▶ ニュー・ヘルス・サイエンシーズ・インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-06
(54)【発明の名称】造血幹細胞を貯蔵するための方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/078 20100101AFI20240228BHJP
A61K 35/28 20150101ALI20240228BHJP
A61P 7/00 20060101ALI20240228BHJP
C12N 5/0789 20100101ALI20240228BHJP
A61P 35/02 20060101ALN20240228BHJP
【ＦＩ】
C12N5/078
A61K35/28
A61P7/00
C12N5/0789
A61P35/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555195
(86)(22)【出願日】2022-03-07
(85)【翻訳文提出日】2023-11-02
(86)【国際出願番号】 US2022019140
(87)【国際公開番号】W WO2022192136
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】63/158,267
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507318956
【氏名又は名称】ヘマネクスト インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ソウェミモ－コーカー サミュエル オー
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AC20
4B065BD12
4B065BD50
4B065CA44
4B065CA60
4C087AA03
4C087BB34
4C087BB63
4C087DA14
4C087DA16
4C087MA66
4C087NA03
4C087ZA51
4C087ZB27
(57)【要約】
本開示は、幹細胞の改善された貯蔵及び増殖のためのデバイス及び方法に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
幹細胞を必要とする患者への移植のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアと酸素吸着剤とを含む低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することと、
前記血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、前記血液製剤を混合することと、
前記血液製剤をフィルタに適用することを含む、前記血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することであって、前記幹細胞及び白血球が、前記フィルタ上に保持され、白血球及び幹細胞が枯渇した血液製剤を調製する、分離することと、
等張性培地を用いて、前記フィルタから前記幹細胞を溶出させることと、
前記幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移し、前記細胞を貯蔵して、低酸素貯蔵された幹細胞を調製することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記低酸素貯蔵容器に移す前又は後に、前記幹細胞を低酸素幹細胞増殖容器に移すことと、前記幹細胞を増殖させて、増殖した幹細胞集団を形成することと、を更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記増殖した幹細胞を、それを必要とする患者に移植することを更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記混合すること、分離すること、溶出させること、及び移すことが、各々、４００～２０００ＰａのｐＯ２下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記混合することが、最大３時間にわたる、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
前記混合することが、前記血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が、少なくとも５０％減少するまでである、請求項１に記載の方法。
【請求項7】
前記等張性培地が、少なくとも５３３３ＰａのｐＯ2を含む脱酸素等張性培地である、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
前記移すことが、前記低酸素貯蔵容器内に直接溶出させることを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記溶出させることが、５０～２００ｍＬの前記等張性培地を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項10】
前記等張性培地を、空気中の酸素と平衡化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記低酸素貯蔵容器が、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、折りたたみ可能な内側血液容器と、前記外側レセプタクルと前記折りたたみ可能な内側血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、前記外側レセプタクルを通り抜け、前記折りたたみ可能な容器と低酸素流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含み、前記低酸素貯蔵容器が、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項12】
前記血液製剤が、末梢血、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）、及び骨髄からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
輸血のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含む血液製剤を収集することと、
前記血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、
前記幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、
前記幹細胞を、３５００Ｐａ未満の酸素の分圧で、３７℃未満の温度で所定時間、低酸素環境で貯蔵することと、を含む、方法。
【請求項14】
前記低酸素貯蔵容器が、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、折りたたみ可能な内側血液容器と、前記外側レセプタクルと前記折りたたみ可能な内側血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、前記外側レセプタクルを通り抜け、前記折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含み、その組み合わせが、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
移植のための幹細胞を調製するための方法であって、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を収集することと、
前記ＨＵＣＢを白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタに適用することによって、前記ＨＵＣＢから白血球及び幹細胞を分離することと、
等張性培地を用いて、前記幹細胞保持フィルタから前記幹細胞を溶出させることと、
前記幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことと、を含む、方法。
【請求項16】
移植のための幹細胞を処理するためのキットであって、低酸素収集容器と、
白血球及び幹細胞の回復フィルタと、
濾過された上清を収集するための第１の付属低酸素貯蔵容器と、
幹細胞維持培地を含む第２の付属低酸素貯蔵容器と、を含み、
前記第２の付属低酸素貯蔵容器が、前記白血球及び幹細胞の回復フィルタと流体連通しており、
前記キットが、１，４００パスカル（Ｐａ）未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む、キット。
【請求項17】
移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵容器を３７℃にさらすことと、
凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む前記低酸素貯蔵バッグを、前記凍結した幹細胞を解凍して、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を生成するために、４２℃未満の水浴に浸漬することと、
前記解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を、２．５％（重量／体積）のヒトアルブミンを含有する等体積の低酸素溶液で希釈して、希釈した低酸素貯蔵された幹細胞を形成することと、を含む、方法。
【請求項18】
移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグを少なくとも２５℃にさらして、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を形成することと、
前記解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を遠心分離し、上清を除去することと、
前記低酸素貯蔵された幹細胞を、３％のデキストラン４０を含む溶液に再懸濁させることと、を含み、前記低酸素貯蔵バッグが、３５００Ｐａ未満の低酸素環境を含む、方法。
【請求項19】
幹細胞を必要とする対象において移植のための幹細胞を調製するための方法であって、低酸素貯蔵された幹細胞を解凍することと、
低酸素幹細胞増殖システムで前記低酸素貯蔵された幹細胞を増殖させ、低酸素増殖した幹細胞を調製することと、
前記低酸素増殖した幹細胞を、それを必要とする前記対象に移植することと、を含み、前記低酸素貯蔵バッグが、３５００Ｐａ未満の低酸素環境を含む、方法。
【請求項20】
移植のための細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することであって、前記低酸素収集容器が、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素のＯ2透過性を特徴とする酸素（Ｏ2）バリアと、酸素吸着剤と、を含む、収集することと、
前記血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、前記血液製剤を混合することと、
前記血液製剤を幹細胞結合フィルタに適用して、白血球及び幹細胞が枯渇した血液製剤を調製することを含む、前記血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、
等張性培地を用いて、前記フィルタから前記幹細胞を溶出させることと、
前記幹細胞を、２５バーラーより大きな酸素（Ｏ2）透過性を有し、低酸素貯蔵された幹細胞を形成する材料を含む内側細胞適合性バッグを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、を含み、
前記幹細胞が、前記収集することと前記移すこととの間に１時間を超えて正常酸素圧条件にさらされず、前記正常酸素圧条件が、少なくとも約２１，０００パスカルの酸素の分圧を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５８，２６７号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月８日に出願された米国仮特許出願第６３／１５８，２６７号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、幹細胞の低酸素貯蔵のための方法に関する。本開示はまた、幹細胞の事前調整のための方法に関する。本開示は更に、低酸素デバイスにおいて幹細胞を貯蔵するための方法に関する。本開示は更に、ヒト臍帯血由来の幹細胞の低酸素性の成長及び増殖のための方法に関する。
【背景技術】
【0003】
幹細胞は、人体の全ての部分の基礎である。幹細胞から組織、臓器、及び血液細胞の発達へのこのプロセスは複雑であり、かつ予測不可能である。この複雑なプロセスに関与する要因の１つは酸素である。
【0004】
研究によると、幹細胞は、異なる濃度の酸素にさらされる微小環境に存在し、その酸素は、その酸素は、その生物学、維持、分化、及び異なるストレスシグナルに対する応答において重要な役割を果たすことが示されている。Ａｂｄｏｌｌａｈｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”Ｊ Ｓｕｒｇ Ｒｅｓ，１６５（１）：１１２－１１７（２０１１）、及びＤｒｅｌａ Ｋ，Ｓａｒｎｏｗｓｋａ Ａ，ｅｔ ａｌ．，Ｌｏｗ ｏｘｙｇｅｎ ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍａｉｎｔａｉｎｓ ｕｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ ｓｔａｔｅ ｏｆ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｃｏｒｄ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ａｎ ｈｙｐｏｘｉａ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍａｎｎｅｒ．Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１６：８８１－８９２（２０１４）を参照されたい。
【0005】
通常の生理学的条件下では、ＨＳＣは、比較的低い増殖、静止状態に維持され、活性酸素種（ＲＯＳ）の蓄積及びＤＮＡ損傷などのストレスから保護され、過剰増殖に起因するそれらの枯渇を防止すると考えられる。Ｍａｓ－Ｂａｒｇｕｅｓ Ｃ，ｅｔ ａｌ．“Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ ｏｆ Ｏｘｙｇｅｎ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｓｃｉ．，２０（１１９５）：１－２７（２０１９）、Ｓｉｍｏｎ，Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｋｅｉｔｈ，Ｂ．“Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．９，２８５－２９６（２００８）、Ｂｉｇａｒｅｌｌａ Ｃ Ｌ，ａｎｄ Ｌｉａｎｇ Ｒ，Ｇｈａｆｆａｒｉ Ｓ．“Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐａｃｔ ｏｆ ＲＯＳ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ”Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１４１：４２０６－４２１８（２０１４）、Ｌｅｅ Ｊ，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｏｘｉｄａｔｉｖｅ ｓｔｒｅｓｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”Ｏｘｉｄａｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ．１－１３（２０１８）を参照されたい。現在、酸素は、インビトロ及びインビボの両方で、細胞の代謝基質及びシグナル伝達分子の両方として機能するというコンセンサスが存在する。Ｍｏｈｙｅｌｄｉｎ Ａ，ｅｔ ａｌ．“Ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ”Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．７：１５０－１６１（２０１０）を参照されたい。
【0006】
特定の種類の成体幹細胞では、インビトロでの低い酸素濃度は、多能性状態の増殖及び維持を促進する。Ｇｒａｙｓｏｎ ＷＬ，ｅｔ ａｌ．“Ｈｙｐｏｘｉａ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｓｓｕｅ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．３５８：９４８－９５３（２００７）、及びＣｓｅｔｅ Ｍ．“Ｏｘｙｇｅｎ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ”Ａｎｎ ＮＹ Ａｃａｄ Ｓｃｉ．１０４９：１－８（２００５）。これとは逆に、他の研究者は、低酸素が特定の細胞株への分化のための強力な刺激であることを実証している。Ｋｏａｙ ＥＪ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｃａｒｔｉｌａｇｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ”Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ａｎｄ Ｃａｒｔｉｌｅｇｅ．１０：１－７（２００８）、及びＫｈａｎ ＷＳ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｙｐｏｘｉｃ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｈｙｐｏｘｉａ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ２α ａｎｄ ｅｎｈａｎｃｅ ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｆｒａｐａｔｅｌｌａｒ ｆａｔ ｐａｄ ｏｆ ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ ｐａｔｉｅｎｔｓ”Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｈｅｒ．９：１－９（２００７）。あるいは、低酸素は、サイトカイン産生を刺激することができ、それによって、治療用血管新生において役割を果たす可能性がある。Ｔｈａｎｇａｒａｊａｈ Ｈ，ｅｔ ａｌ．“ＩＦＡＴＳ Ｓｅｒｉｅｓ：Ａｄｉｐｏｓｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｄｏｐｔ ａ ｐｒｏａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ｕｎｄｅｒ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ”Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ．２７：２６６－２７４（２００９）、Ｓａｄａｔ Ｓ，ｅｔ ａｌ．“Ｔｈｅ ｃａｒｄｉｏｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ＩＧＦ－１ ａｎｄ ＶＥＧＦ”Ｂｉｏｃｈ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．３６３：６７４－６７９（２００７）、及びＲｅｈｍａｎ Ｊ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ ａｎｄ ａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃ ｆａｃｔｏｒｓ ｂｙ ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ”Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０９：１２９２－１２９８（２００４）を参照されたい。幹細胞による血管新生への関与は、血管新生に関与する細胞の分化を介して直接的に、又は低酸素によって刺激されるサイトカイン産生を介して間接的に生じ得る。Ｃａｏ Ｙ，ｅｔ ａｌ．“Ｈｕｍａｎ ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ ｉｎｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｍｐｒｏｖｅ ｐｏｓｔｎａｔａｌ ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｖｏ”Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍ．３３２：３７０－３７９（２００５）、及びＮａｋａｇａｍｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．“Ａｄｉｐｏｓｅ ｔｉｓｓｕｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｓｔｒｏｍａｌ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｏｐｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ”Ｊ Ａｔｈｅｒｏｓｌｃｅｒ Ｔｈｒｏｍｂ．１３：７７－８１（２００６）を参照されたい。幹細胞を、ニッチな微小環境によって提供されるものと同じではない酸素レベルで培養する場合、細胞は、酸化ストレス、代謝ターンオーバー、増殖及び自己再生の減少、運動性の阻害、分化電位の変化、及び幹細胞性電位損失などの一連の変化を受ける。幹細胞が、その生理的酸素レベルで培養される場合、これらの結果は全て回避することができる。
【0007】
本明細書では、幹細胞の貯蔵及び増殖中に幹細胞を低酸素状態に保つためのデバイス及び方法を実証する。この低酸素状態は、患者への移植のための幹細胞の改善された品質を提供する。
【発明の概要】
【0008】
本開示は、幹細胞を必要とする患者内で移植のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素Ｏ2透過性を特徴とする酸素（Ｏ2）バリアと酸素吸着剤とを含む低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することと、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を混合することと、血液製剤をフィルタに適用することを含む、血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することであって、幹細胞及び白血球が、フィルタ上に保持され、白血球及び幹細胞が枯渇した血液製剤を調製する、分離することと、等張性培地を用いて、フィルタから幹細胞を溶出させることと、幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移し、低酸素貯蔵された幹細胞を調製することと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0009】
本開示はまた、輸血のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含む血液製剤を収集することと、血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、幹細胞を、３５００Ｐａ未満の低酸素環境で、３７℃未満の温度で所定時間貯蔵することと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0010】
本開示はまた、移植のための幹細胞を調製するための方法であって、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を収集することと、ＨＵＣＢを白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタに適用することによって、ＨＵＣＢから白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、幹細胞保持フィルタから幹細胞を溶出させることと、幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0011】
本開示はまた、移植のための幹細胞を処理するためのキットであって、低酸素収集容器と、白血球及び幹細胞の回復フィルタと、濾過された上清を収集するための第１の付属低酸素貯蔵容器と、幹細胞維持培地を含む第２の付属低酸素貯蔵容器と、を含み、第２の付属低酸素貯蔵容器が、白血球及び幹細胞の回復フィルタと流体連通しており、流体連通が、１，４００パスカル（Ｐａ）未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む、キットを提供し、かつそれを含む。
【0012】
本開示はまた、移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵容器を３７℃にさらすことと、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグを、凍結した幹細胞を解凍して、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を生成するために、４２℃未満の水浴に浸漬することと、解凍した幹細胞を、２．５％（重量／体積）のヒトアルブミンを含有する等体積の低酸素溶液で希釈して、希釈した幹細胞を形成することと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0013】
本開示はまた、移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグを少なくとも２５℃にさらして、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を形成することと、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を遠心分離し、上清を除去することと、低酸素貯蔵された幹細胞を、３％のデキストラン４０を含む溶液に再懸濁させることと、を含み、低酸素貯蔵バッグが、３５００Ｐａ未満の低酸素環境を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0014】
本開示はまた、幹細胞を必要とする対象において移植のための幹細胞を調製するための方法であって、低酸素調製された幹細胞を解凍することと、低酸素幹細胞増殖システムで、幹細胞を増殖させることと、を含み、増殖した幹細胞を、それを必要とする対象に移植することを含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0015】
本開示は更に、移植のための細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することであって、低酸素収集容器が、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素のＯ2透過性を特徴とする酸素（Ｏ2）バリアと酸素吸着剤とを含む、収集することと、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を混合することと、血液製剤を幹細胞結合フィルタに適用して、白血球及び幹細胞が枯渇した血液製剤を調製することを含む、血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、フィルタから幹細胞を溶出させることと、幹細胞を、２５バーラーより大きな酸素（Ｏ2）透過性を有し、低酸素貯蔵された幹細胞を形成する材料を含む内側細胞適合性バッグを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、を含み、幹細胞が、収集することと移すこととの間に１時間を超えて正常酸素圧条件にさらされず、正常酸素圧条件が、少なくとも約２１，０００パスカルの酸素の分圧を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0016】
本開示のいくつかの態様は、単なる例として、添付の図面を参照して本明細書において説明される。ここで、図面を詳細に具体的に参照すると、示される詳細は、例としてであり、本開示の実施形態の例示的な考察の目的のためであることが強調される。この点に関して、図面とともに解釈される説明は、本開示の態様がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】本明細書の態様による、濾過技術を使用して、幹細胞を収集し、濃縮することの概略図である。概略図は、（Ａ）抗凝固ヒト臍帯血を含有する低酸素貯蔵バッグ、（Ｂ）濾過後のヒト臍帯血を含有する低酸素貯蔵バッグ、及び（Ｃ）回収された幹細胞を収集するための低酸素貯蔵バッグを示す。
【図2】本明細書のある態様で提供されるような、低酸素幹細胞増殖容器の概略図である。
【0018】
本明細書において記載される実施例は、本発明のいくつかの実施形態を例示するが、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【発明を実施するための形態】
【0019】
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。当業者は、本開示の実施において使用可能な多くの方法を認識するであろう。実際、本開示は、説明される方法及び材料に決して限定されない。本明細書で引用される任意の参照文献は、参照によってその全体が組み込まれる。本開示の目的のために、以下の用語は、以下で定義される。
【0020】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、±１０％を指す。
【0021】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、及びそれらの同根語は、「含むが、これらに限定されない」を意味する。
【0022】
「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語は、「を含み、これに限定する」ことを意味する。
【0023】
「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語は、組成物、方法、又は構造が、追加の成分、工程、及び／又は部品が、特許請求される組成物、方法、又は構造の基本的かつ新規な特徴を実質的に変化させない場合にのみ、追加の成分、工程、及び／又は部品を含み得ることを意味する。
【0024】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明示的に別途示さない限り、複数の参照を含む。例えば、「１つの化合物」又は「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む、複数の化合物を含み得る。
【0025】
本出願を通じて、本開示の様々な実施形態は、範囲形式で提示され得る。したがって、範囲の記載は、全ての可能な部分範囲並びにその範囲内の個々の値を具体的に開示しているとみなされるべきである。これは、範囲の幅に関係なく適用される。本明細書で使用される場合、「～」は、その範囲が、全ての可能な部分範囲、並びにその範囲内の個々の数値を含むが、外部値を含まないことを意味する。例えば、「１～７」は、値１又は７を含まず、「０～７」は、値０又は７を含まない。
【0026】
本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、化学、薬理学、生物学、生化学、及び医学分野の実践者によって既知の様式、手段、技術、及び手順から既知であるか、又はそれらから容易に開発される様式、手段、技術、及び手順を含むが、これらに限定されない、所与のタスクを達成するための様式、手段、技術、及び手順を指す。
【0027】
本明細書で使用される場合、「バッグ」という用語は、可撓性材料から調製される折り畳み可能な容器を指し、ポーチ、チューブ、及びマチ袋を含む。特定の態様では、バッグは、非折り畳み可能な容器を指す。本明細書で使用され、本開示において含まれる場合、バッグという用語は、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上のひだを有し、１つ、２つ、３つ、又はそれ以上の側面上で封止されるか又は結合される、折り畳まれたバッグを含む。バッグは、１つ以上の材料のシートの結合を含む、当該技術分野において既知の様々な技術を使用して調製される。バッグを形成するための材料を結合する方法は、当該技術分野において既知である。国際公開第ＷＯ２０１６／１４５２１０号を参照されたい。本開示には、射出及びブロー成形によって調製される容器も含まれ、かつ提供される。ブロー成形容器及び射出成形容器を調製する方法は、当該技術分野において既知である。米国特許第４，２８０，８５９号、及び同第９，０９６，０１０号を参照されたい。好ましいタイプのブロー成形又は射出成形容器は、酸素の低減に関して血液又は血液成分を収容するために拡張することが可能でありながら、効率的な包装及び出荷のためにサイズを低減させることができる可撓性容器である。それらはまた、完全に拡張するまで、血液の体積に適合するように設計され得る。本開示を通して使用される場合、バッグは、折り畳み可能な容器の形態であり、２つの用語は、本開示を通して互換的に使用される。
【0028】
本明細書で使用される場合、「正常酸素圧」又は「正常酸素圧条件」という用語は、枯渇していないレベルの酸素を有する血液製剤又は環境を指す。ある態様では、正常酸素圧又は正常酸素圧条件は、少なくとも２１，０００Ｐａの酸素の分圧を指す。本明細書で使用される場合、「中間酸素圧」又は「中酸素圧条件」という用語は、非枯渇レベルの酸素及び最小限の酸素の侵入を有する血液製剤又は環境を指す。複数の態様では、中間酸素圧又は中間酸素圧条件は、少なくとも１３，０００Ｐａの酸素の分圧を指す。別の態様では、中間酸素圧又は中間酸素圧条件は、１３，０００Ｐａ～２０，０００Ｐａの酸素の分圧を指す。本明細書で使用される場合、「低酸素」又は「低酸素状態」という用語は、枯渇したレベルの酸素を有する血液製剤又は環境を指す。ある態様では、低酸素又は低酸素状態は、１２，０００Ｐａ未満の酸素の分圧を指す。別の態様では、低酸素又は低酸素状態は、４００～１２，０００Ｐａを指す。更に別の態様では、低酸素又は低酸素状態は、２，０００～１０，０００Ｐａ、３，０００～１０，０００Ｐａ、４，０００～１０，０００Ｐａ、２，０００～１２，０００Ｐａ、３，０００～１２，０００Ｐａ、又は４，０００～１２，０００Ｐａを指す。
【0029】
本明細書で使用される場合、「血液」及び「血液製剤」という用語は、幹細胞を含有する末梢血、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）、及び骨髄を指す。血液の温度は、採取プロセスの段階とともに変化し、採取時及び採取地点において通常の体温３７℃で開始するが、患者の身体から一旦除去されると、急速に約３０℃まで低下する。１単位の収集した血液を、未処理の場合、約６時間で室温まで冷却する。実際には、輸血のための血液は、２４時間以内に処理され、約２℃～６℃、通常は４℃で冷蔵される。
【0030】
本明細書で使用される場合、「血液幹細胞」又は「幹細胞」という用語は、赤血球、白血球、及び血小板を含む全ての型の血球へと発達することができる未成熟細胞を指す。血液幹細胞は、造血幹細胞としても知られている。血液幹細胞は、ドナーの臍帯血、骨髄及び末梢血中に見出され、それらから抽出される。
【0031】
幹細胞は、様々な種類の細胞に分化し、無期限に分裂して同じものを産生する能力を有する、未分化又は部分分化細胞である。これらの娘細胞は、新しい幹細胞になるか（自己再生）、又は血液細胞、脳細胞、心筋細胞、若しくは骨細胞などのより特異的な機能を有する特化した細胞になる（分化）。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ ＳＪ，ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｅｌｌ，８８：２８７－２９８（１９９７）（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ１９９７）、及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆ ＢＥ，ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ：ｓｏｍａｔｉｃ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｉｎ ｖｉｔｒｏ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：３９９－４０４（２０００）（Ｒｅｕｂｉｎｏｆｆ ２０００）（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0032】
理論に限定されるものではないが、最近の証拠は、幹細胞を用いて、全てではないにしても多くの組織を再集団化し、生理学的機能及び解剖学的機能を回復させることができることを実証する。したがって、幹細胞は、神経系外傷、悪性腫瘍、遺伝性疾患、ヘモグロビン異常症、及び免疫不全を含む多種多様な疾患及び傷害の治療に使用される可能性を有する。一般的に、幹細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞及び成体幹（ＡＳ）細胞の２つの種類に分けられる。胚性幹細胞は、３～５日齢の胚から調製される。この段階で、胚は、胚盤胞と呼ばれ、約１５０個の細胞を有する。Ｍｏｒｒｉｓｏｎ１９９７及びＲｅｕｂｉｎｏｆｆ２０００を参照されたい。ＥＳ細胞は、全能性であると理解される。
【0033】
成体幹細胞は、自然の細胞死サイクル、損傷、又は疾患を通して失われた細胞型を迅速に補充することができる。成体幹細胞は、いくつかの細胞型（多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）又は多能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ））に分化することができ、あるいは１つの細胞型に限定することができる（単能性）。
【0034】
多能性幹細胞の１つの種類は、血液及び免疫細胞を補充することに関与する造血幹細胞（ＨＳＣ）である。造血幹細胞（ＨＳＣ）は、骨髄系（単球、マクロファージ、好中球、好塩基球、好酸球、赤血球、巨核球／血小板、及び樹状細胞）並びにリンパ系（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）を含む全ての種類の血液細胞を生じさせることができる多能性幹細胞である。成体幹細胞は、子孫細胞及びそれらが分化する最終分化細胞によって大幅に数が上回っている。ＭｃＫｅｅ Ｃ，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖａｎｃｅｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ ｉｎ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ ａｎｄ Ｓｕｒｆ Ｂ：Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ，１５９：６２－７７（２０１７）及びＢｉｅｎｉａｓｚ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅｒａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ａｎｄ ｓｏｕｒｃｅｓ．ＭＥＤｔｕｂｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，２：８－１４（２０１４）（参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【0035】
成体幹細胞は、胚性幹細胞の全能性の多くを有するように変更することができ、人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）と呼ばれる。成体幹細胞の３つの主なドナー源は、骨髄、脂肪組織、及び末梢血である。ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）はまた、造血幹細胞（ＨＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、及び他の前駆細胞を含む成体幹細胞の豊富な供給源である。造血幹細胞及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）、並びにいくつかの成熟細胞は、それらの表面上にＣＤ３４と呼ばれる抗原を発現し、ＣＤ３４は、造血幹細胞の１つの識別子として広く使用され、幹細胞移植のプロトコルにおける用量要件として使用されてきた。
【0036】
本開示は、ポリコーム群ＲＩＮＧフィンガータンパク質４（ＢＭＩ－１）、分化クラスター２１（ＣＤ２１）、分化クラスター２２（ＣＤ２２）、分化クラスター３４（ＣＤ３４）、分化クラスター３８（ＣＤ３８）、分化クラスター４１（ＣＤ４１）、分化クラスター４４（ＣＤ４４）、分化クラスター４５（ＣＤ４５）、分化クラスター４８（ＣＤ４８）、分化クラスター９０（ＣＤ９０、Ｔｈｙ１）、分化クラスター１０５（ＣＤ１０５）、分化クラスター１０６（ＣＤ１０６）、分化クラスター１１７（ＣＤ１１７、ｃ－ｋｉｔ）、分化クラスター１２７（ＣＤ１２７）、分化クラスター１５０（ＣＤ１５０）、ｃ－ｍｙｃ、内皮細胞プロテインｃ受容体（ＥＰＣＲ）、リンパ球抗原－６（Ｌｙ６Ａ／Ｅ、ｓｃａ－１）、ＭＹＢ、誘導性骨髄性白血病細胞分化タンパク質（Ｍｃｌ－１）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｓｋｐ、キュリン、Ｆ－ｂｏｘ（ＳＣＦ、ｋｉｔリガンド）、転写の単一トランスデューサー及びアクチベーター５ａ（ＳＴＡＴ５ａ）、転写の単一トランスデューサー及びアクチベーター５ｂ（ＳＴＡＴ５ｂ）、及び血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される１つ以上の造血幹細胞マーカーを含む造血幹細胞を提供し、かつそれを含む。別の態様では、造血幹細胞は、ポリコーム群ＲＩＮＧフィンガータンパク質４（Ｂｍｉ－１）、分化クラスター２１（ＣＤ２１）、分化クラスター２２（ＣＤ２２）、分化クラスター３４（ＣＤ３４）、分化クラスター３８（ＣＤ３８）、分化クラスター４１（ＣＤ４１）、分化クラスター４４（ＣＤ４４）、分化クラスター４５（ＣＤ４５）、分化クラスター４８（ＣＤ４８）、分化クラスター９０（ＣＤ９０、Ｔｈｙ１）、分化クラスター１０５（ＣＤ１０５）、分化クラスター１０６（ＣＤ１０６）、分化クラスター１１７（ＣＤ１１７、ｃ－ｋｉｔ）、分化クラスター１２７（ＣＤ１２７）、分化クラスター１５０（ＣＤ１５０）、ｃ－ｍｙｃ、内皮細胞プロテインｃ受容体（ＥＰＣＲ）、リンパ球抗原－６（Ｌｙ６Ａ／Ｅ、ｓｃａ－１）、ＭＹＢ、誘導性骨髄性白血病細胞分化タンパク質（Ｍｃｌ－１）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｓｋｐ、キュリン、Ｆ－ｂｏｘ（ＳＣＦ、ｋｉｔリガンド）、転写の単一トランスデューサー及びアクチベーター５ａ（ＳＴＡＴ５ａ）、転写の単一トランスデューサー及びアクチベーター５ｂ（ＳＴＡＴ５ｂ）、及び血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される２つ以上の造血幹細胞マーカーを含む。
【0037】
ある態様では、本開示は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、及びＳｔｒｏ－１からなる群から選択される１つ以上の間葉系幹細胞マーカーを含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である幹細胞を提供し、かつそれを含む。別の態様では、本開示は、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、及びＳｔｒｏ－１からなる群から選択される２つ以上の間葉系幹細胞マーカーを含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を提供する。更に別の態様では、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、及びＳｔｒｏ－１からなる群から選択される３つ以上の間葉系幹細胞マーカーを含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）。別の態様では、造血幹細胞は、Ｂｍｉ１、Ｍｅｌ１８、Ｒａｅ２８、Ｃｂｘ２、Ｃｂｘ８、Ｒｉｎｇ１Ｂ、Ｅｚｈ１、Ｅｚｈ２、Ｅｅｄ、及びＳｕｚ１２からなるポリコーム群タンパク質の群から選択される群から選択される１つ以上の造血幹細胞マーカーを含む。Ｔａｋａｍａｔｓｕ－Ｉｃｈｉｈａｒａ，Ｅ．ａｎｄ Ｋｉｔａｂａｙａｓｈｉ，Ｉ．，“Ｔｈｅ ｒｏｌｅｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｃｏｍｂ ｇｒｏｕｐ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｅｔｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ”Ｉｎｔｅｒｎ Ｊｏｕｒ．Ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ．１０３，６３４－６４２（２０１６）を参照されたい。
【0038】
本開示は、幹細胞の品質及び増殖能を改善するために、収集及び濃縮の間に低酸素条件下で幹細胞を調製するための方法を提供し、かつそれを含む。より具体的には、本開示の方法は、収集段階及び増殖段階の間に酸素を除外することを提供する。
【0039】
ある態様では、本開示は、幹細胞を必要とする患者への移植のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、低い酸素の分圧を有する酸素吸収環境内に収集することと、血液製剤を混合して酸素を減少させることと、血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことと、を含む方法を提供する。ある態様では、幹細胞は、室温で最大３日間貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、室温で少なくとも１日間貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、凍結して貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、幹細胞移植を必要とする患者に移植される。室温は、２０～２２℃である。室温は、１９～２５℃である。室温は、少なくとも２０℃である。室温は、２２℃未満である。室温は、２０～２３℃である。室温は、１９～２２℃である。本開示の別の態様では、幹細胞は、室温で７日間未満貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、室温で１～７日間貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、室温で少なくとも１日間、少なくとも３日間、少なくとも５日間、及び少なくとも７日間貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、４℃で１～７日間、１～３日間、１～５日間、１～１４日間、２～７日間、２～８日間、４～７日間、５～１０日間、又は３～１４日間貯蔵される。別の態様では、幹細胞は、４℃で１４日未満、１０日未満、７日未満、５日未満、及び３日未満貯蔵される。更に別の態様では、幹細胞は、４℃で少なくとも１日間、少なくとも３日間、少なくとも５日間、少なくとも７日間、及び少なくとも１０日間貯蔵される。
【0040】
本開示は、幹細胞を必要とする患者への移植のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素のＯ2透過性を特徴とするＯ2バリアと酸素吸着剤とを含む低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することと、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ２）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を混合することと、血液製剤を幹細胞及び白血球結合フィルタに適用することによって、上述の血液製剤から白血球及び幹細胞を分離して、低い酸素の分圧で、幹細胞が枯渇した血液製剤及び幹細胞が結合したフィルタを生成することと、を含む方法を提供し、かつそれを含む。幹細胞を、等張性培地を用いてフィルタから溶出させ、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移し、低酸素幹細胞を調製する。幹細胞を、低酸素条件下、３７℃未満の温度で貯蔵して、貯蔵された低酸素幹細胞を調製することができる。
【0041】
本開示は、輸血のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含む血液製剤を収集することと、上述の血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、上述の幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素のＯ2透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、上述の幹細胞を、未満の低酸素環境で、３７℃以下の温度で所定時間貯蔵することと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0042】
本開示は、移植のための幹細胞を調製するための方法であって、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を収集することと、ＵＣＢを白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタに適用することによって、上述のＨＵＣＢから白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、上述の幹細胞保持フィルタから上述の幹細胞を溶出させることと、上述の幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0043】
本開示は、移植のための幹細胞を調製するための方法であって、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を収集することと、ＵＣＢを白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタに適用することによって、上述のＨＵＣＢから白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、上述の幹細胞保持フィルタから上述の幹細胞を溶出させることと、上述の幹細胞を中間酸素圧貯蔵容器に移すことと、を含み、中間酸素圧貯蔵容器が、酸素の侵入を防ぐ、方法を提供し、かつそれを含む。
【0044】
本開示のある態様では、幹細胞移植を必要とする患者への移植のための幹細胞を調製するための方法が提供される。別の態様では、それを必要とする患者は、がん又は免疫系疾患を有する人である。別の態様では、それを必要とし、幹細胞移植を必要とする患者は、血液又は骨髄の悪性腫瘍又は非悪性腫瘍を有する患者である。更に別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、再生不良性貧血及び発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、精巣がん、血液産生の先天性障害（例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア）、ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）、シュワッハマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）、先天性角化不全症候群、又は自己免疫障害を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、再生不良性貧血を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、ホジキンリンパ腫を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、非ホジキンリンパ腫を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、多発性骨髄腫を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、骨髄異形成症候群を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、精巣がんを有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、血液産生の先天性障害（例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、ダイアモンド・ブラックファン貧血（ＤＢＡ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、シュワッハマン・ダイアモンド症候群（ＳＤＳ）を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、先天性角化不全症候群を有する人である。別の態様では、幹細胞移植を必要とする人は、自己免疫障害を有する人である。ある態様では、本開示は、幹細胞を必要とする患者への移植に適した体積の幹細胞を提供し、かつそれを含む。別の態様では、移植に適した体積は、１０～５０ミリリットル／キログラム（ｍＬ／ｋｇ）である。別の態様では、移植に適した体積は、２０～４０ｍＬ／ｋｇである。別の態様では、移植に適した体積は、少なくとも１０ｍＬ／ｋｇである。別の態様では、移植に適した体積は、少なくとも２０ｍＬ／ｋｇである。更なる態様では、適切な体積は、３０ｍＬ／ｋｇである。
【0045】
本開示は、幹細胞を含有する血液製剤を低酸素収集バッグに収集するための方法を提供し、かつそれを含む。本明細書に提供される態様では、低酸素収集バッグは、血液の凝固又は幹細胞の凝集を防止するための抗凝固剤を含有する。ある態様では、抗凝固剤は、クエン酸－リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１）、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）及びヘパリンからなる群から選択される。別の態様では、抗凝固剤は、クエン酸－リン酸デキストロース（ＣＰＤ）である。別の態様では、抗凝固剤は、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１）である。別の態様では、抗凝固剤は、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）である。更に別の態様では、抗凝固剤は、ヘパリンである。
【0046】
複数の態様では、低酸素収集バッグに収集された幹細胞を含有する血液製剤を混合して、血液製剤からの酸素枯渇を増加させる。本明細書に提供される態様では、低酸素収集バッグに収集された幹細胞を含有する血液製剤の酸素の分圧をできるだけ早く減少させることが重要である。ある態様では、混合の１～３時間後、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を酸素吸収環境で混合する。別の態様では、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が、３時間以内に７０～９５％、６０～９５％、５０～９５％、４０～９５％、３０～９５％、３０～７０％、３０～８０％減少するまで、血液製剤を酸素吸収環境で混合する。更に別の態様では、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が、混合の３時間以内に少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５％減少するまで、血液製剤を酸素吸収環境で混合する。更に別の態様では、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は９５％減少するまで、血液製剤を３時間未満、酸素吸収環境で混合する。
【0047】
別の態様では、ｐＯ2が、３５００パスカル（Ｐａ、２６ｍｍＨｇに相当する）未満、３０００Ｐａ未満、２５００Ｐａ未満、２０００Ｐａ未満、１５００Ｐａ未満、又は１０００Ｐａ未満になるまで、幹細胞を含有する血液製剤を混合する。複数の態様では、幹細胞を含有する血液製剤のｐＯ２は、収集から３時間以内に減少する。別の態様では、血液製剤を、ｐＯ2が、９９０～３５００Ｐａ、９９０～３０００Ｐａ、９９０～２５００Ｐａ、９９０～２０００Ｐａ、９９０～１５００Ｐａ、又は１０００～３０００Ｐａになるまで混合する。本開示のある態様では、血液製剤を、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2下で混合する。別の態様では、血液製剤を、９００～３５００Ｐａ又は２０００～３５００ＰａのｐＯ2下で混合する。
【0048】
本開示のある態様では、血液製剤を、９００～３５００Ｐａの酸素の分圧（ｐＯ2）下で最大３時間混合する。別の態様では、血液製剤を、１時間以下、かつ血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、混合する。別の態様では、血液製剤を、２時間以下、かつ血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、混合する。別の態様では、血液製剤を、最大３時間、かつ血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、混合する。更に別の態様では、血液製剤を、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が７０～９５％減少するまで、１～３時間混合する。
【0049】
本開示は、低酸素条件下で幹細胞を血液製剤から分離するための様々な方法を提供する。本開示のある態様では、幹細胞を、幹細胞保持フィルタを用いた親和性クロマトグラフィーによって、血液製剤（すなわち、末梢血、ヒト臍帯血、又は骨髄）から分離する。別の態様では、幹細胞又は幹細胞及び白血球は、白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタによる濾過によって、血液製剤から分離される。様々な白血球減少フィルタは、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）白血球減少フィルタ（ＢＰＦ４白血球除去フィルタ、Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ（登録商標）、Ｂｒａｉｎｔｒｅｅ，ＭＡ）を含め、当該技術分野において一般的に既知である。更に別の態様では、白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタを、単一のフィルタに組み合わせる。別の態様では、幹細胞保持フィルタは、幹細胞特異的モノクローナル抗体を含む。別の態様では、幹細胞保持フィルタは、ＣＤ３４に対する抗体を含む。別の態様では、幹細胞保持フィルタは、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ４９ｆ（インテグリンａ６）ｃＫｉｔ／ＣＤ１１７、Ｌｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ－１）、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ１４６からなる群から選択される１つ以上の抗体を含む。別の態様では、幹細胞保持フィルタは、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ４９ｆ（インテグリンａ６）ｃＫｉｔ／ＣＤ１１７、Ｌｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ－１）、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ１４６からなる群から選択される２つ以上の抗体を含む。更なる態様では、幹細胞保持フィルタは、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ４９ｆ（インテグリンａ６）ｃＫｉｔ／ＣＤ１１７、Ｌｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ－１）、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ１４６からなる群から選択される３つ以上の抗体を含む。更なる態様では、幹細胞保持フィルタは、ＣＤ４５、ＣＤ９０、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３４、ＣＤ４９ｆ（インテグリンａ６）ｃＫｉｔ／ＣＤ１１７、Ｌｙ６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ－１）、ＣＤ１３、ＣＤ２９、ＣＤ３６、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ１０５、及びＣＤ１４６からなる群から選択される４つ以上の抗体を含む。幹細胞は、結合によってフィルタ上に濃縮され、等張性培地を使用してフィルタから溶出される。複数の態様では、等張性培地は、３５００Ｐａ以下のｐＯ2を有する酸素減少培地である。
【0050】
別の態様では、幹細胞は、骨髄穿刺液、臍帯血、末梢血、リポアスピレート、又はそれらの混合物の遠心分離によって血液製剤から分離される。上清を除去し、幹細胞を幹細胞維持溶液に再懸濁させる。幹細胞維持溶液の一例は、３重量／体積％のデキストランを有するリン酸緩衝化生理食塩水である。幹細胞維持溶液の別の例は、５％ヒトアルブミンで緩衝化されたリン酸塩である。ある態様では、幹細胞は、低酸素血液製剤から分離される。別の態様では、幹細胞は、正常酸素圧血液製剤から分離される。別の態様では、血液製剤は、遠心分離の前に、密度勾配により混合される。
【0051】
本開示のある態様では、血液製剤を、ｐＯ2が４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００Ｐａに維持される酸素減少条件下で濾過又は遠心分離によって分離する。別の態様では、血液製剤を、９００～３５００Ｐａ又は２０００～３５００ＰａのｐＯ2下で分離する。
【0052】
ある態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、２０％未満の酸素飽和度を有するように処理された赤血球を含む。複数の態様では、幹細胞を有する赤血球含有血液製剤は、末梢血（例えば、全血）から、又は臍帯血及び骨髄から得ることができる。別の態様では、幹細胞（例えば、全血）を有する赤血球含有血液製剤は、幹細胞の抽出前に、２０％未満の酸素飽和度を有するように処理される。別の態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、脱酸素処理後に１５％未満の酸素飽和度を有する赤血球を含む。別の態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、脱酸素処理後に１０％未満の酸素飽和度を有する赤血球を含む。別の態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、脱酸素処理後に５％未満の酸素飽和度を有する赤血球を含む。更に別の態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、脱酸素処理後に４～２５％の酸素飽和度を有する赤血球を含む。別の態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、脱酸素処理後に４～２０％の酸素飽和度を有する赤血球を含む。別の態様では、フィルタを通り抜ける血液製剤は、脱酸素処理後に１０～２０％の酸素飽和度を有する赤血球を含む。末梢血からの酸素を効率的に減少させる方法は、２０１６年９月１５日に公開された米国国際公開第２０１６／１４５２１０号及び２０１６年１０月２７日に公開された国際公開第２０１６／０２９０６９号に提供される。
【0053】
本開示のある態様では、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、又は白血球及び幹細胞の回収フィルタ、並びに溶液は、３０００Ｐａ未満のｐＯ2の酸素の分圧を含む低酸素条件下で維持される。複数の態様では、細胞、デバイス、及び溶液は、２５００Ｐａ未満のｐＯ2、２０００Ｐａ未満のｐＯ2、１４００Ｐａ未満のｐＯ2、又は９００Ｐａ未満のｐＯ2の酸素の分圧で維持される。別の態様では、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、又は白血球及び幹細胞の回収フィルタは、９００～３０００ＰａのｐＯ2、９００～２５００ＰａのｐＯ2、９００～２０００ＰａのｐＯ2、１４００～２５００ＰａのｐＯ2、又は１３００～２５００ＰａのｐＯ2を含む低酸素条件下で維持される。別の態様では、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、又は白血球及び幹細胞の回収フィルタは、３０００Ｐａ未満のｐＯ2の酸素の分圧及び６０００Ｐａ未満の二酸化炭素の分圧を含む低酸素条件下で維持される。更に別の態様では、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、又は白血球及び幹細胞の回収フィルタは、この段落で提供されるような酸素の分圧及び６０００Ｐａ未満の二酸化炭素の分圧を含む低酸素条件下で維持される。
【0054】
本開示は、幹細胞回収フィルタ上に濃縮された幹細胞を溶出させるための方法を提供し、かつそれを含む。ある態様では、濃縮された幹細胞は、低酸素条件下、等張性培地中で溶出される。特定の態様では、等張性培地は、等張性培地である。他の態様では、等張性培地は、幹細胞の組織培養と適合性である。いくつかの態様では、等張性培地は、等張性培地を調製するための追加の成分と組み合わせることができる。別の態様では、本開示は、濃縮された幹細胞を等張性培地で溶出させることを提供する。別の態様では、溶出させることは、５０～２００ｍＬの等張性培地を用いて、濃縮された幹細胞を処理することを含む。別の態様では、溶出させることは、少なくとも５０ｍＬの等張性培地を用いて、濃縮された幹細胞を処理することを含む。別の態様では、溶出させることは、少なくとも１００ｍＬの等張性培地を用いて、濃縮された幹細胞を処理することを含む。別の態様では、溶出させることは、少なくとも１５０ｍＬの等張性培地を用いて、濃縮された幹細胞を処理することを含む。別の態様では、溶出させることは、１００ｍＬの等張性培地を用いて、濃縮された幹細胞を処理することを含む。
【0055】
本開示は、酸素の分圧を特徴とする等張性培地を提供し、かつそれを含む。複数の態様では、等張性培地は、正常酸素圧である（例えば、周囲圧力で酸素と平衡化される）。他の態様では、等張性培地は、減少した酸素分圧を有する。複数の態様では、等張性培地及び成分は、３５００Ｐａ未満の酸素の分圧を有する。別の態様では、等張性培地は、３０００Ｐａ未満、２５００Ｐａ未満、２０００Ｐａ未満、１５００Ｐａ未満、又は１０００Ｐａ未満のｐＯ2を含む脱酸素等張性培地である。別の態様では、等張性培地は、９９０～６０００Ｐａ、９９０～３５００Ｐａ、９９０～３０００Ｐａ、９９０～２５００Ｐａ、９９０～２０００Ｐａ、９９０～１５００Ｐａ、又は１０００～３０００ＰａのｐＯ2を含む脱酸素等張性培地である。本開示のある態様では、等張性培地は、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2を含む脱酸素等張性培地である。別の態様では、等張性培地は、９００～３０００Ｐａ又は２０００～３０００ＰａのｐＯ2を含む脱酸素等張性培地である。別の態様では、濃縮された幹細胞は、容器へと溶出される。更に別の態様では、濃縮された幹細胞を、低酸素貯蔵容器へと直接溶出させる。
【0056】
本開示のある態様では、幹細胞を、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2下で溶出させる。別の態様では、幹細胞を、９００～４０００Ｐａ又は２０００～４０００ＰａのｐＯ2下で溶出させる。
【0057】
本開示のある態様では、幹細胞を血液製剤から分離し、低酸素条件下で貯蔵する。ある態様では、分離された幹細胞を、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2下で低酸素貯蔵容器へと移す。別の態様では、幹細胞を、９００～３５００Ｐａ又は２０００～３５００ＰａのｐＯ2下で低酸素貯蔵容器へと移す。
【0058】
ある態様では、幹細胞懸濁液（幹細胞維持溶液を有する幹細胞）を、室温で最大３日間、低酸素貯蔵バッグで貯蔵する。別の態様では、幹細胞懸濁液を凍結保護剤で希釈し、－８０℃で、又は液体窒素（およそ－１９５℃）中で貯蔵する。ある態様では、幹細胞懸濁液を凍結させるための凍結保護剤は、トレハロース、マンニトール、スクロース、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、グリセロール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、ホルムアミド、グリセロール－３ホスフェート、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、トリエチレングリコール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。別の態様では、幹細胞懸濁液を、トレハロース及びデキストランを含む溶液中で凍結させる。
【0059】
本開示は、血液製剤を収集し、幹細胞を分離し、低酸素条件下で３～４日間にわたって培養し、幹細胞を３～１４倍に増殖させることによって、幹細胞を更に増殖させることを提供し、かつそれを含む。例えば、本開示は、幹細胞を含有する血液製剤を、酸素吸収環境内に収集し、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ２）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を混合し、血液製剤から白血球及び幹細胞を分離し、幹細胞を増殖させ、幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことを提供する。
【0060】
本開示のある態様では、幹細胞を低酸素貯蔵容器に移す前に、分離された幹細胞を、低酸素幹細胞増殖容器に移す。別の態様では、幹細胞を低酸素幹細胞増殖容器に移す前に、分離された幹細胞を、低酸素貯蔵容器に移す。別の態様では、分離された幹細胞を低酸素増殖容器に移し、次いで、それを必要とする患者に移植する。
【0061】
本開示のある態様では、単離された幹細胞を低酸素幹細胞増殖容器に入れることによって、幹細胞を増殖させる。別の態様では、図２に提供されるように、低酸素幹細胞増殖容器は、シェーカ（線形又はオービタル）上に置かれ、供給培養培地を含む低酸素バッグ及び灌流廃棄物のための低酸素バッグに接続される。別の態様では、シェーカを一定期間、７０～８０ｒｐｍに設定して、混合、並びに酸素及び二酸化炭素の枯渇を増加させる。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、閉じたシステムで酸素及び二酸化炭素の吸着剤に結合される。他の態様では、酸素及び二酸化炭素は、酸素を窒素などの不活性ガスに置き換えることによって、制御された雰囲気内での増殖の間に制御され、維持される。
【0062】
本開示のある態様では、単離された幹細胞（すなわち、幹細胞回収フィルタから溶出された幹細胞）を、幹細胞増殖培地を用いて低酸素幹細胞増殖容器に入れ、低酸素幹細胞増殖容器をシェーカ（線形又はオービタル）上に置き、幹細胞を混合して、酸素及び二酸化炭素の枯渇を増加させることによって、幹細胞を増殖させる。典型的には、混合は、７０～８０ｒｐｍの速度で所定期間行われるが、好適な混合方法及び速度の選択は、当業者に知られている。ある態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の上述の増殖培養期間の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、３，０００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の上述の増殖培養期間の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、２，５００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の上述の増殖培養期間の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、２，０００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の上述の増殖培養期間の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、１，６００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の上述の増殖培養期間の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、１，４００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の上述の増殖培養期間の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、１，２００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される。
【0063】
別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の培養期間にわたって、３，０００Ｐａ未満である酸素の分圧で維持され、細胞が３～１４倍まで増殖するように培養する。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の培養期間にわたって、２，０００Ｐａ未満である酸素の分圧で維持され、細胞が３～１４倍まで増殖するように培養する。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の培養期間にわたって、１，６００Ｐａ未満である酸素の分圧で維持され、細胞が３～１４倍まで増殖するように培養する。更に別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の培養期間にわたって、１，４００Ｐａ未満である酸素の分圧で維持され、細胞が３～１４倍まで増殖するように培養する。更なる態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、１～５日間の培養期間にわたって、１，２００Ｐａ未満である酸素の分圧で維持され、細胞が３～１４倍まで増殖するように培養する。
【0064】
更なる態様では、幹細胞を低酸素増殖条件下で所定期間培養し、幹細胞を３～１４倍に増殖させる。ある態様では、幹細胞を低酸素増殖条件下で所定期間培養し、幹細胞を３～１６倍に増殖させ、少なくとも１０4個の細胞を含む集団を調製する。別の態様では、増殖した幹細胞集団を培養して、１～５日後に、ＣＤ３４＋細胞の数を少なくとも２倍増加させる。ある態様では、幹細胞を低酸素増殖条件下で所定期間培養し、１～５日後に、ＣＤ３４＋細胞の数を少なくとも３倍に増殖させる。別の態様では、幹細胞を低酸素増殖条件下で所定期間培養し、幹細胞を、５～１０％のＣＤ３４＋細胞を含む集団へと増殖させる。別の態様では、幹細胞を低酸素増殖条件下で所定期間培養し、幹細胞を、２、１、０．５、０．０５％未満、次いで０．００５％のＣＤ４４＋細胞を含む集団へと増殖させる。別の態様では、幹細胞を３～１４倍まで増殖させ、１０％を超えるＣＤ３４＋及び２％未満のＣＤ４４＋細胞を含有する。別の態様では、幹細胞を、低酸素増殖条件下で、幹細胞を１％未満のＣＤ９０＋細胞を含む集団へと増殖させるのに十分な所定期間培養する。ある態様では、増殖した幹細胞は、少なくとも５％のＣＤ３４＋細胞、２％未満のＣＤ４４＋細胞、及び１％未満のＣＤ９０＋細胞の集団を含む。ある態様では、低酸素増殖条件下で１～５日間培養された幹細胞は、細胞染色技術（すなわち、トリパンブルー及び７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）によって測定される場合、９８％を超える生存率を維持する。
【0065】
本開示は、０．１５５～０．７平方メートル（ｍ2）の総表面積を含む、低酸素幹細胞増殖容器を提供する。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、０．１５５～０．３１ｍ2の総表面積を含む。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、少なくとも０．１５５ｍ2の総表面積を含む。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、少なくとも０．２ｍ2の総表面積を含む。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、少なくとも０．３ｍ2の総表面積を含む。更に別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、少なくとも０．４ｍ2の総表面積を含む。別の態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、少なくとも０．５ｍ2の総表面積を含む。更なる態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、少なくとも０．６ｍ2の総表面積を含む。更なる態様では、低酸素幹細胞増殖容器は、０．７ｍ2未満の総表面積を含む。
【0066】
別の態様では、本開示は、マイクロキャリアビーズを含む低酸素幹細胞増殖容器を提供する。別の態様では、本開示は、マイクロキャリアビーズ及び幹細胞増殖培地を含む低酸素幹細胞増殖容器を提供する。
【0067】
一般に、本開示の低酸素方法を使用した幹細胞増殖に好適な培地は、当該技術分野において既知である。典型的には、細胞培養培地は、６．６～７．８のｐＨを有する緩衝化培地であり、エネルギー源（典型的には、グルコース／デキストロース）、及び血清タンパク質（例えば、アルブミン）を含む。本開示の態様では、幹細胞増殖培地には、幹細胞増殖を強化するために、添加剤又は増殖因子が補充される。一般的な幹細胞増殖培地の例は、ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）、及びＳｔｅｍｌｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）である。ある態様では、幹細胞増殖培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ－ベータ、ＶＥＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、アクチビンＢ、ＴＧＦ－ベータ、ＶＥＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、及び幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、又は６つ以上の増殖因子を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、アクチビンＡを含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、アクチビンＢを含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、ＴＧＦ－ベータを含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、ＶＥＧＦを含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、幹細胞因子（ＳＣＦ）を含む。更に別の態様では、幹細胞増殖培地は、１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の増殖因子を含み、６．６～７．８のｐＨを含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、少なくとも６．６のｐＨを含む。更に別の態様では、幹細胞増殖培地は、少なくとも７のｐＨを含む。更なる態様では、幹細胞増殖培地は、７．５のｐＨを含む。
【0068】
別の態様では、本開示は、レチノイン酸、アスコルビン酸、ホルモン、細胞内ｃＡＭＰ上昇剤、Ｆｌｔ－３リガンド、異なるサイトカイン及び増殖因子の組み合わせ（例えば、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６）からなる群から選択される１つ以上の添加剤を更に含む幹細胞増殖培地を提供する。別の態様では、レチノイン酸、アスコルビン酸、ホルモン、細胞内ｃＡＭＰ上昇剤、Ｆｌｔ－３リガンド、異なるサイトカイン及び増殖因子の組み合わせからなる群から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、又は５つ以上の添加剤を更に含む、幹細胞増殖培地。更に別の態様では、幹細胞増殖培地は、レチノイン酸を含む。更に別の態様では、幹細胞増殖培地は、アスコルビン酸を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、ホルモンを含む。更に別の態様では、幹細胞増殖培地は、細胞内ｃＡＭＰ上昇剤を含む。別の態様では、幹細胞増殖培地は、Ｆｌｔ－３リガンドを含む。更に別の態様では、幹細胞増殖培地は、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６からなる群から選択される１つ以上の増殖因子を含む。本開示のある態様では、幹細胞増殖培地は、１つ以上の増殖因子、１つ以上の添加剤、及び６．６～７．８のｐＨを含む。
【0069】
本開示は、幹細胞を含有する血液製剤を、酸素吸収環境内に収集することを提供し、かつそれを含む。ある態様では、酸素吸収環境は、酸素バリア層を含む低酸素収集容器である。別の態様では、酸素吸収環境は、酸素透過性層を囲む酸素バリア層を含む低酸素収集容器である。別の態様では、酸素吸収環境は、一方の側で血液製剤層と、他方の側で酸素吸着剤と接触する酸素透過性層と、酸素吸着剤及び酸素透過性層の両方を囲む酸素バリア層と、を含む、低酸素収集容器である。更に別の態様では、酸素吸収環境は、酸素透過性層と、１つ以上の酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、酸素バリア層と、を含む、低酸素収集容器である。
【0070】
本開示はまた、幹細胞又は赤血球を貯蔵するための低酸素貯蔵容器を提供し、かつそれを含む。ある態様では、低酸素貯蔵容器は、酸素バリア層を含む。別の態様では、低酸素貯蔵容器は、酸素透過性層を囲む酸素バリア層を含む。別の態様では、低酸素貯蔵容器は、一方の側で血液製剤層と、他方の側で酸素吸着剤と接触する酸素透過性層と、酸素吸着剤及び酸素透過性層の両方を囲む酸素バリア層と、を含む。更に別の態様では、低酸素貯蔵容器は、酸素透過性層と、１つ以上の酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、酸素バリア層と、を含む。
【0071】
本開示はまた、酸素又は酸素及び二酸化炭素に対して実質的に不透過性である酸素バリア層を提供し、かつそれを含む。ある態様では、酸素バリアバッグは、可撓性フィルム材料から調製される。別の態様では、酸素バリア層は、剛性、又は非可撓性のフィルム材料から調製される。本明細書で提供される場合、酸素バリアという用語は、４２日間以上にわたって二酸化炭素の分圧の著しい増加を防ぐのに十分な、バリアの一方の側から他方の側への酸素の通過に対するバリアを提供する材料及び組成物を指す。
【0072】
別途指示がない限り、酸素バリアとは、酸素に対して実質的に不透過性である膜を指す。本明細書で使用される場合、実質的に酸素に対して不透過性であるとは、１日当たり約１．０ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素に対する透過性である。別の態様では、実質的に酸素に対して不透過性であるとは、１日当たり約０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素に対する透過性である。特定の態様では、酸素バリア層の調製における使用に好適な膜は、約０．１４０バーラー未満のバーラー値によって特徴付けられる材料である。本明細書で使用される場合、酸素バリア層はまた、二酸化炭素に対して実質的に不透過性である。二酸化炭素に対して実質的に不透過性な酸素バリア層とは、３ヶ月の期間にわたってレセプタクルの内側に１０ｃｃ以下の二酸化炭素、より好ましくは、６ヶ月の期間にわたって５ｃｃ以下の二酸化炭素を可能にする層を意味する。
【0073】
ガス不透過性バリアバッグを調製するための材料及び方法は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｇａｗｒｙｌ ｅｔ ａｌ．に発行された米国特許第７，０４１，８００号、及びＧｕｓｔａｆｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．に発行された米国特許第６，００７，５２９号、及びＭｃＤｏｒｍａｎによる米国特許出願公開第３０１３／０３２７６７７号を参照されたい。その各々は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。酸素吸収環境並びに低酸素収集及び貯蔵容器を調製するための材料及び方法はまた、当該技術分野において既知である。Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．に発行された米国特許第９，８０１，７８４号、Ｙｏｓｈｉｄａ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第１０，８４９，８２４号、及びＷｏｌｆ ｅｔ ａｌ．に対する米国特許第１０，０５８，０９１号を参照されたい。その各々は、参照により、それらの全体が本明細書に組み込まれる。不透過性材料は、当該技術分野において規定通りに使用され、任意の好適な材料が、使用され得る。成形ポリマーの場合、酸素及び二酸化炭素のバリア特性を強化するために、添加剤が規定通りに添加される。例えば、Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．に発行された米国特許第４，８３７，０４７号を参照されたい。例えば、Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．に発行された米国特許第７，４３１，９９５号は、酸素及び二酸化炭素の侵入に対して不透過性である、エチレンビニルアルコールコポリマー及び変性エチレンビニルアセテートコポリマーの層から構成される酸素及び二酸化炭素に対する不透過性受容体を記載する。別の態様では、ガス不透過性バリアバッグは、酸素及び二酸化炭素に対して不透過性である。
【0074】
特定の態様では、二酸化炭素、酸素、又は二酸化炭素及び酸素の両方に対して実質的に不透過性であるフィルムは、積層フィルムである。ある態様では、二酸化炭素、酸素、又は二酸化炭素及び酸素の両方に対して実質的に不透過性である積層フィルムは、積層箔フィルムである。フィルム材料は、箔及びポリマーの組み合わせである、ポリマー又は多層構造であり得る。ある態様では、積層フィルムは、アルミニウムで積層されたポリエステル膜である。酸素に対して実質的に不透過性である、積層箔としても既知である、好適なアルミニウム積層フィルムの例は、当該技術分野において既知である。例えば、Ｓｕｇｉｓａｗａの米国特許第４，７９８，７２８号は、ナイロン、ポリエチレン、ポリエステル、ポリプロピレン、及び塩化ビニリデンのアルミニウム積層箔を開示する。他の積層フィルムは、当該技術分野において既知である。例えば、Ｃｈｏｗ ｅｔ ａｌ．の米国特許第７，７１３，６１４号は、酸素に対して実質的に不透過性であるエチレン－ビニルアルコールコポリマー（ＥＶＯＨ）樹脂を含む、多層容器を開示する。ある態様では、ガス不透過性バリアバッグは、ヒートシールによって３つ又は４つの側面をシールすることによって構築されたバリアバッグである。バッグは、二酸化炭素及び酸素バリア特性の強化を提供する材料を含む、多層構造で構成される。バッグは、二酸化炭素及び酸素バリア特性の強化を提供する材料を含む、多層構造で構成される。かかる材料としては、０．０１ｃｃ／１００ｉｎ2／２４時間の酸素透過率を有するＲｏｌｌｐｒｉｎｔ Ｃｌｅａｒｆｏｉｌ（登録商標）Ｖ２フィルム、０．００４ｃｃ／１００ｉｎ2／２４時間の酸素透過率を有するＲｏｌｌｐｒｉｎｔ Ｃｌｅａｒｆｏｉｌ（登録商標）Ｘフィルム、及び０．０００８ｃｃ／１００ｉｎ2／２４時間の酸素透過率を有するＣｌｅａｒｆｏｉｌ（登録商標）Ｚフィルム（Ｒｏｌｌｐｒｉｎｔ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ａｄｄｉｓｏｎ，ＩＬ）が挙げられる。他の製造業者は、Ｒｅｎｏｌｉｔ Ｓｏｌｍｅｄ Ｗｒａｐｆｌｅｘ（登録商標）フィルム（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｎｏｌｉｔ Ｃｏｒｐ．、Ｃｉｔｙ ｏｆ Ｃｏｍｍｅｒｃｅ，ＣＡ）など、同様の酸素透過率を有する同様の製品を作製する。酸素に対して実質的に不透過性である、積層箔としても既知である、好適なアルミニウム積層フィルムの例は、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ Ｐａｃｋａｇｉｎｇ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｒｏｌｌｔｏｎ，ＴＸ）から取得可能である。
【0075】
本開示のある態様では、低酸素収集容器は、１３５０Ｐａ未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む。別の態様では、低酸素収集容器は、４００Ｐａ未満の二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ2）を含む。別の態様では、低酸素収集容器は、９９０～３０００Ｐａ、９９０～２５００Ｐａ、９９０～２０００Ｐａ、９９０～１５００Ｐａ、又は１０００～３０００Ｐａの分圧ｐＯ2を含む。本開示の別の態様では、低酸素収集容器は、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2を含む。
【0076】
別の態様では、低酸素貯蔵容器は、１３５０Ｐａ未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む。別の態様では、低酸素貯蔵容器は、４００Ｐａ未満の二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ2）を含む。別の態様では、低酸素貯蔵容器は、９９０～３０００Ｐａ、９９０～２５００Ｐａ、９９０～２０００Ｐａ、９９０～１５００Ｐａ、又は１０００～３０００Ｐａの分圧ｐＯ2を含む。本開示の別の態様では、低酸素貯蔵容器は、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2を含む。
【0077】
本開示は、血液製剤の低酸素収集及び幹細胞の単離のための方法を提供し、かつそれを含む。複数の態様では、血液製剤を低酸素収集容器に収集し、濾過して、幹細胞を単離し、濃縮する。幹細胞を、幹細胞又は幹細胞及び白血球フィルタを使用して単離する。図１に示す等張性培地を使用して、幹細胞を、フィルタから低酸素貯蔵バッグ又は低酸素幹細胞増殖容器へと溶出させる。ある態様では、等張性培地は、０．５ｍＭの塩化カルシウム、２５０～５００ｍＭのトレハロース、３％のデキストラン４０、又は３％のデキストラン７０のいずれかを含有する１ｍＭの硫酸マグネシウムを含む１０～３０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水を含み、２８０～３００ｍＯｓｍｏｌ／水ｋｇの張度を有する。ある態様では、等張性培地は、市販の培地であるＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（Ｂａｘｔｅｒ、Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，ＩＬ）、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．、Ｂｏｔｈｅｌｌ，ＷＡ）である。別の態様では、等張性培地は、１ｍＭのＮ－アセチルシステイン、１ｍＭのトロロックス水溶性ビタミンＥ、１ｍＭのビタミンＣ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される１つ以上の抗酸化剤を更に含む。別の態様では、等張性幹細胞培養培地は、１ｍＭのＮ－アセチルシステイン、１ｍＭのトロロックス水溶性ビタミンＥ、１ｍＭのビタミンＣ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される２つ以上の抗酸化剤を更に含む。
【0078】
別の態様では、本開示は、幹細胞溶出前に等張性培地を酸素と平衡化させることを提供する。
【0079】
本開示は、貯蔵又は移植のための幹細胞を処理するためのキットであって、低酸素収集容器と、白血球及び幹細胞の回収フィルタと、濾過された幹細胞が枯渇した血液製剤を収集するための第１の付属低酸素貯蔵容器と、幹細胞維持培地を含む第２の付属低酸素貯蔵容器と、を含むキットを提供し、且つそれを含む。本開示のある態様では、第２の付属低酸素貯蔵容器は、上述の白血球及び幹細胞の回復フィルタと流体連通している。別の態様では、キットは、１，４００Ｐａ未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む。別の態様では、白血球及び幹細胞のフィルタは、単一の組み合わせフィルタである。別の態様では、第１の付属低酸素貯蔵容器は、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、ガス透過性の内側の折りたたみ可能な容器と、外側レセプタクルと内側の折りたたみ可能な容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、外側レセプタクルを通り抜け、折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含む。別の態様では、キットは、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む。別の態様では、第２の付属低酸素貯蔵容器は、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、ガス透過性の内側の折りたたみ可能な容器と、外側レセプタクルと内側の折りたたみ可能な容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、外側レセプタクルを通り抜け、折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含む。別の態様では、低酸素収集及び貯蔵容器は、Ｈｅｍａｎｅｘｔ Ｉｎｃに対する国際公開第ＷＯ２０１６／１７２６４５号及び第ＷＯ２０１６／１４５２１０号において知られており、記載されるものが含まれ、これらの両方が参照により本明細書に組み込まれる。
【0080】
本開示は、移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグを少なくとも２５℃の温度にさらして、解凍した幹細胞を形成することと、解凍した幹細胞を遠心分離し、上清を除去することと、幹細胞を、３％のデキストラン４０を含む溶液に再懸濁させることと、を含む方法を提供し、かつそれを含む。別の態様では、本開示は、幹細胞を必要とする対象において移植のための幹細胞を調製するための方法であって、低酸素調製された幹細胞を解凍することと、上述の低酸素幹細胞増殖システムで、幹細胞を増殖させることと、を含み、増殖した幹細胞を、それを必要とする対象に移植することを含む、方法を提供し、かつそれを含む。別の態様では、合計で少なくとも１０4個のＨＳＣが、それを必要とする対象に移植される。更に別の態様では、合計で少なくとも１０5、１０6、１０7、１０8、又は１０9個のＨＳＣが、それを必要とする対象に移植される。
【0081】
別の態様では、幹細胞増殖システムは、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、内側の折りたたみ可能な容器と、外側レセプタクルと内側の折りたたみ可能な血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、外側レセプタクルを通り抜け、折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含む。別の態様では、幹細胞増殖システムは、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む制御された環境における幹細胞の３Ｄ培養を含む。更に別の態様では、システムは、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む制御された環境における幹細胞の２Ｄ培養を含む。
【0082】
本開示は、移植のための幹細胞を調製するための方法であって、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を収集することと、白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタを用いて、白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、幹細胞保持フィルタから幹細胞を溶出させることと、幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。
【0083】
別の態様では、本開示は、移植のための幹細胞を調製するための方法であって、凍結した低酸素幹細胞を含む低酸素貯蔵容器を３７℃にさらすことと、凍結した低酸素幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグを、上述の凍結した幹細胞を解凍して、解凍した幹細胞を生成するために、４２℃未満の水浴に浸漬することと、解凍した幹細胞を、２．５％（重量／体積）のヒトアルブミンを含有する等体積の低酸素溶液で希釈して、希釈した幹細胞を形成することと、を含む、方法を提供し、かつそれを含む。別の態様では、本開示は、解凍した幹細胞を、１～５％（重量／体積）のヒトアルブミンを含有する等体積の低酸素溶液で希釈して、希釈した幹細胞を形成することを提供する。別の態様では、低酸素溶液は、少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、及び５％（重量／体積）のヒトアルブミンを含有する。別の態様では、低酸素溶液は、１～２％、１～３％、１～４％、１～５％、２～３％、２～５％、２～４％を含有する。更に別の態様では、低酸素溶液は、５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３．０％未満、２．５％未満、２．０％未満、及び１．５％未満を含有する。更に別の態様では、低酸素溶液は、５％未満、４．５％未満、４％未満、３．５％未満、３．０％未満、２．５％未満、２．０％未満、及び１．５％未満を含有する。
【0084】
別の態様では、低酸素溶液は、５％のデキストラン４０を更に含む。別の態様では、幹細胞は、３７℃に１５～３０分間さらされる。別の態様では、凍結した幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグは、少なくとも３２℃の水浴に入れられる。更に別の態様では、幹細胞を調製するための方法は、希釈した幹細胞を遠心分離することと、上清を除去することと、を更に含む。別の態様では、本開示は、上述の解凍した幹細胞を、移植に適した体積になるまで、アルブミンデキストラン溶液で再懸濁させることを更に含む、移植のための幹細胞を調製するための方法を提供する。
【0085】
本開示のある態様では、低酸素収集容器、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、及び低酸素貯蔵容器は、１４００Ｐａ（１０ｍｍＨｇ）未満のｐＯ2を含むシステムの一部である。より具体的には、フィルタ、デバイス、溶液、及び他の成分は、低酸素状態に維持されるシステムの一部である。別の態様では、低酸素収集容器、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、及び低酸素貯蔵容器は、１３５０Ｐａ（１０ｍｍＨｇ）未満のｐＯ2を含むシステムの一部である。別の態様では、低酸素収集容器、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、及び低酸素貯蔵容器は、９９０～３０００Ｐａ、９９０～２５００Ｐａ、９９０～２０００Ｐａ、９９０～１５００Ｐａ、又は１０００～３０００ＰａのｐＯ2を含むシステム中にある。本開示の別の態様では、低酸素収集容器、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、及び低酸素貯蔵容器は、４００～２０００Ｐａ、５００～２０００Ｐａ、６００～２０００Ｐａ、７００～２０００Ｐａ、８００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、９００～２０００Ｐａ、１０００～２０００Ｐａ、１２００～２０００Ｐａ、１４００～２０００Ｐａ、１６００～２０００Ｐａ、１８００～２０００ＰａのｐＯ2を含むシステム中にある。
【0086】
ある態様では、本開示は、閉じた低酸素システム中の２つの付属低酸素貯蔵バッグに接続される低酸素収集バッグを提供する。ある態様では、本開示は、閉じたシステムにおいて遠心分離される相互接続されたバッグを提供する。別の態様では、相互接続されたバッグは、遠心分離され、上清は、取り付けられたバッグのうちの１つに現れる。
【0087】
本開示は、輸血のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含む血液製剤を収集することと、血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、幹細胞を、３０００Ｐａ未満のＯ2の低酸素環境で、ある温度で所定時間貯蔵することと、を含む、方法を提供する。本開示のある態様では、貯蔵期間は、少なくとも２、４、７、１０、１４、２１、又は２８日間である。別の態様では、白血球及び幹細胞は、本開示に記載されるように、白血球フィルタ、幹細胞回収フィルタ、又は白血球及び幹細胞の組み合わせ回収フィルタを使用して、血液製剤から分離する。別の態様では、幹細胞を、低酸素環境で貯蔵される前に、等張性培地を用いて、幹細胞回収フィルタ、又は白血球及び幹細胞の回収フィルタから溶出させる。別の態様では、低酸素環境は、本開示に提供されるような低酸素貯蔵容器である。別の態様では、血液製剤を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ２）透過性を特徴とするＯ2バリアと酸素吸着剤とを含む低酸素収集容器に収集する。別の態様では、低酸素収集容器は、２５バーラー未満の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む。低酸素収集容器中の血液製剤を、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が２０～６０％減少するまで、混合する。別の態様では、ｐＯ2は、８０～９５％減少する。別の態様では、ｐＯ2は、５０～９５％減少する。別の態様では、ｐＯ2は、７０～９５％減少する。別の態様では、ｐＯ2は、５０～９５％減少する。更なる態様では、幹細胞は、混合する前に血液製剤から分離される。
【0088】
本開示はまた、幹細胞が、低酸素貯蔵容器又は低酸素幹細胞増殖容器に収集する工程と集める工程との間に１時間を超えて正常酸素圧条件にさらされない方法を提供する。ある態様では、正常酸素圧条件は、少なくとも約１５７ｍｍＨｇ（又は２１，０００Ｐａ）の酸素の分圧を含む。
【0089】
本開示全体で提供される全ての参照文献は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【0090】
本開示は、以下の実施形態も提供する。
【0091】
実施形態１．幹細胞を必要とする患者への移植のための幹細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアと酸素吸着剤とを含む低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することと、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を混合することと、上述の血液製剤をフィルタに適用することを含む、上述の血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することであって、幹細胞及び白血球が、上述のフィルタ上に保持され、白血球及び幹細胞が枯渇した血液製剤を調製する、分離することと、等張性培地を用いて、上述のフィルタから上述の幹細胞を溶出させることと、
【0092】
上述の幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ2）透過性を特徴とするＯ2バリアを含む低酸素貯蔵容器に移し、上述の細胞を貯蔵して、低酸素貯蔵された幹細胞を調製することと、を含む、方法。
【0093】
実施形態２．上述の低酸素貯蔵容器に移す前又は後に、上述の幹細胞を低酸素幹細胞増殖容器に移すことと、上述の幹細胞を増殖させて、増殖した幹細胞集団を形成することと、を更に含む、実施形態１の方法。
【0094】
実施形態３．上述の増殖した幹細胞を、それを必要とする患者に移植することを更に含む、実施形態２の方法。
【0095】
実施形態４．上述の混合すること、分離すること、溶出させること、及び移すことが、各々、４００～２０００ＰａのｐＯ２下で行われる、実施形態１の方法。
【0096】
実施形態５．上述の混合することが、最大３時間にわたる、実施形態１の方法。
【0097】
実施形態６．上述の混合することが、上述の血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ2）が、少なくとも５０％減少するまでである、実施形態１の方法。
【0098】
実施形態７．上述の等張性培地が、少なくとも５３３３ＰａのｐＯ2を含む脱酸素等張性培地である、実施形態１の方法。
【0099】
実施形態８．上述の移すことが、上述の低酸素貯蔵容器内に直接溶出させることを含む、実施形態１の方法。
【0100】
実施形態９．上述の溶出させることが、５０～２００ｍＬの上述の等張性培地を含む、実施形態１の方法。
【0101】
実施形態１０．上述の等張性培地を、空気中の酸素と平衡化することを更に含む、実施形態１の方法。
【0102】
実施形態１１．上述の低酸素貯蔵容器が、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、折りたたみ可能な内側血液容器と、上述の外側レセプタクルと上述の折りたたみ可能な内側血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、上述の外側レセプタクルを通り抜け、上述の折りたたみ可能な容器と低酸素流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含み、上述の低酸素貯蔵容器が、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む、実施形態１の方法。
【0103】
実施形態１２．上述の血液製剤が、末梢血、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）、及び骨髄からなる群から選択される、実施形態１の方法。
【0104】
実施形態１３．上述の幹細胞が、血液細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、実施形態１の方法。
【0105】
実施形態１４．上述の低酸素収集容器が、抗凝固剤を含む、実施形態１の方法。
【0106】
実施形態１５．上述のフィルタが、白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタを含む、実施形態１の方法。
【0107】
実施形態１６．上述の血液製剤に含まれる赤血球が、上述のフィルタ上で上述の分離する間に、２０％、１５％、１０％、５％、１％又は０．０１％未満のＯ2の赤血球酸素飽和度（ｓＯ2）を含む、実施形態１の方法。
【0108】
実施形態１７．上述の低酸素収集容器、上述のフィルタ、及び上述の低酸素貯蔵容器が、１３５０Ｐａ未満のｐＯ2を含むシステム中にある、実施形態１の方法。
【0109】
実施形態１８．上述のフィルタが、６０００Ｐａ未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む低酸素条件下で維持される、実施形態１の方法。
【0110】
実施形態１９．上述の低酸素収集容器又は上述の低酸素貯蔵容器が、１３５０Ｐａ未満の酸素の分圧（ｐＯ2）を含む、実施形態１の方法。
【0111】
実施形態２０．上述の低酸素収集容器、上述の低酸素貯蔵容器、又は上述の低酸素容器及び上述の低酸素貯蔵容器の両方が、６０００Ｐａ未満の二酸化炭素の分圧（ｐＣＯ2）を含む、実施形態１の方法。
【0112】
実施形態２１．上述の白血球減少フィルタ及び上述の幹細胞保持フィルタが、白血球及び幹細胞の組み合わせフィルタである、実施形態１の方法。
【0113】
実施形態２２．上述の抗凝固剤が、クエン酸－リン酸デキストロース（ＣＰＤ）、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１）、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）、又はヘパリンである、実施形態１４の方法。
【0114】
実施形態２３．上述の低酸素収集容器が、上述のフィルタと流体連通し、上述のフィルタが、上述の低酸素貯蔵容器と流体連通し、上述の組み合わせが、１，４００Ｐａ未満のｐＯ2を含む、実施形態１の方法。
【0115】
実施形態２４．上述のフィルタが、幹細胞特異的モノクローナル抗体を含む、実施形態１５の方法。
【0116】
実施形態２５．上述の低酸素貯蔵された幹細胞が、１４００パスカル未満である酸素の分圧で維持される、実施形態１の方法。
【0117】
実施形態２６．上述の血液製剤中、上述の溶出された幹細胞中、上述の低酸素貯蔵された幹細胞中、又はそれらの組み合わせにおいて、有核細胞の総数を決定することを更に含む、実施形態１の方法。
【0118】
実施形態２７．上述の細胞の数を決定することが、上述の収集の後である、実施形態２６の方法。
【0119】
実施形態２８．上述の細胞の数を決定することが、上述の濾過の後である、実施形態２６又は２７の方法。
【0120】
実施形態２９．上述の溶出された幹細胞中の有核細胞の総数が、上述の血液製剤中の有核細胞の総数の少なくとも５０％を含む、実施形態２８の方法。
【0121】
実施形態３０．上述の幹細胞が、造血幹細胞（ＨＳＣ）である、実施形態１の方法。
【0122】
実施形態３１．上述の造血幹細胞が、ポリコーム群ＲＩＮＧフィンガータンパク質４（ＢＭＩ－１）、分化クラスター２１（ＣＤ２１）、分化クラスター２２（ＣＤ２２）、分化クラスター３４（ＣＤ３４）、分化クラスター３８（ＣＤ３８）、分化クラスター４１（ＣＤ４１）、分化クラスター４４（ＣＤ４４）、分化クラスター４５（ＣＤ４５）、分化クラスター４８（ＣＤ４８）、分化クラスター９０（ＣＤ９０、Ｔｈｙ１）、分化クラスター１０５（ＣＤ１０５）、分化クラスター１０６（ＣＤ１０６）、分化クラスター１１７（ＣＤ１１７、ｃ－ｋｉｔ）、分化クラスター１２７（ＣＤ１２７）、分化クラスター１５０（ＣＤ１５０）、ｃ－ｍｙｃ、内皮細胞プロテインｃ受容体（ＥＰＣＲ）、リンパ球抗原－６（Ｌｙ６Ａ／Ｅ、ｓｃａ－１）、ＭＹＢ、誘導性骨髄性白血病細胞分化タンパク質（Ｍｃｌ－１）、ホスファターゼ及びテンシンホモログ（ＰＴＥＮ）、Ｓｋｐ、キュリン、Ｆ－ｂｏｘ（ＳＣＦ、ｋｉｔリガンド）、転写の単一トランスデューサー及びアクチベーター５ａ（ＳＴＡＴ５ａ）、転写の単一トランスデューサー及びアクチベーター５ｂ（ＳＴＡＴ５ｂ）、及び血管内皮細胞増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）からなる群から選択される１つ以上の造血幹細胞マーカーを含む、実施形態３０の方法。
【0123】
実施形態３２．少なくとも１０4個の低酸素貯蔵された幹細胞を、それを必要とする上述の患者に移植することを更に含む、実施形態３０の方法。
【0124】
実施形態３３．上述の低酸素幹細胞増殖容器が、０．１５５～０．７平方メートル（ｍ2）の総表面積を含む、実施形態２の方法。
【0125】
実施形態３４．上述の低酸素幹細胞増殖容器が、０．１５５～０．３１ｍ2の総表面積を含む、実施形態３３の方法。
【0126】
実施形態３５．上述の低酸素幹細胞増殖容器が、マイクロキャリアビーズ及び幹細胞増殖培地を含む、実施形態３３の方法。
【0127】
実施形態３６．上述の幹細胞増殖培地が、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、アクチビンＡ、アクチビンＢ及びＴＧＦ－ベータ、ＶＥＧＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）、並びに幹細胞因子（ＳＣＦ）からなる群から選択される増殖因子を含む、実施形態３５の方法。
【0128】
実施形態３７．上述の幹細胞増殖容器が、６．６～７．８のｐＨを含む、実施形態３５の方法。
【0129】
実施形態３８．上述の幹細胞増殖培地が、レチノイン酸、アスコルビン酸、ホルモン、又は細胞内ｃＡＭＰ上昇剤、Ｆｌｔ－３リガンド、異なるサイトカイン及び増殖因子の組み合わせ（例えば、ＳＣＦ、Ｆｌｔ３、ＴＰＯ、ＩＬ－３、及びＩＬ－６）からなる群から選択される添加剤を含む、実施形態３５の方法。
【0130】
実施形態３９．上述の低酸素幹細胞増殖容器が、上述の増殖の間、標準的な温度及び圧力（ＳＴＰ）下で、３，０００パスカル（Ｐａ）未満である酸素の分圧で維持される、実施形態３３の方法。
【0131】
実施形態４０．上述の低酸素幹細胞増殖の間の上述のｐＯ２が、ＳＴＰ下で１，４００パスカル未満である酸素の分圧で維持される、実施形態３９の方法。
【0132】
実施形態４１．上述の幹細胞を増殖させることが、ＳＴＰ下で１，４００パスカル未満のｐＯ2を含む低酸素条件下で３～４日間の培養期間培養して、増殖した幹細胞集団を調製することを含む、実施形態３３の方法。
【0133】
実施形態４２．上述の低酸素幹細胞を増殖させることが、上述の幹細胞を３～１４倍に増加させる期間培養することを含む、実施形態４１の方法。
【0134】
実施形態４３．上述の増殖させることが、上述の低酸素幹細胞を増殖させて、少なくとも１０4個の細胞を含む集団を調製するのに十分な期間培養することを含む、実施形態４１の方法。
【0135】
実施形態４４．上述の増殖した幹細胞集団が、上述の増殖の後に、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも２倍の増加を含む、実施形態４１の方法。
【0136】
実施形態４５．上述の増殖した幹細胞集団が、上述の増殖の後に、ＣＤ３４＋細胞の少なくとも３倍の増加を含む、実施形態４４の方法。
【0137】
実施形態４６．上述の増殖した幹細胞集団が、５～１０％のＣＤ３４＋細胞を含む、実施形態４５の方法。
【0138】
実施形態４７．上述の増殖した幹細胞集団が、２、１、又は０．００５％未満のＣＤ４４＋細胞を含む、実施形態４１の方法。
【0139】
実施形態４８．上述の増殖した幹細胞集団１％未満のＣＤ９０＋細胞、実施形態４１の方法。
【0140】
実施形態４９．上述の貯蔵された幹細胞が、ＣＤ４４、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１６６、及びＳｔｒｏ－１からなる群から選択される１つ以上のマーカーを含む間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である、実施形態３３の方法。
【0141】
実施形態５０．上述の増殖した幹細胞集団が、９８％を超える生存率を含む、実施形態４１の方法。
【0142】
実施形態５１．上述の生存率が、トリパンブルー除外アッセイによって測定される、実施形態５０の方法。
【0143】
実施形態５２．上述の生存率が、７－アミノ－アクチノマイシンＤ（７－ＡＡＤ）の細胞除外によって測定される、実施形態５０の方法。
【0144】
実施形態５３．上述の低酸素貯蔵された幹細胞が、正常酸素圧条件下で収集され、貯蔵され、培養された幹細胞よりも大きな生存率を維持し、上述の正常酸素圧条件が、少なくとも約２１，０００パスカルの酸素の分圧を含む、実施形態１の方法。
【0145】
実施形態５４．輸血のための幹細胞を調製するための方法であって、
【0146】
幹細胞を含む血液製剤を収集することと、上述の血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、上述の幹細胞を、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素の酸素（Ｏ２）透過性を特徴とするＯ２バリアを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、上述の幹細胞を、３５００Ｐａ未満の酸素の分圧で、３７℃未満の温度で所定時間、低酸素環境で貯蔵することと、を含む、方法。
【0147】
実施形態５５．上述の低酸素貯蔵容器が、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、折りたたみ可能な内側血液容器と、上述の外側レセプタクルと上述の折りたたみ可能な内側血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、上述の外側レセプタクルを通り抜け、上述の折りたたみ可能な容器と低酸素流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含み、上述の組み合わせが、１，４００Ｐａ未満のｐＯ２を含む、実施形態５４の方法。
【0148】
実施形態５６．上述の血液製剤を収集することが、３０００Ｐａ未満である酸素の分圧を有する低酸素環境を含む、実施形態５４の方法。
【0149】
実施形態５７．上述の血液製剤が、末梢血、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）、及び骨髄からなる群から選択される、実施形態５４の方法。
【0150】
実施形態５８．上述の幹細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、実施形態５４の方法。
【0151】
実施形態５９．上述の分離することが、濃縮された幹細胞を調製するための遠心分離を含む、実施形態５４の方法。
【0152】
実施形態６０．上述の遠心分離の前又は後に、白血球を減少させることを更に含む、実施形態５９の方法。
【0153】
実施形態６１．上述の濃縮された幹細胞から上清を除去することと、上述の濃縮された幹細胞を低酸素幹細胞懸濁培地に再懸濁させることを更に含む、実施形態５９の方法。
【0154】
実施形態６２．上述の幹細胞懸濁培地を、トレハロース、マンニトール、スクロース、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン、グルコース、グリセロール、ポリビニルピロリドン、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、２－メチル－２，４－ペンタンジオール、ホルムアミド、グリセロール－３ホスフェート、プロリン、ソルビトール、ジエチルグリコール、トリエチレングリコール、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される凍結保護剤で希釈する、実施形態６１の方法。
【0155】
実施形態６３．上述の貯蔵することが、－８０℃で、又はおよそ－１９５．７９℃での液体窒素中である、実施形態６２の方法。
【0156】
実施形態６４．上述の少なくとも１つの入口／出口が、第１のチューブ、結合、及び第２のチューブを含む、酸素に対して実質的に不透過性である単一チューブを更に含み、上述の単一チューブが、少なくとも１つの酸素バリア層、及び少なくとも１つの血液適合性層を有するバリア横断チューブである、実施形態５４の方法。
【0157】
実施形態６５．移植のための幹細胞を調製するための方法であって、ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を収集することと、ＨＵＣＢを白血球減少フィルタ及び幹細胞保持フィルタに適用することによって、ＨＵＣＢから白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、上述の幹細胞保持フィルタから上述の幹細胞を溶出させることと、上述の幹細胞を低酸素貯蔵容器に移すことと、を含む、方法。
【0158】
実施形態６６．上述の等張性培地が、０．５ｍＭの塩化カルシウム、２５０～５００ｍＭのトレハロース、３％のデキストラン４０、又は３％のデキストラン７０のいずれかを含有する１ｍＭの硫酸マグネシウムを含む１０～３０ｍＭのリン酸緩衝化生理食塩水を含み、２８０～３００ｍＯｓｍｏｌ／水ｋｇの張度を有する、実施形態６５の方法。
【0159】
実施形態６７．上述の等張性培地が、１ｍＭのＮ－アセチルシステイン、１ｍＭのトロロックス水溶性ビタミンＥ、１ｍＭのビタミンＣ、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される抗酸化剤を更に含む、実施形態６６の方法。
【0160】
実施形態６８．上述の白血球減少フィルタ及び上述の幹細胞保持フィルタが、同じフィルタである、実施形態６５の方法。
【0161】
実施形態６９．上述の方法が、３５００Ｐａ未満の酸素の分圧で行われる、実施形態６５の方法。
【0162】
実施形態７０．移植のための幹細胞を処理するためのキットであって、低酸素収集容器と、白血球及び幹細胞の回復フィルタと、濾過された上清を収集するための第１の付属低酸素貯蔵容器と、幹細胞維持培地を含む第２の付属低酸素貯蔵容器と、を含み、上述の第２の付属低酸素貯蔵容器が、上述の白血球及び幹細胞の回復フィルタと流体連通しており、上述のキットが、１，４００パスカル（Ｐａ）未満の酸素の分圧（ｐＯ２）を含む、キット。
【0163】
実施形態７１．上述の白血球及び幹細胞のフィルタが、単一のフィルタである、実施形態７０のキット。
【0164】
実施形態７２．上述の第１の付属低酸素貯蔵容器が、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、内側の折りたたみ可能な血液容器と、上述の外側レセプタクルと上述の内側の折りたたみ可能な血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、上述の外側レセプタクルを通り抜け、上述の折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含み、上述の流体連通が、１，４００Ｐａ未満のｐＯ２を含む、実施形態７０のキット。
【0165】
実施形態７３．上述の第２の付属低酸素貯蔵容器が、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、内側の折りたたみ可能な血液容器と、上述の外側レセプタクルと上述の内側の折りたたみ可能な血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、上述の外側レセプタクルを通り抜け、上述の折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含む、実施形態７０の方法。
【0166】
実施形態７４．上述の第１及び第２の付属低酸素貯蔵容器が、メッシュ、成形マット、織布マット、不織布マット、オープンセルフォーム、ストランドベール、及びストランドマットからなる群から選択されるスペーサを更に含む、実施形態７０の方法。
【0167】
実施形態７５．移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵容器を３７℃にさらすことと、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む上述の低酸素貯蔵バッグを、上述の凍結した幹細胞を解凍して、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を生成するために、４２℃未満の水浴に浸漬することと、上述の解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を、２．５％（重量／体積）のヒトアルブミンを含有する等体積の低酸素溶液で希釈して、希釈した低酸素貯蔵された幹細胞を形成することと、を含む、方法。
【0168】
実施形態７６．上述の溶液が、５％のデキストラン４０を更に含む、実施形態７５の方法。
【0169】
実施形態７７．上述の水浴が、少なくとも３２℃である、実施形態７５の方法。
【0170】
実施形態７８．上述のさらすことが、１５～３０日間にわたる、実施形態７５の方法。
【0171】
実施形態７９．上述の希釈した幹細胞を遠心分離することと、上清を除去することと、を更に含む、実施形態７５の方法。
【0172】
実施形態８０．上述の解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を、移植に適した体積になるまで、アルブミンデキストラン溶液で再懸濁させることを更に含む、実施形態７５の方法。
【0173】
実施形態８１．上述の移植に適した体積が、１０～５０ミリリットル／キログラム（ｍＬ／ｋｇ）である、実施形態８０の方法。
【0174】
実施形態８２．移植のための幹細胞を調製する方法であって、凍結した低酸素貯蔵された幹細胞を含む低酸素貯蔵バッグを少なくとも２５℃にさらして、解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を形成することと、
【0175】
上述の解凍した低酸素貯蔵された幹細胞を遠心分離し、上清を除去することと、上述の低酸素貯蔵された幹細胞を、３％のデキストラン４０を含む溶液に再懸濁させることと、を含み、低酸素貯蔵バッグが、３５００Ｐａ未満の低酸素環境を含む、方法。
【0176】
実施形態８３．幹細胞を必要とする対象において移植のための幹細胞を調製するための方法であって、低酸素貯蔵された幹細胞を解凍することと、低酸素幹細胞増殖システムで上述の低酸素貯蔵された幹細胞を増殖させ、低酸素増殖した幹細胞を調製することと、
【0177】
上述の低酸素増殖した幹細胞を、それを必要とする上述の対象に移植することと、を含み、低酸素貯蔵バッグが、３５００Ｐａ未満の低酸素環境を含む、方法。
【0178】
実施形態８４．上述の低酸素幹細胞増殖システムが、酸素に対して実質的に不透過性の外側レセプタクルと、内側の折りたたみ可能な血液容器と、上述の外側レセプタクルと上述の内側の折りたたみ可能な血液容器との間に位置する酸素又は酸素及び二酸化炭素の吸着剤と、実質的に不透過性であり、上述の外側レセプタクルを通り抜け、上述の折りたたみ可能な容器と流体連通する少なくとも１つの入口／出口と、を含む、実施形態８３の方法。
【0179】
実施形態８５．上述の幹細胞増殖システムが、単回使用バイオリアクターバッグを含む、実施形態８３の方法。
【0180】
実施形態８６．上述の幹細胞増殖システムが、１，４００Ｐａ未満のｐＯ２を含む制御された環境における幹細胞の３Ｄ培養を含む、実施形態８３の方法。
【0181】
実施形態８７．上述のシステムが、１，４００Ｐａ未満のｐＯ２を含む制御された環境における幹細胞の２Ｄ培養を含む、実施形態８３の方法。
【0182】
実施形態８８．移植のための細胞を調製するための方法であって、幹細胞を含有する血液製剤を、低酸素収集容器を含む酸素吸収環境内に収集することであって、上述の低酸素収集容器が、１日当たり０．５ｃｃ／平方メートル未満の酸素のＯ２透過性を特徴とする酸素（Ｏ２）バリアと酸素吸着剤とを含む、収集することと、血液製剤の酸素の初期分圧（ｐＯ２）が８０～９５％減少するまで、血液製剤を混合することと、上述の血液製剤を幹細胞結合フィルタに適用して、白血球及び幹細胞が枯渇した血液製剤を調製することを含む、上述の血液製剤から白血球及び幹細胞を分離することと、等張性培地を用いて、上述のフィルタから上述の幹細胞を溶出させることと、上述の幹細胞を、２５バーラーより大きな酸素（Ｏ２）透過性を有し、低酸素貯蔵された幹細胞を形成する材料を含む内側細胞適合性バッグを含む低酸素貯蔵容器に移すことと、を含み、上述の幹細胞が、上述の収集することと上述の移すこととの間に１時間を超えて正常酸素圧条件にさらされず、上述の正常酸素圧条件が、少なくとも約２１，０００パスカルの酸素の分圧を含む、方法。
【0183】
実施形態８９．上述の分離することが、上述の混合することの前に行われる、実施形態８８の方法。
【実施例】
【0184】
実施例１：ヒト臍帯血の収集及び分析
約１５０ｍＬのＨＵＣＢを、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＵＳＡ）のプロトコルに従って、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１、１５０ｍＬのＨＵＣＢ当たり２１ｍＬの抗凝固剤）を含有する滅菌血液収集バッグに収集する。５０ミリリットル（５０ｍＬ）のアリコートを、Ａ、Ｂ、及びＣとラベル付けされたバッグに移す。バッグＡ、Ｂ、及びＣを線形血小板撹拌機に３時間置き、赤血球のヘモグロビン中の酸素飽和率を異なるレベルまで減少させる。バッグＡ中のＨＵＣＢは、８０～９０％の飽和酸素を有する、好気性貯蔵対照血液である。バッグＢ中のＨＵＣＢは、１０～２０％のＳＯ2を有する、低酸素貯蔵試料である。バッグＣ中のＨＵＣＢは、１～５％のＳＯ2を有する、低酸素貯蔵試料である。ＨＵＣＢの細胞成分（白血球、血小板及び赤血球）の濃度を、Ｓｙｓｍｅｘ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、赤血球のヘモグロビンの酸素飽和率（％ＳＯ2）を使用して測定する。酸素の分圧（ｍｍＨｇ単位でのＰＯ2）及び二酸化炭素の分圧（ＰＣＯ2）を、ＡＢＬ ９０ガスアナライザ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて測定する。
約１５０ｍＬのＨＵＣＢを、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（ＵＳＡ）のプロトコルに従って、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１、１５０ｍＬのＨＵＣＢ当たり２１ｍＬの抗凝固剤）を含有する滅菌血液収集バッグに収集する。５０ミリリットル（５０ｍＬ）のアリコートを、Ａ、Ｂ、及びＣとラベル付けされたバッグに移す。バッグＡ、Ｂ、及びＣを線形血小板撹拌機に３時間置き、赤血球のヘモグロビン中の酸素飽和率を異なるレベルまで減少させる。バッグＡ中のＨＵＣＢは、８０～９０％の飽和酸素を有する、好気性貯蔵対照血液である。バッグＢ中のＨＵＣＢは、１０～２０％のＳＯ2を有する、低酸素貯蔵試料である。バッグＣ中のＨＵＣＢは、１～５％のＳＯ2を有する、低酸素貯蔵試料である。ＨＵＣＢの細胞成分（白血球、血小板及び赤血球）の濃度を、Ｓｙｓｍｅｘ ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、赤血球のヘモグロビンの酸素飽和率（％ＳＯ2）を使用して測定する。酸素の分圧（ｍｍＨｇ単位でのＰＯ2）及び二酸化炭素の分圧（ＰＣＯ2）を、ＡＢＬ ９０ガスアナライザ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて測定する。
【0185】
バッグは、収集及び処理後の７６時間、室温で貯蔵される。臍帯血中のＨＳＣの品質、生存率、及び分化の分析のために、２４時間、３６時間、及び７２時間の貯蔵後に、バッグＡ、Ｂ、及びＣからアリコート（各１５ｍＬ）を除去する。
【0186】
実施例２：ヒト臍帯血中のＣＤ３４＋細胞のフローサイトメトリー分析
濾過前ＨＵＣＢ及び回収された細胞懸濁液中のＣＤ３４＋細胞の濃度を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＰｒｏＣｏｕｎｔチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた３色の直接免疫蛍光システムを備えたフローサイトメータ（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定する。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｐｒｏ－Ｃｏｕｎｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎキットは、ＣＤ３４＋試薬（バイアル「Ａ」）、対照試薬（バイアル「Ｂ」）及びＴｒｕＣｏｕｎｔチューブを含む。ＣＤ３４試薬は、以下の試薬の混合物を含有する。白血球及び有核赤血球を含む全ての有核細胞の検出を可能にする核酸染料、未成熟造血前駆細胞及びＨＵＣＢ中の全ての造血コロニー形成細胞上に存在するヒトＨＳＰＣを認識するフィコエリスリン（ＰＥ）標識されたマウスモノクローナルＣＤ３４抗体、非特異的染色又は事象を評価するためのアイソタイプ対照であるＩｇＧ１ＰＥ、並びに全ての白血球に存在し、造血細胞上に弱く発現するか、又は発現しないヒト白血球抗原を認識するペリジニンクロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）標識されたマウスモノクローナル抗体ＣＤ４５。ＰｒｏＣｏｕｎｔキットのバイアル「Ｂ」は、対照試薬であり、核酸染料、ＰＥ標識されたＩｇＧ１、ヒト細胞上に発現されないキーホールリムペットヘモシアニン抗原のみを認識するための非特異的染色又は事象を評価するためのアイソタイプ対照、及びＣＤ４５－ＰｅｒＣＰの混合物を含有する。
濾過前ＨＵＣＢ及び回収された細胞懸濁液中のＣＤ３４＋細胞の濃度を、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＰｒｏＣｏｕｎｔチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いた３色の直接免疫蛍光システムを備えたフローサイトメータ（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して測定する。Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｐｒｏ－Ｃｏｕｎｔ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌ Ｅｎｕｍｅｒａｔｉｏｎキットは、ＣＤ３４＋試薬（バイアル「Ａ」）、対照試薬（バイアル「Ｂ」）及びＴｒｕＣｏｕｎｔチューブを含む。ＣＤ３４試薬は、以下の試薬の混合物を含有する。白血球及び有核赤血球を含む全ての有核細胞の検出を可能にする核酸染料、未成熟造血前駆細胞及びＨＵＣＢ中の全ての造血コロニー形成細胞上に存在するヒトＨＳＰＣを認識するフィコエリスリン（ＰＥ）標識されたマウスモノクローナルＣＤ３４抗体、非特異的染色又は事象を評価するためのアイソタイプ対照であるＩｇＧ１ＰＥ、並びに全ての白血球に存在し、造血細胞上に弱く発現するか、又は発現しないヒト白血球抗原を認識するペリジニンクロフィルタンパク質（ＰｅｒＣＰ）標識されたマウスモノクローナル抗体ＣＤ４５。ＰｒｏＣｏｕｎｔキットのバイアル「Ｂ」は、対照試薬であり、核酸染料、ＰＥ標識されたＩｇＧ１、ヒト細胞上に発現されないキーホールリムペットヘモシアニン抗原のみを認識するための非特異的染色又は事象を評価するためのアイソタイプ対照、及びＣＤ４５－ＰｅｒＣＰの混合物を含有する。
【0187】
各ＨＵＣＢ試料について、２つのＴｒｕｅＣｏｕｎｔ（商標）チューブは、ＣＤ３４＋については「Ａ」（以下「Ａチューブ」）、対照についてはＢ（以下「Ｂチューブ」）とラベル付けされる。２０μｌのＣＤ３４＋試薬ＡをＡチューブに移し、２０μｌの対照試薬ＢをＢチューブに移す。５０μｌの十分に混合されたＨＵＣＢ試料（濾過前又はフィルタから回収のいずれか）が、Ａチューブ及びＢチューブの両方に添加される。チューブを穏やかにボルテックス撹拌し、試料を混合する。全ての試料を、暗所で室温（２２℃）で１５分間インキュベートする。試験試料は、カウントされた試料体積が外挿される内部標準として役立つ所定の数の蛍光性ビーズと組み合わされる。１５分後、４５０μｌのＦＡＣＳ（商標）溶解溶液をＡチューブ及びＢチューブの両方に添加する。チューブを、暗所で室温で３０分間インキュベートする。試料を、４８８ｎｍの励起波長、１５ｍＷで動作するアルゴンレーザを備えたＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）フローサイトメータ、及び自動データ取得及び分析のためのＢＤ ＰｒｏＣｏｕｎｔソフトウェア２．０を使用して、製造元のＬｙｓｅ／ｎｏ洗浄法に従って分析される。この機器は、ＦＡＣＳＣｏｍｐ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）ソフトウェアを使用して、標識されたビーズ（Ｃａｌｉｂｒｉｔｅ（商標）、Ｂｅｃｔｏｎ－Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を用いて毎日較正される。
【0188】
ＣＤ３４＋細胞の回収率は、以下の式を使用して計算される。
【数1】
【0189】
実施例３：造血クローン原性アッセイ及び細胞生存率
濾過前ＨＵＣＢ、及びＨＵＣＢ細胞の濾過後に回収された細胞を、１皿当たり３×１０4個及び１×１０5個の細胞の細胞濃度で、三重にコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイに配置する。細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）半固体マトリックス中で培養する。培養物を、正常酸素圧（２１％酸素）又は低酸素条件（５％酸素）のいずれかで１４日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。コロニーを、形態に基づいて採点する。このアッセイでは、前駆細胞集団が増殖し、認識可能な成熟細胞のコロニーを形成する。コロニーを生じさせるそれらの細胞は、ＣＦＣ又はＣＦＵと呼ばれ、ＣＦＵ－赤血球系（ＣＦＵ－Ｅ）、破裂形成単位－赤血球系、ＣＦＵ－顆粒球－マクロファージ、ＣＦＵ－顆粒球－赤血球－マクロファージ－巨核球として特定される。データは、各前駆細胞株についてカウントされた３×１０5個の細胞当たりのコロニー数として提示される。濾過前のＨＵＣＢ及び濾過後の回収された細胞懸濁液中の細胞の生存率は、トリパンブルー染料除外（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して評価される。合計１００個の細胞をカウントし、結果を、生細胞の数（染色されていない）を、カウントされた細胞の総数（染色された細胞及び染色されていない細胞）で割った生存率で表す。
濾過前ＨＵＣＢ、及びＨＵＣＢ細胞の濾過後に回収された細胞を、１皿当たり３×１０4個及び１×１０5個の細胞の細胞濃度で、三重にコロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイに配置する。細胞を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ（商標）半固体マトリックス中で培養する。培養物を、正常酸素圧（２１％酸素）又は低酸素条件（５％酸素）のいずれかで１４日間、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートする。コロニーを、形態に基づいて採点する。このアッセイでは、前駆細胞集団が増殖し、認識可能な成熟細胞のコロニーを形成する。コロニーを生じさせるそれらの細胞は、ＣＦＣ又はＣＦＵと呼ばれ、ＣＦＵ－赤血球系（ＣＦＵ－Ｅ）、破裂形成単位－赤血球系、ＣＦＵ－顆粒球－マクロファージ、ＣＦＵ－顆粒球－赤血球－マクロファージ－巨核球として特定される。データは、各前駆細胞株についてカウントされた３×１０5個の細胞当たりのコロニー数として提示される。濾過前のＨＵＣＢ及び濾過後の回収された細胞懸濁液中の細胞の生存率は、トリパンブルー染料除外（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して評価される。合計１００個の細胞をカウントし、結果を、生細胞の数（染色されていない）を、カウントされた細胞の総数（染色された細胞及び染色されていない細胞）で割った生存率で表す。
【0190】
実施例４：幹細胞の低酸素調製及び貯蔵
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＹＢＣ－ＮＣＢＰ）の標準的なプロトコルに従って、約６０～９０ミリリットル（ｍＬ）のヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）をドナーから収集し、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１）を含有する滅菌血液収集バッグに収集する。ＨＵＣＢは、収集から２４時間以内に、ＮＣＢＰ施設で受領される。ＨＵＣＢの細胞成分（白血球、血小板、及び赤血球）の濃度を、Ｓｙｓｍｅｘ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して測定する。赤血球のヘモグロビンの酸素飽和率（％ＳＯ2）、酸素の分圧（ｍｍＨｇ単位でのＰＯ2）、及び二酸化炭素の分圧（ＰＣＯ2）を、ＡＢＬ９０ガスアナライザ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて測定する。
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｂｌｏｏｄ Ｐｒｏｇｒａｍ（ＮＹＢＣ－ＮＣＢＰ）の標準的なプロトコルに従って、約６０～９０ミリリットル（ｍＬ）のヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）をドナーから収集し、クエン酸－リン酸－デキストロース－アデニン１（ＣＰＤＡ－１）を含有する滅菌血液収集バッグに収集する。ＨＵＣＢは、収集から２４時間以内に、ＮＣＢＰ施設で受領される。ＨＵＣＢの細胞成分（白血球、血小板、及び赤血球）の濃度を、Ｓｙｓｍｅｘ ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｓｙｓｍｅｘ Ａｍｅｒｉｃａ、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を使用して測定する。赤血球のヘモグロビンの酸素飽和率（％ＳＯ2）、酸素の分圧（ｍｍＨｇ単位でのＰＯ2）、及び二酸化炭素の分圧（ＰＣＯ2）を、ＡＢＬ９０ガスアナライザ（Ｒａｄｉｏｍｅｔｅｒ、Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用いて測定する。
【0191】
ＨＵＣＢの約２０～３０ｍＬのアリコートを、Ａ（受領時に３０～９０％のＳＯ2での対照好気性貯蔵）、Ｂ（低酸素貯蔵、１０～２０％のＳＯ2）、及びＣ（低酸素貯蔵、０～１０％のＳＯ2）とラベル付けされた滅菌バッグに移す。バッグＢ及びＣ内のＨＵＣＢ中に存在する赤血球は、それぞれ、１０～２０％のＳＯ2及び０～１０％のＳＯ2になるまで脱酸素化される。適切なレベルの％ＳＯ2になるまでの脱酸化から２４時間後及び４８時間後、各試料を、造血クローン原性アッセイ（ＣＦＵ）、生存率アッセイについて試験する。ＣＤ４５＋及びＣＤ３４＋細胞の生存率をフローサイトメトリー及び７－ＡＡＤ除外により評価する）
【0192】
実施例５：幹細胞の低酸素調製及び貯蔵
データの平均及び標準偏差を、統計プログラムＰｒｉｓｍ（Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して計算する。測定されたパラメータの差は、対応ありデータ及び対応なしデータについての両側スチューデントｔ検定によって分析され、０．０５未満の確率レベルが有意であると考えられる。０日目（３時間処理の直前及び直後）、及び処理の２４、３６及び７６時間後に、各貯蔵条件について合計２０個のＨＵＣＢを試験する（Ｎ＝２０）。
データの平均及び標準偏差を、統計プログラムＰｒｉｓｍ（Ｉｎｔｕｉｔｉｖｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して計算する。測定されたパラメータの差は、対応ありデータ及び対応なしデータについての両側スチューデントｔ検定によって分析され、０．０５未満の確率レベルが有意であると考えられる。０日目（３時間処理の直前及び直後）、及び処理の２４、３６及び７６時間後に、各貯蔵条件について合計２０個のＨＵＣＢを試験する（Ｎ＝２０）。
【0193】
実施例６：濾過技術を用いた幹細胞の低酸素収集及び濃縮
ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を、患者から収集し、血液の凝固又は幹細胞の凝集を防止するために、クエン酸－リン酸デキストロース抗凝固剤を含む低酸素収集バッグ（Ａ）に直接収集する。低酸素収集バッグは、濾過された流体を収集するための二次バッグに取り付けられた幹細胞保持フィルタに取り付けられる。ＨＵＣＢは、酸素を枯渇させ、図１によって提供されるように、白血球及び幹細胞を捕捉するための白血球減少フィルタで濾過される。流出物は、低酸素貯蔵バッグ（Ｂ）内に収集される。濃縮された幹細胞は、幹細胞を含有するフィルタを１００ｍＬの等張性幹細胞培養培地で流すことによって回収される。幹細胞は、逆行位置で、フィルタの上流の幹細胞維持培地を含有する低酸素貯蔵バッグ（Ｃ）へと洗い流される（図１）。
ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）を、患者から収集し、血液の凝固又は幹細胞の凝集を防止するために、クエン酸－リン酸デキストロース抗凝固剤を含む低酸素収集バッグ（Ａ）に直接収集する。低酸素収集バッグは、濾過された流体を収集するための二次バッグに取り付けられた幹細胞保持フィルタに取り付けられる。ＨＵＣＢは、酸素を枯渇させ、図１によって提供されるように、白血球及び幹細胞を捕捉するための白血球減少フィルタで濾過される。流出物は、低酸素貯蔵バッグ（Ｂ）内に収集される。濃縮された幹細胞は、幹細胞を含有するフィルタを１００ｍＬの等張性幹細胞培養培地で流すことによって回収される。幹細胞は、逆行位置で、フィルタの上流の幹細胞維持培地を含有する低酸素貯蔵バッグ（Ｃ）へと洗い流される（図１）。
【0194】
実施例７：遠心分離を使用した幹細胞の低酸素収集及び濃縮
ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）、末梢血、骨髄穿刺液、又はリポアスピレートを、低酸素システム内の２つの付属低酸素貯蔵バッグに接続される低酸素収集バッグに収集する。低酸素収集バッグ内の血液製剤を遠心分離して幹細胞を濃縮する。上清を除去し、幹細胞を幹細胞維持培地に再懸濁させる。幹細胞を、低酸素貯蔵バッグに最長３日間貯蔵し、依然として嫌気性貯蔵バッグ内にある間に、移植のために適切な用量に調整し、次いで、患者に直接移植する。あるいは、幹細胞を凍結保護剤で希釈し、－８０℃で液体窒素中に貯蔵する。
ヒト臍帯血（ＨＵＣＢ）、末梢血、骨髄穿刺液、又はリポアスピレートを、低酸素システム内の２つの付属低酸素貯蔵バッグに接続される低酸素収集バッグに収集する。低酸素収集バッグ内の血液製剤を遠心分離して幹細胞を濃縮する。上清を除去し、幹細胞を幹細胞維持培地に再懸濁させる。幹細胞を、低酸素貯蔵バッグに最長３日間貯蔵し、依然として嫌気性貯蔵バッグ内にある間に、移植のために適切な用量に調整し、次いで、患者に直接移植する。あるいは、幹細胞を凍結保護剤で希釈し、－８０℃で液体窒素中に貯蔵する。
【0195】
実施例８：単離された前駆細胞の低酸素増殖
幹細胞を、まず、適切な体積の抗凝固剤を含有する低酸素貯蔵バッグに収集する。実施例６又は７に記載されるように、幹細胞を単離し、濃縮する。次いで、ＨＳＣを、低酸素貯蔵条件下でＨＳＣを増殖させるために、嫌気性貯蔵バッグから市販の増殖バッグ（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＷＡＶＥバイオリアクタ、Ｔｅｒｕｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に移す。増殖倍率は、３～４日間にわたって３～１４倍の範囲であり、細胞生存率は、９８％を超えている。
幹細胞を、まず、適切な体積の抗凝固剤を含有する低酸素貯蔵バッグに収集する。実施例６又は７に記載されるように、幹細胞を単離し、濃縮する。次いで、ＨＳＣを、低酸素貯蔵条件下でＨＳＣを増殖させるために、嫌気性貯蔵バッグから市販の増殖バッグ（例えば、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ ＷＡＶＥバイオリアクタ、Ｔｅｒｕｍｏ Ｑｕａｎｔｕｍ Ｃｅｌｌ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ）に移す。増殖倍率は、３～４日間にわたって３～１４倍の範囲であり、細胞生存率は、９８％を超えている。
【0196】
増殖した幹細胞の懸濁液を遠心分離によって濃縮する。上清を除去し、幹細胞を幹細胞維持溶液に再懸濁させる。幹細胞懸濁液は、依然として嫌気性貯蔵バッグ内にある間に、移植のために適切な用量に調整される。あるいは、幹細胞懸濁液を適切な凍結保護剤で希釈し、次いで－８０℃で液体窒素（ＬＮ）中に貯蔵する。
【0197】
実施例９：単離された前駆細胞の低酸素増殖
実施例６又は７に記載されるように、幹細胞を収集し、単離し、濃縮する。単離された幹細胞を、低酸素貯蔵バッグから、マイクロキャリアビーズ／足場及び幹細胞増殖培地を含む一体的に取り付けられた低酸素バッグに移す。幹細胞を３～４日間にわたって増殖させる。次いで、幹細胞の懸濁液を遠心分離によって濃縮する。上清を除去し、幹細胞を幹細胞維持溶液に再懸濁させる。幹細胞懸濁液は、依然として嫌気性貯蔵バッグ内にある間に、移植のために適切な用量に調整されるか、又は適切な凍結保護剤で希釈し、－８０℃で、又は液体窒素中に貯蔵する。
実施例６又は７に記載されるように、幹細胞を収集し、単離し、濃縮する。単離された幹細胞を、低酸素貯蔵バッグから、マイクロキャリアビーズ／足場及び幹細胞増殖培地を含む一体的に取り付けられた低酸素バッグに移す。幹細胞を３～４日間にわたって増殖させる。次いで、幹細胞の懸濁液を遠心分離によって濃縮する。上清を除去し、幹細胞を幹細胞維持溶液に再懸濁させる。幹細胞懸濁液は、依然として嫌気性貯蔵バッグ内にある間に、移植のために適切な用量に調整されるか、又は適切な凍結保護剤で希釈し、－８０℃で、又は液体窒素中に貯蔵する。
【0198】
実施例１０：凍結した幹細胞懸濁液の解凍及び低酸素事前調整
実施例８又は９に従って調製された凍結したＨＳＣを、冷凍庫から取り出し、約１５分間気相にさらす。次いで、ＨＳＣを周囲の空気に５分間さらして、低酸素貯蔵バッグに、ある程度の弾力性を取り戻させる。低酸素貯蔵バッグを、急速解凍のために３７℃の水浴に浸漬する。解凍後、幹細胞を、等張性溶液中の２．５％（重量／体積）のヒトアルブミン及び５％のデキストラン４０を含有する等体積の溶液で希釈する。上清を遠心分離によって除去し、沈降した幹細胞をアルブミン／デキストラン溶液にゆっくりと再懸濁させ、移植のために適切な体積及び用量にする。
実施例８又は９に従って調製された凍結したＨＳＣを、冷凍庫から取り出し、約１５分間気相にさらす。次いで、ＨＳＣを周囲の空気に５分間さらして、低酸素貯蔵バッグに、ある程度の弾力性を取り戻させる。低酸素貯蔵バッグを、急速解凍のために３７℃の水浴に浸漬する。解凍後、幹細胞を、等張性溶液中の２．５％（重量／体積）のヒトアルブミン及び５％のデキストラン４０を含有する等体積の溶液で希釈する。上清を遠心分離によって除去し、沈降した幹細胞をアルブミン／デキストラン溶液にゆっくりと再懸濁させ、移植のために適切な体積及び用量にする。
【図1】
【図2】
【国際調査報告】