四角)、又は0.5mg/kgのAMG330(黒三角)で処置したマウス(ドナー当たりn=5マウス/使用した2匹のhPBMCドナー)における経時的な腫瘍成長。腫瘍細胞異種移植の4日後に処置を開始した。データを平均+SEMで表示する。図58B図58Aに記載されるマウスにおける腫瘍細胞異種移植の17日後の腫瘍体積の評価。
図58B図58A.hPBMCを腹腔内注射し、hPBMC注射の2日後、MOLM-13腫瘍細胞を皮下異種移植し、PBS 1×(黒丸)、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56(黒四角)、又は0.5mg/kgのAMG330(黒三角)で処置したマウス(ドナー当たりn=5マウス/使用した2匹のhPBMCドナー)における経時的な腫瘍成長。腫瘍細胞異種移植の4日後に処置を開始した。データを平均+SEMで表示する。図58B図58Aに記載されるマウスにおける腫瘍細胞異種移植の17日後の腫瘍体積の評価。
図59A】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59B】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59C】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59D】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59E】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59F】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59G】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59H】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59I】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59J】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59K】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図59L】2日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図59A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図59C.細胞死及びIL-2放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。FIG.59D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図59E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図59F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図59G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図59J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59K.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図59L.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60A】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60B】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60C】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60D】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60E】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60F】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60G】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60H】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60I】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60J】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60K】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図60L)】5日間のインキュベーション後の、患者由来AML細胞の自己殺傷対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞死滅は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図60A細胞死及びIFNγ放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60B.細胞死及びTNFα放出に対するflotetuzumabの影響は同様である。図60C殺細胞及びIL-2放出に対するflotetuzumabの同様の影響。FIG.60D.細胞死滅及びIFNγ放出に対するAMG330の影響は同様である。図60E.細胞死滅及びTNFα放出に対するAMG330の影響は同様である。図60F.細胞死滅及びIL-2放出に対するAMG330の影響は同様である。図60G.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60H.細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60I.細胞死滅及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図60J.細胞死滅及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60K。細胞死滅及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図60L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61A】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61B】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61C】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61D】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61E】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61F】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61G】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61H】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61I】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61J】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61K】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図61L】2日間のインキュベーション後の、ヒト汎T細胞の存在下での患者由来AML細胞の自己殺傷(E:T比4:1)対サイトカイン(IFN-g、TNFα、IL-2)の放出。細胞殺傷は、黒四角/曲線によって生存細胞%として示され、黒丸/曲線によってサイトカインの濃度として示される。図61A.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61B.細胞殺傷及びTNFα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61C.細胞殺傷及びIL-2放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図61D.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するAMG330類似物の影響。図61E.細胞殺傷及びTNFα放出に対するAMG330類似物の影響。図61F.細胞殺傷及びIL-2放出に対するAMG330類似物の影響。図61G.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61H.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61I.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#56の影響。図61J.細胞殺傷及びIFNγ放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61K.細胞殺傷及びTNFα放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。図61L.細胞殺傷及びIL-2放出に対するDARPin(登録商標)タンパク質#57の影響。
図62A】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62B】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62C】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62D】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62E】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62F】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62G】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図62H】Molm13細胞を添加した2人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図62A.ドナー1の血液におけるIFN放出;図62B.ドナー2の血液におけるIFN放出;図62C.ドナー1の血液におけるIL-2放出;図62D.ドナー2の血液におけるIL-2放出;図62E.ドナー1の血液におけるIL-6放出;図62F.ドナー2の血液におけるIL-6放出;図62G.ドナー1の血液におけるTNFα放出;図62H.ドナー2の血液におけるTNFα放出。
図63】血清アルブミン、CD70、CD123、CD33、及びCD3へのDARPin(登録商標)タンパク質#56の同時結合のSPRトレース。(a)固定化HSAへのDARPin(登録商標)タンパク質#56の結合。(b)hCD70の、HSA/DARPin(登録商標)タンパク質#56複合体(*/●)への会合、又はPBST注射。(c)HSA/DARPin(登録商標)タンパク質#56/hCD70複合体(*)若しくはHSA/DARPin(登録商標)タンパク質#56複合体(■)へのhCD123の結合、又はPBST注射。(d)HSA/DARPin(登録商標)タンパク質#56/hCD70/hCD123複合体(*)若しくはHSA/DARPin(登録商標)タンパク質#56複合体(▼)へのhCD33の結合、又はPBST注射。(e)HAS/DARPin(登録商標)タンパク質#56/hCD70/hCD123/hCD33複合体(*)若しくはHSA/DARPin(登録商標)タンパク質#56複合体(▲)へのscCD3の結合、又はPBST注射とそれに続く180秒の解離相。注射スキームを表11に記載する。
図64】全ての標的に対してDARPin(登録商標)タンパク質#56の「測定」対「計算」同時結合のSPRトレースの比較。図63(*)から得られた「測定」結合トレース。「計算」トレースは、それぞれ血清アルブミン、CD70、CD123、CD33、又はCD3に結合するDARPin(登録商標)タンパク質#56の個々の単一対照注射SPRトレースを組み合わせることによって生成された。
図65】hPBMCを腹腔内注射し、MOLM-13細胞を皮下に異種移植し、腫瘍細胞注射後8日目に、PBS 1X(ビヒクル)、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#74、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#75、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#57、0.5mg/kgのAMG330類似物、及び0.5mg/kgのフロテツズマブ類似物で処置した、マウス(n=ドナーあたり5匹のマウス/処置に応じて使用したhPBMCドナー2~6匹)における経時的な腫瘍成長。
図66】hPBMCを腹腔内注射し(ドナー当たりn=5匹のマウス/処置に応じて使用した2~6人のhPBMCドナー)、MOLM-13細胞を皮下に異種移植し、PBS 1X(ビヒクル)で処置したマウスにおける経時的な腫瘍成長。腫瘍細胞注射の8日後に、2mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56、0.5mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56、0.2mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56、及び0.02mg/kgのDARPin(登録商標)タンパク質#56。
図67A】処置後の解離したMOLM-13腫瘍における(T細胞活性化マーカCD25及びCD69によって測定される)CD45を発現するヒト免疫細胞(すなわち、CD45+)(図67A)、及び活性化されたヒトT細胞(CD4発現、図67B)、又はCD8発現、図67C)の頻度。活性化したT細胞を、生存CD4+/CD25+/CD69+細胞(図67B)、及び生存CD8+/CD25+/CD69+細胞(図67C)としてゲーティングした。
図67B】処置後の解離したMOLM-13腫瘍における(T細胞活性化マーカCD25及びCD69によって測定される)CD45を発現するヒト免疫細胞(すなわち、CD45+)(図67A)、及び活性化されたヒトT細胞(CD4発現、図67B)、又はCD8発現、図67C)の頻度。活性化したT細胞を、生存CD4+/CD25+/CD69+細胞(図67B)、及び生存CD8+/CD25+/CD69+細胞(図67C)としてゲーティングした。
図67C】処置後の解離したMOLM-13腫瘍における(T細胞活性化マーカCD25及びCD69によって測定される)CD45を発現するヒト免疫細胞(すなわち、CD45+)(図67A)、及び活性化されたヒトT細胞(CD4発現、図67B)、又はCD8発現、図67C)の頻度。活性化したT細胞を、生存CD4+/CD25+/CD69+細胞(図67B)、及び生存CD8+/CD25+/CD69+細胞(図67C)としてゲーティングした。
図68A】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図68A.IFNγのレベル、図68B.IL-6のレベル、図68C.IL-2のレベル、及び図68D.TNFαのレベル。
図68B】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図68A.IFNγのレベル、図68B.IL-6のレベル、図68C.IL-2のレベル、及び図68D.TNFαのレベル。
図68C】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図68A.IFNγのレベル、図68B.IL-6のレベル、図68C.IL-2のレベル、及び図68D.TNFαのレベル。
図68D】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図68A.IFNγのレベル、図68B.IL-6のレベル、図68C.IL-2のレベル、及び図68D.TNFαのレベル。
図69A】処置後のマウス腫瘍環境におけるサイトカイン及びケモカイン放出。図69A.IFNγのレベル;図69B.IL-6のレベル。
図69B】処置後のマウス腫瘍環境におけるサイトカイン及びケモカイン放出。図69A.IFNγのレベル;図69B.IL-6のレベル。
【発明を実施するための形態】
【0057】
本明細書に開示されるのは、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも2つの結合剤とを含む組換えタンパク質であり、当該2つの結合剤は、異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する。
【0058】
より詳細には、CD3、CD33、CD123、及びCD70などの異なる標的に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質が本明細書に開示される。結合タンパク質をコードする核酸、結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を使用する方法も開示される。設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー(国際公開第2002/020565号、Binzら、「Nat.Biotechnol.」、」第22巻第575~582頁、2004年;Stumppら、「Drug Discov.Today」、第13巻、第695~701頁(2008年))は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異性設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を治療するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計アンキリン反復タンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する2つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組合せを含んでもよい(Stumppら、「Drug Discov.Today」、第13巻、695~701、2008年;米国特許第9,458,211号)。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリン反復タンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質(14kDa)である。これらの特徴、及び1つのタンパク質中の2つ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計アンキリン反復タンパク質を、理想的なアゴニスト、拮抗薬及び/又は阻害薬候補にする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクタ機能、例えば、細胞障害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計アンキリン反復タンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。
【0059】
DARPin(登録商標)は、Molecular Partners AG,Switzerlandによって所有される商標である。
【0060】
腫瘍細胞の表面上で発現される分子、例えば、CD33、CD123、及びCD70などは、特に、それらが腫瘍細胞上で発現されるが、健常細胞上では発現されないか、又ははるかに少ない場合、抗癌療法の潜在的な標的である。一例として、CD33、CD123、及びCD70は、AML芽球及び白血病幹細胞の表面上で発現されるが、造血幹細胞を含む健常細胞の表面上では同時に発現されないか、又はほとんど発現されない。
【0061】
一態様では、本発明は、(1)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、及び(2)腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも2つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該2つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する組換えタンパク質を提供する。
【0062】
一態様では、本発明は、(1)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、及び(2)腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも2つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該2つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合し、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質及び当該2つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、組換えタンパク質を提供する。
【0063】
一態様では、本発明は、(1)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、及び(2)腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも3つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該3つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0064】
一態様では、本発明は、(1)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤と、(2)腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも3つの結合剤とを含む組換えタンパク質であって、当該3つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合し、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質及び当該3つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、組換えタンパク質を提供する。
【0065】
一態様では、当該腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において共発現される。一態様では、当該腫瘍細胞は、液性腫瘍由来の腫瘍細胞である。別の態様では、当該腫瘍細胞は、白血病由来の液性腫瘍細胞である。一態様では、当該白血病は、急性骨髄性白血病(AML)である。
【0066】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤のうちの1つのみを含む組換えタンパク質と比較した場合、当該腫瘍関連抗原を提示する表面に、より低い解離定数(KD)で結合することができる。
【0067】
一態様では、本発明は、当該腫瘍関連抗原を提示する当該表面が、当該腫瘍細胞の表面である組換えタンパク質を提供する。
【0068】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、ここで、当該より低い解離定数(KD)は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤のうちの1つのみを含む当該組換えタンパク質の対応する解離定数の少なくとも約2分の1、少なくとも約4分の1、少なくとも約10分の1、少なくとも約20分の1、少なくとも約40分の1、又は少なくとも約100分の1である。
【0069】
一態様では、本発明は、当該免疫細胞がT細胞である、組換えタンパク質を提供する。
【0070】
一態様では、本発明は、当該T細胞がCD8+細胞障害性T細胞である、組換えタンパク質を提供する。
【0071】
一態様では、本発明は、当該免疫細胞の表面上に発現するタンパク質が、当該T細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である、組換えタンパク質を提供する。
【0072】
一態様では、本発明は、T細胞受容体複合体の一部である当該タンパク質がCD3である、組換えタンパク質を提供する。
【0073】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0074】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0075】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0076】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2又は3のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0077】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5、好ましくは配列番号2又は3のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNは、任意選択的にAによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0078】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号2の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号2の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0079】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号2のアミノ酸配列を含み、配列番号2の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号2の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0080】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号3の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号3の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0081】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号3のアミノ酸配列を含み、配列番号3の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号3の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0082】
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤が、(i)第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤、(ii)第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤、及び(iii)第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤からなる群から選択される、組換えタンパク質を提供する。
【0083】
一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤が、(i)第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤、(ii)第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤、及び(iii)第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤からなる群から選択され、当該選択された結合剤がそれぞれの腫瘍関連抗原標的に同時に結合することができる、組換えタンパク質を提供する。
【0084】
一態様では、本発明は、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、当該第2の結合剤が、当該TAA1に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0085】
一態様では、本発明は、当該TAA1がCD33である、組換えタンパク質を提供する。
【0086】
一態様では、本発明は、当該第2の結合剤が、CD33に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0087】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0088】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0089】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号15の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0090】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15のアミノ酸配列を含み、配列番号15の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0091】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み。配列番号67の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号67の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0092】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号67のアミノ酸配列を含み、配列番号67の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号67の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0093】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号68のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号68の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号68の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0094】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号68のアミノ酸配列を含み、配列番号68の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号68の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0095】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号69のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号69の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号69の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0096】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号69のアミノ酸配列を含み、配列番号69の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号70の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0097】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号70の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号70の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0098】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号70のアミノ酸配列を含み、配列番号70の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号70の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0099】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号111のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号111の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号111の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0100】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号111のアミノ酸配列を含み、配列番号111の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号111の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0101】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号112のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0102】
一態様では、本発明は、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含み、配列番号112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0103】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0104】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0105】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0106】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0107】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0108】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、CD33に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0109】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0110】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0111】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0112】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0113】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0114】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0115】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0116】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、CD123に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0117】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0118】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0119】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号6の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0120】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6のアミノ酸配列を含み、配列番号6の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0121】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号65の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号65の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0122】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号65のアミノ酸配列を含み、配列番号65の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号65の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0123】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号66の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号66の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0124】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号66のアミノ酸配列を含み、配列番号66の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号66の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0125】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号102の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号102の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0126】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号102のアミノ酸配列を含み、配列番号102の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号102の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0127】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号103のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号103の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号103の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0128】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号103のアミノ酸配列を含み、配列番号103の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号103の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0129】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号104の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号104の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0130】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号104のアミノ酸配列を含み、配列番号104の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号104の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0131】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号105のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号105の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号105の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0132】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号105のアミノ酸配列を含み、配列番号105の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号105の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0133】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号106のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0134】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含み、配列番号106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0135】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が。抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0136】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0137】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0138】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0139】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0140】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、CD33に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0141】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0142】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0143】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0144】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0145】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号67のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0146】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号67のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0147】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号68のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0148】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号68のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0149】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号69のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0150】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号69のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0151】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号70のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0152】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号70のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0153】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号111のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0154】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号111のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0155】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号112のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0156】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号112のアミノ酸配列を含み、当該第3の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0157】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第3の結合剤が、CD123に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0158】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0159】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0160】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0161】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0162】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号65のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0163】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号65のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0164】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号66のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0165】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号66のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0166】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号102のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0167】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号102のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0168】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号103のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0169】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号103のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0170】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号104のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0171】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号104のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0172】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号105のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0173】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号105のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0174】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号106のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0175】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号106のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0176】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第4の結合剤がCD70に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。
【0177】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0178】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質であって、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含む。
【0179】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0180】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号64のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0181】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号107のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0182】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号107のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0183】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号108のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0184】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号108のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0185】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号109のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0186】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号109のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0187】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号110のアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0188】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第2の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号110のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0189】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質であって、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0190】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0191】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0192】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0193】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0194】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0195】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0196】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0197】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含む。
【0198】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0199】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0200】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0201】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0202】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0203】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0204】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0205】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0206】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0207】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、111~112のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0208】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0209】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該CD33に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0210】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列を含み、配列番号64の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0211】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~108のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0212】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0213】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0214】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0215】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0216】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。
【0217】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0218】
一態様では、本発明は、当該第1の結合剤が、CD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0219】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後目の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0220】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、当該CD33に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含み、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のいずれか1つを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0221】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されており、CD33に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号15、67~70、及び111~112のアミノ酸配列のいずれか1つを含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、CD123に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号6、65~66、及び102~106のアミノ酸配列のいずれかを含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、CD70に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号64及び107~110のアミノ酸配列のうちのいずれか1つを含み、配列番号64及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0222】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、及び第3の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、及び第3の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。
【0223】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、及び第3の結合剤を含み、当該第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第3の結合剤)-(第2の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0224】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第2の結合剤)-(第3の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0225】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第2の結合剤)-(第3の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0226】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び第3の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第3の結合剤)-(第2の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0227】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、及び第4の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、及び第4の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。
【0228】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、及び第4の結合剤を含み、当該第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第4の結合剤)-(第2の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0229】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第2の結合剤)-(第4の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0230】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第2の結合剤)-(第4の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0231】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第4の結合剤)-(第2の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0232】
一態様では、本発明は組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第3、及び第4の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第1、第3、及び第4の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。
【0233】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第3、及び第4の結合剤を含み、当該第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第4の結合剤)-(第3の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0234】
一態様では、本発明は、当該第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第3の結合剤)-(第4の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0235】
一態様では、本発明は、当該第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第3の結合剤)-(第4の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0236】
一態様では、本発明は、当該第1、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第1の結合剤)-(第4の結合剤)-(第3の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0237】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、第3、及び第4の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、第3、及び第4の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。
【0238】
一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第1、第2、第3、及び第4の結合剤を含み、当該第1、第2、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第4の結合剤)-(第3の結合剤)-(第2の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0239】
一態様では、本発明は、当該組換えタンパク質が、当該第1、第2、第3、及び第4の結合剤を含み、当該第1、第2、第3、及び第4の結合剤が、N末端からC末端に、以下の式:(第2の結合剤)-(第3の結合剤)-(第4の結合剤)-(第1の結合剤)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0240】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、第3及び/又は第4の結合剤がペプチドリンカーと共有結合している組換えタンパク質を提供する。
【0241】
一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを含む組換えタンパク質であって、当該ペプチドリンカーがプロリン-トレオニンに富むペプチドリンカーである、組換えタンパク質を提供する。
【0242】
一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを含む組換えタンパク質であって、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が1~50アミノ酸の長さを有する組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを含む組換えタンパク質であって、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が1~30アミノ酸の長さを有する、組換えタンパク質を提供する。
【0243】
一態様では、本発明は、配列番号1、2、3、4、6、15、64~70、及び102~112のいずれか1つの最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1、2、3、4、6、15、64~70、及び102~112のいずれか1つの最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0244】
一態様では、本発明は、当該第1、第2、又は第3のアンキリン反復ドメインのいずれかが、N末端にG、S、又はGSを更に含む組換えタンパク質を提供する。
【0245】
一態様では、本発明は、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号7~10及び58~62のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0246】
一態様では、本発明は、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、配列番号7~10及び58~62のいずれか1つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。
【0247】
一態様では、本発明は、配列番号7のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質は、配列番号7のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0248】
一態様では、本発明は、配列番号8のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号8のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0249】
一態様では、本発明は、配列番号9のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号9のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0250】
一態様では、本発明は、配列番号10のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号10のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0251】
一態様では、本発明は、配列番号58のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号58のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0252】
一態様では、本発明は、配列番号59のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号59のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0253】
一態様では、本発明は、配列番号60のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号60のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0254】
一態様では、本発明は、配列番号61のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号61のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0255】
一態様では、本発明は、配列番号62のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号62のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0256】
一態様では、本発明は、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0257】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、第1の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第2の結合剤、及び第2の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該第1の結合タンパク質が、約10-6M以下、又は約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する、組換えタンパク質を提供する。したがって、一態様では、当該結合タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する。別の態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する。
【0258】
一態様では、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤を含み、当該結合剤が約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。別の態様では、当該組換え結合タンパク質が、CD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1~5の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。したがって、一態様では、当該タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、当該タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤を含み、当該結合剤が約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つのアミノ酸配列の配列番号を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。
【0259】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、第1の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第2の結合剤、第2の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第3の結合剤、及び第3の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第4の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該結合タンパク質が、約10-6M以下、又は約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する。したがって、一態様では、当該結合タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する。別の態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合する。
【0260】
一態様では、当該組換え結合タンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤を含み、当該結合剤は、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。別の態様では、当該組換え結合タンパク質が、CD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該結合タンパク質は、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。したがって、一態様では、当該タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、当該タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一態様では、当該結合タンパク質が、約5×10-7M未満の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つのアミノ酸配列を有する。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤を含み、当該結合剤が約5×10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号1~5のいずれか1つの配列番号のアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。1つの態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約10-7M以下、又は約10-8M以下、又は約10×10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合する組換えタンパク質を提供する。
【0261】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0262】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0263】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-8M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0264】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0265】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-10M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0266】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約10-7M以下、又は約10-8M以下、又は約10-9M以下、又は約10-10M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0267】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤が、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0268】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤が、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0269】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-8M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤が、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0270】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤が、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0271】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-10M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤が、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0272】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約10-7M以下、又は約10-8M以下、又は約10-9M以下、又は約10-10M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0273】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤が、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0274】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該タンパク質が、約10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤が、配列番号64、及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64、及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0275】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-8M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤が、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0276】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該タンパク質が、約10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤が、配列番号64、及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0277】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該タンパク質が、約10-10M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号64、及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64、及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0278】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約10-7M以下、又は約10-8M以下、又は約10×10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0279】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤が、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号16、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0280】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤は、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0281】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-8M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤は、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0282】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10×10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤は、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されているに従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。
【0283】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10×10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に結合し、当該第2の結合剤は、配列番号15、67~70、及び111~112のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号15、67~70、及び111~112の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号15、67~70、及び111~112の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0284】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約10-7M以下、又は約10-8M以下、又は約10×10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0285】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤は、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0286】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤は、配列番号6、65~66及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0287】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-8M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤は、配列番号6、65~66、及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0288】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10×10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に結合し、当該第3の結合剤は、配列番号6、65~66及び102~106のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号6、65~66、及び102~106の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号6、65~66、及び102~106の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0289】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-6M以下、又は約10-7M以下、又は約10-8M以下、又は約10-9M以下、又は約10-10Mの解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0290】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤が、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0291】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤は、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0292】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約10-8M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤は、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64、及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0293】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約10-9M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤は、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64、及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64、及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0294】
一態様では、本発明は、CD3に対して結合特異性を有する第1の結合剤、CD33に対して結合特異性を有する第2の結合剤、CD123に対して結合特異性を有する第3の結合剤、及びCD70に対して結合特異性を有する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約10-10M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に結合し、当該第4の結合剤は、配列番号64及び107~110のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号64及び107~110の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号64及び107~110の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0295】
本発明の組換え結合タンパク質の解離定数(KD)の、表面プラズモン共鳴(SPR)分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例4に説明されている。したがって、一態様では、本発明の組換え結合タンパク質のCD3、CD33、CD123、又はCD70に対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴(SPR)によってPBS中で決定される。一態様では、本発明の組換え結合タンパク質の当該結合特異性は、実施例3に記載のように、表面プラズモン共鳴(SPR)によってPBS中で決定される。
【0296】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、第1の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第2の結合剤、第2の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第3の結合剤、及び/又は第3の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第4の結合抗原を含み、10nM未満のEC50でヒトCD3に結合する組換えタンパク質を提供する。
【0297】
一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤、第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤、並びに第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤及び/又は第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が約1~約400nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合し、好ましくは当該タンパク質が約1~約10nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合する、組換えタンパク質を提供する。
【0298】
Mirrorballレーザー走査イメージングサイトメトリーを使用することによる、CD3に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質のT細胞上でのCD3結合(EC50)の典型的かつ好ましい決定は、(初代ヒトT細胞を用いて)実施例4に記載されている。したがって、一態様では、本発明の組換え結合タンパク質の当該CD3結合(EC50)は、実施例4に記載されるように、Mirrorballレーザー走査イメージングサイトメトリーによって初代ヒトT細胞上で決定される。
【0299】
一態様では、当該組換えタンパク質が、CD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質が、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該結合タンパク質が、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号1~4の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~4の最後の位置のAは、任意選択的にNによって置換されており、又は配列番号5の最後から2番目の位置のLが、任意選択的にAによって置換されており、及び/又は配列番号5の最後の位置のNが、任意選択的にAによって置換されている。したがって、一態様では、当該タンパク質が、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5と少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質は、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも90%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、当該タンパク質は、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも93%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる態様では、当該タンパク質は、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも95%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質は、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれか1つと少なくとも98%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一態様では、当該タンパク質は、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号1~5のいずれかのアミノ酸配列を含む。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質は、CD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該タンパク質が、約1~約10nMの範囲のEC50でT細胞上のヒトCD3に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号1~5のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、配列番号1~5の最後から2番目の位置のAが、任意選択的にLによって置換されており、及び/又は配列番号1~5の最後の位置のAが、任意選択的にNによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。
【0300】
一態様では、本発明は、(i)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤と、(ii)第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤、第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤、及び/又は第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤とを含み、半減期延長部分を更に含む組換えタンパク質を提供する。したがって、一態様では、当該タンパク質は、半減期延長部分を更に含み、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する結合剤である。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する当該結合剤が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
【0301】
一態様では、本発明は、(i)免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第1の結合剤であって、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメイン、好ましくはCD3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである第1の結合剤、(ii)第1の腫瘍関連抗原(TAA1)に特異的に結合する第2の結合剤であって、当該TAA1に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはTAA1がCD33である第2の結合剤、第2の腫瘍関連抗原(TAA2)に特異的に結合する第3の結合剤であって、当該TAA2に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはTAA2がCD123である第3の結合剤、及び/又は第3の腫瘍関連抗原(TAA3)に特異的に結合する第4の結合剤であって、当該TAA3に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはTAA3がCD70である第4の結合剤、を含む組換えタンパク質であって、当該組換えタンパク質が、半減期延長部分を更に含む、組換えタンパク質を提供する。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質が、半減期延長部分を更に含み、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する結合剤である。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する当該結合剤が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列と少なくとも85%同一、例えば、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号34~36のいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
【0302】
一態様では、本発明は、配列番号11~14、78~86及び95~101のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号11~14、78~86及び95~101のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0303】
一態様では、本発明は、配列番号11~14、78~86、及び95~101のアミノ酸配列のいずれか1つと少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、配列番号11~14、78~86、及び95~101のいずれか1つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。
【0304】
一態様では、本発明は、配列番号11のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号11のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0305】
一態様では、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号12のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0306】
一態様では、本発明は、配列番号13のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号13のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0307】
一態様では、本発明は、配列番号14のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号14のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0308】
一態様では、本発明は、配列番号78のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号78のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0309】
一態様では、本発明は、配列番号79のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。好ましくは、当該タンパク質が、配列番号79のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0310】
一態様では、本発明は、配列番号80のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号80のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0311】
一態様では、本発明は、配列番号81のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号81のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0312】
一態様では、本発明は、配列番号82のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号82のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0313】
一態様では、本発明は、配列番号83のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号83のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0314】
一態様では、本発明は、配列番号84のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号84のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0315】
一態様では、本発明は、配列番号85のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号85のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0316】
一態様では、本発明は、配列番号86のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号86のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0317】
一態様では、本発明は、配列番号95のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号95のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0318】
一態様では、本発明は、第1のアンキリン反復ドメイン、第2のアンキリン反復ドメイン、第3のアンキリン反復ドメイン、第4のアンキリン反復ドメイン、第5のアンキリン反復ドメイン、及び第6のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、当該第1のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第2のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第3のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に特異的に結合し、当該第4のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に特異的に結合し、当該第5のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に特異的に結合し、当該第6のアンキリン反復ドメインが、10-6M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に特異的に結合し、当該第1、第2、第3、第4、第5及び第6のアンキリン反復ドメインが、N末端からC末端に、以下の式:(第1のアンキリン反復ドメイン)-(第2のアンキリン反復ドメイン)-(第3のアンキリン反復ドメイン)-(第4のアンキリン反復ドメイン)-(第5のアンキリン反復ドメイン)-(第6のアンキリン反復ドメイン)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。一態様では、当該第1、第2、第3、第4、第5及び第6のアンキリン反復ドメインのそれぞれは、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)で、PBS中の標的(上記で列挙した通り)に特異的に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、1~400nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、1nM以下のEC50でMolm-13腫瘍細胞に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、CD3、CD33、CD123、及びCD70に同時に結合することができる。一実施形態では、本発明の組換えタンパク質が、配列番号95のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号95のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、そのN末端に、G、S、又はGS、好ましくはGSを更に含む。
【0319】
一態様では、本発明は、配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号96のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0320】
一態様では、本発明は、配列番号97のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。好ましくは、当該タンパク質が、配列番号97のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0321】
一態様では、本発明は、配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号98のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0322】
一態様では、本発明は、配列番号99のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号99のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0323】
一態様では、本発明は、配列番号100のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号100のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0324】
一態様では、本発明は、第1のアンキリン反復ドメイン、第2のアンキリン反復ドメイン、第3のアンキリン反復ドメイン、第4のアンキリン反復ドメイン、第5のアンキリン反復ドメイン、及び第6のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、当該第1のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第2のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第3のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に特異的に結合し、当該第4のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に特異的に結合し、当該第5のアンキリン反復ドメインが、10-7M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に特異的に結合し、当該第6のアンキリン反復ドメインが、10-6M,以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に特異的に結合し、当該第1、第2、第3、第4、第5及び第6のアンキリン反復ドメインが、N末端からC末端に、以下の式:(第1のアンキリン反復ドメイン)-(第2のアンキリン反復ドメイン)-(第5のアンキリン反復ドメイン)-(第4のアンキリン反復ドメイン)-(第3のアンキリン反復ドメイン)-(第6のアンキリン反復ドメイン)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。一実施形態では、当該第1、第2、第3、第4、第5、及び第6のアンキリン反復ドメインの各々は、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)で、PBS中の標的(上記で列挙した通り)に特異的に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、1~400nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、1nM以下のEC50でMolm-13腫瘍細胞に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、CD3、CD33、CD123及びCD70に同時に結合することができる。一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号96のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号97のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号98のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質が、配列番号99のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質が、配列番号100のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号96のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号97のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号98のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号99のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号100のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、そのN末端に、G、S、又はGS、好ましくはGSを更に含む。
【0325】
一態様では、本発明は、配列番号101のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、又は少なくとも約99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号101のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。
【0326】
一態様では、本発明は、第1のアンキリン反復ドメイン、第2のアンキリン反復ドメイン、第3のアンキリン反復ドメイン、第4のアンキリン反復ドメイン、第5のアンキリン反復ドメイン、及び第6のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、当該第1のアンキリン反復ドメインが、10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第2のアンキリン反復ドメインが、10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第3のアンキリン反復ドメインが、10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD33に特異的に結合し、当該第4のアンキリン反復ドメインが、10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD123に特異的に結合し、当該第5のアンキリン反復ドメインが、10-7M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD70に特異的に結合し、当該第6のアンキリン反復ドメインが、10-6M以下の解離定数(KD)でPBS中のヒトCD3に特異的に結合し、当該第1、第2、第3、第4、第5及び第6のアンキリン反復ドメインが、N末端からC末端に、以下の式:(第1のアンキリン反復ドメイン)-(第2のアンキリン反復ドメイン)-(第5のアンキリン反復ドメイン)-(第3のアンキリン反復ドメイン)-(第4のアンキリン反復ドメイン)-(第6のアンキリン反復ドメイン)に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。一態様では、当該第1、第2、第3、第4、第5、及び第6のアンキリン反復ドメインの各々は、10-6M~10-12Mの解離定数(KD)で、PBS中の標的(上記で列挙した通り)に特異的に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、1~400nMの範囲のEC50でヒトCD3に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、1nM以下のEC50でMolm-13腫瘍細胞に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、CD3、CD33、CD123、及びCD70に同時に結合することができる。特定の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列と少なくとも80%同一、例えば、少なくとも約81%、少なくとも約82%、少なくとも約83%、少なくとも約84%、少なくとも約85%、少なくとも約86%、少なくとも約87%、少なくとも約88%、少なくとも約89%、少なくとも約90%、少なくとも約91%、少なくとも約92%、少なくとも約93%、少なくとも約94%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約も97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号101のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、そのN末端に、G、S、又はGS、好ましくはGSを更に含む。
【0327】
本明細書中に開示される組換え結合タンパク質の反復ドメイン、好ましくはアンキリン反復ドメインは、好ましくは、N末端及び/又はC末端キャッピングモジュール(以降、キャッピング反復又はキャッピング単位とも称される)を含む。キャッピングモジュールはアンキリン反復ドメインのN末端及び/又はC末端に位置し、典型的には、アンキリン反復モジュールとの間に密な三次相互作用(すなわち、三次構造相互作用)を形成し、それによって、アンキリン反復ドメインの疎水性コアを溶媒への曝露から側方で遮蔽するキャップを提供する。N末端及び/又はC末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第2002/020565号及び同第2012/069655号、米国特許出願公開第2013/0296221、並びにInterlandiら、J Mol Biol.2008 Jan 18;375(3):837-54に記載されている。N末端キャッピングモジュール(すなわち、N末端キャッピング反復)の例は、配列番号16~22であり、C末端キャッピングモジュール(すなわち、C末端キャッピング反復)の例は、配列番号23-23である。
【0328】
例示的な態様では、N末端キャッピングモジュールは、配列番号16~21のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、配列番号16~21のいずれか1つの最大9、最大8、最大7、最大6、最大5、最大4、最大3、最大2、又は最大1個のアミノ酸が、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。
【0329】
例示的な態様では、C末端キャッピングモジュールは、配列番号23~31のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、配列番号23~31のいずれか1つの最大9、最大8、最大7、最大6、最大5、最大4、最大3、最大2、又は最大1個のアミノ酸は、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。
【0330】
有利には、いくつかの態様では、本明細書の設計アンキリン反復ドメインのN末端キャッピングモジュール及び/又はC末端キャッピングモジュール中のある特定のアミノ酸残基を変化させることにより、設計アンキリン反復ドメインの、及び設計アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質の終末相半減期の長期化を含む、薬物動態特性の改善が得られることが発見された。変化したアミノ酸残基は、ほとんど表面に露出した残基である。好ましくは、変更されたアミノ酸残基は、N末端キャッピングモジュールの8位及び15位におけるアミノ酸残基であり、8位におけるアミノ酸はQであり、15位におけるアミノ酸はLであり、位置番号は、配列番号16の位置、並びにC末端キャッピングモジュールの14位及び18位におけるアミノ酸残基に対応し、14位のアミノ酸はRであり、18位のアミノ酸はQであり、位置番号は配列番号16の位置に対応する。
【0331】
例えば、変化されたアミノ酸残基を有するN末端キャッピングモジュールは、以下の配列:DLGxxLLQAAxxGQLDxVRxLxxxGADVNA(配列番号22)を含むことができ、「x」は、任意のアミノ酸を示す。
【0332】
例えば、変化されたアミノ酸残基を有するC末端キャッピングモジュールは、以下の配列:xDxxGxTPADxAARxGHQxIAxVLQxAA(配列番号32)を含むことができ、「x」は、任意のアミノ酸を示す。
【0333】
したがって、一態様では、本発明のCD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号22のアミノ酸配列を有するN末端キャッピングモジュールを含み、「x」は、任意のアミノ酸を示す。代替的又は追加的に、本発明のCD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号32のアミノ酸配列を有するC末端キャッピングモジュールを含んでもよく、「x」は、任意のアミノ酸を示す。
【0334】
更に、本発明の結合ドメインは、任意選択的に、そのN末端に「G」、「S」、又は「GS」配列を更に含んでもよい。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供される結合タンパク質は、(i)配列番号1~6、15、及び64~70のいずれか1つと少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、少なくとも84%、少なくとも85%、少なくとも86%、少なくとも87%、少なくとも88%、少なくとも89%、少なくとも90%、少なくとも91%、少なくとも92%、少なくとも93%、少なくとも94%、少なくとも95%、少なくとも96%、少なくとも97%、少なくとも98%、少なくとも99%、又は100%同一であるアミノ酸配列を含み、(ii)そのN末端でG、S、又はGSを更に含む。例示的な態様では、結合タンパク質は、配列番号1~6、15、及び64~70のいずれか1つと少なくとも90%同一であるアミノ酸配列を含み、そのN末端でG、S、又はGSを更に含む。例示的な態様では、当該結合タンパク質は、配列番号1~6、15、及び64~70のいずれか1つと少なくとも95%同一であるアミノ酸配列を含み、そのN末端でG、S、又はGSを更に含む。例示的な態様では、当該結合タンパク質は、配列番号1~6、15、及び64~70のいずれか1つのアミノ酸配列を含み、そのN末端でG、S、又はGSを更に含む。
【0335】
一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグは、ポリペプチド/タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド/タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であり、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド/タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、当該アミノ酸配列はエフェクタ機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカーを介して接続してもよい。ポリペプチドタグは技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Hisタグ、HAタグ、mycタグ、FLAGタグ、若しくはStrepタグ、又は酵素(例えばアルカリホスファターゼ)等のポリペプチドであり、これらにより、当該ポリペプチド/タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド(免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等)及び/若しくはエフェクタ分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。
【0336】
一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーは、例えば、2つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、又はタンパク質ドメインと生物学的活性分子、タンパク質ドメインとローカライザ、又は2つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願公開第WO2002/020565号の明細書に提供されている。一態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、1~50アミノ酸の長さを有する。別の態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、1~30アミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーの具体例は、グリシン-セリン-リンカー及び可変長のプロリン-トレオニンに富むリンカーである。グリシン-セリン-リンカーの例は、アミノ酸配列GS及び配列番号63のアミノ酸配列であり、プロリン-トレオニンに富むリンカーの例は、配列番号37のアミノ酸配列である。
【0337】
本発明の文脈において、プロリン-トレオニンに富むリンカーは、そのアミノ酸配列中に少なくとも20%のプロリン残基及び少なくとも20%のトレオニン残基を含む。
【0338】
別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号7~10及び58~62からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号7のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号8のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号9のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号10のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号58のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号59のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号60のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号61のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号62のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で生産するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号52~55及び90~94によって提供され、これは、それぞれ、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列をコードする。
【0339】
別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号11~14、78~86、及び95~101からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号11のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号12のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号13のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号14のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号78のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号79のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号80のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号81のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号82のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号83のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号84のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号85のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号86のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号95のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号95のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号118の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号96のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号96のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号119の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号97のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号97のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号120の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号98のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号98のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号121の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号99のアミノ酸配列をコードする拡散に関する。一実施形態では、配列番号99のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号122の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号100のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号100のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号123の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号101のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号101のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号124の核酸である。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で産生するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号118~124によって提供され、これは、それぞれ、配列番号95~101のアミノ酸配列をコードする。
【0340】
一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び/若しくは設計アンキリン反復ドメイン、及び/又は本発明の組換え結合タンパク質及び/若しくは設計アンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び/若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
【0341】
一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び/若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。
【0342】
薬学的に許容される担体及び/又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。
【0343】
医薬組成物は、本明細書に記載のような組換え結合タンパク質、及び/又は設計アンキリン反復ドメイン、及び/又は核酸、好ましくは、組換え結合タンパク質及び/又は核酸、及び例えば「Remington’s Pharmaceutical Sciences」、第16版、Osol,A.Ed.(1980年)に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を含む。
【0344】
当業者に既知の、好適な担体、希釈剤、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、5%デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。インビボ投与に使用される組成物は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。
【0345】
本発明の一態様は、医薬組成物を製造するための、CD3に対して結合特異性を有する第1のアンキリン反復ドメイン、TAA1、好ましくはCD33に対して結合特異性を有する第2のアンキリン反復ドメイン、TAA2、好ましくはCD123に対して結合特異性を有する第3のアンキリン反復ドメイン、及び/又はTAA3、好ましくはCD70に対して結合特異性を有する第4の反復ドメインを含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む本発明の組換えタンパク質の使用であって、当該組換えタンパク質が、当該第1、第2、及び第3のアンキリン反復ドメインを含むが、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインを含まない対応する組換えタンパク質と比較して、終末相半減期の増加、好ましくは少なくとも約5%、好ましくは少なくとも約10%、約15%、約20%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約100%、約150%、約200%又は約250%の終末相半減期の増加を示す、使用に関する。
【0346】
一態様では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも1つの組換えタンパク質、並びに非イオン性洗剤などの洗剤、リン酸塩緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一態様では、そのような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びPBSを含む。
【0347】
別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるT細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
【0348】
別の態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
【0349】
別の態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の組換えタンパク質、当該結合タンパク質をコードする核酸、又は当該結合タンパク質を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。
【0350】
一態様では、本発明は、疾患の治療において使用するための、本発明による医薬組成物、組換えタンパク質、又は核酸に関する。その目的のため、本発明による医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。親的(parental)投与において、本発明の医薬組成物は、上で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。
【0351】
更に、上述の医薬組成物、核酸又は組換えタンパク質のいずれかは、障害の治療における使用のためのものとみなされる。
【0352】
一態様では、本明細書に記載の当該組換え結合タンパク質又はそのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途のため、組換えタンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注射として又は緩徐な点滴注射により、治療有効量で注射することができる。
【0353】
一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品としての、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品を製造するための、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品の製造のためのプロセスであって、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物が、医薬品の有効成分である、プロセスに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を使用する、疾患の治療方法に関する。
【0354】
一態様では、本発明は更に、それを必要とする対象の医学的状態を治療するためのそのような組換えタンパク質の使用を提供する。
【0355】
本明細書で使用される場合、当該医学的状態又は疾患は、癌、好ましくは液性腫瘍、より好ましくは白血病、更により好ましくは急性骨髄性白血病(AML)である。
【0356】
本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用はまた、当技術分野において既知の1つ以上の他の療法との併用とすることができる。用語「~との併用」は、本明細書で使用する場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる(例えば、化合物Aを1回投与し、かつ化合物Bをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ2つのうちの1つを後の段階でまた投与する)。
【0357】
一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含む、キットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、及び/又は本発明の核酸、及び/又は本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットであって、配列番号7~10及び58~62のいずれか1つを含む組換えタンパク質、及び/又は配列番号52~55及び90~94のいずれか1つを含む組換えタンパク質をコードする核酸、及び/又は配列番号7~10及び58~62のいずれか1つを含む組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列のいずれか1つを含む組換えタンパク質、及び/又は当該組換えタンパク質をコードする核酸、及び/又は組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。
【0358】
一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、及び/又は本発明の核酸、及び/又は本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットであって、配列番号11~14、78~82、及び95~101のいずれか1つを含む組換えタンパク質、及び/又は配列番号118~124のいずれか1つを含む組換えタンパク質をコードする核酸、及び/又は11~14、78~82、及び95~101のいずれか1つを含む組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、配列番号11~14、78~82、及び95~101のアミノ酸配列のいずれか1つを含む組換えタンパク質、及び/又は当該組換えタンパク質をコードする核酸、及び/又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。
【0359】
一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を産生するための方法に関する。一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号7~10及び58~62のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生するための方法であって、(i)当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞(例えば、細菌中)で発現させる工程と、(ii)当該組換え結合タンパク質を(例えば、クロマトグラフィーを使用して)精製する工程と、を含む、方法に関する。当該方法は追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例1に記載される。
【0360】
一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を産生するための方法に関する。一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号11~14、78~82、及び95~101のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生するための方法であって、(i)当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞(例えば、細菌中)で発現させる工程と、(ii)当該組換え結合タンパク質を精製する(例えば、クロマトグラフィーを使用して)工程と、を含む、方法に関する。当該方法は追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例1に記載される。
【0361】
本明細書に記載されるアミノ酸配列の全ては、1つ以上のアミノ酸によって置換され得る。いくつかの態様では、最大15、最大14、最大13、最大12、最大11、最大10、最大9、最大8、最大7、最大6、最大5、最大4、最大3、最大2、又は最大1個の置換が、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかにおいて行われる。
【0362】
いくつかの態様では、アミノ酸置換(複数可)は全て、フレームワーク位置で行われる。いくつかの態様では、アミノ酸置換(複数可)は全て、非無作為化位置で行われる。設計アンキリン反復ドメインにおける無作為化位置の場所は、例えば、Binz et al.,Nature Biotech.22(5):575-582(2004)に開示されている。
【0363】
いくつかの態様では、結合剤に対して行われるアミノ酸置換(複数可)は、非置換結合剤のKD値と比較して、KD値を約1000倍超、約100倍超、又は約10倍超変化させない。例えば、いくつかの態様では、アミノ酸置換(複数可)は、配列番号7~10及び58~62の配列のいずれかを含む結合剤のKD値と比較して、KD値を約1000倍超、約300倍超、約100倍超、約50倍超、約25倍超、約10倍超、又は約5倍超変化させない。
【0364】
特定の態様では、結合部分におけるアミノ酸置換は、以下の表1による保存的置換である。
【0365】
【表1】
【0366】
結合剤が、アンキリン反復ドメインである場合、いくつかの態様では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われ得る。他の態様では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われ得る。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列:xDxxGxTPLHLAxxxGxxxlVxVLLxxGADVNA(式中、「x」は任意のアミノ酸(好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない)を示す);又はxDxxGxTPLHLAAxxGHLEIVEVLLKzGADVNA(式中、「x」は任意のアミノ酸(好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない)を示し、「z」はアスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される)を含んでもよい。一態様では、置換は、「x」として指定される残基に対して行われる。別の態様では、置換は、「x」として指定される残基の外側で行われる。
【0367】
本発明は、実施例に記載の特定の態様に制限されない。本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されている多くのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。
【0368】
定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学の技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。
【0369】
用語「含む(comprising)」、「有する」、「含む(including)」、及び「含有/収容する(containing)」は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様で、ある特徴について、「~を含む」と説明されている場合、態様では、その特徴について「~からなる」又は「~から本質的になる」も考えられる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言(例えば、「など」)の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲に制限を課さない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例以外、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語が当業者によって解釈されるように、その用語によって修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の数値の±10%に相当する。
【0370】
本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。
【0371】
本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び/又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が2つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、2つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び/又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。
【0372】
組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えDNA技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えDNA分子(例えば遺伝子合成によって産生される)を細菌発現プラスミド(例えばpQE30、QIAgen)、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするDNAにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌(例えば、大腸菌)に挿入すると、これらの細菌は、この組換えDNAによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。
【0373】
本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、2つ、3つ、4つ、5つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、CD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、CD33に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、及びCD123に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。
【0374】
更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド(例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど)、又は化学修飾(ポリエチレングリコール、毒素(例えば、免疫原からのDM1)、小分子、抗生物質などへのカップリングなど)を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。
【0375】
用語「結合ドメイン」は、標的に対して結合特異性を示すタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。
【0376】
用語「生物学的標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の2つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、T細胞は、CD3特異的結合タンパク質及びローカライザ標的タンパク質の標的であり、細胞及び組織は、ローカライザの標的である。
【0377】
本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち2つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された8個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのS-S架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。
【0378】
特許出願公開第WO2002/020565号及びForrerら、2003(Forrer,P.,Stumpp,M.T.,Binz,H.K.,Pluckthun,A.,2003.「FEBS Letters」第539巻第2~6頁)には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、1つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、又は6つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び/又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。
【0379】
用語「反復ドメイン」は、構造単位として2つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、N末端及び/又はC末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン(国際公開第2002/020565号)、ロイシンリッチ反復ドメイン(国際公開第2002/020565号)、テトラトリコペプチド反復ドメイン(Main,E.R.,Xiong,Y.,Cocco,M.J.,D’Andrea,L.,Regan,L.,Structure 11(5),497~508,2003)、及びアルマジロ反復ドメイン(国際公開第2009/040338号)の例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン(例えば、フィブロネクチンのFN3ドメイン)を形成することができる。
【0380】
用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として2つ以上の連続するアンキリンモジュールを含む反復ドメインを指す。アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えDNA反復技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインと共に、より大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい(例えば、Forrer,P.ら,FEBS letters 539,2-6,2003、国際公開第2002/020565号、国際公開第2016/156596号、国際公開第2018/054971号を参照されたい)。
【0381】
設計された反復タンパク質、設計反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、反復タンパク質を設計し、これらは少なくとも1つの設計アンキリン反復ドメインを含む。好ましくは、設計反復ドメインは、設計アンキリン反復ドメインである。
【0382】
用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。
【0383】
用語「フレームワーク残基」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα-ヘリックス若しくは-シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、X線結晶解析、NMR及び/若しくはCD分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び/若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。
【0384】
用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位に由来する、設計反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの1つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例1に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。
【0385】
したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。設計アンキリン反復タンパク質は、以前に記載されており、例えば、国際公開第2002/020565号、同第2010/060748号、同第2011/135067号、同第2012/069654号、同第2012/069655号、同第2014/001442号、同第2014/191574号、同第2014/083208号、同第2016/156596号、及び同第2018/054971号を参照されたく、これらは全て、その全体が参照により組み込まれる。典型的には、アンキリン反復モジュールは、ループによって分離された2つのアルファヘリックスを形成する約31~33個のアミノ酸残基を含む。
【0386】
反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置(「非ランダム化位置」)及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置(「ランダム化位置」)を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で2つ以上のアミノ酸が許可され、通常の20個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、20個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。
【0387】
用語「反復配列モチーフ」は、1つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。
【0388】
用語「反復単位」は、1つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての当該モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、HEAT反復単位、及びロイシンに富むバリアント反復単位が挙げられる。
【0389】
用語「標的に対して結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に対して特異的な」又は「標的特異性」、又は「特異的に結合する」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質(MBP)などの非関連タンパク質に結合するよりも、PBS中で、標的に、より低い解離定数で結合する(すなわち、より高い親和性で結合する)ことを意味する。好ましくは、標的に対するPBS中での解離定数(「KD」)は、MBPに対する対応する解離定数に対し、少なくとも102分の1、より好ましくは少なくとも103分の1、より好ましくは少なくとも104分の1、又はより好ましくは少なくとも105分の1である。タンパク質-タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴(SPR)に基づく技術(例えば、SPR平衡解析)又は等温滴定熱量測定(ITC)は、当業者に周知である。特定のタンパク質-タンパク質相互作用のKDの測定値は、異なる条件下(例えば、塩濃度、pH)で測定された場合、変動し得る。したがって、KD値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びPBS等の標準化緩衝液を使用して実施される。CD3、CD33、及びCD123に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数(KD)の、表面プラズモン共鳴(SPR)分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例4に説明されている。様々なアッセイ形式を使用して、目的の薬物分子に特異的に結合する結合部分を選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ELISAイムノアッセイ、免疫沈降、BIAcore(商標)(GE Healthcare、Piscataway、NJ)、蛍光活性化細胞選別(FACS)、Octet(商標)(ForteBio,Inc.,Menlo Park,CA)及びウエスタンブロット分析は、標的薬物分子に特異的に結合する結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的結合は、少なくとも2倍のバックグラウンドシグナル又はノイズ、より典型的には10倍超のバックグラウンドシグナルである。より具体的には、結合剤は、平衡解離定数(KD)値が<1μM、例えば、<500nM、<100nM、<10nM、<1nM、<100pM、又は<10pMである場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。
【0390】
「結合剤」という用語は、標的分子に特異的に結合することができる任意の分子を指す。用語「結合剤」は、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド(例えば、Williamsら、「J Biol Chem」、266:5182~5190(1991年))、抗体模擬体、反復タンパク質、例えば、設計アニクリン反復タンパク質、受容体タンパク質、及び標的分子のいずれかの他の天然に存在する相互作用パートナーを含み、天然タンパク質と、例えば、非天然残基を含むように、及び/又は天然残基を欠いているように修飾され若しくは遺伝子操作されたタンパク質とを含むことができる。
【0391】
用語「PBS」は、137mM NaCl、10mMリン酸塩及び2.7mM KClを含み、pHが7.4であるリン酸緩衝水溶液を意味する。
【0392】
本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」又はTAAという用語は、正常細胞上に見出される抗原と構造が質的に異ならない、腫瘍細胞上に見出される抗原を指す。しかし、腫瘍関連抗原は、ほとんどの健常細胞の表面上よりも多くの数で腫瘍細胞の表面上に見出される。腫瘍関連抗原は、腫瘍型に特異的であり得るが、いくつかの腫瘍型においても発現され得る。例えば、TAA MUC1は、結腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、及び膵臓癌と関連付けられている。
【0393】
用語「マウス血清アルブミン」は、UniProt受託番号P07724を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」(すなわちカニクイザル(macaca fascicularis))は、UniProt受託番号A2V9Z4を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はUniProt受託番号P02768を指す。
【0394】
好ましくは、クリアランス、及び/又は曝露、及び/又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び/又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び/又は曝露、及び/又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後48時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、24時間~48時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び/又は曝露、及び/又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大7日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、1日目~5日目で計算する。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す(例えば、マウスでは24時間~48時間で計算し、又はカニクイザルでは1日~5日で計算する)。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは同等の用量(すなわち、同一のmg/kg用量)又は等モル用量(すなわち、同一のmol/kg用量)、より好ましくは等モル投与量(すなわち、同一のmol/kg用量)で行う。当業者であれば、動物での同等及び/又は等モルの投与は、少なくとも約20%、より好ましくは約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、又は約100%の実験的な投与量のばらつきを伴うことを理解する。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、約0.001~約1000mg/kg、より好ましくは約0.01~約100mg/kg、より好ましくは約0.1~約50mg/kg、より好ましくは約0.5~約10mg/kgから選択される。
【0395】
「CD3」又は「分化クラスター3」という用語は、3つの対(εγ、εδ、ζζ)として集合する4つの異なるポリペプチド鎖、イプシロン(ε)、ガンマ(γ)及びゼータ(ζ)から構成される多量体タンパク質複合体を指す。CD3複合体は、T細胞受容体と非共有結合的に会合するT細胞共受容体として機能する。それは、任意の形態のCD3、並びにCD3の活性の少なくとも一部を保持するその変異体、アイソフォーム、及び種相同体を指し得る。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種からCD3に結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒトCD3に完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を示さなくてもよい。ヒトCD3に対する特定の参照によってなど異なる指示がない限り、CD3は、天然配列CD3、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの全ての哺乳動物種を含む。ヒトCD3ガンマ、デルタ及びゼータのアミノ酸配列は、NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov/)参照配列、それぞれNP_000064.1、NP_000723.1、及びNP_932170.1に示されている。
【0396】
本明細書で使用される用語「CD3発現細胞」は、細胞障害性T細胞(CD8+T細胞)及びTヘルパー細胞(CD4+T細胞)などのT細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にCD3(分化クラスター3)を発現するいずれかの細胞を指す。
【0397】
「CD33」という用語は、骨髄細胞表面抗原CD33を指し、これは、細胞間相互作用を媒介し、免疫細胞を静止状態に維持する役割を果たすシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン(Siglec)である。ヒトCD33(hCD33)のアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)参考資料第P20138号に示されている。
【0398】
「CD70」という用語は、CD27のリガンドとして機能するサイトカインであるCD70抗原を指す。CD70-CD27経路は、特に抗ウイルス応答の間、T細胞免疫の生成及び維持において重要な役割を果たす。ヒトCD70(hCD70)のアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)参考資料第P32970号に示されている。
【0399】
「CD123」という用語は、インターロイキン-3受容体サブユニットαを指す。これはインターロイキン-3の受容体である。ヒトCD123(hCD123)のアミノ酸配列は、UniProt(www.uniprot.org)参考資料第P26951号に示されている。
【0400】
用語「T細胞の腫瘍限局性活性化」は、非腫瘍組織と比較して、T細胞が腫瘍組織において優先的に活性化されることを意味する。
【0401】
更に、用語「ペプチド」とはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、2つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、4~600アミノ酸長の長さの各々、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋されたタンパク質と、を包含する。用語「化学的又は生化学的薬剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の自然起源又は合成の化合物を含むことが意図される。好ましい態様では、ローカライザは、標的特異性アンキリン反復ドメインである。
【0402】
「医学的状態」(又は障害又は疾患)という用語には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症(特に増殖性網膜症)、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、腫瘍性疾患の治療のための薬剤の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法に関する。好ましい態様では、当該医学的状態は、腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態(state or condition)を指す。一態様では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一態様では、当該医学的状態は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病である。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。
【0403】
用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及び変異体も意味する。そのようなフラグメント及び変異体もまた、当技術分野において周知であり、インビトロ及びインビボの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Fab、Fab’、F(ab’)2、及び単鎖V領域フラグメント(scFv)などの抗体フラグメント、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、及び非従来型抗体を包含する。
【0404】
用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、1つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発性及び転移性癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、明細胞腎臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌(NSCLC)、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌(SCLC)、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄性白血病(AML)、慢性リンパ性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫(DLBCL)、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫(HL)、マントル細胞リンパ腫(MCL)、多発性骨髄腫(MM)、骨髄異形成症候群(MDS)、非ホジキンリンパ腫(NHL)、頭頸部扁平上皮癌(SCCHN)、慢性骨髄性白血病(CML)、小リンパ球性リンパ腫(SLL)、悪性中皮腫、結腸直腸癌、又は胃癌が挙げられる。
【実施例
【0405】
以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び/又は周知の技術を用いて調製することができる。
【0406】
材料
化学物質はSigma-Aldrich(USA)より購入した。オリゴヌクレオチドはMicrosynth(Switzerland)より購入した。特に明記しない限り、DNAポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、New England Biolabs(USA)又はFermentas/Thermo Fisher Scientific(USA)より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌のXL1-blue(Stratagene、USA)又はBL21(Novagen、USA)などのクローニング及びタンパク質生産に使用した。適切であれば、精製を容易にするため、N末端Hisタグ(例えば、配列番号33)を有するタンパク質が頻繁に産生された。2つのベンチマークT細胞エンゲージャを作製し、実施例に記載される様々な実験において対照として使用した。これらのベンチマークT細胞性エンゲージャは、それぞれAMG330及びフロテツズマブに類似しており、実施例、図の説明、及び図を通して、AMG330又はAMG330類似物、及びフロテツズマブ又はフロテツズマブ類似物と呼ばれる。
【0407】
分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される(例えば、Sambrook J.、Fritsch E.F.、及びManiatis T.、「Molecular Cloning:A Laboratory Manual」、Cold Spring Harbor Laboratory(1989年)、New York参照)。
【0408】
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第7,417,130号;Binzら、「J.Mol.Biol.第332巻第489~503頁、2003年;Binzら(2004年)、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び/又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化N末端キャッピングモジュール(例えば、配列番号16、17、18、19、20、又は21のN末端キャッピングモジュール)、又は配列番号22によるランダム化N末端キャッピングモジュール、及び固定化C末端キャッピングモジュール(例えば、配列番号23、24、25、26、27、28、29、30、若しくは31のC末端キャッピングモジュール)又は配列番号32のランダム化C末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができる。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸C、G、M、N(G残基の前)及びPのいずれも有することがないように組み立てられる。
【0409】
更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域(CDR)ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼLのN末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた(Tanaka,N.、Nakanishi,M、Kusakabe,Y、Goto,Y.、Kitade,Y、Nakamura,K.T.,EMBO J..23(30),3929-3938,2004)。2つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに10個のアミノ酸が挿入される、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの1つ以上のβターンに挿入された可変長(例えば、1~20個のアミノ酸)のランダム化ループ(固定化及びランダム化位置を有する)を含有してもよい。
【0410】
アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなN末端キャッピングモジュールは、好ましくは、RILLAAモチーフ、RILLKAモチーフ、又はRELLKAモチーフを有し(例えば、配列番号1の位置21~26に存在)、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなC末端キャッピングモジュールは、好ましくは、KLNモチーフ、KLAモチーフ、又はKAAモチーフを有する(例えば、配列番号の最後の3つのアミノ酸に存在)。配列番号16、17、18、19、20、又は21は、RILLAA、RILLKA、又はRELLKAモチーフを含むN末端キャッピングモジュールの例を提供し、配列番号23、24、25、26、27、28、29、30、又は31は、KLN、KLA、又はKAAモチーフを含むC末端キャッピングモジュールの例を提供する。
【0411】
そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。タンパク質構造データバンク(Protein Data Bank:PDB)の独自の受託コード又は識別コード(PDB-ID)によって識別される、そのような構造の例は、1WDY、3V31、3V30、3V2X、3V2O、3UXG、3TWQ-3TWX、1N11、1S70、及び2ZGDである。
【0412】
N2C及びN3Cで設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている(米国特許第7,417,130号、Binzら、2003年、上記引用;Binzら、2004年、上記引用)。N2C及びN3Cの数字は、N末端及びC末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。
【0413】
反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Binzら(2004年)の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、1アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Binzら(2004年)の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置1は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置2に対応し、結果として、Binzら(2004年)の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置33は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置1に相当する。
【0414】
全てのDNA配列は配列決定によって確認され、選択されたタンパク質の計算された分子量は質量分析によって確認された。
【0415】
実施例1:CD3、CD33、CD70、又はCD123に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
A.CD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ(Hanes,J.及びPluckthun,A.、「PNAS」第94巻第4937~42頁(1997年))を用いて、ヒトscCD3に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Binzら(2004年)の上記引用による記載と同様のDARPin(登録商標)ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトCD3標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定(Homogeneous Time Resolved Fluorescence:HTRF)によって評価され、数百のヒトscCD3特異的結合タンパク質がうまく選択されたことを示した。例えば、配列番号2のアンキリン反復ドメインは、scCD3に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
【0416】
ヒト組換えCD3標的調製物
選択された標的フォーマットは、26アミノ酸リンカー(scCD3εγ)及び部位指向的ビオチン化のためのC末端Aviタグによって連結されたヒトCD3ε及びCD3γヘテロ二量体からなる単鎖フォーマットに基づく。標的タンパク質は、CD3細胞外ドメインのみを含み、C末端システイン「ノブ」並びに膜貫通領域及び細胞質領域全体を欠く。
【0417】
ヒトscCD3εγの細胞外ドメイン(配列番号38_scCD3εγ_Avi-Bio)を、大腸菌において以前に記載された(Kjer-Nielsenら、PNAS,2004,101(20):7675-7680)のと同様の一本鎖フォーマットで発現させ、続いて封入体からリフォールディングさせ、分取サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)によって精製した。材料を10mMのTris-HCl、50mMのNaCl、pH8.0中で3.4mg/mlに濃縮し、組換えBirAを使用してインビトロでビオチン化した。機能的標的材料を単離するために、OKT3充填カラム(GE HiTrap NHS活性化HPカラム)を用いて材料を再精製した。最終材料はサイズ排除で単量体であり、10mMのTris、100mMのNaCl、pH8.0、10%のグリセロール中0.39mg/mlの最終濃度で保存した。
【0418】
組換えヒトscCD3標的調製プロセスの概要は、Dunstone et al.,Acta Crystallographica 2004に記載されている。
【0419】
リボソームディスプレイによるCD3特異的アンキリン反復タンパク質の選択
CD3特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトCD3の細胞外ドメインの一部(配列番号38)を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ(Hanes及びPluckthun(上記引用))によって実施した(例えば、Zahnd,C.、Amstutz,P.、及びPluckthun,A.、「Nat.Methods」4、69~79(2007年)を参照)。各選択ラウンド後の逆転写(RT)-PCRサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する45から28に一定に減少させた。最初の4ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ(それぞれ、400nM、133nM、45nM及び15nM)、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド1からラウンド4まで選択圧力を増加させる(Binz et al.2004年、上記引用)。ラウンド2~4において、mRNAを、過剰のCD3結合抗体OKT3を使用する競合溶出によって回収した(各ラウンドにおいて、競合物過剰は、35倍から300倍まで一定に増加した)。
【0420】
選択されたクローンは、二価フォーマットでT細胞を活性化する。
CD3標的に結合する個々のアンキリン反復タンパク質クローンを、リボソームディスプレイによって選択し、発現ベクターのpQE30(Qiagen)の誘導体にクローニングし、大腸菌XL1-Blue(Stratagene)に形質転換し、LB寒天(1%のグルコース及び50μg/mlのアンピシリンを含む)上にプレーティングし、次いで、37℃で一晩インキュベートした。発現ベクター、HisタグとMycタグの両方とCD3特異性アンキリン反復ドメインを備えたJunロイシンジッパー構築物を、二価フォーマット(CD3特異性結合ドメインに関して)でのスクリーニングに使用し、T細胞の架橋による機能性の試験を可能にした。単一のコロニーを、160μLの増殖培地(1%グルコース及びアンピシリン50μg/mLを含有するTB)を含有する96ウェルプレート(単一ウェル内の各クローン)中に拾い上げ、37℃で一晩インキュベートし、800rpmで振盪した。アンピシリン50μg/mLを含有する150μLの新鮮なTB培地に、新しい96ウェルプレート中8.5μLの一晩培養物を播種した。37℃及び850rpmで120分間インキュベートした後、発現をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導し、4時間続けた。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、8.5μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(600rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、160μLのPBSを添加し、細胞片を遠心分離によって除去し(3220gで15分間)、更なる使用のためにー20℃で保存した。
【0421】
第1の工程では、BK112 CD8+モノクローナルT細胞を用いてT細胞活性化スクリーニングを行った。各溶解クローンの抽出物を、PBSB(12%(w/v)FBSを補充したPBS pH7.4)中の1:20希釈物(最終濃度)として、抗ペンタHis抗体(Qiagen)コーティング96ウェルプレートに適用し、4℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSで5回洗浄した後、1ウェル当たり100μlの100’000 BK112 T細胞を添加し、T細胞アッセイ培地RPMI-1640+10%のFBS+1%のL-グルタミン+1%のPen Strep+200IU IL2中で培養した。0.1μgの100μLのGolgi Stopを添加し、プレートを室温で3分間、20gで遠心分離した後、CO2-インキュベーター内で、37℃で4~5時間インキュベートした。細胞を4℃で5分間350gで遠心分離し、デカントした。細胞を表面CD8発現について染色した後、BD Cytofixを用いて細胞を保存し、4℃で一晩インキュベートした。細胞を1×PBS+2%のFBSで洗浄し、Cell perm(BD)中の50μlのIFNγ-APC抗体を添加し、4℃で30分間インキュベートすることによって、細胞内IFNγについて染色した。細胞を再びPBSで洗浄し、BDからのCytometer FACS Canto IIを用いて分析した。
【0422】
選択されたクローンは、CD3への結合(HTRF及びOKT3競合によって示される)及び二重特異性フォーマットにおける機能性を示す。
T細胞エンゲージャ(TCE)構築物を作製するために、同定された機能的な設計アンキリン反復ドメインヒットを、N末端Hisタグ、腫瘍関連抗原(TAA)特異性アンキリン反復ドメイン及びCD3特異性アンキリン反復ドメインを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。25mlの静置一晩培養物(TB、1%のグルコース、50μg/mLのアンピシリン;37℃)を使用して、500mLの培養物(TB、50μg/mLのアンピシリン、37℃)に接種した。600nmで1.0~1.5の吸光度において、培養物を0.5mM IPTGで誘導し、振盪しながら37℃で4~5時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、25mLのTBS500(50mMのTris-HCl、500mMのNaCl、pH8)中に再懸濁し、溶解した(超音波処理)。溶解後、試料を50KU DNase/mLと混合し、62.5℃で30分間の熱処理工程の前に15分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Triton X100(1%(v/v)の最終濃度)及びイミダゾール(20mMの最終濃度)をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ni-ニトリロ三酢(Ni-NTA)酸カラム、続いて、AKTAxpress(商標)システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。
【0423】
第1の工程において、組換えタンパク質への結合を、HTRFアッセイを使用して試験した。PBS-TC(0.1%(w/v)のカゼイン及び0.1%のTween20を補充したPBS、pH7.4)中のアンキリン反復タンパク質(5~640nM)の力価測定を、384ウェルプレートのウェル中で、48nM(最終濃度)のヒトビオチン化scCD3εγ、1:100(最終濃度)の抗6 His-D2 HTRF抗体-FRETアクセプタコンジュゲート(Cisbio)及び1:100(最終濃度)の抗strep-Tb抗体FRETドナーコンジュゲート(Cisbio)に対して行い、室温で120分間インキュベートした。340nmの励起波長及び665±10nmの発光フィルタを使用して、Tecan M1000でHTRFを読み取った。いくつかの候補は用量依存的結合を示し、更なる評価のために使用した。全てのこれらの構築物について、結合シグナルは、CD3εの立体構造エピトープに結合する20倍過剰のCD3結合抗体(ヒトFc領域を含有するOKT3変異体、最終濃度2.4mM)と競合した場合にバックグラウンドレベルであった(Kjer-Nielsenら、PNAS、2004,101(20):7675-7680)。用量依存的なインビトロでのT細胞活性化を、TAA1発現腫瘍細胞の存在下で、BK112 T細胞活性化アッセイ(CD3/CD28 Dynabeadsで予め活性化されたBK112 CD8モノクローナルT細胞)を使用して確認した。細胞内IFNyレベルを、1~100’000pMの二重特異性TCE構築物の存在下でのBK112及びSKOV3細胞(E:T=1:10)の5時間のインキュベーション後に、CD8+又はCD4+T細胞上で測定した。最も強力な構築物は、CD4+細胞及びCD8+細胞についてそれぞれ0.5nM及び0.4nMのEC50値を示した。
【0424】
選択されたCD3特異的アンキリン反復タンパク質の親和性成熟及び合理的設計
合理的設計と組み合わせた数ラウンドの親和性成熟を、親の低親和性結合CD3特異的アンキリン反復タンパク質(前駆体Aと称する)に適用し、4つのより高い親和性のCD3特異的アンキリン反復タンパク質(前駆体B、C及びDと称する)を得た。次いで、これらの前駆体分子を、CD3特異性アンキリン反復タンパク質、例えばDARPin(登録商標)タンパク質#2に最終的に操作した。
【0425】
親和性成熟は、Zahnd et al.,Nat Methods,2007,4:269-279に記載されているエラープローンPCR及びDNA Iシャッフリングを使用して多様性を導入することによって、CD3標的への十分な結合能力と、インビトロでのT細胞を効率的に活性化する能力の両方を考慮して選択した、親CD3特異的アンキリン反復タンパク質(前駆体A)の1つに対して実行した。簡単に説明する。3ラウンドのリボソームディスプレイを、増加させた選択圧力(洗浄工程はラウンド1(3×15分)から、3×30分(ラウンド2)まで、3×45分(ラウンド3)まで増加)を用いて、CD3特異性アンキリン反復タンパク質/ラウンド当たり約1~2個の変異を導入するために、異なる濃度のdNTP類似体(5~10μMの8-oxo-dGTP及びdPTPを用いるJena Biosciences製の変異誘発キット)を使用して実施したが、標的濃度は5nMで一定に保った。第2の工程では、DNAプールをDNAシャッフルし、90秒のDNAse Iインキュベーション時間及びDNAポリメラーゼHotStarTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen)を使用し、以前に記載されているように(Cadwell & Joyce、PCR Methods Appl,1992,2:28-33;Stemmer,Nature,1994 370:389-391;Zaccolo et al.,J Mol Biol1996、255:589-603)使用して、1ラウンド又は2ラウンドのリボソームディスプレイで親クローンを使用して戻し交雑した。親和性成熟したCD3特異性アンキリン反復タンパク質プールを、最終的にN末端His-Flagタグ、半減期延長のためのHSA結合アンキリン反復ドメイン、TAA1結合アンキリン反復ドメイン及びCD3特異性アンキリン反復ドメインを含むpQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体にサブクローニングし、発現させ、前述のようにHTRFによって組換えscCD3εγへの結合についてスクリーニングした。リードクローンを選択した(前駆体B、全ての工程において10μMのdNTP類似体を使用する3ラウンドのエラープローンPCR並びに2ラウンドのDNAシャッフリング及び戻し交雑を含む5ラウンドの親和性成熟後に作製した)。
【0426】
同じプロセスにおいて、5位及び20位におけるNキャップ変異、2位及び4位における第1の内部反復変異、2位、5位及び20位における第2の内部反復変異、並びに1位及び18位におけるCキャップ変異を含む、増加したT細胞活性化についてのいくつかの潜在的に有益な変異を、BK112アッセイにおけるIFNγ+T細胞の%によって同定した。熱安定性を維持するためにN及びCキャップフレームワーク変異を最小限に維持しながら、これらの変異の組み合わせは、設計された変異体のセットをもたらし、これを、改善されたT細胞活性化について同じフォーマットで再び試験した。それによって、親及び最初に成熟したものと比較してより高いT細胞活性化効力を有する、新しい更に成熟した変異体(前駆体C)を生成した。
【0427】
CD3親和性及びT細胞活性化効力を更に増加させるために、上記に記載されたものと同様に、前駆体Cクローンに対して第2の親和性成熟を行った。簡単に説明する。4ラウンドのリボソームディスプレイを行った。最初の3ラウンドでは、7.5μMのdNTP類似体を用いたエラープローンPCRによって変異を導入した。ラウンド1及び3では、更に成熟したクローン自体又は競合のための非ビオチン化CD3標的タンパク質のいずれかを使用して、オフレート選択を適用した。1nMの標的をラウンド1及び2で使用し、一方、5nMをあまりストリンジェントでないラウンド3及び4で適用した。HSA結合ドメイン及びTAA1結合アンキリン反復ドメインを含む三重特異性フォーマットにおいて、競合物として更に成熟したクローンの250倍アクセスを用いるオフレートHTRFアッセイを使用して、CD3変異体をスクリーニングした。競合後に最も高い残存HTRFシグナルを有する合計3×96個のクローンを配列決定した。改善された結合(Nキャップ16位、第1の内部反復1、12、18、19、26、30及び33位、第2の内部反復2、3、7、20、21、26、及び32位、並びにCキャップ9、11及び18位を含む)について、又は減少されたドメイン相互作用(Nキャップ11、18、19、26位、及びCキャップ3、19、及び22位を含む)についての同定された有益な変異を、まず、BK112 T細胞活性化について、精製タンパク質変異体の個別又は対になる変異として試験した。次いで、最も有益な変異体を第2の工程において組換え、変異体を最も高いT細胞活性化についてスクリーニングし、これにより、前駆体Dの同定をもたらした。
【0428】
最後の工程では、血清中半減期及び生物理学的特性を改善するために、変異体、例えばDARPin(登録商標)タンパク質#6を、それぞれCD3特異性アンキリン反復タンパク質前駆体A、B、C、及びDに基づいて作製した。それにより、23位及び/又は26位のNキャップ変異を導入し、フレームワーク変異のいくつかを除去した(19位、18位)。
【0429】
ヒトCD3に対して結合特異性を有する親和性成熟アンキリン反復ドメインを、N末端Hisタグ(配列番号33)を提供するpQE(QIAgen、ドイツ)を基にした発現ベクターにクローニングして、以下に説明されるような単純なタンパク質精製を容易にした。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
DARPin(登録商標)タンパク質#1(配列番号1、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合)。
DARPin(登録商標)タンパク質#2(配列番号2、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合)。
DARPin(登録商標)タンパク質#3(配列番号3、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合)。
DARPin(登録商標)タンパク質#4(配列番号4、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合)。
【0430】
CD3特異的アンキリン反復タンパク質の高レベル及び可溶性発現
詳細な分析のために、一価として、又はTAA及び/若しくはHSA結合アンキリン反復ドメインと組み合わせてのいずれかで、特異的なCD3結合を示す選択されたクローンを大腸菌細胞で発現させ、Hisタグを使用して精製し、続いて当業者に公知の標準的なプロトコル及び樹脂に従ってAKTAxpress(商標)システムでサイズ排除クロマトグラフィを行った。一価構築物及び多価構築物について、それぞれ、TBS pH8.0(50mMのTris、500mMのNaCl)又はPBS pH7.4中で10mg/mlに濃縮したとき、タンパク質は単量体であり、可溶性であった。A.そのようなSDS-PAGE分析の代表的な例を、図19に示す。
【0431】
B.CD33に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ(Hanes,J.及びPluckthun,A.、「PNAS」第94巻第4937~42頁(1997年))を用いて、ヒトCD33(hCD33)に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Binzら(2004年)の上記引用による記載と同様のDARPin(登録商標)ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトCD33標的(CD33のECDの全長及びスプライス変異体)への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)によって評価され、数百のhCD33特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号15及び67~70のアンキリン反復ドメインは、hCD33に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
【0432】
リボソームディスプレイによるCD33特異性アンキリン反復タンパク質の選択
hCD33特異性アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトCD33の細胞外ドメイン(配列番号87)を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ(Hanes及びPluckthun(上記引用))によって実施した(例えば、Zahnd,C.、Amstutz,P.、及びPluckthun,A.、「Nat.Methods」第4巻第69~79頁、2007年、参照)。CD33標的(Evitria)は、C末端Fcタグ及びAviタグを含有し、酵素BirA-GSTを使用してビオチン化した。CD33の2つの異なる形態を選択のために使用した。残基18~259を使用することによってCD33の可変ドメイン及び定常ドメインの両方をカバーするCD33の全長ECD、並びに残基120~259を使用することによってCD33の定常ドメインのみをカバーするCD33のスプライス変異体。計4ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド1からラウンド4への選択圧力を増加させた(Binzら、2004年、上記引用)。ビオチン化非CD33 Fcドメインと併せてストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて脱選択戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写(RT)-PCRサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する45から28に一定に減少させた。
【0433】
高親和性CD33特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択(上記)の第4ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した(Zahnd(2007年)上記引用)。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。これら最後の2つの選択ラウンドでは、RT-PCRサイクルの数はそれぞれ30及び35であった。
【0434】
合計3つの異なる選択アプローチが、以下の差異を伴って、上記のように行われた。第1のアプローチでは、全長CD33タンパク質のECDに対してのみ選択を行った。第2のアプローチでは、完全長CD33及びスプライス変異体の標的を各ラウンドで交互にした。第3のアプローチでは、HIM-3-4 CD33結合抗体(BD Pharmingen(商標))を添加することによって、第1のアプローチの条件を使用して競合溶出工程を適用した。各アプローチから、全長CD33及び/又はそのスプライス変異体に対して結合剤を生成した。
【0435】
選択されたクローンは、粗抽出物HTRFによって示されるようにヒト及びカニクイザルCD33に特異的に結合する
溶液中でhCD33に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、pQE30(Qiagen)発現ベクター(pMPAG06)の誘導体にクローニングし、大腸菌のXL1-Blue(Stratagene)に形質転換し、LB-寒天(1%グルコース及び50μg/mlのアンピシリンを含有)上に播種し、次いで、37℃で一晩インキュベートした。160μlの成長培地(1%グルコースと50μg/mlのアンピシリンとを含有するTB)を含有する96ウェルプレートに単一のコロニーを播種し(単一のウェル中に各クローン)、37℃、800rpmで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン50μg/mLを含有する900μLの新鮮なTB培地に、新しい96ディープウェルプレート中50μLの一晩培養物を播種した。37℃及び700rpmで120分間インキュベートした後、発現をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導し、4時間続けた。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、50μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で15分間インキュベートした。次いで、950μLのPBSを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。
【0436】
各溶解したクローンの抽出物を、PBSTB(0.1%Tween20(登録商標)及び0.2%(w/v)BSA、pH7.4を補充したPBS)中で、12nM(最終濃度)ビオチン化hCD33、1:200(最終濃度)の抗strep-D2 HTRF抗体-FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)、及び1:200(最終濃度)の抗6His-Tb抗体FRETドナーコンジュゲート(Cisbio)と一緒に、1:900希釈(最終濃度)として384ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で90分間インキュベートした。340nmの励起波長及び665±10nmの発光フィルタを使用して、Tecan M1000でHTRFを読み取った。そのような粗細胞抽出物HTRFによる数百のクローンのスクリーニングは、hCD33に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。hCD33に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、配列番号15である。
DARPin(登録商標)タンパク質#15(配列番号15)。
【0437】
同様に、溶液中でhCD33に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、C末端CD3結合設計アンキリン反復タンパク質、引き続いてFlagタグを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクター(pMPDV045)の誘導体にクローニングし、大腸菌のXL1-Blue(Stratagene)に形質転換し、LB-寒天(1%グルコース及び50μg/mlのアンピシリンを含有)上に播種し、次いで、37℃で一晩インキュベートした。160μlの成長培地(1%グルコースと50μg/mlのアンピシリンとを含有するTB)を含有する96ウェルプレートに単一のコロニーを播種し(単一のウェル中に各クローン)、37℃、800rpmで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン50μg/mLを含有する150μLの新鮮なTB培地に、新しい96ウェルプレート中8.5μLの一晩培養物を播種した。37℃及び700rpmで120分間インキュベートした後、発現をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導し、4時間続けた。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、8μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、160μLのPBSを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。
【0438】
各溶解したクローンの抽出物を、PBSTB(0.1%Tween20(登録商標)及び0.2%(w/v)BSA、pH7.4を補充したPBS)中で、6nM(最終濃度)ビオチン化hCD33(ECD CD33の全長又はスプライス変異体)、1:400(最終濃度)の抗strep-Tb HTRF抗体-FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)、及び1:400(最終濃度)の抗6His-D2抗体FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)と一緒に、1:1000希釈(最終濃度)として384ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で60分間インキュベートした。340nmの励起波長及び665±10nmの発光フィルタを使用して、Tecan M1000でHTRFを読み取った。そのような粗細胞抽出物HTRFによる数百のクローンのスクリーニングは、hCD33に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。hCD33に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、
配列番号68はDARPin(登録商標)タンパク質#37であり、配列番号69はDARPin(登録商標)タンパク質#38である。
【0439】
hCD33に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号67~70は、それぞれ配列番号68及び69の配列に基づいて操作される。
【0440】
DARPin(登録商標)タンパク質#37及びDARPin(登録商標)タンパク質#38については、芳香族残基の量を減少させ、表面電荷を変化させるために配列を改変した。両方のN末端キャッピングモジュールにおいて、RILLAAモチーフをRILLKAで置換し、アスパラギン酸(18位)をロイシンで置換した。両方のC末端キャッピングモジュールにおいて、グルタミン酸(18位)をグルタミンで置換した。DARPin(登録商標)タンパク質#12については、N末端キャッピングモジュールにおいて追加のフェニルアラニン(14位)をバリンで置換した。DARPin(登録商標)タンパク質#37については、N末端キャッピングモジュールにおいて追加のトリプトファン(7位)をバリンで置換し、第2の内部反復(18~21位)におけるEDIAモチーフをLEIVで置換した。操作された変異体は、5:1の比で汎T細胞及びMOLM-13細胞を使用して48時間インキュベートした後に標準的なLDH殺傷アッセイにおいて測定された2倍を超えて、親バージョンと比較して、T細胞殺傷(他のTAA及びCD3結合DARPin分子と組み合わせて評価された)を変化させなかった。
【0441】
CD33特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物HTRFで特異的なヒトCD33結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。0.11mlの静置一晩培養物(TB、1%のグルコース、50mg/lのアンピシリン;37℃)を使用して、96ディープウェルプレートで0.99mLの培養物(TB、50mg/lのアンピシリン、37℃)に接種した。37℃(700rpm)で2時間インキュベートした後、培養物を0.5mM IPTGで誘導し、振盪しながら(900rpm)37℃で6時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、DNAase I(200ユニット/ml)及びリゾチーム(0.4mg/ml)を補充した50μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、60μLの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。合計で、8つの個々の発現をプールした後、遠心分離(3,200 g、60分間、4℃)によって細胞破片を除去した。MultiScreenフィルタプレート(Millipore)を用いて上清を濾過した後、96ウェルThermo HisPurコバルトスピンプレートを用いて精製し、96ウェルThermo Zebaスピン脱塩プレートを用いてPBS中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Agilent 1200HPLCシステム上で標準Sephadex 150/5カラムを使用して、PBS中で可溶性及び単量体であった。
【0442】
親和性成熟CD33特異性結合タンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#36(配列番号67)に由来する、DARPin(登録商標)タンパク質#72(配列番号111)及びDARPin(登録商標)タンパク質#73(配列番号112)。
【0443】
最初に同定されたCD33特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び/又はそれからの非常に低いオフ速度を有する新たな変異体が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、1つの最初に同定されたCD33特異性結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#36(「親」結合タンパク質)を、親和性成熟のための適切な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合HTRFによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。単一アミノ酸点突然変異変異体を、単一のNNK縮重コドンを有するプライマーを使用して親プラスミド(pMCHE1190)上で標準的なQuikChange PCRによって生成して、潜在的な結合位置に20個全てのアミノ酸を導入した。タンパク質変異体の粗抽出物(CE)(最後にN末端Hisタグ、続いてCD33特異性結合ドメインを含有する)を、標準大腸菌発現培養物から生成した。希釈したCEをビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の非タグ化親CD33結合タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#36)を添加し、HTRFシグナルを経時的に測定した。親クローンよりも高いHTRFシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。
【0444】
操作されたCD33特異性ヒットを、pQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体である、最後にN末端Hisタグ、続いて配列番号111又は112のCD33特異性結合ドメイン及び配列番号3のC末端CD3結合ドメインを含有する1つのベクター、並びに最後にN末端Hisタグ、続いて配列番号111又は112のCD33特異性結合ドメインを含有する1つのベクターにサブクローニングして、それぞれ、二価(2D)及び一価フォーマット(1D)でタンパク質を発現した。全ての構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。
【0445】
CD123に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ(Hanes,J.及びPluckthun,A.、「PNAS」第94巻、第4937~42頁、1997年)を用いて、ヒトCD123(hCD123)及びカニクイザルCD123(cCD123)に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Binzら(2004年)の上記引用による記載と同様のDARPin(登録商標)ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒト及びカニクイザルCD123標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)によって評価され、数百のhCD123特異性結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号6及び65~66のアンキリン反復ドメインは、hCD123及びcCD123に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
【0446】
リボソームディスプレイによるCD123特異性アンキリン反復タンパク質の選択
hCD123特異性アンキリン反復タンパク質(例えば、配列番号6)の選択は、ヒト(uniprot ID 26951)及びカニクイザル(cyno)CD123(uniprot ID G8F3K3)のビオチン化細胞外ドメインを標的タンパク質として、上述したようなアンキリン反復タンパク質のライブラリー及び確立したプロトコルを用いるリボソームディスプレイによって実行した(例えば、Zahnd,C.、Amstutz,P.、及びPluckthun,A.、「Nat.Methods」4、69~79(2007年)を参照)。全ての標的分子をFcフォーマットで産生した。計4ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド1からラウンド4への選択圧力を増加させた(Binzら、2004年、上記引用)。具体的には、カニクイザル標的をラウンド1、2、及び4で使用し、ヒトCD123をラウンド3で使用した。過剰の非CD123-Fcタンパク質を使用して、第2ラウンドから選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写(RT)-PCRサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する45から31に一定に減少させた。
【0447】
hCD123特異性アンキリン反復タンパク質(配列番号65~66)の選択は、ヒトCD123の細胞外ドメイン(配列番号88)を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ(Hanes及びPluckthun(上記引用))によって実施した(例えば、Zahnd,C.、Amstutz,P.、及びPluckthun,A.、「Nat.Methods」第4巻、第69~79頁、2007年、参照)。CD123標的(Evitria)は、C末端Fcタグ及びAviタグを含有し、酵素BirA-GSTを使用してビオチン化した。計4ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド1からラウンド4への選択圧力を増加させた(Binzら、2004年、上記引用)。ストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写(RT)-PCRサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する45から28に一定に減少させた。
【0448】
高親和性CD123特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択(上記)の第4ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した(Zahnd(2007年)上記引用)。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。ラウンド5及び6では、RT-PCRサイクルの数は、それぞれ30及び35であった。
【0449】
CD123結合T細胞エンゲージャ(特許US9822181B2-7G3エピトープ)を使用する競合溶出工程を適用することによって、又は選択を実行する前にhCD123特異性アンキリン反復タンパク質(抗体7G3とは異なるエピトープを有する)をCD123標的と共インキュベートすることによって、潜在的なエピトープ空間を拡大するために、更なる2つの更なる選択アプローチを(上記のような)標準的なアプローチの次に行った。適用したアプローチのそれぞれから、CD123に対して結合剤を生成した。
【0450】
選択されたクローンは、粗抽出物HTRFによって示されるようにヒトCD123に特異的に結合する
溶液中でhCD123に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、C末端CD3結合設計アンキリン反復タンパク質、引き続いてFlagタグを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクター(pMPDV045)の誘導体にクローニングし、大腸菌のXL1-Blue(Stratagene)に形質転換し、LB-寒天(1%グルコース及び50μg/mlのアンピシリンを含有)上に播種し、次いで、37℃で一晩インキュベートした。160μlの成長培地(1%グルコースと50μg/mlのアンピシリンとを含有するTB)を含有する96ウェルプレートに単一のコロニーを播種し(単一のウェル中に各クローン)、37℃、800rpmで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン50μg/mLを含有する150μLの新鮮なTB培地に、新しい96ウェルプレート中8.5μLの一晩培養物を播種した。37℃及び700rpmで120分間インキュベートした後、発現をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導し、4時間続けた。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、8μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、160μLのPBSを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。
【0451】
各溶解したクローンの抽出物を、PBSTB(0.1%Tween20(登録商標)及び0.2%(w/v)BSA、pH7.4を補充したPBS)中で、6nM(最終濃度)ビオチン化ヒト又はカニクイザルCD123、1:300(最終濃度)の抗-6His-D2 HTRF抗体-FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)、及び1:300(最終濃度)の抗strep-Tb抗体FRETドナーコンジュゲート(Cisbio)と一緒に、1:500希釈物(最終濃度)として384ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で120分間インキュベートした。340nmの励起波長及び665±10nmの発光フィルタを使用して、Tecan M1000でHTRFを読み取った。そのような粗細胞抽出物HTRFによる数百のクローンのスクリーニングは、ヒト及びカニクイザルCD123に特異的な数百の異なるアンキリン反復ドメインを明らかにした。ヒト及びカニクイザルCD123に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号6、102、及び103に提供されている。
DARPin(登録商標)タンパク質#6(配列番号6);
DARPin(登録商標)タンパク質#63(配列番号102);
DARPin(登録商標)タンパク質#64(配列番号103)
【0452】
あるいは、各溶解したクローンの抽出物を、PBSTB(0.1%Tween20(登録商標)及び0.2%(w/v)BSA、pH7.4を補充したPBS)中で、4nM(最終濃度)ビオチン化hCD123、1:400(最終濃度)の抗strep-Tb HTRF抗体-FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)、及び1:400(最終濃度)の抗6His-D2抗体FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)と一緒に、1:1000希釈(最終濃度)として384ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で60分間インキュベートした。340nmの励起波長及び665±10nmの発光フィルタを使用して、Tecan M1000でHTRFを読み取った。そのような粗細胞抽出物HTRFによる数百のクローンのスクリーニングは、hCD123に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。hCD123に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号66である。
DARPin(登録商標)タンパク質#35(配列番号66)。
【0453】
hCD123に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号65は、配列番号66の配列に基づいて更に操作される。
【0454】
DARPin(登録商標)タンパク質#35(配列番号66)は、表面電荷を変化させるために改変した。N末端キャッピングモジュールにおいて、アスパラギン酸(18位)をロイシンで置換し、C末端キャッピングモジュールにおいて、グルタミン酸(18位)をグルタミンで置換した。操作された変異体は、汎T細胞及びMOLM-13細胞を5:1の比で使用したインキュベーションの48時間後に標準的なLDH殺傷アッセイにおいて測定された親と比較して、T細胞殺傷(CD3結合DARPin分子と組み合わせて評価された)を低減した。
【0455】
CD123特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物HTRFで特異的なヒトCD123結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。0.11mlの静置一晩培養物(TB、1%のグルコース、50mg/lのアンピシリン;37℃)を使用して、96ディープウェルプレートで0.99mLの培養物(TB、50mg/lのアンピシリン、37℃)に接種した。37℃(700rpm)で2時間インキュベートした後、培養物を0.5mM IPTGで誘導し、振盪しながら(900rpm)37℃で6時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、DNAse I(200ユニット/ml)及びリゾチーム(0.4mg/ml)を補充した50μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、60μLの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。合計で、8つの個々の発現をプールした後、遠心分離(3,200g、60分間、4℃)によって細胞破片を除去した。MultiScreenフィルタプレート(Millipore)を用いて上清を濾過した後、96ウェルThermo HisPurコバルトスピンプレートを用いて精製し、96ウェルThermo Zebaスピン脱塩プレートを用いてPBS中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Agilent 1200HPLCシステム上で標準Sephadex 150/5カラムを使用して、PBS中で可溶性及び単量体であった。
【0456】
DARPin(登録商標)タンパク質#34に由来する親和性成熟CD123特異性結合タンパク質であるDARPin(登録商標)タンパク質#66及びDARPin(登録商標)タンパク質#67の生成。
最初に同定されたCD123特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び/又はそれからの非常に低いオフ速度を有する変異体が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、1つの最初に同定された結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#34(配列番号65、「親」結合タンパク質)を、親和性成熟の好適な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合HTRFによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。簡単に説明する。単一アミノ酸点突然変異変異体を、単一のNNK縮重コドンを有するプライマーを使用して親プラスミド上で標準的なQuikChange PCRによって生成して、潜在的な結合位置に20個全てのアミノ酸を導入した。タンパク質変異体の粗抽出物(CE)(最後にN末端Hisタグ、続いて配列番号105又は106のCD123特異性結合ドメインを含有する)を、標準的な大腸菌発現培養物から生成した。希釈したCEをビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の配列番号65の非タグ化親CD123特異性結合ドメインを添加し、HTRFシグナルを経時的に測定した。親タンパク質よりも高いHTRFシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。
【0457】
第1の工程では、操作されたCD123特異性ヒットを、最後にN末端Hisタグ、続いて配列番号105又は106のCD123特異性結合ドメインと配列番号3のC末端CD3特異性結合ドメインとを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。
【0458】
D.CD70に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ(Hanes,J.及びPluckthun,A.、「PNAS」第94巻第4937~42頁(1997年))を用いて、ヒトCD70(hCD70)に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Binzら(2004年)の上記引用による記載と同様のDARPin(登録商標)ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトCD70標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)によって評価され、数百のhCD70特異性結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号64のアンキリン反復ドメインは、hCD70に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。
【0459】
リボソームディスプレイによるCD70特異性アンキリン反復タンパク質の選択
hCD70特異性アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトCD70の細胞外ドメイン(配列番号89)を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ(Hanes及びPluckthun(上記引用))によって実施した(例えば、Zahnd,C.、Amstutz,P.、及びPluckthun,A.、「Nat.Methods」第4巻、第69~79頁、2007年、参照)。CD70標的(ACROBiosystems)は、C末端Fcタグを含み、5倍過剰のビオチンを用いて化学的にビオチン化した。計4ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド1からラウンド4への選択圧力を増加させた(Binzら、2004年、上記引用)。ストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写(RT)-PCRサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する45から28に一定に減少させた。
【0460】
高親和性CD70特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択(上記)の第4ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した(Zahnd(2007年)上記引用)。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。ラウンド5及び6では、RT-PCRサイクルの数は、それぞれ30及び35であった。
【0461】
選択されたクローンは、粗抽出物HTRFによって示されるようにCD70に特異的に結合する。
溶液中でhCD70に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定(HTRF)アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、pQE30(Qiagen)発現ベクター(pMPDV25)の誘導体にクローニングし、大腸菌のXL1-Blue(Stratagene)に形質転換し、LB-寒天(1%グルコース及び50μg/mlのアンピシリンを含有)上に播種し、次いで、37℃で一晩インキュベートした。160μlの成長培地(1%グルコースと50μg/mlのアンピシリンとを含有するTB)を含有する96ウェルプレートに単一のコロニーを播種し(単一のウェル中に各クローン)、37℃、800rpmで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン50μg/mLを含有する150μLの新鮮なTB培地に、新しい96ウェルプレート中8.5μLの一晩培養物を播種した。37℃及び700rpmで120分間インキュベートした後、発現をIPTG(最終濃度0.5mM)で誘導し、4時間続けた。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、8μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、160μLのPBSを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。
【0462】
各溶解したクローンの抽出物を、PBSTB(0.1%Tween20(登録商標)及び0.2%(w/v)BSA、pH7.4を補充したPBS)中で、2nM(最終濃度)ビオチン化ヒトhCD70、1:400(最終濃度)の抗strep-Tb HTRF抗体-FRETドナーコンジュゲート(Cisbio)、及び1:400(最終濃度)の抗6His-D2抗体FRET受容体コンジュゲート(Cisbio)と一緒に、1:2000希釈(最終濃度)として384ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で60分間インキュベートした。340nmの励起波長及び665±10nmの発光フィルタを使用して、Tecan M1000でHTRFを読み取った。そのような粗細胞抽出物HTRFによる数百のクローンのスクリーニングは、hCD70に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。hCD70に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、107、108である
DARPin(登録商標)タンパク質#68(配列番号107);
DARPin(登録商標)タンパク質#69(配列番号108)。
【0463】
hCD70に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号64は、前の工程の選択された設計アンキリン反復ドメインの配列、すなわちDARPin(登録商標)タンパク質#69(配列番号108)に基づいて操作される。
【0464】
表面電荷を変化させるために、この選択された配列を改変した。N末端キャッピングモジュールでは、RILLAAモチーフをRILLKAで置換し、アスパラギン酸(18位)をロイシンで置換した。更に、C末端キャッピングモジュールについては、セリン(16位)をグリシンで置換し、グルタミン酸(18位)をグルタミンで置換して改変した。
【0465】
CD70特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物HTRFで特異的なヒトCD70結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。0.11mlの静置一晩培養物(TB、1%のグルコース、50mg/lのアンピシリン;37℃)を使用して、96ディープウェルプレートで0.99mLの培養物(TB、50mg/lのアンピシリン、37℃)に接種した。37℃(700rpm)で2時間インキュベートした後、培養物を0.5mM IPTGで誘導し、振盪しながら(900rpm)37℃で6時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを-20℃で一晩凍結した後、DNAse I(200ユニット/ml)及びリゾチーム(0.4mg/ml)を補充した50μLのB-PERII(Thermo Scientific)中に再懸濁し、振盪(900rpm)しながら室温で1時間インキュベートした。次いで、60μLの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した(3220gで15分間)。合計で、8つの個々の発現をプールした後、遠心分離(3,200g、60分間、4℃)によって細胞破片を除去した。MultiScreenフィルタプレート(Millipore)を用いて上清を濾過した後、96ウェルThermo HisPurコバルトスピンプレートを用いて精製し、96ウェルThermo Zebaスピン脱塩プレートを用いてPBS中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Agilent 1200HPLCシステム上で標準Sephadex 150/5カラムを使用して、PBS中で可溶性及び単量体であった。
【0466】
それぞれ親タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#69(配列番号108)及びDARPin(登録商標)タンパク質#68(配列番号107)に由来する親和性成熟CD70特異性アンキリン反復タンパク質であるDARPin(登録商標)タンパク質#70(配列番号109)及びDARPin(登録商標)タンパク質#71(配列番号110)の生成。
最初に同定されたCD70特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び/又はそれからの非常に低いオフ速度を有する結合剤が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、2つの最初に同定された結合タンパク質(「親」結合タンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#68及びDARPin(登録商標)タンパク質#69)を、親和性成熟の適切な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合HTRFによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。N末端Hisタグを含有するアンキリン反復タンパク質の粗抽出物をビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の非タグ化親CD70特異性結合タンパク質を添加し、HTRFシグナルを経時的に測定した。親クローンよりも高いHTRFシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。
【0467】
第1の工程では、操作されたCD70特異性結合ドメインを、最後にN末端Hisタグ、続いてCD70特異性結合ドメイン(配列番号109又は110)及びC末端CD3特異性結合ドメイン(配列番号3)を含有するpQE30(Qiagen)発現ベクターpMPTLO847の誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのHisタグを用いて精製した。タンパク質を、健常ドナーPBMC及びMolm-13-N1腫瘍細胞(5:1のE:T比)から単離された初代T細胞を使用して、用量依存的インビトロT細胞活性化及び殺傷アッセイについて試験した。48時間の共培養物のアッセイインキュベーション並びにフローサイトメトリー及びLDH放出による分析。DARPin(登録商標)タンパク質#70(配列番号109)及びDARPin(登録商標)タンパク質#71(配列番号110)を、親結合タンパク質と比較して、それぞれ約7倍及び31倍改善されたEC50値、並びに分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された95%超の単量体性に基づいて選択した。第2の工程において、CD70特異性結合タンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#70(配列番号109)及びDARPin(登録商標)タンパク質#71(配列番号110)を、N末端Hisタグを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクターpMPDV025の誘導体にサブクローニングし、一価の設計アンキリン反復タンパク質として大腸菌中で発現させ、標準プロトコルに従って精製し、特徴付けた。
【0468】
実施例2:雌BALB/cマウスにおける組換えタンパク質の薬物動態分析
雌BALB/cマウスにおけるCD3特異性アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析
本発明のCD3特異的アンキリン反復ドメインが、治療薬の開発に有用であるためにインビボで適切な血清半減期を有し得るかどうかを決定するために、DARPin(登録商標)タンパク質#1、DARPin(登録商標)タンパク質#2、DARPin(登録商標)タンパク質#3及びDARPin(登録商標)タンパク質#4の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、DARPin構築物をサブクローニングし、N末端Hisタグ、半減期延長のためのHSA結合アンキリン反復ドメイン、続いてCD3特異性結合ドメインの1つを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体に上記に記載されるように発現させた。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
DARPin(登録商標)タンパク質#16(配列番号39、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#17(配列番号40、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#18(配列番号41、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#19(配列番号42、Hisタグ付き(配列番号33)でそのN末端に融合)
【0469】
インビボ投与及び試料採取
ヒト血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインでフォーマットされたDARPin(登録商標)タンパク質#16、DARPin(登録商標)タンパク質#17、DARPin(登録商標)タンパク質#18、及びDARPin(登録商標)タンパク質#19を、各アンキリン反復融合タンパク質に6匹のマウスの尾静脈に1回の静脈内ボーラス注射として投与した。目標用量レベルは、5mL/kgの適用容量で1mg/kgであった。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中に配合した。
【0470】
マウスを、等しい数の動物を有する2つの群に分割した。各マウスから4つの血清試料を収集した。薬学的動態調査のための血液試料を、化合物投与後5分、4時間、24時間、48時間、76時間、96時間、及び168時間に採取した。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取した。
【0471】
血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのELISAによる生物分析
PBS中の10nMのポリクローナルヤギ抗ウサギIgG抗体(Ab18)の1ウェル当たり100μlを、NUNC Maxisorb ELISAプレートに4℃で一晩コーティングした。1ウェル当たり300μlのPBST(0.1%のTween20を添加したPBS)で5回洗浄した後、Heidolph Titramax 1000振盪器(450rpm)で、0.25%のカゼイン(PBST-C)を補充した300μlのPBSTで、室温(RT)で1時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。PBST-C中の100μlの5nmol/Lのウサギ抗DARPin(登録商標)1-1-1抗体を添加し、プレートを軌道振盪(450rpm)しながら室温(22℃)で1時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。
【0472】
希釈した血清試料(1:5の希釈工程で1:20~1:312500)又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料(1:3の希釈工程で0及び50~0.0008nmol/L)の100μlを、450rpmで振盪しながら、室温で2時間適用した。プレートを上記のように洗浄した。
【0473】
次いで、ウェルを100μlのマウス抗RGS-His-HRP IgG(Ab06、PBST-C中1:2000)と共にインキュベートし、室温、450rpmで1時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。100μl/ウェルのTMB基質溶液を5分間使用して、1mol/LのH2SO4を100μl添加することによって停止させてELISAを展開した。450nmでの吸光度及び620nmでの吸光度の差を計算した。試料は、2つの異なるプレートで二連で測定した。図1Aが、DARPin(登録商標)タンパク質#16、DARPin(登録商標)タンパク質#17、DARPin(登録商標)タンパク質#18、及びDARPin(登録商標)タンパク質#19の血清濃度を、マウスへの単回静脈内投与後の時間の関数として示す。トレースは、化合物のおおよその単一指数関数的除去を示す。
【0474】
薬物動態解析
薬物動態データ解析を、Phoenix 64、Pharsight、North Carolinaの一部としてWinNonlinプログラムのバージョン7.0を使用して、Molecular Partnersで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度-時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析(NCAモデル200-202、IVボーラス、線形台形線形補間)を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
AUCinf、AUClast、AUC_%extrapol、Cmax、Tmax、Cl_pred、Vss_pred、t1/2。
【0475】
最大血清濃度(Cmax)及びそれらの発生時間(Tmax)は、血清濃度-時間プロファイルから直接得られた。血清濃度-時間曲線の下の面積(AUCinf)は、最後のサンプリング点(Tlast)までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大への外挿によって決定した。無限大までの外挿は、Clast/λzを使用して実行され、ここで、λzは、対数線形回帰によって推定された最終速度定数を示し、Clastは、最終対数線形回帰によってTlastで推定された濃度を示す。総血清クリアランス(Cl_pred)及び見かけの終末相半減期を以下のように計算した。Cl_pred=静脈内用量/AUCinf及びt1/2=ln2/λz。定常状態分布体積Vssは、以下によって決定した。Vss=i.v.投与量・AUMCinf/(AUCinf)2。AUMCinfは、AUCinfの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度-時間曲線の第1の瞬間の総面積を示す。nmol/Lで与えられた濃度に基づいてPKパラメータを計算するために、mg/kgとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してnmol/kgに変換した。表2aは、1mg/kgの単回静脈内投与後の、試験した4つのアンキリン反復タンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#16、DARPin(登録商標)タンパク質#17、DARPin(登録商標)タンパク質#18、及びDARPin(登録商標)タンパク質#19の薬物動態特性の概要を示す。
【0476】
【表2】
【0477】
B.雌BALB/cマウスにおける多重特異性組換えタンパク質の薬物動態分析
本発明の多重特異性組換え結合タンパク質が、治療薬の開発に有用であるためにインビボで適切な血清半減期を有し得るかどうかを決定するために、DARPin(登録商標)タンパク質#29、DARPin(登録商標)タンパク質#31の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、DARPin構築物をサブクローニングし、上記のようにして、N末端Hisタグ、(先の実施例に記載したように1つ又は2つの)半減期延長のためのHSA結合アンキリン反復ドメイン、続いて、腫瘍関連結合ドメイン及びCD3結合ドメインを含有する、又はN末端Hisタグ、腫瘍関連結合ドメイン、及びCD3結合ドメイン、続いて、(先の実施例に記載したように1つ又は2つの)半減期延長のためのHSA結合アンキリン反復ドメインを含有する、pQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体に発現させた。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
DARPin(登録商標)タンパク質#50(配列番号81であり、そのN末端にHisタグ(配列番号33)が融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#53(配列番号84であり、そのN末端にHisタグ(配列番号33)が融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#51(配列番号82であり、そのN末端にHisタグ(配列番号33)が融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#54(配列番号85であり、そのN末端にHisタグ(配列番号33)が融合);
DARPin(登録商標)タンパク質#55(配列番号86であり、そのN末端にHisタグ(配列番号33)が融合)。
【0478】
インビボ投与及び試料採取
ヒト血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインでフォーマットされたDARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#53、DARPin(登録商標)タンパク質#51、DARPin(登録商標)タンパク質#54及びDARPin(登録商標)タンパク質#55を、各アンキリン反復融合タンパク質について6匹のマウスの尾静脈への単回静脈内ボーラス注射として投与した。アンキリン反復タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)溶液中で製剤化し、100μlの適用体積で1mg/kgで投与した。
【0479】
マウスを、等しい数の動物を有する2つの群に分割した。各マウスから4つの血清試料を収集した。薬学的動態調査のための血液試料を、化合物投与後5分、4時間、24時間、48時間、76時間、96時間、及び168時間に採取した。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取した。
【0480】
血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのELISAによる生物分析
PBS中の10nMのポリクローナルヤギ抗ウサギIgG抗体(Ab18)の1ウェル当たり100μlを、NUNC Maxisorb ELISAプレートに4℃で一晩コーティングした。1ウェル当たり300μlのPBST(0.1%のTween20を添加したPBS)で5回洗浄した後、Heidolph Titramax 1000振盪器(450rpm)で、0.25%のカゼイン(PBST-C)を補充した300μlのPBSTで、室温(RT)で1時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。PBST-C中の100μlの5nmol/Lのウサギ抗DARPin(登録商標)1-1-1抗体を添加し、プレートを軌道振盪(450rpm)しながら室温(22℃)で1時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。
【0481】
希釈した血清試料(1:5の希釈工程で1:20~1:312500)又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料(1:3の希釈工程で0及び50~0.0008nmol/L)の100μlを、450rpmで振盪しながら、室温で2時間適用した。プレートを上記のように洗浄した。
【0482】
次いで、ウェルを100μlのマウス抗RGS-His-HRP IgG(Ab06、PBST-C中1:2000)と共にインキュベートし、室温、450rpmで1時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。100μl/ウェルのTMB基質溶液を5分間使用して、1mol/LのH2SO4を100μl添加することによって停止させてELISAを展開した。450nmでの吸光度及び620nmでの吸光度の差を計算した。試料は、2つの異なるプレートで二連で測定した。図1Bは、DARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#53、DARPin(登録商標)タンパク質#51、DARPin(登録商標)タンパク質#54、及びDARPin(登録商標)タンパク質#55の血清濃度を、マウスへの単回静脈内投与後の時間の関数として示している。トレースは、化合物のおおよその単一指数関数的除去を示す。
【0483】
薬物動態解析
薬物動態データ解析を、Phoenix 64、Pharsight、North Carolinaの一部としてWinNonlinプログラムのバージョン7.0を使用して、Molecular Partnersで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度-時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析(NCAモデル200-202、IVボーラス、線形台形線形補間)を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
AUCinf、AUC_%extrapol、Cmax、Tmax、Cl_pred、Vss_pred、t1/2。最大血清濃度(Cmax)及びそれらの発生時間(Tmax)は、血清濃度-時間プロファイルから直接得られた。血清濃度-時間曲線の下の面積(AUCinf)は、最後のサンプリング点(Tlast)までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大への外挿によって決定した。無限大までの外挿は、Clast/λzを使用して実行され、ここで、λzは、対数線形回帰によって推定された最終速度定数を示し、Clastは、最終対数線形回帰によってTlastで推定された濃度を示す。総血清クリアランス(Cl_pred)及び見かけの終末相半減期を以下のように計算した。Cl_pred=静脈内用量/AUCinf及びt1/2=ln2/λz。定常状態分布体積Vssは、以下によって決定した。Vss=i.v.投与量・AUMCinf/(AUCinf)2。AUMCinfは、AUCinfの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度-時間曲線の第1の瞬間の総面積を示す。nmol/Lで与えられた濃度に基づいてPKパラメータを計算するために、mg/kgとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してnmol/kgに変換した。表2bは、1mg/kgの単回静脈内投与後の、試験した5つのアンキリン反復タンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#53、DARPin(登録商標)タンパク質#51、DARPin(登録商標)タンパク質#54、及びDARPin(登録商標)タンパク質#55の薬物動態特性の概要を示す。
【0484】
【表3】
【0485】
上記表2b及び図1に見られるように、DARPin(登録商標)タンパク質#51が最長の半減期を示し、続いてDARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#54及びDARPin(登録商標)タンパク質#53であり、C末端で半減期が延長されたDARPin(登録商標)タンパク質#55が最短の半減期を示す。
【0486】
更に、DARPin(登録商標)タンパク質#56(配列番号95)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(配列番号96)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(配列番号97)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(配列番号98)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(配列番号99)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61(配列番号100)の薬物動態プロファイルを、DARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#53、DARPin(登録商標)タンパク質#51、DARPin(登録商標)タンパク質#54及びDARPin(登録商標)タンパク質#55と同じ実験設定に従って、マウスにおいて分析した。
【0487】
表2cは、1mg/kgの単回静脈内投与後の、試験した6つのアンキリン反復タンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61の薬物動態特性の概要を示す。
【0488】
【表4】
【0489】
上記表2cに見られるように、DARPin(登録商標)タンパク質#58が最長の半減期を示し、DARPin(登録商標)タンパク質#60、DARPin(登録商標)タンパク質#61、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#59が続き、DARPin(登録商標)タンパク質#57が最短の半減期を示す。
【0490】
実施例3:多重特異性組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数KDの決定
A.表面プラズモン共鳴(SPR)分析によるヒトCD3に対して結合特異性を有する多重特異性組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数(KD)の決定
組換えヒトCD3標的上の4つの精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ProteOn装置(BioRad)を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明のDARPin(登録商標)タンパク質#7、DARPin(登録商標)タンパク質#8、DARPin(登録商標)タンパク質#9、及びDARPin(登録商標)タンパク質#10をサブクローニングし、N末端Hisタグ、アンキリン反復ドメインに結合するCD33及びCD123、続いて、4つのCD3特異性アンキリン反復タンパク質構築物の1つを含有する、pQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。
【0491】
簡単に説明すると、ビオチン化ヒトscCD3εγを、PBST(PBS、pH7.4、0.005%Tween20(登録商標)含有)中に希釈し、NLCチップ(BioRad)上に、約700~1400共鳴単位(RU)のレベルまでコーティングした。次いで、アンキリン反復タンパク質とヒトCD3との相互作用を、マルチトレースSPR測定については64nM~4nMの濃度範囲を網羅する段階希釈物のアンキリン反復タンパク質を含有する300μLの泳動用緩衝液(0.005% Tween20(登録商標)を含有するPBS、pH7.4)を注入すること、続いて60μL/分の一定流量で少なくとも10分間、泳動用緩衝液流を注入すること(オフレート測定)によって測定した。再生は、30μLの10mMグリシンpH2を用いて行った。スポット間のシグナル(すなわち、共鳴単位(RU)値)及び参照注入(すなわち、ランニング緩衝液のみの注入)を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたRUトレースから減算した(二重参照)。DARPin(登録商標)タンパク質#7については結合が弱すぎたが、親和性成熟構築物については、CD3に対して結合パラメータ(KD、オン速度、オフ速度)を決定した。結合平衡には、最も高い試料濃度であっても適切に到達せず、オン速度に対して最適ではない適合をもたらしたため、オン速度(kon)及び解離定数(KD)は、近似としてのみ与えられる。
【0492】
代表例として、図2Cは、CD33及びCD123結合設計アンキリン反復ドメインでフォーマットされたDARPin(登録商標)タンパク質#9について得られたSPRトレースを示す。解離定数(KD)を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトCD3との結合相互作用のKD値を、6~35nMの範囲にあると決定した(表3aを参照)。
【0493】
【表5】
【0494】
B.表面プラズモン共鳴(SPR)分析によるヒトCD33及びCD123に対して結合特異性を有する組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数(KD)の決定
組換えヒトCD33及びCD123標的上の2つの精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ProteOn装置(BioRad)を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明の(CD33及びCD3に対して結合特異性を有する)DARPin(登録商標)タンパク質#25及び(CD123及びCD33に対して結合特異性を有する)DARPin(登録商標)タンパク質#26をサブクローニングし、N末端Hisタグ、アンキリン反復ドメインに結合するCD33又はCD123、続いて、4つのCD3特異性アンキリン反復タンパク質構築物の1つを含有する、pQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。以下の工程を上記Aに記載したように行った。簡潔に述べると、標的タンパク質としてのヒトCD33のビオチン化細胞外ドメイン(Speed BioSystemsによって提供、ロット番号カタログ番号YCP2045)をDARPin(登録商標)タンパク質#25の評価に使用し、ヒトのビオチン化細胞外ドメイン(uniprot ID 26951)をDARPin(登録商標)タンパク質#26の評価に使用した。
【0495】
選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトCD33及びCD123との結合相互作用のKD値を、下記の表に示す(表3bを参照)。
【0496】
【表6】
【0497】
表面プラズモン共鳴(SPR)分析によるヒトCD33、CD123、及び/又はCD70に対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数(KD)の決定
組換えヒトCD33、CD123、及びCD70標的上の16の精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ProteOn XPR36装置(BioRad)を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#29、DARPin(登録商標)タンパク質#47、DARPin(登録商標)タンパク質#48、DARPin(登録商標)タンパク質#49、DARPin(登録商標)タンパク質#50、DARPin(登録商標)タンパク質#51、DARPin(登録商標)タンパク質#52、DARPin(登録商標)タンパク質#31、DARPin(登録商標)タンパク質#53、DARPin(登録商標)タンパク質#54、DARPin(登録商標)タンパク質#55、DARPin(登録商標)タンパク質#34、DARPin(登録商標)タンパク質#33、DARPin(登録商標)タンパク質#39、及びDARPin(登録商標)タンパク質#36をサブクローニングし、N末端Hisタグ、CD33、CD123、及び/又はCD70結合アンキリン反復ドメイン、続いてCD3特異性アンキリン反復ドメインを含有するpQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体に上記のように発現させ、いくつかの構築物についてはヒト血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインによって発現させた。
【0498】
簡単に説明すると、ビオチン化ヒトCD70、CD123、及びCD33を、PBST(PBS、pH7.4、0.005%Tween20(登録商標)含有)中に希釈し、GLCチップ(BioRad)上に、約200、460、及び450共鳴単位(RU)のレベルまでコーティングした。NaOAc(pH5.0)中のHSAを、800RUのレベルまでGLCチップ上に直接固定した。Bio.CD70、CD33、及びbio.CD123は、ビオチン化標的が適用され得る前に、最初に6000RUのレベルまでニュートラアビジンをコーティングする必要があった。次いで、選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトCD70、CD123、及びCD33との相互作用を、マルチトレースSPR測定のために、100nM~2.6nM(それぞれ100、40、16、6.4、及び2.6nM)の濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の段階希釈物を含有する300μlのランニング緩衝液(PBS、0.005%Tween 20(登録商標)を含有するpH7.4)を注射することによって、100μl/分の一定流量を使用して120秒の会合及び1200秒の解離で測定した。再生は、30μLの4mMのグリシン(pH2)を用いて行った。スポット間のシグナル(すなわち、共鳴単位(RU)値)及び参照注入(すなわち、ランニング緩衝液のみの注入)を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたRUトレースから減算した(二重参照)。
【0499】
選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトCD33、CD123、及びCD70との結合相互作用のKD値を、以下の表に示す(表3cを参照)。
【0500】
【表7】
【0501】
同様に、組換えヒトCD3標的に対して2つの精製アンキリン反復タンパク質の結合親和性を、前述のように分析した。簡単に説明すると、NaOAc pH4.5中のDARPin(登録商標)タンパク質#53、DARPin(登録商標)タンパク質#54を、約790~1500共鳴単位(RU)のレベルまでGLCチップ(BioRad)上にコーティングした。次いで、アンキリン反復タンパク質とヒトCD3との相互作用を、マルチトレースSPR測定については300nM~19nMの濃度範囲を網羅し、PBST中で希釈した(0.005% Tween20(登録商標)を含有するPBS、pH7.4)ヒトscCD3εγ(56.4uM)段階希釈物を含有する300μLの泳動用緩衝液(0.005% Tween20(登録商標)を含有するPBS、pH7.4)を注射すること、続いて、60μL/分の一定流量で少なくとも10分間、泳動用緩衝液流を注射すること(オフ速度測定)によって測定した。
【0502】
再生は、30μLの10mMグリシンpH2を用いて行った。スポット間のシグナル(すなわち、共鳴単位(RU)値)及び参照注射(すなわち、ランニング緩衝液のみの注射)を、CD3の注射後に得られたRUトレースから減算した(二重参照)。CD3に対して結合パラメータ(KD、オン速度、オフ速度)を、標準ラングミュアフィットモデルを使用することによって決定した。代表的な例として、図2(A及びB)は、DARPin(登録商標)タンパク質#53(A)及びDARPin(登録商標)タンパク質54について得られたSPRトレースを示す。
【0503】
【表8】
【0504】
D.表面プラズモン共鳴(SPR)分析によるヒトCD33、CD123、及びCD70に対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数(KD)の決定
組換え標的に対して選択された多重特異性アンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ProteOn(BioRad)及びBruker Sierra SPR-32 Pro機器を使用して分析した。測定は、当業者に知られている標準的な手順に従って行った。そのために、本発明のDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57をサブクローニングし、N末端Hisタグ、2つのヒト血清アルブミン特異性結合ドメイン及びCD70、CD123、及びCD33特異性結合ドメイン、続いて1つのCD3特異性結合ドメインを含むpQE30(Qiagen)発現ベクターの誘導体中に上記のように発現させた。
【0505】
簡潔に述べると、ヒト標的CD70(配列番号89;hCD70-Fc-三量体、ACRO Biosystems)をPBST(0.005%Tween 20(登録商標)を含有するPBS、pH7.4)で希釈し、PAGD200Lタンパク質A/Gセンサチップ(XanTec bioanalytics GmbH)上にXanTec bioanalytics GmbH)上に約36共鳴単位(RU)のレベルまで捕捉した。次いで、各試験アンキリン反復タンパク質とヒトCD70-Fc三量体との相互作用を、600nM~7.4nMの濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の3倍段階希釈物を含有する400μlのランニング緩衝液(PBS、pH7.4、0.005%のTween20(登録商標))を注射し、続いて、100μl/分の一定流量で2700秒間、ランニング緩衝液流を注射(オフ速度測定)することによって測定した。30μlの10mMグリシンpH2を使用して再生を行い、hCD70-Fc-三量体を再注射して、次の測定のための表面を調製した。各相互作用を三連で記録した。スポット間のシグナル(すなわち、共鳴単位(RU)値)及び参照注射(すなわち、ランニング緩衝液のみの注射)を、アンキリン反復タンパク質の注射後に得られたRUトレースから減算した(二重参照)。標準1:1-ラングミュアモデルを使用して、全体的に当てはめられたオン速度及びオフ速度から解離定数(KD)を計算した。
【0506】
同様に、ヒトtarget_hCD123(配列番号88)をPBST(0.005%Tween20(登録商標)を含有するPBS、pH7.4)で希釈し、Bruker Sierra SPR-32proを使用して、Bruker IgG Captureセンサチップ上で約177共鳴単位(RU)のレベルまで捕捉した。次いで、各試験アンキリン反復タンパク質と標的_hCD123との相互作用を、200nM~91pMの濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の段階希釈物を含有する100μlのランニング緩衝液(PBS、pH7.4、0.005%のTween20(登録商標)を含有する)を注射(オン速度測定)し、続いて、25μl/分の一定流量で少なくとも1500秒間、ランニング緩衝液流を注射(オフ速度測定)することによって測定した。8.3μlの10mMグリシン(pH2)を用いて再生を行い、hCD123を再注射して、次の測定のために表面を調製した。各相互作用を三連で記録した。空の表面のシグナル(すなわち、共鳴単位(RU)値)及び参照注射(すなわち、ランニング緩衝液のみの注射)を、アンキリン反復タンパク質の注射後に得られたRUトレースから減算した(二重参照)。標準1:1-ラングミュアモデルを使用して、全体的に当てはめられたオン速度及びオフ速度から解離定数(KD)を計算した。
【0507】
ヒトCD33との相互作用を測定するために、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57を10mM NaOAc(pH4.0)で希釈し、ProteOn(BioRad)を使用して約1000共鳴単位(RU)(SMA555)又は1400Rus(PSC466)のレベルまでNHS/EDC活性化HC200Mセンサチップ(XanTec bioanalytics GmbH)上に固定化した。エタノールアミンを使用して表面を不活性化した。次いで、試験タンパク質とヒト標的hCD33(配列番号87)との相互作用を、66.7nM~0.82nMの濃度範囲を網羅するヒト標的hCD33の3倍段階希釈物を含有する400μlのランニング緩衝液(PBS、pH7.4、0.005%のTween20(登録商標)を含有する)を注射(オン速度測定)し、続いて、100μl/分の一定流量で500秒間、ランニング緩衝液流を注射(オフ速度測定)することによって測定した。各測定後、分析物の完全な解離を可能にするために10分間の休止を導入した。各相互作用を三連で記録した。スポット間のシグナル(すなわち、共鳴単位(RU)値)及び参照注射(すなわち、ランニング緩衝液のみの注射)を、ヒトhCD33の注射後に得られたRUトレースから減算した(二重参照)。標準1:1-ラングミュアモデルを使用して、全体的に当てはめられたオン速度及びオフ速度から解離定数(KD)を計算した。図2Dは、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57について得られたSPRトレースを示す。
【0508】
選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトCD33、CD123、CD70、及びCD3との結合相互作用のKD値を、以下の表に示す(表4bを参照)。
【0509】
【表9】
【0510】
実施例4:T細胞又は腫瘍細胞結合の決定。
DARPin(登録商標)タンパク質#11、DARPin(登録商標)タンパク質#12、DARPin(登録商標)タンパク質#13及びDARPin(登録商標)タンパク質#14のCD3T細胞結合の決定。
CD3結合の決定は、Mirrorballレーザー走査撮像サイトメトリーを使用して、初代ヒトT細胞で行った。したがって、pan-T細胞精製キット(Miltenyi Biotec)を使用して、ヒト末梢血単核球(PBMC)から初代T細胞を単離した。三重特異性フォーマット(CD33及びCD123結合アンキリン反復ドメインを含む)にフォーマットされたDARPin(登録商標)タンパク質#7、DARPinタンパク質#8、DARPinタンパク質#9、及びDARPinタンパク質#10、DARPinタンパク質#11、DARPinタンパク質#12、DARPinタンパク質#13、及びDARPinタンパク質#14UN四重特異性フォーマット(ヒト血清アルブミンに特異的に結合する追加のアンキリン反復ドメインを含む)の滴定物を、600μMヒト血清アルブミン(生理的血清濃度を模倣するため)の存在下で1ウェル当たり50,000個の汎T細胞と共に4℃で30分間インキュベートした。CD33又はCD123を標的とする2つのベンチマークT細胞性エンゲージャである、AMG330及びフロテツズマブを対照として適用した。洗浄後、CD3結合を、1:100希釈した抗ペンタ-His Alexa Fluor488抗体(Qiagen)によって検出した。4℃で30分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、Cytofix固定緩衝液(BD Biosciences)に再懸濁し、5μMのDRAQ5(Abcam)によって室温で15分間対比染色した。遠赤色対比染色細胞上のAlexa Fluor 488結合の平均蛍光強度の中央値を、Cellistaソフトウェア(SPT Labtech)を使用してMirrorballによって測定し、データを、GraphPad Prism 8を使用してプロットした。
【0511】
図20A~Bに示すように、DARPin(登録商標)タンパク質は、DARPin(登録商標)タンパク質#7に対して検出可能な結合なしから、DARPin(登録商標)タンパク質#10に対してベンチマーク分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)と同程度に良好な結合までの幅広い親和性を示す。T細胞へのCD3結合は、SPRによって測定されるCD3親和性と合致する。追加のHSA結合ドメインの存在(図3Bを参照されたい)は、T細胞への結合にわずかな影響しか及ぼさなかった。表5aは、EC50値によって表される、4つの例示的なアンキリン反復タンパク質のCD3結合親和性を示す。
【0512】
【表10】
【0513】
DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#28及びDARPin(登録商標)タンパク質#29及びDARPin(登録商標)タンパク質#30のT細胞結合の決定。
T細胞結合の決定は、Mirrorballレーザー走査撮像サイトメトリーを使用して、初代ヒトT細胞で行った。したがって、pan-T細胞精製キット(Miltenyi Biotec)を使用して、ヒト末梢血単核球(PBMC)から初代T細胞を単離した。DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPinタンパク質#28、DARPinタンパク質#29、及びDARPinタンパク質#30の滴定物を、600μMヒト血清アルブミン(生理学的血清濃度を模倣するため)の存在下で、1ウェル当たり50,000個の汎T細胞と共に、4℃で30分間インキュベートした。CD33又はCD123を標的とする2つのベンチマークT細胞性エンゲージャであるAMG330及びフロテツズマブを対照として適用した。洗浄後、CD3結合を、1:100希釈した抗ペンタ-His Alexa Fluor488抗体(Qiagen)によって検出した。4℃で30分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、Cytofix固定緩衝液(BD Biosciences)に再懸濁し、5μMのDRAQ5(Abcam)によって室温で15分間対比染色した。遠赤色対比染色細胞上のAlexa Fluor 488結合の平均蛍光強度の中央値を、Cellistaソフトウェア(SPT Labtech)を使用してMirrorballによって測定し、データを、GraphPad Prism 8を使用してプロットした。
【0514】
表5bは、EC50値によって表される、4つの例示的なアンキリン反復タンパク質の結合親和性を示す。
【0515】
【表11】
【0516】
多重特異性結合タンパク質の腫瘍細胞結合の決定
いくつかの多重特異性タンパク質の腫瘍細胞への結合の決定を、蛍光活性化細胞選別(FACS)フローサイトメトリーによって行った。したがって、腫瘍細胞(Molm-13N1)を96ウェルプレートに1ウェル当たり100’000細胞で播種した。DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、ARPin(登録商標)タンパク質#61及びDARPin(登録商標)タンパク質#62を、100nMから出発して1:5の希釈比で滴定した。腫瘍細胞を希釈したDARPin(登録商標)タンパク質で再懸濁し、4℃で60分間インキュベートした。アッセイは、2%ウシ胎児血清及びヒト血清アルブミン20μM(HSA)を含むPBS中で行った。リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で2回洗浄した後、DARPin(登録商標)タンパク質特異性腫瘍細胞結合を、非標識一次抗ウサギDARPin(登録商標)抗体(抗ウサギ1-1-1抗体、CePower)を2μg/mlで添加することによって検出した。続いて4℃で少なくとも30分間のインキュベーション工程を行った。その後、細胞をPBSで洗浄し、Alexa Fluor 647抗体(ThermoFisher)で標識した2μg/mlの抗ウサギ二次抗体を添加した。同じインキュベーション条件を適用した。最後に、細胞を2回洗浄し、Cytofix固定緩衝液(BD Biosciences)中に室温(RT)で15分間再懸濁した。Alexa Fluor 647 DARPin(登録商標)標識細胞の蛍光強度中央値(MFI)を、Attune NxT(Thermo Fisher)GraphPad Prism 8を使用して、Attune NxT(Thermo Fisher)によって測定した。図20Cは、Molm-13N1細胞上のCD123、CD33、及びCD70を標的とする選択されたDARPin(登録商標)タンパク質の滴定曲線を示す。
【0517】
表5cは、EC50値によって表される、7つの例示的な多重特異性結合タンパク質の結合親和性を示す。
【0518】
【表12】
【0519】
実施例5:インビトロ短期T細胞活性化アッセイによる多重特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価
A.ヒト汎T細胞との共培養におけるMolm-13標的細胞に対する多重特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
上述の組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、CD8+T細胞上のCD25活性化マーカを測定するFACSによるインビトロ短期T細胞活性化アッセイにおいて評価した。
【0520】
したがって、1ウェル当たり50,000個の精製された汎Tエフェクタ細胞及び50,000個のMolm-13標的細胞を、600μMのヒト血清アルブミンの存在下で、37℃で24時間、選択されたDARPin(登録商標)タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と共に2連で同時インキュベートした(E:T比1:1)。細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Aqua(Thermo Fisher)、1:250マウス抗ヒトCD8 Pacific Blue(BD)、及び1:100マウス抗ヒトCD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8を用いてデータをプロットした。
【0521】
図3に示すように、(A)DARPin(登録商標)タンパク質#27、(B)DARPin(登録商標)タンパク質#28、(C)DARPin(登録商標)タンパク質#29、及び(D)DARPin(登録商標)タンパク質#30は、ベンチマーク分子(既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330、及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)に匹敵する特異性短期T細胞性活性化を誘導した。更に、T細胞活性化のDARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#28、DARPin(登録商標)タンパク質#29、及びDARPin(登録商標)タンパク質#30は、単一標的化対照組換えタンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#40(CD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#41(CD123に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#42(CD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#43(CD70に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#44(CD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#45(CD70に対して結合特異性を有する)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#46(CD123に対して結合特異性を有する)と比較した場合、明確なアビディティ獲得を示す。
【0522】
更に、いくつかの多重特異性組換えタンパク質を、今度は半減期延長結合ドメインを有する同様のアッセイにおいて試験し、分子の効力に対する当該半減期延長の影響を評価した。(A)DARPin(登録商標)タンパク質#27を、2つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン(それぞれ、CD123及びCD33)及びN末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する半減期フォーマット化DARPin(登録商標)タンパク質#47、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較し、(B)DARPin(登録商標)タンパク質#29を、2つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン(それぞれ、CD70及びCD33)及びN末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する半減期フォーマット化DARPin(登録商標)タンパク質#50、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似物タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似物タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較し、DARPin(登録商標)タンパク質#31を、3つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン(それぞれ、CD70、CD123、及びCD33)及びN末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する半減期フォーマット化DARPin(登録商標)タンパク質#53、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)、及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似物タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した。図4に見られるように、半減期延長結合ドメインの付加は、DARPin(登録商標)タンパク質#27の場合には少なくとも20分の1、DARPin(登録商標)タンパク質#29の場合には4分の1、DARPin(登録商標)タンパク質#31の場合には10分の1未満のわずかな効力低下をもたらす。
【0523】
更に、CD3、CD33及びCD123に対して結合特異性を有する多重特異性アンキリン反復タンパク質であるDARPin(登録商標)タンパク質#8の特異性及び効力を、CD8+T細胞上のCD25活性化マーカを測定するFACSによるインビトロ短期T細胞活性化アッセイにおいて評価した。特異性及び効力を、既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブを、CD3及びCD33に対して結合特異性を有する組換えタンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#23、CD3及びCD123に対して結合特異性を有する組換えタンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#24の両方とそれぞれ比較した。
【0524】
簡潔には、1ウェル当たり50,000個の精製汎Tエフェクタ細胞及び50,000個のMOLM-13標的細胞を、組換えタンパク質又は対照ベンチマーク分子(フロテツズマブ及びAMG330)の段階希釈物と、2連で、600μMヒト血清アルブミンの存在下、37℃で24時間、共インキュベートした(E:T比1:1)。細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Aqua(Thermo Fisher)、1:250マウス抗ヒトCD8 Pasific Blue(BD)、及び1:100マウス抗ヒトCD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8を用いてデータをプロットした。図21に示すように、CD3、CD33、及びCD123に対して結合特異性を有し、したがってMOLM-13上の2つの腫瘍特異性標的に結合するDARPin(登録商標)タンパク質#8は、ベンチマーク分子に匹敵する特異性短期T細胞活性化を誘導したが、腫瘍特異性標的のうちの1つ(CD33又はCD123)のみにそれぞれ結合するDARPin(登録商標)タンパク質#23及びDARPin(登録商標)タンパク質#24は、効力の10~100分の1の低下を示した。
【0525】
同様の実験設定において、DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61もまた、CD8+T細胞上のCD25活性化マーカを測定するFACSによって評価した。簡単に説明すると、1ウェル当たり80,000個の精製された汎Tエフェクタ細胞及び20,000個のMolm-13又は標的細胞を、20μMヒト血清アルブミンの存在下、37℃で48時間、選択された試験タンパク質の段階希釈物と2連で同時インキュベートした(E:T比4:1)。48時間後、細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)、1:400マウス抗ヒトCD8 Pacific Blue(BD)、及び1:100マウス抗ヒト-CD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8(3-PL-フィット)を用いてデータをプロットした。
【0526】
図51Aに示すように、CD3、CD33、CD123、及びCD70に対して結合特異性を有する試験DARPinタンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、予想通り強力なT細胞活性化を誘導した(Molm-13に対してEC50はそれぞれ26.1pM及び10.4pM)。図51Aに示すDARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61は、予想通りの効力を示し、EC50値に関して互いにおよそ5倍の差がある。
【0527】
更に、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57はまた、陰性対照化合物として使用される非結合設計アンキリン反復タンパク質と比較して(同じ実験設定で)試験した。簡潔には、1ウェル当たり100,000個の精製された汎Tエフェクタ細胞及び20,000個のMolm-13標的細胞を、20μMヒト血清アルブミンの存在下で、37℃で48時間、選択されたタンパク質の段階希釈物と2連で共インキュベートした(培養汎T細胞についてE:T比5:1)。48時間後、細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)、1:400マウス抗ヒトCD8 Pacific Blue(BD)、及び1:100マウス抗ヒトCD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8(3-PL-フィット)を用いてデータをプロットした。
【0528】
図51Bに示すように、CD3、CD33、CD123、及びCD70に対して結合特異性を有する試験DARPinタンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、対応する陰性対照と比較して、強力かつ特異的なT細胞活性化(それぞれMolm-13に対してEC50 23.3pM)を誘導した。それぞれ腫瘍特異性標的又はCD3のいずれかにのみ結合する陰性対照タンパク質は、CD25活性化マーカのアップレギュレーションを示さなかった。
【0529】
DARPin(登録商標)タンパク質#56はまた、既知のベンチマーク分子フロテツズマブ類似物及びAMG330類似物と比較して(同じ実験設定で)評価した。図51Cに示すように、CD3、CD33、CD123、及びCD70に対して結合特異性を有する(したがって、3つの腫瘍特異性標的に結合する)DARPin(登録商標)タンパク質#56は、強力かつ特異的なT細胞活性化を誘導した。
【0530】
B.ヒト汎T細胞との共培養におけるMolm13 CRISPRノックアウト(KO)標的細胞に対する多特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57の特異性及び効力を、CD8+T細胞上のCD25活性化マーカを測定するFACSによるインビトロ短期T細胞活性化アッセイにおいて評価した。このアッセイでは、汎T細胞を、CD33、CD123、及びCD70に対して野生型標的発現を有するMolm-13細胞、並びに同じ標的に対して様々なノックアウトの組み合わせ(Molm13 CRISPRノックアウト(KO)標的細胞)からなる腫瘍細胞と共培養した(図51D及び図51E)。
【0531】
このため、1ウェル当たり100,000個の精製された汎Tエフェクタ細胞及び20,000個の標的細胞を、20μMのヒト血清アルブミンの存在下で、37℃で48時間、選択されたタンパク質の段階希釈物と2連で同時インキュベートした(E:T比5:1)。48時間後、細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)、1:400マウス抗ヒトCD8 Pacific Blue(BD)、及び1:100マウス抗ヒト-CD 25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8(3-PL-フィット)を用いてデータをプロットした。
【0532】
図51D及び51Eでは、CD33、CD123、CD70、及びCD3に特異的なDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57の効力(T細胞活性化)が、様々な標的ノックアウトの組み合わせを有するMolm-13腫瘍細胞の存在下で示されている。最も高い効力は、3つ全ての標的が同時発現される場合(曲線1)、及び更に2つの標的が同時発現される場合(曲線2~4)に、示される両方の分子について到達される。効力は、T細胞を、CD33+、CD123+、CD70+などの単一標的発現腫瘍細胞と共培養すると、最大10~100分の1に低下する(曲線5~7)。DARPin(登録商標)タンパク質#56は、CD33+単一発現腫瘍細胞に対して同様のEC50値を示すが、全てのノックアウト細胞株に対して同等の有効性に達するDARPin(登録商標)タンパク質#57と比較して有効性が低い。
【0533】
実施例6:組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質によって誘導される標的特異性短期腫瘍細胞殺傷のLDH細胞障害性アッセイによる評価
A.ヒト汎T細胞との共培養におけるMolm-13標的細胞に対する多重特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
2つ又は3つの異なる腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する多重特異性組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質#7~#14、DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#28、DARPin(登録商標)タンパク質#29、DARPin(登録商標)タンパク質#30の特異性及び効力を、LDH放出によるインビトロ短期細胞障害性アッセイによって評価した。
【0534】
エフェクタ細胞及び標的細胞を、600μMのヒト血清アルブミン(生理学的濃度を模倣するため)の存在下で、5:1のE:T比で96ウェルプレート中、2連で共インキュベートした。pan-T細胞単離キット(Miltenyi)を使用することによって、ヒトPBMCから付着していない(untouched)T細胞を単離した。1ウェル当たり100,000個の精製汎T細胞(エフェクタ細胞)と20,000個のMolm-13細胞(標的細胞)を、選択した多重特異性組換えタンパク質、対照ベンチマーク分子又は1%のTriton X-100を含む対照の段階希釈物と37℃で48時間インキュベートした。48時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、1ウェル当たり100μlの上清及び1ウェル当たり100μlのLDH反応混合物(LDH検出キット;Roche Applied Science)を30分間インキュベートした。吸光度を、TECAN infinite M1000Proリーダーによって492nm~620nmで測定した。バックグラウンド補正後、GraphPad Prism8を使用してOD値をプロットした。
【0535】
図22Aに示すように、半減期延長のないDARPinタンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#8及びDARPin(登録商標)タンパク質#9は、ベンチマーク分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330)に匹敵する腫瘍細胞殺傷を誘導したが、DARPin(登録商標)タンパク質#7及びDARPin(登録商標)タンパク質#10は、10~100分の1の効力を示す。図22Bの半減期が延長されたDARPin(登録商標)タンパク質#10~14は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約4~70分の1の低減を示す。
【0536】
図5に示すように、DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#28、DARPin(登録商標)タンパク質#29、及びDARPin(登録商標)タンパク質#30は、ベンチマーク分子AMG330及びフロテツズマブに匹敵する標的細胞殺傷活性を示す。更に、それらは、単一標的化対照組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質#40(CD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#41(CD123に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#42(CD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#43(CD70に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#44(CD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#45(CD70に対して結合特異性を有する)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#46(CD123に対して結合特異性を有する)と比較した場合に、明確なアビディティ獲得を示す。
【0537】
更に、多重特異性組換えタンパク質を、今度は半減期延長結合ドメインを有する同様のアッセイにおいて試験し、分子の効力に対する当該半減期延長の影響を評価した。2つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン(それぞれ特異性結合ドメイン(それぞれCD123及びCD33)及び1つの半減期延長ドメインを有しN末端に位置するDARPin(登録商標)タンパク質#47を、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#48)及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#49)と比較し、2つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン(それぞれCD70及びCD33)及びN末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有するDARPin(登録商標)タンパク質#50を、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#51)及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#52)と比較し、3つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン(それぞれCD70、CD123、及びCD33)及びN末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有するDARPin(登録商標)タンパク質#53を、N末端に位置する2つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#54)及びC末端に位置する1つの半減期延長ドメインを有する類似物のタンパク質(DARPin(登録商標)タンパク質#55)と比較した。図6に見られるように、半減期延長結合ドメインの付加は、DARPin(登録商標)タンパク質#27の場合には少なくとも20分の1、DARPin(登録商標)タンパク質#29の場合には4分の1、DARPin(登録商標)タンパク質#31の場合には10分の1未満のわずかな効力低下をもたらす。
【0538】
同じ実験設定において、DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61も評価した。
【0539】
図52Aに示すように、CD3、CD33、CD123、及びCD70に対して結合特異性を有する試験タンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、予想通り強力な腫瘍細胞殺傷を誘導する(Molm-13のEC50、それぞれ7.1pM及び1.6pM)一方で、図51Aに示されるDARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61は、EC50値に関して互いに5~10倍の差があり、予想通りの効力を示す。
【0540】
DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57はまた、陰性対照化合物として使用される非結合設計アンキリン反復タンパク質と比較して試験した。図52Bに示すように、試験タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、対応する陰性対照と比較した場合、汎T細胞の存在下で強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示す(Molm-13上のIC50、DARPin(登録商標)タンパク質#56:4.6pM、DARPin(登録商標)タンパク質#57:1.3pM)。陰性対照として設計アンキリン反復タンパク質は、腫瘍特異性標的(又はCD3)のいずれかにのみ結合し、予想通り、使用した最大濃度で腫瘍細胞殺傷をほとんどもたらさない。
【0541】
更に、DARPin(登録商標)タンパク質#56を、フロテツズマブ類似物及びAMG330類似物の既知のベンチマーク分子と比較して評価した。図52Cに示すように、試験したDARPin(登録商標)タンパク質#56は、ヒト汎T細胞の存在下で強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示す。フロテツズマブDARPin(登録商標)タンパク質#56の効力は同等であるが、DARPin(登録商標)タンパク質#56のEC50値は、試験したフロテツズマブ及びAMG330よりも低い。
【0542】
B.ヒト汎T細胞との共培養におけるMolm13 CRISPRノックアウト(KO)標的細胞に対する多特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
DARPin(登録商標)タンパク質#56の特異性及び効力を、LDH放出を測定することによって、インビトロ短期LDH細胞毒性アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、汎T細胞を、CD33、CD123、及びCD70に対して野生型標的発現を有するMolm-13細胞、並びに同じ標的に対する様々なノックアウトの組み合わせ(Molm13 CRISPRノックアウト(KO)標的細胞)からなる腫瘍細胞と共培養した(図52D)。
【0543】
このため、1ウェル当たり100,000個の精製汎T細胞(エフェクタ細胞)と20,000個のMolm-13 KO細胞(標的細胞)を、選択したCD3特異性換えタンパク質、対照ベンチマーク分子又は1%のTriton X-100を含む対照の段階希釈物と37℃で48時間インキュベートした。48時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、1ウェル当たり100μlの上清及び1ウェル当たり100μlのLDH反応混合物(LDH検出キット;Roche Applied Science)を30分間インキュベートした。吸光度を、TECAN infinite M1000Proリーダーによって492nm~620nmで測定した。バックグラウンド補正後、GraphPad Prism8を使用してOD値をプロットした。図52Dに示すように、3つ全ての標的が共発現される場合(曲線1)、及び更に2つの標的が共発現される場合(曲線2~4)、試験タンパク質についての最も高い効力に達する。効力は、T細胞を、CD33+、CD123+、CD70+などの単一標的発現腫瘍細胞と共培養すると、最大10~100倍低下する(曲線5~7)。更に、DARPin(登録商標)タンパク質#56では、CD33+細胞に対して有効性も低下する。
【0544】
実施例7:3つの腫瘍関連抗原を標的とする多重特異性組換えタンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質#31による腫瘍細胞殺傷の評価。
腫瘍細胞殺傷に対するDARPin(登録商標)タンパク質#31の活性を分析するために、エフェクタ細胞(汎T細胞、100,000細胞)及びMolm13腫瘍細胞(20,000細胞)を、5:1のE:T比で96ウェルプレートに播種した。汎T細胞をCell Trace Violet(CTV)で染色した後、播種して、FACS分析中に腫瘍細胞からの分化を可能にした。示された分子の段階希釈物の存在下での共培養の48時間後、フローサイトメトリーによって腫瘍細胞殺傷について試料を分析した。細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Aqua(Thermo Fisher)で染色し、4℃で30分間インキュベートした。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。腫瘍細胞殺傷は、残存するL/Dneg/CTVneg細胞の絶対数によって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8を用いてデータをプロットした。
【0545】
図7は、ベンチマーク対照分子(既知のベンチマークT細胞性エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)及びDARPin(登録商標)タンパク質#31を示す。データは、腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて、DARPin(登録商標)タンパク質#31が、臨床ベンチマークと比較した場合に同様の効力及び有効性を発揮することを示す。
【0546】
DARPin(登録商標)タンパク質#31はまた、Molm13 CRISPRノックアウト(KO)細胞上で同様に試験して、分子の機能性を調査した。図8に見られるように、曲線7は、3つ全ての標的(CD70、CD123、及びCD33)を発現するMolm13親細胞を表す。DARPin(登録商標)タンパク質#31は、ここで完全な効力を示す。曲線4~6は、2つの標的のみが依然として発現されていることを意味する単一KO細胞を表す。ここで、DARPin(登録商標)タンパク質#31は依然として活性であり、腫瘍不均一性に対抗する可能性を示唆している。曲線1~3は、二重KO細胞を表し、1つのみの標的が健常組織区画を模倣するために依然として発現されていることを意味する。ここで、DARPin(登録商標)タンパク質#31は有意に活性が低く、健常組織に対して選択性が改善されていることを意味する。要約すると、図7は、DARPin(登録商標)タンパク質#31が、腫瘍不均一性に対抗し、選択性を改善する可能性を有することを示す。
【0547】
実施例8:ヒトエキソビボ全血ループモデルにおけるサイトカイン放出に対する多重特異性結合タンパク質の効果
全血ループ系は、血液と薬物試料との間の相互作用(サイトカイン放出に対して効果を含む)を試験するために使用される。血液ループ系は、血中の免疫細胞、免疫グロブリン、並びにインタクトな補体及び凝固カスケード系の両方を独自に含む(Fletcher,E.A.K.ら、Int Immunopharmacol(2018年)54、1~11頁)。このシステムは、凝固を回避するために回転を維持される新鮮なヒト全血に依存し、ヒト血液循環を模倣するモデルを表す。
【0548】
A.組換え結合タンパク質DARPin(登録商標)#7、DARPin(登録商標)#8、DARPin(登録商標)#9、及びDARPin(登録商標)#10を、2つの既知の対照ベンチマークT細胞性エンゲージャ、AMG330類似物及びフロテツズマブ類似物と共に、全血ループ系において4つの異なる濃度で評価した(AMG330類似物/フロテツズマブ類似物:10nM、0.1nM、0.01nM及び0.001nM;DARPin(登録商標)#7~10:10nM、1nM、0.1nM及び0.01nM)。
全血ループ系において、サイトカイン放出を、0時間、4時間、8時間、24時間、及び48時間の時点で分析した。この試験では、サイトカイン放出のために、PBSを陰性対照として使用し、AMG330類似物/及びフロテツズマブ類似物をベンチマーク対照として使用した(T細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)。
【0549】
薬物試料は、以下の血中濃度を得るように調製した。AMG330類似物/フロテツズマブ類似物;10nM、0.1nM、0,01nM、及び0.001nM、DARPin(登録商標)#7~10;10nM、1nM、0.1nM、及び0.01nM。滅菌PBSをビヒクルとして、並びに各ループに添加される100μlの最終体積を得るための試験試料の希釈のために使用した。残りの試験試料溶液は廃棄した。
【0550】
ループ系中の全ての材料は、表面をヘパリン処理した。凝固を防止するために、血液をプラスチックチューブ中で回転するようにセットし、ここで、チューブの内側、実験の前に独特のヘパリン結合体で予めコーティングした。コーティングは、血液中への高い抗凝固剤添加を必要とせずに血液が循環することを可能にする。新鮮な全血を2人の健常ボランティア(D1、D2)から採取した。血液採取直後に、血液をプレコートプラスチックチューブに移してループを形成した後、以下の設計に従って試験アイテムを投与した。
1.ビヒクル(PBS)
2.AMG330類似物0.001nM
3.AMG330類似物0.01nM
4.AMG330類似物0.1nM
5.AMG330類似物10nM
6.フロテツズマブ類似物0.001nM
7.フロテツズマブ類似物0.01nM
8.フロテツズマブ類似物0.1nM
9.フロテツズマブ類似物10nM
10.DARPin(登録商標)#7 0.01nM
11.DARPin(登録商標)#7 0.1nM
12.DARPin(登録商標)#7 1nM
13.DARPin(登録商標)#7 10nM
14.DARPin(登録商標)#8 0.01nM
15.DARPin(登録商標)#8 0.1nM
16.DARPin(登録商標)#8 1nM
17.DARPin(登録商標)#8 10nM
18.DARPin(登録商標)#9 0.01nM
19.DARPin(登録商標)#9 0.1nM
20.DARPin(登録商標)#9 1nM
21.DARPin(登録商標)#9 10nM
22.DARPin(登録商標)#10 0.01nM
23.DARPin(登録商標)#10 0.1nM
24.DARPin(登録商標)#10 1nM
25.DARPin(登録商標)#10 10nM
【0551】
続いて、ループを回転するように設定し、各ドナーについて、26個のループのセットを2つの平行回転プラットフォーム上に分割した。
【0552】
2人の健常ドナー(18歳以上の男性)を募集した(献血から7日以内に急性感染がなく、NSAID又は任意の種類のコルチコステロイドの摂取がない)。
【0553】
採血後に直接保存された各ドナーからの新鮮な血液(ゼロ時点試料として記載される)を、血漿中に処理し、サイトカイン分析に含めた。ループを、試験物質及びEDTAの添加の4時間後、8時間後、24時間、及び48時間後にサンプリングした(血液中の濃度:10mM)を各試料に添加して、サンプリング時点で反応を停止させた。ループを、サイトカイン放出及びフローサイトメトリー分析のために、4時間、8時間、24時間、及び48時間でサンプリングした。血漿試料を遠心分離によって調製し、アリコートに分け、分析まで-60℃以下で保存した。
【0554】
サイトカイン(IFNγ、TNFα)を、Meso Scale Discovery MSDからのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使用して測定した(図11、12)。サイトカイン分析のための試料を、0、4時間、8時間、24時間、及び48時間の時点で収集した。血液試料を血漿に加工し、分析まで-60℃以下で保存し、分析は、本試験では試料収集から22日以内に行った。試料を1:4、1:8、1:16、1:32、又は1:100に希釈し、製造業者の指示に従って二連で実行した。
【0555】
検出下限(LLOD)をMSDソフトウェアによって計算し、0較正物質(標準-8)を超える2.5xSDとして定義した。検出上限(ULOD)は、標準-1のシグナル値からMSDソフトウェアによって計算される。定量化の下限及び上限(LLOQ及びULOQ)をMSDによって検証し、標準曲線及び希釈標準の回収率から20%の精度及び80~120%の精度で計算する。MSDからのIFNγ及びTNFαについての3つのレベルの多分析物対照(ロット番号A00C0640、A00C0641、A00C0641)を使用して、複数回の実行にわたる精度及び正確度を評価した。対照及び試験試料を二連で行った。対照の典型的な許容基準は、CV<20%である。この試験において、全ての実行間CV値は20%未満であった。
【0556】
サイトカインを、全血ループ系において、0(ゼロ)、4時間、8時間、24時間及び48時間の時点で測定した。DARPin(登録商標)#7~10及び対照に応答したサイトカインIFNγ及びTNFαの濃度は、2人のドナーの経時的な平均値、並びにMSDソフトウェアによって計算された0pg/mlを超える全ての値についての生の平均濃度データとして、図27及び28に示す。サイトカイン産生は、50pg/ml以下の値については低、50pg/ml超~500pg/ml以下の値については中、500pg/ml超~5000pg/ml以下の値については高と記載する(任意分類)。
【0557】
IFNγのレベル
ループ系において、AMG330類似物及びフロテツズマブ類似物は、2つの最も高い濃度(10nM及び0.1nM)で高レベルのIFNγを誘導したが、0.01nMでは、レベルは、AMG330類似物では中等度から高度であり、フロテツズマブ類似物では低度から中等度であった。最低濃度(0.001nM)での両ベンチマークT細胞エンゲージャについて、IFNγレベルは低かった(図27)。DARPin(登録商標)#7群ではIFNγレベルが低く、最高濃度(10nM)のみがビヒクルの上に認められ、8時間でピークを示した(平均34.8pg/ml)。DARPin(登録商標)#8~10を用いたループにおけるIFNγレベルは、4時間後に10nMピークで高く(DARPin(登録商標)#8について平均6758.6pg/ml、DARPin(登録商標)#9について平均10988.6pg/ml、及びDARPin(登録商標)#10について平均18972.3pg/ml)、24時間後に1nMピークであり(DARPin(登録商標)#8について平均3914.4pg/ml、DARPin(登録商標)#9について平均6482.0pg/ml、及びDARPin(登録商標)#10について平均4511.3pg/ml)、24時間後に0.1nMピークで低~高(DARPin(登録商標)#8について平均222.4pg/ml、DARPin(登録商標)#9について平均710.1pg/ml、及びDARPin(登録商標)#10について平均326.4pg/ml)であった。DARPin(登録商標)#7~10の最低濃度(0.01nM)では、IFNγレベルは低く、4つ全ての時点でビヒクルと同等であった。
【0558】
TNFαのレベル
IFNγと同様に、高いTNFαレベルが、10nMでAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物において認められ、AMG330類似物では24時間後にピーク(平均7680.9pg/ml)、フロテツズマブ類似物では4時間後にピーク(平均4594.1pg/ml)であった(図28)。0.1nMでは、TNFαレベルは高く、AMG330類似物のレベルでは24時間後にピークに達し(平均6159.6pg/ml)、フロテツズマブ類似物のレベルでは8時間後にピークに達した(平均4077.3pg/ml)。0.01nMでは、TNFαレベルは、AMG330類似物では中等度から高度であったが(24時間後のピークは平均1813.9pg/ml)、フロテツズマブ類似物では、レベルは低度から中等度であった(24時間後のピークは141.9pg/ml)。0.001nMでのAMG330類似物及びフロテツズマブ類似物におけるTNFαレベルは低く、ビヒクル群と同等であった。TNFαレベルは、全ての4つの時点で全てのDARPin(登録商標)#7群において低く、18.5pg/mlで48時間後にピークに達した最高濃度は別として、全てがビヒクルと同等であった。DARPin(登録商標)#8~10を用いたループにおけるTNFαレベルは、それぞれ、DARPin(登録商標)#8については24時間後(平均2732.8pg/ml)、及びDARPin(登録商標)#9~10については8時間後(平均4671.9pg/ml及び6026.4pg/ml)にピークに達する10nMで中~高レベルであった。1nMでは、TNFαレベルは中~高いレベルであり、24時間後にピークに達した(DARPin(登録商標)#8では2046.0pg/ml、DARPin(登録商標)#9では3288.6pg/ml、DARPin(登録商標)#10では2522.7pg/mlの平均)。0.1nMのDARPin(登録商標)#8~10では、TNFαレベルは、4時間及び8時間の時点で低~中であったが、24~48時間では、レベルは中~高であった(24時間後のDARPin(登録商標)#8のピークは88.3pg/ml、48時間後のDARPin(登録商標)#9のピークは800.7pg/ml、24時間後のDARPin(登録商標)#10のピークは1382.8pg/ml)。最低濃度(0.01nM)では、全てのDARPin(登録商標)#8~10群は、4つの時点全てでビヒクル群と同等であった。
【0559】
全体として、既知のベンチマーク対照群(10nM、0.1nM及び0.01nM)及びDARPin(登録商標)#8~10群(10nM、1nM及び0.1nM)では、4つの時点全てにおいて、ビヒクルよりも高いレベルの全てのサイトカイン(IFNγ及びTNFα)が観察された。DARPin(登録商標)#7(全ての濃度)、AMG330類似物及びフロテツズマブ類似物(0.001nM)、並びにDARPin(登録商標)#8~10(0.01nM)に応答して、明確なサイトカイン放出は観察されなかった。これは、10倍高い濃度のDARPin(登録商標)#8~10が、参照分子AMG330類似物及びフロテツズマブ類似物によって誘導されるサイトカイン放出を一致させるために適用される必要があることを示唆し得る。更に、これは、DARPin(登録商標)#8~10化合物による、より管理可能なサイトカイン放出を示唆する。
【0560】
B.組換え結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#29、及びDARPin(登録商標)タンパク質#31を、既知の対照ベンチマークT細胞エンゲージャのフロテツズマブと共に、全血ループ系において3つの異なる濃度で評価した。
全血ループ系において、サイトカイン放出を、0時間、2時間、4時間、8時間、及び24時間の時点で分析した。この試験では、サイトカイン放出について、PBSを陰性対照として使用し、フロテツズマブをベンチマーク陽性対照(CD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)として使用した。
【0561】
薬物試料及び陽性対照を調製して、血液中の以下の濃度を得た:0.005nM、0.1nM、及び2nM。滅菌PBSをビヒクルとして、並びに各ループに添加される100μlの最終体積を得るための試験試料の希釈のために使用した。残りの試験試料溶液は廃棄した。
【0562】
ループ系中の全ての材料は、表面をヘパリン処理した。凝固を防止するために、血液をプラスチックチューブ中で回転するようにセットし、ここで、チューブの内側、実験の前に独特のヘパリン結合体で予めコーティングした。コーティングは、血液中への高い抗凝固剤添加を必要とせずに血液が循環することを可能にする。新鮮な全血を3人の健常ボランティア(D1~D3)から採取した。血液採取直後に、血液をプレコートプラスチックチューブに移してループを形成した後、以下の設計に従って試験アイテムを投与した。
1.ビヒクル(PBS)
2.フロテツズマブ0.005nM
3.フロテツズマブ0.1nM
4.フロテツズマブ2nM
5.DARPin(登録商標)タンパク質#27 0.005nM
6.DARPin(登録商標)タンパク質#27 0.1nM
7.DARPin(登録商標)タンパク質#27 2nM
8.DARPin(登録商標)タンパク質#29 0.005nM
9.DARPin(登録商標)タンパク質#29 0.1nM
10.DARPin(登録商標)タンパク質#29 2nM
11.DARPin(登録商標)タンパク質#31 0.005nM
12.DARPin(登録商標)タンパク質#31 0.1nM
13.DARPin(登録商標)タンパク質#31 2nM
【0563】
続いて、ループを回転するように設定し、各ドナーについて、26個のループのセットを2つの平行回転プラットフォーム上に分割した。
【0564】
3人の健常ドナー(18歳以上の女性2人及び男性1人)を募集した(献血から7日以内に、急性感染がなく、NSAID又は任意の種類のコルチコステロイドの摂取がない)。
【0565】
採血後に直接保存した新鮮な血液(ゼロ時点試料として記載)を血液学的測定に使用した。更に、ゼロ時点で採取した血液を血漿に加工し、サイトカイン分析に含めた。試料を、試験物質及びEDTAの添加の2、4、8、及び24時間後に各ループから抽出し、EDTA(血液中の濃度:10mM)を各試料に添加して、サンプリング時点で反応を停止させた。血液学及びサイトカイン放出分析のために、2、4、8、及び24時間目にループをサンプリングした。血漿試料を遠心分離によって調製し、アリコートに分け、分析まで-60℃以下で保存した。
【0566】
Meso Scale Discovery(MSD)からのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使用して、サイトカイン(IFNγ、IL-2、IL-6、IL-8、TNFα)を測定した。サイトカインのレベルは、経時的に平均値として示される(図9図10図11図12図13)。サイトカイン分析のための試料を、0、2、4、8、及び24時間の時点で収集した。血液試料を血漿に加工し、分析まで-60℃以下で保存した。分析は、本試験では試料収集から8日以内に行った。試料を1:4(又は1:100)に希釈し、製造業者の指示に従って二連で行った。
【0567】
検出下限(LLOD)をMSDソフトウェアによって計算し、0較正物質(標準-8)を超える2.5xSDとして定義した。検出上限(ULOD)は、標準-1のシグナル値からMSDソフトウェアによって計算される。定量化の下限及び上限(LLOQ及びULOQ)をMSDによって検証し、標準曲線及び希釈標準の回収率から20%の精度及び80~120%の精度で計算する。希釈血漿試料の測定平均濃度値がLLOQ未満又はULOQ超である場合、データをLLOQ未満又はULOQ超と定義した。データを希釈係数(4×又は100×)によって更に変換して、計算された平均濃度値を得た。生データは、全ての試料の計算された平均濃度値に対応した。定量可能な範囲内の複製の許容基準を、係数値(CV)≦20%として設定した。全ての試料は、複製について20%以下のCV値を有していた。
【0568】
サイトカインを、全血ループ系において0(ゼロ)、2、4、8、及び24時間の時点で測定した。薬物試料に応答したサイトカインIFNγ、IL-2、IL-6、IL-8、及びTNFαの濃度を、3人のドナーの経時的な平均値として図9図10図11図12図13に示す。サイトカイン産生は、50pg/ml以下の値については低、50pg/ml超~500pg/ml以下の値については中、500pg/ml超~5000pg/ml以下の値については高と記載する(任意分類)。
【0569】
IFNγのレベル
IFNγは、2nM及び0.1nMのフロテツズマブを含む試料において高レベル(500pg/ml超と定義される)で誘導され、2nMで平均1243.8から48937.8pg/mlまで、0.1nMで485.7から31335.2pg/mlまで経時的に増加したが、0.005nMのフロテツズマブを含む試料では、IFNγレベルは、平均11.9から2064.8pg/mlまで経時的に低から高に上昇した(図9)。DARPin(登録商標)タンパク質#27(2nMで)は、平均233.5から6131.5pg/mlまで(2~24時間で)経時的に増加する中~高レベルのIFNγを誘導した。0.1nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、IFNγのレベルは、ビヒクルと比較して、平均10.2から334.3pg/mlまで(2~24時間)低レベルから中レベルに増加した。0.005nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、IFNγのレベルは低く、全てのドナーにおいて4つの時点全てでビヒクルと同様であった。DARPin(登録商標)タンパク質#29を有する試料では、IFNγのレベルは低く、0.005nM及び0.1nMでビヒクルと同様であったが、2nMでは、レベルは、2~24時間の時点で平均3.1から55.2pg/mlまでビヒクルよりもわずかに増加した。2nMのDARPin(登録商標)タンパク質#29を有する試料では、IFNγのレベルは、2時間での平均23.4pg/mlから24時間での511.0pg/mlまで経時的に増加したが、レベルは低く、0.1nM及び0.005nMでは4つの時点全てでビヒクルと同様であった。
【0570】
IL-2のレベル
IL-2のレベルは、2時間及び4時間でフロテツズマブ(0.005nM)を有する試料において低かったが、8~24時間でビヒクルと比較して経時的に増加し、24時間の時点で472.1pg/mlの平均ピークを有した(図10)。0.1nM及び2nMで、フロテツズマブは、8時間の時点で1951.6pg/ml(0.1nMで)及び2756.6pg/ml(2nMで)の平均ピークで低~高レベルのIL-2を誘導した。IL-2のレベルは低く、DARPin(登録商標)タンパク質#27の0.005でビヒクルと同様であったが、0.1nMではレベルは低かったが、D1ではなくD2及びD3からの試料において24時間でビヒクルよりも増加した。2nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、IL-2のレベルは、24時間の時点で600.0pg/mlの平均ピークで、2~4時間での低レベルから8~24時間での高レベルに増加した。DARPin(登録商標)タンパク質#29を有する試料において、IL-2のレベルは、IL-2レベルが2nMでD1及びD3からの試料においてビヒクルよりも増加した24時間の時点を除いて、全ての濃度及び時点で低かった。DARPin(登録商標)タンパク質#31を有する試料では、IL-2のレベルは、最も高い濃度(2nM)を除いて、全ての濃度及び時点で低かったが、ここで、レベルは、24時間で99.9pg/mlの平均ピークを有する3つの後の時点でビヒクルよりも増加した。
【0571】
IL-6のレベル
IL-6は、2nM及び0.1nMのフロテツズマブを有する試料において低~高レベルで誘導され、2nMで平均3.5から432.2pg/mlまで、0.1nMで1.4から713.2pg/mlまで経時的に増加したが、0.005nMのフロテツズマブを有する試料において、IL-6のレベルは低く、2~4時間でビヒクルと同様であり、8~24時間でビヒクルよりも増加し、24時間で1744.4pg/mlの平均ピークを有した(図11)。DARPin(登録商標)タンパク質#27(2nM)を有する試料では、IL-6レベルは、3つの後の時点(4~24時間)でビヒクルよりも増加したが、0.005及び0.1nMでは、レベルは、中程度のレベルが観察された24時間の時点でのD3(77.6pg/ml)を除いて、低いか又はビヒクルと同様であった。IL-6のレベルは、4つの時点全てにおいて、DARPin(登録商標)タンパク質#29及びDARPin(登録商標)タンパク質#31の全ての濃度で、低い(50pg/ml未満と定義される)か、又はビヒクルと同様であった。
【0572】
IL-8のレベル
IL-8のレベルは、2nM及び0.1nMのフロテツズマブを有する試料において経時的に中から高に増加したが、0.005nMでは、レベルは、4つ全ての時点でD1においてビヒクルと同様であり、D2(24時間)及びD3(4~24時間)からの試料においてビヒクルよりも増加した(図12)。2nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、IL-8レベルは、3人のドナー全てについて時間と共にビヒクルよりも増加したが、0.1nMでは、IL-8レベルは、D2(24時間)及びD3(4~24時間)からの試料においてビヒクルよりも増加したが、D1では増加しなかった。0.005nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、IL-8のレベルは4つ全ての時点でビヒクルと同様であった。DARPin(登録商標)タンパク質#29を用いた全ての試料において、IL-8のレベルは低く、ビヒクルと同様であったが、DARPin(登録商標)タンパク質#31を用いた試料では、IL-8レベルは、最高濃度(2nM)及び4~24時間でビヒクルよりわずかに増加した。
【0573】
TNFαのレベル
TNFαは、2nM及び0.1nMのフロテツズマブを有する試料において中~高レベル(500pg/ml超として定義される)で誘導され、2nMで平均412.1から7673.8pg/mlまで、0.1nMで184.2から4689.8pg/mlまで経時的に増加したが、0.005nMのフロテツズマブを有する試料では、TNFαレベルは、平均3.9から458.9pg/mlまで低~高に経時的に増加した(図13)。DARPin(登録商標)タンパク質#1(2nM)は、平均57.8pg/mlから1522.6pg/ml(2~24時間)まで中~高レベルに経時的に増加するTNFαを誘導した。0.1nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、TNFαのレベルは、ビヒクルと比較して、平均4.0~95.4pg/ml(2~24時間)で低~中レベルに増加した。0.005nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27では、TNFαのレベルは低く、全てのドナー及び4つ全ての時点でビヒクルと同様であった。DARPin(登録商標)タンパク質#29を有する試料では、TNFαのレベルは低く、3つ全ての濃度及び4つ全ての時点でビヒクルと同様であった。2nMのDARPin(登録商標)タンパク質#31を有する試料では、TNFαのレベルは、2時間で6.5pg/mlから24時間で98.6pg/mlの平均で、低~中レベルまで経時的に増加したが、レベルは低く、0.1nM及び0.005nMでは4つ全ての時点でビヒクルと同様であった。
【0574】
全体として、4つ全ての時点(2、4、8、及び24時間)でビヒクル群において認められたIFNγ、IL-2、IL-6及びTNFαのレベルは、概して、ゼロ時点群において認められたレベルと同様であった。対照的に、IL-8について0とビヒクルとの間で観察された差異が存在し、これは、活性カスケード系を有する系におけるビヒクルに応答したドナーからのサイトカイン放出のバックグラウンドレベルを示し得る。結論として、フロテツズマブ(0.005、0.1、及び2nM)、DARPin(登録商標)タンパク質#27(0.1及び2nM)及びDARPin(登録商標)タンパク質#31(2nM)は、フロテツズマブ>DARPin(登録商標)タンパク質#27>DARPin(登録商標)タンパク質#31の大きさの順序で経時的に増加するサイトカイン放出を誘導した。対照的に、DARPin(登録商標)タンパク質#29は、3つ全ての濃度及び4つ全ての時点でサイトカインを誘導しなかったか、又は低レベルのサイトカインを誘導した。
【0575】
C.CD70、CD123、及びCD33を標的とする、組換え結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#60、DARPin(登録商標)タンパク質#61、及びDARPin(登録商標)タンパク質#56を、全血流ループ系において3つの異なる濃度で評価し、半減期が延長された非TAA(Ni2C)DARPin(登録商標)タンパク質#74及びベンチマークとしてのフロテツズマブ類似物と比較した。
全血ループ系において、サイトカイン放出を、0時間、2時間、4時間、8時間、及び24時間の時点で分析した。本試験では、サイトカイン放出のために、PBSを陰性対照として使用し、フロテツズマブ類似物をベンチマーク陽性対照(CD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)として使用した。
【0576】
薬物試料及び陽性対照を調製して、血液中で以下の濃度を得た。0.005nM、0.1nM、及び2nM。滅菌PBSをビヒクルとして、並びに各ループに添加される100μlの最終体積を得るための試験試料の希釈のために使用した。残りの試験試料溶液は廃棄した。
【0577】
ループ系中の全ての材料は、表面をヘパリン処理した。凝固を防止するために、血液をプラスチックチューブ中で回転するようにセットし、ここで、チューブの内側、実験の前に独特のヘパリン結合体で予めコーティングした。コーティングは、血液中への高い抗凝固剤添加を必要とせずに血液が循環することを可能にする。新鮮な全血を3人の健常ボランティア(D1~D3)から採取した。血液採取直後に、血液をプレコートプラスチックチューブに移してループを形成した後、以下の設計に従って試験アイテムを投与した。
【0578】
【表13】
【0579】
続いて、ループを回転するように設定し、各ドナーについて、26個のループのセットを2つの平行回転プラットフォーム上に分割した。
【0580】
3人の健常ドナー(18歳以上の女性2人及び男性1人)を募集した(献血から7日以内に、急性感染がなく、NSAID又は任意の種類のコルチコステロイドの摂取がない)。
【0581】
採血後に直接保存した新鮮な血液(ゼロ時点試料として記載)を血液学的測定に使用した。更に、ゼロ時点で採取した血液を血漿に加工し、サイトカイン分析に含めた。試料を、試験物質及びEDTAの添加の2、4、8、及び24時間後に各ループから抽出し、EDTA(血液中の濃度:10mM)を各試料に添加して、サンプリング時点で反応を停止させた。血液学及びサイトカイン放出分析のために、2、4、8、及び24時間目にループをサンプリングした。血漿試料を遠心分離によって調製し、アリコートに分け、分析まで-60℃以下で保存した。
【0582】
Meso Scale Discovery(MSD)からのMULTI-ARRAY(登録商標)技術を使用して、サイトカイン(IFNγ、IL-2、IL-6、IL-8、TNFα)を測定した。サイトカインのレベルは、経時的に平均値として示される(図44図45図46図47図48)。サイトカイン分析のための試料を、0、2、4、8、及び24時間の時点で収集した。血液試料を血漿に加工し、分析まで-60℃以下で保存した。分析は、本試験では試料収集から8日以内に行った。試料を1:4(又は1:100)に希釈し、製造業者の指示に従って二連で行った。
【0583】
検出下限(LLOD)をMSDソフトウェアによって計算し、0較正物質(標準-8)を超える2.5xSDとして定義した。検出上限(ULOD)は、標準-1のシグナル値からMSDソフトウェアによって計算される。定量化の下限及び上限(LLOQ及びULOQ)をMSDによって検証し、標準曲線及び希釈標準の回収率から20%の精度及び80~120%の精度で計算する。希釈血漿試料の測定平均濃度値がLLOQ未満又はULOQ超である場合、データをLLOQ未満又はULOQ超と定義した。データを希釈係数(4×又は100×)によって更に変換して、計算された平均濃度値を得た。生データは、全ての試料の計算された平均濃度値に対応した。定量可能な範囲内の複製の許容基準を、係数値(CV)≦20%として設定した。全ての試料は、複製について20%以下のCV値を有していた。
【0584】
サイトカイン産生は、50pg/ml以下の値については低、50pg/ml超~500pg/ml以下の値については中、500pg/ml超~5000pg/ml以下の値については高と記載する(任意分類)。
【0585】
全体として、最低濃度(0.005)でのDARPin(登録商標)タンパク質#56 DARPin(登録商標)タンパク質#57は、ビヒクルと比較してIL-2、IL-8、又はTNFαの増加を誘導しなかった。更に、最低及び中濃度のDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#60は、同じ濃度で試験した他の全てのタンパク質よりも遅い時点でIL-2及びIL-6を誘導した。最高濃度のDARPin(登録商標)タンパク質#60は、8時間及び24時間の時点で、ほとんどの試験アイテムと同様のTNFαレベルを誘導した。対照的に、最高濃度のDARPin(登録商標)タンパク質#56は、他の全ての試験アイテムよりも低いTNFα値を誘導した。フロテツズマブのCD3及びCD123結合特性は、予想通りに細胞枯渇及びサイトカイン放出を誘導したが、DARPin(登録商標)タンパク質#74は、ビヒクルと比較して、細胞枯渇及び免疫反応を顕著に変化させなかった。
【0586】
実施例9:ヒトエキソビボ全血ループモデルにおけるT細胞活性化、細胞生存性、血小板数、及び白血球数に対する多重特異性結合タンパク質の効果
A.T細胞活性化及び細胞生存性に対する多重特異性結合タンパク質の効果
実施例8と同様に、全血ループ系において、AMG330類似物/フロテツズマブ類似物及びDARPin(登録商標)#7~10に応答したT活性化及び生存性を、0時間(投与前)、4時間、8時間、24時間、及び48時間の時点で評価した。試料を実施例10に記載のように調製した。血液細胞を蛍光標識モノクローナル抗体(Biolegendによって提供される)で染色して、骨髄細胞(CD33+及びCD123+-使用した抗体:CD33-PE/Cy7、CD123-PerCP/Cy5.5)、T細胞(CD3-使用した抗体: CD3-BV510)、活性化マーカ(CD69、CD25-使用した抗体: CD69-BV421、CD25-APC)、及び死細胞を染色する生存性色素(Fixable viability dye eFluor780)を検出した。各ループについて経時的な相対細胞数を計算するために、細胞計数ビーズを添加した。フローサイトメトリー分析用の試料を蛍光標識抗体と共にインキュベートし、赤血球を溶解し、洗浄した。試料をCytoFlexフローサイトメーター(Beckman Coulter)にかけ、データをFlowJo v10によって分析して、活性化マーカ及び生存性色素について陽性の細胞型のパーセンテージ(死細胞%)を提示した。更に、両方のドナーについてのゼロ試料を、T細胞によるCD33及びCD123発現について分析した。ループから収集した血液試料の分析に加えて、各ドナーのゼロ時点の試料を、全血細胞に特異的な抗体と共に、活性化マーカなしでインキュベートした。全ての対照は予想通りであった。フローサイトメトリー中の蛍光体のスペクトル重複を補償するために、補償を行った。ビーズ(cat.no.B22804、Beckman Coulter)を、試験に含まれたものと同じ蛍光体を有する抗体で染色し、ソフトウェア(Beckman CoulterによるCytExpert)によって自動補正計算を行った。単一染色細胞を用いて補償設定を評価し、必要に応じて最適化した。
【0587】
フローサイトメトリー分析を、4時間、8時間、24時間、及び48時間の時点で収集した試料に対して行った。更に、ゼロ時点の試料を分析して、採血後に直接的に細胞活性化状態を決定した。表面マーカ(CD3、CD33+、及びCD123+)を使用して、T細胞及び骨髄細胞を検出した。細胞活性化及び生存性を、活性化マーカCD25、CD69(活性化)及び死細胞に結合する生存性染色によって測定した。加えて、細胞数がCD3+、CD33+、及びCD123+細胞について経時的にどのように変化するかを分析するためにカウントビーズを含めた(図29~30)。
【0588】
T細胞活性化
CD25+T細胞のパーセンテージは、全ての群において(4時間及び8時間の時点で)ビヒクルと同様であった(4時間で9.3%の陽性細胞及び8時間で7.0%の陽性細胞の平均)(図29)。24時間及び48時間で、AMG330類似物/フロテツズマブ類似物(10nM及び0.1nMで)の群において、CD25+T細胞のパーセンテージは、15.4~28.4%の陽性T細胞の範囲でビヒクルよりも増加したが、AMG330類似物/フロテツズマブ類似物の2つの最低濃度は、24時間及び48時間の時点でビヒクルと類似していた(24時間で13.5%及び48時間で13.9%の平均)。DARPin(登録商標)#7群におけるCD25+T細胞のパーセンテージは、4つの時点でビヒクルと同様であった。DARPin(登録商標)#8-10は、4時間及び8時間でビヒクルと同様であった。24時間及び48時間で、CD25%T細胞のパーセンテージは、DARPin(登録商標)#8では11.9~23.2%、DARPin(登録商標)#9では12.3~26.2%、及びDARPin(登録商標)#10では12.4~26.5%の範囲で増加した。2つの最も低いDARPin(登録商標)#8-10濃度(0.1nM及び0.01nM)では、CD25陽性T細胞のパーセンテージは、4つ全ての時点でビヒクルと同様であった。
【0589】
T細胞は、10nM(4時間で28.9%陽性T細胞のピーク平均)、0.1nM(8時間で30.0%陽性T細胞のピーク平均)、及び0.01nM(24時間で22.0%陽性T細胞のピーク平均)でAMG330類似物によってCD69を発現するように活性化された(図30)。0.001nMでは、AMG330類似物群は、ビヒクルと類似物していた(平均4時間で2.5%、8時間で3.0%、24時間で5.6%、及び48時間で7.9%)。フロテツズマブ類似物は、10nM(8時間で52.2%陽性T細胞のピーク平均を有する)、0.1nM(8時間で39.7%陽性T細胞のピーク平均を有する)、及び0.01nM(24時間で39.7%陽性T細胞のピーク平均を有する)でCD69発現を誘導した。DARPin(登録商標)#7群におけるCD69発現は、4つの時点全てにおいてビヒクルと同様であった。10nMのDARPin(登録商標)#8-10群では、CD69発現は、DARPin(登録商標)#10では4時間で10nMでピークに達し(平均41.4%陽性T細胞)、10nMのDARPin(登録商標)#8-9では8時間後にピークに達した(平均DARPin(登録商標)#8では26.4%、DARPin(登録商標)#9では33.1%)。1nM及び0.1nMにおいて、CD69発現は、DARPin(登録商標)#8~10群において24~48時間でピークに達し、陽性T細胞の範囲平均は14.4%~30.6%であった(図30)。0.01nMでは、DARPin(登録商標)#8~10群は、4つの時点全てでビヒクルと同様であった。
【0590】
細胞生存性
細胞型マーカ及び活性化マーカに加えて、生存性色素を染色に含めて、標的細胞及びエフェクタ細胞の生存性を評価した(死細胞%として提示)。更に、生存性色素染色は細胞型マーカの発現に依存するため、細胞数は、生存性及び細胞数の包括的な像を経時的にもたらすことが報告された(図31~32)。
【0591】
生存性色素陽性T細胞%(すなわち、死細胞%)は、試験した全ての分子について11.0%未満であった(図31)。全ての分子におけるT細胞の数は、DARPin(登録商標)#7(1nMで20.8%及び10nMで19.2%の平均低下)を除いて、4時間でビヒクルと同様であった(ビヒクル群と比較して20%未満の低下として定義される)。8時間で、T細胞数は、10nMでビヒクルと比較して低下したが(AMG330類似物について33.3%、フロテツズマブ類似物について26.3%、DARPin(登録商標)#9について19.8%、及びDARPin(登録商標)#10について63.6%の平均低下)、他の全ての群は、8時間の時点でビヒクルと類似していた。24時間後、ビヒクル群におけるT細胞数は低下し、0.01nMのDARPin(登録商標)#8を除いて(ビヒクルと比較して43.6%の平均低下)、全ての群がビヒクルと同様であった。48時間後、T細胞数は、ビヒクルと比較して2つの最低濃度、0.1nM(平均低下63.9%)及び0.01nM(平均低下23.5%)で最大の低下があったDARPin(登録商標)#8を除いて、分子濃度の増加と共に低下した(平均低下範囲は、AMG330類似物で15.5~86.5%、フロテツズマブ類似物で45.4~83.0%、DARPin(登録商標)#7で48.7~65.2%、DARPin(登録商標)#9で27.9~62.4%、及びDARPin(登録商標)#10で20.7~58.9%)。
【0592】
AMG330類似物群において、CD33+骨髄細胞は、10nM(8時間で平均56.4%の生存性色素陽性細胞、24時間で56.1%及び48時間で52.8%)、0.1nM(8時間で平均15.3%の生存性色素陽性細胞、24時間で58.0%及び48時間で51.1%)及び0.01nM(24時間で平均19.8%の生存性色素陽性細胞及び48時間で31.5%)で生存性色素(すなわち、死細胞%)について陽性に染色された(図32)。フロテツズマブ類似物は、10nM(4時間で平均53.2%、8~48時間で98.0%超の生存性色素陽性細胞を有する)及び0.1nM(24時間で平均76.3%、48時間で80.1%)でCD33+細胞を殺傷した。より低い濃度(AMG330類似物/フロテツズマブ類似物については0.001nM、DARPin(登録商標)#8-10については0.01nM、及びDARPin(登録商標)#7については0.1nM)では、生存性は、4つ全ての時点でビヒクルと同様であった(10%未満の生存性色素陽性細胞)。4時間で、生存性色素陽性細胞の%は、DARPin(登録商標)#7群(10nMで平均13.6%及び1nMで11.2%の生存性色素陽性細胞生存性)、DARPin(登録商標)#8群(0.1nMで平均19.7%)、及びDARPin(登録商標)#10群(10nMで平均14.0%、1nMで13.9%及び0.01nMで14.2%)において、ビヒクルと比較して増加した。DARPin(登録商標)#7~10群は、10nMで8~48時間でビヒクルと比較して生存性色素陽性細胞のパーセンテージを増加させた(DARPin(登録商標)#7では10.5~30.2%、DARPin(登録商標)#8では73.1~69.1%、DARPin(登録商標)#9では90.9~92.6%、DARPin(登録商標)#10では93.7~91.9%の範囲平均)。1nMで、DARPin(登録商標)#8は24~48時間で(39.6~42.1%の平均)、DARPin(登録商標)#9は8~48時間で(13.7~60.7%の平均)、及びDARPin(登録商標)#10は8~24時間で(13.2~47.1%の平均)陽性細胞の生存性を誘導した。更に、DARPin(登録商標)#9及びDARPin(登録商標)#10は、0.01nMで、DARPin(登録商標)#9については48時間で(平均33.9%)、v10については24~48時間で(それぞれ平均22.9%及び14.7%)、生存性陽性細胞のパーセンテージを増加させた。
【0593】
同様に、DARPin(登録商標)#7を除く全ての試験群において、CD33+細胞の細胞数は、最高分子濃度(10nM)で4~8時間の時点でビヒクルと比較して減少した(30%超の差)(図35)。2番目に高い濃度(AMG330類似物/フロテツズマブ類似物では0.1nM及びDARPin(登録商標)#7~10では1nM)は、全ての試験群について8~24時間の時点でCD33+細胞の低下を引き起こす。より低い濃度(AMG330類似物/フロテツズマブ類似物では0.01~0.001nM、DARPin(登録商標)#7~10では0.1~0.01nM)では、CD33+細胞は、初期の時点でビヒクルと同様であり、いくつかの群については、細胞数は後期の時点で減少した。
【0594】
生存性色素陽性CD123+細胞のパーセンテージ(すなわち、死細胞%)は、ビヒクルと同様であり、4時間で試験した全ての分子について平均8.0%未満、8時間で20.0%未満であった。24時間で、生存性陽性CD123+細胞のパーセンテージは、最高濃度のAMG330類似物、DARPin(登録商標)#8、DARPin(登録商標)#9、及びDARPin(登録商標)#10(10.2~29.2%の生存性色素陽性細胞の範囲平均を有する)でビヒクルと比較して増加した。48時間で、生存性色素陽性細胞のパーセンテージは、全ての群において3.0~50.3%の範囲であり、群の一部はビヒクル群よりも高く、一部はビヒクル群よりも低かった(平均13.9%)(図31~33)。
【0595】
AMG330類似物群におけるビヒクルと比較して、CD123+細胞の数は、10nM(4時間で54.6%、8時間で85.1%、24時間で89.5%、及び48時間で78.6%の平均低下)、0.1nM(8時間で40.3%、24時間で81.5%、及び48時間で86.6%の平均低下)及び0.01nM(24時間で49.3%及び48時間で72.4%の平均低下)で経時的に低下した(図36)。フロテツズマブ類似物は、10nM(10nMで8時間で60.2%、24時間で65.2%、及び48時間で42.4%の平均低下)及び0.1nM(24時間で79.0%、及び24時間で63.4%の平均低下)でCD123+細胞の低下を誘導した。より低い濃度のAMG330類似物(0.001nM)及びフロテツズマブ類似物(0.01nM及び0.001nM)では、カウントは、4つ全ての時点でビヒクルと同様であった。DARPin(登録商標)#7群において、%CD123+細胞は、ビヒクルと比較して31.2%の低下が認められた4時間の時点で1nMを有する群を除いて、ビヒクルと同様であった。DARPin(登録商標)#8-10は、分子濃度及び時点の増加と共に、ビヒクル群と比較してCD123+細胞の数を減少させた。10nM(8時間で50.4%、24時間で47.7%、及び48時間で72.9%の平均低下)及び1nM(24時間で38.1%及び48時間で68.1%の平均低下)でのDARPin(登録商標)#8。DARPin(登録商標)#9について、CD123+細胞は、ビヒクルと比較して、10nM(8時間で58.1%、24時間で67.9%及び48時間で79.1%の平均低下)、1nM(24時間で29.6%及び48時間で76.2%の平均低下)、及び0.1nM(24時間で34.4%及び48時間で48.6%の平均低下)で低下した。DARPin(登録商標)#10は、ビヒクルと比較して、10nM(4時間で31.3%、8時間で72.3%、24時間で81.3%、及び48時間で76.3%の平均低下)、1nM(24時間で74.4%及び48時間で72.7の平均低下)及び0.1nM(24時間で57.2%及び62.9%の平均低下)でCD123+細胞の低下を引き起こした。より低い濃度のDARPin(登録商標)#8(0.1及び0.01nM)、DARPin(登録商標)#9(0.01nM)、及びDARPin(登録商標)#10(0.01nM)では、カウントは4つの時点全てでビヒクルと同様であった。
【0596】
B.血液血小板数に対する多重特異性結合タンパク質の効果
実施例8と同様に、全血ループ系において、組換え結合タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#29、及びDARPin(登録商標)タンパク質#31に応答した血小板数(PLT(109/L))を、0時間(投与前)、2時間、4時間、8時間及び24時間の時点で評価した。全ての試料調製を実施例xに記載したように行い、測定をHaematology Analyzer Sysmex XN-L350によって行った。機器の技術的機能及び試薬系を、XN-CHECKレベル1及びレベル2での各実行の前に監視した。XN-CHECKは、装置の効果的かつ信頼性のある内部及び外部品質管理を可能にする分析器のために特別に設計された対照血液である。XN-CHECKレベル2が血液学的パラメータの正常範囲をカバーする一方、XN-CHECKレベル1は、血液学的パラメータの異常な低い範囲に使用される。微小血餅が形成されていないことを確認する手段としてPLT数を測定したが、これは細胞/血液活性化の徴候であり得る。更に、肉眼で見える血餅の存在を目視検査によって評価した。示された場合、溶血を視覚的に等級付けした。
【0597】
血小板数
ドナーは、ゼロ時点で正常なPLT範囲(すなわち、150~400×109細胞/Lの範囲の値)を示した(図14)。ゼロ時点の20%超のPLT数減少は、血小板凝集として分類される(閾値は、4時間時点での同じ条件における測定再現性に基づいて決定される)。4時間を超える時点の閾値は決定されていない)。0.005nM(D1及びD3については24時間)、0.1nM(D1~D2については8時間及びD1~D3については24時間)、及び2nM(D1~D3については24時間)のフロテツズマブと共にインキュベートしたループにおいて、肉眼で見える血餅(1mm以上)が観察された。2nMのDARPin(登録商標)タンパク質#27を有する試料(D1~D3については24時間)では、DARPin(登録商標)タンパク質#29及びDARPin(登録商標)タンパク質#31試料では、いずれの時点でもマクロ血餅は観察されなかった。8時間の時点で、D1からのビヒクル試料中に小さな微小血餅が観察された。ビヒクル群におけるPLTレベルは、2時間及び4時間でゼロ時点と同様であった(20%以下の差のレベルとして定義される)が、8時間では、PLT数は、D1について35.0%減少し、24時間では、PLTは、D1について37.9%及びD2について24.9%減少した。一般に、フロテツズマブは、8時間及び24時間で、濃度と共に増加するPLT数の減少を誘導した。2つの最も高い濃度(0.1nM及び2nM)のDARPin(登録商標)タンパク質#27は、2つの後の時点でPLT数を減少させたが、DARPin(登録商標)タンパク質#29及びDARPin(登録商標)タンパク質#31を有する試料中のPLT数は、全ての濃度及び時点でビヒクルと同様であった。
【0598】
フロテツズマブに応答して、PLT数は、24時間でD1及びD2を除いて(それぞれ、ビヒクルと比較して65.1%及び85.8%の減少)、0.005nMでビヒクル試料の20%以下の減少であった。0.1nMでは、PLT数は、2時間及び4時間で各ドナーについてビヒクル試料の20%以内であったが、8時間及び24時間では、PLT数は3人の全てのドナーで減少し、平均減少はそれぞれ83.7%及び88.4%であった)。2nMでは、PLT数は、2つの後の時点で全てのドナーの血液中でビヒクルの20%超減少した(8時間で75.1%及び24時間で88.9%の平均減少)。PLT数は、D1(8時間で85.4%及び24時間で97.1%の減少)、D2(24時間で94.7%の減少)、及びD3(24時間で90.4%の減少)からの血液中の2nMの最高濃度を除いて、DARPin(登録商標)タンパク質#27の3つ全ての濃度でビヒクル試料の20%以下で減少した。DARPin(登録商標)タンパク質#29及びDARPin(登録商標)タンパク質#31の3つ全ての濃度で、PLT数は、4つ全ての時点で3人の全てのドナーについてビヒクル試料の20%以内であった。
【0599】
C.血小板数及び白血球数に対する多重特異性結合タンパク質の効果
実施例8と同様に、全血ループ系において、フロテツズマブ類似物、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#60、DARPin(登録商標)タンパク質#61及びDARPin(登録商標)タンパク質#56に応答する、0時間(投与前)、2時間、4時間、8時間、及び24時間の時点での血小板数(PLT)及び白血球数(WBC)(109/L)を評価した。全ての試料調製を実施例8に記載されるように行い、測定をHaematology Analyzer Sysmex XN-L350によって行った。機器の技術的機能及び試薬系を、XN-CHECKレベル1及びレベル2での各実行の前に監視した。XN-CHECKは、装置の効果的かつ信頼性のある内部及び外部品質管理を可能にする分析器のために特別に設計された対照血液である。XN-CHECKレベル2が血液学的パラメータの正常範囲をカバーする一方、XN-CHECKレベル1は、血液学的パラメータの異常な低い範囲に使用される。微小血餅が形成されていないことを確認する手段としてPLT数を測定したが、これは細胞/血液活性化の徴候であり得る。更に、肉眼で見える血餅の存在を目視検査によって評価した。
【0600】
ゼロ及びビヒクル群における血小板。
全てのドナーは、ゼロ時点で正常なPLT範囲(すなわち、150~400×109細胞/Lの範囲の値)を示した(図49)。ビヒクル群におけるPLTレベルは、全てのドナーについてゼロ時点の試料と同様であった(20%未満の差のレベルとして定義される)。ビヒクルと共にインキュベートした新鮮血では肉眼で見える血餅は観察されなかったが、8時間及び24時間で試験したいくつかの試験アイテムでは肉眼で見える血餅が検出された(表9B)。
【0601】
【表14】
【0602】
全てのドナーは、ゼロ時点で正常なPLT範囲(すなわち、150~400×109細胞/Lの範囲の値)を示した(図49)。ビヒクル群におけるPLTレベルは、全てのドナーについてゼロ時点の試料と同様であった(20%未満の差のレベルとして定義される)。ビヒクル(PBS)と共にインキュベートした新鮮血では肉眼で見える血餅は観察されなかったが、8時間及び24時間で試験したいくつかの試験アイテムでは肉眼で見える血餅が検出された(表9b)。
【0603】
全てのドナーのWBC数は、ゼロ時点で正常範囲内であった(すなわち、4.0~11.0×109細胞/Lの範囲の値)。4時間の時点対ゼロ時点の試料における±10%の変動は、正常と判断される(図50)。
【0604】
全体として、試験したタンパク質の3つ全ての濃度、0.005、0.1、及び2nMにおいて、PLT及びWBC数は、4時間の時点までビヒクル群と同様であった。4時間後、一般に、ビヒクルと比較して、全てのドナーにおける全ての試験タンパク質について、PLT及びWBC数の濃度依存的な減少が経時的に検出された。しかしながら、0.005及び0.1nMでのDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#60は、WBC数の顕著な減少を誘導しなかった。血餅は、いくつかの試験タンパク質について8時間で最初に検出され、24時間で全ての試験タンパク質が異なる濃度で血餅を示した。しかしながら、ビヒクル試料では血餅は観察されず、血餅形成が免疫刺激の効果であることが示唆された。DARPin(登録商標)タンパク質#74については、いずれの時点においても血餅は検出されず、タンパク質におけるこの対照による限定された免疫活性を示した。
【0605】
実施例10:2つの表面リガンド(CD33及びCD123)に対して多重特異性結合タンパク質の複合アビディティの決定
例示的な多重特異性設計アンキリン反復タンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#20及びDARPin(登録商標)タンパク質#27(CD3、CD33、及びCD123に対して結合特異性を有する)、並びに対応する単一TAA標的対照(DARPin(登録商標)タンパク質#21(CD3及びCD123に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#22(CD3及びCD33に対して結合特異性を有する)、DARPin(登録商標)タンパク質#41(CD3及びCD123に対して結合特異性を有する)、及びDARPin(登録商標)タンパク質#40(CD3及びCD33に対して結合特異性を有する)の親和性及びアビディティを決定するために、switchSENSE(登録商標)技術(Dynamic Biosensors)を利用する試験を行った。SwitchSENSE(登録商標)技術は、親和定数(10fMの検出限界を有する)及び結合動態(会合及び解離速度定数についてそれぞれ1E3~1E81/Ms及び1E 6~1E01/sの検出限界を有する)の両方を検出する際に高い感度を可能にする。(Langerら;2013年.電気的に切り替え可能なDNAチップを用いた時間分解測定によるタンパク質分析、Nat Commun 4:2099)。
【0606】
この技術は、2つの相互作用からの2つの独立した信号を同時に同じセンサスポット上で監視することを可能にする2つの異なる蛍光体を利用する。それにより、親和性及びアビディティ動態多重特異性結合剤を、2つの標的分子に対して同時に測定することができる。
【0607】
材料及び方法
設計アンキリン反復タンパク質:2つのリガンドhCD33及びhCD123に対する結合について、0.16及び64nMの濃度で(10mMのNa2HPO4/NaH2PO4、140mMのNaCl、0.05%Tween20、50μMのEDTA、50μMのEGTAを含有する緩衝液PE140中)DARPin(登録商標)タンパク質#20、DARPin(登録商標)タンパク質#21、DARPin(登録商標)タンパク質#22、DARPin(登録商標)タンパク質#27、DARPin(登録商標)タンパク質#40、及びDARPin(登録商標)タンパク質#41を試験した。2つのリガンドhCD33及びhCD123は両方とも、ADP-48-1-0チップ上で、予め規定された比(2:1、CD33:CD123)及び10%密度(100:50)で、表面上のDNAナノレバーに同時に固定化され、ここでは、100%密度≒1000受容体/μm2である(cNL-48(暗)中で希釈されたプレインキュベートされたR1-B48-CD123及びG1-A48-CD33(100nM))。簡単に述べると、以下の工程を行った。
-コンジュゲーション2つのリガンド(CD33及びCD123)のDNAナノレバー(それぞれA48、B48)へのアミンカップリング、及び25℃でのproFIRE(登録商標)溶液(Dynamic Biosensors GmbH)を用いたコンジュゲートの精製。
-DRX+機器(dynamic BIOSENSORS)を使用した、ADPチップの表面上に付着した両方のリガンドに対して全ての異なるタンパク質の全ての親和性及びアビディティの組み合わせの評価。
-分析された全ての濃度及び長い解離時間のチップ表面の再生を含む統計分析(2~5回の反復可能性)、及びデータを、双指数関数グローバルフィットを使用してフィッティングさせた。
【0608】
【表15】
【0609】
結果及び結論
多重特異性組換えタンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#20は、チップ上で2つの相互作用を表す二相性解離を示した:1E-2-1程度の親和性(速いオフ速度)及び1E-3-1程度のアビディティ(分析物が両方のリガンドと相互作用している場合の遅いオフ速度)。更に、CD123についての会合速度は、CD33(1E6-1-1)と比較して、わずかに高いようである(1E7-1-1)。両方のDARPin(登録商標)タンパク質#21、DARPin(登録商標)タンパク質#22の対照について、標的のうちの1つへの結合相互作用のみが観察された。例えば、DARPin(登録商標)タンパク質#21は、CD33サブユニットを有していないので、予想通り、CD123とのみ相互作用する。したがって、それは、6E-2-1のkoffを有する単相の会合及び解離を示す。DARPin(登録商標)タンパク質#21とCD33との間の相互作用は観察されない。同様に、DARPin(登録商標)タンパク質#22は、CD123サブユニットを有していないので、予想通り、CD33とのみ相互作用する。したがって、それは、1E-2-1のkoffを有する単相の会合及び解離を示す。DARPin(登録商標)タンパク質#22とCD123との間の相互作用は観察されない。
【0610】
全体として、CD33特異性結合ドメイン及びCD123特異性結合ドメインの両方を含む設計アンキリン反復タンパク質(αCD33-αCD123)は、チップの表面に付着した両方の標的に同時に結合することができ、親和性及びアビディティを示す一方、CD33特異性結合ドメイン又はCD123特異性結合ドメインのいずれかを有する設計アンキリン反復タンパク質は、それぞれCD33及びCD123に対してのみ親和性を示すことが示される。実際、DARPin(登録商標)タンパク質#20についてのみ、チップ上で2つの相互作用(集団)を表す二相性解離が観察され、親和性(2E-2-1、速いオフ速度)及びアビディティ(1E-3-1、遅いオフ速度)が観察された。
【0611】
図38に見られるように、CD123結合ドメインは、その標的に対してCD33結合ドメインよりも速い結合速度を示した。図37(CD123に対して7E6-1-1のkonは、CD33のkonよりも約5倍速く、1.3E6-1-1に等しい)。DARPin(登録商標)タンパク質#20については、2つのオフ速度が観察され、1つは親和性結合に関連する速い速度(3E-2-1)、及び1つはアビディティ効果自体の遅い速度(1.5E-3-1)であった。したがって、DARPin(登録商標)タンパク質#20について2つのKDを決定することができる。高い方の親和性結合に関連するKD,1は、それぞれ、CD33について約17.6nM及びCD123について4.9nMであった。低い方のアビディティ(CD33及びCD123の同時結合)に関連するKD,2はpM範囲である(図39及び40)。
【0612】
多重特異性組換えタンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#27は、チップ上で2つの相互作用を表す二相性解離を示した:1E-2-1程度の親和性(速いオフ速度)及び1E-3-1程度のアビディティ(分析物が両方のリガンドと相互作用している場合の遅いオフ速度)。更に、CD123についての会合速度は、CD33(1E6-1-1)と比較して、わずかに高いようである(1E7-1-1)。DARPin(登録商標)タンパク質#40及びDARPin(登録商標)タンパク質#41対照の両方について、標的の1つへの結合相互作用のみが観察された。例えば、DARPin(登録商標)タンパク質#15は、CD33サブユニットを有していないので、予想通り、CD123とのみ相互作用する。したがって、それは、6E-2-1のkoffを有する単相の会合及び解離を示す。DARPin(登録商標)タンパク質#41とCD33との間の相互作用は観察されない。同様に、DARPin(登録商標)タンパク質#40は、CD123サブユニットを有していないので、予想通り、CD33とのみ相互作用する。したがって、それは、1E-2-1のkoffを有する単相の会合及び解離を示す。DARPin(登録商標)タンパク質#40とCD123との間の相互作用は観察されない。(図15及び図16
【0613】
全体として、CD33特異性結合ドメイン及びCD123特異性結合ドメインの両方を含むDARPin(登録商標)タンパク質#27(αCD33-αCD123)が、チップの表面に付着した両方の標的に同時に結合することができ、親和性及びアビディティを示す一方、CD33特異性結合ドメイン又はCD123特異性結合ドメインのいずれかを有する設計アンキリン反復タンパク質は、それぞれCD33又はCD123に対してのみ親和性を示すことが示される。したがって、DARPin(登録商標)タンパク質#27について以下の2つのKDを決定することができる。高い方の親和性結合に関連するKD,1は、それぞれ、CD33について約20nM及びCD123について4.5nMであった。低い方のアビディティ(CD33及びCD123の同時結合)に関連するKD,2は、0.2~0.3nMの範囲で決定され(図17及び18)、測定された親和性の少なくとも14分の1であった。
【0614】
実施例11:標的特異性短期T細胞活性化及びIFNγ分泌の評価
上述の組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、CD8+T細胞上のCD25活性化マーカを測定するFACS及びIFNγ分泌を測定するELISAによって、インビトロの短期T細胞活性化アッセイで評価した。
【0615】
したがって、1ウェル当たり100,000個の精製汎T細胞(エフェクタ細胞)と100,000個のMolm-13標的細胞を、600μMのヒト血清アルブミンの存在下で、選択したDARPin(登録商標)タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と2連で37℃で24時間共インキュベートした(E:T比1:1)。24時間後、製造業者のプロトコルに従って、ヒトIFNγ標準ABTS ELISA Developmentキット(PeproTech)によるIFNγ分泌の測定のために、1ウェル当たり100μlの上清を移した。細胞を洗浄し、1:1,000のLive/Dead Aqua(Thermo Fisher)、1:250のマウス抗ヒトCD8 Pasific Blue(BD)、及び1:100のマウス抗ヒトCD 25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8を用いてデータをプロットした。
【0616】
図23A及び24Aに示すように、DARPin(登録商標)タンパク質#8及びDARPin(登録商標)タンパク質#9は、半減期延長なしで、ベンチマーク分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330)に匹敵する特異的な短期T細胞活性化を誘導したが、DARPin(登録商標)#7及びDARPin(登録商標)#10は10~100分の1の効力を示した。半減期が延長されたDARPin(登録商標)タンパク質11~14(図23B及び24Bを参照)は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約3~100分の1の低下を示す。
【0617】
実施例12:IncuCyteによる標的特異的長期腫瘍細胞死滅の評価
組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、IncuCyte S3プラットフォームを使用する、インビトロの長期殺傷アッセイによって評価した。
【0618】
Molm-13細胞を最初にNucLight Red(NLR)レンチウイルス粒子(Sartorius)で形質導入し、赤色蛍光細胞を0.7μg/mlのピューロマイシン及び/又はFACSソーティングによって選択した。次いで、IncuCyte S3システム(Sartorius)を用いて長期腫瘍細胞死滅を評価した。エフェクタ細胞及び標的細胞を、1:200のAnnexin V green(Sartorius)及び600μMのヒト血清アルブミン(生理学的濃度を模倣するため)の存在下で、5:1のE:T比で0.01%のポリ-L-オルニチンをコーティングした96ウェルプレート上で2連で同時インキュベートした。1ウェル当たり50,000個の精製(Miltenyi)汎T細胞(健常ドナーPBMCから単離)+10,000個のMolm-13 NLR細胞を、選択されたアンキリン反復タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と一緒に37℃で最大6日間インキュベートした。2時間毎に画像を撮影し、細胞増殖(NLRからの赤色蛍光)(NLRからの赤色蛍光)及び細胞死(アネキシンVからの緑色蛍光)について評価した。GraphPad Prism8を使用して6日間の共培養後の曲線下面積を計算することによって、総細胞増殖及び腫瘍細胞死滅を分析した。
【0619】
図25に示すように、試験したDARPin(登録商標)タンパク質#8、#9、及び#10は、半減期延長とは無関係に、ベンチマーク分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)に匹敵する強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示す。より低い親和性のDARPin(登録商標)タンパク質#7のみが、殺傷効力の低下を示す。
【0620】
実施例13:FACSによる標的特異的長期T細胞活性化及び増殖の評価
組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質(実施例5、6、7及び8に記載される)の特異性及び効力を、FACSベースのインビトロ長期T細胞活性化アッセイによって評価した。
【0621】
薬物及び標的特異性T細胞活性化及び増殖を評価するために、エフェクタ細胞及び標的細胞を、選択した分子の段階希釈物の存在下で1:1のE:T比にて2連で同時インキュベートした。精製された(Miltenyi)汎T細胞(健康なドナーPBMCから単離)を最初に5μMのCellTrace Violet(CTV)(Thermo Fischer)で、37℃で20分間標識した。1ウェル当たり50,000個のCTV標識汎T細胞+50,000個のMolm-13を、次いで、600μMのヒト血清アルブミンの存在下(生理的濃度を模倣するため)、選択したCD3特異性アンキリン反復タンパク質又は対照ベンチマーク分子TCE1及びTCE2)の段階希釈物と共に37℃でインキュベートした。5日後、細胞をPBSで洗浄し、1:5’000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)、1:100のマウス抗ヒトCD8 PE(BD)、及び1:100のマウス抗ヒト-CD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体で、4℃で30分間染色した。PBSで2回洗浄した後、細胞を、CellFIX(BD)を使用して4℃で20分間固定し、最後に緩衝液をPBSで置き換えた。染色された細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。T細胞活性化を、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。T細胞増殖を、Live/Dead陰性及びCTV陽性細胞をゲーティングすることによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8を用いてデータをプロットした。
【0622】
図26及び27に示すように、DARPin(登録商標)#8及びDARPin(登録商標)#9は、半減期の延長なしで、ベンチマーク分子(既知のベンチマークT細胞エンゲージャである、CD33に対して結合特異性を有するAMG330及びCD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ)に匹敵する長期T細胞活性化及び増殖を誘導したが、DARPin(登録商標)タンパク質#7及びDARPin(登録商標)タンパク質#10は10~100分の1の効力を示した。半減期が延長されたDARPin(登録商標)タンパク質#11-14は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約5~30倍の低下を示す。
【0623】
実施例14:PBMCヒト化マウス及びMOLM-13腫瘍モデルにおける例示的な多重特異性結合タンパク質のインビボ有効性評価
実験A.CD33、CD123、及びCD3に対して結合特異性を有する4つの異なる設計アンキリン反復タンパク質である、DARPin(登録商標)タンパク質#8、DARPin(登録商標)タンパク質#12、DARPin(登録商標)タンパク質#13、及びDARPin(登録商標)タンパク質#14を、固形皮下腫瘍として腫瘍細胞系MOLM-13を有する末梢血単核細胞(PBMC)ヒト化マウスモデルにおいて試験し、臨床試験において現在試験されている既知のCD33標的化T細胞性エンゲージャであるAMG330と比較した。
【0624】
DARPin(登録商標)タンパク質#12、DARPin(登録商標)タンパク質#13、及びDARPin(登録商標)タンパク質#14は、半減期延長部分として、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを更に含む。DARPin(登録商標)タンパク質#8は、DARPin(登録商標)タンパク質#12の非半減期延長型である。
【0625】
材料及び方法
動物:60匹の雌NOGマウス、試験開始時の動物の年齢65日(提供者Taconic Biosciences)
試験分子及び対照分子:DARPin(登録商標)タンパク質#8、DARPin(登録商標)タンパク質#12、DARPin(登録商標)タンパク質#13、及びDARPin(登録商標)タンパク質#14を、5mg/mlの濃度で以前に記載されたように産生し、対照は、AMG330 0.59mg/mlであり、Evitria AGによって提供された。
治療群:60匹のマウスを研究に登録した。全ての動物を8つの異なる試験群に無作為に割り当てた。腫瘍細胞接種の日付を0日目として示す。
方法:実験開始の2日前に体重を記録し、各群において等しい平均体重及び同様の標準偏差を有するようにマウスを無作為化した。平均重量は19.6gであった。
2日目に、マウスに5×106個のPBMCを腹腔内注射した。
0日目に、マウスの右脇腹に106個のMOLM-13細胞を皮下注射した。
5日目に、表8に従って腹腔内注射による処置を開始した。最後の処置は16日目であった。
【0626】
腫瘍測定及び秤量を、7、10、12、14、17、19日目に実施した。腫瘍体積を以下の式に従って計算した:[長さ×(幅)2×π]/6。
【0627】
腫瘍体積データを、Anovaによって増殖曲線を比較し、続いて多重比較(Dunn検定)のために補正したノンパラメトリッククラスカル・ウォリス(Kruskal-Wallis)検定によって分析した。
【0628】
処置群の腫瘍体積を、対照群の体積と比較した。2匹の異なるPBMCドナーからのデータを一緒に及び別々に分析した。
【0629】
【表16】
【0630】
結果
腫瘍増殖阻害
試験した多特異性結合タンパク質及び既知のベンチマークT細胞エンゲージャへの曝露時の腫瘍成長曲線を、両方のドナーを一緒に及び別々に含めて、図25A~Cに要約する。図26A~Lは、全てのマウスの個々の成長曲線を示す。
【0631】
【表17】
【0632】
【表18】
【0633】
【表19】
【0634】
ドナーB由来のPBMCは、マウス血液中のCD8陽性リンパ球の量を低下させた。概して、抗腫瘍効果は、試験した全ての分子において観察された。対照的に、DARPin(登録商標)タンパク質#12及びAMG330は、治療の開始後5日目から始まる効果を示したが、DARPin(登録商標)タンパク質#13及びDARPin(登録商標)タンパク質#14の効果は、治療の開始後7日目から始まって有意かつ関連性があった。サブグループAのみを比較した場合、統計的に有意な効果が、治療の開始後5日目から始まって全ての試験分子について観察された。DARPin(登録商標)タンパク質#12、DARPin(登録商標)タンパク質#13、及びDARPin(登録商標)タンパク質#14の効果は、AMG330及びDARPin(登録商標)タンパク質#8の効果よりも強かった。サブグループBを比較した場合、有意な抗腫瘍効果が、DARPin(登録商標)タンパク質#13及びベンチマークAMG330について観察された。
【0635】
ベンチマークで得られた結果は、使用されたモデルを確証するものであった。同時に、ドナーB由来のPBMCでヒト化されたマウスにおいて観察されたベンチマークのあまり顕著でない効果は、このサブグループに属するマウスの感受性がより低いことを示す。これはまた、ドナーB由来のPBMCでヒト化されたマウスにおける実験の終わりに見出されたヒトCD8陽性リンパ球の有意に低い量によって反映される。
【0636】
したがって、ドナーA由来のPBMCを用いてヒト化されたマウスから得られたデータは、より大きな関連性があるものとなる。
【0637】
腫瘍サイズにおける高い変動性は、腫瘍が全てのマウスにおいて認識可能になる前に処置が開始されたため、マウスにおいて無作為化及び範囲選択が行われなかったという事実に起因する。この高い変動性にもかかわらず、最初の腫瘍体積に対する正規化を必要とせずに統計分析を行うことができた。
【0638】
本発明者らは、試験した全ての多重特異性結合タンパク質が抗腫瘍活性を示し、半減期延長分子であるDARPin(登録商標)タンパク質#12、DARPin(登録商標)タンパク質#13、及びDARPin(登録商標)タンパク質#14が、使用した用量及び適用レジメンで、半減期延長していないDARPin(登録商標)タンパク質#8よりも強い抗腫瘍活性を有することを確認した。理論に束縛されるものではないが、DARPin(登録商標)タンパク質#8の曝露は、この分子のより短い半減期に起因して、より低くなり得ると考えられる。
【0639】
全体として、試験した4つ全ての多重特異性結合タンパク質は、AMG330T細胞エンゲージャの抗腫瘍活性に匹敵するか又はそれよりも強いインビボ抗腫瘍活性を示した。
【0640】
実験B.実験Aと同様の実験設定及び手順において、CD70、CD33、CD123、及びCD3に対して結合特異性を有する追加の設計アンキリン反復タンパク質、すなわちDARPin(登録商標)タンパク質#56を、固形皮下腫瘍として腫瘍細胞系MOLM-13を有する末梢血単核細胞(PBMC)ヒト化マウスモデルにおいて試験し、AMG330と比較した。
【0641】
簡単に説明すると、インビボ実験を、6~9週齢の雌免疫不全NXGマウス(Janvier Labsによって提供された)において実施した。マウスを、標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージ(20±1℃の室温、50±10%の相対湿度及び12時間の明暗サイクル)内の標準化環境条件下で維持した。マウスに、放射線照射食品及び床敷並びに0.22umの濾過飲料水を与えた。全ての実験は、スイス動物保護法に従って州及び連邦の獣医学当局からの認可を受けて行った。
【0642】
実験Aと同様に、癌細胞の異種移植の2日前に、マウスにhPBMCを腹腔内注射した。MOLM-13細胞を、マウスの右側腹部の皮下に(s.c.)異種移植した。2匹のhPBMCドナーを使用した。処置は、癌細胞移植の4日後に静脈内(i.v.)注射した。処置は以下のように施した:
-DARPin(登録商標)タンパク質#56を、0.5mg/kgで、2週間、週に3回静脈注射で投与した。
-AMG330を、0.5mg/kgで2週間、毎日i.v.投与した。
【0643】
腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した:腫瘍体積(mm3)=0.5×長さ×幅2
【0644】
図58(A~B)に見られるように、DARPin(登録商標)タンパク質#56は、実験の全期間にわたって(図58A)、及び最初の注射の17日後に(図58B)、腫瘍成長及び腫瘍体積の阻害に関して良好な有効性を示した。
【0645】
実験C.実験A及びBと同様の実験設定及び手順において、CD70、CD33、CD123、及びCD3に対して結合特異性を有する2つの設計アンキリン反復タンパク質、すなわち、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57を、固形皮下腫瘍として腫瘍細胞系MOLM-13を有する末梢血単核細胞(PBMC)ヒト化マウスモデルにおいて試験し、陽性対照としてのAMG330及びフロテツズマブ、並びに陰性対照としてのDARPin(登録商標)タンパク質#74(CD3特異性結合タンパク質)及びDARPin(登録商標)タンパク質#75と(CD33/CD70/CD123特異性結合タンパク質)と比較した。
【0646】
実験Bと同様に、癌細胞の異種移植の2日前に、NXGマウスにhPBMCを腹腔内注射した。MOLM-13細胞を、NXGマウスの右側腹部の皮下に(s.c.)異種移植した。処置に応じて2~6人のhPBMCドナーを使用した。処置は、癌細胞移植(治療的処置)の8日後に開始して静脈内(i.v.)注射した。全ての腫瘍はこの時点で確定された。腫瘍体積の平均は、約150mm3であった。
【0647】
図65は、処置後の腫瘍体積に対する試験タンパク質の効果を経時的に示す。図示されるように、試験した両方の多重特異性タンパク質、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、腫瘍成長の有効な阻害を提供した。図66は、腫瘍成長に対する異なる処置量のDARPin(登録商標)タンパク質#56(0.02~2mg/kg)の効果を示す。腫瘍成長阻害は、投与されるDARPin(登録商標)タンパク質#56の量が増加するにつれてより強力になった。
【0648】
処置は以下のように施した:
●DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#74、DARPin(登録商標)タンパク質#75、及びDARPin(登録商標)タンパク質#57を、週に3回、2週間静脈内投与した。全ての分子を0.5mg/kgで投与した。DARPin(登録商標)タンパク質#56を、いくつかの他の用量(0.02mg/kg、0.2mg/kg及び2mg/kg)でも試験した。
●フロテツズマブ類似物及びAMG類似物を、0.5mg/kgで2週間毎日静脈内投与した。
【0649】
腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した:腫瘍体積(mm3)=0.5×長さ×幅2
【0650】
インビボ有効性を試験多重特異性タンパク質の作用様式と相関させるために、エクスビボアッセイをインビボモデルと並行して行った。この目的のために、NXGマウスに同じドナー由来のhPBMCを腹腔内注射し、上記のように処置した。より具体的には、T細胞活性化をFACSによって評価し、サイトカイン/ケモカイン放出を、マウス血清及びマウス腫瘍上清において、それぞれLuminex(商標)及びMeso Scale Discovery(MSD)アッセイによって決定した。簡単に説明すると、T細胞活性化評価のために、試験タンパク質を最初に注射してから3日後、マウスの一部を屠殺した。提供者のプロトコルに従ってgentleMACS(商標)によって腫瘍を解離させ、細胞懸濁液に対してFACSアッセイを行った。図67は、解離したMOLM-13腫瘍におけるヒト免疫細胞(hCD45+)及び活性化T細胞(CD4+/CD25+/CD69+及びCD8+/CD25+/CD69+)の頻度を示す。データは、平均及びSEM(平均の標準誤差)で示される。
【0651】
血清中のサイトカイン及びケモカイン放出の評価のために、Luminex(商標)アッセイを、試験タンパク質の最初の注射の4時間後に採取したマウス血液からのマウス血清中で行った。Luminex(商標)アッセイは、R&D Systemsから購入したヒトカスタム多重4ビーズアレイアッセイである。より具体的には、IFN-γ、IL-6、IL-2、及びTNF-αのレベルを、Luminex(商標)MAGPIX機器を使用して製造業者の推奨に従って測定した。全ての試験試料を氷上で解凍し、2000rpmで3分間遠心分離し、次いでキャリブレータ希釈剤で1:2に希釈した。各試験試料を二連でアッセイした。更に、4つのQC(品質管理)試料を、製造業者の指示に従って、二連で、様々なサイトカイン標準試料(S2、S3、S5、S6、すなわち、IFN-γ、IL-6、IL-2、及びTNF-α)からのキャリブレータ希釈剤中で1:2に希釈した。製造業者によって供給されたサイトカイン標準を二連でアッセイし、試験試料並びにQC試料の濃度を計算するために使用した。サイトカインレベルを、1回目の注射の4時間後に採取した血清試料において測定した。図68は、マウス血清中のINFガンマ、IL-6、IL-2、及びTNFαのレベルを示す。データを平均及びSEMで表示する。
【0652】
更に、試験タンパク質を最初に注射してから3日後、マウスを屠殺し、腫瘍を採取した。提供者のプロトコルに従ってgentleMACS(商標)によって腫瘍を解離させた。IFNγ、IL-2、IL-6、及びTNFα用にカスタマイズされたMeso Scale Discovery(MSD)Multi-Spot Assay SystemのVPlex Proinflammatory Panel 1(ヒト)キット(K151A9H-4)を使用して、腫瘍上清中のサイトカインレベルを測定した。以下のアッセイプロトコルを、実施例18及び19により詳細に記載する。図69は、例としてマウス腫瘍上清におけるIFNγ及びIL-6のレベルを示す。
【0653】
実験Cのこの実験設定において、DARPin(登録商標)タンパク質#74及びDARPin(登録商標)タンパク質#75は、インビボでいかなる有効性も示さなかった(図65)。これらのデータは、同じ分子中のT細胞動員結合ドメイン及び腫瘍関連抗原特異性結合ドメインの両方の存在が(例えば、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57中のように)抗腫瘍有効性をインビボで誘導するために必要とされることを実証する。試験したT細胞エンゲージャDARPinタンパク質であるDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、インビボで良好な抗腫瘍有効性を示した(図65)。この抗腫瘍有効性は濃度依存性であった(図66)。本発明のTCEタンパク質のインビボ抗腫瘍活性は、腫瘍組織における免疫細胞数の増加及びT細胞活性化に起因すると考えられる(図67)。本発明のTCEタンパク質は、腫瘍組織においてサイトカイン/ケモカイン放出を誘発するが(図69)、血清中でははるかに少ないか又は軽微であり(図68)、これは有益な安全プロファイルと一致する。
【0654】
実施例15:AML患者BMMC腫瘍細胞との共培養における標的特異的短期自己及び同種異系T細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷の評価
DARPin(登録商標)タンパク質#56の特異性及び効力を、AML患者細胞の存在下でCD8+T細胞上のCD25活性化マーカを測定するFACSによるインビトロ短期T細胞活性化アッセイ、及びFACSによるインビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて評価した。
【0655】
したがって、120,000個の精製された汎Tエフェクタ細胞を、製造業者(Thermofisher)のプロトコルに従ってcell trace violet(CTV)で標識し、1ウェル当たり30,000個のAML腫瘍細胞(BMMC、M4型)(E:T比4:1)と、DARPin(登録商標)タンパク質#56の段階希釈物と共に、2連で、200μMヒト血清アルブミンの存在下、37℃で48時間共培養した。48時間後、細胞を洗浄し、1:3,000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)、1:400マウス抗ヒトCD8 Pacific Blue(BD)、及び1:100マウス抗ヒトCD25 PerCP-Cy5.5(eBiosciences)抗体を用いて4℃で30分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。同種異系T細胞活性化を、CTVについて陽性の、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞上のCD25+細胞を測定することによって評価した。自己T細胞活性化を、CTV violet染色について陰性の、Live/Dead陰性及びCD8+ゲートT細胞陽性上のCD25+細胞を測定することによって評価した。FlowJoソフトウェアを用いてFACSデータを分析し、GraphPad Prism8(3-PL-フィット)を用いてデータをプロットした。
【0656】
図53Aに示すように、CD3、CD33、CD123、及びCD70に対して結合特異性を有する(したがって、3つの腫瘍特異性標的に結合する)試験したDARPin(登録商標)タンパク質#56は、強力かつ特異的な同種異系T細胞活性化を誘導した。加えて、自己T細胞上のCD25マーカのアップレギュレーションを示すことができた。
【0657】
薬物及び標的特異性腫瘍細胞殺傷を評価するために、エフェクタ及び標的細胞を、DARPin(登録商標)タンパク質#56、陰性対照DARPin(登録商標)タンパク質#74、フロテツズマブ類似物及びAMG330類似物の段階希釈物の存在下で、4:1のE:T比で2連で同時インキュベートした。精製された(Miltenyi)汎T細胞(健常ドナーPBMCから単離された)を、製造業者のプロトコルに従って、Celltrace violet(Thermofisher)で最初に標識した。次いで、1ウェル当たり120,000個のCTV標識汎T細胞と30,000個のAML腫瘍細胞(BMMC、M4型)を、200μMのヒト血清アルブミン(生理学的濃度を模倣するため)の存在下で、選択されたCD3特異性アンキリン反復タンパク質又は対照分子の段階希釈物と一緒に37℃でインキュベートした。48時間後、細胞をPBSで洗浄し、1:3,000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)で4℃で20分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、CTV陰性、単一、Live/Dead陰性細胞にゲーティングすることによって評価した。FACSデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、GraphPad Prism 8(3PL-フィット)を用いてプロットした。
【0658】
図53Bに示すように、DARPin(登録商標)タンパク質#56は、AML患者由来細胞の強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示し、効力は、比較したAMG330類似物とフロテツズマブ類似物との間である。陰性対照は、腫瘍細胞殺傷をほとんどもたらさない。
【0659】
実施例16:エキソビボAML細胞の自己殺傷における多重特異性結合タンパク質の効果
エキソビボAML細胞の自己殺傷における選択された多重特異性結合タンパク質の効果を、エキソビボ患者の試料中の薬物の完全な薬理学的特徴付けを行うために、独自の自動フローサイトメトリーベースの技術PharmaFlow(商標)を使用して、Vivia Biotechによって提供された天然環境におけるエキソビボ個別化医療試験によって評価した。更に、Viviaは、予測エキソビボ天然環境アッセイを生成し、薬物プロファイリング及び特徴付けと並行して信頼性がありロバストな予測バイオマーカを同定し、化合物の活性の高含量、信頼性があり臨床的に実施可能な予測データを提供することによって、臨床開発を合理化することができる。
【0660】
この試験の目的は以下のことであった。
1.フローサイトメトリーによって、ベースラインで分子(CD123、CD33、及びCD70)の標的の細胞表面発現を評価する。
2.ViviaのNative Environment Immuno-Oncologyアッセイにおいて、単剤としてフロテツズマブと共に、異なる試験タンパク質のエキソビボ薬理活性を実施する。
3.可溶性サイトカインのアッセイ後測定のために、各ウェルの上清、条件、及び時点を保存する。
4.保存された上清中の異なるサイトカインレベルの評価を行う。
【0661】
実験設計は以下のように行った。
-ビーズを使用した、病理学的細胞上の分子標的発現(CD123、CD33及びCD70)の定量化(3連、ベースライン)。
-用量応答曲線によって、病的細胞及びT細胞の両方について同時に枯渇及び活性化を測定する。
-8つの異なる濃度(50nM、10nM、2nM、0.4nM、0.08nM、0.016nM、0.0032nM、及び0.00064nM)の試験タンパク質DARPin(登録商標)タンパク質#56(配列番号95)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(配列番号96)、DARPin(登録商標)タンパク質#58(配列番号97)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(配列番号98)、DARPin(登録商標)タンパク質#60(配列番号99)及びDARPin(登録商標)タンパク質#61(配列番号100)。
-単一療法における1つのベンチマーク(フロテツズマブ(MPEXT118))の8つの異なる濃度(上記の通り)。
-陰性対照としてのDARPin(登録商標)タンパク質#74の3連での1つの高濃度。
-三連での1つの陰性対照(陰性対照は化合物を含まないことを意味し、これらのウェルは溶媒のみを含む)。
-2つのインキュベーション時点(72時間及び120時間)。
-可溶性サイトカインの将来の測定のための上清の保存。
-各インキュベーション時間(72時間及び120時間)後に、全ての実験条件からの上清を-80℃で保存する。
-上清中の異なるサイトカインレベルを測定する。
【0662】
試料収集
Viviaは、このプロジェクトのために、CD123及びCD33を共発現する成人AML患者由来の5つの凍結骨髄試料(試料ID:13043、13045、13271、13272、15131)を使用した。試料は、Vacutainer(商標)チューブに抽出した患者の通常の治療計画内のそれぞれの病院センターにおいて、センターでの臨床診療に続いて、抗凝固剤としてヘパリンを含有する。試料の一部を、Center’s Ethical Committeesが承認した調査試験プロトコル及び患者のインフォームドコンセントに署名した下で、Vivia Biotech研究所に送った。
【0663】
試料の小画分を特異性モノクローナル抗体(MoAb)で染色して、病的細胞及び細胞生存性を同定した。生存細胞数が確立され、分析に十分であるとみなされたら、試料の異なる画分において第2の染色を実施して、アイソタイプ対照と比較した標的タンパク質(CD123、CD33、CD70)の発現を判定した。QuantiBRITE PEキット(Becton Dickinson)を製造業者の推奨に従って使用して、標的の発現を定量した。5つの試料全てがCD33及びCD123の発現を示し、CD33が最も強く発現されたTAAである。CD70発現は、キットの検出限界未満である。
【0664】
殺傷アッセイを行うために、各試料を、20%(v/v)FBS及び1%抗生物質を補充した適切な体積のIMDM/L-グルタミン4mM(「Vivia培地」)で希釈して、1ウェル当たり60μLの最終体積にした。混合物を、自動Echo 550 Liquid Handlerを使用して予め調製した化合物を含有する96ウェルプレートに分注した。試料を含有するプレートを、5%CO2を含有する加湿空気中、37℃で72時間及び120時間インキュベートした。最終エンドポイントにおいて、細胞を、ベースライン特徴付けに従って病理学的細胞をより良好に識別するmAb+細胞死を測定するためのアネキシンV、及びT細胞活性化を測定するためのCD25で染色した。最後に、プレートをViviaのPharmaFlowプラットフォームで分析した。殺傷適合曲線は、個々のドナー適合の中央値として図54Bに示す。T細胞活性化を、CD25陽性T細胞の%として図54Aに示す。殺傷及びT細胞活性化データの両方は、試験した全てのタンパク質が、自己環境においてAML細胞の殺傷及びT細胞活性化を誘導し得ることを示す。
【0665】
実施例17:CD34+選別されたLSC及びHSCの殺傷に対する多重特異性結合タンパク質の効果
白血病幹細胞(LSC)及び造血幹細胞(HSC)の殺傷における選択された多重特異性結合タンパク質の有効性及び選択性を試験するために、凍結AML(末梢血及び/又は骨髄)及び健常ドナー骨髄試料を、CD34+細胞についてFACS選別した。
【0666】
実験の開始時(0日目)に、CD34+選別細胞の一部を染色し(CD70PE、CD123BV421、及びCD33APC)、フローサイトメトリー(BD LSR Fortessa Analyzer)によって測定して、アイソタイプ対照に対してデルタメジアン蛍光強度(MFI)を計算することによって標的発現を定量化した。図55は、デルタMFIとして表される、異なるLSC及びHSC試料にわたる発現中央値を示す。
【0667】
LSC/HSC殺傷アッセイのために、選別されたCD34+AML LSC又は健常ドナーHSCを、100pM、10pM又は1pMのDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#58、DARPin(登録商標)タンパク質#59、DARPin(登録商標)タンパク質#60、及びDARPin(登録商標)タンパク質#61又はベンチマーク分子(フロテツズマブsimilar及びAMG330類似物)が存在する状態で、96ウェルU底プレート中で4日間、最初に同種異系T細胞(健常ドナーのバフィーコートから単離)と1:1の比で共培養した。使用したStemSpan培地は、サイトカインミックス(SCF、IL-6、IL-3、Flt3)及び10μMヒト血清アルブミン(HSA)も含有していた。4日間のインキュベーション後、細胞を再懸濁し、半固体メチルセルロース培地に移して、2週間の更なる培養後のコロニー形成能を調べた。コロニー数を最終的に未処置対照(=100%、すなわち殺傷なし)に対して正規化した。図56は、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57による、HSC(白抜きの棒)よりもLSC(黒塗りの棒)の優先的な殺傷を示し、LSCとHSCとの間の治療機会の存在を確認するものである。更に、2つのベンチマーク化合物(フロテツズマブ類似物及びAMG330類似物)を含めて、これらの2つの分子と比較した選択されたDARPinタンパク質の特異性の差を示した。図56は、両方のベンチマーク分子がLSCに対して強力であるが、フロテツズマブがHSCを等しく良好に殺傷させていることも示す。AMG330も同様にいくらかの機会を示すが、低pM濃度でHSCを強力に殺傷させる。TAA結合ではないがCD3結合タンパク質であるDARPin(登録商標)タンパク質#76を陰性対照として使用した。CD70-CD3特異性結合タンパク質であるDARPin(登録商標)タンパク質#78を陽性対照として用いて、CD70の発現が非常に低い場合であっても、CD70のみを標的とすることによる殺傷が可能である(かつLSCに特異的である)ことを証明した。
【0668】
実施例18:AML Molm-13細胞の殺傷及びサイトカイン放出の誘導に対する多重特異性結合タンパク質の効果
ベンチマーク分子(フロテツズマブ類似物及びAMG330類似物)と共に、DARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#59、及びDARPin(登録商標)タンパク質#62の特異性及び効力を、AML細胞株Molm-13の存在下でのFACSベースのインビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイによって評価した。薬物及び標的特異性腫瘍細胞殺傷を評価するために、エフェクタ細胞及び標的細胞を、選択した分子の段階希釈物の存在下で5:1のE:T比にて2連で同時インキュベートした。精製された(Miltenyi)汎T細胞(健常ドナーPBMCから単離された)を、製造業者のプロトコルに従ってCellTrace violet(Thermofisher)で最初に標識した。次いで、1ウェル当たり100,000個のCTV標識汎T細胞と20,000個のMolm-13細胞を、20μMヒト血清アルブミン(HSA結合ドメインの飽和を提供するため)の存在下で、選択された多重特異性タンパク質又は対照分子の段階希釈物と一緒に37℃でインキュベートした。48時間後、上清を回収し、サイトカイン測定のために-80℃で保存し、細胞をPBSで洗浄し、1:3,000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)で4℃で20分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、CTV陰性、単一、Live/Dead陰性細胞にゲーティングすることによって評価した。FACSデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、GraphPad Prism 8(3PL-フィット)を用いてプロットした。
【0669】
IFNγ、IL-2、IL-6、及びTNFα用にカスタマイズされたMeso Scale Discovery(MSD)Multi-Spot Assay SystemのVPlex Proinflammatory Panel 1(ヒト)キット(K151A9H-4)を使用して、上清中のサイトカインレベルを測定した。MSD機器は、MSD Sulfo-TAGで標識された検出抗体を使用して、MSDプレートのウェル内で生成される電気化学発光(ECL)シグナルを使用して、各試料中に存在する分析物の定量的測定を提供する。信号は、作用電極上に層化された各アッセイ「スポット」からの実際の光子カウントとして報告される。実験は、製造業者のガイドに指示される通り行った。簡潔には、全ての上清を室温(RT)で解凍し、MSDプレートに添加する前に希釈剤2で5倍に希釈した。凍結乾燥されたキャリブレータブレンドを希釈剤2(標準プロトコルより4倍高い)中で再構成し、一連の5倍希釈を実施して、7つのキャリブレータ及び8番目の0キャリブレータ(希釈剤2)を得た。4つの分析物のそれぞれに対してSulfoTag抗体を、希釈剤3中の50倍希釈によって一緒に合わせた。4倍Read緩衝液を脱イオン水で2倍に希釈することによって、2倍Read緩衝液を調製した。MSDプレートを洗浄するための洗浄緩衝液は、PBS+0.05%Tween-20であった。プレートを150μL/ウェルの洗浄緩衝液で3回洗浄し、続いて1ウェル当たり50μLの試料/キャリブレータを添加し、700rpmのオービタルシェーカ上で室温で2時間インキュベートした。その後、150μL/ウェルの洗浄緩衝液で3回洗浄し、25μL/ウェルの検出抗体溶液を添加した。抗体インキュベーションもまた、700rpmのオービタルシェーカ上で室温で2時間行い、続いて150μL/ウェルの洗浄緩衝液で3回洗浄した。最後の洗浄後、150μL/ウェルの2倍Read緩衝液Tを添加し、MSD MESO QuickPlex SQを使用してプレートを読み取った。全てのデータファイルを、MSD discovery workbenchソフトウェアを使用して、アッセイ分析物、プレートレイアウト、及び希釈物を測定された各プレートに割り当てることによって分析した。ソフトウェアは、各プレート(ロット特異的)からの4つ全ての分析物についての較正曲線の4つのパラメータロジスティックフィットにバックフィッティングすることによって、pg/mLで計算濃度を提供した。出力値を、GraphPad Prismを使用して非線形回帰グラフとしてプロットした。
【0670】
図57(A~H)に示すように、試験したタンパク質sDARPin(登録商標)タンパク質#56、DARPin(登録商標)タンパク質#57、DARPin(登録商標)タンパク質#59及びDARPin(登録商標)タンパク質#62は、Molm-13細胞の強力な殺傷を示す(EC50 DARPin(登録商標)タンパク質#56(4.4pM)、DARPin(登録商標)タンパク質#57(1.0pM)、DARPin(登録商標)タンパク質#59(1.4pM)、DARPin(登録商標)タンパク質#62(2.9pM)、フロテツズマブ(0.4pM)、AMG330(0.5pM))。上清中のIFNγの定量はまた、DARPin(登録商標)タンパク質#56が最良の安全性プロファイルを示し、IFNγの最低の放出を誘導することを示す。
【0671】
実施例19:患者由来AML細胞の殺傷及びサイトカイン放出の誘導に対する多重特異性結合タンパク質の効果
陽性対照として使用したベンチマーク分子(フロテツズマブ類似物及びAMG330類似物)と共に、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57の特異性及び効力を、AMLドナー患者細胞の存在下でのFACSベースのエキソビボ腫瘍細胞殺傷アッセイによって評価した。薬物及び標的特異性腫瘍細胞殺傷を評価するために、AML患者由来細胞を、選択された分子の段階希釈物の存在下で、二連で、単独でインキュベートするか(自己設定)、又は健康なドナー由来の汎T細胞と共インキュベートした(同種設定)。同種異系設定では、約4:1のエフェクタ細胞(E)(すなわち、T細胞):標的細胞(T)(すなわち、AML細胞)比が達成された。自家設定では、E:T比は、AMLドナー患者細胞試料中のT細胞の数が限られているため、はるかに低かった。
【0672】
自家設定のために、1ウェル当たり25,000個のAML患者細胞を、20μMヒト血清アルブミン(HSA結合ドメインの飽和を提供するため)及び40ng/mlの各サイトカイン(IL-6、GM-CSF、SCF、TPO、Flt3L、G-CSF)の存在下で、選択されたCD3特異性DARPin化合物又は対照分子の段階希釈物と共に37℃でインキュベートした。48及び120時間後、上清を回収し、サイトカイン測定のために-80℃で保存し、細胞をPBSで洗浄し、1:3000のLive/Dead Green(Thermo Fisher)で4℃で20分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、単一のLive/Dead陰性細胞上でゲーティングすることによって評価した。FACSデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、GraphPad Prism 8(3PL-フィット)を用いてプロットした。
【0673】
同種異系セットアップのために、精製された(Miltenyi)汎T細胞(健常ドナーPBMCから単離された)を、製造業者のプロトコルに従ってCellTrace violet(Thermofisherから購入)で最初に標識した。次いで、1ウェル当たり100,000個のCTV標識汎T細胞と25,000個のAML患者細胞を、20μMヒト血清アルブミン(HSA結合ドメインの飽和を提供するため)及び40ng/mlの各サイトカイン(IL-6、GM-CSF、SCF、TPO、Flt3L、G-CSF)の存在下で、選択されたCD3特異性DARPin化合物又は対照分子の段階希釈物と共に37℃でインキュベートした。48時間後、上清を回収し、サイトカイン測定のために-80℃で保存し、細胞をPBSで洗浄し、1:3000のLive/Dead Green(Thermo Fisherから購入)で4℃で20分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をFACS Canto II(BD)機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、CTV陰性、単一、Live/Dead陰性細胞にゲーティングすることによって評価した。FACSデータを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、GraphPad Prism 8(3PL-フィット)を用いてプロットした。
【0674】
IFNγ、IL-2、及びTNFα用にカスタマイズされたMeso Scale Discovery(MSD)Multi-Spot Assay SystemのVPlex Proinflammatory Panel 1(ヒト)キット(K151A9H-4)を使用して、上清中のサイトカインレベルを測定した。MSD機器は、MSD Sulfo-TAGで標識された検出抗体を使用して、MSDプレートのウェル内で生成される電気化学発光(ECL)シグナルを使用して、各試料中に存在する分析物の定量的測定を提供する。信号は、作用電極上に層化された各アッセイ「スポット」からの実際の光子カウントとして報告される。実験は、製造業者のガイドに指示される通り行った。簡潔には、全ての上清を室温(RT)で解凍し、MSDプレートに添加する前に希釈剤2で5倍に希釈した。凍結乾燥されたキャリブレータブレンドを希釈剤2(標準プロトコルより4倍高い)中で再構成し、一連の5倍希釈を実施して、7つのキャリブレータ及び8番目の0キャリブレータ(希釈剤2)を得た。4つの分析物のそれぞれに対してSulfoTag抗体を、希釈剤3中の50倍希釈によって一緒に合わせた。4倍Read緩衝液Tを脱イオン水で2倍に希釈することによって、2倍Read緩衝液を調製した。MSDプレートを洗浄するための洗浄緩衝液は、PBS+0.05%Tween-20であった。プレートを150μL/ウェルの洗浄緩衝液で3回洗浄し、続いて1ウェル当たり50μLの試料/キャリブレータを添加し、700rpmのオービタルシェーカ上で室温で2時間インキュベートした。その後、150μL/ウェルの洗浄緩衝液で3回洗浄し、25μL/ウェルの検出抗体溶液を添加した。抗体インキュベーションもまた、700rpmのオービタルシェーカ上で室温で2時間行い、続いて150μL/ウェルの洗浄緩衝液で3回洗浄した。最後の洗浄後、150μL/ウェルの2倍Read緩衝液Tを添加し、MSD MESO QuickPlex SQを使用してプレートを読み取った。全てのデータファイルを、MSD discovery workbenchソフトウェアを使用して、アッセイ分析物、プレートレイアウト、及び希釈物を測定された各プレートに割り当てることによって分析した。ソフトウェアは、各プレート(ロット特異的)からの4つ全ての分析物についての較正曲線の4つのパラメータロジスティックフィットにバックフィッティングすることによって、pg/mLで計算濃度を提供した。出力値を、GraphPad Prismを使用して非線形回帰グラフとしてプロットした。
【0675】
図59(A~L)及び図60(A~L)に示すように、試験タンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、5日間にわたって、AML患者細胞の強力な自己殺傷を濃度依存的に示した(EC50値:DARPin(登録商標)タンパク質#56:33pM、DARPin(登録商標)タンパク質#57:2.9pM、フロテツズマブ類似物:0.4pM、AMG330-類似物:4pM)。サイトカイン放出誘導と患者AML細胞殺傷データとの比較は、DARPin(登録商標)タンパク質#56が最低レベルのサイトカインを誘導したため、DARPin(登録商標)タンパク質#56について有効濃度で潜在的に最良の安全性プロファイルを示す。また、DARPin(登録商標)タンパク質#57は、ベンチマークフロテツズマブ類似物よりも少ないサイトカインを誘導した。
【0676】
同様に、図61(A~L)に見られるように、試験タンパク質のDARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57はまた、同種異系の設定において腫瘍細胞の強力な殺傷を示した(EC50:DARPin(登録商標)タンパク質#56:103pM、DARPin(登録商標)タンパク質#57:22.7pM、フロテツズマブ類似物:0.6pM、AMG330類似物:4.1pM)。また、この実験設定において、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57は、ベンチマークフロテツズマブ類似物よりも少ないサイトカインを誘導した。
【0677】
実施例20:多特異性結合タンパク質の存在下で全血をMolm-13細胞でスパイクしたときのサイトカイン放出に対する効果。
サイトカイン放出を、Molm13細胞でスパイクした2人の健常ドナーからの全血を使用して、DARPin(登録商標)タンパク質#56及びDARPin(登録商標)タンパク質#57について評価した。400,000個のMolm13細胞を、選択された分子の段階希釈物の存在下で健常ドナーの全血と一緒にインキュベートした。Molm13細胞の数は、1:2のE:T比を達成し、各ウェルにおいて約20~25%の腫瘍負荷を得るように選択した(180μLの血液中の平均白血球数はほぼ130万個の白血球であり、約200,000個の総T細胞を有するため)。Molm13細胞を、健常ドナーの分子及び全血と一緒に37℃で30分間及び6時間インキュベートした。各ドナープレートからの上清を2つの異なる時点(30分及び6時間)で収集し、サイトカイン測定アッセイの準備ができるまで-80℃で保存した。30分のインキュベーション時間後に、有意なサイトカイン放出は観察されなかった。
【0678】
上清中のサイトカインレベルを、Meso Scale Discovery(MSD)を使用して測定した。マルチスポットアッセイシステムのVPlex炎症促進性パネル1(ヒト)キット(K151A9H-4)は、実施例19に記載されるのと同じプロトコルに従って、IFNγ、IL-2、IL-6、及びTNFαについてカスタマイズした。
【0679】
図62(A~H)に示すように、上清中のIFNγ、IL-2、IL-6、及びTNFαの定量は、DARPin(登録商標)タンパク質#56が両方のドナーにおいて4つの試験したサイトカインの最低の放出を誘導することを実証し、DARPin(登録商標)タンパク質#56が試験した分子の中で最良の安全性プロファイルを有する可能性が高いことを示した。また、DARPin(登録商標)タンパク質#57は、ベンチマーク分子よりも全体的に低いサイトカイン誘導を示した。
【0680】
実施例21:表面プラズモン共鳴(SPR)による、DARPin(登録商標)タンパク質#56のCD33、CD123、CD70、CD3、及び血清アルブミンへの同時結合の決定。
ヒトCD33、ヒトCD123、ヒトCD70、及びヒトCD3標的並びにヒト血清アルブミンへのDARPin(登録商標)タンパク質#56の同時結合を、表面プラズモン共鳴(SPR)によって評価した。
【0681】
SPR測定は、Sierra SPR(登録商標)-32機器(Bruker)で行った。0.005%Tween20を含有するPBS pH7.4を、泳動用緩衝液として使用した。2600RUの300nMヒト血清アルブミン(HSA)をHCAセンサチップ上に固定した。HSA固定化チップに、連続して、1nMのDARPin(登録商標)タンパク質#56(会合60秒、解離0秒)、200nMのhCD70(会合40秒、解離0秒)、及び500nMのhCD123(会合120秒、解離0秒)を、独立した分析物注射工程として適用した。直後に、150nMのhCD33(会合150秒、解離0秒)、続いて1.35μMのscCD3(会合150秒、解離180秒)を注射する二重注射工程を実施した。より具体的には、DARPin(登録商標)タンパク質#56の注射は、750RUの応答をもたらした。次に、300RUのhCD70をDARPin(登録商標)タンパク質#56に結合させた。続いて、hCD123を注射し、700RUの増加により、DARPin(登録商標)タンパク質#56への結合を示すことができた。二重注射を使用して、hCD33結合は、更に800RUの応答を与え、これに続いて、hCD33の注射停止時にscCD3が結合し、150RUが更に増加した。注目すべきことに、hCD3のRUの減少は、scCD3注射期の間のhCD33の進行中の解離を示す。
【0682】
この設定は、DARPin(登録商標)タンパク質#56が既にHSAに結合している場合にのみ、hCD70、hCD123、hCD33及びscCD3の結合を可能にした。この設定の要件は、DARPin(登録商標)タンパク質#56が高い親和性でHSA及びhCD70/hCD123に結合して、最後の標的を適用する前の急速なシグナル損失を防ぐことであった。hCD33及びscCD3のより速い解離速度を克服するために、これらの標的について二重注射を使用して、hCD33注射停止とscCD3注射開始との間の時間を短縮した。要するに、二重注射は、気泡によって1つのシリンジ内で両方の標的溶液を分離することによって行われる。更に、表11の注射スキームに記載されているように、標的なし(PBST)又は標的の1つのみ(分析物2~5)を注射することによって、単回注射対照実験を行った。シグナルは、同じチャネル上の空の対照スポットを基準とした。20μl/分での二重注射を除いて、全ての工程を10μl/分の流速で行った。
【0683】
図63は、DARPin(登録商標)タンパク質#56のCD70、CD123、CD33及びCD3への同時結合のSPRトレースを示す。DARPin(登録商標)タンパク質#56のCD70、CD123、CD33及びCD3への同時結合は、プレートに固定された血清アルブミンに結合したDARPin(登録商標)タンパク質#56上で起こった。これらの発見は、DARPin(登録商標)タンパク質#56が、その標的の5つ全てに同時に結合することができることを示す。
【0684】
【表20】
【0685】
更に、同時結合の理論的センサグラムを、全ての標的の単回注射の値を合計することによって計算した(冗長なDARPin(登録商標)タンパク質#56添加についての制御は、DARPin(登録商標)タンパク質#56単回注射を3回減算することによって達成される)。「測定」及び「計算」センサグラムの重ね合わせは、DARPin(登録商標)タンパク質#56がその5つの標的の全てに同時に結合することができることを確認する(図64)。図64は、「測定」及び「計算」SPRトレースの比較を示す。
【0686】
本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びGenBank配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。
【0687】
当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【0688】
【表21-1】
【0689】
【表21-2】
【0690】
【表21-3】
【0691】
【表21-4】
【0692】
【表21-5】
【0693】
【表21-6】
【0694】
【表21-7】
【0695】
【表21-8】
【0696】
【表21-9】
【0697】
【表21-10】
【0698】
【表21-11】
【0699】
【表21-12】
【0700】
【表21-13】
【0701】
【表21-14】
【0702】
【表21-15】
【0703】
【表21-16】
【0704】
【表21-17】
【0705】
【表21-18】
【0706】
【表21-19】
【0707】
【表21-20】
【0708】
【表21-21】
【0709】
【表21-22】
【0710】
【表21-23】
【0711】
【表21-24】
【0712】
【表21-25】
【0713】
【表21-26】
【0714】
【表21-27】
【0715】
【表21-28】
【0716】
【表21-29】
【0717】
【表21-30】
【0718】
【表21-31】
図1A
図1B
図2A
図2B
図2C
図2D
図3A
図3B
図3C
図4A
図4B
図4C
図5A
図5B
図5C
図6A
図6B
図6C
図7
図8
図9A
図9B
図9C
図9D
図10A
図10B
図10C
図10D
図11A
図11B
図11C
図11D
図12A
図12B
図12C
図12D
図13A
図13B
図13C
図13D
図14A
図14B
図14C
図14D
図15A
図15B
図16A
図16B
図17
図18
図19
図20A
図20B
図20C
図21
図22A
図22B
図23A
図23B
図24A
図24B
図25
図26A
図26B
図27A
図27B
図28A
図28B
図28C
図28D
図28E
図28F
図29A
図29B
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図29E
図29F
図30A
図30B
図30C
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図30E
図30F
図31A
図31B
図31C
図31D
図31E
図31F
図32A
図32B
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図32D
図32E
図32F
図33A
図33B
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図33D
図33E
図33F
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図35A
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図35D
図35E
図35F
図36A
図36B
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図37A
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図37D
図37E
図37F
図38A
図38B
図39A
図39B
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図42A
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図43A
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図43E
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図43G
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図43I
図43J
図43K
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図44A
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図44G
図44H
図45A
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図45C
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図45E
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図45H
図46A
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図46E
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図47A
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図47C
図47D
図47E
図47F
図47G
図47H
図48A
図48B
図48C
図48D
図48E
図48F
図48G
図48H
図49A
図49B
図49C
図49D
図49E
【配列表】
2024509904000001.app
【国際調査報告】