特表 2024-510098 抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３三重特異性抗体およびその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-06

(54)【発明の名称】抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３三重特異性抗体およびその使用

(51)【国際特許分類】

   C07K 16/46 20060101AFI20240228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240228BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240228BHJP

   A61K 35/76 20150101ALI20240228BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240228BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240228BHJP

   G01N 33/574 20060101ALI20240228BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240228BHJP

   C07K 16/28 20060101ALN20240228BHJP

【ＦＩ】

C07K16/46 ZNA

C12N5/10

C12N15/13

C12N15/62

C12N15/63 Z

A61K39/395 D

A61K39/395 N

A61K35/76

A61K35/17

A61K47/68

G01N33/574 A

G01N33/53 D

C07K16/28

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550109

(86)(22)【出願日】2022-02-18

(85)【翻訳文提出日】2023-08-18

(86)【国際出願番号】 CN2022076832

(87)【国際公開番号】W WO2022174813

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】202110189359.8

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】519274183

【氏名又は名称】イノベント バイオロジクス（スーチョウ）カンパニー，リミティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】シュイ ウェイ

(72)【発明者】

【氏名】シェン ワンワン

(72)【発明者】

【氏名】リー リー

(72)【発明者】

【氏名】ワン シュアン

(72)【発明者】

【氏名】チュー チェンチュアン

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C085AA13

4C085AA14

4C085AA21

4C085BB36

4C085BB41

4C085BB42

4C085BB44

4C085CC01

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB37

4C087BC83

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045BA41

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、三重特異性抗原結合タンパク質に関し、より具体的には、ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの２種類の腫瘍抗原とＴ細胞表面抗原ＣＤ３に特異的に結合する三重特異性抗体、およびそれを含む医薬組成物、調製方法ならびに使用に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

三重特異性Ｙ型抗体分子であって、下記の式（Ｉ）：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｉ）
の構造を有し、式中、
前記Ｍ１および前記Ｍ２は、前記抗体分子の第１抗体アームおよび第２抗体アームをそれぞれ表し、かつ前記Ｍ１および前記Ｍ２は、第１と第２抗原に結合する抗原結合部位をそれぞれ含み、前記抗原結合部位はＦａｂまたはｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂであり、
前記Ｆｃ：：Ｆｃは、抗体分子のステムを表し、ペアリングして二量体化された第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインで構成され、ここで前記第１と第２抗体アームは、直接または連結ペプチド（好ましくはヒンジ領域）を介して前記第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインのＮ末端にそれぞれ連結され、
前記Ｘ１は、前記抗体アームのＣ末端に複合された複合成分を表し、前記Ｘ２は、前記ステムのＣ末端に複合された複合成分を表し、ここで前記複合成分は、第３抗原に結合する抗原結合部位を含み、かつ
式中、ｐとｑは、０、１もしくは２の整数をそれぞれ表し、ｐとｑのうちの１つは０であり、
好ましくは、式中、ｐ＝０の場合、ｑ＝１であり、前記Ｍ１および前記Ｍ２の抗原結合部位はそれぞれＦａｂまたはｓｃＦａｂであり、複合成分Ｘ２は前記抗体分子のステムの２つのＦｃドメインのうちの１つに複合され、あるいは
ｑ＝０の場合、ｐ＝２であり、前記Ｍ１および前記Ｍ２の抗原結合部位はそれぞれＦａｂであり、複合成分Ｘ１は前記抗体分子の前記抗体アームＭ１およびＭ２の両方のＦａｂ軽鎖に複合され、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される、
三重特異性Ｙ型抗体分子。

【請求項2】

前記複合成分は、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖから選択される抗原結合部位を含む、
請求項１に記載の抗体分子。

【請求項3】

前記抗体分子は、
（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｆｏｒｍａｔ＿２）
の構造を有し、式中、
ｑ＝１、
前記Ｍ１および前記Ｍ２は、第１と第２抗原に結合する抗原結合部位ＦａｂまたはｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂをそれぞれ含み、かつ
前記Ｘ２は、第３抗原に結合する抗原結合部位ｓｃＦｖ、好ましくはｄｓｓｃＦｖを含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される、
請求項１に記載の抗体分子。

【請求項4】

前記抗体分子は、
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ， （Ｆｏｒｍａｔ＿７）
の構造を有し、式中、
ｐ＝２、
前記Ｍ１および前記Ｍ２は、第１と第２抗原に結合する抗原結合部位Ｆａｂをそれぞれ含み、かつ
前記Ｘ１は、第３抗原に結合する抗原結合部位ｓｃＦｖ、好ましくはｄｓｓｃＦｖを含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される、
請求項１に記載の抗体分子。

【請求項5】

前記抗体アームのＦａｂ抗原結合部位は２本の鎖を含み、その１本の鎖はＮ末端からＣ末端までＶＨ－ＣＨ１を含み、もう１本の鎖はＮ末端からＣ末端までＶＬ－ＣＬを含み、または、その１本の鎖はＮ末端からＣ末端までＶＨ－ＣＬを含み、もう１本の鎖はＮ末端からＣ末端までＶＬ－ＣＨ１を含む、
請求項１～４のいずれか１項に記載の抗体分子。

【請求項6】

前記複合成分に含まれたｓｃＦｖはＮ末端からＣ末端まで、ＶＨ－リンカー－ＶＬまたはＶＬ－リンカー－ＣＨを含む、
請求項１～５のいずれか１項に記載の抗体分子。

【請求項7】

前記第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４免疫グロブリンに由来するＦｃドメイン、好ましくは、ＩｇＧ１免疫グロブリンに由来するＦｃドメイン、より好ましくは、ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンに由来するＦｃドメインである、
請求項１～６のいずれか１項に記載の抗体分子。

【請求項8】

ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位は、以下の群：
（ａ）配列番号１～３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４～６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号７～８のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号１０～１２のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号１３～１５のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号１６～１８のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１９～２１のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号２２～２４のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記抗原結合部位は、以下の群：配列番号２５／２６、配列番号２７／２８、配列番号２９／３０および配列番号３１／３２から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、前記抗原結合部位がｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む、
請求項１～７のいずれか１項に記載の抗体分子。

【請求項9】

ＣＤ３に結合する抗原結合部位は、以下の群：
（ａ）配列番号４１～４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号４７、４２、４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記抗原結合部位は、以下の群：配列番号４８／４９、配列番号５０／４９、かつより好ましくは配列番号４８／４９から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、前記抗原結合部位がｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む、
請求項１～８のいずれか１項に記載の抗体分子。

【請求項10】

ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位は、以下のＶＨとＶＬ：
配列番号３３～３５のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号３６～３８のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬを含み、
好ましくは、前記抗原結合部位は、配列番号３９／４０というＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、前記抗原結合部位がｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む、
請求項１～９のいずれか１項に記載の抗体分子。

【請求項11】

前記抗体分子は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
かつ、ここで、第１重鎖ポリペプチド鎖または第２重鎖ポリペプチド鎖は、直接または好ましくは連結ペプチド（例えば（Ｇ４Ｓ）２またはＴＳ（Ｇ４Ｓ）２）を介してそのＦｃドメインのＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインをさらに含み、
ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第１軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第１抗原に結合する第１抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第２重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第２軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第２抗原に結合する第２抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインと第２重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインがペアリングおよび二量体化されて抗体ステム（Ｆｃ：：Ｆｃ）を形成し、かつ
第１重鎖ポリペプチド鎖または第２重鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインは、第３抗原に結合する複合成分（Ｘ２）を形成し、
ここで、第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される、
請求項３に記載の抗体分子。

【請求項12】

前記抗体分子は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
かつ、ここで、第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖は、直接または好ましくは連結ペプチド（例えば（Ｇ４Ｓ）２またはＴＳ（Ｇ４Ｓ）２）を介してそのＣＬドメインのＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインをさらに含み、
ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第１軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第１抗原に結合する第１抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第２重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第２軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第２抗原に結合する第２抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインと第２重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインがペアリングおよび二量体化されて抗体ステム（Ｆｃ：：Ｆｃ）を形成し、かつ
第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインは、第３抗原に結合する複合成分（Ｘ１）を形成し、
ここで、第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される、
請求項４に記載の抗体分子。

【請求項13】

（ａ）前記抗体分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３にそれぞれ結合され、かつ複合成分はＢＣＭＡに結合される、あるいは
（ｂ）前記抗体分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３にそれぞれ結合され、かつ複合成分はＧＰＲＣ５Ｄに結合される、あるいは
（ｃ）前記抗体分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡにそれぞれ結合され、かつ複合成分はＣＤ３に結合される、
請求項１１もしくは１２に記載の抗体分子。

【請求項14】

第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
（ａ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいは
（ｂ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいは
（ｃ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいは
（ｄ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７もしくは７８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、あるいは
（ｅ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１１に記載の抗体分子。

【請求項15】

第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
（ａ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７もしくは７８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは
（ｂ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、あるいは
（ｃ）第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９３もしくは９６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９５もしくは９７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、
請求項１２に記載の抗体分子。

【請求項16】

ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片であって、以下：
（ｉ）それぞれ配列番号１～６に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉ）それぞれ配列番号７～１２に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１３～１８に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｖ）それぞれ配列番号１９～２４に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖ）それぞれ配列番号１３、１１０および１５～１８に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、から選択されるＣＤＲ配列の組み合わせを含む、
抗体またはその抗原結合断片。

【請求項17】

（ａ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｂ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｃ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｄ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３２に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｅ）配列番号９８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号９９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｆ）配列番号１００に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列の組み合わせを含み、
場合により、前記ＶＨとＶＬ配列には、導入したシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位およびＶＬ配列の１００位でのシステイン置換が含まれ、このようにして前記ＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を形成する、
請求項１６に記載の抗体。

【請求項18】

単一特異性、二重特異性または三重特異性抗体であり、好ましくは、前記抗体は、ＣＤ３に結合する抗原結合部位をさらに含み、または、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位およびＣＤ３に結合する抗原結合部位をさらに含む、
請求項１６もしくは１７に記載の抗体。

【請求項19】

ＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体であり、
好ましくは、ここで、前記抗体は、ＣＤ３に結合する以下の群：
（ａ）配列番号４１～４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号４７、４２、４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬ対を含み、
好ましくは、以下の群：配列番号４８／４９および配列番号５０／４９から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
場合により、前記ＶＨとＶＬ配列には、導入したシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位およびＶＬ配列の１００位でのシステイン置換が含まれ、このようにして前記ＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を形成する、
請求項１８に記載の抗体。

【請求項20】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体分子をコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項21】

請求項２０に記載のポリヌクレオチドを含み、好ましくは発現ベクターである、ベクター。

【請求項22】

請求項２０に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２１に記載のベクターを含む、例えば、哺乳動物細胞である、宿主細胞。

【請求項23】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体分子を製造するための方法であって、
前記抗体を発現するのに適するポリペプチド鎖の条件で前記ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、前記ポリペプチド鎖を前記抗体分子に組み立てるのに適する条件でポリペプチド鎖を組み立てて前記抗体を生成することと、を含み、好ましくは、
前記方法は、前記抗体分子を発現するのに適する第１重鎖ポリペプチド鎖および第１軽鎖ポリペプチド鎖の条件で、前記第１重鎖および第１軽鎖をコードするものを含む宿主細胞を培養し、第１親タンパク質を生成するステップ（ｉ）と、前記抗体分子を発現するのに適する第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖の条件で、前記第２重鎖および第２軽鎖をコードするものを含む宿主細胞を培養し、第２親タンパク質を生成するステップ（ｉｉ）と、第１親タンパク質と第２親タンパク質とを等モル比率で混合し、インビトロで適切な酸化還元条件に置いて組み立てて前記抗体ステップを形成するステップ（ｉｉ）と、を含む、方法。

【請求項24】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体分子と薬学的に許容可能なベクターとを含む、医薬組成物。

【請求項25】

請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗体分子、請求項２４に記載の医薬組成物の、インビボおよび／またはインビトロでの以下の使用：
－細胞の表面にＧＰＲＣ５Ｄ抗原を発現することを含む、１０ｎＭ未満のＫＤなどの高親和性で、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合すること、
－Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を、その表面にＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞、特にＧＰＲＣ５Ｄ陽性腫瘍細胞を標的とすること、
－Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を、その表面にＢＣＭＡを発現する細胞、特にＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を標的とすること、
－Ｔ細胞のＣＤ３下流シグナル伝達経路を活性化すること、
－ＧＰＲＣ５Ｄ陽性および／またはＢＣＭＡ陽性の腫瘍細胞に対するＴ細胞の殺傷効果を介在すること、
－Ｔ細胞がＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－２などのサイトカインを放出するように誘導すること、
－ＧＰＲＣ５Ｄ陽性および／またはＢＣＭＡ陽性の腫瘍細胞を抑制または殺傷すること、または
－ＢＣＭＡ陽性患者集団、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性患者集団、または抗ＢＣＭＡ分子を投与した後のＢＣＭＡ喪失を伴うＧＰＲＣ５Ｄ陽性患者集団を治療するなど、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性および／またはＢＣＭＡ陽性の多発性骨髄腫を治療すること。

【請求項26】

前記抗体分子または医薬組成物は、個体において疾患を治療および／または予防するための薬物として使用され、あるいは疾患の診断ツールとして使用され、好ましくは、前記個体は哺乳動物、より好ましくはヒトである、請求項２５に記載の使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、三重特異性抗原結合タンパク質に関し、より具体的には、ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの２種類の腫瘍抗原とＴ細胞表面抗原ＣＤ３に特異的に結合する三重特異性抗体、およびそれを含む医薬組成物、調製方法ならびに使用に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｔ細胞二重特異性抗体（ＢｓＡｂ）は、腫瘍の治療に使用されている。このような抗体は、細胞傷害性Ｔリンパ球と腫瘍細胞との間にシナプスを形成し、腫瘍細胞の破壊を誘導することができる。ＢｓＡｂは通常、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）とＴ細胞表面抗原（Ｔ細胞エンゲージ抗原、ＴＥＡとも呼ばれる）に対する二重標的に関する。しかし、ＢｓＡｂに基づいた治療計画は、典型的に、治療される腫瘍細胞における腫瘍関連抗原の分布に依存する。これは、患者集団に対する治療の選択性および治療の限界性につながっている。さらに、研究によると、単一のＴＡＡ部位を標的とする治療形式は、腫瘍の回避機構により疾患の再発を引き起こすため、治療の有効性を制限する可能性があることも示されている。

【0003】

三重特異性および／または四重特異性抗体を開発して、免疫細胞を腫瘍部位に効率的に動員し、治療効果を改善するために提案されている。このため、近年、さまざまな多価、多重特異性抗体形式（ｆｏｒｍａｔ）が報告されている。しかし、治療の機能性および治療の行動に関するさまざまな治療製品の多様な要件により、大部分の異なる望ましい分子の組み合わせに適用できる「最適な形態」が存在しないことが決められている。したがって、多重特異性を達成する場合、異なる標的抗原の空間分布またはサイズ、および腫瘍細胞表面の腫瘍関連抗原の発現密度など、さまざまな要因を考慮する必要がある。多くの場合、特定の標的抗原を組み合わせる有効な抗体形式は、異なる抗体形式の機能性を産生および比較することによって、同定する必要がある。

【発明の概要】

【0004】

腫瘍におけるＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの発現には相関がないため、本発明者らは、ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡを標的とする多重特異性抗体を組み合わせることで、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性腫瘍患者とＢＣＭＡ陽性腫瘍患者の両方をカバーすることができると同時に、単一抗原の喪失による再発を回避することができ、それにより患者のカバー率の増加および治療効果の改善の目的を達成する。

【0005】

この目的を達成するために、本発明者らは、ＧＰＲＣ５Ｄ／ＢＣＭＡ／ＣＤ３を標的とする三重特異性抗体を提案し、複数のＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３ ｆｏｒｍａｔを詳細に研究している。２種類のＴＡＡ抗原（ＧＰＲＣ５ＤおよびＢＣＭＡ）とＴ細胞表面抗原（ＣＤ３）との間の組み合わせの方法および距離を調節し、Ｔ細胞活性化および殺傷効果を媒介する際のＴ細胞エンゲージャー（Ｔ ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）抗体の作用を調節することにより、本発明者らは、多標的の組み合わせをうまく達成し、複数の薬剤併用のニーズを減少させる。これに基づいて、ＦｃセグメントによってＫｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ技術がさらに使用され、重鎖のミスマッチを減少させるとともに、細胞外酸化還元の手段によって軽鎖のミスマッチの問題が解決される。本発明の抗体は良好な調製可能性および良好な創薬可能性も有する。

【0006】

したがって、一態様において、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を含み、かつ２つの抗体アーム、抗体アームのＣ末端に位置するステム、および抗体アームおよび／またはステムのＣ末端に複合した複合成分を含む、前記の優位性を有する三重特異性Ｙ型抗体分子を提供する。

【0007】

さらなる態様において、本発明は、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３の順による配列番号１～６、７～１２、１３～１８もしくは１９～２４から選択されるＣＤＲ配列の組み合わせを含む、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する抗体分子を提供する。本発明の抗体分子は、高親和性でＧＰＲＣ５Ｄに結合し、細胞におけるＧＰＲＣ５Ｄ介在性シグナル伝達を遮断する。

【0008】

さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体分子をコードする核酸、ベクターおよび宿主細胞、ならびに本発明の抗体分子の使用、特に、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性および／またはＢＣＭＡ陽性腫瘍、例えば多発性骨髄腫を治療する方法および使用も提供する。

【図面の簡単な説明】

【0009】

以下の図面と合わせて読めば、次に詳細に記載される本発明の好ましい実施形態がより良く理解される。本発明を説明するために、図面には現在の好ましい実施形態が示されている。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の精確な配置と手段に限定されないと理解すべきである。

【図1A】Ｆｏｒｍａｔ＿１、２、６および７により設計された三重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図1B】Ｆｏｒｍａｔ＿１、２、６および７により設計された三重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図1C】Ｆｏｒｍａｔ＿１、２、６および７により設計された三重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図1D】Ｆｏｒｍａｔ＿１、２、６および７により設計された三重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図2A】実施例に使用される対照二重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図2B】実施例に使用される対照二重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図2C】実施例に使用される対照二重特異性抗体分子の構造を模式的に示す。

【図3A】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－１および－２介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図3B】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－１および－２介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図4A】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－３およびＴＳ－Ｆ６介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図4B】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－３およびＴＳ－Ｆ６介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図4C】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－３およびＴＳ－Ｆ６介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図4D】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－３およびＴＳ－Ｆ６介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図5A】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４および５介在性Ｔ細胞活性化（Ａ－Ｄ）の検出、

【図5B】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４および５介在性Ｔ細胞活性化（Ａ－Ｄ）の検出、

【図5C】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４および５介在性Ｔ細胞活性化（Ａ－Ｄ）の検出、

【図5D】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４および５介在性Ｔ細胞活性化（Ａ－Ｄ）の検出、

【図5E】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４、５および６介在性Ｔ細胞活性化（Ｅ－Ｆ）の検出を示す。

【図5F】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４、５および６介在性Ｔ細胞活性化（Ｅ－Ｆ）の検出を示す。

【図6A】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－１および７－２介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図6B】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－１および７－２介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図6C】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－１および７－２介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図6D】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－１および７－２介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図7】Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによる例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－３および７－４介在性Ｔ細胞活性化の検出を示す。

【図8】例示的な抗体介在性ＰＢＭＣにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を示す。

【図9】例示的な抗体介在性ＰＢＭＣにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞の活性化（Ｂ）を示す。

【図10】Ｈ９２９細胞に対する例示的な抗体介在性ＰＢＭＣの殺傷効果を示す。

【図11A】ＮＣｌ－Ｈ９２９細胞の殺傷プロセスに伴う例示的な抗体誘導性ＰＢＭＣのサイトカインの放出量を示す。

【図11B】ＮＣｌ－Ｈ９２９細胞の殺傷プロセスに伴う例示的な抗体誘導性ＰＢＭＣのサイトカインの放出量を示す。

【図11C】ＮＣｌ－Ｈ９２９細胞の殺傷プロセスに伴う例示的な抗体誘導性ＰＢＭＣのサイトカインの放出量を示す。

【図11D】ＮＣｌ－Ｈ９２９細胞の殺傷プロセスに伴う例示的な抗体誘導性ＰＢＭＣのサイトカインの放出量を示す。

【図12】Ｈ９２９担腫瘍ヒト化マウスモデルにおける例示的な抗体の腫瘍抑制作用を示す。

【図13】異なる多発性骨髄腫細胞表面におけるＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの発現レベルを示す。

【発明を実施するための形態】

【0010】

特に断らない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明の当業者が理解している通常の意味を有する。本明細書に言及される全ての刊行物、特許出願、特許または他の参照文献は引用によりその全体が組み込まれる。また、本明細書に記載の材料、方法および例は、説明用のものであり、制限することが意図されない。本発明の他の特徴、目的および利点は、本明細書と図面、添付された特許請求の範囲から明らかになる。

【0011】

I． 定義
用語「約」は、数字または数値とともに使用される場合、下限として指定された数字または数値より５％小さく、上限として指定された数字または数値より５％大きい範囲内の数字または数値をカバーすることを意味する。

【0012】

本明細書に使用されるように、用語「包含する」または「含む」は、記載される要素、整数またはステップを含むが、任意の他の要素、整数またはステップを排除しないことを意味する。

【0013】

用語「抗体」は、本明細書において最も広い意味で使用されており、抗原結合部位を含むタンパク質を意味し、さまざまな構造の天然抗体および人工抗体を含み、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一本鎖抗体、完全な抗体および抗体断片を含むが、これらに限定されない。

【0014】

用語「全抗体」、「全長抗体」、「完全な抗体」および「無傷抗体」は、ジスルフィド結合を介して互いに接続された少なくとも２本の重鎖（Ｈ）と２本の軽鎖（Ｌ）とを含む天然に存在する糖タンパク質を指す。それぞれの重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）と重鎖定常領域とからなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインからなる。それぞれの軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）と軽鎖定常領域とからなる。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、さらに、その間に保存的な領域（フレームワーク領域（ＦＲ））が介在している超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ））に分けることができる。それぞれのＶＨとＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとからなり、アミノ末端からカルボキシル末端まで、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配列されている。定常領域は、抗体と抗原の結合に直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示している。

【0015】

用語「抗原結合断片」は、無傷抗体または完全な抗体のアミノ酸残基の数よりも少ない無傷抗体または完全な抗体の一部または１つの断片であり、抗原に結合しまたは完全な抗体（すなわち、抗原結合断片が由来する無傷抗体）と競争的に抗原と結合できる。抗原結合断片は、組換えＤＮＡ技術、または酵素もしくは化学的手段により無傷抗体を切断することによって調製することができる。抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、単鎖Ｆｖ、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を含むが、これらに限定されない。前記Ｆａｂ断片は、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインとからなる一価の断片であり、例えば、Ｆａｂ断片はパパインで完全抗体を消化することによって得られる。また、ペプシンを用いてヒンジ領域のジスルフィド結合の下方で完全抗体を消化して産生されたＦ（ａｂ’）２は、Ｆａｂ’の二量体であり、二価の抗体断片である。Ｆ（ａｂ’）２は、中性条件でヒンジ領域におけるジスルフィド結合を破壊することによって還元でき、これによってＦ（ａｂ’）２二量体はＦａｂ’単量体に変換される。Ｆａｂ’単量体は、基本的にはヒンジ領域を有するＦａｂ断片である（他の抗体断片に関する詳細な説明は、基礎免疫学（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ），Ｗ．Ｅ．Ｐａｕｌ編集，Ｒａｖｅｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９３）が参照される）。前記Ｆｖ断片は、抗体のシングルアームＶＬおよびＶＨドメインからなる。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬおよびＶＨは独立した遺伝子によってコードされるものの、組換え法により、この２つのドメインを１本のタンパク質鎖として産生できる合成接続ペプチドによってこれらを接続することができ、前記１本のタンパク質鎖においてＶＬ領域とＶＨ領域がペアリングして単鎖Ｆｖを形成する。前記抗体断片は化学的方法、ＤＮＡ組換え法またはタンパク質酵素消化法により得られる。

【0016】

本明細書で使用される用語「抗原結合部位」および「抗原結合ドメイン」は、互換的に使用可能であり、実際に抗原に結合する抗体分子の領域を表す。好ましくは、本発明に使用される抗体分子の抗原結合部位は、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）からなるＶＨ／ＶＬ対を含み、前記ＶＨ／ＶＬ対は、単一のポリペプチド鎖に含まれてもよく、単離した２本のポリペプチド鎖に含まれてもよい。好ましい実施形態において、本発明の抗体分子は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、ＢＣＭＡに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位、およびＣＤ３に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含む。一実施形態において、本発明の抗体は、三価三重特異性抗体、４価三重特異性抗体、または６価三重特異性抗体である。

【0017】

本明細書で使用される用語「単一特異性」抗体は、１つまたは複数の結合部位を有する抗体を指し、前記部位のそれぞれは、同じ抗原の同じエピトープと結合する。本明細書で使用される用語「多重特異性」抗体は、少なくとも２つの抗原結合部位を有する抗体を指し、前記少なくとも２つの抗原結合部位の各抗原結合部位は、同じ抗原の異なるエピトープまたは異なる抗原の異なるエピトープと結合する。本明細書により提供される抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に対する三重特異性抗体である。

【0018】

用語「免疫グロブリン分子」は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、ジスルフィド結合した２本の軽鎖および２本の重鎖からなる約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン重鎖は、重鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの重鎖可変領域（ＶＨ）を有し、それに続くのは３つの重鎖定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）である。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各本の免疫グロブリン軽鎖は、軽鎖可変ドメインとも呼ばれる１つの軽鎖可変領域（ＶＬ）を有し、それに続くのは１つの軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）である。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５つのクラスのいずれかに分類することができ、ここで、一部のクラスは、例えばγ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）というサブクラスにさらに分けることができる。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列によって、κおよびλと呼ばれる２つのタイプのいずれかに分類できる。ＩｇＧ免疫グロブリンは基本的に、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続された２つのＦａｂ分子および２つの二量体化のＦｃ領域で構成される。

【0019】

用語「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体と抗原の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖と軽鎖の可変ドメインは、通常、類似の構造を有し、ここで、各ドメインは、４つの保存的なフレームワーク領域（ＦＲ）と３つの相補性決定領域とを含む。一部の状況において、単独のＶＨまたはＶＬドメインは抗原結合特異性を十分に与えることができる。

【0020】

「相補性決定領域」または「ＣＤＲ領域」または「ＣＤＲ」または「超可変領域」は、抗体可変ドメインにおける、配列において超可変であるとともに構造上に形成されて決定されたループ（「超可変ループ」）であり、および／または抗原接触残基（「抗原接触点」）を含む領域である。ＣＤＲは、主に抗原エピトープに結合する役割を果たす。重鎖および軽鎖のＣＤＲは、Ｎ末端から順に番号付けられ、通常ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれる。抗体の重鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３とも呼ばれ、抗体の軽鎖可変ドメイン内に位置するＣＤＲはＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と呼ばれる。１つの所定の軽鎖可変領域または重鎖可変領域のアミノ酸配列において、抗体の３次元構造およびＣＤＲループのトポロジーに基づくＣｈｏｔｈｉａ、抗体配列の可変性に基づくＫａｂａｔ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，４ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ（１９８７））、ＡｂＭ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｂａｔｈ）、Ｃｏｎｔａｃｔ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ）、国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ ｄａｔａｂａｓｅ（ＩＭＧＴ）（国際免疫遺伝学情報システム、ワールドワイドウェブｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ／）、および大量の結晶構造が利用されるアフィニティ伝播クラスタリング（ａｆｆｉｎｉｔｙ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ）に基づくＮｏｒｔｈ ＣＤＲ定義（Ｎｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，「Ａ Ｎｅｗ Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ＣＤＲ Ｌｏｏｐ Ｃｏｎフォーマットｉｏｎｓ」，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４０６，２２８～２５６（２０１１））など、当該分野で公知のさまざまな方案によってそのＣＤＲ配列を決定することができる。

【0021】

例えば、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａによって番号付けられるＣＤＲ領域の異なる定義範囲を使用する。

【表1】

【0022】

特に断りのない限り、本発明において、用語「ＣＤＲ」または「ＣＤＲ配列」は、前記いずれか１つの方法で決定されるＣＤＲ配列を含む。

【0023】

ＣＤＲは、参照ＣＤＲ配列と同じＫａｂａｔ番号付け位置を有することに基づいて決定することもできる。特に断りのない限り、本発明において、抗体可変領域における残基位置（重鎖可変領域残基と軽鎖可変領域残基を含む）に言及する場合、Ｋａｂａｔ番号付けシステム（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５^ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））に基づく番号付け位置を指す。

【0024】

用語「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」は、本明細書において、少なくとも一部の定常領域を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するように使用される。当該用語は、天然配列Ｆｃ領域および変異体Ｆｃ領域を含む。天然の免疫グロブリン「Ｆｃドメイン」は、２つまたは３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび選択可能なＣＨ４ドメインを含む。例えば、天然抗体において、免疫グロブリンＦｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ類抗体の２本の重鎖に由来する第２および第３定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含み、またはＩｇＭおよびＩｇＥ類抗体の２本の重鎖に由来する第２、第３および第４定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン）を含む。本明細書において、特に断らない限り、Ｆｃ領域または重鎖定常領域におけるアミノ酸残基の番号は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓ，５ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載のＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に基づいて番号が付けられる。

【0025】

用語「エフェクター機能」は、免疫グロブリンアイソタイプによって変化する免疫グロブリンＦｃ領域に直結する生物学的活性を指す。免疫グロブリンのエフェクター機能の例は、Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合作用、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞貪食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、免疫複合体介在性抗原提示細胞による抗原の取り込み、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体）のダウンレギュレートおよびＢ細胞活性化を含む。

【0026】

用語「キメラ抗体」は、（ａ）定常領域またはその一部を変化、置換または交換することによって、抗原結合部位が異なるまたは変化したタイプ、エフェクター機能および／または生物種の定常領域またはキメラ抗体に新しい性能を付与する完全に異なる分子（例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、医薬品）などに接続され、または（ｂ）可変領域またはその一部を、異なるまたは変化した抗原特異性を有する可変領域によって変化、置換または交換させた抗体分子を指す。例えば、マウス抗体は、その定常領域をヒト免疫グロブリンに由来する定常領域に変更することによって修飾できる。ヒト定常領域に変更したため、当該キメラ抗体は、抗原認識についてのその特異性を保持するとともに、元のマウス抗体と比べて、ヒトにおいて低下した抗原性を有する。

【0027】

「ヒト化抗体」は、非ヒト抗体（例えばマウスモノクローナル抗体）の抗原特異性反応性を保留するとともに、治療剤としてヒトに投与する場合に免疫原性が低い抗体である。これは、例えば、非ヒト抗原結合部位を保留するとともに、抗体の残りの部分をこれらに対応するヒト由来の部分（すなわち、定常領域および可変領域における結合に関与しない部分はヒト抗体の対応する部分である）に変更することによって実現できる。例えばＰａｄｌａｎ，Ａｎａｔｏｍｙ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｍｏｌｅｃｕｌｅ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．，１９９４，３１：１６９～２１７が参照される。ヒト抗体工学技術の他の例は、ＵＳ５，７６６，８８６に開示されているＸｏｍａ技術を含むが、これに限定されない。

【0028】

本明細書に使用されるように、用語「結合」または「特異的に結合」は、結合作用が抗原に対して選択的であり、かつ好ましくないまたは非特異的な相互作用と区別できることを意味する。特定の抗原に対する抗原結合部位の結合能力は、酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）または本分野で公知の通常の結合測定法により測定できる。

【0029】

「親和性」または「結合親和性」は、結合対のメンバー同士間の相互作用を反映する固有結合の親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は通常、解離速度定数と結合速度定数（それぞれｋｄｉｓとｋｏｎ）の比である解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本分野で公知の通常の方法により測定できる。親和性を測定するための具体的な方法の１つは、本明細書に記載のＦｏｒｔｅＢｉｏ動力学的結合測定法である。

【0030】

アミノ酸配列の「同一性百分率（％）」とは、候補配列と本明細書に示される具体的なアミノ酸配列を比較し、かつ必要に応じて最大の配列同一性百分率を実現するためにギャップを導入し、いずれの保存的置換も配列同一性の一部と考慮されない場合、本明細書に示される具体的なアミノ酸配列のアミノ酸残基と一致するアミノ酸残基の候補配列における百分率を指す。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体分子の変異体を考慮しており、前記変異体は、本明細書に具体的に開示された抗体分子およびその配列に対して相当な程度の同一性、例えば少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有する。前記変異体は、保存的修飾を含んでもよい。
ポリペプチド配列の場合、「保存的修飾」は、ポリペプチド配列に対する置換、欠失または添加を含み、それによって特定のアミノ酸は化学的に類似するアミノ酸に置換される。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、この分野でよく知られているものである。このような保存的に修飾された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログおよび対立遺伝子に対しては、付加的なものであり、それらが排除されない。以下は、互いに保存的置換となる８組のアミノ酸である。１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）、２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）、５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）、６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、７）セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ（１９８４）を参照）。いくつかの実施形態において、用語「保存的配列修飾」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に明らかな影響がないまたは結合特徴を変えないアミノ酸修飾を指す。

【0031】

用語「宿主細胞」は、既に外因性ポリヌクレオチドが導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、「形質転換体」と「形質転換された細胞」は、初代より形質転換された細胞およびこれらより誘導された子孫を含む。宿主細胞は、本発明の抗体分子を産生するために用いられる任意のタイプの細胞株であってもよく、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞などの真核細胞と、大腸菌細胞などの原核細胞とを含む。宿主細胞は、培養された細胞を含み、遺伝子組換え動物、遺伝子組換え植物または培養された植物組織もしくは動物組織の内部の細胞を含む。

【0032】

用語「発現ベクター」は、組換えポリヌクレオチドを含むベクターを指し、発現されるヌクレオチド配列に有効に接続された発現制御配列を含む。発現ベクターは、発現するのに十分なシス作用エレメントを含み、発現用の別のエレメントは、宿主細胞により提供されるか、またはインビトロ発現系にあるものであってもよい。発現ベクターは、本分野で公知の全てのものを含み、これらは、組換えポリヌクレオチドが組み込まれたコスミド、プラスミド（例えば、ヌードなるものまたはリポソームに含まれるもの）、ウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス）を含む。

【0033】

哺乳動物は、家畜（例えば、乳牛、綿羊、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒト、およびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギおよびげっ歯類（例えば、マウスとラット）を含むが、これらに限定されない。特に、対象はヒトを指す。

【0034】

用語「治療」は、治療を受けている対象における疾患の自然的過程を変えるための臨床的介入を指す。所望の治療效果は、疾病の発生または再発の防止、症状の軽減、疾病の如何なる直接的または間接的な病理学的結果の減少、転移の防止、病状進展速度の低減、疾病の状態の改善または緩和、および予後の緩和または改善を含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、疾患の発展または疾患の進行を遅延させるために用いられる。

【0035】

用語「腫瘍」および「癌」は、本明細書において交換して使用され、固形腫瘍と液性腫瘍を含む。

【0036】

用語「ＧＰＲＣ５Ｄ」は、腫瘍関連抗原Ｇタンパク質共役受容体ファミリーＣグループ５メンバーＤ（例えば、受託番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ９ＮＺＤ１のヒトＧＰＲＣ５Ｄタンパク質）を指す。本明細書において、「ＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合特異性」とは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する抗体または抗体断片、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂを指す。一実施形態において、フローサイトメトリーにより検出されるように、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する本発明の抗体分子の抗原結合部位は、ＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞に対して高親和性結合活性、例えば、１ｎＭ～１００ｎＭ、例えば２０ｎＭ～６０ｎＭのＥＣ５０値を有してもよい。一実施形態において、前記抗原結合特異性は、ヒトおよびサルＧＰＲＣ５Ｄに対して交差反応性を有する。

【0037】

用語「ＢＣＭＡ」は、ＢＣＭＡ、ＴＲ１７＿ヒト、ＴＮＦＲＳＦ１７とも呼ばれる腫瘍関連抗原Ｂ細胞成熟抗原（例えば、受託番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｑ０２２２３のヒトＢＣＭＡタンパク質）を指す。本明細書において、「ＢＣＭＡに対する抗原結合特異性」とは、ＢＣＭＡに特異的に結合する抗体または抗体断片、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂを指す。一実施形態において、バイオフィルム層光干渉技術により検出されるように、ＢＣＭＡに結合する本発明の抗体分子の抗原結合部位は、ＢＣＭＡに対して高親和性結合活性、例えば、０．１ｎＭ～１０ｎＭ、例えば０．１ｎＭ～５ｎＭのＫＤ値を有してもよい。一実施形態において、前記抗原結合特異性は、ヒトおよびサルＢＣＭＡに対して交差反応性を有する。

【0038】

用語「ＣＤ３」は、Ｔ細胞エンゲージ抗原Ｔ細胞表面の糖タンパク質ＣＤ３（例えば、受託番号ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０７７６６のヒトＣＤ３タンパク質）を指す。本明細書において、「ＣＤ３に対する抗原結合特異性」とは、ＣＤ３に特異的に結合する抗体または抗体断片、例えばｓｃＦｖまたはＦａｂを指す。一実施形態において、バイオフィルム層光干渉技術により検出されるように、ＣＤ３に結合する本発明の抗体分子の抗原結合部位は、ＣＤ３ ｅｐｓｉｌｏｎ鎖に対して高親和性結合活性、例えば、１ｎＭ～５０ｎＭ、例えば０．１ｎＭ～５ｎＭのＫＤ値を有してもよい。好ましくは、本発明の三重特異性抗体分子において、５０ｎＭ未満のＫＤ値を有する高親和性ＣＤ３抗原結合部位を使用する。一実施形態において、前記抗原結合特異性は、ヒトおよびサルＣＤ３に対して交差反応性を有する。

【0039】

本発明の抗体構造を説明する場合、用語「Ｎ末端」は、Ｎ末端の最後のアミノ酸を指し、用語「Ｃ末端」は、Ｃ末端の最後のアミノ酸を指す。

【0040】

「ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ」変異または「ノブインホール」変異は、本明細書において、「ノブインホール」技術により、第１のＦｃポリペプチドおよび第２のＦｃポリペプチドに変異をそれぞれ導入して、第１のＦｃポリペプチドのインターフェースおよび第２のＦｃポリペプチドのインターフェースに突起（「ノブ（ｋｎｏｂ）」）および相補な空洞（「ホール（ｈｏｌｅ）」）を形成することを意味する。当該分野で知られているように、「ノブインホール」技術は、抗体分子の異なる鎖同士の間にインターフェースを改変させることによって、抗体分子の各本の鎖の正確な結合を促進することができる。一般に、当該技術は突起が空洞に配置できるように、一方の鎖のインターフェースに「突起」を導入し、それとペアリングする他方の鎖のインターフェースに対応する「空洞」を導入することに関する。１つの好ましいインターフェースは、一方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインおよびそれとペアリングする他方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインを含む。一方の鎖に由来する重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインのインターフェースの小さなアミノ酸側鎖を比較的大きな側鎖（例えばチロシンまたはトリプトファン）に置き換えることで突起を構築することができる。大きなアミノ酸側鎖を比較的小さな側鎖（例えばアラニンまたはトレオニン）に置き換えることによって、ペアリングされる他方の鎖の重鎖定常ドメインのＣＨ３ドメインのインターフェースで、大きさが突起と同じまたは類似する補償用空洞が構築される。もう１つの選択可能なインターフェースは、前記Ｆａｂ断片のように軽鎖のＣＬドメインと重鎖のＣＨ１ドメインとを含み、突起－空洞の相互作用を構築することによってＦａｂ断片の２本の鎖同士の間に正確なヘテロ二量体化が行われるように促進する。

【0041】

「一本鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」は、本明細書において、リンカーによって連結された重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖可変ドメインＶＬを含む一本鎖抗体断片を指すために使用され、ここで、ＶＨとＶＬがペアリングして抗原結合部位を形成する。「ジスルフィド結合安定化一本鎖可変断片」または「ｄｓｓｃＦｖ」は、本明細書において、ジスルフィド結合により安定化された一本鎖可変断片を指すために使用され、ここで、システイン変異をＶＨドメインおよびＶＬドメインに人為的に導入することによって、前記ｓｃＦｖ断片は、ＶＨとＶＬドメインとの間にジスルフィド結合連結を形成する。

【0042】

「Ｆｖ断片」は、本明細書において、重鎖可変ドメインＶＨおよび軽鎖可変ドメインＶＬを含む抗体断片を指すために使用される。「ジスルフィド結合安定化可変断片」または「ｄｓＦｖ」は、本明細書において、ＶＨとＶＬドメインの間に人為的に導入したジスルフィド結合によって安定化されたＦｖ断片を指すために使用される。

【0043】

「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」は、本明細書において、単一の可変抗体ドメイン、例えばＶＨまたはＶＬからなる抗体断片を指すために使用され、例えばラクダ科重鎖抗体に由来する重鎖可変ドメイン、魚類ＩｇＮＡＲに由来するＶＨ様単一ドメイン（ｖ－ＮＡＲ）である。単一ドメイン抗体の単一可変ドメインは、標的抗原を認識するために別の可変ドメインと相互作用する必要がない。単一ドメイン抗体の例は、ラクダ科（ラマおよびラクダ）および軟骨魚類（例えばコモリザメ）に由来する単一ドメイン抗体を含む。

【0044】

「Ｆａｂ断片」または「Ｆａｂ」は、本明細書において、２本のポリペプチド鎖からなる、免疫グロブリンの重鎖可変ドメインＶＨ、重鎖定常ドメインＣＨ１、軽鎖可変ドメインＶＬおよび軽鎖定常ドメインＣＬを含む免疫グロブリン断片を指すために使用され、ここで、一方のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨと、ＣＨ１およびＣＬから選択される一方の定常領域とを含み、他方のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬと、ＣＬおよびＣＨ１から選択される他方の定常領域とを含み、ここで、前記ＶＨドメインとＶＬドメインがペアリングして抗原結合部位を形成する。本明細書において、Ｆａｂの一方のポリペプチド鎖には、ＣＬに連結されるＶＨが含まれるとともに、他方のポリペプチド鎖には、ＣＨ１に連結されるＶＬが含まれる場合、当該Ｆａｂは、ｃｒｏｓｓＦａｂとも呼ばれる。

【0045】

本明細書において、「一本鎖Ｆａｂ」または「ｓｃＦａｂ」は、Ｆａｂ断片の２本の鎖をリンカーによって連結して形成する一本鎖ポリペプチドを指すために使用される。

【0046】

本発明のいくつかの実施形態において、本発明の抗体は、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１を含む一本の鎖およびＶＬ－ＣＬを含む一本の鎖からなるＦａｂ、ならびに（ｉｉ）ＶＨ－ＣＬを含む一本の鎖およびＶＬ－ＣＨ１を含む一本の鎖からなるｃｒｏｓｓＦａｂから選択されるＦａｂ断片を含んでもよい。本発明の別のいくつかの実施形態において、本発明の抗体は、（ｉ）ＶＨ－ＣＨ１－リンカー－ＶＬ－ＣＬを含む一本鎖Ｆａｂ、ならびに（ｉｉ）ＶＨ－ＣＬ－リンカー－ＶＬ－ＣＨ１を含む一本鎖Ｆａｂから選択される一本鎖Ｆａｂ断片を含んでもよい。

【0047】

本明細書において、免疫グロブリン定常ドメインは、抗体分子の予期される機能に基づいて選択することができる。例えば、定常ドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧもしくはＩｇＭドメイン、特にヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の定常ドメインなどのヒトＩｇＧの免疫グロブリン定常ドメインであってもよく、好ましくはヒトＩｇＧ１の定常ドメインである。一例として、抗体のＦａｂ断片は、ＩｇＧ１に由来するＣＨおよびＣＬ定常ドメインを含んでもよい。さらなる例として、抗体のＦｃ領域は、ＩｇＧ１に由来するＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含んでもよい。

【0048】

本明細書において、用語「フレキシブル連結ペプチド」、「連結ペプチド」または「リンカー」は、アミノ酸からなる短いアミノ酸配列、例えば単独でまたは組み合わせて使用するグリシン（Ｇ）および／またはセリン（Ｓ）および／またはスレオニン残基（Ｔ）、あるいは免疫グロブリンに由来するヒンジ領域を指す。一実施形態において、連結ペプチドは、５個～５０個のアミノ酸長さ、例えば、１０、１５、２０、２５もしくは３０個のアミノ酸長さを有する。一実施形態において、連結ペプチドはアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここで、ｎは１以上の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６もしくは７の整数である。一実施形態において、連結ペプチドはアミノ酸配列ＴＳ（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、ここで、ｎは１以上の整数であり、例えば、ｎは２、３、４、５、６もしくは７の整数である。さらなる実施形態において、連結ペプチドは、免疫グロブリンに由来するヒンジ領域であり、例えば、「ＣＰＰＣ」を含むヒンジ領域のアミノ酸配列であり、例えば、アミノ酸配列「ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」（配列番号１１４）または「ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ」（配列番号１１５）である。本発明に適用できる抗体分子の各ドメインを連結する連結ペプチドは、例えば、ＧＧＧ（配列番号１１６）、ＤＧＧＧＳ（配列番号１１７）、ＴＧＥＫＰ（配列番号１１８）、ＧＧＲＲ（配列番号１１９）、ＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＶＤ（配列番号１２０）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号１２１）、ＧＧＲＲＧＧＧＳ（配列番号１２２）、ＬＲＱＲＤＧＥＲＰ（配列番号１２３）、ＬＲＱＫＤＧＧＧＳＥＲＰ（配列番号１２４）およびＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号１２５）であってもよいが、これらに限定されない。あるいは、コンピュータプログラムを使用してタンパク質およびペプチドの三次元構造を模擬するか、またはファージディスプレイ法によって適切なフレキシブル連結ペプチドを合理的に設計することができる。

【0049】

I． 本発明の三重特異性抗体分子
本発明の三重特異性抗体分子はＹ型抗体分子である。本明細書において、用語「Ｙ型抗体分子」は、２つの抗体アームおよび１つのステム部を含むＹ型構造の抗体分子を指し、ここで、２つの抗体アームはＹ型構造の２つの分岐が形成され、かつ２つの抗体Ｆｃドメインによりペアリングされて形成されたＹ型構造のステム部にそれぞれ連結される。１つの典型的なＹ型抗体分子は免疫グロブリンＩｇＧ分子である。免疫グロブリンＩｇＧ分子のＹ型構造は、２つの抗体アーム（Ｆａｂ）および１つのステム部（Ｆｃ）という３つの領域で構成され、ここで、フレキシブルなヒンジ領域（Ｈｉｎｇｅ）は抗体のステム部（Ｆｃ）と抗体アーム（Ｆａｂ）を連結する。ＩｇＧ分子において、２つのアームは抗原の特異的結合に使用されるが、ステム部は抗体の種類および機能特性を決定する。本明細書において、Ｙ型抗体分子は、ＩｇＧ分子と同じまたは類似するＹ型構造を有する分子、例えば抗体の抗体アームおよび／またはステムに複合成分を有するＹ型分子もカバーする。好ましくは、本発明の抗体分子は複合成分を有する三重特異性抗体分子である。

【0050】

本発明のＹ型抗体分子において、抗体アームは、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｓｄＡＢなどの抗原結合ドメインで構成することができ、かつ２つの抗体アームを構成する抗原結合ドメインは、相同または相異の抗原および／またはエピトープを標的し、相同または相異の結合特異性を有することができる。本発明のＹ型抗体分子において、抗体分子のステムは、ペアリングした２つの免疫グロブリンＦｃドメインで構成することができ、ここで、前記Ｆｃドメインは、それぞれ独立して変異を含んでもよく、含まなくてもよい。抗体分子が非対称ＩｇＧ様分子である場合、好ましくは、ステム部の２つのＦｃドメインは、そのペアリングおよび二量体化を促進する変異、例えば、相補的な「ノブインホール」変異を含む。さらに、ステム部のＦｃドメインは、他の変異、例えばシステイン変異（第１のＦｃと第２のＦｃとの間でのジスルフィド結合連結の形成を促進する）、電荷ペアリング変異、および／またはエフェクター機能が低減または排除された変異（例えば、ＡＤＣＣ活性が低減または排除された変異、例えばＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異の組み合わせ）を含んでもよい。本発明のＹ型抗体分子の２つの抗体アームは、ステムのそれぞれのＦｃドメインに直接または連結ペプチドを介してそれぞれ共有結合されてもよく、好ましくは、アームは免疫グロブリンのヒンジ領域を介してステムのＦｃドメインに連結される。

【0051】

アームおよびステムに加えて、本発明のＹ型抗体分子は、好ましくは、アームおよび／またはステムに複合した複合成分をさらに含み、前記複合成分は、Ｆａｂ、ｓｃＦｖおよびｓｄＡＢなどの追加する抗原結合ドメイン、好ましくはｓｃＦｖを含む。複合成分における抗原結合ドメインは、抗体アームと異なる抗原結合特異性を付与することができる。例えば、Ｙ型分子の２つの抗体アームは、第１と第２抗原結合特異性をそれぞれ提供する抗原結合ドメインを含んでもよく、Ｙ型分子の複合成分は、第３抗原結合特異性を提供する抗原結合ドメインを含み、かつ第１、第２および第３抗原結合特異性はそれぞれ異なる。あるいは、Ｙ型分子の２つの抗体アームは、第１抗原結合特異性を提供する抗原結合ドメインを含んでもよく、Ｙ型分子の複合成分は、第２と第３抗原結合特異性を提供する抗原結合ドメインを含み、かつ第１、第２および第３抗原結合特異性はそれぞれ異なる。

【0052】

本発明のＹ型抗体分子において、第１、第２および第３抗原結合特異性は、それぞれＣＤ３、ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄから選択される異なる抗原に対する結合特異性である。例えば、第１と第２抗原結合特異性は、それぞれＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡから選択される異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するものであってもよく、第３抗原結合特異性は、Ｔ細胞表面抗原（ＴＥＡ）ＣＤ３に対するものであってもよい。あるいは、第１（または第２）と第３抗原結合特異性は、それぞれＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡから選択される異なる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対するものであってもよく、第２（または第１）抗原結合特異性は、Ｔ細胞表面抗原（ＴＥＡ）に対するものであってもよい。

【0053】

アーム、ステムおよび複合成分の構造によって、本発明のＹ型抗体分子は、少なくとも２本のポリペプチド鎖、例えば２本もしくは４本のポリペプチド鎖を含んでもよい。本明細書において、ステムＦｃドメインを含むポリペプチド鎖は重鎖と呼ばれ、それに対してＦｃドメインを含まないポリペプチド鎖は軽鎖と呼ばれる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明のＹ型分子は第１重鎖ポリペプチド鎖と第２重鎖ポリペプチド鎖を含む二本鎖分子であり、他のいくつかの実施形態において、本発明のＹ型分子は２本の重鎖ポリペプチド鎖と２本の軽鎖ポリペプチド鎖を含む四本鎖分子である。複合成分を含む本発明のＹ型分子において、複合成分は、抗体分子の重鎖ポリペプチド鎖（例えば、ステム部のＦｃドメインのＣ末端）に複合されてもよく、または抗体分子の軽鎖ポリペプチド鎖（例えば、Ｆａｂ抗原結合部位を含む抗体アームのＦａｂ軽鎖のＣ末端）に複合されてもよい。したがって、例えば、本発明の抗体は、２本の重鎖ポリペプチド鎖と２本の軽鎖ポリペプチド鎖を含んでもよく、ここで第１重鎖と第１軽鎖がペアリングして抗体の１つの抗体アームを形成し、第２重鎖と第２軽鎖がペアリングして抗体のもう１つの抗体アームを形成し、かつ第１重鎖のＦｃドメインと第２重鎖のＦｃドメインがペアリングして抗体ステムを形成し、ここで第１重鎖または第２重鎖のＣ末端には抗体複合成分を形成する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖなど）がさらに含まれ、あるいは第１軽鎖と第２軽鎖のＣ末端には抗体複合成分を形成する一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖなど）がさらに含まれる。

【0054】

一態様において、したがって、本発明は、三重特異性Ｙ型抗体分子を提供する。本発明のＹ型抗体分子は、下記の式：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ （式Ｉ）
の構造の構造を有し、式中、
Ｍ１とＭ２は、抗原結合部位を含むＹ型抗体分子の第１抗体アームと第２抗体アームをそれぞれ表し、ここで、第１抗体アームと第２抗体アームの抗原結合部位は相同または相異であってもよく、
Ｆｃ：：Ｆｃは、第１と第２抗体アームのＣ末端に位置するＹ型抗体分子のステムを表し、ペアリングおよび二量体化された第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインで構成され、
Ｘ１は抗体アームのＣ末端に複合した複合成分を表し、Ｘ２はステムのＣ末端に複合した複合成分を表し、ここで前記複合成分は抗原結合部位を含み、ここで複合成分は直接または連結ペプチドを介して抗体分子に複合され、かつ
式中、ｐとｑは、０、１もしくは２の整数をそれぞれ表し、かつｐとｑは同時に０ではなく、
ここで、前記抗体は抗体アームおよび複合成分を介してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合され、
好ましくは、第１抗体アームおよび第２抗体アームが異なる抗原に結合する場合、ｐとｑのいずれか１つは０であり、ここで抗体アームＭ１およびＭ２は第１と第２抗原結合特異性を提供し、複合成分は第３抗原結合特異性を提供し、あるいは
好ましくは、第１抗体アームおよび第２抗体アームが同じ抗原に結合する場合、ｐとｑはいずれも０ではなく、ここで抗体アームＭ１およびＭ２は第１抗原結合特異性を提供し、複合成分Ｘ１およびＸ２は第２と第３抗原結合特異性をそれぞれ提供する。

【0055】

いくつかの実施形態において、抗体分子の抗体アーム（Ｍ１およびＭ２）は、ＦａｂまたはｓｃＦａｂ（好ましくはＦａｂ）から選択される抗原結合部位を含み、かつｐとｑのいずれか１つは０であり、ここで抗体アームＭ１およびＭ２は第１と第２抗原にそれぞれ結合され、複合成分（Ｘ１またはＸ２）は第３抗原に結合され、ここで第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択され、
好ましくは、ｐ＝０の場合、ｑ＝１であり、複合成分Ｘ２は抗体分子のステムの２つのＦｃドメインのいずれか１つに複合され、あるいは
好ましくは、ｑ＝０の場合、ｐ＝２であり、複合成分Ｘ１は抗体分子の抗体アームＭ１およびＭ２の両方のＦａｂ軽鎖に複合される。

【0056】

いくつかの実施形態において、抗体分子の抗体アーム（Ｍ１およびＭ２）は、ＦａｂまたはｓｃＦａｂ（好ましくはＦａｂ）から選択される抗原結合部位を含み、かつｐとｑはいずれも０ではなく、ここで抗体アームＭ１およびＭ２は同じ第１抗原に結合され、複合成分Ｘ１およびＸ２は第２抗原および第３抗原にそれぞれ結合され、ここで第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択され、
好ましくは、ｐ＝２かつｑ＝２であり、ここで複合成分Ｘ１は抗体分子の抗体アームＭ１およびＭ２両方のＦａｂ軽鎖に複合され、かつ複合成分Ｘ２は抗体分子のステムの２つのＦｃドメインに複合される。

さらなる実施形態において、抗体分子の抗体アーム（Ｍ１およびＭ２）は、ｓｃＦｖ（好ましくはｄｓｓｃＦｖ）から選択される抗原結合部位を含み、かつｐ＝０、ｑ＝１もしくは２であり、ここで抗体アームＭ１およびＭ２は第１と第２抗原にそれぞれ結合され、複合成分Ｘ２は第３抗原に結合され、ここで第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択され、
好ましくは、ｐ＝０の場合、ｑ＝１であり、複合成分Ｘ２は抗体分子のステムの２つのＦｃドメインのいずれか１つのＣ末端に複合される。

【0057】

前記いずれか１つの実施形態において、好ましくは、複合成分は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖ、より好ましくはｄｓｓｃＦｖから選択される抗原結合部位を含む。
前記いずれか１つの実施形態において、好ましくは、第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインは、「ＣＰＰＣ」アミノ酸残基を有するヒンジ領域を含み、これにより、本発明の抗体分子は、第１と第２のＦｃドメインの間に鎖間ジスルフィド結合を形成して、本発明の抗体分子のポリペプチド鎖が正しくペアリングすることを促進する。好ましくは、本発明の抗体分子において、抗体アームはＦｃ領域のヒンジ領域によりＦｃ領域のＮ末端に融合される。
前記いずれか１つの実施形態において、好ましくは、複合成分は、フレキシブル連結ペプチドにより抗体分子のステムおよび／またはアームに複合される。好ましくは、前記連結ペプチドの長さは、５個～１５個のアミノ酸長さ、例えば１０、１２、１５個のアミノ酸長さである。好ましくは、前記連結ペプチドは、アミノ酸配列ＴＳ（Ｇ４Ｓ）ｎまたは（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１、２もしくは３、好ましくはｎ＝２である。

【0058】

したがって、いくつかの好ましい実施形態において、式Ｉのｐとｑのいずれか１つが０である場合、本発明は、下記の式：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ （式Ｉ）
の構造の構造を有するＩｇＧ様抗体分子を提供し、式中、
Ｍ１およびＭ２は、第１と第２抗原に結合するＦａｂまたはｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂをそれぞれ含み、
式中、ｐ＝０の場合、Ｘ２は第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、あるいは
ｑ＝０の場合、Ｘ１は第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

さらなるいくつかの好ましい実施形態において、式Ｉのｐ＝０の場合、本発明は、下記の式：
（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｆｏｒｍａｔ＿２）
の構造の構造を有するＩｇＧ様抗体分子を提供し、式中、
ｑ＝１、
Ｍ１およびＭ２は、第１と第２抗原に結合するＦａｂまたはｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂをそれぞれ含み、かつ
Ｘ２は、第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0059】

さらなるいくつかの好ましい実施形態において、式Ｉのｑ＝０の場合、本発明は、下記の式：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ， （Ｆｏｒｍａｔ＿７）
の構造の構造を有するＩｇＧ様抗体分子を提供し、式中、
ｐ＝２、
Ｍ１およびＭ２は、第１と第２抗原に結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ
Ｘ２は、第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0060】

さらなるいくつかの実施形態において、式Ｉのｐ＝２かつｑ＝２の場合、本発明は、下記の式：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｆｏｒｍａｔ＿６）
の構造の構造を有するＩｇＧ様抗体分子を提供し、式中、
Ｍ１およびＭ２は、同じ第１抗原に結合するＦａｂまたはｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂを含み、かつ
Ｘ１およびＸ２は、第２抗原および第３抗原に結合するｓｃＦｖをそれぞれ含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0061】

さらなるいくつかの実施形態において、式Ｉのｐ＝０かつｑ＝１の場合、本発明は、下記の式：
（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－Ｘ２， （Ｆｏｒｍａｔ＿１）
の構造の構造を有するＩｇＧ様抗体分子を提供し、式中、
Ｍ１、Ｍ２およびＸ２は、第１、第２、および第３抗原に結合するｓｃＦｖをそれぞれ含み、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0062】

以下、本発明の三重特異性抗体分子を構成する抗体アーム、複合成分およびステムについて、それぞれ詳細にさらに説明する。当業者にとって明らかのように、これらの説明は、前記の本発明にかかる任意の三重特異性抗体分子、例えば式Ｉの分子、およびＦｏｒｍａｔ＿１、２、６および７の構造を有する分子に適用される。

【0063】

本発明の抗体分子の抗体アームおよび複合成分
本発明の抗体分子は、抗体アームおよび複合成分の抗原結合部位により、第１、第２および第３抗原に特異的に結合する抗原結合部位を提供し、ここで第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立して腫瘍関連抗原ＧＰＲＣ５Ｄ、腫瘍関連抗原ＢＣＭＡおよびＴ細胞エンゲージ抗原ＣＤ３から選択される。

【0064】

一実施形態において、本発明は式Ｉの抗体分子を提供し、式中、ｐ＝０またはｑ＝０の場合、抗体の第１抗体アームおよび第２抗体アームは、第１と第２抗原結合部位をそれぞれ提供し、複合成分は第３抗原結合部位を提供する。

【0065】

他の実施形態において、本発明は式Ｉの抗体分子を提供し、式中、ｐとｑがいずれも０ではない場合、抗体の第１抗体アームおよび第２抗体アームは第１抗原結合部位を提供し、かつ抗体アームのＣ末端に複合された複合成分は第２抗原結合部位を提供し、抗体ステムに複合された複合成分は第３抗原結合部位を提供する。

【0066】

本発明に適用できる三重特異性抗体分子の抗原結合部位（ＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に特異的に結合する抗原結合部位を含む）は、標的抗原に結合できる任意の抗体または抗体断片を含んでもよい。例えば、本発明の式Ｉの抗体分子において、抗体アームおよび複合成分における抗原結合部位は、独立してｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｄＡｂであってもよい。好ましくは、いくつかの実施形態において、抗体アームの抗原結合部位は、ＦａｂおよびｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂから選択される。好ましくは、他のいくつかの実施形態において、複合成分の抗原結合部位は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖ、より好ましくはジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖ（すなわち、ｄｓｓｃＦｖ）から選択される。いくつかのより好ましい実施形態において、抗体アームの抗原結合部位はＦａｂ、かつ複合成分の抗原結合部位はｓｃＦｖ、特にｄｓｓｃＦｖである。

【0067】

本明細書において、Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ、Ｆａｂ＿ＢＣＭＡおよびＦａｂ＿ＣＤ３は、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に結合するＦａｂ形式の抗原結合部位をそれぞれ表すために使用される。本明細書において、ＳｃＦｖ＿ＧＰＲＣ５Ｄ、ＳｃＦｖ＿ＢＣＭＡおよびＳｃＦｖ＿ＣＤ３は、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖ形式の抗原結合部位をそれぞれ表すために使用される。

【0068】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるＦａｂ抗原結合部位は、免疫グロブリンＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含む２本のポリペプチド鎖で構成され、ここで前記ＶＨとＶＬがペアリングし、かつ前記ＣＨ１とＣＬがペアリングして、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、Ｆａｂにおいて、１本の鎖はＮ末端からＣ末端まで、ＶＨとＣＨ１（すなわち、ＶＨ－ＣＨ１）を含み、もう１本の鎖はＮ末端からＣ末端まで、ＶＬとＣＬ（すなわち、ＶＬ－ＣＬ）を含む。他のいくつかの実施形態において、Ｆａｂにおいて、１本の鎖はＮ末端からＣ末端まで、ＶＨとＣＬ（すなわち、ＶＨ－ＣＬ）を含み、もう１本の鎖はＮ末端からＣ末端まで、ＶＬとＣＨ１（すなわち、ＶＬ－ＣＨ１）を含む。いくつかの実施形態において、Ｆａｂは、本発明の抗体分子の抗体アームの抗原結合部位を構成する。前記実施形態において、前記Ｆａｂは、ＶＨを含む鎖のＣ末端により抗体ステムのＦｃドメインのＮ末端に融合することができ、あるいは、ここで前記Ｆａｂは、ＶＬを含む鎖のＣ末端により抗体ステムのＦｃドメインのＮ末端に融合される。好ましくは、前記Ｆａｂは、ＶＨ－ＣＨ１鎖およびＶＬ－ＣＬ鎖を含み、ＶＨ－ＣＨ１鎖のＣ末端により抗体ステムのＦｃ領域に結合する。好ましくは、本発明の抗体分子には、抗体アームに複合された複合成分が含まれる場合、前記複合成分は抗体ステムに連結していないＦａｂ鎖のＣ末端に複合される。本明細書において、抗体ステムに連結していないＦａｂ鎖はＦａｂの軽鎖とも呼ばれる。したがって、いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、抗体アームのＦａｂ軽鎖に複合された複合成分を有する。

【0069】

他のいくつかの実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるｓｃＦａｂ抗原結合部位は、免疫グロブリンＶＨ、ＣＨ１、ＶＬおよびＣＬドメインを含む１本のポリペプチド鎖で構成され、ここで前記ＶＨとＶＬがペアリングし、かつ前記ＣＨ１とＣＬがペアリングして、抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、前記ｓｃＦａｂはＮ末端からＣ末端まで、ＶＨ－ＣＨ１、リンカー、およびＶＬ－ＣＬを含む。他のいくつかの実施形態において、前記ｓｃＦａｂはＮ末端からＣ末端まで、ＶＬ－ＣＬ、リンカー、およびＶＨ－ＣＨ１を含む。さらなるいくつかの実施形態において、前記ｓｃＦａｂはＮ末端からＣ末端まで、ＶＨ－ＣＬ、リンカー、およびＶＬ－ＣＨ１を含む。他のいくつかの実施形態において、前記ｓｃＦａｂはＮ末端からＣ末端まで、ＶＬ－ＣＨ１、リンカー、およびＶＨ－ＣＬを含む。いくつかの実施形態において、ｓｃＦａｂは、本発明の抗体分子の抗体アームの抗原結合部位を構成する。いくつかの実施形態において、前記ｓｃＦａｂは、そのポリペプチド鎖のＣ末端により抗体ステムのＦｃドメインのＮ末端に融合される。好ましくは、前記ｓｃＦａｂはＮ末端からＣ末端まで、ＶＬ－ＣＬ、リンカー、およびＶＨ－ＣＨ１を含み、かつＣＨ１ドメインのＣ末端により抗体ステムのＦｃ領域に結合する。好ましくは、本発明の抗体分子にはｓｃＦａｂ抗体アームが含まれる場合、抗体分子の複合成分は、抗体ステムのＦｃドメインのＣ末端にのみ複合される。

【0070】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるＦａｂまたはｓｃＦａｂは、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来するＣＨ１ドメイン、例えば、ＩｇＧ１のＣＨ１ドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＨ１ドメインを含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記ＣＨ１ドメインは、配列番号１０４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるＦａｂまたはｓｃＦａｂは、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来するｋａｐｐａ軽鎖定常ドメイン、例えばＩｇＧ１のＣＬ_κドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＬ_κドメインを含む。例えば、前記ＦａｂまたはｓｃＦａｂは、配列番号１０５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｋａｐｐａ軽鎖定常ドメインを含む。他のいくつかの実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるＦａｂまたはｓｃＦａｂは、ＩｇＧ免疫グロブリンに由来するｌａｍｄａ軽鎖定常領域、例えばＩｇＧ１のＣＬ_λドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１のＣＬ_λドメインを含む。例えば、前記Ｆａｂは、配列番号１０６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有するｌａｍｄａ軽鎖定常ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子の抗体アームＭ１およびＭ２には、異なる抗原に結合するＦａｂまたはｓｃＦａｂ（好ましくはＦａｂ）が含まれる場合、抗体アームＭ１および抗体アームＭ２のＦａｂまたはｓｃＦａｂの軽鎖定常ドメインは互いに異なる。例えば、いくつかの実施形態において、抗体アームＭ１のＦａｂはｋａｐｐａ軽鎖定常ドメインを含み、抗体アームＭ２のＦａｂはｌａｍｄａ軽鎖可変ドメインを含み、または抗体アームＭ１のＦａｂはｌａｍｄａ軽鎖定常ドメインを含み、抗体アームＭ２のＦａｂはｋａｐｐａ軽鎖可変ドメインを含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるｓｃＦｖ抗原結合部位は、免疫グロブリンＶＨとＶＬドメインを含む１本のポリペプチド鎖で構成され、ここで前記ＶＨとＶＬはリンカーにより連結されてペアリングして抗原結合部位を形成する。いくつかの実施形態において、前記ｓｃＦｖはトランス構成であり、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＨ、リンカー、およびＶＬ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ）を含む。他のいくつかの実施形態において、前記ｓｃＦｖはシス構成であり、Ｎ末端からＣ末端まで、ＶＬ、リンカー、およびＶＨ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ）を含む。いくつかの実施形態において、リンカーは、アミノ酸残基で構成されるペプチドリンカーである。好適なペプチドリンカーは当業者によく知られている。一実施形態において、リンカーは、１０個～５０個のアミノ酸長さ、例えば５個～３０個のアミノ酸長さ、例えば１５個のアミノ酸もしくは２０個のアミノ酸長さである。一実施形態において、リンカーはアミノ酸配列（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１、２、３、４もしくは５、好ましくは、ｎ＝３もしくは４、より好ましくは、ｎ＝４である。
いくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、本発明の抗体分子の抗体アームの抗原結合部位を構成し、そのポリペプチド鎖のＣ末端により抗体ステムのＦｃドメインのＮ末端に融合される。

【0072】

他のいくつかの実施形態において、ｓｃＦｖは、本発明の抗体分子の複合成分の抗原結合部位を構成する。いくつかの実施形態において、前記ｓｃＦｖは、そのポリペプチド鎖のＮ末端により抗体ステムのＣ末端および／または抗体アームのＣ末端に融合される。好ましくは、本発明の抗体分子において、抗体アームはＦａｂを含み、複合成分はｓｃＦｖを含み、ここで、前記ｓｃＦｖは、そのポリペプチド鎖のＮ末端により抗体ステムＦｃのＣ末端および／または抗体アームＦａｂ軽鎖のＣ末端に融合される。
いくつかの好ましい実施形態において、本発明の抗体分子に含まれるｓｃＦｖ抗原結合部位は、ジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖ、すなわちｄｓｓｃＦｖである。抗原結合部位がｄｓｓｃＦｖである場合、ｓｃＦｖに変異するＶＨとＶＬ可変ドメインの間に導入するジスルフィド結合により、下記の残基対（以下の位置はＫａｂａｔ番号によって決定される）：
ＶＨの３７位残基＋ＶＬの９５位残基、ＶＨの４４位残基＋ＶＬの１００位残基、ＶＨの４４位残基＋ＶＬの１０５位残基、ＶＨの４５位残基＋ＶＬの８７位残基、ＶＨの５５位残基＋ＶＬの１０１位残基、ＶＨの１００位残基＋ＶＬの５０位残基、ＶＨの１００ｂ位残基＋ＶＬの４９位残基、ＶＨの９８位残基＋ＶＬの４６位残基、ＶＨの１０５位残基＋ＶＬの４３位残基、およびＶＨの１０６位残基＋ＶＬの５７位残基、の間に位置することができる。好ましくは、ｄｓｓｃＦｖを形成するために、システイン置換にＶＨの４４位とＶＬの１００位残基を導入することで、前記ＶＨとＶＬがペアリングする時に２つの残基の間にジスルフィド結合による連結を形成することができる。

【0073】

ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位
本発明に適用できる抗体分子のＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合できる任意の抗体または抗体断片であってもよい。例えば、本発明の抗体分子において、抗体アームまたは複合成分に含まれるＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、独立してｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｄＡｂであってもよく、かつ好ましくは上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する抗原結合部位である。好ましくは、抗体アームのＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、ＦａｂおよびｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂから選択される。好ましくは、複合成分のＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖ、より好ましくはジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖ（すなわち、ｄｓｓｃＦｖ）から選択される。１つのより好ましい実施形態において、抗体はＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗体アームを含み、かつ抗体アームのＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位はＦａｂであり、もう１つのより好ましい実施形態において、抗体はＧＰＲＣ５Ｄに結合する複合成分を含み、かつ複合成分のＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位はｓｃＦｖ、特にｄｓｓｃＦｖである。

【0074】

いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、
（ｉ）配列番号２５に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号２６に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉ）配列番号２７に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号２８に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２９に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号３０に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｖ）配列番号３１に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号３２に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖ）配列番号９８に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号９９に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖｉ）配列番号１００に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号１０１に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、を含む。

【0075】

いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、以下：
（ｉ）それぞれ配列番号１～６に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉ）それぞれ配列番号７～１２に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１３～１８に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｖ）それぞれ配列番号１９～２４に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖ）それぞれ配列番号１３、１１０および１５～１８に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、から選択されるＣＤＲ配列の組み合わせを含む。

【0076】

あるいは、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する前記抗原結合部位、例えば、ｓｃＦｖまたはＦａｂは、前記ＣＤＲ配列の組み合わせの１つの変異体を含み、ここで前記変異体は、１、２、３、４、５もしくは好ましくは６個のＣＤＲ領域において合計で少なくとも１個かつ５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含み、好ましくは、重鎖ＣＤＲ３は変化しないままである。

【0077】

いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、以下：
（ａ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｂ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｃ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｄ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、
（ｅ）配列番号９８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および
（ｆ）配列番号１００に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、から選択される重鎖可変ドメインＶＨを含む。

【0078】

いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、以下：
（ａ）配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｂ）配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｃ）配列番号３０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｄ）配列番号３２に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｅ）配列番号９９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、および
（ｆ）配列番号１０１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、から選択される軽鎖可変ドメインＶＬを含む。

【0079】

いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、以下：
（ａ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｂ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｃ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｄ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３２に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｅ）配列番号９８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号９９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｆ）配列番号１００に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0080】

いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位は、以下：
（ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｉｉ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｉｉｉ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｉｖ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｖ）配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｖｉ）配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、から選択されるＶＨとＶＬ配列の組み合わせを含む。
いくつかの好ましい実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合する抗原結合部位はジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖである場合、前記ｓｃＦｖはさらに、ＶＨドメインの４４位にシステイン置換が含まれ、ＶＬドメインの１００位にシステイン置換が含まれる。

【0081】

ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位
本発明に適用できる抗体分子のＢＣＭＡ抗原結合部位は、ＢＣＭＡに結合できる任意の抗体または抗体断片であってもよい。例えば、本発明の抗体分子において、抗体アームまたは複合成分に含まれるＢＣＭＡ抗原結合部位は、独立してｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｄＡｂであってもよく、かつ好ましくは上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する抗原結合部位である。好ましくは、抗体アームのＢＣＭＡ抗原結合部位は、ＦａｂおよびｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂから選択される。好ましくは、複合成分のＢＣＭＡ抗原結合部位は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖ、より好ましくはジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖ（すなわち、ｄｓｓｃＦｖ）から選択される。１つのより好ましい実施形態において、抗体はＢＣＭＡに結合する抗体アームを含み、かつ抗体アームのＢＣＭＡ抗原結合部位はＦａｂであり、もう１つのより好ましい実施形態において、抗体はＢＣＭＡに結合する複合成分を含み、かつ複合成分のＢＣＭＡ抗原結合部位はｓｃＦｖ、特にｄｓｓｃＦｖである。

【0082】

いくつかの好ましい実施形態において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＢＣＭＡ抗原結合部位は、配列番号３９に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号４０に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列を含む。

【0083】

いくつかの好ましい実施形態において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＢＣＭＡ抗原結合部位は、以下：
－配列番号３３に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＨＣＤＲ１、
－配列番号３４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＨＣＤＲ２、
－配列番号３５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＨＣＤＲ３、
－配列番号３６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＬＣＤＲ１、
－配列番号３７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＬＣＤＲ２、
－配列番号３８に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＬＣＤＲ３、というＣＤＲ配列の組み合わせを含み、
あるいは、ＢＣＭＡに結合する前記抗原結合部位は、前記ＣＤＲ配列の組み合わせの１つの変異体を含み、ここで前記変異体は、１、２、３、４、５もしくは好ましくは６個のＣＤＲ領域において合計で少なくとも１個かつ５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含み、好ましくは、重鎖ＣＤＲ３は変化しないままである。

【0084】

いくつかの好ましい実施形態において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＢＣＭＡ抗原結合部位は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨを含む。

【0085】

いくつかの好ましい実施形態において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＢＣＭＡ抗原結合部位は、配列番号４０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む。

【0086】

いくつかの好ましい実施形態において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＢＣＭＡ抗原結合部位は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨを含み、かつ配列番号４０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む。

【0087】

好ましくは、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＢＣＭＡ抗原結合部位は、配列番号３９に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４０に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。いくつかの好ましい実施形態において、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位はジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖである場合、前記ｓｃＦｖはさらに、ＶＨドメインの４４位にシステイン置換が含まれ、ＶＬドメインの１００位にシステイン置換が含まれる。

【0088】

ＣＤ３に結合する抗原結合部位
本発明に適用できる抗体分子のＣＤ３抗原結合部位は、ＣＤ３に結合できる任意の抗体または抗体断片であってもよい。例えば、本発明の抗体分子において、抗体アームまたは複合成分に含まれるＣＤ３抗原結合部位は、独立してｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦａｂまたはｓｄＡｂであってもよく、かつ好ましくは上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する抗原結合部位である。好ましくは、抗体アームのＣＤ３抗原結合部位は、ＦａｂおよびｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂから選択される。好ましくは、複合成分のＣＤ３抗原結合部位は、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖおよびｄｓＡｂ、好ましくはｓｃＦｖ、より好ましくはジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖ（すなわち、ｄｓｓｃＦｖ）から選択される。１つのより好ましい実施形態において、抗体はＣＤ３に結合する抗体アームを含み、かつ抗体アームのＣＤ３抗原結合部位はＦａｂであり、もう１つのより好ましい実施形態において、抗体はＣＤ３に結合する複合成分を含み、かつ複合成分のＣＤ３抗原結合部位はｓｃＦｖ、特にｄｓｓｃＦｖである。

【0089】

いくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号４８に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号４９に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列を含む。
別のいくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号５０に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号４９に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列を含む。

【0090】

いくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、以下：
－配列番号４１に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＨＣＤＲ１、
－配列番号４２もしくは４７に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＨＣＤＲ２、
－配列番号４３に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＨＣＤＲ３、
－配列番号４４に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＬＣＤＲ１、
－配列番号４５に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＬＣＤＲ２、
－配列番号４６に示されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるＬＣＤＲ３、というＣＤＲ配列の組み合わせを含み、
あるいは、ＣＤ３に結合する前記抗原結合部位は、前記ＣＤＲ配列の組み合わせの１つの変異体を含み、ここで前記変異体は、１、２、３、４、５もしくは好ましくは６個のＣＤＲ領域において合計で少なくとも１個かつ５、４、３、２もしくは１個以下のアミノ酸変異（好ましくはアミノ酸置換、好ましくは保存的置換）を含み、好ましくは、重鎖ＣＤＲ３は変化しないままである。

【0091】

いくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号４８もしくは５０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨを含む。

【0092】

いくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号４９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む。
いくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号４８もしくは５０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変ドメインＶＨを含み、かつ配列番号４９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変ドメインＶＬを含む。

【0093】

好ましくは、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号４８もしくは５０に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。より好ましくは、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば、上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有するＣＤ３抗原結合部位は、配列番号４８に示されるアミノ酸配列を有するＶＨドメインおよび配列番号４９に示されるアミノ酸配列を有するＶＬドメインを含む。いくつかの好ましい実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位はジスルフィド結合が安定したｓｃＦｖである場合、前記ｓｃＦｖはさらに、ＶＨドメインの４４位にシステイン置換が含まれ、ＶＬドメインの１００位にシステイン置換が含まれる。

【0094】

本発明の抗体分子のステム
本発明の抗体分子は、抗体アームのＣ末端に位置し、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインにより形成されたステムを含む。いくつかの実施形態において、第１と第２のＦｃドメインは同じである。他のいくつかの実施形態において、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインが異なり、両者がペアリングしてヘテロ二量体化されている。

【0095】

本発明に適用される抗体分子のＦｃドメイン断片は、任意の抗体Ｆｃドメインであってもよい。例えば、本発明の抗体のＦｃドメインは、２つもしくは３つの定常ドメイン、すなわちＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよび選択可能なＣＨ４ドメインを含んでもよい。好ましくは、本発明の抗体のＦｃドメインはＮ末端からＣ末端まで、ＣＨ２－ＣＨ３を含み、より好ましくはＮ末端からＣ末端まで、ヒンジ領域－ＣＨ２－ＣＨ３を含む。
本発明の抗体分子において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＤ類抗体に由来する第２および第３定常ドメイン（ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメイン）を含んでもよく、またはＩｇＭおよびＩｇＥ類抗体に由来する第２、第３および第４定常ドメイン（ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメインおよびＣＨ４ドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、抗体分子のＦｃドメインは、ＩｇＧからのＦｃドメイン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４からのＦｃドメイン、好ましくはヒトＩｇＧ１からのＦｃドメインである。

【0096】

当業者には理解されるように、本発明の抗体分子の予期される使用に応じて、本発明の抗体分子は、Ｆｃドメインにエフェクター機能を変更する修飾を含んでもよい。一実施形態において、本発明のＦｃドメインの１種または複数種のエフェクター機能は、同じアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して、低減または排除されている。Ｆｃドメインのグリコシル化の改変、天然に低減または排除されたエフェクター機能を有するＦｃアイソタイプの使用、およびＦｃドメインのアミノ酸配列の修飾から選ばれる任意の方法により、Ｆｃドメインのエフェクター機能を低減または排除することができる。

【0097】

一実施形態において、Ｆｃドメインのグリコシル化を低減することによってエフェクター機能を低減または排除する。当該分野で公知であるＦｃドメインのグリコシル化を低減するための様々な方法は、野生型グリコシル化が許容されない環境での本発明の抗体分子の製造、Ｆｃドメインにすでに存在した炭水化物基の除去、および野生型グリコシル化が起こらないようにＦｃドメインの修飾を含むが、これらに限定されない。一実施形態において、Ｆｃドメインを修飾することによってＦｃドメインのグリコシル化を低減する。例えば、Ｆｃドメインの位置２９７に変異を導入することによって、当該位置での野生型アスパラギン残基が当該位置のグリコシル化を妨げる別のアミノ酸で置換される、例えばＮ２９７Ａ変異である。

【0098】

別の実施形態において、少なくとも１つのＦｃドメインのアミノ酸配列を修飾することによって、エフェクター機能を低減または排除する。前記Ｆｃドメイン修飾は、２３８、２３９、２４８、２４９、２５２、２５４、２６５、２６８、２６９、２７０、２７２、２７８、２８９、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、３０１、３０３、３２２、３２４、３２７、３２９、３３３、３３５、３３８、３４０、３７３、３７６、３８２、３８８、３８９、４１４、４１６、４１９、４３４、４３５、４３７、４３８および４３９から選択される１つもしくは複数の位置に、Ｆｃドメインの１つもしくは複数のＦｃ受容体への結合を損なう点変異を導入するか、または、２７０、３２２、３２９および３２１から選択される位置にＣ１ｑ結合を損なう点変異を導入する。

【0099】

当業者には理解されるように、本発明の抗体分子の予期される使用に応じて、本発明の抗体分子は、Ｆｃドメインに１種または複数種のＦｃ受容体への結合親和性を変更する修飾を含んでもよい。一実施形態において、前記Ｆｃ受容体は、Ｆｃγ受容体であり、特にヒトＦｃγ受容体である。一実施形態において、前記修飾は、本発明の抗体分子のエフェクター機能を低減する。一具体的な実施形態において、前記エフェクター機能は、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）である。一実施形態において、本発明の抗体分子のＦｃドメインは、第２３４と２３５位（ＥＵ番号）にアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態において、前記アミノ酸置換は、Ｌ２３４ＡとＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ変異）である。別の実施形態において、本発明の抗体分子のＦｃドメインは、第３２９位（ＥＵ番号）にアミノ酸置換を含む。一具体的な実施形態において、前記アミノ酸置換はＰ３２９Ｇである。

【0100】

当業者には理解されるように、本発明の抗体分子が非対称抗体分子（例えばＦｏｒｍａｔ＿２とＦｏｒｍａｔ＿７の抗体分子）である場合、非対称抗体分子が正しく形成されるように促進するために、本発明の抗体分子は、第１と第２のＦｃドメインに、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインのヘテロ二量体化を容易にする変異を含んでもよい。例えば、Ｋｎｏｂ－ｉｎ－Ｈｏｌｅ技術により、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインに相補的なＫｎｏｂ変異とＨｏｌｅ変異を導入することができる。

【0101】

したがって、いくつかの実施形態において、本発明は、第１のＦｃドメインと第２のＦｃドメインには、第１と第２のＦｃドメインのペアリングおよびヘテロ二量体化を促進する第１と第２ヘテロ二量体化変異がそれぞれ含まれる、三重特異性抗体分子を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、第１のＦｃドメインの第１ヘテロ二量体化変異はＫｎｏｂ変異を含み、第２のＦｃドメインの第２ヘテロ二量体化変異は前記ｋｎｏｂ変異と相補的なＨｏｌｅ変異を含み、または、第１のＦｃドメインの第１ヘテロ二量体化変異はＨｏｌｅ変異を含み、第２のＦｃドメインの第２ヘテロ二量体化変異は前記ｈｏｌｅ変異と相補的なＫｎｏｂ変異を含む。いくつかの好ましい実施形態において、前記Ｋｎｏｂ変異はＴ３６６Ｗ、かつ前記相補的なｈｏｌｅ変異はＴ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖである。

【0102】

一実施形態において、本発明は、
ｉ）場合により、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラスのホモ二量体Ｆｃ－領域、または
ｉｉ）場合により、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを有する、ヒトＩｇＧ４サブクラスのホモ二量体Ｆｃ－領域、または
ｉｉｉ）ヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、そのうち
ａ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
ｂ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
ｃ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
または
ｉｖ）ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、そのうち、２つのＦｃ－領域ポリペプチドはいずれも、変異Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａを含み、かつ
ａ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
ｂ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
ｃ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ１サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
または
ｖ）ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域であって、そのうち、２つのＦｃ－領域ポリペプチドはいずれも、変異Ｐ３２９Ｇ、Ｓ２２８ＰおよびＬ２３５Ｅを含み、かつ
ａ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｗを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含み、または
ｂ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＹ３４９Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＳ３５４Ｃを含み、または
ｃ）１つのＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含み、別のＦｃ－領域ポリペプチドは変異Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含む、ヒトＩｇＧ４サブクラスのヘテロ二量体Ｆｃ－領域、
を含む三重特異性抗体分子を提供する。

【0103】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子のＦｃドメインは、ヘテロポリマー抗体の精製を促進する他の変異をさらに含んでもよい。例えば、Ｈ４３５Ｒ変異を第１と第２のＦｃドメインの一方（例えば、Ｈｏｌｅ変異を有するＦｃドメイン）に導入して、タンパク質Ａを使用した標的ヘテロポリマー抗体の精製を促進する。

【0104】

本発明の抗体分子において、抗体ステムはＦｃドメインのＮ末端で抗体アームに連結される。当業者に明らかなように、本発明に適用される抗体分子において、抗体アームとステム部Ｆｃドメイン断片とを連結する連結ペプチドは、当該分野で既知の任意のフレキシブル連結ペプチドであってもよい。いくつかの実施形態において、連結ペプチドは、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域のアミノ酸配列を含んでもよく、または、（ＧＳ）ｎ、（ＧＳＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎおよび（ＧＧＧＳ）ｎから選択されるアミノ酸配列を含んでもよく、式中、ｎは少なくとも１の整数である。好ましくは、抗体ステムは、ＩｇＧに由来するヒンジ領域（特にヒトＩｇＧ１に由来するヒンジ領域）を介して抗体アームに連結することができる。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域を含む本発明のヘテロポリマー抗体については、標的ヘテロポリマー抗体の形成を促進するために、ヒンジ領域に変異、例えばＣ２２０Ｓを導入することができる。

【0105】

例示的な三重特異性抗体分子
Ｆｏｒｍａｔ＿２
いくつかの実施形態において、ｐ＝０かつｑ＝１の場合、本発明の抗体分子は、（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑの構造の構造を有する。このようにして、前記抗体分子において、ステムに複合された複合成分Ｘ２のみがある。前記抗体分子において、好ましくは、抗体アームＭ１およびＭ２は、第１抗原および第２抗原にそれぞれ結合するＦａｂ抗原結合部位を含み、かつ複合成分Ｘ２は第３抗原に結合するｓｃＦｖ抗原結合部位を含み、ここで第１、第２、第３抗原はそれぞれ異なり、かつ互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0106】

したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明は三重特異性Ｙ型抗体分子を提供し、前記抗体分子は、以下：
（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｆｏｒｍａｔ＿２）
の構造の構造を有し、式中、ｑ＝１であり、
Ｍ１およびＭ２は、抗体分子の第１抗体アームおよび第２抗体アームをそれぞれ表し、かつＭ１およびＭ２は第１と第２抗原に結合するＦａｂまたはｓｃＦａｂ、好ましくはＦａｂをそれぞれ含み、
Ｆｃ：：Ｆｃは抗体分子のステムを表し、ペアリングして二量体化された第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインで構成され、ここで第１と第２抗体アームは、直接または連結ペプチド（好ましくはヒンジ領域）を介して第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインのＮ末端にそれぞれ連結され、
Ｘ２はステムのＣ末端に複合された複合成分を表し、ここで前記複合成分は第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、ここでＸ２は、直接または連結ペプチドを介して第１のＦｃドメインのＣ末端に複合され、あるいは第２のＦｃドメインのＣ末端に複合され、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0107】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｏｒｍａｔ＿２構造を有する三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
（ａ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂおよびＣＤ３に結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ２はＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ：Ｆａｂ＿ＣＤ３）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＢＣＭＡ）の構造の構造を有する（例えば実施例のＴＳ－Ｆ２－１、３－６分子）、あるいは
（ｂ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＢＣＭＡに結合するＦａｂおよびＣＤ３に結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ２はＧＰＲＣ５Ｄに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＢＣＭＡ：Ｆａｂ＿ＣＤ３）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＧＰＲＣ５Ｄ）の構造の構造を有する（例えば実施例のＴＳ－Ｆ２－２分子）、あるいは
（ｃ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂおよびＢＣＭＡに結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ２はＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ：Ｆａｂ＿ＢＣＭＡ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＣＤ３）の構造の構造を有する。

【0108】

前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿２抗体分子の任意の実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する任意の適切なＦａｂまたはｓｃＦｖ、例えば上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位であってもよく、特に上述したＶＨとＶＬアミノ酸配列を有するｓｃＦｖまたはＦａｂである。

【0109】

前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿２抗体分子の任意の実施形態において、ＢＣＭＡに結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに特異的に結合する任意の適切なＦａｂまたはｓｃＦｖ、例えば上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する本発明のＢＣＭＡ抗原結合部位であってもよく、特に上述したＶＨとＶＬアミノ酸配列を有するｓｃＦｖまたはＦａｂである。

【0110】

前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿２抗体分子の任意の実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位は、特異性ＣＤ３に結合する任意の適切なｓｃＦｖまたはＦａｂ、例えば上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する本発明のＣＤ３抗原結合部位であってもよく、特に上述したＶＨとＶＬアミノ酸配列を有するｓｃＦｖまたはＦａｂである。

【0111】

前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿２抗体分子の任意の実施形態において、抗体分子は、上述したＦｏｒｍａｔ＿２に適用される任意の本発明の抗体ステム構造を含んでもよい。例えば、本発明のＦｏｒｍａｔ＿２非対称三重特異性抗体分子において、好ましくは、抗体分子ポリペプチド鎖が正しくペアリングされるように促進するために、ステムの第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインに第１と第２のＦｃドメインのヘテロ二量体化を促進できる変異、特に相補的な「ノブインホール」変異を導入することができる。例えば第１のＦｃドメインにｋｎｏｂ変異を導入するとともに、第２のＦｃドメインに相補的なｈｏｌｅ変異を導入し、または逆である。このようにして、前記抗体分子の２つのＦｃドメインは、ペアリングして「ノブインホール」の安定した結合を形成することができる。予期される使用に応じて、本発明のＦｏｒｍａｔ＿２抗体分子の第１および／または第２のＦｃドメインは好ましくは、ＡＤＣＣ活性を低減する変異など、抗体エフェクター機能に影響を与える変異、例えばＬＡＬＡ変異をさらに含んでもよい。

【0112】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｏｒｍａｔ＿２三重特異性抗体分子は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
かつ、ここで、第１重鎖ポリペプチド鎖または第２重鎖ポリペプチド鎖は、直接または好ましくは連結ペプチド（例えば（Ｇ４Ｓ）２またはＴＳ（Ｇ４Ｓ）２）を介してそのＦｃドメインのＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインをさらに含み、
ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第１軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第１抗原に結合する第１抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第２重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第２軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第２抗原に結合する第２抗体アーム（Ｍ２）を形成し、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインと第２重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインがペアリングおよび二量体化されて抗体ステム（Ｆｃ：：Ｆｃ）を形成し、かつ
第１重鎖ポリペプチド鎖または第２重鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインは、第３抗原に結合する複合成分（Ｘ２）を形成し、
ここで、第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0113】

一実施形態において、抗体アームＭ１はＧＰＣＲ５Ｄに結合され、第２抗体アームＭ２はＣＤ３に結合され、複合成分Ｘ２はＢＣＭＡに結合され、このようにして、
－第１重鎖ポリペプチド鎖と第１軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
－第２重鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
ここで、複合成分Ｘ２が第１重鎖ポリペプチド鎖に複合される場合、第１重鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれ、または、好ましくは、複合成分Ｘ２が第２重鎖ポリペプチド鎖に複合される場合、第２重鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれる。

【0114】

他の実施形態において、抗体アームＭ１はＢＣＭＡに結合され、第２抗体アームＭ２はＣＤ３に結合され、複合成分Ｘ２はＧＰＣＲ５Ｄに結合され、このようにして、
－第１重鎖ポリペプチド鎖と第１軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
－第２重鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
ここで、複合成分Ｘ２が第１重鎖ポリペプチド鎖に複合される場合、第１重鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれ、または、好ましくは、複合成分Ｘ２が第２重鎖ポリペプチド鎖に複合される場合、第２重鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれる。

【0115】

さらなる一実施形態において、抗体アームＭ１はＧＰＣＲ５Ｄに結合され、第２抗体アームＭ２はＢＣＭＡに結合され、複合成分Ｘ２はＣＤ３に結合され、このようにして、
－第１重鎖ポリペプチド鎖と第１軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
－第２重鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
ここで、複合成分Ｘ２が第１重鎖ポリペプチド鎖に複合される場合、第１重鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれ、または、複合成分Ｘ２が第２重鎖ポリペプチド鎖に複合される場合、第２重鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれる。

【0116】

好ましい一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下の群：
（ａ）配列番号１～３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４～６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号７～８のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号１０～１２のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号１３～１５のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号１６～１８のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１９～２１のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号２２～２４のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記Ｆａｂおよび前記ｓｃＦｖは、以下の群：配列番号２５／２６、配列番号２７／２８、配列番号２９／３０および配列番号３１／３２から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、ｓｃＦｖがｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む。

好ましい一実施形態において、前記ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下の群：
（ａ）配列番号４１～４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号４１、４７、４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記ＦａｂおよびｓｃＦｖは、以下の群：配列番号４８／４９、配列番号５０／４９、かつより好ましくは配列番号４８／４９から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、ｓｃＦｖがｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む。

【0117】

好ましい一実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下：
配列番号３３～３５のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号３６～３８のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、というＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記ＦａｂおよびｓｃＦｖは、配列番号３９／４０というＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、ｓｃＦｖがｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む。

【0118】

いくつかの好ましい実施形態において、第１軽鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常ドメインＣＬ_κとｌａｍｄａ軽鎖定常ドメインＣＬ_λをそれぞれ含む。一具体的な実施形態において、軽鎖定常ドメインＣＬ_κは、配列番号１０５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、軽鎖定常ドメインＣＬ_λは、配列番号１０６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0119】

いくつかの好ましい実施形態において、第１重鎖ポリペプチド鎖と第２重鎖ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１に由来する重鎖定常領域ＣＨ１を含み、好ましくは、配列番号１０４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0120】

いくつかの好ましい実施形態において、第１重鎖ポリペプチド鎖と第２重鎖ポリペプチド鎖は、ｋｎｏｂまたは相補的なｈｏｌｅ変異を含むＦｃドメインをそれぞれ含む。一具体的な実施形態において、ｋｎｏｂ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｗを含み、相補的なｈｏｌｅ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を含む。一具体的な実施形態において、ｈｏｌｅ変異を含むＦｃドメインは、配列番号１０２および１０７から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、相補的なｋｎｏｂ変異を含むＦｃドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0121】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿２構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0122】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿２構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0123】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿２構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0124】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿２構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７５のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７もしくは７８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0125】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿２構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0126】

Ｆｏｒｍａｔ＿７
いくつかの実施形態において、ｑ＝０かつｐ＝２の場合、本発明の抗体分子は、（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃの構造を有する。このようにして、前記抗体分子において、抗体アームに複合された複合成分Ｘ１のみがある。前記抗体分子において、抗体アームＭ１およびＭ２は、第１抗原および第２抗原にそれぞれ結合するＦａｂ抗原結合部位を含み、かつ複合成分Ｘ１は第３抗原に結合するｓｃＦｖ抗原結合部位を含み、ここで第１、第２、第３抗原はそれぞれ異なり、かつ互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0127】

したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明は三重特異性Ｙ型抗体分子を提供し、前記抗体分子は、以下：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ１）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ， （Ｆｏｒｍａｔ＿７）
の構造を有し、式中、ｐ＝２であり、
Ｍ１およびＭ２は、抗体分子の第１抗体アームおよび第２抗体アームをそれぞれ表し、かつＭ１およびＭ２は第１と第２抗原に結合するＦａｂをそれぞれ含み、
Ｆｃ：：Ｆｃは抗体分子のステムを表し、ペアリングして二量体化された第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインで構成され、ここで第１と第２抗体アームは、直接または連結ペプチド（好ましくはヒンジ領域）を介して第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインのＮ末端にそれぞれ連結され、
Ｘ１は抗体アームのＣ末端に複合された複合成分を表し、ここで前記複合成分は第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、ここでＸ１は、直接または連結ペプチドを介して第１と第２抗体アームのＦａｂ軽鎖のＣ末端に複合され、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0128】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｏｒｍａｔ＿７構造を有する三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
（ａ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂおよびＣＤ３に結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ１はＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ：Ｆａｂ＿ＣＤ３－（ｓｃＦｖ＿ＢＣＭＡ）_２）－Ｆｃ：：Ｆｃの構造を有する（例えば、実施例ＴＳ－Ｆ７－１，２，５の分子）、あるいは
（ｂ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂおよびＢＣＭＡに結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ１はＣＤ３に結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ：Ｆａｂ＿ＢＣＭＡ－（ｓｃＦｖ＿ＣＤ３）_２）－Ｆｃ：：Ｆｃの構造を有する（例えば、実施例ＴＳ－Ｆ７－３，４の分子）、あるいは
（ｃ）前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＢＣＭＡに結合するＦａｂおよびＣＤ３に結合するＦａｂをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ１はＧＰＲＣ５Ｄに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＢＣＭＡ：Ｆａｂ＿ＣＤ３－（ｓｃＦｖ＿ＧＰＲＣ５Ｄ）_２）－Ｆｃ：：Ｆｃの構造を有する。

【0129】

前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿７抗体分子の任意の実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する任意の適切なＦａｂまたはｓｃＦｖ、例えば上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗原結合部位であってもよく、特に上述したＶＨとＶＬアミノ酸配列を有するｓｃＦｖまたはＦａｂである。
前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿７抗体分子の任意の実施形態において、ＢＣＭＡに結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、ＢＣＭＡに特異的に結合する任意の適切なＦａｂまたはｓｃＦｖ、例えば上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する本発明のＢＣＭＡ抗原結合部位であってもよく、特に上述したＶＨとＶＬアミノ酸配列を有するｓｃＦｖまたはＦａｂである。
前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿７抗体分子の任意の実施形態において、ＣＤ３に結合する抗原結合部位は、ＣＤ３に特異的に結合する任意の適切なｓｃＦｖまたはＦａｂ、例えば上述したｓｃＦｖまたはＦａｂ構造を有する本発明のＣＤ３抗原結合部位であってもよく、特に上述したＶＨとＶＬアミノ酸配列を有するｓｃＦｖまたはＦａｂである。

【0130】

前述した本発明のＦｏｒｍａｔ＿７抗体分子の任意の実施形態において、抗体分子は、上述したＦｏｒｍａｔ＿７に適用される任意の本発明の抗体ステム構造を含んでもよい。例えば、本発明のＦｏｒｍａｔ＿７非対称三重特異性抗体分子において、好ましくは、抗体分子ポリペプチド鎖が正しくペアリングされるように促進するために、ステムの第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインに第１と第２のＦｃドメインのヘテロ二量体化を促進できる変異、特に相補的な「ノブインホール」変異を導入することができる。例えば第１のＦｃドメインにｋｎｏｂ変異を導入するとともに、第２のＦｃドメインに相補的なｈｏｌｅ変異を導入し、または逆である。このようにして、前記抗体分子の２つのＦｃドメインは、ペアリングして「ノブインホール」の安定した結合を形成することができる。予期される使用に応じて、本発明のＦｏｒｍａｔ＿７抗体分子の第１および／または第２のＦｃドメインは好ましくは、ＡＤＣＣ活性を低減する変異など、抗体エフェクター機能に影響を与える変異、例えばＬＡＬＡ変異をさらに含んでもよい。

【0131】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｏｒｍａｔ＿７三重特異性抗体分子は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインを含み、
かつ、ここで、第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖は、直接または好ましくは連結ペプチド（例えば（Ｇ４Ｓ）２またはＴＳ（Ｇ４Ｓ）２）を介してそのＣＬドメインのＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインをさらに含み、
ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第１軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第１抗原に結合する第１抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第２重鎖ポリペプチド鎖のＶＨ－ＣＨ１と第２軽鎖ポリペプチド鎖のＶＬ－ＣＬがペアリングして第２抗原に結合する第２抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインと第２重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインがペアリングおよび二量体化されて抗体ステム（Ｆｃ：：Ｆｃ）を形成し、かつ
第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインは、第３抗原に結合する複合成分（Ｘ１）を形成し、
ここで、第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0132】

一実施形態において、抗体アームＭ１はＧＰＣＲ５Ｄに結合され、第２抗体アームＭ２はＣＤ３に結合され、複合成分Ｘ１はＢＣＭＡに結合され、このようにして、
－第１重鎖ポリペプチド鎖と第１軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
－第２重鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
かつ、第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれる。

【0133】

一実施形態において、抗体アームＭ１はＢＣＭＡに結合され、第２抗体アームＭ２はＣＤ３に結合され、複合成分Ｘ１はＧＰＣＲ５Ｄに結合され、このようにして、
－第１重鎖ポリペプチド鎖と第１軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
－第２重鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＣＤ３に特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
かつ、第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれる。

【0134】

一実施形態において、抗体アームＭ１はＧＰＣＲ５Ｄに結合され、第２抗体アームＭ２はＢＣＭＡに結合され、複合成分Ｘ１はＣＤ３に結合され、このようにして、
－第１重鎖ポリペプチド鎖と第１軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
－第２重鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｎ末端にはＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂ抗原結合部位のＶＨとＶＬアミノ酸配列がそれぞれ含まれ、
かつ、第１軽鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖は、Ｃ末端にはＣＤ３に特異的に結合するｓｃＦｖのアミノ酸配列がさらに含まれる。

【0135】

好ましい一実施形態において、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下の群：
（ａ）配列番号１～３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４～６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
（ｂ）配列番号７～８のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号１０～１２のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
（ｃ）配列番号１３～１５のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号１６～１８のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｄ）配列番号１９～２１のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号２２～２４のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記Ｆａｂおよび前記ｓｃＦｖは、以下の群：配列番号２５／２６、配列番号２７／２８、配列番号２９／３０および配列番号３１／３２から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、ｓｃＦｖがｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む。

【0136】

好ましい一実施形態において、前記ＣＤ３に特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下の群：
（ａ）配列番号４１～４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号４１、４７、４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記ＦａｂおよびｓｃＦｖは、以下の群：配列番号４８／４９、配列番号５０／４９、かつより好ましくは配列番号４８／４９から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、ｓｃＦｖがｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む。

【0137】

好ましい一実施形態において、前記ＢＣＭＡに特異的に結合するＦａｂまたはｓｃＦｖは、以下：
配列番号３３～３５のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号３６～３８のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、というＶＨとＶＬを含み、
好ましくは、前記ＦａｂおよびｓｃＦｖは、配列番号３９／４０というＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
かつ好ましくは、ｓｃＦｖがｄｓｓｃＦｖである場合、前記ＶＨとＶＬ配列に導入されたシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位とＶＬ配列の１００位でのシステイン置換をさらに含む。

【0138】

いくつかの実施形態において、第１軽鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、ｋａｐｐａ軽鎖定常ドメインＣＬ_κを含む。いくつかの実施形態において、第１軽鎖ポリペプチド鎖と第２軽鎖ポリペプチド鎖は、ｌａｍｄａ軽鎖定常ドメインＣＬ_λを含む。一具体的な実施形態において、軽鎖定常ドメインＣＬ_κは、配列番号１０５のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。一具体的な実施形態において、軽鎖定常ドメインＣＬ_λは、配列番号１０６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0139】

いくつかの好ましい実施形態において、第１重鎖ポリペプチド鎖と第２重鎖ポリペプチド鎖は、ヒトＩｇＧ１に由来する重鎖定常領域ＣＨ１を含み、好ましくは、配列番号１０４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0140】

いくつかの好ましい実施形態において、第１重鎖ポリペプチド鎖と第２重鎖ポリペプチド鎖は、ｋｎｏｂまたは相補的なｈｏｌｅ変異を含むＦｃドメインをそれぞれ含む。一具体的な実施形態において、ｋｎｏｂ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｗを含み、相補的なｈｏｌｅ変異を含むＦｃドメインはＴ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ変異を含む。一具体的な実施形態において、ｋｎｏｂ変異を含むＦｃドメインは、配列番号１０２および１０７から選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、相補的なｈｏｌｅ変異を含むＦｃドメインは、配列番号１０３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0141】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿７構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７もしくは７８のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0142】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿７構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９０のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号７７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８９のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0143】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖、第１軽鎖ポリペプチド鎖、第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿７構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第１軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９３もしくは９６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号９５または９７のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0144】

Ｆｏｒｍａｔ＿１
いくつかの実施形態において、ｐ＝０かつｑ＝１の場合、本発明の抗体分子は、（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑの構造を有し、ここで抗体アームＭ１、Ｍ２および複合成分Ｘ２は、第１抗原、第２抗原および第３抗原に結合するｓｃＦｖ抗原結合部位をそれぞれ含み、ここで第１、第２、第３抗原はそれぞれ異なり、かつ互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0145】

したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明は三重特異性Ｙ型抗体分子を提供し、前記抗体分子は、以下：
（Ｍ１：Ｍ２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｆｏｒｍａｔ＿１）
の構造を有し、式中、ｑ＝１であり、
Ｍ１およびＭ２は、抗体分子の第１抗体アームおよび第２抗体アームをそれぞれ表し、かつＭ１およびＭ２は第１と第２抗原に結合するｓｃＦｖをそれぞれ含み、
Ｆｃ：：Ｆｃは抗体分子のステムを表し、ペアリングして二量体化された第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインで構成され、ここで第１と第２抗体アームは、直接または連結ペプチド（好ましくはヒンジ領域）を介して第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインのＮ末端にそれぞれ連結され、
Ｘ２はステムのＣ末端に複合された複合成分を表し、ここで前記複合成分は第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、ここでＸ２は、直接または連結ペプチドを介して第１のＦｃドメインのＣ末端に複合され、あるいは第２のＦｃドメインのＣ末端に複合され、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0146】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｏｒｍａｔ＿１構造を有する三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
（ａ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＧＰＲＣ５Ｄに結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ２はＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（ｓｃＦｖ＿ＧＰＲＣ５Ｄ：ｓｃＦｖ＿ＣＤ３）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＢＣＭＡ）の構造を有する（例えば、実施例ＴＳ－Ｆ１－１の分子）、あるいは
（ｂ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２は、ＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖおよびＣＤ３に結合するｓｃＦｖをそれぞれ含み、かつ複合成分Ｘ２はＧＰＲＣ５Ｄに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（ｓｃＦｖ＿ＢＣＭＡ：ｓｃＦｖ＿ＣＤ３）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＧＰＲＣ５Ｄ）の構造を有する（例えば、実施例ＴＳ－Ｆ１－２の分子）。

【0147】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｏｒｍａｔ＿１三重特異性抗体分子は、第１重鎖ポリペプチド鎖および第２重鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、第１ｓｃＦｖおよびＦｃドメインを含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、第２ｓｃＦｖおよびＦｃドメインを含み、
かつ、ここで、第１重鎖ポリペプチド鎖または第２重鎖ポリペプチド鎖は、直接または好ましくは連結ペプチド（例えば（Ｇ４Ｓ）２またはＴＳ（Ｇ４Ｓ）２）を介してそのＦｃドメインのＣ末端に複合された第３のｓｃＦｖドメインをさらに含み、
ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖の第１のｓｃＦｖは、第１抗原に結合する第１抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第２重鎖ポリペプチド鎖の第２のｓｃＦｖは、第２抗原に結合する第２抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
第１重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインと第２重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインがペアリングおよび二量体化されて抗体ステム（Ｆｃ：：Ｆｃ）を形成し、かつ
第１重鎖ポリペプチド鎖または第２重鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合された第３のｓｃＦｖドメインは、第３抗原に結合する複合成分（Ｘ２）を形成し、
ここで、第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0148】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖および第２重鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿１構造を有する三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６２のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0149】

いくつかの実施形態において、本発明は、第１重鎖ポリペプチド鎖および第２重鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿１構造を有する三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
第１重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
第２重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号６４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0150】

Ｆｏｒｍａｔ＿６
いくつかの実施形態において、ｐ＝２かつｑ＝２の場合、本発明の抗体分子は、（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ２）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑの構造を有し、ここで抗体アームＭ１およびＭ２は、第１抗原に結合するＦａｂ抗原結合部位を含み、かつ複合成分Ｘ１およびＸ２は、第２抗原と第３抗原に結合するｓｃＦｖ抗原結合部位をそれぞれ含み、ここで第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、かつ互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0151】

したがって、いくつかの好ましい実施形態において、本発明は三重特異性対称Ｙ型抗体分子を提供し、前記抗体分子は、以下：
（Ｍ１：Ｍ２－（Ｘ２）ｐ）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（Ｘ２）ｑ， （Ｆｏｒｍａｔ＿６）
の構造を有し、式中、ｐ＝２かつｑ＝２であり、
Ｍ１およびＭ２は、抗体分子の第１抗体アームおよび第２抗体アームをそれぞれ表し、かつＭ１およびＭ２はいずれも、第１抗原に結合するＦａｂを含み、
Ｆｃ：：Ｆｃは抗体分子のステムを表し、ペアリングして二量体化された第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインで構成され、ここで第１と第２抗体アームは、直接または連結ペプチド（好ましくはヒンジ領域）を介して第１のＦｃドメインおよび第２のＦｃドメインのＮ末端にそれぞれ連結され、
Ｘ１およびＸ２は、抗体アームＦａｂ軽鎖のＣ末端またはステムＦｃドメインのＣ末端に複合された複合成分をそれぞれ表し、ここで前記複合成分Ｘ１は第２抗原に結合するｓｃＦｖを含み、前記複合成分Ｘ２は第３抗原に結合するｓｃＦｖを含み、ここでＸ１およびＸ２は、直接または連結ペプチドを介してアームまたはステムに複合され、
ここで、第１、第２および第３抗原は互いに異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0152】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｆｏｒｍａｔ＿６構造を有する三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
（ａ）前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２はＧＰＲＣ５Ｄに結合するＦａｂを含み、複合成分Ｘ１はＣＤ３のｓｃＦｖを含み、かつ複合成分Ｘ２はＢＣＭＡに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ：Ｆａｂ＿ＧＰＲＣ５Ｄ－（ｓｃＦｖ＿ＣＤ３）_２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＢＣＭＡ）_２の構造を有する（例えば、実施例ＴＳ－Ｆ６－１，２の分子）、あるいは
（ｂ）：前記分子の抗体アームＭ１および抗体アームＭ２はＢＣＭＡに結合するＦａｂを含み、複合成分Ｘ１はＣＤ３のｓｃＦｖを含み、かつ複合成分Ｘ２はＧＰＲＣ５Ｄに結合するｓｃＦｖを含み、前記分子は、（Ｆａｂ＿ＢＣＭＡ：Ｆａｂ＿ＢＣＭＡ－（ｓｃＦｖ＿ＣＤ３）_２）－Ｆｃ：：Ｆｃ－（ｓｃＦｖ＿ＧＰＲＣ５Ｄ）_２の構造を有する（例えば、実施例ＴＳ－Ｆ６－３，４の分子）。

【0153】

いくつかの実施形態において、本発明のＦｏｒｍａｔ＿６三重特異性抗体分子は、２本の同じ重鎖ポリペプチド鎖および２本の同じ軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなり、ここで、
前記重鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、重鎖可変ドメインＶＨ、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、Ｆｃドメイン、および第１のｓｃＦｖドメインを含み、
前記軽鎖ポリペプチド鎖はＮ末端からＣ末端まで、軽鎖可変ドメインＶＬ、免疫グロブリンＣＬドメインおよび第２のｓｃＦｖドメインを含み、
ここで、前記重鎖ポリペプチド鎖と軽鎖ポリペプチド鎖の第１と第２のｓｃＦｖドメインは、直接または好ましく連結ペプチド（例えば（Ｇ４Ｓ）２またはＴＳ（Ｇ４Ｓ）２）を介してそのＣ末端にそれぞれ複合され、
ここで、
１本の重鎖ポリペプチド鎖のＮ末端のＶＨ－ＣＨ１ドメインと１本の軽鎖ポリペプチド鎖のＮ末端のＶＬ－ＣＨ１ドメインがペアリングして第１抗原に結合する第１抗体アーム（Ｍ１）を形成し、
もう１本の重鎖ポリペプチド鎖のＮ末端のＶＨ－ＣＨ１ドメインと１本の軽鎖ポリペプチド鎖のＮ末端のＶＬ－ＣＨ１ドメインがペアリングして第１抗原に結合する第２抗体アーム（Ｍ２）を形成し、
２本の重鎖ポリペプチド鎖のＦｃドメインがペアリングして形成し、二量体化されて抗体ステム（Ｆｃ：：Ｆｃ）を形成し、かつ
２本の軽鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインは、第２抗原に結合する複合成分（Ｘ１）を形成し、
２本の重鎖ポリペプチド鎖のＣ末端に複合されたｓｃＦｖドメインは、第３抗原に結合する複合成分（Ｘ２）を形成し、
ここで、第１、第２および第３抗原はそれぞれ異なり、互いに独立してＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３から選択される。

【0154】

いくつかの実施形態において、本発明は、２本の同じ重鎖ポリペプチド鎖および２本の同じ軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿６構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
前記重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８１のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８２もしくは８３のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、本発明は、２本の同じ重鎖ポリペプチド鎖および２本の同じ軽鎖ポリペプチド鎖を含むか、またはそれからなるＦｏｒｍａｔ＿６構造の三重特異性抗体分子を提供し、ここで、
前記重鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８４のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
前記軽鎖ポリペプチド鎖は、配列番号８５もしくは８６のアミノ酸配列、またはそれと少なくとも９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0156】

ＩＩＩ．本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体分子
一態様において、本発明は、ＧＰＲＣ５Ｄに特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片を提供する。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号２５に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号２６に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉ）配列番号２７に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号２８に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉｉ）配列番号２９に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号３０に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｖ）配列番号３１に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号３２に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖ）配列番号９８に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号９９に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖｉ）配列番号１００に示される重鎖可変ドメインのＨＣＤＲ１、２および３の配列、ならびに配列番号１０１に示される軽鎖可変ドメインのＬＣＤＲ１、２および３の配列、を含む。

【0157】

他のいくつかの実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体またはその抗原結合断片は、
（ｉ）それぞれ配列番号１～６に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉ）それぞれ配列番号７～１２に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｉｉ）それぞれ配列番号１３～１８に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｉｖ）それぞれ配列番号１９～２４に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、または
（ｖ）それぞれ配列番号１３、１１０および１８に示される重鎖可変ドメインＨＣＤＲ１、２および３の配列ならびに軽鎖可変ドメインＬＣＤＲ１、２および３の配列、から選択されるＣＤＲ配列の組み合わせを含む。

【0158】

さらなるいくつかの実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体分子またはその抗原結合断片は、
（ａ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２６に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｂ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｃ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３０に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｄ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３２に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｅ）配列番号９８に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号９９に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｆ）配列番号１００に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０１に示されるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0159】

好ましくは、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体分子またはその抗原結合断片は、
（ｉ）配列番号２５に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２６に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｉｉ）配列番号２７に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｉｉｉ）配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３０に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、または
（ｉｖ）配列番号３１に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号３２に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｖ）配列番号９８に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号９９に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、
（ｖｉ）配列番号１００に示されるアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、ならびに配列番号１０１に示されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン、から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【0160】

いくつかの実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、単一特異性抗体、二重特異性抗体または三重特異性抗体である。いくつかの好ましい実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ＣＤ３に結合する抗原結合部位、例えば上述した本発明のＣＤ３抗原結合部位をさらに含む二重特異性抗体である。別のいくつかの好ましい実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ＢＣＭＡに結合する抗原結合部位（例えば上述した本発明のＢＣＭＡ抗原結合部位）およびＣＤ３に結合する抗原結合部位（例えば、上述した本発明のＣＤ３抗原結合部位）をさらに含む三重特異性抗体である。

【0161】

いくつかの実施形態において、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体は、ＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体であり、
好ましくは、ここで、前記抗体は、ＣＤ３に結合する以下の群：
（ａ）配列番号４１～４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、または
（ｂ）配列番号４７、４２、４３のＨＣＤＲ１～３配列を含むＶＨおよび配列番号４４～４６のＬＣＤＲ１～３配列を含むＶＬ、
から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
好ましくは、以下の群：配列番号４８／４９および配列番号５０／４９から選択されるＶＨとＶＬアミノ酸配列対を含み、
場合により、前記ＶＨとＶＬ配列には、導入したシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位およびＶＬ配列の１００位でのシステイン置換が含まれ、このようにして前記ＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を形成する。

【0162】

したがって、好ましい一実施形態において、本発明は、ＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３に結合する二重特異性抗体を提供しており、ここで前記抗体は、以下の群から選択されるＧＰＲＣ５Ｄに結合するＶＨとＶＬアミノ酸配列対およびＣＤ３に結合するＶＨとＶＬアミノ酸配列対の組み合わせを含む。

【表2】

【0163】

本発明は、前記二重特異性抗体の変異体をさらに提供し、ここで前記変異体は、前記ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＶＨとＶＬアミノ酸配列対、および／または、前記ＣＤ３に結合するＶＨとＶＬアミノ酸配列対にはアミノ酸の置換、欠失および／または挿入などのアミノ酸変異が含まれ、ここで前記アミノ酸変異は、二重特異性抗体のＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３への結合に影響を与えない。いくつかの実施形態において、前記変異体は、以下から選択されるアミノ酸配列の組み合わせを含む。

【表3-1】

【表3-2】

【0164】

好ましい一実施形態において、本発明の二重特異性抗体は、前記ＧＰＲＣ５Ｄに結合するＶＨとＶＬアミノ酸配列対、および／または、前記ＣＤ３に結合するＶＨとＶＬアミノ酸配列対に導入したシステイン置換、例えば、ＶＨ配列の４４位およびＶＬ配列の１００位でのシステイン置換を含み、このようにして前記ＶＨとＶＬとの間にジスルフィド結合を形成する。

【0165】

本発明は、本発明のＧＰＲＣ５Ｄ抗体を含む融合タンパク質と免疫複合体（例えば毒素または化学小分子との複合）、および医薬組成物ならびに薬物組合せをさらに提供する。医薬組成物または薬物組合せにおいて、本発明の抗体は、本発明の抗体の予期される使用に適用できる他の治療剤などの他の治療剤、例えば、化学療法剤、放射線療法剤、腫瘍抑制分子を含んでもよい。

【0166】

ＩＶ．本発明の抗体分子の製造および精製
さらなる態様において、本発明は、本発明の抗体分子を製造するための方法を提供し、前記方法は、前記抗体を発現するのに適するポリペプチド鎖の条件で前記ポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養することと、前記ポリペプチド鎖を前記抗体分子に組み立てるのに適する条件でポリペプチド鎖を組み立てて前記抗体を生成することと、を含む。

【0167】

本発明の抗体分子が、第１重鎖ポリペプチド鎖および第１軽鎖ポリペプチド鎖ならびに第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖を含む三重特異性抗体分子などの非対称抗体分子、例えばＦｏｒｍａｔ＿２およびＦｏｒｍａｔ＿７の抗体分子である場合、好ましくは、本発明の抗体分子の製造方法は、前記抗体分子を発現するのに適する第１重鎖ポリペプチド鎖および第１軽鎖ポリペプチド鎖の条件で、前記第１重鎖および第１軽鎖をコードするものを含む宿主細胞を培養し、第１親タンパク質を生成するステップ（ｉ）と、前記抗体分子を発現するのに適する第２重鎖ポリペプチド鎖および第２軽鎖ポリペプチド鎖の条件で、前記第２重鎖および第２軽鎖をコードするものを含む宿主細胞を培養し、第２親タンパク質を生成するステップ（ｉｉ）と、第１親タンパク質と第２親タンパク質とを等モル比率で混合し、インビトロで適切な酸化還元条件に置いて組み立てて前記抗体を形成するステップ（ｉｉｉ）と、を含む。一具体的な実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）は、精製した第１と第２親タンパク質の混合溶液にグルタチオン（ＧＳＨ）を加えることを含み、ここで、好ましくは、ＧＳＨ／タンパク質のモル比率を５００倍～７００倍に制御する。一具体的な実施形態において、ステップ（ｉｉｉ）は、ＧＳＨを除去した後、一定の時間（例えば２時間～３時間）の自然酸化を行うことをさらに含む。

【0168】

本発明の抗体分子のポリペプチド鎖は、例えば、固相ペプチド合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ固相合成）または組換えにより製造できる。組換え製造において、宿主細胞でクローニングおよび／または発現するために、前記抗体分子のいずれか１本のポリペプチド鎖および／または複数本のポリペプチド鎖をコードするポリヌクレオチドを単離し、１つまたは複数のベクターに挿入する。通常の方法を用いて、前記ポリヌクレオチドを簡易に単離してシーケンシングすることができる。一実施形態において、本発明の１種または複数種のポリヌクレオチドを含むベクター、好ましくは発現ベクターを提供する。

【0169】

当業者が公知する方法を用いて発現ベクターを構築することができる。発現ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、λファージまたは酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含むが、これらに限定されない。
本発明の１種または複数種のポリヌクレオチドを含む発現用の発現ベクターを調製できたら、発現ベクターを適切な宿主細胞にトランスフェクションまたは導入できる。この目的を達成させるためには、例えば、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム共沈殿、エレクトロポレーション、レトロウイルス形質導入、ウイルストランスフェクション、パーティクルガン、リポソームに基づくトランスフェクションまたは他の一般的な技術など、さまざまな技術を利用できる。

【0170】

一実施形態において、本発明のポリヌクレオチドを含む１種または複数種の宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。本明細書で使用される用語「宿主細胞」は、工学的手法により本発明の抗体分子を産生できる任意の種類の細胞系を指す。複製および本発明の抗体分子の発現をサポートするのに適する宿主細胞は、本分野で公知する事項である。必要に応じて、このような細胞は特定の発現ベクターを用いてトランスフェクションまたは形質導入することができ、しかもベクターを含む多くの細胞を培養して大型の発酵槽に接種して、臨床用として十分な量の本発明の抗体分子を得ることができる。適切な宿主細胞は、大腸菌などの原核微生物、糸状真菌もしくは酵母などの真核微生物、または、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、昆虫細胞などのさまざまな真核細胞を含む。懸濁培養に適する哺乳動物細胞系を用いることができる。使用可能な哺乳動物宿主細胞系の例としては、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ－７）、ヒト胎児腎臓株（ＨＥＫ ２９３または２９３Ｆ細胞）、ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）、サル腎臓細胞（ＣＶ１）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ－７６）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）、犬腎臓細胞（ＭＤＣＫ）、バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ ３Ａ）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８）、ヒト肝臓細胞（Ｈｅｐ Ｇ２）、ＣＨＯ細胞、ＮＳＯ細胞、骨髄腫細胞株、例えばＹＯ、ＮＳ０、Ｐ３Ｘ６３およびＳｐ２／０などが挙げられる。タンパク質の産生に適する哺乳動物宿主細胞株に関する概要は、例えば、Ｙａｚａｋｉ＆Ｗｕ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２４８巻（Ｂ．Ｋ．Ｃ．Ｌｏ編集，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ），ｐ２５５～２６８（２００３）が参照される。好ましい一実施形態において、前記宿主細胞はＣＨＯ、ＨＥＫ２９３またはＮＳＯ細胞である。
本明細書に記載の通り調製された抗体分子は、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーなどの既知の従来技術により精製することができる。特定のタンパク質を精製するための実際の条件は、正味電荷、疎水性、親水性などの因素にも依存し、これは当業者にとって公知する内容である。
本発明の抗体分子の純度は、さまざまな公知する分析方法のいずれかにより決定でき、前記公知する分析方法は、サイズ排除クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、高速液体クロマトグラフィーなどを含む。本明細書に係る抗体分子の物理的／化学的特性および／または生物学的活性は、本分野の公知するさまざまな測定法により、同定し、選別しまたはその特性評価を行うことができる。

【0171】

Ｖ．医薬組成物、薬物組合せおよび試薬キット
一態様において、本発明は、組成物、例えば、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容可能なベクターと配合される本明細書に記載の抗体分子を含む。本明細書で使用される「薬学的に許容可能なベクター」は、生理学的に適合性がある溶剤、分散媒体、等張剤、吸収遅延剤などのいずれかまたはその全てを含む。本発明の医薬組成物は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、非経口投与、直腸投与、脊髄投与または表皮投与（例えば、注射または輸注）に適する。いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は、医薬組成物中の唯一の活性成分である。他のいくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載の抗体分子および１つ以上の治療剤を含んでもよい。

【0172】

別の態様において、本発明は、本明細書に記載の抗体分子および１つ以上の治療剤を含む薬物組合せをさらに提供する。

【0173】

本発明の医薬組成物および薬物組合せに適用される治療剤は、以下のカテゴリ（ｉ）～（ｉｉｉ）：（ｉ）抗原提示（例えば、腫瘍抗原提示）を増強する薬物、（ｉｉ）エフェクター細胞応答（例えば、Ｂ細胞および／またはＴ細胞活性化および／または動員）を増強する薬物、（ｉｉｉ）免疫抑制を軽減する薬物、（ｉｖ）腫瘍抑制効果を有する薬物、から選択されるいずれか１つの治療剤であってもよい。

【0174】

本発明の組成物は、さまざまな形態で存在することができる。これらの形態は、液体、半固体および固体の剤型、例えば、液体溶液剤（例えば、注射用溶液剤、輸注用溶液剤）、分散体剤もしくは懸濁剤、リポソーム剤および坐剤を含む。好ましい形態は、所望の投与モードと治療的使用によって決定する。一般的に好ましくは、組成物が注射用溶液剤または輸注用溶液剤の形態である。好ましい投与モードは、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内（ｉ．ｐ．）、筋肉内）注射である。好ましい一実施形態において、抗体分子は静脈内注入または注射により投与される。別の好ましい実施形態において、抗体分子は筋肉内、腹腔内または皮下注射により投与される。

【0175】

本明細書で使用される用語「非経口投与」および「非経口方式投与」は、経腸投与および局所投与以外の投与モードを指し、一般には注射して投与されるが、静脈内、筋肉内、動脈内、皮内、腹腔内、経気管、皮下注射、輸注を含むが、これらに限定されない。

【0176】

治療用組成物は一般に、滅菌されたものであり、しかもその製造・保管条件において安定している。組成物は溶液、マイクロエマルション、分散体、リポソームまたは凍結乾燥物の形態として調製することができる。活性化合物（すなわち抗体分子）を所定の量で適切な溶剤に加え、次にろ過・消毒することによって、滅菌された注射用溶液剤を調製することができる。一般には、前記活性化合物を滅菌溶媒に混入することによって分散体を調製し、前記滅菌溶媒は基礎となる分散媒体と他の成分を含む。レシチンなどのコーティング剤を用いることができる。分散体である場合は、界面活性剤を用いて溶液剤に適切な流動性を維持できる。吸収を遅延させる物質、例えばモノステアレート、ゼラチンを組成物に含有させることによって注射用組成物の吸収を引き伸ばすことができる。

【0177】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子は経口投与され、例えば、不活性希釈剤または食用可能ベクターとともに経口投与される。本発明の抗体分子は、ハードゼラチンカプセルまたはソフトゼラチンカプセルに封入されるか、錠剤に圧縮されてもよいし、またはそのまま対象の食事に混入されてもよい。経口投与して治療に使用される場合は、前記化合物は、賦形剤とともに混入され、摂取される錠剤、頬錠、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅ）、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハ剤（ｗａｆｅｒ）などの形態で使用されてもよい。本発明の抗体分子を非経口経路で投与するためには、前記抗体分子をその不活性化を防ぐ材料でコーティングするか、または当該材料とともに投与する場合がある。さらに治療用組成物は、本分野で公知する医療機器を用いて投与できる。

【0178】

本発明の医薬組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明に記載の抗体分子を含んでもよい。「治療有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の治療結果を効果的に実現するための量を指す。治療有効量は、病状、個体の年齢、性別、体重などの多くの要因によって異なる。治療有効量は、毒性または害が治療による有益な効果に及ばないような任意の量である。治療を受けていない対象と比べ、「治療有効量」は、測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍増殖率）を好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらに好ましくは少なくとも約６０％、一層好ましくは少なくとも約８０％抑制する。前記測定可能なパラメータ（例えば、腫瘍体積）に対する本発明の抗体分子の抑制能力は、ヒト腫瘍における効果を示すための動物モデルシステムにおいて評価できる。

【0179】

「予防有効量」とは、必要な期間にわたって必要な用量で所望の予防結果を効果的に実現するための量を指す。一般には、予防的用量は疾患の早期より前にまたは比較的初期の段階で対象に使用されるため、予防有効量は治療有効量を下回る。

【0180】

本明細書に記載の抗体分子を含む試薬キットも本発明の範囲内である。キットは、１つまたは複数の他の要素を含んでもよく、例えば、取扱説明書、マーカーまたはカップリングのための試薬などの他の試薬、薬学的に許容可能なベクター、対象への投与のための装置もしくは他の材料を含む。

【0181】

Ｖ．本発明の分子の使用および方法
一態様において、本発明は、本発明の抗体分子のインビボ、インビトロでの使用および適用方法を提供する。

【0182】

いくつかの実施形態において、本発明の使用および方法は、本発明の抗体分子のインビボおよび／またはインビトロでの以下の適用に関する。
－細胞の表面にＧＰＲＣ５Ｄ抗原を発現することを含む、１０ｎＭ未満のＫＤなどの高親和性で、ＧＰＲＣ５Ｄ抗原に結合すること、
－Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を、その表面にＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞、特にＧＰＲＣ５Ｄ陽性腫瘍細胞を標的とすること、
－Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞）を、その表面にＢＣＭＡを発現する細胞、特にＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を標的とすること、
－Ｔ細胞のＣＤ３下流シグナル伝達経路を活性化すること、
－ＧＰＲＣ５Ｄ陽性腫瘍細胞および／またはＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞に対するＴ細胞の殺傷効果を介在すること、
－Ｔ細胞がＴＮＦ－α、ＩＦＮ－γ、およびＩＬ－２などのサイトカインを放出するように誘導すること、
－ＧＰＲＣ５Ｄ陽性および／またはＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞を抑制または殺傷すること、または
－ＢＣＭＡ陽性患者集団、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性患者集団、抗ＢＣＭＡ分子に結合した後のＢＣＭＡ喪失を伴うＧＰＲＣ５Ｄ陽性患者集団を治療するなど、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性および／またはＢＣＭＡ陽性多発性骨髄腫を治療すること、
－多発性骨髄腫の再発など、ＢＣＭＡエスケープ介在性腫瘍の再発を回避すること。

【0183】

いくつかの実施形態において、本発明の抗体分子または本発明の抗体分子を含む医薬組成物は、個体において疾患を治療および／または予防するための薬物として使用され、あるいは疾患の診断ツールとして使用され、好ましくは、前記個体は哺乳動物、より好ましくはヒトである。

【0184】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の抗体分子、特に三重特異性抗体分子を使用した癌の治療方法および使用を提供し、ここで、前記癌は、多発性骨髄腫、黒色腫、Ｂ細胞リンパ腫から選択されてもよい。好ましくは、前記癌は多発性骨髄腫である。ＢＣＭＡおよびＧＰＲＣ５Ｄに対する抗原結合特異性を有するため、本発明の三重特異性抗体分子は、ＢＣＭＡおよびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体ならびにＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３を標的とする二重特異性抗体よりも、さらに広範な癌治療の患者集団を有することができる。いくつかの実施形態において、本発明は、本発明の三重特異性抗体分子を使用したＢＣＭＡ陰性癌またはＢＣＭＡ低発現癌の治療方法を提供する。さらなるいくつかの実施形態において、本発明は、本発明の三重特異性抗体分子を使用したＧＰＲＣ５ＤおよびＣＤ３二重陽性癌の治療を提供する。

【0185】

一態様において、本発明は、血清、精液、尿または組織生検試料（例えば、過剰増殖性または癌性の病巣に由来する）などの生体試料中の関連抗原の存在をインビトロまたはインビボで検出する診断方法を提供する。当該診断方法は、（ｉ）相互作用が生じることが認められる条件において、試料（および場合により、対照試料）を本明細書に記載の抗体分子と接触させ、または対象に前記抗体を投与することと、（ｉｉ）前記抗体と試料（および場合により、対照試料）による複合物の形成を検出することと、を含む。複合物が形成される場合、関連抗原が存在することを示し、本明細書に記載の治療および／または予防の適合性またはその必要性も示唆される。

【0186】

いくつかの実施形態において、治療前、例えば、治療を開始する前、または治療間隔がある場合は、治療を再開する前に関連抗原を検出する。利用可能な検出方法は、免疫組織化学、免疫細胞化学、ＦＡＣＳ、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＰＣＲ技術（例えば、ＲＴ－ＰＣＲ）またはインビボイメージング技術を含む。一般には、インビボおよびインビトロ検出方法に使用される抗体分子は、結合されたまたは未結合のコンジュゲートを検出しやすくするために、検出可能な物質で直接的または間接的に標識される。適切な検出可能な物質は、さまざまな生物活性酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、常磁性（例えば、核磁気共鳴活性）物質、および放射性物質を含む。

【0187】

いくつかの実施形態において、関連抗原のレベルおよび／または分布をインビボで決定し、例えば、検出可能な物質で標識された本発明の抗体分子を、非侵襲的方式（例えば、適切なイメージング技術（例えば、ポジトロン断層法（ＰＥＴ）による走査）により検出する。一実施形態において、例えば、ＰＥＴ試薬（例えば、１８Ｆ－フルオロデオキシグルコース（ＦＤＧ））を用いて検出可能な方式で標識された本発明の抗体分子を検出することによって、関連抗原のレベルおよび／または分布をインビボで測定する。
一実施形態において、本発明は、本明細書に記載の抗体分子と、取扱説明書とを含む診断キットを提供する。

【0188】

本発明の理解を補助するために、以下の実施例を説明する。如何なる方法によって、実施例を、本発明の請求範囲を制限するものと解釈する意図もなく、そうすべきでもない。

【実施例1】

【0189】

実施例
実施例１、ハイブリドーマ細胞の製造
過剰発現細胞株の構築
ヒト、サルおよびマウスのＧＰＲＣ５Ｄ全長配列をＰＥＥ１７．４プラスミド（Ｌｏｎｚａ、ＧＳ Ｘｃｅｅｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）にそれぞれ挿入し、エレクトロポレーションの方法によってプラスミドを宿主細胞ＧＳ－ＣＨＯに導入し、加圧スクリーニングによってＧＰＲＣ５Ｄタンパク質を過剰発現する安定的な細胞株を構築した。同時にヒトＧＰＲＣ５Ｄ全長配列をｐＣＨＯ１．０ベクターに挿入し、宿主細胞２９３Ｆに導入し、過剰発現細胞株２９３Ｆ－ｈｕＧＰＲＣ５Ｄを構築した。

【0190】

免疫
ヒトＧＰＲＣ５Ｄ全長配列をｐｃＤＮＡ３．１ベクターに構築し、当該プラスミドをＢａｌｂ￥ｃおよびＨａｒｂｏｕｒマウス（北京維通利華実験動物技術有限公司から購入）に免疫するために使用し、２週間に１回筋肉内注射し（各マウスに５０μｇのプラスミド）、合計３回免疫した。続いて、ヒトＧＰＲＣ５Ｄを過剰発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞株を追加免疫に使用し、２週間に１回腹腔内注射し（各マウスに１×１０^７）、合計２回免疫した。

【0191】

細胞の融合
血清力価が要件を満たした後、マウスの脾臓を摘出してＢリンパ球懸濁液を調製し、ＳＰ２／０骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ）と１：２～１：１の比率で混合した後に電気融合を行った。融合後の細胞を電極皿から５０ｍＬの遠心分離管に移入し、ＨＡＴ培地で１×１０^４個の細胞／ｍＬ～２×１０^４個の細胞／ｍＬになるまで細胞を希釈し、９６ウェルプレートの各ウェルに１００μＬの細胞懸濁液を加えた。融合後の７日目にスクリーニング培地を交換し、１０日目（または細胞増殖状態によって、それ以上である）培養した後にフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）検出を行い、陽性クローニングをスクリーニングした。

【0192】

ハイブリドーマ細胞によるハイスループットスクリーニング
フローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体を特異的に発現するハイブリドーマ細胞をスクリーニングした。検出される細胞（２９３Ｆ－ｈｕＧＰＲＣ５Ｄ／ＧＳ－ＣＨＯ－ｈｕＧＰＲＣ５Ｄ）をカウントし、１×１０^６個の細胞／ｍＬになるまで希釈し、Ｕ型底の９６ウェルプレートに１００μＬ／ウェル加えた。５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、細胞培地を除去した。ハイブリドーマの９６ウェルプレートで培養した上清および陽性対照抗体をＵ字形プレートに加えて細胞を再懸濁し、１ウェル当たり１００μＬ加え、氷上で３０ｍｉｎ静置した。５００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。５００ｇで５ｍｉｎ、ＰＢＳ除去した。ハイブリドーマ上清が加えられたウェルの各ウェルにｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧのＦＩＴＣで標識された二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒ、Ｃａｔ＃１１５－５４５－００６を１：５００でＰＢＳに希釈したもの）１００μＬを加え、陽性対照抗体（Ｒｏｃｈｅ－５Ｅ１１）を含むウェルに抗ヒトＦｃのＰＥで標識された二次抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｃａｔ＃４０９３０４）１００μＬを加えた。氷上で３０ｍｉｎ遮光してインキュベートした。５００ｇで５ｍｉｎ、上清を除去し、ＰＢＳで細胞を１回洗浄した。５０μＬの１×ＰＢＳで細胞を再懸濁し、ＦＡＣＳ機上検出を行った。

【0193】

スクリーニングされた陽性クローニングに対して前記と同じ方法によりＧＳ－ｃｙｎｏＧＰＲＣ５Ｄ／ＧＳ－ｈｕＧＰＲＣ５Ａ細胞の再スクリーニングを行い、ヒトＧＰＲＣ５ＤおよびサルＧＰＲＣ５Ｄの両方と結合し、かつヒトＧＰＲＣ５Ａと結合しないハイブリドーマ細胞を合計８２株得た。

【0194】

陽性ハイブリドーマ細胞のサブクローニング
細胞結合実験の結果に基づいて、従来の方法により候補クローンに対してサブクローニングを行った。その後、前記のハイスループットのスクリーニング方法によって検出し、標的陽性ウェルを取り出し、細胞を凍結保存した。

【0195】

実施例２、キメラ抗体の製造
実施例１で得られたハイブリドーマ候補クローンから抗体の軽鎖と重鎖の遺伝子配列を取り出し、ヒト－マウスキメラ抗体を構築した。

【0196】

新たに培養した細胞を各株から約５×１０^６個採取し、ＲＮＡ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ、Ｃａｔ＃７４０９８４．２５０）を抽出した。ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＩＩ １ｓｔ Ｓｔｒａｎｄ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ）逆転写によりｃＤＮＡが得られた。５’端末のＦＲ１領域に位置する塩基配列で上流プライマーを設計し、抗体定常領域またはＦＲ４領域に位置する塩基で下流プライマーを設計し、抗体の軽鎖と重鎖の可変領域遺伝子断片を増幅した。それをＴベクター（Ｍｉｇｈｔｙ ＴＡ－ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ試薬キット、Ｔａｋａｒａ）に連結し、モノクローナルを選び出して配列決定を行い、ＭＥＧＡ７ソフトウェアを用いて配列決定の結果に対して分析およびアラインメントを行った。

【0197】

アラインメントにより、抗体の軽鎖と重鎖の可変領域配列が正しく、かつペアリングされたクローニングを選び出し、南京諾維贊公司の相同組換え酵素（Ｅｘｎａｓｅ（登録商標）ＩＩ、カタログ番号：Ｃ１１２－０１）によってその軽鎖と重鎖可変領域遺伝子断片をｐｃＤＮＡ３．１ベクターにそれぞれ連結し、ここで、定常領域はＩｇＧ１サブタイプを選択し、軽鎖と重鎖抗体の発現プラスミドを得た。

【0198】

次に、同一抗体の軽鎖プラスミドと重鎖プラスミドを１：１のモル比で混合し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｔ＃２３９６６）を用いて２９３Ｆ細胞をトランスフェクションし、５日～７日培養した後、細胞活性が６０％未満になると、細胞培養上清を収集し、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティーカラムでモノクローナル抗体を精製した。

【0199】

実施例３、キメラ抗体のインビトロスクリーニング
抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体の親和性はフローサイトメトリーにより検出された。異なる濃度の抗体と、ヒトＧＰＲＣ５Ｄを過剰発現するＧＳ－ＣＨＯ細胞（ｈｕＧＰＲＣ５Ｄ ＧＳ－ＣＨＯ）、多発性骨髄腫細胞ＭＭ１．Ｒ、Ｈ９２９およびＡＭＯ－１を含むヒトＧＰＲＣ５Ｄを発現する細胞とともに３０分間共インキュベートした。次に、蛍光標識二次抗体（ＡＰＣ－マウス抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ抗体、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、製品番号：４０９３０６）を加え、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ ｙｅｌｌｏｗ死細胞染色剤（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、製品番号：Ｌ３４９６７）を使用し、フローサイトメトリーにより細胞蛍光強度を検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を用いて曲線をフィッティングし、抗体のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する親和性を示すために、ＥＣ５０値を計算した。

【0200】

検出された抗体において、ＨＢ１５Ｈ１Ｇ１（重鎖可変領域の配列番号２５、軽鎖可変領域の配列番号２６）は完全ヒト化抗体であり、ｃｈ５Ｅ１２Ｃ４（重鎖可変領域の配列番号９８、軽鎖可変領域の配列番号９９）、ｃｈ１１Ｂ７（重鎖可変領域の配列番号１００、軽鎖可変領域の配列番号１０１）およびｃｈ７Ｆ５Ｄ４抗体（重鎖可変領域の配列番号２７、軽鎖可変領域の配列番号２８）はキメラ抗体である。結果は下記の表１に示される。

【表4】

【0201】

スクリーニングされたｃｈ５Ｅ１２Ｃ４およびキメラｃｈ１１Ｂ７抗体をヒト化し、抗体ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１およびｈｚ１１Ｂ７．５を形成した。

【0202】

実施例４、三重特異性抗体（ＴＳ）の分子構造の設計および構築
同時にＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３を標的とするＴ細胞エンゲージャー（Ｔ－ｃｅｌｌ ｅｎｇａｇｅｒ）類の多重特異性抗体は、多発性骨髄腫細胞（Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ、ＭＭ）表面の２種類の腫瘍関連抗原ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡおよびＴ細胞表面のＣＤ３受容体に同時に結合することができる。４つの抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ＨＢ１５Ｈ１Ｂ１、ｃｈ７Ｆ５Ｄ４、ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１、ｈｚ１１Ｂ７．５）、１つの抗ＢＣＭＡ抗体（ＡＤＩ－３８４５６）および親和性が異なる２つの抗ＣＤ３抗体（親和性が比較的低いＣＤ３抗体ｈｚｓｐ３４．８７と親和性が比較的高いＣＤ３抗体ｈｚｓｐ３４．２４）に基づいて、同時にＧＰＲＣ５Ｄ、ＢＣＭＡおよびＣＤ３を標的とする多重特異性抗体を設計した。

【0203】

図１に示すように、１＋１＋１ ｆｏｒｍａｔ １（ＴＳ－Ｆ１）の２つの例示的な抗体、１＋１＋１ ｆｏｒｍａｔ ２（ＴＳ－Ｆ２）の６つの例示的な抗体、２＋２＋２ ｆｏｒｍａｔ ６（ＴＳ－Ｆ６）の４つの例示的な抗体および１＋１＋２ ｆｏｒｍａｔ ７（ＴＳ－Ｆ７）の５つの例示的な抗体（下記の表４を参照）を含むｆｏｒｍａｔの異なる４種類の多重特異性抗体分子を設計した。Ｆｃ「ノブインホール」（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）技術により非対称ＩｇＧ様二重特異性抗体の重鎖のミスペアリングを解決し、ここで、ＦｃはＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、同時にエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を弱化するＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（Ｋａｂａｔの「ＥＵ」によって番号付けられた）アミノ酸変異を導入して、例示的な抗体を設計した。

【0204】

ＴＳ－Ｆ２とＴＳ－Ｆ７は、４本のポリペプチド鎖から左右非対称のＩｇＧ様四量体で構成され、ＴＳ－Ｆ６は、２本のポリペプチド鎖から左右対称のＩｇＧ様四量体で構成された。

【0205】

ＴＳ－Ｆ２は、重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む１本のペプチド鎖＃１、軽鎖可変ドメインおよび免疫グロブリンＣＬドメインを含む１本のペプチド鎖＃２、重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、Ｆｃドメインおよび人工合成された連結ペプチドによって連結されてなる一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む１本のペプチド鎖＃３、ならびに軽鎖可変ドメインおよび免疫グロブリンＣＬドメインを含む１本のペプチド鎖＃４で構成された。ペプチド鎖＃１の重鎖可変ドメインとペプチド鎖＃２の軽鎖可変ドメインがペアリングして第１抗原認識部位を形成し、ペプチド鎖＃３の重鎖可変ドメインとペプチド鎖＃４の軽鎖可変ドメインがペアリングして第２抗原認識部位を形成し、ｓｃＦｖは第３抗原認識部位を形成した。

【0206】

ＴＳ－Ｆ７は、重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む１本のペプチド鎖＃１、軽鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメインおよび人工合成された連結ペプチドにより連結されてなる一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む１本のペプチド鎖＃２、重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメインおよびＦｃドメインを含む１本のペプチド鎖＃３、ならびに軽鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメインおよび人工合成された連結ペプチドにより連結されてなる一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む１本のペプチド鎖＃４で構成された。ペプチド鎖＃１の重鎖可変ドメインとペプチド鎖＃２の軽鎖可変ドメインがペアリングして第１抗原認識部位を形成し、ペプチド鎖＃３の重鎖可変ドメインとペプチド鎖＃４の軽鎖可変ドメインがペアリングして第２抗原認識部位を形成し、ペプチド鎖＃２とペプチド鎖＃４における２つのｓｃＦｖは、２つの同じ第３抗原認識部位である。

【0207】

ＴＳ－Ｆ２とＴＳ－Ｆ７において、ペプチド鎖＃１とペプチド鎖＃３のそれぞれのＦｃドメインには、「ノブインホール」の対応する安定結合変異がそれぞれ含まれた。

【0208】

ＴＳ－Ｆ６は、重鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＨ１ドメイン、Ｆｃドメインおよび人工合成された連結ペプチドにより連結されてなる一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む２本の同じペプチド鎖＃１、ならびに、軽鎖可変ドメイン、免疫グロブリンＣＬドメインおよび人工合成された連結ペプチドにより連結されてなる一本鎖抗体ｓｃＦｖを含む２本の同じペプチド鎖＃２で構成された。ペプチド鎖＃１の重鎖可変ドメインとペプチド鎖＃２の軽鎖可変ドメインがペアリングして第１抗原認識部位を形成し、ペプチド鎖＃１におけるｓｃＦｖは第２抗原認識部位であり、ペプチド鎖＃２におけるｓｃＦｖは第３抗原認識部位である。

【0209】

ＴＳ－Ｆ１は、第１の一本鎖抗体ｓｃＦｖおよびＦｃドメインを含むペプチド鎖＃１、ならびに、第２の一本鎖抗体ｓｃＦｖおよびＦｃドメインを含むペプチド鎖＃２で構成された。ペプチド鎖＃１における第１のｓｃＦｖは第１抗原認識部位を形成し、ペプチド鎖＃２におけるｓｃＦｖは第２抗原認識部位を形成した。

【0210】

実施例５、ＴＳ抗体の発現および精製
４つの抗ＧＰＲＣ５Ｄ抗体（ＨＢ１５Ｈ１Ｂ１、ｃｈ７Ｆ５Ｄ４、ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１、ｈｚ１１Ｂ７．５）において、ＨＢ１５Ｈ１Ｂ１は完全ヒト化抗体、ｃｈ７Ｆ５Ｄ４はキメラ抗体、ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１とｈｚ１１Ｂ７．５はヒト化抗体であり、１つの抗ＢＣＭＡ抗体（ＡＤＩ－３８４５６）および親和性が異なる２つの抗ＣＤ３抗体（ｈｚｓｐ３４．８７とｈｚｓｐ３４．２４）のＣＤＲ領域、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列は、本願の「配列表」の部分にリストされ、前記抗体のＣＤＲ領域、軽鎖可変領域および重鎖可変領域のアミノ酸配列の配列番号は表２に示される。

【表5】

【表6】

【表7】

【表8】

【0211】

ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３およびＢＣＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体を同時に設計した。図２Ａに示すように、合理的な設計として、二重特異性抗体の両端はいずれもＦａｂ形式であり、１＋１ ｆｏｒｍａｔの非対称Ｉｇ様構造を形成した。Ｆｃ「ノブインホール」（ｋｎｏｂ－ｉｎ－ｈｏｌｅ）技術により当該非対称ＩｇＧ－様二重特異性抗体の重鎖のミスペアリングを解決し、ここで、ＦｃはＩｇＧ１の重鎖定常領域であり、同時にエフェクター機能（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を弱化するＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ（Ｋａｂａｔの「ＥＵ」によって番号付けられた）アミノ酸変異を導入した。

【0212】

同時に、ＢＣＭＡｘＣＤ３二重特異性抗体４６７５８をさらに発現した。図２Ｂに示すように、当該二重特異性抗体の１つの抗体アームはＢＣＭＡに結合するＦａｂであり、もう１つの抗体アームはＣＤ３に結合するｓｃＦｖであり、ここで前記Ｆａｂは抗ＢＣＭＡ親抗体３８４５６に由来し、前記ｓｃＦｖは前と異なる抗ＣＤ３親抗体に由来した。当該二重特異性抗体を構成した３本のポリペプチド鎖は配列番号１１１～１１３に示された。

【0213】

同時に、Ｒｏｃｈｅ－５Ｅ１１二重特異性抗体（ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３、２：１ ｆｏｒｍａｔ、特許ＷＯ ２０１９／１５４８９０ Ａ１から）をさらに発現して精製した。図２Ｃに示される通りである。二重特異性抗体Ｒｏｃｈｅ＿５Ｅ１１は、ＷＯ ２０１９／１５４８９０ Ａ１の配列番号１７、１８、１９および２０の配列で構成され、２つのＧＰＲＣ５Ｄ結合部位および１つのＣＤ３結合部位を含む。

【0214】

組換え製造のために、宿主細胞におけるさらなるクローニングおよび／または発現のために、重鎖と軽鎖をコードするヌクレオチド配列を合成し、ベクターｐｃＤＮＡ３．１にそれぞれ挿入するように、蘇州金唯智生物科技有限公司に委託した。

【0215】

ＨＥＫ２９３細胞における発現および精製：
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入）をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞培地（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入）に継代培養した。トランスフェクションの前日に細胞密度を検出し、新鮮なＥｘｐｉ２９３細胞培地を２×１０^６個の細胞／ｍＬに調整して培養を継続し、トランスフェクションの当日に細胞密度を３×１０^６個の細胞／ｍＬに調整した。

【0216】

トランスフェクションされたＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞の最終体積が１／１０のＯｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ社から購入）をトランスフェクション緩衝液として取り、１ｍＬ当たりのトランスフェクション緩衝液に１：１のモル比率で前記に製造された、ペアリングされた重鎖と軽鎖をそれぞれ含むヌクレオチド配列の組換えプラスミド１０μｇを加え、均一に混合し、１ｍＬ当たりのトランスフェクション緩衝液にポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）３０μｇをさらに加え、均一に混合し、室温で２０分間インキュベートし、次にＰＥＩ／ＤＮＡ混合物をＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞懸濁液に軽く注入して均一に混合し、シェーカーにおいて、８％のＣＯ_２、３６．５℃、１２０ｒｐｍの培養条件で培養した。

【0217】

１６時間～１８時間培養した後、培養フラスコにトランスフェクション後の培養物体積１／５０の濃度が２００ｇ／ＬのＦＥＥＤ（１００ｇ／ＬのＰｈｙｔｏｎｅ Ｐｅｐｔｏｎｅ＋１００ｇ／ＬのＤｉｆｃｏ Ｓｅｌｅｃｔ Ｐｈｙｔｏｎｅ）、最終濃度が４ｇ／Ｌのグルコース溶液および最終濃度が２ｍＭ／ＬのＶＰＡ（Ｇｉｂｃｏ）を追加し、軽く均一に混合し、８％のＣＯ_２、３６．５℃、１２０ｒｐｍのシェーカーにおいて培養を継続した。連続的に６日培養し、培養物を収集し、４０００回転／分間で３０分間遠心分離し、細胞上清を取って０．４５μＭのろ過膜でろ過し、アフィニティークロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーにより親タンパク質を精製した。対称構造のＩｇＧ様抗体に関しては、最終分子を精製した。

【0218】

以下、前記の異なるＦｏｒｍａｔのＴＳ抗体および二重特異性抗体に対して組換えによって生成された親タンパク質が示される。

【表9】

【0219】

非対称ＩｇＧ様抗体の場合、精製された２つの親タンパク質が液を交換する必要はなく、タンパク質濃度はそれぞれ＞１ｍｇ／ｍＬであり、１：１のモル比および混合液中のタンパク質濃度１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬに従って混合した。次に、ＧＳＨ／タンパク質のモル比を５００倍～７００倍に制御し、ＧＳＨ最終濃度＞５ｍＭである適量なＧＳＨを加えた。最後に、ｐＨが１０．０のＡｒｇ１Ｍで前記混合液のｐＨを８．０～８．５に調節した。Ａｒｇ最終濃度＞＝５０ｍＭである。前記反応液を、２４ｈを超えないように、室温で一晩置いた。翌日、一晩反応させた反応液を交換してＧＳＨを除去し、液交換用ｂｕｆｆｅｒは、ＧＳＨを含まない前記組換え反応０．２ＭのＰＢ溶液（Ｐｈ６．０）であってもよい。２ｈ～３ｈ自然酸化した後、ｍｏｎｏＳ（ＧＥ Ｃａｔ．１７５１６８０１）により精製されてよい。

【0220】

Ｒｏｃｈｅ－５Ｅ１１二重特異性抗体は、ＷＯ ２０１９／１５４８９０ Ａ１に開示された方法により製造された。

【0221】

前記方法により製造された対称性抗体および非対称抗体を回収し、アフィニティークロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーにより精製された。
サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、ＳＥＣ）を利用して、クロマトグラフィーにより収集された各レベルのサブチューブ中の試料の純度を検出した。ＳＥＣ結果に基づいて純度が９５％より大きいレベルのサブチューブ中の試料を合わせた。
精製された二重特異性抗体溶液を１５ｍＬの限外ろ過遠心分離管で、４５００回転／分間で３０分間遠心分離し、ＰＢＳでタンパク質を希釈した後に遠心分離を継続し、緩衝液を交換するために、４５００回転／分間で３０分間遠心分離し、当該操作を数回繰り返した。緩衝液が交換された抗体を合わせて、抗体濃度を測定した。さらに、キャピラリー電気泳動（ＣＥ－ＳＤＳ）および液体クロマトグラフィー－質量分析技術（ＬＣ－ＭＳ）を組み合わせて多重特異性抗体の成分および含有量に対して定性および定量を行った。

【0222】

実施例６、三重特異性抗体親和性の測定
例示的な三重特異性抗体において、ヒト化抗体ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１およびｈｚ１１Ｂ７．５に由来する抗原結合部位のＧＰＲＣ５Ｄへの結合親和性を調べた。実施例３と同じ方法により、異なる濃度の三重特異性抗体とｈｕＧＰＲＣ５Ｄ ＧＳ－ＣＨＯ細胞とともに３０分間共インキュベートし、次に蛍光標識二次抗体を加え、フローサイトメトリー（ＢＤ）により細胞蛍光強度を検出し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を用いて曲線をフィッティングし、抗体のヒトＧＰＲＣ５Ｄに結合する親和性を示すために、ＥＣ５０値を計算した。結果は下記の表５に示される。

【表10】

【0223】

例示的な三重特異性抗体において、抗ＢＣＭＡ末端と抗ＣＤ３末端の親和性は、バイオフィルム層光学干渉技術（ＢＬＩ）により検出された。例示的な抗体のヒトＢＣＭＡ、サルＢＣＭＡ、ヒトＣＤ３Ｅ及びサルＣＤ３Ｅへの結合動態を測定した。

【0224】

結合型ストレプトアビジンタンパク質（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ、ＳＡ）または抗ｈｕｍａｎ－Ｆｃ（ＡＨＣ）のプローブｓｅｎｓｏｒｓ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、製品番号１８－５０１９）を２００μＬのＳＤ ｂｕｆｆｅｒ（１×ＰＢＳ、０．１％のＢＳＡ、０．０５％のｔｗｅｅｎ－２０）に浸漬して予め湿らせた。例示的な抗体およびビオチンで標識されたまたはＦｃ－ｔａｇ付きのＢＣＭＡとＣＤ３Ｄ＆Ｅヘテロ二量体抗原をＳＤ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ希釈した。２００μＬのＳＤ ｂｕｆｆｅｒ、各希釈試料（１００ｎＭ）を９６ウェルブラックプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、製品番号６５５２０９）にそれぞれ加えた。プローブおよび試料をＯｃｔｅｔ（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ、Ｒｅｄ９６ｅ）に置いた。Ｄａｔａ Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ １０．０を起動し、「Ｎｅｗ Ｋｉｎｅｔｉｃ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ」を選択し、試料の位置に従って播種し、ｓｅｎｓｏｒｓの位置を選択し、実行ステップおよび時間：Ｂａｓｅｌｉｎｅ ６０ｓ、Ｌｏａｄｉｎｇ ２５０ｓ、Ｂａｓｅｌｉｎｅ １００ｓ、Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ６００ｓおよびＤｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ６００ｓを設定した。実験の回転速度は１０００ｒｐｍ、温度は３０℃であった。

【0225】

「Ｄａｔａ Ａｎａｌｙｓｉｓ １０．０」ソフトウェアで結果を分析し、ｂｕｆｆｅｒ参照チャネルを差し引いて、１：１のｂｉｎｄｉｎｇを選択してデータをフィッテングし、例示的な抗体のｋｏｎ、ｋｏｆｆ、ＫＤ値を計算した。

【0226】

前記の測定法に記載される実験において、ヒトＢＣＭＡ抗原（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびサルＢＣＭＡ抗原（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて例示的な抗体を検出した。ヒトＢＣＭＡに対する親和性の検出結果は表６に示され、サルＢＣＭＡに対する親和性の検出結果は表７に示される。

【表11】

【表12】

【0227】

前記の測定法に記載される実験において、ヒトＣＤ３Ｄ＆Ｅヘテロ二量体抗原（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびサルＣＤ３Ｄ＆Ｅヘテロ二量体抗原（ＡＣＲＯ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて例示的な抗体の親和性を検出し、結果は表８、表９に示される。同時に、ＧＰＲＣ５Ｄ×ＣＤ３二重特異性抗体、ｈｚ５Ｅ１２．１－Ｐ１／ＳＰ３４．２４およびｈｚ５Ｅ１２．１－Ｐ１／ＳＰ３４．８７の、ヒト／サルＣＤ３Ｄ＆Ｅに対する結合親和性を調べた。

【表13】

【表14】

【0228】

実施例７、抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３抗体介在性Ｊｕｒｋａｔ細胞活性化実験
Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃレポートシステムによって抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３抗体のＣＤ３Ｅ下流シグナル伝達経路を活性化する活性を検出した。抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３多重抗体が多発性骨髄腫（ＭＭ）細胞株表面のＧＰＲＣ５Ｄおよび／またはＢＣＭＡに結合すると同時に、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）表面のＣＤ３Ｅに結合する場合、腫瘍関連抗原（ＧＰＲＣ５Ｄおよび／またはＢＣＭＡ）依存性ＣＤ３と架橋することにより、Ｊｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ細胞中のＣＤ３Ｅ下流シグナルを刺激することができる。したがって、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅレポートシステムによって例示的な抗体介在性Ｔ細胞活性化レベルを評価した。

【0229】

Ｊｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ細胞およびＭＭ腫瘍細胞において、異なる濃度の例示的な抗体を加え、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を観察した。

【表15】

【0230】

簡単に言えば、まず試料の希釈：ＲＰＭＩ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（５％のＦＢＳ）を用いて抗体を１００ｎＭの濃度に希釈した後に、５倍勾配希釈した。次に細胞の準備：Ｊｕｒｋａｔ細胞および腫瘍細胞を３００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、ＲＰＭＩ ｍｅｄｉｕｍ １６４０（５％のＦＢＳ）に再懸濁させ、カウント（Ｃｏｕｎｔｓｔａｒ）後に細胞の密度をＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ ２ｘ１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整し、腫瘍細胞はエフェクター細胞と標的細胞との比率に応じて調整した。９６ウェル白色細胞培養プレートの各ウェルに４５μＬの腫瘍細胞を加え、３０μＬの勾配希釈した試料を加え、４５μＬのＪｕｒｋａｔ ＮＦＡＴ細胞を加えた。次に、９６ウェルプレートを３７℃、５％のＣＯ_２インキュベーターに置いて培養を継続した。一定時間培養した後、培養プレートおよび細胞培養プレートを取り出し、室温で５ｍｉｎ置き、各ウェルに８０μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７９４０）を加え、１０ｍｉｎ遮光してインキュベートし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ ｉ３（ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＤＥＶＩＣＥＳ）で蛍光値を読取った。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を用いて曲線をフィッティングし、例示的な抗体のＴ細胞を活性化する活性を比較するために、ＥＣ５０値を計算した。結果は、対照ｈＩｇＧ１群の読取値に対する実験群の読取値の倍数の比として示される。

【0231】

結果：
ＴＳ－Ｆ２－１とＴＳ－Ｆ２－２
Ｈ９２９細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を１６時間共培養する条件で、およびＬ３６３細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を１６時間共培養する条件で、ＴＳ－Ｆ２－１とＴＳ－Ｆ２－２は、いずれも抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができ（図３Ａおよび図３Ｂ）、かつそのアゴニスト活性がＴＳ－Ｆ１、対照群ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重抗体およびＢＣＭＡｘＣＤ３二重抗体よりも高い。検出された抗体の具体的なＥＣ５０は表１０に示される。ここで、例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－１とＴＳ－Ｆ２－２は、いずれもＨＢ１５Ｈ１Ｇ１（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．２４（ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）に由来する３つの結合特異性で構成されるが、ＨＢ１５Ｈ１Ｇ１および３８４５６の結合特異性の位置が異なっている。

【表16】

【0232】

ＴＳ－Ｆ２－３
Ｈ９２９細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を１６時間共培養する条件で、Ｌ３６３細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を１６時間共培養する条件で、およびＵ２６６細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を１６時間共培養する条件で、ＴＳ－Ｆ２－３は、いずれも抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができ（図４Ａ、図４Ｂおよび図４Ｃ）、かつそのアゴニスト活性がＴＳ－Ｆ６抗体よりも顕著に高く、対照群ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重抗体（ｃｈ７Ｆ５Ｄ４／ｈｚｓｐ３４．２４）およびＢＣＭＡｘＣＤ３（４６７５８）二重抗体よりも高い。検出された抗体の具体的なＥＣ５０は表１１に示される。例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－３とＴＳ－Ｆ６（ＴＳ－Ｆ６－１～ＴＳ－Ｆ６－４）は、ｃｈ７Ｆ５Ｄ４（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．２４（ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）に由来する３つの結合特異性で構成される。

【0233】

構築したｈｕＧＰＲＣ５Ｄを過剰発現するＧＳ－ＣＨＯ（ｈｕＧＰＲＣ５Ｄ－ＧＳ－ＣＨＯ）細胞とＪｕｒｋａｔ細胞を１６時間共培養し、ＧＰＲＣ５Ｄのみを発現する多発性骨髄腫細胞介在性Ｔ細胞活性化をシミュレーションするために、例示的な抗体を共培養した。ここで、エフェクター細胞（Ｊｕｒｋａｔ細胞）と標的細胞（ｈｕＧＰＲＣ５Ｄ－ＧＳ－ＣＨＯ細胞）との比率は５０：１であった。実験結果により、ＴＳ－Ｆ２－３は、抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができ（図４Ｄ）、かつそのアゴニスト活性がＴＳ－Ｆ６抗体、対照群ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重抗体およびＢＣＭＡｘＣＤ３二重抗体（４６７５８）よりも高いことが示された。具体的なＥＣ５０は表１１に示される。

【表17】

【0234】

ＴＳ－Ｆ２－４とＴＳ－Ｆ２－５
Ｈ９２９細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、
Ｌ３６３細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、
８２２６細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、および
Ｕ２６６細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、
ＴＳ－Ｆ２－４とＴＳ－Ｆ２－５は、いずれも抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができ（図５Ａ、図５Ｂ、図５Ｃ）、かつそのアゴニスト活性が対照群ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３、ＢＣＭＡｘＣＤ３二重抗体（３８４５６／ｈｚｓｐ３４．２４）および４６７５８二重抗体よりも高い。具体的なＥＣ５０は表１２に示される。ここで、例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－４は、ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．２４（高親和性ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）で構成され、例示的な抗体ＴＳ－Ｆ２－５は、ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．８７（低親和性ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）で構成された。

【表18】

【0235】

ＭＭ１．Ｓ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が１０：１）を５時間共培養する条件で、およびＡＲＤ細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が１０：１）を５時間共培養する条件で、ＴＳ－Ｆ２－４とＴＳ－Ｆ２－５は、抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができ（図５Ｅ）、かつそのアゴニスト活性が対照群ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重抗体およびＢＣＭＡｘＣＤ３二重抗体４６７５８よりも高い。具体的なＥＣ５０は表１３に示される。

【表19】

【0236】

ＴＳ－Ｆ７－１とＴＳ－Ｆ７－２
Ｈ９２９細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、
Ｌ３６３細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、
８２２６細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、および
Ｕ２６６細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を５時間共培養する条件で、
ＴＳ－Ｆ７－１とＴＳ－Ｆ７－２は、抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができ（図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、図６Ｄ）、かつそのアゴニスト活性が対照群ＧＰＲＣ５ＤｘＣＤ３二重抗体およびＢＣＭＡｘＣＤ３二重抗体４６７５８よりも高い。具体的なＥＣ５０は表１４に示される。ここで、例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－１は、ｈｚ５Ｅ１２．１．Ｐ１（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．２４（ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）で構成され、例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－２は、ｈｚ１１Ｂ７．５（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．８７（ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）で構成された。

【表20】

【0237】

ＴＳ－Ｆ７－３とＴＳ－Ｆ７－４
Ｌ３６３細胞とＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞と腫瘍細胞との比率が５：１）を１６時間共培養する条件で、ＴＳ－Ｆ７－３とＴＳ－Ｆ７－４は、抗体濃度の増加に伴い、Ｊｕｒｋａｔ細胞ルシフェラーゼの発現を顕著に向上させることができるが（図７）、そのアゴニスト活性がＴＳ－Ｆ２－３よりも低い。ここで、例示的な抗体ＴＳ－Ｆ７－３とＴＳ－Ｆ７－４は、ｃｈ７Ｆ５Ｄ４（ＧＰＲＣ５Ｄ抗体）、ｈｚｓｐ３４．２４（ＣＤ３抗体）および３８４５６（ＢＣＭＡ抗体）で構成され、ｈｚｓｐ３４．２４抗体が一本鎖抗体を形成する場合、ＴＳ－Ｆ７－３はＶＬが前、ＶＨが後に位置し、ＴＳ－Ｆ７－４はＶＨが前、ＶＬが後に位置する。

【0238】

実施例８、ヒト多発性骨髄種細胞に対する抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３抗体の殺傷実験
乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）法によって、ＰＢＭＣとＧＰＲＣ５Ｄおよび／またはＢＣＭＡ陽性のＭＭ細胞を共培養する条件での、ヒト多発性骨髄腫細胞に対する例示的な抗体介在性Ｔ細胞の殺傷能力を検出した。抗ＧＰＲＣ５ＤｘＢＣＭＡｘＣＤ３多重抗体がＭＭ細胞表面のＧＰＲＣ５Ｄおよび／またはＢＣＭＡに結合すると同時に、ｐｒｉｍａｒｙ Ｔ細胞表面のＣＤ３Ｅに結合する場合、腫瘍関連抗原（ＧＰＲＣ５Ｄおよび／またはＢＣＭＡ）依存性Ｔ細胞と架橋することにより、Ｔ細胞の活性化を刺激し、腫瘍細胞の殺傷を介在することができる。多因子検出試薬キット（Ｈｕｍａｎ Ｔｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７、ＢＤ）を用いて複数のサイトカインのレベルを同時に検出するとともに、フローサイトメトリー（ＢＤ）によりＴ細胞中のＣＤ６９陽性細胞の百分率を検出した。

【0239】

下記の試薬および材料を使用した。

【表21】

【0240】

実験ステップ：
ＰＢＭＣ細胞を液体窒素から取り出し、３７℃のウォーターバスで急速に溶解し、９ｍＬの無血清培地に加え、３００ｇで４ｍｉｎ遠心分離し、上清を捨て、１０％のＦＢＳフェノールレッドフリー１６４０培地に再懸濁させ、細胞密度を４×１０^６ｃｅｌｌ／ｍＬに調整した。一定量の対数期Ｈ９２９細胞を収集し、遠心分離し、１０％のＦＢＳフェノールレッドフリー１６４０培地で腫瘍細胞密度を２×１０^５ｃｅｌｌ／ｍＬに調整した。前記の表に従って、抗体を１０％のＦＢＳフェノールレッドフリー１６４０培地で、５μＭから５倍勾配希釈するように、１００ｎＭに希釈した。９６ウェル細胞培養プレート（Ｕ字形）に、１００μＬの腫瘍細胞、５０μＬの勾配希釈した試料および５０μＬのＰＢＭＣ細胞を加えた。同時に、対照ウェルを設定し、培地で２００μＬ／ウェルまで補充した。３７℃、ＣＯ_２インキュベーターに入れて１６ｈ培養した。１６ｈ培養した後、細胞培養プレートを取り出し、室温で５ｍｉｎ放置し、ＴＭウェルの各ウェルに１０％のＬｙｓｉｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎを加え、１５ｍｉｎ遮光して溶解させた。細胞培養プレートを４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、５０μＬの上清を取って新しい平底９６ウェルプレートに移した。ＬＤＨ発色試薬５０μＬを加え、室温で３０ｍｉｎ遮光して発色させ、停止液５０μＬを加えた。プレートリーダーで吸光度を読取り、吸光度により殺傷を計算した。後続のサイトカイン検出のために、さらに９０μＬの上清を新しい９６ウェルプレート（Ｖ字形）に取った。細胞培養プレートの各ウェルに２００μＬのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒを加えて１回洗浄し、遠心分離後に液体を除去し、各ウェルに４５μＬの染色溶液（ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで調製）を加え、４℃で、２０ｍｉｎ遮光してインキュベートし、２００μＬのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで１回洗浄し、１５０μＬのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒで再懸濁させた後に機上検出を行った。

【0241】

ＣＢＡによるサイトカインの検出：
ｓｔａｎｄａｒｄ ０（ｓｔｄ ０）となるように、２ｍＬのａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔで標準品を溶解し、次に８ウェルｓｔｄ １～８を２倍勾配希釈し、ｓｔｄ ９はａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔブランク対照であった。各ｂｅａｄｓを５ｓ～１０ｓボルテックスし、それぞれ３２２μＬ吸い出し、次に２２５４μＬのａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔを加え、ボルテックスして均一に混合し、９６ウェルのＶ字形プレートを準備し、各ウェルに５０μＬの均一に混合したｂｅａｄｓを加え、各ウェルに３０μＬのａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔを加え、次に各ウェルに３０μＬの試料を加え、すなわち、すべての試料を２倍希釈した。ＰＥ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ：ａｓｓａｙ ｄｉｌｕｅｎｔ １：１で希釈した後に使用された。ウェルに５０μＬのｓｔｄまたはｓａｍｐｌｅおよびＰＥ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを加え、プレートをパラフィルムで密封し、アルミホイルで覆った。プレートシェーカーにおいて、１１００ｒｐｍの回転速度で室温で５ｍｉｎ振とうした。次に、室温で３ｈインキュベートした。インキュベート終了後、各ウェルに１２０μＬのｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒを加え、３００ｇで５ｍｉｎを遠心分離し、上清を吸い取った。１２０μＬのＷａｓｈ Ｂｕｆｆｅｒを加えて再懸濁させ、フローサイトメトリーにより検出された。

【0242】

実験結果：
フローサイトメトリーにより検出されると、例示的な抗体は、用量依存的にｐｒｉｍａｒｙ Ｔ細胞を活性化することができ（図８Ａおよび図８Ｂ）、かつＴ細胞の活性化程度とＣＤ３の親和性には一定の相関関係：抗ＣＤ３の親和性が高いほど、Ｔ細胞を活性化する能力が強くなり、それによりＨ９２９細胞に対するＰＢＭＣの殺傷作用を介在する（図９）ことが見出され、殺傷過程に伴うさまざまなサイトカインの放出レベルは図１１Ａ～図１１Ｄに示される。

【0243】

実施例９、Ｈ９２９担腫瘍ヒト化マウスモデルインビボにおける例示的な抗体の抗腫瘍薬効
雌のＮＯＧマウス（３５日～４１日）は、北京維通達実験動物技術有限公司から購入した。グレードは、ＳＰＦグレードである。マウスを受け入れた後、研究開始前に７日間馴化と隔離した。
Ｈ９２９細胞は、後続のインビボ実験のために、日常的に継代培養し、遠心分離して細胞を収集し、ＰＢＳでＨ９２９細胞を分散させた。５×１０^６細胞／匹、接種体積２００μＬ／匹で、毛を剃ったＨ９２９細胞をＮＯＧマウスの右側背腹部に接種した。Ｈ９２９細胞接種後の５日目に、５×１０^６細胞／匹、接種体積２００μＬ／匹で、マウスにＰＢＭＣ細胞を静脈内注射した。

【0244】

投与：ＰＢＭＣ細胞接種後の３日目、腫瘍体積に従ってマウスを群分け（各群７匹）して投与した。７日ごとに１回、合計３回投与した。マウスの腫瘍体積と体重を週に２回監視した。腫瘍体積の測定：ノギスで腫瘍の最大長軸（Ｌ）と最大短軸（Ｗ）を測定し、腫瘍体積を下記の式Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２により算出した。電子天びんを用いて体重を測定した。研究期間全体を通じて、腫瘍がエンドポイントに達した時またはマウスの体重減少＞２０％である時、マウスを安楽死させた。腫瘍のサイズを統計した。

【0245】

実験結果
腫瘍増殖曲線は、図１２に示され、例示的な抗体は、Ｈ９２９細胞の成長を顕著に抑制することができる。同時に投与されたマウス群において、いずれも体重減少は見られなかった。

【0246】

実施例１０、異なる多発性骨髄腫表面におけるＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの発現レベル
ｑｉｆｉｋｉｔ試薬キットにより、飽和濃度のＢＣＭＡ抗体とＧＰＲＣ５Ｄ抗体を使用してＭＭ細胞を染色し、フローサイトメトリーで異なる多発性骨髄腫細胞株表面におけるＢＣＭＡとＧＰＲＣ５Ｄ分子を定量した。

【表22】

【0247】

１×１０^５個の異なるＭＭ細胞を９６－ｗｅｌｌプレートに加え、ＧＳ－ＣＨＯ－ｈｕＧＰＲＣ５ＤとＧＳ－ＣＨＯ－ｈｕＢＣＭＡ細胞は陽性対照とし、かつ互いに陰性対照とした。４００ｇで５ｍｉｎ遠心分離し、上清を除去した。１０μＬのマウス由来の一次抗体（ＢＣＭＡおよびＭｇｐｒｃ５ｄ－１７Ｇ１Ｂ８）を加えて４℃の条件で１ｈインキュベートした。陰性対照ＩｇＧ１。ＱＩＦＩＫＩＴ／Ｂｅａｄｓ準備：１００μＬの均一に混合したｂｅａｄｓ（Ｖｉａｌ １およびＶｉａｌ ２）をそれぞれ加えた。２００μＬのＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒを加え、３回洗浄した後に上清を除去し、１００μＬの二次抗体（ＦＩＴＣ Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、Ｖｉａｌ ３（合計２００μＬ）、１：５０で０．０１ｍｏｌ／ＬのＰＢＳに希釈した）を加えて均一に混合し、４℃の遮光条件で４５分間インキュベートした。２００μＬのＦＡＣＳ緩衝液を加え、３回洗浄した後、１００μＬのＰＢＳを加え、均一に混合し、フローサイトメトリーにより検出された。

【0248】

実験結果：図１３に示すように、試験した異なるＭＭ細胞には、異なる表面ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡの発現レベルがあった。図５Ａ～図５Ｆ、図６Ａ～図６Ｄおよび図７に示すように、対照ＧＰＲＣ５Ｄ／ＣＤ３二重抗体およびＢＣＭＡ／ＣＤ３二重抗体と比較して、評価されたＦｏｒｍａｔ ２およびＦｏｒｍａｔ ７の三重特異性抗体は、異なるＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡ発現レベルを有するさまざまなＭＭ細胞（Ｈ９２９、Ｌ３６３、８２２６、Ｕ２６６、ＭＭ１．ＳおよびＡＲＤ）において、いずれも有利な生物学的活性を誘導した。これは、ＧＰＲＣ５ＤとＢＣＭＡを組み合わせて標的とすることにより、本発明の三重特異性抗体は、ＧＰＲＣ５Ｄ陽性腫瘍患者とＢＣＭＡ陽性腫瘍患者の両方をカバーし、多発性腫瘍患者に対するカバー率を向上させることができると同時に、ＢＣＭＡなどの単一抗原の喪失による腫瘍の再発を回避し、治療効果を改善することができることが示唆された。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図4D】

【図5A】

【図5B】

【図5C】

【図5D】

【図5E】

【図5F】

【図6A】

【図6B】

【図6C】

【図6D】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13】

【配列表】

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【国際調査報告】