特表 2024-510278 官能化セルロース、セルロースの酵素官能化の方法、有機酸を使用するセルロースの酵素官能化の方法、ならびに増加した疎水性を有するセルロース、および物品の生成のための方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-06

(54)【発明の名称】官能化セルロース、セルロースの酵素官能化の方法、有機酸を使用するセルロースの酵素官能化の方法、ならびに増加した疎水性を有するセルロース、および物品の生成のための方法

(51)【国際特許分類】

   C08B 3/00 20060101AFI20240228BHJP

   C08B 3/08 20060101ALI20240228BHJP

【ＦＩ】

C08B3/00

C08B3/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023557148

(86)(22)【出願日】2022-03-18

(85)【翻訳文提出日】2023-11-13

(86)【国際出願番号】 BR2022050097

(87)【国際公開番号】W WO2022192978

(87)【国際公開日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】102021005126-4

(32)【優先日】2021-03-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】BR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521023425

【氏名又は名称】スザノ・エス．エー．

【氏名又は名称原語表記】ＳＵＺＡＮＯ Ｓ．Ａ．

(71)【出願人】

【識別番号】519120798

【氏名又は名称】ウニベルシダデ デ サンパウロ－ユーエスピー

(74)【代理人】

【識別番号】110003708

【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所

(72)【発明者】

【氏名】シケイラ、ジェルマーノ

(72)【発明者】

【氏名】アランテス、バルデイル

(72)【発明者】

【氏名】マロッティ、ブラス・デ・ソウザ

【テーマコード（参考）】

4C090

【Ｆターム（参考）】

4C090AA05

4C090BA25

4C090BC08

4C090BD36

4C090CA38

4C090CA43

4C090DA02

(57)【要約】

本発明は、セルロースが脂肪酸からの疎水性エステル基を含む官能化セルロース、ならびに増加した疎水性を有するセルロースを生成する、セルロースの官能化のプロセスおよび方法にも関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

セルロースが疎水性エステル基を含むことを特徴とする、官能化セルロース。

【請求項2】

前記セルロースが少なくとも０．０１の置換度を有することを特徴とする、請求項１に記載の官能化セルロース。

【請求項3】

前記セルロースが、セルロース繊維、セルロースマイクロフィブリル、マイクロフィブリル化セルロース、セルロースナノフィブリル、ナノフィブリル化セルロース、セルロースフィラメント、またはこれらの混合物でありうることを特徴とする、先行する請求項に記載の官能化セルロース。

【請求項4】

前記疎水性エステル基が、有機酸、好ましくは２～１８個の炭素の炭素鎖を有する有機酸に由来することを特徴とする、請求項１に記載の官能化セルロース。

【請求項5】

前記有機酸が植物起源のものであることを特徴とする、請求項１に記載の官能化セルロース。

【請求項6】

前記有機酸が、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、ブタン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸、カプリン酸、カプリル酸、ラウリン酸、ステアリン酸、メリッサ（melissa）、吉草酸、またはこれらの混合物から選択されることを特徴とする、請求項４または５に記載の官能化セルロース。

【請求項7】

酵素がリパーゼであることを特徴とする、請求項１～６に記載の官能化セルロース。

【請求項8】

前記リパーゼが、ＡｍａｎｏリパーゼＡ、ブタの膵臓からのリパーゼ、カンジダ種（Candida sp）のアンタルチカ（antartica）およびルゴサ（rugosa）からのリパーゼ、コウジカビ（Aspergillus oryzae）からのリパーゼ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ１５０に固定化されたリパーゼＢカンジダ・アンタルチカから選択されることを特徴とする、請求項７に記載の官能化セルロース。

【請求項9】

セルロースの酵素官能化の方法であって、酵素の作用により有機酸からセルロースにエステル基を導入することを含むことを特徴とする、前記方法。

【請求項10】

前記方法が、少なくとも１ｇの酵素の存在下で少なくとも１Ｍの有機酸により各１ｇのセルロースを官能化することを含むことを特徴とする、請求項１０に記載のセルロースの酵素官能化の方法。

【請求項11】

前記方法が、１：５０：１のセルロース：有機酸：酵素の比による官能化を含むことを特徴とする、請求項１０に記載のセルロースの酵素官能化の方法。

【請求項12】

前記方法が、少なくとも７．４３ｇのリパーゼの存在下で２０８ｇ～４１６．６６ｇのブタン酸により各１ｇのセルロースを官能化することを含むことを特徴とする、請求項９～１１に記載のセルロースの酵素官能化の方法。

【請求項13】

有機酸を用いるセルロースのエステル化の方法であって、リパーゼの酵素触媒により有機酸からセルロースにエステル基を導入することを特徴とする、方法。

【請求項14】

有機酸からのセルロースの酵素官能化方法であって、以下の工程：
１．セルロースを水性媒体中に分散させる工程；
２．前記水性媒体をエタノール／アセトン混合物に置きかえる工程；
３．前記セルロースをジメチルホルムアミドに再懸濁させ、少なくとも１％の質量濃度を得る工程；
４．撹拌下に保持しながら、１％ｍ／ｍ ＤＭＦのセルロース懸濁液の１００ｇ毎に少なくとも５０：１の質量比の酸：酵素を添加し、反応混合物を生成し、次いで放置する工程；
５．前記懸濁液を遠心分離することによって、官能化セルロースを回収する工程；
６．任意に、前記官能化セルロースをアセトンに再懸濁させ、続いて遠心分離し、上澄みを除去し、前記セルロースを、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の水溶液に再懸濁させる工程；
７．任意に、続いて遠心分離により官能化セルロースを得て、蒸留水に再懸濁させる工程
を含むことを特徴とする、有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項15】

工程４が、少なくとも２２１ｇのＤＭＦを含むことを特徴とする、請求項１４に記載の有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項16】

セルロースの少なくとも０．２５質量％の割合でセルロースを水性媒体中に分散させる工程（１）を特徴とする、請求項１４に記載の有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項17】

工程（２）の前記エタノール／アセトン混合物が１：５～５：１の比であることを特徴とする、請求項１４に記載の有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項18】

工程（４）の前記放置が少なくとも１２時間、好ましくは７２時間であることを特徴とする、請求項１４に記載の有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項19】

前記反応混合物を遠心分離して、残留有機酸を除去する工程（４ａ）が工程（４）の後に続くことを特徴とする、請求項１４に記載の有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項20】

酵素が加熱により非活性化される工程（４ｂ）が工程（４ａ）の後に続くことを特徴とする、請求項１４に記載の有機酸からのセルロースの酵素官能化方法。

【請求項21】

増加した疎水性を有するパルプを生成するための方法であって、
（ａ）セルロース原材料を供給すること；
（ｂ）リパーゼの存在下、有機酸から誘導されたエステル基を導入することにより、前記セルロース原材料を官能化して、増加した疎水性を有する官能化セルロースを生じること；
（ｃ）前記増加した疎水性を有する官能化セルロースを回収することを含むこと
を特徴とする、方法。

【請求項22】

請求項２１に記載のセルロースの官能化のためのリパーゼの使用であって、リパーゼ／セルロースの割合が、セルロース１ｇ当たり少なくとも１ｇのリパーゼであることを特徴とする、使用。

【請求項23】

請求項２１に記載の官能化セルロースを含む物品であって、セルロースが少なくとも０．０１の置換度の官能化度を有することを特徴とする、物品。

【発明の詳細な説明】

【発明の分野】

【0001】

[001]本発明は、有機酸からの疎水性エステルを有する官能化セルロース、ならびにその官能化法、および増加した疎水性の特徴をセルロースに与える方法に関する。セルロースは、好ましくは、マイクロフィブリル化（ＣＭＦ）またはナノフィブリル化（ＣＮＦ）セルロースである。

【発明の背景】

【0002】

[002]環境保全、ならびに再生可能資源、たとえば、サトウキビおよび漂白ユーカリクラフトパルプ（bleached eucalyptus kraft pulp）（ＢＥＫＰ）に重点を置いた、リグノセルロース材料の供給源からの原材料の適用に関連して、環境持続可能性が経済発展に取って代わっている。両方の栽培物は、すでに確立された常に成長している市場を有していることに加えて、高い生産性、広範囲の流通を有する。これらの材料は、高分子、たとえばリグニンおよびバイオポリマー、たとえば、セルロースおよびヘミセルロースの供給源であり、セルロースが、多数の産業界、たとえば、パルプ製紙部門、梱包およびバイオエネルギーにおいて多数の用途があるので最も際立っており、ブラジルが世界で第２位のパルプ生産国であり、生産の３分の２を国際市場に送り出している。したがって、これは、セルロース微粒子およびナノ粒子、たとえば、それぞれマイクロフィブリル化セルロース（ＣＭＦ）およびナノフィブリル化セルロース（ＣＮＦ）を含むいくつかの新たな生成物の合成のための、主要な原材料のうちの１つである。

【0003】

[003]セルロース粒子は、原繊維の高充填セットから単離される。したがって、これらをより高価な材料、たとえば繊維またはカーボンナノチューブの代替物として考慮することができる。粒子を物理的および化学的の両方において異なる方法により単離することができ、これらは、産業部門にとって極めて望ましい特性、たとえば、高い機械抵抗性、軽量および多数のヒドロキシルのために高度な親水性を有し、故に複合材料の生成、特にナノ粒子の場合にはナノ複合材料の作製のために優れた材料になる。用途の範囲を拡大する目的において、セルロース粒子の官能化によって物理化学的特性を変えること、たとえばマイクロフィブリル化セルロース（ＣＭＦ）またはナノフィブリル化セルロース（ＣＮＦ）が望ましく、故に、他の材料との適合性を拡大する。

【0004】

[004]当該技術は、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．（ＨＵＡＮＧ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｆｕｌｌｙ Ｇｒｅｅｎ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ．Ｉｎ：ＨＡＮＩＥＨ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．（Ｅｄ．）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｎａｎｏｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ａｎｄ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｎａｎｏｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ．１．ｅｄ．Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：Ｗｉｌｅｙ－ＶＣＨ，２０１７．Ｉｐ．３０１－３３４．）のように、ナノセルロースの表面が、物理的相互作用（分子および高分子の吸着）、およびセルロース材料と結合剤の共有結合を確立する目的の手法の使用の両方により官能化されうることを明らかにしている。これらの結合を確立する化学反応は、化学または生化学経路（酵素）により触媒されうる。基本的に、すべての化学官能化は、表面に安定した正または負の静電荷を導入し、とりわけナノ複合材料の非極性構造または疎水性の特性と一緒に使用される場合、より良好な分散を得ること、またはナノセルロースの表面エネルギーの特徴を調整して適合性を改善することを可能にするという主要な目的を有し、Ｈａｂｉｂｉ，ＬｕｃｉａおよびＲｏｊａｓ（ＨＡＢＩＢＩ，Ｙ．；ＬＵＣＩＡ，Ｌ．Ａ．；ＲＯＪＡＳ，Ｏ．Ｊ．Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ：ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｒｅｖｉｅｗｓ，ｖ．１１０，ｎ．６，ｐ．３４７９－５００，９ Ｊｕｎｅ ２０１０．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂｍｅｄ／２０２０１５００＞）により明らかである。

【0005】

[005]当該技術は、いくつかの分野、たとえば、生物医学、織物、空気および製紙産業に適用される、化学触媒を使用した官能化ナノセルロースの潜在性を明らかにしている。

【0006】

[006]産業界では、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｔｌａｎｔａ／Ｇｅｏｒｇｉａ，ＵＳＡ）およびＩｎｏＦｉｂ（Ｇｒｅｎｏｂｌｅ／Ｉｓｅｒｅ，Ｆｒａｎｃｅ）が機能性ナノセルロースの生成方法を開発した。Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｒｏｃｅｓｓは、ＡＶＡＰ（登録商標）として知られている方法により、リグノセルロース分解性材料それ自体から抽出されたリグニンをセルロースの官能化のために使用する（ＣＮＣ－Ｌ／ＣＮＦ－Ｌ）。２０１２年に設立されたフランスの会社であるＩｎｏｆｉｂは、官能化または非官能性ＣＮＦを見出すことが可能なポートフォリオ（ＩＮＯＦＩＢ．ＩｎｏＦｉｂ．Ａｖａｉｌａｂｌｅ ａｔ：＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｏｆｉｂ．ｆｒ／ｌｅｎｔｒｅｐｒｉｓｅ／＞．Ａｃｃｅｓｓｅｄ ｏｎ：１２ ｍａｒ．２０１９）を有する。両方の会社は、彼らの材料の開発のために化学経路のみを使用する。

【0007】

[007]生物工学経路に関しては、酵素が触媒として使用され、生成物が生物医学分野（「薬物送達」およびバイオセンサー）に使用できることに加えて、利点、たとえば、穏やかな反応条件、低減されたエネルギー消費量を有する反応がある。これらの利点にかかわらず、セルロースナノ粒子の官能化反応における触媒としての酵素の使用は、文献においてほとんどなく、とりわけマイクロフィブリル化（ＣＭＦ）またはナノフィブリル化（ＣＮＦ）セルロースについてそうであり、依然として事実上探索されていない分野であるが、途方もない商業的潜在性のある分野である。

【0008】

[008]増加した疎水性を有するセルロースは、官能化として知られている方法において、より疎水性の化学基の導入により、マイクロフィブリル化（ＣＭＦ）またはナノフィブリル化（ＣＮＦ）セルロースのように、そのようなセルロースの表面に存在するヒドロキシルをマイクロとナノの両方のスケールで改質することによって達成されうる。単一工程で人工的に設計され構造的に制御されたナノセルロースを得ることを目的にした酵素官能化が、注目を集めており、Ｂｏｚｉｃ（ＢＯＺＩＣ，Ｍ．；ＧＯＲＧＩＥＶＡ，Ｓ．；ＫＯＫＯＬ，Ｖ．Ｌａｃｃａｓｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎ ｂｙ ｃａｆｆｅｉｃ ａｎｄ ｇａｌｌｉｃ ａｃｉｄｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ．Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，ｖ．８７，ｎｏ．４，ｐ．２３８８－２３９８，２０１２）に報告されている。エステルの形成は、より高い疎水性をセルロース表面に賦与する１つの方法である。

【0009】

[009]本発明は、有機酸、好ましくは脂肪酸と、基材としてのセルロースのヒドロキシル基とを反応させるエステル化反応である、酵素官能化を適用し、故に増加した疎水特性を有するセルロース生成物を生じることによって、当該技術の問題を克服する。当該技術の努力、たとえば、無水酢酸を伴う酵素の使用にもかかわらず、本発明は、新たな化合物群、たとえば有機酸を利用して、より大きな疎水性値を達成する。好ましくは、有機酸は２～１８個の炭素の炭素鎖を有し、好ましくは脂肪酸である。加えて、方法は、環境に注意して行われ、方法に環境持続可能性を提供し、それは、当該技術より少ない工程を有し、主として有機酸を植物性原材料から得ることができるからである。

【発明の簡単な説明】

【0010】

[010]本発明は、官能化セルロースであって、疎水性エステル基を含む、官能化セルロースを提供する。好ましくは、本発明の第１の目的である官能化セルロースは、有機酸、好ましくは脂を起源とする疎水性エステル基を有する。特定の態様において、有機酸から誘導されるエステル基は、酵素の作用によりセルロースに組み込まれ、酵素はリパーゼでありうる。有機酸は、植物起源のものであってもよく、とりわけ、ブタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはこれらの混合物から選択されうる。セルロースの酵素官能化の方法も開示され、各１ｇのセルロースの官能化が、１ｇの酵素の存在下で少なくとも１Ｍの有機酸によって行われ、セルロース：酸：酵素の比が１：５０：１である。

【図面の簡単な説明】

【0011】

【図1A】[011]図１Ａは、溶媒切替（solvent switching）の後に実施されたレーザー回折により実施されたＣＭＦのサイズ分析である（Ａ）。

【図1B】[012]図１Ｂは、異なる脂肪酸を使用した官能化反応の後に、レーザー回折により実施されたＣＭＦのサイズ分析である（Ｂ）。

【図2】[013]図２は、表１の値と、接触角の例証画像を伴った、官能化反応前および後にＣＭＦを使用した異なる接触角との相関関係の代表例である。

【図3A】[014]図３Ａは、官能化反応の前に、図１Ａのマイクロフィブリル化セルロース（ＣＭＦ）を使用して実施された分析を伴う、ＸＰＳ技術により生成されたスペクトルの代表例である。

【図3B】[015]図３Ｂは、アシルドナーとしてブタン酸を使用した後に、図１Ｂのマイクロフィブリル化セルロース（ＣＭＦ）を使用して実施された分析を伴う、ＸＰＳ技術により生成されたスペクトルの代表例である（Ｂ）。

【図3C】[016]図３Ｃは、アシルドナーとしてオレイン酸を使用した後に、図１Ｂのマイクロフィブリル化セルロース（ＣＭＦ）を使用して実施された分析を伴う、ＸＰＳ技術により生成されたスペクトルの代表例である（Ｃ）。

【図4A】[017]図４Ａは、官能化反応の前に、ＣＭＦ漂白ユーカリクラフトパルプのＡＦＭ－ＩＲ技術を使用して生成された画像およびスペクトルの代表例である（Ａ）。

【図4B】[018]図４Ｂは、アシルドナー基としてオレイン酸を用いたセルロースの官能化反応の後に得られた、漂白ユーカリクラフトパルプのＣＭＦのＡＦＭ－ＩＲ技術を使用して生成された画像およびスペクトルの代表例である（Ｂ）。

【図4C】[019]図４Ｃは、アシル基ドナーとしてブタン酸を用いた官能化反応の後に得られた、漂白ユーカリクラフトパルプのＡＦＭ－ＩＲ ＣＭＦ技術を使用して生成された画像およびスペクトルの代表例である（Ｃ）。

【図5A】[020]図５Ａは、官能化反応の前に、ＮＭＲ技術を使用して生成されたセルローススペクトルの代表例である（Ａ）。

【図6】[021]図６は、本発明に使用される例示的パルプである、漂白クラフトパルプ（ＢＥＫＰ）ＣＮＦ繊維の原子間力顕微鏡画像である。（Ｂ）。

【図6】[022]図６は、本発明に使用される例示的パルプである、漂白クラフトパルプ（ＢＥＫＰ）ＣＮＦ繊維の原子間力顕微鏡画像である。

【図7】[023]図７は、本発明に使用される例示的パルプである漂白クラフトパルプ（ＢＥＫＰ）の、ＣＮＦ繊維の平均直径分布のヒストグラムである。

【図8】[024]図８は、溶媒交換の際の漂白サトウキビバガスパルプのＣＮＦの粒径分布の例証である。

【図9A】[025]図９Ａは、酵素官能化処理前の漂白ユーカリクラフトパルプ（Ａ）のＸ線励起光電子分光法（ＸＰＳ）技術を介して生成された、セルロースに存在する結合のスペクトルの代表例である。

【図9B】[026]図９Ｂは、酵素官能化処理後の漂白ユーカリクラフトパルプ（Ａ）のＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）技術を介して生成された、セルロースに存在する結合のスペクトルの代表例である。

【図10】[027]図１０は、漂白サトウキビバガスパルプＣＮＦ繊維の原子間力顕微鏡画像である。

【図11】[028]図１１は、漂白サトウキビバガスのＣＮＦの平均直径分布のヒストグラムである。

【図12A】[029]図１２Ａは、酵素官能化処理前の漂白サトウキビバガスのパルプのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の技術を介して生成された、セルロースに存在する結合のスペクトルの代表例である（Ａ）。

【図12B】[030]図１２Ｂは、酵素官能化処理後の漂白サトウキビバガスのパルプのＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）の技術を介して生成された、セルロースに存在する結合のスペクトルの代表例である（Ｂ）。

【図13】[031]図１３は、ＡＦＭにより生成された画像およびその対応するＦＴ－ＩＲスペクトルである。リサイクル数５の後の固定化酵素を用いる反応（ＣＦＭ－Ｆ５）。

【発明の詳細な説明】

【0012】

[032]本発明は、官能化セルロース、それを得るためのプロセスおよび方法を指す。本発明は、セルロースの官能化を提供し、セルロースは、セルロース繊維、マイクロフィブリル化セルロース、ナノフィブリル化セルロースまたはこれらの混合物でありうる。好ましくは、セルロースは、マイクロフィブリル化（ＣＭＦ）またはナノフィブリル化（ＣＮＦ）セルロースである。本発明の目的のために、セルロースは、たとえば、ベータ（１～４）連結を有する数百個から数千個のＤ－グルコース単位の直鎖からなる多糖を指し、これらは木材の原材料に存在する。木材およびパルプ繊維供給原料に存在するセルロースの量は、ＴＡＰＰＩ Ｔ－２９４ｃｍ－０９方法を使用して本発明に従って測定される。

【0013】

[033]この意味において、リグノセルロース材料のいくつかの供給源を使用することができ、サトウキビバガスおよび漂白ユーカリクラフトパルプ（ＢＥＫＰ）に重点が置かれている。

【0014】

[034]この意味において、セルロース繊維は構造に多くのヒドロキシル基を有し、そのことが水素結合を容易に確立すること、ならびに親水性の性格を与えることを可能にする。マイクロフィブリル化またはナノフィブリル化されると、繊維サイズ、絡み合いおよび接触表面により、結合を形成するこの能力は増加する。したがって、とりわけ微粉砕パルプの官能化は、より重要になる。

【0015】

[035]第１の態様において、本発明は、官能化セルロースであって、セルロースが疎水性エステル基を含む、官能化セルロースを提供する。好ましくは、本発明の第１の目的である官能化セルロースは、有機酸を起源とする疎水性基を有し、有機酸は２～１８個の炭素の炭素鎖を有する酸であり、より好ましくは脂肪酸であり、さらにより好ましくは、ブタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはこれらの混合物から選択される脂肪酸であり、疎水性エステル基が賦与される。

【0016】

[036]特定の態様において、有機酸から誘導されるエステル基は、酵素の作用によりセルロースに組み込まれる。酵素はリパーゼでありうる。

【0017】

[037]リパーゼは、エステル結合の加水分解反応または合成を触媒することができる酵素である。本発明に使用することができるリパーゼのうちで多くのものは、市販の製品として容易に入手可能である。本発明に従って使用されるリパーゼは、単独型またはリパーゼの組み合わせのものでありうる。本発明に適切なリパーゼの例は、ＡｍａｎｏリパーゼＡ、ブタの膵臓からのリパーゼ、カンジダ種（Candida sp）のアンタルチカ（antartica）およびルゴサ（rugosa）からのリパーゼ、コウジカビ（Aspergillus oryzae）からのリパーゼ、Ｉｍｍｏｂｅａｄ１５０に固定化されたリパーゼＢカンジダ・アンタルチカである。たとえば、ＥＣ３．１．１．３リパーゼが引用される。

【0018】

[038]使用されるリパーゼの量は、反応におけるアシル基供与源の質量に基づいて、好ましくは［１．２５］～［５］質量パーセント、特に［２］～［３］パーセントである。

【0019】

[039]有機酸は、植物起源のものでありうる。さらに、有機酸は２～１８個の炭素の炭素鎖を有する有機酸であり、好ましくは、酸は脂肪酸であり、より好ましくは、脂肪酸は、ブタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはこれらの混合物から選択されうる。使用される有機酸の量は、反応混合物の質量に基づいて、３２．５～７０質量％、特に６０～６５％である。

【0020】

[040]本発明の目的である官能化セルロースは、有利には、官能化された後に寸法の増加を示さない。このように、図１Ａおよび１Ｂを比較的に使用すると、疎水性が増加したにもかかわらず、官能化によって、同じサイズのセルロースを得ることができることを検証することが可能である。図１２に例証されているように、セルロース官能化によって得られる接触角が表示されており、ＣＭＦに組み込まれた脂肪酸に由来する炭素－炭素結合の量の増加を示すＸＰＳスペクトルを例証する図２Ａ～２Ｃにより裏付けられる。

【0021】

[041]このように、得られる官能化セルロースは、好ましくは、増加量のエステル基を有する。好ましくは、エステル基の存在は、セルロースの約５０ｍｍｏｌ／ｇである。この意味において、本発明の目的である官能化セルロースは、少なくとも０．０１の官能化（置換）度および少なくとも０．０１の表面置換度を提示する。

【0022】

[042]本発明の第２の目的は、セルロースの酵素官能化の方法であって、方法が、少なくとも１ｇの酵素の存在下で少なくとも１Ｍの有機酸により各１ｇのセルロースを官能化することを含み、セルロース：有機酸：酵素の比が１：５０：１である、方法を提供することである。一例として、過剰量下で、各１ｇのセルロースに、５８８ｇの脂肪酸を４７ｇのリパーゼの存在下で使用した。この意味において、本発明はまた、有機酸を用いるセルロースのエステル化の方法であって、脂肪酸のエステル基をリパーゼの酵素触媒によりセルロースに導入することによって達成される、方法も提供する。

【0023】

[043]本発明の第３の目的は、有機酸からのセルロースの酵素官能化の方法であり、以下の工程を含む：
[044]１．セルロースを水性媒体中に分散させる工程；
[045]２．水性媒体をエタノール／アセトン混合物に置きかえる工程；
[046]３．セルロースをジメチルホルムアミドに再懸濁させ、少なくとも１％の質量濃度を得る工程；
[047]４．撹拌下に保持しながら、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中１％ｍ／ｍでセルロース懸濁液の１００ｇ毎に少なくとも５０：１の質量比の酸：酵素を添加し、反応混合物を生成し、次いで放置する工程；
[048]５．懸濁液を遠心分離することによって、官能化セルロースを回収する工程；
[049]６．任意に、官能化セルロースをアセトンに再懸濁させ、続いて遠心分離し、上澄みを除去し、セルロースを、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の水溶液に再懸濁させる工程；
[050]７．任意に、続いて遠心分離により官能化セルロースを得て、蒸留水に再懸濁させる工程。

【0024】

[051]好ましくは、工程４は、少なくとも２２１ｇのＤＭＦを含む。

【0025】

[052]態様の一例として、マイクロフィブリル化セルロース（ＣＭＦ）を、１％（ｍ／ｍ）の濃度に達するまで水性媒体で希釈し、溶媒交換を、連続遠心分離を使用して実施した。簡潔には、１％ｍ／ｍのＣＭＦ水性懸濁液の１０ｍＬを、５０ｍＬの円錐遠心分離管により５℃および１３，３００ｇ（６，０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、上澄みを収集し、廃棄した。次いで、１０ｍＬのエタノール／アセトン（１：１）混合物を添加し、撹拌により混合物をホモジナイズし、懸濁液を同じ条件下で再び遠心分離した。この手順を合計５回繰り返した。５回目の遠心分離の終了時に、ＣＭＦを１０ｍＬのＤＭＦに再懸濁させ、１％（ｍ／ｍ）の最終濃度を得て、およそ１ｍＬのアリコートを取り出し、粒径についてレーザー回折により分析した。

【0026】

[053]官能化反応は、１２５ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて、６０ｍＬの総反応体積を用いて、１７０ｒｐｍにより４８時間の軌道撹拌下で行った。反応は、アシルドナー基として２５ｇのオレイン酸、４．２５ｇのＤＭＦ中１％ｍ／ｍのＣＭＦ懸濁液、３３ｇのＤＭＦおよび２ｇのリパーゼ（ＣＡＢＬ，Ｓｉｇｍａ）を使用して実行した。４８時間後、反応混合物を上記に記述した条件下で遠心分離して、残留有機酸を除去し、固体材料（ＣＭＦ）を１０ｍＬの蒸留水に再懸濁させ、５分間沸点加熱して、酵素を非活性化した。次いで、懸濁液を再び遠心分離し、得られたペレットを最初に１０ｍＬのアセトンに再懸濁させ、４回遠心分離した。４回目の遠心分離工程で上澄みを除去した後、ＣＭＦを１０ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１％水溶液に再懸濁させ、５回遠心分離した。最後に、５回目の遠心分離の後に得たＣＭＦを１０ｍＬの蒸留水に再懸濁させ、再び遠心分離した。

【0027】

[054]図１Ａおよび１Ｂは、溶媒交換の前（１Ａ）および後（１Ｂ）に取った読取り値のレーザー回折により実施された、および異なる脂肪酸を使用した官能化反応の後（１Ｂ）にも実施されたサイズ分析を例証する。図１Ａおよび１Ｂは、すべての官能化工程でＣＭＦサイズに変化がなかったことを明確に実証しており、分析はレーザー回折機器により実行された。検証されたように、粒子分析器により評価された粒子のサイズに変化はなく、実施された溶媒の交換によってサイズを増加させることなく、ＣＭＦにおいてエステル化反応が発生した。

【0028】

[055]これらの工程の後に得られたＣＭＦを、原子間力顕微鏡法－ＡＦＭ、ＡＦＭ－ＩＲ、ＮＭＲ、接触角、およびＸ線励起光電子分光法－ＸＰＳの粒径分析に使用した。

【0029】

[056]接触角分析は、Ｒａｍｅ－Ｈａｒｔ ３００Ｆ１ゴニオメーターを使用して実施した。機器を使用して、ＣＭＦおよび官能化ＣＭＦ試料（ＣＭＦ－Ｆ）で調製されたフィルム上の１μＬの脱イオン水の液滴により接触角を測定した。フィルムは、官能化ＣＭＦ／ＣＭＦの希釈溶液（０．１％）を室温で２４時間乾燥することにより調製した。測定の良好な統計管理を可能にするため、３滴を各試料上に置き、５つの角度測定値を各液滴で取った。対照ＣＭＦの接触角の値は、親水性のために３０°に近く、これらの結果は文献に見出されるものに類似していた。最初に、官能化に使用される生化学経路は、非官能化ＣＭＦ（対照）と比較したときに、肯定的な結果を実証していることに注目することができる。異なる有機酸を官能化反応で比較し、対照と比較したとき高い疎水性を提示したのはオレイン酸とブタン酸であった。ブタン酸は高い値に達し、オレイン酸（＞８０°）と異なる疎水性値（＞１１０°）に達し、図２の表１において見ることができる。

【0030】

[057]ＣＭＦの表面改質を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によりさらに分析した。分析は、低圧力でＭｇ Ｋライン（ｈ＝１２５３．６ｅＶ）を備え、１０ｅＶで作動する市販の分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ－Ａｌｐｈａ）を使用して実施した。図３Ａおよび３Ｂを比較することによって分かるように、結果は、表面の化学組成に明確な変化があり、炭素－炭素結合の数が増加していることを示す。

【0031】

[058]具体的に、図３Ａ、３Ｂおよび３Ｃは、ＸＰＳ技術を使用して生成されたスペクトルを示す。分析は、官能化反応の前（Ａ）、ならびにアシルドナーとしてブタン酸（Ｂ）およびオレイン酸（Ｃ）を使用した後のＣＭＦを使用して実行した。図を分析すると、ＣＭＦに組み込まれた有機酸に由来する炭素－炭素結合量の増加を検証することが可能である（ＢおよびＣ）。

【0032】

[059]さらに、官能化の前後の炭素原子の割合を分析する場合、下記の表２によると、表面に存在する炭素原子の量の増加が検証され、これらの原子は、ＣＭＦポリマーに連結されたオレイン酸に由来する。

【0033】

[060]

【0034】

【表1】

【0035】

[061]ここでＣＭＦ－ＦＡＢは、ブタン酸官能化マイクロフィブリル化セルロースであり、ＣＭＦ－ＦＡＯは、オレイン酸官能化マイクロフィブリル化セルロースである。

【0036】

[062]具体的に、表２は、酵素エステル化反応の前（対照）および後の、異なるリグノセルロース原材料のフィルムの表面上に見出される、ＸＰＳにより得た酸素原子の割合およびこれらと炭素原子との関係を実証する。表を観察すると、ＣＭＦにおいて炭素の量が増加し、故に、酵素エステル化反応の後に酸素／炭素比が減少していると結論づけることが可能である。

【0037】

[063]図４Ａ～４Ｃに例証されているように、ＦＴ－ＩＲを融合したＡＦＭを使用して別の定性分析技術が実施され、この技術はＡＦＭ－ＩＲとして知られている。この技術は、画像の生成に加えて、赤外スペクトルがマイクロファイバーの特定の地点から生成されることを可能にする。結果はＣＭＦのエステル化にブタン酸とオレイン酸の両方を使用することにより、エステル化反応が十分に発生したことを示し、これは非官能化ＣＭＦ（図４Ａ）と異なり、１７４０ｃｍ－１の近くにエステル基の特徴的なバンドが現れた（図４Ｂおよび４Ｃ）ことによって証明されている。さらにＡＦＭにより生成された画像は、ＣＭＦが官能化反応の後であっても同じサイズであることを示す。両方の分析は、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＣＮＰＥＭ）にあるＮａｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＮＮａｎｏ）において実行された。

【0038】

[064]図５は、ブタン酸官能化反応（図５）の前（図５Ａ）および後（図５Ｂ）の試料を使用して生成された、核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルを例証する。分析は、プローブ：４ｍｍ ＣＰ／ＭＡＳを備えたＡｖａｎｃｅ ＩＩＩ ４００ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ（Ｂｒｕｋｅｒ）－９．４Ｔｅｓｌａ（水素周波数で４００ＭＨｚ）により実行した。生成されたスペクトルは、ＡＣＤ Ｓｐｅｃｔｒｕｓ Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ ２０１８ソフトウエアバージョン２．５を使用して分析し、見出されたピークを表３に列挙する。

【0039】

[065]

【0040】

【表2】

【0041】

[066]具体的に、表３は、主要な化学基およびこれらの対応する「化学シフト」値が、図５Ａおよび図５Ｂに示されるＮＭＲスペクトルに見出されることを実証している。官能化反応の後には、新たなタイプの炭素ハイブリダイゼーション（ｓｐ３およびｓｐ２）、ならびに新たな化学基（カルボキシル基）が見出される。スペクトルに示されるこの化学変化は、酵素リパーゼにより触媒された、ＣＭＦに存在するヒドロキシルとブタン酸とのエステル化反応に潜在的に起源する。

【0042】

[067]スペクトルの分析は、ピラノシド環のスペクトルに見出される炭素原子の存在を示唆し、官能化反応の後にＣＭＦにおいて化学変化があったことを実証している（図５Ａおよび５Ｂ）。１４．０８～３６．６２ｐｐｍで変動する値を有するピークの出現（図５Ｂ）は、ブタン酸から誘導された脂肪族炭素原子の存在を示す。さらに、１７５ｐｐｍの値を有する小さなピークを検証することが可能であり、セルロースと酸とのエステル化から誘導されたカルボキシル基の存在を示している。したがって、この分析は、官能化反応がブタン酸からのＣＭＦにエステル基を生成することができるという記述を裏付けている。

【0043】

[068]物理的および化学的分析方法が一緒に使用される場合、これらに技術が分離されて使用される場合に不可能である特徴を分析することが可能である。したがって、ＮＭＲを使用すると、ＣＭＦが有効に官能化されたこと、すなわち、有機酸をアシルドナー基として使用し、酵素触媒を介してエステル化されたことが立証される。加えて、ＸＰＳおよび接触角によって、この反応を使用して生成されたフィルム表面の物理化学的特徴が改質され、対照材料（反応前）には存在していない特徴、たとえば、疎水性およびエステル基の存在を提示していることが明白である。

【0044】

[069]このようにして、記載されているように本発明の目的は、工程（１）がセルロースの少なくとも０．２５質量％の割合でセルロースを水性媒体に分散させる、有機酸から開始されるセルロースの酵素官能化の方法である。

【0045】

[070]他に、本発明の目的である、有機酸からのセルロースの酵素官能化の方法は、１：５～５：１比の範囲内で工程（２）のエタノール／アセトンの混合物を提示する。好ましくは、方法は、工程（４）において、少なくとも１２時間、好ましくは４８時間の放置を含む。さらに、記載されているように、反応混合物を遠心分離して、残留有機酸を除去する工程（４ａ）が工程（４）の後に続くことができる。官能化方法の工程（４ａ）の後に、酵素が加熱により非活性化される工程（４ｂ）を行うことができる。

【0046】

[071]加えて、本発明は、増加した疎水性を有するセルロースを生成する方法であって、
[072]（ａ）セルロース原材料を供給すること；
[073]（ｂ）リパーゼの存在下、有機酸から誘導されたエステル基を導入することにより、前記セルロース原材料を官能化して、増加した疎水性を有する官能化セルロースを生じること；
[074]（ｃ）前記増加した疎水性を有する官能化セルロースを回収すること
を含む方法を提供する。

【0047】

[075]例２は、漂白ユーカリクラフトパルプ（ＢＥＫＰ）から単離されたナノセルロースの酵素官能化を実証する。この例において、漂白ユーカリクラフトパルプ（ＢＥＫＰ）を最初に１％セルロース固形分（ｍ／ｍ）で懸濁させ、溶媒として水を使用してディスクウルトラ－リファイナー（disk ultra-refiner）（ＳｕｐｅｒＭａｓｓＣｏｌｌｏｉｄｅｒ，Ｍａｓｕｋｏ，Ｍｏｄｅｌ ＭＫＣＡ６－５Ｊ）により処理した。ＭＫＧＡ１０－８０モデルディスクは、多孔質ではないセラミック材料（酸化アルミニウムおよび樹脂）製であり、如何なるナノメートル粒子の浸潤を防止し、ディスク間の良好な適合を可能にする。一方のディスクは静止したままであり、もう一方は動作中であり、１，６００ｒｐｍで回転している。ディスク間の距離を決定し、固定した。簡潔には、運動のゼロ位置は互いに接触しているディスクにより生じるノイズによって決定した。ゼロ運動位置からウルトラ－リファイナーがセルロース懸濁液を供給し、ディスクを－１００μｍのディスク間振幅の位置に直ちに調整した。位置は負であるが、セルロース懸濁液の存在によって、ディスクが互いに接触しないこと、およびディスクが摩耗しないことが確実になる。

【0048】

[076]処理（エネルギー消費量２１ｋＷｈ／ｋｇ）の直後に取り出したＣＮＦ懸濁液試料を、およそ０．０１％（ｍ／ｖ）の濃度に希釈し、雲母支持体上に滴下した。試料を有する雲母をデシケーターに少なくとも４時間設置した。試料を調製した後、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＮｎａｎｏ）ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｒ（ＣＮＰＥＭ，Ｃａｍｐｉｎａｓ，Ｂｒａｚｉｌ）において、Ｎａｎｏｓｕｒｆ ＦｌｅｘＡＦＭ顕微鏡（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＦＭＲシリカプローブ（Ｎａｎｏｗｏｒｌｄ）を使用して画像を取った。公称共振周波数の７５ｋＨｚおよび公称力定数（スプリング）の２．８ｍ／ｍで間次接触技術を使用して、システムを操作した。結果は、使用された条件下では、極めて小さな直径および１μｍを超える長さを有するＣＮＦを生成することが可能であることを示し、図６において見ることができる。Ｇｗｙｄｄｉｏｎ２．４９ソフトウエアプログラム（６４ビット）で処理された画像から、ＣＮＦ粒子の１００個の直径測定値を取り、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（バージョン２０１９）でグラフにプロットして、直径階級および平均直径を分析し、図７のヒストグラムに表示した。

【0049】

[077]ＣＮＦを調製した後、ＣＮＦ溶媒を、連続遠心分離の使用により有機溶媒の水性懸濁液に交換した。簡潔には、５０ｍＬの円錐遠心分離管中の１０ｍＬのＣＮＦ水性懸濁液（１％ｍ／ｍ）を５℃および１３，３００ｇ（１０，０００ｒｐｍ）で５分間遠心分離し、上澄みを収集し、廃棄した。次いで、１０ｍＬのエタノール／アセトン混合物（１：１）を添加し、管を手作業で振とうして混合物をホモジナイズし、懸濁液を同じ条件下で再び遠心分離した。この手順を合計５回繰り返した。それぞれの遠心分離の後、およそ１ｍＬのアリコートを取り、レーザー回折により粒径を分析した。５回目の遠心分離の終了時に、ＣＮＦを１０ｍＬのジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に再懸濁させ、１％（ｍ／ｍ）の最終濃度を得た。予測されたように、粒子分析器で評価された粒子のサイズに変化はなく、図８において見ることができる。したがって、実施された溶媒の交換によってサイズに有意な変化を有することなく、ＣＮＦにおいてエステル化反応が発生することを確証することが可能であった。

【0050】

[078]官能化反応は、１２５ｍＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコにおいて、６０ｍＬの総反応体積を用いて、１７０ｒｐｍにより４８時間の軌道撹拌下で行った。反応は、アシルドナー基として２５ｇのオレイン酸、４．２５ｇのＤＭＦ中１％ｍ／ｍＣＮＦ懸濁液、３３ｇのＤＭＦおよび２ｇのリパーゼ（ＣＡＢＬ，Ｓｉｇｍａ）を使用して実行した。４８時間後、反応混合物を上記に記述した条件下で遠心分離して、残留有機酸を除去し、固体材料（ＣＮＦ）を１０ｍＬの蒸留水に再懸濁させ、５分間沸騰加熱して、酵素を非活性化した。次いで、懸濁液を再び遠心分離し、得られたペレットを最初に１０ｍＬのアセトンに再懸濁させ、４回遠心分離した。４回目の遠心分離工程で上澄みを除去した後、ＣＮＦを１０ｍＬのドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１％水溶液に再懸濁させ、５回遠心分離した。最後に、５回目の遠心分離の後に得たＣＮＦを１０ｍＬの蒸留水に再懸濁させ、再び遠心分離した。これらの工程の後に得られたＣＮＦを、原子間力顕微鏡法－ＡＦＭ、接触角、およびＸ線励起光電子分光法－ＸＰＳの粒径分析に使用した。

【0051】

[079]接触角測定は、Ｒａｍｅ－Ｈａｒｔ ３００Ｆ１ゴニオメーターを使用して実施した。機器を使用して、ＣＮＦおよび官能化ＣＮＦ試料で調製されたフィルム上の１μＬの脱イオン水の液滴により接触角を測定した。フィルムは、ＣＮＦおよび官能化ＣＮＦの希釈溶液（０．１％）を室温で２４時間乾燥することにより調製した。測定の良好な統計管理を可能にするため、２滴を各試料上に置き、５つの角度測定値を各液滴で取った。高い親水性、すなわち、０または０に近い値のために、対照の接触角値を定量化することが可能でなかったことを強調することが重要である。最初に、官能化に使用される生化学経路は、非官能化ＣＮＦ（対照）と比較したときに、肯定的な結果を示していることに注目することができる。オレイン酸およびブタン酸は、対照と比較した場合、高い疎水性を示した。ＣＮＦと反応し、化学結合を形成し、故に高い疎水性の性格を移行する場合、その分子に存在する炭素の数が推測される。

【0052】

[080]ＣＮＦの表面改質を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によりさらに分析した。分析は、低圧力でＭｇ Ｋライン（ｈ＝１２５３．６ｅＶ）を備え、１０ｅＶで作動する市販の分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ－Ａｌｐｈａ）を使用して実施した。官能化の前後の炭素原子の割合を分析する場合、下記の表３によると、表面に存在する炭素原子の量の増加が検証され、これらの原子は、ＣＮＦポリマーに連結されたオレイン酸に由来する。漂白ユーカリクラフトパルプ対照から単離された（図９Ａ）および酵素官能化処理後（９Ｂ）のＣＮＦ。スペクトルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＣＮＰＥＭ）のＮａｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの施設を使用して、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）技術を使用して生成した。実用的な方法では、ＣＮＦに存在する接続の変化を観察することが可能である。画像９Ａ（対照）および９Ｂ（官能化）を比較すると、炭素－炭素（Ｃ－Ｃ）結合の量が増加していた。さらに、画像９Ｂを観察すると、新たなバンド（２８９．０４ｅ．ｖ）の出現が検証され、カルボニル型結合を表している。したがって、生成されたスペクトルから、オレイン酸（１８個の炭素の炭素鎖を有する有機酸）とのエステル化反応を起源とする、ＣＮＦ表面の化学組成の変化を、化学分析によって立証することが可能である。

【0053】

[081]表４は、酵素エステル化反応の前後の、漂白クラフトパルプから誘導されたＣＮＦ製のフィルムの表面に見出される、炭素原子の割合およびこれらと酸素原子との関係を表す。

【0054】

【表3】

【0055】

[082]本発明は、また、セルロースの官能化におけるリパーゼの使用であって、リパーゼ／セルロースの割合が、セルロース１ｇ当たり４７ｇのリパーゼである、使用を提供する。この意味において、例３は、漂白サトウキビバガスパルプから単離されたナノフィブリル化セルロースの酵素官能化を明らかにする。

【0056】

[083]最初に、使用されるサトウキビバガスのセルロースパルプを、蒸気爆発により、続いてアルカリ脱リグニンにより前処理して生成した。脱リグニン処理から得た材料の漂白を、２段階で実行し、１つは酸性であり、もう一方はアルカリ性であった。第１の段階では、容量２ＬのＰａｒｒ ｃｏｍ反応器において、５０ｇの乾燥材料を固体液体比の１：２０で処理した。過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）を濃度の８％（ｍ／ｍ）、ならびに３％でＮａＯＨ（ｍ／ｍ）および１．２％でＭｇＳＯ_４（ｍ／ｍ）を添加した。反応を一定撹拌（１２０ｒｐｍ）下、８０±２℃で２時間行った。この工程の後、材料を濾過し、乾燥材料の質量の２０倍、混合物の１０倍および真空濾過流の１０倍に比例する蒸留水の体積で洗浄した。第２の段階は、同じ反応器において、同じ固体比（１：２０）により、以前の反応から回収されたすべての質量を使用し、濃酢酸を２．０％ｖ／ｍ（乾燥質量に対する体積）の濃度に達するまで、ならびに６％ｍ／ｖの塩化ナトリウムを添加した。反応を７５±２℃で２時間実行した。より高濃度のリグニンを除去するため、この工程をさらに２回繰り返した。したがって、４回の漂白反応を実行し、１回は酸媒体によるものであり、３回は塩基性媒体によるものであった。

【0057】

[084]ナノフィブリル化セルロース（ＮＦＣ）の生成を目的として、漂白サトウキビバガスから単離したセルロース懸濁液（固形分１％（ｍ／ｍ））を、溶媒として水を使用するウルトラ－ディスクリファイナー（ＳｕｐｅｒＭａｓｓＣｏｌｌｏｉｄｅｒ，Ｍａｓｕｋｏ，Ｍｏｄｅｌ ＭＫＣＡ６－５Ｊ）により処理した。ディスク（ＭＫＧＡ１０－８０モデル）は、多孔質ではないセラミック材料（酸化アルミニウムおよび樹脂）製であり、如何なるナノメートル粒子の浸潤を防止し、ディスク間の良好な適合も可能にする。一方のディスクは静止したままであり、もう一方は動作中であり、１，６００ｒｐｍで回転している。ディスク間の距離を決定し、固定した。簡潔には、運動のゼロ位置は互いに接触しているディスクにより生じるノイズによって決定した。ゼロ運動位置からウルトラ－リファイナーがセルロース懸濁液を供給し、ディスクを－１００μｍのディスク間振幅の位置に直ちに調整した。位置は負であるが、セルロース懸濁液の存在によって、ディスクが互いに接触しないこと、およびディスクが摩耗しないことが確実になる。

【0058】

[085]処理（エネルギー消費量４０ｋＷｈ／ｋｇ）の直後に取り出したＣＮＦ懸濁液試料を、およそ０．０１％（ｍ／ｖ）の濃度に希釈し、雲母支持体上に滴下した。試料を有する雲母をデシケーターに少なくとも４時間挿入した。試料を調製した後、ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ＬＮｎａｎｏ）ｏｆ ｔｈｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｔｅｒ（ＣＮＰＥＭ，Ｃａｍｐｉｎａｓ，Ｂｒａｚｉｌ）において、Ｎａｎｏｓｕｒｆ ＦｌｅｘＡＦＭ顕微鏡（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＦＭＲシリカプローブ（Ｎａｎｏｗｏｒｌｄ）を使用して画像を取った。公称共振周波数の７５ｋＨｚおよび公称力定数（スプリング）の２．８ｍ／ｍで間次接触技術を使用して、システムを操作した。結果は、使用された条件下では、極めて小さな直径および１μｍを超える長さを有するＣＮＦを生成することが可能であることを示した（図１０）。Ｇｗｙｄｄｉｏｎ２．４９ソフトウエア（６４ビット）プログラムで処理された画像から、ＣＮＦ粒子の１００個の直径測定値を取り、Ｏｒｉｇｉｎソフトウエア（バージョン２０１９）でグラフにプロットして、直径階級および平均直径を分析した。見出された値は、生成されたＣＮＦの大部分が１０～２０ｎｍの範囲の直径を有することを示し、図１１において見ることができる。

【0059】

[086]故に接触角測定は、Ｒａｍｅ－Ｈａｒｔ ３００Ｆ１ゴニオメーターを使用して実施した（表５）。機器を使用して、ＣＮＦおよび官能化ＣＮＦ試料で調製されたフィルム上の１μＬの脱イオン水の液滴により接触角を測定した。フィルムは、ＣＮＦおよび官能化ＣＮＦの希釈溶液（０．１％）を室温で２４時間乾燥することにより調製した。測定の良好な統計管理を可能にするため、３滴を各試料上に置き、５つの角度測定値を各液滴で取った。高い親水性、すなわち、０または０に近い値のために、対照の接触角値を定量化することが可能でなかったことを強調することが重要である（ＪＯＮＯＯＢＩ ｅｔ ａｌ．，２０１０ａ；ＢＯＺＩＣ ｅｔ ａｌ．，２０１５）。最初に、官能化に使用される生化学経路は、非官能化ＣＮＦ（対照）と比較したときに、肯定的な結果を示していることに注目することができる。オレイン酸およびブタン酸は、対照と比較した場合、高い疎水性を示した。

【0060】

[087]

【0061】

【表4】

【0062】

[088]ＣＮＦの表面改質を、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）によりさらに分析した。分析は、低圧力でＭｇ Ｋライン（ｈ＝１２５３．６ｅＶ）を備え、１０ｅＶで作動する市販の分光計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｋ－Ａｌｐｈａ）を使用して実施した。図１２Ａおよび１２Ｂを比較することによって分かるように、結果は、表面の化学組成に明確な変化があり、植物起源の異なる原材料からのセルロースにおける炭素－炭素および酸素－カルボニル結合の数が増加していることを示し、官能化の前後の炭素原子の割合を分析する場合、下記の表６によると、表面に存在する炭素原子の量の増加が検証され、これらの原子は、ＣＮＦポリマーに連結されたオレイン酸に由来する。具体的に、図１２Ａおよび１２ＢはＸ線光電子分光法（ＸＰＳ）技術を使用して生成された、セルロースに存在する結合のスペクトルを示す：漂白サトウキビバガスパルプ対照から単離された（図１２Ａ）および酵素官能化処置後（図１２Ｂ）のＣＮＦ。スペクトルは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ Ｅｎｅｒｇｙ ａｎｄ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ（ＣＮＰＥＭ）のＮａｔｉｏｎａｌ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙの施設を使用して、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）技術を使用して生成した。実用的な方法では、ＣＮＦに存在する化学結合の変化を観察することが可能である。画像１２Ａ（対照）および１２Ｂ（官能化）を比較すると、炭素－炭素（Ｃ－Ｃ）およびカルボニル型結合（Ｏ－Ｃ＝Ｏ）の量が増加していた。セルロースの単離に使用した原材料は、漂白サトウキビバガスであり、これは残留値（およそ４％）のリグニンを有する。ＣＮＦに存在するこのリグニンは、対照材料であってもカルボニル（エステル基）を有する。したがって、生成されたスペクトルから、オレイン酸（１８個の炭素の有機酸）とのエステル化反応を起源とする、ＣＮＦ表面の化学組成の変化を、化学分析によって立証することが可能である。

【0063】

[089]表６は、酵素エステル化反応の前後の、サトウキビバガスから誘導されたＣＮＦに誘導されたフィルムの表面に見出される、炭素原子の割合およびこれらと酸素原子との関係を表示する。

【0064】

【表5】

【0065】

[090]得られた結果を分析すると、ＢＥＫＰ誘導と漂白バガスの両方において、使用されたセルロースの表面に化学的および物理的改質があり、これらの改質が、リパーゼにより触媒されたエステル化反応の結果であり、故に疎水性を増加していると結論づけることが可能である。現存する技術と異なり、提案されている方法は、リパーゼ酵素を使用してＣＮＦを疎水性化すること、およびアシルドナー基として有機酸を使用することを目的とする。

【0066】

[091]したがって、この技術は、セルロースの供給源および有機酸の種類にかかわりなく官能的であることが実証されている。この意味において、固定化酵素による酵素官能化反応を例証する例４を裏付ける。

【0067】

[092]最初に、ＣＭＦ溶媒交換を前記例に記述された方法と同じ方法で実行した。固定化酵素（リパーゼアクリル樹脂）を用いた官能化反応を、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎ型遠心管において、６ｇの１％ｍ／ｍ近似ＣＭＦ懸濁液、３２．５ｇのブタン酸、５．９ｇのＤＭＦ、１．２ｇの酵素の合計反応質量の４５．６ｇにより、１７０ｒｐｍのタンブリング（tumbling）撹拌下で実行した。量は、最初の反応では２ｇの酵素であった。他の反応では、反応値を回収された酵素の量に基づいて適応させて、最初の割合を常に維持した。パラメーターは、たとえば温度および時間であり、これらは、すべてのリサイクル反応においてそれぞれ４５℃および４８時間で一定に保持された。

【0068】

[093]固定化酵素の回収では、酵素の分離方法を、２つの濾過システムを使用する前（上流）および後（下流）で使用した。濾過システム１は、０．５ｍｍの多孔質のステンレス鋼金属メッシュフィルターを使用する。それとは異なり、濾過システム２は、ワットマン濾紙番号１を組み合わせたブフナー漏斗を使用する。最初に、酵素を、濾過システム１の脱気水で洗浄し、後に、濾過システム２のヘキサンで洗浄した。両方とも真空システムに連結された。これらの工程の後、酵素をオーブン（４５℃）で乾燥し、反応媒体に添加する（上流工程）まで３℃で保管した。それぞれの反応（下流工程）の終了時に、反応媒体を濾過システム１に設置し、２００ｍｌの蒸留水を添加した。次いでフィルターケーキを取り出し、濾過システム２に設置し、ヘキサンを添加した。この操作をさらに２回繰り返し、次いで、濾過材料を４，７８９ｇで５分間遠心分離して、酪酸およびＤＭＦを除去し、その結果としてＣＭＦを濃縮した。分離工程の終了時に、回収された固定化酵素を冷蔵庫に保管した。すべての分離工程からのＣＭＦを水性媒体中で、さらに３回またはｐＨ値のばらつきがなくなり、過剰量の酸が除去されたことを示すまで遠心分離した。

【0069】

[094]ＡＦＭ－ＦＴＩＲ技術を使用して、１７３０～１７５０ｃｍ^－１の領域に見出されるエステルのＣ－Ｏ－ＯＨ（カルボキシル）バンドの存在または非存在を検証することが可能である。加えて、グルコースモノマーに見出されるセルロースに存在するＯ－Ｈ結合の典型的なバンドを見ることもでき（１６４０ｃｍ^－１）、図１３に示されている。得られたスペクトルにおいて、官能化ＣＭＦ（ＣＭＦ－Ｆ）は、Ｃ－Ｏ－ＯＨバンド（カルボキシル）が対照ＣＭＦにおいて証明されていないことを示し、マイクロファイバーのエステル化を化学的に示している。したがって、３つの異なるリサイクル反応においてＣＭＦ官能化の発生を化学的に立証することが可能であり、同じ酵素を使用してＣＭＦを少なくとも５回エステル化できること（ＣＭＦ－Ｆ５）を実証した。ここで実証された結果は、この技術は定性的なだけであるという事実から、官能化の強度を示していない。

【0070】

[095]固定化リパーゼを用いた官能化ＣＭＦフィルム（ＣＭＦ－Ｆ）の接触角値を下記の表７に示す。第１の反応において固定化リパーゼで官能化したＣＭＦフィルム（ＣＭＦ－Ｆ１）は、１１４°の接触角をもたらした。さらに、固定化酵素は、５回までのリサイクル反応で官能化することができた。したがって、得られた接触角値は対照（ＣＭＦ）より高く、試験した５回のリサイクル反応のすべてにおいてＣＭＦが官能化されたことを実証した。

【0071】

[096]表７は、固定化酵素を使用して官能化されたＣＭＦの接触角を表示する。

【0072】

【表6】

【0073】

[097]^＊ＣＭＦ：ＣＭＦ対照
[098]^＊＊ＣＭＦ Ｆ１：固定化酵素による１回の反応後のＣＭＦ、ＣＭＦ－Ｆ２：以前に使用された同じ固定化酵素による２回の反応後のＣＭＦ、このようにしてＣＭＦ－５まで。

【0074】

[099]ここでも、本発明は、セルロースの供給源および有機酸の種類と無関係に、遊離および固定化リパーゼを使用して官能的であることが実証されている。

【0075】

[0100]本発明の目的である官能化セルロースは、また、使用物品、たとえば、フィルム、有機溶媒に基づいた非水性配合物に組み込むこともでき、このことは官能化セルロースを含む物品を得ることを可能にし、これは少なくとも０．０１の官能化（置きかえ）度を表す。

【0076】

[0101]提案されている技術は、多数の用途を有し、高い付加価値を有する新たな材料から、パルプ輸送の費用を低減する、とりわけマイクロおよびナノスケールで、既存の角質化（hornification）プロセス、たとえば、技術特性を低減する悪影響である、乾燥プロセスで存在する多数のヒドロキシルが原因のセルロースマイクロおよびナノフィブリルの凝集を低減するために使用されるものまで、あらゆるものを生成することができる。したがって、酵素、特にリパーゼにより触媒され、有機酸、好ましくは２～１８個の酸素の炭素鎖を有する有機酸、より好ましくは脂肪酸、さらにより好ましくは、ブタン酸、オレイン酸、パルミチン酸、ミリスチン酸またはこれらの混合物から選択される脂肪酸を使用する疎水性官能化方法は、たとえば、穏やかな反応条件を有し、製紙、包装および生物医学の部門を含むいくつかの産業部門に容易に適用可能である等の魅力的な特徴を有する。増加した疎水性を有するそのようなセルロースは、極めて豊富にある産業副産物である原材料として適用することに加えて、広範囲の材料と優れた適合性を持つ高い疎水性能を特質として有する。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図10】

【図11】

【図12A】

【図12B】

【図13】

【国際調査報告】