知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-510288マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを用いた無標識細胞活性化プロファイリングのための方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-06
(54)【発明の名称】マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを用いた無標識細胞活性化プロファイリングのための方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240228BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240228BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12M1/00 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557226
(86)(22)【出願日】2022-03-18
(85)【翻訳文提出日】2023-10-18
(86)【国際出願番号】 SG2022050149
(87)【国際公開番号】W WO2022197253
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】10202102747Y
(32)【優先日】2021-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】506076891
【氏名又は名称】ナンヤン テクノロジカル ユニヴァーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ホウ、ハン ウェイ
(72)【発明者】
【氏名】ペチャクプ、チャヤコーン
(72)【発明者】
【氏名】リ、キング ホー ホールデン
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029BB11
4B029CC01
4B029DC07
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QS39
4B063QX04
4B063QX10
(57)【要約】
本発明は、統合型バイオセンサを含むマイクロ流体インピーダンスサイトメータ、ならびに骨髄球および／またはリンパ球および好中球などの試料中の細胞の無標識活性化プロファイリングのためのそのデバイスの使用に関する。マイクロ流体インピーダンスサイトメータは、スパイラル形状のフローチャネルと、チャネルにわたって電場を発生させるための共面電極と、第１の試料入口と、第２のシース流体入口とを備えてもよく、試料入口は、試料入口の高さがシース流体入口およびフローチャネルの高さよりも低いという点で、段差付き試料入口である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
インピーダンスサイトメトリーを使用した、任意選択で定量的な、無標識細胞プロファイリングのための方法であって、前記方法は：（ｉ）細胞を含む流体試料を提供するステップと；
（ｉｉ）第１の試料入口および第２のシース流体入口ならびにフローチャネルを有するインピーダンスサイトメータに前記試料を灌流させるステップであって、前記フローチャネルは、前記チャネルにわたって電場を生成するための共面電極と、前記電気インピーダンスにおける変化を検出することによって前記電場の破壊を検出するための手段とを備える、灌流させるステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の細胞の無標識定量的プロファイリングのために前記電気インピーダンスの変化を測定するステップと；
を含む、方法。
【請求項2】
前記細胞が血液細胞、好ましくは骨髄球および／またはリンパ球および好中球である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
請求項１または２に記載の方法であって、前記方法は：（ａ）活性化リンパ球プロファイリング；および／または
（ｂ）好中球プロファイリング；
のためのものである、方法。
【請求項4】
前記インピーダンス測定が、リンパ球細胞サイズを決定するために、０．１～１ＭＨｚ、好ましくは０．２～０．６ＭＨｚの範囲の低周波数で行われる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
インピーダンス測定が、高周波数でのインピーダンス信号の大きさに対する低周波数でのインピーダンス信号の大きさの比として電気的不透明度を決定するために、＞１～２０ＭＨｚ、好ましくは１．２～１２．０ＭＨｚの範囲の高周波数でさらに行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記インピーダンス測定が、膜不透明度を決定するために＞１～１０Ｍｈｚ、好ましくは１．２～８Ｍｈｚの周波数で、および／または核容量を決定するために＞１０～２０Ｍｈｚ、好ましくは１０．５～１５Ｍｈｚの周波数で行われる、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
前記方法は、マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを使用する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
ステップ（ｉ）はスパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスの形態のインピーダンスサイトメータを提供することをさらに含み、前記２つの入口のうちの一方は試料入口であり、前記スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、前記２つの入口のうちの他方はシース入口であり、前記スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、前記出口のうちの少なくとも１つは、リンパ球の直接インピーダンス定量化のための共面電極を含むインピーダンス検出器を備える、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
ステップ（ｉｉ）は、（ｉ）の前記試料を試料流量で前記試料入口ポートに導入し、シース流体をシース流量で前記シース入口に導入するステップであって、試料対シース流量比が１：１５以下、好ましくは１：２０以下である、導入するステップと、細胞選別および集束のために、前記試料およびシース流体を前記スパイラル形状フローチャネルを通して駆動するステップとを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップ（ｉｉｉ）は、選別され集束されたリンパ球を、インピーダンス検出器を備える少なくとも１つの出口内に駆動することによって、ステップ（ｉｉ）において選別されるとともに集束された細胞をインピーダンス検出器へと向かわせて、インピーダンス信号読み出しを決定することにより、細胞、好ましくは活性化リンパ球を定量的にプロファイリングすることを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記試料流量が１０～４００μＬ／分の範囲にある、請求項９～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記試料対シース流量比が１：２０～１：５０である、請求項９～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記試料入口は、前記試料入口の高さが前記シース流体入口および前記フローチャネルの高さよりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３～１０倍低い段差付き試料入口であり、前記試料入口は、任意選択で前記フローチャネルの底部に位置する、請求項８～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記試料入口は、１５～５０μｍの高さを有し、前記シース流体入口および前記フローチャネルは、８０～２５０μｍの高さを有する、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記シース流体入口の開口幅は、２００～７００μｍの範囲内であり、および／または前記試料入口の開口幅は、５０～２００μｍである、請求項１３または請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記シース流体入口と前記試料入口のアスペクト比（高さに対する幅）は、３～１０、好ましくは４～８の範囲にある、請求項１３～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
シース入口の試料入口に対する面積比は、１０～５０、好ましくは２０～４０の範囲内である、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記方法は、任意選択で、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）におけるインピーダンスプロファイリングの前に、前記試料を望ましくない細胞に結合する磁気ビーズとともにインキュベートし、望ましくない細胞が結合した磁気ビーズを磁場によって結合していない細胞から分離することによって、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を実施することによる、細胞精製のステップをさらに含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記望ましくない細胞が単球を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
インピーダンスサイトメトリーを使用する定量的無標識細胞プロファイリングのためのバイオセンサであって、前記バイオセンサは：（ｉ）スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスであって、前記２つの入口のうちの一方は試料入口であり、前記スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、前記２つの入口のうちの他方はシース流体入口であり、前記スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する、マイクロ流体デバイスと；
（ｉｉ）細胞の直接インピーダンス定量化のための共面電極であって、前記マイクロ流体デバイスの前記出口のうちの少なくとも１つと一体化されている共面電極と；
を備える、バイオセンサ。
【請求項21】
前記試料入口は、前記試料入口の高さが前記シース流体入口および前記フローチャネルの高さよりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３～１０倍低い段差付き試料入口であり、前記試料入口は、任意選択で前記フローチャネルの底部に位置する、請求項２０に記載のバイオセンサ。
【請求項22】
前記試料入口は、１５～５０μｍの高さを有し、前記シース流体入口および前記フローチャネルは、８０～２５０μｍの高さを有する、請求項２０または請求項２１に記載のバイオセンサ。
【請求項23】
前記シース流体入口の開口幅は、２００～７００μｍの範囲内であり、および／または前記試料入口の開口幅は、５０～２００μｍである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項24】
前記シース流体入口と前記試料入口のアスペクト比（高さに対する幅）は、３～１０、好ましくは４～８の範囲にある、請求項２０～２３のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項25】
シース入口の試料入口に対する面積比は、１０～５０、好ましくは２０～４０の範囲内にある、請求項２０～２４のいずれか一項に記載のバイオセンサ。
【請求項26】
請求項２０～２５のいずれか一項に記載のバイオセンサを含む統合型インピーダンスサイトメータであって、（１）マイクロチップ、（２）インピーダンス分析器、ならびに（３）灌流制御を可能にするために前記試料およびシース流体入口に接続された流体ポンプをさらに含み、前記マイクロチップは前記インピーダンス分析器および前記流体ポンプと接続され、前記インピーダンス分析器はインピーダンス測定を可能にするために前記共面電極に接続されている、統合型インピーダンスサイトメータ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、概して、インピーダンスサイトメトリーに基づく無標識マイクロ流体法を用いた細胞の選別およびプロファイリングの分野に関する。具体的には、本発明は、前記目的のために特に設計された統合型バイオセンサを有するマイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを使用することによる、試料中の好中球およびリンパ球の生物物理学的プロファイリング、ならびに前記バイオセンサに関する。
【背景技術】
【0002】
リンパ球は我々の獲得免疫系に不可欠である。特異的抗原が認識されると、それらはサイトカインを分泌し、増殖および分化を受け、全体的な免疫応答を調節する。これらの細胞は、ＨＩＶなどの病原体に対する応答に加えて、癌および心血管疾患などの障害においても重要である。したがって、リンパ球表現型の定性的および定量的検出は、宿主免疫状態を反映するために、および疾患診断のために臨床的に有用である。例えば、リンパ球数および好中球対リンパ球比は、しばしば、菌血症、マラリアおよび結核における疾患予測のための臨床パラメータとして使用される。細胞媒介性免疫応答にとって極めて重要な活性化Ｔリンパ球は、ＨＩＶ感染に対する感受性ならびに癌患者の生存にも関連している。
【0003】
Ｔリンパ球は非常に多様であるので、種々のリンパ球亜集団を同定するために単一細胞分析を行うことが重要である。リンパ球細胞活性化を研究するための従来の技術は、フローサイトメトリーによる表面マーカー発現（ＣＤ６９、ＣＤ１３７など）の測定（非特許文献１；非特許文献２）、または酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いた分泌サイトカイン（ＩＦＮγ、ＩＬ２など）の測定（非特許文献３；非特許文献４）を含む。しかしながら、これらのアプローチは、抗体の使用に起因して高価で手間がかかるため、臨床試験のために必ずしも拡張可能であるとは限らない。
【0004】
電気ベースのマイクロテクノロジー（誘電泳動（ＤＥＰ）、エレクトロローテーション、インピーダンスサイトメトリーなど）は、最小限の試料要件と細胞摂動で単一細胞の無標識測定を容易にする魅力的な代替手段である（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。最近の研究としては、エレクトロローテーションを用いたリンパ球プロファイリング（非特許文献９；非特許文献１０）、インピーダンスサイトメータを用いたマウスリンパ球活性化およびリンパ球差分計数（非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４）が挙げられる。しかしながら、これらのアプローチは、低スループット（試料流量＜２０μＬ／分）に悩まされ、追加の血液試料調製ステップを必要とする。インピーダンスサイトメトリーではスループットの向上が可能であるが（非特許文献１５）、細胞は垂直方向（チャネルの高さ方向）に＞１の平衡位置を持つように慣性集束を受ける可能性がある。これは、表現型決定精度に悪影響を及ぼす電気的プロファイルにおける複数の細胞クラスタにつながる（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８）。ＤＥＰ集束（非特許文献１９）やマルチ電極を用いた位置センシング（スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、前掲；デニノ（Ｄｅ Ｎｉｎｎｏ）ら、前掲）を含むいくつかの解決策が提案されているが、追加の機器（増幅器）を備えることからセットアップが複雑であり、（追加の電極により）検出領域が大きくなることで、粒子の同時発生事象（検出領域に２つ以上の粒子が存在すること）が増加する可能性がある。
【0005】
好中球は、先天性免疫の最も豊富で重要なエフェクター細胞である。好中球活性化を研究するための従来の技術は、フローサイトメトリーによる表面マーカー発現の測定、または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）を用いた分泌サイトカイン／酵素の測定を含む。しかしながら、これらのアプローチは、抗体の使用に起因して高価で手間がかかるため、臨床試験のために必ずしも拡張可能であるとは限らない。電気ベースのマイクロテクノロジー（誘電泳動（ＤＥＰ）、エレクトロローテーション、インピーダンスサイトメトリーなど）は、最小限の試料要件と細胞摂動で単一細胞の無標識測定を容易にする魅力的な代替手段である（非特許文献５（ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１０４０４－０１０－０５８０－９（２０１０））；非特許文献６；非特許文献８（ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｄ０ＬＣ００８４０Ｋ（２０２１）））。最近の研究としては、エレクトロローテーションを用いた白血球プロファイリング（非特許文献９（ｄｏｉ：１０．１００２／１５２２－２６８３（２００２０７）２３：１３＜２０５７：：ＡＩＤ－ＥＬＰＳ２０５７＞３．０．ＣＯ；２－Ｘ（２００２））；非特許文献１０（ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／Ｓ０００５－２７３６（９８）００２５３－３（１９９９）））および差動インピーダンスサイトメータ（非特許文献１２（ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｔｒａｎｓｌｍｅｄ．３００６８７０（２０１３））；非特許文献１３（ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｂｉｏｓ．２０１７．０２．０４７（２０１７））；非特許文献１４（ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｎａｎｏ．０ｃ０３０１８（２０２０）））が挙げられる。しかしながら、これらのアプローチは、低スループット（試料流量＜２０μＬ／分）に悩まされ、追加の血液試料調製ステップを必要とする。
【0006】
主たる障害を軽減するために、インピーダンスサイトメトリーは、細胞固有の電気的特性に基づく無標識の単一細胞表現型分類技術として台頭してきている（非特許文献７）。この技術は細胞の種類の決定に広く用いられている（非特許文献１１（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１６．０３８）；非特許文献２０；非特許文献２１）が、微細加工インピーダンスサイトメータは分析前に標的細胞を精製する従来の試料処理ステップを必要とするため、臨床での有用性は限られている。
【0007】
インピーダンスサイトメトリーではスループットの向上が可能であるが、細胞は垂直方向（チャネルの高さ方向）に＞１の平衡位置を持つように慣性集束を受ける可能性がある。これは、表現型決定精度に悪影響を及ぼす電気プロファイルにおける複数の細胞クラスタにつながる（非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８（ｄｏｉ：ｈｔｔｐｓ：／／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｓｎｂ．２０１７．１０．１１３（２０１８）））。
【0008】
ＤＥＰ集束（非特許文献１９（ｄｏｉ：１０．１０２１／ａｃｓｓｅｎｓｏｒｓ．６ｂ００２８６（２０１６）））やマルチ電極を用いた位置センシング（スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、前掲；デニノ（ｄｅ Ｎｉｎｎｏ）ら、前掲）を含むいくつかの解決策が提案されているが、追加の機器（増幅器）を備えることからセットアップが複雑であり、（追加の電極により）検出領域が大きくなることで、粒子の同時発生事象（検出領域に２つ以上の粒子が存在すること）が増加する可能性がある。
【0009】
白血球表現型決定のためのオンチップインピーダンス検出を備えた統合型スパイラルマイクロ流体デバイス（ディーンフロー分画（Ｄｅａｎ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ），ＤＦＦ）は、以前に開発されている（非特許文献１５（ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ９ＬＣ００２５０Ｂ（２０１９）））。しかしながら、このデバイスについても、慣性ベースの選別の使用により、流動中に２つの異なる垂直位置（チャネル高さに沿った位置）で粒子集束をもたらすことが判明した。これは、同じ粒子／細胞でも垂直方向の位置が異なると信号の大きさが異なるため、インピーダンスの検出精度に悪影響を及ぼす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0010】
【非特許文献1】ヴェルフル（Ｗｏｌｆｌ）ら、Ｂｌｏｏｄ、２００７、１１０、２０１－２１０
【非特許文献2】シブリアンおよびサンチェス－マドリッド（Ｃｉｂｒｉａｎ ＆ Ｓａｎｃｈｅｚ－Ｍａｄｒｉｄ）、Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１７、４７、９４６－９５３
【非特許文献3】フェルステーヘン（Ｖｅｒｓｔｅｅｇｅｎ）ら、Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８８、１１１、２５－２９
【非特許文献4】イギーチェメおよびヘルスコビッツ（Ｉｇｉｅｔｓｅｍｅ＆Ｈｅｒｓｃｏｗｉｔｚ）、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄｓ、１９８７、９７、１２３－１３１
【非特許文献5】サンおよびモーガン（Ｓｕｎ＆Ｍｏｒｇａｎ）、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、２０１０、８、４２３－４４３
【非特許文献6】チェン（Ｃｈｅｎ）ら、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、２０１５、１６、９８０４
【非特許文献7】ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら、Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｅｓ，２０１７、８、８７
【非特許文献8】ホンラド（Ｈｏｎｒａｄｏ）ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０２１、２１、２２－５４
【非特許文献9】ペシグ（Ｐｅｔｈｉｇ）ら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２００２、２３、２０５７－２０６３
【非特許文献10】ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、１９９９、１４１７、５１－６２
【非特許文献11】ハッサン（Ｈａｓｓａｎ）ら、Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２０１６、１１、７１４－７２６
【非特許文献12】ワトキンズ（Ｗａｔｋｉｎｓ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２０１３、５、２１４ｒａ１７０－２１４ｒａ１７０
【非特許文献13】ロロ（Ｒｏｌｌｏ）ら、Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ、２０１７、９４、１９３－１９９
【非特許文献14】ハン（Ｈａｎ）ら、ＡＣＳ Ｎａｎｏ、２０２０、１４、８６４６－８６５７
【非特許文献15】ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０１９、１９、１７３６－１７４６
【非特許文献16】スペンサー（Ｓｐｅｎｃｅｒ）ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０１６、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ６ＬＣ００３３９Ｇ
【非特許文献17】デニノ（Ｄｅ Ｎｉｎｎｏ）ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、２０１７、ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ６ＬＣ０１５１６Ｆ
【非特許文献18】キャセリ（Ｃａｓｅｌｌｉ）ら、Ｓｅｎｓｏｒｓ ａｎｄ Ａｃｔｕａｔｏｒｓ Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ、２０１８、２５６、５８０－５８９
【非特許文献19】ハーンドベック（Ｈａａｎｄｂａｅｋ）ら、ＡＣＳ Ｓｅｎｓｏｒｓ、２０１６、１、１０２０－１０２７
【非特許文献20】サイモン（Ｓｉｍｏｎ）ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、１６、２３２６－２３３８、ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ６ＬＣ００１２８Ａ（２０１６）
【非特許文献21】ソング（Ｓｏｎｇ）ら、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ、１３、２３００－２３１０、ｄｏｉ：１０．１０３９／Ｃ３ＬＣ４１３２１Ｇ（２０１３）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0011】
したがって、当技術分野では、細胞プロファイリング、特にリンパ球および好中球のプロファイリングのためのさらに改善された方法が依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【0012】
本発明は、（マイクロ流体）インピーダンスサイトメトリーに基づく、無標識の（ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ）血球（リンパ球または好中球等）活性化プロファイリングのための方法を提供することにより、この必要性を満たす。
【0013】
第１の態様において、本発明は、インピーダンスサイトメトリーを使用する無標識の細胞プロファイリングのための方法であって、前記方法は：
（ｉ）細胞を含む流体試料を提供するステップと；
（ｉｉ）第１の試料入口および第２のシース流体入口ならびにフローチャネルを有するインピーダンスサイトメータに前記試料を灌流させるステップであって、前記フローチャネルは、前記チャネルにわたって電場を生成するための共面電極（ｃｏｐｌａｎａｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）と、電気インピーダンスの変化を検出することによって前記電場の破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ）を検出するための手段とを備える、灌流させるステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の細胞の無標識定量的プロファイリングのために前記電気インピーダンスの変化を測定するステップと；
を含む。
（ｉ）細胞を含む流体試料を提供するステップと；
（ｉｉ）第１の試料入口および第２のシース流体入口ならびにフローチャネルを有するインピーダンスサイトメータに前記試料を灌流させるステップであって、前記フローチャネルは、前記チャネルにわたって電場を生成するための共面電極（ｃｏｐｌａｎａｒ ｅｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）と、電気インピーダンスの変化を検出することによって前記電場の破壊（ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｓ）を検出するための手段とを備える、灌流させるステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の細胞の無標識定量的プロファイリングのために前記電気インピーダンスの変化を測定するステップと；
を含む。
【0014】
本方法は、定量的無標識細胞プロファイリングのためのものであり得る。
そのような方法の種々の実施形態において、細胞は血液細胞、好ましくは骨髄球および／またはリンパ球である。特定の実施形態において、細胞はリンパ球または好中球である。したがって、本方法は、活性化リンパ球プロファイリングまたは活性化好中球プロファイリングのための方法であり得る。
そのような方法の種々の実施形態において、細胞は血液細胞、好ましくは骨髄球および／またはリンパ球である。特定の実施形態において、細胞はリンパ球または好中球である。したがって、本方法は、活性化リンパ球プロファイリングまたは活性化好中球プロファイリングのための方法であり得る。
【0015】
種々の実施形態において、インピーダンス測定は、リンパ球細胞サイズを決定するために、０．１～１ＭＨｚ、好ましくは０．２～０．６ＭＨｚの範囲の低周波数で実施される。種々の実施形態において、前記測定は、電気的不透明度を決定するために、＞１～２０ＭＨｚ、好ましくは１．２～１５．０または１．２～１２．０ＭＨｚの範囲の高周波数でインピーダンス測定をさらに実行することによって補足されてもよい。電気的不透明度（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｏｐａｃｉｔｙ）は、高周波数（＞１～２０ＭＨｚ）におけるインピーダンス信号の大きさに対する低周波数（０．１～１ＭＨｚ）におけるインピーダンス信号の大きさの比として計算することができ、細胞膜キャパシタンスまたは細胞核特性を反映する。種々の実施形態において、測定は、２つのより高い周波数範囲で行われることができ、１つは、膜特性（＞１～１０ＭＨｚ）を決定するためのものであり、１つは、核特性（＞１０～２０ＭＨｚ）を決定するためのものである。
【0016】
種々の実施形態において、本方法は、マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを使用する。そのような実施形態において、ステップ（ｉ）は、スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスの形態のインピーダンスサイトメータを提供することをさらに含んでもよく、２つの入口のうちの一方は試料入口であり、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、２つの入口のうちの他方はシース入口であり、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置し、出口のうちの少なくとも１つは、リンパ球の直接インピーダンス定量化のための共面電極を含むインピーダンス検出器を備える。そのような実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、（ｉ）の試料を試料流量で試料入口ポートに導入し、シース流体をシース流量でシース入口に導入するステップであって、試料対シース流量比が１：１５以下、好ましくは１：２０以下である、導入するステップと、細胞選別および集束のために、前記試料およびシース流体を、スパイラル形状フローチャネルを通して駆動するステップとを含んでもよい。次いで、ステップ（ｉｉｉ）は、選別され集束されたリンパ球を、インピーダンス検出器を備える少なくとも１つの出口内に駆動することによる、ステップ（ｉｉ）で選別されるとともに集束された細胞をインピーダンス検出器へと向かわせて、インピーダンス信号読み出しを決定することによって、細胞、好ましくは活性化リンパ球を定量的にプロファイリングすることを含んでもよい。
【0017】
これらの方法において、試料流量は、１０～４００μＬ／分の範囲であり得る。
種々の実施形態において、試料対シース流量比は、１：２０～１：５０である。
試料入口は、試料入口の高さがシース流体入口およびフローチャネルの高さよりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３～１０倍低いという、段差付き試料入口であってもよい。この設定は、本明細書では「段差付き試料入口（ｓｔｅｐｐｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｉｎｌｅｔ）」とも呼ばれる。試料入口は、細胞のより良好な集束を可能にするために、フローチャネルの底部に位置してもよい。
種々の実施形態において、試料対シース流量比は、１：２０～１：５０である。
試料入口は、試料入口の高さがシース流体入口およびフローチャネルの高さよりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３～１０倍低いという、段差付き試料入口であってもよい。この設定は、本明細書では「段差付き試料入口（ｓｔｅｐｐｅｄ ｓａｍｐｌｅ ｉｎｌｅｔ）」とも呼ばれる。試料入口は、細胞のより良好な集束を可能にするために、フローチャネルの底部に位置してもよい。
【0018】
種々の実施形態において、試料入口は、１５～５０μｍの高さを有し、および／またはシース流体入口およびフローチャネルは、８０～２５０μｍの高さを有する。
方法の種々の実施形態において、シース流体入口の開口幅は、２００～７００μｍの範囲内であり、および／または試料入口の開口幅は、５０～２００μｍ、好ましくは６０～１８０または７０～１６０μｍまたは８０～１５０μｍである。このような実施形態において、シース流体入口と試料入口のアスペクト比（高さに対する幅）は、３～１０、好ましくは４～８の範囲にある。種々の実施形態において、シース入口対試料入口の面積比は、１０～５０、好ましくは２０～４０の範囲内である。
方法の種々の実施形態において、シース流体入口の開口幅は、２００～７００μｍの範囲内であり、および／または試料入口の開口幅は、５０～２００μｍ、好ましくは６０～１８０または７０～１６０μｍまたは８０～１５０μｍである。このような実施形態において、シース流体入口と試料入口のアスペクト比（高さに対する幅）は、３～１０、好ましくは４～８の範囲にある。種々の実施形態において、シース入口対試料入口の面積比は、１０～５０、好ましくは２０～４０の範囲内である。
【0019】
本発明の方法は、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）におけるインピーダンスプロファイリングの前に、試料を望ましくない細胞に結合する磁気ビーズとともにインキュベートし、望ましくない細胞が結合した磁気ビーズを磁場によって結合していない細胞から分離することによって、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を行うステップをさらに含んでもよい。そのような望ましくない細胞には、特に本方法がリンパ球プロファイリングのためのものである場合、単球などの骨髄球が含まれ得る。
【0020】
別の態様において、本発明はまた、インピーダンスサイトメトリーを使用する定量的無標識細胞プロファイリングのためのバイオセンサであって、同バイオセンサは：
（ｉ）スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスであって、２つの入口のうちの一方は試料入口であり、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、２つの入口のうちの他方はシース入口であり、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する、マイクロ流体デバイスと；
（ｉｉ）細胞の直接インピーダンス定量化のための共面電極であって、前記マイクロ流体デバイスの前記出口のうちの少なくとも１つと一体化されている共面電極と；
を備える。
（ｉ）スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスであって、２つの入口のうちの一方は試料入口であり、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、２つの入口のうちの他方はシース入口であり、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する、マイクロ流体デバイスと；
（ｉｉ）細胞の直接インピーダンス定量化のための共面電極であって、前記マイクロ流体デバイスの前記出口のうちの少なくとも１つと一体化されている共面電極と；
を備える。
【0021】
方法の文脈において上述され、マイクロ流体デバイスおよびインピーダンス検出器自体に関する全ての実施形態は、本発明のバイオセンサに同様に適用可能である。
さらに別の態様において、本発明はまた、本発明のバイオセンサを含み、（１）マイクロチップ、（２）インピーダンス分析器、ならびに（３）灌流制御を可能にするために試料およびシース流体入口に接続された流体ポンプをさらに含み、マイクロチップはインピーダンス分析器および流体ポンプと接続され、インピーダンス分析器はインピーダンス測定を可能にするために共面電極に接続されている統合型インピーダンスサイトメータを特徴とする。
さらに別の態様において、本発明はまた、本発明のバイオセンサを含み、（１）マイクロチップ、（２）インピーダンス分析器、ならびに（３）灌流制御を可能にするために試料およびシース流体入口に接続された流体ポンプをさらに含み、マイクロチップはインピーダンス分析器および流体ポンプと接続され、インピーダンス分析器はインピーダンス測定を可能にするために共面電極に接続されている統合型インピーダンスサイトメータを特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【0022】
【図1】段差を備えた高さの試料入口を使用する、単一ストリーム粒子集束が向上した細胞選別および検出デバイスの概略図を示す。段差を備えた高さの入口の３Ｄ形状は、点線のボックスで強調されている。
【図2】スパイラルデバイスの入口領域（断面図）における３Ｄ試料集束を示すＣＦＤシミュレーションである。黒色および灰色は、それぞれ試料流線およびシース流線を示す。粒子は、慣性集束および二次ディーン渦によりチャネル底部で平衡化し、（電極に近い）検出領域まで集束されたままである。
【図3】段差を備えた入口粒子集束の特徴付けを示す。試料対シース流量比を変えた場合のＣＦＤシミュレーションの断面図（左）と、単一粒子の平衡位置を示す１０μｍビーズのインピーダンス検出（右）。
【図4】試料流線（黒色ドット）に対する試料入口の段差を備えた高さの変更の影響を示す。シース入口開口は、すべての条件について１００μｍに固定される。
【図5】試料流線に対する試料入口の開口幅の影響を示す。試料入口高さは、すべての条件について２０μｍに固定される。灰色の点および黒色の点は、それぞれシースおよび試料の流線を表す。
【図6】試料流閉じ込めの効率を示す、チャネルの下半分における試料流線のパーセンテージの定量化を示す。
【図7】インピーダンスモデル化の項で説明される二重シェルモデルを使用して、インピーダンススペクトル（上）、差動電流応答（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｃｕｒｒｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ）（中）、および不透明度（ｏｐａｃｉｔｙ）（下）に対する膜伝導率の影響を調べるための数値インピーダンスシミュレーションを示す。表１は、細胞成分の電気特性を含む。
【図8】核サイズ（上）および核膜伝導率（下）を変化させる効果についての数値インピーダンスシミュレーションを示す。垂直の点線は、システムの周波数選択を示す。
【図9】好中球のマルチパラメータインピーダンス表現型決定（ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）を示す。異なる表現型を有する好中球を、統合デバイスにおいて試験した。多周波数測定スキーム（０．３ＭＨｚ、１．７２ＭＨｚおよび１２ＭＨｚ）を使用することによって、インピーダンス特性、すなわち、１）細胞サイズ（０．３ＭＨｚにおけるインピーダンス）、２）原形質膜特性を反映する膜の不透明度（１．７２ＭＨｚにおけるインピーダンスの０．３ＭＨｚに対する比）、および３）核特性を表す核の不透明度（１２ＭＨｚにおけるインピーダンスの０．３ＭＨｚに対する比）に基づいて、異なる表現型を区別することができる。
【図10】統合デバイスを使用する好中球の表現型決定を示す。好中球表現型は、１）未処理対照、２）死滅（７５℃熱処理）、３）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（ＰＭＡ）で２時間処理（ＮＥＴｏｓｉｓ）、および４）ｐＨ９における自発的ＮＥＴｏｓｉｓである。強度スケールは、単一細胞事象の密度を示す。
【図11】ＮＥＴｏｓｉｓ集団の定量化。（Ａ）ＮＥＴｏｓｉｓ定量化のための核の不透明度を使用するインピーダンスゲーティング戦略（上）、および膜の不透明度対電気的サイズに対する対応するバックゲーティングされた集団（下）。健常な集団およびＮＥＴｏｓｉｓ集団の（Ｂ）細胞サイズおよび（Ｃ）核の不透明度。（Ｄ）異なるｐＨ環境における好中球の自発的ＮＥＴｏｓｉｓ定量化。
【図12】大腸菌（ＥＣ）に対する好中球細菌応答のインピーダンスプロファイリング。好中球を、１）細菌ストックからの１０倍希釈（ＥＣ－１０×、ＯＤ６２５：０．２９）２）１０３倍希釈（ＥＣ－１ｋ×）３）１０６倍希釈（ＥＣ－１Ｍ×）で、異なる細菌懸濁液で２４時間処理した。
【図13】統合慣性インピーダンスサイトメトリーを使用したリンパ球活性化プロファイリングのワークフローを示す。活性化されたリンパ球はサイズが大きく、インピーダンス検出領域に分類され、一方、健常なリンパ球（サイズが小さい）はスパイラル段階で廃棄物に分類される。
【図14】統合慣性インピーダンスサイトメトリーを使用するリンパ球インピーダンスプロファイリングを示す。（Ａ）死滅リンパ球集団、対照リンパ球集団および活性化リンパ球集団についての選別段階およびインピーダンス検出前の段階の分岐における細胞集束を示す積み重ねられた高速画像。（Ｂ）３分間の各条件における活性化リンパ球のインピーダンスカウント数。
【図15】リンパ球試料の選別前（ｐｒｅ－ｓｏｒｔｅｄ）（試料）画分、（インピーダンス検出器の出口から）選別された画分、および（スパイラル選別器の廃棄出口からの）廃棄画分の前方散乱シグナルおよび側方散乱シグナルの散布図を示す。
【図16】元のリンパ球試料（入口）およびインピーダンス出口からの選別されたリンパ球のリンパ球活性化マーカーＣＤ１３７発現プロファイルを示す。
【図17】選別された画分対選別前の画分における活性化細胞のパーセンテージの散布図を示す。点線は、選別前の（ｐｒｅｓｏｒｔｅｄ）細胞中の５％活性化細胞を示す（左）。二人の異なるドナーからの選別前の（試料）中の活性化細胞のパーセンテージに対するインピーダンスカウント数の較正曲線（右）。
【図18】１）ＰＢＭＣ単離および抗原との培養、２）Ｔリンパ球のＭＡＣＳ分離（ＣＤ４ネガティブセレクション）、ならびに３）マイクロ流体インピーダンスプロファイリングを含む、インピーダンスサイトメトリーを使用する抗原特異的Ｔリンパ球応答試験のワークフローを示す。
【図19】未刺激対照リンパ球および刺激リンパ球（フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ））のインピーダンスプロファイルを示す。ｎは、検出されたインピーダンス細胞数を示す（入口試料として１００ｋ細胞に正規化されている）。
【図20】三人の異なるドナーからの選別前および選別後における活性化リンパ球（ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋）の定量化を示す（左）。ＰＰＤ処理されたＰＢＭＣについての選別前細胞（入口）および選別後細胞（インピーダンス出口）の代表的なフローサイトメトリー分析（右）。
【図21】フローサイトメトリー分析（左）によってインピーダンス選別された画分（左）中の対照（未刺激）に対して正規化された刺激を受けた試料（ＰＰＤ、ＰＨＡ）中のＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋リンパ球の比を示す。四人の異なるドナーからの選別された画分におけるマイクロ流体差動インピーダンスカウント比（対照（未刺激）に対して正規化された刺激を受けた試料（ＰＨＡ、ＰＰＤ）中の検出細胞）（右）。
【図22】試料（選別前）中のリンパ球集団（対照、ＰＨＡおよびＰＰＤ処理）、ならびにマイクロ流体選別後のより大きな（活性化）リンパ球（選別後）および非活性化リンパ球（廃棄物）の代表的なフローサイトメトリー分析を示す。
【図23】ＰＨＡで刺激された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を使用するインピーダンス活性化プロファイリングを示す。（Ａ）実験ワークフローおよび（Ｂ）未刺激対照およびＰＨＡ刺激ＰＢＭＣの選別を示す積み重ねられた高速画像。スケールバーは１５０μｍである。（Ｃ）対照、ＰＨＡおよびＰＰＤについて選別されたリンパ球の３分間でのインピーダンスプロファイル。
【図24】インピーダンスシステムプロトタイピングを示す。流体ポンプ、マイクロ流体デバイス、およびインピーダンス分析器に接続されたＰＣＢチップホルダを含むマイクロ流体サイトメータセットアップ。挿入図は、ＰＣＢおよびチップホルダの拡大図を示す。
【発明を実施するための形態】
【0023】
本発明は、非限定的な実施例および添付の図面と併せて考慮されるとき、詳細な説明を参照してより良く理解されるであろう。
以下の詳細な説明は、例示として、本発明が実施され得る特定の詳細および実施形態を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分詳細に説明されている。他の実施形態が利用されてもよく、本発明の範囲から逸脱することなく、構造的および論理的変更が行われてもよい。いくつかの実施形態を１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせて新しい実施形態を形成することができるので、種々の実施形態は必ずしも相互に排他的ではない。
以下の詳細な説明は、例示として、本発明が実施され得る特定の詳細および実施形態を参照する。これらの実施形態は、当業者が本発明を実施することを可能にするのに十分詳細に説明されている。他の実施形態が利用されてもよく、本発明の範囲から逸脱することなく、構造的および論理的変更が行われてもよい。いくつかの実施形態を１つまたは複数の他の実施形態と組み合わせて新しい実施形態を形成することができるので、種々の実施形態は必ずしも相互に排他的ではない。
【0024】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「または（ｏｒ）」という語は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、「および（ａｎｄ）」を含むことが意図される。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」を意味する。矛盾がある場合には、用語の説明を含む本明細書が優先する。
【0025】
本発明者らは、インピーダンスシグネチャに基づく無標識ハイスループットマイクロ流体リンパ球表現型決定アッセイ法を開発した。この開発は、異なるＴリンパ球集団（ＣＤ４＋）の最初の特徴付け、すなわち、これらは、健常なリンパ球、（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標））によって）活性化されたリンパ球、および（１０％ＤＭＳＯによって処理された）死滅リンパ球のインピーダンスプロファイルにおいて有意な生物物理学的差異を示すことが観察されたこと、によって可能となった。マイトジェンレクチンフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）およびツベルクリン精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）抗原を使用する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）刺激もまた、リンパ球活性化（ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋）に対応するリンパ球細胞サイズの増加（＞８μｍ）を明らかにした。次いで、臨床利用のための概念実証として、本発明者らは、活性化Ｔリンパ球（＞８μｍ）の無標識定量的測定のために統合型の細胞選別およびインピーダンスプロファイリングプラットフォームを適用し、段差付き高さを備えた（ｓｔｅｐｐｅｄ ｈｅｉｇｈｔ）試料入口を使用して、共面電極に近接する単一細胞集束流を流体力学的に達成した。これは、単一細胞インピーダンス測定にいくつかの利点をもたらすことが見出された。すなわち、１．初期選別段階中の細胞損失を最小限にする、十分に整列した粒子集束流、２．電極への細胞の近接に起因する改善された信号検出感度、および３．チャネルの下半分におけるより閉じ込められた粒子の位置／高さに起因して、インピーダンス信号変動がより小さくなること。これらの利点は、より大きな活性化Ｔリンパ球の有意な濃縮（約１１．７倍）および低レベルのリンパ球活性化（＜５％）の電気的検出を可能にした。次いで、ＰＨＡおよびＰＰＤで刺激されたＰＢＭＣからの活性化Ｔリンパ球（ＣＤ４＋）のインピーダンスプロファイリングのために、統合マイクロチップを磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）と結合した。活性化Ｔリンパ球を識別するために、差動インピーダンス細胞数比（刺激／未刺激）を定義し、それはフローサイトメトリーによる免疫表現型決定と比較してより良好な感度を示した。
【0026】
本明細書に説明される統合慣性インピーダンスサイトメトリープラットフォームは、１）サイズベースの活性化リンパ球濃縮、および２）インピーダンス検出感度を改善するための流体力学的ベースの単一ストリーム集束を含む、いくつかの重要な利点を提供する。ＭＡＣＳと組み合わせた場合、プラットフォームは、ＰＨＡおよびＰＰＤで刺激されたＰＢＭＣからの活性化ＣＤ４Ｔリンパ球応答を首尾よく検出した。まとめると、本明細書に報告される結果は、無標識抗原特異的リンパ球プロファイリングのための開発されたプラットフォームの可能性を実証する。開発された技術は、感染症（例えば、結核およびＣＯＶＩＤ１９）のためのポイントオブケア検査として抗原特異性Ｔリンパ球応答の定量的検出のためにさらに使用され得ることが想定される。無標識細胞分析および溶出細胞の連続収集は、生物物理学的細胞特性と抗原特異的応答との間の新規な関連を解明するための下流の生物分析を非常に容易にする。
【0027】
本発明者らはさらに、単一ストリーム粒子集束のための段差付き高さを備えた試料入口の組み込みが、スパイラル状マイクロ流体およびインピーダンスサイトメトリーの統合型プラットフォームを強化可能にすることを発見した。この新規な特徴を用いて、核および膜特性に基づく異なる好中球表現型（健常、死滅、ＮＥＴｏｓｉｓ）の無標識特徴付けを首尾よく実証することができた。開発されたプラットフォームはまた、最小限の細胞摂動を伴って、試料の取扱いおよび分析／試験時間を大幅に最小化し、これは、ポイントオブケア用途への重要な進歩を表す。
【0028】
本発明の方法は、インピーダンスサイトメトリーを用いた定量的な無標識細胞プロファイリングを可能にし、以下のステップ：
（ｉ）細胞を含む流体試料を提供するステップと；
（ｉｉ）第１の試料入口および第２のシース流体入口ならびにフローチャネルを有するインピーダンスサイトメータに前記試料を灌流させるステップであって、前記フローチャネルは、前記チャネルにわたって電場を生成するための共面電極と、電気インピーダンスの変化を検出することによって前記電場の破壊を検出するための手段とを備える、灌流させるステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の細胞の無標識定量的プロファイリングのための電気インピーダンスの変化を測定するステップと；
を含む。
（ｉ）細胞を含む流体試料を提供するステップと；
（ｉｉ）第１の試料入口および第２のシース流体入口ならびにフローチャネルを有するインピーダンスサイトメータに前記試料を灌流させるステップであって、前記フローチャネルは、前記チャネルにわたって電場を生成するための共面電極と、電気インピーダンスの変化を検出することによって前記電場の破壊を検出するための手段とを備える、灌流させるステップと；
（ｉｉｉ）前記試料中の細胞の無標識定量的プロファイリングのための電気インピーダンスの変化を測定するステップと；
を含む。
【0029】
本発明の種々の実施形態において、本発明の方法は、（ａ）遠心分離ステップ；および／または（ｂ）少なくとも１つの型の血液細胞がマーカー分子で標識される標識ステップを含まない。
【0030】
プロファイリングされる細胞は、典型的には血液細胞、通常は白血球、すなわち骨髄球および／またはリンパ球であり、リンパ球および好中球が、本明細書における方法の実現可能性を実証するための特定の例として使用される。したがって、記載および例示される方法は、主に、活性化リンパ球または活性化好中球プロファイリングを可能にする方法である。
【0031】
用語「血液細胞」は、本明細書で使用される場合、血小板、赤血球および白血球（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）を含むことを意味する。全ての白血球は有核であり、無核の赤血球および血小板と区別される。白血球のタイプは、標準的な方法で分類することができる。２対の最も広いカテゴリーは、構造（顆粒球または無顆粒細胞）または細胞系統（骨髄細胞またはリンパ系細胞）のいずれかによってそれらを分類する。これらの最も広いカテゴリーは、さらに５の主要なタイプに分けることができる：好中球、好酸球、好塩基球、単球、およびリンパ球。これらのタイプは、それらの物理的および機能的特徴によって区別される。単球および好中球は食作用性である。さらなるサブタイプ分類は、当技術分野において周知である。
【0032】
本明細書で互換的に使用される「リンパ球細胞」または「リンパ球」という用語は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞およびそれらの任意の組合せのいずれか１つを指す。末梢血単核（ＰＢＭＣ）細胞、腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）細胞およびリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞もリンパ球細胞と考えられる。リンパ球の非限定的な例としては、細胞傷害性リンパ球（ＣＴＬ、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋）、ＮＫ細胞（ＣＤ２＋）、およびＴヘルパー細胞（ＣＤ４＋）が挙げられる。
【0033】
したがって、使用される試料は、典型的には血液試料である。この試料は、本発明の方法において使用される前に、例えば、種々の分離、精製および保存処理（これらの全ては当業者に周知である）に供することによって、処理されてもよい。例えば、赤血球は、白血球の濃度を増加させ、赤血球バックグラウンドを減少させるために、溶解され得るか、またはそうでなければ血液試料の残りから分離され得る。
【0034】
種々の実施形態において、さらなる分離ステップが、白血球の亜集団を分離するために実施される。優勢な好中球およびリンパ球集団と比較して少ない総数で生じる白血球（例えば、好塩基球、好酸球および単球など）については、赤血球および血小板だけでなく、リンパ球および／または好中球も分離して、これらの細胞のプロファイリングを可能にすることが有益であり得る。好中球またはリンパ球をプロファイリングする場合にも同じことが当てはまる。そのような実施形態において、本明細書に記載の方法を実施する前に、プロファイリングされているものから評価されない亜集団を分離する（ｓｅｐｅｒａｔｒｅ）ことは必須ではないが、依然として有益であり得る。白血球の異なる亜集団を互いに分離するための手段は、当該分野で周知であり、いくつかはまた、本明細書中において、以下に記載される。
【0035】
試料は、指穿刺試料または静脈穿刺から生成された試料であり得る。
「試料」または「患者試料」は、本明細書で使用する場合、一般に、組織および体液などの生物学的試料を含む。「体液」には、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙、乳管液、リンパ液、痰、尿、羊水、および精液が含まれ得るが、これらに限定されない。試料は、「無細胞」である体液を含んでもよい。「無細胞体液」は、約１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞物質を含む。血漿または血清は無細胞体液の例である。試料は、天然または合成起源の標本を含み得る。「血漿」は、本明細書で使用する場合、血液中に見出される無細胞流体を指す。「血漿」は、当技術分野で公知の方法（例えば、遠心分離、濾過など）によって血液から全細胞性物質を除去することによって血液から得ることができる。本明細書で使用される場合、「末梢血血漿」は、末梢血試料から得られる血漿を指す。本明細書で使用される「血清」は、血漿または血液を凝固させ、凝固した画分を除去した後に得られる血漿の画分を含む。したがって、血清試料も無細胞である。一方、本明細書において使用される場合、「全血」とは、ヒト等の対象から採取された血液そのものであって、分離されていない血球を含む血液を意味する。また、全血試料としては、全血を適当な緩衝液等で希釈することによって、および／または抗凝固剤、プロテアーゼ阻害剤等の添加剤を添加することによって、得られた試料を用いてもよい。全血試料は、血小板、赤血球および白血球などの血液細胞を含む。本明細書に開示される方法は、細胞、特にリンパ球のプロファイリングに関するので、細胞を典型的に含有する試料のタイプが、本発明の意味において好ましい。
「試料」または「患者試料」は、本明細書で使用する場合、一般に、組織および体液などの生物学的試料を含む。「体液」には、血液、血清、血漿、唾液、脳脊髄液、胸膜液、涙、乳管液、リンパ液、痰、尿、羊水、および精液が含まれ得るが、これらに限定されない。試料は、「無細胞」である体液を含んでもよい。「無細胞体液」は、約１％（ｗ／ｗ）未満の全細胞物質を含む。血漿または血清は無細胞体液の例である。試料は、天然または合成起源の標本を含み得る。「血漿」は、本明細書で使用する場合、血液中に見出される無細胞流体を指す。「血漿」は、当技術分野で公知の方法（例えば、遠心分離、濾過など）によって血液から全細胞性物質を除去することによって血液から得ることができる。本明細書で使用される場合、「末梢血血漿」は、末梢血試料から得られる血漿を指す。本明細書で使用される「血清」は、血漿または血液を凝固させ、凝固した画分を除去した後に得られる血漿の画分を含む。したがって、血清試料も無細胞である。一方、本明細書において使用される場合、「全血」とは、ヒト等の対象から採取された血液そのものであって、分離されていない血球を含む血液を意味する。また、全血試料としては、全血を適当な緩衝液等で希釈することによって、および／または抗凝固剤、プロテアーゼ阻害剤等の添加剤を添加することによって、得られた試料を用いてもよい。全血試料は、血小板、赤血球および白血球などの血液細胞を含む。本明細書に開示される方法は、細胞、特にリンパ球のプロファイリングに関するので、細胞を典型的に含有する試料のタイプが、本発明の意味において好ましい。
【0036】
本明細書で使用される「指穿刺試料（Ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｉｃｋ ｓａｍｐｌｅ）」は、指（先端）から採取された１滴からなる血液の試料である。好ましくは、試料は、痛みを伴わずに皮膚を穿刺して新鮮な血流を生み出すことができる小型の指先ランセットデバイスによって採取される。血液の液滴が指に垂れたら、コレクターを液滴に当て、血液をコレクターに吸収させることができる。指穿刺試料の体積は、１０～５００μＬ、好ましくは５０～３００μＬ、より好ましくは８０～１５０μＬの範囲であり得る。あるいは、血液滴はまた、耳たぶのような身体の他の部分から採取されてもよい。指穿刺試料について記載された特徴は、身体の他の領域から採取されたそのような血液滴試料にも同様に当てはまる。
【0037】
種々の実施形態において、本方法は、マイクロ流体インピーダンスサイトメトリーを使用する。そのような実施形態において、ステップ（ｉ）は、マイクロ流体デバイスの形態のインピーダンスサイトメータを提供することをさらに含んでもよい。
【0038】
前記マイクロ流体デバイスは、スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備える。典型的には、２つの入口のうちの一方は試料入口であり、２つの入口のうちの他方はシース入口である。いくつかの実施形態において、試料入口は、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、シース流体入口は、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する。デバイスは３つ以上の入口を備えてもよいが、典型的な設定では、これは必要ではなく、したがって好ましくない。少なくとも２つの出口ポートは、少なくとも３つまたは少なくとも４つの出口ポートであってもよく、２つ、３つ、または４つの出口であってもよい。一実施形態において、デバイスは３つの出口ポートを有する。
【0039】
スパイラル形状フローチャネルは、少なくとも第１の端部および第２の端部を有してもよく、前記フローチャネルは、前記第１の端部またはその近傍に２つの入口ポートを有し、前記第２の端部またはその近傍に少なくとも２つの出口ポートを有し、２つの入口ポートのうちの一方は、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、他方の入口ポートは、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する。図３、図６および図１０に概略的に示すように、第１の端部はスパイラルの内側端部であってもよく、第２の端部は外側端部であってもよい。
【0040】
マイクロ流体デバイスのこれらの設定において、インピーダンス測定、特にリンパ球の直接インピーダンス定量化に必要とされる共面電極を含むインピーダンス検出器は、出口の少なくとも１つ、典型的にはプロファイリングされる細胞がマイクロ流体デバイスによって選別される出口に位置する。
【0041】
参照によりその全体が本明細書に組み込まれる本発明者らの以前の研究（国際公開第２０１７／００３３８０Ａ１号）において、特にマイクロ流体デバイスに関する節において、本発明者らは、ディーンフロー分別（ＤＦＦ）が、血液中に存在する血液成分および／または微粒子（細菌など）を分離するのに適格であることを見出し、異なる細胞および粒子の効率的かつ別個の精製のためにマイクロ流体デバイスのパラメータ設定をどのように適合させる必要があるかを説明した。しかしながら、この以前に報告された方法は、好中球の精製に焦点を当てていた。本方法は、細胞選別および集束のためにＤＦＦを使用して、以下のインピーダンス測定を可能にする。
【0042】
ディーンフロー分画（Ｄｅａｎ Ｆｌｏｗ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ（ＤＦＦ））と称されるマイクロ流体細胞選別技術は、罹患細胞のサイズに基づく分離として周知である（ホウ（Ｈｏｕ）ら、Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．３（２０１３）；ホウ（Ｈｏｕ）ら、Ｌａｂ Ｃｈｉｐ、１５、２２９７－２３０７（２０１５））。ＤＦＦは、高い流速（レイノルズ数、Ｒｅ約５０～１００）での支配的な慣性力（ＦＬ）に起因してより明確な位置で集束するための、流線にわたる粒子または細胞の側方移動を伴う、慣性微小流体技術に基づく選別方法である。ＤＦＦシステムにおいて、スパイラル状マイクロチャネルを通って流れる流体は、半径方向外向きの遠心加速を受けて、チャネルの上半分および下半分で２つの対称な反対方向に回転するディーン渦の形成をもたらす。スパイラルマイクロチャネル内にディーン渦が存在すると、側方のディーン牽引力（ＦＤ）が追加され、両方の力（ＦＬおよびＦＤ）が粒子サイズに応じて非線形に変化し、それらの重ね合わせ（ＦＬ／ＦＤ）がチャネル断面内の平衡位置を決定するため、優れた分離分解能が得られる。
【0043】
本明細書で使用される場合、「フローチャネル」という用語は、液体のための管状通路を意味する。好ましくは、フローチャネルはスパイラル形状である。スパイラル形状は非対称形状を表すので、内壁および外壁を定義することができる。本明細書で使用される場合、「マイクロ流体デバイス」という表現は、小さい、典型的にはサブミリメートル規模に幾何学的に制約された流体の制御および操作を可能にする物理的要素を意味する。本明細書で使用される「マイクロ流体デバイス」は、典型的には１ミリリットル未満の体積の液体試料を搬送、貯蔵、混合、反応、および／または分析するように設計された１つ以上のマイクロ流体フローチャネルを含むデバイスを指す。マイクロ流体デバイスを作製するために使用され得る材料の代表的な例としては、限定されるものではないが、シリコーンゴム、ガラス、プラスチック、シリコンおよび金属が挙げられ、好ましくは、マイクロ流体デバイスは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）から作製される。
【0044】
本明細書で使用される「入口ポート」という用語は、試料およびシース流体と最初に接触するフローチャネルの端部として定義される。反対に、「出口ポート」という用語は、試料の流体材料およびシース流体をマイクロ流体デバイスから、例えば、それが接続されている容器内に放出するフローチャネルの端部を指す。
【0045】
本明細書で使用される「容器に接続される」という用語は、本発明のマイクロ流体デバイス内で回収された流体の第２の貯蔵ユニットへの移送に関する。「容器」は、本発明の意味において、その唯一の機能が回収された流体を貯蔵することであるユニットであり得るが、カラムまたはフィルターユニットなどのさらなる精製、または回収された流体の分析を可能にするデバイスでもあり得る。回収された流体の分析のために使用されるデバイスは、限定されるものではないが、ＦＡＣＳデバイス、質量分析デバイス、顕微鏡、遠心分離機、ＰＣＲサーモサイクラー、および機能アッセイを実行するために使用され得るコーティングを含む第２のフローチャネルを含み得る。
【0046】
「シース流体」という用語は、本明細書で使用される場合、水性もしくは非水性流体、および／または追加の材料成分、例えば、可溶性化学成分または少なくとも部分的に不溶性の成分の懸濁液もしくはエマルジョンを含み得る流体を含む、種々の流体を指す。好ましくは、シース液は緩衝液、好ましくは血液細胞と適合性の緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（略してＰＢＳ）および他の周知の緩衝液である。本明細書で使用される「緩衝液」という用語は、それらが溶解または分散される環境のｐＨを制御する任意の化合物または化合物の組合せの水溶液を意味する。ｐＨ値に関して、緩衝物質は、緩衝溶液に添加される酸または塩基の効果を減少させる。水溶性緩衝物質の例としては、限定されるものではないが、メグルミン、重炭酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、グルコン酸カルシウム、水素リン酸ジナトリウム、水素リン酸ジカリウム、リン酸トリカリウム、酒石酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、グリセロリン酸カルシウム、トロメタミン、酸化マグネシウムまたはこれらの任意の組合せが挙げられる。金属カチオンは、緩衝物質の緩衝特性を変化させることなく、別の適切な金属カチオンで置換され得ることが理解される。低い水溶性を有する緩衝物質もまた、典型的には他のより可溶性の成分と組み合わせて使用され得る。例としては、限定されるものではないが、水酸化マグネシウム、水酸化アルミニウム、ジヒドロキシアルミニウム炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸アルミニウム、炭酸アルミニウム、ジヒドロキシアルミニウムアミノアセテート、酸化マグネシウム、三ケイ酸マグネシウム、炭酸マグネシウム、およびこれらの組み合わせが挙げられる。緩衝液には、塩、界面活性剤、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）などの補助剤を補充することもできる。上記に列挙した緩衝物質の各々について使用され得る濃度は、当該分野で周知である。
【0047】
マイクロ流体デバイスを使用する方法の上記の実施形態において、ステップ（ｉｉ）は、典型的には、試料を試料流量で試料入口ポートに導入することと、シース流体をシース流量でシース入口に導入することとを含む。試料およびシース流体の流量は、本方法の細胞選別特性に影響を及ぼすパラメータである。
【0048】
種々の実施形態において、試料対シースの流量比は、１：１５以下、好ましくは１：２０以下、例えば、１：１５～１：１００または１：１５～１：８０または１：１５～１：６０または１：１５～１：５０または１：１８～１：４５または１：２０～１：４５の範囲、例えば、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０または１：４５である。これらの方法において、試料の流速は、１０～４００μＬ／分の範囲であり得る。試料対シースの流量比が低い場合、試料流量も低く、この低い比を可能にし、シース流体流量を大幅に増加させなければならない。典型的な試料流量は、約１：１５～約１：２５０の範囲であり得る。したがって、シース流体の流量は、例えば、約２００～約５０００μＬ／分の範囲であってもよい。使用される流量は、典型的には、フローチャネルおよびマイクロ流体デバイスの寸法によって制限される。
【0049】
数値に関連して本明細書で使用される「約」は、参照される数値±１０％または±５％を指す。
試料は、シリンジまたは他の手段によって、マイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入され得る。マイクロ流体デバイスのフローチャネルに試料を導入するための他の手段としては、マイクロディスペンサ、例えば、液滴ディスペンサ（例えば、注入ノズルなど）；チャネル内ディスペンサ（例えば、計量ディスペンサ）が挙げられる。マイクロ流体デバイスのフローチャネルに試料を導入するための手段は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）らおよびリー（Ｌｉ）らにより、より詳細に考察されている（ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、「マイクロ流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（マサチューセッツ州ノーウッド：２００６年）、３９５－４１７頁；リー（Ｌｉ）ら、「マイクロチップに基づく分析システム用の注射スキーム（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｍｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ－ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、３８５－４０３頁）。ヌグイェンらは、マイクロディスペンサを詳細に論じている。リー（Ｌｉ）らは、マイクロディスペンサを詳細に論じている。
試料は、シリンジまたは他の手段によって、マイクロ流体デバイスのフローチャネルに導入され得る。マイクロ流体デバイスのフローチャネルに試料を導入するための他の手段としては、マイクロディスペンサ、例えば、液滴ディスペンサ（例えば、注入ノズルなど）；チャネル内ディスペンサ（例えば、計量ディスペンサ）が挙げられる。マイクロ流体デバイスのフローチャネルに試料を導入するための手段は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）らおよびリー（Ｌｉ）らにより、より詳細に考察されている（ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、「マイクロ流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（マサチューセッツ州ノーウッド：２００６年）、３９５－４１７頁；リー（Ｌｉ）ら、「マイクロチップに基づく分析システム用の注射スキーム（Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ Ｓｃｈｅｍｅｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏｃｈｉｐ－ｂａｓｅｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、３８５－４０３頁）。ヌグイェンらは、マイクロディスペンサを詳細に論じている。リー（Ｌｉ）らは、マイクロディスペンサを詳細に論じている。
【0050】
試料入口は、段差付きの試料入口であってもよい。本明細書で使用される場合、「段差付きの試料入口」は、試料入口の高さがフローチャネルの高さよりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３～１０倍、例えば約４倍、約５倍、約６倍、約７倍、約８倍、または約９倍低いことを意味する。試料入口は、細胞のより良好な集束を可能にするために、フローチャネルの底部に位置してもよい。種々の実施形態において、前記段差付きの試料入口はまた、その高さがシース流体入口の高さよりも、典型的にはフローチャネルの場合と同じ係数だけ低いことを意味する。種々の実施形態において、シース流体入口およびフローチャネルは、類似または同一の高さを有し、試料入口は、「段差（ｓｔｅｐ）」を提供するために有意に低い。
【0051】
本発明者らは、段差付きの入口の試料が、インピーダンス測定に使用される共面電極の近くで単一細胞集束流を流体力学的に達成するための適切な手段を表すことを見出した。これは、単一細胞インピーダンス測定にいくつかの利点をもたらす：すなわち、１．初期選別段階中の細胞損失を最小限にする、十分に整列した粒子集束流、２．電極への細胞の近接に起因する改善された信号検出感度、および３．チャネルの下半分におけるより閉じ込められた粒子の位置／高さに起因して、インピーダンス信号変動がより小さくなること。
【0052】
種々の実施形態において、試料入口は、１５～５０μｍの高さを有し、および／またはシース流体入口およびフローチャネルは、８０～２５０μｍの高さを有する。一例において、試料流体入口の高さは約２０μｍであり、フローチャネルおよび任意選択でシース流体入口も約１１０μｍの高さを有する。
【0053】
本方法の種々の実施形態において、シース流体入口の開口幅は、２００～７００μｍの範囲内であり、および／または試料入口の開口幅は、５０～２００μｍ、好ましくは６０～１８０または７０～１６０μｍまたは８０～１５０μｍである。いくつかの実施形態において、シース流体入口と試料入口のアスペクト比（高さに対する幅）は、３～１０、好ましくは４～８の範囲にある。試料入口および／またはシース（Ｓｈｅａｔ）流体入口のアスペクト比は、１より大きく、典型的には１．５より大きく、または２より大きいことが一般に好ましい。種々の実施形態において、シース入口対試料入口の面積比は、１０～５０、好ましくは２０～４０の範囲内である。
【0054】
本発明の種々の実施形態において、少なくとも２つの出口ポートは、少なくとも３つまたは少なくとも４つの出口ポートである。本明細書で説明されるいくつかの実施形態において、デバイスは、３つの出口ポートを備え、１つは、インピーダンス検出器につながり、他の２つは、廃棄物出口ポートである。種々の実施形態において、インピーダンス測定につながる試料出口ポートは、中間出口ポート（ｍｉｄｄｌｅ ｏｕｔｌｅｔ ｐｏｒｔ）であり、流動特性は、標的細胞がこの中間出口ポートに選別されるように調節される。
【0055】
種々の実施形態において、スパイラル形状フローチャネルを通して流動する試料のレイノルズ数（Ｒｅ）は、５０～１００である。本明細書で使用される場合、「レイノルズ数」という表現は、ρυＬ／μを意味し、式中、ρは液体の密度を表し、υは液体の速度を表し、Ｌはフローチャネルの特徴的な長さを表し、μは液体の粘度を表す。
【0056】
スパイラル形状フローチャネルは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むか、またはポリジメチルシロキサンからなってもよい。それは、２００～７００μｍ、例えば３００～６５０または４００～６００μｍ、好ましくは約５００μｍの幅を有してもよい。種々の実施形態において、それは、１１０～１３０μｍの高さを有し、および／または４～２０、５～１５または７～１３ｃｍ、好ましくは約１０ｃｍの全長を有する。
【0057】
デバイスの種々の実施形態において、少なくとも２つの出口ポートは、２つの出口ポートである。上記で定義された２つの出口ポートデバイスのより好ましい実施形態において、第１の出口ポートはフローチャネルの幅の５～３０％、好ましくは２０％をカバーし、第２の出口ポートはフローチャネルの幅の７０～９５％をカバーし、第１の出口ポートは内壁に位置し、第２の出口ポートは外壁に位置する。上記で定義された２つの出口ポートデバイスの種々の実施形態において、スパイラル形状のフローチャネルは、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むか、またはそれからなり；（ｂ）５～１０ｃｍ、好ましくは６．５ｃｍの全長を有し；（ｃ）２００～４００μｍ、好ましくは３００μｍの幅を有し；および／または（ｄ）３０～９０μｍ、好ましくは６０μｍの高さを有する。そのような実施形態において、第１の出口ポートの幅は、１～５０μｍであってもよく、第２の出口ポートの幅は、内壁から外壁まで測定して５１～３００μｍであってもよい。
【0058】
他の実施形態において、スパイラル形状フローチャネルは、（ａ）ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）を含むか、またはそれからなり、（ｂ）幅が３００～６００μｍ、好ましくは５００μｍであり、（ｃ）高さが１００～１３０μｍ、好ましくは１１０μｍであり、および／または（ｄ）全長が７～１３ｃｍ、好ましくは１０ｃｍである。そのような実施形態において、デバイスは、３つまたは４つの出口ポート、例えば、３つの出口ポートを有してもよい。種々の実施形態において、スパイラル形状フローチャネルは、出口ポートの分岐において８００～１２００μｍの幅まで徐々に拡大してもよい。３～４個の出口ポートが存在する本発明のさらなる種々の実施形態において、フローチャネルの幅は、３または４で等分されて、本質的に同じ幅を有する３または４個の出口ポートを提供し得る。出口ポートは一般に水平に配置され、スパイラルの中心に対して、１つが内壁の近くにあり、別の１つが外壁の近くにあり、任意のさらなる出口ポートが内壁の出口ポートと外壁の出口ポートとの間に位置する。
【0059】
マイクロ流体デバイスおよびそのフローチャネルの寸法、ならびにマイクロ流体デバイスを構築するための材料およびマイクロ流体デバイスを構築するための方法は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、タベリング（Ｔａｂｅｌｉｎｇ）、アルマニ（Ａｒｍａｎｉ）ら、ツァオ（Ｔｓａｏ）ら、カーレン（Ｃａｒｌｅｎ）ら、チェン（Ｃｈｅｕｎｇ）ら、サン（Ｓｕｎ）らおよびワッデル（Ｗａｄｄｅｌｌ）により記載がなされている（ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、「マイクロ流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（マサチューセッツ州ノーウッド：２００６年）、５５－１１５頁；タベリング（Ｔａｂｅｌｉｎｇ）著、「マイクロ流体技術入門（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）（英国オックスフォード：２００５年）、２４４－２９５頁；アルマニ（Ａｒｍａｎｉ）ら、「ビニルサインプロッターを用いたＰＤＭＳマイクロ流体チャネルの製作（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｎｇ ＰＤＭＳ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈａｎｎｅｌｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｖｉｎｙｌ Ｓｉｇｎ Ｐｌｏｔｔｅｒ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、９－１５頁；ツァオ（Ｔｓａｏ）ら、「熱可塑性マイクロ流体におけるボンディング技術（Ｂｏｎｄｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｆｏｒ Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｔｉｃ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、４５－６３頁；カーレン（Ｃａｒｌｅｎ）ら、「シリコンおよびガラス微細加工（Ｓｉｌｉｏｎ ａｎｄ Ｇｌａｓｓ Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ）、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、８３－１１４頁；チェン（Ｃｈｅｕｎｇ）ら、「多成分生体適合性微細構造の製作におけるマイクロ流体技術に基づくリソグラフィー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ－ｂａｓｅｄ Ｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｕｌｔｉ－Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｍｉｃｒｏｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、１１５－１３８頁；サン（Ｓｕｎ）ら、「酵素および化学分析のためのラミネートオブジェクト製造（ＬＯＭ）技術に基づく多チャネルラブオンアチップ（Ｌａｍｉｎａｔｅｄ Ｏｂｊｅｃｔ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ（ＬＯＭ）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ－Ｂａｓｅｄ Ｍｕｌｔｉ－Ｃｈａｎｎｅｌ Ｌａｂ－ｏｎ－ａ－Ｃｈｉｐ ｆｏｒ Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、１６１－１７２頁；ワッデル（Ｗａｄｄｅｌｌ）著、「レーザー微細加工（Ｌａｓｅｒ Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻：「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、１７３－１８４頁）。
【0060】
種々の実施形態において、スパイラル形状フローチャネルは、例えば、出口ポートの分岐部において８００～１２００μｍの幅まで徐々に拡大する。いくつかの実施形態において、拡大された幅は約１０００μｍである。本明細書で使用される場合、「分岐される（ｆｕｒｃａｔｅｄ）」という用語は、枝に分割されることを意味する。本明細書で使用される場合、「枝（ｂｒａｎｃｈ）」という用語は、より大きいまたはより複雑な本体の限られた部分、すなわち、一次フローチャネルから出現するかまたは一次フローチャネルに入力もしくは再入力するより小さいフローチャネルを意味する。本明細書で使用される場合、用語「一次フローチャネル」または「第１のフローチャネル」は、試料の少なくとも大部分がフロースルーするフローチャネルを意味する。
【0061】
４つの出口ポートが使用される本発明の種々の実施形態において、第１の出口ポートは、内壁から外壁に向かって画定されるフローチャネルの幅の、０～１００μｍをカバーし、第２の出口ポートは、同幅の１０１～２５０μｍをカバーし、第３の出口ポートは、同幅の２５１～６５０μｍをカバーし、第４の出口ポートは、同幅の６５１～１０００μｍをカバーする。本発明の代替実施形態において、第１の出口ポートはフローチャネルの幅の１～２０％をカバーし（ｃｏｖｅｒ）、第２の出口ポートはフローチャネルの幅の１０～２０％をカバーし、第３の出口ポートはフローチャネルの幅の３０～５０％をカバーし、第４の出口ポートはフローチャネルの幅の２５～４５％をカバーし、ここで、出口ポート１～４の順序は内壁から外壁に向かって定められる。
【0062】
ステップ（ｉｉ）は、マイクロ流体デバイスを採用する実施形態において、細胞選別および集束のために、スパイラル形状フローチャネルを通して前記試料およびシース流体を駆動するステップを含んでもよい。
【0063】
試料は、毛管作用の力によって駆動されてもよい。あるいは、試料は、ポンプによって、電気的な力によって、または試料を駆動するための他の手段によって駆動されてもよい。同じことがシース流体にも当てはまるが、シース流体は、典型的には、毛管作用によって駆動されるのではなく、ポンプなどの能動的手段によって駆動される。適切なポンプとしては、限定されるものではないが、回転（遠心）ポンプ；蠕動ポンプ；および超音波ポンプが挙げられる。電気的な力は、限定されるものではないが、電気流体力学的力；電場駆動力、例えば、電気泳動、電気浸透；および表面張力駆動、例えば、電気湿潤、誘電体表面上の電気湿潤を含む。試料を駆動するための手段は、ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら、グローバー（Ｇｒｏｖｅｒ）ら、ハント（Ｈｕｎｔ）らおよびベルサノ・ベゲイ（Ｂｅｒｓａｎｏ－Ｂｅｇｅｙ）らにより、より詳細に考察されている（ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）ら、「マイクロ流体技術の基礎と応用（Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、第２版、アーテックハウス社（ＡＲＴＥＣＨ ＨＯＵＳＥ，ＩＮＣ．）（マサチューセッツ州ノーウッド：２００６年）、２５５－３０９頁；エリクソン（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ）ら、「マイクロ流体システムにおける動電輸送への導入（Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｋｉｎｅｔｉｃ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｙｓｔｅｍｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻、「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、２３１－２４８頁；グローバー（Ｇｒｏｖｅｒ）ら、「モノリシック膜の弁およびポンプ（Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｖａｌｖｅｓ ａｎｄ Ｐｕｍｐｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１巻、「製作およびマイクロ流体（Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、２８５－３１７頁；ハント（Ｈｕｎｔ）ら、「誘電体操作のための集積回路／マイクロ流体チップ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ Ｃｉｒｃｕｉｔ／Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｃｈｉｐｓ ｆｏｒ Ｄｉｅｌｅｃｔｒｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻：「生体分子の分離および分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、１８７－２０６頁、ベルサノ・ベゲイ（Ｂｅｒｓａｎｏ－Ｂｅｇｅｙ）ら、「ブライユマイクロ流体（Ｂｒａｉｌｌｅ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）」、Ｌａｂ ｏｎ ａ Ｃｈｉｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第２巻：「生体分子の分離および分析（Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ）」、ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）ら編、ケイスター・アカデミック・プレス（Ｃａｉｓｔｅｒ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（英国ノーフォーク：２００９年）、２６９－２８５頁）。ヌグイェン（Ｎｇｕｙｅｎ）らは、マイクロバルブ、マイクロポンプ、マイクロフローセンサ、マイクロフィルタおよびマイクロセパレータを詳細に論じている。ヘロルド（Ｈｅｒｏｌｄ）らにおける章では、バルブ、ポンプ、および分離について詳細に説明している。
【0064】
次いで、ステップ（ｉｉｉ）は、選別され集束されたリンパ球をインピーダンス検出器、すなわちインピーダンス測定に使用される共面電極を備える少なくとも１つの出口内に駆動することによって、ステップ（ｉｉ）の選別かつ集束された細胞をインピーダンス検出器へと向かわせて、インピーダンス信号読み出しを決定することによって、細胞、好ましくは活性化リンパ球を定量的にプロファイリングするステップを含む。
【0065】
種々の実施形態において、インピーダンス測定は、細胞サイズを決定するために、０．１～１ＭＨｚ、好ましくは０．２～０．８または０．２～０．６ＭＨｚの範囲の低周波数で実施される。種々の実施形態において、前記測定は、電気的不透明度を決定するために、＞１～２０ＭＨｚ、好ましくは１．２～１５．０または１．２～１２．０ＭＨｚの範囲の高周波数でインピーダンス測定をさらに実行することによって補足されてもよい。電気的不透明度は、高周波数（＞１～２０ＭＨｚ）におけるインピーダンス信号の大きさの低周波数（０．１～１ＭＨｚ）におけるインピーダンス信号の大きさに対する比として計算することができる。電気的不透明度（１．７２ＭＨｚ／０．３ＭＨｚ）は細胞膜の電気的特性を反映し、電気的不透明度（１２ＭＨｚ／０．３ＭＨｚ）は核の電気的特性を反映する。種々の実施形態において、測定は、２つのより高い周波数範囲で行うことができ、１つは膜特性を決定するため（＞１～１０ＭＨｚ、好ましくは１．２～８ＭＨｚまたは１．３～５ＭＨｚまたは１．３～３ＭＨｚ）であり、１つは核特性を決定するため（＞１０～２０ＭＨｚ、好ましくは１０．５～１５ＭＨｚまたは１０．５～１３ＭＨｚ）である。したがって、このより高い周波数帯域のうちの第１の周波数帯域は、膜不透明度を決定するために使用されるものとも呼ばれ、第２の周波数帯域は、核不透明度を決定するために使用される。示されたより高い周波数範囲、すなわち＞１０～２０ＭＨｚは、細胞内構造の特性を決定するために、例えば食作用を評価するために使用することもできる。また、この高周波数範囲は、好中球をプロファイリングして、ＮＥＴｏｓｉｓを受けているものを同定することを可能にすることも見出されている。なぜなら、これは核の膨化（ｎｕｃｌｅａｒ ｓｗｅｌｌｉｎｇ）を伴うからである。種々の実施形態において、上記の低周波数範囲での測定は、膜特性または核特性の決定を可能にするために２つのより高い周波数範囲のいずれか１つと組み合わせることができ、あるいは両方を決定するために両方のより高い周波数範囲と組み合わせることができる。したがって、種々の実施形態において、インピーダンス測定は、０．１～１ＭＨｚ、好ましくは０．２～０．６ＭＨｚの周波数で、任意選択で、＞１～１０ＭＨｚ、好ましくは１．３～５ＭＨｚの周波数、および／または＞１０～２０ＭＨｚ、好ましくは１０．５～１３ＭＨｚの周波数で行われる。
【0066】
ステップ（ｉｉｉ）の後、細胞は廃棄され得るか、またはそれぞれの出口ポートに連結された容器に収集され得る。これは、選別された細胞のさらなる使用および／または分析を可能にする。
【0067】
本発明の方法は、ステップ（ｉｉ）および（ｉｉｉ）におけるインピーダンスプロファイリングの前に、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を行うステップをさらに含んでもよい。これは例えば、試料を望ましくない細胞に結合する磁気ビーズとともにインキュベートし、望ましくない細胞が結合した磁気ビーズを磁場によって結合していない細胞から分離することによって、達成され得る。そのような望ましくない細胞には、特に本方法がリンパ球プロファイリングのためのものである場合、単球などの骨髄球が含まれ得る。そのような細胞選別を可能にするために、磁気ビーズは、典型的には、特定のタイプの細胞によってのみ結合される化合物またはリガンドでコーティングされる。当該化合物は、種々の実施形態において、抗体または抗体様分子であってもよい。
【0068】
本発明の種々の実施形態において、本発明の方法は、少なくとも１つの型の血液細胞がマーカー分子で標識される標識ステップを含まない。本明細書中で使用される場合、用語「標識（ｌａｂｅｌｉｎｇ）」は、本発明において使用される細胞、タンパク質および／またはペプチドへの１つ以上の検出可能なマーカー（または「標識」）の付着または組み込みを示す。本明細書で互換的に使用される「マーカー分子」または「検出可能なマーカー」という用語は、化学的、物理的または酵素的反応において検出可能な化合物またはシグナルを直接的または間接的に生成する、１つまたは複数の適切な化学物質または酵素を含む任意の化合物を指す。本明細書中で使用される場合、この用語は、標識自体（すなわち、タンパク質および／またはペプチドに結合した化合物または部分）ならびに標識試薬（すなわち、ペプチドまたはタンパク質と結合する前の化合物または部分）の両方を含むと理解されるべきである。本発明において使用される標識は、共有結合または非共有結合を介してタンパク質および／またはペプチドのアミノ酸残基に結合され得る。典型的には、結合は共有結合である。標識は、とりわけ、同位体標識、等圧標識、酵素標識、着色標識、蛍光標識、発色標識、発光標識、放射性標識、ハプテン、ビオチン、金属錯体、金属、および金コロイドから選択することができ、等張標識（ｉｓｏｔｏｎｉｃ ｌａｂｅｌ）および等圧標識が特に好ましい。全てのこれらのタイプの標識は、当該技術分野で十分に確立されている。
【0069】
本発明はまた、本明細書に開示されるマイクロ流体デバイスを包含する。一実施形態において、本発明はまた、インピーダンスサイトメトリーを使用する定量的無標識細胞プロファイリングのためのバイオセンサであって、前記バイオセンサは：
（ｉ）スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスであって、２つの入口のうちの一方は試料入口であり、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、２つの入口のうちの他方はシース入口であり、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する、マイクロ流体デバイスと；
（ｉｉ）細胞の直接インピーダンス定量化のための共面電極であって、前記マイクロ流体デバイスの前記出口のうちの少なくとも１つと一体化されている共面電極と；
を備える。
（ｉ）スパイラルの中心に対して内壁および外壁を有し、２つの入口および少なくとも２つの出口を有するスパイラル形状フローチャネルを備えるマイクロ流体デバイスであって、２つの入口のうちの一方は試料入口であり、スパイラル形状フローチャネルの内壁に位置し、２つの入口のうちの他方はシース入口であり、スパイラル形状フローチャネルの外壁に位置する、マイクロ流体デバイスと；
（ｉｉ）細胞の直接インピーダンス定量化のための共面電極であって、前記マイクロ流体デバイスの前記出口のうちの少なくとも１つと一体化されている共面電極と；
を備える。
【0070】
「バイオセンサ」という用語は、この文脈で使用される場合、本明細書に記載され、以下にも定義されるマイクロ流体デバイスに関し、選別された細胞のインピーダンス測定を実行するための手段を備える。
【0071】
本方法の文脈で、また寸法および部品を含むマイクロ流体デバイスおよびインピーダンス検出器に関して上述したすべての実施形態は、本発明のバイオセンサにも同様に適用可能である。したがって、種々の実施形態において、バイオセンサは、試料入口の高さがシース流体入口およびフローチャネルの高さよりも、好ましくは少なくとも２倍、より好ましくは３～１０倍低いという点で段差付き試料入口である試料入口を備え、試料入口は、任意選択でフローチャネルの底部に位置する。
【0072】
バイオセンサの種々の実施形態において、試料入口は、１５～５０μｍの高さを有し、そしてシース流体入口およびフローチャネルは、８０～２５０μｍの高さを有する。シース流体入口の開口幅は、２００～７００μｍの範囲内であってもよく、および／または試料入口の開口幅は、５０～２００μｍであってもよく、好ましくは両方の寸法範囲が満たされる。シース流体入口と試料入口のアスペクト比（高さに対する幅）は、好ましくは３～１０、より好ましくは４～８の範囲にある。種々の実施形態において、シース入口対試料入口の面積比は、１０～５０、好ましくは２０～４０の範囲内である。種々の実施形態において、スパイラル形状のフローチャネルは、４～２０、５～１５または７～１３ｃｍ、好ましくは約１０ｃｍの全長を有する。
【0073】
このようなバイオセンサ／マイクロ流体デバイスは、好ましくは、試料がデバイスの試料入口に導入される前に、それぞれの他の細胞集団が除去されるセットアップにおいて、好中球およびリンパ球の両方の選別およびプロファイリングのために使用され得る。
【0074】
さらに別の態様は、本発明のバイオセンサを含む統合型インピーダンスサイトメータであり、さらに、（１）マイクロチップ、（２）インピーダンス分析器、ならびに（３）灌流制御を可能にするために試料およびシース流体入口に接続された流体ポンプのうちの１つ以上、好ましくは全てを含み、マイクロチップはインピーダンス分析器および流体ポンプと接続され、インピーダンス分析器はインピーダンス測定を可能にするために共面電極に接続されている。統合型インピーダンスサイトメータは、サイトメータを操作するためのソフトウェアをさらに含んでもよい。
【0075】
単一チップ上での連続的な無標識の細胞分離およびインピーダンスプロファイリングを特徴とする統合型プラットフォームの実現は、免疫学研究、癌診断、ならびにポイントオブケアおよび免疫健常プロファイリングを含む広範囲の臨床適用を伴う大きな商業的関心の対象である。この技術は、ヒトによる取り扱いが最小限で、単一ステップかつ無標識の細胞分離およびインピーダンス分析を提供する。マルチパラメータ研究のために、開発されたプラットフォームを他の細胞ベースのプラットフォームと統合することも可能である。この統合型プラットフォームの全ての特徴を用いて、それは、免疫学研究およびポイントオブケア検査市場のための製品に開発され得る。
【0076】
本発明の方法に関連して上記に開示された全ての実施形態は、本発明のバイオセンサおよびインピーダンスサイトメータに同様に適用され、逆もまた同様である。
本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。しかしながら、本発明は、例示された実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
本発明は、以下の非限定的な例によってさらに説明される。しかしながら、本発明は、例示された実施形態に限定されないことが理解されるべきである。
【実施例】
【0077】
材料および方法
デバイス設計、製作および動作
デバイスの概略図を図１Ａに示す。簡単に述べると、それは３つのステージ、すなわち（１）スパイラル細胞選別器、（２）慣性細胞集束器、および（３）共面電極を使用するインピーダンス検出器からなる。これは、白血球（約８～１０μｍ）研究のための以前の統合型プラットフォームに基づいており、インピーダンスサイトメータの詳細は以前の文献（ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１９）、前掲；ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１８）、前掲）に記載されている。
デバイス設計、製作および動作
デバイスの概略図を図１Ａに示す。簡単に述べると、それは３つのステージ、すなわち（１）スパイラル細胞選別器、（２）慣性細胞集束器、および（３）共面電極を使用するインピーダンス検出器からなる。これは、白血球（約８～１０μｍ）研究のための以前の統合型プラットフォームに基づいており、インピーダンスサイトメータの詳細は以前の文献（ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１９）、前掲；ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１８）、前掲）に記載されている。
【0078】
インピーダンスの検出感度および一貫性をさらに改善するために、本発明者らは、シース流体を使用して試料流をチャネルの下半分に流体力学的に閉じ込めるために、段差付き試料入口を追加した（図１Ｂ）。スパイラルマイクロチャネル内の慣性結合ディーンフロー移動の影響下で、より大きな細胞（流体力学的直径（Ｄｈ）に対する粒径（Ａｐ）＞０．０７）は、好中球選別およびインピーダンス検出のために（電極表面により近い）チャネル底部付近で平衡化する（図１Ｂ）。
【0079】
デバイスにおける段差付き試料入口を実現するために、ＳＵ－８マスター作製のための二層フォトリソグラフィを使用し、第１の層（高さ約２０μｍ）が試料入口および検出領域（幅３０μｍ）を画定し、第２の層を第１の層の上に位置合わせしてデバイスの残りの部分（高さ約１１０μｍ）を画定した。シース入口（開口幅５００μｍ）と段差付き高さ試料入口（開口幅１００μｍ）との面積比は、約２７．５であった。統合型プラットフォームに関して、最適流量試料およびシース流量は、それぞれ８０μＬ／分および１６８０μＬ／分（１：２１）であった。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）をＳＵ－８マスター上にキャストしてマイクロ流体デバイスを作製し、マイクロ流体デバイスは、パターン化された共面金電極（幅２０μｍ、ギャップ２０μｍおよび厚さ２００ｎｍ）を有するガラス上に接合される。
【0080】
任意の実験の前に、デバイスをリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｌｏｎｚａ）中の１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ、Ｂｉｏｗｅｓｔ）で少なくとも１時間コーティングして、デバイスへの非特異的接着を防止した。試料およびシース（いずれもＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ中）をデバイスにロードし、シリンジポンプ（ＰＨＤ ＵＬＴＲＡ（商標）、Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ）によって灌流した。
【0081】
電気的測定および高速イメージングの前に、試料およびシースを１分間灌流して、フローが安定状態に達するようにした。実験中、プラットフォームを倒立顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ Ｅｃｌｉｐｓｅ Ｔｉ）上に取り付けた。ＰｈａｎｔｏｍＶ９．１（ＡＭＥＴＥＫ）を用いて高速画像を撮影した。
【0082】
測定セットアップおよびデータ提示
３つの電極による差動測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を、単一細胞インピーダンスプロファイリングのために使用した。中央の電極を使用して、ロックイン増幅器（ＨＦ２ＬＩ、Ｚｕｒｉｃｈ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって３つの異なる周波数（０．３ＭＨｚ、１．７２ＭＨｚおよび１２ＭＨｚ）で１Ｖの励起信号を印加した。側部電極からの電流応答は、１０ｋＶ／Ａのトランスインピーダンス利得を有するトランスインピーダンス増幅器（ＤＨＰＣＡ－１００、ＦＥＭＴＯ（登録商標））によって電圧に変換され、ロックイン増幅器にフィードバックされ、印加された周波数における大きさおよび位相が２３０ｋサンプル／ｓのサンプリングレートで抽出された。時系列インピーダンス応答を３分間記録し、処理して、単一粒子事象に対応する振幅ピークを抽出した。参照ビーズ（１０μｍビーズ）をスパイクすることによって、細胞の電気的サイズ（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｉｚｅ）を、以前の文献（キャセリ（Ｃａｓｅｌｌｉ）ら、前掲）に示されるように決定することができ（｜ＺＬＦ｜α電気的サイズ３）、データ較正を実施して、電気的サイズおよび正規化不透明度（参照ビーズの不透明度によって正規化された粒子不透明度、ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１９）、前掲）を計算した。最後に、電気的サイズ（μｍ）対正規化不透明度の２Ｄ散乱プロットをプロットして、細胞集団のインピーダンスプロファイルを示した。データ処理は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）で書かれたカスタムメイドのプログラムを用いて行った。
３つの電極による差動測定（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）を、単一細胞インピーダンスプロファイリングのために使用した。中央の電極を使用して、ロックイン増幅器（ＨＦ２ＬＩ、Ｚｕｒｉｃｈ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）によって３つの異なる周波数（０．３ＭＨｚ、１．７２ＭＨｚおよび１２ＭＨｚ）で１Ｖの励起信号を印加した。側部電極からの電流応答は、１０ｋＶ／Ａのトランスインピーダンス利得を有するトランスインピーダンス増幅器（ＤＨＰＣＡ－１００、ＦＥＭＴＯ（登録商標））によって電圧に変換され、ロックイン増幅器にフィードバックされ、印加された周波数における大きさおよび位相が２３０ｋサンプル／ｓのサンプリングレートで抽出された。時系列インピーダンス応答を３分間記録し、処理して、単一粒子事象に対応する振幅ピークを抽出した。参照ビーズ（１０μｍビーズ）をスパイクすることによって、細胞の電気的サイズ（ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ ｓｉｚｅ）を、以前の文献（キャセリ（Ｃａｓｅｌｌｉ）ら、前掲）に示されるように決定することができ（｜ＺＬＦ｜α電気的サイズ３）、データ較正を実施して、電気的サイズおよび正規化不透明度（参照ビーズの不透明度によって正規化された粒子不透明度、ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１９）、前掲）を計算した。最後に、電気的サイズ（μｍ）対正規化不透明度の２Ｄ散乱プロットをプロットして、細胞集団のインピーダンスプロファイルを示した。データ処理は、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（ＭａｔｈＷｏｒｋｓ）で書かれたカスタムメイドのプログラムを用いて行った。
【0083】
試料調製
健康なドナーの血液試料を、インフォームドコンセント後、実験のために、静脈穿刺によってクエン酸ナトリウムバキュテナー（登録商標）（ＢＤ）に収集した。初代好中球を単離するために、全血試料をＰｏｌｙｍｏｒｐｈＰｒｅｐ（商標）上に１：１の比で重層した。製造業者のプロトコールに従って密度遠心分離した後、好中球を収集し、０．５×ＰＢＳで洗浄した。その後、さらにＲＢＣを除去するためにＲＢＣ溶解を行った。ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を好中球ペレット（１ｍＬ）に３分間添加し、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡでクエンチした。好中球を洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに再懸濁した。
健康なドナーの血液試料を、インフォームドコンセント後、実験のために、静脈穿刺によってクエン酸ナトリウムバキュテナー（登録商標）（ＢＤ）に収集した。初代好中球を単離するために、全血試料をＰｏｌｙｍｏｒｐｈＰｒｅｐ（商標）上に１：１の比で重層した。製造業者のプロトコールに従って密度遠心分離した後、好中球を収集し、０．５×ＰＢＳで洗浄した。その後、さらにＲＢＣを除去するためにＲＢＣ溶解を行った。ＲＢＣ溶解緩衝液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を好中球ペレット（１ｍＬ）に３分間添加し、ＰＢＳ中０．５％ＢＳＡでクエンチした。好中球を洗浄し、ＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに再懸濁した。
【0084】
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を抽出するために、全血を、製造業者のプロトコールに従ってＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）密度遠心分離に供した。精製リンパ球を必要とする実験のために、ヒトＣＤ４ Ｔ細胞ネガティブ分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ）を使用して、培養の前または後に他の残留する免疫細胞集団を除去した。
【0085】
異なる実験およびデバイスにわたる比較のために、１０μｍポリスチレンビーズ（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を試料（１０４～１０５ビーズ／ｍＬ）にスパイクして、それらが一貫した誘電特性を有するので、参照として使用した。
【0086】
ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）を用いたリンパ球活性化
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）をリンパ球活性化に使用した。簡潔に述べると、リンパ球を、３０Ｕ／ｍＬのｒＩＬ－２と共に１：１の細胞対ビーズ比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを有するウェルプレート上で培養し、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持した。２４時間後、細胞を収集し、磁石を使用して活性化因子を除去した。その後、細胞を所望の濃度でＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに再懸濁した。未処理の対照試料については、リンパ球を活性化剤およびｒＩＬ－２なしで培養した。
Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）をリンパ球活性化に使用した。簡潔に述べると、リンパ球を、３０Ｕ／ｍＬのｒＩＬ－２と共に１：１の細胞対ビーズ比で抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズを有するウェルプレート上で培養し、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で維持した。２４時間後、細胞を収集し、磁石を使用して活性化因子を除去した。その後、細胞を所望の濃度でＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡに再懸濁した。未処理の対照試料については、リンパ球を活性化剤およびｒＩＬ－２なしで培養した。
【0087】
ＰＨＡおよびＰＰＤ刺激
単離されたＰＢＭＣをまず２４ウェルプレート上に２×１０６細胞／ｍｌの濃度で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中、３７℃で２４時間インキュベートした。活性化実験のために、ＰＨＡ（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）またはＰＰＤ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク）を培地に添加してリンパ球を活性化した。所望の時点の後、細胞を回収し、推奨されるＭＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ４リンパ球ＭＡＣｓネガティブ分離を使用して、他の免疫細胞集団を除去した。その後、インピーダンス測定のために、細胞を約５～５０×１０４細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。
単離されたＰＢＭＣをまず２４ウェルプレート上に２×１０６細胞／ｍｌの濃度で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ１６４０培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ）中、３７℃で２４時間インキュベートした。活性化実験のために、ＰＨＡ（最終濃度２．５μｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）またはＰＰＤ（最終濃度１０μｇ／ｍｌ、Ｓｔａｔｅｎｓ Ｓｅｒｕｍ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、デンマーク）を培地に添加してリンパ球を活性化した。所望の時点の後、細胞を回収し、推奨されるＭＡＣｓ緩衝液に再懸濁した。ＣＤ４リンパ球ＭＡＣｓネガティブ分離を使用して、他の免疫細胞集団を除去した。その後、インピーダンス測定のために、細胞を約５～５０×１０４細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳ中の０．１％ＢＳＡ中に再懸濁した。
【0088】
好中球活性化
好中球の生物物理学的特性に対する異なるｐＨの効果を研究するために、異なるｐＨを有するＲＰＭＩに再懸濁した好中球を、４℃で２時間インキュベートした。細菌研究のために、好中球を、オービタルシェーカー内で２４時間、ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）を含まないＲＰＭＩ中で異なる細菌濃度でインキュベートした。
好中球の生物物理学的特性に対する異なるｐＨの効果を研究するために、異なるｐＨを有するＲＰＭＩに再懸濁した好中球を、４℃で２時間インキュベートした。細菌研究のために、好中球を、オービタルシェーカー内で２４時間、ペニシリン－ストレプトマイシン（ＰＳ）を含まないＲＰＭＩ中で異なる細菌濃度でインキュベートした。
【0089】
フローサイトメトリー分析
リンパ球活性化状態を評価するために、異なる細胞画分を、氷上で１５分間、ＣＤ３－ＢＵＶ７３７、ＣＤ４－ＢＶ６５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）、ＣＤ１３７－ＰＥ、およびＣＤ６９－ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）抗体で染色した。細胞を１回洗浄して未結合の抗体を除去し、次いでＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。細胞選別は、ＢＤ ＦＡＣＳＦｕｓｉｏｎセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。ＦｌｏｗＪｏ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメトリーデータを分析および定量化した。
リンパ球活性化状態を評価するために、異なる細胞画分を、氷上で１５分間、ＣＤ３－ＢＵＶ７３７、ＣＤ４－ＢＶ６５０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ）、ＣＤ１３７－ＰＥ、およびＣＤ６９－ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，ＵＳＡ）抗体で染色した。細胞を１回洗浄して未結合の抗体を除去し、次いでＢＤ ＬＳＲ Ｆｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０フローサイトメータ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で分析した。細胞選別は、ＢＤ ＦＡＣＳＦｕｓｉｏｎセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行った。ＦｌｏｗＪｏ（商標）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、フローサイトメトリーデータを分析および定量化した。
【0090】
統計解析
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）Ｖ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を用いて行った。
全ての統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（商標）Ｖ８．０（ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア）を用いて行った。
【0091】
研究承認
募集中に全ての対象について書面によるインフォームドコンセントを得た。全てのプロトコールは、Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｃｔ（シンガポール保健省）に従って、ナンヤン工科大学（Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（ＩＲＢ－２０１４－０４／２７およびＩＲＢ－２０１８－１０－０１５－０２）、タントックセン病院（Ｔａｎ Ｔｏｃｋ Ｓｅｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（２０１４／００４１６）の施設内倫理委員会によって承認された。実験のために、健康なドナーの４ｍＬクエン酸ナトリウムまたはリチウムヘパリンチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標））へ静脈穿刺からの血液試料を採取した。
募集中に全ての対象について書面によるインフォームドコンセントを得た。全てのプロトコールは、Ｈｕｍａｎ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ａｃｔ（シンガポール保健省）に従って、ナンヤン工科大学（Ｎａｎｙａｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）（ＩＲＢ－２０１４－０４／２７およびＩＲＢ－２０１８－１０－０１５－０２）、タントックセン病院（Ｔａｎ Ｔｏｃｋ Ｓｅｎｇ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）（２０１４／００４１６）の施設内倫理委員会によって承認された。実験のために、健康なドナーの４ｍＬクエン酸ナトリウムまたはリチウムヘパリンチューブ（ＢＤ Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標））へ静脈穿刺からの血液試料を採取した。
【0092】
インピーダンスモデリング
インピーダンスシグナルにおける膜伝導率の効果を理解するために、マクスウェルの混合理論（ＭＭＴ）（サン（Ｓｕｎ）ら、ＩＥＴ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１，６９－７９；非特許文献５（サンおよびモルガン（Ｓｕｎ＆Ｍｏｒｇａｎ），Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２０１０，８，４２３－４４３））に基づく二重シェルモデルを使用して、異なる膜伝導率を有する単一細胞をモデル化した。このモデルでは、球状細胞は、励起電極と感知電極との間のチャネル中心に懸架される。混合物のインピーダンスは以下の式で与えられる。
インピーダンスシグナルにおける膜伝導率の効果を理解するために、マクスウェルの混合理論（ＭＭＴ）（サン（Ｓｕｎ）ら、ＩＥＴ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，１，６９－７９；非特許文献５（サンおよびモルガン（Ｓｕｎ＆Ｍｏｒｇａｎ），Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，２０１０，８，４２３－４４３））に基づく二重シェルモデルを使用して、異なる膜伝導率を有する単一細胞をモデル化した。このモデルでは、球状細胞は、励起電極と感知電極との間のチャネル中心に懸架される。混合物のインピーダンスは以下の式で与えられる。
【0093】
【数1】
【0094】
式中：
【0095】
【数2】
【0096】
は、誘電率（ε）および導電率（σ）が与えられた場合の複素誘電率（ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｅｒｍｉｔｔｉｖｉｔｙ）を表し、ｊ２＝－１、ωは角周波数であり、φは、検出チャネル内の細胞の体積と培地の体積との比である体積分率である。下付き文字「ｍｉｘ」は混合物を表す。ｌはチャネルの幅である。Ｇは不均一なフリンジ電界１を説明するためのセル定数である。混合物の複素誘電率の計算は、以下の式に基づいている：
【0097】
【数3】
【0098】
ここで、φは体積分率であり、検出チャネル内の培地の体積に対する細胞の体積の比である。下付き文字「ｍｉｘ」、「ｃｅｌｌ」および「ｍｅｄ」は、それぞれ混合物、細胞および培地を示す。細胞構造を説明するために、細胞の複素誘電率は、以下のように、内部成分（膜、細胞質含有物および核）の関数として計算することができる：
【0099】
【数4】
【0100】
式中：
【0101】
【数5】
【0102】
は、２つの隣接する成分（例えば、膜および細胞質）の有効複素誘電率であり、θは外側成分の体積に対する内側成分の体積の比である体積分率である。下付き文字「ｉｎ」および「ｏｕｔ」は、それぞれ内側成分および外側成分を表す。このモデルにおいて、本発明者らは、まず、核エンベロープおよび核細胞質の複素誘電率を使用して核の有効複素誘電率を計算し、続いて、細胞質および核の複素誘電率を使用して細胞質含有物の有効複素誘電率を計算する。最後に、細胞の複素誘電率は、細胞質含有物および膜の複素誘電率を使用して計算することができる。
【0103】
マイクロ流体デバイス設計では、差動測定のための３電極設計を用いて、コモンモードノイズ（ｃｏｍｍｏｎ－ｍｏｄｅ ｎｏｉｓｅ）および信号ドリフトを最小限に抑えた。差動電流応答
【0104】
【数6】
【0105】
は、細胞が第１および第２の電極
【0106】
【数7】
【0107】
との間にあるときの電流読み出しをシミュレートするように計算され、そして、第２および第３電極
【0108】
【数8】
【0109】
との間には媒体（ｍｅｄｉｕｍ）のみが存在する。
電気的不透明度は、低周波数（０．３ＭＨｚ）に対する高周波数での電流応答の比として定義される。
電気的不透明度は、低周波数（０．３ＭＨｚ）に対する高周波数での電流応答の比として定義される。
【0110】
【表1】
【0111】
計算流体力学
計算流体力学シミュレーションは、Ａｎｓｙｓ ＦＬＵＥＮＴ（登録商標）（Ａｎｓｙｓ、米国ペンシルベニア州キャノンズバーグ（Ｃａｎｏｓｂｕｒｇ））を使用して行った。入口分岐部から半ループ後にチャネル長が切り取られた部分スパイラルチャネルをシミュレートした。水力直径（１８０．３２μｍ）の７６倍と同等のチャネル長を有する切り取られた領域後の下流流は、入口分岐部における流線（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）プロファイルに対して無視できる影響を有すると仮定する。圧力ベースのソルバーを使用して、ＰＢＳのシース液を模倣するための媒体として水を使用して定常状態層流をシミュレートした。境界条件は、チャネル壁でのスリップなし状態、両方の入口での速度入口、および出口での０ゲージ圧出口を有する静止壁に設定した。高さ方向に沿って３．５μｍ、幅方向に沿って８．５μｍおよび長さ方向に沿って３１０μｍの要素寸法を有する完全な六面体メッシュを、ＩＣＥＭ（Ａｎｓｙｓ．、米国ペンシルベニア州キャノンズバーグ（Ｃａｎｏｓｂｕｒｇ））を使用して生成した。格子細分化（Ｍｅｓｈ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）は、メッシュ全体を１．５倍に細分化して行い、その結果、ノードの数は、１５２６８０ノードから４３２８３２ノードに増加した。スパイラルチャネルの異なる断面領域におけるチャネル高さに沿った速度プロファイルを、元のメッシュと細分化したメッシュとの間で比較した。メッシュ間のピーク速度の差は８％未満に制御され、１５２６８０個のノードを有するメッシュのシミュレーション結果を、本研究における分析のために選択した。流線は、離散相モデル（ＤＰＭ）を使用して試料入口で開始され、粒子と連続相との間の相互作用は、流体流線の動態を模倣するために無効にした。流線の座標は後にエクスポートし、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，ＵＳＡ）で処理した。
計算流体力学シミュレーションは、Ａｎｓｙｓ ＦＬＵＥＮＴ（登録商標）（Ａｎｓｙｓ、米国ペンシルベニア州キャノンズバーグ（Ｃａｎｏｓｂｕｒｇ））を使用して行った。入口分岐部から半ループ後にチャネル長が切り取られた部分スパイラルチャネルをシミュレートした。水力直径（１８０．３２μｍ）の７６倍と同等のチャネル長を有する切り取られた領域後の下流流は、入口分岐部における流線（ｓｔｒｅａｍｌｉｎｅ）プロファイルに対して無視できる影響を有すると仮定する。圧力ベースのソルバーを使用して、ＰＢＳのシース液を模倣するための媒体として水を使用して定常状態層流をシミュレートした。境界条件は、チャネル壁でのスリップなし状態、両方の入口での速度入口、および出口での０ゲージ圧出口を有する静止壁に設定した。高さ方向に沿って３．５μｍ、幅方向に沿って８．５μｍおよび長さ方向に沿って３１０μｍの要素寸法を有する完全な六面体メッシュを、ＩＣＥＭ（Ａｎｓｙｓ．、米国ペンシルベニア州キャノンズバーグ（Ｃａｎｏｓｂｕｒｇ））を使用して生成した。格子細分化（Ｍｅｓｈ ｒｅｆｉｎｅｍｅｎｔ）は、メッシュ全体を１．５倍に細分化して行い、その結果、ノードの数は、１５２６８０ノードから４３２８３２ノードに増加した。スパイラルチャネルの異なる断面領域におけるチャネル高さに沿った速度プロファイルを、元のメッシュと細分化したメッシュとの間で比較した。メッシュ間のピーク速度の差は８％未満に制御され、１５２６８０個のノードを有するメッシュのシミュレーション結果を、本研究における分析のために選択した。流線は、離散相モデル（ＤＰＭ）を使用して試料入口で開始され、粒子と連続相との間の相互作用は、流体流線の動態を模倣するために無効にした。流線の座標は後にエクスポートし、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ，ＵＳＡ）で処理した。
【0112】
結果および考察
実施例１：段差付き入口の特徴
最適な試料ピンチ効果（ｐｉｎｃｈｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）を決定するために、まず、計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションを使用して、様々な試料対シース流量比を特徴付けた（図２および図３）。流速比１：１０（１６０μＬ／分：１６００μＬ／分）では、細胞／粒子流を示す試料流線（黒色）は、チャネルの上半分および下半分の両方に等しく広がっている。流量比が増加すると（１：２１）、粒子流線は、チャネルの下半分に流体力学的に閉じ込められた。１０μｍビーズ（好中球と同様のサイズ）のインピーダンス特徴付けに基づくシミュレーション結果をさらに検証した（図３）。１：１０および１：１４の流量比では、粒子（最初は閉じ込められていない）がスパイラルチャネル内の２つの異なる平衡位置（チャネルの上半分および下半分）に慣性的に集束されたので、インピーダンスプロファイル内に２つの別個のクラスタが観察された。これに対して、より高い流量比条件（１：２１および１：４３）では、単一のクラスタが存在し、これは、チャネルの下半分で粒子集束が成功したことを示した。これらの結果は、粒子もまた電極の近くに整列したままであったことから、インピーダンス検出を向上させるためには、単一ストリーム粒子集束が極めて重要であることを浮き彫りにした。これらの結果に基づいて、１：２１（８０μＬ／分：１６８０μＬ／分）の流量比を引き続く実験で使用した。
実施例１：段差付き入口の特徴
最適な試料ピンチ効果（ｐｉｎｃｈｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔｓ）を決定するために、まず、計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションを使用して、様々な試料対シース流量比を特徴付けた（図２および図３）。流速比１：１０（１６０μＬ／分：１６００μＬ／分）では、細胞／粒子流を示す試料流線（黒色）は、チャネルの上半分および下半分の両方に等しく広がっている。流量比が増加すると（１：２１）、粒子流線は、チャネルの下半分に流体力学的に閉じ込められた。１０μｍビーズ（好中球と同様のサイズ）のインピーダンス特徴付けに基づくシミュレーション結果をさらに検証した（図３）。１：１０および１：１４の流量比では、粒子（最初は閉じ込められていない）がスパイラルチャネル内の２つの異なる平衡位置（チャネルの上半分および下半分）に慣性的に集束されたので、インピーダンスプロファイル内に２つの別個のクラスタが観察された。これに対して、より高い流量比条件（１：２１および１：４３）では、単一のクラスタが存在し、これは、チャネルの下半分で粒子集束が成功したことを示した。これらの結果は、粒子もまた電極の近くに整列したままであったことから、インピーダンス検出を向上させるためには、単一ストリーム粒子集束が極めて重要であることを浮き彫りにした。これらの結果に基づいて、１：２１（８０μＬ／分：１６８０μＬ／分）の流量比を引き続く実験で使用した。
【0113】
段差付き試料入口設計は、二重層フォトリソグラフィへの製作プロセスを簡略化するために、高さ２０μｍ（検出チャネルと同じ）である。さらなるＣＦＤシミュレーションを実行して、段差付き試料入口パラメータ（幅および高さ）が３Ｄ集束にどのように影響するかを理解した（図４～図６）。
【0114】
段差付き入口高さを２０から６０μｍに変化させることによって（図４）、２０μｍおよび４０μｍの高さの両方は、１：２１の流量比で試料流線をチャネルの下半分に閉じ込めること（＞９０％）に匹敵した。より低い段差付き入口高さ（＜２０μｍ）は、細胞処理に適しておらず、目詰まりしやすいので、本研究に含めなかった。開口幅に関して、小さい開口幅（５０μｍ）は、高速流の形成（図５）および試料流体とシース流体との極端な混合をもたらした。これは、より大きい開口幅（＞１００μｍ）と比較して、より分散された試料流線（１：２１について約５０％）をもたらした。
【0115】
実施例２：好中球活性化プロファイリングのための統合型細胞選別およびインピーダンスサイトメトリー
３つの周波数測定スキーム（０．３ＭＨｚ、１．７２ＭＨｚおよび１２ＭＨｚ、各周波数について１Ｖ）を使用して、各細胞の３つの電気的特性を捕捉した：１）細胞のサイズを示す０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさ。２）細胞膜キャパシタンスを反映する０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさに対する１．７２ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさの比として定義される膜不透明度、および３）核特性を反映する０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさに対する１２ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさの比として定義される核不透明度。不透明度スペクトルに対する様々な核パラメータ（核膜、核サイズ）の影響を研究するために、数値インピーダンスシミュレーションを行った（図８）。不透明度（Ｏｐａｃｉｔｙ）は、異なる周波数におけるインピーダンス応答と０．３ＭＨｚにおけるインピーダンス応答との間の比として定義される。アポトーシスまたは壊死などの特定の生物学的事象は、核膜の分解をもたらし得るので（リンデンボーム（Ｌｉｎｄｅｎｂｏｉｍ）ら、２０２０年、６巻、２９頁；クウォン（Ｋｗｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５年、５巻、１５６２３頁）、核エンベロープの様々な伝導率の影響を調べ、伝導率が増加するにつれて不透明度が増加することを観察した（８）。ＮＥＴｏｓｉｓを受けている好中球については、それらは、核膨化などの特徴的な核変化を示す（リ（Ｌｉ）ら、ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，２１，ｅ４８７７９）。電気的測定が核サイズに関連する変化を捕捉することができるかどうかを理解するために、核サイズを変更して、核サイズが増加するにつれて不透明度が減少することを明らかにした（８）。これらのシミュレーションに基づいて、核の電気的特性の変化を表すために、１２ＭＨｚでのインピーダンス測定を行った。粒子分布を説明するために、密度散乱プロットを用いて細胞集団の電気的パラメータを表した。臨床試験のための概念実証として（図９）、このプラットフォームをさまざまな好中球の表現型（１．対照、２．死滅（７５℃で培養）、３．ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート）によるＮＥＴｏｓｉｓ、４．高ｐＨ培地（ｐＨ９）での自発的ＮＥＴｏｓｉｓ）の特性評価に利用した。死滅好中球と対照好中球との間の比較（図１０）は、死滅細胞が、おそらく細胞死の特徴である損なわれた／漏出性の膜から生じる高い膜伝導率（図７）に起因して、小さい電気的サイズおよび高い膜不透明度を示すことを明らかにしている。
３つの周波数測定スキーム（０．３ＭＨｚ、１．７２ＭＨｚおよび１２ＭＨｚ、各周波数について１Ｖ）を使用して、各細胞の３つの電気的特性を捕捉した：１）細胞のサイズを示す０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさ。２）細胞膜キャパシタンスを反映する０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさに対する１．７２ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさの比として定義される膜不透明度、および３）核特性を反映する０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさに対する１２ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさの比として定義される核不透明度。不透明度スペクトルに対する様々な核パラメータ（核膜、核サイズ）の影響を研究するために、数値インピーダンスシミュレーションを行った（図８）。不透明度（Ｏｐａｃｉｔｙ）は、異なる周波数におけるインピーダンス応答と０．３ＭＨｚにおけるインピーダンス応答との間の比として定義される。アポトーシスまたは壊死などの特定の生物学的事象は、核膜の分解をもたらし得るので（リンデンボーム（Ｌｉｎｄｅｎｂｏｉｍ）ら、２０２０年、６巻、２９頁；クウォン（Ｋｗｏｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１５年、５巻、１５６２３頁）、核エンベロープの様々な伝導率の影響を調べ、伝導率が増加するにつれて不透明度が増加することを観察した（８）。ＮＥＴｏｓｉｓを受けている好中球については、それらは、核膨化などの特徴的な核変化を示す（リ（Ｌｉ）ら、ＥＭＢＯ ｒｅｐｏｒｔｓ，２０２０，２１，ｅ４８７７９）。電気的測定が核サイズに関連する変化を捕捉することができるかどうかを理解するために、核サイズを変更して、核サイズが増加するにつれて不透明度が減少することを明らかにした（８）。これらのシミュレーションに基づいて、核の電気的特性の変化を表すために、１２ＭＨｚでのインピーダンス測定を行った。粒子分布を説明するために、密度散乱プロットを用いて細胞集団の電気的パラメータを表した。臨床試験のための概念実証として（図９）、このプラットフォームをさまざまな好中球の表現型（１．対照、２．死滅（７５℃で培養）、３．ＰＭＡ（ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート）によるＮＥＴｏｓｉｓ、４．高ｐＨ培地（ｐＨ９）での自発的ＮＥＴｏｓｉｓ）の特性評価に利用した。死滅好中球と対照好中球との間の比較（図１０）は、死滅細胞が、おそらく細胞死の特徴である損なわれた／漏出性の膜から生じる高い膜伝導率（図７）に起因して、小さい電気的サイズおよび高い膜不透明度を示すことを明らかにしている。
【0116】
次に、プラットフォームを利用して、新たに発見された好中球機能であるＮＥＴｏｓｉｓを受けている好中球を研究し、ここで、好中球は、感染を解決するために抗菌物質と共にそれらの核を放出する。ＰＭＡを２時間処理することによって、ＮＥＴｏｓｉｓを受けている好中球は、電気的サイズが大きくなり、膜不透明度（細胞膜面積の増加による）および核不透明度（核形態の変化（イップ（Ｙｉｐｐ）およびクベシュ（Ｋｕｂｅｓ）、Ｂｌｏｏｄ、１２２、２７８４－２７９４，ｄｏｉ：１０．１１８２／ｂｌｏｏｄ－２０１３－０４－４５７６７１（２０１３））が低下した。ＰＭＡは強力なＮＥＴｏｓｉｓ誘導物質であるため（タッシー（Ｔａｔｓｉｙ）およびマクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、９、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｉｍｍｕ．２０１８．０２０３６（２０１８））、本発明者らは次に、本発明者らの統合型プラットフォームを使用して、ｐＨ変化によって誘導されるＮＥＴｏｓｉｓの存在を検出することができるかどうかを決定した。本発明者らは、好中球を高アルカリ溶液（ｐＨ９）中に懸濁して、自発的なＮＥＴｏｓｉｓを促進した（カーン（Ｋｈａｎ）ら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、５、ｄｏｉ：１０．３３８９／ｆｍｅｄ．２０１８．０００１９（２０１８））。
【0117】
その結果、ｐＨ９の試料の電気特性の変化は、ＰＭＡ刺激よりも小さく、細胞サイズが大きく、膜の不透明度がわずかに低い（約０．８）テール領域の存在が明らかであった。興味深いことに、核不透明度に関して、対照試料に近いインピーダンス特性を示した主な集団および（ＰＭＡ処置と同様の）自発的なＮＥＴｏｓｉｓの存在を示す長いテール領域（０．４～０．７の範囲）が観察された。次に、図１１に示されるような健常な集団およびＮＥＴｏｓｉｓ集団の定量化が行われ、核不透明度（ｎｕｃｌｅｕｓ ｏｐａｃｉｔｙ）が、膜不透明度（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｏｐａｃｉｔｙ）と比較して、ＮＥＴｏｓｉｓ集団のより良好な分離を提供することが見出された。
【0118】
最後に、細菌感染に応答した好中球の電気的シグネチャを調べた。ＲＰＭＩ中の単離された好中球を、異なる濃度（１０×、１０３×および１０６×希釈）の大腸菌（ＥＣ）と共に３７℃で２４時間培養した。図１２は、低ＥＣ濃度（ＥＣ－１Ｍ×）が、増加した細胞サイズ、減少した膜不透明度および核不透明度において明らかなように、インピーダンスプロファイルの観察可能な変化を誘導したことを示す。より高いＥＣ濃度において、膜不透明度プロファイルは、２つの別個の集団；１）高い不透明度（約０．９～１）を有する死細胞集団、および２）高密度活性化好中球集団（０．７５～０．８５の範囲の膜不透明度）を明らかにした。核不透明度に関して、インピーダンスプロファイルは、ＰＭＡ処置において観察されるものと同様のより低い不透明度（約０．４）を有する主たる高密度集団を示す。ＮＥＴｏｓｉｓ研究とは異なり、好中球は細菌を根絶するための異なる応答（食作用、脱顆粒またはＮＥＴｏｓｉｓ）を示すことができるので、好中球インピーダンス表現型を生物学的機能に関連付けることは依然として不明である。全体として、これらの結果は、様々な好中球応答（生死、ＮＥＴｏｓｉｓおよび細菌応答）を研究するための多周波インピーダンスサイトメトリー、特に高周波インピーダンスシグネチャの使用を実証している。これら全ての能力により、本明細書に記載されるプラットフォームは、癌、尿路感染症（ＵＴＩ）ならびに敗血症などの様々な疾患における好中球応答に基づく臨床診断のために容易に変換され得ることが想定される。
【0119】
実施例３：リンパ球活性化プロファイリングのための統合型細胞選別およびインピーダンスサイトメトリー
細胞は、交流（ＡＣ）でエネルギー印加された共面電極を横切って流れるとき、電界を破壊し、電気インピーダンスの変化をもたらす。低周波（０．１～１ＭＨｚ）でのインピーダンス測定は、粒子（ビーズ／細胞）を通る最小の電場浸透に起因して粒子サイズに相関するが、高周波領域（１～１０ＭＨｚ）でのインピーダンス測定は、膜分極の効果に起因して膜特性を反映する（サンおよびモルガン（Ｓｕｎ＆Ｍｏｒｇａｎ）、前掲；ホンラド（Ｈｏｎｒａｄｏ）ら、前掲）。本願明細書において、二重周波数測定スキーム（０．３ＭＨｚおよび１．７２ＭＨｚ）を用いて、各細胞の２つの電気的特性を捕捉した：１．細胞膜キャパシタンスを反映する０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさに対する１．７２ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさの比として定義される不透明度、および２．細胞サイズを示す０．３ＭＨｚにおけるインピーダンス信号の大きさ。高導電性媒体（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ、約１．６Ｓ／ｍ）（ホンラド（Ｈｏｎｒａｄｏ）ら、前掲）中での電気化学反応による損傷を防ぐために、各周波数の励起電圧を１Ｖに設定した。粒子分布を説明するために、密度散乱プロットを用いて細胞集団の両方の電気的パラメータを表す。
細胞は、交流（ＡＣ）でエネルギー印加された共面電極を横切って流れるとき、電界を破壊し、電気インピーダンスの変化をもたらす。低周波（０．１～１ＭＨｚ）でのインピーダンス測定は、粒子（ビーズ／細胞）を通る最小の電場浸透に起因して粒子サイズに相関するが、高周波領域（１～１０ＭＨｚ）でのインピーダンス測定は、膜分極の効果に起因して膜特性を反映する（サンおよびモルガン（Ｓｕｎ＆Ｍｏｒｇａｎ）、前掲；ホンラド（Ｈｏｎｒａｄｏ）ら、前掲）。本願明細書において、二重周波数測定スキーム（０．３ＭＨｚおよび１．７２ＭＨｚ）を用いて、各細胞の２つの電気的特性を捕捉した：１．細胞膜キャパシタンスを反映する０．３ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさに対する１．７２ＭＨｚでのインピーダンス信号の大きさの比として定義される不透明度、および２．細胞サイズを示す０．３ＭＨｚにおけるインピーダンス信号の大きさ。高導電性媒体（ＰＢＳ中０．１％ＢＳＡ、約１．６Ｓ／ｍ）（ホンラド（Ｈｏｎｒａｄｏ）ら、前掲）中での電気化学反応による損傷を防ぐために、各周波数の励起電圧を１Ｖに設定した。粒子分布を説明するために、密度散乱プロットを用いて細胞集団の両方の電気的パラメータを表す。
【0120】
異なる精製リンパ球集団の第１のインピーダンスプロファイリングを行った；１．健常リンパ球（対照）、２．死滅リンパ球（１０％ジメチルスルホキシド（死滅）、２４時間）、および３．活性化リンパ球（抗ＣＤ３／ＣＤ２８Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（活性化）、２４時間）。死滅リンパ球の不透明度は、おそらくリンパ球アポトーシスに起因して（デアブレウコスタ（ｄｅ ＡｂｒｅｕＣｏｓｔａ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、２０１７、２２、１７８９）健常なリンパ球よりも高く、これは膜統合性の喪失（チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、２０１８、２８，９－２１）および膜コンダクタンスの増加（ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ ａｃｔａ、２００２、１５６４、４１２－４２０）をもたらした。これらの観察は、二重シェルインピーダンスモデルを使用して確認され、シミュレーション結果は、膜コンダクタンスの増加が、低周波（｜ＺＬＦ｜）におけるインピーダンス信号を低下させ、不透明度（｜ＺＨＦ｜／｜ＺＬＦ｜）を高めることを示した（図７）。活性化リンパ球については、リンパ球が活性化を受けるにつれて増加した膜表面積に起因し得る、より低い不透明度を伴う細胞サイズの増加が観察された（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ ｅｔ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ Ａｃｔａ（ＢＢＡ）－Ｂｉｏｍｅｍｂｒａｎｅｓ、１９９９、１４１７、５１－６２；テーグ（Ｔｅａｇｕｅ）ら、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ、１９９３、１４、７７２－７８２）。これらのインピーダンス測定はまた、活性化リンパ球について細胞サイズの有意な増加を示した光学画像と一致した。
【0121】
次に、定量的リンパ球活性化プロファイリングのための統合型慣性インピーダンスサイトメトリーの使用を検討した（図１３）。簡単に述べると、前記プラットフォームは３つのステージ、すなわち（１）スパイラル細胞選別器、（２）慣性細胞集束器、および（３）共面電極を使用するインピーダンス検出器からなる。プラットフォームは以前に好中球（約８～１０μｍ）研究に適用されたので（ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１９）、前掲）、デバイスは活性化リンパ球（＞８μｍ）を濃縮し、電気的に特徴付けることができると仮定した。インピーダンス検出感度および一貫性をさらに改善するために、段差付き試料入口を追加して、シース流体を使用して試料流をチャネルの下半分に流体力学的に閉じ込めた。スパイラルマイクロチャネル内の慣性結合ディーンフロー移動の影響下で、より大きな細胞（流体力学的直径（Ｄｈ）に対する粒径（Ａｐ）＞０．０７）は、活性化されたリンパ球選別およびインピーダンス検出のために（電極表面により近い）チャネル底部付近で平衡化する。最適な試料ピンチ効果を決定するために、まず、計算流体力学（ＣＦＤ）シミュレーションを使用して、様々な試料対シース流量比を特徴付けた（図２）。１：１０の流速比（１６０μＬ／分：１６００μＬ／分）では、細胞／粒子流を示す試料流線（黒色）は、チャネルの上半分および下半分の両方に等しく広がる。流量比が増加すると（１：２１）、粒子流線は、チャネルの下半分に流体力学的に閉じ込められた。１０μｍビーズ（活性化リンパ球と同様のサイズ）のインピーダンス特徴付けに基づくシミュレーション結果をさらに検証した（図３）。１：１０および１：１４の流量比では、粒子（最初は閉じ込められていない）がスパイラルチャネル内の２つの異なる平衡位置（チャネルの上半分および下半分）に慣性的に集束されたので、インピーダンスプロファイル内に２つの別個のクラスタが観察された（ホウ（Ｈｏｕ）ら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ、２０１６、６、２９４１０）。これに対し、より高い流量比条件（１：２１および１：４３）では、単一のクラスタが存在しており、これは、チャネルの下半分で粒子集束が成功したことを示す。これらの結果は、粒子もまた電極の近くに整列したままであったことから、インピーダンス検出を向上させるためには、単一ストリーム粒子集束が極めて重要であることを浮き彫りにした。これらの結果に基づいて、１：２１（８０μＬ／分：１６８０μＬ／分）の流量比を引き続く実験で使用した。
【0122】
デバイスパフォーマンスに関して、プラットフォームは、約１×１０３粒子／秒のインピーダンス測定スループットを達成することができる（ペチャクプ（Ｐｅｔｃｈａｋｕｐ）ら（２０１９）、前掲）。このプラットフォームにおいて利用される受動的慣性ベースの集束はまた、高流動条件（レイノルズ数、Ｒｅ＞５０）において確立され、これは、高粒子濃度（最大１０×１０６粒子／ｍＬ）の処理を可能にする。まとめると、このチップは、無標識で迅速な免疫細胞プロファイリングのための複雑な生物学的試料（例えば血液）の処理を容易にする。
【0123】
実施例４：統合型プラットフォームを用いた活性化Ｔリンパ球の定量的プロファイリング
次に、統合型慣性インピーダンスサイトメトリープラットフォームを、異なるＴリンパ球（ＣＤ４＋）表現型（対照、死滅および活性化）の電気的プロファイリングに適用した。スパイラルチャネル設計（約１１０μｍの高さ）に基づいて、活性化リンパ球（＞８μｍ、Ａｐ／Ｄｈ＞０．０７）のみが、支配的な慣性力を経験し、内壁付近で平衡化する。次いで、これらの細胞は、中間出口に選別され、インピーダンス検出器に向かって送られる。より小さい活性化されていないリンパ球は、内壁領域からさらに離れて位置し、スパイラル選別器中の廃棄物として底部出口に除去される。図１４Ａは、対照および活性化リンパ球および死滅リンパ球集団に対するスパイラル細胞選別器および前インピーダンス検出器の三分岐点に焦点を合わせた細胞の重ねられたタイムラプス画像（ｓｔａｃｋｅｄ ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｅｓ）を示す。予想通り、対照リンパ球および死滅リンパ球の両方についてインピーダンス検出器に選別された細胞はほとんどなかった。対照的に、より大きな活性化リンパ球は、それらが内壁に近づくにつれて流動位置の明確なシフトを示し、これは、インピーダンスサイトメータによって選別および検出される細胞の有意な増加をもたらした。これは、健常対照と比較して、より高いインピーダンスシグナル読み出し（より高い活性化細胞カウント数、約１５倍高い）と解釈される（図１４Ｂ）。
次に、統合型慣性インピーダンスサイトメトリープラットフォームを、異なるＴリンパ球（ＣＤ４＋）表現型（対照、死滅および活性化）の電気的プロファイリングに適用した。スパイラルチャネル設計（約１１０μｍの高さ）に基づいて、活性化リンパ球（＞８μｍ、Ａｐ／Ｄｈ＞０．０７）のみが、支配的な慣性力を経験し、内壁付近で平衡化する。次いで、これらの細胞は、中間出口に選別され、インピーダンス検出器に向かって送られる。より小さい活性化されていないリンパ球は、内壁領域からさらに離れて位置し、スパイラル選別器中の廃棄物として底部出口に除去される。図１４Ａは、対照および活性化リンパ球および死滅リンパ球集団に対するスパイラル細胞選別器および前インピーダンス検出器の三分岐点に焦点を合わせた細胞の重ねられたタイムラプス画像（ｓｔａｃｋｅｄ ｔｉｍｅ－ｌａｐｓｅ ｉｍａｇｅｓ）を示す。予想通り、対照リンパ球および死滅リンパ球の両方についてインピーダンス検出器に選別された細胞はほとんどなかった。対照的に、より大きな活性化リンパ球は、それらが内壁に近づくにつれて流動位置の明確なシフトを示し、これは、インピーダンスサイトメータによって選別および検出される細胞の有意な増加をもたらした。これは、健常対照と比較して、より高いインピーダンスシグナル読み出し（より高い活性化細胞カウント数、約１５倍高い）と解釈される（図１４Ｂ）。
【0124】
さらに、活性化ＣＤ４Ｔリンパ球試料（抗ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズによる）を使用して、選別前（試料入口）、選別された細胞（インピーダンス検出器の出口から）、および廃棄細胞（スパイラル選別器の廃棄出口から）を含む様々な細胞画分に対するフローサイトメトリー分析を行った。サイズに基づく選別原理に起因して、前方側方散乱（ＦＳＣ）の増加が、選別された画分中の細胞について観察され、これにより、インピーダンスによって検出されるより大きな細胞の存在が確認された（図１５）。選別感度およびインピーダンス検出限界を決定するために、様々なレベル（０．３％～７４．６％）のスパイクされた活性化（ＣＤ１３７＋）リンパ球を有する試料（１０５細胞／ｍＬの濃度）を処理した（図１６）。多数の活性化リンパ球（＞５％）を含有する試料については、約６０～７５％のＣＤ１３７＋発現細胞が、選別された画分において一貫して収集された（図１７）。低いリンパ球活性化（５％未満）を有する試料については、平均選別後濃縮は約３０％（約１１．７倍）であり、これはランダムノイズ事象に起因し得る。較正曲線はまた、２７８．８インピーダンスカウント／ｍＬの感度および１．７×１０３細胞／ｍＬの検出限界（３つの異なる実験から外挿された０％活性化細胞における検出数の３標準偏差）で、インピーダンスカウントと試料中の活性化リンパ球のパーセンテージとの間の良好な直線性を示した（図１７）。これらの測定基準は、試料中に存在する初期／自発的に活性化された細胞の量（ミン（Ｍｉｎ）、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１８，９）ならびに細胞サイクルに起因する生物物理学的特性の変動性（ホアン（Ｈｕａｎｇ）ら、前掲；キンジョウ（Ｋｉｎｊｙｏ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、２０１５、６、６３０１）に影響を及ぼし得る処理プロトコールおよび期間に依存することに留意されたい。まとめると、結果は、低レベルのリンパ球活性化（＜５％）を定量化するために、開発された統合型プラットフォームを使用することの実現可能性を明確に示唆する。
【0125】
実施例５：ＣＤ４Ｔリンパ球抗原活性化プロファイリングのための統合ワークフロー
感染性疾患における定量的リンパ球プロファイリングの概念実証として、開発されたプラットフォームを使用してリンパ球活性化を検出するために、ＰＢＭＣをＰＨＡおよびＰＰＤで２４時間刺激した。高細胞カウント数が対照試料について観察され、これはＰＢＭＣ中の（より大きい）単球の存在に起因し得る（図２３）。この問題を克服するために、ＣＤ４磁気活性化細胞選別（ＭＡＣｓ、ネガティブ分離）を組み合わせて、インピーダンスプロファイリングの前に単球および他の常在細胞を枯渇させた（図１８）。この戦略を使用して、対照についての低い細胞カウント数（ｎ＝５５２）、ならびに活性化Ｔリンパ球の存在を示すＰＨＡおよびＰＰＤ処理後ＰＢＭＣについてのより高いインピーダンス細胞カウント数（それぞれ、ｎ＝３１９８３および７１０）が首尾よく検出された（図１９）。これは、活性化リンパ球（ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋）が、スパイラル選別器におけるより小さいリンパ球の効率的な除去を伴うＰＰＤ処置について０．３８７％から７．０１７％（約１８倍）に有意に濃縮されたので、フローサイトメトリー分析と良好に一致した（図２０）。ドナー変動性を説明するために、刺激された試料（ＰＨＡまたはＰＰＤ）の選別された細胞（インピーダンス出口から）におけるリンパ球活性化（ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋）の、対照試料（刺激されていない）における選別された細胞に対する比を定量化した（図２１）。同様に、刺激された条件（ＰＨＡまたはＰＰＤ）において検出された細胞数のそれぞれの対照（刺激されていない）に対する比としての「差動インピーダンスカウント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｐｅｄａｎｃｅ ｃｏｕｎｔ）」も定義した。予想通り、差動インピーダンスカウント比は、より強いマイトジェン応答に起因して、ＰＰＤ（約６倍）よりもＰＨＡ（約１０５倍）について高かった（図２１）。インピーダンスサイトメトリーによるＰＰＤ特異的リンパ球応答の検出はまた、フローサイトメトリーよりも感度が高く（約６倍（インピーダンス）、約３倍（フローサイトメトリー））、全てのドナーにおいて検出された１を超える差動インピーダンスカウントを備えていた。まとめると、これらの結果は、抗原特異的Ｔリンパ球応答に基づくポイントオブケア検査としてさらに適用することができる、無標識の定量的リンパ球活性化プロファイリングのための統合型プラットフォームの使用を実証する。
感染性疾患における定量的リンパ球プロファイリングの概念実証として、開発されたプラットフォームを使用してリンパ球活性化を検出するために、ＰＢＭＣをＰＨＡおよびＰＰＤで２４時間刺激した。高細胞カウント数が対照試料について観察され、これはＰＢＭＣ中の（より大きい）単球の存在に起因し得る（図２３）。この問題を克服するために、ＣＤ４磁気活性化細胞選別（ＭＡＣｓ、ネガティブ分離）を組み合わせて、インピーダンスプロファイリングの前に単球および他の常在細胞を枯渇させた（図１８）。この戦略を使用して、対照についての低い細胞カウント数（ｎ＝５５２）、ならびに活性化Ｔリンパ球の存在を示すＰＨＡおよびＰＰＤ処理後ＰＢＭＣについてのより高いインピーダンス細胞カウント数（それぞれ、ｎ＝３１９８３および７１０）が首尾よく検出された（図１９）。これは、活性化リンパ球（ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋）が、スパイラル選別器におけるより小さいリンパ球の効率的な除去を伴うＰＰＤ処置について０．３８７％から７．０１７％（約１８倍）に有意に濃縮されたので、フローサイトメトリー分析と良好に一致した（図２０）。ドナー変動性を説明するために、刺激された試料（ＰＨＡまたはＰＰＤ）の選別された細胞（インピーダンス出口から）におけるリンパ球活性化（ＣＤ６９＋ＣＤ１３７＋）の、対照試料（刺激されていない）における選別された細胞に対する比を定量化した（図２１）。同様に、刺激された条件（ＰＨＡまたはＰＰＤ）において検出された細胞数のそれぞれの対照（刺激されていない）に対する比としての「差動インピーダンスカウント（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｉｎｐｅｄａｎｃｅ ｃｏｕｎｔ）」も定義した。予想通り、差動インピーダンスカウント比は、より強いマイトジェン応答に起因して、ＰＰＤ（約６倍）よりもＰＨＡ（約１０５倍）について高かった（図２１）。インピーダンスサイトメトリーによるＰＰＤ特異的リンパ球応答の検出はまた、フローサイトメトリーよりも感度が高く（約６倍（インピーダンス）、約３倍（フローサイトメトリー））、全てのドナーにおいて検出された１を超える差動インピーダンスカウントを備えていた。まとめると、これらの結果は、抗原特異的Ｔリンパ球応答に基づくポイントオブケア検査としてさらに適用することができる、無標識の定量的リンパ球活性化プロファイリングのための統合型プラットフォームの使用を実証する。
【0126】
実施例６：統合型インピーダンスサイトメータのためのシステムプロトタイピング
統合型インピーダンスサイトメータの商業化を容易にするために、図２４に示されるようにシステムプロトタイピングを実施した。最初に、システムの小型化の実現可能性を、１．インピーダンス分析器へのマイクロチップのインターフェースのためのＰＣＢチップホルダ、および２．統合ソフトウェアを使用して試料およびシースの灌流制御を可能にするための流体ポンプを組み込むことによって試験した（図２４）。次に、現場結果分析のためのリアルタイムデータ視覚化および定量化を提供するために、エンドユーザ／共同作業者用のグラフィカルユーザインターフェースを有するソフトウェアを開発した。
統合型インピーダンスサイトメータの商業化を容易にするために、図２４に示されるようにシステムプロトタイピングを実施した。最初に、システムの小型化の実現可能性を、１．インピーダンス分析器へのマイクロチップのインターフェースのためのＰＣＢチップホルダ、および２．統合ソフトウェアを使用して試料およびシースの灌流制御を可能にするための流体ポンプを組み込むことによって試験した（図２４）。次に、現場結果分析のためのリアルタイムデータ視覚化および定量化を提供するために、エンドユーザ／共同作業者用のグラフィカルユーザインターフェースを有するソフトウェアを開発した。
【0127】
本発明は、本明細書において広く一般的に記載されてきた。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属の分類のそれぞれもまた、本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書に具体的に記載されているか否かにかかわらず、属から任意の主題を除去する条件または否定的限定を有する本発明の一般的な記載を含む。他の実施形態も以下の特許請求の範囲内にある。
【0128】
当業者は、本発明が、目的を実行し、言及された結果および利点、ならびにその中に固有のものを得るために十分に適合されることを容易に理解するであろう。さらに、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、本明細書に開示されている本発明に対して様々な置換および改変を行うことができることは、当業者には容易に明らかであろう。本明細書中に記載される組成物、方法、手順、処置、分子および特定の化合物は、好ましい実施形態の現在の代表例であり、例示的であり、本発明の範囲に対する限定として意図されていない。当業者であれば、特許請求の範囲によって定義される本発明の精神に包含される変更および他の使用を思い付くであろう。本明細書における以前に公開された文書の列挙または考察は、必ずしも、その文書が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であるという承認として解釈されるべきではない。
【0129】
本明細書に例示的に記載される本発明は、本明細書に具体的に開示されていない任意の要素（単数または複数）、限定（単数または複数）の非存在下で適切に実施され得る。したがって、本発明は、例示的な実施形態および任意選択の特徴によって具体的に開示されているが、本明細書に開示されている実施形態において具体化されている本発明の修正形態および変形形態は、当業者によって用いられてもよく、そのような修正形態および変形形態は、本発明の範囲内であると考えられることを理解されたい。
【0130】
本明細書に引用される全ての文献および特許文献の内容は、その全体が参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【国際調査報告】