特表 2024-510210 モグロシドの生合成

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-06

(54)【発明の名称】モグロシドの生合成

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/12 20060101AFI20240228BHJP

   C12N 15/52 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240228BHJP

   C12P 19/44 20060101ALI20240228BHJP

   C12P 15/00 20060101ALI20240228BHJP

   C12N 9/00 20060101ALI20240228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/52 Z

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/63 Z

C12P19/44

C12P15/00

C12N9/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】有

(21)【出願番号】P 2023555541

(86)(22)【出願日】2022-03-11

(85)【翻訳文提出日】2023-11-06

(86)【国際出願番号】 US2022019977

(87)【国際公開番号】W WO2022192688

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】63/160,712

(32)【優先日】2021-03-12

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516286741

【氏名又は名称】ギンゴー バイオワークス， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100106518

【弁理士】

【氏名又は名称】松谷 道子

(74)【代理人】

【識別番号】100122301

【弁理士】

【氏名又は名称】冨田 憲史

(74)【代理人】

【識別番号】100157956

【弁理士】

【氏名又は名称】稲井 史生

(74)【代理人】

【識別番号】100170520

【弁理士】

【氏名又は名称】笹倉 真奈美

(74)【代理人】

【識別番号】100221545

【弁理士】

【氏名又は名称】白江 雄介

(72)【発明者】

【氏名】ベッカー，ディビーナ

(72)【発明者】

【氏名】ボーバー，ヨーゼフ

(72)【発明者】

【氏名】ガーディン，ジャスティン マイケル

(72)【発明者】

【氏名】マクマホン，マシュー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AB05

4B064AF42

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA10

4B065AA01X

4B065AA72X

4B065AA80X

4B065AA88X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA05

4B065CA19

4B065CA41

4B065CA60

(57)【要約】

本明細書に記載されるのは、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドを産生する方法に関与するタンパク質および宿主細胞である。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該宿主細胞が、該異種ポリヌクレオチドを含まない対照宿主細胞よりも多くのモグロールを産生でき、そしてここで、該ＣＢ５が、
ａ）アミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；
ｂ）アミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；
ｃ）アミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）；および／または
ｄ）アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＥであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＰまたはＨであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＡまたはＳであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＤまたはＮであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＰまたはＨであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＳまたはＲであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＮであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＦであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＥであり；および／または
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＡまたはＩである］
を含む、宿主細胞。

【請求項2】

該ＣＢ５が、
ａ）アミノ酸配列Ｘ₁Ｘ₂Ｘ₃Ｘ₄Ｘ₅Ｘ₆Ｘ₇ＥＸ₈ＩＸ₉Ｘ₁₀ＹＴＧＬＳＰＸ₁₁Ｘ₁₂ＦＦＴＸ₁₃ＬＡＸ₁₄Ｘ₁₅Ｘ₁₆Ｘ₁₇ＶＸ₁₈Ｘ₁₉Ｘ₂₀Ｘ₂₁ＳＸ₂₂Ｘ₂₃ＦＸ₂₄Ｘ₂₅Ｘ₂₆Ｘ₂₇Ｘ₂₈Ｘ₂₉Ｘ₃₀Ｘ₃₁（配列番号５０）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＬまたはＶであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＹまたはＷであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＷまたはＥであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＴであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＡまたはＬであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＭまたはＫであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＱまたはＡであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＡまたはＶであり；
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＷまたはＡであり；
（ｘｉ）Ｘ_１１はアミノ酸ＴまたはＡであり；
（ｘｉｉ）Ｘ_１２はアミノ酸ＡまたはＴであり；
（ｘｉｉｉ）Ｘ_１３はアミノ酸ＩまたはＶであり；
（ｘｉｖ）Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＬであり；
（ｘｖ）Ｘ_１５はアミノ酸ＭまたはＧであり；
（ｘｖｉ）Ｘ_１６はアミノ酸ＩまたはＬであり；
（ｘｖｉｉ）Ｘ_１７はアミノ酸ＦまたはＡであり；
（ｘｖｉｉｉ）Ｘ_１８はアミノ酸ＦまたはＹであり；
（ｘｉｘ）Ｘ_１９はアミノ酸ＱまたはＹであり；
（ｘｘ）Ｘ_２０はアミノ酸ＭまたはＶであり；
（ｘｘｉ）Ｘ_２１はアミノ酸ＶまたはＩであり；
（ｘｘｉｉ）Ｘ_２２はアミノ酸ＳまたはＧであり；
（ｘｘｉｉｉ）Ｘ_２３はアミノ酸ＭまたはＦであり；
（ｘｘｉｖ）Ｘ_２４はアミノ酸ＶまたはＧであり；
（ｘｘｖ）Ｘ_２５はアミノ酸ＳまたはＴであり；
（ｘｘｖｉ）Ｘ_２６はアミノ酸ＰまたはＳであり；
（ｘｘｖｉｉ）Ｘ_２７はアミノ酸ＥまたはＤであり；
（ｘｘｖｉｉｉ）Ｘ_２８はアミノ酸ＥまたはＹであり；
（ｘｘｉｘ）Ｘ_２９はアミノ酸ＦまたはＧであり；
（ｘｘｘ）Ｘ_３０はアミノ酸ＮまたはＳであり；および／または
（ｘｘｘｉ）Ｘ_３１はアミノ酸ＫまたはＨである］；
ｂ）アミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＰまたはＡであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＶまたはＩであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＩまたはＬであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＳまたはＴであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＫまたはＲであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＡであり；
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＳまたはＰであり；
（ｘｉ）Ｘ_１１はアミノ酸ＫまたはＮであり；
（ｘｉｉ）Ｘ_１２はアミノ酸ＱまたはＳであり；および／または
（ｘｉｉｉ）Ｘ_１３はアミノ酸ＳまたはＧである］；および／または
ｃ）アミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＬであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＭまたはＬであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＫであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＥまたはＰであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＥであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＬまたはＩであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＤまたはＮであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＥであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＧまたはＳであり；
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＰまたはＥであり；
（ｘｉ）Ｘ_１１はアミノ酸ＦまたはＥであり；
（ｘｉｉ）Ｘ_１２はアミノ酸ＥまたはＶであり；
（ｘｉｉｉ）Ｘ_１３はアミノ酸ＡまたはＩであり；
（ｘｉｖ）Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＥであり；
（ｘｖ）Ｘ_１５はアミノ酸ＴまたはＥであり；および／または
（ｘｖｉ）Ｘ_１６はアミノ酸ＶまたはＬである］
を含む、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項3】

該ＣＢ５が次のアミノ酸配列：
ａ）QVWETLKEAIVAYTGLSPATFFTVLALGLAVYYVISGFFGTSDYGSH（配列番号５８）またはELYWKAMEQIAWYTGLSPTAFFTILASMIFVFQMVSSMFVSPEEFNK（配列番号５９）；
ｂ）PVQVGEISEEELKQYDGSDSKKPLLMAIKGQIYDVSQSRMF（配列番号６０）または
AVQIGQLTEQQLRAYDGSDPNKPLLMAIKGQIYDVSSGRMF（配列番号６１）；
ｃ）LAKMSFEEKDLTGDISGLGPFELEALQDWEYKFMSKYVKVGTV（配列番号６２）または
LALLSFKPEDITGNIEGLSEEELVILQDWEYKFMEKYVKVGEL（配列番号６３）；および
ｄ）KPAEDGPSESQAD（配列番号６４）またはEHSENGHRNFEID（配列番号６５）
の１以上を含む、請求項１または２に記載の宿主細胞。

【請求項4】

該ＣＢ５が
ａ）配列番号１における１６～２１位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；
ｂ）配列番号１における８５～９９位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および／または
ｃ）配列番号１における１４８～１５６位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）
を含む、請求項１に記載の宿主細胞。

【請求項5】

該ＣＢ５が、配列番号１の１９０～２０２位に対応する残基の位置にアミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）を含む、請求項１または３に記載の宿主細胞。

【請求項6】

該ＣＢ５が
ａ）配列番号１における４～５０位に対応する残基の位置にアミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＥＸ_８ＩＸ_９Ｘ_１０ＹＴＧＬＳＰＸ_１１Ｘ_１２ＦＦＴＸ_１３ＬＡＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＳＸ_２２Ｘ_２３ＦＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号５０）、
ｂ）配列番号１の６４～１０４位に対応する残基の位置にアミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）；および／または
ｃ）配列番号１の１２３～１６５位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）
を含む、請求項２または請求項３に記載の宿主細胞。

【請求項7】

該ＣＢ５が次の領域：
ａ）配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；
ｂ）配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域；および／または
ｃ）配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域
の１以上において、最高で１つのヒスチジンを含む、請求項１～６の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項8】

該ＣＢ５が
ａ）配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；
ｂ）配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域；および／または
ｃ）配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域
において、ヒスチジン残基を含まない、請求項７に記載の宿主細胞。

【請求項9】

該ＣＢ５が、配列番号１、３および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１～８の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項10】

該ＣＢ５が配列番号１～３および３１８の何れかの配列を含む、請求項９に記載の宿主細胞。

【請求項11】

該異種ポリヌクレオチドが、配列番号１１～１４、２２～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１～１０の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項12】

該異種ポリヌクレオチドが配列番号１１～１４、２２～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかの配列を含む、請求項１１に記載の宿主細胞。

【請求項13】

シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該ＣＢ５が、配列番号１～１０および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含み、そしてここで、該宿主細胞がモグロールを産生できる、宿主細胞。

【請求項14】

該ＣＢ５が配列番号１～１０および３１８の何れかの配列を含む、請求項１３に記載の宿主細胞。

【請求項15】

シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該ＣＢ５が、配列番号１～４および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含み、そしてここで、該宿主細胞が、該異種ポリヌクレオチドを含まない対照宿主細胞よりも多くのモグロールを産生できる、宿主細胞。

【請求項16】

シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該異種ポリヌクレオチドが配列番号１１～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含み、そしてここで、該宿主細胞がモグロールを産生できる、宿主細胞。

【請求項17】

該異種ポリヌクレオチドが配列番号１１～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかの配列を含む、請求項１６に記載の宿主細胞。

【請求項18】

シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ここで、該ＣＢ５が
ａ）アミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；
ｂ）アミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；
ｃ）アミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／または
ｄ）アミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）
を含み、そしてここで、該宿主細胞が、該異種ポリヌクレオチドを含まない対照宿主細胞よりも多くのモグロールを産生できる、宿主細胞。

【請求項19】

該ＣＢ５が
ａ）配列番号４の２３～３７位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；
ｂ）配列番号４の５３～７０位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；
ｃ）配列番号４の１６８～１７５位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／または
ｄ）配列番号４の２０３～２２２位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）
を含む、請求項１８に記載の宿主細胞。

【請求項20】

該ＣＢ５が、配列番号４と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１８または１９に記載の宿主細胞。

【請求項21】

該ＣＢ５が配列番号４を含む、請求項２０に記載の宿主細胞。

【請求項22】

該異種ポリヌクレオチドが、配列番号１５と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項１８～２１の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項23】

該異種ポリヌクレオチドが配列番号１５を含む、請求項２２に記載の宿主細胞。

【請求項24】

該宿主細胞が、１３．５ｍｇ／Ｌを超えるモグロールを産生できる、請求項１～２３の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項25】

該宿主細胞が、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素、ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、エポキシドヒドロラーゼ（ＥＰＨ）、ラノステロールシンターゼおよびスクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）の１以上をコードする１以上の異種ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１～２４の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項26】

該ＵＧＴ酵素が、配列番号１２１と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５に記載の宿主細胞。

【請求項27】

該ＣＤＳ酵素が、配列番号２２６、配列番号２３５および配列番号２３２の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５または２６に記載の宿主細胞。

【請求項28】

該Ｃ１１ヒドロキシラーゼが、配列番号２８０～２８１、３０５、３１５および３２４の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５～２７の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項29】

該シトクロムＰ４５０レダクターゼが、配列番号２８２～２８３および３０６～３０７の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５～２８の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項30】

該ＥＰＨが、配列番号２８４～２９２および３０９～３１０の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５～２９の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項31】

該ＳＱＥが、配列番号２９３～２９５、３１２または３２８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５～３０の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項32】

該ラノステロールシンターゼが、配列番号３２９または３３６と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５～３１の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項33】

該ＳＱＥが、配列番号３１２または３２８と少なくとも９０％同一である配列を含む、請求項２５～３２の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項34】

該宿主細胞が酵母細胞、植物細胞または細菌細胞である、請求項１～３３の何れかに記載の宿主細胞。

【請求項35】

該宿主細胞が酵母細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。

【請求項36】

該酵母細胞がサッカロマイセス・セレビシエである、請求項３５に記載の宿主細胞。

【請求項37】

該酵母細胞がヤロウイア・リポリティカ細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。

【請求項38】

該宿主細胞が細菌細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。

【請求項39】

該細菌細胞が大腸菌細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。

【請求項40】

請求項１～３９の何れかに記載の宿主細胞を培養することを含む、モグロールを産生する方法。

【請求項41】

請求項１～３９の何れかに記載の宿主細胞を培養することを含む、モグロシドを産生する方法。

【請求項42】

該モグロシドが、モグロシドＩ－Ａ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩＥ（ＭＩＥ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩ）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ（ＭＩＶ）、モグロシドＩＶａ（ＭＩＶＡ）、イソモグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥ）、モグロシドＶ（ＭＶ）および／またはモグロシドＶＩ（ＭＶＩ）から選択される、請求項４０または４１に記載の方法。

【請求項43】

請求項１～３９の何れかに記載の宿主細胞を含む、モグロールまたはモグロシドを産生するバイオリアクター。

【請求項44】

配列番号１１～１４、２２～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む非天然型ポリヌクレオチド。

【請求項45】

該ポリヌクレオチドが、配列番号１～１０および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含むシトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする、請求項４４に記載の非天然型ポリヌクレオチド。

【請求項46】

請求項４４または４５に記載の非天然型ポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

発明の分野
本発明は、組み換え細胞におけるモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドの産生に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１２日出願の「BIOSYNTHESIS OF MOGROSIDES」なる名称の米国仮出願６３／１６０，７１２に基づく35 U.S.C. § 119(e)下の利益を主張し、その全開示を、全体として引用により本明細書に包含させる。

【0003】

ＥＦＳ－ＷＥＢによりテキストファイルとして提出した配列表の記載
本出願は、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介してASCII形式で提供した配列表を含み、ここにその全体を引用により包含させる。ＡＳＣＩＩファイルは２０２２年３月１１日に作成し、G091970076WO00-SEQ-FL.TXTなる名称であり、６８６，９２２バイトサイズである。

【背景技術】

【0004】

背景
モグロシドは、ククルビタン誘導体の配糖体である。甘味料および糖代替物として高度に需要がある、モグロシドは、シライチア・グロスベノリイ（Ｓｉｒａｉｔｉａ ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）（ラカンカ）を含む食物果実で天然に合成されている。抗癌、抗酸化および抗炎症性質はモグロシドに帰属するとされているが、モグロシド生合成に関与する正確なタンパク質の特徴づけは限られている。さらに、果実からのモグロシド抽出は大きな労働力を要し、モグロシドの構造の複雑さが、デノボ化学合成をしばしば妨げている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0005】

概要
本発明の態様は、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に有用な宿主細胞ならびに方法を提供する。ある実施態様において、該宿主細胞はシトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、該宿主細胞は、該異種ポリヌクレオチドを含まない対照宿主細胞よりも多くのモグロールを産生でき、そしてここで、該ＣＢ５は、アミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；アミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；アミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）；および／またはアミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＥであり；Ｘ_２はアミノ酸ＰまたはＨであり；Ｘ_３はアミノ酸ＡまたはＳであり；Ｘ_４はアミノ酸ＤまたはＮであり；Ｘ_５はアミノ酸ＰまたはＨであり；Ｘ_６はアミノ酸ＳまたはＲであり；Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＮであり；Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＦであり；Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＥであり；および／またはＸ_１０はアミノ酸ＡまたはＩである。

【0006】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＥＸ_８ＩＸ_９Ｘ_１０ＹＴＧＬＳＰＸ_１１Ｘ_１２ＦＦＴＸ_１３ＬＡＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＳＸ_２２Ｘ_２３ＦＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号５０）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＥもしくはＱであり；Ｘ_２はアミノ酸ＬもしくはＶであり；Ｘ_３はアミノ酸ＹもしくはＷであり；Ｘ_４はアミノ酸ＷもしくはＥであり；Ｘ_５はアミノ酸ＫもしくはＴであり；Ｘ_６はアミノ酸ＡもしくはＬであり；Ｘ_７はアミノ酸ＭまたはＫであり；Ｘ_８はアミノ酸ＱもしくはＡであり；Ｘ_９はアミノ酸ＡもしくはＶであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＷもしくはＡであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＴもしくはＡであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＡもしくはＴであり；Ｘ_１３はアミノ酸ＩもしくはＶであり；Ｘ_１４はアミノ酸ＳもしくはＬであり；Ｘ_１５はアミノ酸ＭもしくはＧであり；Ｘ_１６はアミノ酸ＩもしくはＬであり；Ｘ_１７はアミノ酸ＦもしくはＡであり；Ｘ_１８はアミノ酸ＦもしくはＹであり；Ｘ_１９はアミノ酸ＱもしくはＹであり；Ｘ_２０はアミノ酸ＭもしくはＶであり；Ｘ_２１はアミノ酸ＶもしくはＩであり；Ｘ_２２はアミノ酸ＳもしくはＧであり；Ｘ_２３はアミノ酸ＭもしくはＦであり；Ｘ_２４はアミノ酸ＶもしくはＧであり；Ｘ_２５はアミノ酸ＳもしくはＴであり；Ｘ_２６はアミノ酸ＰもしくはＳであり；Ｘ_２７はアミノ酸ＥもしくはＤであり；Ｘ_２８はアミノ酸ＥもしくはＹであり；Ｘ_２９はアミノ酸ＦもしくはＧであり；Ｘ_３０はアミノ酸ＮもしくはＳであり；および／もしくはＸ_３１はアミノ酸ＫもしくはＨである；アミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＰもしくはＡであり；Ｘ_２はアミノ酸ＶもしくはＩであり；Ｘ_３はアミノ酸ＥもしくはＱであり；Ｘ_４はアミノ酸ＩもしくはＬであり；Ｘ_５はアミノ酸ＳもしくはＴであり；Ｘ_６はアミノ酸ＥもしくはＱであり；Ｘ_７はアミノ酸ＥもしくはＱであり；Ｘ_８はアミノ酸ＫもしくはＲであり；Ｘ_９はアミノ酸ＱもしくはＡであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＳもしくはＰであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＫもしくはＮであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＱもしくはＳであり；および／もしくはＸ_１３はアミノ酸ＳもしくはＧである；ならびに／またはアミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＫもしくはＬであり；Ｘ_２はアミノ酸ＭもしくはＬであり；Ｘ_３はアミノ酸ＥもしくはＫであり；Ｘ_４はアミノ酸ＥもしくはＰであり；Ｘ_５はアミノ酸ＫもしくはＥであり；Ｘ_６はアミノ酸ＬもしくはＩであり；Ｘ_７はアミノ酸ＤもしくはＮであり；Ｘ_８はアミノ酸ＳもしくはＥであり；Ｘ_９はアミノ酸ＧもしくはＳであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＰもしくはＥであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＦもしくはＥであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＥもしくはＶであり；Ｘ_１３はアミノ酸ＡもしくはＩであり；Ｘ_１４はアミノ酸ＳもしくはＥであり；Ｘ_１５はアミノ酸ＴもしくはＥであり；および／もしくはＸ_１６はアミノ酸ＶもしくはＬである。

【0007】

ある実施態様において、ＣＢ５は、次のアミノ酸配列：QVWETLKEAIVAYTGLSPATFFTVLALGLAVYYVISGFFGTSDYGSH（配列番号５８）またはELYWKAMEQIAWYTGLSPTAFFTILASMIFVFQMVSSMFVSPEEFNK（配列番号５９）；PVQVGEISEEELKQYDGSDSKKPLLMAIKGQIYDVSQSRMF（配列番号６０）またはAVQIGQLTEQQLRAYDGSDPNKPLLMAIKGQIYDVSSGRMF（配列番号６１）；LAKMSFEEKDLTGDISGLGPFELEALQDWEYKFMSKYVKVGTV（配列番号６２）またはLALLSFKPEDITGNIEGLSEEELVILQDWEYKFMEKYVKVGEL（配列番号６３）；およびKPAEDGPSESQAD（配列番号６４）またはEHSENGHRNFEID（配列番号６５）の１以上を含む。

【0008】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１における１６～２１位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；配列番号１における８５～９９位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および／または配列番号１における１４８～１５６位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）を含む。

【0009】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１の１９０～２０２位に対応する残基の位置にアミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）を含む。

【0010】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１の４～５０位に対応する残基の位置にアミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＥＸ_８ＩＸ_９Ｘ_１０ＹＴＧＬＳＰＸ_１１Ｘ_１２ＦＦＴＸ_１３ＬＡＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＳＸ_２２Ｘ_２３ＦＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号５０）；配列番号１の６４～１０４位に対応する残基の位置にアミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）；および／または配列番号１の１２３～１６５位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）を含む。

【0011】

ある実施態様において、ＣＢ５は、次の領域：配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域；および／または配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域の１以上において、最高で１つのヒスチジンを含む。

【0012】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域；および／または配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域において、ヒスチジン残基を含まない。

【0013】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１～３および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１～３および３１８の何れかの配列を含む。

【0014】

ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１１～１４、２２～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１１～１４、２２～２４、３１６～３１７、および３３０～３３１の何れかの配列を含む。

【0015】

本発明のさらなる態様は、シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関し、ここで、該ＣＢ５は、配列番号１～１０および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含み、そしてここで、該宿主細胞は、モグロールを産生できる。

【0016】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１～１０および３１８の何れかの配列を含む。

【0017】

本発明のさらなる態様は、シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ここで、該ＣＢ５は、配列番号１～４および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含み、そしてここで、該宿主細胞は、該異種ポリヌクレオチドを含まない対照宿主細胞よりも多くのモグロールを産生できる。

【0018】

本発明のさらなる態様は、シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ここで、該異種ポリヌクレオチドは、配列番号１１～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含み、そしてここで、該宿主細胞は、モグロールを産生できる。

【0019】

ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１１～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかの配列を含む。

【0020】

本発明のさらなる態様は、シトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ここで、該ＣＢ５は、アミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；アミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；アミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／またはアミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）を含み、そしてここで、該宿主細胞は、該異種ポリヌクレオチドを含まない対照宿主細胞よりも多くのモグロールを産生できる。

【0021】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号４の２３～３７位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；配列番号４の５３～７０位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；配列番号４の１６８～１７５位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／または配列番号４の２０３～２２２位の対応する残基の位置にアミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）を含む。

【0022】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号４と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0023】

ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号４を含む。

【0024】

ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１５と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0025】

ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１５を含む。

【0026】

ある実施態様において、宿主細胞は、１３．５ｍｇ／Ｌを超えるモグロールを産生できる。

【0027】

ある実施態様において、宿主細胞は、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素、ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、エポキシドヒドロラーゼ（ＥＰＨ）、ラノステロールシンターゼおよびスクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）の１以上をコードする１以上の異種ポリヌクレオチドをさらに含む。ある実施態様において、ＵＧＴ酵素は、配列番号１２１と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は、配列番号２２６、配列番号２３５および配列番号２３２の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、配列番号２８０～２８１、３０５、３１５および３２４の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、配列番号２８２～２８３および３０６～３０７の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、ＥＰＨは、配列番号２８４～２９２および３０９～３１０の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、ＳＱＥは、配列番号２９３～２９５、３１２または３２８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0028】

ある実施態様において、ラノステロールシンターゼは、配列番号３２９または３３６と少なくとも９０％同一である配列を含む。ある実施態様において、ＳＱＥは、配列番号３１２または３２８と少なくとも９０％同一である配列を含む。

【0029】

ある実施態様において、宿主細胞は酵母細胞、植物細胞または細菌細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は酵母細胞である。ある実施態様において、該酵母細胞はサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）細胞またはヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。ある実施態様において、宿主細胞は細菌細胞である。ある実施態様において、該細菌細胞は大腸菌細胞である。

【0030】

本発明のさらなる態様は、モグロールを産生する方法であって、本発明の宿主細胞の何れかを培養することを含む方法に関する。

【0031】

本発明のさらなる態様は、モグロシドを産生する方法であって、本発明の宿主細胞の何れかを培養することを含む方法に関する。

【0032】

ある実施態様において、モグロシドは、モグロシドＩ－Ａ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩＥ（ＭＩＥ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩ）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ（ＭＩＶ）、モグロシドＩＶａ（ＭＩＶＡ）、イソモグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥ）、モグロシドＶ（ＭＶ）および／またはモグロシドＶＩ（ＭＶＩ）から選択される。

【0033】

本発明のさらなる態様は、モグロールまたはモグロシドを産生するバイオリアクターに関し、ここで、該バイオリアクターは、本発明の宿主細胞の何れかを含む。

【0034】

本発明のさらなる態様は、配列番号１１～１４、２２～２４、３１６～３１７および３３０～３３１の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含む非天然型ポリヌクレオチドに関する。ある実施態様において、ポリヌクレオチドは、配列番号１～１０および３１８の何れかと少なくとも９０％同一である配列を含むシトクロムｂ５（ＣＢ５）をコードする。

【0035】

本発明のさらなる態様は、本発明の非天然型ポリヌクレオチドの何れかを含む発現ベクターに関する。

【0036】

本発明の限定の各々は、種々の本発明の実施態様を含み得る。それ故に、要素の何れか一つまたは複数要素の組み合わせを含む本発明の限定の各々が、本発明の各態様に包含され得ると見込まれる。この発明は、以下に記載されまたは図面において説明される、構成の詳細および要素の配置にその適用は限定されない。本発明は、他の実施態様が可能であり、種々の方法で実施または実行されることが可能である。

【0037】

添付する図面は、正確な比率であることは意図しない。図面は説明のためのみであり、本発明の実施可能性に必要なものではない。明確にする目的で、全ての図面に全ての要素がラベルされていない可能性がある。図面は次のとおりである。

【図面の簡単な説明】

【0038】

【図1A】図１Ａ～１Ｄは、推定されるモグロール生合成経路の図式的概略を示す。ＳＱＳはスクアレンシンターゼを示し、ＥＰＤはエポキシダーゼを示し、Ｐ４５０はＣ１１ヒドロキシラーゼを示し、ＥＰＨはエポキシドヒドロラーゼを示し、ＣＤＳはククルビタジエノールシンターゼを示す。図１Ａおよび図１Ｂは、推定されるモグロール生合成経路を示す。図１Ｃは、一次ＵＧＴ活性の非限定的例を示す。図１Ｄは、二次ＵＧＴ活性の非限定的例を示す。

【図1B】同上。

【図1C】同上。

【図1D】同上。

【図2A】図２Ａ～２Ｂは、実施例１に記載のようにスクリーニングされたライブラリーに含まれた、モグロシド生合成に関与する候補タンパク質を含む株によるモグロール産生を示すグラフである。親株６６９８８９は、候補タンパク質を含まない対照ベース株(control base strain)である。図２Ａは、スクリーニングでの結果を全ての株に関して示すグラフである。図２Ｂは、シトクロムｂ５（ＣＢ５）を含む株によるモグロール産生を示すグラフである。

【図2B】同上。

【図3A】図３Ａ～３Ｂは、ヤロウイア・リポリティカ株によるモグロール産生を示すグラフである。図３Ａは、配列番号１に対応する配列を有するＣＢ５タンパク質を発現するヤロウイア・リポリティカ株（株９９４３７５）かまたは配列番号３１８に対応する配列を有する、同じＣＢ５タンパク質の切断型を発現するヤロウイア・リポリティカ株（株９３４９０３）によるモグロール産生を示すグラフである。株９７４１３７は、何れのラカンカ（Ｓ．ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）シトクロムｂ５タンパク質も欠き、陰性対照として使用された。図３Ｂは、配列番号１（株１３３８４８８）、配列番号２（株１３３８４８９）、配列番号３（株１３３８４９０）に対応する配列を有するＣＢ５タンパク質を発現するヤロウイア・リポリティカ株によるモグロール産生を示すグラフである。株１４１９５９６は、何れのラカンカシトクロムｂ５タンパク質も欠き、陰性対照として使用された。

【図3B】同上。

【発明を実施するための形態】

【0039】

詳細な記載
モグロシドは、例えば、飲料において、天然甘味料として広く使用されている。しかしながら、デノボ合成および天然源からのモグロシド抽出にはしばしば高い製造費と低収量が伴う。本発明は、モグロール（または１１，２４，２５－トリヒドロキシククルビタジエノール）、モグロシドおよびその前駆体を効率的に産生するよう操作された宿主細胞を提供する。方法は、ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）酵素、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素、エポキシドヒドロラーゼ（ＥＰＨ）酵素、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）酵素またはこれらの組み合わせの異種発現を含む。実施例１および２は、シトクロムｂ５（ＣＢ５）を含む、モグロール産生を増加させるタンパク質の同定および機能的特徴づけを記載する。本発明に記載のタンパク質および宿主細胞は、モグロール、モグロシドおよびその前駆体の製造に使用され得る。

【0040】

モグロールおよびモグロシドの合成
図１Ａ～１Ｂは、推定されるモグロール合成経路を示す。経路における初期工程は、スクアレンから２，３－オキシドスクアレンへの変換を含む。図１Ａに示すとおり、２，３－オキシドスクアレンをまずククルビタジエノールに環化し、続いてエポキシ化して２４，２５－エポキシククルビタジエノールを形成できるかまたは２，３－オキシドスクアレンを２，３，２２，２３－ジオキシドスクアレンにエポキシ化し、次いで２４，２５－エポキシククルビタジエノールに環化し得る。次に、２４，２５－エポキシククルビタジエノールを、エポキシド加水分解、次いで酸化または酸化、次いでエポキシド加水分解の後にモグロール（モグロシドのアグリコン）に変換し得る。図１Ｂに示すとおり、２，３－オキシドスクアレンをまずククルビタジエノールに環化し、次いでシトクロムＰ４５０ Ｃ１１ヒドロキシラーゼにより１１－ヒドロキシククルビタジエノールに変換し得る。次いで、シトクロムＰ４５０ Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、１１－ヒドロキシククルビタジエノールを１１－ヒドロキシ－２４，２５－エポキシククルビタジエノールに変換し得る。１１－ヒドロキシ－２４，２５－エポキシククルビタジエノールは、エポキシドヒドロラーゼによりモグロールに変換され得る。Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、シトクロムＰ４５０レダクターゼと共に働く（図１Ａ～１Ｂに示していない）。

【0041】

モグロールは、Ｃ３、Ｃ１１、Ｃ２４およびＣ２５での酸素化により、他のククルビタントリテルペノイド類と区別され得る。モグロールの、例えばＣ３および／またはＣ２４のグリコシル化により、モグロシドが形成され得る。

【0042】

モグロール前駆体は、スクアレン、２－３－オキシドスクアレン、２，３，２２，２３－ジオキシドスクアレン、ククルビタジエノール、２４，２５－エポキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－２４，２５－エポキシククルビタジエノール、１１－ヒドロキシ－ククルビタジエノール、１１－オキソ－ククルビタジエノールおよび２４，２５－ジヒドロキシククルビタジエノールを含むが、これらに限定されない。用語「ジオキシドスクアレン」を使用して、２，３，２２，２３－ジエポキシスクアレンまたは２，３，２２，２３－ジオキシドスクアレンを言い得る。用語「２，３－エポキシスクアレン」は、用語「２－３－オキシドスクアレン」と相互交換可能に使用され得る。本明細書で使用する、モグロシド前駆体はモグロール前駆体、モグロールおよびモグロシドを含む。

【0043】

モグロシドの例は、モグロシドＩ－Ａ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩＥ（ＭＩＥまたはＭ１Ｅ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１またはＭ２Ａ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２またはＭ２Ａ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１またはＭ３Ａ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥまたはＭ２Ｅ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩまたはＭ３）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ（ＭＩＶまたはＭ４）、モグロシドＩＶａ（ＭＩＶＡまたはＭ４Ａ）、イソモグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥまたはＭ３Ｅ）、モグロシドＶ（ＭＶまたはＭ５）およびモグロシドＶＩ（ＭＶＩまたはＭ６）を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、産生されるモグロシドは、Ｓｉａｍと称され得るシアメノシドＩである。ある実施態様において、産生されるモグロシドはＭＩＩＩＥである。特に断らない限り、用語「Ｍ１」、「ＭＩ」、「Ｍ２」、「ＭＩＩ」、「Ｍ３」、「ＭＩＩＩ」、「Ｍ４」、「ＭＩＶ」、「ＭＶ」、「Ｍ５」、「Ｍ６」および「ＭＶＩ」は、複数で使用する場合、各々、モグロシドの１クラスに関する。非限定的例として、Ｍ２またはＭＩＩは、ＭＩＩＡ１、ＭＩＩＡ、ＭＩＩＡ２および／またはＭＩＩＥを含み得る。

【0044】

他の実施態様において、モグロシドは、式１

【0045】

【化1】

の化合物である。

【0046】

ある実施態様において、本明細書に記載する方法は、ＵＳ２０１９／００７１７０５（米国特許第１１，０６０，１２４号明細書として付与）、に開示の化合物１～２０を含み、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載され、引用により本明細書に包含される化合物の何れかを産生するのに使用され得る。ある実施態様において、本明細書に記載する方法は、ＵＳ２０１９／００７１７０５に開示の化合物１～２０のバリアントを含み、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載され、引用により本明細書に包含される化合物のバリアントの何れかを産生するのに使用され得る。例えば、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物における１以上のアルファ－グリコシル結合の、１以上のベータ－グリコシル結合への置換を含み得る。ある実施態様において、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物における１以上のベータ－グリコシル結合の、１以上のアルファ－グリコシル結合での置換を含む。ある実施態様において、ＵＳ２０１９／００７１７０５に記載の化合物のバリアントは、上記式１の化合物である。

【0047】

ある実施態様において、本明細書に記載の１以上のタンパク質（例えば、シトクロムｂ５（ＣＢ５）、ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素、ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）酵素、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素、エポキシドヒドロラーゼ酵素（ＥＰＨ）、スクアレンエポキシダーゼ酵素（ＳＱＥ）および／または本発明と関連する何れかのタンパク質）を含む宿主細胞は、少なくとも０．００５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０２ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０３ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０４ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０６ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０７ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０８ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０９ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．２ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．３ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．４ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．５ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．６ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．７ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．８ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．９ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、少なくとも２ｍｇ／Ｌ、少なくとも３ｍｇ／Ｌ、少なくとも４ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６ｍｇ／Ｌ、少なくとも７ｍｇ／Ｌ、少なくとも８ｍｇ／Ｌ、少なくとも９ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１１ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２ｍｇ／Ｌ、少なくとも１３ｍｇ／Ｌ、少なくとも１４ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１６ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７ｍｇ／Ｌ、少なくとも１８ｍｇ／Ｌ、少なくとも１９ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２１ｍｇ／Ｌ、少なくとも２２ｍｇ／Ｌ、少なくとも２３ｍｇ／Ｌ、少なくとも２４ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２６ｍｇ／Ｌ、少なくとも２７ｍｇ／Ｌ、少なくとも２８ｍｇ／Ｌ、少なくとも２９ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３１ｍｇ／Ｌ、少なくとも３２ｍｇ／Ｌ、少なくとも３３ｍｇ／Ｌ、少なくとも３４ｍｇ／Ｌ、少なくとも３５ｍｇ／Ｌ、少なくとも３６ｍｇ／Ｌ、少なくとも３７ｍｇ／Ｌ、少なくとも３８ｍｇ／Ｌ、少なくとも３９ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも４１ｍｇ／Ｌ、少なくとも４２ｍｇ／Ｌ、少なくとも４３ｍｇ／Ｌ、少なくとも４４ｍｇ／Ｌ、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ、少なくとも４６ｍｇ／Ｌ、少なくとも４７ｍｇ／Ｌ、少なくとも４８ｍｇ／Ｌ、少なくとも４９ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５１ｍｇ／Ｌ、少なくとも５２ｍｇ／Ｌ、少なくとも５３ｍｇ／Ｌ、少なくとも５４ｍｇ／Ｌ、少なくとも５５ｍｇ／Ｌ、少なくとも５６ｍｇ／Ｌ、少なくとも５７ｍｇ／Ｌ、少なくとも５８ｍｇ／Ｌ、少なくとも５９ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも６１ｍｇ／Ｌ、少なくとも６２ｍｇ／Ｌ、少なくとも６３ｍｇ／Ｌ、少なくとも６４ｍｇ／Ｌ、少なくとも６５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６６ｍｇ／Ｌ、少なくとも６７ｍｇ／Ｌ、少なくとも６８ｍｇ／Ｌ、少なくとも６９ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８５ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも３５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも４５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも４７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８，０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９，０００ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１０，０００ｍｇ／Ｌの１以上のモグロシドおよび／またはモグロシド前駆体を産生できる。ある実施態様において、モグロシドは、モグロシドＩ－Ａ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩＥ（ＭＩＥもしくはＭ１Ｅ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１もしくはＭ２Ａ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２もしくはＭ２Ａ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１もしくはＭ３Ａ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥもしくはＭ２Ｅ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩもしくはＭ３）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ（ＭＩＶもしくはＭ４）、モグロシドＩＶａ（ＭＩＶＡもしくはＭ４Ａ）、イソモグロシドＩＶ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥもしくはＭ３Ｅ）、モグロシドＶ（ＭＶもしくはＭ５）またはモグロシドＶＩ（ＭＶＩもしくはＭ６）である。

【0048】

シトクロムｂ５（ＣＢ５）
本発明の態様は、モグロール産生の促進に有用であり得るシトクロムｂ５（ＣＢ５）タンパク質を提供する。本明細書で使用する「シトクロムｂ５」または「ＣＢ５」は、脂質結合ドメインまたはシトクロムｂ５様ヘム結合ドメインを含むタンパク質に関する。ある実施態様において、脂質結合ドメインは、ステロイド結合ドメインである。

【0049】

ＣＢ５タンパク質は、ヘムまたは脂質結合タンパク質である。例えば、ＣＢ５は、ステロイド結合タンパク質であり得る。あるものは、電子輸送および酵素レドックス反応と関連付けられている。ＣＢ５タンパク質は、一般に、保存されたＣＢ５ドメイン（例えば、シトクロムｂ５様ヘムまたはステロイド結合ドメイン）を持つ。ＣＢ５ドメインの三次構造は、高度に保存されており、ドメインは、ベータシートの各々の側にある２つの疎水性残基コアの周りに折り畳まれる。任意の理論に拘束されることは望まないが、一方の疎水性コアは、ヘムまたは脂質結合ドメインを含み得、他方の疎水性コアは、適切な立体配座の形成を促進し得る。ある実施態様において、脂質結合ドメインは、ステロイド結合ドメインである。

【0050】

特定の理論に拘束されることなく、ＣＢ５がヘム内の鉄と相互作用するには２つのヒスチジン残基が必要であり得て、それらの保存されたヒスチジン残基を含まないＣＢ５は、ヘム結合ドメインの代わりに脂質結合ドメイン（例えば、ステロイド結合ドメイン）を含み得る。ある実施態様において、モグロール産生を増加できるＣＢ５は、配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域、および／または配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域において、２つのヒスチジン残基を含まない。ある実施態様において、モグロール産生を増加できるＣＢ５は、配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域、および／または配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域において、最高で１つのヒスチジンを含む。ある実施態様において、モグロール産生を増加できるＣＢ５は、配列番号１の６４～１０４位に対応する領域；配列番号１の１０５～１２２位に対応する領域、および／または配列番号１の１２３～１６５位に対応する領域において、ヒスチジン残基を含まない。

【0051】

ＣＢ５ドメインの非限定的例は、Ｐｆａｍ登録番号ＰＦ００１７３に提供される。ＣＢ５ドメインは、そのタンパク質の構造の大半を形成し得る。例えば、配列番号１～３または３１８参照。ある実施態様において、脂肪酸デサチュラーゼおよび／またはＦＭＮ依存性デヒドロゲナーゼなどのさらなるドメインも存在する。

【0052】

ＣＢ５タンパク質は、レドックス反応の電子伝達成分として使用され得る。例えば、ＣＢ５は、酸化反応における絶対電子供与体(obligate electron donor)として機能し得る。ある実施態様において、ＣＢ５は、シトクロムＰ４５０（例えば、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ）の電子送達相手として使用される。ある実施態様において、ＣＢ５は、ＮＡＤＰＨからシトクロムＰ４５０酵素（例えば、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ）への電子伝達を触媒または促進する。

【0053】

ある実施態様において、ＣＢ５は、モグロール産生を促進するアロステリックの役割を果たす。非限定的例として、ＣＢ５は、Ｐ４５０酵素活性を支持するために、ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール様分子の結合および配置に関与し得る。ある実施態様において、ＣＢ５は、Ｐ４５０酵素と立体的に相互作用して、ＣＢ５自身が直接に酵素的役割を有すことなしに、より高い活性を促進する酵素立体配座を支持する。

【0054】

酵素レドックス反応の率は、ある期間にわたる産物濃度の変化の決定を含む、何れかの適切な方法により評価され得る。質量分析法を含む、何れかの適切な方法は、基質または産物の存在を測定するために使用され得る。例えば、Schenkman et al., Pharmacology & Therapeutics 97 (2003) 139- 152; Gou et al., Plant Cell. 2019 Jun;31(6):1344-1366；Ｉｎｔｅｒｐｒｏ登録番号ＩＰＲ００１１９９；Ｉｎｔｅｒｐｒｏ登録番号ＩＰＲ０１８５０６；Lederer Biochimie. 1994;76(7):674-92；ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ３３２４１５；ＵｎｉＰｒｏｔ登録番号Ｐ４０３１２も参照。

【0055】

ある実施態様において、ＣＢ５は、２００～３００アミノ酸長（例えば、２１０～２９０アミノ酸長、２０５～２１５アミノ酸長または２７５～２９５アミノ酸長）である。

【0056】

ある実施態様において、本発明のＣＢ５は、配列番号１～２４、３１６～３１８、３３０～３３１の何れかまたは本明細書に開示するもしくは当分野で知られる何れかのＣＢ５配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）を含む。ある実施態様において、本発明のＣＢ５は、配列番号１～１０および３１８の何れかの保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0057】

ある実施態様において、ＣＢ５は、１以上のモチーフを含む。非限定的例として、モチーフは、モグロール産生を増加できるＣＢ５を、対照に比してモグロール産生を増加させないＣＢ５と区別し得る。

【0058】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；アミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および／またはアミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１における１６～２１位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；配列番号１における８５～９９位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および／または配列番号１における１４８～１５６位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；アミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および／またはアミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１における１６～２１位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；配列番号１における８５～９９位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および配列番号１における１４８～１５６位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）を含む。

【0059】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＥＸ_８ＩＸ_９Ｘ_１０ＹＴＧＬＳＰＸ_１１Ｘ_１２ＦＦＴＸ_１３ＬＡＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＳＸ_２２Ｘ_２３ＦＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号５０）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_２はアミノ酸ＬまたはＶであり；Ｘ_３はアミノ酸ＹまたはＷであり；Ｘ_４はアミノ酸ＷまたはＥであり；Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＴであり；Ｘ_６はアミノ酸ＡまたはＬであり；Ｘ_７はアミノ酸ＭまたはＫであり；Ｘ_８はアミノ酸ＱまたはＡであり；Ｘ_９はアミノ酸ＡまたはＶであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＷまたはＡであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＴまたはＡであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＡまたはＴであり；Ｘ_１３はアミノ酸ＩまたはＶであり；Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＬであり；Ｘ_１５はアミノ酸ＭまたはＧであり；Ｘ_１６はアミノ酸ＩまたはＬであり；Ｘ_１７はアミノ酸ＦまたはＡであり；Ｘ_１８はアミノ酸ＦまたはＹであり；Ｘ_１９はアミノ酸ＱまたはＹであり；Ｘ_２０はアミノ酸ＭまたはＶであり；Ｘ_２１はアミノ酸ＶまたはＩであり；Ｘ_２２はアミノ酸ＳまたはＧであり；Ｘ_２３はアミノ酸ＭまたはＦであり；Ｘ_２４はアミノ酸ＶまたはＧであり；Ｘ_２５はアミノ酸ＳまたはＴであり；Ｘ_２６はアミノ酸ＰまたはＳであり；Ｘ_２７はアミノ酸ＥまたはＤであり；Ｘ_２８はアミノ酸ＥまたはＹであり；Ｘ_２９はアミノ酸ＦまたはＧであり；Ｘ_３０はアミノ酸ＮまたはＳであり；および／またはＸ_３１はアミノ酸ＫまたはＨである。非限定的例として、配列番号５０を含むＣＢ５は、アミノ酸配列ＱＶＷＥＴＬＫＥＡＩＶＡＹＴＧＬＳＰＡＴＦＦＴＶＬＡＬＧＬＡＶＹＹＶＩＳＧＦＦＧＴＳＤＹＧＳＨ（配列番号５８）またはアミノ酸配列ＥＬＹＷＫＡＭＥＱＩＡＷＹＴＧＬＳＰＴＡＦＦＴＩＬＡＳＭＩＦＶＦＱＭＶＳＳＭＦＶＳＰＥＥＦＮＫ（配列番号５９）を含み得る。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１の４～５０位に対応する残基の位置に配列番号５０を含み得る。

【0060】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＰまたはＡであり；Ｘ_２はアミノ酸ＶまたはＩであり；Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_４はアミノ酸ＩまたはＬであり；Ｘ_５はアミノ酸ＳまたはＴであり；Ｘ_６はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_８はアミノ酸ＫまたはＲであり；Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＡであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＳまたはＰであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＫまたはＮであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＱまたはＳであり；および／またはＸ_１３はアミノ酸ＳまたはＧである。非限定的例として、配列番号５１を含むＣＢ５は、アミノ酸配列ＰＶＱＶＧＥＩＳＥＥＥＬＫＱＹＤＧＳＤＳＫＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＱＳＲＭＦ（配列番号６０）またはＡＶＱＩＧＱＬＴＥＱＱＬＲＡＹＤＧＳＤＰＮＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＳＧＲＭＦ（配列番号６１）を含み得る。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１における６４～１０４位に対応する残基の位置に配列番号５１を含み得る。

【0061】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＬであり；Ｘ_２はアミノ酸ＭまたはＬであり；Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＫであり；Ｘ_４はアミノ酸ＥまたはＰであり；Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＥであり；Ｘ_６はアミノ酸ＬまたはＩであり；Ｘ_７はアミノ酸ＤまたはＮであり；Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＥであり；Ｘ_９はアミノ酸ＧまたはＳであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＰまたはＥであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＦまたはＥであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＥまたはＶであり；Ｘ_１３はアミノ酸ＡまたはＩであり；Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＥであり；Ｘ_１５はアミノ酸ＴまたはＥであり；および／またはＸ_１６はアミノ酸ＶまたはＬである。ある実施態様において、配列番号５２を含むＣＢ５は、ＬＡＫＭＳＦＥＥＫＤＬＴＧＤＩＳＧＬＧＰＦＥＬＥＡＬＱＤＷＥＹＫＦＭＳＫＹＶＫＶＧＴＶ（配列番号６２）またはＬＡＬＬＳＦＫＰＥＤＩＴＧＮＩＥＧＬＳＥＥＥＬＶＩＬＱＤＷＥＹＫＦＭＥＫＹＶＫＶＧＥＬ（配列番号６３）を含み得る。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１の１２３～１６５位に対応する残基の位置に配列番号５２を含む。

【0062】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＥであり；Ｘ_２はアミノ酸ＰまたはＨであり；Ｘ_３はアミノ酸ＡまたはＳであり；Ｘ_４はアミノ酸ＤまたはＮであり；Ｘ_５はアミノ酸ＰまたはＨであり；Ｘ_６はアミノ酸ＳまたはＲであり；Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＮであり；Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＦであり；Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＥであり；および／またはＸ_１０はアミノ酸ＡまたはＩである。ある実施態様において、配列番号５３を含むＣＢ５は、ＫＰＡＥＤＧＰＳＥＳＱＡＤ（配列番号６４）またはＥＨＳＥＮＧＨＲＮＦＥＩＤ（配列番号６５）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号１の１９０～２０２位に対応する残基の位置に配列番号５３を含む。

【0063】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＥＸ_８ＩＸ_９Ｘ_１０ＹＴＧＬＳＰＸ_１１Ｘ_１２ＦＦＴＸ_１３ＬＡＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＳＸ_２２Ｘ_２３ＦＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号５０）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_２はアミノ酸ＬまたはＶであり；Ｘ_３はアミノ酸ＹまたはＷであり；Ｘ_４はアミノ酸ＷまたはＥであり；Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＴであり；Ｘ_６はアミノ酸ＡまたはＬであり；Ｘ_７はアミノ酸ＭまたはＫであり；Ｘ_８はアミノ酸ＱまたはＡであり；Ｘ_９はアミノ酸ＡまたはＶであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＷまたはＡであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＴまたはＡであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＡまたはＴであり；Ｘ_１３はアミノ酸ＩまたはＶであり；Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＬであり；Ｘ_１５はアミノ酸ＭまたはＧであり；Ｘ_１６はアミノ酸ＩまたはＬであり；Ｘ_１７はアミノ酸ＦまたはＡであり；Ｘ_１８はアミノ酸ＦまたはＹであり；Ｘ_１９はアミノ酸ＱまたはＹであり；Ｘ_２０はアミノ酸ＭまたはＶであり；Ｘ_２１はアミノ酸ＶまたはＩであり；Ｘ_２２はアミノ酸ＳまたはＧであり；Ｘ_２３はアミノ酸ＭまたはＦであり；Ｘ_２４はアミノ酸ＶまたはＧであり；Ｘ_２５はアミノ酸ＳまたはＴであり；Ｘ_２６はアミノ酸ＰまたはＳであり；Ｘ_２７はアミノ酸ＥまたはＤであり；Ｘ_２８はアミノ酸ＥまたはＹであり；Ｘ_２９はアミノ酸ＦまたはＧであり；Ｘ_３０はアミノ酸ＮまたはＳであり；および／またはＸ_３１はアミノ酸ＫまたはＨである；アミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＰまたはＡであり；Ｘ_２はアミノ酸ＶまたはＩであり；Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_４はアミノ酸ＩまたはＬであり；Ｘ_５はアミノ酸ＳまたはＴであり；Ｘ_６はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＱであり；Ｘ_８はアミノ酸ＫまたはＲであり；Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＡであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＳまたはＰであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＫまたはＮであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＱまたはＳであり；および／またはＸ_１３はアミノ酸ＳまたはＧである；ならびにアミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）を含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＬであり；Ｘ_２はアミノ酸ＭまたはＬであり；Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＫであり；Ｘ_４はアミノ酸ＥまたはＰであり；Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＥであり；Ｘ_６はアミノ酸ＬまたはＩであり；Ｘ_７はアミノ酸ＤまたはＮであり；Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＥであり；Ｘ_９はアミノ酸ＧまたはＳであり；Ｘ_１０はアミノ酸ＰまたはＥであり；Ｘ_１１はアミノ酸ＦまたはＥであり；Ｘ_１２はアミノ酸ＥまたはＶであり；Ｘ_１３はアミノ酸ＡまたはＩであり；Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＥであり；Ｘ_１５はアミノ酸ＴまたはＥであり；および／またはＸ_１６はアミノ酸ＶまたはＬである。ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）をさらに含み、ここで、Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＥであり；Ｘ_２はアミノ酸ＰまたはＨであり；Ｘ_３はアミノ酸ＡまたはＳであり；Ｘ_４はアミノ酸ＤまたはＮであり；Ｘ_５はアミノ酸ＰまたはＨであり；Ｘ_６はアミノ酸ＳまたはＲであり；Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＮであり；Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＦであり；Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＥであり；および／またはＸ_１０はアミノ酸ＡまたはＩである。

【0064】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列ＱＶＷＥＴＬＫＥＡＩＶＡＹＴＧＬＳＰＡＴＦＦＴＶＬＡＬＧＬＡＶＹＹＶＩＳＧＦＦＧＴＳＤＹＧＳＨ（配列番号５８）またはアミノ酸配列ＥＬＹＷＫＡＭＥＱＩＡＷＹＴＧＬＳＰＴＡＦＦＴＩＬＡＳＭＩＦＶＦＱＭＶＳＳＭＦＶＳＰＥＥＦＮＫ（配列番号５９）；アミノ酸配列ＰＶＱＶＧＥＩＳＥＥＥＬＫＱＹＤＧＳＤＳＫＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＱＳＲＭＦ（配列番号６０）またはＡＶＱＩＧＱＬＴＥＱＱＬＲＡＹＤＧＳＤＰＮＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＳＧＲＭＦ（配列番号６１）；およびアミノ酸配列ＬＡＫＭＳＦＥＥＫＤＬＴＧＤＩＳＧＬＧＰＦＥＬＥＡＬＱＤＷＥＹＫＦＭＳＫＹＶＫＶＧＴＶ（配列番号６２）またはＬＡＬＬＳＦＫＰＥＤＩＴＧＮＩＥＧＬＳＥＥＥＬＶＩＬＱＤＷＥＹＫＦＭＥＫＹＶＫＶＧＥＬ（配列番号６３）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、ＫＰＡＥＤＧＰＳＥＳＱＡＤ（配列番号６４）またはＥＨＳＥＮＧＨＲＮＦＥＩＤ（配列番号６５）をさらに含む。

【0065】

ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；アミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；アミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／またはアミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、配列番号４の２３～３７位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；配列番号４の５３～７０位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；配列番号４の１６８～１７５位に対応する残基の位置にアミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／または配列番号４の２０３～２２２位の対応する残基の位置にアミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）を含む。ある実施態様において、ＣＢ５は、アミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；アミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；アミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；およびアミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）を含む。

【0066】

ある実施態様において、ＣＢ５は、ＣＢ５を含まない宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に比して、宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生を少なくとも０．０１％、少なくとも０．０５％、少なくとも１％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％、少なくとも６００％、少なくとも６５０％、少なくとも７００％、少なくとも７５０％、少なくとも８００％、少なくとも８５０％、少なくとも９００％、少なくとも９５０％または少なくとも１０００％（各数値間の全数値を含む）増加できる。ある実施態様において、ＣＢ５は、ＣＢ５を含まない宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に比して、宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生を最高で５％、最高で１０％、最高で１５％、最高で２０％、最高で２５％、最高で３０％、最高で３５％、最高で４０％、最高で４５％、最高で５０％、最高で５５％、最高で６０％、最高で６５％、最高で７０％、最高で７５％、最高で８０％、最高で８５％、最高で９０％、最高で９５％、最高で１００％、最高で１５０％、最高で２００％、最高で２５０％、最高で３００％、最高で３５０％、最高で４００％、最高で４５０％、最高で５００％、最高で５５０％、最高で６００％、最高で６５０％、最高で７００％、最高で７５０％、最高で８００％、最高で８５０％、最高で９００％、最高で９５０％または最高で１０００％（各数値間の全数値を含む）増加できる。ある実施態様において、ＣＢ５は、ＣＢ５を含まない宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に比して、宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生を０．０１％から１％の間、１％から１０％の間、１０％から２０％の間、１０％から５０％の間、５０％から１００％の間、１００％から２００％の間、２００％から３００％の間、３００％から４００％の間、４００％から５００％の間、５００％から６００％の間、６００％から７００％の間、７００％から８００％の間、８００％から９００％の間、９００％から１０００％の間、１％から５０％、１％から１００％の間、１％から５００％の間、または１％から１０００％の間（各数値間の全数値を含む）増加できる。

【0067】

ある実施態様において、ＣＢ５を含む宿主細胞は、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドを少なくとも０．０１ｍｇ／Ｌ、少なくとも０．０５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１ｍｇ／Ｌ、少なくとも５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１０ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５ｍｇ／Ｌ、少なくとも２０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５ｍｇ／Ｌ、少なくとも３０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３５ｍｇ／Ｌ、少なくとも４０ｍｇ／Ｌ、少なくとも４５ｍｇ／Ｌ、少なくとも５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５５ｍｇ／Ｌ、少なくとも６０ｍｇ／Ｌ、少なくとも６５ｍｇ／Ｌ、少なくとも７０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５ｍｇ／Ｌ、少なくとも８０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８５ｍｇ／Ｌ、少なくとも９０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９５ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも２００ｍｇ／Ｌ、少なくとも２５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも３００ｍｇ／Ｌ、少なくとも３５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも４００ｍｇ／Ｌ、少なくとも４５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも５００ｍｇ／Ｌ、少なくとも５５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも６００ｍｇ／Ｌ、少なくとも６５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも７００ｍｇ／Ｌ、少なくとも７５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも８００ｍｇ／Ｌ、少なくとも８５０ｍｇ／Ｌ、少なくとも９００ｍｇ／Ｌ、少なくとも９５０ｍｇ／Ｌまたは少なくとも１０００ｍｇ／Ｌ（各数値間の全数値を含む）産生できる。ある実施態様において、ＣＢ５を含む宿主細胞は、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドを最高で５ｍｇ／Ｌ、最高で１０ｍｇ／Ｌ、最高で１５ｍｇ／Ｌ、最高で２０ｍｇ／Ｌ、最高で２５ｍｇ／Ｌ、最高で３０ｍｇ／Ｌ、最高で３５ｍｇ／Ｌ、最高で４０ｍｇ／Ｌ、最高で４５ｍｇ／Ｌ、最高で５０ｍｇ／Ｌ、最高で５５ｍｇ／Ｌ、最高で６０ｍｇ／Ｌ、最高で６５ｍｇ／Ｌ、最高で７０ｍｇ／Ｌ、最高で７５ｍｇ／Ｌ、最高で８０ｍｇ／Ｌ、最高で８５ｍｇ／Ｌ、最高で９０ｍｇ／Ｌ、最高で９５ｍｇ／Ｌ、最高で１００ｍｇ／Ｌ、最高で１５０ｍｇ／Ｌ、最高で２００ｍｇ／Ｌ、最高で２５０ｍｇ／Ｌ、最高で３００ｍｇ／Ｌ、最高で３５０ｍｇ／Ｌ、最高で４００ｍｇ／Ｌ、最高で４５０ｍｇ／Ｌ、最高で５００ｍｇ／Ｌ、最高で５５０ｍｇ／Ｌ、最高で６００ｍｇ／Ｌ、最高で６５０ｍｇ／Ｌ、最高で７００ｍｇ／Ｌ、最高で７５０ｍｇ／Ｌ、最高で８００ｍｇ／Ｌ、最高で８５０ｍｇ／Ｌ、最高で９００ｍｇ／Ｌ、最高で９５０ｍｇ／Ｌまたは最高で１０００ｍｇ／Ｌ産生できる。ある実施態様において、ＣＢ５を含む宿主細胞は、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドを０．０１ｍｇ／Ｌから１ｍｇ／Ｌの間、１ｍｇ／Ｌから１０ｍｇ／Ｌの間、１０ｍｇ／Ｌから２０ｍｇ／Ｌの間、１０ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌの間、５０ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌの間、１００ｍｇ／Ｌから２００ｍｇ／Ｌの間、２００ｍｇ／Ｌから３００ｍｇ／Ｌの間、３００ｍｇ／Ｌから４００ｍｇ／Ｌの間、４００ｍｇ／Ｌから５００ｍｇ／Ｌの間、５００ｍｇ／Ｌから６００ｍｇ／Ｌの間、６００ｍｇ／Ｌから７００ｍｇ／Ｌの間、７００ｍｇ／Ｌから８００ｍｇ／Ｌの間、８００ｍｇ／Ｌから９００ｍｇ／Ｌの間、９００ｍｇ／Ｌから１０００ｍｇ／Ｌの間、１ｍｇ／Ｌから５０ｍｇ／Ｌの間、１ｍｇ／Ｌから１００ｍｇ／Ｌの間、１ｍｇ／Ｌから５００ｍｇ／Ｌの間、または１ｍｇ／Ｌから１０００ｍｇ／Ｌの間（各数値間の全数値を含む）産生できる。非限定的例として、ＣＢ５は、１以上のスクアレンシンターゼ、エポキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、エポキシドヒドロラーゼおよび／またはククルビタジエノールシンターゼを含む宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生を増加でき得る。ある場合、ＣＢ５は、１以上のスクアレンシンターゼ、エポキシダーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、ククルビタジエノールシンターゼおよび／またはＵＤＰグリコシルトランスフェラーゼを含む宿主細胞による、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生を増加できる。ある実施態様において、宿主細胞は、ＣＢ５レダクターゼをさらに含む。ある実施態様において、宿主細胞は、グルカナーゼをさらに含む。

【0068】

ＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ（ＵＧＴ）酵素
本発明の態様は、例えば、モグロシド（例えば、モグロシドＩ－Ａ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩ－Ｅ（ＭＩＥ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩ）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥ）、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶａ、イソモグロシドＩＶ、モグロシドＶまたはモグロシドＶＩ）の産生に有用であり得るＵＤＰ－グリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＵＧＴ）を提供する。

【0069】

本発明で使用する、「ＵＧＴ」は、ＵＴＰ－糖からの化合物（例えば、モグロシドまたはモグロール）へのグリコシル基の付加を触媒できる、酵素をいう。ＵＧＴは、一次および／または二次ＵＧＴであり得る。

【0070】

「一次」ＵＧＴまたは「一次グリコシル化活性」を有するＵＧＴは、グリコシル基を含まない化合物上の位置へのグリコシル基の付加の触媒ができるＵＧＴをいう。例えば、一次ＵＧＴは、イソプレノイド基質（例えば、モグロール）のＣ３および／またはＣ２４位へのグリコシル基の付加が可能であり得る。例えば、図１Ｃ参照。

【0071】

「二次」ＵＧＴまたは「二次グリコシル化活性」を有するＵＧＴは、グリコシル基を既に含む化合物上のある位置へのグリコシル基の付加を触媒できるＵＧＴをいう。例えば、図１Ｄ参照。非限定的例として、二次ＵＧＴは、モグロシドＩ－Ａ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩ－Ｅ（ＭＩＥ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩ）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥ）、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶａ、イソモグロシドＩＶ、モグロシドＶおよび／またはモグロシドＶＩにグリコシル基を付加し得る。

【0072】

ある実施態様において、本発明のＵＧＴ（例えば、一次または二次ＵＧＴ）は、本明細書に開示するまたは当分野で知られる何れかのＵＧＴ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）を含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、配列番号１２１の保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0073】

本発明のＵＧＴは、酸素化部位の何れか（例えば、Ｃ３、Ｃ１１、Ｃ２４およびＣ２５）でモグロールまたはモグロシドのグリコシル化が可能であり得る。ある実施態様において、ＵＧＴは、分岐グリコシル化（例えば、モグロシドのＣ３またはＣ２４での分岐グリコシル化）が可能である。

【0074】

本発明のＵＧＴのための適当な基質の非限定的例は、モグロールおよびモグロシド（例えば、モグロシドＩＡ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩＥ（ＭＩＥ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩ）またはモグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥ）、シアメノシドＩ）を含む。

【0075】

ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、モグロシドＩＡ１（ＭＩＡ１）、モグロシドＩＥ（ＭＩＥ）、モグロシドＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ａ２（ＭＩＩＡ２）、モグロシドＩＩＩ－Ａ１（ＭＩＩＩＡ１）、モグロシドＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＥ）、モグロシドＩＩＩ（ＭＩＩＩ）、シアメノシドＩ、モグロシドＩＩＩ－Ｅ（ＭＩＩＩＥ）、モグロシドＩＶ、モグロシドＩＶａ、イソモグロシドＩＶおよび／またはモグロシドＶを産生できる。

【0076】

ある実施態様において、ＵＧＴは、モグロールからＭＩＡ１；モグロールからＭＩＥ１；ＭＩＡ１からＭＩＩＡ１；ＭＩＥ１からＭＩＩＥ；ＭＩＩＡ１からＭＩＩＩＡ１；ＭＩＡ１からＭＩＩＥ；ＭＩＩＡ１からＭＩＩＩ；ＭＩＩＩＡ１からシアメノシドＩ；ＭＩＩＥからＭＩＩＩ；ＭＩＩＩからシアメノシドＩ；ＭＩＩＥからＭＩＩＥ；および／またはＭＩＩＩＥからシアメノシドＩの変換の触媒ができる。

【0077】

ＵＧＴの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＵＧＴの比活性などの活性は、単位時間あたりの単位酵素あたりに産生されるグリコシル化モグロシドの量の測定により決定され得る。例えば、比活性などの活性は、１時間あたり酵素１グラムあたりに産生されるグリコシル化モグロシド標的のｍｍｏｌで測定され得る。ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、１時間あたり酵素１グラムあたりに産生されるグリコシル化モグロシド標的が少なくとも０．１ｍｍｏｌ（例えば、少なくとも１ｍｍｏｌ、少なくとも１．５ｍｍｏｌ、少なくとも２ｍｍｏｌ、少なくとも２．５ｍｍｏｌ、少なくとも３、少なくとも３．５ｍｍｏｌ、少なくとも４ｍｍｏｌ、少なくとも４．５ｍｍｏｌ、少なくとも５ｍｍｏｌ、少なくとも１０ｍｍｏｌ（各数値間の全数値を含む））である比活性などの活性を有し得る。

【0078】

ある実施態様において、本発明のＵＧＴの比活性などの活性は、対照ＵＧＴより少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍（各数値間の全数値を含む））大きい。ある実施態様において、対照ＵＧＴは一次ＵＧＴである。ある実施態様において、対照ＵＧＴは二次ＵＧＴである。ある実施態様において、対照ＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１（配列番号１２１により提供される、ラカンカであるシライチア・グロスベノリイからの野生型ＵＧＴ配列）である。ある実施態様において、アミノ酸置換を有するＵＧＴに関して、対照ＵＧＴは、アミノ酸置換がない以外同じＵＧＴである。

【0079】

当業者は、タンパク質に付随する構造的および／または機能的情報に基づき、タンパク質をＵＧＴ酵素として特徴づけされ得ることは認識される。例えば、タンパク質は、モグロールなどのモグロシド前駆体存在下、１以上のモグロシドを産生する能力などの、機能に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。

【0080】

ＵＧＴ酵素はさらに、グリコシル基を含まない化合物上の位置へのグリコシル基の付加を触媒するその機能に基づき、一次ＵＧＴとして特徴づけされ得る。ＵＧＴ酵素は、グリコシル基を既に含む化合物のある位置へのグリコシル基の付加を触媒するその機能に基づき、二次ＵＧＴとして特徴づけされ得る。ある実施態様において、ＵＧＴ酵素は、一次および二次ＵＧＴ酵素の両方として特徴づけされ得る。

【0081】

他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質と既知ＵＧＴ酵素間のパーセント同一性に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、本明細書に記載するＵＧＴ配列の何れかまたは他のＵＧＴ酵素の何れかの配列と少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一（各数値間の全数値を含む）であり得る。

【0082】

他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質における、ＵＧＴ酵素と関連する１以上のドメインの存在に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、当分野で知られるＵＧＴ酵素の特徴である糖結合ドメインおよび／または触媒ドメインの存在に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。ある実施態様において、触媒ドメインは、グリコシル化される基質に結合する。

【0083】

他の実施態様において、タンパク質は、既知ＵＧＴ酵素の三次元構造と比較する、タンパク質の三次元構造の比較に基づき、ＵＧＴ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、アルファヘリックスドメイン、ベータシートドメインなどの数または位置に基づき、ＵＧＴとして特徴づけされる。ＵＧＴ酵素は合成タンパク質であり得ることは認識される。

【0084】

構造的に、ＵＧＴはしばしばＵＤＰＧＴ（Ｐｒｏｓｉｔｅ：ＰＳ００３７５）ドメインおよび触媒ダイアド(catalytic dyad)を含む。非限定的例として、当業者は、ＵＧＴ配列をＵＧＴ９４－２８９－１とアラインし、該ＵＧＴにおけるＵＧＴ９４－２８９－１のヒスチジン２１（Ｈ２１）およびアスパラギン酸１２２（Ｄ１２２）に対応する２残基を同定することにより、該ＵＧＴにおける触媒ダイアドを同定し得る。

【0085】

ＵＧＴ９４－２８９－１のアミノ酸配列：
MDAQRGHTTTILMFPWLGYGHLSAFLELAKSLSRRNFHIYFCSTSVNLDAIKPKLPSSSSSDSIQLVELCLPSSPDQLPPHLHTTNALPPHLMPTLHQAFSMAAQHFAAILHTLAPHLLIYDSFQPWAPQLASSLNIPAINFNTTGASVLTRMLHATHYPSSKFPISEFVLHDYWKAMYSAAGGAVTKKDHKIGETLANCLHASCSVILINSFRELEEKYMDYLSVLLNKKVVPVGPLVYEPNQDGEDEGYSSIKNWLDKKEPSSTVFVSFGSEYFPSKEEMEEIAHGLEASEVHFIWVVRFPQGDNTSAIEDALPKGFLERVGERGMVVKGWAPQAKILKHWSTGGFVSHCGWNSVMESMMFGVPIIGVPMHLDQPFNAGLAEEAGVGVEAKRDPDGKIQRDEVAKLIKEVVVEKTREDVRKKAREMSEILRSKGEEKMDEMVAAISLFLKI（配列番号１２１）

【0086】

ＵＧＴ９４－２８９－１をコードする核酸配列の非限定的例：
atggacgcgcaacgcggacatacgactaccatcctgatgtttccgtggttggggtacggccaccttagtgcattcctcgaattagccaagagcttgtcgcgtaggaactttcatatttatttctgttccacatctgtcaatttagatgctataaaacccaaactaccatcatcttcaagttccgattctattcagcttgtagagttatgcttgccttcctcgccagaccaactacccccacacctgcatacaactaatgctctacctccacatctaatgcctaccctgcaccaggccttttcaatggcagctcaacattttgcagctatattacatactttagcaccgcacttgttaatctatgattcgttccagccttgggcgccacaattggccagctctcttaacattcctgctattaattttaataccacgggtgccagtgtgctaacaagaatgttacacgcgactcattacccatcttcaaagttcccaatctccgaatttgttttacatgattattggaaagcaatgtattcagcagctggtggtgctgttacaaaaaaggaccataaaataggagaaaccttggcaaactgtttacacgcttcttgctcggtaattctgatcaattcattcagagagttggaagaaaaatacatggattacttgtctgtcttactaaacaagaaagttgtgcccgtgggtccgcttgtttatgagccaaaccaagatggcgaagacgaaggttatagttcgataaagaattggctcgataaaaaggagccctcctcaactgtctttgtttccttcgggtccgaatattttccgtccaaagaagaaatggaagaaattgcccatggcttggaggctagcgaggtacactttatttgggtcgttagattcccacaaggagacaatacttctgcaattgaagatgcccttcctaagggttttcttgagcgagtgggcgaacgtggaatggtggttaagggttgggctcctcaggccaaaattttgaaacattggagcacaggcggtttcgtaagtcattgtggatggaatagtgttatggagagcatgatgtttggtgtacccataataggtgttccgatgcatttagatcaaccatttaatgcagggctcgcggaagaagcaggagtaggggtagaggctaaaagggaccctgatggtaagatacagagagatgaagtcgctaaactgatcaaagaagtggttgtcgaaaaaacgcgcgaagatgtcagaaagaaggctagggaaatgtctgaaattttacgttcgaaaggtgaggaaaagatggacgagatggttgcagccattagtctcttcttgaagatataa（配列番号３２５）

【0087】

当業者は、あらゆるＵＧＴ酵素ついて、例えば、配列のアラインおよび／または二次または三次構造の比較により、どのアミノ酸残基がＵＧＴ９４－２８９－１（配列番号１２１）などの参照ＵＧＴにおける特定のアミノ酸残基に対応するかをどのようにして決定するかを容易に認識する。

【0088】

ある実施態様において、本発明のＵＧＴは、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１における構造モチーフに対応する（例えば、表１に示す構造モチーフに対応する）１以上の構造モチーフを含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、表１における全構造モチーフに対応する構造モチーフを含む。ある実施態様において、ＵＧＴは、表１に示す全てではなく、一部の構造モチーフに対応する構造モチーフを含む。ある実施態様において、一部構造モチーフは、異なる長さまたは異なるらせん構造を有する点で、異なり得る。例えば、本発明のＵＧＴは、ループ１１、１６、２０またはこれらの組み合わせの拡張バージョンを含み得る。本発明のＵＧＴは、ＵＧＴ９４－２８９－１における対応物（例えば、ＵＧＴ９４－２８９－１におけるループ１１、１６、２０またはこれらの組み合わせ）より大きならせん構造を有するループを含み得る。

【0089】

表1. 参照配列UGT94-289-1(配列番号121)における構造モチーフの非限定的例

【表1-1】

【表1-2】

【0090】

ある実施態様において、ＵＧＴは、参照ＵＧＴの循環置換バージョンである。ある実施態様において、ＵＧＴは、参照ＵＧＴと異なる順番で表１からの少なくとも２つのモチーフを含む配列を含む。例えば、参照ＵＧＴが、第二モチーフのＣ末端に位置する第一モチーフを含むならば、循環置換ＵＧＴにおいて第一モチーフは第二モチーフのＮ末端に位置し得る。

【0091】

ＵＧＴは、表１におけるベータシート７、ループ１６、アルファヘリックス９、ループ１７、ベータシート８、ループ１８、アルファヘリックス１０、ループ１９、ベータシート９、アルファヘリックス１１、ループ２０、アルファヘリックス１２、ループ２１、ベータシート１０、ループ２２、アルファヘリックス１３、ループ２３、ベータシート１１、ループ２４、アルファヘリックス１４、ループ２５、ベータシート１２、ループ２６、アルファヘリックス１５、ループ２７、ベータシート１３、ループ２８、アルファヘリックス１６、ループ２９、アルファヘリックス１７、ループ３０、アルファヘリックス１８およびループ３１から選択される１以上のモチーフに対応する１以上のモチーフに対してＣ末端に位置する、表１からのループ１、ベータシート１、ループ２、アルファヘリックス１、ループ３、ベータシート２、ループ４、アルファヘリックス２、ループ５、ベータシート３、ループ６、アルファヘリックス３、ループ７、ベータシート４、ループ８、アルファヘリックス４、ループ９、ベータシート５、ループ１０、アルファヘリックス５、ループ１１、アルファヘリックス６、ループ１２、アルファヘリックス７、ループ１３、ベータシート６、ループ１４、アルファヘリックス８およびループ１５から選択される１以上のモチーフを含み得る。

【0092】

ある実施態様において、ＵＧＴのＮ末端部分は、触媒ダイアドおよび／または基質結合部位を含む触媒部位を含む。ある実施態様において、ＵＧＴのＣ末端部分は、補因子結合部位を含む。本発明の態様は、循環置換されているＵＧＴを含む。ある実施態様において、ＵＧＴの循環置換バージョンにおいて、Ｎ末端部分およびＣ末端部分は、全体的にまたは一部逆転し得る。例えば、循環置換ＵＧＴのＣ末端部分は触媒ダイアドおよび／または基質結合部位を含む触媒部位を含み得て、一方Ｎ末端部分は補因子結合部位を含み得る。ある実施態様において、ＵＧＴの循環置換バージョンはＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含み、ここで、該ＵＧＴは触媒ダイアドおよび補因子結合部位を含み、ここで、該触媒ダイアドは該補因子結合部位に対してＣ末端に位置する。

【0093】

本発明に包含される循環置換ＵＧＴは、循環置換に付されていない同じＵＧＴと異なる性質を示し得る。ある実施態様において、このようなＵＧＴの循環置換バージョンを発現する宿主細胞は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１（配列番号１２１）などの循環置換されていない参照ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％多い１以上のモグロシドを産生する。ある実施態様において、このようなＵＧＴの循環置換バージョンを発現する宿主細胞は、野生型ＵＧＴ９４－２８９－１（配列番号１２１）などの循環置換されていない参照ＵＧＴをコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞に比して、少なくとも１つのモグロシド前駆体の存在下、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％少ない１以上のモグロシドを産生する。

【0094】

ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）酵素
本発明の態様は、例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールなどのククルビタジエノール化合物の産生に有用であり得る、ククルビタジエノールシンターゼ（ＣＤＳ）酵素を提供する。ＣＤＳは、オキシドスクアレン（例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２，３；２２，２３－ジエポキシスクアレン）から２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノールなどのククルビタジエノール化合物の形成を触媒できる。

【0095】

ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号２５６の１２３位に対応する残基の位置にロイシンを有し、これは、引用により全体として包含させる、Takase et al. Org. Biomol. Chem., 2015, 13, 7331-7336に記載のとおり、他のオキシドスクアレンシクラーゼと区別する。

【0096】

本発明のＣＤＳは、表６における核酸配列もしくはアミノ酸配列、配列番号１８４～２６３、２９９、３０８もしくは３１９から選択される配列、または本明細書に開示するもしくは当分野で知られる他の何れかのＣＤＳ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列を含み得る。ある実施態様において、ＣＤＳは、配列番号２２４～２６３または３０８の何れかの保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0097】

ある実施態様において、ＣＤＳ酵素は、ＡｑｕＡｇａＣＤＳ１６（配列番号２２６）、ＣＳＰＩ０６Ｇ０７１８０．１（配列番号２３５）、またはＡ０Ａ１Ｓ３ＣＢＦ６（配列番号２３２）に対応する。

【0098】

ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードする核酸配列は、出芽酵母を含む特定の宿主細胞における発現のために、コドン最適化され得る。ある実施態様において、コドン最適化された、ＣＤＳ酵素をコードする核酸配列は、配列番号１８６、１９５または１９２に対応する。

【0099】

ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、基質としてオキシドスクアレン（例えば、２，３－オキシドスクアレンまたは２，３；２２，２３－ジエポキシスクアレン）を使用できる。ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、ククルビタジエノール化合物（例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール）を産生できる。ある実施態様において、本発明のＣＤＳは、オキシドスクアレン（例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２，３；２２，２３－ジエポキシスクアレン）からククルビタジエノール化合物（例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール）の形成を触媒する。

【0100】

ＣＤＳの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＣＤＳの活性は、産生されたククルビタジエノールの正規化ピーク面積として測定され得る。ある実施態様において、この活性は、任意単位で測定される。ある実施態様において、本発明のＣＤＳの比活性などの活性は、対照ＣＤＳより少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍（各数値間の全数値を含む））大きい。

【0101】

当業者は、タンパク質に付随する構造的および／または機能的情報に基づき、ＣＤＳ酵素としてタンパク質を特徴づけできることは認識される。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、基質としてオキシドスクアレン（例えば、２，３－オキシドスクアレンまたは２，３；２２，２３－ジエポキシスクアレン）を使用して、ククルビタジエノール化合物（例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールまたはククルビタジエノール）を産生する能力などの機能に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。ある実施態様において、タンパク質は、少なくとも一部、配列番号２５６の１２３位に対応する位置のロイシン残基の存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。

【0102】

ある実施態様において、ＣＤＳ酵素をコードする異種ポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、異種遺伝子を発現しない同じ宿主細胞に比して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％以上のククルビタジエノール化合物を産生する。

【0103】

他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質と既知ＣＤＳ酵素のパーセント同一性に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。例えば、タンパク質は、本明細書に記載のＣＤＳ配列の何れかまたは他のＣＤＳ酵素の何れかの配列と、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一（各数値間の全数値を含む）であり得る。他の実施態様において、タンパク質は、該タンパク質における、ＣＤＳ酵素と関連する１以上のドメインの存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。例えば、ある実施態様において、タンパク質は、当分野で知られるＣＤＳ酵素の基質溝および／または活性部位腔特徴の存在に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけられる。ある実施態様において、活性部位腔は、この溝へのゲートとして作用し、該腔から水を排除することを助ける、残基を含む。ある実施態様において、活性部位は、基質のエポキシドを開環するプロトンドナーとして、そして環化過程を触媒する残基を含む。

【0104】

他の実施態様において、タンパク質は、既知ＣＤＳ酵素の三次元構造に対応する、タンパク質の三次元構造の比較に基づき、ＣＤＳ酵素として特徴づけされ得る。ＣＤＳ酵素は合成タンパク質であり得ることが認識される。

【0105】

Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素
本発明の態様は、例えば、モグロールの産生に有用であり得る、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ酵素を提供する。

【0106】

本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、表７および８におけるＣ１１ヒドロキシラーゼ配列（例えば、核酸配列もしくはアミノ酸配列）、配列番号２６４～２６５、２８０～２８１、２９６、３０５，３１４～３１５、３２０、３２１、３２４、３３４もしくは３３５に示す配列、または本明細書に開示するもしくは当分野で知られる何れかのＣ１１ヒドロキシラーゼ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列を含み得る。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼは、配列番号２８０～２８１、３０５、３１５および３２４の何れかの保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0107】

ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、モグロール前駆体（例えば、ククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４，２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールおよび／または２４，２５－エポキシ－ククルビタジエノール）を酸化できる。ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、モグロールの形成を触媒する。

【0108】

Ｃ１１ヒドロキシラーゼの比活性などの活性は、当業者に知られるあらゆる手段により決定され得ることは認識される。ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの活性（例えば、比活性）は、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体または産生されるモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のＣ１１ヒドロキシラーゼは、少なくとも０．０００１～０．００１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．００１～０．０１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０１～０．１μｍｏｌ／分／ｍｇまたは少なくとも０．１～１μｍｏｌ／分／ｍｇ（各数値間の全数値を含む）の活性（例えば、比活性）を有する。

【0109】

ある実施態様において、Ｃ１１ヒドロキシラーゼの比活性などの活性は、対照Ｃ１１ヒドロキシラーゼより少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１００００倍（各数値間の全数値を含む））大きい。

【0110】

シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素
本発明の態様は、例えば、モグロールの産生に有用であり得る、シトクロムＰ４５０レダクターゼ酵素を提供する。シトクロムＰ４５０レダクターゼは、ＮＡＤＰＨ：フェリヘモタンパク質オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：ヘムタンパク質オキシドレダクターゼ、ＮＡＤＰＨ：Ｐ４５０オキシドレダクターゼ、Ｐ４５０レダクターゼ、ＰＯＲ、ＣＰＲおよびＣＹＰＯＲとも称される。これらのレダクターゼは、ＮＡＤＰＨからＣ１１ヒドロキシラーゼへの電子移動を触媒することにより、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ活性を助長できる。

【0111】

本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、表７および８におけるシトクロムＰ４５０レダクターゼ配列（例えば、核酸配列もしくはアミノ酸配列）、配列番号２６６～２６７、２８２～２８３、２９７～２９８、３０６～３０７、３２３もしくは３３３に示す配列、または本明細書に開示するもしくは当分野で知られる何れかのシトクロムｐ４５０レダクターゼと少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列を含み得る。ある実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼは、配列番号２８２～２８３および３０６～３０７の何れかの保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0112】

ある実施態様において、本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、モグロール前駆体（例えば、ククルビタジエノール、１１－ヒドロキシククルビタジエノール、２４，２５－ジヒドロキシ－ククルビタジエノールおよび／または２４，２５－エポキシ－ククルビタジエノール）の酸化を促進できる。ある実施態様において、本発明のＰ４５０レダクターゼは、モグロール前駆体またはモグロールの形成を触媒する。

【0113】

シトクロムＰ４５０レダクターゼの活性（例えば、比活性）は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、組み換えシトクロムＰ４５０レダクターゼの活性（例えば、比活性）は、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ存在下、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体または産生されるモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のシトクロムＰ４５０レダクターゼは、少なくとも０．０００１～０．００１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．００１～０．０１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０１～０．１μｍｏｌ／分／ｍｇまたは少なくとも０．１～１μｍｏｌ／分／ｍｇ（各数値間の全数値を含む）の活性（例えば、比活性）を有する。

【0114】

ある実施態様において、シトクロムＰ４５０レダクターゼの活性（例えば、比活性）は、対照シトクロムＰ４５０レダクターゼより少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍または少なくとも１００００倍（各数値間の全数値を含む））大きい。

【0115】

エポキシドヒドロラーゼ酵素（ＥＰＨ）
本発明の態様は、例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールから２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノールへの変換または１１－ヒドロキシ－２４，２５－エポキシククルビタジエノールからモグロールへの変換に有用であり得る、エポキシドヒドロラーゼ酵素（ＥＰＨ）を提供する。ＥＰＨは、エポキシドを２個のヒドロキシルに変換できる。

【0116】

本発明のＥＰＨは、表７および８におけるＥＰＨ配列（例えば、核酸配列もしくはアミノ酸配列）、配列番号２６８～２７６、２８４～２９２、３００～３０１、３０９～３１０もしくは３２２に示す配列、または本明細書に開示するもしくは当分野で知られる何れかのＥＰＨ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列を含み得る。ある実施態様において、ＥＰＨは、配列番号２８４～２９２および３０９～３１０の何れかの保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0117】

ある実施態様において、組み換え本発明のＥＰＨは、ククルビタジエノール化合物におけるエポキシドの加水分解（例えば、２４－２５エポキシ－ククルビタジエノールにおけるエポキシドの加水分解）を促進できる。ある実施態様において、本発明のＥＰＨは、モグロール前駆体（例えば、２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノール）の形成を触媒する。

【0118】

ＥＰＨの活性（例えば、比活性）は、当業者に知られるあらゆる手段により測定され得ることは認識される。ある実施態様において、ＥＰＨの活性（例えば、比活性）は、産生されるモグロール前駆体（例えば、２４－２５ジヒドロキシ－ククルビタジエノール）またはモグロールの濃度として測定され得る。ある実施態様において、組み換え本発明のＥＰＨは、少なくとも１～１００μｇ／Ｌ、少なくとも１００～１０００μｇ／Ｌ、少なくとも１～１００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１００～１０００ｍｇ／Ｌ、少なくとも１～１０ｇ／Ｌまたは少なくとも１０～１００ｇ／Ｌ（各数値間の全数値を含む）の産生を可能とする。

【0119】

ある実施態様において、ＥＰＨの活性（例えば、比活性）は、対照ＥＰＨより少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍（各数値間の全数値を含む））大きい。

【0120】

スクアレンエポキシダーゼ酵素（ＳＱＥ）
本発明の態様は、スクアレン（例えば、スクアレンまたは２－３－オキシドスクアレン）を酸化して、スクアレンエポキシド（例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３，２２－２３－ジエポキシスクアレン）を産生できる、スクアレンエポキシダーゼ（ＳＱＥ）を提供する。ＳＱＥは、スクアレンモノオキシゲナーゼとも称され得る。

【0121】

本発明のＳＱＥは、表７および８におけるＳＱＥ配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）、配列番号２７７～２７９、２９３～２９５、３０３、３１２、３２６または３２８に示す配列または本明細書に開示するもしくは当分野で知られるあらゆるＳＱＥ配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも１００％同一（各数値間の全数値を含む）である配列を含み得る。ある実施態様において、ＳＱＥは、配列番号２９３～２９５、３１２または３２８の何れかの保存的に置換されたバージョンである配列を含む。

【0122】

ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、スクアレン化合物におけるエポキシド形成（例えば、スクアレンまたは２，３－オキシドスクアレンのエポキシ化）を促進できる。ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、モグロール前駆体（例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３，２２－２３－ジエポキシスクアレン）の形成を促進する。

【0123】

組み換えＳＱＥの比活性などの活性は、単位時間あたり酵素単位あたり産生されるモグロール前駆体（例えば、２－３－オキシドスクアレンまたは２－３，２２－２３－ジエポキシスクアレン）の濃度として測定され得る。ある実施態様において、本発明のＳＱＥは、少なくとも０．００００００１μｍｏｌ／分／ｍｇ（例えば、少なくとも０．０００００１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．００００１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０００１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．００１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．０１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも０．１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１μｍｏｌ／分／ｍｇ、少なくとも１０μｍｏｌ／分／ｍｇまたは少なくとも１００μｍｏｌ／分／ｍｇ（各数値間の全数値））の比活性などの活性を有する、

【0124】

ある実施態様において、ＳＱＥの比活性などの活性は、対照ＳＱＥより少なくとも１．１倍（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．９倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍または少なくとも１００倍（数値間の全数値を含む））大きい。

【0125】

バリアント
本発明の態様は、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥおよびラノステロールシンターゼ酵素ならびに本発明と関連する何れかのタンパク質など、記載される組み換えポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチドに関する。本明細書に記載するポリヌクレオチドまたはアミノ酸配列のバリアントも、本発明により包含される。バリアントは、参照配列と少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％配列同一性（数値間の全数値を含む）を共有し得る。

【0126】

特に断らない限り、用語「配列同一性」は、当分野で知られるとおり、配列比較（アライメント）により決定した、２つのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの配列間の関係をいう。ある実施態様において、配列同一性は、配列の全長にわたり決定されるが、他の実施態様において、配列同一性は、配列領域にわたり決定される。

【0127】

同一性は、一連の２以上の残基（例えば、核酸またはアミノ酸残基）間のマッチ数により決定される、２個の配列間の配列関連性の程度ともいい得る。同一性は、特定の数学的モデル、アルゴリズムまたはコンピュータープログラムにより処理されるギャップアライメント（あるならば）を伴う２以上の配列の小さいほうの間の同一マッチのパーセントを測定する。

【0128】

関連ポリペプチドまたは核酸配列の同一性は、当業者に知られる方法の何れかにより容易に計算され得る。２個の配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）の「パーセント同一性」は、例えば、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変したKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを使用して決定され得る。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}およびＸＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}プログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}タンパク質サーチは、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラムで、スコア＝５０、単語長＝３で実施して、本発明のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２配列間にギャップが存在するとき、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}を、例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載のとおり実施できる。ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}およびＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}プログラムを使用するとき、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}およびＮＢＬＡＳＴ^{（登録商標）}）のデフォルトパラメータを使用できまたはパラメータを当業者により理解されるとおり適切に調整できる。

【0129】

使用され得る他の局所アライメント技術は、例えば、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)に基づく。使用され得る一般的包括的アライメント技術は、例えば、動的計画法に基づく、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453)である。

【0130】

さらに最近、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）が開発され、これは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを含む他の最適包括的アライメント方法より速く、核酸およびアミノ酸配列の包括的アライメントを作成するとされている。ある実施態様において、２個のポリペプチドの同一性を、２個のアミノ酸配列をアラインし、同一アミノ酸数を計算し、アミノ酸配列の一方の長さで除すことにより決定する。ある実施態様において、２個の核酸の同一性を、２個のヌクレオチド配列をアラインし、同一ヌクレオチド数を計算し、核酸の一方の長さで除すことにより決定する。

【0131】

複数配列アライメントのために、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を含むコンピュータープログラムが使用され得る。

【0132】

好ましい実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993におけるように改変したKarlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ(登録商標)、ＮＢＬＡＳＴ(登録商標)、ＸＢＬＡＳＴ(登録商標)またはＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ(登録商標)プログラム、各プログラムのデフォルトパラメータを使用）を使用して配列同一性を決定した場合、本明細書に開示の配列および／または特許請求の範囲に記載する配列などの参照配列と特定のパーセント同一性を有することが見出される。

【0133】

ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム(Smith, T.F. & Waterman, M.S. (1981) “Identification of common molecular subsequences.” J. Mol. Biol. 147:195-197)またはＮｅｅｄｌｅｍａｎ-Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム(Needleman, S.B. & Wunsch, C.D. (1970) “A general method applicable to the search for similarities in the amino acid sequences of two proteins.” J. Mol. Biol. 48:443-453)を使用して配列同一性を決定した場合、本明細書に開示の配列および／または特許請求の範囲に記載する配列などの参照配列と特定のパーセント同一性を有することが見出される。

【0134】

ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Ｆａｓｔ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｇｌｏｂａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ（ＦＯＧＳＡＡ）を使用して配列同一性を決定した場合、本明細書に開示の配列および／または特許請求の範囲に記載する配列などの参照配列と特定のパーセント同一性を有することが見出される。

【0135】

ある実施態様において、核酸またはアミノ酸配列を含む配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ(Sievers et al., Mol Syst Biol. 2011 Oct 11;7:539)を使用して配列同一性を決定した場合、本明細書に開示の配列および／または特許請求の範囲に記載する配列などの参照配列と特定のパーセント同一性を有することが見出される。

【0136】

本明細書で使用する、配列「Ｘ」における残基（例えば核酸残基またはアミノ酸残基）は、配列ＸおよびＹを当分野で知られるアミノ酸配列アライメントツールを使用してアラインしたとき、配列「Ｘ」における該残基が異なる配列「Ｙ」における「ｚ」のカウンターパート位置にあるならば、該配列「Ｙ」における「ｚ」位または残基（例えば核酸残基またはアミノ酸残基）に対応するという。

【0137】

バリアント配列は相同配列であり得る。本明細書で使用する、相同配列は、特定のパーセント同一性（例えば、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％パーセント同一性（各数値間の全数値を含む））を共有する配列（例えば、核酸またはアミノ酸配列）であり、パラロガス配列、オルソロガス配列または収斂進化に起因する配列を含むが、これらに限定されない。パラロガス配列は、種のゲノム内の遺伝子の重複に起因し、一方オルソロガス配列は、種分化事象後分岐する。２つの異なる種は、独立して進化しているかもしれないが、各々、収斂進化の結果として、他方の種からの配列と特定のパーセント同一性を有する配列を含み得る。

【0138】

ある実施態様において、ポリペプチドバリアント（例えば、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨもしくはＳＱＥバリアント、または本発明と関連する何れかのタンパク質のバリアント）は、対照ポリペプチド（例えば、対照ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、または本発明と関連する何れかのタンパク質）と二次構造（例えば、アルファヘリックス、ベータシート）を共有するドメインを含む。ある実施態様において、ポリペプチドバリアント（例えば、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨもしくはＳＱＥバリアント、または本発明と関連する何れかのタンパク質のバリアント）は、対照ポリペプチド（例えば、対照ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥ、または本発明と関連する何れかのタンパク質）と三次構造を共有する。非限定的例として、バリアントポリペプチドは、対照ポリペプチドと比較して低い一次配列同一性（例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満配列同一性）を有するが、１以上の二次構造（例えば、ループ、アルファヘリックスまたはベータシートを含むが、これらに限定されない）を共有するかまたは対照ポリペプチドと同じ三次構造を有し得る。例えば、ループは、ベータシートとアルファヘリックス間、２個のアルファヘリックス間または２個のベータシート間に位置し得る。相同性モデリングを使用して、２以上の三次構造を比較し得る。

【0139】

当業者に知られる多様な方法により、ヌクレオチド配列に変異を付し得る。例えば、変異を、ＰＣＲ指向変異、Kunkel(Kunkel, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 82: 488-492, 1985)の方法による部位特異的変異誘発、ポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成、遺伝子編集ツールまたはタグ（例えば、ＨＩＳタグまたはＧＦＰタグ）挿入などの挿入により付し得る。変異は、例えば、当分野で知られる何らかの方法により産生される、置換、欠失および転座を含み得る。変異を産生する方法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 2012またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York, 2010などの参考書に見られ得る。

【0140】

ある実施態様において、バリアントを産生する方法は、循環置換を含む(Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25)。循環置換において、ポリペプチドの直鎖状一次配列が環状化（例えば、配列のＮ末端とＣ末端の結合による）され、ポリペプチドを異なる位置で切断（「破壊」）し得る。故に、新規ポリペプチドの直鎖状一次配列は、直鎖状配列アライメント方法（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ ＯｍｅｇａまたはＢＬＡＳＴ）により決定して、低配列同一性（例えば、８０％未満、７５％未満、７０％未満、６５％未満、６０％未満、５５％未満、５０％未満、４５％未満、４０％未満、３５％未満、３０％未満、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満または５％未満（各数値間の全数値を含む））を有し得る。しかしながら、２個のタンパク質の位相的分析は、２個のポリペプチドの三次構造が類似または相違することを確認し得る。特定の理論に拘束されないが、対照ポリペプチドの循環置換により作製し、対照ポリペプチドと類似する三次構造を有するバリアントポリペプチドは、類似する機能的特徴（例えば、酵素活性、酵素動力学、基質特異性または産物特異性）を有し得る。ある場合、循環置換は二次構造、三次構造または四次構造を変え、異なる機能的特徴（例えば、酵素活性が増加または低減、異なる基質特異性または異なる産物特異性）のタンパク質を生じ得る。例えば、Yu and Lutz, Trends Biotechnol. 2011 Jan;29(1):18-25参照。

【0141】

循環置換を受けたタンパク質で、タンパク質の直鎖状アミノ酸配列は、循環置換を受けていない対照タンパク質と異なることは認識される。しかしながら、循環置換を受けたタンパク質のどの残基が、循環置換を受けていない対照タンパク質における残基に対応するか、例えば、配列をアラインし、保存されたモチーフを決定するおよび／または、例えば、相同性モデリングにより、タンパク質の構造または予測構造の比較により、当業者は容易に決定できる。

【0142】

ある実施態様において、目的の配列と本明細書に記載の対照配列のパーセント同一性を決定するアルゴリズムは、これら配列間の循環置換の存在を説明する。循環置換の存在は、例えば、ＲＡＳＰＯＤＯＭ(Weiner et al., Bioinformatics. 2005 Apr 1;21(7):932-7)を含む、当分野で知られる何らかの方法を使用して検出され得る。ある実施態様において、循環置換の存在は、目的の配列と本明細書に記載の配列のパーセント同一性前に補正される（例えば、少なくとも１つの配列におけるドメインが再配列される）。本発明の特許請求の範囲は、対照配列に対するパーセント同一性が、配列の循環置換の可能性を考慮した後、計算されている配列を含むと理解される。

【0143】

組み換えＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、スクアレンエポキシダーゼおよび本明細書に開示する他の何れかのタンパク質の機能的バリアントも、本発明により包含される。例えば、機能的バリアントは、１以上の同じ基質（例えば、モグロール、モグロシドまたはその前駆体）と結合するか、１以上の同じ産物（例えば、モグロール、モグロシドまたはその前駆体）を産生し得る。機能的バリアントは、当分野で知られる何らかの方法を使用して、同定され得る。例えば、上記Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990のアルゴリズムを、既知機能を有する相同タンパク質の同定に使用し得る。

【0144】

推定される機能的バリアントは、機能的にアノテートされたドメインを有するポリペプチドのサーチによっても同定され得る。Ｐｆａｍ(Sonnhammer et al., Proteins. 1997 Jul;28(3):405-20)を含むデータベースを使用して、特定のドメインを有するポリペプチドを同定し得る。例えば、オキシドスクアレンシクラーゼ中で、さらなるＣＤＳ酵素が、ある場合、配列番号２５６の１２３位に対応するロイシン残基を有するポリペプチドのサーチにより同定され得る。このロイシン残基は、ＣＤＳ酵素の産物特異性決定と関連付けられている；この残基の変異は、例えば、産物としてシクロアルテノールまたはパルケオールをもたらす(Takase et al., Org Biomol Chem. 2015 Jul 13(26):7331-6)。

【0145】

さらなるＵＧＴ酵素が、例えば、ＵＤＰＧＴドメイン(PROSITE accession number PS00375)を有するポリペプチドのサーチにより、同定され得る。

【0146】

相同性モデリングも、機能に影響することなく、変異しやすいアミノ酸残基の同定に使用され得る。このような方法の非限定的例は、位置特異的スコアマトリックス（ＰＳＳＭ）およびエネルギー最小化プロトコールの使用を含み得る。例えば、Stormo et al., Nucleic Acids Res. 1982 May 11;10(9):2997-3011参照。

【0147】

ＰＳＳＭは、野生型と単一点変異体の間の差異を決定する、ロゼッタエネルギー関数の計算と対合され得る。特定の理論に拘束されないが、潜在的に安定化する変異が、タンパク質操作（例えば、機能的ホモログの産生）で望まれる。ある実施態様において、潜在的に安定化する変異は、－０．１未満（例えば、－０．２未満、－０．３未満、－０．３５未満、－０．４未満、－０．４５未満、－０．５未満、－０．５５未満、－０．６未満、－０．６５未満、－０．７未満、－０．７５未満、－０．８未満、－０．８５未満、－０．９未満、－０．９５未満または－１．０未満）のロゼッタエネルギー単位（Ｒ．ｅ．ｕ．）のΔΔＧ_ｃａｌｃ値を有する。例えば、Goldenzweig et al., Mol Cell. 2016 Jul 21;63(2):337-346. doi: 10.1016/j.molcel.2016.06.012参照。

【0148】

ある実施態様において、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、もしくはＳＱＥコード配列、または本発明と関連する何れかのタンパク質のコード配列は、対照コード配列に対応する、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００または１００を超える位置に変異を含む。ある実施態様において、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、もしくはＳＱＥコード配列、または本発明と関連する何れかのタンパク質のコード配列は、対照コード配列に対してコード配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００またはそれ以上のコドンに変異を含む。当業者には理解されるとおり、コドン内の変異は、遺伝暗号の縮重により、該コドンによりコードされるアミノ酸を変化させるかもしれないし、させないかもしれない。ある実施態様において、コード配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、コード配列のアミノ酸配列を変えない。

【0149】

ある実施態様において、組み換えＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨもしくはＳＱＥ配列、または本発明と関連する他の組み換えタンパク質配列における１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して、ポリペプチドのアミノ酸配列を変える。ある実施態様において、１以上の変異は、対照ポリペプチドのアミノ酸配列に対して組み換えポリペプチドのアミノ酸配列を変え、対照ポリペプチドに対してポリペプチドの活性を変える（増強または低減）。

【0150】

本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかの、比活性を含む活性は、当分野で知られる方法を使用して測定され得る。非限定的例として、組み換えポリペプチドの活性を、その基質特異性、生産される産物、生産される産物の濃度またはこれらの何らかの組み合わせの測定により決定し得る。本明細書で使用する、組み換えポリペプチドの「比活性」は、単位時間あたりある量（例えば、濃度）の組み換えポリペプチドにより産生される特定の産物の量（例えば、濃度）をいう。

【0151】

組み換えポリペプチドコード配列における変異は、前記ポリペプチドの機能的に等価なバリアント、例えば、ポリペプチドの活性を保持するバリアントを提供するための保存的アミノ酸置換をもたらし得ることも当業者は認識する。本明細書で使用する、「保存的アミノ酸置換」または「保存的に置換された」は、アミノ酸置換がなされたタンパク質の相対的電荷またはサイズ特徴または機能的活性を変えないアミノ酸置換をいう。

【0152】

ある場合、アミノ酸は、そのＲ基（例えば、表２参照）により特徴づけられる。例えば、アミノ酸は、非極性脂肪族Ｒ基、正電荷Ｒ基、負電荷Ｒ基、非極性芳香族Ｒ基または極性非電荷Ｒ基を含み得る。非極性脂肪族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アラニン、グリシン、バリン、ロイシン、メチオニンおよびイソロイシンを含む。正電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、リシン、アルギニンおよびヒスチジンを含む。負電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。非極性、芳香族Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンを含む。極性非電荷Ｒ基を含むアミノ酸の非限定的例は、セリン、スレオニン、システイン、プロリン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。

【0153】

ポリペプチドの機能的に等価なバリアントの非限定的例は、本明細書に開示のタンパク質のアミノ酸配列に保存的アミノ酸置換を含み得る。アミノ酸の保存的置換は、次の群内のアミノ酸間でなされる置換である：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。保存的アミノ酸置換のさらなる非限定的例を表２に提供する。

【0154】

ある実施態様において、バリアントポリペプチドの調製時、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０を超える残基を変え得る。ある実施態様において、アミノは保存的アミノ酸置換により置換される。

【0155】

表2. 保存的アミノ酸置換の非限定的例

【表2】

【0156】

所望の性質および／または活性を有する組み換えポリペプチドバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列におけるアミノ酸置換は、ポリペプチドのコード配列の改変により行い得る。同様に、ポリペプチドの機能的に等価なバリアントを産生するためのポリペプチドのアミノ酸配列における保存的アミノ酸置換は、一般に組み換えポリペプチド（例えば、ＣＢ５、ＵＧＴ、ＣＤＳ、Ｐ４５０、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、スクアレンエポキシダーゼまたは本発明と関連する何れかのタンパク質）のコード配列の改変により行う。

【0157】

宿主細胞における核酸の発現
本発明の態様は、タンパク質、その機能的修飾体およびバリアントをコードする遺伝子の組み換え発現ならびにそれに関連する使用に関する。例えば、本明細書に記載する方法を、モグロール前駆体、モグロールおよび／またはモグロシドの産生に使用され得る。

【0158】

遺伝子を含むポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドに関する用語「異種」は、用語「外来性」および用語「組み換え」と相互交換可能に使用され、生物系に人工的に供給されているポリヌクレオチド；生物系内で修飾されているポリヌクレオチド；または発現または制御が生物系内で操作されているポリヌクレオチドをいう。宿主細胞に導入されるまたは発現される異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞と異なる生物または種由来のポリヌクレオチドであり得るかまたは合成ポリヌクレオチドであり得るかまたは宿主細胞と同じ生物または種でまた内因性に発現されるポリヌクレオチドであり得る。例えば、宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドは、宿主細胞で天然ではない位置である；安定的または一過性に宿主細胞で組み換え発現される；宿主細胞内で修飾される；宿主細胞内で選択的に編集される；天然に存在するコピー数と異なるコピー数で宿主細胞内で発現される；またはポリヌクレオチドの発現を制御する制御領域の操作によるなど、宿主細胞内で天然ではない方法で発現されるとき、異種とみなされる。ある実施態様において、異種ポリヌクレオチドは、宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドであるが、発現が該ポリヌクレオチドの発現を天然では制御しないプロモーターにより駆動される。他の実施態様において、異種ポリヌクレオチドは宿主細胞で内因性に発現されるポリヌクレオチドであり、その発現は該ポリヌクレオチドの発現を天然で制御するプロモーターにより駆動されるが、該プロモーターまたは他の制御領域が修飾される。ある実施態様において、プロモーターは、組み換えにより活性化または抑制される。例えば、遺伝子編集ベースの技術を使用して、内因性ポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの、内因性プロモーターを含むプロモーターからの発現を制御し得る。例えば、Chavez et al., Nat Methods. 2016 Jul; 13(7): 563-567参照。異種ポリヌクレオチドは、対照ポリヌクレオチド配列と比較して野生型配列または変異体配列を含み得る。

【0159】

本明細書に記載するＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥまたは本発明と関連する何れかのタンパク質などの組み換えポリペプチドの何れかをコードする核酸を、当分野で知られる何れかの方法により何れかの適切なベクターに組み込み得る。例えば、ベクターは、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスまたはアデノ随伴ウイルスベクター）を含むが、これらに限定されない発現ベクター、一過性発現に適するあらゆるベクター、構成的発現に適するあらゆるベクターまたは誘導型発現に適するあらゆるベクター（例えば、ガラクトース誘導型またはドキシサイクリン誘導型ベクター）であり得る。

【0160】

ある実施態様において、ベクターは、細胞で自律的に複製する。ベクターは、１以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含み、本明細書に記載の遺伝子を含む核酸の挿入およびライゲートのために制限エンドヌクレアーゼにより切断され、細胞で複製できる組み換えベクターが産生され得る。ベクターは、一般にＤＮＡからなるが、ＲＮＡベクターも利用可能である。クローニングベクターは、プラスミド、フォスミド、ファージミド、ウイルスゲノムおよび人工染色体を含むが、これらに限定されない。本明細書で使用する、用語「発現ベクター」または「発現構築物」は、酵母細胞などの宿主細胞における特定の核酸の転写を可能とする一連の特定の核酸要素を有する、組み換えまたは合成により産生された、核酸構築物をいう。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列を、制御配列と操作可能に結合し、ある実施態様において、ＲＮＡ転写物として発現されるように、クローニングベクターに挿入される。ある実施態様において、ベクターは、組み換えベクターで形質転換またはトランスフェクトされた細胞を同定するための、本明細書に記載する選択可能マーカーなどの１以上のマーカーを含む。ある実施態様において、本明細書に記載する遺伝子の核酸配列はコドン最適化される。コドン最適化は、コドン最適化されていない参照配列に比して、遺伝子産物の産生を少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％（各数値間の全数値を含む）増加させ得る。

【0161】

コード配列および制御配列は、コード配列と制御配列が共有結合され、コード配列の発現または転写が該制御配列の影響または制御下にあるならば、「操作可能に結合」または「操作可能に連結」されたという。コード配列が機能的タンパク質に翻訳されるならば、コード配列および制御配列は、５’制御配列におけるプロモーターの導入がコード配列を翻訳させるならばおよびコード配列と制御配列の間の結合の性質が、（１）フレームシフト変異の導入をもたらす、（２）プロモーター領域がコード配列の転写を指示する能力を妨害するまたは（３）対応するＲＮＡ転写物がタンパク質に翻訳される能力を妨害することがないならば、操作可能に結合または連結されたという。

【0162】

ある実施態様において、本明細書に記載するタンパク質の何れかをコードする核酸は、制御配列（例えば、エンハンサー配列）の制御下にある。ある実施態様において、核酸は、プロモーターの制御下発現される。プロモーターは、天然プロモーター、例えば、内因性状況で遺伝子のプロモーターであり、該遺伝子の発現の通常の制御を提供する。あるいは、プロモーターは、遺伝子の天然プロモーターと異なるプロモーター、例えば、その内因性状況における遺伝子のプロモーターと異なるプロモーターである。

【0163】

ある実施態様において、プロモーターは、真核生物プロモーターである。真核生物プロモーターの非限定的例は、当業者に知られるとおり、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１ ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＧＡＬ７、ＧＡＬ３、ＧＡＬ２、ＭＥＴ３、ＭＥＴ２５、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＵＰ１－１、ＥＮＯ２およびＳＯＤ１を含む（例えば、Addgene website: blog.addgene.org/plasmids-101-the-promoter-region参照）。ある実施態様において、プロモーターは、原核生物プロモーター（例えば、バクテリオファージまたは細菌プロモーター）である。バクテリオファージプロモーターの非限定的例は、Ｐｌｓ１ｃｏｎ、Ｔ３、Ｔ７、ＳＰ６およびＰＬを含む。細菌プロモーターの非限定的例は、Ｐｂａｄ、ＰｍｇｒＢ、Ｐｔｒｃ２、Ｐｌａｃ／ａｒａ、ＰｔａｃおよびＰｍを含む。

【0164】

ある実施態様において、プロモーターは誘導型プロモーターである。本明細書で使用する、「誘導型プロモーター」は、分子の存在または不在により制御されるプロモーターである。誘導型プロモーターの非限定的例は、化学制御プロモーターおよび物理制御プロモーターを含む。化学制御プロモーターについて、転写活性は、アルコール、テトラサイクリン、ガラクトース、ステロイド、金属または他の化合物などの１以上の化合物により制御される。物理制御プロモーターについて、転写活性は、光または温度などの現象により制御され得る。テトラサイクリン制御プロモーターの非限定的例は、ヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーターおよび他のテトラサイクリン応答性プロモーター系（例えば、テトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）およびテトラサイクリントランスアクティベーター融合タンパク質（ｔＴＡ））を含む。ステロイド制御プロモーターの非限定的例は、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体およびステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリーからのプロモーターに基づくプロモーターを含む。金属制御プロモーターの非限定的例は、メタロチオネイン（金属イオンを結合および隔離するタンパク質）遺伝子に由来するプロモーターを含む。病因制御プロモーターの非限定的例は、サリチル酸、エチレンまたはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）により誘導されるプロモーターを含む。温度／熱誘導型プロモーターの非限定的例は、ヒートショックプロモーターを含む。光制御プロモーターの非限定的例は、植物細胞の光反応性プロモーターを含む。ある実施態様において、誘導型プロモーターはガラクトース誘導型プロモーターである。ある実施態様において、誘導型プロモーターは、１以上の生理学的条件（例えば、ｐＨ、温度、放射、浸透圧、食塩水勾配、細胞表面結合または１以上の外因性もしくは内因性誘導剤の濃度）により誘導される。外因性インデューサーまたは誘導剤の非限定的例は、アミノ酸およびアミノ酸アナログ、サッカライドおよび多糖、核酸、タンパク質転写アクティベーターおよびリプレッサー、サイトカイン、毒素、石油ベースの化合物、金属含有化合物、塩、イオン、酵素基質アナログ、ホルモンまたはこれらの何らかの組み合わせを含む。

【0165】

ある実施態様において、プロモーターは構成的プロモーターである。本明細書で使用する、「構成的プロモーター」は、遺伝子の連続的転写を可能とする非制御プロモーターをいう。構成的プロモーターの非限定的例は、ＴＤＨ３、ＰＧＫ１、ＰＫＣ１、ＰＤＣ１、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＲＰＬ１８Ｂ、ＳＳＡ１、ＴＤＨ２、ＰＹＫ１、ＴＰＩ１、ＨＸＴ３、ＨＸＴ７、ＡＣＴ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＥＮＯ２およびＳＯＤ１を含む。

【0166】

当業者に知られる他の誘導型プロモーターまたは構成的プロモーターも考慮される。

【0167】

遺伝子発現に必要な制御配列は種または細胞型により変わり得るが、一般に、必要に応じて、ＴＡＴＡボックス、キャッピング配列、ＣＡＡＴ配列など、それぞれ転写および翻訳の開始に関与する５’非転写および５’非翻訳配列を含む。特に、このような５’非転写制御配列は、操作可能に結合した遺伝子の転写制御のためのプロモーター配列を含むプロモーター領域を含む。制御配列は、エンハンサー配列または上流アクティベーター配列も含み得る。ベクターは、５’リーダーまたはシグナル配列を含み得る。制御配列はターミネーター配列も含み得る。ある実施態様において、ターミネーター配列は、転写中のＤＮＡ遺伝子の終わりを示す。宿主細胞における本明細書に記載する１以上の遺伝子の発現に適する１以上の適切なベクターの選択および設計は、当業者の能力および裁量の範囲内である。

【0168】

発現に必要な要素を含む発現ベクターは市販され、当業者に知られる（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Fourth Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2012参照）。

【0169】

ある実施態様において、宿主細胞への組み換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドの導入は、ポリヌクレオチドのゲノム統合をもたらす。ある実施態様において、宿主細胞は、ゲノムにおいて、本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかをコードするポリヌクレオチド配列などのポリヌクレオチド配列を少なくとも１コピー、少なくとも２コピー、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー、少なくとも５コピー、少なくとも６コピー、少なくとも７コピー、少なくとも８コピー、少なくとも９コピー、少なくとも１０コピー、少なくとも１１コピー、少なくとも１２コピー、少なくとも１３コピー、少なくとも１４コピー、少なくとも１５コピー、少なくとも１６コピー、少なくとも１７コピー、少なくとも１８コピー、少なくとも１９コピー、少なくとも２０コピー、少なくとも２１コピー、少なくとも２２コピー、少なくとも２３コピー、少なくとも２４コピー、少なくとも２５コピー、少なくとも２６コピー、少なくとも２７コピー、少なくとも２８コピー、少なくとも２９コピー、少なくとも３０コピー、少なくとも３１コピー、少なくとも３２コピー、少なくとも３３コピー、少なくとも３４コピー、少なくとも３５コピー、少なくとも３６コピー、少なくとも３７コピー、少なくとも３８コピー、少なくとも３９コピー、少なくとも４０コピー、少なくとも４１コピー、少なくとも４２コピー、少なくとも４３コピー、少なくとも４４コピー、少なくとも４５コピー、少なくとも４６コピー、少なくとも４７コピー、少なくとも４８コピー、少なくとも４９コピー、少なくとも５０コピー、少なくとも６０コピー、少なくとも７０コピー、少なくとも８０コピー、少なくとも９０コピー、少なくとも１００コピーまたはそれ以上（各数値間のあらゆる数値を含む）含む。

【0170】

宿主細胞
本発明のタンパク質の何れかを、宿主細胞で発現させ得る。本明細書で使用する、用語「宿主細胞」は、モグロール、モグロシドおよびその前駆体の産生に使用するタンパク質をコードするポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドを発現させるために使用され得る細胞をいう。

【0171】

真核生物細胞または原核生物細胞を含む、あらゆる適当な宿主細胞を、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、ＳＱＥおよび本明細書に開示する他のタンパク質を含む組み換えポリペプチドの何れかの産生に使用できる。適当な宿主細胞は、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、細菌細胞（例えば、大腸菌細胞）、藻類細胞、植物細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞を含む動物細胞を含むが、これらに限定されない。

【0172】

適当な酵母宿主細胞は、カンジダ、エシェリキア、ハンセヌラ、サッカロマイセス（例えば、出芽酵母）、シゾサッカロマイセス、ピキア、クルイベロマイセス（例えば、クルイベロマイセス・ラクチス）およびヤロウイア（例えば、ヤロウイア・リポリティカ）を含むが、これらに限定されない。ある実施態様において、酵母細胞は、ハンセヌラ・ポリモルファ、サッカロマイセス・セレビシエ、サッカロマイセス・カールスベルゲンシス、サッカロマイセス・ディアスタティックス、サッカロマイセス・ノルベンシス、サッカロマイセス・クルイベリ、シゾサッカロマイセス・ポンベ、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コダマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア、ピキア・ケルクウム、ピキア・ピジェペリ、ピキア・スティピティス、ピキア・メタノリカ、ピキア・アングスタ、コマガタエラ・ファフィ、コマガタエラ・パストリス、クルイベロミセス・ラクティス、カンジダ・アルビカンスまたはヤロウイア・リポリティカである。

【0173】

ある実施態様において、酵母株は工業的多数体酵母株である。真菌細胞の他の非限定的例は、アスペルギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属、リゾプス属、アクレモニウム属、アカパンカビ属、ソルダリア属、マグナポルテ属、アロミセス属、ウスティラゴ属ボトリチス属、およびトリコデルマ属から得られた細胞を含む。

【0174】

ある実施態様において、宿主細胞はクラミドモナス（例えば、クラミドモナス・ラインハルトチイ）およびフォルミディウム(P.sp.ATCC29409)などの藻類細胞である。

【0175】

他の実施態様において、宿主細胞は原核生物細胞である。適当な原核生物細胞は、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定細菌細胞を含む。宿主細胞は、アグロバクテリウム、アリシクロバチルス、アナバエナ、アナシスティス、アシネトバクター、アシドサーマス、アートロバクター、アゾバクター、バチルス、ビフィドバクテリウム、ブレビバクテリウム、ブチリビブリオ、ブフネラ、カンペストリス、カンプリオバクター、クロストリジウム、コリネバクテリウム、クロマチウム、コプロコッカス、エシェリキア、エンテロコッカス、エンテロバクター、エルウィニア、フソバクテリウム、フィーカリバクテリウム、フランシセラ、フラボバクテリウム、ゲオバチルス、ヘモフィルス、ヘリコバクター、クレブシエラ、ラクトバチルス、ラクトコッカス、イリオバクター、マイクロコッカス、ミクロバクテリウム、メソリゾビウム、メチロバクテリウム、メチロバクテリウム、マイコバクテリウム、ナイセリア、パントエア、シュードモナス、プロクロロコッカス、ロドバクター、ロドシュードモナス、ロドシュードモナス、ロゼブリア、ロドスピリルム、ロドコッカス、セネデスムス、ストレプトマイセス、ストレプトコッカス、シネコッカス、サッカロモノスポラ、サッカロポリスポラ、スタフィロコッカス、セラチア、サルモネラ、シゲラ、サーモアナエロバクテリウム、トロフェリマ、ツラレンシス、テメキュラ、サーモシネココッカス、サーモコッカス、ウレアプラズマ、キサントモナス、キシレラ、エルシニアおよびザイモモナスを含むが、これらに限定されない属のものであり得る。

【0176】

ある実施態様において、細菌宿主細胞は、アグロバクテリウム属（例えば、アグロバクテリウム・ラジオバクター、アグロバクテリウム・リゾゲネス、アグロバクテリウム・ルビ）、アルスロバクター属（例えば、アルスロバクター・アウレッセンス、アルスロバクター・シトレウス、アルスロバクター・グロビフォルミス、アルスロバクター・ヒドロカルボグルタミナス、アルスロバクター・マイソレンス、アルスロバクター・ニコチアナエ、アルスロバクター・パラフィネウス、アルスロバクター・プロトフォルミアエ、アルスロバクター・ロゼオパラフィナス、アルスロバクター・スルフレウス、アルスロバクター・ウレアファシエンス）またはバシラス属（例えば、バシラス・チューリンゲンシス、バシラス・アントラシス、バシラス・メガテリウム、バシラス・スブチリス、バシラス・レンタス、バシラス・サーキュランス、バシラス・プミラス、バシラス・ラクタス、バシラス・コアギュランス、バシラス・ブレビス、バシラス・フィルムス、バシラス・アルカオフィウス、バシラス・リヒェニフォルミス、バシラス・クラウジ、バシラス・ステアロテルモフィルス、バシラス・ハロデュランスおよびバシラス・アミロリクエファシエンス）のものである。具体的実施態様において、宿主細胞は、バシラス・スブチリス、バシラス・プミラス、バシラス・リヒェニフォルミス、バシラス・メガテリウム、バシラス・クラウジ、バシラス・ステアロテルモフィルスおよびバシラス・アミロリクエファシエンスを含むが、これらに限定されない工業的バシラス属である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的クロストリジウム属（例えば、クロストリジウム・アセトブチリカム、クロストリジウム・テタニＥ８８、クロストリジウム・リツセブレンス、クロストリジウム・サッカロブチリカム、クロストリジウム・パーフリンジェンス、クロストリジウム・ベイジェリンキー）。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的コリネバクテリウム族（例えば、コリネバクテリウム・グルタミナム、コリネバクテリウム・アセトアシドフィルム）。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的エシェリキア属（例えば、大腸菌）である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的エルウィニア属（例えば、エルウィニア・ウレドボラ、エルウィニア・カロトボラ、エルウィニア・アナナス、エルウィニア・ハービコラ、エルウィニア・プンクタタ、エルウィニア・テレウス）である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的パントエア属（例えば、パントエア・シトレア、パントエア・アグロメランス）である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的シュードモナス属（例えば、シュードモナス・プイチダ、シュードモナス・エアルギノーザ、シュードモナス・メバロニ）である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的ストレプトコッカス属（例えば、ストレプトコッカス・エキシミレス、ストレプトコッカス・ピオゲネシス、ストレプトコッカス・ウベリス）である。ある実施態様において、宿主細胞は工業的ストレプトマイセス属（例えば、ストレプトマイセス・アンボファシエンス、ストレプトマイセス・アクロモゲネス、ストレプトマイセス・アベルミチリス、ストレプトマイセス・コエリカラー、ストレプトマイセス・アウレオファシエンス、ストレプトマイセス・アウレウス、ストレプトマイセス・フンギシジカス、ストレプトマイセス・グリセウス、ストレプトマイセス・リビダンス）である。ある実施態様において、宿主細胞は、工業的ザイモモナス属（例えば、ザイモモナス・モビリス、ザイモモナス・リポリティカ）である。

【0177】

本発明はまた哺乳動物細胞、例えば、ヒト（２９３、ＨｅＬａ、ＷＩ３８、ＰＥＲ．Ｃ６およびボーズ黒色腫細胞を含む）、マウス（３Ｔ３、ＮＳ０、ＮＳ１、Ｓｐ２／０を含む）、ハムスター（ＣＨＯ、ＢＨＫ）、サル（ＣＯＳ、ＦＲｈＬ、Ｖｅｒｏ）およびハイブリドーマ細胞株を含む多様な動物細胞型での使用に適する。

【0178】

本発明はまた多様な植物細胞型での使用に適する。

【0179】

本明細書で使用する用語「細胞」は、単一細胞または同じ細胞株もしくは種に属する細胞集団などの細胞集団をいい得る。単数表現「細胞」の使用は、細胞集団ではなく、明示的に単一の細胞をいうと解釈されてはならない。

【0180】

宿主細胞は、野生型カウンターパートに比して遺伝子修飾を含み得る。非限定的例として、宿主細胞（例えば、出芽酵母またはヤロウイア・リポリティカ）は、次の遺伝子：ヒドロキシメチルグルタリル－ＣｏＡ （ＨＭＧ－ＣｏＡ）レダクターゼ（ＨＭＧ１）、アセチル－ＣｏＡ Ｃ－アセチルトランスフェラーゼ（アセトアセチル－ＣｏＡチオラーゼ）（ＥＲＧ１０）、３－ヒドロキシ－３－メチルグルタリル－ＣｏＡ（ＨＭＧ－ＣｏＡ）シンターゼ（ＥＲＧ１３）、ファルネシル－ジホスフェートファルネシルトランスフェラーゼ（スクアレンシンターゼ）（ＥＲＧ９）の１以上の低減または不活性化のために修飾されてよく、スクアレンエポキシダーゼ（ＥＲＧ１）を過発現するよう修飾されてよくまたはラノステロールシンターゼ（ＥＲＧ７）を下方制御するよう修飾されてよい。ある実施態様において、ＰＤＲ１もしくはＰＤＲ３、および／またはグルカナーゼ遺伝子ＥＸＧ１などの１以上のトランスポータ遺伝子の発現を減少または除去するために宿主細胞を改変する。

【0181】

ある実施態様において、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個または少なくとも２０個の遺伝子を減少または不活性化させるために、宿主細胞を改変する。

【0182】

ある実施態様において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個または２０個の遺伝子を減少または不活性化させるために宿主細胞を改変する。

【0183】

遺伝子発現の低減および／または遺伝子不活性化は、遺伝子の欠失、遺伝子への点変異導入、遺伝子短縮化、遺伝子への挿入導入、遺伝子へのタグもしくは融合の導入または遺伝子の選択的編集を含むが、これらに限定されない何れかの適当な方法で達成され得る。例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの方法が使用され得る（例えば、Gardner et al., Methods Mol Biol. 2014;1205:45-78）または周知遺伝子編集技術が使用され得る。非限定的例として、遺伝子を、遺伝子置換（例えば、選択マーカーを含むマーカーで）により欠失させ得る。遺伝子を、トランスポゾン系の使用により切断することもできる（例えば、Poussu et al., Nucleic Acids Res. 2005; 33(12): e104参照）。

【0184】

本明細書に記載する組み換えポリペプチドの何れかをコードするベクターを、当分野で知られる何れかの方法を使用して適当な宿主細胞に導入し得る。酵母形質転換プロトコールの非限定的例は、引用によりその全体として本明細書に包含させる、Gietz et al., Yeast transformation can be conducted by the LiAc/SS Carrier DNA/PEG method. Methods Mol Biol. 2006;313:107-20に記載される。宿主細胞を、当業者により理解される何らかの適当な条件下で培養し得る。例えば、当分野で知られるあらゆる培地、温度およびインキュベーション条件が使用され得る。誘導型ベクターを担持する宿主細胞について、細胞を、発現を促進する適切な誘導剤と培養し得る。

【0185】

本明細書に開示の細胞のいずれも、核酸の接触および／または統合前、途中および／または、あらゆるタイプ（リッチまたは最小）およびあらゆる組成の培地で培養できる。培養条件または培養過程は、当業者により理解されるとおり、慣用の実験により最適化され得る。ある実施態様において、選択培地は種々の成分が添加される。ある実施態様において、補助的成分の濃度および量は、最適化される。ある実施態様において、培地および増殖条件（例えば、ｐＨ、温度など）の他の態様は、慣用の実験により最適化される。ある実施態様において、培地に１以上の補助的成分を添加する頻度および細胞を培養する時間は最適化される。

【0186】

本明細書に記載する細胞の培養は、当分野で知られ、かつ使用される培養容器で実施できる。ある実施態様において、通気した反応器（例えば、撹拌タンクリアクター）を細胞の培養に使用する。ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽を細胞の培養に使用する。故に、ある実施態様において、細胞は、発酵で使用される。本明細書で使用する、用語「バイオリアクター」および「発酵槽」は相互交換可能に使用され、生存生物、生存生物の一部または精製タンパク質が関与する、生物学的、生化学的および／または化学的反応が行われるハウジングまたは部分的ハウジングをいう。「大規模バイオリアクター」または「工業的規模バイオリアクター」は、商業的または準商規模で生産物を産生するのに使用するバイオリアクターをいう。大規模バイオリアクターは、一般に数リットル、数百リットル、数千リットルまたはそれ以上の範囲の体積を有する。

【0187】

バイオリアクターの非限定的例は、撹拌タンク発酵槽、回転混合デバイスで撹拌されているバイオリアクター、ケモスタット、振盪デバイスで撹拌されているバイオリアクター、気泡ポンプ発酵槽、充填床リアクター、固定床リアクター、流動床バイオリアクター、波誘発撹拌を用いるバイオリアクター、遠心性バイオリアクター、ローラーボトルおよび中空繊維バイオリアクター、ローラー装置（例えばベンチトップ、カート搭載および／または自動化改変種）、垂直積層プレート、スピナーフラスコ、撹拌またはロッキングフラスコ、振盪多ウェルプレート、ＭＤボトル、Ｔ－フラスコ、Ｒｏｕｘボトル、多表面組織培養プロパゲーター、修飾発酵槽および被覆ビーズ（例えば、細胞接着阻止のために血清タンパク質、ニトロセルロースまたはカルボキシメチルセルロースで被覆されたビーズ）を含む。

【0188】

ある実施態様において、バイオリアクターは、細胞（例えば、酵母細胞）が動いている液体および／または気泡と接触する細胞培養系を含む。ある実施態様において、細胞または細胞培養物は懸濁液で増殖される。他の実施態様において、細胞または細胞培養物は、固相担体に結合される。担体系の非限定的例は、マイクロ担体（例えば、多孔性または非多孔性であり得るポリマースフェア、マイクロビーズおよびマイクロディスク）、特定の化学基（例えば、三級アミン基）で荷電された架橋ビーズ（例えば、デキストラン）、非多孔性ポリマー繊維に捕捉された細胞を含む２Ｄマイクロ担体、３Ｄ担体（例えば、担体繊維、中空繊維、多カートリッジリアクターおよび多孔性繊維を含み得る半透膜）、イオン交換能が低減したマイクロ担体、封入細胞、キャピラリーおよび凝集体を含む。ある実施態様において、担体は、デキストラン、ゼラチン、ガラスまたはセルロースなどの材料から製作される。

【0189】

ある実施態様において、工業的規模過程を、連続的、半連続的または非連続的モードで操作する。操作モードの非限定的例は、バッチ、流加、拡張バッチ、反復バッチ、排出／充填、回転壁、回転フラスコおよび／または潅流モードの操作である。ある実施態様において、バイオリアクターは、基質ストック、例えば炭水化物源の連続的または半連続的補充および／またはバイオリアクターからの生成物の連続的または半連続的分離を可能にする。

【0190】

ある実施態様において、バイオリアクターまたは発酵槽は、反応パラメータを測定および／または調節するためのセンサーおよび／または制御系を含む。反応パラメータの非限定的例は、生物学的パラメータ（例えば、増殖速度、細胞サイズ、細胞数、細胞密度、細胞型または細胞状態など）、化学パラメータ（例えば、ｐＨ、酸化還元電位、反応基質および／または生成物濃度、酸素濃度およびＣＯ_２濃度などの溶解ガス濃度、栄養素濃度、代謝物濃度、オリゴペプチド濃度、アミノ酸濃度、ビタミン濃度、ホルモン濃度、添加剤濃度、血清濃度、イオン強度、イオン濃度、相対湿度、モル濃度、モル浸透圧濃度、他の化学物質、例えば緩衝剤、アジュバントまたは反応副産物の濃度）、物理的／機械的パラメータ（例えば、密度、伝導性、撹拌の程度、圧力および流速、剪断応力、剪断速度、粘性、色、濁度、光吸収、混合速度、変換速度ならびに温度、光強度／質などの熱力学パラメータなど）を含む。本明細書に記載のパラメータを測定するセンサーは、関連する機械および電子分野の当業者に周知である。本明細書に記載のセンサーからの入力に基づきバイオリアクターのパラメータを調節する制御系は、バイオリアクター工学の分野の当業者に周知である。

【0191】

ある実施態様において、方法はバッチ発酵（例えば、振盪フラスコ発酵）を含む。バッチ発酵（例えば、振盪フラスコ発酵）の一般的懸念は、酸素およびグルコースのレベルを含む。例えば、バッチ発酵（例えば、振盪フラスコ発酵）は、酸素およびグルコースを限定してよく、よって、ある実施態様において、株が適切に設計された流加発酵において実行する能力は過小評価されている。また、最終産物（例えば、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド前駆体またはモグロシド）は、溶解度、毒性、細胞蓄積および分泌の観点で基質（例えば、モグロール前駆体、モグロール、モグロシド前駆体またはモグロシド）とある程度異なり得て、ある実施態様において異なる発酵力学を有し得る。

【0192】

本明細書に記載する方法は、組み換え細胞、細胞ライセートまたは単離組み換えポリペプチド（例えば、ＣＢ５、ＣＤＳ、ＵＧＴ、Ｃ１１ヒドロキシラーゼ、シトクロムＰ４５０レダクターゼ、ＥＰＨ、スクアレンエポキシダーゼおよび本発明と関連する何れかのタンパク質）を使用する、モグロール前駆体（例えば、スクアレン、２，３－オキシドスクアレンまたは２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール）、モグロールまたはモグロシド（例えば、ＭＩＡ１、ＭＩＥ１、ＭＩＩＡ１、ＭＩＩＡ２、ＭＩＩＩＡ１、ＭＩＩＥ、ＭＩＩＩ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、イソモグロシドＩＶ、ＭＩＩＩＥおよびモグロシドＶ）の産生を包含する。

【0193】

本明細書に開示の組み換え細胞の何れかにより産生されたモグロール前駆体（例えば、スクアレン、２，３－オキシドスクアレンまたは２４－２５エポキシ－ククルビタジエノール）、モグロール、モグロシド（例えば、ＭＩＡ１、ＭＩＥ、ＭＩＩＡ１、ＭＩＩＡ２、ＭＩＩＩＡ１、ＭＩＩＥ、ＭＩＩＩ、シアメノシドＩ、モグロシドＩＶ、イソモグロシドＩＶ、ＭＩＩＩＥおよびモグロシドＶ）は、当分野で知られる何らかの方法を使用して同定および抽出され得る。マススペクトロメトリー（例えば、ＬＣ－ＭＳ、ＧＣ－ＭＳ）は、同定方法の非限定的例であり、目的の化合物を抽出する一助として使用し得る。

【0194】

本明細書において使用する表現および用語は、説明の目的であり、限定としてみなしてはならない。本明細書における「含む」、「包含する」、「有する」、「含有する」、「関与する」などの用語および／またはこれらのバリエーションは、その前に挙げられた項目ならびにさらなる項目を包含することを意味する。

【0195】

本発明を次の実施例によりさらに説明し、これは、決してさらなる限定と解釈されてはならない。本明細書をとおして引用する全引用文献（文献引用文献、登録特許、公開特許出願および同時係属特許出願）の内容全体は、引用により明示的に本明細書に包含させる。

【実施例】

【0196】

［実施例１］
モグロール産生を増加させるＣＢ５タンパク質の同定および機能的特徴づけ
本実施例は、モグロール産生を促進するタンパク質を同定するために、出芽酵母におけるラカンカタンパク質のスクリーニングを記載する。ライブラリーは、その発現が、モグロシド生合成に関与するタンパク質の発現と相関し、および／またはその酵素クラスと一致した、おおよそ３３３個のラカンカタンパク質を含んだ。解析には、Xia et al. Gigascience. 2018 Jun 1;7(6):giy067からのトランスクリプトームデータを使用した。その発現がモグロシド生合成に関与する１以上のタンパク質の発現と相関し、および／またはその酵素クラスと一致したタンパク質が、モグロール産生を増加させるために使用され得るか否かを決定するために、モグロール産生に関して、ライブラリー全体をスクリーニングした。

【0197】

出芽酵母宿主細胞をスクリーニングに使用した。１以上のコピーのＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ５４９１、ＡｔＣＰＲ、ＣＰＲ４４９７、ＳｇＣＤＳ、ＥＰＨ３およびＡｔＥＰＨ２を発現させるように、ならびにＥＲＧ９およびＥＲＧ１の発現をアップレギュレートするように、ならびにＥＲＧ７の発現をダウンレギュレートするように、宿主細胞ベース株を操作した。ベース株はさらに、ゲノムに組み込まれた数コピーのｐＰＧＫ１＿Ｘ＿ｔＳＳＡ１を有した。「Ｘ」は、２４ｂｐであり、かつ配列ＧＡＴＧＣＡＣＧＡＧＣＧＣＡＡＣＧＣＴＣＡＣＡＡ（配列番号４６）を有するＦ－Ｃｐｈ１認識部位に対応する。

【0198】

モグロール産生の増強に関してタンパク質ライブラリーを試験するために、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）プレートアッセイをＬＣ－ＭＳ分析と組み合わせた。個々の遺伝子を担持するプラスミドを、モグロールを産生する出芽酵母シャーシ株に形質転換し、その染色体に組み込んだ。さらなる何れの植物タンパク質も欠く株を陰性対照として使用した。

【0199】

形質転換から得られた単一コロニーを、培養培地を含有する前培養として、２６℃の振とう培養器中、１０００ｒｐｍで９６時間増殖させた。４８時間後、前培養を産生培地に移し、２６℃の振とう培養器中、１０００ｒｐｍで９６時間増殖させた。９６時間後、有機溶媒を用いて培養を抽出し、産物形成をＬＣ－ＭＳ分析により試験して、モグロールおよびモグロシド産生を評価した。ＬＸ２多重化カラム配置のＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ ＭＳを使用した。水中の１２．５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）泳動用緩衝液およびアセトニトリル勾配を用いるＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｕｃｏｒｅ ＰＦＰカラム（２．６μｍ、２．１ｍｍＸ１００ｍｍ）を、フルスキャンを使用するネガティブモードでの分離に使用した。

【0200】

最初に、質量に基づいて産物種を同定するために、ショート分析ランを行った。そのスクリーニングに基づいて、親株のモグロール産生を増加させた数タンパク質を同定した(表３および図２Ａ～２Ｂ)。特に、１１個のシトクロムｂ５（ＣＢ５）タンパク質が、スクリーニングに含まれた（図２Ｂ）。株８４８９２１、８４８９３０、８４８９１７、８４８９２２および８４８９４０により発現されるＣＢ５タンパク質を含む、これらのＣＢ５タンパク質のいくつかは、親株のモグロール産生を増加させることが見出された。

【0201】

モチーフ同定ソフトウェアを使用した、スクリーニングにおけるＣＢ５タンパク質の解析は、モグロール産生を増加させなかったＣＢ５タンパク質と比較してモグロール産生を増加させたＣＢ５タンパク質においてエンリッチされた多数の配列モチーフを同定した。

【0202】

配列番号４７～４９に対応する次のモチーフ：
ａ）アミノ酸配列ＹＴＧＬＳＰ（配列番号４７）；
ｂ）アミノ酸配列ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳ（配列番号４８）；および
ｃ）アミノ酸配列ＬＱＤＷＥＹＫＦＭ（配列番号４９）
が、株８４８９１７、８４８９２１、８４８９２２および８４８９３０において発現されるＣＢ５配列中に存在する。

【0203】

配列番号５０～５３に対応する次のモチーフ：
ａ）アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３Ｘ_４Ｘ_５Ｘ_６Ｘ_７ＥＸ_８ＩＸ_９Ｘ_１０ＹＴＧＬＳＰＸ_１１Ｘ_１２ＦＦＴＸ_１３ＬＡＸ_１４Ｘ_１５Ｘ_１６Ｘ_１７ＶＸ_１８Ｘ_１９Ｘ_２０Ｘ_２１ＳＸ_２２Ｘ_２３ＦＸ_２４Ｘ_２５Ｘ_２６Ｘ_２７Ｘ_２８Ｘ_２９Ｘ_３０Ｘ_３１（配列番号５０）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＬまたはＶであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＹまたはＷであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＷまたはＥであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＴであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＡまたはＬであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＭまたはＫであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＱまたはＡであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＡまたはＶであり；
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＷまたはＡであり；
（ｘｉ）Ｘ_１１はアミノ酸ＴまたはＡであり；
（ｘｉｉ）Ｘ_１２はアミノ酸ＡまたはＴであり；
（ｘｉｉｉ）Ｘ_１３はアミノ酸ＩまたはＶであり；
（ｘｉｖ）Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＬであり；
（ｘｖ）Ｘ_１５はアミノ酸ＭまたはＧであり；
（ｘｖｉ）Ｘ_１６はアミノ酸ＩまたはＬであり；
（ｘｖｉｉ）Ｘ_１７はアミノ酸ＦまたはＡであり；
（ｘｖｉｉｉ）Ｘ_１８はアミノ酸ＦまたはＹであり；
（ｘｉｘ）Ｘ_１９はアミノ酸ＱまたはＹであり；
（ｘｘ）Ｘ_２０はアミノ酸ＭまたはＶであり；
（ｘｘｉ）Ｘ_２１はアミノ酸ＶまたはＩであり；
（ｘｘｉｉ）Ｘ_２２はアミノ酸ＳまたはＧであり；
（ｘｘｉｉｉ）Ｘ_２３はアミノ酸ＭまたはＦであり；
（ｘｘｉｖ）Ｘ_２４はアミノ酸ＶまたはＧであり；
（ｘｘｖ）Ｘ_２５はアミノ酸ＳまたはＴであり；
（ｘｘｖｉ）Ｘ_２６はアミノ酸ＰまたはＳであり；
（ｘｘｖｉｉ）Ｘ_２７はアミノ酸ＥまたはＤであり；
（ｘｘｖｉｉｉ）Ｘ_２８はアミノ酸ＥまたはＹであり；
（ｘｘｉｘ）Ｘ_２９はアミノ酸ＦまたはＧであり；
（ｘｘｘ）Ｘ_３０はアミノ酸ＮまたはＳであり；および／または
（ｘｘｘｉ）Ｘ_３１はアミノ酸ＫまたはＨである］；
ｂ）アミノ酸配列Ｘ_１ＶＱＸ_２ＧＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＥＸ_６Ｘ_７ＬＸ_８Ｘ_９ＹＤＧＳＤＸ_１０Ｘ_１１ＫＰＬＬＭＡＩＫＧＱＩＹＤＶＳＸ_１２Ｘ_１３ＲＭＦ（配列番号５１）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＰまたはＡであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＶまたはＩであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＩまたはＬであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＳまたはＴであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＱであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＫまたはＲであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＡであり；
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＳまたはＰであり；
（ｘｉ）Ｘ_１１はアミノ酸ＫまたはＮであり；
（ｘｉｉ）Ｘ_１２はアミノ酸ＱまたはＳであり；および／または
（ｘｉｉｉ）Ｘ_１３はアミノ酸ＳまたはＧである］；
ｃ）アミノ酸配列ＬＡＸ_１Ｘ_２ＳＦＸ_３Ｘ_４Ｘ_５ＤＸ_６ＴＧＸ_７ＩＸ_８ＧＬＸ_９Ｘ_１０Ｘ_１１ＥＬＸ_１２Ｘ_１３ＬＱＤＷＥＹＫＦＭＸ_１４ＫＹＶＫＶＧＸ_１５Ｘ_１６（配列番号５２）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＬであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＭまたはＬであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＥまたはＫであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＥまたはＰであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＫまたはＥであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＬまたはＩであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＤまたはＮであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＥであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＧまたはＳであり；
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＰまたはＥであり；
（ｘｉ）Ｘ_１１はアミノ酸ＦまたはＥであり；
（ｘｉｉ）Ｘ_１２はアミノ酸ＥまたはＶであり；
（ｘｉｉｉ）Ｘ_１３はアミノ酸ＡまたはＩであり；
（ｘｉｖ）Ｘ_１４はアミノ酸ＳまたはＥであり；
（ｘｖ）Ｘ_１５はアミノ酸ＴまたはＥであり；および／または
（ｘｖｉ）Ｘ_１６はアミノ酸ＶまたはＬである］；ならびに
ｄ）アミノ酸配列Ｘ_１Ｘ_２Ｘ_３ＥＸ_４ＧＸ_５Ｘ_６Ｘ_７Ｘ_８Ｘ_９Ｘ_１０Ｄ（配列番号５３）［ここで、
（ｉ）Ｘ_１はアミノ酸ＫまたはＥであり；
（ｉｉ）Ｘ_２はアミノ酸ＰまたはＨであり；
（ｉｉｉ）Ｘ_３はアミノ酸ＡまたはＳであり；
（ｉｖ）Ｘ_４はアミノ酸ＤまたはＮであり；
（ｖ）Ｘ_５はアミノ酸ＰまたはＨであり；
（ｖｉ）Ｘ_６はアミノ酸ＳまたはＲであり；
（ｖｉｉ）Ｘ_７はアミノ酸ＥまたはＮであり；
（ｖｉｉｉ）Ｘ_８はアミノ酸ＳまたはＦであり；
（ｉｘ）Ｘ_９はアミノ酸ＱまたはＥであり；および／または
（ｘ）Ｘ_１０はアミノ酸ＡまたはＩである］
も同じく、株８４８９１７、８４８９２１、８４８９２２および８４８９３０において発現されるＣＢ５配列中に存在する。

【0204】

配列番号５８、６０、６２および６４に対応する次のモチーフ：
ａ）QVWETLKEAIVAYTGLSPATFFTVLALGLAVYYVISGFFGTSDYGSH（配列番号５８）；
ｂ）PVQVGEISEEELKQYDGSDSKKPLLMAIKGQIYDVSQSRMF（配列番号６０）；
ｃ）LAKMSFEEKDLTGDISGLGPFELEALQDWEYKFMSKYVKVGTV（配列番号６２）；および
ｄ）KPAEDGPSESQAD（配列番号６４）
が、株８４８９１７および８４８９２１において発現されるＣＢ５配列中に存在する。

【0205】

配列番号５９、６１、６３および６５に対応する次のモチーフ：
ａ）ELYWKAMEQIAWYTGLSPTAFFTILASMIFVFQMVSSMFVSPEEFNK（配列番号５９）；
ｂ）AVQIGQLTEQQLRAYDGSDPNKPLLMAIKGQIYDVSSGRMF（配列番号６１）；
ｃ）LALLSFKPEDITGNIEGLSEEELVILQDWEYKFMEKYVKVGEL（配列番号６３）；および
ｄ）EHSENGHRNFEID（配列番号６５）
が、株８４８９２２および８４８９３０において発現されるＣＢ５配列中に存在する。

【0206】

配列番号５４～５７に対応する次のモチーフ：
ａ）アミノ酸配列ＩＬＲＶＳＦＲＫＹＲＫＡＩＥＱ（配列番号５４）；
ｂ）アミノ酸配列ＲＡＦＲＰＳＩＲＦＫＫＳＨＳＴＶＰＴ（配列番号５５）；
ｃ）アミノ酸配列ＫＮＴＬＹＶＧＧ（配列番号５６）；および／または
ｄ）アミノ酸配列ＤＱＡＴＱＫＨＲＳＦＧＦＶＴＦＬＥＫＥＤ（配列番号５７）
が、株８４８９４０において発現されるＣＢ５配列中に存在する。

【0207】

表3. CB5を含む株によるモグロール産生

【表3】

【0208】

表３および図２Ｂに示すとおり、モグロール産生の増強をもたらす複数のＣＢ５タンパク質が、このスクリーニングにおいて同定され、それらは、シトクロムＰ４５０酵素ならびにシトクロムＰ４５０レダクターゼパートナーと相互作用し得る。
［実施例２］

【0209】

ヤロウイア・リポリティカにおけるＣＢ５タンパク質によるモグロール産生の増加
本実施例は、実施例１において同定された代表的ラカンカシトクロムｂ５タンパク質が、複数の細胞型でモグロール産生を増強することを確認するための、ヤロウイア・リポリティカでの試験を記載する。

【0210】

実施例１で同定された３つのＣＢ５タンパク質（配列番号１、配列番号２および配列番号３に対応）、ならびに配列番号１および配列番号３の切断バージョン（配列番号３１８に対応）を、該タンパク質が、ヤロウイア・リポリティカでのモグロールまたはモグロシド産生を増強させるか否かを決定するために、ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞において発現させた。

【0211】

１以上のコピーのＣＹＰ１７９８、ＣＹＰ５４９１－Ｔ３５１Ｍ、ＡｔＣＰＲ、ＳｇＣＤＳおよびＥＰＨ３を発現させるように、ならびにＥＲＧ１の発現をアップレギュレートするように、ならびにＥＲＧ７の発現をダウンレギュレートするように、２つの異なる宿主細胞ベース株を操作した。

【0212】

モグロール産生の増強に関して、ＣＢ５タンパク質を発現する株を試験するために、インビボプレートアッセイをＬＣ－ＭＳ分析と組み合わせた。個々の遺伝子を担持するプラスミドを、モグロールを産生するヤロウイア・リポリティカ親株に形質転換し、その染色体に組み込んだ。株９７４１３７および１４１９５９６に対応する、何れのラカンカシトクロムｂ５タンパク質も欠く親株を、陰性対照として使用した。形質転換から得られた単一コロニーを、培養培地を含有する前培養として、３０℃の振とう培養器中、１０００ｒｐｍで９６時間増殖させた。４８時間後、前培養を産生培地に移し、３０℃の振とう培養器中、１０００ｒｐｍで９６時間増殖させた。９６時間後、有機溶媒を用いて培養を抽出し、産物形成をＬＣ－ＭＳ分析により試験して、モグロールおよびモグロシド産生を評価した。ＬＸ２多重化カラム配置のＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｑ Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｆｏｃｕｓ ＭＳを使用した。水中の１２．５ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ８．０）泳動用緩衝液およびアセトニトリル勾配を用いるＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｃｃｕｃｏｒｅ ＰＦＰカラム（２．６μｍ、２．１ｍｍＸ１００ｍｍ）を、フルスキャンを使用するネガティブモードでの分離に使用した。最初に、質量に基づいて産物種を同定するために、ショート分析ランを行った。

【0213】

それぞれ、株９９４３７５および９３４９０３において発現させた、配列番号１に対応する配列、ならびに配列番号３１８に対応する配列を有する切断型ＣＢ５－ｔｒｕｎｃ、を有するＣＢ５タンパク質は、第１の株バックグラウンドにおいて、親株９７４１３７に比してモグロール産生を増加させることが観察された（表４および図３Ａ）。

【0214】

第２の株バックグラウンドにおいて、それぞれ、株１３３８４８８、１３３８４９０および１３３８４８９において発現させた配列番号１、配列番号２または配列番号３に対応する配列を有するＣＢ５タンパク質は、親株１４１９５９６に比してモグロール産生を増加させることが観察された（表４および図３Ｂ）。

【0215】

前記で考察した、配列番号４７～４９、５０～５２、５８、６０および６２に対応するモチーフが、株９９４３７５、９３４９０３および１３３８４９０において発現されるＣＢ５配列中に存在する。

【0216】

表4. CB5タンパク質を含むヤロウイア・リポリティカ株によるモグロール産生

【表4】

【0217】

表４および図３Ａ～３Ｂに示すとおり、本実施例は、実施例１で同定された代表的ＣＢ５タンパク質、および実施例１で同定されたＣＢ５タンパク質に対する類似性を共有する、ＣＢ５タンパク質の非天然型切断型は、ヤロウイア・リポリティカ宿主細胞におけるモグロール産生を増強できることを示し、その効果が、出芽酵母細胞に限定されないことを確認する。これらのデータは、同定されたＣＢ５タンパク質が、宿主細胞において発現される異種経路との相互作用により、モグロール産生を増強できること、およびその効果が宿主依存性でないことを示す。

【0218】

表5. CB5配列の非限定的例

【表5-1】

【表5-2】

【表5-3】

【表5-4】

【表5-5】

【表5-6】

【表5-7】

【0219】

表6. CDSの非限定的例

【表6】

【0220】

表7. C11ヒドロキシラーゼ (P450)、シトクロムP450レダクターゼ、エポキシドヒドロラーゼ(EPH)およびスクアレンエポキシダーゼの非限定的例

【表7】

【0221】

表8. 本発明と関連するさらなる酵素の配列

【表8】

【0222】

等価物
当業者は、本明細書に記載する特定の本発明の実施態様の多くの等価物を認識するかまたは、常套的なものを超えない試験を使用して、確認できる。このような等価物は次の特許請求の範囲に包含されることが意図される。

【0223】

本明細書に開示される特許文献を含む全引用文献は、全体として、特に本明細書で引用される開示について引用により本明細書に包含される。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図1D】

【図2A】

【図2B】

【図3A】

【図3B】

【配列表】

2024510210000001.app

【国際調査報告】