2024-509904 新規なＤＡＲＰｉｎに基づく多重特異性Ｔ細胞エンゲージャ

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-05

(54)【発明の名称】新規なＤＡＲＰｉｎに基づく多重特異性Ｔ細胞エンゲージャ

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240227BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240227BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240227BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240227BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240227BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240227BHJP

   A61K 47/64 20170101ALI20240227BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240227BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240227BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240227BHJP

   A61K 47/65 20170101ALI20240227BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240227BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240227BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20240227BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/46 ZNA

C12N15/13

A61P35/00

A61P37/04

A61P35/02

A61K47/64

A61K47/68

A61K38/16

A61K39/395 T

A61K39/395 E

A61K47/65

A61K48/00

C07K16/28

C07K16/30

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023554922

(86)(22)【出願日】2022-03-09

(85)【翻訳文提出日】2023-09-07

(86)【国際出願番号】 IB2022052126

(87)【国際公開番号】W WO2022190016

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】63/158,539

(32)【優先日】2021-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/172,973

(32)【優先日】2021-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/265,184

(32)【優先日】2021-12-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】515146556

【氏名又は名称】モレキュラー パートナーズ アクチェンゲゼルシャフト

(74)【代理人】

【識別番号】100094569

【弁理士】

【氏名又は名称】田中 伸一郎

(74)【代理人】

【識別番号】100103610

【弁理士】

【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦

(74)【代理人】

【識別番号】100109070

【弁理士】

【氏名又は名称】須田 洋之

(74)【代理人】

【識別番号】100119013

【弁理士】

【氏名又は名称】山崎 一夫

(74)【代理人】

【識別番号】100123777

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 さつき

(74)【代理人】

【識別番号】100111796

【弁理士】

【氏名又は名称】服部 博信

(74)【代理人】

【識別番号】100123766

【弁理士】

【氏名又は名称】松田 七重

(72)【発明者】

【氏名】ビアンキ マッテオ

(72)【発明者】

【氏名】レシュケ ニーナ

(72)【発明者】

【氏名】グリム セバスティアン

(72)【発明者】

【氏名】ライヒェン クリスティアン

(72)【発明者】

【氏名】シュレーレス ベルント

(72)【発明者】

【氏名】レヴィツキー ヴィクター

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C076AA95

4C076CC07

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C084AA02

4C084AA03

4C084AA13

4C084BA44

4C084DC50

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB091

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZB262

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC22

4C085CC23

4C085EE01

4C085GG02

4C085GG08

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA22

4H045EA28

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、例えばＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０などの異なる標的に対して結合特異性を有する結合剤を含む組換え多重特異性タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような多重特異性タンパク質をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌など、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、の疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（１）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、及び（２）腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも２つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、前記２つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、組換えタンパク質。

【請求項2】

前記２つの結合剤によって特異的に結合される前記腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞において共発現される、請求項１に記載の組換えタンパク質。

【請求項3】

（１）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、及び（２）腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも３つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、前記３つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、組換えタンパク質。

【請求項4】

前記３つの結合剤によって特異的に結合される前記腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞において共発現される、請求項３に記載の組換えタンパク質。

【請求項5】

前記腫瘍細胞が、液性腫瘍由来の腫瘍細胞である、請求項２及び４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項6】

前記腫瘍細胞が、白血病由来である、請求項２、４、及び５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項7】

前記白血病が、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、請求項６に記載の組換えタンパク質。

【請求項8】

前記組換えタンパク質が、腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤のうちの１つのみを含む組換えタンパク質と比較した場合に、前記腫瘍関連抗原を提示する表面に、より低い解離定数（Ｋ_D）で結合することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項9】

前記腫瘍関連抗原を提示する前記表面が、腫瘍細胞の表面である、請求項８に記載の組換えタンパク質。

【請求項10】

前記より低い解離定数（Ｋ_D）が、腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤のうちの１つのみを含む前記組換えタンパク質の対応する解離定数に対しよりも少なくとも約２分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約４０分の１、又は少なくとも約１００分の１である、請求項８及び９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項11】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項12】

前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞である、請求項１１に記載の組換えタンパク質。

【請求項13】

免疫細胞の表面上に発現する前記タンパク質が、前記Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項14】

免疫細胞の表面上に発現される前記タンパク質がＣＤ３である、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項15】

前記第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項16】

前記第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される前記タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項17】

前記第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項18】

ＣＤ３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１７に記載の組換えタンパク質。

【請求項19】

ＣＤ３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、請求項１７及び１８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項20】

腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤が、（ｉ）第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤、（ｉｉ）第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤、及び（ｉｉｉ）第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤からなる群から選択される、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項21】

前記第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、請求項２０に記載の組換えタンパク質。

【請求項22】

前記第２の結合剤が、前記ＴＡＡ１に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項２０及び２１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項23】

前記ＴＡＡ１が、ＣＤ３３である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項24】

前記第２の結合剤が、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項25】

ＣＤ３３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の組換えタンパク質。

【請求項26】

ＣＤ３３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項２４及び２５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項27】

前記第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、請求項２０～２６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項28】

前記第３の結合剤が、前記ＴＡＡ２に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項２０～２７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項29】

前記ＴＡＡ２が、ＣＤ１２３である、請求項２０～２８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項30】

前記第３の結合剤が、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項２０～２９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項31】

ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の組換えタンパク質。

【請求項32】

ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３０及び３１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項33】

前記第４の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、請求項２０～３２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項34】

前記第４の結合剤が、前記ＴＡＡ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項２０～３３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項35】

前記ＴＡＡ３が、ＣＤ７０である、請求項２０～３４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項36】

前記第４の結合剤が、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項２０～３５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項37】

ＣＤ７０に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の組換えタンパク質。

【請求項38】

ＣＤ７０に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項３６及び３７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項39】

ＣＤ３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２又は３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、及び／又はＣＤ７０に対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３６及び３７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項40】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第３の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第３の結合剤）－（第２の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項41】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第３の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第２の結合剤）－（第３の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項42】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第３の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第２の結合剤）－（第３の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項43】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第３の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第３の結合剤）－（第２の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項44】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第４の結合剤）－（第２の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項45】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第２の結合剤）－（第４の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項46】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第２の結合剤）－（第４の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項47】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第４の結合剤）－（第２の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項48】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第３、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第４の結合剤）－（第３の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項49】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第３、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第３の結合剤）－（第４の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項50】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第３、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第３の結合剤）－（第４の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項51】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第３、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第４の結合剤）－（第３の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項52】

前記組換えタンパク質が、前記第１、第２、第３、及び第４の結合剤を含み、前記第１、第２、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第４の結合剤）－（第３の結合剤）－（第２の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、請求項２０～３９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項53】

前記第１、第２、第３、及び／又は第４の結合剤が、ペプチドリンカーと共有結合している、請求項２０～５２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項54】

前記ペプチドリンカーが、プロリン－トレオニンに富むペプチドリンカーである、請求項５３に記載の組換えタンパク質。

【請求項55】

前記ペプチドリンカーのアミノ酸配列が、１～５０個のアミノ酸の長さを有する、請求項５３又は５４に記載の組換えタンパク質。

【請求項56】

配列番号１～４、６、１５、６４～７０、及び１０２～１１２のいずれか１つの最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４、６、及び１５のいずれか１つの最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている、請求項１８～５５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項57】

前記アンキリン反復ドメインのいずれかが、Ｎ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む、請求項１８～５６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項58】

前記組換えタンパク質が、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号７～１０及び５８～６２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項59】

前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項60】

前記組換えタンパク質が前記第２の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合する、請求項２０～５９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項61】

前記組換えタンパク質が前記第３の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合する、請求項２０～６０のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項62】

前記組換えタンパク質が前記第４の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合する、請求項２０～６１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項63】

前記組換えタンパク質が、１～４００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３に結合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項64】

前記組換えタンパク質が、前記第２及び第３の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ１に結合し、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ２に結合する、請求項２０～６３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項65】

前記組換えタンパク質が、前記第２及び第４の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ１に結合し、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ３に結合する、請求項２０～６４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項66】

前記組換えタンパク質が、前記第３及び第４の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ２に結合し、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ３に結合する、請求項２０～６５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項67】

前記組換えタンパク質が、前記第２、第３、及び第４の結合剤を含み、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ１に結合し、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ２に結合し、前記組換えタンパク質が、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中の前記ＴＡＡ３に結合する、請求項２０～６３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項68】

前記組換えタンパク質が、半減期延長部分を更に含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項69】

前記半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する結合剤である、請求項６８に記載の組換えタンパク質。

【請求項70】

ヒト血清アルブミンに特異的に結合する前記結合剤が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、請求項６９に記載の組換えタンパク質。

【請求項71】

ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項７０に記載の組換えタンパク質。

【請求項72】

ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する前記アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項７０及び７１のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項73】

前記組換えタンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに結合する、請求項６９～７２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項74】

前記組換えタンパク質が、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～３９、５３～５７、及び５９～７３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項75】

前記組換えタンパク質が、配列番号９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号９５～１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～３９、５３～５７、及び５９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項76】

前記組換えタンパク質が、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号９５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～３９、５３～５７、及び５９～７３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項77】

前記組換えタンパク質が、配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、前記組換えタンパク質が、配列番号９６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１～３９、５３～５７、及び５９～７３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項78】

前記半減期延長部分が、前記第１の結合剤及び腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記結合剤のＮ末端側に位置する、請求項６８～７３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項79】

前記組換えタンパク質が、前記第１の結合剤によって特異的に結合される免疫細胞の表面上に発現される前記タンパク質と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記少なくとも２つの結合剤又は腫瘍関連抗原に特異的に結合する前記少なくとも３つの結合剤によって特異的に結合される前記腫瘍関連抗原とに同時に結合することができる、先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。

【請求項80】

先行する請求項のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸。

【請求項81】

請求項１６～７８のいずれか一項に記載のアンキリン反復ドメインをコードする核酸。

【請求項82】

請求項１～７９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、又は請求項８０及び８１のいずれか一項に記載の核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤を含む、医薬組成物。

【請求項83】

ヒトを含む哺乳動物の腫瘍組織における免疫細胞活性化の方法であって、請求項１～７９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質を前記哺乳動物に投与する工程を含む、方法。

【請求項84】

前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項８３に記載の方法。

【請求項85】

医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の請求項１～７９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項８０及び８１のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項８２に記載の医薬組成物を投与する工程を含む、方法。

【請求項86】

前記医学的状態が、癌である、請求項８５に記載の方法。

【請求項87】

前記医学的状態が、液性腫瘍を特徴とする癌である、請求項８５に記載の方法。

【請求項88】

前記医学的状態が、白血病である、請求項８５に記載の方法。

【請求項89】

前記医学的状態が、急性骨髄性白血病である、請求項８５に記載の方法。

【請求項90】

治療に使用するための、請求項１～７９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項８０及び８１のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項８２に記載の医薬組成物。

【請求項91】

癌の治療に使用するための、任意選択で液性腫瘍を特徴とする癌の治療に使用するための、請求項１～７９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、請求項８０及び８１のいずれか一項に記載の核酸、又は請求項８２に記載の医薬組成物。

【請求項92】

前記癌が白血病であり、任意選択で前記癌が急性骨髄性白血病である、請求項９１に記載の使用のための組換えタンパク質、核酸、又は医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月９日に出願された米国特許仮出願第６３／１５８，５３９号、２０２１年４月９日に出願された米国特許第６３／１７２，９７３号、及び２０２１年１２月９日に出願された米国特許出願第６３／２６５，１８４号に対して優先権の利益を主張するものである。これら特許出願の開示は、全ての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、例えば、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ７０、及びＣＤ１２３などの異なる標的に対して結合特異性を有する結合剤を含む組換え多重特異性タンパク質に関する。加えて、本発明は、そのような多重特異性タンパク質、医薬組成物をコードする核酸、そのようなタンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及びそのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の、癌、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）などの疾患を治療又は診断するための方法における、ヒトを含む哺乳動物での使用に関する。

【背景技術】

【0003】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、急速な細胞増殖、侵攻性の臨床経過、及び一般的に高い死亡率を特徴とする、不均一かつ複雑な悪性疾患である。ＡＭＬ治療抵抗性は、急性白血病関連死の未だに主要な原因である（Ｗｉｎｅｒ ＆ Ｓｔｏｎｅ，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ；２０１９；１０）。化学療法を用いる標準プロトコルは、依然として世界的に適用される主要な治療アプローチであるが、免疫療法における最近の進歩は、化学療法抵抗性ＡＭＬに対して有効な治療選択肢を提供している。そのような免疫療法アプローチには、モノクローナル抗体、二重特異性抗体、及びキメラ抗原受容体発現Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ細胞）が含まれる。

【0004】

モノクローナル抗体ベースの療法は、主に、抗ＣＤ ３３抗体又は抗ＣＤ １２３抗体を、単剤療法として、又は細胞毒性剤とコンジュゲートさせて含む（Ｗｉｎｅｒ ＆ Ｓｔｏｎｅ，Ｔｈｅｒ Ａｄｖ Ｈｅｍａｔｏｌ；２０１９；１０）。しかしながら、これらの薬物は、有意な有害作用又は低い有効性のいずれかを示している。例えば、抗生物質カリケアマイシンにコンジュゲートしたヒト化抗ＣＤ３３モノクローナル抗体であるゲムツズマブオゾガマイシンによる治療は、有意な血液学的及び肝毒性をもたらしたが、ヒト化抗ＣＤ１２３モノクローナル抗体であるタルコツズマブによる治療は、有効な治療上の利益を提供することができなかった。現在、ＣＤ７０を標的とする別のヒトモノクローナル抗体が臨床試験中であり（クサツズマブ）、最初の知見は有望であるように思われるが、専門家は依然として、その潜在的な安全プロファイルに関する懸念を表明している（例えば、ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓａｒｅｎａ．ｃｏｍ／ｃｏｍｍｅｎｔ／ａｒｇｅｎｘｓ－ｃｕｓａｔｕｚｕｍａｂ－ｉｎ－ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ－ｕｎｔｒｅａｔｅｄ－ａｍｌ－ｄｒａｗｓ－ｖａｒｉｅｄ－ｅｘｐｅｒｔ－ｆｏｒｅｃａｓｔｓを参照されたい）。

【0005】

ＣＡＲ－Ｔ細胞療法は、リンパ系悪性腫瘍の管理に強く影響してきたアプローチである。この技術をＡＭＬにも適用することに大きな関心が寄せられているが、実際には、これは困難であることが証明されている。モノクローナル抗体に関して、ＣＤ３３及びＣＤ１２３は、ＡＭＬにおけるＣＡＲ－Ｔ細胞療法のための最も有望な標的であると考えられている。しかしながら、これらの標的についての前臨床モデルは、非ＡＭＬ細胞に対して広範な副作用（オンターゲット／オフ腫瘍毒性）を示し、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）は、別の認識されている副作用である。

【0006】

二重特異性抗体を使用した腫瘍細胞のＴ細胞指向性殺傷は、ＡＭＬを含む様々な癌型の治療に利用されている別の最近の治療ツールである。これらのＴ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）二重特異性抗体は、２つの異なる可変領域を含み、一方はＴ細胞受容体複合体サブユニットＣＤ３に結合し、他方は腫瘍細胞表面抗原に結合する。これらの２つの標的へのＴＣＥの結合は、細胞間の機能的接続を提供し、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞に対して細胞傷害活性をもたらし、正常なＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用を回避する（Ｅｌｌｅｒｍａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ；１５４：１０２～１１７（２０１９年））。ＡＭＧ３３０は、ＡＭＬ細胞に対してＴ細胞の細胞障害性を引き起こすことができる、ＣＤ３及びＣＤ３３に対して二重特異性抗体である。同様に、フロテツズマブは、２つの独立したポリペプチドを用いて、一方の抗体の重鎖可変ドメインを他方の抗体の軽鎖可変ドメインに融合させて、Ｔ細胞上のＣＤ３及びＡＭＬ細胞上のＣＤ１２３を接続する二重親和性再標的化抗体（ＤＡＲＴ（登録商標））である。

【0007】

しかしながら、これらの抗体ベースのTCE治療薬は、製造コストが高いこと、複数の病気関連抗原を標的とすることができないことなどのいくつかの欠点を提示し、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）などの重篤な副作用（Ｓｈｉｍａｂｕｋｕｒｏ－Ｖｏｒｎｈａｇｅｎら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ Ｃａｎｃｅｒ；６（１）：５６（２０１８年）；Ｌａｂｒｊｉｎら、Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ；１８（８）：５８５～６０８（２０１９年））及び／又はオンターゲット／オフ腫瘍毒性（Ｗｅｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；５５（２０）：４５８６～４５９３（１９９５年）；Ｗｅｉｎｅｒら、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．；４２（３）；１４１－１５０（１９９６））を引き起こすリスクを抱えている。抗体ベースのＴ細胞エンゲージャは、天然のＴＣＲ－ＭＨＣ相互作用と比較して、ＣＤ３に対して１０００倍超高い親和性を示すことが多い（（Ｗｕら、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ；１８２：１６１～７５（２０１８年）；国際公開第２０１４／１６７０２２号；Ｊｕｎｎｔｉｌａ ｅｔ ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．；１９：５５６１～７１（２０１４年）；Ｙａｎｇら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ａｕｇ．；１５（１３７）：１０９７～１００（１９８６年））。この高い親和性は、Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷の点でより低い効率と相関している（Ｂｏｒｔｏｌｅｔｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２；１１：３１０２－３１０７（２００２年）；Ｅｌｌｅｒｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ；１５４：１０２～１１７（２０１９年）；Ｍａｎｄｉｋｉａｎら，Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．；１７（４）：７７６ ＬＰ－７８５（２０１８）；Ｖａｆａら，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ；１０：４４６（２０２０））。更に、ＴＣＥによって標的化される腫瘍表面マーカのダウンレギュレーションは、ＴＣＥ治療に対して腫瘍の耐性をもたらし得る。

【0008】

急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、上述したように、多くの点で癌療法の課題及び現在利用可能な癌療法の欠点を例示する癌の一種である。ＡＭＬについては、高い死亡率による医学的必要性が高いままであり、再発性又は難治性ＡＭＬの処置は、未だに治療が困難である。現在、多量の抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）及び標的化Ｔ細胞エンゲージャ療法がＡＭＬにおける臨床開発に入っているが、これらの療法は、用量制限毒性を伴うことが多い。最大の課題は、例えば、それぞれ骨髄毒性及びサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）をもたらす、限定された標的特異性及び免疫系の過剰刺激であると思われる。更に、標的癌療法に対する耐性は、腫瘍細胞における個々の標的のダウンレギュレーションに起因して進化し得る。したがって、ＡＭＬに例示されるように、癌療法のこれらの課題及び現在利用可能な癌療法の欠点に対処するために、新規のアプローチ又は薬物分子が必要とされる。

【0009】

したがって、上述の治療用タンパク質の１つ以上の欠点に対処する有益な特性を有する、免疫細胞エンゲージャ、例えばＴＣＥタンパク質などの新しい分子が依然として必要とされている。そのような新規分子は、腫瘍性疾患、例えば急性骨髄性白血病の治療のための治療アプローチに有用であり得る。

【発明の概要】

【0010】

本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも２つの結合剤とを含む組換えタンパク質であって、当該２つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する組換えタンパク質を提供する。加えて、本発明は、そのような結合タンパク質をコードする核酸、及びそのような結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物を提供する。本発明はまた、腫瘍環境におけるＴ細胞などの免疫細胞の局所的活性化のため、及びヒトを含む哺乳動物における急性骨髄性白血病などの疾患を治療及び診断するための方法における、そのような結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物の使用を提供する。

【0011】

本発明の組換えタンパク質は、少なくとも２つの異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を標的とする。本発明の組換えタンパク質は、少なくとも２つのＴＡＡが腫瘍細胞中に同時に存在する場合、アビディティ獲得による実質的に増加した腫瘍特異性を示し得る。また、そのようなアビディティ獲得に起因して、本発明の多重特異性タンパク質は、それぞれの単一標的特異性対照と比較してより大きな効果領域を有し得る。更に、本発明のタンパク質は、現在の治療分子と比較して、有意に少ないサイトカイン放出を誘導し得、改善された治療領域を示す。また、少なくとも２つの異なるＴＡＡを標的化することによって、本発明のタンパク質は、標的ダウンレギュレーションに起因する腫瘍耐性の発生に対してより高い耐性を有し得る。

【0012】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも２つの結合剤とを含み、当該２つの結合剤が、異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現された当該タンパク質及び当該２つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0013】

一態様では、本発明は、当該２つの結合剤によって特異的に結合される当該腫瘍関連抗原が腫瘍細胞において共発現される、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0014】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも３つの結合剤とを含み、当該３つの結合剤が、異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現された当該タンパク質及び当該３つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0015】

一態様では、本発明は、当該３つの結合剤によって特異的に結合される当該腫瘍関連抗原が、腫瘍細胞において共発現される、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0016】

一態様では、本発明は、当該腫瘍細胞が液性腫瘍由来の腫瘍細胞であり、好ましくは当該液性腫瘍が白血病であり、より好ましくは当該白血病が急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0017】

一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤のうちの１つのみを含む組換えタンパク質と比較した場合に、当該腫瘍関連抗原を提示する表面に、より低い解離定数（Ｋ_D）で結合することができる、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0018】

一態様では、本発明は、当該腫瘍関連抗原を提示する当該表面が当該腫瘍細胞の表面である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0019】

一態様では、本発明は、当該免疫細胞がＴ細胞である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0020】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質が、Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質であり、好ましくは、Ｔ細胞受容体複合体の当該一部がＣＤ３である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0021】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0022】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0023】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0024】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0025】

一態様では、本発明は、そのような組換えタンパク質であって、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤が、（ｉ）第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤、（ｉｉ）第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤、及び（ｉｉｉ）第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤からなる群から選択される組換えタンパク質を提供する。

【0026】

一態様では、本発明は、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0027】

一態様では、本発明は、当該第２の結合剤が、当該ＴＡＡ１に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはＴＡＡ１が、ＣＤ３３である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0028】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５及び６７～７０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２、好ましくは配列番号１１１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0029】

一態様では、本発明は、当該第３の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0030】

一態様では、本発明は、当該第３の結合剤が、当該ＴＡＡ２に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはＴＡＡ２が、ＣＤ１２３である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0031】

一態様では、本発明は、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６及び６５～６６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６、好ましくは配列番号１０５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0032】

一態様では、本発明は、当該第４の結合剤が、当該ＴＡＡ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはＴＡＡ３が、ＣＤ７０である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0033】

一態様では、本発明は、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０、好ましくは配列番号１０９のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0034】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５及び６７～７０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２、好ましくは配列番号１１１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、当該ＣＤ１２３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６、好ましくは配列番号１０５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0035】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５及び６７～７０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２、好ましくは配列番号１１１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０、好ましくは配列番号１０９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0036】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６及び６５～６６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６、好ましくは配列番号１０５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、当該ＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０、好ましくは配列番号１０９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0037】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５及び６７～７０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６及び６５～６６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２、好ましくは配列番号１１１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、当該ＣＤ１２３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６、好ましくは配列番号１０５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含み、当該ＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０、好ましくは配列番号１０９のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含みそのような組換えタンパク質を提供する。

【0038】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び／又は第３の結合剤がペプチドリンカーと共有結合している、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0039】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、当該タンパク質は、配列番号７～１０及び５８～６２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、当該タンパク質が、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つを有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、当該タンパク質が、配列番号９５～１０１、好ましくは配列番号９５又は配列番号９６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。本発明は更に、当該タンパク質が、配列番号９５～１０１、好ましくは配列番号９５又は配列番号９６のアミノ酸配列のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0040】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、１０^-6Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0041】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0042】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0043】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0044】

一態様では、本発明は、当該結合タンパク質が、１～４００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３に結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0045】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、半減期延長部分を更に含み、好ましくは、当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する結合剤である、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0046】

一態様では、本発明は、当該半減期延長部分が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0047】

一態様では、本発明は、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0048】

一態様では、本発明は、当該組換えタンパク質が、１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに結合する、そのような組換えタンパク質を提供する。

【0049】

一態様では、本発明は更に、そのような組換えタンパク質をコードする核酸を提供する。

【0050】

一態様では、本発明は更に、組換えタンパク質、又はそのような組換えタンパク質をコードする核酸、並びに薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物を提供する。

【0051】

一態様では、本発明は更に、必要とする患者に、治療有効量のそのような組換えタンパク質、又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を投与する工程を含む、医学的状態を治療する方法を提供する。

【0052】

一態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、当該医学的状態が癌、好ましくは液性腫瘍、より好ましくは白血病、更により好ましくは急性骨髄性白血病である、方法を提供する。

【0053】

一態様では、本発明は、治療に使用するための、本明細書で定義される組換えタンパク質又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を提供する。

【0054】

一態様では、本発明は、癌の治療に使用するための、好ましくは液性腫瘍の治療に使用するための、本明細書で定義される組換えタンパク質又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を提供する。

【0055】

一態様では、本発明は、癌の治療に使用するための、本明細書で定義される組換えタンパク質又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を提供し、当該癌は白血病であり、好ましくは当該癌は急性骨髄性白血病である。

【図面の簡単な説明】

【0056】

【図1A】雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ３特異性設計アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析図は、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラス投与後の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９の群平均血清濃度－時間プロファイルを示す（平均±最大／分、群当たりＮ＝３）。

【図1B】雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける例示的な特異的設計アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析図は、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内ボーラス投与後の、雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５の群平均血清濃度－時間プロファイルを示す（平均±最大／分、群当たりＮ＝３）。

【図2A】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３（図２Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４（図２Ｂ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２Ｃ）によって例示される、ヒトＣＤ３に対してアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトＣＤ３を有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質ＣＤ３相互作用を決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。

【図2B】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３（図２Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４（図２Ｂ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２Ｃ）によって例示される、ヒトＣＤ３に対してアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトＣＤ３を有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質ＣＤ３相互作用を決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。

【図2C】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３（図２Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４（図２Ｂ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２Ｃ）によって例示される、ヒトＣＤ３に対してアンキリン反復タンパク質結合の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析。様々な濃度の精製されたアンキリン反復タンパク質を、オン速度及びオフ速度測定のために不動化したヒトＣＤ３を有するＧＬＣチップに適用した。得られたＳＰＲトレース分析を使用して、アンキリン反復タンパク質ＣＤ３相互作用を決定した。ＲＵ、共鳴単位；ｓ、時間（秒）。

【図2D】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７について得られたＳＰＲトレースを示す。

【図3A】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにＭＯＬＭ－１３細胞に結合する（半減期延長を伴わない）選択された組換えタンパク質（図３Ａ）、１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１）と比較した、ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図３Ｂ）１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４３）と比較した、ＣＤ７０及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図３Ｃ）１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４６）と比較した、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する３つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０、を示す。

【図3B】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにＭＯＬＭ－１３細胞に結合する（半減期延長を伴わない）選択された組換えタンパク質（図３Ａ）、１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１）と比較した、ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図３Ｂ）１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４３）と比較した、ＣＤ７０及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図３Ｃ）１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４６）と比較した、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する３つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０、を示す。

【図3C】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにＭＯＬＭ－１３細胞に結合する（半減期延長を伴わない）選択された組換えタンパク質（図３Ａ）、１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１）と比較した、ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図３Ｂ）１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４３）と比較した、ＣＤ７０及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異性結合ドメインであるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図３Ｃ）１つのみの腫瘍抗原特異性結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４６）と比較した、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する３つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０、を示す。

【図4A】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにＭＯＬＭ－１３細胞に結合する選択された組換えタンパク質、（図４Ａ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図４Ｂ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図４Ｃ）Ｎ末端に位置する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、を示す。

【図4B】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにＭＯＬＭ－１３細胞に結合する選択された組換えタンパク質、（図４Ａ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図４Ｂ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図４Ｃ）Ｎ末端に位置する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、を示す。

【図4C】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びにＭＯＬＭ－１３細胞に結合する選択された組換えタンパク質、（図４Ａ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図４Ｂ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図４Ｃ）Ｎ末端に位置する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、を示す。

【図5A】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに２つ又は３つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、（図５Ａ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１）と比較した、ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図５Ｂ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４３）と比較した、ＣＤ７０及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図５Ｃ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４６）と比較した、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０、を示す。

【図5B】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに２つ又は３つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、（図５Ａ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１）と比較した、ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図５Ｂ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４３）と比較した、ＣＤ７０及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図５Ｃ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４６）と比較した、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０、を示す。

【図5C】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに２つ又は３つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、（図５Ａ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１）と比較した、ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図５Ｂ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４２及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４３）と比較した、ＣＤ７０及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図５Ｃ）１つのみの腫瘍抗原特異的結合ドメインを有するタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４６）と比較した、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０、を示す。

【図6A】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに２つ又は３つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、（図６Ａ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図６Ｂ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図６Ｃ）Ｎ末端に位置する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６３）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、を示す。

【図6B】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに２つ又は３つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、（図６Ａ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図６Ｂ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図６Ｃ）Ｎ末端に位置する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６３）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、を示す。

【図6C】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに２つ又は３つの腫瘍特異的結合ドメインを有する多重特異性組換えタンパク質、（図６Ａ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（図６Ｂ）Ｎ末端に位置する２つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、（図６Ｃ）Ｎ末端に位置する３つの腫瘍抗原特異的結合ドメイン及び１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６３）、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、を示す。

【図7】標的細胞殺傷。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を示す。データは、腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５が、臨床ベンチマークと比較した場合に同様の効力及び有効性を発揮することを示す。

【図8】標的細胞殺傷。曲線７は、３つ全ての標的（ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３）を発現するＭｏｌｍ１３親細胞を表す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１は、完全な効力を示す。曲線４～６は、２つの標的のみが依然として発現されていることを意味する単一ＫＯ細胞を表す。ここで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５は依然として活性であり、腫瘍不均一性に対抗する可能性を示唆している。曲線１～３は、二重ＫＯ細胞を表し、１つのみの標的が健常組織区画を模倣するために依然として発現されていることを意味する。ここで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１は、活性が有意に低く、健常組織に対する選択性が改善されていることを意味する。

【図9A】ＩＦＮγのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図９Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図９Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図９Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図９Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図9B】ＩＦＮγのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図９Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図９Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図９Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図９Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図9C】ＩＦＮγのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図９Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図９Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図９Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図９Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図9D】ＩＦＮγのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図９Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図９Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図９Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図９Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図10A】ＩＬ－２のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１０Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１０Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１０Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１０Ｄに示す。

【図10B】ＩＬ－２のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１０Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１０Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１０Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１０Ｄに示す。

【図10C】ＩＬ－２のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１０Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１０Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１０Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１０Ｄに示す。

【図10D】ＩＬ－２のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１０Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１０Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１０Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１０Ｄに示す。

【図11A】ＩＬ－６のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図11B】ＩＬ－６のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図11C】ＩＬ－６のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図11D】ＩＬ－６のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図12A】ＩＬ－８のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図12B】ＩＬ－８のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図12C】ＩＬ－８のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図12D】ＩＬ－８のレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１１Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１１Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１１Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１１Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図13A】ＴＮＦαのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１３Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１３Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１３Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１３Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図13B】ＴＮＦαのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１３Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１３Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１３Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１３Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図13C】ＴＮＦαのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１３Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１３Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１３Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１３Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図13D】ＴＮＦαのレベル（３人のドナーの平均）。血液ループ系における全３人のドナー（Ｄ１～３）についてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。各点は３人のドナーの平均であり、エラーバーはＳＤである。フロテツズマブを図１３Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１３Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１３Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１３Ｄに示す。データ及び値はＵＬＯＱ超である。

【図14A】血小板数。血液を時間０（ゼロ試料）、２、４、８、及び２４時間でループから抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＰＬＴ数を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブを図１４Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１４Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１４Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１４Ｄに示す。

【図14B】血小板数。血液を時間０（ゼロ試料）、２、４、８、及び２４時間でループから抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＰＬＴ数を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブを図１４Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１４Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１４Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１４Ｄに示す。

【図14C】血小板数。血液を時間０（ゼロ試料）、２、４、８、及び２４時間でループから抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＰＬＴ数を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブを図１４Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１４Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１４Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１４Ｄに示す。

【図14D】血小板数。血液を時間０（ゼロ試料）、２、４、８、及び２４時間でループから抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを用いてＰＬＴ数を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブを図１４Ａに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を図１４Ｂに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を図１４Ｃに、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を図１４Ｄに示す。

【図15A】選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１について測定した、ＣＤ３３標的についてのオン速度／オフ速度定数。

【図15B】選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１について測定した、ＣＤ３３標的についてのオン速度／オフ速度定数。

【図16A】選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１について測定した、ＣＤ１２３標的についてのオン速度／オフ速度定数。

【図16B】選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質４１について測定した、ＣＤ１２３標的についてのオン速度／オフ速度定数。

【図17】組換えタンパク質とヒトＣＤ３３との相互作用のＫ_D値

【図18】組換えタンパク質とヒトＣＤ１２３との相互作用のＫ_D値

【図19】ヒトＣＤ３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４に対して結合特異性を有する、４つの選択されたアンキリン反復タンパク質の精製物のＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル分析である。Ｍは、タンパク質サイズマーカ（還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＮｕＰＡＧＥ４～１２％、Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ゲル；５μｇ／レーン；ＭＥＳ緩衝液；インスタントブルー染色）。マーカタンパク質の分子量（ｋＤａ）を示す。レーン１：タンパク質サイズマーカ；レーン２：精製ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１；レーン３：精製ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２；レーン４：精製ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３；レーン５：精製ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４。

【図20A】図２０Ａ及び図２０Ｂ．例示したアンキリン反復タンパク質のＴ細胞へのＣＤ３結合Ｐａｎ－Ｔ細胞上のＣＤ３への結合を、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌによって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２０Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２０Ｂ）を示す。半減期延長タンパク質（Ｂ）は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して同様の結合を示す。５人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。図２０Ｃは、Ｍｏｌｍ－１３ Ｎ１細胞に対して、選択された多重特異性結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の腫瘍細胞結合を示す。

【図20B】図２０Ａ及び図２０Ｂ．例示したアンキリン反復タンパク質のＴ細胞へのＣＤ３結合Ｐａｎ－Ｔ細胞上のＣＤ３への結合を、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌによって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２０Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２０Ｂ）を示す。半減期延長タンパク質（Ｂ）は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して同様の結合を示す。５人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。図２０Ｃは、Ｍｏｌｍ－１３ Ｎ１細胞に対して、選択された多重特異性結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の腫瘍細胞結合を示す。

【図20C】図２０Ａ及び図２０Ｂ．例示したアンキリン反復タンパク質のＴ細胞へのＣＤ３結合Ｐａｎ－Ｔ細胞上のＣＤ３への結合を、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌによって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２０Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２０Ｂ）を示す。半減期延長タンパク質（Ｂ）は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して同様の結合を示す。５人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。図２０Ｃは、Ｍｏｌｍ－１３ Ｎ１細胞に対して、選択された多重特異性結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の腫瘍細胞結合を示す。

【図21】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ、並びに２つの腫瘍特異的結合ドメイン（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８）又は１つのみの腫瘍特異的結合ドメイン（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２４）のいずれかでＭＯＬＭ－１３細胞に結合する選択された組換えタンパク質を示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８によって誘導されるＴ細胞活性化はベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２４はより低い効力を示した。１人のドナーからの汎Ｔ細胞を使用した代表的なデータを示す。

【図22A】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２２Ａ）、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２２Ｂ）を示す。（図２２Ａ）半減期延長を伴わないタンパク質について、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導される腫瘍細胞殺傷は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７は、細胞障害性においてより低い効力を示す。（図２２Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において４～７０倍の減少を示す。５人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。

【図22B】短期標的細胞殺傷（ＬＤＨ）。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での４８時間の共培養後の上清中のＬＤＨ放出によって評価した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２２Ａ）、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２２Ｂ）を示す。（図２２Ａ）半減期延長を伴わないタンパク質について、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導される腫瘍細胞殺傷は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７は、細胞障害性においてより低い効力を示す。（図２２Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において４～７０倍の減少を示す。５人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。

【図23A】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化である。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２３Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２３Ｂ）を示す。（図２３Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞活性化は、ベンチマークに匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７は、より低い効力を示す。（図２３Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において４－１００倍の減少を示す。７人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。

【図23B】活性化マーカＣＤ２５によって測定される短期Ｔ細胞活性化である。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での２４時間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２３Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２３Ｂ）を示す。（図２３Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞活性化は、ベンチマークに匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７は、より低い効力を示す。（図２３Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において４－１００倍の減少を示す。７人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。

【図24A】ＩＦＮγ分泌によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートした。示された分子の段階希釈物の存在下で２４時間共培養した後、培養上清中のＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡによって分析した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２４Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２４Ｂ）を示す。（図２４Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７は、より低い効力を示す。（図２４Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において３－２０倍の減少を示す。４人の異なるドナーからのＰａｎ－Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。

【図24B】ＩＦＮγ分泌によって測定される短期Ｔ細胞活性化。汎Ｔ及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートした。示された分子の段階希釈物の存在下で２４時間共培養した後、培養上清中のＩＦＮγ分泌をＥＬＩＳＡによって分析した。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２４Ａ）又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４（図２４Ｂ）を示す。（図２４Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７は、より低い効力を示す。（図２４Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において３－２０倍の減少を示す。４人の異なるドナーからのＰａｎ－Ｔ細胞を試験し、１人の代表的なドナーをここに示す。（^*陰性対照：それぞれ半減期延長を伴うか又は伴わないＣＤ３３及びＣＤ１２３のみに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復タンパク質）。

【図25】長期腫瘍細胞死滅である。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、５：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、腫瘍細胞殺傷を、示された分子の段階希釈物の存在下での６日間にわたる共培養で、ＩｎｃｕＣｙｔｅによって評価した。腫瘍細胞死滅を、アネキシンＶ染色の曲線下面積と細胞増殖との間の比として計算する。２つのベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４を示す。データは、半減期延長とは無関係に、ほとんどの試験されたタンパク質で、ベンチマーク分子に匹敵する強力かつ特異的な腫瘍細胞死滅を示す。より低い親和性のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７のみが、死滅効力の顕著な低下を示す。濃度は、左から右に、ベンチマーク及び試験タンパク質については１／１０に希釈した２ｎＭであり、半減期延長分子については１／１０に希釈した２０ｎＭである。５人の異なるドナーからのＰａｎ－Ｔ細胞を使用し、１人の代表的なドナーをここに示す。

【図26A】長期Ｔ細胞活性化である。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での５日間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４を示す。（図２６Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０は、効力において１００倍超の減少を示す。（図２６Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において１０倍超の減少を示す。２人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を使用し、１人の代表的なドナーをここに示す。

【図26B】長期Ｔ細胞活性化である。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞活性化を、示された分子の段階希釈物の存在下での５日間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋細胞としてゲーティングした。ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４を示す。（図２６Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞活性化は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０は、効力において１００倍超の減少を示す。（図２６Ｂ）半減期延長タンパク質は、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において１０倍超の減少を示す。２人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を使用し、１人の代表的なドナーをここに示す。

【図27A】長期Ｔ細胞増殖。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞増殖を、示された分子の段階希釈物の存在下での５日間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。増殖Ｔ細胞を、少なくとも１回の細胞分裂を示すＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性細胞としてゲーティングした。２つのベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４を示す。（図２７Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞増殖は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０は、効力において１００倍超の減少を示す。（図２７Ｂ）半減期延長ＤＡＲＰｉｎは、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において３０倍超の減少を示す。２人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を使用し、１人の代表的なドナーをここに示す。

【図27B】長期Ｔ細胞増殖。汎Ｔ細胞及びＭｏｌｍ－１３細胞を、１：１のＥ：Ｔ比でインキュベートし、Ｔ細胞増殖を、示された分子の段階希釈物の存在下での５日間の共培養後に、ＦＡＣＳによって評価した。増殖Ｔ細胞を、少なくとも１回の細胞分裂を示すＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ陽性細胞としてゲーティングした。２つのベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）、並びに選択されたアンキリン反復タンパク質の半減期延長（ＨＬＥ）を伴わないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０、又は半減期延長（ＨＬＥ）を伴うＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１４を示す。（図２７Ａ）半減期延長を伴わない、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９によって誘導されるＴ細胞増殖は、ベンチマーク分子に匹敵するが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０は、効力において１００倍超の減少を示す。（図２７Ｂ）半減期延長ＤＡＲＰｉｎは、（Ａ）に示される対応する非ＨＬＥ分子と比較して、効力において３０倍超の減少を示す。２人の異なるドナーからの汎Ｔ細胞を使用し、１人の代表的なドナーをここに示す。

【図28A】ＩＦＮγのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２８Ａ）、フロテツズマブ類似物（図２８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図２８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図２８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２８Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２８Ｆ）について経時的に示す。０値は示されていない。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を表す。全ての値は定量化の上限未満である（ＵＬＯＱ未満）。

【図28B】ＩＦＮγのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２８Ａ）、フロテツズマブ類似物（図２８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図２８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図２８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２８Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２８Ｆ）について経時的に示す。０値は示されていない。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を表す。全ての値は定量化の上限未満である（ＵＬＯＱ未満）。

【図28C】ＩＦＮγのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２８Ａ）、フロテツズマブ類似物（図２８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図２８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図２８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２８Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２８Ｆ）について経時的に示す。０値は示されていない。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を表す。全ての値は定量化の上限未満である（ＵＬＯＱ未満）。

【図28D】ＩＦＮγのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２８Ａ）、フロテツズマブ類似物（図２８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図２８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図２８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２８Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２８Ｆ）について経時的に示す。０値は示されていない。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を表す。全ての値は定量化の上限未満である（ＵＬＯＱ未満）。

【図28E】ＩＦＮγのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２８Ａ）、フロテツズマブ類似物（図２８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図２８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図２８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２８Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２８Ｆ）について経時的に示す。０値は示されていない。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を表す。全ての値は定量化の上限未満である（ＵＬＯＱ未満）。

【図28F】ＩＦＮγのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２８Ａ）、フロテツズマブ類似物（図２８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図２８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図２８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図２８Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２８Ｆ）について経時的に示す。０値は示されていない。点線は、定量下限（ＬＬＯＱ）を表す。全ての値は定量化の上限未満である（ＵＬＯＱ未満）。

【図29A】ＴＮＦαのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２９Ａ）、フロテツズマブ類似物（図図２９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図２９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８（図２９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９（図２９Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２９Ｆ）について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はＬＬＯＱを表す。全ての値はＵＬＯＱ未満である。

【図29B】ＴＮＦαのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２９Ａ）、フロテツズマブ類似物（図図２９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図２９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８（図２９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９（図２９Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２９Ｆ）について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はＬＬＯＱを表す。全ての値はＵＬＯＱ未満である。

【図29C】ＴＮＦαのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２９Ａ）、フロテツズマブ類似物（図図２９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図２９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８（図２９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９（図２９Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２９Ｆ）について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はＬＬＯＱを表す。全ての値はＵＬＯＱ未満である。

【図29D】ＴＮＦαのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２９Ａ）、フロテツズマブ類似物（図図２９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図２９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８（図２９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９（図２９Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２９Ｆ）について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はＬＬＯＱを表す。全ての値はＵＬＯＱ未満である。

【図29E】ＴＮＦαのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２９Ａ）、フロテツズマブ類似物（図図２９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図２９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８（図２９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９（図２９Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２９Ｆ）について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はＬＬＯＱを表す。全ての値はＵＬＯＱ未満である。

【図29F】ＴＮＦαのレベル。血漿試料を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間に全血ループ系から収集した。ビヒクルは陰性対照である。２人のドナーの平均を、ＡＭＧ３３０類似物（図２９Ａ）、フロテツズマブ類似物（図図２９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図２９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質８（図２９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質９（図２９Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図２９Ｆ）について経時的に示す。ゼロ値は示されていない。点線はＬＬＯＱを表す。全ての値はＵＬＯＱ未満である。

【図30A】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ２５陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＡＭＧ３３０類似物（図３０Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３０Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３０Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図30B】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ２５陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＡＭＧ３３０類似物（図３０Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３０Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３０Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図30C】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ２５陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＡＭＧ３３０類似物（図３０Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３０Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３０Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図30D】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ２５陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＡＭＧ３３０類似物（図３０Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３０Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３０Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図30E】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ２５陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＡＭＧ３３０類似物（図３０Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３０Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３０Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図30F】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ２５陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。％ＣＤ２５陽性Ｔ細胞は、ＡＭＧ３３０類似物（図３０Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３０Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３０Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図31A】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ６９陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞％は、ＡＭＧ３３０類似物（図３１Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３１Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３１Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３１Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３１Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３１Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図31B】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ６９陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞％は、ＡＭＧ３３０類似物（図３１Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３１Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３１Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３１Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３１Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３１Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図31C】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ６９陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞％は、ＡＭＧ３３０類似物（図３１Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３１Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３１Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３１Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３１Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３１Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図31D】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ６９陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞％は、ＡＭＧ３３０類似物（図３１Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３１Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３１Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３１Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３１Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３１Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図31E】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ６９陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞％は、ＡＭＧ３３０類似物（図３１Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３１Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３１Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３１Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３１Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３１Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図31F】Ｔ細胞活性化（％ＣＤ６９陽性細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ６９陽性Ｔ細胞％は、ＡＭＧ３３０類似物（図３１Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３１Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３１Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３１Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３１Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３１Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図32A】Ｔ細胞生存性（全ＣＤ３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３２Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３２Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３２Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３２Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３２Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３２Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図32B】Ｔ細胞生存性（全ＣＤ３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３２Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３２Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３２Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３２Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３２Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３２Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図32C】Ｔ細胞生存性（全ＣＤ３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３２Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３２Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３２Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３２Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３２Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３２Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図32D】Ｔ細胞生存性（全ＣＤ３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３２Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３２Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３２Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３２Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３２Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３２Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図32E】Ｔ細胞生存性（全ＣＤ３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３２Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３２Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３２Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３２Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３２Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３２Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図32F】Ｔ細胞生存性（全ＣＤ３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３２Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３２Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３２Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３２Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３２Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３２Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図33A】ＣＤ３３＋細胞生存性（全ＣＤ３３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ３３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３３Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３３Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３３Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３３Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３３Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３３Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図33B】ＣＤ３３＋細胞生存性（全ＣＤ３３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ３３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３３Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３３Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３３Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３３Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３３Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３３Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図33C】ＣＤ３３＋細胞生存性（全ＣＤ３３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ３３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３３Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３３Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３３Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３３Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３３Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３３Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図33D】ＣＤ３３＋細胞生存性（全ＣＤ３３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ３３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３３Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３３Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３３Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３３Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３３Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３３Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図33E】ＣＤ３３＋細胞生存性（全ＣＤ３３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ３３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３３Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３３Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３３Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３３Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３３Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３３Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図33F】ＣＤ３３＋細胞生存性（全ＣＤ３３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ３３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３３Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３３Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３３Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３３Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３３Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３３Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図34A】ＣＤ１２３＋細胞生存性（全ＣＤ１２３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（０）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３４Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図３４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３４Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３４Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図34B】ＣＤ１２３＋細胞生存性（全ＣＤ１２３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（０）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３４Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図３４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３４Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３４Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図34C】ＣＤ１２３＋細胞生存性（全ＣＤ１２３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（０）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３４Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図３４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３４Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３４Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図34D】ＣＤ１２３＋細胞生存性（全ＣＤ１２３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（０）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３４Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図３４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３４Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３４Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図34E】ＣＤ１２３＋細胞生存性（全ＣＤ１２３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（０）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３４Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図３４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３４Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３４Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図34F】ＣＤ１２３＋細胞生存性（全ＣＤ１２３＋の死細胞％）。血液細胞を、０（０）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞％（すなわち、死細胞％）は、ＡＭＧ３３０類似物（図３４Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質７（図３４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３４Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３４Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図35A】Ｔ細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３５Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３５Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３５Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図35B】Ｔ細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３５Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３５Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３５Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図35C】Ｔ細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３５Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３５Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３５Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図35D】Ｔ細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３５Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３５Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３５Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図35E】Ｔ細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３５Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３５Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３５Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図35F】Ｔ細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３５Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３５Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３５Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図36A】ＣＤ３３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３６Ａ）、フロテツズマブ類似（図３６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３６Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３６Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図36B】ＣＤ３３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３６Ａ）、フロテツズマブ類似（図３６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３６Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３６Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図36C】ＣＤ３３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３６Ａ）、フロテツズマブ類似（図３６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３６Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３６Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図36D】ＣＤ３３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３６Ａ）、フロテツズマブ類似（図３６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３６Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３６Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図36E】ＣＤ３３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３６Ａ）、フロテツズマブ類似（図３６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３６Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３６Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図36F】ＣＤ３３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３６Ａ）、フロテツズマブ類似（図３６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３６Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３６Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図37A】ＣＤ１２３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３７Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３７Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３７Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図37B】ＣＤ１２３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３７Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３７Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３７Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図37C】ＣＤ１２３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３７Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３７Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３７Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図37D】ＣＤ１２３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３７Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３７Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３７Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図37E】ＣＤ１２３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３７Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３７Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３７Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図37F】ＣＤ１２３＋細胞の細胞数（１００００ビーズ当たりの細胞）。血液細胞を、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間、４８時間に全血ループ系から収集し、蛍光体標識抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。１００００個のビーズ当たりの細胞数は、ＡＭＧ３３０類似物（図３７Ａ）、フロテツズマブ類似物（図３７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７（図３７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８（図３７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９（図３７Ｅ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１０（図３７Ｆ）について２人のドナーの平均として経時的に報告される。ビヒクルは陰性対照である。

【図38A】ＣＤ３３標的についてのオン速度（図３８Ａ）及びオフ速度（図３８Ｂ）定数、選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２２について測定。

【図38B】ＣＤ３３標的についてのオン速度（図３８Ａ）及びオフ速度（図３８Ｂ）定数、選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２２について測定。

【図39A】ＣＤ１２３標的についてのオン速度（図３９Ａ）及びオフ速度（図３９Ｂ）定数、選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２２について測定。

【図39B】ＣＤ１２３標的についてのオン速度（図３９Ａ）及びオフ速度（図３９Ｂ）定数、選択された組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質２２について測定。

【図40】組換えタンパク質とヒトＣＤ３３との相互作用のＫ_D値

【図41】組換えタンパク質とヒトＣＤ１２３との相互作用のＫ_D値

【図42A】腫瘍体積の平均及びＳＤ。

【図42B】腫瘍体積の平均及びＳＤ。

【図42C】腫瘍体積の平均及びＳＤ。

【図43A】単一の腫瘍成長曲線。

【図43B】単一の腫瘍成長曲線。

【図43C】単一の腫瘍成長曲線。

【図43D】単一の腫瘍成長曲線。

【図43E】単一の腫瘍成長曲線。

【図43F】単一の腫瘍成長曲線。

【図43G】単一の腫瘍成長曲線。

【図43H】単一の腫瘍成長曲線。

【図43I】単一の腫瘍成長曲線。

【図43J】単一の腫瘍成長曲線。

【図43K】単一の腫瘍成長曲線。

【図43L】単一の腫瘍成長曲線。

【図44A】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44B】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44C】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44D】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44E】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44F】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44G】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図44H】ＩＦＮγのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＦＮγの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４４Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４４Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４４Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４４Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４４Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４４Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４４Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45A】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45B】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45C】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45D】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45E】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45F】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45G】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図45H】ＩＬ－２のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－２の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４５Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４５Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４５Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４５Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４５Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４５Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４５Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４５Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46A】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46B】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46C】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46D】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46E】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46F】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46G】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図46H】ＩＬ－６のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－６の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４６Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４６Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４６Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４６Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４６Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４６Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４６Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４６Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47A】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47B】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47C】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47D】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47E】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47F】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47G】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図47H】ＩＬ－８のレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＩＬ－８の平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４７Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４７Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４７Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４７Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４７Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４７Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４７Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４７Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48A】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48B】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48C】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48D】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48E】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48F】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48G】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図48H】ＴＮＦαのレベル。血液ループ系における全３人のドナーについてのＴＮＦαの平均濃度値を計算した。血漿試料を、０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間で血液ループ系から収集した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４８Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４８Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４８Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４８Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４８Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４８Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４８Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４４Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49A】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49B】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49C】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49D】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49E】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49F】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49G】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図49H】血小板数。時間０（ゼロ）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ（Ｈ）を使用して血小板を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図４９Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図４９Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図４９Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図４９Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図４９Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図４９Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図４９Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図４９Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50A】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50B】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50C】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50D】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50E】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50F】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50G】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図50H】白血球数。時間０（０）、並びに２、４、８、及び２４時間に血液ループ系から血液試料を抽出し、Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒを使用して白血球を自動的に計数した。各点は、３人のドナーの平均（及びエラーバーはＳＤ）を表す。フロテツズマブ（図５０Ａ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（図５０Ｂ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（図５０Ｃ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（図５０Ｄ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（図５０Ｅ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（図５０Ｆ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（図５０Ｇ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（図５０Ｈ）。計算されたＬＬＯＱは点線で示されている。

【図51A】図５１Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は様々なＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｅ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図51B】図５１Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は様々なＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｅ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図51C】図５１Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は様々なＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｅ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図51D】図５１Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は様々なＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｅ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図51E】図５１Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は様々なＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の効力滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５１Ｅ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図52A】図５２Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０－類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞に対して、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図52B】図５２Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０－類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞に対して、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図52C】図５２Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０－類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞に対して、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図52D】図５２Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０－類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞に対して、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図52E】図５２Ａ．ヒト培養汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の効力滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、並びに対応する陰性対照であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７７の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｃ．ヒト汎Ｔ細胞と共培養したＭｏｌｍ１３腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び既知のベンチマーク対照分子であるＡＭＧ３３０－類似物及びフロテツズマブ類似物の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５２Ｄ．Ｍｏｌｍ１３野生型又は種々のＴＡＡノックアウト腫瘍細胞に対して、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。

【図53A】図５３Ａ．ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（同種及び自己Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５３Ｂ．フロテツズマブ及びＡＭＧ３３０と比較した、ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。

【図53B】図５３Ａ．ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（同種及び自己Ｔ細胞活性化）。ＥＣ５０値をｐＭで示す。図５３Ｂ．フロテツズマブ及びＡＭＧ３３０と比較した、ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的とするＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の力価滴定曲線（細胞殺傷）。

【図54A】図５Ａフロテツズマブと比較した、ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的化する選択された多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。図５４Ｂ．フロテツズマブと比較した、ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的化する選択された多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の力価滴定曲線（腫瘍細胞殺傷）。

【図54B】図５Ａフロテツズマブと比較した、ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的化する選択された多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の力価滴定曲線（Ｔ細胞活性化）。図５４Ｂ．フロテツズマブと比較した、ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞上の、ＣＤ１２３－ＣＤ３３－ＣＤ７０を標的化する選択された多重特異性ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の力価滴定曲線（腫瘍細胞殺傷）。

【図55】デルタＭＦＩとして表される、異なるＬＳＣ及びＨＳＣ試料にわたる発現中央値。

【図56】ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７による、ＨＳＣ（白抜きの棒）よりもＬＳＣ（黒塗りの棒）の優先的な殺傷は、ＬＳＣとＨＳＣとの間の治療機会の存在を確認する。

【図57A】Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷対ＩＦＮγの放出。Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷を黒い四角／曲線で示し、ＩＦＮγの濃度を黒い丸／曲線で示す。図５７Ａ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５７Ｂ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５７Ｃ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９の影響。図５７Ｄ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の影響。図５７Ｅ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図５７Ｆ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＡＭＧ３３０の影響。

【図57B】Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷対ＩＦＮγの放出。Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷を黒い四角／曲線で示し、ＩＦＮγの濃度を黒い丸／曲線で示す。図５７Ａ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５７Ｂ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５７Ｃ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９の影響。図５７Ｄ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の影響。図５７Ｅ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図５７Ｆ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＡＭＧ３３０の影響。

【図57C】Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷対ＩＦＮγの放出。Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷を黒い四角／曲線で示し、ＩＦＮγの濃度を黒い丸／曲線で示す。図５７Ａ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５７Ｂ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５７Ｃ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９の影響。図５７Ｄ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の影響。図５７Ｅ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図５７Ｆ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＡＭＧ３３０の影響。

【図57D】Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷対ＩＦＮγの放出。Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷を黒い四角／曲線で示し、ＩＦＮγの濃度を黒い丸／曲線で示す。図５７Ａ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５７Ｂ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５７Ｃ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９の影響。図５７Ｄ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の影響。図５７Ｅ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図５７Ｆ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＡＭＧ３３０の影響。

【図57E】Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷対ＩＦＮγの放出。Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷を黒い四角／曲線で示し、ＩＦＮγの濃度を黒い丸／曲線で示す。図５７Ａ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５７Ｂ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５７Ｃ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９の影響。図５７Ｄ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の影響。図５７Ｅ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図５７Ｆ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＡＭＧ３３０の影響。

【図57F】Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷対ＩＦＮγの放出。Ｍｏｌｍ－１３細胞殺傷を黒い四角／曲線で示し、ＩＦＮγの濃度を黒い丸／曲線で示す。図５７Ａ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５７Ｂ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５７Ｃ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９の影響。図５７Ｄ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の影響。図５７Ｅ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するフロテツズマブの影響。図５７Ｆ．細胞殺傷及びサイトカイン放出に対するＡＭＧ３３０の影響。

【図58A】図５８Ａ．ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ｈＰＢＭＣ注射の２日後、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を皮下異種移植し、ＰＢＳ １×（黒丸）、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（黒四角）、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ３３０（黒三角）で処置したマウス（ドナー当たりｎ＝５マウス／使用した２匹のｈＰＢＭＣドナー）における経時的な腫瘍成長。腫瘍細胞異種移植の４日後に処置を開始した。データを平均＋ＳＥＭで表示する。図５８Ｂ．図５８Ａに記載されるマウスにおける腫瘍細胞異種移植の１７日後の腫瘍体積の評価。

【図58B】図５８Ａ．ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ｈＰＢＭＣ注射の２日後、ＭＯＬＭ－１３腫瘍細胞を皮下異種移植し、ＰＢＳ １×（黒丸）、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（黒四角）、又は０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ３３０（黒三角）で処置したマウス（ドナー当たりｎ＝５マウス／使用した２匹のｈＰＢＭＣドナー）における経時的な腫瘍成長。腫瘍細胞異種移植の４日後に処置を開始した。データを平均＋ＳＥＭで表示する。図５８Ｂ．図５８Ａに記載されるマウスにおける腫瘍細胞異種移植の１７日後の腫瘍体積の評価。

【図59A】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59B】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59C】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59D】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59E】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59F】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59G】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59H】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59I】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59J】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59K】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図59L】２日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図５９Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図５９Ｃ．細胞死及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。ＦＩＧ．５９Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図５９Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図５９Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｋ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図５９Ｌ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60A】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60B】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60C】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60D】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60E】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60F】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60G】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60H】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60I】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60J】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60K】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図60L)】５日間のインキュベーション後の、患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞死滅は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６０Ａ細胞死及びＩＦＮγ放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｂ．細胞死及びＴＮＦα放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの影響は同様である。図６０Ｃ殺細胞及びＩＬ－２放出に対するｆｌｏｔｅｔｕｚｕｍａｂの同様の影響。ＦＩＧ．６０Ｄ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｅ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｆ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０の影響は同様である。図６０Ｇ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｈ．細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｉ．細胞死滅及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６０Ｊ．細胞死滅及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｋ。細胞死滅及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６０Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61A】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61B】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61C】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61D】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61E】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61F】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61G】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61H】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61I】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61J】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61K】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図61L】２日間のインキュベーション後の、ヒト汎Ｔ細胞の存在下での患者由来ＡＭＬ細胞の自己殺傷（Ｅ：Ｔ比４：１）対サイトカイン（ＩＦＮ－ｇ、ＴＮＦα、ＩＬ－２）の放出。細胞殺傷は、黒四角／曲線によって生存細胞％として示され、黒丸／曲線によってサイトカインの濃度として示される。図６１Ａ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｂ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｃ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するフロテツズマブ類似物の影響。図６１Ｄ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｅ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｆ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＡＭＧ３３０類似物の影響。図６１Ｇ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｈ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｉ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の影響。図６１Ｊ．細胞殺傷及びＩＦＮγ放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｋ．細胞殺傷及びＴＮＦα放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。図６１Ｌ．細胞殺傷及びＩＬ－２放出に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の影響。

【図62A】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62B】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62C】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62D】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62E】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62F】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62G】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図62H】Ｍｏｌｍ１３細胞を添加した２人の健常ドナーからの全血におけるサイトカイン放出。図６２Ａ．ドナー１の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｂ．ドナー２の血液におけるＩＦＮ放出；図６２Ｃ．ドナー１の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｄ．ドナー２の血液におけるＩＬ－２放出；図６２Ｅ．ドナー１の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｆ．ドナー２の血液におけるＩＬ－６放出；図６２Ｇ．ドナー１の血液におけるＴＮＦα放出；図６２Ｈ．ドナー２の血液におけるＴＮＦα放出。

【図63】血清アルブミン、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、及びＣＤ３へのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の同時結合のＳＰＲトレース。（ａ）固定化ＨＳＡへのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の結合。（ｂ）ｈＣＤ７０の、ＨＳＡ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６複合体（＊／●）への会合、又はＰＢＳＴ注射。（ｃ）ＨＳＡ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６／ｈＣＤ７０複合体（＊）若しくはＨＳＡ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６複合体（■）へのｈＣＤ１２３の結合、又はＰＢＳＴ注射。（ｄ）ＨＳＡ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６／ｈＣＤ７０／ｈＣＤ１２３複合体（＊）若しくはＨＳＡ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６複合体（▼）へのｈＣＤ３３の結合、又はＰＢＳＴ注射。（ｅ）ＨＡＳ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６／ｈＣＤ７０／ｈＣＤ１２３／ｈＣＤ３３複合体（＊）若しくはＨＳＡ／ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６複合体（▲）へのｓｃＣＤ３の結合、又はＰＢＳＴ注射とそれに続く１８０秒の解離相。注射スキームを表１１に記載する。

【図64】全ての標的に対してＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の「測定」対「計算」同時結合のＳＰＲトレースの比較。図６３（＊）から得られた「測定」結合トレース。「計算」トレースは、それぞれ血清アルブミン、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３、又はＣＤ３に結合するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の個々の単一対照注射ＳＰＲトレースを組み合わせることによって生成された。

【図65】ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、ＭＯＬＭ－１３細胞を皮下に異種移植し、腫瘍細胞注射後８日目に、ＰＢＳ １Ｘ（ビヒクル）、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、０．５ｍｇ／ｋｇのＡＭＧ３３０類似物、及び０．５ｍｇ／ｋｇのフロテツズマブ類似物で処置した、マウス（ｎ＝ドナーあたり５匹のマウス／処置に応じて使用したｈＰＢＭＣドナー２～６匹）における経時的な腫瘍成長。

【図66】ｈＰＢＭＣを腹腔内注射し（ドナー当たりｎ＝５匹のマウス／処置に応じて使用した２～６人のｈＰＢＭＣドナー）、ＭＯＬＭ－１３細胞を皮下に異種移植し、ＰＢＳ １Ｘ（ビヒクル）で処置したマウスにおける経時的な腫瘍成長。腫瘍細胞注射の８日後に、２ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、０．５ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、０．２ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、及び０．０２ｍｇ／ｋｇのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６。

【図67A】処置後の解離したＭＯＬＭ－１３腫瘍における（Ｔ細胞活性化マーカＣＤ２５及びＣＤ６９によって測定される）ＣＤ４５を発現するヒト免疫細胞（すなわち、ＣＤ４５＋）（図６７Ａ）、及び活性化されたヒトＴ細胞（ＣＤ４発現、図６７Ｂ）、又はＣＤ８発現、図６７Ｃ）の頻度。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞（図６７Ｂ）、及び生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞（図６７Ｃ）としてゲーティングした。

【図67B】処置後の解離したＭＯＬＭ－１３腫瘍における（Ｔ細胞活性化マーカＣＤ２５及びＣＤ６９によって測定される）ＣＤ４５を発現するヒト免疫細胞（すなわち、ＣＤ４５＋）（図６７Ａ）、及び活性化されたヒトＴ細胞（ＣＤ４発現、図６７Ｂ）、又はＣＤ８発現、図６７Ｃ）の頻度。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞（図６７Ｂ）、及び生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞（図６７Ｃ）としてゲーティングした。

【図67C】処置後の解離したＭＯＬＭ－１３腫瘍における（Ｔ細胞活性化マーカＣＤ２５及びＣＤ６９によって測定される）ＣＤ４５を発現するヒト免疫細胞（すなわち、ＣＤ４５＋）（図６７Ａ）、及び活性化されたヒトＴ細胞（ＣＤ４発現、図６７Ｂ）、又はＣＤ８発現、図６７Ｃ）の頻度。活性化したＴ細胞を、生存ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞（図６７Ｂ）、及び生存ＣＤ８＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞（図６７Ｃ）としてゲーティングした。

【図68A】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図６８Ａ．ＩＦＮγのレベル、図６８Ｂ．ＩＬ－６のレベル、図６８Ｃ．ＩＬ－２のレベル、及び図６８Ｄ．ＴＮＦαのレベル。

【図68B】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図６８Ａ．ＩＦＮγのレベル、図６８Ｂ．ＩＬ－６のレベル、図６８Ｃ．ＩＬ－２のレベル、及び図６８Ｄ．ＴＮＦαのレベル。

【図68C】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図６８Ａ．ＩＦＮγのレベル、図６８Ｂ．ＩＬ－６のレベル、図６８Ｃ．ＩＬ－２のレベル、及び図６８Ｄ．ＴＮＦαのレベル。

【図68D】処置後のマウス血清中のサイトカイン及びケモカイン放出。図６８Ａ．ＩＦＮγのレベル、図６８Ｂ．ＩＬ－６のレベル、図６８Ｃ．ＩＬ－２のレベル、及び図６８Ｄ．ＴＮＦαのレベル。

【図69A】処置後のマウス腫瘍環境におけるサイトカイン及びケモカイン放出。図６９Ａ．ＩＦＮγのレベル；図６９Ｂ．ＩＬ－６のレベル。

【図69B】処置後のマウス腫瘍環境におけるサイトカイン及びケモカイン放出。図６９Ａ．ＩＦＮγのレベル；図６９Ｂ．ＩＬ－６のレベル。

【発明を実施するための形態】

【0057】

本明細書に開示されるのは、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤と、腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも２つの結合剤とを含む組換えタンパク質であり、当該２つの結合剤は、異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する。

【0058】

より詳細には、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０などの異なる標的に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質が本明細書に開示される。結合タンパク質をコードする核酸、結合タンパク質又は核酸を含む医薬組成物、及び結合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を使用する方法も開示される。設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー（国際公開第２００２／０２０５６５号、Ｂｉｎｚら、「Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、」第２２巻第５７５～５８２頁、２００４年；Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ」、第１３巻、第６９５～７０１頁（２００８年））は、高い親和性でそれらの標的に結合する標的特異性設計アンキリン反復ドメインの選択に使用することができる。次に、そのような標的特異的設計アンキリン反復ドメインを、疾患を治療するための組換え結合タンパク質の価値ある成分として使用することができる。設計アンキリン反復タンパク質は、モノクローナル抗体の限界を克服する可能性を有する結合分子のクラスであり、したがって新規な治療的アプローチを可能にする。そのようなアンキリン反復タンパク質は、単一の設計アンキリン反復ドメインを含んでもよく、又は同じ若しくは異なる標的特異性を有する２つ以上の設計アンキリン反復ドメインの組合せを含んでもよい（Ｓｔｕｍｐｐら、「Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ」、第１３巻、６９５～７０１、２００８年；米国特許第９，４５８，２１１号）。単一の設計アンキリン反復ドメインのみを含むアンキリン反復タンパク質は、高い親和性及び特異性で所与の標的タンパク質に結合するように選択され得る小タンパク質（１４ｋＤａ）である。これらの特徴、及び１つのタンパク質中の２つ以上の設計アンキリン反復ドメインを組み合わせる可能性は、設計アンキリン反復タンパク質を、理想的なアゴニスト、拮抗薬及び／又は阻害薬候補にする。更に、そのようなアンキリン反復タンパク質は、様々なエフェクタ機能、例えば、細胞障害性剤又は半減期延長剤を担持し、完全に新しい薬物フォーマットを可能にするように操作することができる。まとめると、設計アンキリン反復タンパク質は、既存の抗体薬物を超える可能性を有するタンパク質治療薬の次世代の例である。

【0059】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄによって所有される商標である。

【0060】

腫瘍細胞の表面上で発現される分子、例えば、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０などは、特に、それらが腫瘍細胞上で発現されるが、健常細胞上では発現されないか、又ははるかに少ない場合、抗癌療法の潜在的な標的である。一例として、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０は、ＡＭＬ芽球及び白血病幹細胞の表面上で発現されるが、造血幹細胞を含む健常細胞の表面上では同時に発現されないか、又はほとんど発現されない。

【0061】

一態様では、本発明は、（１）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、及び（２）腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも２つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該２つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する組換えタンパク質を提供する。

【0062】

一態様では、本発明は、（１）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、及び（２）腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも２つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該２つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合し、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質及び当該２つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、組換えタンパク質を提供する。

【0063】

一態様では、本発明は、（１）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、及び（２）腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも３つの結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該３つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0064】

一態様では、本発明は、（１）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤と、（２）腫瘍関連抗原に特異的に結合する少なくとも３つの結合剤とを含む組換えタンパク質であって、当該３つの結合剤が異なる腫瘍関連抗原に特異的に結合し、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質及び当該３つの異なる腫瘍関連抗原に同時に結合することができる、組換えタンパク質を提供する。

【0065】

一態様では、当該腫瘍関連抗原は、腫瘍細胞において共発現される。一態様では、当該腫瘍細胞は、液性腫瘍由来の腫瘍細胞である。別の態様では、当該腫瘍細胞は、白血病由来の液性腫瘍細胞である。一態様では、当該白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

【0066】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤のうちの１つのみを含む組換えタンパク質と比較した場合、当該腫瘍関連抗原を提示する表面に、より低い解離定数（Ｋ_D）で結合することができる。

【0067】

一態様では、本発明は、当該腫瘍関連抗原を提示する当該表面が、当該腫瘍細胞の表面である組換えタンパク質を提供する。

【0068】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、ここで、当該より低い解離定数（Ｋ_D）は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤のうちの１つのみを含む当該組換えタンパク質の対応する解離定数の少なくとも約２分の１、少なくとも約４分の１、少なくとも約１０分の１、少なくとも約２０分の１、少なくとも約４０分の１、又は少なくとも約１００分の１である。

【0069】

一態様では、本発明は、当該免疫細胞がＴ細胞である、組換えタンパク質を提供する。

【0070】

一態様では、本発明は、当該Ｔ細胞がＣＤ８＋細胞障害性Ｔ細胞である、組換えタンパク質を提供する。

【0071】

一態様では、本発明は、当該免疫細胞の表面上に発現するタンパク質が、当該Ｔ細胞受容体複合体の一部であるタンパク質である、組換えタンパク質を提供する。

【0072】

一態様では、本発明は、Ｔ細胞受容体複合体の一部である当該タンパク質がＣＤ３である、組換えタンパク質を提供する。

【0073】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0074】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0075】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0076】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２又は３のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0077】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５、好ましくは配列番号２又は３のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮは、任意選択的にＡによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0078】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0079】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号２のアミノ酸配列を含み、配列番号２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0080】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0081】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含み、配列番号３の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号３の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0082】

一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤が、（ｉ）第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤、（ｉｉ）第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤、及び（ｉｉｉ）第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤からなる群から選択される、組換えタンパク質を提供する。

【0083】

一態様では、本発明は、腫瘍関連抗原に特異的に結合する当該結合剤が、（ｉ）第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤、（ｉｉ）第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤、及び（ｉｉｉ）第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤からなる群から選択され、当該選択された結合剤がそれぞれの腫瘍関連抗原標的に同時に結合することができる、組換えタンパク質を提供する。

【0084】

一態様では、本発明は、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、当該第２の結合剤が、当該ＴＡＡ１に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0085】

一態様では、本発明は、当該ＴＡＡ１がＣＤ３３である、組換えタンパク質を提供する。

【0086】

一態様では、本発明は、当該第２の結合剤が、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0087】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0088】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0089】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0090】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、配列番号１５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0091】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み。配列番号６７の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６７の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0092】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、配列番号６７の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６７の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0093】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６８の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６８の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0094】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、配列番号６８の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６８の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0095】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６９の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６９の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0096】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、配列番号６９の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号７０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0097】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号７０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号７０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0098】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、配列番号７０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号７０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0099】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１１１の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１１１の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0100】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１１のアミノ酸配列を含み、配列番号１１１の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１１１の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0101】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0102】

一態様では、本発明は、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、配列番号１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0103】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0104】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0105】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0106】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0107】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0108】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0109】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれかと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0110】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0111】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0112】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0113】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0114】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0115】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0116】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0117】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0118】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0119】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0120】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列を含み、配列番号６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0121】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0122】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６５のアミノ酸配列を含み、配列番号６５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0123】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号６６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0124】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６６のアミノ酸配列を含み、配列番号６６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0125】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１０２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0126】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０２のアミノ酸配列を含み、配列番号１０２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0127】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１０３の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０３の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0128】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０３のアミノ酸配列を含み、配列番号１０３の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０３の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0129】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１０４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0130】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０４のアミノ酸配列を含み、配列番号１０４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0131】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１０５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0132】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０５のアミノ酸配列を含み、配列番号１０５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0133】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0134】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０６のアミノ酸配列を含み、配列番号１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0135】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が。抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0136】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0137】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0138】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0139】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0140】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0141】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0142】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0143】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0144】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0145】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0146】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６７のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0147】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0148】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６８のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0149】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0150】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６９のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0151】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0152】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号７０のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0153】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１１のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0154】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１１のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0155】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0156】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１２のアミノ酸配列を含み、当該第３の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0157】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第３の結合剤が、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0158】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0159】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0160】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対する結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0161】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0162】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0163】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６５のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0164】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0165】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0166】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０２のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0167】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０２のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0168】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０３のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0169】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０３のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0170】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0171】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０４のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0172】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０５のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0173】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0174】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０６のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0175】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0176】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第４の結合剤がＣＤ７０に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである、組換えタンパク質を提供する。

【0177】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0178】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質であって、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含む。

【0179】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0180】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号６４のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0181】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０７のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0182】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号１０７のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0183】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０８のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0184】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号１０８のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0185】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１０９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0186】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号１０９のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0187】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１１０のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0188】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、当該第２の結合剤が抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが配列番号１１０のアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0189】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質であって、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0190】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0191】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0192】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0193】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0194】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0195】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0196】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0197】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含む。

【0198】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0199】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0200】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0201】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0202】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0203】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0204】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0205】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0206】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0207】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、１１１～１１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0208】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0209】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該ＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0210】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列を含み、配列番号６４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0211】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１０８のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0212】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、抗体、抗体模倣物、足場タンパク質、反復タンパク質、又は設計反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0213】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0214】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0215】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0216】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む、組換えタンパク質を提供する。

【0217】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0218】

一態様では、本発明は、当該第１の結合剤が、ＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0219】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後目の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0220】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、当該ＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインは、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含み、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のいずれか１つを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0221】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されており、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のアミノ酸配列のいずれか１つを含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のアミノ酸配列のいずれかを含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、ＣＤ７０に対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインが、配列番号６４及び１０７～１１０のアミノ酸配列のうちのいずれか１つを含み、配列番号６４及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0222】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、及び第３の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、及び第３の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。

【0223】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、及び第３の結合剤を含み、当該第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第３の結合剤）－（第２の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0224】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第２の結合剤）－（第３の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0225】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第２の結合剤）－（第３の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0226】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び第３の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第３の結合剤）－（第２の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0227】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、及び第４の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、及び第４の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。

【0228】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、及び第４の結合剤を含み、当該第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第４の結合剤）－（第２の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0229】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第２の結合剤）－（第４の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0230】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第２の結合剤）－（第４の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0231】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第４の結合剤）－（第２の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0232】

一態様では、本発明は組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第３、及び第４の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第１、第３、及び第４の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。

【0233】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第３、及び第４の結合剤を含み、当該第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第４の結合剤）－（第３の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0234】

一態様では、本発明は、当該第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第３の結合剤）－（第４の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0235】

一態様では、本発明は、当該第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第３の結合剤）－（第４の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0236】

一態様では、本発明は、当該第１、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１の結合剤）－（第４の結合剤）－（第３の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0237】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、第３、及び第４の結合剤を含み、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、第３、及び第４の結合剤のそれぞれの標的に同時に結合することができる。

【0238】

一態様では、本発明は、組換えタンパク質を提供し、当該組換えタンパク質は、当該第１、第２、第３、及び第４の結合剤を含み、当該第１、第２、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第４の結合剤）－（第３の結合剤）－（第２の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0239】

一態様では、本発明は、当該組換えタンパク質が、当該第１、第２、第３、及び第４の結合剤を含み、当該第１、第２、第３、及び第４の結合剤が、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第２の結合剤）－（第３の結合剤）－（第４の結合剤）－（第１の結合剤）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0240】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、第３及び／又は第４の結合剤がペプチドリンカーと共有結合している組換えタンパク質を提供する。

【0241】

一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを含む組換えタンパク質であって、当該ペプチドリンカーがプロリン－トレオニンに富むペプチドリンカーである、組換えタンパク質を提供する。

【0242】

一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを含む組換えタンパク質であって、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が１～５０アミノ酸の長さを有する組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、ペプチドリンカーを含む組換えタンパク質であって、当該ペプチドリンカーのアミノ酸配列が１～３０アミノ酸の長さを有する、組換えタンパク質を提供する。

【0243】

一態様では、本発明は、配列番号１、２、３、４、６、１５、６４～７０、及び１０２～１１２のいずれか１つの最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１、２、３、４、６、１５、６４～７０、及び１０２～１１２のいずれか１つの最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0244】

一態様では、本発明は、当該第１、第２、又は第３のアンキリン反復ドメインのいずれかが、Ｎ末端にＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む組換えタンパク質を提供する。

【0245】

一態様では、本発明は、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号７～１０及び５８～６２のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0246】

一態様では、本発明は、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、配列番号７～１０及び５８～６２のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。

【0247】

一態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質は、配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0248】

一態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0249】

一態様では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0250】

一態様では、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0251】

一態様では、本発明は、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号５８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0252】

一態様では、本発明は、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号５９のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0253】

一態様では、本発明は、配列番号６０のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号６０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0254】

一態様では、本発明は、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号６１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0255】

一態様では、本発明は、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号６２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0256】

一態様では、本発明は、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0257】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、第１の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第２の結合剤、及び第２の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該第１の結合タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する、組換えタンパク質を提供する。したがって、一態様では、当該結合タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。別の態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。

【0258】

一態様では、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤を含み、当該結合剤が約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。別の態様では、当該組換え結合タンパク質が、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。したがって、一態様では、当該タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、当該タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤を含み、当該結合剤が約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つのアミノ酸配列の配列番号を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。

【0259】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、第１の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第２の結合剤、第２の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第３の結合剤、及び第３の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第４の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該結合タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。したがって、一態様では、当該結合タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。別の態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合する。

【0260】

一態様では、当該組換え結合タンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤を含み、当該結合剤は、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。別の態様では、当該組換え結合タンパク質が、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質は、約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該結合タンパク質は、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。したがって、一態様では、当該タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、当該タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一態様では、当該結合タンパク質が、約５×１０^-7Ｍ未満の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つのアミノ酸配列を有する。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質が、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤を含み、当該結合剤が約５×１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが配列番号１～５のいずれか１つの配列番号のアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。１つの態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約１０^-7Ｍ以下、又は約１０^-8Ｍ以下、又は約１０×１０^-9Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合する組換えタンパク質を提供する。

【0261】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0262】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0263】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-8Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0264】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0265】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-10Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0266】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約１０^-7Ｍ以下、又は約１０^-8Ｍ以下、又は約１０^-9Ｍ以下、又は約１０^-10Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0267】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤が、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0268】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤が、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0269】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-8Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤が、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0270】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤が、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0271】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-10Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤が、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0272】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約１０^-7Ｍ以下、又は約１０^-8Ｍ以下、又は約１０^-9Ｍ以下、又は約１０^-10Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0273】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤が、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0274】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該タンパク質が、約１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤が、配列番号６４、及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４、及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0275】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-8Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤が、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0276】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該タンパク質が、約１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤が、配列番号６４、及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0277】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質を提供し、当該タンパク質が、約１０^-10Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号６４、及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４、及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0278】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約１０^-7Ｍ以下、又は約１０^-8Ｍ以下、又は約１０×１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0279】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤が、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１６、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0280】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤は、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0281】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-8Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤は、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0282】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０×１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤は、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されているに従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。

【0283】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０×１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に結合し、当該第２の結合剤は、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１５、６７～７０、及び１１１～１１２の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0284】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約１０^-7Ｍ以下、又は約１０^-8Ｍ以下、又は約１０×１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0285】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤は、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0286】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤は、配列番号６、６５～６６及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0287】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-8Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤は、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0288】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０×１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に結合し、当該第３の結合剤は、配列番号６、６５～６６及び１０２～１０６のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６、６５～６６、及び１０２～１０６の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0289】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-6Ｍ以下、又は約１０^-7Ｍ以下、又は約１０^-8Ｍ以下、又は約１０^-9Ｍ以下、又は約１０^-10Ｍの解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0290】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤が、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0291】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤は、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0292】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約１０^-8Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤は、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４、及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0293】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質は、約１０^-9Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤は、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４、及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４、及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0294】

一態様では、本発明は、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１の結合剤、ＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２の結合剤、ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３の結合剤、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が、約１０^-10Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に結合し、当該第４の結合剤は、配列番号６４及び１０７～１１０のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号６４及び１０７～１１０の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号６４及び１０７～１１０の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0295】

本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例４に説明されている。したがって、一態様では、本発明の組換え結合タンパク質のＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、又はＣＤ７０に対する当該結合特異性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。一態様では、本発明の組換え結合タンパク質の当該結合特異性は、実施例３に記載のように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＰＢＳ中で決定される。

【0296】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、第１の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第２の結合剤、第２の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第３の結合剤、及び／又は第３の腫瘍関連抗原に特異的に結合する第４の結合抗原を含み、１０ｎＭ未満のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３に結合する組換えタンパク質を提供する。

【0297】

一態様では、本発明は、免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤、第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤、並びに第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤及び／又は第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤を含む組換えタンパク質であって、当該タンパク質が約１～約４００ｎＭの範囲のＥＣ５０でヒトＣＤ３に結合し、好ましくは当該タンパク質が約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ５０でヒトＣＤ３に結合する、組換えタンパク質を提供する。

【0298】

Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査イメージングサイトメトリーを使用することによる、ＣＤ３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質のＴ細胞上でのＣＤ３結合（ＥＣ５０）の典型的かつ好ましい決定は、（初代ヒトＴ細胞を用いて）実施例４に記載されている。したがって、一態様では、本発明の組換え結合タンパク質の当該ＣＤ３結合（ＥＣ５０）は、実施例４に記載されるように、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査イメージングサイトメトリーによって初代ヒトＴ細胞上で決定される。

【0299】

一態様では、当該組換えタンパク質が、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該結合タンパク質が、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該結合タンパク質が、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号１～４の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～４の最後の位置のＡは、任意選択的にＮによって置換されており、又は配列番号５の最後から２番目の位置のＬが、任意選択的にＡによって置換されており、及び／又は配列番号５の最後の位置のＮが、任意選択的にＡによって置換されている。したがって、一態様では、当該タンパク質が、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５と少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質は、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ５０でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。別の態様では、当該タンパク質は、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ５０でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９３％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、更なる態様では、当該タンパク質は、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一態様では、当該タンパク質は、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれか１つと少なくとも９８％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、一態様では、当該タンパク質は、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインは、配列番号１～５のいずれかのアミノ酸配列を含む。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含み、当該タンパク質が、約１～約１０ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でＴ細胞上のヒトＣＤ３に結合し、当該アンキリン反復ドメインが、配列番号１～５のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１～５の最後から２番目の位置のＡが、任意選択的にＬによって置換されており、及び／又は配列番号１～５の最後の位置のＡが、任意選択的にＮによって置換されている、組換えタンパク質を提供する。

【0300】

一態様では、本発明は、（ｉ）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤と、（ｉｉ）第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤、第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤、及び／又は第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤とを含み、半減期延長部分を更に含む組換えタンパク質を提供する。したがって、一態様では、当該タンパク質は、半減期延長部分を更に含み、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する結合剤である。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する当該結合剤が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0301】

一態様では、本発明は、（ｉ）免疫細胞の表面上に発現されるタンパク質に特異的に結合する第１の結合剤であって、免疫細胞の表面上に発現される当該タンパク質に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメイン、好ましくはＣＤ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである第１の結合剤、（ｉｉ）第１の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ１）に特異的に結合する第２の結合剤であって、当該ＴＡＡ１に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはＴＡＡ１がＣＤ３３である第２の結合剤、第２の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ２）に特異的に結合する第３の結合剤であって、当該ＴＡＡ２に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはＴＡＡ２がＣＤ１２３である第３の結合剤、及び／又は第３の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ３）に特異的に結合する第４の結合剤であって、当該ＴＡＡ３に対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインであり、好ましくはＴＡＡ３がＣＤ７０である第４の結合剤、を含む組換えタンパク質であって、当該組換えタンパク質が、半減期延長部分を更に含む、組換えタンパク質を提供する。したがって、一態様では、当該組換えタンパク質が、半減期延長部分を更に含み、当該半減期延長部分は、ヒト血清アルブミンに特異的に結合する結合剤である。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して特異的に結合する当該結合剤が、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインである。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも８５％同一、例えば、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を含む。一態様では、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該設計アンキリン反復ドメインが、配列番号３４～３６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0302】

一態様では、本発明は、配列番号１１～１４、７８～８６及び９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１１～１４、７８～８６及び９５～１０１のいずれか１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0303】

一態様では、本発明は、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つと少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。一態様では、本発明は、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１のいずれか１つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。

【0304】

一態様では、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0305】

一態様では、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0306】

一態様では、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0307】

一態様では、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0308】

一態様では、本発明は、配列番号７８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号７８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0309】

一態様では、本発明は、配列番号７９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。好ましくは、当該タンパク質が、配列番号７９のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0310】

一態様では、本発明は、配列番号８０のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８０のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0311】

一態様では、本発明は、配列番号８１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0312】

一態様では、本発明は、配列番号８２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８２のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0313】

一態様では、本発明は、配列番号８３のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８３のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0314】

一態様では、本発明は、配列番号８４のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８４のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0315】

一態様では、本発明は、配列番号８５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0316】

一態様では、本発明は、配列番号８６のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号８６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0317】

一態様では、本発明は、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号９５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0318】

一態様では、本発明は、第１のアンキリン反復ドメイン、第２のアンキリン反復ドメイン、第３のアンキリン反復ドメイン、第４のアンキリン反復ドメイン、第５のアンキリン反復ドメイン、及び第６のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第３のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に特異的に結合し、当該第４のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、当該第５のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に特異的に結合し、当該第６のアンキリン反復ドメインが、１０^-6Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に特異的に結合し、当該第１、第２、第３、第４、第５及び第６のアンキリン反復ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１のアンキリン反復ドメイン）－（第２のアンキリン反復ドメイン）－（第３のアンキリン反復ドメイン）－（第４のアンキリン反復ドメイン）－（第５のアンキリン反復ドメイン）－（第６のアンキリン反復ドメイン）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。一態様では、当該第１、第２、第３、第４、第５及び第６のアンキリン反復ドメインのそれぞれは、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）で、ＰＢＳ中の標的（上記で列挙した通り）に特異的に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、１～４００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、１ｎＭ以下のＥＣ₅₀でＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に同時に結合することができる。一実施形態では、本発明の組換えタンパク質が、配列番号９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、そのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳ、好ましくはＧＳを更に含む。

【0319】

一態様では、本発明は、配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号９６のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0320】

一態様では、本発明は、配列番号９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質を提供する。好ましくは、当該タンパク質が、配列番号９７のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0321】

一態様では、本発明は、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号９８のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0322】

一態様では、本発明は、配列番号９９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号９９のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0323】

一態様では、本発明は、配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１００のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0324】

一態様では、本発明は、第１のアンキリン反復ドメイン、第２のアンキリン反復ドメイン、第３のアンキリン反復ドメイン、第４のアンキリン反復ドメイン、第５のアンキリン反復ドメイン、及び第６のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第３のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に特異的に結合し、当該第４のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、当該第５のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に特異的に結合し、当該第６のアンキリン反復ドメインが、１０^-6Ｍ，以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に特異的に結合し、当該第１、第２、第３、第４、第５及び第６のアンキリン反復ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１のアンキリン反復ドメイン）－（第２のアンキリン反復ドメイン）－（第５のアンキリン反復ドメイン）－（第４のアンキリン反復ドメイン）－（第３のアンキリン反復ドメイン）－（第６のアンキリン反復ドメイン）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。一実施形態では、当該第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のアンキリン反復ドメインの各々は、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）で、ＰＢＳ中の標的（上記で列挙した通り）に特異的に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、１～４００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、１ｎＭ以下のＥＣ₅₀でＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３及びＣＤ７０に同時に結合することができる。一実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号９６のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号９７のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号９８のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質が、配列番号９９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。別の実施形態では、本発明の組換えタンパク質が、配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号９６のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号９８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号９９のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質が、そのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳ、好ましくはＧＳを更に含む。

【0325】

一態様では、本発明は、配列番号１０１のアミノ酸配列のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む組換えタンパク質であって、好ましくは、当該タンパク質が、配列番号１０１のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、組換えタンパク質を提供する。

【0326】

一態様では、本発明は、第１のアンキリン反復ドメイン、第２のアンキリン反復ドメイン、第３のアンキリン反復ドメイン、第４のアンキリン反復ドメイン、第５のアンキリン反復ドメイン、及び第６のアンキリン反復ドメインを含む組換えタンパク質であって、当該第１のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第２のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒト血清アルブミンに特異的に結合し、当該第３のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３３に特異的に結合し、当該第４のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ１２３に特異的に結合し、当該第５のアンキリン反復ドメインが、１０^-7Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ７０に特異的に結合し、当該第６のアンキリン反復ドメインが、１０^-6Ｍ以下の解離定数（Ｋ_D）でＰＢＳ中のヒトＣＤ３に特異的に結合し、当該第１、第２、第３、第４、第５及び第６のアンキリン反復ドメインが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：（第１のアンキリン反復ドメイン）－（第２のアンキリン反復ドメイン）－（第５のアンキリン反復ドメイン）－（第３のアンキリン反復ドメイン）－（第４のアンキリン反復ドメイン）－（第６のアンキリン反復ドメイン）に従って配置されている、組換えタンパク質を提供する。一態様では、当該第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のアンキリン反復ドメインの各々は、１０^-6Ｍ～１０^-12Ｍの解離定数（Ｋ_D）で、ＰＢＳ中の標的（上記で列挙した通り）に特異的に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、１～４００ｎＭの範囲のＥＣ₅₀でヒトＣＤ３に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、１ｎＭ以下のＥＣ₅₀でＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞に結合する。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に同時に結合することができる。特定の実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、配列番号１０１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一、例えば、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約も９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、配列番号１０１のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、当該組換えタンパク質は、そのＮ末端に、Ｇ、Ｓ、又はＧＳ、好ましくはＧＳを更に含む。

【0327】

本明細書中に開示される組換え結合タンパク質の反復ドメイン、好ましくはアンキリン反復ドメインは、好ましくは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュール（以降、キャッピング反復又はキャッピング単位とも称される）を含む。キャッピングモジュールはアンキリン反復ドメインのＮ末端及び／又はＣ末端に位置し、典型的には、アンキリン反復モジュールとの間に密な三次相互作用（すなわち、三次構造相互作用）を形成し、それによって、アンキリン反復ドメインの疎水性コアを溶媒への曝露から側方で遮蔽するキャップを提供する。Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールは、キャッピング単位、又は反復単位に隣接する天然に存在する反復タンパク質中に見出される他の構造単位に由来してもよい。キャッピング配列の例は、国際公開第２００２／０２０５６５号及び同第２０１２／０６９６５５号、米国特許出願公開第２０１３／０２９６２２１、並びにＩｎｔｅｒｌａｎｄｉら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００８ Ｊａｎ １８；３７５（３）：８３７－５４に記載されている。Ｎ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｎ末端キャッピング反復）の例は、配列番号１６～２２であり、Ｃ末端キャッピングモジュール（すなわち、Ｃ末端キャッピング反復）の例は、配列番号２３－２３である。

【0328】

例示的な態様では、Ｎ末端キャッピングモジュールは、配列番号１６～２１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号１６～２１のいずれか１つの最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸が、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。

【0329】

例示的な態様では、Ｃ末端キャッピングモジュールは、配列番号２３～３１のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、配列番号２３～３１のいずれか１つの最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個のアミノ酸は、任意選択的に、任意のアミノ酸によって交換される。

【0330】

有利には、いくつかの態様では、本明細書の設計アンキリン反復ドメインのＮ末端キャッピングモジュール及び／又はＣ末端キャッピングモジュール中のある特定のアミノ酸残基を変化させることにより、設計アンキリン反復ドメインの、及び設計アンキリン反復ドメインを含む組換え結合タンパク質の終末相半減期の長期化を含む、薬物動態特性の改善が得られることが発見された。変化したアミノ酸残基は、ほとんど表面に露出した残基である。好ましくは、変更されたアミノ酸残基は、Ｎ末端キャッピングモジュールの８位及び１５位におけるアミノ酸残基であり、８位におけるアミノ酸はＱであり、１５位におけるアミノ酸はＬであり、位置番号は、配列番号１６の位置、並びにＣ末端キャッピングモジュールの１４位及び１８位におけるアミノ酸残基に対応し、１４位のアミノ酸はＲであり、１８位のアミノ酸はＱであり、位置番号は配列番号１６の位置に対応する。

【0331】

例えば、変化されたアミノ酸残基を有するＮ末端キャッピングモジュールは、以下の配列：ＤＬＧｘｘＬＬＱＡＡｘｘＧＱＬＤｘＶＲｘＬｘｘｘＧＡＤＶＮＡ（配列番号２２）を含むことができ、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。

【0332】

例えば、変化されたアミノ酸残基を有するＣ末端キャッピングモジュールは、以下の配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＡＤｘＡＡＲｘＧＨＱｘＩＡｘＶＬＱｘＡＡ（配列番号３２）を含むことができ、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。

【0333】

したがって、一態様では、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号２２のアミノ酸配列を有するＮ末端キャッピングモジュールを含み、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。代替的又は追加的に、本発明のＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインは、配列番号３２のアミノ酸配列を有するＣ末端キャッピングモジュールを含んでもよく、「ｘ」は、任意のアミノ酸を示す。

【0334】

更に、本発明の結合ドメインは、任意選択的に、そのＮ末端に「Ｇ」、「Ｓ」、又は「ＧＳ」配列を更に含んでもよい。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供される結合タンパク質は、（ｉ）配列番号１～６、１５、及び６４～７０のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、（ｉｉ）そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な態様では、結合タンパク質は、配列番号１～６、１５、及び６４～７０のいずれか１つと少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な態様では、当該結合タンパク質は、配列番号１～６、１５、及び６４～７０のいずれか１つと少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。例示的な態様では、当該結合タンパク質は、配列番号１～６、１５、及び６４～７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含み、そのＮ末端でＧ、Ｓ、又はＧＳを更に含む。

【0335】

一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ポリペプチドタグを更に含む。ポリペプチドタグは、ポリペプチド／タンパク質に結合されたアミノ酸配列であり、ここで、当該アミノ酸配列は、当該ポリペプチド／タンパク質の精製、検出、若しくは標的化に有用であり、又は、当該アミノ酸配列は、ポリペプチド／タンパク質の物理化学的挙動を改善し、又は、当該アミノ酸配列はエフェクタ機能を有する。結合タンパク質の個々のポリペプチドタグは、結合タンパク質の他の部位に、直接又はペプチドリンカーを介して接続してもよい。ポリペプチドタグは技術分野で周知であり、当業者には十分に利用可能である。ポリペプチドタグの例は、小ポリペプチド配列、例えば、Ｈｉｓタグ、ＨＡタグ、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧタグ、若しくはＳｔｒｅｐタグ、又は酵素（例えばアルカリホスファターゼ）等のポリペプチドであり、これらにより、当該ポリペプチド／タンパク質、又は標的化に使用できるポリペプチド（免疫グロブリン又はそれらのフラグメント等）及び／若しくはエフェクタ分子として使用できるポリペプチドの検出が可能となる。

【0336】

一態様では、本発明の組換え結合タンパク質は、ペプチドリンカーを更に含む。ペプチドリンカーは、例えば、２つのタンパク質ドメイン、ポリペプチドタグとタンパク質ドメイン、タンパク質ドメインと非タンパク質化合物若しくはポリエチレングリコールなどのポリマー、又はタンパク質ドメインと生物学的活性分子、タンパク質ドメインとローカライザ、又は２つの配列タグを、結合させることができるアミノ酸配列である。ペプチドリンカーは、当業者に既知である。例の一覧は、特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号の明細書に提供されている。一態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、１～５０アミノ酸の長さを有する。別の態様では、本発明において使用するためのペプチドリンカーは、１～３０アミノ酸の長さを有する。ペプチドリンカーの具体例は、グリシン－セリン－リンカー及び可変長のプロリン－トレオニンに富むリンカーである。グリシン－セリン－リンカーの例は、アミノ酸配列ＧＳ及び配列番号６３のアミノ酸配列であり、プロリン－トレオニンに富むリンカーの例は、配列番号３７のアミノ酸配列である。

【0337】

本発明の文脈において、プロリン－トレオニンに富むリンカーは、そのアミノ酸配列中に少なくとも２０％のプロリン残基及び少なくとも２０％のトレオニン残基を含む。

【0338】

別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号７～１０及び５８～６２からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号７のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号９のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号１０のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号５８のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号５９のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号６０のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号６１のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号６２のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で生産するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号５２～５５及び９０～９４によって提供され、これは、それぞれ、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列をコードする。

【0339】

別の態様では、本発明は、本発明のアンキリン反復ドメイン又は組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号１１～１４、７８～８６、及び９５～１０１からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号１１のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号１２のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号１３のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号１４のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号７８のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号７９のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８０のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８１のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８２のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８３のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８４のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８５のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号８６のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一態様では、本発明は、配列番号９５のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号９５のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１１８の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号９６のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号９６のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１１９の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号９７のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号９７のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１２０の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号９８のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号９８のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１２１の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号９９のアミノ酸配列をコードする拡散に関する。一実施形態では、配列番号９９のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１２２の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号１００のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号１００のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１２３の核酸である。一態様では、本発明は、配列番号１０１のアミノ酸配列をコードする核酸に関する。一実施形態では、配列番号１０１のアミノ酸配列をコードする当該核酸は、配列番号１２４の核酸である。更に、本発明は、本発明のいずれかの核酸を含むベクターに関する。核酸は、当業者に周知である。実施例において、核酸は、本発明の設計アンキリン反復ドメイン又は組換え結合タンパク質を、大腸菌で産生するために使用した。本発明の核酸の例は、配列番号１１８～１２４によって提供され、これは、それぞれ、配列番号９５～１０１のアミノ酸配列をコードする。

【0340】

一態様では、本発明は、本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメイン、及び／又は本発明の組換え結合タンパク質及び／若しくは設計アンキリン反復ドメインをコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

【0341】

一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、又は本発明の組換え結合タンパク質をコードする核酸、並びに任意選択的に、薬学的に許容される担体及び／若しくは希釈剤を含む、医薬組成物に関する。

【0342】

薬学的に許容される担体及び／又は希釈剤は当業者に既知であり、下記でより詳細に説明する。

【0343】

医薬組成物は、本明細書に記載のような組換え結合タンパク質、及び／又は設計アンキリン反復ドメイン、及び／又は核酸、好ましくは、組換え結合タンパク質及び／又は核酸、及び例えば「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０年）に記載のような、薬学的に許容される担体、賦形剤若しくは安定剤を含む。

【0344】

当業者に既知の、好適な担体、希釈剤、賦形剤又は安定剤としては、例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液、ハンクス液、固定油、オレイン酸エチル、５％デキストロース生理食塩水、等張性及び化学的安定性を高める物質、緩衝液並びに保存剤が挙げられる。他の好適な担体としては、それ自体が、組成物を投与される個体にとって有害な抗体の産生を誘発しない任意の担体、例えば、タンパク質、ポリサッカライド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸及びアミノ酸コポリマーが挙げられる。医薬組成物はまた、抗癌剤若しくは抗血管新生剤、又は更なる生物活性化合物等の、追加の有効成分を含む、合剤であってもよい。インビボ投与に使用される組成物は、無菌でなくてはならない、又は、滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌濾過膜で濾過することにより、容易に実施される。

【0345】

本発明の一態様は、医薬組成物を製造するための、ＣＤ３に対して結合特異性を有する第１のアンキリン反復ドメイン、ＴＡＡ１、好ましくはＣＤ３３に対して結合特異性を有する第２のアンキリン反復ドメイン、ＴＡＡ２、好ましくはＣＤ１２３に対して結合特異性を有する第３のアンキリン反復ドメイン、及び／又はＴＡＡ３、好ましくはＣＤ７０に対して結合特異性を有する第４の反復ドメインを含み、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを更に含む本発明の組換えタンパク質の使用であって、当該組換えタンパク質が、当該第１、第２、及び第３のアンキリン反復ドメインを含むが、血清アルブミンに対して結合特異性を有する当該アンキリン反復ドメインを含まない対応する組換えタンパク質と比較して、終末相半減期の増加、好ましくは少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約１００％、約１５０％、約２００％又は約２５０％の終末相半減期の増加を示す、使用に関する。

【0346】

一態様では、医薬組成物は、本明細書に記載のような少なくとも１つの組換えタンパク質、並びに非イオン性洗剤などの洗剤、リン酸塩緩衝液などの緩衝液、及びスクロースなどの糖を含む。一態様では、そのような組成物は、上記のような組換え結合タンパク質及びＰＢＳを含む。

【0347】

別の態様では、本発明は、ヒトを含む哺乳動物におけるＴ細胞の腫瘍局所的活性化の方法であって、当該哺乳動物に、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0348】

別の態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0349】

別の態様では、本発明は、医学的状態を治療する方法であって、医学的状態を治療することを必要とする患者に、治療有効量の、疾患関連抗原に対して結合特異性を有する結合剤を更に含む本発明の組換えタンパク質、当該結合タンパク質をコードする核酸、又は当該結合タンパク質を含む医薬組成物を投与する工程を含む、方法を提供する。

【0350】

一態様では、本発明は、疾患の治療において使用するための、本発明による医薬組成物、組換えタンパク質、又は核酸に関する。その目的のため、本発明による医薬組成物、核酸又は組換え結合タンパク質は、これらを必要とする患者に、治療有効量で投与される。投与としては、局所投与、経口投与、及び非経口投与を挙げることができる。典型的な投与経路は非経口投与である。親的（parental）投与において、本発明の医薬組成物は、上で定義したような薬学的に許容される賦形剤と共に、溶液、懸濁液、又はエマルションなどの単位用量の注射可能な形態で処方される。用量及び投与方法は、治療される個体及び特定の疾患によって異なる。

【0351】

更に、上述の医薬組成物、核酸又は組換えタンパク質のいずれかは、障害の治療における使用のためのものとみなされる。

【0352】

一態様では、本明細書に記載の当該組換え結合タンパク質又はそのような他の医薬組成物は、静脈内投与される。非経口用途のため、組換えタンパク質又は当該医薬組成物は、ボーラス注射として又は緩徐な点滴注射により、治療有効量で注射することができる。

【0353】

一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品としての、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、医薬品の製造のための、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品を製造するための、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の、使用に関する。一態様では、本発明は、疾患の治療のための医薬品の製造のためのプロセスであって、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸分子、又は本発明の医薬組成物が、医薬品の有効成分である、プロセスに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物を使用する、疾患の治療方法に関する。

【0354】

一態様では、本発明は更に、それを必要とする対象の医学的状態を治療するためのそのような組換えタンパク質の使用を提供する。

【0355】

本明細書で使用される場合、当該医学的状態又は疾患は、癌、好ましくは液性腫瘍、より好ましくは白血病、更により好ましくは急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。

【0356】

本発明の組換えタンパク質、本発明の核酸、又は本発明の医薬組成物の使用はまた、当技術分野において既知の１つ以上の他の療法との併用とすることができる。用語「～との併用」は、本明細書で使用する場合、所与の投与計画の下で実施される共投与を指すものとする。これには、異なる化合物の同時投与及び異なる化合物の時間を変えた投与が含まれる（例えば、化合物Ａを１回投与し、かつ化合物Ｂをその後に数回投与する、若しくは逆もまた同様、又は、両化合物を同時に投与し、かつ２つのうちの１つを後の段階でまた投与する）。

【0357】

一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を含む、キットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、及び／又は本発明の核酸、及び／又は本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットであって、配列番号７～１０及び５８～６２のいずれか１つを含む組換えタンパク質、及び／又は配列番号５２～５５及び９０～９４のいずれか１つを含む組換えタンパク質をコードする核酸、及び／又は配列番号７～１０及び５８～６２のいずれか１つを含む組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換えタンパク質、及び／又は当該組換えタンパク質をコードする核酸、及び／又は組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。

【0358】

一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質、及び／又は本発明の核酸、及び／又は本発明の医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を含むキットであって、配列番号１１～１４、７８～８２、及び９５～１０１のいずれか１つを含む組換えタンパク質、及び／又は配列番号１１８～１２４のいずれか１つを含む組換えタンパク質をコードする核酸、及び／又は１１～１４、７８～８２、及び９５～１０１のいずれか１つを含む組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。一態様では、本発明は、配列番号１１～１４、７８～８２、及び９５～１０１のアミノ酸配列のいずれか１つを含む組換えタンパク質、及び／又は当該組換えタンパク質をコードする核酸、及び／又は当該組換えタンパク質を含む医薬組成物を備えるキットに関する。

【0359】

一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を産生するための方法に関する。一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号７～１０及び５８～６２のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞（例えば、細菌中）で発現させる工程と、（ｉｉ）当該組換え結合タンパク質を（例えば、クロマトグラフィーを使用して）精製する工程と、を含む、方法に関する。当該方法は追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例１に記載される。

【0360】

一態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質を産生するための方法に関する。一態様では、本発明は、組換え結合タンパク質、例えば、配列番号１１～１４、７８～８２、及び９５～１０１のアミノ酸配列を含む組換えタンパク質を産生するための方法であって、（ｉ）当該組換え結合タンパク質を好適な宿主細胞（例えば、細菌中）で発現させる工程と、（ｉｉ）当該組換え結合タンパク質を精製する（例えば、クロマトグラフィーを使用して）工程と、を含む、方法に関する。当該方法は追加の工程を含んでもよい。本発明の組換え結合タンパク質のこのような産生方法は、実施例１に記載される。

【0361】

本明細書に記載されるアミノ酸配列の全ては、１つ以上のアミノ酸によって置換され得る。いくつかの態様では、最大１５、最大１４、最大１３、最大１２、最大１１、最大１０、最大９、最大８、最大７、最大６、最大５、最大４、最大３、最大２、又は最大１個の置換が、本明細書に記載のアミノ酸配列のいずれかにおいて行われる。

【0362】

いくつかの態様では、アミノ酸置換（複数可）は全て、フレームワーク位置で行われる。いくつかの態様では、アミノ酸置換（複数可）は全て、非無作為化位置で行われる。設計アンキリン反復ドメインにおける無作為化位置の場所は、例えば、Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２２（５）：５７５－５８２（２００４）に開示されている。

【0363】

いくつかの態様では、結合剤に対して行われるアミノ酸置換（複数可）は、非置換結合剤のＫＤ値と比較して、ＫＤ値を約１０００倍超、約１００倍超、又は約１０倍超変化させない。例えば、いくつかの態様では、アミノ酸置換（複数可）は、配列番号７～１０及び５８～６２の配列のいずれかを含む結合剤のＫ_D値と比較して、Ｋ_D値を約１０００倍超、約３００倍超、約１００倍超、約５０倍超、約２５倍超、約１０倍超、又は約５倍超変化させない。

【0364】

特定の態様では、結合部分におけるアミノ酸置換は、以下の表１による保存的置換である。

【0365】

【表1】

【0366】

結合剤が、アンキリン反復ドメインである場合、いくつかの態様では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基の外側、例えば、アルファヘリックスを接続するベータループ内で行われ得る。他の態様では、置換は、アンキリン反復ドメインの構造的コア残基内で行われ得る。例えば、アンキリンドメインは、コンセンサス配列：ｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡｘｘｘＧｘｘｘｌＶｘＶＬＬｘｘＧＡＤＶＮＡ（式中、「ｘ」は任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を示す）；又はｘＤｘｘＧｘＴＰＬＨＬＡＡｘｘＧＨＬＥＩＶＥＶＬＬＫｚＧＡＤＶＮＡ（式中、「ｘ」は任意のアミノ酸（好ましくはシステイン、グリシン、又はプロリンではない）を示し、「ｚ」はアスパラギン、ヒスチジン、又はチロシンからなる群から選択される）を含んでもよい。一態様では、置換は、「ｘ」として指定される残基に対して行われる。別の態様では、置換は、「ｘ」として指定される残基の外側で行われる。

【0367】

本発明は、実施例に記載の特定の態様に制限されない。本明細書は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、添付の配列表に開示されている多くのアミノ酸配列、核酸配列、及び配列番号を参照する。

【0368】

定義
本明細書で別段定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。更に、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。概して、本明細書に記載の細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、及びタンパク質並びに核酸化学の技術に関連して使用される命名法は、当該技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。

【0369】

用語「含む（comprising）」、「有する」、「含む（including）」、及び「含有／収容する（containing）」は、特に明記しない限り、非限定的用語として解釈されるべきである。本発明の態様で、ある特徴について、「～を含む」と説明されている場合、態様では、その特徴について「～からなる」又は「～から本質的になる」も考えられる。本明細書で提供されるありとあらゆる例、又は例示を意味する文言（例えば、「など」）の使用は、単に本開示をよりよく説明することを意図するものであり、別段の請求がない限り、本開示の範囲に制限を課さない。本明細書におけるいかなる文言も、特許請求されていない任意の要素を本開示の実施に不可欠なものとして示すものとして解釈されるべきではない。実施されている例以外、又は別段の指示がない限り、本明細書で使用される成分又は反応条件の量を表す全ての数は、全ての場合において、「約」という用語が当業者によって解釈されるように、その用語によって修飾されると理解されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「約」は、特に明記しない限り、所与の数値の±１０％に相当する。

【0370】

本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において別段の指示がない限り、その範囲内に入る各別個の値及び各エンドポイントを個々に指す簡略法として役立つことを単に意図しており、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書において個々に列挙されているかのように本明細書に組み込まれる。

【0371】

本発明の文脈において、用語「タンパク質」とは、ポリペプチドを含む分子を指し、ポリペプチドの少なくとも一部は、単一のポリペプチド鎖内及び／又は複数のポリペプチド鎖間において二次、三次、又は四次構造を形成することによって、定義された三次元配列を有する、又は獲得することができる。タンパク質が２つ以上のポリペプチド鎖を含む場合、個々のポリペプチド鎖は、非共有結合又は共有結合により、例えば、２つのポリペプチド間のジスルフィド結合により、結合され得る。二次及び／又は三次構造を形成することによって定義された三次元配列を個別に有する、又は獲得することができるタンパク質の一部は、「タンパク質ドメイン」と呼ばれる。そのようなタンパク質ドメインは、当業者に周知である。

【0372】

組換えタンパク質及び組換えポリペプチドなどで使用される用語「組換え」とは、当該タンパク質又はポリペプチドが、当業者に周知の組換えＤＮＡ技術の使用によって産生されることを意味する。例えば、ポリペプチドをコードする組換えＤＮＡ分子（例えば遺伝子合成によって産生される）を細菌発現プラスミド（例えばｐＱＥ３０、ＱＩＡｇｅｎ）、酵母発現プラスミド、哺乳動物発現プラスミド、若しくは植物発現プラスミド、又はインビトロ発現を可能にするＤＮＡにクローニングすることができる。例えば、そのような組換え細菌発現プラスミドを適切な細菌（例えば、大腸菌）に挿入すると、これらの細菌は、この組換えＤＮＡによってコードされたポリペプチドを産生することができる。それに応じて生産されたポリペプチド又はタンパク質は、組換えポリペプチド又は組換えタンパク質と呼ばれる。

【0373】

本発明の文脈において、用語「結合タンパク質」は、結合ドメインを含むタンパク質を指す。結合タンパク質はまた、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれ以上の結合ドメインを含んでもよい。好ましくは、この結合タンパク質は、組換え結合タンパク質である。本発明の結合タンパク質は、ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメイン、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む。

【0374】

更に、任意のそのような結合タンパク質は、当業者に周知の追加のポリペプチド（例えば、ポリペプチドタグ、ペプチドリンカー、結合特異性を有する他のタンパク質ドメインへの融合、サイトカイン、ホルモン、又はアンタゴニストなど）、又は化学修飾（ポリエチレングリコール、毒素（例えば、免疫原からのＤＭ１）、小分子、抗生物質などへのカップリングなど）を含み得る。本発明の結合タンパク質は、ローカライザ分子を含んでもよい。

【0375】

用語「結合ドメイン」は、標的に対して結合特異性を示すタンパク質ドメインを意味する。好ましくは、この結合ドメインは、組換え結合ドメインである。

【0376】

用語「生物学的標的」は、核酸分子、ポリペプチド若しくはタンパク質、炭水化物、又は任意の他の天然に存在する分子などの個々の分子を指し、そのような個々の分子の任意の一部を含むか、又はそのような分子の２つ以上の複合体、又は細胞全体若しくは組織試料、又は任意の非天然化合物を指す。好ましくは、標的は天然に存在する、若しくは、非天然のポリペプチド若しくはタンパク質、又は、例えば、天然に存在する若しくは非天然のリン酸化、アセチル化、若しくはメチル化によって修飾された、化学修飾を含むポリペプチド若しくはタンパク質である。本発明の文脈において、Ｔ細胞は、ＣＤ３特異的結合タンパク質及びローカライザ標的タンパク質の標的であり、細胞及び組織は、ローカライザの標的である。

【0377】

本発明の文脈において、用語「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合された、複数、すなわち２つ以上のアミノ酸の鎖からなる分子に関する。好ましくは、ポリペプチドは、ペプチド結合によって結合された８個超のアミノ酸からなる。用語「ポリペプチド」はまた、システインのＳ－Ｓ架橋によって結合されたアミノ酸の複数の鎖も含む。ポリペプチドは、当業者に周知である。

【0378】

特許出願公開第ＷＯ２００２／０２０５６５号及びＦｏｒｒｅｒら、２００３（Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．，Ｓｔｕｍｐｐ，Ｍ．Ｔ．，Ｂｉｎｚ，Ｈ．Ｋ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，２００３．「ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ」第５３９巻第２～６頁）には、反復タンパク質の特徴及び反復ドメインの特徴、技術、及び用途の一般的な説明が含まれる。用語「反復タンパク質」とは、１つ以上の反復ドメインドメインを含むタンパク質を指す。好ましくは、反復タンパク質は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つの反復ドメインを含む。更に、当該反復タンパク質は、追加の非反復タンパク質ドメイン、ポリペプチドタグ、及び／又はペプチドリンカーを含んでもよい。反復ドメインは、結合ドメインであり得る。

【0379】

用語「反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続する反復モジュールを含むタンパク質ドメインを指し、この反復モジュールは、構造相同性及び配列相同性を有する。好ましくは、反復ドメインは、Ｎ末端及び／又はＣ末端キャッピングモジュールを更に含む。明確にするために、キャッピングモジュールは、反復モジュールであり得る。そのような反復ドメイン、反復モジュール、及びキャッピングモジュール、配列モチーフ、並びに構造的相同性及び配列相同性は、アンキリン反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、ロイシンリッチ反復ドメイン（国際公開第２００２／０２０５６５号）、テトラトリコペプチド反復ドメイン（Ｍａｉｎ，Ｅ．Ｒ．，Ｘｉｏｎｇ，Ｙ．，Ｃｏｃｃｏ，Ｍ．Ｊ．，Ｄ’Ａｎｄｒｅａ，Ｌ．，Ｒｅｇａｎ，Ｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１（５），４９７～５０８，２００３）、及びアルマジロ反復ドメイン（国際公開第２００９／０４０３３８号）の例から、当業者に周知である。そのような反復ドメインが反復されるアミノ酸配列を含むタンパク質とは異なることは、当業者には更に周知であり、反復されるアミノ酸配列は全て、個々のドメイン（例えば、フィブロネクチンのＦＮ３ドメイン）を形成することができる。

【0380】

用語「アンキリン反復ドメイン」は、構造単位として２つ以上の連続するアンキリンモジュールを含む反復ドメインを指す。アンキリン反復ドメインは、標準的な組換えＤＮＡ反復技術を使用して、任意選択で半減期延長ドメインと共に、より大きなアンキリン反復タンパク質にモジュール式に組み立てられてもよい（例えば、Ｆｏｒｒｅｒ，Ｐ．ら，ＦＥＢＳ ｌｅｔｔｅｒｓ ５３９，２－６，２００３、国際公開第２００２／０２０５６５号、国際公開第２０１６／１５６５９６号、国際公開第２０１８／０５４９７１号を参照されたい）。

【0381】

設計された反復タンパク質、設計反復ドメインなどにおいて使用される用語「設計された」は、そのような反復タンパク質及び反復ドメインがそれぞれ人工的であり、自然界では生じないという特性を指す。本発明の結合タンパク質は、反復タンパク質を設計し、これらは少なくとも１つの設計アンキリン反復ドメインを含む。好ましくは、設計反復ドメインは、設計アンキリン反復ドメインである。

【0382】

用語「標的相互作用残基」は、標的との直接的な相互作用に寄与する反復モジュールのアミノ酸残基を指す。

【0383】

用語「フレームワーク残基」は、反復モジュールのアミノ酸残基を指し、これは、折り畳みトポロジーに寄与する、すなわち、反復モジュールの折り畳みに寄与するか、又は隣接モジュールとの相互作用に寄与する。そのような寄与は、反復モジュール内の他の残基との相互作用、又はα－ヘリックス若しくは－シートに見られるポリペプチド骨格構造への影響、又は直鎖ポリペプチド若しくはループを形成するアミノ酸ストレッチへの関与であってもよい。そのようなフレームワーク及び標的相互作用残基は、Ｘ線結晶解析、ＮＭＲ及び／若しくはＣＤ分光法などの物理化学法によって得られる構造データの分析によって、又は構造生物学及び／若しくはバイオインフォマティクスにおいて当業者に周知の既知の関連する構造情報と比較することによって同定され得る。

【0384】

用語「反復モジュール」は、元々は天然に生じる反復タンパク質の反復単位に由来する、設計反復ドメインの反復されたアミノ酸配列及び構造単位を指す。反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、天然に存在する反復タンパク質のファミリー又はサブファミリー、例えば、アンキリン反復タンパク質ファミリーの１つ以上の反復単位に由来する。更に、反復ドメインに含まれる各反復モジュールは、例えば、実施例１に記載されるように、標的上で選択された反復ドメインから得られ、同じ標的特異性を有する相同反復モジュールから推定される「反復配列モチーフ」を含み得る。

【0385】

したがって、用語「アンキリン反復モジュール」は、元々天然に存在するアンキリン反復タンパク質の反復単位に由来する反復モジュールを指す。アンキリン反復タンパク質は、当業者に周知である。設計アンキリン反復タンパク質は、以前に記載されており、例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号、同第２０１０／０６０７４８号、同第２０１１／１３５０６７号、同第２０１２／０６９６５４号、同第２０１２／０６９６５５号、同第２０１４／００１４４２号、同第２０１４／１９１５７４号、同第２０１４／０８３２０８号、同第２０１６／１５６５９６号、及び同第２０１８／０５４９７１号を参照されたく、これらは全て、その全体が参照により組み込まれる。典型的には、アンキリン反復モジュールは、ループによって分離された２つのアルファヘリックスを形成する約３１～３３個のアミノ酸残基を含む。

【0386】

反復モジュールは、標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されていないアミノ酸残基を有する位置（「非ランダム化位置」）及び標的特異的反復ドメインを選択する目的で、ライブラリー内でランダム化されたアミノ酸残基を有する位置（「ランダム化位置」）を含み得る。非ランダム化された位置は、フレームワーク残基を含む。ランダム化された位置は、標的相互作用残基を含む。「ランダム化された」とは、例えば、反復モジュールのアミノ酸位置で２つ以上のアミノ酸が許可され、通常の２０個の天然に存在するアミノ酸のいずれかが許可された、若しくはシステイン以外のアミノ酸、又はグリシン、システイン、及びプロリン以外のアミノ酸などの、２０個の天然に存在するアミノ酸のほとんどが許可されたことを意味する。

【0387】

用語「反復配列モチーフ」は、１つ以上の反復モジュールから推定されるアミノ酸配列を指す。好ましくは、当該反復モジュールは、同じ標的に対して結合特異性を有する反復ドメインに由来する。そのような反復配列モチーフは、フレームワーク残基位置及び標的相互作用残基位置を含む。当該フレームワーク残基位置は、反復モジュールのフレームワーク残基の位置に対応する。同様に、当該標的相互作用残基位置は、反復モジュールの標的相互作用残基の位置に対応する。反復配列モチーフは、非ランダム化位置及びランダム化位置を含む。

【0388】

用語「反復単位」は、１つ以上の天然に存在するタンパク質の配列モチーフを含むアミノ酸配列を指し、当該「反復単位」は複数のコピーに見出され、タンパク質のフォールディングを決定する全ての当該モチーフに共通の定義されたフォールディングトポロジーを示す。そのような反復単位の例としては、ロイシンに富む反復単位、アンキリン反復単位、アルマジロ反復単位、テトラトリコペプチド反復単位、ＨＥＡＴ反復単位、及びロイシンに富むバリアント反復単位が挙げられる。

【0389】

用語「標的に対して結合特異性を有する」、「標的に特異的に結合する」、「高い特異性で標的に結合する」、「標的に対して特異的な」又は「標的特異性」、又は「特異的に結合する」などは、結合タンパク質又は結合ドメインが、大腸菌マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）などの非関連タンパク質に結合するよりも、ＰＢＳ中で、標的に、より低い解離定数で結合する（すなわち、より高い親和性で結合する）ことを意味する。好ましくは、標的に対するＰＢＳ中での解離定数（「Ｋ_D」）は、ＭＢＰに対する対応する解離定数に対し、少なくとも１０２分の１、より好ましくは少なくとも１０３分の１、より好ましくは少なくとも１０４分の１、又はより好ましくは少なくとも１０５分の１である。タンパク質－タンパク質間の相互作用の解離定数を測定するための方法、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）に基づく技術（例えば、ＳＰＲ平衡解析）又は等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）は、当業者に周知である。特定のタンパク質－タンパク質相互作用のＫ_Dの測定値は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変動し得る。したがって、Ｋ_D値の測定は、好ましくは、タンパク質の標準化溶液及びＰＢＳ等の標準化緩衝液を使用して実施される。ＣＤ３、ＣＤ３３、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する本発明の組換え結合タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析による典型的かつ好ましい決定は、実施例４に説明されている。様々なアッセイ形式を使用して、目的の薬物分子に特異的に結合する結合部分を選択又は特徴付けることができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡイムノアッセイ、免疫沈降、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、Ｏｃｔｅｔ（商標）（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ，ＣＡ）及びウエスタンブロット分析は、標的薬物分子に特異的に結合する結合部分を同定するために使用され得る多くのアッセイの一部である。典型的には、特異的又は選択的結合は、少なくとも２倍のバックグラウンドシグナル又はノイズ、より典型的には１０倍超のバックグラウンドシグナルである。より具体的には、結合剤は、平衡解離定数（Ｋ_D）値が＜１μＭ、例えば、＜５００ｎＭ、＜１００ｎＭ、＜１０ｎＭ、＜１ｎＭ、＜１００ｐＭ、又は＜１０ｐＭである場合、標的に「特異的に結合する」と言われる。

【0390】

「結合剤」という用語は、標的分子に特異的に結合することができる任意の分子を指す。用語「結合剤」は、例えば、抗体、抗体フラグメント、アプタマー、ペプチド（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓら、「Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ」、２６６：５１８２～５１９０（１９９１年））、抗体模擬体、反復タンパク質、例えば、設計アニクリン反復タンパク質、受容体タンパク質、及び標的分子のいずれかの他の天然に存在する相互作用パートナーを含み、天然タンパク質と、例えば、非天然残基を含むように、及び／又は天然残基を欠いているように修飾され若しくは遺伝子操作されたタンパク質とを含むことができる。

【0391】

用語「ＰＢＳ」は、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸塩及び２．７ｍＭ ＫＣｌを含み、ｐＨが７．４であるリン酸緩衝水溶液を意味する。

【0392】

本明細書で使用される「腫瘍関連抗原」又はＴＡＡという用語は、正常細胞上に見出される抗原と構造が質的に異ならない、腫瘍細胞上に見出される抗原を指す。しかし、腫瘍関連抗原は、ほとんどの健常細胞の表面上よりも多くの数で腫瘍細胞の表面上に見出される。腫瘍関連抗原は、腫瘍型に特異的であり得るが、いくつかの腫瘍型においても発現され得る。例えば、ＴＡＡ ＭＵＣ１は、結腸癌、乳癌、卵巣癌、肺癌、及び膵臓癌と関連付けられている。

【0393】

用語「マウス血清アルブミン」は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０７７２４を指し、用語「カニクイザル血清アルブミン」（すなわちカニクイザル（ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ａ２Ｖ９Ｚ４を指し、用語「ヒト血清アルブミン」はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０２７６８を指す。

【0394】

好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期は、哺乳動物、より好ましくはマウス及び／又はカニクイザル、より好ましくはカニクイザルで評価する。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をマウスで測定する場合、評価は、注入後４８時間までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、マウスにおける終末相半減期の評価は、２４時間～４８時間で計算される。好ましくは、クリアランス、及び／又は曝露、及び／又は終末相半減期をカニクイザルで測定する場合、評価は、注射後最大７日目までのデータを考慮して実施する。より好ましくは、カニクイザルにおける終末相半減期の評価は、１日目～５日目で計算する。当業者は、標的媒介クリアランスなどの効果を更に特定し、終末相半減期を計算する場合、それらを考慮することができる。本発明の組換え結合タンパク質などの薬物の用語「終末相半減期」とは、偽平衡に達した後、哺乳動物に適用した薬物の血漿中濃度の半分に達するのに必要な時間を指す（例えば、マウスでは２４時間～４８時間で計算し、又はカニクイザルでは１日～５日で計算する）。終末相半減期は、哺乳動物に投与された薬物の用量の半分を排泄するのに必要な時間とは定義されない。終末相半減期という用語は、当業者に周知である。好ましくは、薬物動態の比較は、任意の用量、より好ましくは同等の用量（すなわち、同一のｍｇ／ｋｇ用量）又は等モル用量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）、より好ましくは等モル投与量（すなわち、同一のｍｏｌ／ｋｇ用量）で行う。当業者であれば、動物での同等及び／又は等モルの投与は、少なくとも約２０％、より好ましくは約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、又は約１００％の実験的な投与量のばらつきを伴うことを理解する。好ましくは、薬物動態の測定に用いられる投与量は、約０．００１～約１０００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．０１～約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．１～約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約０．５～約１０ｍｇ／ｋｇから選択される。

【0395】

「ＣＤ３」又は「分化クラスター３」という用語は、３つの対（εγ、εδ、ζζ）として集合する４つの異なるポリペプチド鎖、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）及びゼータ（ζ）から構成される多量体タンパク質複合体を指す。ＣＤ３複合体は、Ｔ細胞受容体と非共有結合的に会合するＴ細胞共受容体として機能する。それは、任意の形態のＣＤ３、並びにＣＤ３の活性の少なくとも一部を保持するその変異体、アイソフォーム、及び種相同体を指し得る。したがって、本明細書に定義及び開示される結合タンパク質はまた、ヒト以外の種からＣＤ３に結合してもよい。他の場合では、結合タンパク質は、ヒトＣＤ３に完全に特異的であってもよく、種又は他のタイプの交差反応性を示さなくてもよい。ヒトＣＤ３に対する特定の参照によってなど異なる指示がない限り、ＣＤ３は、天然配列ＣＤ３、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、及びウシの全ての哺乳動物種を含む。ヒトＣＤ３ガンマ、デルタ及びゼータのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）参照配列、それぞれＮＰ＿００００６４．１、ＮＰ＿０００７２３．１、及びＮＰ＿９３２１７０．１に示されている。

【0396】

本明細書で使用される用語「ＣＤ３発現細胞」は、細胞障害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）及びＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋Ｔ細胞）などのＴ細胞を含むがこれらに限定されない、細胞表面上にＣＤ３（分化クラスター３）を発現するいずれかの細胞を指す。

【0397】

「ＣＤ３３」という用語は、骨髄細胞表面抗原ＣＤ３３を指し、これは、細胞間相互作用を媒介し、免疫細胞を静止状態に維持する役割を果たすシアル酸結合免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）である。ヒトＣＤ３３（ｈＣＤ３３）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）参考資料第Ｐ２０１３８号に示されている。

【0398】

「ＣＤ７０」という用語は、ＣＤ２７のリガンドとして機能するサイトカインであるＣＤ７０抗原を指す。ＣＤ７０－ＣＤ２７経路は、特に抗ウイルス応答の間、Ｔ細胞免疫の生成及び維持において重要な役割を果たす。ヒトＣＤ７０（ｈＣＤ７０）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）参考資料第Ｐ３２９７０号に示されている。

【0399】

「ＣＤ１２３」という用語は、インターロイキン－３受容体サブユニットαを指す。これはインターロイキン－３の受容体である。ヒトＣＤ１２３（ｈＣＤ１２３）のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）参考資料第Ｐ２６９５１号に示されている。

【0400】

用語「Ｔ細胞の腫瘍限局性活性化」は、非腫瘍組織と比較して、Ｔ細胞が腫瘍組織において優先的に活性化されることを意味する。

【0401】

更に、用語「ペプチド」とはまた、例えばグリコシル化によって修飾されたペプチドと、２つ以上のポリペプチド鎖を含むタンパク質、４～６００アミノ酸長の長さの各々、例えばインスリン及び免疫グロブリンなどのジスルフィド結合によって架橋されたタンパク質と、を包含する。用語「化学的又は生化学的薬剤」とは、レシピエントに投与され得る任意の自然起源又は合成の化合物を含むことが意図される。好ましい態様では、ローカライザは、標的特異性アンキリン反復ドメインである。

【0402】

「医学的状態」（又は障害又は疾患）という用語には、自己免疫障害、炎症性障害、網膜症（特に増殖性網膜症）、神経変性障害、感染症、代謝性疾患、及び腫瘍性疾患が含まれる。本明細書に記載の組換え結合タンパク質のいずれかを、そのような障害、特に、腫瘍性疾患の治療のための薬剤の調製に使用することができる。「医学的状態」は、不適切な細胞増殖を特徴とするものである場合がある。医学的状態は、過剰増殖状態である場合がある。本発明は、特に、医学的状態を治療する方法であって、そのような治療を必要とする患者に、本発明の組換え結合タンパク質又は上記の医薬組成物の治療有効量を投与する工程を含む、治療方法に関する。好ましい態様では、当該医学的状態は、腫瘍性疾患である。用語「腫瘍性疾患」は、本明細書で使用する場合、急速に増殖する細胞増殖又は腫瘍を特徴とする、細胞又は組織の異常な状態（state or condition）を指す。一態様では、当該医学的状態は、悪性腫瘍性疾患である。一態様では、当該医学的状態は、癌、好ましくは白血病、より好ましくは急性骨髄性白血病である。用語「治療有効量」は、患者において所望の効果をもたらすのに十分な量を意味する。

【0403】

用語「抗体」は、インタクトな抗体分子だけでなく、免疫原結合能力を保持する抗体分子の任意のフラグメント及び変異体も意味する。そのようなフラグメント及び変異体もまた、当技術分野において周知であり、インビトロ及びインビボの両方で常時使用されている。したがって、用語「抗体」は、インタクトな免疫グロブリン分子、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び単鎖Ｖ領域フラグメント（ｓｃＦｖ）などの抗体フラグメント、二重特異性抗体、キメラ抗体、抗体融合ポリペプチド、及び非従来型抗体を包含する。

【0404】

用語「癌」及び「癌性」は、本明細書では、典型的には、調節されていない細胞増殖によって特徴付けられる哺乳動物における生理学的状態を指すか、又は記載するために使用される。癌は、固形腫瘍及び液性腫瘍、並びに原発性腫瘍及び転移性を包含する。「腫瘍」は、１つ以上の癌性細胞を含む。固形腫瘍は、典型的には、腫瘍間質も含む。癌の例としては、原発性及び転移性癌、リンパ腫、芽腫、肉腫、及び白血病、並びに任意の他の上皮及びリンパ系悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。脳癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、明細胞腎臓癌、頭頸部扁平上皮癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、悪性黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、三重陰性乳癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、濾胞性リンパ腫、ホジキンリンパ腫（ＨＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、小リンパ球性リンパ腫（ＳＬＬ）、悪性中皮腫、結腸直腸癌、又は胃癌が挙げられる。

【実施例】

【0405】

以下に開示の出発物質及び試薬は、当業者に既知であり、市販されている、及び／又は周知の技術を用いて調製することができる。

【0406】

材料
化学物質はＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（ＵＳＡ）より購入した。オリゴヌクレオチドはＭｉｃｒｏｓｙｎｔｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）より購入した。特に明記しない限り、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素、及び緩衝液は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（ＵＳＡ）又はＦｅｒｍｅｎｔａｓ／Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＵＳＡ）より購入した。誘導性大腸菌発現株は、例えば、大腸菌のＸＬ１－ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、ＵＳＡ）又はＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ、ＵＳＡ）などのクローニング及びタンパク質生産に使用した。適切であれば、精製を容易にするため、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（例えば、配列番号３３）を有するタンパク質が頻繁に産生された。２つのベンチマークＴ細胞エンゲージャを作製し、実施例に記載される様々な実験において対照として使用した。これらのベンチマークＴ細胞性エンゲージャは、それぞれＡＭＧ３３０及びフロテツズマブに類似しており、実施例、図の説明、及び図を通して、ＡＭＧ３３０又はＡＭＧ３３０類似物、及びフロテツズマブ又はフロテツズマブ類似物と呼ばれる。

【0407】

分子生物学
特に明記しない限り、方法は、既知のプロトコルに従って実施される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｃｈ Ｅ．Ｆ．、及びＭａｎｉａｔｉｓ Ｔ．、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９年）、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ参照）。

【0408】

設計アンキリン反復タンパク質ライブラリー
設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを生成する方法は、例えば、米国特許第７，４１７，１３０号；Ｂｉｎｚら、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第３３２巻第４８９～５０３頁、２００３年；Ｂｉｎｚら（２００４年）、上記引用に記載されている。このような方法により、ランダム化アンキリン反復モジュール及び／又はランダム化キャッピングモジュールを有する、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーを構築することができる。例えば、そのようなライブラリーはしたがって、固定化Ｎ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号１６、１７、１８、１９、２０、又は２１のＮ末端キャッピングモジュール）、又は配列番号２２によるランダム化Ｎ末端キャッピングモジュール、及び固定化Ｃ末端キャッピングモジュール（例えば、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、若しくは３１のＣ末端キャッピングモジュール）又は配列番号３２のランダム化Ｃ末端キャッピングモジュールに基づいて組み立てることができる。好ましくは、そのようなライブラリーは、反復又はキャッピングモジュールのランダム化された位置にアミノ酸Ｃ、Ｇ、Ｍ、Ｎ（Ｇ残基の前）及びＰのいずれも有することがないように組み立てられる。

【0409】

更に、そのようなライブラリー内のそのようなランダム化されたモジュールは、ランダム化されたアミノ酸位置を有する追加のポリペプチドループ挿入を含んでもよい。そのようなポリペプチドループ挿入の例は、抗体又はデノボ生成ペプチドライブラリーの補体決定領域（ＣＤＲ）ループライブラリーである。例えば、そのようなループ挿入は、ガイダンスとして、ヒトリボヌクレアーゼＬのＮ末端アンキリン反復ドメインの構造を用いて設計することができた（Ｔａｎａｋａ，Ｎ．、Ｎａｋａｎｉｓｈｉ，Ｍ、Ｋｕｓａｋａｂｅ，Ｙ、Ｇｏｔｏ，Ｙ．、Ｋｉｔａｄｅ，Ｙ、Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｋ．Ｔ．，ＥＭＢＯ Ｊ．．２３（３０），３９２９－３９３８，２００４）。２つのアンキリン反復の境界近くに存在するβターンに１０個のアミノ酸が挿入される、このアンキリン反復ドメインと同様に、アンキリン反復タンパク質ライブラリーは、アンキリン反復ドメインの１つ以上のβターンに挿入された可変長（例えば、１～２０個のアミノ酸）のランダム化ループ（固定化及びランダム化位置を有する）を含有してもよい。

【0410】

アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＮ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＲＩＬＬＡＡモチーフ、ＲＩＬＬＫＡモチーフ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを有し（例えば、配列番号１の位置２１～２６に存在）、アンキリン反復タンパク質ライブラリーのいずれかのそのようなＣ末端キャッピングモジュールは、好ましくは、ＫＬＮモチーフ、ＫＬＡモチーフ、又はＫＡＡモチーフを有する（例えば、配列番号の最後の３つのアミノ酸に存在）。配列番号１６、１７、１８、１９、２０、又は２１は、ＲＩＬＬＡＡ、ＲＩＬＬＫＡ、又はＲＥＬＬＫＡモチーフを含むＮ末端キャッピングモジュールの例を提供し、配列番号２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１は、ＫＬＮ、ＫＬＡ、又はＫＡＡモチーフを含むＣ末端キャッピングモジュールの例を提供する。

【0411】

そのようなアンキリン反復タンパク質ライブラリーの設計は、標的と相互作用するアンキリン反復ドメインの既知の構造によって誘導され得る。タンパク質構造データバンク（Protein Data Bank：ＰＤＢ）の独自の受託コード又は識別コード（ＰＤＢ－ＩＤ）によって識別される、そのような構造の例は、１ＷＤＹ、３Ｖ３１、３Ｖ３０、３Ｖ２Ｘ、３Ｖ２Ｏ、３ＵＸＧ、３ＴＷＱ－３ＴＷＸ、１Ｎ１１、１Ｓ７０、及び２ＺＧＤである。

【0412】

Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃで設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーなどの、設計アンキリン反復タンパク質ライブラリーの例が説明されている（米国特許第７，４１７，１３０号、Ｂｉｎｚら、２００３年、上記引用；Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。Ｎ２Ｃ及びＮ３Ｃの数字は、Ｎ末端及びＣ末端のキャッピングモジュール間に存在するランダム化反復モジュールの数を説明している。

【0413】

反復単位及びモジュール内の位置を定義するために使用される命名法は、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用に基づき、アンキリン反復モジュールとアンキリン反復単位との境界が、１アミノ酸位置シフトするという修飾を伴う。例えば、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置１は、本開示のアンキリン反復モジュールの位置２に対応し、結果として、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用のアンキリン反復モジュールの位置３３は、本開示の以下のアンキリン反復モジュールの位置１に相当する。

【0414】

全てのＤＮＡ配列は配列決定によって確認され、選択されたタンパク質の計算された分子量は質量分析によって確認された。

【0415】

実施例１：ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ７０、又はＣＤ１２３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
Ａ．ＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ３標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（Homogeneous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のヒトｓｃＣＤ３特異的結合タンパク質がうまく選択されたことを示した。例えば、配列番号２のアンキリン反復ドメインは、ｓｃＣＤ３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。

【0416】

ヒト組換えＣＤ３標的調製物
選択された標的フォーマットは、２６アミノ酸リンカー（ｓｃＣＤ３εγ）及び部位指向的ビオチン化のためのＣ末端Ａｖｉタグによって連結されたヒトＣＤ３ε及びＣＤ３γヘテロ二量体からなる単鎖フォーマットに基づく。標的タンパク質は、ＣＤ３細胞外ドメインのみを含み、Ｃ末端システイン「ノブ」並びに膜貫通領域及び細胞質領域全体を欠く。

【0417】

ヒトｓｃＣＤ３εγの細胞外ドメイン（配列番号３８＿ｓｃＣＤ３εγ＿Ａｖｉ－Ｂｉｏ）を、大腸菌において以前に記載された（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＰＮＡＳ，２００４，１０１（２０）：７６７５－７６８０）のと同様の一本鎖フォーマットで発現させ、続いて封入体からリフォールディングさせ、分取サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。材料を１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０中で３．４ｍｇ／ｍｌに濃縮し、組換えＢｉｒＡを使用してインビトロでビオチン化した。機能的標的材料を単離するために、ＯＫＴ３充填カラム（ＧＥ ＨｉＴｒａｐ ＮＨＳ活性化ＨＰカラム）を用いて材料を再精製した。最終材料はサイズ排除で単量体であり、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、１０％のグリセロール中０．３９ｍｇ／ｍｌの最終濃度で保存した。

【0418】

組換えヒトｓｃＣＤ３標的調製プロセスの概要は、Ｄｕｎｓｔｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ ２００４に記載されている。

【0419】

リボソームディスプレイによるＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の選択
ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ３の細胞外ドメインの一部（配列番号３８）を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」４、６９～７９（２００７年）を参照）。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。最初の４ラウンドの選択は、標準的なリボソームディスプレイ選択を採用し、標的濃度を減少させ（それぞれ、４００ｎＭ、１３３ｎＭ、４５ｎＭ及び１５ｎＭ）、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４まで選択圧力を増加させる（Ｂｉｎｚ ｅｔ ａｌ．２００４年、上記引用）。ラウンド２～４において、ｍＲＮＡを、過剰のＣＤ３結合抗体ＯＫＴ３を使用する競合溶出によって回収した（各ラウンドにおいて、競合物過剰は、３５倍から３００倍まで一定に増加した）。

【0420】

選択されたクローンは、二価フォーマットでＴ細胞を活性化する。
ＣＤ３標的に結合する個々のアンキリン反復タンパク質クローンを、リボソームディスプレイによって選択し、発現ベクターのｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）の誘導体にクローニングし、大腸菌ＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ寒天（１％のグルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む）上にプレーティングし、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。発現ベクター、ＨｉｓタグとＭｙｃタグの両方とＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインを備えたＪｕｎロイシンジッパー構築物を、二価フォーマット（ＣＤ３特異性結合ドメインに関して）でのスクリーニングに使用し、Ｔ細胞の架橋による機能性の試験を可能にした。単一のコロニーを、１６０μＬの増殖培地（１％グルコース及びアンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレート（単一ウェル内の各クローン）中に拾い上げ、３７℃で一晩インキュベートし、８００ｒｐｍで振盪した。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び８５０ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８．５μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（６００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去し（３２２０ｇで１５分間）、更なる使用のためにー２０℃で保存した。

【0421】

第１の工程では、ＢＫ１１２ ＣＤ８＋モノクローナルＴ細胞を用いてＴ細胞活性化スクリーニングを行った。各溶解クローンの抽出物を、ＰＢＳＢ（１２％（ｗ／ｖ）ＦＢＳを補充したＰＢＳ ｐＨ７．４）中の１：２０希釈物（最終濃度）として、抗ペンタＨｉｓ抗体（Ｑｉａｇｅｎ）コーティング９６ウェルプレートに適用し、４℃で一晩インキュベートした。プレートをＰＢＳで５回洗浄した後、１ウェル当たり１００μｌの１００’０００ ＢＫ１１２ Ｔ細胞を添加し、Ｔ細胞アッセイ培地ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％のＦＢＳ＋１％のＬ－グルタミン＋１％のＰｅｎ Ｓｔｒｅｐ＋２００ＩＵ ＩＬ２中で培養した。０．１μｇの１００μＬのＧｏｌｇｉ Ｓｔｏｐを添加し、プレートを室温で３分間、２０ｇで遠心分離した後、ＣＯ₂－インキュベーター内で、３７℃で４～５時間インキュベートした。細胞を４℃で５分間３５０ｇで遠心分離し、デカントした。細胞を表面ＣＤ８発現について染色した後、ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘを用いて細胞を保存し、４℃で一晩インキュベートした。細胞を１×ＰＢＳ＋２％のＦＢＳで洗浄し、Ｃｅｌｌ ｐｅｒｍ（ＢＤ）中の５０μｌのＩＦＮγ－ＡＰＣ抗体を添加し、４℃で３０分間インキュベートすることによって、細胞内ＩＦＮγについて染色した。細胞を再びＰＢＳで洗浄し、ＢＤからのＣｙｔｏｍｅｔｅｒ ＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩを用いて分析した。

【0422】

選択されたクローンは、ＣＤ３への結合（ＨＴＲＦ及びＯＫＴ３競合によって示される）及び二重特異性フォーマットにおける機能性を示す。
Ｔ細胞エンゲージャ（ＴＣＥ）構築物を作製するために、同定された機能的な設計アンキリン反復ドメインヒットを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）特異性アンキリン反復ドメイン及びＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。２５ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン；３７℃）を使用して、５００ｍＬの培養物（ＴＢ、５０μｇ／ｍＬのアンピシリン、３７℃）に接種した。６００ｎｍで１．０～１．５の吸光度において、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら３７℃で４～５時間インキュベートした。培養物を遠心分離し、得られたペレットを、２５ｍＬのＴＢＳ₅₀₀（５０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）中に再懸濁し、溶解した（超音波処理）。溶解後、試料を５０ＫＵ ＤＮａｓｅ／ｍＬと混合し、６２．５℃で３０分間の熱処理工程の前に１５分間インキュベートし、遠心分離し、上清を回収し、濾過した。Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ１００（１％（ｖ／ｖ）の最終濃度）及びイミダゾール（２０ｍＭの最終濃度）をホモジネートに添加した。タンパク質を、Ｎｉ－ニトリロ三酢（Ｎｉ－ＮＴＡ）酸カラム、続いて、ＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システム上のサイズ排除クロマトグラフィで、当業者に既知の標準的なプロトコル及び樹脂に従って精製した。

【0423】

第１の工程において、組換えタンパク質への結合を、ＨＴＲＦアッセイを使用して試験した。ＰＢＳ－ＴＣ（０．１％（ｗ／ｖ）のカゼイン及び０．１％のＴｗｅｅｎ２０を補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４）中のアンキリン反復タンパク質（５～６４０ｎＭ）の力価測定を、３８４ウェルプレートのウェル中で、４８ｎＭ（最終濃度）のヒトビオチン化ｓｃＣＤ３εγ、１：１００（最終濃度）の抗６ Ｈｉｓ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴアクセプタコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）及び１：１００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）に対して行い、室温で１２０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。いくつかの候補は用量依存的結合を示し、更なる評価のために使用した。全てのこれらの構築物について、結合シグナルは、ＣＤ３εの立体構造エピトープに結合する２０倍過剰のＣＤ３結合抗体（ヒトＦｃ領域を含有するＯＫＴ３変異体、最終濃度２．４ｍＭ）と競合した場合にバックグラウンドレベルであった（Ｋｊｅｒ－Ｎｉｅｌｓｅｎら、ＰＮＡＳ、２００４，１０１（２０）：７６７５－７６８０）。用量依存的なインビトロでのＴ細胞活性化を、ＴＡＡ１発現腫瘍細胞の存在下で、ＢＫ１１２ Ｔ細胞活性化アッセイ（ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓで予め活性化されたＢＫ１１２ ＣＤ８モノクローナルＴ細胞）を使用して確認した。細胞内ＩＦＮｙレベルを、１～１００’０００ｐＭの二重特異性ＴＣＥ構築物の存在下でのＢＫ１１２及びＳＫＯＶ３細胞（Ｅ：Ｔ＝１：１０）の５時間のインキュベーション後に、ＣＤ８＋又はＣＤ４＋Ｔ細胞上で測定した。最も強力な構築物は、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ８＋細胞についてそれぞれ０．５ｎＭ及び０．４ｎＭのＥＣ５０値を示した。

【0424】

選択されたＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の親和性成熟及び合理的設計
合理的設計と組み合わせた数ラウンドの親和性成熟を、親の低親和性結合ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ａと称する）に適用し、４つのより高い親和性のＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ｂ、Ｃ及びＤと称する）を得た。次いで、これらの前駆体分子を、ＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質、例えばＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２に最終的に操作した。

【0425】

親和性成熟は、Ｚａｈｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００７，４：２６９－２７９に記載されているエラープローンＰＣＲ及びＤＮＡ Ｉシャッフリングを使用して多様性を導入することによって、ＣＤ３標的への十分な結合能力と、インビトロでのＴ細胞を効率的に活性化する能力の両方を考慮して選択した、親ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質（前駆体Ａ）の１つに対して実行した。簡単に説明する。３ラウンドのリボソームディスプレイを、増加させた選択圧力（洗浄工程はラウンド１（３×１５分）から、３×３０分（ラウンド２）まで、３×４５分（ラウンド３）まで増加）を用いて、ＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質／ラウンド当たり約１～２個の変異を導入するために、異なる濃度のｄＮＴＰ類似体（５～１０μＭの８－ｏｘｏ－ｄＧＴＰ及びｄＰＴＰを用いるＪｅｎａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製の変異誘発キット）を使用して実施したが、標的濃度は５ｎＭで一定に保った。第２の工程では、ＤＮＡプールをＤＮＡシャッフルし、９０秒のＤＮＡｓｅ Ｉインキュベーション時間及びＤＮＡポリメラーゼＨｏｔＳｔａｒＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、以前に記載されているように（Ｃａｄｗｅｌｌ ＆ Ｊｏｙｃｅ、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ａｐｐｌ，１９９２，２：２８－３３；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９４ ３７０：３８９－３９１；Ｚａｃｃｏｌｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ１９９６、２５５：５８９－６０３）使用して、１ラウンド又は２ラウンドのリボソームディスプレイで親クローンを使用して戻し交雑した。親和性成熟したＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質プールを、最終的にＮ末端Ｈｉｓ－Ｆｌａｇタグ、半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン、ＴＡＡ１結合アンキリン反復ドメイン及びＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインを含むｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングし、発現させ、前述のようにＨＴＲＦによって組換えｓｃＣＤ３εγへの結合についてスクリーニングした。リードクローンを選択した（前駆体Ｂ、全ての工程において１０μＭのｄＮＴＰ類似体を使用する３ラウンドのエラープローンＰＣＲ並びに２ラウンドのＤＮＡシャッフリング及び戻し交雑を含む５ラウンドの親和性成熟後に作製した）。

【0426】

同じプロセスにおいて、５位及び２０位におけるＮキャップ変異、２位及び４位における第１の内部反復変異、２位、５位及び２０位における第２の内部反復変異、並びに１位及び１８位におけるＣキャップ変異を含む、増加したＴ細胞活性化についてのいくつかの潜在的に有益な変異を、ＢＫ１１２アッセイにおけるＩＦＮγ＋Ｔ細胞の％によって同定した。熱安定性を維持するためにＮ及びＣキャップフレームワーク変異を最小限に維持しながら、これらの変異の組み合わせは、設計された変異体のセットをもたらし、これを、改善されたＴ細胞活性化について同じフォーマットで再び試験した。それによって、親及び最初に成熟したものと比較してより高いＴ細胞活性化効力を有する、新しい更に成熟した変異体（前駆体Ｃ）を生成した。

【0427】

ＣＤ３親和性及びＴ細胞活性化効力を更に増加させるために、上記に記載されたものと同様に、前駆体Ｃクローンに対して第２の親和性成熟を行った。簡単に説明する。４ラウンドのリボソームディスプレイを行った。最初の３ラウンドでは、７．５μＭのｄＮＴＰ類似体を用いたエラープローンＰＣＲによって変異を導入した。ラウンド１及び３では、更に成熟したクローン自体又は競合のための非ビオチン化ＣＤ３標的タンパク質のいずれかを使用して、オフレート選択を適用した。１ｎＭの標的をラウンド１及び２で使用し、一方、５ｎＭをあまりストリンジェントでないラウンド３及び４で適用した。ＨＳＡ結合ドメイン及びＴＡＡ１結合アンキリン反復ドメインを含む三重特異性フォーマットにおいて、競合物として更に成熟したクローンの２５０倍アクセスを用いるオフレートＨＴＲＦアッセイを使用して、ＣＤ３変異体をスクリーニングした。競合後に最も高い残存ＨＴＲＦシグナルを有する合計３×９６個のクローンを配列決定した。改善された結合（Ｎキャップ１６位、第１の内部反復１、１２、１８、１９、２６、３０及び３３位、第２の内部反復２、３、７、２０、２１、２６、及び３２位、並びにＣキャップ９、１１及び１８位を含む）について、又は減少されたドメイン相互作用（Ｎキャップ１１、１８、１９、２６位、及びＣキャップ３、１９、及び２２位を含む）についての同定された有益な変異を、まず、ＢＫ１１２ Ｔ細胞活性化について、精製タンパク質変異体の個別又は対になる変異として試験した。次いで、最も有益な変異体を第２の工程において組換え、変異体を最も高いＴ細胞活性化についてスクリーニングし、これにより、前駆体Ｄの同定をもたらした。

【0428】

最後の工程では、血清中半減期及び生物理学的特性を改善するために、変異体、例えばＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６を、それぞれＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質前駆体Ａ、Ｂ、Ｃ、及びＤに基づいて作製した。それにより、２３位及び／又は２６位のＮキャップ変異を導入し、フレームワーク変異のいくつかを除去した（１９位、１８位）。

【0429】

ヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する親和性成熟アンキリン反復ドメインを、Ｎ末端Ｈｉｓタグ（配列番号３３）を提供するｐＱＥ（ＱＩＡｇｅｎ、ドイツ）を基にした発現ベクターにクローニングして、以下に説明されるような単純なタンパク質精製を容易にした。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（配列番号１、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２（配列番号２、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３（配列番号３、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４（配列番号４、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）。

【0430】

ＣＤ３特異的アンキリン反復タンパク質の高レベル及び可溶性発現
詳細な分析のために、一価として、又はＴＡＡ及び／若しくはＨＳＡ結合アンキリン反復ドメインと組み合わせてのいずれかで、特異的なＣＤ３結合を示す選択されたクローンを大腸菌細胞で発現させ、Ｈｉｓタグを使用して精製し、続いて当業者に公知の標準的なプロトコル及び樹脂に従ってＡＫＴＡｘｐｒｅｓｓ（商標）システムでサイズ排除クロマトグラフィを行った。一価構築物及び多価構築物について、それぞれ、ＴＢＳ ｐＨ８．０（５０ｍＭのＴｒｉｓ、５００ｍＭのＮａＣｌ）又はＰＢＳ ｐＨ７．４中で１０ｍｇ／ｍｌに濃縮したとき、タンパク質は単量体であり、可溶性であった。Ａ．そのようなＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析の代表的な例を、図１９に示す。

【0431】

Ｂ．ＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトＣＤ３３（ｈＣＤ３３）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ３３標的（ＣＤ３３のＥＣＤの全長及びスプライス変異体）への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のｈＣＤ３３特異的結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号１５及び６７～７０のアンキリン反復ドメインは、ｈＣＤ３３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。

【0432】

リボソームディスプレイによるＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ３３の細胞外ドメイン（配列番号８７）を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻第６９～７９頁、２００７年、参照）。ＣＤ３３標的（Ｅｖｉｔｒｉａ）は、Ｃ末端Ｆｃタグ及びＡｖｉタグを含有し、酵素ＢｉｒＡ－ＧＳＴを使用してビオチン化した。ＣＤ３３の２つの異なる形態を選択のために使用した。残基１８～２５９を使用することによってＣＤ３３の可変ドメイン及び定常ドメインの両方をカバーするＣＤ３３の全長ＥＣＤ、並びに残基１２０～２５９を使用することによってＣＤ３３の定常ドメインのみをカバーするＣＤ３３のスプライス変異体。計４ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させた（Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。ビオチン化非ＣＤ３３ Ｆｃドメインと併せてストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて脱選択戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。

【0433】

高親和性ＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ（２００７年）上記引用）。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。これら最後の２つの選択ラウンドでは、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数はそれぞれ３０及び３５であった。

【0434】

合計３つの異なる選択アプローチが、以下の差異を伴って、上記のように行われた。第１のアプローチでは、全長ＣＤ３３タンパク質のＥＣＤに対してのみ選択を行った。第２のアプローチでは、完全長ＣＤ３３及びスプライス変異体の標的を各ラウンドで交互にした。第３のアプローチでは、ＨＩＭ－３－４ ＣＤ３３結合抗体（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（商標））を添加することによって、第１のアプローチの条件を使用して競合溶出工程を適用した。各アプローチから、全長ＣＤ３３及び／又はそのスプライス変異体に対して結合剤を生成した。

【0435】

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにヒト及びカニクイザルＣＤ３３に特異的に結合する
溶液中でｈＣＤ３３に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクター（ｐＭＰＡＧ０６）の誘導体にクローニングし、大腸菌のＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６０μｌの成長培地（１％グルコースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する９００μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ディープウェルプレート中５０μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び７００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１５分間インキュベートした。次いで、９５０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

【0436】

各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、１２ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ｈＣＤ３３、１：２００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：２００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：９００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で９０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ｈＣＤ３３に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。ｈＣＤ３３に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１５である。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５（配列番号１５）。

【0437】

同様に、溶液中でｈＣＤ３３に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、Ｃ末端ＣＤ３結合設計アンキリン反復タンパク質、引き続いてＦｌａｇタグを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクター（ｐＭＰＤＶ０４５）の誘導体にクローニングし、大腸菌のＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６０μｌの成長培地（１％グルコースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び７００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

【0438】

各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、６ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ｈＣＤ３３（ＥＣＤ ＣＤ３３の全長又はスプライス変異体）、１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｄ２抗体ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：１０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で６０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ｈＣＤ３３に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。ｈＣＤ３３に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、
配列番号６８はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３７であり、配列番号６９はＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３８である。

【0439】

ｈＣＤ３３に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号６７～７０は、それぞれ配列番号６８及び６９の配列に基づいて操作される。

【0440】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３８については、芳香族残基の量を減少させ、表面電荷を変化させるために配列を改変した。両方のＮ末端キャッピングモジュールにおいて、ＲＩＬＬＡＡモチーフをＲＩＬＬＫＡで置換し、アスパラギン酸（１８位）をロイシンで置換した。両方のＣ末端キャッピングモジュールにおいて、グルタミン酸（１８位）をグルタミンで置換した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２については、Ｎ末端キャッピングモジュールにおいて追加のフェニルアラニン（１４位）をバリンで置換した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３７については、Ｎ末端キャッピングモジュールにおいて追加のトリプトファン（７位）をバリンで置換し、第２の内部反復（１８～２１位）におけるＥＤＩＡモチーフをＬＥＩＶで置換した。操作された変異体は、５：１の比で汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を使用して４８時間インキュベートした後に標準的なＬＤＨ殺傷アッセイにおいて測定された２倍を超えて、親バージョンと比較して、Ｔ細胞殺傷（他のＴＡＡ及びＣＤ３結合ＤＡＲＰｉｎ分子と組み合わせて評価された）を変化させなかった。

【0441】

ＣＤ３３特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的なヒトＣＤ３３結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。０．１１ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、９６ディープウェルプレートで０．９９ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。３７℃（７００ｒｐｍ）で２時間インキュベートした後、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら（９００ｒｐｍ）３７℃で６時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、ＤＮＡａｓｅ Ｉ（２００ユニット／ｍｌ）及びリゾチーム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を補充した５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、６０μＬの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。合計で、８つの個々の発現をプールした後、遠心分離（３，２００ ｇ、６０分間、４℃）によって細胞破片を除去した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて上清を濾過した後、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ ＨｉｓＰｕｒコバルトスピンプレートを用いて精製し、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ Ｚｅｂａスピン脱塩プレートを用いてＰＢＳ中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステム上で標準Ｓｅｐｈａｄｅｘ １５０／５カラムを使用して、ＰＢＳ中で可溶性及び単量体であった。

【0442】

親和性成熟ＣＤ３３特異性結合タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６（配列番号６７）に由来する、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７２（配列番号１１１）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７３（配列番号１１２）。

【0443】

最初に同定されたＣＤ３３特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び／又はそれからの非常に低いオフ速度を有する新たな変異体が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、１つの最初に同定されたＣＤ３３特異性結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６（「親」結合タンパク質）を、親和性成熟のための適切な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合ＨＴＲＦによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。単一アミノ酸点突然変異変異体を、単一のＮＮＫ縮重コドンを有するプライマーを使用して親プラスミド（ｐＭＣＨＥ１１９０）上で標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲによって生成して、潜在的な結合位置に２０個全てのアミノ酸を導入した。タンパク質変異体の粗抽出物（ＣＥ）（最後にＮ末端Ｈｉｓタグ、続いてＣＤ３３特異性結合ドメインを含有する）を、標準大腸菌発現培養物から生成した。希釈したＣＥをビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の非タグ化親ＣＤ３３結合タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６）を添加し、ＨＴＲＦシグナルを経時的に測定した。親クローンよりも高いＨＴＲＦシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。

【0444】

操作されたＣＤ３３特異性ヒットを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体である、最後にＮ末端Ｈｉｓタグ、続いて配列番号１１１又は１１２のＣＤ３３特異性結合ドメイン及び配列番号３のＣ末端ＣＤ３結合ドメインを含有する１つのベクター、並びに最後にＮ末端Ｈｉｓタグ、続いて配列番号１１１又は１１２のＣＤ３３特異性結合ドメインを含有する１つのベクターにサブクローニングして、それぞれ、二価（２Ｄ）及び一価フォーマット（１Ｄ）でタンパク質を発現した。全ての構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。

【0445】

ＣＤ１２３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻、第４９３７～４２頁、１９９７年）を用いて、ヒトＣＤ１２３（ｈＣＤ１２３）及びカニクイザルＣＤ１２３（ｃＣＤ１２３）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒト及びカニクイザルＣＤ１２３標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のｈＣＤ１２３特異性結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号６及び６５～６６のアンキリン反復ドメインは、ｈＣＤ１２３及びｃＣＤ１２３に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。

【0446】

リボソームディスプレイによるＣＤ１２３特異性アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＣＤ１２３特異性アンキリン反復タンパク質（例えば、配列番号６）の選択は、ヒト（ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ ２６９５１）及びカニクイザル（ｃｙｎｏ）ＣＤ１２３（ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ Ｇ８Ｆ３Ｋ３）のビオチン化細胞外ドメインを標的タンパク質として、上述したようなアンキリン反復タンパク質のライブラリー及び確立したプロトコルを用いるリボソームディスプレイによって実行した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」４、６９～７９（２００７年）を参照）。全ての標的分子をＦｃフォーマットで産生した。計４ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させた（Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。具体的には、カニクイザル標的をラウンド１、２、及び４で使用し、ヒトＣＤ１２３をラウンド３で使用した。過剰の非ＣＤ１２３－Ｆｃタンパク質を使用して、第２ラウンドから選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から３１に一定に減少させた。

【0447】

ｈＣＤ１２３特異性アンキリン反復タンパク質（配列番号６５～６６）の選択は、ヒトＣＤ１２３の細胞外ドメイン（配列番号８８）を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻、第６９～７９頁、２００７年、参照）。ＣＤ１２３標的（Ｅｖｉｔｒｉａ）は、Ｃ末端Ｆｃタグ及びＡｖｉタグを含有し、酵素ＢｉｒＡ－ＧＳＴを使用してビオチン化した。計４ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させた（Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。ストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。

【0448】

高親和性ＣＤ１２３特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ（２００７年）上記引用）。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。ラウンド５及び６では、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数は、それぞれ３０及び３５であった。

【0449】

ＣＤ１２３結合Ｔ細胞エンゲージャ（特許ＵＳ９８２２１８１Ｂ２－７Ｇ３エピトープ）を使用する競合溶出工程を適用することによって、又は選択を実行する前にｈＣＤ１２３特異性アンキリン反復タンパク質（抗体７Ｇ３とは異なるエピトープを有する）をＣＤ１２３標的と共インキュベートすることによって、潜在的なエピトープ空間を拡大するために、更なる２つの更なる選択アプローチを（上記のような）標準的なアプローチの次に行った。適用したアプローチのそれぞれから、ＣＤ１２３に対して結合剤を生成した。

【0450】

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにヒトＣＤ１２３に特異的に結合する
溶液中でｈＣＤ１２３に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、Ｃ末端ＣＤ３結合設計アンキリン反復タンパク質、引き続いてＦｌａｇタグを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクター（ｐＭＰＤＶ０４５）の誘導体にクローニングし、大腸菌のＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６０μｌの成長培地（１％グルコースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び７００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

【0451】

各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、６ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ヒト又はカニクイザルＣＤ１２３、１：３００（最終濃度）の抗－６Ｈｉｓ－Ｄ２ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：３００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ抗体ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：５００希釈物（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で１２０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ヒト及びカニクイザルＣＤ１２３に特異的な数百の異なるアンキリン反復ドメインを明らかにした。ヒト及びカニクイザルＣＤ１２３に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号６、１０２、及び１０３に提供されている。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６（配列番号６）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６３（配列番号１０２）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６４（配列番号１０３）

【0452】

あるいは、各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、４ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ｈＣＤ１２３、１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｄ２抗体ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：１０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で６０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ｈＣＤ１２３に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。ｈＣＤ１２３に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列の例は、配列番号６６である。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５（配列番号６６）。

【0453】

ｈＣＤ１２３に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号６５は、配列番号６６の配列に基づいて更に操作される。

【0454】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３５（配列番号６６）は、表面電荷を変化させるために改変した。Ｎ末端キャッピングモジュールにおいて、アスパラギン酸（１８位）をロイシンで置換し、Ｃ末端キャッピングモジュールにおいて、グルタミン酸（１８位）をグルタミンで置換した。操作された変異体は、汎Ｔ細胞及びＭＯＬＭ－１３細胞を５：１の比で使用したインキュベーションの４８時間後に標準的なＬＤＨ殺傷アッセイにおいて測定された親と比較して、Ｔ細胞殺傷（ＣＤ３結合ＤＡＲＰｉｎ分子と組み合わせて評価された）を低減した。

【0455】

ＣＤ１２３特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的なヒトＣＤ１２３結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。０．１１ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、９６ディープウェルプレートで０．９９ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。３７℃（７００ｒｐｍ）で２時間インキュベートした後、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら（９００ｒｐｍ）３７℃で６時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、ＤＮＡｓｅ Ｉ（２００ユニット／ｍｌ）及びリゾチーム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を補充した５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、６０μＬの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。合計で、８つの個々の発現をプールした後、遠心分離（３，２００ｇ、６０分間、４℃）によって細胞破片を除去した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて上清を濾過した後、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ ＨｉｓＰｕｒコバルトスピンプレートを用いて精製し、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ Ｚｅｂａスピン脱塩プレートを用いてＰＢＳ中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステム上で標準Ｓｅｐｈａｄｅｘ １５０／５カラムを使用して、ＰＢＳ中で可溶性及び単量体であった。

【0456】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４に由来する親和性成熟ＣＤ１２３特異性結合タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６７の生成。
最初に同定されたＣＤ１２３特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び／又はそれからの非常に低いオフ速度を有する変異体が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、１つの最初に同定された結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４（配列番号６５、「親」結合タンパク質）を、親和性成熟の好適な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合ＨＴＲＦによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。簡単に説明する。単一アミノ酸点突然変異変異体を、単一のＮＮＫ縮重コドンを有するプライマーを使用して親プラスミド上で標準的なＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲによって生成して、潜在的な結合位置に２０個全てのアミノ酸を導入した。タンパク質変異体の粗抽出物（ＣＥ）（最後にＮ末端Ｈｉｓタグ、続いて配列番号１０５又は１０６のＣＤ１２３特異性結合ドメインを含有する）を、標準的な大腸菌発現培養物から生成した。希釈したＣＥをビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の配列番号６５の非タグ化親ＣＤ１２３特異性結合ドメインを添加し、ＨＴＲＦシグナルを経時的に測定した。親タンパク質よりも高いＨＴＲＦシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。

【0457】

第１の工程では、操作されたＣＤ１２３特異性ヒットを、最後にＮ末端Ｈｉｓタグ、続いて配列番号１０５又は１０６のＣＤ１２３特異性結合ドメインと配列番号３のＣ末端ＣＤ３特異性結合ドメインとを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。

【0458】

Ｄ．ＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む結合タンパク質の選択
リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ，Ｊ．及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「ＰＮＡＳ」第９４巻第４９３７～４２頁（１９９７年））を用いて、ヒトＣＤ７０（ｈＣＤ７０）に対して結合特異性を有する多くのアンキリン反復タンパク質を、Ｂｉｎｚら（２００４年）の上記引用による記載と同様のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）ライブラリーから選択した。選択されたクローンの組換えヒトＣＤ７０標的への結合は、粗抽出物のホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）によって評価され、数百のｈＣＤ７０特異性結合タンパク質が正常に選択されたことを示した。例えば、配列番号６４のアンキリン反復ドメインは、ｈＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復ドメインを含む、選択された結合タンパク質のアミノ酸配列を構成する。

【0459】

リボソームディスプレイによるＣＤ７０特異性アンキリン反復タンパク質の選択
ｈＣＤ７０特異性アンキリン反復タンパク質の選択は、ヒトＣＤ７０の細胞外ドメイン（配列番号８９）を、標的タンパク質として、上記のアンキリン反復タンパク質のライブラリー、及び確立されたプロトコルとして用いる、リボソームディスプレイ（Ｈａｎｅｓ及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（上記引用））によって実施した（例えば、Ｚａｈｎｄ，Ｃ．、Ａｍｓｔｕｔｚ，Ｐ．、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．、「Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ」第４巻、第６９～７９頁、２００７年、参照）。ＣＤ７０標的（ＡＣＲＯＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）は、Ｃ末端Ｆｃタグを含み、５倍過剰のビオチンを用いて化学的にビオチン化した。計４ラウンドの標準的なリボソーム選択を採用し、標的濃度を減少させ、洗浄ストリンジェンシを増加させて、ラウンド１からラウンド４への選択圧力を増加させた（Ｂｉｎｚら、２００４年、上記引用）。ストレプトアビジン及びニュートラアビジンビーズを使用することによって、各ラウンドにおいて選択解除戦略を適用した。各選択ラウンド後の逆転写（ＲＴ）－ＰＣＲサイクルの数は、結合剤の富化のために、収率に合わせて調整する４５から２８に一定に減少させた。

【0460】

高親和性ＣＤ７０特異性アンキリン反復タンパク質を富化するために、標準リボソームディスプレイ選択（上記）の第４ラウンドからの出力を、選択ストリンジェンシの増加を伴うオフ速度選択ラウンドに供した（Ｚａｈｎｄ（２００７年）上記引用）。最後の標準選択ラウンドを、オフレート選択ラウンドの後に実施して、オフレート選択された結合タンパク質を増幅及び回収した。ラウンド５及び６では、ＲＴ－ＰＣＲサイクルの数は、それぞれ３０及び３５であった。

【0461】

選択されたクローンは、粗抽出物ＨＴＲＦによって示されるようにＣＤ７０に特異的に結合する。
溶液中でｈＣＤ７０に特異的に結合する個々の選択されたアンキリン反復タンパク質を、標準的なプロトコルを用いて、アンキリン反復タンパク質発現大腸菌細胞の粗抽出物を使用するホモジニアス時間分解蛍光測定（ＨＴＲＦ）アッセイによって特定した。リボソームディスプレイによって選択されたアンキリン反復タンパク質クローンを、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクター（ｐＭＰＤＶ２５）の誘導体にクローニングし、大腸菌のＸＬ１－Ｂｌｕｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、ＬＢ－寒天（１％グルコース及び５０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含有）上に播種し、次いで、３７℃で一晩インキュベートした。１６０μｌの成長培地（１％グルコースと５０μｇ／ｍｌのアンピシリンとを含有するＴＢ）を含有する９６ウェルプレートに単一のコロニーを播種し（単一のウェル中に各クローン）、３７℃、８００ｒｐｍで振盪しながら、一晩インキュベートした。アンピシリン５０μｇ／ｍＬを含有する１５０μＬの新鮮なＴＢ培地に、新しい９６ウェルプレート中８．５μＬの一晩培養物を播種した。３７℃及び７００ｒｐｍで１２０分間インキュベートした後、発現をＩＰＴＧ（最終濃度０．５ｍＭ）で誘導し、４時間続けた。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、８μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、１６０μＬのＰＢＳを添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。

【0462】

各溶解したクローンの抽出物を、ＰＢＳＴＢ（０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）及び０．２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、ｐＨ７．４を補充したＰＢＳ）中で、２ｎＭ（最終濃度）ビオチン化ヒトｈＣＤ７０、１：４００（最終濃度）の抗ｓｔｒｅｐ－Ｔｂ ＨＴＲＦ抗体－ＦＲＥＴドナーコンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）、及び１：４００（最終濃度）の抗６Ｈｉｓ－Ｄ２抗体ＦＲＥＴ受容体コンジュゲート（Ｃｉｓｂｉｏ）と一緒に、１：２０００希釈（最終濃度）として３８４ウェルプレートのウェルへ適用し、室温で６０分間インキュベートした。３４０ｎｍの励起波長及び６６５±１０ｎｍの発光フィルタを使用して、Ｔｅｃａｎ Ｍ１０００でＨＴＲＦを読み取った。そのような粗細胞抽出物ＨＴＲＦによる数百のクローンのスクリーニングは、ｈＣＤ７０に特異的なアンキリン反復ドメインを明らかにした。ｈＣＤ７０に特異的に結合する選択されたアンキリン反復ドメインのアミノ酸配列は、１０７、１０８である
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６８（配列番号１０７）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６９（配列番号１０８）。

【0463】

ｈＣＤ７０に対して結合特異性を有する追加のアンキリン反復タンパク質の操作
配列番号６４は、前の工程の選択された設計アンキリン反復ドメインの配列、すなわちＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６９（配列番号１０８）に基づいて操作される。

【0464】

表面電荷を変化させるために、この選択された配列を改変した。Ｎ末端キャッピングモジュールでは、ＲＩＬＬＡＡモチーフをＲＩＬＬＫＡで置換し、アスパラギン酸（１８位）をロイシンで置換した。更に、Ｃ末端キャッピングモジュールについては、セリン（１６位）をグリシンで置換し、グルタミン酸（１８位）をグルタミンで置換して改変した。

【0465】

ＣＤ７０特異性アンキリン反復タンパク質の発現
更なる分析のために、上記のように粗細胞抽出物ＨＴＲＦで特異的なヒトＣＤ７０結合を示す選択されたクローンを、大腸菌細胞で発現させ、標準プロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。０．１１ｍｌの静置一晩培養物（ＴＢ、１％のグルコース、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン；３７℃）を使用して、９６ディープウェルプレートで０．９９ｍＬの培養物（ＴＢ、５０ｍｇ／ｌのアンピシリン、３７℃）に接種した。３７℃（７００ｒｐｍ）で２時間インキュベートした後、培養物を０．５ｍＭ ＩＰＴＧで誘導し、振盪しながら（９００ｒｐｍ）３７℃で６時間インキュベートした。細胞を収集し、ペレットを－２０℃で一晩凍結した後、ＤＮＡｓｅ Ｉ（２００ユニット／ｍｌ）及びリゾチーム（０．４ｍｇ／ｍｌ）を補充した５０μＬのＢ－ＰＥＲＩＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、振盪（９００ｒｐｍ）しながら室温で１時間インキュベートした。次いで、６０μＬの低塩リン酸ナトリウム緩衝液を添加し、細胞片を遠心分離によって除去した（３２２０ｇで１５分間）。合計で、８つの個々の発現をプールした後、遠心分離（３，２００ｇ、６０分間、４℃）によって細胞破片を除去した。ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎフィルタプレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて上清を濾過した後、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ ＨｉｓＰｕｒコバルトスピンプレートを用いて精製し、９６ウェルＴｈｅｒｍｏ Ｚｅｂａスピン脱塩プレートを用いてＰＢＳ中でタンパク質溶液を再緩衝化した。精製されたタンパク質は、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ＨＰＬＣシステム上で標準Ｓｅｐｈａｄｅｘ １５０／５カラムを使用して、ＰＢＳ中で可溶性及び単量体であった。

【0466】

それぞれ親タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６９（配列番号１０８）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６８（配列番号１０７）に由来する親和性成熟ＣＤ７０特異性アンキリン反復タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７０（配列番号１０９）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７１（配列番号１１０）の生成。
最初に同定されたＣＤ７０特異性結合タンパク質の更なる開発において、標的タンパク質に対して非常に高い親和性及び／又はそれからの非常に低いオフ速度を有する結合剤が、親和性成熟を用いて生成された。それにより、２つの最初に同定された結合タンパク質（「親」結合タンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６９）を、親和性成熟の適切な出発点として選択した。親和性成熟手順は、出発点として使用されるアンキリン反復ドメインの各無作為化位置の飽和変異誘発を伴った。親和性成熟手順によって生成された配列を、競合ＨＴＲＦによってより低いオフレートについてスクリーニングした。簡単に説明する。Ｎ末端Ｈｉｓタグを含有するアンキリン反復タンパク質の粗抽出物をビオチン化標的と共にインキュベートした後、過剰の非タグ化親ＣＤ７０特異性結合タンパク質を添加し、ＨＴＲＦシグナルを経時的に測定した。親クローンよりも高いＨＴＲＦシグナルに基づいて同定された有益な変異を、タンパク質工学によって結合タンパク質において組み合わせた。

【0467】

第１の工程では、操作されたＣＤ７０特異性結合ドメインを、最後にＮ末端Ｈｉｓタグ、続いてＣＤ７０特異性結合ドメイン（配列番号１０９又は１１０）及びＣ末端ＣＤ３特異性結合ドメイン（配列番号３）を含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターｐＭＰＴＬＯ８４７の誘導体にサブクローニングした。構築物を大腸菌細胞中で発現させ、標準的なプロトコルに従ってそれらのＨｉｓタグを用いて精製した。タンパク質を、健常ドナーＰＢＭＣ及びＭｏｌｍ－１３－Ｎ１腫瘍細胞（５：１のＥ：Ｔ比）から単離された初代Ｔ細胞を使用して、用量依存的インビトロＴ細胞活性化及び殺傷アッセイについて試験した。４８時間の共培養物のアッセイインキュベーション並びにフローサイトメトリー及びＬＤＨ放出による分析。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７０（配列番号１０９）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７１（配列番号１１０）を、親結合タンパク質と比較して、それぞれ約７倍及び３１倍改善されたＥＣ５０値、並びに分析用サイズ排除クロマトグラフィーによって測定された９５％超の単量体性に基づいて選択した。第２の工程において、ＣＤ７０特異性結合タンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７０（配列番号１０９）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７１（配列番号１１０）を、Ｎ末端Ｈｉｓタグを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターｐＭＰＤＶ０２５の誘導体にサブクローニングし、一価の設計アンキリン反復タンパク質として大腸菌中で発現させ、標準プロトコルに従って精製し、特徴付けた。

【0468】

実施例２：雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける組換えタンパク質の薬物動態分析
雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質の薬物動態分析
本発明のＣＤ３特異的アンキリン反復ドメインが、治療薬の開発に有用であるためにインビボで適切な血清半減期を有し得るかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、ＤＡＲＰｉｎ構築物をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン、続いてＣＤ３特異性結合ドメインの１つを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に上記に記載されるように発現させた。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６（配列番号３９、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７（配列番号４０、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８（配列番号４１、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９（配列番号４２、Ｈｉｓタグ付き（配列番号３３）でそのＮ末端に融合）

【0469】

インビボ投与及び試料採取
ヒト血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインでフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９を、各アンキリン反復融合タンパク質に６匹のマウスの尾静脈に１回の静脈内ボーラス注射として投与した。目標用量レベルは、５ｍＬ／ｋｇの適用容量で１ｍｇ／ｋｇであった。アンキリン反復融合タンパク質を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中に配合した。

【0470】

マウスを、等しい数の動物を有する２つの群に分割した。各マウスから４つの血清試料を収集した。薬学的動態調査のための血液試料を、化合物投与後５分、４時間、２４時間、４８時間、７６時間、９６時間、及び１６８時間に採取した。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取した。

【0471】

血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのＥＬＩＳＡによる生物分析
ＰＢＳ中の１０ｎＭのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）の１ウェル当たり１００μｌを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。１ウェル当たり３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で、０．２５％のカゼイン（ＰＢＳＴ－Ｃ）を補充した３００μｌのＰＢＳＴで、室温（ＲＴ）で１時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌの５ｎｍｏｌ／Ｌのウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。

【0472】

希釈した血清試料（１：５の希釈工程で１：２０～１：３１２５００）又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料（１：３の希釈工程で０及び５０～０．０００８ｎｍｏｌ／Ｌ）の１００μｌを、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間適用した。プレートを上記のように洗浄した。

【0473】

次いで、ウェルを１００μｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、ＰＢＳＴ－Ｃ中１：２０００）と共にインキュベートし、室温、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を５分間使用して、１ｍｏｌ／ＬのＨ₂ＳＯ₄を１００μｌ添加することによって停止させてＥＬＩＳＡを展開した。４５０ｎｍでの吸光度及び６２０ｎｍでの吸光度の差を計算した。試料は、２つの異なるプレートで二連で測定した。図１Ａが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９の血清濃度を、マウスへの単回静脈内投与後の時間の関数として示す。トレースは、化合物のおおよその単一指数関数的除去を示す。

【0474】

薬物動態解析
薬物動態データ解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣｌａｓｔ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２。

【0475】

最大血清濃度（Ｃｍａｘ）及びそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）は、血清濃度－時間プロファイルから直接得られた。血清濃度－時間曲線の下の面積（ＡＵＣｉｎｆ）は、最後のサンプリング点（Ｔｌａｓｔ）までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大への外挿によって決定した。無限大までの外挿は、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して実行され、ここで、λｚは、対数線形回帰によって推定された最終速度定数を示し、Ｃｌａｓｔは、最終対数線形回帰によってＴｌａｓｔで推定された濃度を示す。総血清クリアランス（Ｃｌ＿ｐｒｅｄ）及び見かけの終末相半減期を以下のように計算した。Ｃｌ＿ｐｒｅｄ＝静脈内用量／ＡＵＣｉｎｆ及びｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ。定常状態分布体積Ｖｓｓは、以下によって決定した。Ｖｓｓ＝ｉ．ｖ．投与量・ＡＵＭＣｉｎｆ／（ＡＵＣｉｎｆ）２。ＡＵＭＣｉｎｆは、ＡＵＣｉｎｆの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度－時間曲線の第１の瞬間の総面積を示す。ｎｍｏｌ／Ｌで与えられた濃度に基づいてＰＫパラメータを計算するために、ｍｇ／ｋｇとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してｎｍｏｌ／ｋｇに変換した。表２ａは、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、試験した４つのアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１８、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１９の薬物動態特性の概要を示す。

【0476】

【表2】

【0477】

Ｂ．雌ＢＡＬＢ／ｃマウスにおける多重特異性組換えタンパク質の薬物動態分析
本発明の多重特異性組換え結合タンパク質が、治療薬の開発に有用であるためにインビボで適切な血清半減期を有し得るかどうかを決定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の薬物動態プロファイルを、マウスで分析した。そのために、ＤＡＲＰｉｎ構築物をサブクローニングし、上記のようにして、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、（先の実施例に記載したように１つ又は２つの）半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメイン、続いて、腫瘍関連結合ドメイン及びＣＤ３結合ドメインを含有する、又はＮ末端Ｈｉｓタグ、腫瘍関連結合ドメイン、及びＣＤ３結合ドメイン、続いて、（先の実施例に記載したように１つ又は２つの）半減期延長のためのＨＳＡ結合アンキリン反復ドメインを含有する、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に発現させた。例えば、以下のアンキリン反復タンパク質をコードする発現ベクターを構築した。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０（配列番号８１であり、そのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号３３）が融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３（配列番号８４であり、そのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号３３）が融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１（配列番号８２であり、そのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号３３）が融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４（配列番号８５であり、そのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号３３）が融合）；
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５（配列番号８６であり、そのＮ末端にＨｉｓタグ（配列番号３３）が融合）。

【0478】

インビボ投与及び試料採取
ヒト血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインでフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５を、各アンキリン反復融合タンパク質について６匹のマウスの尾静脈への単回静脈内ボーラス注射として投与した。アンキリン反復タンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液中で製剤化し、１００μｌの適用体積で１ｍｇ／ｋｇで投与した。

【0479】

マウスを、等しい数の動物を有する２つの群に分割した。各マウスから４つの血清試料を収集した。薬学的動態調査のための血液試料を、化合物投与後５分、４時間、２４時間、４８時間、７６時間、９６時間、及び１６８時間に採取した。血液を室温に維持して凝固させ、続いて遠心分離し、血清を採取した。

【0480】

血清試料中のアンキリン反復タンパク質を測定するためのＥＬＩＳＡによる生物分析
ＰＢＳ中の１０ｎＭのポリクローナルヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ａｂ１８）の１ウェル当たり１００μｌを、ＮＵＮＣ Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレートに４℃で一晩コーティングした。１ウェル当たり３００μｌのＰＢＳＴ（０．１％のＴｗｅｅｎ２０を添加したＰＢＳ）で５回洗浄した後、Ｈｅｉｄｏｌｐｈ Ｔｉｔｒａｍａｘ １０００振盪器（４５０ｒｐｍ）で、０．２５％のカゼイン（ＰＢＳＴ－Ｃ）を補充した３００μｌのＰＢＳＴで、室温（ＲＴ）で１時間ウェルをブロックした。プレートを上記のように洗浄した。ＰＢＳＴ－Ｃ中の１００μｌの５ｎｍｏｌ／Ｌのウサギ抗ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）１－１－１抗体を添加し、プレートを軌道振盪（４５０ｒｐｍ）しながら室温（２２℃）で１時間インキュベートした。上記のようにプレートを洗浄した。

【0481】

希釈した血清試料（１：５の希釈工程で１：２０～１：３１２５００）又はアンキリン反復タンパク質標準曲線試料（１：３の希釈工程で０及び５０～０．０００８ｎｍｏｌ／Ｌ）の１００μｌを、４５０ｒｐｍで振盪しながら、室温で２時間適用した。プレートを上記のように洗浄した。

【0482】

次いで、ウェルを１００μｌのマウス抗ＲＧＳ－Ｈｉｓ－ＨＲＰ ＩｇＧ（Ａｂ０６、ＰＢＳＴ－Ｃ中１：２０００）と共にインキュベートし、室温、４５０ｒｐｍで１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄した。１００μｌ／ウェルのＴＭＢ基質溶液を５分間使用して、１ｍｏｌ／ＬのＨ₂ＳＯ₄を１００μｌ添加することによって停止させてＥＬＩＳＡを展開した。４５０ｎｍでの吸光度及び６２０ｎｍでの吸光度の差を計算した。試料は、２つの異なるプレートで二連で測定した。図１Ｂは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５の血清濃度を、マウスへの単回静脈内投与後の時間の関数として示している。トレースは、化合物のおおよその単一指数関数的除去を示す。

【0483】

薬物動態解析
薬物動態データ解析を、Ｐｈｏｅｎｉｘ ６４、Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ、Ｎｏｒｔｈ Ｃａｒｏｌｉｎａの一部としてＷｉｎＮｏｎｌｉｎプログラムのバージョン７．０を使用して、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐａｒｔｎｅｒｓで行った。静脈内ボーラス注射を介して投与された動物の平均濃度－時間データに基づく薬物動態パラメータの計算を、ノンコンパートメント解析（ＮＣＡモデル２００－２０２、ＩＶボーラス、線形台形線形補間）を用いて行った。以下の薬物動態パラメータを計算した。
ＡＵＣｉｎｆ、ＡＵＣ＿％ｅｘｔｒａｐｏｌ、Ｃｍａｘ、Ｔｍａｘ、Ｃｌ＿ｐｒｅｄ、Ｖｓｓ＿ｐｒｅｄ、ｔ１／２。最大血清濃度（Ｃｍａｘ）及びそれらの発生時間（Ｔｍａｘ）は、血清濃度－時間プロファイルから直接得られた。血清濃度－時間曲線の下の面積（ＡＵＣｉｎｆ）は、最後のサンプリング点（Ｔｌａｓｔ）までの線形台形公式及び終末相の単一指数関数的減少を仮定した無限大への外挿によって決定した。無限大までの外挿は、Ｃｌａｓｔ／λｚを使用して実行され、ここで、λｚは、対数線形回帰によって推定された最終速度定数を示し、Ｃｌａｓｔは、最終対数線形回帰によってＴｌａｓｔで推定された濃度を示す。総血清クリアランス（Ｃｌ＿ｐｒｅｄ）及び見かけの終末相半減期を以下のように計算した。Ｃｌ＿ｐｒｅｄ＝静脈内用量／ＡＵＣｉｎｆ及びｔ１／２＝ｌｎ２／λｚ。定常状態分布体積Ｖｓｓは、以下によって決定した。Ｖｓｓ＝ｉ．ｖ．投与量・ＡＵＭＣｉｎｆ／（ＡＵＣｉｎｆ）２。ＡＵＭＣｉｎｆは、ＡＵＣｉｎｆの計算について記載したのと同じ外挿手順を使用して、無限大に外挿された薬物濃度－時間曲線の第１の瞬間の総面積を示す。ｎｍｏｌ／Ｌで与えられた濃度に基づいてＰＫパラメータを計算するために、ｍｇ／ｋｇとして与えられた投与量値をアンキリン反復タンパク質の分子量を使用してｎｍｏｌ／ｋｇに変換した。表２ｂは、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、試験した５つのアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５の薬物動態特性の概要を示す。

【0484】

【表3】

【0485】

上記表２ｂ及び図１に見られるように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１が最長の半減期を示し、続いてＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３であり、Ｃ末端で半減期が延長されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５が最短の半減期を示す。

【0486】

更に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（配列番号９５）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（配列番号９６）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（配列番号９７）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（配列番号９８）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（配列番号９９）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（配列番号１００）の薬物動態プロファイルを、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５と同じ実験設定に従って、マウスにおいて分析した。

【0487】

表２ｃは、１ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の、試験した６つのアンキリン反復タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１の薬物動態特性の概要を示す。

【0488】

【表4】

【0489】

上記表２ｃに見られるように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８が最長の半減期を示し、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９が続き、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７が最短の半減期を示す。

【0490】

実施例３：多重特異性組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数Ｋ_Dの決定
Ａ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ３に対して結合特異性を有する多重特異性組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数（ＫＤ）の決定
組換えヒトＣＤ３標的上の４つの精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、アンキリン反復ドメインに結合するＣＤ３３及びＣＤ１２３、続いて、４つのＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質構築物の１つを含有する、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。

【0491】

簡単に説明すると、ビオチン化ヒトｓｃＣＤ３εγを、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有）中に希釈し、ＮＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に、約７００～１４００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでコーティングした。次いで、アンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３との相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定については６４ｎＭ～４ｎＭの濃度範囲を網羅する段階希釈物のアンキリン反復タンパク質を含有する３００μＬの泳動用緩衝液（０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を注入すること、続いて６０μＬ／分の一定流量で少なくとも１０分間、泳動用緩衝液流を注入すること（オフレート測定）によって測定した。再生は、３０μＬの１０ｍＭグリシンｐＨ２を用いて行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７については結合が弱すぎたが、親和性成熟構築物については、ＣＤ３に対して結合パラメータ（Ｋ_D、オン速度、オフ速度）を決定した。結合平衡には、最も高い試料濃度であっても適切に到達せず、オン速度に対して最適ではない適合をもたらしたため、オン速度（ｋ_on）及び解離定数（Ｋ_D）は、近似としてのみ与えられる。

【0492】

代表例として、図２Ｃは、ＣＤ３３及びＣＤ１２３結合設計アンキリン反復ドメインでフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９について得られたＳＰＲトレースを示す。解離定数（Ｋ_D）を、当業者に既知の標準的な手順を用いて、推定されたオンレート及びオフレートから算出した。選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３との結合相互作用のＫ_D値を、６～３５ｎＭの範囲にあると決定した（表３ａを参照）。

【0493】

【表5】

【0494】

Ｂ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ３３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する組換えアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の決定
組換えヒトＣＤ３３及びＣＤ１２３標的上の２つの精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、本発明の（ＣＤ３３及びＣＤ３に対して結合特異性を有する）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５及び（ＣＤ１２３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、アンキリン反復ドメインに結合するＣＤ３３又はＣＤ１２３、続いて、４つのＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質構築物の１つを含有する、ｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に、上記に記載されるように発現させた。以下の工程を上記Ａに記載したように行った。簡潔に述べると、標的タンパク質としてのヒトＣＤ３３のビオチン化細胞外ドメイン（Ｓｐｅｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓによって提供、ロット番号カタログ番号ＹＣＰ２０４５）をＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２５の評価に使用し、ヒトのビオチン化細胞外ドメイン（ｕｎｉｐｒｏｔ ＩＤ ２６９５１）をＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２６の評価に使用した。

【0495】

選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３３及びＣＤ１２３との結合相互作用のＫ_D値を、下記の表に示す（表３ｂを参照）。

【0496】

【表6】

【0497】

表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ３３、ＣＤ１２３、及び／又はＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の決定
組換えヒトＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０標的上の１６の精製されたアンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ ＸＰＲ３６装置（ＢｉｏＲａｄ）を用いて分析し、当業者に既知の標準的な手順に従って測定を行った。そのために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３６をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及び／又はＣＤ７０結合アンキリン反復ドメイン、続いてＣＤ３特異性アンキリン反復ドメインを含有するｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体に上記のように発現させ、いくつかの構築物についてはヒト血清アルブミン特異性アンキリン反復ドメインによって発現させた。

【0498】

簡単に説明すると、ビオチン化ヒトＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３を、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）含有）中に希釈し、ＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上に、約２００、４６０、及び４５０共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでコーティングした。ＮａＯＡｃ（ｐＨ５．０）中のＨＳＡを、８００ＲＵのレベルまでＧＬＣチップ上に直接固定した。Ｂｉｏ．ＣＤ７０、ＣＤ３３、及びｂｉｏ．ＣＤ１２３は、ビオチン化標的が適用され得る前に、最初に６０００ＲＵのレベルまでニュートラアビジンをコーティングする必要があった。次いで、選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３との相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定のために、１００ｎＭ～２．６ｎＭ（それぞれ１００、４０、１６、６．４、及び２．６ｎＭ）の濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の段階希釈物を含有する３００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）を含有するｐＨ７．４）を注射することによって、１００μｌ／分の一定流量を使用して１２０秒の会合及び１２００秒の解離で測定した。再生は、３０μＬの４ｍＭのグリシン（ｐＨ２）を用いて行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注入（すなわち、ランニング緩衝液のみの注入）を、アンキリン反復タンパク質の注入後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。

【0499】

選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０との結合相互作用のＫ_D値を、以下の表に示す（表３ｃを参照）。

【0500】

【表7】

【0501】

同様に、組換えヒトＣＤ３標的に対して２つの精製アンキリン反復タンパク質の結合親和性を、前述のように分析した。簡単に説明すると、ＮａＯＡｃ ｐＨ４．５中のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４を、約７９０～１５００共鳴単位（ＲＵ）のレベルまでＧＬＣチップ（ＢｉｏＲａｄ）上にコーティングした。次いで、アンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３との相互作用を、マルチトレースＳＰＲ測定については３００ｎＭ～１９ｎＭの濃度範囲を網羅し、ＰＢＳＴ中で希釈した（０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）ヒトｓｃＣＤ３εγ（５６．４ｕＭ）段階希釈物を含有する３００μＬの泳動用緩衝液（０．００５％ Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）を注射すること、続いて、６０μＬ／分の一定流量で少なくとも１０分間、泳動用緩衝液流を注射すること（オフ速度測定）によって測定した。

【0502】

再生は、３０μＬの１０ｍＭグリシンｐＨ２を用いて行った。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注射（すなわち、ランニング緩衝液のみの注射）を、ＣＤ３の注射後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。ＣＤ３に対して結合パラメータ（ＫＤ、オン速度、オフ速度）を、標準ラングミュアフィットモデルを使用することによって決定した。代表的な例として、図２（Ａ及びＢ）は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３（Ａ）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質５４について得られたＳＰＲトレースを示す。

【0503】

【表8】

【0504】

Ｄ．表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によるヒトＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有するアンキリン反復タンパク質の解離定数（Ｋ_D）の決定
組換え標的に対して選択された多重特異性アンキリン反復タンパク質の結合親和性を、ＰｒｏｔｅＯｎ（ＢｉｏＲａｄ）及びＢｒｕｋｅｒ Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ－３２ Ｐｒｏ機器を使用して分析した。測定は、当業者に知られている標準的な手順に従って行った。そのために、本発明のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７をサブクローニングし、Ｎ末端Ｈｉｓタグ、２つのヒト血清アルブミン特異性結合ドメイン及びＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３特異性結合ドメイン、続いて１つのＣＤ３特異性結合ドメインを含むｐＱＥ３０（Ｑｉａｇｅｎ）発現ベクターの誘導体中に上記のように発現させた。

【0505】

簡潔に述べると、ヒト標的ＣＤ７０（配列番号８９；ｈＣＤ７０－Ｆｃ－三量体、ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳＴ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈し、ＰＡＧＤ２００Ｌタンパク質Ａ／Ｇセンサチップ（ＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）上にＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）上に約３６共鳴単位（ＲＵ）のレベルまで捕捉した。次いで、各試験アンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ７０－Ｆｃ三量体との相互作用を、６００ｎＭ～７．４ｎＭの濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の３倍段階希釈物を含有する４００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標））を注射し、続いて、１００μｌ／分の一定流量で２７００秒間、ランニング緩衝液流を注射（オフ速度測定）することによって測定した。３０μｌの１０ｍＭグリシンｐＨ２を使用して再生を行い、ｈＣＤ７０－Ｆｃ－三量体を再注射して、次の測定のための表面を調製した。各相互作用を三連で記録した。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注射（すなわち、ランニング緩衝液のみの注射）を、アンキリン反復タンパク質の注射後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。標準１：１－ラングミュアモデルを使用して、全体的に当てはめられたオン速度及びオフ速度から解離定数（ＫＤ）を計算した。

【0506】

同様に、ヒトｔａｒｇｅｔ＿ｈＣＤ１２３（配列番号８８）をＰＢＳＴ（０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有するＰＢＳ、ｐＨ７．４）で希釈し、Ｂｒｕｋｅｒ Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ－３２ｐｒｏを使用して、Ｂｒｕｋｅｒ ＩｇＧ Ｃａｐｔｕｒｅセンサチップ上で約１７７共鳴単位（ＲＵ）のレベルまで捕捉した。次いで、各試験アンキリン反復タンパク質と標的＿ｈＣＤ１２３との相互作用を、２００ｎＭ～９１ｐＭの濃度範囲を網羅するアンキリン反復タンパク質の段階希釈物を含有する１００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有する）を注射（オン速度測定）し、続いて、２５μｌ／分の一定流量で少なくとも１５００秒間、ランニング緩衝液流を注射（オフ速度測定）することによって測定した。８．３μｌの１０ｍＭグリシン（ｐＨ２）を用いて再生を行い、ｈＣＤ１２３を再注射して、次の測定のために表面を調製した。各相互作用を三連で記録した。空の表面のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注射（すなわち、ランニング緩衝液のみの注射）を、アンキリン反復タンパク質の注射後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。標準１：１－ラングミュアモデルを使用して、全体的に当てはめられたオン速度及びオフ速度から解離定数（Ｋ_D）を計算した。

【0507】

ヒトＣＤ３３との相互作用を測定するために、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７を１０ｍＭ ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．０）で希釈し、ＰｒｏｔｅＯｎ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して約１０００共鳴単位（ＲＵ）（ＳＭＡ５５５）又は１４００Ｒｕｓ（ＰＳＣ４６６）のレベルまでＮＨＳ／ＥＤＣ活性化ＨＣ２００Ｍセンサチップ（ＸａｎＴｅｃ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ ＧｍｂＨ）上に固定化した。エタノールアミンを使用して表面を不活性化した。次いで、試験タンパク質とヒト標的ｈＣＤ３３（配列番号８７）との相互作用を、６６．７ｎＭ～０．８２ｎＭの濃度範囲を網羅するヒト標的ｈＣＤ３３の３倍段階希釈物を含有する４００μｌのランニング緩衝液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％のＴｗｅｅｎ２０（登録商標）を含有する）を注射（オン速度測定）し、続いて、１００μｌ／分の一定流量で５００秒間、ランニング緩衝液流を注射（オフ速度測定）することによって測定した。各測定後、分析物の完全な解離を可能にするために１０分間の休止を導入した。各相互作用を三連で記録した。スポット間のシグナル（すなわち、共鳴単位（ＲＵ）値）及び参照注射（すなわち、ランニング緩衝液のみの注射）を、ヒトｈＣＤ３３の注射後に得られたＲＵトレースから減算した（二重参照）。標準１：１－ラングミュアモデルを使用して、全体的に当てはめられたオン速度及びオフ速度から解離定数（Ｋ_D）を計算した。図２Ｄは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７について得られたＳＰＲトレースを示す。

【0508】

選択されたアンキリン反復タンパク質とヒトＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、及びＣＤ３との結合相互作用のＫ_D値を、以下の表に示す（表４ｂを参照）。

【0509】

【表9】

【0510】

実施例４：Ｔ細胞又は腫瘍細胞結合の決定。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４のＣＤ３Ｔ細胞結合の決定。
ＣＤ３結合の決定は、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査撮像サイトメトリーを使用して、初代ヒトＴ細胞で行った。したがって、ｐａｎ－Ｔ細胞精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から初代Ｔ細胞を単離した。三重特異性フォーマット（ＣＤ３３及びＣＤ１２３結合アンキリン反復ドメインを含む）にフォーマットされたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃８、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃９、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１０、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１１、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１３、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃１４ＵＮ四重特異性フォーマット（ヒト血清アルブミンに特異的に結合する追加のアンキリン反復ドメインを含む）の滴定物を、６００μＭヒト血清アルブミン（生理的血清濃度を模倣するため）の存在下で１ウェル当たり５０，０００個の汎Ｔ細胞と共に４℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ３３又はＣＤ１２３を標的とする２つのベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＡＭＧ３３０及びフロテツズマブを対照として適用した。洗浄後、ＣＤ３結合を、１：１００希釈した抗ペンタ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって検出した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、５μＭのＤＲＡＱ５（Ａｂｃａｍ）によって室温で１５分間対比染色した。遠赤色対比染色細胞上のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合の平均蛍光強度の中央値を、Ｃｅｌｌｉｓｔａソフトウェア（ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してＭｉｒｒｏｒｂａｌｌによって測定し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用してプロットした。

【0511】

図２０Ａ～Ｂに示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７に対して検出可能な結合なしから、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０に対してベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）と同程度に良好な結合までの幅広い親和性を示す。Ｔ細胞へのＣＤ３結合は、ＳＰＲによって測定されるＣＤ３親和性と合致する。追加のＨＳＡ結合ドメインの存在（図３Ｂを参照されたい）は、Ｔ細胞への結合にわずかな影響しか及ぼさなかった。表５ａは、ＥＣ₅₀値によって表される、４つの例示的なアンキリン反復タンパク質のＣＤ３結合親和性を示す。

【0512】

【表10】

【0513】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０のＴ細胞結合の決定。
Ｔ細胞結合の決定は、Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌレーザー走査撮像サイトメトリーを使用して、初代ヒトＴ細胞で行った。したがって、ｐａｎ－Ｔ細胞精製キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から初代Ｔ細胞を単離した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎタンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎタンパク質＃３０の滴定物を、６００μＭヒト血清アルブミン（生理学的血清濃度を模倣するため）の存在下で、１ウェル当たり５０，０００個の汎Ｔ細胞と共に、４℃で３０分間インキュベートした。ＣＤ３３又はＣＤ１２３を標的とする２つのベンチマークＴ細胞性エンゲージャであるＡＭＧ３３０及びフロテツズマブを対照として適用した。洗浄後、ＣＤ３結合を、１：１００希釈した抗ペンタ－Ｈｉｓ Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（Ｑｉａｇｅｎ）によって検出した。４℃で３０分間インキュベートした後、細胞を洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に再懸濁し、５μＭのＤＲＡＱ５（Ａｂｃａｍ）によって室温で１５分間対比染色した。遠赤色対比染色細胞上のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８結合の平均蛍光強度の中央値を、Ｃｅｌｌｉｓｔａソフトウェア（ＳＰＴ Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用してＭｉｒｒｏｒｂａｌｌによって測定し、データを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用してプロットした。

【0514】

表５ｂは、ＥＣ₅₀値によって表される、４つの例示的なアンキリン反復タンパク質の結合親和性を示す。

【0515】

【表11】

【0516】

多重特異性結合タンパク質の腫瘍細胞結合の決定
いくつかの多重特異性タンパク質の腫瘍細胞への結合の決定を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）フローサイトメトリーによって行った。したがって、腫瘍細胞（Ｍｏｌｍ－１３Ｎ１）を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１００’０００細胞で播種した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２を、１００ｎＭから出発して１：５の希釈比で滴定した。腫瘍細胞を希釈したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質で再懸濁し、４℃で６０分間インキュベートした。アッセイは、２％ウシ胎児血清及びヒト血清アルブミン２０μＭ（ＨＳＡ）を含むＰＢＳ中で行った。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質特異性腫瘍細胞結合を、非標識一次抗ウサギＤＡＲＰｉｎ（登録商標）抗体（抗ウサギ１－１－１抗体、ＣｅＰｏｗｅｒ）を２μｇ／ｍｌで添加することによって検出した。続いて４℃で少なくとも３０分間のインキュベーション工程を行った。その後、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で標識した２μｇ／ｍｌの抗ウサギ二次抗体を添加した。同じインキュベーション条件を適用した。最後に、細胞を２回洗浄し、Ｃｙｔｏｆｉｘ固定緩衝液（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）中に室温（ＲＴ）で１５分間再懸濁した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）標識細胞の蛍光強度中央値（ＭＦＩ）を、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８を使用して、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）によって測定した。図２０Ｃは、Ｍｏｌｍ－１３Ｎ１細胞上のＣＤ１２３、ＣＤ３３、及びＣＤ７０を標的とする選択されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質の滴定曲線を示す。

【0517】

表５ｃは、ＥＣ₅₀値によって表される、７つの例示的な多重特異性結合タンパク質の結合親和性を示す。

【0518】

【表12】

【0519】

実施例５：インビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイによる多重特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価
Ａ．ヒト汎Ｔ細胞との共培養におけるＭｏｌｍ－１３標的細胞に対する多重特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
上述の組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカを測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて評価した。

【0520】

したがって、１ウェル当たり５０，０００個の精製された汎Ｔエフェクタ細胞及び５０，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞を、６００μＭのヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で２４時間、選択されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と共に２連で同時インキュベートした（Ｅ：Ｔ比１：１）。細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２５０マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒトＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。

【0521】

図３に示すように、（Ａ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、（Ｂ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８、（Ｃ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及び（Ｄ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０は、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）に匹敵する特異性短期Ｔ細胞性活性化を誘導した。更に、Ｔ細胞活性化のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０は、単一標的化対照組換えタンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０（ＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１（ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２（ＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３（ＣＤ７０に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４４（ＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５（ＣＤ７０に対して結合特異性を有する）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４６（ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）と比較した場合、明確なアビディティ獲得を示す。

【0522】

更に、いくつかの多重特異性組換えタンパク質を、今度は半減期延長結合ドメインを有する同様のアッセイにおいて試験し、分子の効力に対する当該半減期延長の影響を評価した。（Ａ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を、２つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン（それぞれ、ＣＤ１２３及びＣＤ３３）及びＮ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する半減期フォーマット化ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較し、（Ｂ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を、２つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン（それぞれ、ＣＤ７０及びＣＤ３３）及びＮ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する半減期フォーマット化ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似物タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似物タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較し、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を、３つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン（それぞれ、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３）及びＮ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する半減期フォーマット化ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）、及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似物タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した。図４に見られるように、半減期延長結合ドメインの付加は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７の場合には少なくとも２０分の１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９の場合には４分の１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の場合には１０分の１未満のわずかな効力低下をもたらす。

【0523】

更に、ＣＤ３、ＣＤ３３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する多重特異性アンキリン反復タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカを測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて評価した。特異性及び効力を、既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブを、ＣＤ３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する組換えタンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２３、ＣＤ３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する組換えタンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４の両方とそれぞれ比較した。

【0524】

簡潔には、１ウェル当たり５０，０００個の精製汎Ｔエフェクタ細胞及び５０，０００個のＭＯＬＭ－１３標的細胞を、組換えタンパク質又は対照ベンチマーク分子（フロテツズマブ及びＡＭＧ３３０）の段階希釈物と、２連で、６００μＭヒト血清アルブミンの存在下、３７℃で２４時間、共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比１：１）。細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２５０マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｓｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒトＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。図２１に示すように、ＣＤ３、ＣＤ３３、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有し、したがってＭＯＬＭ－１３上の２つの腫瘍特異性標的に結合するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８は、ベンチマーク分子に匹敵する特異性短期Ｔ細胞活性化を誘導したが、腫瘍特異性標的のうちの１つ（ＣＤ３３又はＣＤ１２３）のみにそれぞれ結合するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２４は、効力の１０～１００分の１の低下を示した。

【0525】

同様の実験設定において、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１もまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカを測定するＦＡＣＳによって評価した。簡単に説明すると、１ウェル当たり８０，０００個の精製された汎Ｔエフェクタ細胞及び２０，０００個のＭｏｌｍ－１３又は標的細胞を、２０μＭヒト血清アルブミンの存在下、３７℃で４８時間、選択された試験タンパク質の段階希釈物と２連で同時インキュベートした（Ｅ：Ｔ比４：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒト－ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。

【0526】

図５１Ａに示すように、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する試験ＤＡＲＰｉｎタンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、予想通り強力なＴ細胞活性化を誘導した（Ｍｏｌｍ－１３に対してＥＣ５０はそれぞれ２６．１ｐＭ及び１０．４ｐＭ）。図５１Ａに示すＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１は、予想通りの効力を示し、ＥＣ５０値に関して互いにおよそ５倍の差がある。

【0527】

更に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７はまた、陰性対照化合物として使用される非結合設計アンキリン反復タンパク質と比較して（同じ実験設定で）試験した。簡潔には、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎Ｔエフェクタ細胞及び２０，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞を、２０μＭヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で４８時間、選択されたタンパク質の段階希釈物と２連で共インキュベートした（培養汎Ｔ細胞についてＥ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒトＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。

【0528】

図５１Ｂに示すように、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する試験ＤＡＲＰｉｎタンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、対応する陰性対照と比較して、強力かつ特異的なＴ細胞活性化（それぞれＭｏｌｍ－１３に対してＥＣ５０ ２３．３ｐＭ）を誘導した。それぞれ腫瘍特異性標的又はＣＤ３のいずれかにのみ結合する陰性対照タンパク質は、ＣＤ２５活性化マーカのアップレギュレーションを示さなかった。

【0529】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６はまた、既知のベンチマーク分子フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ３３０類似物と比較して（同じ実験設定で）評価した。図５１Ｃに示すように、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する（したがって、３つの腫瘍特異性標的に結合する）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、強力かつ特異的なＴ細胞活性化を誘導した。

【0530】

Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞との共培養におけるＭｏｌｍ１３ ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）標的細胞に対する多特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカを測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイにおいて評価した。このアッセイでは、汎Ｔ細胞を、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して野生型標的発現を有するＭｏｌｍ－１３細胞、並びに同じ標的に対して様々なノックアウトの組み合わせ（Ｍｏｌｍ１３ ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）標的細胞）からなる腫瘍細胞と共培養した（図５１Ｄ及び図５１Ｅ）。

【0531】

このため、１ウェル当たり１００，０００個の精製された汎Ｔエフェクタ細胞及び２０，０００個の標的細胞を、２０μＭのヒト血清アルブミンの存在下で、３７℃で４８時間、選択されたタンパク質の段階希釈物と２連で同時インキュベートした（Ｅ：Ｔ比５：１）。４８時間後、細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒト－ＣＤ ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。

【0532】

図５１Ｄ及び５１Ｅでは、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、及びＣＤ３に特異的なＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の効力（Ｔ細胞活性化）が、様々な標的ノックアウトの組み合わせを有するＭｏｌｍ－１３腫瘍細胞の存在下で示されている。最も高い効力は、３つ全ての標的が同時発現される場合（曲線１）、及び更に２つの標的が同時発現される場合（曲線２～４）に、示される両方の分子について到達される。効力は、Ｔ細胞を、ＣＤ３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ７０＋などの単一標的発現腫瘍細胞と共培養すると、最大１０～１００分の１に低下する（曲線５～７）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、ＣＤ３３＋単一発現腫瘍細胞に対して同様のＥＣ５０値を示すが、全てのノックアウト細胞株に対して同等の有効性に達するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７と比較して有効性が低い。

【0533】

実施例６：組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質によって誘導される標的特異性短期腫瘍細胞殺傷のＬＤＨ細胞障害性アッセイによる評価
Ａ．ヒト汎Ｔ細胞との共培養におけるＭｏｌｍ－１３標的細胞に対する多重特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
２つ又は３つの異なる腫瘍関連抗原に対して結合特異性を有する多重特異性組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７～＃１４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０の特異性及び効力を、ＬＤＨ放出によるインビトロ短期細胞障害性アッセイによって評価した。

【0534】

エフェクタ細胞及び標的細胞を、６００μＭのヒト血清アルブミン（生理学的濃度を模倣するため）の存在下で、５：１のＥ：Ｔ比で９６ウェルプレート中、２連で共インキュベートした。ｐａｎ－Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を使用することによって、ヒトＰＢＭＣから付着していない（ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ）Ｔ細胞を単離した。１ウェル当たり１００，０００個の精製汎Ｔ細胞（エフェクタ細胞）と２０，０００個のＭｏｌｍ－１３細胞（標的細胞）を、選択した多重特異性組換えタンパク質、対照ベンチマーク分子又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む対照の段階希釈物と３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、１ウェル当たり１００μｌの上清及び１ウェル当たり１００μｌのＬＤＨ反応混合物（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を３０分間インキュベートした。吸光度を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏリーダーによって４９２ｎｍ～６２０ｎｍで測定した。バックグラウンド補正後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＯＤ値をプロットした。

【0535】

図２２Ａに示すように、半減期延長のないＤＡＲＰｉｎタンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９は、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０）に匹敵する腫瘍細胞殺傷を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０は、１０～１００分の１の効力を示す。図２２Ｂの半減期が延長されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０～１４は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約４～７０分の１の低減を示す。

【0536】

図５に示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３０は、ベンチマーク分子ＡＭＧ３３０及びフロテツズマブに匹敵する標的細胞殺傷活性を示す。更に、それらは、単一標的化対照組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０（ＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１（ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４２（ＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４３（ＣＤ７０に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４４（ＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４５（ＣＤ７０に対して結合特異性を有する）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４６（ＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）と比較した場合に、明確なアビディティ獲得を示す。

【0537】

更に、多重特異性組換えタンパク質を、今度は半減期延長結合ドメインを有する同様のアッセイにおいて試験し、分子の効力に対する当該半減期延長の影響を評価した。２つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン（それぞれ特異性結合ドメイン（それぞれＣＤ１２３及びＣＤ３３）及び１つの半減期延長ドメインを有しＮ末端に位置するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４７を、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４８）及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４９）と比較し、２つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン（それぞれＣＤ７０及びＣＤ３３）及びＮ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５０を、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５１）及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５２）と比較し、３つの腫瘍抗原特異性結合ドメイン（それぞれＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３）及びＮ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５３を、Ｎ末端に位置する２つの半減期延長ドメインを有する類似タンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５４）及びＣ末端に位置する１つの半減期延長ドメインを有する類似物のタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５５）と比較した。図６に見られるように、半減期延長結合ドメインの付加は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７の場合には少なくとも２０分の１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９の場合には４分の１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の場合には１０分の１未満のわずかな効力低下をもたらす。

【0538】

同じ実験設定において、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１も評価した。

【0539】

図５２Ａに示すように、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する試験タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、予想通り強力な腫瘍細胞殺傷を誘導する（Ｍｏｌｍ－１３のＥＣ５０、それぞれ７．１ｐＭ及び１．６ｐＭ）一方で、図５１Ａに示されるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１は、ＥＣ５０値に関して互いに５～１０倍の差があり、予想通りの効力を示す。

【0540】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７はまた、陰性対照化合物として使用される非結合設計アンキリン反復タンパク質と比較して試験した。図５２Ｂに示すように、試験タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、対応する陰性対照と比較した場合、汎Ｔ細胞の存在下で強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示す（Ｍｏｌｍ－１３上のＩＣ５０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６：４．６ｐＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７：１．３ｐＭ）。陰性対照として設計アンキリン反復タンパク質は、腫瘍特異性標的（又はＣＤ３）のいずれかにのみ結合し、予想通り、使用した最大濃度で腫瘍細胞殺傷をほとんどもたらさない。

【0541】

更に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６を、フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ３３０類似物の既知のベンチマーク分子と比較して評価した。図５２Ｃに示すように、試験したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、ヒト汎Ｔ細胞の存在下で強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示す。フロテツズマブＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の効力は同等であるが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６のＥＣ５０値は、試験したフロテツズマブ及びＡＭＧ３３０よりも低い。

【0542】

Ｂ．ヒト汎Ｔ細胞との共培養におけるＭｏｌｍ１３ ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）標的細胞に対する多特異性組換えタンパク質の効力及び特異性の評価。
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の特異性及び効力を、ＬＤＨ放出を測定することによって、インビトロ短期ＬＤＨ細胞毒性アッセイにおいて評価した。このアッセイにおいて、汎Ｔ細胞を、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して野生型標的発現を有するＭｏｌｍ－１３細胞、並びに同じ標的に対する様々なノックアウトの組み合わせ（Ｍｏｌｍ１３ ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）標的細胞）からなる腫瘍細胞と共培養した（図５２Ｄ）。

【0543】

このため、１ウェル当たり１００，０００個の精製汎Ｔ細胞（エフェクタ細胞）と２０，０００個のＭｏｌｍ－１３ ＫＯ細胞（標的細胞）を、選択したＣＤ３特異性換えタンパク質、対照ベンチマーク分子又は１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む対照の段階希釈物と３７℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーション後、細胞をスピンダウンし、１ウェル当たり１００μｌの上清及び１ウェル当たり１００μｌのＬＤＨ反応混合物（ＬＤＨ検出キット；Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を３０分間インキュベートした。吸光度を、ＴＥＣＡＮ ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ１０００Ｐｒｏリーダーによって４９２ｎｍ～６２０ｎｍで測定した。バックグラウンド補正後、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用してＯＤ値をプロットした。図５２Ｄに示すように、３つ全ての標的が共発現される場合（曲線１）、及び更に２つの標的が共発現される場合（曲線２～４）、試験タンパク質についての最も高い効力に達する。効力は、Ｔ細胞を、ＣＤ３３＋、ＣＤ１２３＋、ＣＤ７０＋などの単一標的発現腫瘍細胞と共培養すると、最大１０～１００倍低下する（曲線５～７）。更に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６では、ＣＤ３３＋細胞に対して有効性も低下する。

【0544】

実施例７：３つの腫瘍関連抗原を標的とする多重特異性組換えタンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１による腫瘍細胞殺傷の評価。
腫瘍細胞殺傷に対するＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の活性を分析するために、エフェクタ細胞（汎Ｔ細胞、１００，０００細胞）及びＭｏｌｍ１３腫瘍細胞（２０，０００細胞）を、５：１のＥ：Ｔ比で９６ウェルプレートに播種した。汎Ｔ細胞をＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で染色した後、播種して、ＦＡＣＳ分析中に腫瘍細胞からの分化を可能にした。示された分子の段階希釈物の存在下での共培養の４８時間後、フローサイトメトリーによって腫瘍細胞殺傷について試料を分析した。細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で染色し、４℃で３０分間インキュベートした。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。腫瘍細胞殺傷は、残存するＬ／Ｄｎｅｇ／ＣＴＶｎｅｇ細胞の絶対数によって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。

【0545】

図７は、ベンチマーク対照分子（既知のベンチマークＴ細胞性エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を示す。データは、腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１が、臨床ベンチマークと比較した場合に同様の効力及び有効性を発揮することを示す。

【0546】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１はまた、Ｍｏｌｍ１３ ＣＲＩＳＰＲノックアウト（ＫＯ）細胞上で同様に試験して、分子の機能性を調査した。図８に見られるように、曲線７は、３つ全ての標的（ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３）を発現するＭｏｌｍ１３親細胞を表す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１は、ここで完全な効力を示す。曲線４～６は、２つの標的のみが依然として発現されていることを意味する単一ＫＯ細胞を表す。ここで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１は依然として活性であり、腫瘍不均一性に対抗する可能性を示唆している。曲線１～３は、二重ＫＯ細胞を表し、１つのみの標的が健常組織区画を模倣するために依然として発現されていることを意味する。ここで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１は有意に活性が低く、健常組織に対して選択性が改善されていることを意味する。要約すると、図７は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１が、腫瘍不均一性に対抗し、選択性を改善する可能性を有することを示す。

【0547】

実施例８：ヒトエキソビボ全血ループモデルにおけるサイトカイン放出に対する多重特異性結合タンパク質の効果
全血ループ系は、血液と薬物試料との間の相互作用（サイトカイン放出に対して効果を含む）を試験するために使用される。血液ループ系は、血中の免疫細胞、免疫グロブリン、並びにインタクトな補体及び凝固カスケード系の両方を独自に含む（Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ａ．Ｋ．ら、Ｉｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ（２０１８年）５４、１～１１頁）。このシステムは、凝固を回避するために回転を維持される新鮮なヒト全血に依存し、ヒト血液循環を模倣するモデルを表す。

【0548】

Ａ．組換え結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０を、２つの既知の対照ベンチマークＴ細胞性エンゲージャ、ＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物と共に、全血ループ系において４つの異なる濃度で評価した（ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物：１０ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０１ｎＭ及び０．００１ｎＭ；ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０：１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ及び０．０１ｎＭ）。
全血ループ系において、サイトカイン放出を、０時間、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間の時点で分析した。この試験では、サイトカイン放出のために、ＰＢＳを陰性対照として使用し、ＡＭＧ３３０類似物／及びフロテツズマブ類似物をベンチマーク対照として使用した（Ｔ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）。

【0549】

薬物試料は、以下の血中濃度を得るように調製した。ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物；１０ｎＭ、０．１ｎＭ、０，０１ｎＭ、及び０．００１ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０；１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ、及び０．０１ｎＭ。滅菌ＰＢＳをビヒクルとして、並びに各ループに添加される１００μｌの最終体積を得るための試験試料の希釈のために使用した。残りの試験試料溶液は廃棄した。

【0550】

ループ系中の全ての材料は、表面をヘパリン処理した。凝固を防止するために、血液をプラスチックチューブ中で回転するようにセットし、ここで、チューブの内側、実験の前に独特のヘパリン結合体で予めコーティングした。コーティングは、血液中への高い抗凝固剤添加を必要とせずに血液が循環することを可能にする。新鮮な全血を２人の健常ボランティア（Ｄ１、Ｄ２）から採取した。血液採取直後に、血液をプレコートプラスチックチューブに移してループを形成した後、以下の設計に従って試験アイテムを投与した。
１．ビヒクル（ＰＢＳ）
２．ＡＭＧ３３０類似物０．００１ｎＭ
３．ＡＭＧ３３０類似物０．０１ｎＭ
４．ＡＭＧ３３０類似物０．１ｎＭ
５．ＡＭＧ３３０類似物１０ｎＭ
６．フロテツズマブ類似物０．００１ｎＭ
７．フロテツズマブ類似物０．０１ｎＭ
８．フロテツズマブ類似物０．１ｎＭ
９．フロテツズマブ類似物１０ｎＭ
１０．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７ ０．０１ｎＭ
１１．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７ ０．１ｎＭ
１２．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７ １ｎＭ
１３．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７ １０ｎＭ
１４．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８ ０．０１ｎＭ
１５．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８ ０．１ｎＭ
１６．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８ １ｎＭ
１７．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８ １０ｎＭ
１８．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９ ０．０１ｎＭ
１９．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９ ０．１ｎＭ
２０．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９ １ｎＭ
２１．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９ １０ｎＭ
２２．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０ ０．０１ｎＭ
２３．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０ ０．１ｎＭ
２４．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０ １ｎＭ
２５．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０ １０ｎＭ

【0551】

続いて、ループを回転するように設定し、各ドナーについて、２６個のループのセットを２つの平行回転プラットフォーム上に分割した。

【0552】

２人の健常ドナー（１８歳以上の男性）を募集した（献血から７日以内に急性感染がなく、ＮＳＡＩＤ又は任意の種類のコルチコステロイドの摂取がない）。

【0553】

採血後に直接保存された各ドナーからの新鮮な血液（ゼロ時点試料として記載される）を、血漿中に処理し、サイトカイン分析に含めた。ループを、試験物質及びＥＤＴＡの添加の４時間後、８時間後、２４時間、及び４８時間後にサンプリングした（血液中の濃度：１０ｍＭ）を各試料に添加して、サンプリング時点で反応を停止させた。ループを、サイトカイン放出及びフローサイトメトリー分析のために、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間でサンプリングした。血漿試料を遠心分離によって調製し、アリコートに分け、分析まで－６０℃以下で保存した。

【0554】

サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα）を、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ＭＳＤからのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用して測定した（図１１、１２）。サイトカイン分析のための試料を、０、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間の時点で収集した。血液試料を血漿に加工し、分析まで－６０℃以下で保存し、分析は、本試験では試料収集から２２日以内に行った。試料を１：４、１：８、１：１６、１：３２、又は１：１００に希釈し、製造業者の指示に従って二連で実行した。

【0555】

検出下限（ＬＬＯＤ）をＭＳＤソフトウェアによって計算し、０較正物質（標準－８）を超える２．５ｘＳＤとして定義した。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準－１のシグナル値からＭＳＤソフトウェアによって計算される。定量化の下限及び上限（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱ）をＭＳＤによって検証し、標準曲線及び希釈標準の回収率から２０％の精度及び８０～１２０％の精度で計算する。ＭＳＤからのＩＦＮγ及びＴＮＦαについての３つのレベルの多分析物対照（ロット番号Ａ００Ｃ０６４０、Ａ００Ｃ０６４１、Ａ００Ｃ０６４１）を使用して、複数回の実行にわたる精度及び正確度を評価した。対照及び試験試料を二連で行った。対照の典型的な許容基準は、ＣＶ＜２０％である。この試験において、全ての実行間ＣＶ値は２０％未満であった。

【0556】

サイトカインを、全血ループ系において、０（ゼロ）、４時間、８時間、２４時間及び４８時間の時点で測定した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０及び対照に応答したサイトカインＩＦＮγ及びＴＮＦαの濃度は、２人のドナーの経時的な平均値、並びにＭＳＤソフトウェアによって計算された０ｐｇ／ｍｌを超える全ての値についての生の平均濃度データとして、図２７及び２８に示す。サイトカイン産生は、５０ｐｇ／ｍｌ以下の値については低、５０ｐｇ／ｍｌ超～５００ｐｇ／ｍｌ以下の値については中、５００ｐｇ／ｍｌ超～５０００ｐｇ／ｍｌ以下の値については高と記載する（任意分類）。

【0557】

ＩＦＮγのレベル
ループ系において、ＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物は、２つの最も高い濃度（１０ｎＭ及び０．１ｎＭ）で高レベルのＩＦＮγを誘導したが、０．０１ｎＭでは、レベルは、ＡＭＧ３３０類似物では中等度から高度であり、フロテツズマブ類似物では低度から中等度であった。最低濃度（０．００１ｎＭ）での両ベンチマークＴ細胞エンゲージャについて、ＩＦＮγレベルは低かった（図２７）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７群ではＩＦＮγレベルが低く、最高濃度（１０ｎＭ）のみがビヒクルの上に認められ、８時間でピークを示した（平均３４．８ｐｇ／ｍｌ）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８～１０を用いたループにおけるＩＦＮγレベルは、４時間後に１０ｎＭピークで高く（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８について平均６７５８．６ｐｇ／ｍｌ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９について平均１０９８８．６ｐｇ／ｍｌ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０について平均１８９７２．３ｐｇ／ｍｌ）、２４時間後に１ｎＭピークであり（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８について平均３９１４．４ｐｇ／ｍｌ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９について平均６４８２．０ｐｇ／ｍｌ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０について平均４５１１．３ｐｇ／ｍｌ）、２４時間後に０．１ｎＭピークで低～高（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８について平均２２２．４ｐｇ／ｍｌ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９について平均７１０．１ｐｇ／ｍｌ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０について平均３２６．４ｐｇ／ｍｌ）であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０の最低濃度（０．０１ｎＭ）では、ＩＦＮγレベルは低く、４つ全ての時点でビヒクルと同等であった。

【0558】

ＴＮＦαのレベル
ＩＦＮγと同様に、高いＴＮＦαレベルが、１０ｎＭでＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物において認められ、ＡＭＧ３３０類似物では２４時間後にピーク（平均７６８０．９ｐｇ／ｍｌ）、フロテツズマブ類似物では４時間後にピーク（平均４５９４．１ｐｇ／ｍｌ）であった（図２８）。０．１ｎＭでは、ＴＮＦαレベルは高く、ＡＭＧ３３０類似物のレベルでは２４時間後にピークに達し（平均６１５９．６ｐｇ／ｍｌ）、フロテツズマブ類似物のレベルでは８時間後にピークに達した（平均４０７７．３ｐｇ／ｍｌ）。０．０１ｎＭでは、ＴＮＦαレベルは、ＡＭＧ３３０類似物では中等度から高度であったが（２４時間後のピークは平均１８１３．９ｐｇ／ｍｌ）、フロテツズマブ類似物では、レベルは低度から中等度であった（２４時間後のピークは１４１．９ｐｇ／ｍｌ）。０．００１ｎＭでのＡＭＧ３３０類似物及びフロテツズマブ類似物におけるＴＮＦαレベルは低く、ビヒクル群と同等であった。ＴＮＦαレベルは、全ての４つの時点で全てのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７群において低く、１８．５ｐｇ／ｍｌで４８時間後にピークに達した最高濃度は別として、全てがビヒクルと同等であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８～１０を用いたループにおけるＴＮＦαレベルは、それぞれ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８については２４時間後（平均２７３２．８ｐｇ／ｍｌ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９～１０については８時間後（平均４６７１．９ｐｇ／ｍｌ及び６０２６．４ｐｇ／ｍｌ）にピークに達する１０ｎＭで中～高レベルであった。１ｎＭでは、ＴＮＦαレベルは中～高いレベルであり、２４時間後にピークに達した（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８では２０４６．０ｐｇ／ｍｌ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９では３２８８．６ｐｇ／ｍｌ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０では２５２２．７ｐｇ／ｍｌの平均）。０．１ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８～１０では、ＴＮＦαレベルは、４時間及び８時間の時点で低～中であったが、２４～４８時間では、レベルは中～高であった（２４時間後のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８のピークは８８．３ｐｇ／ｍｌ、４８時間後のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９のピークは８００．７ｐｇ／ｍｌ、２４時間後のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０のピークは１３８２．８ｐｇ／ｍｌ）。最低濃度（０．０１ｎＭ）では、全てのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８～１０群は、４つの時点全てでビヒクル群と同等であった。

【0559】

全体として、既知のベンチマーク対照群（10nM、0.1nM及び0.01nM）及びDARPin（登録商標）#8～10群（10nM、1nM及び0.1nM）では、4つの時点全てにおいて、ビヒクルよりも高いレベルの全てのサイトカイン（IFNγ及びTNFα）が観察された。DARPin（登録商標）#7（全ての濃度）、AMG330類似物及びフロテツズマブ類似物（0.001nM）、並びにDARPin（登録商標）#8～10（0.01nM）に応答して、明確なサイトカイン放出は観察されなかった。これは、10倍高い濃度のDARPin（登録商標）#8～10が、参照分子AMG330類似物及びフロテツズマブ類似物によって誘導されるサイトカイン放出を一致させるために適用される必要があることを示唆し得る。更に、これは、DARPin（登録商標）#8～10化合物による、より管理可能なサイトカイン放出を示唆する。

【0560】

Ｂ．組換え結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を、既知の対照ベンチマークＴ細胞エンゲージャのフロテツズマブと共に、全血ループ系において３つの異なる濃度で評価した。
全血ループ系において、サイトカイン放出を、0時間、2時間、4時間、8時間、及び24時間の時点で分析した。この試験では、サイトカイン放出について、PBSを陰性対照として使用し、フロテツズマブをベンチマーク陽性対照（CD123に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）として使用した。

【0561】

薬物試料及び陽性対照を調製して、血液中の以下の濃度を得た：０．００５ｎＭ、０．１ｎＭ、及び２ｎＭ。滅菌ＰＢＳをビヒクルとして、並びに各ループに添加される１００μｌの最終体積を得るための試験試料の希釈のために使用した。残りの試験試料溶液は廃棄した。

【0562】

ループ系中の全ての材料は、表面をヘパリン処理した。凝固を防止するために、血液をプラスチックチューブ中で回転するようにセットし、ここで、チューブの内側、実験の前に独特のヘパリン結合体で予めコーティングした。コーティングは、血液中への高い抗凝固剤添加を必要とせずに血液が循環することを可能にする。新鮮な全血を３人の健常ボランティア（Ｄ１～Ｄ３）から採取した。血液採取直後に、血液をプレコートプラスチックチューブに移してループを形成した後、以下の設計に従って試験アイテムを投与した。
１．ビヒクル（ＰＢＳ）
２．フロテツズマブ０．００５ｎＭ
３．フロテツズマブ０．１ｎＭ
４．フロテツズマブ２ｎＭ
５．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７ ０．００５ｎＭ
６．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７ ０．１ｎＭ
７．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７ ２ｎＭ
８．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９ ０．００５ｎＭ
９．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９ ０．１ｎＭ
１０．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９ ２ｎＭ
１１．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１ ０．００５ｎＭ
１２．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１ ０．１ｎＭ
１３．ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１ ２ｎＭ

【0563】

続いて、ループを回転するように設定し、各ドナーについて、２６個のループのセットを２つの平行回転プラットフォーム上に分割した。

【0564】

３人の健常ドナー（１８歳以上の女性２人及び男性１人）を募集した（献血から７日以内に、急性感染がなく、ＮＳＡＩＤ又は任意の種類のコルチコステロイドの摂取がない）。

【0565】

採血後に直接保存した新鮮な血液（ゼロ時点試料として記載）を血液学的測定に使用した。更に、ゼロ時点で採取した血液を血漿に加工し、サイトカイン分析に含めた。試料を、試験物質及びＥＤＴＡの添加の２、４、８、及び２４時間後に各ループから抽出し、ＥＤＴＡ（血液中の濃度：１０ｍＭ）を各試料に添加して、サンプリング時点で反応を停止させた。血液学及びサイトカイン放出分析のために、２、４、８、及び２４時間目にループをサンプリングした。血漿試料を遠心分離によって調製し、アリコートに分け、分析まで－６０℃以下で保存した。

【0566】

Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）からのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用して、サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα）を測定した。サイトカインのレベルは、経時的に平均値として示される（図９、図１０、図１１、図１２、図１３）。サイトカイン分析のための試料を、０、２、４、８、及び２４時間の時点で収集した。血液試料を血漿に加工し、分析まで－６０℃以下で保存した。分析は、本試験では試料収集から８日以内に行った。試料を１：４（又は１：１００）に希釈し、製造業者の指示に従って二連で行った。

【0567】

検出下限（ＬＬＯＤ）をＭＳＤソフトウェアによって計算し、０較正物質（標準－８）を超える２．５ｘＳＤとして定義した。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準－１のシグナル値からＭＳＤソフトウェアによって計算される。定量化の下限及び上限（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱ）をＭＳＤによって検証し、標準曲線及び希釈標準の回収率から２０％の精度及び８０～１２０％の精度で計算する。希釈血漿試料の測定平均濃度値がＬＬＯＱ未満又はＵＬＯＱ超である場合、データをＬＬＯＱ未満又はＵＬＯＱ超と定義した。データを希釈係数（４×又は１００×）によって更に変換して、計算された平均濃度値を得た。生データは、全ての試料の計算された平均濃度値に対応した。定量可能な範囲内の複製の許容基準を、係数値（ＣＶ）≦２０％として設定した。全ての試料は、複製について２０％以下のＣＶ値を有していた。

【0568】

サイトカインを、全血ループ系において０（ゼロ）、２、４、８、及び２４時間の時点で測定した。薬物試料に応答したサイトカインＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、及びＴＮＦαの濃度を、３人のドナーの経時的な平均値として図９、図１０、図１１、図１２、図１３に示す。サイトカイン産生は、５０ｐｇ／ｍｌ以下の値については低、５０ｐｇ／ｍｌ超～５００ｐｇ／ｍｌ以下の値については中、５００ｐｇ／ｍｌ超～５０００ｐｇ／ｍｌ以下の値については高と記載する（任意分類）。

【0569】

ＩＦＮγのレベル
ＩＦＮγは、２ｎＭ及び０．１ｎＭのフロテツズマブを含む試料において高レベル（５００ｐｇ／ｍｌ超と定義される）で誘導され、２ｎＭで平均１２４３．８から４８９３７．８ｐｇ／ｍｌまで、０．１ｎＭで４８５．７から３１３３５．２ｐｇ／ｍｌまで経時的に増加したが、０．００５ｎＭのフロテツズマブを含む試料では、ＩＦＮγレベルは、平均１１．９から２０６４．８ｐｇ／ｍｌまで経時的に低から高に上昇した（図９）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７（２ｎＭで）は、平均２３３．５から６１３１．５ｐｇ／ｍｌまで（２～２４時間で）経時的に増加する中～高レベルのＩＦＮγを誘導した。０．１ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＩＦＮγのレベルは、ビヒクルと比較して、平均１０．２から３３４．３ｐｇ／ｍｌまで（２～２４時間）低レベルから中レベルに増加した。０．００５ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＩＦＮγのレベルは低く、全てのドナーにおいて４つの時点全てでビヒクルと同様であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を有する試料では、ＩＦＮγのレベルは低く、０．００５ｎＭ及び０．１ｎＭでビヒクルと同様であったが、２ｎＭでは、レベルは、２～２４時間の時点で平均３．１から５５．２ｐｇ／ｍｌまでビヒクルよりもわずかに増加した。２ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を有する試料では、ＩＦＮγのレベルは、２時間での平均２３．４ｐｇ／ｍｌから２４時間での５１１．０ｐｇ／ｍｌまで経時的に増加したが、レベルは低く、０．１ｎＭ及び０．００５ｎＭでは４つの時点全てでビヒクルと同様であった。

【0570】

ＩＬ－２のレベル
ＩＬ－２のレベルは、２時間及び４時間でフロテツズマブ（０．００５ｎＭ）を有する試料において低かったが、８～２４時間でビヒクルと比較して経時的に増加し、２４時間の時点で４７２．１ｐｇ／ｍｌの平均ピークを有した（図１０）。０．１ｎＭ及び２ｎＭで、フロテツズマブは、８時間の時点で１９５１．６ｐｇ／ｍｌ（０．１ｎＭで）及び２７５６．６ｐｇ／ｍｌ（２ｎＭで）の平均ピークで低～高レベルのＩＬ－２を誘導した。ＩＬ－２のレベルは低く、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７の０．００５でビヒクルと同様であったが、０．１ｎＭではレベルは低かったが、Ｄ１ではなくＤ２及びＤ３からの試料において２４時間でビヒクルよりも増加した。２ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＩＬ－２のレベルは、２４時間の時点で６００．０ｐｇ／ｍｌの平均ピークで、２～４時間での低レベルから８～２４時間での高レベルに増加した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を有する試料において、ＩＬ－２のレベルは、ＩＬ－２レベルが２ｎＭでＤ１及びＤ３からの試料においてビヒクルよりも増加した２４時間の時点を除いて、全ての濃度及び時点で低かった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を有する試料では、ＩＬ－２のレベルは、最も高い濃度（２ｎＭ）を除いて、全ての濃度及び時点で低かったが、ここで、レベルは、２４時間で９９．９ｐｇ／ｍｌの平均ピークを有する３つの後の時点でビヒクルよりも増加した。

【0571】

ＩＬ－６のレベル
ＩＬ－６は、２ｎＭ及び０．１ｎＭのフロテツズマブを有する試料において低～高レベルで誘導され、２ｎＭで平均３．５から４３２．２ｐｇ／ｍｌまで、０．１ｎＭで１．４から７１３．２ｐｇ／ｍｌまで経時的に増加したが、０．００５ｎＭのフロテツズマブを有する試料において、ＩＬ－６のレベルは低く、２～４時間でビヒクルと同様であり、８～２４時間でビヒクルよりも増加し、２４時間で１７４４．４ｐｇ／ｍｌの平均ピークを有した（図１１）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７（２ｎＭ）を有する試料では、ＩＬ－６レベルは、３つの後の時点（４～２４時間）でビヒクルよりも増加したが、０．００５及び０．１ｎＭでは、レベルは、中程度のレベルが観察された２４時間の時点でのＤ３（７７．６ｐｇ／ｍｌ）を除いて、低いか又はビヒクルと同様であった。ＩＬ－６のレベルは、４つの時点全てにおいて、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の全ての濃度で、低い（５０ｐｇ／ｍｌ未満と定義される）か、又はビヒクルと同様であった。

【0572】

ＩＬ－８のレベル
ＩＬ－８のレベルは、２ｎＭ及び０．１ｎＭのフロテツズマブを有する試料において経時的に中から高に増加したが、０．００５ｎＭでは、レベルは、４つ全ての時点でＤ１においてビヒクルと同様であり、Ｄ２（２４時間）及びＤ３（４～２４時間）からの試料においてビヒクルよりも増加した（図１２）。２ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＩＬ－８レベルは、３人のドナー全てについて時間と共にビヒクルよりも増加したが、０．１ｎＭでは、ＩＬ－８レベルは、Ｄ２（２４時間）及びＤ３（４～２４時間）からの試料においてビヒクルよりも増加したが、Ｄ１では増加しなかった。０．００５ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＩＬ－８のレベルは４つ全ての時点でビヒクルと同様であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を用いた全ての試料において、ＩＬ－８のレベルは低く、ビヒクルと同様であったが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を用いた試料では、ＩＬ－８レベルは、最高濃度（２ｎＭ）及び４～２４時間でビヒクルよりわずかに増加した。

【0573】

ＴＮＦαのレベル
ＴＮＦαは、２ｎＭ及び０．１ｎＭのフロテツズマブを有する試料において中～高レベル（５００ｐｇ／ｍｌ超として定義される）で誘導され、２ｎＭで平均４１２．１から７６７３．８ｐｇ／ｍｌまで、０．１ｎＭで１８４．２から４６８９．８ｐｇ／ｍｌまで経時的に増加したが、０．００５ｎＭのフロテツズマブを有する試料では、ＴＮＦαレベルは、平均３．９から４５８．９ｐｇ／ｍｌまで低～高に経時的に増加した（図１３）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１（２ｎＭ）は、平均５７．８ｐｇ／ｍｌから１５２２．６ｐｇ／ｍｌ（２～２４時間）まで中～高レベルに経時的に増加するＴＮＦαを誘導した。０．１ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＴＮＦαのレベルは、ビヒクルと比較して、平均４．０～９５．４ｐｇ／ｍｌ（２～２４時間）で低～中レベルに増加した。０．００５ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７では、ＴＮＦαのレベルは低く、全てのドナー及び４つ全ての時点でビヒクルと同様であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９を有する試料では、ＴＮＦαのレベルは低く、３つ全ての濃度及び４つ全ての時点でビヒクルと同様であった。２ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を有する試料では、ＴＮＦαのレベルは、２時間で６．５ｐｇ／ｍｌから２４時間で９８．６ｐｇ／ｍｌの平均で、低～中レベルまで経時的に増加したが、レベルは低く、０．１ｎＭ及び０．００５ｎＭでは４つ全ての時点でビヒクルと同様であった。

【0574】

全体として、４つ全ての時点（２、４、８、及び２４時間）でビヒクル群において認められたＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６及びＴＮＦαのレベルは、概して、ゼロ時点群において認められたレベルと同様であった。対照的に、ＩＬ－８について０とビヒクルとの間で観察された差異が存在し、これは、活性カスケード系を有する系におけるビヒクルに応答したドナーからのサイトカイン放出のバックグラウンドレベルを示し得る。結論として、フロテツズマブ（０．００５、０．１、及び２ｎＭ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７（０．１及び２ｎＭ）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１（２ｎＭ）は、フロテツズマブ＞ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７＞ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の大きさの順序で経時的に増加するサイトカイン放出を誘導した。対照的に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９は、３つ全ての濃度及び４つ全ての時点でサイトカインを誘導しなかったか、又は低レベルのサイトカインを誘導した。

【0575】

Ｃ．ＣＤ７０、ＣＤ１２３、及びＣＤ３３を標的とする、組換え結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６を、全血流ループ系において３つの異なる濃度で評価し、半減期が延長された非ＴＡＡ（Ｎｉ２Ｃ）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４及びベンチマークとしてのフロテツズマブ類似物と比較した。
全血ループ系において、サイトカイン放出を、０時間、２時間、４時間、８時間、及び２４時間の時点で分析した。本試験では、サイトカイン放出のために、ＰＢＳを陰性対照として使用し、フロテツズマブ類似物をベンチマーク陽性対照（ＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）として使用した。

【0576】

薬物試料及び陽性対照を調製して、血液中で以下の濃度を得た。０．００５ｎＭ、０．１ｎＭ、及び２ｎＭ。滅菌ＰＢＳをビヒクルとして、並びに各ループに添加される１００μｌの最終体積を得るための試験試料の希釈のために使用した。残りの試験試料溶液は廃棄した。

【0577】

ループ系中の全ての材料は、表面をヘパリン処理した。凝固を防止するために、血液をプラスチックチューブ中で回転するようにセットし、ここで、チューブの内側、実験の前に独特のヘパリン結合体で予めコーティングした。コーティングは、血液中への高い抗凝固剤添加を必要とせずに血液が循環することを可能にする。新鮮な全血を３人の健常ボランティア（Ｄ１～Ｄ３）から採取した。血液採取直後に、血液をプレコートプラスチックチューブに移してループを形成した後、以下の設計に従って試験アイテムを投与した。

【0578】

【表13】

【0579】

続いて、ループを回転するように設定し、各ドナーについて、２６個のループのセットを２つの平行回転プラットフォーム上に分割した。

【0580】

３人の健常ドナー（１８歳以上の女性２人及び男性１人）を募集した（献血から７日以内に、急性感染がなく、ＮＳＡＩＤ又は任意の種類のコルチコステロイドの摂取がない）。

【0581】

採血後に直接保存した新鮮な血液（ゼロ時点試料として記載）を血液学的測定に使用した。更に、ゼロ時点で採取した血液を血漿に加工し、サイトカイン分析に含めた。試料を、試験物質及びＥＤＴＡの添加の２、４、８、及び２４時間後に各ループから抽出し、ＥＤＴＡ（血液中の濃度：１０ｍＭ）を各試料に添加して、サンプリング時点で反応を停止させた。血液学及びサイトカイン放出分析のために、２、４、８、及び２４時間目にループをサンプリングした。血漿試料を遠心分離によって調製し、アリコートに分け、分析まで－６０℃以下で保存した。

【0582】

Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）からのＭＵＬＴＩ－ＡＲＲＡＹ（登録商標）技術を使用して、サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、ＩＬ－８、ＴＮＦα）を測定した。サイトカインのレベルは、経時的に平均値として示される（図４４、図４５、図４６、図４７、図４８）。サイトカイン分析のための試料を、０、２、４、８、及び２４時間の時点で収集した。血液試料を血漿に加工し、分析まで－６０℃以下で保存した。分析は、本試験では試料収集から８日以内に行った。試料を１：４（又は１：１００）に希釈し、製造業者の指示に従って二連で行った。

【0583】

検出下限（ＬＬＯＤ）をＭＳＤソフトウェアによって計算し、０較正物質（標準－８）を超える２．５ｘＳＤとして定義した。検出上限（ＵＬＯＤ）は、標準－１のシグナル値からＭＳＤソフトウェアによって計算される。定量化の下限及び上限（ＬＬＯＱ及びＵＬＯＱ）をＭＳＤによって検証し、標準曲線及び希釈標準の回収率から２０％の精度及び８０～１２０％の精度で計算する。希釈血漿試料の測定平均濃度値がＬＬＯＱ未満又はＵＬＯＱ超である場合、データをＬＬＯＱ未満又はＵＬＯＱ超と定義した。データを希釈係数（４×又は１００×）によって更に変換して、計算された平均濃度値を得た。生データは、全ての試料の計算された平均濃度値に対応した。定量可能な範囲内の複製の許容基準を、係数値（ＣＶ）≦２０％として設定した。全ての試料は、複製について２０％以下のＣＶ値を有していた。

【0584】

サイトカイン産生は、５０ｐｇ／ｍｌ以下の値については低、５０ｐｇ／ｍｌ超～５００ｐｇ／ｍｌ以下の値については中、５００ｐｇ／ｍｌ超～５０００ｐｇ／ｍｌ以下の値については高と記載する（任意分類）。

【0585】

全体として、最低濃度（０．００５）でのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、ビヒクルと比較してＩＬ－２、ＩＬ－８、又はＴＮＦαの増加を誘導しなかった。更に、最低及び中濃度のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０は、同じ濃度で試験した他の全てのタンパク質よりも遅い時点でＩＬ－２及びＩＬ－６を誘導した。最高濃度のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０は、８時間及び２４時間の時点で、ほとんどの試験アイテムと同様のＴＮＦαレベルを誘導した。対照的に、最高濃度のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、他の全ての試験アイテムよりも低いＴＮＦα値を誘導した。フロテツズマブのＣＤ３及びＣＤ１２３結合特性は、予想通りに細胞枯渇及びサイトカイン放出を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４は、ビヒクルと比較して、細胞枯渇及び免疫反応を顕著に変化させなかった。

【0586】

実施例９：ヒトエキソビボ全血ループモデルにおけるＴ細胞活性化、細胞生存性、血小板数、及び白血球数に対する多重特異性結合タンパク質の効果
Ａ．Ｔ細胞活性化及び細胞生存性に対する多重特異性結合タンパク質の効果
実施例８と同様に、全血ループ系において、ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０に応答したＴ活性化及び生存性を、０時間（投与前）、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間の時点で評価した。試料を実施例１０に記載のように調製した。血液細胞を蛍光標識モノクローナル抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄによって提供される）で染色して、骨髄細胞（ＣＤ３３＋及びＣＤ１２３＋－使用した抗体：ＣＤ３３－ＰＥ／Ｃｙ７、ＣＤ１２３－ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５）、Ｔ細胞（ＣＤ３－使用した抗体： ＣＤ３－ＢＶ５１０）、活性化マーカ（ＣＤ６９、ＣＤ２５－使用した抗体： ＣＤ６９－ＢＶ４２１、ＣＤ２５－ＡＰＣ）、及び死細胞を染色する生存性色素（Ｆｉｘａｂｌｅ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ｄｙｅ ｅＦｌｕｏｒ７８０）を検出した。各ループについて経時的な相対細胞数を計算するために、細胞計数ビーズを添加した。フローサイトメトリー分析用の試料を蛍光標識抗体と共にインキュベートし、赤血球を溶解し、洗浄した。試料をＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）にかけ、データをＦｌｏｗＪｏ ｖ１０によって分析して、活性化マーカ及び生存性色素について陽性の細胞型のパーセンテージ（死細胞％）を提示した。更に、両方のドナーについてのゼロ試料を、Ｔ細胞によるＣＤ３３及びＣＤ１２３発現について分析した。ループから収集した血液試料の分析に加えて、各ドナーのゼロ時点の試料を、全血細胞に特異的な抗体と共に、活性化マーカなしでインキュベートした。全ての対照は予想通りであった。フローサイトメトリー中の蛍光体のスペクトル重複を補償するために、補償を行った。ビーズ（ｃａｔ．ｎｏ．Ｂ２２８０４、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を、試験に含まれたものと同じ蛍光体を有する抗体で染色し、ソフトウェア（Ｂｅｃｋｍａｎ ＣｏｕｌｔｅｒによるＣｙｔＥｘｐｅｒｔ）によって自動補正計算を行った。単一染色細胞を用いて補償設定を評価し、必要に応じて最適化した。

【0587】

フローサイトメトリー分析を、４時間、８時間、２４時間、及び４８時間の時点で収集した試料に対して行った。更に、ゼロ時点の試料を分析して、採血後に直接的に細胞活性化状態を決定した。表面マーカ（ＣＤ３、ＣＤ３３＋、及びＣＤ１２３＋）を使用して、Ｔ細胞及び骨髄細胞を検出した。細胞活性化及び生存性を、活性化マーカＣＤ２５、ＣＤ６９（活性化）及び死細胞に結合する生存性染色によって測定した。加えて、細胞数がＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、及びＣＤ１２３＋細胞について経時的にどのように変化するかを分析するためにカウントビーズを含めた（図２９～３０）。

【0588】

Ｔ細胞活性化
ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージは、全ての群において（４時間及び８時間の時点で）ビヒクルと同様であった（４時間で９．３％の陽性細胞及び８時間で７．０％の陽性細胞の平均）（図２９）。２４時間及び４８時間で、ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物（１０ｎＭ及び０．１ｎＭで）の群において、ＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージは、１５．４～２８．４％の陽性Ｔ細胞の範囲でビヒクルよりも増加したが、ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物の２つの最低濃度は、２４時間及び４８時間の時点でビヒクルと類似していた（２４時間で１３．５％及び４８時間で１３．９％の平均）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７群におけるＣＤ２５＋Ｔ細胞のパーセンテージは、４つの時点でビヒクルと同様であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８－１０は、４時間及び８時間でビヒクルと同様であった。２４時間及び４８時間で、ＣＤ２５％Ｔ細胞のパーセンテージは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８では１１．９～２３．２％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９では１２．３～２６．２％、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０では１２．４～２６．５％の範囲で増加した。２つの最も低いＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８－１０濃度（０．１ｎＭ及び０．０１ｎＭ）では、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞のパーセンテージは、４つ全ての時点でビヒクルと同様であった。

【0589】

Ｔ細胞は、１０ｎＭ（４時間で２８．９％陽性Ｔ細胞のピーク平均）、０．１ｎＭ（８時間で３０．０％陽性Ｔ細胞のピーク平均）、及び０．０１ｎＭ（２４時間で２２．０％陽性Ｔ細胞のピーク平均）でＡＭＧ３３０類似物によってＣＤ６９を発現するように活性化された（図３０）。０．００１ｎＭでは、ＡＭＧ３３０類似物群は、ビヒクルと類似物していた（平均４時間で２．５％、８時間で３．０％、２４時間で５．６％、及び４８時間で７．９％）。フロテツズマブ類似物は、１０ｎＭ（８時間で５２．２％陽性Ｔ細胞のピーク平均を有する）、０．１ｎＭ（８時間で３９．７％陽性Ｔ細胞のピーク平均を有する）、及び０．０１ｎＭ（２４時間で３９．７％陽性Ｔ細胞のピーク平均を有する）でＣＤ６９発現を誘導した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７群におけるＣＤ６９発現は、４つの時点全てにおいてビヒクルと同様であった。１０ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８－１０群では、ＣＤ６９発現は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０では４時間で１０ｎＭでピークに達し（平均４１．４％陽性Ｔ細胞）、１０ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８－９では８時間後にピークに達した（平均ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８では２６．４％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９では３３．１％）。１ｎＭ及び０．１ｎＭにおいて、ＣＤ６９発現は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８～１０群において２４～４８時間でピークに達し、陽性Ｔ細胞の範囲平均は１４．４％～３０．６％であった（図３０）。０．０１ｎＭでは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８～１０群は、４つの時点全てでビヒクルと同様であった。

【0590】

細胞生存性
細胞型マーカ及び活性化マーカに加えて、生存性色素を染色に含めて、標的細胞及びエフェクタ細胞の生存性を評価した（死細胞％として提示）。更に、生存性色素染色は細胞型マーカの発現に依存するため、細胞数は、生存性及び細胞数の包括的な像を経時的にもたらすことが報告された（図３１～３２）。

【0591】

生存性色素陽性Ｔ細胞％（すなわち、死細胞％）は、試験した全ての分子について１１．０％未満であった（図３１）。全ての分子におけるＴ細胞の数は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７（１ｎＭで２０．８％及び１０ｎＭで１９．２％の平均低下）を除いて、４時間でビヒクルと同様であった（ビヒクル群と比較して２０％未満の低下として定義される）。８時間で、Ｔ細胞数は、１０ｎＭでビヒクルと比較して低下したが（ＡＭＧ３３０類似物について３３．３％、フロテツズマブ類似物について２６．３％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９について１９．８％、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０について６３．６％の平均低下）、他の全ての群は、８時間の時点でビヒクルと類似していた。２４時間後、ビヒクル群におけるＴ細胞数は低下し、０．０１ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８を除いて（ビヒクルと比較して４３．６％の平均低下）、全ての群がビヒクルと同様であった。４８時間後、Ｔ細胞数は、ビヒクルと比較して２つの最低濃度、０．１ｎＭ（平均低下６３．９％）及び０．０１ｎＭ（平均低下２３．５％）で最大の低下があったＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８を除いて、分子濃度の増加と共に低下した（平均低下範囲は、ＡＭＧ３３０類似物で１５．５～８６．５％、フロテツズマブ類似物で４５．４～８３．０％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７で４８．７～６５．２％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９で２７．９～６２．４％、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０で２０．７～５８．９％）。

【0592】

ＡＭＧ３３０類似物群において、ＣＤ３３＋骨髄細胞は、１０ｎＭ（８時間で平均５６．４％の生存性色素陽性細胞、２４時間で５６．１％及び４８時間で５２．８％）、０．１ｎＭ（８時間で平均１５．３％の生存性色素陽性細胞、２４時間で５８．０％及び４８時間で５１．１％）及び０．０１ｎＭ（２４時間で平均１９．８％の生存性色素陽性細胞及び４８時間で３１．５％）で生存性色素（すなわち、死細胞％）について陽性に染色された（図３２）。フロテツズマブ類似物は、１０ｎＭ（４時間で平均５３．２％、８～４８時間で９８．０％超の生存性色素陽性細胞を有する）及び０．１ｎＭ（２４時間で平均７６．３％、４８時間で８０．１％）でＣＤ３３＋細胞を殺傷した。より低い濃度（ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物については０．００１ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８－１０については０．０１ｎＭ、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７については０．１ｎＭ）では、生存性は、４つ全ての時点でビヒクルと同様であった（１０％未満の生存性色素陽性細胞）。４時間で、生存性色素陽性細胞の％は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７群（１０ｎＭで平均１３．６％及び１ｎＭで１１．２％の生存性色素陽性細胞生存性）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８群（０．１ｎＭで平均１９．７％）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０群（１０ｎＭで平均１４．０％、１ｎＭで１３．９％及び０．０１ｎＭで１４．２％）において、ビヒクルと比較して増加した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０群は、１０ｎＭで８～４８時間でビヒクルと比較して生存性色素陽性細胞のパーセンテージを増加させた（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７では１０．５～３０．２％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８では７３．１～６９．１％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９では９０．９～９２．６％、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０では９３．７～９１．９％の範囲平均）。１ｎＭで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８は２４～４８時間で（３９．６～４２．１％の平均）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９は８～４８時間で（１３．７～６０．７％の平均）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０は８～２４時間で（１３．２～４７．１％の平均）陽性細胞の生存性を誘導した。更に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０は、０．０１ｎＭで、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９については４８時間で（平均３３．９％）、ｖ１０については２４～４８時間で（それぞれ平均２２．９％及び１４．７％）、生存性陽性細胞のパーセンテージを増加させた。

【0593】

同様に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７を除く全ての試験群において、ＣＤ３３＋細胞の細胞数は、最高分子濃度（１０ｎＭ）で４～８時間の時点でビヒクルと比較して減少した（３０％超の差）（図３５）。２番目に高い濃度（ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物では０．１ｎＭ及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０では１ｎＭ）は、全ての試験群について８～２４時間の時点でＣＤ３３＋細胞の低下を引き起こす。より低い濃度（ＡＭＧ３３０類似物／フロテツズマブ類似物では０．０１～０．００１ｎＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７～１０では０．１～０．０１ｎＭ）では、ＣＤ３３＋細胞は、初期の時点でビヒクルと同様であり、いくつかの群については、細胞数は後期の時点で減少した。

【0594】

生存性色素陽性ＣＤ１２３＋細胞のパーセンテージ（すなわち、死細胞％）は、ビヒクルと同様であり、４時間で試験した全ての分子について平均８．０％未満、８時間で２０．０％未満であった。２４時間で、生存性陽性ＣＤ１２３＋細胞のパーセンテージは、最高濃度のＡＭＧ３３０類似物、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０（１０．２～２９．２％の生存性色素陽性細胞の範囲平均を有する）でビヒクルと比較して増加した。４８時間で、生存性色素陽性細胞のパーセンテージは、全ての群において３．０～５０．３％の範囲であり、群の一部はビヒクル群よりも高く、一部はビヒクル群よりも低かった（平均１３．９％）（図３１～３３）。

【0595】

ＡＭＧ３３０類似物群におけるビヒクルと比較して、ＣＤ１２３＋細胞の数は、１０ｎＭ（４時間で５４．６％、８時間で８５．１％、２４時間で８９．５％、及び４８時間で７８．６％の平均低下）、０．１ｎＭ（８時間で４０．３％、２４時間で８１．５％、及び４８時間で８６．６％の平均低下）及び０．０１ｎＭ（２４時間で４９．３％及び４８時間で７２．４％の平均低下）で経時的に低下した（図３６）。フロテツズマブ類似物は、１０ｎＭ（１０ｎＭで８時間で６０．２％、２４時間で６５．２％、及び４８時間で４２．４％の平均低下）及び０．１ｎＭ（２４時間で７９．０％、及び２４時間で６３．４％の平均低下）でＣＤ１２３＋細胞の低下を誘導した。より低い濃度のＡＭＧ３３０類似物（０．００１ｎＭ）及びフロテツズマブ類似物（０．０１ｎＭ及び０．００１ｎＭ）では、カウントは、４つ全ての時点でビヒクルと同様であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７群において、％ＣＤ１２３＋細胞は、ビヒクルと比較して３１．２％の低下が認められた４時間の時点で１ｎＭを有する群を除いて、ビヒクルと同様であった。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８－１０は、分子濃度及び時点の増加と共に、ビヒクル群と比較してＣＤ１２３＋細胞の数を減少させた。１０ｎＭ（８時間で５０．４％、２４時間で４７．７％、及び４８時間で７２．９％の平均低下）及び１ｎＭ（２４時間で３８．１％及び４８時間で６８．１％の平均低下）でのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９について、ＣＤ１２３＋細胞は、ビヒクルと比較して、１０ｎＭ（８時間で５８．１％、２４時間で６７．９％及び４８時間で７９．１％の平均低下）、１ｎＭ（２４時間で２９．６％及び４８時間で７６．２％の平均低下）、及び０．１ｎＭ（２４時間で３４．４％及び４８時間で４８．６％の平均低下）で低下した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０は、ビヒクルと比較して、１０ｎＭ（４時間で３１．３％、８時間で７２．３％、２４時間で８１．３％、及び４８時間で７６．３％の平均低下）、１ｎＭ（２４時間で７４．４％及び４８時間で７２．７の平均低下）及び０．１ｎＭ（２４時間で５７．２％及び６２．９％の平均低下）でＣＤ１２３＋細胞の低下を引き起こした。より低い濃度のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８（０．１及び０．０１ｎＭ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９（０．０１ｎＭ）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０（０．０１ｎＭ）では、カウントは４つの時点全てでビヒクルと同様であった。

【0596】

Ｂ．血液血小板数に対する多重特異性結合タンパク質の効果
実施例８と同様に、全血ループ系において、組換え結合タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１に応答した血小板数（ＰＬＴ（１０９／Ｌ））を、０時間（投与前）、２時間、４時間、８時間及び２４時間の時点で評価した。全ての試料調製を実施例ｘに記載したように行い、測定をＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０によって行った。機器の技術的機能及び試薬系を、ＸＮ－ＣＨＥＣＫレベル１及びレベル２での各実行の前に監視した。ＸＮ－ＣＨＥＣＫは、装置の効果的かつ信頼性のある内部及び外部品質管理を可能にする分析器のために特別に設計された対照血液である。ＸＮ－ＣＨＥＣＫレベル２が血液学的パラメータの正常範囲をカバーする一方、ＸＮ－ＣＨＥＣＫレベル１は、血液学的パラメータの異常な低い範囲に使用される。微小血餅が形成されていないことを確認する手段としてＰＬＴ数を測定したが、これは細胞／血液活性化の徴候であり得る。更に、肉眼で見える血餅の存在を目視検査によって評価した。示された場合、溶血を視覚的に等級付けした。

【0597】

血小板数
ドナーは、ゼロ時点で正常なＰＬＴ範囲（すなわち、１５０～４００×１０９細胞／Ｌの範囲の値）を示した（図１４）。ゼロ時点の２０％超のＰＬＴ数減少は、血小板凝集として分類される（閾値は、４時間時点での同じ条件における測定再現性に基づいて決定される）。４時間を超える時点の閾値は決定されていない）。０．００５ｎＭ（Ｄ１及びＤ３については２４時間）、０．１ｎＭ（Ｄ１～Ｄ２については８時間及びＤ１～Ｄ３については２４時間）、及び２ｎＭ（Ｄ１～Ｄ３については２４時間）のフロテツズマブと共にインキュベートしたループにおいて、肉眼で見える血餅（１ｍｍ以上）が観察された。２ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７を有する試料（Ｄ１～Ｄ３については２４時間）では、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１試料では、いずれの時点でもマクロ血餅は観察されなかった。８時間の時点で、Ｄ１からのビヒクル試料中に小さな微小血餅が観察された。ビヒクル群におけるＰＬＴレベルは、２時間及び４時間でゼロ時点と同様であった（２０％以下の差のレベルとして定義される）が、８時間では、ＰＬＴ数は、Ｄ１について３５．０％減少し、２４時間では、ＰＬＴは、Ｄ１について３７．９％及びＤ２について２４．９％減少した。一般に、フロテツズマブは、８時間及び２４時間で、濃度と共に増加するＰＬＴ数の減少を誘導した。２つの最も高い濃度（０．１ｎＭ及び２ｎＭ）のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７は、２つの後の時点でＰＬＴ数を減少させたが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１を有する試料中のＰＬＴ数は、全ての濃度及び時点でビヒクルと同様であった。

【0598】

フロテツズマブに応答して、ＰＬＴ数は、２４時間でＤ１及びＤ２を除いて（それぞれ、ビヒクルと比較して６５．１％及び８５．８％の減少）、０．００５ｎＭでビヒクル試料の２０％以下の減少であった。０．１ｎＭでは、ＰＬＴ数は、２時間及び４時間で各ドナーについてビヒクル試料の２０％以内であったが、８時間及び２４時間では、ＰＬＴ数は３人の全てのドナーで減少し、平均減少はそれぞれ８３．７％及び８８．４％であった）。２ｎＭでは、ＰＬＴ数は、２つの後の時点で全てのドナーの血液中でビヒクルの２０％超減少した（８時間で７５．１％及び２４時間で８８．９％の平均減少）。ＰＬＴ数は、Ｄ１（８時間で８５．４％及び２４時間で９７．１％の減少）、Ｄ２（２４時間で９４．７％の減少）、及びＤ３（２４時間で９０．４％の減少）からの血液中の２ｎＭの最高濃度を除いて、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７の３つ全ての濃度でビヒクル試料の２０％以下で減少した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃３１の３つ全ての濃度で、ＰＬＴ数は、４つ全ての時点で３人の全てのドナーについてビヒクル試料の２０％以内であった。

【0599】

Ｃ．血小板数及び白血球数に対する多重特異性結合タンパク質の効果
実施例８と同様に、全血ループ系において、フロテツズマブ類似物、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６に応答する、０時間（投与前）、２時間、４時間、８時間、及び２４時間の時点での血小板数（ＰＬＴ）及び白血球数（ＷＢＣ）（１０⁹／Ｌ）を評価した。全ての試料調製を実施例８に記載されるように行い、測定をＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ Ｓｙｓｍｅｘ ＸＮ－Ｌ３５０によって行った。機器の技術的機能及び試薬系を、ＸＮ－ＣＨＥＣＫレベル１及びレベル２での各実行の前に監視した。ＸＮ－ＣＨＥＣＫは、装置の効果的かつ信頼性のある内部及び外部品質管理を可能にする分析器のために特別に設計された対照血液である。ＸＮ－ＣＨＥＣＫレベル２が血液学的パラメータの正常範囲をカバーする一方、ＸＮ－ＣＨＥＣＫレベル１は、血液学的パラメータの異常な低い範囲に使用される。微小血餅が形成されていないことを確認する手段としてＰＬＴ数を測定したが、これは細胞／血液活性化の徴候であり得る。更に、肉眼で見える血餅の存在を目視検査によって評価した。

【0600】

ゼロ及びビヒクル群における血小板。
全てのドナーは、ゼロ時点で正常なＰＬＴ範囲（すなわち、１５０～４００×１０⁹細胞／Ｌの範囲の値）を示した（図４９）。ビヒクル群におけるＰＬＴレベルは、全てのドナーについてゼロ時点の試料と同様であった（２０％未満の差のレベルとして定義される）。ビヒクルと共にインキュベートした新鮮血では肉眼で見える血餅は観察されなかったが、８時間及び２４時間で試験したいくつかの試験アイテムでは肉眼で見える血餅が検出された（表９Ｂ）。

【0601】

【表14】

【0602】

全てのドナーは、ゼロ時点で正常なＰＬＴ範囲（すなわち、１５０～４００×１０９細胞／Ｌの範囲の値）を示した（図４９）。ビヒクル群におけるＰＬＴレベルは、全てのドナーについてゼロ時点の試料と同様であった（２０％未満の差のレベルとして定義される）。ビヒクル（ＰＢＳ）と共にインキュベートした新鮮血では肉眼で見える血餅は観察されなかったが、８時間及び２４時間で試験したいくつかの試験アイテムでは肉眼で見える血餅が検出された（表９ｂ）。

【0603】

全てのドナーのＷＢＣ数は、ゼロ時点で正常範囲内であった（すなわち、４．０～１１．０×１０⁹細胞／Ｌの範囲の値）。４時間の時点対ゼロ時点の試料における±１０％の変動は、正常と判断される（図５０）。

【0604】

全体として、試験したタンパク質の３つ全ての濃度、０．００５、０．１、及び２ｎＭにおいて、ＰＬＴ及びＷＢＣ数は、４時間の時点までビヒクル群と同様であった。４時間後、一般に、ビヒクルと比較して、全てのドナーにおける全ての試験タンパク質について、ＰＬＴ及びＷＢＣ数の濃度依存的な減少が経時的に検出された。しかしながら、０．００５及び０．１ｎＭでのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０は、ＷＢＣ数の顕著な減少を誘導しなかった。血餅は、いくつかの試験タンパク質について８時間で最初に検出され、２４時間で全ての試験タンパク質が異なる濃度で血餅を示した。しかしながら、ビヒクル試料では血餅は観察されず、血餅形成が免疫刺激の効果であることが示唆された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４については、いずれの時点においても血餅は検出されず、タンパク質におけるこの対照による限定された免疫活性を示した。

【0605】

実施例１０：２つの表面リガンド（ＣＤ３３及びＣＤ１２３）に対して多重特異性結合タンパク質の複合アビディティの決定
例示的な多重特異性設計アンキリン反復タンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７（ＣＤ３、ＣＤ３３、及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）、並びに対応する単一ＴＡＡ標的対照（ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１（ＣＤ３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２（ＣＤ３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１（ＣＤ３及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有する）、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０（ＣＤ３及びＣＤ３３に対して結合特異性を有する）の親和性及びアビディティを決定するために、ｓｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ（登録商標）技術（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）を利用する試験を行った。ＳｗｉｔｃｈＳＥＮＳＥ（登録商標）技術は、親和定数（１０ｆＭの検出限界を有する）及び結合動態（会合及び解離速度定数についてそれぞれ１Ｅ３～１Ｅ８１／Ｍｓ及び１Ｅ ６～１Ｅ０１／ｓの検出限界を有する）の両方を検出する際に高い感度を可能にする。（Ｌａｎｇｅｒら；２０１３年．電気的に切り替え可能なＤＮＡチップを用いた時間分解測定によるタンパク質分析、Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ４：２０９９）。

【0606】

この技術は、２つの相互作用からの２つの独立した信号を同時に同じセンサスポット上で監視することを可能にする２つの異なる蛍光体を利用する。それにより、親和性及びアビディティ動態多重特異性結合剤を、２つの標的分子に対して同時に測定することができる。

【0607】

材料及び方法
設計アンキリン反復タンパク質：２つのリガンドｈＣＤ３３及びｈＣＤ１２３に対する結合について、０．１６及び６４ｎＭの濃度で（１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５０μＭのＥＤＴＡ、５０μＭのＥＧＴＡを含有する緩衝液ＰＥ１４０中）ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１を試験した。２つのリガンドｈＣＤ３３及びｈＣＤ１２３は両方とも、ＡＤＰ－４８－１－０チップ上で、予め規定された比（２：１、ＣＤ３３：ＣＤ１２３）及び１０％密度（１００：５０）で、表面上のＤＮＡナノレバーに同時に固定化され、ここでは、１００％密度≒１０００受容体／μｍ２である（ｃＮＬ－４８（暗）中で希釈されたプレインキュベートされたＲ１－Ｂ４８－ＣＤ１２３及びＧ１－Ａ４８－ＣＤ３３（１００ｎＭ））。簡単に述べると、以下の工程を行った。
－コンジュゲーション２つのリガンド（ＣＤ３３及びＣＤ１２３）のＤＮＡナノレバー（それぞれＡ４８、Ｂ４８）へのアミンカップリング、及び２５℃でのｐｒｏＦＩＲＥ（登録商標）溶液（Ｄｙｎａｍｉｃ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ＧｍｂＨ）を用いたコンジュゲートの精製。
－ＤＲＸ＋機器（ｄｙｎａｍｉｃ ＢＩＯＳＥＮＳＯＲＳ）を使用した、ＡＤＰチップの表面上に付着した両方のリガンドに対して全ての異なるタンパク質の全ての親和性及びアビディティの組み合わせの評価。
－分析された全ての濃度及び長い解離時間のチップ表面の再生を含む統計分析（２～５回の反復可能性）、及びデータを、双指数関数グローバルフィットを使用してフィッティングさせた。

【0608】

【表15】

【0609】

結果及び結論
多重特異性組換えタンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０は、チップ上で２つの相互作用を表す二相性解離を示した：１Ｅ^-2ｓ^-1程度の親和性（速いオフ速度）及び１Ｅ^-3ｓ^-1程度のアビディティ（分析物が両方のリガンドと相互作用している場合の遅いオフ速度）。更に、ＣＤ１２３についての会合速度は、ＣＤ３３（１Ｅ⁶Ｍ^-1ｓ^-1）と比較して、わずかに高いようである（１Ｅ⁷Ｍ^-1ｓ^-1）。両方のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２の対照について、標的のうちの１つへの結合相互作用のみが観察された。例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１は、ＣＤ３３サブユニットを有していないので、予想通り、ＣＤ１２３とのみ相互作用する。したがって、それは、６Ｅ^-2ｓ^-1のｋ_offを有する単相の会合及び解離を示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２１とＣＤ３３との間の相互作用は観察されない。同様に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２は、ＣＤ１２３サブユニットを有していないので、予想通り、ＣＤ３３とのみ相互作用する。したがって、それは、１Ｅ^-2ｓ^-1のｋ_offを有する単相の会合及び解離を示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２２とＣＤ１２３との間の相互作用は観察されない。

【0610】

全体として、ＣＤ３３特異性結合ドメイン及びＣＤ１２３特異性結合ドメインの両方を含む設計アンキリン反復タンパク質（αＣＤ３３－αＣＤ１２３）は、チップの表面に付着した両方の標的に同時に結合することができ、親和性及びアビディティを示す一方、ＣＤ３３特異性結合ドメイン又はＣＤ１２３特異性結合ドメインのいずれかを有する設計アンキリン反復タンパク質は、それぞれＣＤ３３及びＣＤ１２３に対してのみ親和性を示すことが示される。実際、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０についてのみ、チップ上で２つの相互作用（集団）を表す二相性解離が観察され、親和性（２Ｅ^-2ｓ^-1、速いオフ速度）及びアビディティ（１Ｅ^-3ｓ^-1、遅いオフ速度）が観察された。

【0611】

図３８に見られるように、ＣＤ１２３結合ドメインは、その標的に対してＣＤ３３結合ドメインよりも速い結合速度を示した。図３７（ＣＤ１２３に対して７Ｅ⁶Ｍ^-1ｓ^-1のｋ_onは、ＣＤ３３のｋ_onよりも約５倍速く、１．３Ｅ⁶Ｍ^-1ｓ^-1に等しい）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０については、２つのオフ速度が観察され、１つは親和性結合に関連する速い速度（３Ｅ^-2ｓ^-1）、及び１つはアビディティ効果自体の遅い速度（１．５Ｅ^-3ｓ^-1）であった。したがって、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２０について２つのＫ_Dを決定することができる。高い方の親和性結合に関連するＫ_D,1は、それぞれ、ＣＤ３３について約１７．６ｎＭ及びＣＤ１２３について４．９ｎＭであった。低い方のアビディティ（ＣＤ３３及びＣＤ１２３の同時結合）に関連するＫ_D,2はｐＭ範囲である（図３９及び４０）。

【0612】

多重特異性組換えタンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７は、チップ上で２つの相互作用を表す二相性解離を示した：１Ｅ^-2ｓ^-1程度の親和性（速いオフ速度）及び１Ｅ^-3ｓ^-1程度のアビディティ（分析物が両方のリガンドと相互作用している場合の遅いオフ速度）。更に、ＣＤ１２３についての会合速度は、ＣＤ３３（１Ｅ⁶Ｍ^-1ｓ^-1）と比較して、わずかに高いようである（１Ｅ⁷Ｍ^-1ｓ^-1）。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１対照の両方について、標的の１つへの結合相互作用のみが観察された。例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１５は、ＣＤ３３サブユニットを有していないので、予想通り、ＣＤ１２３とのみ相互作用する。したがって、それは、６Ｅ^-2ｓ^-1のｋ_offを有する単相の会合及び解離を示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４１とＣＤ３３との間の相互作用は観察されない。同様に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０は、ＣＤ１２３サブユニットを有していないので、予想通り、ＣＤ３３とのみ相互作用する。したがって、それは、１Ｅ^-2ｓ^-1のｋ_offを有する単相の会合及び解離を示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃４０とＣＤ１２３との間の相互作用は観察されない。（図１５及び図１６）

【0613】

全体として、ＣＤ３３特異性結合ドメイン及びＣＤ１２３特異性結合ドメインの両方を含むＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７（αＣＤ３３－αＣＤ１２３）が、チップの表面に付着した両方の標的に同時に結合することができ、親和性及びアビディティを示す一方、ＣＤ３３特異性結合ドメイン又はＣＤ１２３特異性結合ドメインのいずれかを有する設計アンキリン反復タンパク質は、それぞれＣＤ３３又はＣＤ１２３に対してのみ親和性を示すことが示される。したがって、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃２７について以下の２つのＫ_Dを決定することができる。高い方の親和性結合に関連するＫ_D,1は、それぞれ、ＣＤ３３について約２０ｎＭ及びＣＤ１２３について４．５ｎＭであった。低い方のアビディティ（ＣＤ３３及びＣＤ１２３の同時結合）に関連するＫ_D,2は、０．２～０．３ｎＭの範囲で決定され（図１７及び１８）、測定された親和性の少なくとも１４分の１であった。

【0614】

実施例１１：標的特異性短期Ｔ細胞活性化及びＩＦＮγ分泌の評価
上述の組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカを測定するＦＡＣＳ及びＩＦＮγ分泌を測定するＥＬＩＳＡによって、インビトロの短期Ｔ細胞活性化アッセイで評価した。

【0615】

したがって、１ウェル当たり１００，０００個の精製汎Ｔ細胞（エフェクタ細胞）と１００，０００個のＭｏｌｍ－１３標的細胞を、６００μＭのヒト血清アルブミンの存在下で、選択したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と２連で３７℃で２４時間共インキュベートした（Ｅ：Ｔ比１：１）。２４時間後、製造業者のプロトコルに従って、ヒトＩＦＮγ標準ＡＢＴＳ ＥＬＩＳＡ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔキット（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）によるＩＦＮγ分泌の測定のために、１ウェル当たり１００μｌの上清を移した。細胞を洗浄し、１：１，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：２５０のマウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｓｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００のマウス抗ヒトＣＤ ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。

【0616】

図２３Ａ及び２４Ａに示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃９は、半減期延長なしで、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０）に匹敵する特異的な短期Ｔ細胞活性化を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃１０は１０～１００分の１の効力を示した。半減期が延長されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質１１～１４（図２３Ｂ及び２４Ｂを参照）は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約３～１００分の１の低下を示す。

【0617】

実施例１２：ＩｎｃｕＣｙｔｅによる標的特異的長期腫瘍細胞死滅の評価
組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質の特異性及び効力を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３プラットフォームを使用する、インビトロの長期殺傷アッセイによって評価した。

【0618】

Ｍｏｌｍ－１３細胞を最初にＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ（ＮＬＲ）レンチウイルス粒子（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で形質導入し、赤色蛍光細胞を０．７μｇ／ｍｌのピューロマイシン及び／又はＦＡＣＳソーティングによって選択した。次いで、ＩｎｃｕＣｙｔｅ Ｓ３システム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて長期腫瘍細胞死滅を評価した。エフェクタ細胞及び標的細胞を、１：２００のＡｎｎｅｘｉｎ Ｖ ｇｒｅｅｎ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）及び６００μＭのヒト血清アルブミン（生理学的濃度を模倣するため）の存在下で、５：１のＥ：Ｔ比で０．０１％のポリ－Ｌ－オルニチンをコーティングした９６ウェルプレート上で２連で同時インキュベートした。１ウェル当たり５０，０００個の精製（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）汎Ｔ細胞（健常ドナーＰＢＭＣから単離）＋１０，０００個のＭｏｌｍ－１３ ＮＬＲ細胞を、選択されたアンキリン反復タンパク質又は対照ベンチマーク分子の段階希釈物と一緒に３７℃で最大６日間インキュベートした。２時間毎に画像を撮影し、細胞増殖（ＮＬＲからの赤色蛍光）（ＮＬＲからの赤色蛍光）及び細胞死（アネキシンＶからの緑色蛍光）について評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を使用して６日間の共培養後の曲線下面積を計算することによって、総細胞増殖及び腫瘍細胞死滅を分析した。

【0619】

図２５に示すように、試験したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８、＃９、及び＃１０は、半減期延長とは無関係に、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）に匹敵する強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示す。より低い親和性のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７のみが、殺傷効力の低下を示す。

【0620】

実施例１３：ＦＡＣＳによる標的特異的長期Ｔ細胞活性化及び増殖の評価
組換え多重特異性アンキリン反復タンパク質（実施例５、６、７及び８に記載される）の特異性及び効力を、ＦＡＣＳベースのインビトロ長期Ｔ細胞活性化アッセイによって評価した。

【0621】

薬物及び標的特異性Ｔ細胞活性化及び増殖を評価するために、エフェクタ細胞及び標的細胞を、選択した分子の段階希釈物の存在下で１：１のＥ：Ｔ比にて２連で同時インキュベートした。精製された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）汎Ｔ細胞（健康なドナーＰＢＭＣから単離）を最初に５μＭのＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ）で、３７℃で２０分間標識した。１ウェル当たり５０，０００個のＣＴＶ標識汎Ｔ細胞＋５０，０００個のＭｏｌｍ－１３を、次いで、６００μＭのヒト血清アルブミンの存在下（生理的濃度を模倣するため）、選択したＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質又は対照ベンチマーク分子ＴＣＥ１及びＴＣＥ２）の段階希釈物と共に３７℃でインキュベートした。５日後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：５’０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：１００のマウス抗ヒトＣＤ８ ＰＥ（ＢＤ）、及び１：１００のマウス抗ヒト－ＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体で、４℃で３０分間染色した。ＰＢＳで２回洗浄した後、細胞を、ＣｅｌｌＦＩＸ（ＢＤ）を使用して４℃で２０分間固定し、最後に緩衝液をＰＢＳで置き換えた。染色された細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。Ｔ細胞活性化を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。Ｔ細胞増殖を、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＴＶ陽性細胞をゲーティングすることによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８を用いてデータをプロットした。

【0622】

図２６及び２７に示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃８及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）＃９は、半減期の延長なしで、ベンチマーク分子（既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャである、ＣＤ３３に対して結合特異性を有するＡＭＧ３３０及びＣＤ１２３に対して結合特異性を有するフロテツズマブ）に匹敵する長期Ｔ細胞活性化及び増殖を誘導したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１０は１０～１００分の１の効力を示した。半減期が延長されたＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１１－１４は、対応する半減期が延長されていない分子と比較して、効力の約５～３０倍の低下を示す。

【0623】

実施例１４：ＰＢＭＣヒト化マウス及びＭＯＬＭ－１３腫瘍モデルにおける例示的な多重特異性結合タンパク質のインビボ有効性評価
実験Ａ．ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ３に対して結合特異性を有する４つの異なる設計アンキリン反復タンパク質である、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４を、固形皮下腫瘍として腫瘍細胞系ＭＯＬＭ－１３を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルにおいて試験し、臨床試験において現在試験されている既知のＣＤ３３標的化Ｔ細胞性エンゲージャであるＡＭＧ３３０と比較した。

【0624】

ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４は、半減期延長部分として、ヒト血清アルブミンに対して結合特異性を有する設計アンキリン反復ドメインを更に含む。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２の非半減期延長型である。

【0625】

材料及び方法
動物：６０匹の雌ＮＯＧマウス、試験開始時の動物の年齢６５日（提供者Ｔａｃｏｎｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）
試験分子及び対照分子：ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４を、５ｍｇ／ｍｌの濃度で以前に記載されたように産生し、対照は、ＡＭＧ３３０ ０．５９ｍｇ／ｍｌであり、Ｅｖｉｔｒｉａ ＡＧによって提供された。
治療群：６０匹のマウスを研究に登録した。全ての動物を８つの異なる試験群に無作為に割り当てた。腫瘍細胞接種の日付を０日目として示す。
方法：実験開始の２日前に体重を記録し、各群において等しい平均体重及び同様の標準偏差を有するようにマウスを無作為化した。平均重量は１９．６ｇであった。
２日目に、マウスに５×１０⁶個のＰＢＭＣを腹腔内注射した。
０日目に、マウスの右脇腹に１０⁶個のＭＯＬＭ－１３細胞を皮下注射した。
５日目に、表８に従って腹腔内注射による処置を開始した。最後の処置は１６日目であった。

【0626】

腫瘍測定及び秤量を、７、１０、１２、１４、１７、１９日目に実施した。腫瘍体積を以下の式に従って計算した：［長さ×（幅）²×π］／６。

【0627】

腫瘍体積データを、Ａｎｏｖａによって増殖曲線を比較し、続いて多重比較（Ｄｕｎｎ検定）のために補正したノンパラメトリッククラスカル・ウォリス（Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ）検定によって分析した。

【0628】

処置群の腫瘍体積を、対照群の体積と比較した。２匹の異なるＰＢＭＣドナーからのデータを一緒に及び別々に分析した。

【0629】

【表16】

【0630】

結果
腫瘍増殖阻害
試験した多特異性結合タンパク質及び既知のベンチマークＴ細胞エンゲージャへの曝露時の腫瘍成長曲線を、両方のドナーを一緒に及び別々に含めて、図２５Ａ～Ｃに要約する。図２６Ａ～Ｌは、全てのマウスの個々の成長曲線を示す。

【0631】

【表17】

【0632】

【表18】

【0633】

【表19】

【0634】

ドナーＢ由来のＰＢＭＣは、マウス血液中のＣＤ８陽性リンパ球の量を低下させた。概して、抗腫瘍効果は、試験した全ての分子において観察された。対照的に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２及びＡＭＧ３３０は、治療の開始後５日目から始まる効果を示したが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４の効果は、治療の開始後７日目から始まって有意かつ関連性があった。サブグループＡのみを比較した場合、統計的に有意な効果が、治療の開始後５日目から始まって全ての試験分子について観察された。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４の効果は、ＡＭＧ３３０及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８の効果よりも強かった。サブグループＢを比較した場合、有意な抗腫瘍効果が、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３及びベンチマークＡＭＧ３３０について観察された。

【0635】

ベンチマークで得られた結果は、使用されたモデルを確証するものであった。同時に、ドナーＢ由来のＰＢＭＣでヒト化されたマウスにおいて観察されたベンチマークのあまり顕著でない効果は、このサブグループに属するマウスの感受性がより低いことを示す。これはまた、ドナーＢ由来のＰＢＭＣでヒト化されたマウスにおける実験の終わりに見出されたヒトＣＤ８陽性リンパ球の有意に低い量によって反映される。

【0636】

したがって、ドナーＡ由来のＰＢＭＣを用いてヒト化されたマウスから得られたデータは、より大きな関連性があるものとなる。

【0637】

腫瘍サイズにおける高い変動性は、腫瘍が全てのマウスにおいて認識可能になる前に処置が開始されたため、マウスにおいて無作為化及び範囲選択が行われなかったという事実に起因する。この高い変動性にもかかわらず、最初の腫瘍体積に対する正規化を必要とせずに統計分析を行うことができた。

【0638】

本発明者らは、試験した全ての多重特異性結合タンパク質が抗腫瘍活性を示し、半減期延長分子であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１２、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１３、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃１４が、使用した用量及び適用レジメンで、半減期延長していないＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８よりも強い抗腫瘍活性を有することを確認した。理論に束縛されるものではないが、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃８の曝露は、この分子のより短い半減期に起因して、より低くなり得ると考えられる。

【0639】

全体として、試験した４つ全ての多重特異性結合タンパク質は、ＡＭＧ３３０Ｔ細胞エンゲージャの抗腫瘍活性に匹敵するか又はそれよりも強いインビボ抗腫瘍活性を示した。

【0640】

実験Ｂ．実験Ａと同様の実験設定及び手順において、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ３に対して結合特異性を有する追加の設計アンキリン反復タンパク質、すなわちＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６を、固形皮下腫瘍として腫瘍細胞系ＭＯＬＭ－１３を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルにおいて試験し、ＡＭＧ３３０と比較した。

【0641】

簡単に説明すると、インビボ実験を、６～９週齢の雌免疫不全ＮＸＧマウス（Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓによって提供された）において実施した。マウスを、標準的な齧歯類マイクロアイソレーターケージ（２０±１℃の室温、５０±１０％の相対湿度及び１２時間の明暗サイクル）内の標準化環境条件下で維持した。マウスに、放射線照射食品及び床敷並びに０．２２ｕｍの濾過飲料水を与えた。全ての実験は、スイス動物保護法に従って州及び連邦の獣医学当局からの認可を受けて行った。

【0642】

実験Ａと同様に、癌細胞の異種移植の２日前に、マウスにｈＰＢＭＣを腹腔内注射した。ＭＯＬＭ－１３細胞を、マウスの右側腹部の皮下に（ｓ．ｃ．）異種移植した。２匹のｈＰＢＭＣドナーを使用した。処置は、癌細胞移植の４日後に静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。処置は以下のように施した：
－ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６を、０．５ｍｇ／ｋｇで、２週間、週に３回静脈注射で投与した。
－ＡＭＧ３３０を、０．５ｍｇ／ｋｇで２週間、毎日ｉ．ｖ．投与した。

【0643】

腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した：腫瘍体積（ｍｍ³）＝０．５×長さ×幅²。

【0644】

図５８（Ａ～Ｂ）に見られるように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、実験の全期間にわたって（図５８Ａ）、及び最初の注射の１７日後に（図５８Ｂ）、腫瘍成長及び腫瘍体積の阻害に関して良好な有効性を示した。

【0645】

実験Ｃ．実験Ａ及びＢと同様の実験設定及び手順において、ＣＤ７０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ３に対して結合特異性を有する２つの設計アンキリン反復タンパク質、すなわち、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７を、固形皮下腫瘍として腫瘍細胞系ＭＯＬＭ－１３を有する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）ヒト化マウスモデルにおいて試験し、陽性対照としてのＡＭＧ３３０及びフロテツズマブ、並びに陰性対照としてのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４（ＣＤ３特異性結合タンパク質）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５と（ＣＤ３３／ＣＤ７０／ＣＤ１２３特異性結合タンパク質）と比較した。

【0646】

実験Ｂと同様に、癌細胞の異種移植の２日前に、ＮＸＧマウスにｈＰＢＭＣを腹腔内注射した。ＭＯＬＭ－１３細胞を、ＮＸＧマウスの右側腹部の皮下に（ｓ．ｃ．）異種移植した。処置に応じて２～６人のｈＰＢＭＣドナーを使用した。処置は、癌細胞移植（治療的処置）の８日後に開始して静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。全ての腫瘍はこの時点で確定された。腫瘍体積の平均は、約１５０ｍｍ³であった。

【0647】

図６５は、処置後の腫瘍体積に対する試験タンパク質の効果を経時的に示す。図示されるように、試験した両方の多重特異性タンパク質、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、腫瘍成長の有効な阻害を提供した。図６６は、腫瘍成長に対する異なる処置量のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（０．０２～２ｍｇ／ｋｇ）の効果を示す。腫瘍成長阻害は、投与されるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の量が増加するにつれてより強力になった。

【0648】

処置は以下のように施した：
●ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７を、週に３回、２週間静脈内投与した。全ての分子を０．５ｍｇ／ｋｇで投与した。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６を、いくつかの他の用量（０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ及び２ｍｇ／ｋｇ）でも試験した。
●フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ類似物を、０．５ｍｇ／ｋｇで２週間毎日静脈内投与した。

【0649】

腫瘍サイズをキャリパー測定によって評価した。腫瘍体積は、以下の式を用いて計算した：腫瘍体積（ｍｍ³）＝０．５×長さ×幅²。

【0650】

インビボ有効性を試験多重特異性タンパク質の作用様式と相関させるために、エクスビボアッセイをインビボモデルと並行して行った。この目的のために、ＮＸＧマウスに同じドナー由来のｈＰＢＭＣを腹腔内注射し、上記のように処置した。より具体的には、Ｔ細胞活性化をＦＡＣＳによって評価し、サイトカイン／ケモカイン放出を、マウス血清及びマウス腫瘍上清において、それぞれＬｕｍｉｎｅｘ（商標）及びＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）アッセイによって決定した。簡単に説明すると、Ｔ細胞活性化評価のために、試験タンパク質を最初に注射してから３日後、マウスの一部を屠殺した。提供者のプロトコルに従ってｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）によって腫瘍を解離させ、細胞懸濁液に対してＦＡＣＳアッセイを行った。図６７は、解離したＭＯＬＭ－１３腫瘍におけるヒト免疫細胞（ｈＣＤ４５＋）及び活性化Ｔ細胞（ＣＤ４＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋及びＣＤ８＋／ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋）の頻度を示す。データは、平均及びＳＥＭ（平均の標準誤差）で示される。

【0651】

血清中のサイトカイン及びケモカイン放出の評価のために、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイを、試験タンパク質の最初の注射の４時間後に採取したマウス血液からのマウス血清中で行った。Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）アッセイは、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入したヒトカスタム多重４ビーズアレイアッセイである。より具体的には、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－αのレベルを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（商標）ＭＡＧＰＩＸ機器を使用して製造業者の推奨に従って測定した。全ての試験試料を氷上で解凍し、２０００ｒｐｍで３分間遠心分離し、次いでキャリブレータ希釈剤で１：２に希釈した。各試験試料を二連でアッセイした。更に、４つのＱＣ（品質管理）試料を、製造業者の指示に従って、二連で、様々なサイトカイン標準試料（Ｓ２、Ｓ３、Ｓ５、Ｓ６、すなわち、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６、ＩＬ－２、及びＴＮＦ－α）からのキャリブレータ希釈剤中で１：２に希釈した。製造業者によって供給されたサイトカイン標準を二連でアッセイし、試験試料並びにＱＣ試料の濃度を計算するために使用した。サイトカインレベルを、１回目の注射の４時間後に採取した血清試料において測定した。図６８は、マウス血清中のＩＮＦガンマ、ＩＬ－６、ＩＬ－２、及びＴＮＦαのレベルを示す。データを平均及びＳＥＭで表示する。

【0652】

更に、試験タンパク質を最初に注射してから３日後、マウスを屠殺し、腫瘍を採取した。提供者のプロトコルに従ってｇｅｎｔｌｅＭＡＣＳ（商標）によって腫瘍を解離させた。ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦα用にカスタマイズされたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｍｕｌｔｉ－Ｓｐｏｔ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍのＶＰｌｅｘ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（ヒト）キット（Ｋ１５１Ａ９Ｈ－４）を使用して、腫瘍上清中のサイトカインレベルを測定した。以下のアッセイプロトコルを、実施例１８及び１９により詳細に記載する。図６９は、例としてマウス腫瘍上清におけるＩＦＮγ及びＩＬ－６のレベルを示す。

【0653】

実験Ｃのこの実験設定において、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７５は、インビボでいかなる有効性も示さなかった（図６５）。これらのデータは、同じ分子中のＴ細胞動員結合ドメイン及び腫瘍関連抗原特異性結合ドメインの両方の存在が（例えば、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７中のように）抗腫瘍有効性をインビボで誘導するために必要とされることを実証する。試験したＴ細胞エンゲージャＤＡＲＰｉｎタンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、インビボで良好な抗腫瘍有効性を示した（図６５）。この抗腫瘍有効性は濃度依存性であった（図６６）。本発明のＴＣＥタンパク質のインビボ抗腫瘍活性は、腫瘍組織における免疫細胞数の増加及びＴ細胞活性化に起因すると考えられる（図６７）。本発明のＴＣＥタンパク質は、腫瘍組織においてサイトカイン／ケモカイン放出を誘発するが（図６９）、血清中でははるかに少ないか又は軽微であり（図６８）、これは有益な安全プロファイルと一致する。

【0654】

実施例１５：ＡＭＬ患者ＢＭＭＣ腫瘍細胞との共培養における標的特異的短期自己及び同種異系Ｔ細胞活性化及び腫瘍細胞殺傷の評価
ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の特異性及び効力を、ＡＭＬ患者細胞の存在下でＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５活性化マーカを測定するＦＡＣＳによるインビトロ短期Ｔ細胞活性化アッセイ、及びＦＡＣＳによるインビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイにおいて評価した。

【0655】

したがって、１２０，０００個の精製された汎Ｔエフェクタ細胞を、製造業者（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）のプロトコルに従ってｃｅｌｌ ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、１ウェル当たり３０，０００個のＡＭＬ腫瘍細胞（ＢＭＭＣ、Ｍ４型）（Ｅ：Ｔ比４：１）と、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の段階希釈物と共に、２連で、２００μＭヒト血清アルブミンの存在下、３７℃で４８時間共培養した。４８時間後、細胞を洗浄し、１：３，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）、１：４００マウス抗ヒトＣＤ８ Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ（ＢＤ）、及び１：１００マウス抗ヒトＣＤ２５ ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）抗体を用いて４℃で３０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。同種異系Ｔ細胞活性化を、ＣＴＶについて陽性の、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。自己Ｔ細胞活性化を、ＣＴＶ ｖｉｏｌｅｔ染色について陰性の、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性及びＣＤ８＋ゲートＴ細胞陽性上のＣＤ２５＋細胞を測定することによって評価した。ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを用いてＦＡＣＳデータを分析し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ８（３－ＰＬ－フィット）を用いてデータをプロットした。

【0656】

図５３Ａに示すように、ＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、及びＣＤ７０に対して結合特異性を有する（したがって、３つの腫瘍特異性標的に結合する）試験したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、強力かつ特異的な同種異系Ｔ細胞活性化を誘導した。加えて、自己Ｔ細胞上のＣＤ２５マーカのアップレギュレーションを示すことができた。

【0657】

薬物及び標的特異性腫瘍細胞殺傷を評価するために、エフェクタ及び標的細胞を、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、陰性対照ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４、フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ３３０類似物の段階希釈物の存在下で、４：１のＥ：Ｔ比で２連で同時インキュベートした。精製された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）汎Ｔ細胞（健常ドナーＰＢＭＣから単離された）を、製造業者のプロトコルに従って、Ｃｅｌｌｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で最初に標識した。次いで、１ウェル当たり１２０，０００個のＣＴＶ標識汎Ｔ細胞と３０，０００個のＡＭＬ腫瘍細胞（ＢＭＭＣ、Ｍ４型）を、２００μＭのヒト血清アルブミン（生理学的濃度を模倣するため）の存在下で、選択されたＣＤ３特異性アンキリン反復タンパク質又は対照分子の段階希釈物と一緒に３７℃でインキュベートした。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：３，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で４℃で２０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、ＣＴＶ陰性、単一、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性細胞にゲーティングすることによって評価した。ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（３ＰＬ－フィット）を用いてプロットした。

【0658】

図５３Ｂに示すように、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６は、ＡＭＬ患者由来細胞の強力かつ特異的な腫瘍細胞殺傷を示し、効力は、比較したＡＭＧ３３０類似物とフロテツズマブ類似物との間である。陰性対照は、腫瘍細胞殺傷をほとんどもたらさない。

【0659】

実施例１６：エキソビボＡＭＬ細胞の自己殺傷における多重特異性結合タンパク質の効果
エキソビボＡＭＬ細胞の自己殺傷における選択された多重特異性結合タンパク質の効果を、エキソビボ患者の試料中の薬物の完全な薬理学的特徴付けを行うために、独自の自動フローサイトメトリーベースの技術ＰｈａｒｍａＦｌｏｗ（商標）を使用して、Ｖｉｖｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈによって提供された天然環境におけるエキソビボ個別化医療試験によって評価した。更に、Ｖｉｖｉａは、予測エキソビボ天然環境アッセイを生成し、薬物プロファイリング及び特徴付けと並行して信頼性がありロバストな予測バイオマーカを同定し、化合物の活性の高含量、信頼性があり臨床的に実施可能な予測データを提供することによって、臨床開発を合理化することができる。

【0660】

この試験の目的は以下のことであった。
１．フローサイトメトリーによって、ベースラインで分子（ＣＤ１２３、ＣＤ３３、及びＣＤ７０）の標的の細胞表面発現を評価する。
２．ＶｉｖｉａのＮａｔｉｖｅ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ Ｉｍｍｕｎｏ－Ｏｎｃｏｌｏｇｙアッセイにおいて、単剤としてフロテツズマブと共に、異なる試験タンパク質のエキソビボ薬理活性を実施する。
３．可溶性サイトカインのアッセイ後測定のために、各ウェルの上清、条件、及び時点を保存する。
４．保存された上清中の異なるサイトカインレベルの評価を行う。

【0661】

実験設計は以下のように行った。
－ビーズを使用した、病理学的細胞上の分子標的発現（ＣＤ１２３、ＣＤ３３及びＣＤ７０）の定量化（３連、ベースライン）。
－用量応答曲線によって、病的細胞及びＴ細胞の両方について同時に枯渇及び活性化を測定する。
－８つの異なる濃度（５０ｎＭ、１０ｎＭ、２ｎＭ、０．４ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０１６ｎＭ、０．００３２ｎＭ、及び０．０００６４ｎＭ）の試験タンパク質ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（配列番号９５）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（配列番号９６）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８（配列番号９７）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（配列番号９８）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０（配列番号９９）及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１（配列番号１００）。
－単一療法における１つのベンチマーク（フロテツズマブ（ＭＰＥＸＴ１１８））の８つの異なる濃度（上記の通り）。
－陰性対照としてのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７４の３連での１つの高濃度。
－三連での１つの陰性対照（陰性対照は化合物を含まないことを意味し、これらのウェルは溶媒のみを含む）。
－２つのインキュベーション時点（７２時間及び１２０時間）。
－可溶性サイトカインの将来の測定のための上清の保存。
－各インキュベーション時間（７２時間及び１２０時間）後に、全ての実験条件からの上清を－８０℃で保存する。
－上清中の異なるサイトカインレベルを測定する。

【0662】

試料収集
Ｖｉｖｉａは、このプロジェクトのために、ＣＤ１２３及びＣＤ３３を共発現する成人ＡＭＬ患者由来の５つの凍結骨髄試料（試料ＩＤ：１３０４３、１３０４５、１３２７１、１３２７２、１５１３１）を使用した。試料は、Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（商標）チューブに抽出した患者の通常の治療計画内のそれぞれの病院センターにおいて、センターでの臨床診療に続いて、抗凝固剤としてヘパリンを含有する。試料の一部を、Ｃｅｎｔｅｒ’ｓ Ｅｔｈｉｃａｌ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｓが承認した調査試験プロトコル及び患者のインフォームドコンセントに署名した下で、Ｖｉｖｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ研究所に送った。

【0663】

試料の小画分を特異性モノクローナル抗体（ＭｏＡｂ）で染色して、病的細胞及び細胞生存性を同定した。生存細胞数が確立され、分析に十分であるとみなされたら、試料の異なる画分において第２の染色を実施して、アイソタイプ対照と比較した標的タンパク質（ＣＤ１２３、ＣＤ３３、ＣＤ７０）の発現を判定した。ＱｕａｎｔｉＢＲＩＴＥ ＰＥキット（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を製造業者の推奨に従って使用して、標的の発現を定量した。５つの試料全てがＣＤ３３及びＣＤ１２３の発現を示し、ＣＤ３３が最も強く発現されたＴＡＡである。ＣＤ７０発現は、キットの検出限界未満である。

【0664】

殺傷アッセイを行うために、各試料を、２０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ及び１％抗生物質を補充した適切な体積のＩＭＤＭ／Ｌ－グルタミン４ｍＭ（「Ｖｉｖｉａ培地」）で希釈して、１ウェル当たり６０μＬの最終体積にした。混合物を、自動Ｅｃｈｏ ５５０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒを使用して予め調製した化合物を含有する９６ウェルプレートに分注した。試料を含有するプレートを、５％ＣＯ２を含有する加湿空気中、３７℃で７２時間及び１２０時間インキュベートした。最終エンドポイントにおいて、細胞を、ベースライン特徴付けに従って病理学的細胞をより良好に識別するｍＡｂ＋細胞死を測定するためのアネキシンＶ、及びＴ細胞活性化を測定するためのＣＤ２５で染色した。最後に、プレートをＶｉｖｉａのＰｈａｒｍａＦｌｏｗプラットフォームで分析した。殺傷適合曲線は、個々のドナー適合の中央値として図５４Ｂに示す。Ｔ細胞活性化を、ＣＤ２５陽性Ｔ細胞の％として図５４Ａに示す。殺傷及びＴ細胞活性化データの両方は、試験した全てのタンパク質が、自己環境においてＡＭＬ細胞の殺傷及びＴ細胞活性化を誘導し得ることを示す。

【0665】

実施例１７：ＣＤ３４＋選別されたＬＳＣ及びＨＳＣの殺傷に対する多重特異性結合タンパク質の効果
白血病幹細胞（ＬＳＣ）及び造血幹細胞（ＨＳＣ）の殺傷における選択された多重特異性結合タンパク質の有効性及び選択性を試験するために、凍結ＡＭＬ（末梢血及び／又は骨髄）及び健常ドナー骨髄試料を、ＣＤ３４＋細胞についてＦＡＣＳ選別した。

【0666】

実験の開始時（０日目）に、ＣＤ３４＋選別細胞の一部を染色し（ＣＤ７０ＰＥ、ＣＤ１２３ＢＶ４２１、及びＣＤ３３ＡＰＣ）、フローサイトメトリー（ＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ Ａｎａｌｙｚｅｒ）によって測定して、アイソタイプ対照に対してデルタメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）を計算することによって標的発現を定量化した。図５５は、デルタＭＦＩとして表される、異なるＬＳＣ及びＨＳＣ試料にわたる発現中央値を示す。

【0667】

ＬＳＣ／ＨＳＣ殺傷アッセイのために、選別されたＣＤ３４＋ＡＭＬ ＬＳＣ又は健常ドナーＨＳＣを、１００ｐＭ、１０ｐＭ又は１ｐＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５８、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６０、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６１又はベンチマーク分子（フロテツズマブｓｉｍｉｌａｒ及びＡＭＧ３３０類似物）が存在する状態で、９６ウェルＵ底プレート中で４日間、最初に同種異系Ｔ細胞（健常ドナーのバフィーコートから単離）と１：１の比で共培養した。使用したＳｔｅｍＳｐａｎ培地は、サイトカインミックス（ＳＣＦ、ＩＬ－６、ＩＬ－３、Ｆｌｔ３）及び１０μＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）も含有していた。４日間のインキュベーション後、細胞を再懸濁し、半固体メチルセルロース培地に移して、２週間の更なる培養後のコロニー形成能を調べた。コロニー数を最終的に未処置対照（＝１００％、すなわち殺傷なし）に対して正規化した。図５６は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７による、ＨＳＣ（白抜きの棒）よりもＬＳＣ（黒塗りの棒）の優先的な殺傷を示し、ＬＳＣとＨＳＣとの間の治療機会の存在を確認するものである。更に、２つのベンチマーク化合物（フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ３３０類似物）を含めて、これらの２つの分子と比較した選択されたＤＡＲＰｉｎタンパク質の特異性の差を示した。図５６は、両方のベンチマーク分子がＬＳＣに対して強力であるが、フロテツズマブがＨＳＣを等しく良好に殺傷させていることも示す。ＡＭＧ３３０も同様にいくらかの機会を示すが、低ｐＭ濃度でＨＳＣを強力に殺傷させる。ＴＡＡ結合ではないがＣＤ３結合タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７６を陰性対照として使用した。ＣＤ７０－ＣＤ３特異性結合タンパク質であるＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃７８を陽性対照として用いて、ＣＤ７０の発現が非常に低い場合であっても、ＣＤ７０のみを標的とすることによる殺傷が可能である（かつＬＳＣに特異的である）ことを証明した。

【0668】

実施例１８：ＡＭＬ Ｍｏｌｍ－１３細胞の殺傷及びサイトカイン放出の誘導に対する多重特異性結合タンパク質の効果
ベンチマーク分子（フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ３３０類似物）と共に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９、及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２の特異性及び効力を、ＡＭＬ細胞株Ｍｏｌｍ－１３の存在下でのＦＡＣＳベースのインビトロ腫瘍細胞殺傷アッセイによって評価した。薬物及び標的特異性腫瘍細胞殺傷を評価するために、エフェクタ細胞及び標的細胞を、選択した分子の段階希釈物の存在下で５：１のＥ：Ｔ比にて２連で同時インキュベートした。精製された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）汎Ｔ細胞（健常ドナーＰＢＭＣから単離された）を、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で最初に標識した。次いで、１ウェル当たり１００，０００個のＣＴＶ標識汎Ｔ細胞と２０，０００個のＭｏｌｍ－１３細胞を、２０μＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ結合ドメインの飽和を提供するため）の存在下で、選択された多重特異性タンパク質又は対照分子の段階希釈物と一緒に３７℃でインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、サイトカイン測定のために－８０℃で保存し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：３，０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で４℃で２０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、ＣＴＶ陰性、単一、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性細胞にゲーティングすることによって評価した。ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（３ＰＬ－フィット）を用いてプロットした。

【0669】

ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦα用にカスタマイズされたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｍｕｌｔｉ－Ｓｐｏｔ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍのＶＰｌｅｘ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（ヒト）キット（Ｋ１５１Ａ９Ｈ－４）を使用して、上清中のサイトカインレベルを測定した。ＭＳＤ機器は、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ－ＴＡＧで標識された検出抗体を使用して、ＭＳＤプレートのウェル内で生成される電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを使用して、各試料中に存在する分析物の定量的測定を提供する。信号は、作用電極上に層化された各アッセイ「スポット」からの実際の光子カウントとして報告される。実験は、製造業者のガイドに指示される通り行った。簡潔には、全ての上清を室温（ＲＴ）で解凍し、ＭＳＤプレートに添加する前に希釈剤２で５倍に希釈した。凍結乾燥されたキャリブレータブレンドを希釈剤２（標準プロトコルより４倍高い）中で再構成し、一連の５倍希釈を実施して、７つのキャリブレータ及び８番目の０キャリブレータ（希釈剤２）を得た。４つの分析物のそれぞれに対してＳｕｌｆｏＴａｇ抗体を、希釈剤３中の５０倍希釈によって一緒に合わせた。４倍Ｒｅａｄ緩衝液を脱イオン水で２倍に希釈することによって、２倍Ｒｅａｄ緩衝液を調製した。ＭＳＤプレートを洗浄するための洗浄緩衝液は、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０であった。プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて１ウェル当たり５０μＬの試料／キャリブレータを添加し、７００ｒｐｍのオービタルシェーカ上で室温で２時間インキュベートした。その後、１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μＬ／ウェルの検出抗体溶液を添加した。抗体インキュベーションもまた、７００ｒｐｍのオービタルシェーカ上で室温で２時間行い、続いて１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄後、１５０μＬ／ウェルの２倍Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを添加し、ＭＳＤ ＭＥＳＯ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱを使用してプレートを読み取った。全てのデータファイルを、ＭＳＤ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを使用して、アッセイ分析物、プレートレイアウト、及び希釈物を測定された各プレートに割り当てることによって分析した。ソフトウェアは、各プレート（ロット特異的）からの４つ全ての分析物についての較正曲線の４つのパラメータロジスティックフィットにバックフィッティングすることによって、ｐｇ／ｍＬで計算濃度を提供した。出力値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して非線形回帰グラフとしてプロットした。

【0670】

図５７（Ａ～Ｈ）に示すように、試験したタンパク質ｓＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２は、Ｍｏｌｍ－１３細胞の強力な殺傷を示す（ＥＣ５０ ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（４．４ｐＭ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７（１．０ｐＭ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５９（１．４ｐＭ）、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃６２（２．９ｐＭ）、フロテツズマブ（０．４ｐＭ）、ＡＭＧ３３０（０．５ｐＭ））。上清中のＩＦＮγの定量はまた、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が最良の安全性プロファイルを示し、ＩＦＮγの最低の放出を誘導することを示す。

【0671】

実施例１９：患者由来ＡＭＬ細胞の殺傷及びサイトカイン放出の誘導に対する多重特異性結合タンパク質の効果
陽性対照として使用したベンチマーク分子（フロテツズマブ類似物及びＡＭＧ３３０類似物）と共に、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７の特異性及び効力を、ＡＭＬドナー患者細胞の存在下でのＦＡＣＳベースのエキソビボ腫瘍細胞殺傷アッセイによって評価した。薬物及び標的特異性腫瘍細胞殺傷を評価するために、ＡＭＬ患者由来細胞を、選択された分子の段階希釈物の存在下で、二連で、単独でインキュベートするか（自己設定）、又は健康なドナー由来の汎Ｔ細胞と共インキュベートした（同種設定）。同種異系設定では、約４：１のエフェクタ細胞（Ｅ）（すなわち、Ｔ細胞）：標的細胞（Ｔ）（すなわち、ＡＭＬ細胞）比が達成された。自家設定では、Ｅ：Ｔ比は、ＡＭＬドナー患者細胞試料中のＴ細胞の数が限られているため、はるかに低かった。

【0672】

自家設定のために、１ウェル当たり２５，０００個のＡＭＬ患者細胞を、２０μＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ結合ドメインの飽和を提供するため）及び４０ｎｇ／ｍｌの各サイトカイン（ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ－ＣＳＦ）の存在下で、選択されたＣＤ３特異性ＤＡＲＰｉｎ化合物又は対照分子の段階希釈物と共に３７℃でインキュベートした。４８及び１２０時間後、上清を回収し、サイトカイン測定のために－８０℃で保存し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：３０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で４℃で２０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、単一のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性細胞上でゲーティングすることによって評価した。ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（３ＰＬ－フィット）を用いてプロットした。

【0673】

同種異系セットアップのために、精製された（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）汎Ｔ細胞（健常ドナーＰＢＭＣから単離された）を、製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒから購入）で最初に標識した。次いで、１ウェル当たり１００，０００個のＣＴＶ標識汎Ｔ細胞と２５，０００個のＡＭＬ患者細胞を、２０μＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ結合ドメインの飽和を提供するため）及び４０ｎｇ／ｍｌの各サイトカイン（ＩＬ－６、ＧＭ－ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＴＰＯ、Ｆｌｔ３Ｌ、Ｇ－ＣＳＦ）の存在下で、選択されたＣＤ３特異性ＤＡＲＰｉｎ化合物又は対照分子の段階希釈物と共に３７℃でインキュベートした。４８時間後、上清を回収し、サイトカイン測定のために－８０℃で保存し、細胞をＰＢＳで洗浄し、１：３０００のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ｇｒｅｅｎ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒから購入）で４℃で２０分間染色した。洗浄及び固定後、細胞をＦＡＣＳ Ｃａｎｔｏ ＩＩ（ＢＤ）機で分析した。腫瘍細胞殺傷を、ＣＴＶ陰性、単一、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ陰性細胞にゲーティングすることによって評価した。ＦＡＣＳデータを、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して分析した。データを共培養のみのバックグラウンドに対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８（３ＰＬ－フィット）を用いてプロットした。

【0674】

ＩＦＮγ、ＩＬ－２、及びＴＮＦα用にカスタマイズされたＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）Ｍｕｌｔｉ－Ｓｐｏｔ Ａｓｓａｙ ＳｙｓｔｅｍのＶＰｌｅｘ Ｐｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ Ｐａｎｅｌ １（ヒト）キット（Ｋ１５１Ａ９Ｈ－４）を使用して、上清中のサイトカインレベルを測定した。ＭＳＤ機器は、ＭＳＤ Ｓｕｌｆｏ－ＴＡＧで標識された検出抗体を使用して、ＭＳＤプレートのウェル内で生成される電気化学発光（ＥＣＬ）シグナルを使用して、各試料中に存在する分析物の定量的測定を提供する。信号は、作用電極上に層化された各アッセイ「スポット」からの実際の光子カウントとして報告される。実験は、製造業者のガイドに指示される通り行った。簡潔には、全ての上清を室温（ＲＴ）で解凍し、ＭＳＤプレートに添加する前に希釈剤２で５倍に希釈した。凍結乾燥されたキャリブレータブレンドを希釈剤２（標準プロトコルより４倍高い）中で再構成し、一連の５倍希釈を実施して、７つのキャリブレータ及び８番目の０キャリブレータ（希釈剤２）を得た。４つの分析物のそれぞれに対してＳｕｌｆｏＴａｇ抗体を、希釈剤３中の５０倍希釈によって一緒に合わせた。４倍Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを脱イオン水で２倍に希釈することによって、２倍Ｒｅａｄ緩衝液を調製した。ＭＳＤプレートを洗浄するための洗浄緩衝液は、ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０であった。プレートを１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、続いて１ウェル当たり５０μＬの試料／キャリブレータを添加し、７００ｒｐｍのオービタルシェーカ上で室温で２時間インキュベートした。その後、１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄し、２５μＬ／ウェルの検出抗体溶液を添加した。抗体インキュベーションもまた、７００ｒｐｍのオービタルシェーカ上で室温で２時間行い、続いて１５０μＬ／ウェルの洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後の洗浄後、１５０μＬ／ウェルの２倍Ｒｅａｄ緩衝液Ｔを添加し、ＭＳＤ ＭＥＳＯ ＱｕｉｃｋＰｌｅｘ ＳＱを使用してプレートを読み取った。全てのデータファイルを、ＭＳＤ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｗｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェアを使用して、アッセイ分析物、プレートレイアウト、及び希釈物を測定された各プレートに割り当てることによって分析した。ソフトウェアは、各プレート（ロット特異的）からの４つ全ての分析物についての較正曲線の４つのパラメータロジスティックフィットにバックフィッティングすることによって、ｐｇ／ｍＬで計算濃度を提供した。出力値を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍを使用して非線形回帰グラフとしてプロットした。

【0675】

図５９（Ａ～Ｌ）及び図６０（Ａ～Ｌ）に示すように、試験タンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、５日間にわたって、ＡＭＬ患者細胞の強力な自己殺傷を濃度依存的に示した（ＥＣ５０値：ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６：３３ｐＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７：２．９ｐＭ、フロテツズマブ類似物：０．４ｐＭ、ＡＭＧ３３０－類似物：４ｐＭ）。サイトカイン放出誘導と患者ＡＭＬ細胞殺傷データとの比較は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が最低レベルのサイトカインを誘導したため、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６について有効濃度で潜在的に最良の安全性プロファイルを示す。また、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、ベンチマークフロテツズマブ類似物よりも少ないサイトカインを誘導した。

【0676】

同様に、図６１（Ａ～Ｌ）に見られるように、試験タンパク質のＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７はまた、同種異系の設定において腫瘍細胞の強力な殺傷を示した（ＥＣ５０：ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６：１０３ｐＭ、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７：２２．７ｐＭ、フロテツズマブ類似物：０．６ｐＭ、ＡＭＧ３３０類似物：４．１ｐＭ）。また、この実験設定において、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、ベンチマークフロテツズマブ類似物よりも少ないサイトカインを誘導した。

【0677】

実施例２０：多特異性結合タンパク質の存在下で全血をＭｏｌｍ－１３細胞でスパイクしたときのサイトカイン放出に対する効果。
サイトカイン放出を、Ｍｏｌｍ１３細胞でスパイクした２人の健常ドナーからの全血を使用して、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６及びＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７について評価した。４００，０００個のＭｏｌｍ１３細胞を、選択された分子の段階希釈物の存在下で健常ドナーの全血と一緒にインキュベートした。Ｍｏｌｍ１３細胞の数は、１：２のＥ：Ｔ比を達成し、各ウェルにおいて約２０～２５％の腫瘍負荷を得るように選択した（１８０μＬの血液中の平均白血球数はほぼ１３０万個の白血球であり、約２００，０００個の総Ｔ細胞を有するため）。Ｍｏｌｍ１３細胞を、健常ドナーの分子及び全血と一緒に３７℃で３０分間及び６時間インキュベートした。各ドナープレートからの上清を２つの異なる時点（３０分及び６時間）で収集し、サイトカイン測定アッセイの準備ができるまで－８０℃で保存した。３０分のインキュベーション時間後に、有意なサイトカイン放出は観察されなかった。

【0678】

上清中のサイトカインレベルを、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ（ＭＳＤ）を使用して測定した。マルチスポットアッセイシステムのＶＰｌｅｘ炎症促進性パネル１（ヒト）キット（Ｋ１５１Ａ９Ｈ－４）は、実施例１９に記載されるのと同じプロトコルに従って、ＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦαについてカスタマイズした。

【0679】

図６２（Ａ～Ｈ）に示すように、上清中のＩＦＮγ、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及びＴＮＦαの定量は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が両方のドナーにおいて４つの試験したサイトカインの最低の放出を誘導することを実証し、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が試験した分子の中で最良の安全性プロファイルを有する可能性が高いことを示した。また、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５７は、ベンチマーク分子よりも全体的に低いサイトカイン誘導を示した。

【0680】

実施例２１：表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６のＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ７０、ＣＤ３、及び血清アルブミンへの同時結合の決定。
ヒトＣＤ３３、ヒトＣＤ１２３、ヒトＣＤ７０、及びヒトＣＤ３標的並びにヒト血清アルブミンへのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の同時結合を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。

【0681】

ＳＰＲ測定は、Ｓｉｅｒｒａ ＳＰＲ（登録商標）－３２機器（Ｂｒｕｋｅｒ）で行った。０．００５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ ｐＨ７．４を、泳動用緩衝液として使用した。２６００ＲＵの３００ｎＭヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をＨＣＡセンサチップ上に固定した。ＨＳＡ固定化チップに、連続して、１ｎＭのＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６（会合６０秒、解離０秒）、２００ｎＭのｈＣＤ７０（会合４０秒、解離０秒）、及び５００ｎＭのｈＣＤ１２３（会合１２０秒、解離０秒）を、独立した分析物注射工程として適用した。直後に、１５０ｎＭのｈＣＤ３３（会合１５０秒、解離０秒）、続いて１．３５μＭのｓｃＣＤ３（会合１５０秒、解離１８０秒）を注射する二重注射工程を実施した。より具体的には、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６の注射は、７５０ＲＵの応答をもたらした。次に、３００ＲＵのｈＣＤ７０をＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６に結合させた。続いて、ｈＣＤ１２３を注射し、７００ＲＵの増加により、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６への結合を示すことができた。二重注射を使用して、ｈＣＤ３３結合は、更に８００ＲＵの応答を与え、これに続いて、ｈＣＤ３３の注射停止時にｓｃＣＤ３が結合し、１５０ＲＵが更に増加した。注目すべきことに、ｈＣＤ３のＲＵの減少は、ｓｃＣＤ３注射期の間のｈＣＤ３３の進行中の解離を示す。

【0682】

この設定は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が既にＨＳＡに結合している場合にのみ、ｈＣＤ７０、ｈＣＤ１２３、ｈＣＤ３３及びｓｃＣＤ３の結合を可能にした。この設定の要件は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が高い親和性でＨＳＡ及びｈＣＤ７０／ｈＣＤ１２３に結合して、最後の標的を適用する前の急速なシグナル損失を防ぐことであった。ｈＣＤ３３及びｓｃＣＤ３のより速い解離速度を克服するために、これらの標的について二重注射を使用して、ｈＣＤ３３注射停止とｓｃＣＤ３注射開始との間の時間を短縮した。要するに、二重注射は、気泡によって１つのシリンジ内で両方の標的溶液を分離することによって行われる。更に、表１１の注射スキームに記載されているように、標的なし（ＰＢＳＴ）又は標的の１つのみ（分析物２～５）を注射することによって、単回注射対照実験を行った。シグナルは、同じチャネル上の空の対照スポットを基準とした。２０μｌ／分での二重注射を除いて、全ての工程を１０μｌ／分の流速で行った。

【0683】

図６３は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６のＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３及びＣＤ３への同時結合のＳＰＲトレースを示す。ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６のＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ３３及びＣＤ３への同時結合は、プレートに固定された血清アルブミンに結合したＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６上で起こった。これらの発見は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６が、その標的の５つ全てに同時に結合することができることを示す。

【0684】

【表20】

【0685】

更に、同時結合の理論的センサグラムを、全ての標的の単回注射の値を合計することによって計算した（冗長なＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６添加についての制御は、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６単回注射を３回減算することによって達成される）。「測定」及び「計算」センサグラムの重ね合わせは、ＤＡＲＰｉｎ（登録商標）タンパク質＃５６がその５つの標的の全てに同時に結合することができることを確認する（図６４）。図６４は、「測定」及び「計算」ＳＰＲトレースの比較を示す。

【0686】

本明細書は、明細書内で引用された参考文献の教示に照らして最も十分に理解される。本明細書内の態様は、本発明の態様の例示を提供し、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。当業者は、多くの他の態様が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示で引用された全ての刊行物、特許、及びＧｅｎＢａｎｋ配列は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾するか、又は一致しない限り、本明細書は、任意のそのような資料に優先する。本明細書における参考文献の引用は、そのような参考文献が本発明に対する先行技術であることを認めるものではない。

【0687】

当業者は、本明細書に記載の本発明の特定の態様に対する多くの等価物を認識するか、又は日常的な実験のみを使用して確認することができる。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図される。

【0688】

【表21-1】

【0689】

【表21-2】

【0690】

【表21-3】

【0691】

【表21-4】

【0692】

【表21-5】

【0693】

【表21-6】

【0694】

【表21-7】

【0695】

【表21-8】

【0696】

【表21-9】

【0697】

【表21-10】

【0698】

【表21-11】

【0699】

【表21-12】

【0700】

【表21-13】

【0701】

【表21-14】

【0702】

【表21-15】

【0703】

【表21-16】

【0704】

【表21-17】

【0705】

【表21-18】

【0706】

【表21-19】

【0707】

【表21-20】

【0708】

【表21-21】

【0709】

【表21-22】

【0710】

【表21-23】

【0711】

【表21-24】

【0712】

【表21-25】

【0713】

【表21-26】

【0714】

【表21-27】

【0715】

【表21-28】

【0716】

【表21-29】

【0717】

【表21-30】

【0718】

【表21-31】

【図1A】

【図1B】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12A】

【図12B】

【図12C】

【図12D】

【図13A】

【図13B】

【図13C】

【図13D】

【図14A】

【図14B】

【図14C】

【図14D】

【図15A】

【図15B】

【図16A】

【図16B】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20A】

【図20B】

【図20C】

【図21】

【図22A】

【図22B】

【図23A】

【図23B】

【図24A】

【図24B】

【図25】

【図26A】

【図26B】

【図27A】

【図27B】

【図28A】

【図28B】

【図28C】

【図28D】

【図28E】

【図28F】

【図29A】

【図29B】

【図29C】

【図29D】

【図29E】

【図29F】

【図30A】

【図30B】

【図30C】

【図30D】

【図30E】

【図30F】

【図31A】

【図31B】

【図31C】

【図31D】

【図31E】

【図31F】

【図32A】

【図32B】

【図32C】

【図32D】

【図32E】

【図32F】

【図33A】

【図33B】

【図33C】

【図33D】

【図33E】

【図33F】

【図34A】

【図34B】

【図34C】

【図34D】

【図34E】

【図34F】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図35D】

【図35E】

【図35F】

【図36A】

【図36B】

【図36C】

【図36D】

【図36E】

【図36F】

【図37A】

【図37B】

【図37C】

【図37D】

【図37E】

【図37F】

【図38A】

【図38B】

【図39A】

【図39B】

【図40】

【図41】

【図42A】

【図42B】

【図42C】

【図43A】

【図43B】

【図43C】

【図43D】

【図43E】

【図43F】

【図43G】

【図43H】

【図43I】

【図43J】

【図43K】

【図43L】

【図44A】

【図44B】

【図44C】

【図44D】

【図44E】

【図44F】

【図44G】

【図44H】

【図45A】

【図45B】

【図45C】

【図45D】

【図45E】

【図45F】

【図45G】

【図45H】

【図46A】

【図46B】

【図46C】

【図46D】

【図46E】

【図46F】

【図46G】

【図46H】

【図47A】

【図47B】

【図47C】

【図47D】

【図47E】

【図47F】

【図47G】

【図47H】

【図48A】

【図48B】

【図48C】

【図48D】

【図48E】

【図48F】

【図48G】

【図48H】

【図49A】

【図49B】

【図49C】

【図49D】

【図49E】

【配列表】

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【国際調査報告】