特表 2024-510046 複数の種類の核酸サンプルから二本鎖ＤＮＡライブラリを調製するための不偏同時増幅法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-05

(54)【発明の名称】複数の種類の核酸サンプルから二本鎖ＤＮＡライブラリを調製するための不偏同時増幅法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/6844 20180101AFI20240227BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240227BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/6844 Z ZNA

C12N15/11 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023574880

(86)(22)【出願日】2022-02-24

(85)【翻訳文提出日】2023-10-04

(86)【国際出願番号】 IB2022051620

(87)【国際公開番号】W WO2022180557

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】63/152,856

(32)【優先日】2021-02-24

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】17/496,796

(32)【優先日】2021-10-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514005364

【氏名又は名称】エージェンシー・フォー・サイエンス・テクノロジー・アンド・リサーチ

【氏名又は名称原語表記】ＡＧＥＮＣＹ ＦＯＲ ＳＣＩＥＮＣＥ，ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ ＡＮＤ ＲＥＳＥＡＲＣＨ

(74)【代理人】

【識別番号】100163991

【弁理士】

【氏名又は名称】加藤 慎司

(72)【発明者】

【氏名】コー，リアン チェー ウィンストン

(72)【発明者】

【氏名】ソウ，イーチー

(72)【発明者】

【氏名】ホン，シアン ショーン

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA18

4B063QQ08

4B063QQ28

4B063QQ52

4B063QQ62

4B063QR08

4B063QR35

4B063QR42

4B063QR62

4B063QR66

4B063QR77

4B063QS03

4B063QS25

4B063QS34

4B063QS36

4B063QX02

(57)【要約】

本発明は、複数の種類の核酸サンプルから二本鎖ＤＮＡライブラリを調製するための不偏同時増幅法に関する。特に、本発明は、従来のＤＮＡライブラリの調製方法と比較して、比較的短いターンアラウンド時間内に、実質的に増幅間及びｃＤＮＡ調製と増幅との間の精製ステップなしに、サンプル中の非核酸分子と比較して実質的に少量の複数の種類の核酸から二本鎖ＤＮＡライブラリを調製するための不偏同時増幅法を提供する。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

非核酸分子と比較して実質的に少量の複数の種類の核酸サンプルからライブラリを調製するための不偏同時増幅方法であって、前記方法は：
一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む複数の種類の核酸のサンプルを、その後の伸長及び増幅のテンプレートとして提供する工程と；
前記サンプルから第１のＤＮＡ鎖を調製する工程であって、第１のＤＮＡ鎖生成プライマをＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートの何れかにアニーリングすることと、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートの何れか又は両方からの前記第１のＤＮＡ鎖のワンポット合成を可能にするＤＮＡポリメラーゼを使用して、アニールされた第１のＤＮＡ鎖生成プライマから伸長することと、を含み、前記第１のＤＮＡ鎖生成プライマは：
第１のヌクレオチド配列であって、５’末端に第１のアダプタ配列を含み、その後にポリチミジン配列及び２つのランダムなヌクレオチドが続き、前記ポリチミジン配列は、少なくとも１０個のチミジン塩基を含み、その後にランダムなヌクレオチドＶが続き、更にランダムなヌクレオチドＮが続き、ここで、Ｖ及びＮは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによるものである、第１のヌクレオチド配列と、
第２のヌクレオチド配列であって、５’末端に第１のアダプタ配列を含み、その後に６つの反復ランダムヌクレオチドが続き、前記６つの反復ランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによる、Ｂ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される、第２のヌクレオチド配列と、
を含んでいる工程と、
ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの第２の鎖を調製する工程であって、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートからの解離及びその変性の後で、第２のＤＮＡ鎖生成プライマを前記第１のＤＮＡ鎖にアニ―リングすることと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、アニールされた前記第２のＤＮＡ鎖生成プライマから伸長することと、を含み、前記第２のＤＮＡ鎖生成プライマは：
３’末端にランダムな複数のヌクレオチドを含むランダムなヌクレオチド配列と、
前記ランダムなヌクレオチド配列に物理的に連結されたその５’末端における第２のアダプタ配列と、
を含んでおり、
前記複数のランダムなヌクレオチドは、８つの反復ランダムヌクレオチドを含み、前記８つの反復ランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによる、Ｂ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される、工程と；
ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの前記第２の鎖をポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅する工程であって、増幅プライマの１つの５’末端において前記第１のアダプタ配列を含み、増幅プライマの別の１つの５’末端において前記第２のアダプタ配列を含んでいる、一対の増幅プライマを、ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの前記第２の鎖にアニ―リングして、複数のアンプリコンを得ることを含み、それにより、前記アンプリコンの各々は、少なくとも第１及び第２のアダプタ配列を含み、前記第１及び第２のアダプタ配列の各々は、メチル化によって修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを有している、工程と；
前記アンプリコンを複数の二本鎖ＤＮＡフラグメントに断片化する工程であって、前記第１及び第２のアダプタ配列を欠く二本鎖ＤＮＡフラグメントを得るために、前記アンプリコンをメチル化特異的制限酵素と反応させることを含んだ工程と、
を含んでいる、方法。

【請求項2】

前記第１のＤＮＡ鎖生成プライマのうちの１つは、配列番号１によって表される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記第１のＤＮＡ鎖生成プライマのうちの１つは、配列番号２によって表される、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記第２のＤＮＡ鎖生成プライマのうちの１つは、配列番号３によって表される、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のアダプタ配列は、配列番号４によって表される、請求項１に記載の方法。

【請求項6】

前記第２のアダプタ配列は、配列番号５によって表される、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

メチル化ヌクレオシド三リン酸が、前記第１及び／又は第２のＤＮＡ鎖又はＤＮＡフラグメント調製及び／又は前記ポリメラーゼ連鎖反応における反応混合物に添加される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記メチル化ヌクレオシド三リン酸は、０．０１％～２５％の濃度のデオキシメチルシチジン三リン酸であり、前記ポリメラーゼ連鎖反応後に前記アンプリコン全体で０．０１％～２５％のメチル化シトシンを生じさせる、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

メチル化されたヌクレオチド塩基を有する複数のアンプリコンを得るために、前記第１のアダプタ配列中の１つのシトシンがメチル化によって修飾されてメチルシトシンになっている、請求項５に記載の方法。

【請求項10】

メチル化されたヌクレオチド塩基を有する複数のアンプリコンを得るために、前記第２のアダプタ配列中の１つのシトシンがメチル化によって修飾されてメチルシトシンになっている、請求項６に記載の方法。

【請求項11】

前記第１のＤＮＡ鎖生成プライマは、複数のランダムヌクレオチドを含んだランダムヌクレオチド配列と、その後に２つ以上のランダムヌクレオチドが続くポリチミジン配列とを、それぞれ１：１の比率で含んだ２つの異なるプライマである、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

少なくとも一対の二本鎖アダプタを付加する工程を更に含み、その両端に付加された二本鎖アダプタを含むサイズの１０００ヌクレオチド未満の二本鎖ＤＮＡ断片を得るために、その一方の鎖が、前記断片化後の二本鎖ＤＮＡ断片の両端の４－ヌクレオチドオーバーハングと相補的な４－ランダムヌクレオチドオーバーハングを含んでいる、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

その後のバーコーディングのために、対応する二本鎖アダプタがそれぞれ付加された二本鎖ＤＮＡ断片の両端に一対のシークエンスアダプタを付加する工程を更に含んでいる、請求項１２記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願への相互参照：
本出願は、２０２１年２月２４日に出願された米国仮出願第６３／１５２，８５６号、及び、２０２１年１０月８日に出願され後に許可された米国本出願第１７／４９６，７９６号の優先権を主張し、それらの開示の全体は参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本発明は、複数の種類の核酸サンプルから二本鎖ＤＮＡライブラリを調製するための不偏同時（unbiased and simultaneous）増幅法に関する。特に、本発明は、サンプル中の非核酸分子と比較して実質的に少量の複数の種類の核酸から二本鎖ＤＮＡライブラリを調製するための不偏同時増幅法を提供する。

【背景技術】

【0003】

生物学的又は医学的サンプルからのハイスループットシーケンシングのためのライブラリの調製は、核酸の量が通常は著しく少ないため、必ずしも容易ではない。従来の多くの方法では、この制限に対処するために、より複雑な手順を必要とし、より時間とコストがかかるか、特定の種類の核酸サンプルに限定されるか、又は、幾つかの要素を失ったり元のサンプルに属さない要素を追加したりする可能性がある。それは、特に核酸サンプルの量がピコグラムレベル以下しかない場合には、同じ標的に対する異なる種類の核酸間の偏りを回避又は低下させるような核酸サンプルの同時増幅が行われていないことを意味している。

【0004】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第５７３１１７１号（Ｂｏｈｌａｎｄｅｒら）は、配列非依存性増幅（ＳＩＡ）、即ち、顕微解剖された染色体材料などから微量のＤＮＡを増幅できるＰＣＲベースの方法を提供した。この方法では、３’末端に４～８個のランダムなヌクレオチドと、５’末端に１０～３０個の規定された（ランダムではない）配列と、からなる初期プライマを含み、ランダムなヌクレオチドは、Ｇ／Ａ／Ｔ／Ｃの何れか（任意の順序）にすることができる。初期プライマの３’末端は、ターゲットＤＮＡセグメント全体のランダムな部位に相補的である必要があるが、規定された配列は、自己相同性を形成せず、同じヌクレオチドが連続せず、過度に豊富なＧ：Ｃ又はＡ：Ｔを形成しないＰＣＲプライマを構成する必要がある。

【0005】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第６１２４１２０号（Ｌｉｚａｒｄｉら）は、一対の二本鎖ＤＮＡに相補的な２セットのプライマを使用する非ＰＣＲベースの多重鎖置換増幅（ＭＤＡ）法を提供した。この方法では、介在するプライマの一部がポリメラーゼによる複製中に置換される。この特許の別の実施形態においても、全ゲノムを配列決定するためにランダムなプライマセットが使用される。複製には、高度に処理能力の高いポリメラーゼが使用され、ゲノム全体の重複するコピーを短時間で合成することができる。

【0006】

しかしながら、Ｂｏｒｌａｎｄｅｒら及びＬｉｚａｒｄｉらの何れも、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、又はそれらの任意のアナログ（一本鎖若しくは二本鎖、又はその両方）を含む異なる核酸の混合物を含むサンプルを偏りなく同時に増幅するために使用することはできない。

【0007】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第７４０２３８６号（Ｋｕｒｎら）は、ＤＮＡ／ＲＮＡポリヌクレオチド標的を全体的に増幅するために、ＲＮＡ－ＤＮＡ複合プライマ、並びに、ＤＮＡ依存性及びＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用することを開示している。この方法では、その後の増幅の前に、ＲＮＡ／ＤＮＡヘテロ二本鎖からＲＮＡ部分を切断する必要がある。

【0008】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第７７１８４０３号及び米国特許第８２０６９１３号（Ｋａｍｂｅｒｏｖら）は、ライブラリ生成工程とライブラリ増幅工程とを含んだ全ゲノム増幅（ＷＧＡ）及び前トランスクリプトーム増幅（ＷＴＡ）の方法を開示している。これには、ＤＮＡ／ＲＮＡテンプレートから最初の鎖を生成するために、ライブラリ生成工程でのランダムプライマ及び特異的ＤＮＡポリメラーゼの使用が含まれる。ここで、プライマの可変領域は、プライマが互いにセルフハイブリダイズ又はクロスハイブリダイズしないように、それぞれ２つの非相補的ヌクレオチドで構成される最大３つのランダムなヌクレオチドを含んでいる。少なくとも３つの非相補的ヌクレオチド塩基で構成されるランダムなヌクレオチドではなく、２つの非相補的ヌクレオチド塩基で構成されるランダムなヌクレオチドを選択しても、ＰＣＲが短いアンプリコンの生成を促進するため、ランダムプライマのそれぞれに最大３つのランダムヌクレオチドしかない場合、ランダムプライマのプール間のクロスハイブリダイゼーションを効果的に減少させることはできない。非生産的な（unproductive）アンプリコンへのポリメラーゼの隔離を防ぐために、非特異的な（non－specific）アンプリコンを形成する能力を低下させることが重要である。

【0009】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第８７４１６０６号（Ｃａｓｂｏｎら）は、配列決定される核酸分子の両端に縮重塩基領域（ＤＢＲ；degenerate base region）をタグ付けして、２つの異なるＤＢＲにより非対称にタグ付けされた核酸分子を得る方法を開示している。ＤＢＲには、その後のＰＣＲのための配列決定プライマ部位が含まれている。’６０６の特定の実施形態では、ＤＢＲは３～１０個 のランダムなヌクレオチド長であってもよく、各ＤＢＲは異なる塩基組成を有していてもよく、例えば４塩基ＤＢＲは以下の組成の何れかを有していてもよい：ＮＮＮＮ；ＮＲＳＮ；ＳＷＳＷ；ＢＤＨＶ（ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによる）。’６０６では、配列決定する核酸分子の両端に２つの異なるＤＢＲを追加し、配列決定用のプライマ部位や固有の多重識別子などの幾つかの機能ドメインを付加するが、一本鎖又は二本鎖の何れかの形でＤＮＡ及びＲＮＡの両方を含む異なる核酸の混合物からのライブラリ調製のために主に設計されたものではない。

【0010】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第８７２８７６６号（Ｃａｓｂｏｎら）は、最初の標的ＤＮＡ分子のゲノムサンプルをハイブリダイズさせるために第１のプライマの集団（population）を使用することを含む、ゲノムＤＮＡサンプルを処理する方法を開示している。ここで、第１のプライマは、標的特異的配列の５’側に異なるＤＢＲ配列を含み、そして、異なるＤＢＲ配列には、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによる、Ｒ、Ｙ、Ｓ、Ｗ、Ｋ、Ｍ、Ｂ、Ｄ、Ｈ、Ｖ、Ｎ、又は、それらの修飾バージョンの少なくとも１つが含まれている。特定の例では、ＲＹＢがＤＢＲ配列として機能し、ＤＨＶＢが標的特異的配列として機能する。これらの例では、それらのランダムなヌクレオチドからの異なる配列の総数は９７２（２×２×３×３×３×３×３）になる可能性がある。’７６６の第１のプライマで使用されたＤＢＲ配列には、ランダムなヌクレオチドが未だ３つしかなかった。適切な条件下では、プライマ間のクロスハイブリダイゼーションが依然として発生する可能性がある。

【0011】

Ｒｏｌａｎｄ社による米国特許第９９２０３５５号（Ｏｓｂｏｒｎｅら）は、特定の制限酵素消化を使用してフラグメンテーションを容易にするために、第一鎖、第二鎖生成、及び／又はＰＣＲ増幅のためのＲＴ反応ミックスに、異なる濃度のデオキシメチル－シチジン三リン酸を含めることを含むライブラリ調製方法を提供している。

【0012】

したがって、ハイスループットシーケンシングには、実質的に少量の異なる種類の核酸の混合物のサンプルから偏りなくＤＮＡライブラリを調製するワンポット法が必要である。慎重に設計された一組のＤＮＡ鎖生成プライマーを使用してヌクレオチド配列のプールを標的とすることにより、どのような形態の核酸サンプルであっても、異なる形態の核酸の混合物のサンプルから同時に偏りのないライブラリ調製、即ち、ワンポット合成を行うことができると共に、核酸サンプルからＤＮＡ鎖を生成する際に、セルフプライミングが効率的に回避される。

【発明の概要】

【0013】

したがって、本発明の第１の態様では、非核酸分子と比較して実質的に少量の複数の種類の核酸サンプルからライブラリを調製するための不偏同時増幅方法が提供され、この本法は、以下の工程を含んでいる。
一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む複数の種類の核酸のサンプルを、その後の伸長及び増幅のテンプレートとして提供する工程；
前記サンプルから第１のＤＮＡ鎖を調製する工程であって、第１のＤＮＡ鎖生成プライマをＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートの何れかにアニーリングすることと、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートの何れか又は両方からの前記第１のＤＮＡ鎖のワンポット合成を可能にするＤＮＡポリメラーゼを使用して、アニールされた第１のＤＮＡ鎖生成プライマから伸長することと、を含み、前記第１のＤＮＡ鎖生成プライマは：
第１のヌクレオチド配列であって、５’末端にコンスタントアダプタ配列を含み、その後にポリチミジン配列及び２つのランダムなヌクレオチドが続き、前記ポリチミジン配列は、少なくとも１０個のチミジン塩基を含み、その後にランダムなヌクレオチドＶが続き、更にランダムなヌクレオチドＮが続き、ここで、Ｖ及びＮは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードによるものである、第１のヌクレオチド配列と、第２のヌクレオチド配列であって、５’末端にコンスタントアダプタ配列を含み、その後に、５つ、６つ、又は７つのランダムヌクレオチド、好ましくは６つの反復ランダムヌクレオチドが続き、前記６つの反復ランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードにに従って、Ｂ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される、第２のヌクレオチド配列と、
を含んでいる工程、
ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの第２の鎖を調製する工程であって、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートからの解離及びその変性の後で、第２のＤＮＡ鎖生成プライマを前記第１のＤＮＡ鎖にアニ―リングすることと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、アニールされた前記第２のＤＮＡ鎖生成プライマから伸長することと、を含み、前記第２のＤＮＡ鎖生成プライマは：
３’末端にランダムな複数のヌクレオチドを含むランダムなヌクレオチド配列と、
前記ランダムなヌクレオチド配列に物理的に連結されたその５’末端における第２のアダプタ配列と、
を含んでおり、
前記複数のランダムなヌクレオチドは、少なくとも８つのランダムヌクレオチド、より好ましくは８つの反復ランダムヌクレオチドを含み、前記少なくとも８つのランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードにに従って、Ｂ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される、工程；
ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの前記第２の鎖をポリメラーゼ連鎖反応を介して増幅する工程であって、増幅プライマの１つの５’末端において前記第１のアダプタ配列を含み、増幅プライマの別の１つの５’末端において前記第２のアダプタ配列を含んでいる、一対の増幅プライマを、ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの前記第２の鎖にアニ―リングして、複数のアンプリコンを得ることを含み、それにより、前記アンプリコンの各々は、少なくとも第１及び第２のアダプタ配列を含み、前記第１及び第２のアダプタ配列の各々は、メチル化によって修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを有している、工程；及び、
前記アンプリコンを複数の二本鎖ＤＮＡフラグメントに断片化する工程であって、前記第１及び第２のアダプタ配列を欠く二本鎖ＤＮＡフラグメントを得るために、前記アンプリコンをメチル化特異的制限酵素と反応させることを含んだ工程。

【0014】

一実施形態では、第２の鎖生成プライマ中のランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、Ｂ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される。

【0015】

より具体的な実施形態では、第１の鎖生成プライマ及び／又は第２の鎖生成プライマのランダムヌクレオチド配列は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、最後のランダムヌクレオチドがランダムヌクレオチド配列の残りのランダムヌクレオチドと異っていてもよい６～８個のランダムヌクレオチドを含んでいる。

【0016】

別のより具体的な実施形態では、第１の鎖生成プライマ及び／又は第２の鎖生成プライマのランダムヌクレオチド配列は、最後のランダムヌクレオチドを除いて、ランダムヌクレオチド配列の残りのランダムヌクレオチドが、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、４つのヌクレオチド塩基のうち３つがランダムに選択されるランダムヌクレオチドの１つから共同で選択される、６～８個のランダムヌクレオチドを含んでいる。

【0017】

別の実施形態では、メチル化ヌクレオシド三リン酸が、第１及び／又は第２のＤＮＡ鎖又はＤＮＡフラグメント調製及び／又は前記ポリメラーゼ連鎖反応における反応混合物に添加される。

【0018】

好ましい実施形態では、上記メチル化ヌクレオシド三リン酸は、０．０１％～２５％の濃度のデオキシメチルシチジン三リン酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応後に、メチル化される生成物中の０．０１～２５％のシトシンを生じさせる。

【0019】

他の実施形態では、メチル化されたヌクレオチド塩基を有する複数のアンプリコンを得るために、第１及び第２のアダプタ配列中の１つのシトシンが、増幅プライマにおいてメチル化によって修飾されてメチルシトシンになっている。

【0020】

更に別の実施形態では、本方法は、少なくとも一対の二本鎖アダプタを付加する（appending）工程を更に含み、その両端に付加された二本鎖アダプタを含むサイズの１０００ヌクレオチド未満の二本鎖ＤＮＡ断片を得るために、その一方の鎖が、前記断片化後の二本鎖ＤＮＡ断片の両端の４－ヌクレオチドオーバーハングと相補的な４－ランダムヌクレオチドオーバーハングを含んでいる。

【0021】

更なる実施形態では、対応する二本鎖アダプタが付加された二本鎖ＤＮＡフラグメントには、任意の後続のバーコーディングのために、その両端に一対のシーケンシングアダプタが更に付加されていてもよい。

【0022】

別の実施形態では、対応する二本鎖アダプタが付加された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のバーコーディングが意図されている場合、一対のシーケンシングアダプタを付加する前に、一対のプライマをアニーリングして増幅し、そのアンプリコンを更に生成する。

【0023】

本発明の第２の態様は、本明細書に記載の方法に従ってライブラリを生成するためのキットに関する。このキットは、一本鎖ＲＮＡテンプレート及び一本鎖ｍＲＮＡを含むＲＮＡテンプレートをアニーリングするための２つの第１の鎖生成プライマと結合した（conjugated）基質を含んでいる。このキットは、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、及び、アニーリングされた第１の鎖生成プライマからの第１のＤＮＡ鎖の逆転写を開始するための反応混合物も含んでいる。このキットは、第２の鎖生成プライマ、鎖置換活性を有するポリメラーゼ、及び、逆転写後に液体から基質を分離した後、第１のＤＮＡ鎖から第２のＤＮＡ鎖を重合させるための反応混合物を更に含んでいる。加えて、このキットは、第２のＤＮＡ鎖を増幅するための、増幅プライマ、酵素、及び反応混合物を含んでおり、増幅プライマは、それぞれ、第１の鎖生成プライマ及び第２の鎖生成プライマのアダプタ配列に対応している。第２のＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅後の増幅物は、反応物の液相から回収することができる。

【図面の簡単な説明】

【0024】

本発明の実施形態は、以下により、図面を参照して詳細に説明される。

【0025】

図１は、本発明の第１の鎖生成プライマ、第２の鎖生成プライマ、及び対応する増幅プライマを使用して、異なる核酸から二本鎖ＤＮＡ分子を生成する本方法の実施形態を概略的に示している。

【0026】

図２は、図１に示すように、第２のＤＮＡ鎖の増幅から得られた二本鎖ＤＮＡ分子を修飾して断片化し、１０００ヌクレオチドより短い直線長の二本鎖ＤＮＡ分子を生成する、本方法の一実施形態を概略的に示している。

【0027】

図３は、バーコーディングのために、図２に示されている断片化された二本鎖ＤＮＡ分子に対応するアダプタ配列を付加する本方法の一実施形態を概略的に示している。

【0028】

図４は、本明細書に記載された本方法及び成分に従ってＲＮＡテンプレートを用いてサンプルからライブラリを調製する本発明の一実施形態を概略的に示している。

【0029】

図５Ａ～５Ｄは、実施例１に従って、５ｎｇ／５００ｐｇのＨＥＫ２９３細胞ＲＮＡ（ｄＴ５ｎｇ／５００ｐｇ）から、ヒト１８Ｓ（図５Ａ）、Ｕ２ＡＦ１（図５Ｂ）、ＧＡＰＤＨコード領域（図５Ｃ）、及びＧＡＰＤＨ３’ＵＴＲ（図５Ｄ）に対するプライマを使用したｑＰＣＲによる入力ＲＮＡの正規化の結果と、５ｎｇ／５００ｐｇのｄＴ－アダプターＢ６配列（ｄＴ：Ｂ６５ｇ／５００ｐｇ）を使用して作成されたクリーニングされた（cleaned）ライブラリ製剤を示している。

【0030】

図６は、５ｎｇのｄＴアダプタＢ６配列（ｄＴ：Ｂ６５ｎｇ）及び５ｎｇのｄＴを使用したサンプルの間、並びに、ｄＴ：Ｂ６５ｎｇとｄＴ：Ｂ６５００ｐｇとの間の、転写リード（transcript reads）の２つのプロットを示している。
定義

【0031】

本明細書に記載される「ワンポット」とは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方の鋳型からｃＤＮＡ鎖を生成できるように、適切な逆転写条件下でＤＮＡ伸長能力とＲＮＡ転写能力との両方を持つポリメラーゼを使用して、ＤＮＡをプライミングし、同時にｍＲＮＡなどのＲＮＡをプライミングする（例えば、２つのランダムヌクレオチドの５’末端にオリゴｄＴ配列を持つプライマによって）一連のプライマを使用する単一のステップを指していてもよく、通常の技術によって提供されるオリゴヌクレオチド合成スキームの制限のために、追加の精製及び／又は他の方法を使用せずに１つのタイプの核酸を他の核酸から分離する任意の他のオリゴヌクレオチド合成を指していてもよい。

【発明を実施するための形態】

【0032】

以下の説明では、異なる核酸の混合物から偏りなくライブラリを生成するための同時増幅法を、好ましい例として説明する。追加及び／又は置換を含む修正が、本発明の範囲及び精神から逸脱することなくなされ得ることは、当業者には明らかであろう。特定の詳細は、本発明を不明瞭にしないために省略される場合がある。しかしながら、本開示は、当業者が過度の実験なしに本明細書の教示を実施できるように記載されている。

【0033】

本発明は、非核酸分子と比較して実質的に少量の複数の種類の核酸サンプルからライブラリを調製するための不偏同時増幅法を提供する。一本鎖及び／又は二本鎖のＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む複数の種類の核酸のサンプルが、その後の伸長及び増幅のテンプレートとして提供される。第１のＤＮＡ鎖がサンプルから調製される。これには、第１のＤＮＡ鎖生成プライマをＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートの何れかにアニーリングすることと、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートの何れか又は両方からの第１のＤＮＡ鎖のワンポット合成を可能にするＤＮＡポリメラーゼを使用して、アニールされた第１のＤＮＡ鎖生成プライマから伸長することと、が含まれる。

【0034】

第１のＤＮＡ鎖生成プライマは、５’末端にコンスタントアダプタ配列を有し、その後にポリチミジン配列及び２つのランダムなヌクレオチドが続く、第１のヌクレオチド配列を含んでいる。ポリチミジン配列は、少なくとも１０個のチミジン塩基を含み、その後にランダムヌクレオチドＶが続き、更にその後にランダムヌクレオチドＮが続く。Ｖ及びＮは、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従ったものである。第２のヌクレオチド配列は、５’末端にコンスタントアダプタ配列と、それに続く５、６又は７個のランダムヌクレオチド、より好ましくは６個の反復ランダムヌクレオチドと、を含んでいる。６個の反復ランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、Ｂ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される。

【0035】

ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの第２の鎖が調製される。この調製には、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡテンプレートからの解離及びその変性の後で、第２のＤＮＡ鎖生成プライマを前記第１のＤＮＡ鎖にアニ―リングすることと、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、アニールされた前記第２のＤＮＡ鎖生成プライマから伸長することと、を含んでいる。第２のＤＮＡ鎖生成プライマは、３’末端に複数のランダムなヌクレオチドを含むランダムヌクレオチド配列と、５’末端にこのランダム塩基配列に物理的に連結された第２のアダプタ配列と、を含んでいる。

【0036】

複数のランダムヌクレオチドは、少なくとも８つのランダムヌクレオチド、より好ましくは８つの反復ランダムヌクレオチドを含んでいる。８つのランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、Ｂ、Ｖ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される。ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの第２の鎖は、増幅プライマの１つの５’末端にある第１のアダプタ配列と、増幅プライマのもう１つの５’末端にある第２のアダプタ配列とを含んだ一対の増幅プライマを、ＤＮＡ又はＤＮＡフラグメントの第２の鎖にアニーリングすることを含む、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される。各アンプリコンが少なくとも第１及び第２のアダプタ配列を含むように複数のアンプリコンが得られる；第１及び第２のアダプタ配列の各々は、メチル化によって修飾された少なくとも１つのヌクレオチドを有している。

【0037】

これらのアンプリコンは、複数の二本鎖ＤＮＡフラグメントに断片化され、この工程は、第１及び第２のアダプタ配列を欠く二本鎖ＤＮＡフラグメントを得るために、アンプリコンをメチル化特異的制限酵素と反応させることを含んでいる。

【0038】

一実施形態では、第２の鎖生成プライマ中のランダムヌクレオチドの各々は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、Ｂ、Ｄ、Ｈ、又はＶから共同して又は独立して選択される。

【0039】

より具体的な実施形態では、第１の鎖生成プライマ及び／又は第２の鎖生成プライマのランダムヌクレオチド配列は、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、最後のランダムヌクレオチドがランダムヌクレオチド配列の残りのランダムヌクレオチドと異っていてもよい６～８個のランダムヌクレオチドを含んでいる。

【0040】

別のより具体的な実施形態では、第１の鎖生成プライマ及び／又は第２の鎖生成プライマのランダムヌクレオチド配列は、最後のランダムヌクレオチドを除いて、ランダムヌクレオチド配列の残りのランダムヌクレオチドが、ＩＵＰＡＣヌクレオチドコードに従って、４つのヌクレオチド塩基のうち３つがランダムに選択されるランダムヌクレオチドの１つから共同で選択される、６～８個のランダムヌクレオチドを含んでいる。

【0041】

別の実施形態では、メチル化ヌクレオシド三リン酸が、第１及び／又は第２のＤＮＡ鎖又はＤＮＡフラグメント調製及び／又は前記ポリメラーゼ連鎖反応における反応混合物に添加される。

【0042】

好ましい実施形態では、上記メチル化ヌクレオシド三リン酸は、０．０１％～２５％の濃度のデオキシメチルシチジン三リン酸であり、ポリメラーゼ連鎖反応後に、メチル化される生成物中の０．０１～２５％のシトシンを生じさせる。

【0043】

他の実施形態では、メチル化されたヌクレオチド塩基を有する複数のアンプリコンを得るために、第１及び第２のアダプタ配列中の１つのシトシンが、増幅プライマにおいてメチル化によって修飾されてメチルシトシンになっている。

【0044】

更に別の実施形態では、本方法は、少なくとも一対の二本鎖アダプタを付加する工程を更に含み、その両端に付加された二本鎖アダプタを含むサイズの１０００ヌクレオチド未満の二本鎖ＤＮＡ断片を得るために、その一方の鎖が、前記断片化後の二本鎖ＤＮＡ断片の両端の４－ヌクレオチドオーバーハングと相補的な４－ランダムヌクレオチドオーバーハングを含んでいる。

【0045】

更なる実施形態では、対応する二本鎖アダプタが付加された二本鎖ＤＮＡフラグメントには、任意の後続のバーコーディングのために、その両端に一対のシーケンシングアダプタが更に付加されてもよい。

【0046】

別の実施形態では、対応する二本鎖アダプタが付加された二本鎖ＤＮＡ断片は、その後のバーコーディングが意図されている場合、一対のシーケンシングアダプタを付加する前に、一対のプライマをアニーリングして増幅し、そのアンプリコンを更に生成する。

【0047】

本発明の第２の態様は、本明細書に記載の方法に従ってライブラリを生成するためのキットに関する。このキットは、一本鎖ＲＮＡテンプレート及び一本鎖ｍＲＮＡを含むＲＮＡテンプレートをアニーリングするための２つの第１の鎖生成プライマと結合した基質を含んでいる。このキットは、逆転写酵素、ＲＮＡｓｅ、及び、アニーリングされた第１の鎖生成プライマからの第１のＤＮＡ鎖の逆転写を開始するための反応混合物も含んでいる。このキットは、第２の鎖生成プライマ、鎖置換活性を有するポリメラーゼ、及び、逆転写後に液体から基質を分離した後、第１のＤＮＡ鎖から第２のＤＮＡ鎖を重合させるための反応混合物を更に含んでいる。加えて、このキットは、第２のＤＮＡ鎖を増幅するための、増幅プライマ、酵素、及び反応混合物を含んでおり、増幅プライマは、それぞれ、第１の鎖生成プライマ及び第２の鎖生成プライマのアダプタ配列に対応している。第２のＤＮＡ鎖のＰＣＲ増幅後の増幅物は、反応物の液相から回収することができる。

【0048】

以下は、シーケンス用のライブラリ調製物（library preparation）を生成するために本方法を使用する利点の一部である。
（１）第１の鎖の生成では、ＤＮＡ分子及びＲＮＡ分子の両方へのランダム配列の結合を可能にするメルトプロトコルを使用して、第１の鎖が全核酸から生成される。第１の鎖生成プライマにおいて特定の逆転写酵素及びアダプタ配列を使用して第１のＤＮＡ鎖を生成することにより、異なる核酸の混合物から第１の鎖ＤＮＡテンプレートをワンポットで合成できるため、バイアスを回避することができる。
（２）第２の鎖の生成では、第２の鎖生成プライマは、第１のＤＮＡ鎖から第２の鎖を生成する間のコンカテマー形成を避けるためのランダム配列を含有している。第１のＤＮＡ鎖はアダプタ配列を含有しているため、第２の鎖生成プライマの相補的アダプタ配列により、第２のＤＮＡ鎖の両端に固有の識別子を有する生成物がもたらされる。
（３）第１及び第２の鎖生成プライマのアダプタ配列の両方を含む増幅プライマにメチル化ｄＣＴを組み込み、デオキシメチル化シトシン三リン酸をＰＣＲ反応混合物に加えることにより、１０００ヌクレオチド以下の断片のサイズを小さくするために、メチル化された塩基において、それらのアンプリコンに特異的なその後の制限酵素消化が可能になる。
（４）４ｎｔ５’オーバーハングを有するアダプタ配列を付加すると、後続のシーケンシングＰＣＲ及びバーコーディングのために、ＤＮＡ断片の両端にアダプタを後から連結（later ligation）することが可能となる。

【0049】

実施例

【0050】

例１：ＨＥＫ２９３細胞からのライブラリ調製

【0051】

ＨＥＫ２９３細胞から採取した１０ｎｇ又は１ｎｇのＤＮＡｓｅＩ処理ＲＮＡを、５００ｎＭのアダプタＡ－Ｂ６（５’－ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣＢＢＢＢＢＢ－３’）（配列番号１）及びアダプタＡ－オリゴｄＴ（５’－ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＶＮ－３’）（配列番号２）を１：１の比率で、又はアダプタＡ－オリゴｄＴを単独で、メーカーの指示に従ってＰＲＯＭＥＧＡＭＭＬＶ逆転写酵素を使用して、１０μｌの逆転写反応混合物に溶解させ、４０℃で１５分間反応させた後、７０℃で５分間変性させた。５μｌをｑＰＣＲ用に保存した。１μｌの１０μＭアダプタＢ－Ｂ８（５’－ＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＢＢＢＢＢＢＢ－３’）（配列番号３）を残りの５μｌのＲＴ反応混合物に添加し、７０℃まで２分間加熱し、その後サーモサイクラで４℃に冷却した。次に、１．５μｌの等温緩衝液、１．０μｌの２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、２．０μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、３．５μｌの水、及び１μｌのＢｓｔ３．０を加え、サーモサイクラ内で４５℃で２０秒間インキュベートし、２０秒ごとに１℃ずつ６０℃まで上昇させ、６０℃で１２分間保持した。２．２５μｌの１０μＭメチル化アダプタＡプライマ（５’－ＣＡＧＡＣＴＡＣｍＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣ－３’）（配列番号４）及びメチル化アダプタＢプライマ（５’ＧＴＣＡＧＡＧＴｍＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧ－３’）（配列番号５）、４．５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．９μｌの１μＭ ｄｍＣＴＰ、３．６μｌのＫＯＤ緩衝液、２．２５μｌの２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．４５μｌのＫＯＤを加え、水を満たして４５μｌにした。次に、テンプレートを９５℃で２分間加熱し、９５℃で１０秒間、５８℃で１０秒間、７０℃で２分間を１０サイクル繰り返した。次いで、得られた５０μｌの反応混合物を、製造業者の指示に従って、１．０ｘＡｍｐｕｒｅＸＰビーズで洗浄し、１０μｌで溶出した（図４）。

【0052】

例２－入力ＲＮＡの正規化のためのｑＰＣＲ：

【0053】

５μｌのＲＴは５ｎｇ／５００ｐｇのＨＥＫ２９３ＲＮＡインプットに相当し、１０μｌのＡｍｐｕｒｅＸＰ洗浄ライブラリ調製物は同じインプットに相当する。例１から保存したＲＴ反応混合物を１：２０に希釈し、ライブラリ調製物を１：１０に希釈し、ｑＰＣＲごとに１μｌを使用して、ヒト１８Ｓ（図５Ａ）、Ｕ２ＡＦ１（図５Ｂ）、ＧＡＰＤＨコード領域（図５Ｃ）及びＧＡＰＤＨ３’ＵＴＲ（図５Ｄ）に対するプライマを使用してｑＰＣＲを行った。本明細書に記載の方法による増幅後、全てのアンプリコンは、本明細書に記載の不偏増幅法を用いて増幅されることが実証された。

【0054】

例３－ＤＮＡ断片化及びライブラリ調製：

【0055】

次いで、例１からのＡｍｐｕｒｅＸＰ精製ライブラリ３μｌを、製造業者の指示に従って、５μｌの反応物中で３７℃で１５分間、ＭｓｐＪＩによって消化して、ライブラリを断片化した。１．５μｌの二本鎖アダプタであって、そのうちの１つは（５’－ＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’）（配列番号６）によって表され、４ｎｔの５’オーバーハングを有するもう１つは（５’－ＮＮＮＣＴＧＴＣＴＣＴＴＡＴＡＣＡＣＡＴＣＴ－３’）（配列番号７）によって表される、二本鎖アダプタと、７μｌの２ｘＱｕｉｃｋリガーゼバッファ（ＮＥＢ）と、０．５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰと、０．３μｌの組換えＴａｑと、０．７μｌのＱｕｉｃｋリガーゼと、を添加して、アダプタを末端にライゲートした。次いで、これを、２つのプライマ（５’－ＴＣＧＴＣＧＧＣＡＧＣＧＴＣＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号８）及び５’－ＧＴＣＴＣＧＴＧＧＧＣＴＣＧＧＡＧＡＴＧＴＧＴＡＴＡＡＧＡＧＡＣＡＧ－３’（配列番号９））を用いて、アニーリング温度６０℃、伸長４０秒、１０サイクルのＫＯＤ反応において増幅した。次に、ＩＬＬＵＭＩＮＡバーコーディングプライマを使用して、反応をバーコード化し、製造業者のプロトコルに従って、ｉＳｅｑ１００上でシークエンスした。

【0056】

表１及び表２の試薬からライブラリを生成するために使用するサーモサイクラの設定及び条件（表３～１０）を提供する例を以下に示す。
１）３μｌ以下のサンプル核酸を、配列番号１～２で表される１μｌのプライマ、ヌクレオチドと水との反応混合物に加え、更に必要に応じて、ヌクレアーゼを含まない水（nuclease－free water）で４μｌまで満たす。以下の設定でサーモサイクラに入れる（表１）。

【表1】

２）１μｌの逆転写酵素（ＮＥＢ製）を加え、以下の設定でサーモサイクラに入れる（表２）。

【表2】

３）配列番号３で表されるプライマー４μｌと、等温緩衝液、オリゴヌクレオチド、及び水を含む反応混合物、並びに氷上で鎖置換活性を有するポリメラーゼ１μｌを加えて合計１０μｌとし、次の設定でサーモサイクラに入れる（表３）。

【表3】

４）ＫＯＤキットの試薬１５μｌと、配列番号４及び５で表される一対の増幅プライマ（各増幅プライマーの５’末端から９番目のシトシンがメチル化されている）を加え、以下の設定でサーモサイクラに入れる（表４）。

【表4】

５）室温に戻したＡｍｐｕｒｅＸＰ（希釈）ビーズ２５μｌを加え、ピペットで少なくとも１０回上下に混合し、サンプルをビーズと共に室温で少なくとも３分間インキュベートする。
６）磁気ラックを使用してビーズを引き出す。ラックの上に少なくとも２分間放置する。
７）上清を除去し、新しく調製した８０％エタノール１００μｌにビーズを再懸濁する。ビーズを引き出すために磁気ラック上に２０秒間放置する。この手順をもう一度繰り返す。
８）上清を除去し、ビーズを室温で５分間乾燥させた後、８μｌのヌクレアーゼを含まない水によく再懸濁する。磁気ラックに置く前に、室温で１分間インキュベートする。
９）溶出液を慎重に除去し、新しいチューブに移す。
１０）溶出液４μｌを採取し、ＭｓｐＪＩキットの試薬１μｌを新しいチューブに加え、以下の設定のサーモサイクラに入れる（表５）。

【表5】

１１）それぞれが配列番号６及び７で表されるプライマを有するＱｕｉｃｋリガーゼ及びＴａｑキットからの試薬１０μｌをサンプルに加えて合計１５μｌとし、次の設定でサーモサイクラに入れる（表６）。

【表6】

１２）それぞれが配列番号８及び９で表されるプライマを有するＫＯＤキットからの試薬２５μｌをサンプルに加えて合計４０μｌとし、次の設定でサーモサイクラに入れる（表７）。

【表7】

１３）ステップ１２からのサンプル５μｌを採取し、各バーコーディングプライマ０．８μｌとステップ１２と同じＫＯＤキットからの試薬１３．４μｌを加えて合計２０μｌにし、以下の設定でサーモサイクラに入れる（表８）。

【表8】

１４）室温に戻したＡｍｐｕｒｅＸＰ（希釈）ビーズ２０μｌを加え、ピペットで少なくとも１０回上下に混合し、サンプルをビーズと共に室温で少なくとも３分間インキュベートする。
１５）磁気ラックを使用してビーズを引き出す。ラックの上に少なくとも２分間放置する。
１６）上清を除去し、新しく調製した８０％エタノール１００μｌにビーズを再懸濁する。ビーズを引き出すために磁気ラック上に２０秒間放置する。この手順をもう一度繰り返す。
１７）上清を除去し、ビーズを室温で５分間乾燥させた後、８μｌのヌクレアーゼを含まない水によく再懸濁する。磁気ラックに置く前に、室温で１分間インキュベートする。
１８）溶出液を慎重に除去し、新しいチューブに移す。
１９）ライブラリはシーケンス処理の準備ができている。
注意：サイクル数を示す列のボックスが空白の場合は、１サイクルを表す可能性がある。

【0057】

図６及び表９に示すような配列決定の結果は、本方法によって調製されたライブラリが、読み取り深度が６００００～９００００の間のＨＥＫ細胞に発現する９０００以上の遺伝子を検出できることを示唆している。

【0058】

【表9】

【0059】

更に、ｄＴ＿５ｎｇサンプル及びｄＴ＿Ｂ６＿５ｎｇサンプルの読み取り分布は、７ＳＫ、ｍｔ－ＲＮＲ１、及びｍｔ－ＲＮＲ２などのｐｏｌｙＡテールのない転写産物を除いて、非常によく似ている。これらの結果は、この方法が偏りのない（unbiased）代表的なライブラリを生成することを示唆している。

【0060】

例４－バックグラウンド増幅に関するＮ、Ｂ、Ｄ、Ｈ及びＮＴＣの比較

【0061】

潜在的なバックグラウンド増幅を特定するために、Ｎ６（ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣＮＮＮＮＮＮ）（配列番号１０）、Ｂ６（ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣＢＢＢＢＢＢ）（配列番号１）、Ｄ６（ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣＤＤＤＤＤＤ）（配列番号１１）、又はＨ６（ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣＨＨＨＨＨＨ）（配列番号：１２）を、０．２μｌの２５ｍＭ ｄＮＴＰ、１．０μｌの５ｘＰＲＯＭＥＧＡＭＭＬＶ逆転写酵素バッファ、及び３．１μｌの水と混合し、７０℃まで３０秒間加熱し、４℃に冷却した。次に、０．５μｌのＰＲＯＭＥＧＡＭＭＬＶ逆転写酵素を添加し、反応物を４０℃で１５分間、続いて７０℃で５分間インキュベートした。

【0062】

１．５μｌのＮＥＢ等温緩衝液、０．７５μｌの２５ｍＭ ＭｇＳＯ_４、１．５μｌの２ｍＭ ｄＮＴＰ、０．５μｌのＢｓｔ３．０、４．８μｌの水、及び１．０μｌのＮ８（ＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＮＮＮＮＮＮＮＮ）（配列番号１３）、Ｂ８（ＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＢＢＢＢＢＢＢ）（配列番号３）、Ｄ８（ＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＤＤＤＤＤＤＤＤ）（配列番号１４）、又はＨ６（ＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧＨＨＨＨＨＨＨＨ）（配列番号１５）を、上記のようにそれぞれのサンプル管に加えた。

【0063】

サンプルを４５℃で２０秒間インキュベートし、サンプルが６０℃に達するまで２０秒ごとに１℃ずつ上昇させた。サンプルを更に６０℃で１０分間インキュベートした。

【0064】

得られたサンプルを１／１００に希釈し、メーカーの指示に従ってＳｏｌｉｓＢｉｏｄｙｎｅのＦＩＲＥＰＯＬＳｙＢｒＧｒｅｅｎｑＰＣＲマスターミックスと、以下のプライマ（ＧＴＣＡＧＡＧＴＣＧＡＡＴＧＣＧＴＡＣＴＧ）（配列番号１７）及び（ＣＡＧＡＣＴＡＣＣＡＴＧＡＣＣＴＧＡＧＴＣ）（配列番号１８）とを、以下のプロトコルで繰り返した：９５℃１５秒、６０℃１５秒、７２℃４０秒を、５０サイクル。

【0065】

得られたｑＰＣＲＣｔ（表１０）は、ランダムな六量体及び八量体の異なるセットを使用した「空の」反応のバックグラウンドレベルを明らかにする。Ｎの場合の低いＣｔは、バックグラウンド信号がＢ、Ｄ、又はＨのベースセットよりも著しく高いことを示している。

【0066】

したがって、第１及び第２のＤＮＡ鎖生成プライマのアダプタ配列の３’末端におけるＢ、Ｄ、又はＨのランダムな六量体又は八量体の繰り返しは、鎖生成プライマの同じ領域の繰り返しＮに対して、非特異的プライミングの機会が減少する。

【0067】

【表10】

【0068】

例５

【0069】

以下の例は、本発明の他の実施形態に従ってＤＮＡライブラリがどのように調製されるかを示す。
１．９．５μｌの１００μＭＢ５Ｙ１（配列番号で表される）と、０．５μｌのｄＴ（配列番号２で表される）とを、１９０μｌの水と混合させて、１．５μＭのＢ５Ｙ１：ｄＴを作製する；
２．オリゴヌクレオチド製造業者から供給されるままの１００μＭＢ７Ｙ１（配列番号３）を使用する；
３．３μｌの１００μＭｍＣＦ（５’末端から９番目のヌクレオチドのシトシンがメチル化されている；配列番号４で表される）と、３μｌの１００μＭｍＣＲ（５’末端から９番目のヌクレオチドのシトシンがメチル化されている；配列番号５で表される）と、１μｌの１０ｍＭｄｍＣＴＰ（ＮＥＢ）と、２３μｌの水と、を混合する；
４．３μｌの１００μＭアダプタＦ（配列番号６で表される）と、３μｌの１００μＭアダプタＲ（配列番号７で表される）と、３μｌの１Ｍ塩化ナトリウムと、３μｌの１０ｘＴＥ緩衝液と、１８μｌの水と、を混合する。９５℃まで加熱し、毎秒０．２５℃の速度で４℃まで冷却し、１０μｍのアダプタ混合物を作製する；
５．１５μｌの１００μＭ ｉ５Ｆ（配列番号８で表される）と、１５μｌの１００μＭｉ７Ｒ（配列番号９で表される）とを混合して、５０μＭ ｉ５ｉ７アンプを作製する。
１５μｌチューブは、別のボックスでバーコーディングの準備ができている異なったプライマを使用して調製される。

【0070】

例６－ＤＮＡライブラリ調製の機能的品質管理（ＱＣ）：

【0071】

３μｌ中５ｎｇのＨＥＫ２９３をＡｍｐＲＥキットで処理し、ゲル又はＴａｐｅＳｔａｔｉｏｎで実行する。２００～５００ｎｔのスミアが見られるべきである。

【0072】

本発明の上述の説明は、例示及び説明の目的で提供されたものである。網羅的であること、又は、開示された正確な形態に本発明を限定することは意図されていない。当業者には、多くの修正及び変形が明らかであろう。

【0073】

実施形態は、本発明の原理及びその実際の応用を最もよく説明するために選択及び説明され、それにより、当業者は、様々な実施形態及び考えられる特定の用途に適した様々な修正で本発明を理解できるようになる。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲及びそれらの同等物によって定義されることが意図されている。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図6】

【国際調査報告】