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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-06
(54)【発明の名称】医薬ポリマーコンジュゲート
(51)【国際特許分類】
A61K 33/30 20060101AFI20240228BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240228BHJP
A61K 47/64 20170101ALI20240228BHJP
A61K 47/56 20170101ALI20240228BHJP
【ＦＩ】
A61K33/30
A61P35/00
A61K47/64
A61K47/56
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557679
(86)(22)【出願日】2022-03-16
(85)【翻訳文提出日】2023-11-17
(86)【国際出願番号】 SG2022050139
(87)【国際公開番号】W WO2022197246
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】10202102785S
(32)【優先日】2021-03-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523356134
【氏名又は名称】ジロニックス・ピーティーイー．リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100187540
【弁理士】
【氏名又は名称】國枝 由紀子
(72)【発明者】
【氏名】チュン，ジニョク・フレッド
【テーマコード（参考）】
4C076
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C076AA12
4C076AA95
4C076BB11
4C076BB31
4C076CC27
4C076EE41
4C076EE59
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA03
4C086HA20
4C086HA28
4C086MA01
4C086MA06
4C086NA13
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、治療的に活性な二価金属イオンを細胞内送達するための組成物であって、（ｉ）ポリペプチドに結合した１つまたは複数の標的化部分、（ｉｉ）それに開裂性リンカーを介して結合したイオノホア、および（ｉｉｉ）それに結合した二価金属イオンを有するポリペプチドを含む組成物、ならびにそのような組成物を調製する方法、ならびに治療法におけるそれらの使用に関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ペプチド結合によって結合されたグルタミン酸モノマー単位を含むポリグルタミン酸を含むポリマー主鎖と、それぞれが第１のリンカー部分を介してポリマー主鎖中のモノマー単位に共有結合し、モノマー単位から懸垂（ｐｅｎｄａｎｔ）している、複数の第１の受容体標的化部分と、
それぞれが開裂性リンカー部分を介してポリマー主鎖中のモノマー単位に共有結合し、モノマー単位から懸垂している、複数のイオノホアと、
またはその塩もしくは溶媒和物と
を含むポリマーコンジュゲート。
【請求項2】
それぞれが第２のリンカー部分を介してポリマー主鎖中のモノマー単位に共有結合し、モノマー単位から懸垂している、複数の第２の受容体標的化部分をさらに含む、請求項１に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項3】
それぞれが標識リンカー部分を介してポリマー主鎖中のモノマー単位に共有結合し、モノマー単位から懸垂している、複数の標識部分をさらに含む、請求項１または２に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項4】
前記塩が、その亜鉛（ＩＩ）複合体である、請求項１、２、または３に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項5】
ポリマーコンジュゲートに対する亜鉛（ＩＩ）の重量対重量比が、１：５～１：２０の範囲内である、請求項４に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項6】
ポリマーコンジュゲート当たりの亜鉛（ＩＩ）イオンの数が、平均して少なくとも２０である、請求項４に記載のポリマーコンジュゲート。
【請求項7】
式ＩＶ、Ｖ、またはＶＩ：【化1】
（式中、Ｒ１はＨであり、
Ｒ２は、ＯＨ、またはＯＭ、またはＬＡ－Ｔ１、またはＬＢ－Ｔ２、またはＬＱ－Ｑであり、
ＬＡは、結合またはポリマーに結合した第１の末端部位およびＴ１に結合した第２の末端部位を有する二官能性連結基であり、第１の末端部位および第２の末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して接続されており、
ＬＢは、結合またはポリマーに結合した第１の末端部位およびＴ２に結合した第２の末端部位を有する二官能性連結基であり、第１の末端部位および第２の末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して接続されており、
ＬＱは、ポリマーに結合した第１の末端部位およびＱに結合した開裂性末端部位を有する二官能性連結基であり、第１の末端部位および開裂性末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して接続されており、
ＬＺは、存在する場合、結合またはポリマーに結合した第１の末端部位およびＺに結合した第２の末端部位を有する二官能性連結基であり、第１の末端部位および第２の末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して接続されており、
Ｔ１は、第１の標的化部分であり、
Ｔ２は、第２の標的化部分であり、
Ｑは、イオノホア部分であり、
Ｚは、存在する場合、蛍光団部分であり、
Ｍのそれぞれは、独立してＨ、プロトン、アルカリイオン、薬学的に許容される一価カチオンであるか、または存在せず、
ａおよびｂは、ゼロ、または約５までの有限数であるが、ａおよびｂは両方ともゼロではなく、
ｃは、約３から約５０の範囲の有限数であり、
ｄは、存在する場合、約１であり、
ｍは、約５０から約７００の範囲の有限数である。）
【請求項8】
請求項７に記載のポリマーコンジュゲート、および薬学的に許容される希釈剤、担体、緩衝剤、ビヒクル、またはそれらの任意の組み合わせを含む、医薬組成物。
【請求項9】
非経口投与用に製剤化される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項10】
ポリマーコンジュゲートが、ポリマーコンジュゲートの亜鉛（ＩＩ）複合体である、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項11】
ポリマーコンジュゲートに対する亜鉛（ＩＩ）の重量対重量比が、１：５～１：２０の範囲内である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項12】
ポリマーコンジュゲート当たりの亜鉛（ＩＩ）イオンの数が、平均して少なくとも２０である、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項13】
患者の腫瘍を治療するための方法であって、請求項８から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。
【請求項14】
患者の腫瘍におけるパータナトスを誘導する方法であって、請求項８から１２のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量を前記患者に投与するステップを含む方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書では、治療有効量の金属イオンの細胞内送達に有用なポリペプチドポリマーコンジュゲートが提示される。本発明はまた、組成物が対象とする細胞内でパータナトスを誘導するための組成物、およびそのような組成物を使用する治療の方法に関する。
【背景技術】
【0002】
がんの複雑さおよび不均一性は長期にわたって認識されてきたが、しばらくの間、生理学的位置、組織学的外観、および系統による疾患分類などの歴史的発展に治療様式は追随してきた。最近、免疫療法および他の免疫関連の手法に注意が向けられており、例えば、ワクチン接種による抗がんＴ細胞免疫応答の開始、または腫瘍細胞にネオ抗原提示を引き起こす手段としての免疫原性細胞死の誘導が挙げられる。
【0003】
ネクロトーシス、ピロトーシス、またはパータナトスなどの免疫原性細胞死を誘導するための方法には、いくつかの機構が関連している場合がある。ネクロトーシスに基づく治療の可能性を実証する前臨床研究がいくつかある一方で、ピロトーシスまたはパータナトス経路を利用する方法については、ほとんど進歩が報告されていない。パータナトスは、ＤＮＡ損傷センサーおよび修復酵素ＰＡＲＰの過剰活性化によって誘発される、プログラムされたネクローシスの一様式である。ＰＡＲＰの過剰な活性化により、反応生成物であるＰＡＲポリマーが蓄積し、ＡＩＦの核移行を引き起こし、次に重度のＤＮＡ断片化を誘発し、最終的には細胞死を誘発する。
【0004】
報告では、亜鉛またはカドミウムの急性毒性が、ＰＡＲＰ１活性に関与していることが示唆されている。（非特許文献１、２）。例えば、亜鉛塩の神経毒性を評価した報告では、単純な亜鉛塩に由来する高濃度の亜鉛イオン（４００μＭまたは２６μｇ／ｍＬ）は、培養皮質細胞におけるＰＡＲＰ／ＰＡＲＧ媒介ＮＡＤ＋およびＡＴＰの枯渇、ならびにその後のネクローシスを誘導することが記載されている。（非特許文献３）。反対に、がん細胞株に対する亜鉛活性の研究では、特定の壊死機構が観察されたが、その亜鉛剤の濃度でラットに急性神経毒性を引き起こすことが他の研究者によって示された。（非特許文献４、５）。
【0005】
これらの二価金属イオンに関する他の研究では、それらのピリチオン（「Ｐｙｒ」）複合体（すなわち、ＺｎＰｙｒ２）に焦点が当てられている。ある研究では、ＺｎＰｙｒ２が細胞毒性効果を示し、したがって潜在的に抗腫瘍特性を有すると報告されているが、その研究では、ＺｎＰｙｒ２ががん細胞株でアポトーシスを誘導し、いかなるＤＮＡ損傷も引き起こさずに完全なＰＡＲＰ切断を引き起こすことが判明した。（非特許文献６）。アポトーシスによる細胞死は、パータナトス機構に対して直交性である（機構的な共通性が欠如している）と考えられており、実際、ＺｎＰｙｒ２について報告されているＰＡＲＰ切断は、パータナトスカスケードを誘発する役割を果たす過剰活性は言うまでもなく、いかなるＰＡＲ活性も妨げるであろう。
【0006】
本発明者らは、２０１６年１１月１日出願のシンガポール特許出願第１０２０１６０９１３１Ｙ号、および２０１７年１０月３０日出願の第１０２０１７０８８８６Ｒ号において、可消化ポリマー亜鉛キレート複合体（それぞれ、γ－ポリグルタミン酸亜鉛［Ｚｎ－γＰＧＡ］およびα－ポリグルタミン酸亜鉛［Ｚｎ－αＰＧＡ］）の抗がん効果について以前に開示した。その後、２０１８年６月２２日出願のシンガポール特許出願第１０２０１８０５４１２Ｔ号および２０１８年１２月２４日出願の第１０２０１８１１５７７Ｔ号において、本発明者らは、関連する亜鉛ベースの薬剤が、単独療法として、または免疫腫瘍薬と組み合わせて、一連のがんの兆候に対して治療効果を有することについて開示した。前述の出願は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0007】
それにもかかわらず、腫瘍に対するより大きな有効性、および／またはＭ２様マクロファージなどの他の細胞型に対する活性のどちらも示す改良された薬剤の必要性が依然として存在する。
【0008】
言及された問題を解決するために、ポリペプチドポリマーの設計を実験し、追加の構造的特徴および機能的特性が、細胞内、特に金属イオンの送達に使用されるポリペプチドコンジュゲートによって標的とされる細胞型内で治療効果を発揮する金属イオンの能力をどのように改善するかを実験した。二価金属イオンの細胞内送達に有用であり、さらにパータナトスを誘導することができるポリマーコンジュゲート組成物を調製するために、ポリマーに結合する部分の種類およびそれらの結合の方法を実験した。そのような組成物をがん細胞（固形腫瘍がんおよび血液がん細胞を含む）およびＭ２様マクロファージに対する活性について試験し、そのような組成物が強力な殺腫瘍効果を有し、かつパータナトスを誘導することを発見し、したがって本明細書に記載の本発明を完成した。
【0009】
本明細書に開示される組成物および方法は、標的化部分および開裂性イオノホア部分を含むポリペプチドポリマーコンジュゲートの金属イオン複合体が、様々なヒトおよびマウスの腫瘍においてパータナトスを誘導することができ、ｉｎ ｖｉｖｏ試験でのＴ細胞およびマクロファージなどの抗腫瘍免疫コンパートメントにおける応答を開始することができるという驚くべき観察に起因する。
引用
NPL1. Sheline, C.T., Wang, H., Cai, A.L., Dawson, V.L., Choi, D.W. (2002). Involvement of poly ADP ribosyl polymerase-1 in acute but not chronic zinc toxicity. Eur. J. Neurosci. 18, 1402-1409.
NPL2. Luo, T., Yuan, Y., Yu, Q., Liu, G., Long, M., Zhang, K., Bian, J., Gu, J., Zou, H., Wang, Y., Zhu, J., Liu, X., Liu, Z. (2017). PARP-1 overexpression contributes to cadmium-induced death in rat proximal tubular cells via parthanatos and the MAPK signalling pathway. Scientific Reports 7, 4331.
NPL3. Kim, Y.H., and Koh, J.Y. (2002). The role of NADPH oxidase and neuronal nitric oxide synthase in zinc-induced poly(ADP-ribose) polymerase activation and cell death in cortical culture. Experimental Neurology 177, 407-418.
NPL4. Carraway, R.E., and Dobner, P.R. (2012). Zinc pyrithione induces ERK- and PKC-dependent necrosis distinct from TPEN-induced apoptosis in prostate cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta 1823, 544-557.
NPL5. Snyder, D.R., de Jesus, C.P., Towfighi, J., Jacoby, R.O., and Wedig, J.H. (1979). Neurological, microscopic and enzyme-histochemical assessment of zinc pyrithione toxicity. Food and Cosmetics Toxicology 17, 651-660.
NPL6. Zhao, C. et al. (2017). Repurposing an antidandruff agent to treating cancer: zinc pyrithione inhibits tumor growth via targeting proteasome-associated deubiquitinases. Oncotarget8, 13942-13956.
引用
NPL1. Sheline, C.T., Wang, H., Cai, A.L., Dawson, V.L., Choi, D.W. (2002). Involvement of poly ADP ribosyl polymerase-1 in acute but not chronic zinc toxicity. Eur. J. Neurosci. 18, 1402-1409.
NPL2. Luo, T., Yuan, Y., Yu, Q., Liu, G., Long, M., Zhang, K., Bian, J., Gu, J., Zou, H., Wang, Y., Zhu, J., Liu, X., Liu, Z. (2017). PARP-1 overexpression contributes to cadmium-induced death in rat proximal tubular cells via parthanatos and the MAPK signalling pathway. Scientific Reports 7, 4331.
NPL3. Kim, Y.H., and Koh, J.Y. (2002). The role of NADPH oxidase and neuronal nitric oxide synthase in zinc-induced poly(ADP-ribose) polymerase activation and cell death in cortical culture. Experimental Neurology 177, 407-418.
NPL4. Carraway, R.E., and Dobner, P.R. (2012). Zinc pyrithione induces ERK- and PKC-dependent necrosis distinct from TPEN-induced apoptosis in prostate cancer cells. Biochimica et Biophysica Acta 1823, 544-557.
NPL5. Snyder, D.R., de Jesus, C.P., Towfighi, J., Jacoby, R.O., and Wedig, J.H. (1979). Neurological, microscopic and enzyme-histochemical assessment of zinc pyrithione toxicity. Food and Cosmetics Toxicology 17, 651-660.
NPL6. Zhao, C. et al. (2017). Repurposing an antidandruff agent to treating cancer: zinc pyrithione inhibits tumor growth via targeting proteasome-associated deubiquitinases. Oncotarget8, 13942-13956.
【発明の概要】
【0010】
本開示は、概して、治療的に活性なポリペプチドポリマーコンジュゲート組成物、ならびにそれらを製造する方法および使用する方法に関する。より具体的には、この組成物は、ポリマーに結合した標的化部分およびイオノホアリガンド、ならびに前記ポリマーに結合した治療的に活性な金属イオンを含み、そのような組成物は、治療有効量の金属イオンの組成物によって標的とされる細胞への細胞内送達に有用である。治療的に活性な金属イオンは、亜鉛（ＩＩ）およびカドミウム（ＩＩ）イオンから選択される。
【0011】
一態様では、本開示は、ポリペプチドポリマーコンジュゲート組成物およびその合成方法を提供する。ポリマーは、ペプチド結合を介して結合されたモノマー単位から構成されており、モノマー単位は、様々な官能部分をポリマーに結合させるために利用できる官能基を備えた側鎖を含む。好ましい一実施形態では、モノマー単位側鎖に存在する官能基は、カルボキシル基である。カルボキシル基は、様々な部分をポリマー主鎖に結合するための多種多様な周知の共役化学反応を提供する。また、この官能基はカルボキシレートの形態で調製でき、治療的に活性な金属イオンをポリマーに結合するために使用できる。
【0012】
少なくとも１つのモノマー単位側鎖は、標的化部分に結合し、少なくとも１つのモノマー単位側鎖は、イオノホア部分に結合する。標的化部分は、組成物が対象とする細胞上に見出される細胞表面受容体によって認識され得る分子を含む。したがって、この部分は、ポリマー組成物を特定の細胞に導く役割を果たし、その際、受容体は、細胞へのポリマー組成物の取り込みを促進することができる。イオノホアは、治療的に活性な金属イオンと配位複合体を形成できる分子を含む。概して、官能部分の結合は、リンカー基を介して側鎖官能基を官能部分と結合することによって達成される。好ましくは、標的化部分は、非開裂性共有結合リンカー基を介してポリマーに結合され、一方、イオノホア部分は、開裂性結合を含む共有結合リンカー基を介してポリマーに結合され、それによってイオノホア部分がポリマー主鎖から分離し、治療的に活性な金属イオンと複合体を形成することができる。
【0013】
標的化部分またはイオノホア部分のいずれにも結合していない残りのモノマー単位のうち、いくつかの実施形態では、そのようなモノマー単位側鎖は、独立して、プロトン化（カルボン酸）または非プロトン化（カルボン酸イオン）形態である。カルボキシル基の形態は、概して、ポリマーの固体形態を生成する化学的処理によって決まり、ポリマーは、塩として調製されても遊離酸として調製されてもよいか、またはポリマーは、溶液中で提供され、この場合、カルボキシル基の水溶液中のイオン化状態は、ｐＨに応じる。他の実施形態では、複数の残りの非共役側鎖は、カルボン酸イオンとして存在し、治療的に活性な金属イオンと複合体を形成するが、他の残りの側鎖カルボキシル基は、プロトン化および／または非プロトン化形態で存在してもよい。
【0014】
いくつかの実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、式（Ｉ）で示される部分構造を含む。
【0015】
【化1】
【0016】
（式中、
Ａは、イオン性官能基を有する側鎖を持つモノマー単位であり、
ＬＱは、開裂性連結基であり、
Ｑは、イオノホアリガンドであり、
ＬＡは、第１の連結基であり、
Ｔ１は、第１の受容体を標的とする第１の標的化部分であり、
Ｍは、出現ごとに独立して選択され、プロトン、カチオン性対イオン、または治療的に活性な金属イオンであってもよく、
括弧は、集合的にポリマーを形成する各種類のモノマー単位の、１回または複数回の出現を表す。）
各モノマー種類の数は互いに独立しているが、特定のモノマー種類の出現の回数は、本明細書に記載の組成物に所望される官能性および特性に従って選択され得る。当業者が理解するように、特に本明細書の開示を考慮すると、各モノマー種類の出現は、概して無作為に順序づけられているため、一次構造は例示によって意図されているのではない。
Ａは、イオン性官能基を有する側鎖を持つモノマー単位であり、
ＬＱは、開裂性連結基であり、
Ｑは、イオノホアリガンドであり、
ＬＡは、第１の連結基であり、
Ｔ１は、第１の受容体を標的とする第１の標的化部分であり、
Ｍは、出現ごとに独立して選択され、プロトン、カチオン性対イオン、または治療的に活性な金属イオンであってもよく、
括弧は、集合的にポリマーを形成する各種類のモノマー単位の、１回または複数回の出現を表す。）
各モノマー種類の数は互いに独立しているが、特定のモノマー種類の出現の回数は、本明細書に記載の組成物に所望される官能性および特性に従って選択され得る。当業者が理解するように、特に本明細書の開示を考慮すると、各モノマー種類の出現は、概して無作為に順序づけられているため、一次構造は例示によって意図されているのではない。
【0017】
他の実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、式（ＩＩ）で示される部分構造を含む。
【0018】
【化2】
【0019】
（式中、
式（Ｉ）と共通の記号は、同じ意味を有し、
ＬＢは、第２の連結基であり、
Ｔ２は、第１の受容体または第２の受容体を標的とする第２の標的化部分である。）
他の実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）で示される部分構造を含む。
式（Ｉ）と共通の記号は、同じ意味を有し、
ＬＢは、第２の連結基であり、
Ｔ２は、第１の受容体または第２の受容体を標的とする第２の標的化部分である。）
他の実施形態では、本発明のポリマーコンジュゲートは、式（ＩＩＩ）で示される部分構造を含む。
【0020】
【化3】
【0021】
（式中、
式（Ｉ）および式（ＩＩ）と共通の記号は、同じ意味を有し、
ＬＺは、標識連結基であり、
Ｚは、標識部分である。）
標識部分は、化学合成の開発、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏの調査研究を容易にするのに役立つ検出可能な標識である。好ましくは、標識は、蛍光団である。
式（Ｉ）および式（ＩＩ）と共通の記号は、同じ意味を有し、
ＬＺは、標識連結基であり、
Ｚは、標識部分である。）
標識部分は、化学合成の開発、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｓｉｔｕ、もしくはｉｎ ｖｉｖｏの調査研究を容易にするのに役立つ検出可能な標識である。好ましくは、標識は、蛍光団である。
【0022】
式（Ｉ）～（ＩＩＩ）のそれぞれにおいて、ポリマー主鎖が側鎖官能基と同じかまたは同様の化学反応性を有する末端官能基を有する限り、連結基ＬＡ、ＬＢ、ＬＱ、またはＬＺのうちの１つは、末端官能基の位置に結合してもよいことが認識されるべきである。これは、無作為な競合、共役反応における試薬の添加順序、またはカップリング剤、反応条件、もしくは特定のリンカー基の官能基による反応選択性の結果である場合がある。
【0023】
別の態様では、本発明は、存在する治療的に活性な金属イオンを用いて調製された式（Ｉ）～（ＩＩＩ）の上記のポリマー組成物のいずれかを、治療的に活性なポリマーコンジュゲート剤として提供する。このような治療薬組成物は、概して、溶液として製剤化され、かつ投与経路および投与形態と一致する薬学的に許容される方法で製剤化される。一実施形態では、治療薬組成物は、静脈内投与用に製剤化される。
【0024】
別の態様では、対象における固形腫瘍または血液がんを治療するための方法における、治療的に活性なポリペプチドポリマーコンジュゲートの実施形態のうちのいずれかの医薬組成物の使用が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、治療される固形腫瘍または血液がんは、ＰＡＲＰ媒介壊死を起こしやすい種類である。
【0025】
別の態様では、マクロファージ媒介炎症を治療するための方法における、治療的に活性なポリペプチドポリマーコンジュゲートの実施形態のうちのいずれかの医薬組成物の使用が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、Ｍ２様マクロファージを標的とし、マクロファージ媒介炎症状態を治療するのに有用である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、様々な免疫コンパートメントにおいて免疫応答を開始するのに有用である。
【0026】
別の態様では、細胞が葉酸受容体を過剰発現するために、病変を引き起こす細胞が葉酸部分による標的化を受けやすいか、または細胞が標的インテグリンを過剰発現するために、病変を引き起こす細胞がインテグリンのリガンドによる標的化を受けやすい対象の症状を治療するための方法における、治療的に活性なポリペプチドポリマーコンジュゲートの実施形態のうちのいずれかの医薬組成物の使用が本明細書で提供される。
【0027】
別の態様では、本明細書に開示される治療の方法で使用するための医薬組成物または医薬の製造における、本明細書に開示される実施形態のいずれかによるポリペプチドポリマーコンジュゲート組成物の使用が本明細書で提供される。
【図面の簡単な説明】
【0028】
【図1】実施例６に記載されるポリマーコンジュゲートの一実施形態を示す図である。
【図2】実施例７に記載されるポリマーコンジュゲートの一実施形態を示す図である。
【図3】実施例８に記載されるポリマーコンジュゲートの一実施形態を示す図である。
【図4】実施例９に記載される、対照として使用されるポリマーコンジュゲートを示す図である。
【図5A】図５Ａは、４Ｔ１細胞に対する２４時間処置後のＬＤＨ放出アッセイを使用した比較ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価を示すグラフである。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ時間分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用量分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｄは、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４を伴うかまたは伴わずに、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎで処置した４Ｔ１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＲ－ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図5B】図５Ａは、４Ｔ１細胞に対する２４時間処置後のＬＤＨ放出アッセイを使用した比較ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価を示すグラフである。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ時間分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用量分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｄは、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４を伴うかまたは伴わずに、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎで処置した４Ｔ１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＲ－ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図5C】図５Ａは、４Ｔ１細胞に対する２４時間処置後のＬＤＨ放出アッセイを使用した比較ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価を示すグラフである。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ時間分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用量分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｄは、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４を伴うかまたは伴わずに、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎで処置した４Ｔ１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＲ－ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図5D】図５Ａは、４Ｔ１細胞に対する２４時間処置後のＬＤＨ放出アッセイを使用した比較ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性評価を示すグラフである。図５Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ時間分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｃは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ用量分解アポトーシス－ネクローシスフローサイトメトリーアッセイの結果を示す図である。図５Ｄは、ＰＡＲＰ阻害剤ＰＪ３４を伴うかまたは伴わずに、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎで処置した４Ｔ１細胞に対するｉｎ ｖｉｔｒｏ ＰＡＲ－ＥＬＩＳＡアッセイの結果を示すグラフである。
【図6】図６Ａは、１．５時間処置した４Ｔ１細胞の代表的な共焦点蛍光画像である。図６Ｂは、細胞生存率、ＡＩＦの核移行、および核ＴＵＮＥＬ強度（ｎｕｃｌｅａｒ ＴＵＮＥＬ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）についての蛍光画像の定量分析を示すグラフである。
【図7A】図７Ａは、腫瘍部位によって層化された５３個のＰＤＸ腫瘍タイプに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎのｅｘ ｖｉｖｏ ＩＣ５０値を示すグラフである。図７Ｂは、各ＰＤＸ腫瘍断片に関連するＴＭＢまたはＭＳＩスコアに対するｅｘ ｖｉｖｏ ＩＣ５０値のプロットである。図７Ｃは、ＣＴＧ－１４１３肉腫ＰＤＸ腫瘍断片からのｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性反応データの１例を示す図である。
【図7B】図７Ａは、腫瘍部位によって層化された５３個のＰＤＸ腫瘍タイプに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎのｅｘ ｖｉｖｏ ＩＣ５０値を示すグラフである。図７Ｂは、各ＰＤＸ腫瘍断片に関連するＴＭＢまたはＭＳＩスコアに対するｅｘ ｖｉｖｏ ＩＣ５０値のプロットである。図７Ｃは、ＣＴＧ－１４１３肉腫ＰＤＸ腫瘍断片からのｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性反応データの１例を示す図である。
【図7C】図７Ａは、腫瘍部位によって層化された５３個のＰＤＸ腫瘍タイプに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎのｅｘ ｖｉｖｏ ＩＣ５０値を示すグラフである。図７Ｂは、各ＰＤＸ腫瘍断片に関連するＴＭＢまたはＭＳＩスコアに対するｅｘ ｖｉｖｏ ＩＣ５０値のプロットである。図７Ｃは、ＣＴＧ－１４１３肉腫ＰＤＸ腫瘍断片からのｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性反応データの１例を示す図である。
【図8】１０％ＤＭＳＯ（ＰＣ）またはＣ０１０ＤＳ－Ｚｎによるｅｘ ｖｉｖｏ処置時のＰＤＸ腫瘍断片における抗γＨ２ＡＸ取り込みの比較蛍光画像特性を示す図である。
【図9A】図９Ａは、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃ処置モデルスキーム、腫瘍増殖動態、およびＴＭＥにおける顕著な免疫応答を示す図である。図９Ｂは、ＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃ処置モデルスキーム、腫瘍増殖動態、およびＴＭＥにおける顕著な免疫応答を示す図である。
【図9B】図９Ａは、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃ処置モデルスキーム、腫瘍増殖動態、およびＴＭＥにおける顕著な免疫応答を示す図である。図９Ｂは、ＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃ処置モデルスキーム、腫瘍増殖動態、およびＴＭＥにおける顕著な免疫応答を示す図である。
【図10A】図１０Ａは、スプラーグドーリーラットを使用したＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの単回静脈内ボーラス投与後の、Ｃｙ５．５シグナルおよび亜鉛レベルを介してＣ０１０ＤＳを個別に追跡した、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎの血漿薬物動態プロファイルを示す図である。図１０Ｂは、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルに対する１３日間の非抗がん投与スキーム、その腫瘍増殖動態、および収集された腫瘍における処置に対するマクロファージ免疫応答を示す図である。図１０Ｃは、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルに対する１６日間の非抗がん投与スキーム、その腫瘍増殖動態、および収集された腫瘍における処置に対するマクロファージ免疫応答を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0029】
本明細書に開示されるポリマーコンジュゲートは、ポリマー主鎖に結合した２つの官能部分の種類から構成されており、治療的に活性な金属イオンと複合体を形成することができる。これらの成分（標的化部分、イオノホア部分、および金属イオン）は、本明細書に記載の金属イオンポリマーコンジュゲート複合体（ｍｅｔａｌ ｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒ ｃｏｎｊｕｇａｔｅ ｃｏｍｐｌｅｘ）として接合されると、対象において治療的利益を与える生物学的反応を誘導することができる。ポリマーコンジュゲートは、イオノホア部分の援助により、標的化部分によってポリマーコンジュゲートが向けられる受容体を発現する細胞の細胞内環境に、ある用量の金属イオンを送達する役割を果たすと考えられる。
【0030】
主題である高分子組成物には、その望ましい特性に寄与する全体的な特徴がいくつかある。第１に、本組成物は、細胞表面受容体に結合するリガンドを含む。このリガンドは、標的化部分と呼ばれる。目的のリガンドは、目的の細胞型で過剰発現しているか、または少なくとも豊富に存在する細胞表面受容体に結合するリガンドである。注目すべきことに、腫瘍細胞およびマクロファージなどの免疫細胞は、特定の受容体、例えば葉酸受容体または葉酸結合タンパク質を過剰発現することが判明しており、したがって、受容体リガンドまたはその類似体もしくは誘導体を使用してこれらの細胞型を標的とする手段を提供する。全体的に、標的化部分は、開裂されにくい方法で構造の残りの部分に共有結合する。構造の残りの部分との結合は、概して親水性であり、構造の残りの部分からの立体障害をほとんど受けずにリガンドが細胞表面受容体に接近することを可能とするのに十分な長さがある。複数の標的化部分が構造に結合されていてもよく、かつ／または１つより多くの種類の標的化部分が含まれていてもよい。
【0031】
第２に、本組成物は、金属イオンのイオノホアを含む。このイオノホアは、イオノホア部分と呼ばれる。イオノホアは、金属イオンと可逆的に結合し、生体膜を横断する金属イオンの輸送を助ける分子である。好ましい実施形態では、イオノホア部分は、開裂性結合を介して構造の残りの部分に結合される。さらなる実施形態では、結合は、高分子が蓄積する微小環境の結果として開裂される。さらなる実施形態では、イオノホアは、構造の残りの部分から開裂された結果として、正常に金属イオンと結合することができる。つまり、例えば、結合の開裂により、金属イオンに配位する基の１つであるイオノホア内の官能基が曝露される。複数のイオノホア部分が構造に結合されていてもよく、かつ／または１つより多くの種類のイオノホア部分が含まれていてもよい。
【0032】
第３に、本組成物は、生物学的効果をもたらすことができる金属イオンを含む。本組成物の目的は、治療的利益を有する生物学的効果をもたらすために、対象内に金属イオンを送達することである。全体的に、複数の金属イオンが各高分子構造体に結合しており、したがって、本質的に、特定の細胞環境にボーラス用量の金属イオンを提供する。本明細書に開示される構造体を使用して金属イオンを送達する利点は、そのような構造体がなければ、金属イオンをそのような濃度で細胞環境に送達することができず、かつ／または細胞、組織、器官、または対象全体に対する毒性効果がそのように欠如していなければ送達できないことである。
【0033】
第４に、本組成物は、（ｉ）セットとして送達可能であり、セットとして機能するための、上記で論じた他の様々な成分が結合できる足場と、（ｉｉ）細胞がエンドサイトーシス（例えば、受容体媒介エンドサイトーシス、吸着エンドサイトーシスなど）によって組成物を取り込むのに十分なサイズまたは嵩との両方を提供する高分子から構成される。このような足場を提供し得る一般的な高分子構造体には、直鎖状ポリマー、分岐ポリマー、デンドリマー、および他の種類のナノ粒子が含まれる。概して、このような高分子は、コンジュゲートを調製して金属イオンを結合するために必要な官能基を提供することに加えて、水溶性、非毒性、および非免疫原性であるべきである。さらに、このような高分子は、好ましくは生分解性であり、そうでない場合は、効率的な腎排出のために約４０ｋＤａ未満であるべきである。理論に束縛されるものではないが、エンドサイトーシスによる取り込み過程では、エンドソームおよびリソソームが組成物を受け入れ、その中の微小環境、例えば、低いｐＨ、ならびに消化酵素、および酸化還元活性分子（例えば、グルタチオン）の存在により、イオノホアに開裂性結合がもたらされて開裂すると考えられている。その結果、金属イオンはイオノホアと結合することができ、イオノホアがエンドソームおよびリソソームから残りの細胞内環境への金属イオンの輸送を援助し、そこで金属イオンがパータナトス誘発などの意図された生物学的効果を発揮し得る。
【0034】
主題である組成物のこれらの全体的な原理および特性について説明してきたが、次に本発明の特定の実施形態について詳細に言及する。
Ａ．ポリマーコンジュゲート。
Ａ．ポリマーコンジュゲート。
【0035】
一実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、式（ＩＶ）：
【0036】
【化4】
【0037】
およびその金属イオン複合体によって記載される。
式（ＩＶ）では、ポリマー主鎖は、ガンマ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）であり、直鎖状主鎖は、１つのモノマーのアミノ基と、第２のモノマー単位のガンマ位に位置するカルボン酸基の間のペプチド結合によって形成される。したがって、各モノマー単位のアルファ位にあるカルボン酸基は、共役に利用できるペンダント側鎖であり、カルボン酸イオンとして存在する場合、金属イオンと結合するか、またはカチオンと対になることも可能である。
式（ＩＶ）では、ポリマー主鎖は、ガンマ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）であり、直鎖状主鎖は、１つのモノマーのアミノ基と、第２のモノマー単位のガンマ位に位置するカルボン酸基の間のペプチド結合によって形成される。したがって、各モノマー単位のアルファ位にあるカルボン酸基は、共役に利用できるペンダント側鎖であり、カルボン酸イオンとして存在する場合、金属イオンと結合するか、またはカチオンと対になることも可能である。
【0038】
この式は、異なるモノマー単位の周りに角括弧を備えており、これは４つの異なる種類のモノマー単位があり、置換基によって定義される異なる構造を潜在的に有することを示している。各括弧は、下付き文字（左から右にｃ、ａ、ｂ、およびｍ）を有し、各モノマー単位の種類が多くの場合に存在する可能性があることを示している。但し、この式は、ポリマー主鎖の接続性、つまり一次構造が、最初のモノマー種類の「ｃ」単位であり、その後に２番目のモノマー種類の「ａ」単位が続く、などということを要求することを意図するものではない。むしろ、一次構造は、ポリマーコンジュゲート組成物を調製するために使用される合成経路によって生じる任意の傾向、例えば、当業者によって理解されるように、連結基および側鎖の付加の順序、連結基とαカルボキシル基の間に形成される結合の性質、カップリング剤、反応条件などの影響を受けて、さまざまなモノマー種類の無作為な順序を含む。
【0039】
末端位置を考慮すると、Ｎ末端では、Ｒ１はＨであり、Ｃ末端では、Ｒ２はＯＨまたはＯＭまたはＬＡ－Ｔ１またはＬＢ－Ｔ２またはＬＱ－Ｑである。
Ｔ１およびＴ２は、標的化部分である。一実施形態では、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ、異なるクラスの細胞表面受容体と結合し、したがって異なるクラスのリガンドを表す。別の実施形態では、Ｔ１およびＴ２は異なる分子であるが、それらはそれぞれ同じクラスの細胞表面受容体と結合する。Ｔ１およびＴ２は、天然のリガンド（受容体との天然の結合パートナーである細胞内に見られる分子）でもよいか、またはリガンド類似体（細胞内に天然には見られないが、受容体に対する結合親和性を有する分子）、またはリガンド誘導体（天然リガンドの修飾された形態であり、通常は結合を促進するために修飾されている）でもよい。Ｔ１またはＴ２が、反応して共有結合を形成しやすく存在する官能基を有する場合、その官能基を使用して、部分を連結基に結合するか、または部分をポリマーに直接結合させることができる。概して、リガンド類似体は、好適な官能基を有するように調製されている。葉酸などの天然のリガンドは、好適な官能基を有する場合があるが、そうでない場合には、好適な官能基を提供するためにリガンド誘導体を調製することができる。
Ｔ１およびＴ２は、標的化部分である。一実施形態では、Ｔ１およびＴ２はそれぞれ、異なるクラスの細胞表面受容体と結合し、したがって異なるクラスのリガンドを表す。別の実施形態では、Ｔ１およびＴ２は異なる分子であるが、それらはそれぞれ同じクラスの細胞表面受容体と結合する。Ｔ１およびＴ２は、天然のリガンド（受容体との天然の結合パートナーである細胞内に見られる分子）でもよいか、またはリガンド類似体（細胞内に天然には見られないが、受容体に対する結合親和性を有する分子）、またはリガンド誘導体（天然リガンドの修飾された形態であり、通常は結合を促進するために修飾されている）でもよい。Ｔ１またはＴ２が、反応して共有結合を形成しやすく存在する官能基を有する場合、その官能基を使用して、部分を連結基に結合するか、または部分をポリマーに直接結合させることができる。概して、リガンド類似体は、好適な官能基を有するように調製されている。葉酸などの天然のリガンドは、好適な官能基を有する場合があるが、そうでない場合には、好適な官能基を提供するためにリガンド誘導体を調製することができる。
【0040】
Ｔ１およびＴ２は、それぞれ連結基ＬＡおよびＬＢを介してペンダント側鎖のα－カルボキシル基を通じてポリマー主鎖に結合している。ＬＡおよびＬＢは、共有結合を介して標的部分をポリマー主鎖に結合することができる任意の化学部分である。Ｔ１またはＴ２がポリマーと直接共有結合を形成できる場合、ＬＡまたはＬＢは、それぞれ結合を表す。それ以外の場合、ＬＡおよびＬＢは、モノマー単位のペンダントα－カルボキシル基と結合を形成することができる第１の末端部位、ならびにＴ１およびＴ２の好適な官能基と結合を形成することができる第２の末端部位を有する二官能性分子をそれぞれ表し、第１の末端部位および第２の末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して互いに接続されている。第１の末端部位は、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＨ－であってもよく、それによってエステル、チオエステル、またはポリマーへのアミド結合が形成される。第２の末端部位は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、または－アシルであってもよい。３～２０個の原子の鎖は、ポリエーテル、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ－などのエーテルセグメント、または場合により置換されている直鎖状または分岐状炭化水素を含んでもよい。ＬＡおよびＬＢの第１の末端部位および第２の末端部位は、同じであっても異なっていてもよい。便宜上、ＬＡおよびＬＢに同じ第１の末端部位を提供すると、ＬＡおよびＬＢとポリマーの間のカップリング反応を同時に実施することが容易になり得る。
【0041】
Ｔ１およびＴ２の少なくとも一方または両方が、標的化部分として存在する。指数「ａ」および「ｂ」は、それぞれＴ１の組み込み度およびＴ２の組み込み度であり、「ａ」および「ｂ」は、ポリマー当たりの組成物中のそのようなモノマー単位の平均数を表す。「ａ」および「ｂ」は、それぞれ、ゼロ、または約５までの有限数であり得るが、「ａ」および「ｂ」は、両方ともゼロではない。
【0042】
Ｑは、イオノホア部分であり、ポリマーコンジュゲートの金属イオン複合体を調製するために使用される金属イオンに対するイオノホアを含む。好ましい実施形態では、イオノホアは二座リガンドであり、リガンドの一方は、チオールまたはチオン基であり、他方のリガンドは、概してＯ－またはＮ－ベースの官能基である。一実施形態では、イオノホア部分は、チオールまたはチオン基を介してリンカーＬＱに結合されるように調製され、リンカーＬＱにはＳベースの官能基が備わっており、それによりＬＱ－Ｑは、開裂され得るジスルフィド結合によって結合される。
【0043】
ＬＱは、それを介してＱがモノマー単位のα－カルボキシル基に結合される連結基を表し、ＬＱは開裂性部位を含む。開裂性結合は、ＬＱとＱの間の結合である。ＬＱは、モノマー単位のペンダントα－カルボキシル基と結合を形成することができる第１の末端部位、およびＱの好適な官能基と結合を形成することができる第２の末端部位を有する二官能性分子を表し、第１の末端部位および第２の末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して互いに接続されている。第１の末端部位は、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＨ－であってもよく、それによってエステル、チオエステル、またはポリマーへのアミド結合が形成される。開裂性末端部位は、例えばＱのチオール基とジスルフィド結合を形成するために、－Ｓ－であってもよい。３～２０個の原子の鎖は、ポリエーテル、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ－などのエーテルセグメント、または場合により置換されている直鎖状または分岐状炭化水素を含んでもよい。ＬＱの第１の末端部位は、ＬＡおよびＬＢの第１の末端部位と同じであっても異なっていてもよい。便宜上、ＬＱ、ＬＡおよびＬＢに同じ第１の末端部位を提供すると、ＬＱ、ＬＡおよびＬＢとポリマーの間のカップリング反応を同時に実施することが容易になり得る。
【0044】
指数「ｃ」はＱの組み込み度であり、「ｃ」はポリマー当たりの組成物中のそのようなモノマー単位の平均数を表す。「ｃ」は、約３から約５０までの有限数であり得る。
Ｍは、それぞれの場合において、独立してＨ、プロトン、アルカリイオン、薬学的に許容される一価カチオンを表すか、または存在しない。
Ｍは、それぞれの場合において、独立してＨ、プロトン、アルカリイオン、薬学的に許容される一価カチオンを表すか、または存在しない。
【0045】
指数「ｍ」は、他のいかなる基にも存しないモノマー単位の組み込み度であり、「ｍ」は、ポリマー当たりの組成物中のそのようなモノマー単位の平均数を表す。「ｍ」は、約５０から約７００までの有限数であり得る。
【0046】
一実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、式（Ｖ）：
【0047】
【化5】
【0048】
およびその金属イオン複合体によって記載される。
式（ＩＶ）中の記号と共通する式（Ｖ）中の記号は、同じ意味を有する。
式（ＩＶ）によって記載される実施形態に対して、式（Ｖ）の実施形態は、リンカー基ＬＺを介してＣ末端γ－カルボキシル基でポリマーに結合する蛍光団部分Ｚをさらに含む。
式（ＩＶ）中の記号と共通する式（Ｖ）中の記号は、同じ意味を有する。
式（ＩＶ）によって記載される実施形態に対して、式（Ｖ）の実施形態は、リンカー基ＬＺを介してＣ末端γ－カルボキシル基でポリマーに結合する蛍光団部分Ｚをさらに含む。
【0049】
ＬＺは、共有結合を介して蛍光団部分をポリマー主鎖（ここでは、末端モノマー単位）に結合することができる任意の化学部分である。Ｚがポリマーと直接共有結合を形成できる場合、ＬＺは結合を表す。それ以外の場合、ＬＺは、モノマー単位のカルボキシル基と結合を形成することができる第１の末端部位、およびＺの好適な官能基と結合を形成することができる第２の末端部位を有する二官能性分子を表し、第１の末端部位および第２の末端部位は、３～２０個の原子の鎖を介して互いに接続されている。第１の末端部位は、－Ｏ－、－Ｓ－、または－ＮＨ－であってもよく、それによってエステル、チオエステル、またはポリマーへのアミド結合が形成される。第２の末端部位は、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、または－アシルであってもよい。３～２０個の原子の鎖は、ポリエーテル、－Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２）Ｏ－などのエーテルセグメント、または場合により置換されている直鎖状または分岐状炭化水素を含んでもよい。ＬＺの第１の末端部位およびＬＺの第２の末端部位は、同じであっても異なっていてもよい。便宜上、ＬＡ、ＬＢ、およびＬＱの１つ、一部、またはすべてと同じ第１の末端部位をＬＺに提供すると、ＬＺ、ＬＡ、ＬＢ、およびＬＱの一部またはすべてとポリマーの間のカップリング反応を同時に実施することが容易になり得る。
【0050】
式（Ｖ）には明示されていないが、末端位置での蛍光団部分の組み込み度は、正確に１ではない可能性がある。その代わりに、様々な反応収率の結果として、組み込み度は、約０．８～１．２になる可能性がある。
【0051】
一実施形態では、ポリマーコンジュゲートは、式（ＶＩ）：
【0052】
【化6】
【0053】
およびその金属イオン複合体によって記載される。
式（Ｖ）中の記号と共通する式（ＶＩ）中の記号は、同じ意味を有する。
式（Ｖ）によって記載される実施形態と比較して、式（ＶＩ）の実施形態は同じ成分を含むが、蛍光団部分Ｚが、リンカー基ＬＺを介してペンダントα－カルボキシル基でモノマー単位の１つに結合している。
式（Ｖ）中の記号と共通する式（ＶＩ）中の記号は、同じ意味を有する。
式（Ｖ）によって記載される実施形態と比較して、式（ＶＩ）の実施形態は同じ成分を含むが、蛍光団部分Ｚが、リンカー基ＬＺを介してペンダントα－カルボキシル基でモノマー単位の１つに結合している。
【0054】
指数「ｄ」はＺの組み込み度であり、「ｄ」はポリマー当たりの組成物中のそのようなモノマー単位の平均数を表す。「ｃ」は、約１（１より大きいかまたは小さい）の有限数であり得る。
Ｂ．ポリマーコンジュゲートの成分。
ポリマー主鎖。
Ｂ．ポリマーコンジュゲートの成分。
ポリマー主鎖。
【0055】
様々な部分およびイオンが結合する高分子構造体としての使用が本明細書で企図されるポリマーには、医薬用途に安全である生分解性の非免疫原性ポリマーが含まれる。ポリマーは、官能部分をポリマーに結合させるため、または金属イオンなどのカチオンと相互作用して結合するために使用できるカルボン酸官能基を提供するモノマー単位を含む。
【0056】
一実施形態では、ポリマーは、ペプチド結合によって結合されたモノマー単位を実質的に含む。さらなる実施形態では、モノマー単位は、グルタミン酸の任意の形態から選択される。グルタミン酸の形態は、グルタミン酸のＬ異性体、Ｄ異性体、またはＤＬラセミ体を含む。これらの形態のいずれかを使用してもよく、任意の比率で２種以上の異なる形態をともに使用してもよい。
【0057】
別の実施形態では、グルタミン酸モノマー単位は、α－カルボン酸基またはγ－カルボン酸基のいずれかを介してペプチド結合で結合してもよい。一実施形態では、同じカルボン酸基がポリマー中で繰り返し使用され、α－ポリグルタミン酸（α－ＰＧＡ）またはγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ）の均一なセグメントを含むポリマーが提供される。さらなる実施形態では、ポリマー全体にわたって同じ接続性が見られ、すなわち、ポリマーは、α－ＰＧＡまたはγ－ＰＧＡのホモポリマーであってもよい。α－ＰＧＡおよびγ－ＰＧＡのさまざまな異性体形態は、合成でも天然源由来でもよい。生物は通常、Ｌ異性体からポリ（アミノ酸）を生成するのみであるが、α－ＰＧＡまたはγ－ＰＧＡを生成する特定の細菌酵素は、いずれかの異性体または両方の異性体からポリマーを生成することができる。
【0058】
α－ＰＧＡまたはγ－ＰＧＡからなるものを含むグルタミン酸モノマー単位を含むポリマーは、様々なサイズおよびさまざまなポリマー分散度で提供され得る。ポリマーの分子量は、概して少なくとも約５ｋＤａ、最大で約１００ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、少なくとも約５ｋＤａ、または少なくとも約１０ｋＤａ、または少なくとも約２０ｋＤａ、または少なくとも約３０ｋＤａ、または少なくとも約３５ｋＤａ、または少なくとも約４０ｋＤａ、または少なくとも約５０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの分子量は、最大で約１００ｋＤａ、または最大で約９０ｋＤａ、または最大で約８０ｋＤａ、または最大で約７０ｋＤａ、または最大で約６０ｋＤａである。許容されるポリマー分子量範囲は、上記に示したポリマー分子量値のいずれかから選択することができる。一実施形態では、ポリマーの分子量は、約５ｋＤａ～約５０ｋＤａの範囲内である。一実施形態では、ポリマーの分子量は、約５０ｋＤａ～約１００ｋＤａの範囲内である。一実施形態では、ポリマーの分子量は、約５０ｋＤａである。ポリマーの分子量は、典型的には、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）による測定に基づく数平均分子量（Ｍｎ）として与えられる。上記のポリマー質量は、Ｍｎとして引用され、他の測定技術を使用して、例えば質量（重量）平均分子量（Ｍｗ）を求めることができ、所与の任意のポリマーの仕様を様々なポリマー質量表示の間で変換することができる。
標的化部分。
標的化部分。
【0059】
企図される標的化部分は、葉酸、およびその類似体または誘導体などの葉酸受容体リガンド、ならびにＲＧＤペプチドおよびその類似体または誘導体などのインテグリン標的化ペプチドを含む。
【0060】
葉酸受容体タンパク質は、多くのヒト腫瘍でしばしば発現される。葉酸は本来、葉酸受容体に対して高い親和性を有し、さらに結合すると、葉酸および結合されたコンジュゲートは、エンドサイトーシスによって細胞内に輸送され得る。このようにして、葉酸部分を含むポリマーコンジュゲートは、腫瘍細胞を標的にして蓄積し、金属イオンを腫瘍細胞の近傍および／または内部に送達することができる。
【0061】
Ｎ５、Ｎ１０－ジメチルテトラヒドロ葉酸（ＤＭＴＨＦ）は、葉酸受容体に対して高い親和性を有することも公知である。ＤＭＴＨＦの調製は、Ｌｅａｍｏｎ，Ｃ．Ｐ．ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３，１２００～１２１０に記載されている。さらに、葉酸受容体（ＦＲ）には２つの主要なアイソフォームである、ＦＲ－αおよびＦＲ－βがあり、ＤＭＴＨＦは、ＦＲ－βよりもＦＲ－αに対してより高い親和性を有することが示されている（Ｖａｉｔｉｌｉｎｇａｍ，Ｂ．ら、Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ５３、１１２７～１１３４）。これは、腫瘍細胞を標的化するのに有益であり、なぜならＦＲ－αが多くの悪性細胞型で過剰発現される一方、ＦＲ－βは、炎症性疾患に関連するマクロファージで過剰発現されるからである。したがって、葉酸ベースの標的化部分は、腫瘍細胞またはマクロファージによって発現される葉酸受容体に選択的に結合する手段を提供し得る。
【0062】
同様に、ＲＧＤペプチドは、腫瘍内皮細胞および一部の腫瘍細胞で発現される、α（Ｖ）β（３）インテグリンに強力に結合することが公知である。したがって、ＲＧＤコンジュゲートは、抗腫瘍剤を腫瘍部位に標的化して送達するために使用され得る。細胞表面受容体のインテグリンファミリー、がん、炎症性または自己免疫疾患を含むさまざまな病態におけるその役割、それに結合する天然リガンドおよび類似体またはミメティクス、ならびに結合方法に関するさらなる情報が、最近概説されている（Ｗｕ，ＰＨ．ら、（２０１９）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃａｎｃｅｒｓ １１、１７８３）。
【0063】
ポリマー主鎖への標的化部分の結合に関して、葉酸はモノマー（グルタミン酸モノマー単位など）の遊離カルボン酸基と結合して、両者を結合するアミド結合を形成できる環外アミン基を有する。葉酸と同じ環外アミン基が、ＤＭＴＨＦでアミド結合の形成に利用できる。ＲＧＤコンジュゲートも、当技術分野で周知であり、また同様に、例えばＲＧＤの遊離α－アミノ基を介して遊離カルボン酸基に共有結合することができる。代替的に、いずれかの部分が、例えばポリエチレングリコールアミンなどの連結基（例えば、ＬＡまたはＬＢ）を介してポリマー主鎖に結合してもよい。α－ＰＧＡのγ－カルボン酸炭素基とアミノ基の間の共役反応の例は、Ｂａｉらの米国特許第９，６３６，４１１号に見出され、アミノ基およびヒドロキシル基に関するものは、Ｖａｎらによる米国特許付与前出願公開（ＵＳ Ｐｒｅ－Ｇｒａｎｔ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ）第２００８／０２７９７７８号に見出すことができる。葉酸およびクエン酸を含むγ－ＰＧＡへの共役反応の例は、ＷＯ２０１４／１５５１４２（２０１４年１０月２日公開）に見出すことができる。他の合成スキームは、以下の実施例に提供される。
イオノホア部分。
イオノホア部分。
【0064】
金属イオンに対するイオノホアを含むイオノホア部分は、金属イオンの治療活性を高めるために、金属イオンが細胞の細胞内コンパートメントに入るのを援助することができるリガンドを提供するための手段として、開裂性リンカー基を介してポリマーコンジュゲートに結合することが本明細書において企図される。例示的なイオノホアには、ピリチオンおよび１－ヒドロキシピリジン－２－チオンが含まれ、当業者は他の好適なイオノホアを特定することができる。これらのイオノホアは、イオノホア内の硫黄部分を使用してイオノホア連結基（ＬＱ）のチオール基とジスルフィド結合を形成することができるという有益な特性を有し、イオノホアは遮蔽され、後程まで金属イオンと結合せず、ジスルフィド結合が開裂されると同時にイオノホアが放出され、遮蔽が解除される。別の実施形態では、イオノホア結合部位は、開裂される前に遮蔽されず、イオノホアがポリマーコンジュゲートから開裂される前および開裂される後の両方で、金属イオンと（結合を含めて）相互作用することができる。理論に束縛されるものではないが、これは、金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物が細胞に取り込まれ、その条件がジスルフィドの開裂に有利な場合に起こると考えられている。その結果、金属イオン－イオノホア複合体が形成され得、かつ／またはイオノホアは金属イオンが細胞内コンパートメントに入るのを援助することができる。
標識部分。
標識部分。
【0065】
例えば蛍光団などの検出可能な標識を含む標識部分は、ポリマーコンジュゲート組成物を容易に検出および／または定量化する手段としてポリマーコンジュゲートに結合することが本明細書において企図される。これは、調査研究において特に有用であると考えられる。直接または連結基（ＬＺ）を介して蛍光団をポリマーに容易に結合させることを可能にする官能基を蛍光団構造が含む限り、当業者に公知の任意の標準的な蛍光団を使用することができる。例示的な蛍光団は、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、およびＣｙ７色素を含むシアニン色素、ならびに市販されているこれらの色素の他の類似体および誘導体を含む。色素の特定の選択は、各化合物によって提供される特定の励起および発光波長、または共役反応の準備が整った状態で提供される活性化合成中間体の入手可能性に依存し得る。
金属イオン。
金属イオン。
【0066】
金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物について本明細書で企図される金属イオンには、亜鉛（ＩＩ）イオンおよびカドミウム（ＩＩ）イオンが含まれる。金属イオン塩、例えば、亜鉛（ＩＩ）塩（すなわち、Ｚｎ２＋塩）が組成物を調製するために使用され、対イオン（アニオン）は、医薬品の製造における使用に好適な任意の無機または有機アニオンであり得る。好適なアニオンは、毒性ではないものを含め、人体に許容されるものである。概して、金属イオン塩は、式Ｍ２＋Ｘ２－またはＭ２＋（Ｘ－）２、さらにはＭ２＋（Ｘ－）（Ｙ－）で表すことができ、ここでＭ２＋は、Ｚｎ２＋またはＣｄ２＋であり、Ｘ２－／１－およびＹ２－／１－が好適なアニオンである。アニオンは、ＦＤＡ承認の医薬品の成分であるアニオンの群から選択され得る。いくつかの実施形態では、金属（ＩＩ）塩は、薬学的に許容される金属塩である。亜鉛塩の例としては、塩化亜鉛、硫酸亜鉛、クエン酸亜鉛、酢酸亜鉛、ピコリン酸亜鉛、グルコン酸亜鉛、アミノ酸亜鉛キレート、例えばグリシン酸亜鉛、または当技術分野で公知であり、使用されている他のアミノ酸が挙げられる。カドミウム塩の例としては、塩化カドミウム、硫酸カドミウム、および当技術分野で公知であり、使用されている他の塩が挙げられる。
Ｃ．金属イオン－ポリマーコンジュゲート複合体。
Ｃ．金属イオン－ポリマーコンジュゲート複合体。
【0067】
金属イオン－ポリマーコンジュゲート複合体は、金属イオンを本明細書に記載のポリマーコンジュゲート組成物と組み合わせることによって調製され得る。本発明による複合体中の金属イオンの量は、モノマー単位（「ＭＵ」）に対する金属イオンのモル比、またはポリマーコンジュゲートに対する金属イオンの重量比として表すことができる。１：２、１：５、１：１０、１：２０の範囲のモル比が考えられ、さらに低い比率も可能であるが、その場合には、好適な用量の金属イオンを送達するために必要とされる投与量に含まれるＰＧＡの量が増加する。投与量と非亜鉛成分の量の間の適切なバランスは、当業者によって決定され得る。一実施形態では、この比率は、約１：２から約１：１０のＺｎ：ＭＵの間の任意の値である。別の実施形態では、この比率は、約１：３から約１：６の間の任意の値である。別の実施形態では、この比率は、約１：４．５である。他の実施形態では、金属イオンは、２つの成分の特定の重量比でポリマーコンジュゲートと組み合わされて、金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物を形成する。一実施形態では、金属イオン：ポリマーコンジュゲートの重量比は、約１：５から１：２０の間であり、好ましい一実施形態では、重量比は約１：１０である。
【0068】
金属イオン－ポリマーコンジュゲート複合体は、以下の実施例に開示される方法を含む、水溶性高分子電解質と金属イオン複合体を調製するための当技術分野で公知の技術によって調製することができる。このような複合体は、溶液として調製および保存されてもよく、または凍結乾燥して固体として保存されてもよい。溶液として調製される場合、組成物中に提供される金属イオンの濃度は、概して約１μｇ／ｍＬ～約１００ｍｇ／ｍＬの範囲である。これは、金属イオンの約０．０００１重量％～約１０重量％の範囲に相当する。濃度は少なくとも約１０μｇ／ｍＬ、もしくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、もしくは少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、もしくは少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、もしくは少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬであってもよく、または濃度の範囲は、これらの例示的な濃度のうちの任意の２つの範囲内に収まってもよい。一実施形態では、濃度は約１００μｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。別の実施形態では、濃度は約２００μｇ／ｍＬ～約２ｍｇ／ｍＬの範囲であってもよい。
Ｄ．医薬組成物。
Ｄ．医薬組成物。
【0069】
金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物は、医薬組成物または薬剤を調製するために使用され得る。一実施形態では、医薬組成物または薬剤は、液体剤形として製剤化されてもよい。好適な液体剤形は、溶液、懸濁剤、シロップ剤、および口腔スプレー剤を含む。このような溶液は、経口摂取されるか、または静脈内、皮内、筋肉内、髄腔内もしくは皮下などの注射によって投与されてもよいか、または腫瘍内に直接もしくはその近傍に投与されてもよいが、経口投与には一般に懸濁剤、シロップ剤およびスプレー剤が適切である。別の実施形態では、医薬組成物または薬剤は、液体剤形として投与する前に再構成される凍結乾燥形態として製剤化されてもよい。
【0070】
好ましくは、医薬組成物または薬剤は、対象、特にヒト患者への投与に好適であり、医薬組成物を意図した目的に対して安定で有効である状態にするのに好適である、１種または複数の薬学的に許容される担体、緩衝剤、希釈剤、ビヒクル、賦形剤、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。
【0071】
いくつかの実施形態では、液体剤形は全身送達用に製剤化される。特定の状況では、金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物を、標準的な送達器具を使用して、好適に製剤化された医薬ビヒクルで、非経口的に、例えば、限定されないが、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、経皮、または局所投与することが望ましい場合がある。他の実施形態では、液体剤形は、対象、特にヒト患者の腫瘤を含む体内または体の周囲の１つまたは複数の細胞、組織、または器官に直接注射することによって投与され得る。
【0072】
非経口または経口送達に好適な液体剤形の実施形態は、金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物および水を含む。さらなる実施形態では、液体剤形は、緩衝剤および／または塩化ナトリウムなどの塩をさらに含んでもよい。緩衝剤が含まれる場合、好ましい緩衝剤のｐＨは、約ｐＨ４～約ｐＨ９の範囲である。また、液体剤形のいくつかの実施形態では、溶液は、それが注入される流体と等張であり、好適なｐＨを有する。前述の液体剤形の実施形態のいずれにおいても、溶液は滅菌溶液として調製され得る。このような等張性の緩衝滅菌水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、経皮、真皮下、および／または腹腔内投与に特に好適である。
【0073】
本明細書に開示される医薬組成物は、例えば滅菌水性媒体、緩衝剤、希釈剤を含む１種または複数の薬学的に許容されるビヒクルでの使用に好適な方法で製剤化され得る。例えば、所与の投与量の金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物を特定容量の等張溶液（例えば等張食塩水）に溶解し、次いで、提案された投与部位に注射するか、または静脈内注射に好適なビヒクルでさらに希釈することができる。
【0074】
液体剤形は、バイアル瓶、アンプル、カートリッジ、およびプレフィルドシリンジなどに包装され得る。いくつかの実施形態では、液体剤形は、投与前に希釈されてもよく、かつ／または包装または送達器具から別の送達器具に移されてもよく、例えばバイアル瓶から輸血用器具に移されてもよい。凍結乾燥形態は、バイアル瓶、カートリッジ、好適なシリンジ器具、および凍結乾燥物を液体剤形に再構成することを容易にする他の好適な混合システムに包装することができる。
Ｅ．使用方法
本明細書に記載の医薬組成物は、治療有効量の金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物を提供して、対象において所望の生物学的反応を達成するために投与され得る。治療有効量とは、治療を必要とする患者に送達される金属イオンの量が、金属イオン、ポリマーコンジュゲートに結合した部分またはそこから放出された部分を含むポリマーコンジュゲート、および／または剤形の送達効率などの組み合わされた効果によって、所望の生物学的反応を達成するであろうことを意味する。治療有効量は、治療される適応症および対象の状態によっても異なる可能性がある。
Ｅ．使用方法
本明細書に記載の医薬組成物は、治療有効量の金属イオン－ポリマーコンジュゲート組成物を提供して、対象において所望の生物学的反応を達成するために投与され得る。治療有効量とは、治療を必要とする患者に送達される金属イオンの量が、金属イオン、ポリマーコンジュゲートに結合した部分またはそこから放出された部分を含むポリマーコンジュゲート、および／または剤形の送達効率などの組み合わされた効果によって、所望の生物学的反応を達成するであろうことを意味する。治療有効量は、治療される適応症および対象の状態によっても異なる可能性がある。
【0075】
所望の生物学的反応には、対象、例えば哺乳類、特にヒト（患者とも呼ばれる）における腫瘍もしくはがんの発症または成長の予防、腫瘍もしくはがんの進行の部分的もしくは全体的な予防、遅延もしくは阻害、または腫瘍もしくはがんの再発の予防、遅延または阻害が含まれる。治療法の臨床的利点は、客観的奏効率、腫瘍サイズ、奏効期間、治療失敗までの期間、無増悪生存期間、および臨床使用で評価される他の一次および二次エンドポイントによって評価され得る。
【0076】
ＰＡＲＰ媒介ネクローシスの影響を受けやすいすべての腫瘍タイプまたはマクロファージ媒介炎症性病態は、本明細書に開示される治療方法に従って治療され得る適応症であると考えられる。様々な実施例は、開示された組成物および医薬製剤の実施形態を使用した、開示された方法の実施形態による治療の有効性を実証する。この結果は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマウスがん細胞、ｅｘ ｖｉｖｏでのヒトがん細胞の効果的な治療、および同系マウスがんモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの治療効果を実証する。
【0077】
治療有効量の達成は、製剤の特徴に依存し、各個人の性別、年齢、状態、および遺伝子構造によっても異なる。亜鉛金属複合体の場合、例えば、遺伝的原因または他の吸収不良の原因、または重度の食事制限により亜鉛が不十分な個人は、一般に亜鉛が適切なレベルである個人と比較して、治療効果を得るために異なる量が必要である可能性がある。
【0078】
対象には概して、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日から約６ｍｇ／ｋｇ／日までの量の金属イオンが投与される。いくつかの実施形態では、投与される金属イオン、例えば、亜鉛の量は、約１．０ｍｇ／ｋｇ／日から約４ｍｇ／ｋｇ／日である。複数の剤形を１日に一緒に服用しても別々に服用してもよい。治療は概して、所望の治療効果が達成されるまで継続される。本明細書に記載の組成物および製剤の低投与量レベルは、腫瘍が退縮するかまたは阻害される場合、その再発を予防、遅延、もしくは阻害する目的で、または予防的治療として使用するために、本発明の実施形態による治療として継続することもできる。
【実施例】
【0079】
本発明は、以下の実施例においてさらに定義される。実施例は例示のみを目的として示されており、実施形態は本発明の態様を非限定的に実証することを意図していることを理解されたい。本明細書に開示される説明および実施例から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本開示を適合させるために様々な変更および修正を加えてもなお、同様の製品また結果を得ることができる。結果として、本開示は、本明細書に記載される例示的な実施例によって限定されるものではない。
【0080】
以下では次の略語が使用される。ＡＣＮはアセトニトリルであり、ＤＣＣはＮ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドであり、ＤＩＣは、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミドであり、ＤＩＥＡはＮ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミンであり、ＤＭＳＯはジメチルスルホキシドであり、ＥＤＣは１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドであり、ｅｑｕｉｖ．は当量であり、ＨＢＴＵは２－（１Ｈ－ベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、ＨＯＢｔはヒドロキシベンゾトリアゾールであり、ＭＴＢＥはメチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルであり、ＮＨＳはＮ－ヒドロキシスクシンイミドであり、ＮＬＴは以上であり、ＮＭＴは以下であり、ＴＦＡはトリフルオロ酢酸である。
Ａ．ポリマーコンジュゲートおよびその金属イオン複合体の調製
実施例１：葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２側鎖の調製
葉酸側鎖である、葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
Ａ．ポリマーコンジュゲートおよびその金属イオン複合体の調製
実施例１：葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２側鎖の調製
葉酸側鎖である、葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
【0081】
【化7】
【0082】
Ａ．葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ－Ｂｏｃの合成
ＤＩＣ（５．７２ｇ、２ｅｑｕｉｖ．）を投入したＤＭＳＯ（３５０ｍＬ）／ピリジン（１５０ｍＬ）溶液に葉酸（１０ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を溶解し、２５℃で０．５時間撹拌することによって、１０ｇスケールの合成を実施した。ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解したＢｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２（９．１５ｇ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を添加し、３日間撹拌した。４日目に、追加投入のＤＩＣ（１．４３ｇ、０．５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、撹拌を１日続けた。反応時間の終わりに、γ－異性体：α異性体比は９５：５であることが判明した。ピリジンを４０℃でロータリーエバポレーションにより除去した。残った溶液をＭＴＢＥ（４ｖｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）に注ぎ、次いで上層を除去した。ＭＴＢＥ（２ｖｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）を２回添加して褐色粘着性化合物をスラリー化し、毎回上層を除去した。ＭＴＢＥ（１ｖｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）を添加して橙色粘着性化合物をスラリー化し、次いで上層を除去した。スラリー化プロセスを数回繰り返した結果、粘着性褐色粗生成物は橙色／黄色の固体に変化した。ろ過し、固体をＮ２下で乾燥させた後、粗Ｂｏｃ－葉酸側鎖を橙色から黄色の粉末として得た（１５．１ｇ、粗収率８８％）。生成物を、プロトンＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）によって確認した。２０ｇスケールの他の調製物は、同様の結果をもたらした。
Ｂ．葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２の合成
葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ－Ｂｏｃ（１０．０ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ．）を室温にてトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）で処置し、反応の進行をＨＰＬＣで監視した。４０℃で減圧濃縮することによりＴＦＡを除去し、褐色の粘稠な油を得た。この油を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５カラム（２００ｇ；０．１Ｍ四ホウ酸カリウム（Ｋ２Ｂ４Ｏ７）四水和物で前処理し、Ｈ２Ｏ相に変えた）を使用するイオン交換により精製した。油を水（５ｍＬ）で希釈し、カラムに添加し、１倍量のＨ２Ｏで洗浄し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で溶出した。生成物を含む画分を収集し（推定生成物収率：８１％）、同様に調製した別のバッチと合わせて、約４．２Ｌの重炭酸アンモニウム溶液中に約２．４ｇの粗生成物を得た。この溶液を、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（４０～６３μｍ）（１００ｇ）を使用してさらに精製した。材料をカラムに装填した後、カラムをＨ２Ｏで洗浄し、５倍量の０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏで洗浄することによってｐＨ２に酸性化し、生成物を９：１のＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／ＡＣＮで溶出した。適切な画分を収集し、３５℃で約２００ｍＬに減圧濃縮し、これを凍結乾燥して、葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２（１．９８８ｇ、収率７０％、純度９０．８％）を黄色の綿毛状固体として生成した。
ＤＩＣ（５．７２ｇ、２ｅｑｕｉｖ．）を投入したＤＭＳＯ（３５０ｍＬ）／ピリジン（１５０ｍＬ）溶液に葉酸（１０ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を溶解し、２５℃で０．５時間撹拌することによって、１０ｇスケールの合成を実施した。ＤＭＳＯ（１０ｍＬ）に溶解したＢｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２（９．１５ｇ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を添加し、３日間撹拌した。４日目に、追加投入のＤＩＣ（１．４３ｇ、０．５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、撹拌を１日続けた。反応時間の終わりに、γ－異性体：α異性体比は９５：５であることが判明した。ピリジンを４０℃でロータリーエバポレーションにより除去した。残った溶液をＭＴＢＥ（４ｖｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）に注ぎ、次いで上層を除去した。ＭＴＢＥ（２ｖｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）を２回添加して褐色粘着性化合物をスラリー化し、毎回上層を除去した。ＭＴＢＥ（１ｖｏｌ．ｅｑｕｉｖ．）を添加して橙色粘着性化合物をスラリー化し、次いで上層を除去した。スラリー化プロセスを数回繰り返した結果、粘着性褐色粗生成物は橙色／黄色の固体に変化した。ろ過し、固体をＮ２下で乾燥させた後、粗Ｂｏｃ－葉酸側鎖を橙色から黄色の粉末として得た（１５．１ｇ、粗収率８８％）。生成物を、プロトンＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）によって確認した。２０ｇスケールの他の調製物は、同様の結果をもたらした。
Ｂ．葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２の合成
葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ－Ｂｏｃ（１０．０ｇ、１．０ｅｑｕｉｖ．）を室温にてトリフルオロ酢酸（１００ｍＬ）で処置し、反応の進行をＨＰＬＣで監視した。４０℃で減圧濃縮することによりＴＦＡを除去し、褐色の粘稠な油を得た。この油を、ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ａ－２５カラム（２００ｇ；０．１Ｍ四ホウ酸カリウム（Ｋ２Ｂ４Ｏ７）四水和物で前処理し、Ｈ２Ｏ相に変えた）を使用するイオン交換により精製した。油を水（５ｍＬ）で希釈し、カラムに添加し、１倍量のＨ２Ｏで洗浄し、５０ｍＭ重炭酸アンモニウム溶液で溶出した。生成物を含む画分を収集し（推定生成物収率：８１％）、同様に調製した別のバッチと合わせて、約４．２Ｌの重炭酸アンモニウム溶液中に約２．４ｇの粗生成物を得た。この溶液を、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（４０～６３μｍ）（１００ｇ）を使用してさらに精製した。材料をカラムに装填した後、カラムをＨ２Ｏで洗浄し、５倍量の０．１％ＴＦＡ／Ｈ２Ｏで洗浄することによってｐＨ２に酸性化し、生成物を９：１のＨ２Ｏ（０．１％ＴＦＡ）／ＡＣＮで溶出した。適切な画分を収集し、３５℃で約２００ｍＬに減圧濃縮し、これを凍結乾燥して、葉酸－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＮＨ２（１．９８８ｇ、収率７０％、純度９０．８％）を黄色の綿毛状固体として生成した。
【0083】
生成物を、プロトンＮＭＲ（ｄ６－ＤＭＳＯ）およびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：６５８．２９［Ｍ－Ｈ］＋）によって確認した。
実施例２：ｃＲＧＤｆｋ－（Ｏ）Ｃ－ＰＥＧ４－ＮＨ２側鎖の調製
環状ＲＧＤ側鎖である、ｃＲＧＤｆｋ－（Ｏ）Ｃ－ＰＥＧ４－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
実施例２：ｃＲＧＤｆｋ－（Ｏ）Ｃ－ＰＥＧ４－ＮＨ２側鎖の調製
環状ＲＧＤ側鎖である、ｃＲＧＤｆｋ－（Ｏ）Ｃ－ＰＥＧ４－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
【0084】
【化8】
【0085】
Ａ．Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈの合成
Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）の溶液に、ＮＨ２－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ（５ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＮａＨＣＯ３（４．７４ｇ、３ｅｑｕｉｖ．）を添加した。混合物を０～５℃に冷却し、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の（Ｂｏｃ）２Ｏ（４．９４ｇ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を添加し、得られた混合物を０～５℃で１時間撹拌した。混合物を室温に温め、一晩撹拌した。混濁した溶液を、ＭＴＢＥで抽出した（８０ｍＬ×３）。４２％クエン酸をＮＭＴ１０℃で添加することにより、水層をｐＨ４に酸性化し、次いでＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（８０ｍＬ×３）。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固して、Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ（５．１ｇ、収率７４％）を無色の油として得た。生成物を、プロトンＮＭＲによって確認した。
Ｂ．Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆｋの合成
Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ（１３００ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を室温でＤＭＦ（１２０ｍＬ）に溶解し、次いでＥＤＣ－ＨＣｌ（７００ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）、ＮＨＳ（４３０ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を活性化のために添加した。１時間後、ＤＭＦ（４５ｍＬ）中のｃＲＧＤｆＫ（ＴＦＡ対イオン）（３ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＤＩＰＥＡ（８７０μＬ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を活性化Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ溶液に添加し、一晩撹拌し、次いでＭＴＢＥ（３Ｌ）に添加して生成物を沈殿させた。ろ過し、ろ液を８０ｍＬのＭＴＢＥで洗浄した後、粗生成物Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆＫ（３．２６ｇ、収率８０％）を白色固体として得た。Ｃ－１８ゲル（２０μｍ）（Ｄｉａｓｏｇｅｌ Ｇｒａｄｅ：ＳＰ－１２０－２０－ＯＤＳ－ＢＰ）を使用して、水（２３０ｍＬ）に溶解した粗生成物を装填すること、ならびに移動相ＡおよびＢとして０．１％ＨＣｌ（水溶液）およびＡＣＮ中の０．１％ＨＣｌを使用して、Ｂの画分を０％から１５％まで、次いで２５％まで５％ずつ増加させることによって溶出することによって粗生成物（２．２ｇ）をさらに精製した。適切な画分を収集し、合わせ、溶媒を除去して、生成物Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆＫ（０．６ｇ）を得た。
Ｃ．ｃＲＧＤｆｋ－ＰＥＧ４－ＮＨ２の合成
Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆＫ（０．６ｇ）をＴＦＡ（２ｍＬ）で室温にて１５分間処置することにより脱保護し、ＴＦＡを除去した。粗生成物を水（８０ｍＬ）に溶解し、前述のＢｏｃ保護前駆体の場合と同様にＣ－１８ゲルを使用して精製した、但し、移動相Ｂの画分を０％から１０％まで５％ずつ増加させることによってカラムを溶出したことを除く。適切な画分を収集し、合わせ、溶媒を除去して、生成物ｃＲＧＤｆＫ－ＰＥＧ４－ＮＨ２（０．２２ｇ）を得た。生成物を、プロトンＮＭＲおよびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：８４９．４４［Ｍ－Ｈ］＋）によって確認した。
Ｈ２Ｏ（５０ｍＬ）の溶液に、ＮＨ２－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ（５ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＮａＨＣＯ３（４．７４ｇ、３ｅｑｕｉｖ．）を添加した。混合物を０～５℃に冷却し、ＴＨＦ（５０ｍＬ）中の（Ｂｏｃ）２Ｏ（４．９４ｇ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を添加し、得られた混合物を０～５℃で１時間撹拌した。混合物を室温に温め、一晩撹拌した。混濁した溶液を、ＭＴＢＥで抽出した（８０ｍＬ×３）。４２％クエン酸をＮＭＴ１０℃で添加することにより、水層をｐＨ４に酸性化し、次いでＣＨ２Ｃｌ２で抽出した（８０ｍＬ×３）。合わせた有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥し、蒸発乾固して、Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ（５．１ｇ、収率７４％）を無色の油として得た。生成物を、プロトンＮＭＲによって確認した。
Ｂ．Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆｋの合成
Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ（１３００ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を室温でＤＭＦ（１２０ｍＬ）に溶解し、次いでＥＤＣ－ＨＣｌ（７００ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）、ＮＨＳ（４３０ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を活性化のために添加した。１時間後、ＤＭＦ（４５ｍＬ）中のｃＲＧＤｆＫ（ＴＦＡ対イオン）（３ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）およびＤＩＰＥＡ（８７０μＬ、１．２ｅｑｕｉｖ．）を活性化Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ＣＯ２Ｈ溶液に添加し、一晩撹拌し、次いでＭＴＢＥ（３Ｌ）に添加して生成物を沈殿させた。ろ過し、ろ液を８０ｍＬのＭＴＢＥで洗浄した後、粗生成物Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆＫ（３．２６ｇ、収率８０％）を白色固体として得た。Ｃ－１８ゲル（２０μｍ）（Ｄｉａｓｏｇｅｌ Ｇｒａｄｅ：ＳＰ－１２０－２０－ＯＤＳ－ＢＰ）を使用して、水（２３０ｍＬ）に溶解した粗生成物を装填すること、ならびに移動相ＡおよびＢとして０．１％ＨＣｌ（水溶液）およびＡＣＮ中の０．１％ＨＣｌを使用して、Ｂの画分を０％から１５％まで、次いで２５％まで５％ずつ増加させることによって溶出することによって粗生成物（２．２ｇ）をさらに精製した。適切な画分を収集し、合わせ、溶媒を除去して、生成物Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆＫ（０．６ｇ）を得た。
Ｃ．ｃＲＧＤｆｋ－ＰＥＧ４－ＮＨ２の合成
Ｂｏｃ－ＮＨ－ＰＥＧ４－ｃＲＧＤｆＫ（０．６ｇ）をＴＦＡ（２ｍＬ）で室温にて１５分間処置することにより脱保護し、ＴＦＡを除去した。粗生成物を水（８０ｍＬ）に溶解し、前述のＢｏｃ保護前駆体の場合と同様にＣ－１８ゲルを使用して精製した、但し、移動相Ｂの画分を０％から１０％まで５％ずつ増加させることによってカラムを溶出したことを除く。適切な画分を収集し、合わせ、溶媒を除去して、生成物ｃＲＧＤｆＫ－ＰＥＧ４－ＮＨ２（０．２２ｇ）を得た。生成物を、プロトンＮＭＲおよびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：８４９．４４［Ｍ－Ｈ］＋）によって確認した。
【0086】
実施例３：ピリチオン－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２側鎖の調製
イオノホア側鎖である、Ｐｙｒ－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
イオノホア側鎖である、Ｐｙｒ－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
【0087】
【化9】
【0088】
Ａ．Ｐｙｒ－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃの合成
ジピリチオン（８ｇ、５ｅｑｕｉｖ．）およびＢｏｃ－Ｎ－アミド－ＰＥＧ３－チオール（２ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をメタノール（４００ｍＬ）／酢酸（２５０ｍＬ）溶液に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応完了後、反応混合物を４０℃でロータリーエバポレーションにより蒸発乾固し、白色固体を得た。メタノールを固体に添加し、得られた混合物をろ過した。このケーキは、ジピリチオンであることを確認した。濃縮したろ液を１００ｍＬのＭＴＢＥに添加し、得られた白色沈殿物（ジピリチオン）をろ過により除去した。ＭＴＢＥろ液は、ピリチオンおよび目的生成物を含むことを確認した。ピリチオン－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃを、４０ｇのＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（４０～６３μｍ）を使用して、移動相として水およびＡＣＮを使用して分離および精製し、ＡＣＮを１０％から３０％まで５％ずつ増加させた。適切な画分を収集し、合わせ、溶媒を除去して、ピリチオン－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃ（２．０４ｇ、純度９７．６％）を無色の油として得た。生成物を、ＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ４５７．１［Ｍ＋Ｎａ］＋）によって確認した。
Ｂ．Ｐｙｒ－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２の合成
ピリチオン－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃ（１．８ｇ）を、ＴＦＡ（１５ｍＬ）で室温にて１２分間処置することにより脱保護し、ＴＦＡを４０℃でロータリーエバポレーションによって除去した。粗生成物を水（６ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、粗生成物ピリチオン－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２（３．０ｇ、純度９７％）を透明な淡黒色の油として得た。生成物を、プロトンＮＭＲおよびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：３５５．１［Ｍ＋Ｈ］＋）によって確認した。
ジピリチオン（８ｇ、５ｅｑｕｉｖ．）およびＢｏｃ－Ｎ－アミド－ＰＥＧ３－チオール（２ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をメタノール（４００ｍＬ）／酢酸（２５０ｍＬ）溶液に溶解し、室温で２４時間撹拌した。反応完了後、反応混合物を４０℃でロータリーエバポレーションにより蒸発乾固し、白色固体を得た。メタノールを固体に添加し、得られた混合物をろ過した。このケーキは、ジピリチオンであることを確認した。濃縮したろ液を１００ｍＬのＭＴＢＥに添加し、得られた白色沈殿物（ジピリチオン）をろ過により除去した。ＭＴＢＥろ液は、ピリチオンおよび目的生成物を含むことを確認した。ピリチオン－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃを、４０ｇのＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（４０～６３μｍ）を使用して、移動相として水およびＡＣＮを使用して分離および精製し、ＡＣＮを１０％から３０％まで５％ずつ増加させた。適切な画分を収集し、合わせ、溶媒を除去して、ピリチオン－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃ（２．０４ｇ、純度９７．６％）を無色の油として得た。生成物を、ＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ４５７．１［Ｍ＋Ｎａ］＋）によって確認した。
Ｂ．Ｐｙｒ－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２の合成
ピリチオン－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ－Ｂｏｃ（１．８ｇ）を、ＴＦＡ（１５ｍＬ）で室温にて１２分間処置することにより脱保護し、ＴＦＡを４０℃でロータリーエバポレーションによって除去した。粗生成物を水（６ｍＬ）に溶解し、凍結乾燥して、粗生成物ピリチオン－Ｓ－ＰＥＧ３－ＮＨ２（３．０ｇ、純度９７％）を透明な淡黒色の油として得た。生成物を、プロトンＮＭＲおよびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：３５５．１［Ｍ＋Ｈ］＋）によって確認した。
【0089】
実施例４：Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２側鎖の調製
Ｃｙ５．５側鎖である、Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
Ｃｙ５．５側鎖である、Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２を、以下に示す合成スキームに従って調製した。
【0090】
【化10】
【0091】
Ａ．Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ジアミノヘキサンの合成
１，６－ジアミノヘキサン（２７．８ｇ、５ｅｑｕｉｖ．）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）溶液に、Ｂｏｃ無水物（１０．４５ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）溶液を、ＮＭＴ５℃で滴加した。混合物をＮＭＴ５℃で５０分間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。混合物を真空下８５℃で蒸発乾固した。残渣を１２０ｍＬの１５％Ｎａ２ＣＯ３溶液で洗浄した。Ｈ２Ｏ層を除去した後、３０ｍＬのＤＣＭを添加して、相を分離し、ＤＣＭ層を５２ｍＬの１５％Ｎａ２ＣＯ３溶液で抽出し、５０ｍＬのＨ２Ｏで４回洗浄して、残留１，６－ジアミノヘキサンを除去した。有機層を蒸発乾固して、粗Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキシルジアミン（７．２１ｇ）を淡黄色の油として粗収率７０％で得た。生成物を、プロトンＮＭＲによって確認した。粗生成物（４ｍＬ）を１０ｍＬのＤＣＭに溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、次いで真空下４０℃で蒸発乾固して、所望の生成物を得た。
Ｂ．Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－Ｂｏｃの合成
Ｃｙ５．５－ＣＯ２Ｈ（２．０ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）、Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ジアミノヘキサン塩酸塩（８１６ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）、ＨＢＴＵ（３．６８ｍｇ、３ｅｑｕｉｖ．）、ＨＯＢｔ水和物（１．３１ｇ、３ｅｑｕｉｖ．）およびＤＩＥＡ（８．４ｍＬ、１５ｅｑｕｉｖ．）を４０ｍＬのＤＭＦに溶解した。混合物を室温でＮＬＴ２．５時間撹拌した。ＴＬＣで監視して反応が完了した後、混合物にＤＣＭ（２５ｍＬ）を添加して、Ｈ２Ｏで抽出した（２５ｍＬ×４）。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９／１）で精製して、Ｂｏｃ保護Ｃｙ５．５側鎖（２．９５ｇ、収率１１２％（残留溶媒が過剰分の原因である））を得た。生成物を、プロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）によって確認した。
Ｃ．Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２の合成
５％ＨＣｌ（３７％）の２，２，２，－トリフルオロエタノール溶液（９４ｍＬ）中のＢｏｃ保護Ｃｙ５．５側鎖（２．９５ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を暗所、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣで監視して反応が完了した後、溶媒を蒸発乾固して、粗Ｃｙ５．５側鎖（３．４４ｇ、ＨＰＬＣによる純度９０％）を得た。粗生成物を、移動相ＡおよびＢとして０．１％ＨＣｌ（水溶液）およびＡＣＮ中の０．１％ＨＣｌを使用して、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（４０～６３μｍ）により精製した。粗生成物を、０．１％ＨＣｌを含有する１０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮに溶解し、カラムに注ぎ、Ｂの画分を１０％から６０％まで１０％ずつ増加させることによって溶出した。適切な画分を収集し、合わせ、凍結乾燥して、Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２（１．３３ｇ、収率５１％、純度９９％）を深青色固体として得た。生成物を、プロトンＮＭＲ（メタノール－ｄ４）およびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：６８１．４５［Ｍ＋］）によって確認した。
１，６－ジアミノヘキサン（２７．８ｇ、５ｅｑｕｉｖ．）のＣＨ２Ｃｌ２（２００ｍＬ）溶液に、Ｂｏｃ無水物（１０．４５ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）溶液を、ＮＭＴ５℃で滴加した。混合物をＮＭＴ５℃で５０分間撹拌し、次いで室温で一晩撹拌した。混合物を真空下８５℃で蒸発乾固した。残渣を１２０ｍＬの１５％Ｎａ２ＣＯ３溶液で洗浄した。Ｈ２Ｏ層を除去した後、３０ｍＬのＤＣＭを添加して、相を分離し、ＤＣＭ層を５２ｍＬの１５％Ｎａ２ＣＯ３溶液で抽出し、５０ｍＬのＨ２Ｏで４回洗浄して、残留１，６－ジアミノヘキサンを除去した。有機層を蒸発乾固して、粗Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ヘキシルジアミン（７．２１ｇ）を淡黄色の油として粗収率７０％で得た。生成物を、プロトンＮＭＲによって確認した。粗生成物（４ｍＬ）を１０ｍＬのＤＣＭに溶解し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、次いで真空下４０℃で蒸発乾固して、所望の生成物を得た。
Ｂ．Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ－Ｂｏｃの合成
Ｃｙ５．５－ＣＯ２Ｈ（２．０ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）、Ｎ－Ｂｏｃ－１，６－ジアミノヘキサン塩酸塩（８１６ｍｇ、１ｅｑｕｉｖ．）、ＨＢＴＵ（３．６８ｍｇ、３ｅｑｕｉｖ．）、ＨＯＢｔ水和物（１．３１ｇ、３ｅｑｕｉｖ．）およびＤＩＥＡ（８．４ｍＬ、１５ｅｑｕｉｖ．）を４０ｍＬのＤＭＦに溶解した。混合物を室温でＮＬＴ２．５時間撹拌した。ＴＬＣで監視して反応が完了した後、混合物にＤＣＭ（２５ｍＬ）を添加して、Ｈ２Ｏで抽出した（２５ｍＬ×４）。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過し、蒸発乾固した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ＤＣＭ／ＭｅＯＨ＝９／１）で精製して、Ｂｏｃ保護Ｃｙ５．５側鎖（２．９５ｇ、収率１１２％（残留溶媒が過剰分の原因である））を得た。生成物を、プロトンＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）によって確認した。
Ｃ．Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２の合成
５％ＨＣｌ（３７％）の２，２，２，－トリフルオロエタノール溶液（９４ｍＬ）中のＢｏｃ保護Ｃｙ５．５側鎖（２．９５ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）を暗所、室温で３時間撹拌した。ＴＬＣで監視して反応が完了した後、溶媒を蒸発乾固して、粗Ｃｙ５．５側鎖（３．４４ｇ、ＨＰＬＣによる純度９０％）を得た。粗生成物を、移動相ＡおよびＢとして０．１％ＨＣｌ（水溶液）およびＡＣＮ中の０．１％ＨＣｌを使用して、ＬｉＣｈｒｏｐｒｅｐ ＲＰ－１８（４０～６３μｍ）により精製した。粗生成物を、０．１％ＨＣｌを含有する１０％（ｖ／ｖ）ＡＣＮに溶解し、カラムに注ぎ、Ｂの画分を１０％から６０％まで１０％ずつ増加させることによって溶出した。適切な画分を収集し、合わせ、凍結乾燥して、Ｃｙ５．５－ＮＨ－（ＣＨ２）６－ＮＨ２（１．３３ｇ、収率５１％、純度９９％）を深青色固体として得た。生成物を、プロトンＮＭＲ（メタノール－ｄ４）およびＥＳＩ質量分析法（ｍ／ｚ：６８１．４５［Ｍ＋］）によって確認した。
【0092】
実施例５：γ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）の調製
γ－ＰＧＡのナトリウム塩の溶液を酸性化し、ｎ－プロパノールを使用して遊離酸の沈殿を助けることによって、遊離酸形態のγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）を調製した。
γ－ＰＧＡのナトリウム塩の溶液を酸性化し、ｎ－プロパノールを使用して遊離酸の沈殿を助けることによって、遊離酸形態のγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）を調製した。
【0093】
約３２ｋＤａのＭｗを有するγ－ＰＧＡ－Ｎａ＋（１００ｇ）を水（２００ｍＬ）に溶解し、この溶液をＬＴ１０℃で６ＮのＨＣｌ（約６５ｍＬ）を添加することによって、約ｐＨ３に酸性化した。酸性化した溶液を９９．５％ＥｔＯＨ／ｎ－プロパノール（１：３ｖ／ｖ）溶液（１２００ｍＬ）に５分間にわたって添加し、次いで１０分間撹拌し、白色の粘着性の沈殿物を得た。溶液を注ぎ出し、油状の沈殿物を残した。水（２００ｍＬ）を添加して沈殿物を溶解し、得られた溶液をさらなるワークアップのために２つの部分に分離した。溶液を１０℃未満に保ちながら、６Ｎ ＨＣｌを使用して約２０～２５分間にわたって約ｐＨ２に調整することによって、各部分を酸性化した。次いで、各部分を９９．５％ＥｔＯＨ（１６００ｍＬ）中に室温で５分間にわたって添加し、白色の綿毛状の沈殿物を得た。ろ過、および乾燥後、γ－ＰＧＡ－Ｈ（６１．０ｇ）を白色固体として得た。γ－ＰＧＡ－Ｈは、ＤＭＳＯおよびＨ２Ｏに可溶であった。
【0094】
実施例６：Ｃ０１０Ｄ－Ｚｎの調製
ポリマーコンジュゲートＣ０１０Ｄは、図１に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれピリチオン、葉酸、ｃＲＧＤｆｋ、およびＣｙ５．５部分を有する４つの側鎖を、実施例１～５に記載のように調製し、以下のように使用してＣ０１０Ｄを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（０．７６ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７４ｍｇ、２３ｅｑｕｉｖ．）およびＮＨＳ（４５ｍｇ、２３ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液を室温で４５分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の６ｅｑｕｉｖのＤＩＰＥＡ（側鎖に対して）と合わせた。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は、ピリチオン：５ｅｑｕｉｖ．、葉酸：２ｅｑｕｉｖ．、ｃＲＧＤｆｋ：２ｅｑｕｉｖ．、Ｃｙ５．５：１ｅｑｕｉｖ．であった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を２１時間撹拌した。完了したら、反応物を水（２００ｍＬ）に溶解し、６Ｎ ＮａＯＨ／６Ｎ ＨＣｌでｐＨを４．２から８．８４に調整し、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜でろ過し、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３カセット（０．１１ｍ２、５ｋＤ膜）を使用するタンジェンシャルフローろ過によってＤＭＳＯ除去を含む精製を行い、続いて６回のダイアフィルトレーション（毎回２０００ｍＬのＨ２Ｏを添加）を行い、２２０ｍＬの最終容量を提供した。不純物を再度ろ過によって除去し、ろ液を凍結乾燥して、Ｃ０１０Ｄポリマーコンジュゲート（０．８７４ｇ）を青色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖であるピリチオン：葉酸：ｃＲＧＤｆｋ：Ｃｙ５．５は、３．９６：１．８４：１．７１：１．０９の比率で存在した。
ポリマーコンジュゲートＣ０１０Ｄは、図１に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれピリチオン、葉酸、ｃＲＧＤｆｋ、およびＣｙ５．５部分を有する４つの側鎖を、実施例１～５に記載のように調製し、以下のように使用してＣ０１０Ｄを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（０．７６ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（７４ｍｇ、２３ｅｑｕｉｖ．）およびＮＨＳ（４５ｍｇ、２３ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液を室温で４５分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の６ｅｑｕｉｖのＤＩＰＥＡ（側鎖に対して）と合わせた。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は、ピリチオン：５ｅｑｕｉｖ．、葉酸：２ｅｑｕｉｖ．、ｃＲＧＤｆｋ：２ｅｑｕｉｖ．、Ｃｙ５．５：１ｅｑｕｉｖ．であった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を２１時間撹拌した。完了したら、反応物を水（２００ｍＬ）に溶解し、６Ｎ ＮａＯＨ／６Ｎ ＨＣｌでｐＨを４．２から８．８４に調整し、０．２２μｍのＰＶＤＦ膜でろ過し、次いでＭｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ（登録商標）３カセット（０．１１ｍ２、５ｋＤ膜）を使用するタンジェンシャルフローろ過によってＤＭＳＯ除去を含む精製を行い、続いて６回のダイアフィルトレーション（毎回２０００ｍＬのＨ２Ｏを添加）を行い、２２０ｍＬの最終容量を提供した。不純物を再度ろ過によって除去し、ろ液を凍結乾燥して、Ｃ０１０Ｄポリマーコンジュゲート（０．８７４ｇ）を青色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖であるピリチオン：葉酸：ｃＲＧＤｆｋ：Ｃｙ５．５は、３．９６：１．８４：１．７１：１．０９の比率で存在した。
【0095】
Ｃ０１０Ｄ（２７９ｍｇ、ポリマーコンジュゲートのアッセイ量：７１．６５％）を３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）水溶液（２０ｍＬ）中で硫酸亜鉛七水和物（８８ｍｇ；０．１ｅｑｕｉｖ、ポリマーコンジュゲート当たり）と混合することにより、Ｃ０１０Ｄ－Ｚｎを調製した。この溶液では、亜鉛イオンとＣ０１０Ｄのγ－ＰＧＡ主鎖の間の重量／重量比は１：１０であり、別段に言及しない限り、以下の生物学的試験の実施例の一部においてそのまま使用した。
【0096】
実施例７：Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎの調製
ポリマーコンジュゲートＣ０１０ＤＳは、図２に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれピリチオン、葉酸、ｃＲＧＤｆｋ、およびＣｙ５．５部分を有する４つの側鎖を、実施例１～５に記載のように調製し、以下のように使用してＣ０１０ＤＳを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（０．７６ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１１３ｍｇ、３５ｅｑｕｉｖ．）およびＮＨＳ（６８ｍｇ、３５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液を室温で４５分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の６ｅｑｕｉｖのＤＩＰＥＡ（側鎖に対して）と合わせた。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は、ピリチオン：１０ｅｑｕｉｖ．、葉酸：２ｅｑｕｉｖ．、ｃＲＧＤｆｋ：２ｅｑｕｉｖ．、Ｃｙ５．５：１ｅｑｕｉｖ．であった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を２１時間撹拌した。完了したら、実施例６に記載したのと同じ手順を使用して反応物をワークアップおよび精製し、Ｃ０１０ＤＳポリマーコンジュゲート（０．９ｇ）を青色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖であるピリチオン：葉酸：ｃＲＧＤｆｋ：Ｃｙ５．５は、７．９４：１．８２：１．７０：０．９６の比率で存在した。
ポリマーコンジュゲートＣ０１０ＤＳは、図２に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれピリチオン、葉酸、ｃＲＧＤｆｋ、およびＣｙ５．５部分を有する４つの側鎖を、実施例１～５に記載のように調製し、以下のように使用してＣ０１０ＤＳを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（０．７６ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（５０ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（１１３ｍｇ、３５ｅｑｕｉｖ．）およびＮＨＳ（６８ｍｇ、３５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液を室温で４５分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（１ｍＬ）中の６ｅｑｕｉｖのＤＩＰＥＡ（側鎖に対して）と合わせた。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は、ピリチオン：１０ｅｑｕｉｖ．、葉酸：２ｅｑｕｉｖ．、ｃＲＧＤｆｋ：２ｅｑｕｉｖ．、Ｃｙ５．５：１ｅｑｕｉｖ．であった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を２１時間撹拌した。完了したら、実施例６に記載したのと同じ手順を使用して反応物をワークアップおよび精製し、Ｃ０１０ＤＳポリマーコンジュゲート（０．９ｇ）を青色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖であるピリチオン：葉酸：ｃＲＧＤｆｋ：Ｃｙ５．５は、７．９４：１．８２：１．７０：０．９６の比率で存在した。
【0097】
Ｃ０１０ＤＳ（３０９ｍｇ、ポリマーコンジュゲートのアッセイ量：６４．７７％）を３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）水溶液（２０ｍＬ）中で硫酸亜鉛七水和物（８８ｍｇ；０．１ｅｑｕｉｖ、ポリマーコンジュゲート当たり）と混合することにより、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎを調製した。この溶液では、亜鉛イオンとＣ０１０Ｄのγ－ＰＧＡ主鎖の間の重量／重量比は１：１０であり、別段に言及しない限り、以下の生物学的試験の実施例の一部においてそのまま使用した。
【0098】
実施例８：０１０ＤＳ（Ｐ５０）－Ｚｎの調製
ポリマーコンジュゲート０１０ＤＳ（Ｐ５０）は、図３に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれピリチオン、葉酸、およびｃＲＧＤｆｋ部分を有する３つの側鎖を、実施例１～３、および５に記載のように調製し、以下のように使用して０１０ＤＳを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（３７．１ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（２２５０ｍＬ）、およびＤＩＣ（６．７７ｇ、６５ｅｑｕｉｖ．）、ＮＨＳ（６．１７ｇ、６５ｅｑｕｉｖ．）に溶解し、ＮａＯＨ（２．１４ｇ、６５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液をＮ２下室温で６０分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（４５ｍＬ）に溶解した。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は、ピリチオン：２５ｅｑｕｉｖ．、葉酸：２ｅｑｕｉｖ．、ｃＲＧＤｆｋ：２ｅｑｕｉｖ．であった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を１７．５時間撹拌した。その後、追加の２５ｅｑｕｉｖ．のピリチオン側鎖を添加する第２段階を開始した。１８時間目に、この反応混合物にＤＩＣ（７．８ｇ、γ－ＰＧＡ－Ｈに対して７５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、２０時間目に４５ｍＬのＤＭＳＯ中のピリチオン側鎖（２５ｅｑｕｉｖ．）、２０．５時間目にＮａＯＨ（１８１ｍｇ、５．５ｅｑｕｉｖ．）を添加した。２３時間目に、さらにＮａＯＨ（１８１ｍｇ、５．５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、２４時間目に、ＮＨＳ（７．１２ｇ、７５ｅｑｕｉｖ．）を添加した。２４．４時間の時点で、ピリチオン側鎖は未反応のままであったが、その後反応が開始した。４６時間目に、追加のＮａＯＨ（３５０ｍｇ、１０．６ｅｑｕｉｖ．）を添加し、４７．５時間目に、ピリチオン側鎖共役反応は３７％進行した。１１２．５時間後、側鎖共役反応は９７％進行し、反応を停止した。その後、反応溶液を９２８０ｍＬの水に添加し、６Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。実施例６に記載したのと同じ手順を使用して溶液を精製し、適切にスケール調整し、最後に凍結乾燥して、０１０ＤＳポリマーコンジュゲート（４６．６ｇ）を黄色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖であるピリチオン：葉酸：ｃＲＧＤｆｋは、４７．１０：１．５８：１．９１の比率で存在した。分子量（Ｍｗ）は、４０，０８５と測定した。さらに、ＭＰは３９，６９８、Ｍｎは２５，８７２、Ｍｚは６２，８５２であり、多分散指数は１．５５であった。
ポリマーコンジュゲート０１０ＤＳ（Ｐ５０）は、図３に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれピリチオン、葉酸、およびｃＲＧＤｆｋ部分を有する３つの側鎖を、実施例１～３、および５に記載のように調製し、以下のように使用して０１０ＤＳを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（３７．１ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（２２５０ｍＬ）、およびＤＩＣ（６．７７ｇ、６５ｅｑｕｉｖ．）、ＮＨＳ（６．１７ｇ、６５ｅｑｕｉｖ．）に溶解し、ＮａＯＨ（２．１４ｇ、６５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液をＮ２下室温で６０分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（４５ｍＬ）に溶解した。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は、ピリチオン：２５ｅｑｕｉｖ．、葉酸：２ｅｑｕｉｖ．、ｃＲＧＤｆｋ：２ｅｑｕｉｖ．であった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を１７．５時間撹拌した。その後、追加の２５ｅｑｕｉｖ．のピリチオン側鎖を添加する第２段階を開始した。１８時間目に、この反応混合物にＤＩＣ（７．８ｇ、γ－ＰＧＡ－Ｈに対して７５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、２０時間目に４５ｍＬのＤＭＳＯ中のピリチオン側鎖（２５ｅｑｕｉｖ．）、２０．５時間目にＮａＯＨ（１８１ｍｇ、５．５ｅｑｕｉｖ．）を添加した。２３時間目に、さらにＮａＯＨ（１８１ｍｇ、５．５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、２４時間目に、ＮＨＳ（７．１２ｇ、７５ｅｑｕｉｖ．）を添加した。２４．４時間の時点で、ピリチオン側鎖は未反応のままであったが、その後反応が開始した。４６時間目に、追加のＮａＯＨ（３５０ｍｇ、１０．６ｅｑｕｉｖ．）を添加し、４７．５時間目に、ピリチオン側鎖共役反応は３７％進行した。１１２．５時間後、側鎖共役反応は９７％進行し、反応を停止した。その後、反応溶液を９２８０ｍＬの水に添加し、６Ｎ ＮａＯＨを添加してｐＨを７．０に調整した。実施例６に記載したのと同じ手順を使用して溶液を精製し、適切にスケール調整し、最後に凍結乾燥して、０１０ＤＳポリマーコンジュゲート（４６．６ｇ）を黄色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖であるピリチオン：葉酸：ｃＲＧＤｆｋは、４７．１０：１．５８：１．９１の比率で存在した。分子量（Ｍｗ）は、４０，０８５と測定した。さらに、ＭＰは３９，６９８、Ｍｎは２５，８７２、Ｍｚは６２，８５２であり、多分散指数は１．５５であった。
【0099】
０１０ＤＳ（Ｐ５０）（３６．７ｇ、ポリマーコンジュゲートのアッセイ量：６８．１３％）を水（１８４ｍＬ）中で硫酸亜鉛七水和物（１１ｇ；０．１ｅｑｕｉｖ、ポリマーコンジュゲート当たり）と混合することにより、０１０ＤＳ（Ｐ５０）－Ｚｎを調製した。この溶液を凍結乾燥して、０１０ＤＳ（Ｐ５０）－Ｚｎ（４０．１ｇ）を黄色固体として得た。亜鉛イオンと０１０ＤＳ（Ｐ５０）のγ－ＰＧＡ主鎖の間の重量／重量比は、１：１０であった。
【0100】
実施例９：Ｃ００５Ｄ－Ｚｎ（対照）の調製
ポリマーコンジュゲートＣ００５Ｄは、図４に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれ葉酸、ｃＲＧＤｆｋ、およびＣｙ５．５部分を有する３つの側鎖を、実施例１～２および４～５に記載のように調製し、以下のように使用してＣ００５Ｄを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（５０ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（３５０ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．２ｇ、１５ｅｑｕｉｖ．）およびＮＨＳ（１．９２ｇ、１５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液を室温で６０分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中の６ｅｑｕｉｖのＤＩＰＥＡ（側鎖に対して）と合わせた。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は：葉酸：３ｅｑｕｉｖ．；ｃＲＧＤｆｋ：３ｅｑｕｉｖ．；Ｃｙ５．５：１ｅｑｕｉｖであった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を３０時間撹拌した。完了したら、水（１００ｍＬ）をＤＭＳＯ反応物に添加し、すべての溶媒を凍結乾燥によって除去して、粗生成物Ｃ００５Ｄ（１３０．３４ｇ）を得た。実施例６に記載したのと同じ手順を使用してワークアップおよび精製し、Ｃ０１０ＤＳポリマーコンジュゲート（４２．５６ｇ）を青色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖である葉酸：ｃＲＧＤｆｋ：Ｃｙ５．５は、３．２５：３．１４：０．７９の比率で存在した。
ポリマーコンジュゲートＣ００５Ｄは、図４に示す公称構造を有する。
ポリペプチドポリマーγ－ポリグルタミン酸（γ－ＰＧＡ－Ｈ）、ならびにそれぞれ葉酸、ｃＲＧＤｆｋ、およびＣｙ５．５部分を有する３つの側鎖を、実施例１～２および４～５に記載のように調製し、以下のように使用してＣ００５Ｄを調製した。γ－ＰＧＡ－Ｈ（５０ｇ、１ｅｑｕｉｖ．）をＤＭＳＯ（３５０ｍＬ）に溶解し、ＥＤＣ・ＨＣｌ（３．２ｇ、１５ｅｑｕｉｖ．）およびＮＨＳ（１．９２ｇ、１５ｅｑｕｉｖ．）を添加し、溶液を室温で６０分間撹拌した。各側鎖を、ＤＭＳＯ（５０ｍＬ）中の６ｅｑｕｉｖのＤＩＰＥＡ（側鎖に対して）と合わせた。γ－ＰＧＡ－Ｈに対する各側鎖の公称比率は：葉酸：３ｅｑｕｉｖ．；ｃＲＧＤｆｋ：３ｅｑｕｉｖ．；Ｃｙ５．５：１ｅｑｕｉｖであった。各側鎖を有するＤＭＳＯ溶液を活性化されたγ－ＰＧＡ－Ｈに添加し、側鎖の消費をＨＰＬＣで監視しながら溶液を３０時間撹拌した。完了したら、水（１００ｍＬ）をＤＭＳＯ反応物に添加し、すべての溶媒を凍結乾燥によって除去して、粗生成物Ｃ００５Ｄ（１３０．３４ｇ）を得た。実施例６に記載したのと同じ手順を使用してワークアップおよび精製し、Ｃ０１０ＤＳポリマーコンジュゲート（４２．５６ｇ）を青色固体として得た。各側鎖の組み込み度は、プロトンＮＭＲ（Ｄ２Ｏ／ＤＭＳＯ－ｄ６）によって求めた。γ－ＰＧＡポリマー当たり、側鎖である葉酸：ｃＲＧＤｆｋ：Ｃｙ５．５は、３．２５：３．１４：０．７９の比率で存在した。
【0101】
Ｃ００５Ｄ（１０ｇ、ポリマーコンジュゲートのアッセイ量：７９．１％）を、水（１５ｍＬ）中の硫酸亜鉛七水和物（３．４８ｇ；０．１ｅｑｕｉｖ、ポリマーコンジュゲート当たり）の水溶液（０．２２μｍのＰＶＤＦフィルターで事前にろ過）と混合することにより、Ｃ００５Ｄ－Ｚｎを調製した。１Ｎ ＮａＯＨ（３ｍＬ）および６Ｎ ＨＣｌ（３５０μＬ）を使用して、溶液のｐＨを６．３７に調整した。溶液を凍結乾燥により除去し、Ｃ００５Ｄ（１１．８９ｇ）を青色固体として得た。
【0102】
この固体を、本発明による治療的に活性な金属イオンポリマーコンジュゲート組成物のいくつかの実施形態に対して、生物学的試験のための以下の実施例のいくつかで対照として使用するために、３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７）水溶液に溶解した。この溶液では、別段に言及しない限り、亜鉛イオンとＣ００５Ｄのγ－ＰＧＡ主鎖の間の重量／重量比は１：１０であった。
Ｂ．ポリマーコンジュゲート－金属イオン複合体の生物学的試験
実施例１０：ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験
Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ（実施例７に従って調製）および硫酸亜鉛、Ｚｎ２＋７対Ｐｙｒ１のモル比の硫酸亜鉛－Ｐｙｒナトリウム混合物（７Ｚｎ－１Ｐｙｒ）（Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎペイロードと一致するように）を含む関連する対照群、ならびにＣ００５Ｄ－Ｚｎ（同一の構造および亜鉛含有量からＰｙｒ側鎖修飾を差し引いた陽性対照化合物）（実施例９に従って調製）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を試験した。
Ｂ．ポリマーコンジュゲート－金属イオン複合体の生物学的試験
実施例１０：ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性試験
Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ（実施例７に従って調製）および硫酸亜鉛、Ｚｎ２＋７対Ｐｙｒ１のモル比の硫酸亜鉛－Ｐｙｒナトリウム混合物（７Ｚｎ－１Ｐｙｒ）（Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎペイロードと一致するように）を含む関連する対照群、ならびにＣ００５Ｄ－Ｚｎ（同一の構造および亜鉛含有量からＰｙｒ側鎖修飾を差し引いた陽性対照化合物）（実施例９に従って調製）のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を試験した。
【0103】
各化合物の２４時間ＩＣ５０値を取得する際に乳酸デヒドロゲナーゼ放出アッセイ（ＬＤＨアッセイ）を使用して、４Ｔ１マウスの三重陰性乳がん細胞株に対して、各化合物について２４時間ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性を試験し、比較検討するために亜鉛濃度（μＭ Ｚｎ）単位で表した。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎは、硫酸亜鉛（８０．７μＭ Ｚｎ）またはＣ００５Ｄ－Ｚｎ（２６８．７μＭ Ｚｎ）に対して、２４時間ＩＣ５０が１６．３５μＭ Ｚｎで、著しく高い効力を示した。７Ｚｎ－１Ｐｙｒは、試験した濃度範囲（１２．１μＭ Ｚｎ～３００μＭ Ｚｎ）では細胞毒性反応を示さなかった（図５Ａ）。
【0104】
アネキシンＶ（Ａ５）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）マーカーを使用したフローサイトメトリー分析を実施して、３時間処置後（図５Ｃ）、またはそれ以上経過した２４時間ＩＣ５０を超える過剰濃度（図５Ｂ）での、２４時間ＩＣ５０で定義された濃度勾配付近で観察された細胞毒性効果のｉｎ ｖｉｔｒｏアポトーシス／ネクローシス細胞死の特徴を比較した。７Ｚｎ－１Ｐｙｒは、細胞毒性がなく、２４時間ＩＣ５０値を導き出すことができなかったため、試験から除外した。時間分解試験での処置は、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ（５０μＭ Ｚｎ）および硫酸亜鉛（４５０μＭ Ｚｎ）群が治療後１．５時間で主にＰＩ＋Ａ５＋および軽度のＰＩ＋のみのネクローシス細胞死を誘導したのに対し、Ｃ００５Ｄ－Ｚｎ（６００μＭ Ｚｎ）が処置の３時間後に同様のネクローシス細胞死を示したことを示した。Ａ５＋のみのアポトーシス死反応は、いずれの試験群、またはいずれの時点でも観察されなかった。３時間処置後の濃度分解試験では、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ、Ｃ００５Ｄ－Ｚｎ、および硫酸亜鉛が、Ａ５＋のみのアポトーシス細胞死において顕著な増加はなく、濃度依存的にＰＩ＋のみまたはＰＩ＋Ａ５＋のネクローシス細胞死をそれぞれ最大７７％、６２％、２６％誘導したことが示された。また、ＰＩ＋Ａ５＋とＰＩ＋のみのネクローシスの割合は、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ群で最も高く（５７％対３０％）、硫酸亜鉛群で最も低い（４％対１８％）ことが判明した。まとめると、これらの細胞毒性試験は、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎが、４Ｔ１細胞に対する所定の亜鉛含有量当たりのＰＩ＋Ａ５＋ネクローシス細胞死の最も強力かつ効率的な誘導物質であることを実証した。
【0105】
実施例１１：ｉｎ ｖｉｔｒｏ作用機序試験
ＰＩおよびＡ５の同時取り込みを特徴とする細胞毒性に加えて、Ｆａｔｏｋｕｎらは、ＰＡＲＰ依存性のＡＩＦの核移行およびその後の大量のＤＮＡ切断の生成が、パータナトスの顕著な特徴であると以前に定義していた（Ｐａｒｔｈａｎａｔｏｓ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７１、２０００～２０１６（２０１４））。観察された亜鉛化合物によるＰＩ＋Ａ５＋ネクローシス性４Ｔ１細胞死（図５Ｂおよび５Ｃ）が、これらの特徴を伴うか否かを調査するために、１．５時間処置後の共焦点顕微鏡法試験を実施し、強力なＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２阻害剤ＰＪ３４との共インキュベートの際の抗ＡＩＦ、ＴＵＮＥＬ、およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ）ＤＮＡ染色の蛍光プローブを使用したＰＡＲＰ依存性細胞毒性、ＡＩＦの核移行、およびＤＮＡ切断の発生を評価した。しかしながら、この試験中にＰＡＲポリマーに対する十分に感度の高い蛍光プローブが入手できなかったため、ＰＡＲポリマー含量の評価をこの実験に組み込むことができなかった。また、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置群で観察された広範な細胞毒性変化のため、これ以上長い処置時間をこの実験に適用することはできなかった。
ＰＩおよびＡ５の同時取り込みを特徴とする細胞毒性に加えて、Ｆａｔｏｋｕｎらは、ＰＡＲＰ依存性のＡＩＦの核移行およびその後の大量のＤＮＡ切断の生成が、パータナトスの顕著な特徴であると以前に定義していた（Ｐａｒｔｈａｎａｔｏｓ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ－ｌｉｎｋｅｄ ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ．Ｂｒｉｔｉｓｈ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ １７１、２０００～２０１６（２０１４））。観察された亜鉛化合物によるＰＩ＋Ａ５＋ネクローシス性４Ｔ１細胞死（図５Ｂおよび５Ｃ）が、これらの特徴を伴うか否かを調査するために、１．５時間処置後の共焦点顕微鏡法試験を実施し、強力なＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２阻害剤ＰＪ３４との共インキュベートの際の抗ＡＩＦ、ＴＵＮＥＬ、およびＨｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｈｏｅｃｈｓｔ）ＤＮＡ染色の蛍光プローブを使用したＰＡＲＰ依存性細胞毒性、ＡＩＦの核移行、およびＤＮＡ切断の発生を評価した。しかしながら、この試験中にＰＡＲポリマーに対する十分に感度の高い蛍光プローブが入手できなかったため、ＰＡＲポリマー含量の評価をこの実験に組み込むことができなかった。また、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置群で観察された広範な細胞毒性変化のため、これ以上長い処置時間をこの実験に適用することはできなかった。
【0106】
１．５時間処置後、硫酸亜鉛およびＣ００５Ｄ－Ｚｎ処置は、試験したすべての濃度にわたって顕著な細胞剥離を引き起こさなかったが、より高濃度の処置における細胞形態は、細胞毒性変化を示した。しかしながら、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置では、６０μＭ Ｚｎ処置群で細胞が完全に消失し、１５μＭ Ｚｎ処置群でさえ広範囲の細胞剥離が起こった。０．５μＭ ＰＪ３４（選択的ＰＡＲＰ１およびＰＡＲＰ２阻害剤）との共処置は、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ １５μＭ Ｚｎ群では細胞剥離を有意に軽減したが、６０μＭ Ｚｎ治療群では保護効果を示さなかった（図６Ｂ）。
【0107】
その後の平均核ＡＩＦシグナルおよび平均核ＴＵＮＥＬシグナルの定量的画像解析は、それぞれＡＩＦの核移行の程度、および結果として生じる検出された核におけるＤＮＡ損傷を表しており、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎが１５μＭ Ｚｎで有意にＡＩＦの核移行および大量のＤＮＡ損傷の誘導を引き起こしたことを示し、これはＰＪ３４共処置によって阻害された。Ｃ００５Ｄ－Ｚｎ処置群において、同様であるが、有意に少ない傾向が見られた。一方、硫酸亜鉛処置は、有意に高いＡＩＦの核移行もＤＮＡ損傷も誘発しなかった。
【0108】
Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎの細胞毒性で観察されたＰＡＲＰ酵素の関与をさらに検証するために、市販のＥＬＩＳＡキットを使用してＰＡＲポリマーの定量化を実施し、２４時間のＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ処置４Ｔ１細胞におけるＰＡＲＰ酵素の活動亢進を示すＰＡＲポリマーの用量依存的な蓄積が実際に生じたことを観察した（図５Ｄ）。
【0109】
これらの観察は、Ｆａｔｏｋｕｎらによって規定されたパータナトスの細胞死の特徴と一致しているため、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎは、試験した硫酸亜鉛、Ｃ００５Ｄ－Ｚｎ、または他の対照物質よりも著しく強力なパータナトスの誘導物質であることが一括して証明された。
【0110】
実施例１２：患者由来の固形腫瘍に対するｅｘ ｖｉｖｏスクリーニング
より広範な種類の固形がんに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ薬理活性の適用性および一貫性を明らかにするために、Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｐｈｅｎｏｖｉｓｔａの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の腫瘍断片を使用した画像ベースのｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性スクリーニングサービスプラットフォームを採用した。三重陰性乳がん（ＢｒＣ－ＴＮＢＣ）、非三重陰性乳がん（ＢｒＣ－ｎｏｎＴＮＢＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん（ＯＶＣ）、膵臓がん（Ｐａｎｃ）、前立腺がん（ＰｒＣ）を含む８種類のがんおよび肉腫の５３個のＰＤＸモデルを選択した。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎは、０．０７μｇ Ｚｎ／ｍＬから１．９１μｇ Ｚｎ／ｍＬの範囲のＩＣ５０値で試験した５３のモデルすべてに対して細胞毒性を示し、卵巣がんでは統計的に有意ではないものの、他の種類のがんよりも高い平均ＩＣ５０値を示した（図７Ａ）。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ ＩＣ５０値と各モデルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）スコアの間に統計的に有意な相関関係はやはり見出されなかったが、これは、ＤＮＡ損傷媒介ＰＡＲＰ活性化がパータナトス誘導における最初の重要なステップであるという従来の見解にもかかわらず（上記、Ｆａｔｕｋｕｎらを参照）、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎの細胞毒性が、標的モデルの先天的な遺伝子変異量に依存しなかったことを示している（図７Ｂ）。
より広範な種類の固形がんに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ薬理活性の適用性および一貫性を明らかにするために、Ｃｈａｍｐｉｏｎｓ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ／Ｐｈｅｎｏｖｉｓｔａの患者由来異種移植片（ＰＤＸ）の腫瘍断片を使用した画像ベースのｅｘ ｖｉｖｏ細胞毒性スクリーニングサービスプラットフォームを採用した。三重陰性乳がん（ＢｒＣ－ＴＮＢＣ）、非三重陰性乳がん（ＢｒＣ－ｎｏｎＴＮＢＣ）、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、卵巣がん（ＯＶＣ）、膵臓がん（Ｐａｎｃ）、前立腺がん（ＰｒＣ）を含む８種類のがんおよび肉腫の５３個のＰＤＸモデルを選択した。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎは、０．０７μｇ Ｚｎ／ｍＬから１．９１μｇ Ｚｎ／ｍＬの範囲のＩＣ５０値で試験した５３のモデルすべてに対して細胞毒性を示し、卵巣がんでは統計的に有意ではないものの、他の種類のがんよりも高い平均ＩＣ５０値を示した（図７Ａ）。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ ＩＣ５０値と各モデルの腫瘍遺伝子変異量（ＴＭＢ）またはマイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）スコアの間に統計的に有意な相関関係はやはり見出されなかったが、これは、ＤＮＡ損傷媒介ＰＡＲＰ活性化がパータナトス誘導における最初の重要なステップであるという従来の見解にもかかわらず（上記、Ｆａｔｕｋｕｎらを参照）、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎの細胞毒性が、標的モデルの先天的な遺伝子変異量に依存しなかったことを示している（図７Ｂ）。
【0111】
アポトーシスを誘導する１０％ＤＭＳＯ陽性対照処置群と最高用量のＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置群の間で、腫瘍断片中の二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断の指標であるγＨ２ＡＸレベルを比較評価したところ、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎが、試験した最も高いＩＣ５０値を有するモデルにおいてさえ、アポトーシス陽性対照よりも著しく多くのｄｓＤＮＡ切断を誘導したことが示された（図７Ｃ）。１０％ＤＭＳＯ陽性対照処置に対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置によるこの特徴的な大量のｄｓＤＮＡ切断の誘導は、試験した５３個のｅｘ ｖｉｖｏＰＤＸモデルのうち５０個でさらに観察され、これは様々な種類の固形がんにおけるその薬理作用の高い一貫性を示している（図８）。
【0112】
実施例１３：Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置に対するｉｎ ｖｉｖｏ治療反応
次に、免疫原性同系がんモデルＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃおよび免疫抑制性同系がんモデル４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの静脈内（ｉｖ）投与のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を試験した。簡潔に言えば、ＣＴ２６は広範に使用される免疫原性マウス結腸直腸がんモデルであり、抗ＰＤ１処置に対する応答細胞である。一方、４Ｔ１は、抗ＰＤ１処置に応答しない、広範に使用される免疫抑制性三重陰性乳がんモデルである（Ｋｉｍ，Ｋら、Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｏｕｓｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１、１１７７４～１１７７９（２０１４））。
次に、免疫原性同系がんモデルＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃおよび免疫抑制性同系がんモデル４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの静脈内（ｉｖ）投与のｉｎ ｖｉｖｏ治療効果を試験した。簡潔に言えば、ＣＴ２６は広範に使用される免疫原性マウス結腸直腸がんモデルであり、抗ＰＤ１処置に対する応答細胞である。一方、４Ｔ１は、抗ＰＤ１処置に応答しない、広範に使用される免疫抑制性三重陰性乳がんモデルである（Ｋｉｍ，Ｋら、Ｅｒａｄｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｏｕｓｅ ｃａｎｃｅｒｓ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｏ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｂｌｏｃｋａｄｅ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｙｅｌｏｉｄ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃｅｌｌｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１、１１７７４～１１７７９（２０１４））。
【0113】
４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルを標的とした最初の試行錯誤の結果、観察可能な治療効果を生み出すには、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎを２ｍｇ Ｚｎ／Ｋｇの各注射用量で、１日２回静脈内投与する必要があることを発見した。無処置動物でのパイロット試験中に、５０％＋の腫瘍表面潰瘍形成の問題に頻繁に遭遇したが、一般毒性の定義（下記参照）を満たす毒性の兆候は、最終試験中に観察されなかった（図９Ａ）。ビヒクル対照群（ｐＨ７で３０ｍＭ ＨＥＰＥＳ）では、腫瘍潰瘍形成が急速に発生したため、腫瘍増殖速度の直接比較は困難であったが、エンドポイントの腫瘍微小環境（ＴＭＥ）免疫細胞分析により、１日２回の２ｍｇ Ｚｎ／ＫｇのＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの注射が、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、グランザイムＢ＋樹状細胞（ＧＢ＋ＤＣ）、およびマクロファージの免疫コンパートメントの著しい拡大を引き起こすことが明らかになった。特にマクロファージコンパートメントでは、抗腫瘍Ｍ１様マクロファージの割合が有意に増加した（対照群の７％に対して２５％、ｐ＜０．０５）が、一方で前腫瘍Ｍ２様マクロファージの割合は抑制された（対照群の３５％に対して１８％、ｐ＜０．００５）（図９Ａ）。より少ない量または頻度でのＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ投与、例えば、１日１回１ｍｇ Ｚｎ／Ｋｇの静脈内注射では、そのような結果は生じなかった。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置は忍容性が良好であり、動物の体重は安定したままであった。
【0114】
ＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃモデルに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ静脈内投与処置は、腫瘍増殖およびエンドポイントのＴＭＥ免疫細胞分析の両方において、より顕著で用量依存的な応答を生成した。一般毒性の定義を満たす毒性の兆候は、試験中に観察されなかった（図９Ｂ）。ＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃモデルは、１日１回および２回の注射レジメンの両方で腫瘍増殖の減少を示したが、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルとは異なり、有意な免疫応答開始効果は、ＣＤ８Ｔ細胞コンパートメントに限定されていた（図９Ｂ）。Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置は忍容性が良好であり、動物の体重は安定したままであった。
【0115】
興味深いことに、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルとＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃ対照モデルの間のエンドポイント腫瘍免疫プロファイルを比較すると、Ｔ細胞（４Ｔ１では１Ｅ＋３であるのに対してＣＴ２６では９Ｅ＋３）、ＣＤ１１ｂ＋骨髄細胞（４Ｔ１では１Ｅ＋４であるのに対してＣＴ２６では４Ｅ＋４）、およびＭ１マクロファージレベル（４Ｔ１ではＣＤ１１ｂ＋細胞の５％であるのに対してＣＴ２６ではＣＤ１１ｂ＋細胞の１１％）は、ＣＴ２６モデルと比較して４Ｔ１モデルで顕著に抑制されたことが観察された。一方、４Ｔ１およびＣＴ２６の１日２回のＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置群間の同様の比較では、Ｔ細胞（４Ｔ１では８Ｅ＋３であるのに対してＣＴ２６では２Ｅ＋４）、およびＣＤ１１ｂ＋細胞（４Ｔ１では４Ｅ＋４であるのに対してＣＴ２６では５Ｅ＋４）における２つの腫瘍モデルの免疫組成間の差が小さいことが示された。４Ｔ１モデルとＣＴ２６モデルにおける処置後のＭ２様マクロファージレベルは、１８％および１５％で同様であった。まとめると、これらの観察は、１日２回のＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置の抗腫瘍免疫開始効果が、４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルおよびＣＴ２６－Ｂａｌｂ／ｃモデルの腫瘍抑制免疫コンパートメントにおいてより顕著であることを示した。
全体的な毒性。
全体的な毒性。
【0116】
０日目から動物を毎日観察し、デジタルスケールを使用して週に３回体重を測定し、個体および平均のグラム重量、０日目に対する体重変化の平均パーセント（％ｖＤ０）を含むデータを各群について記録し、試験完了時に％ｖＤ０をプロットした。０日目と比較した場合に１０％以上の体重減少を示した動物には、存在する場合、ＤｉｅｔＧｅｌ（商標）（ＣｌｅａｒＨ２Ｏ（登録商標）、メイン州、Ｗｅｓｔｂｒｏｏｋ）を随意に与えた。動物の死亡があった場合は記録した。％ｖＤ０が２０％超および／または１０％超の死亡率の平均損失を報告した群は、評価されたレジメンにおけるその処置の最大耐用量（ＭＴＤ）を超えているとみなされた。追加の毒性試験エンドポイントは、瀕死状態であることが判明したマウス、または７日間続く期間で２０％超の正味体重減少を示したマウス、またはマウスが３０％超の正味体重減少を示した場合であった。各処置群の最大平均％ｖＤ０（体重の最低点）は、試験完了時に報告した。
【0117】
実施例１４：低用量でのＣ０１０ＤＳ－Ｚｎのマクロファージ除去効果
４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルにおいて抗腫瘍免疫応答開始を引き起こすには、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎを使用した１日２回の静脈内処置が必要であるという観察は、静脈内注射されたＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの薬物動態プロファイルを試験することを本発明者らに促した（図１０Ａ）。非腫瘍担持スプラーグドーリーラットにＣ０１０ＤＳ－Ｚｎを単回ボーラス静脈内注射した後のラット内ＰＫプロファイルの評価は、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎによって注射された亜鉛の一部のみが、Ｔｍａｘ２時間の血液の無細胞血漿コンパートメントに見出されたことを明らかにし、これは、単核食細胞系（ＭＰＳ）による注射されたＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの急速な全身クリアランスを示している（Ｓｏｎｇ，ｇ．ら、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｖ．１０、２２～３４（２０１４））。ＭＰＳは、主に肝臓および脾臓のマクロファージからなるため、この観察は、マクロファージに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの直接的な細胞毒性相互作用の可能性を示唆した。
４Ｔ１－Ｂａｌｂ／ｃモデルにおいて抗腫瘍免疫応答開始を引き起こすには、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎを使用した１日２回の静脈内処置が必要であるという観察は、静脈内注射されたＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの薬物動態プロファイルを試験することを本発明者らに促した（図１０Ａ）。非腫瘍担持スプラーグドーリーラットにＣ０１０ＤＳ－Ｚｎを単回ボーラス静脈内注射した後のラット内ＰＫプロファイルの評価は、Ｃ０１０ＤＳ－Ｚｎによって注射された亜鉛の一部のみが、Ｔｍａｘ２時間の血液の無細胞血漿コンパートメントに見出されたことを明らかにし、これは、単核食細胞系（ＭＰＳ）による注射されたＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの急速な全身クリアランスを示している（Ｓｏｎｇ，ｇ．ら、Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｐｈａｇｏｃｙｔｅ ｓｙｓｔｅｍ：ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｃｕｒｒ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．Ｒｅｖ．１０、２２～３４（２０１４））。ＭＰＳは、主に肝臓および脾臓のマクロファージからなるため、この観察は、マクロファージに対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの直接的な細胞毒性相互作用の可能性を示唆した。
【0118】
Ｃ０１０ＤＳ－ＺｎがＴＭＥ内の生きたマクロファージを直接減少させることができるかどうかを評価するために、抗腫瘍活性または免疫開始効果を生じない低用量で、生きたＴＭＥマクロファージ集団に対するＣ０１０ＤＳ－Ｚｎの効果を試験することを決定した。また、４Ｔ１がんモデルは、初期の免疫抑制状態から、後期の転移を促進するＭ２様マクロファージが豊富な状態へのＴＭＥ免疫転移を起こすことが報告されているため、処置後１３日目および処置後１６日目のＴＭＥ免疫の特性を明らかにすることを決定した（Ｓｔｅｅｎｂｒｕｇｇｅ， Ｊ．，ら、Ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｙ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｐｒｏｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｉｎ ａｎ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｉｎｔｒａｄｕｃｔａｌ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ．Ｊ． Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．３７、１９１（２０１８）； Ｙａｎｇ， Ｙ．，ら、Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃａｎｃｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｍ２－ｌｉｋｅ ｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．５０３、４１４～４１９（２０１８）．）。以前の報告と一致して、１３日目に収集された４Ｔ１腫瘍は、Ｔ細胞およびＭ１様およびＭ２様タイプの両方のマクロファージ含有量が大幅に抑制されていることを特徴とした。これらの動物では、一般毒性の定義（実施例１３を参照）を満たす毒性の兆候は、試験中に観察されなかった（図１０Ｂ）。それに対して、１６日目に採取されたものには、大幅に増加した量のマクロファージが含まれており（１３日目の腫瘍では１Ｅ＋２であったのに対し、１６日目の腫瘍では１．３Ｅ＋５）、これは主に、活発な炎症を示唆するＭ２様マクロファージ集団の拡大、およびＴ細胞含有量の大幅な拡大によるものである（図１０Ｂおよび図１０Ｃ）。１６日目に屠殺された動物の多くは、試験の終わりに向けて５０％＋の腫瘍表面潰瘍形成を発生したため、１６日目より前に瀕死と断定した。低用量のＣ０１０ＤＳ－Ｚｎをそれぞれ２ｍｇのＺｎ／Ｋｇの１日１回の静脈内注射、または１ｍｇのＺｎ／Ｋｇの１日２回の注射で処置した場合、この処置により１３日目および１６日目の両方の処置マウスで、ＴＭＥ中のマクロファージ含有量が有意に減少した。特に、１６日目の処置群では、２ｍｇ Ｚｎ／Ｋｇを１日１回投与するとＭ２様マクロファージが優先的に減少したが、１ｍｇ Ｚｎ／Ｋｇを１日２回投与すると、Ｍ１様およびＭ２様マクロファージの両方が顕著に減少した。また、１６日目のマウスの両方のＣ０１０ＤＳ－Ｚｎ処置群は、ＴＭＥ中のＴ細胞含有量のレベルの顕著な減少を示し、炎症の減少を示唆した（図１０Ｃ）。
【0119】
前述の開示において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、別段に記載がない限り、または文脈が別段に必要としない限り、複数の指示対象を含む。したがって、これらの冠詞は、文脈によってこれらの用語の全範囲が除外されない限り、「１つ」、「１つまたは複数」、または「１つまたは１つより多くの」を意味する場合がある。代替物が「または」という用語で導入されている場合、代替物が相互に排他的な選択肢でない限り、「または」という用語は「および／または」という意味を含むものとして読まれるべきである。本開示では「および／または」という用語が使用され得るが、これは強調のために使用されており、「または」が単に選言的なものとして読まれるべきであることを含意するものではない。
【0120】
本発明は、特定の実施形態および実施例に関して本明細書に開示されているが、本発明は、その精神または本質的な特徴から逸脱することなく、他の特定の形態で具現化することができる。したがって、説明および図面は例示としてみなされるべきであり、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。本発明の範囲は特許請求の範囲によって決定され、特許請求の範囲内に含まれるすべての適切な変更および等価物が本発明に包含される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【国際調査報告】