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特表2024-510328７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡからウルソデオキシコール酸への変換率を向上させるルミノコッカスグナバス株由来の７β－ＨＳＤＨの変異体及びこれを用いたウルソデオキシコール酸の製造方法

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-06

(54)【発明の名称】７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡからウルソデオキシコール酸への変換率を向上させるルミノコッカスグナバス株由来の７β－ＨＳＤＨの変異体及びこれを用いたウルソデオキシコール酸の製造方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/53 20060101AFI20240228BHJP

C12N 9/04 20060101ALI20240228BHJP

C12N 15/31 20060101ALI20240228BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240228BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240228BHJP

C12P 7/42 20060101ALI20240228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53

C12N9/04 Z ZNA

C12N15/31

C12N15/63 Z

C12N1/21

C12P7/42

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023557700

(86)(22)【出願日】2022-10-20

(85)【翻訳文提出日】2023-09-19

(86)【国際出願番号】 KR2022016088

(87)【国際公開番号】W WO2023075295

(87)【国際公開日】2023-05-04

(31)【優先権主張番号】10-2021-0142625

(32)【優先日】2021-10-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523357131

【氏名又は名称】エイスバイオファーマカンパニーリミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＣＥＢＩＯＰＨＡＲＭＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】４１Ｄｏｎｇｓａｎ－ｒｏ８－ｇｉｌＳｅｏｃｈｏ－ｇｕＳｅｏｕｌ０６７８４（ＫＲ）

(74)【代理人】

【識別番号】110001139

【氏名又は名称】ＳＫ弁理士法人

(74)【代理人】

【識別番号】100130328

【弁理士】

【氏名又は名称】奥野彰彦

(74)【代理人】

【識別番号】100130672

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤寛之

(72)【発明者】

【氏名】ミン、ビョンギュ

(72)【発明者】

【氏名】ジャン、ヒョンウク

(72)【発明者】

【氏名】パク、ジェボム

(72)【発明者】

【氏名】キム、ソヨン

(72)【発明者】

【氏名】ソン、ミンジョン

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AD07

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA20

4B065AA01Y

4B065AA26X

4B065AB01

4B065AC14

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA10

4B065CA60

(57)【要約】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させるルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）の変異体及びこれを用いたウルソデオキシコール酸の製造方法に関する。本発明では、酵素改良による変異体の製造及び組換えタンパク質生産の開発を通じて、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換効率を向上させたところ、ＵＤＣＡ生合成及び生合成効率の向上のために広く活用できるものと期待される。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）のアミノ酸配列変異を含む、７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体であって、
前記アミノ酸配列変異は、
１）Ｍ２０７Ｘ_１、
２）Ｔ２１０Ｘ_２、及び
３）Ｑ２１２Ｘ_３
からなる群から選択されるいずれか一つ以上の変異を含み、
Ｘ_１はメチオニン（Ｍ）以外のアミノ酸を表し、
Ｘ_２はトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を表し、
Ｘ_３はグルタミン（Ｑ）以外のアミノ酸を表す、
７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体。

【請求項2】

前記７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に対応する配列モチーフに少なくとも１つの突然変異を付加的に有する、
請求項１に記載の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体。

【請求項3】

前記突然変異は、配列番号１の２０７～２１２の配列モチーフがＶＭＫＩＡＬである、
請求項２に記載の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体。

【請求項4】

前記ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）は、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）を基質として認識し、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡの７番目の炭素において立体特異的な酵素的還元の触媒作用を誘導する、
請求項１に記載の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体。

【請求項5】

前記アミノ酸配列変異は、
４）Ｄ２５２Ｘ_４を付加的に有し、
Ｘ_４がアスパラギン酸（Ｄ）以外のアミノ酸を表す、
請求項１に記載の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体。

【請求項6】

請求項１～請求項５のいずれか１項に記載の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体を含む、組換えベクター。

【請求項7】

前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる、請求項６に記載の組換えベクター。

【請求項8】

前記変異体は、配列番号２の塩基配列からなる、請求項６に記載の組換えベクター。

【請求項9】

前記組換えベクターは、Ｔａｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及びカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含む、請求項６に記載の組換えベクター。

【請求項10】

請求項６に記載の組換えベクターで形質転換された細胞。

【請求項11】

前記細胞は、組換えベクターを大腸菌に導入して形質転換された、請求項１０に記載の細胞。

【請求項12】

受託番号ＫＣＴＣ１４７１５ＢＰで寄託されたものである、請求項１１に記載の細胞。

【請求項13】

酵素の基質結合部位が変異した７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）により７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）をウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）に変換させるステップを含む、
７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる、
ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）の製造方法。

【請求項14】

前記酵素の基質結合部位は、７β－ＨＳＤＨのアミノ酸配列２００～２１５の配列モチーフである、
請求項１３に記載のウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）の製造方法。

【請求項15】

前記変異は、
１）Ｍ２０７Ｘ_１、
２）Ｔ２１０Ｘ_２、及び
３）Ｑ２１２Ｘ_３
からなる群から選択されるいずれか一つ以上の変異を含み、
Ｘ_１はメチオニン（Ｍ）以外のアミノ酸を表し、
Ｘ_２はトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を表し、
Ｘ_３はグルタミン（Ｑ）以外のアミノ酸を表す、
請求項１３に記載のウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）の製造方法。

【請求項16】

【請求項17】

前記酵素の基質結合部位は、７β－ＨＳＤＨのアミノ酸配列２００～２１５の配列モチーフである、請求項１６に記載の７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる方法。

【請求項18】

前記変異は、
１）Ｍ２０７Ｘ_１、
２）Ｔ２１０Ｘ_２、及び
３）Ｑ２１２Ｘ_３
からなる群から選択されるいずれか一つ以上の変異を含み、
Ｘ_１はメチオニン（Ｍ）以外のアミノ酸を表し、
Ｘ_２はトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を表し、
Ｘ_３はグルタミン（Ｑ）以外のアミノ酸を表す、
請求項１６に記載の７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

【背景技術】

【0002】

胆汁酸は胆汁の主な構成成分であり、脂肪、脂肪酸及び疎水性ビタミンの消化及び吸収に必要な生体分子である。代謝がよく行われない安定した物質であり、生化学的機能及び溶解度の違いを引き起こす様々なヒドロキシ基（ｈｙｄｒｏｘｙｇｒｏｕｐ）がコレステロール環（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｒｉｎｇ）の中心の様々な炭素位置に配置されている。様々な種類の胆汁酸のうち、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）は、少量でしか見られない胆汁酸の一つである。ＵＤＣＡは最近、コレステロール含有胆石の溶解に関する治療的機能が明らかになっている。そのような化合物は、化学的ステップまたは酵素的ステップでトン単位の量（ｔｏｎｎｅｑｕａｎｔｉｔｙ）で工業的に製造される。ＵＤＣＡの合成にとって重要な前駆体は、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）が存在し、ナトリウムを触媒として７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡとｎ－ブタノールを反応させてＵＤＣＡに変換することができる。酵素を用いた方法の場合、７－ケト基を立体選択的に還元することができる７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）により触媒される酵素触媒作用を用いて、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換を進める。このようなステップは、７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）によって触媒される酵素触媒作用を用いて、反応において補酵素であるＮＡＤ（Ｐ）Ｈを必要とする。しかしながら、従来のルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）を用いた７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からＵＤＣＡへの変換反応の場合、３０ｇ／Ｌ以上の７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）が基質として存在する場合、基質濃度による阻害により変換能が低下する問題がある。

【0003】

したがって、基質結合部位（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）のアミノ酸配列の変化による基質濃度の増加に伴う７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）酵素活性の低下効果を緩和するか、または組換え大腸菌を用いて前記改良された酵素の大量生産に関する研究が必要であり、まだ関連分野での研究は不十分な実情である。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0004】

一態様は、ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨのアミノ酸配列変異を含む、７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体を提供することである。

【0005】

別の態様は、前記変異体を含む組換えベクターを提供することである。

【0006】

別の態様は、前記組換えベクターで形質転換された細胞を提供することである。

【0007】

別の態様は、酵素の基質結合部位が変異した７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）により７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）をウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）に変換させるステップを含む、

【0008】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）の製造方法を提供することである。

【0009】

別の態様は、酵素の基質結合部位が変異した７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）により、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）をウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）に変換させるステップを含む、

【0010】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる方法を提供することである。

【発明を解決するための手段】

【0011】

一態様は、ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）のアミノ酸配列変異を含む、７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体であって、

【0012】

前記アミノ酸配列変異は、１）Ｍ２０７Ｘ_１、２）Ｔ２１０Ｘ_２、及び３）Ｑ２１２Ｘ_３からなる群から選択されるいずれか一つ以上の変異を含み、Ｘ_１はメチオニン（Ｍ）以外のアミノ酸を表し、Ｘ_２はトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を表し、Ｘ_３はグルタミン（Ｑ）以外のアミノ酸を表す７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体を提供する。

【0013】

一実施形態において、前記７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体は、４）Ｄ２５２Ｘ_４変異を付加的に有し、Ｘ_４はアスパラギン酸（Ｄ）以外のアミノ酸であり得る。

【0014】

本明細書で使用される「７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：７β－ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ）」という用語は、７－ケトステロイドの対応する７β－ＨＳＤＨの立体特異的還元（水素化）、または７位にケト基及びステロイド構造上に１つ以上の追加のケト基を含むケトステロイドに対応する７β－ＨＳＤＨを意味する。

【0015】

本明細書で使用される「アミノ酸」という用語は、アラニン（Ａ；Ａｌａｎｉｎｅ、Ａ）、システイン（Ｃ；Ｃｙｓｔｅｉｎｅ、Ｃｙｓ）、アスパラギン酸（Ｄ；Ａｓｐａｒｔｉｃａｃｉｄ、Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｇｌｕ）、フェニルアラニン（Ｆ；Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、Ｐｈｅ）、グリシン（Ｇ；Ｇｌｙｃｉｎｅ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈ；Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）、リジン（Ｋ；Ｌｙｓｉｎｅ、Ｌｙｓ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍ；Ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ、Ｍｅｔ）、アスパラギン（Ｎ；Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ、Ａｓｎ）、プロリン（Ｐ；Ｐｒｏｌｉｎｅ、Ｐｒｏ）、グルタミン（Ｑ；Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ、Ｇｌｎ）、アルギニン（Ｒ；Ａｒｇｉｎｉｎｅ、Ａｒｇ）、セリン（Ｓ；Ｓｅｒｉｎｅ、Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔ；Ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ、Ｔｈｒ）、バリン（Ｖ；Ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）、トリプトファン（Ｗ；Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ、Ｔｒｐ）、チロシン（Ｙ；Ｔｙｒｏｓｉｎｅ、Ｔｙｒ）であり得、具体的には、バリン（Ｖ；Ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）またはグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｇｌｕ）から選択されるものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0016】

本明細書で使用される「アミノ酸配列変異」という用語は、１つ以上のアミノ酸配列の変異を示すものであり、１つの突然変異を表すＭ２０７Ｘ_１、Ｔ２１０Ｘ_２、Ｑ２１２Ｘ_３及びＤ２５２Ｘ_４からなる群から選択される１つであり得、ここでＸ_１～Ｘ_４は、バリン（Ｖ；Ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）またはグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｇｌｕ）から選択されるものであり得、具体的にはＸ_１はバリン（Ｖ；Ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）、Ｘ_２はイソロイシン（Ｉ；Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）、Ｘ_３はロイシン（Ｌ；Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）、及びＸ_４はグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｇｌｕ）であり得る。

【0017】

また、複数のアミノ酸配列変異を有する場合（Ｍ２０７Ｘ_１及びＴ２１０Ｘ_２）、（Ｍ２０７Ｘ_１、及びＱ２１２Ｘ_３）、（Ｍ２０７Ｘ_１及びＤ２５２Ｘ_４）、（Ｔ２１０Ｘ_２及びＱ２１２Ｘ_３）、（Ｔ２１０Ｘ_２及びＤ２５２Ｘ_４）、（Ｍ２０７Ｘ_１、Ｑ２１２Ｘ_３及びＤ２５２Ｘ_４）、（Ｍ２０７Ｘ_１、Ｔ２１０Ｘ_２及びＱ２１２Ｘ_３）、（Ｍ２０７Ｘ_１、Ｔ２１０Ｘ_２、及びＤ２５２Ｘ_４）、（Ｔ２１０Ｘ_２、Ｑ２１２Ｘ_３及びＤ２５２Ｘ_４）または（Ｍ２０７Ｘ_１、Ｔ２１０Ｘ_２、Ｑ２１２Ｘ_３及びＤ２５２Ｘ_４）から選択されるものであり得、Ｘ_１～Ｘ_４はバリン（Ｖ；Ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉ；Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌ；Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）またはグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｇｌｕ）から選択されるものであり得、具体的にはＸ_１はバリン（Ｖ；Ｖａｌｉｎｅ、Ｖａｌ）、Ｘ_２はイソロイシン（Ｉ；Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ、Ｉｌｅ）、Ｘ_３はロイシン（Ｌ；Ｌｅｕｃｉｎｅ、Ｌｅｕ）、及びＸ_４はグルタミン酸（Ｅ；Ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ、Ｇｌｕ）であり得る。

【0018】

一実施形態において、７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に対応する配列モチーフに少なくとも１つの突然変異を付加的に有する７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体であり得、前記突然変異は、配列番号１の２０７～２１２の配列モチーフがＶＭＫＩＡＬであり得るが、これに限定されない。

【0019】

本明細書で使用される「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」という用語は、１つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／または修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、前記変異体の変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特徴（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持しているポリペプチドを指す。このような変異体は、一般に、前記ポリペプチドのアミノ酸配列のうちの１つ以上のアミノ酸を修飾し、前記修飾したポリペプチドの特徴を評価することによって同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）することができる。すなわち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドと比較して増加することもあれば、変化しないこともあり、または減少することもある。また、一部の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｄｏｍａｉｎ）のような１つ以上の部分が除去された変異体を含み得る。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ末端及び／またはＣ末端から一部が除去された変異体を含み得る。前記用語「変異体」は、変異型、修飾、修飾ポリペプチド、修飾タンパク質、変異及び変異体等の用語（英語表現としては、ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｍｏｄｉｆｉｅｄｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｄｉｆｉｅｄｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｕｔａｎｔ、ｍｕｔｅｉｎ、ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ等）を混用されて使用することができ、変異したという意味で使用される用語であれば、これに限定されない。本出願の目的上、前記変異体は、配列番号３のアミノ酸配列の２１０番目のアミノ酸であるトレオニンがイソロイシンに置換され、２１２番目のアミノ酸であるグルタミンがロイシンに置換された、配列番号１に示されるポリペプチドであり得る。

【0020】

本明細書で使用される「立体選択性（Ｓｔｅｒｅｏｓｅｌｅｃｔｉｖｉｔｙ）」という用語は、化学反応時に１つの立体構造を有し、選択的に生成される性質を意味する。

【0021】

一実施形態において、前記７β－ＨＳＤＨ変異体は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列に対応する配列モチーフに少なくとも１つの突然変異を付加的に有する７β－ＨＳＤＨ変異体であり得る。前記変異体は、配列番号１と８０％以上、９０％以上、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるものであり得、前記突然変異は配列番号１の２０７～２１２の配列モチーフはＶＭＫＩＡＬであり得る。

【0022】

本明細書で使用される「配列モチーフ（ｓｅｑｕｅｎｃｅｍｏｔｉｆ）」という用語は、配列の一部の構成要素としてＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨのアミノ酸配列のうちの基質結合部位（ｓｕｂｓｔｒａｔｅｂｉｎｄｉｎｇｓｉｔｅ）である配列番号１の２０７～２１２の配列を意味する。

【0023】

別の実施形態において、前記ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨは、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）を基質として認識し、７番目の炭素において立体特異的な酵素的還元の触媒作用を誘導することができる。

【0024】

本明細書で使用される「立体特異性（ｓｔｅｒｅｏｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）」という用語は、反応におけるある特定の立体異性体（ｓｔｅｒｅｏｉｓｏｍｅｒ）の反応物が１つの特定の立体異性体（または鏡像異性体対）の生成物を生成することを意味し、所与の反応物から生成される立体化学的結果を確実に特定（ｓｐｅｃｉｆｙ）できることを意味する。

【0025】

本明細書で使用される「酵素的還元」という用語は、微生物由来の還元酵素を用いる方法であり、酵素的還元法は、自然界から単離された新規微生物または論文または特許公知の微生物から還元酵素遺伝子を単離し、単離した遺伝子をプラスミドに移植して大腸菌内で形質転換させ、得られた大腸菌を培養した後、細胞を破砕及び遠心分離して得られた菌体をそのまま反応に使用してもよいし、あるいは前記大腸菌を破砕及び遠心分離して回収した上清液を反応に使用してもよい。ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｖｕｓ）株を用いて酵素的還元の触媒作用を誘導することができるが、これに限定されるものではない。

【0026】

他の態様は、７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）変異体の遺伝子を含む組換えベクターを提供する。

【0027】

一実施形態において、前記組換えベクターに含まれる変異体は、配列番号１と８０％以上、より具体的には９０％以上、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列からなるものであり得る。

【0028】

一実施形態において、前記変異体は配列番号２の塩基配列からなるものであり得る。

【0029】

本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、遺伝子情報を決定する構造単位を意味し、タンパク質のアミノ酸配列または機能ＲＮＡ（ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡなど）の塩基配列を決定する情報を有する構造遺伝子、及び／または構造遺伝子の発現を制御する調節遺伝子（例えば、プロモーター、リプレッサー（ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ）、作動遺伝子（ｏｐｅｒａｔｏｒ）など）を含み、遺伝子の産物を生成するために転写されるヌクレオチド配列を含む一本鎖の方を意味すると理解される。

【0030】

本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている他の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の遊離の末端を含む核酸分子、遊離の末端を含まない核酸分子（例えば、環状）；またはＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；及び当業界で知られている他の様々なポリヌクレオチドを含む。

【0031】

本明細書で使用される「組換えベクター」という用語は、発現させようとする目的ポリペプチド（核酸）のコードする遺伝子が作動可能に連結される場合、適切な宿主細胞において前記目的ポリペプチドを高効率で発現させることができる目的ポリペプチドの発現ベクターとして使用することができ、前記組換えベクターは宿主細胞で発現可能である。宿主細胞は原核細胞であり得、宿主細胞の種類に応じて、プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、ターミネーター（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）などの発現調節配列、膜標的化または分泌のための配列などを適宜選択し、目的に応じて様々な組み合わせが可能である。

【0032】

一実施形態において、前記組換えベクターは、Ｔａｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及びカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子を含み得る。

【0033】

本明細書で使用される「プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）」という用語は、遺伝子がいつどこでどの程度発現するかを決定する作用をする塩基配列、すなわち遺伝子の発現調節機能を有する調節領域の一種であり、ｔｒｐ及びｌａｃオペロンのプロモーターの組み合わせで生成される合成ＤＮＡプロモーターとして、一般に大腸菌でのタンパク質生産に使用されるＴａｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）を使用することができる。

【0034】

本明細書で使用される「カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）耐性遺伝子」という用語は、組換え微生物が抗生物質にさらされても生き残ることができる薬物耐性を示す遺伝子を意味する。

【0035】

別の態様は、前記組換えベクターで形質転換された細胞を提供する。

【0036】

本明細書で使用される「形質転換」という用語は、外部から与えられたＤＮＡによって生物の遺伝的性質が変化することで、すなわち生物のある系統の細胞から抽出された核酸の一種であるＤＮＡを他の系統の生細胞に導入したとき、ＤＮＡがその細胞に入って遺伝形質が変化する現象を意味するものであり得る。

【0037】

一実施形態において、前記形質転換された細胞は、組換えベクターを大腸菌に導入して形質転換された細胞であり得、前記形質転換された細胞は受託番号ＫＣＴＣ１４７１５ＢＰで寄託されたものであり得る。

【0038】

一実施形態において、前記大腸菌は、ＬＢ培地を含む発酵培地で３０～４０℃で４～４８時間培養することができ、このとき前記培養は振とう三角フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄｆｌａｓｋ）を用いて好気的条件下で行うことができるが、これに限定されない。

【0039】

本明細書で使用される「発現」という用語は、大腸菌株が自ら発現できない酵素を人為的に発現させるために外部由来の遺伝子を菌株に導入して発現させることを意味し、「過剰発現」という用語は大腸菌株が自ら当該酵素をコードする遺伝子を有し、自ら発現できるが、大量生産のための目的でその発現量を増大させるために、人為的に当該酵素の発現量を増大させて過剰発現したことを意味する。

【0040】

本明細書で使用される「プライマー」という用語は、短い遊離の３末端ヒドロキシル基（ｆｒｅｅ３' ｈｙｄｒｏｘｙｌｇｒｏｕｐ）を有する核酸配列であって、相補的な核酸の鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）と塩基対（ｂａｓｅｐａｉｒ）を形成することができ、核酸鋳型の鎖コピーのための開始点として機能する短い核酸配列を意味する。プライマーは、適切な緩衝溶液及び温度での重合反応（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素）のための試薬及び異なる４つのヌクレオチド三リン酸の存在下でＤＮＡ合成を開始することができる。

【0041】

前記プライマー設計時、プライマーのＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ含量比、プライマー結合体（ｄｉｍｅｒ）形成防止、同じ塩基配列の３回以上繰り返し禁止など様々な制約が伴い、その他単独ＰＣＲ反応条件における鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）ＤＮＡの量、プライマーの濃度、ｄＮＴＰの濃度、Ｍｇ^２＋の濃度、反応温度、反応時間などの条件が適正でなければならない。

【0042】

前記プライマーは、基本特性を変えない追加の特徴を組み込むことができる。すなわち、核酸配列は、当技術分野で公知さている多くの手段を用いて修飾することができる。このような修飾の例としては、メチル化、キャッピング、ヌクレオチドの１つ以上の相同体への置換、及びホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホロアミダートまたはカルバメートなどの非荷電の結合体、またはホスホロチオエートまたはホスホロジチオエート等の荷電の結合体へのヌクレオチドの修飾が可能である。さらに、核酸は、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリＬリジンなどのタンパク質、アクリジンまたはソラレンなどのインターカレーター、金属、放射性金属、鉄酸化金属などのキレート剤及びアルキル化剤などの１つ以上の付加的な共有結合した残基を有し得る。

【0043】

一実施形態において、前記形質転換された細胞は、７β－ＨＳＤＨ酵素のアミノ酸４種が変化した酵素（配列番号１）を発現するために、前記遺伝子が挿入された発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５）に導入し、形質転換されたものであり得、組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＡＢＰ－５（寄託番号ＫＣＴＣ１４７１５ＢＰ））はＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の当該菌株を用いたタンパク質発現過程を通じて、改良された７β－ＨＳＤＨ酵素変異体であるＡＢＰ－５を確保することができる。

【0044】

【0045】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）の製造方法を提供する。

【0046】

【0047】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換率を向上させる方法を提供する。

【0048】

一実施形態において、前記酵素の基質結合部位は、７β－ＨＳＤＨのアミノ酸配列２００～２１５配列モチーフであり得るが、これに限定されない。

【0049】

一実施形態において、前記変異は、１）Ｍ２０７Ｘ_１、２）Ｔ２１０Ｘ_２、及び３）Ｑ２１２Ｘ_３からなる群から選択されるいずれか１つ以上の変異を含み、Ｘ_１はメチオニン（Ｍ）以外のアミノ酸を表し、Ｘ_２はトレオニン（Ｔ）以外のアミノ酸を表し、Ｘ_３はグルタミン（Ｑ）以外のアミノ酸を表すものであり得るが、これに限定されるものではない。

【0050】

本明細書で使用される「７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ：７－ケトリトコール酸）」という用語は、ヒトの腸内細菌による二次胆汁酸ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）合成の中間体としてケノデオキシコール酸から形成される中間体を意味する。

【0051】

本明細書で使用される「変換率」という用語は、元の特定の物質（原料）のモル数を基準として、化学反応により他の物質に変換される元の特定の物質（原料）の百分率を意味する。

【発明の効果】

【0052】

本発明では、酵素改良による変異体の製造及び組換えタンパク質生産の開発により、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）への変換効率を向上させたところ、ウルソデオキシコール酸（ｕｒｓｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃａｃｉｄ；ＵＤＣＡ）生合成及び生合成効率の向上のために広く活用できると期待される。

【図面の簡単な説明】

【0053】

【図1】図１は、Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ（７β－ｈｙｄｒｏｘｙｓｔｅｒｏｉｄ）（配列番号３）と本発明で改良したＡＢＰ－５のアミノ酸配列（配列番号１）を比較した結果を示す図である。

【図2】図２は、改良された７β－ＨＳＤＨ酵素であるＡＢＰ－５を発現するために用いたｐＣＤＦＤｕｅｔ－１－Ｔａｃ－Ｋａｎベクター（Ｔａｃプロモーター、カナマイシン耐性：Ｔａｃｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｋａｎａｍｙｃｉｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）を示す図である。

【図3】図３は、大腸菌を用いたＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及び改良されたＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ（ＡＢＰ－５）酵素発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥで分析した結果を示す図である。（Ａ：Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ酵素（２９．３２ｋＤａ）、Ｂ：ＡＢＰ－５（２９．３ｋＤａ））

【図4】図４は、補酵素再生系を含む７β－ＨＳＤＨ酵素を用いた７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）からＵＤＣＡへの変換模式図である。

【図5】図５は、様々な７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ濃度別各酵素のＵＤＣＡへの変換率を比較した結果を示す図である。（○：Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ、■：ＡＢＰ－５）

【図6】図６は、ｐＨ調節による様々な７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ濃度別各酵素のＵＤＣＡへの変換率を比較した結果を示す図である。（○：ｐＨ調節ありＡＢＰ－５ ■：ｐＨ調節なしＡＢＰ－５）

【発明を実施するための形態】

【0054】

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明しようとする。これらの実施例は単に本発明を例示するためのものであり、範囲がこれらの実施例によって制限されるものと解釈されないことは当業界で通常の知識を有する者にとって明らかであろう。

【実施例】

【0055】

＜実施例１：ＡＢＰ－５発現ベクター及び発現株の開発＞
Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨのアミノ酸配列のうち、２００～２１５位の周りの領域が基質結合に関与しており、２４０～２５９位の周りの領域が基質の立体選択性に関与していることが知られており、基質結合に関与するアミノ酸のうち、２０７位のメチオニン（ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ）、２１０位のトレオニン（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ）、２１２位のグルタミン（ｇｌｕｔａｍｉｎｅ）及び基質立体選択性に関与するアミノ酸のうち、２５２位のグルタミン酸（ｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄ）を置き換えた場合、基質濃度が増加しても活性が維持されることを確認した。

【0056】

したがって、７β－ＨＳＤＨの変異体であるＡＢＰ－５は、既存の７β－ＨＳＤＨのアミノ酸においてＭ２０７Ｖ、Ｔ２１０Ｉ、Ｑ２１２Ｌ、Ｄ２５２Ｅ変異を含むものであり、より具体的には２０７番目のアミノ酸であるメチオニンがバリンに置き換えられ、２１０番目のアミノ酸であるトレオニンがイソロイシンに置き換えられ、２１２番目のアミノ酸であるグルタミンがロイシンに置き換えられ、２５２番目のアミノ酸であるアスパラギン酸がグルタミン酸に置き換えられた変異体を意味する（図１）。

【0057】

ルミノコッカスグナバス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓｇｎａｒｖｕｓ）株由来の７β－ＨＳＤＨ酵素を改良した組換え酵素であるＡＢＰ－５の遺伝子をＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株に挿入するために、ＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＤＮＡＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．のホームページで提供するコドン最適化ツール（ＣｏｄｏｎＯｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎＴｏｏｌ）を用いてＡＢＰ－５のアミノ酸配列を用いたコドン最適化を行った後、マクロジェン（Ｓｅｏｕｌ，ＲｅｐｕｂｌｉｃｏｆＫｏｒｅａ）社に依頼してＤＮＡ合成を進行した。

【0058】

具体的には、本実験のコドン最適化されたＡＢＰ－５遺伝子（配列番号２）及び比較対象であるＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ（配列番号４）を確保するためにＡＢＰ－５＿Ｆ（配列番号５）、ＡＢＰ－５＿Ｒ（配列番号６）、７β－ＨＳＤＨ－Ｆ（配列番号７）、及び７β－ＨＳＤＨ－Ｒ（配列番号８）プライマーを用いてＰＣＲによる遺伝子増幅を進行した。

【0059】

発現に使用するベクターを作製するために、大腸菌用発現ベクターであるｐＣＤＦＤｕｅｔ－１を使用した。前記ベクターに存在するＴ７プロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）をＴａｃプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）に置換するためにハングオーバーＰＣＲ（ｈａｎｇｏｖｅｒＰＣＲ）を応用した方法を用い、このとき使用したプライマーであるＦ＿Ｔａｃ＿オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）及びＲ＿Ｔａｃ＿オーバーハング（ｏｖｅｒｈａｎｇ）は配列番号２及び３にある配列で作製して進行した。ベクターを作製するためにＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＮＥＢ）を９８℃で１０秒間、６０℃で３０秒間、及び７２℃で遺伝子サイズ１ｋｂ当たり３０秒間の条件で反応を設定し、前記サイクル（９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で遺伝子サイズ１ｋｂ当たり３０秒間反応）を３０回行い、最後に７２℃で５分間反応させる条件でベクター全体をリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ反応を行った。その後、鋳型ベクターであるｐＣＤＦＤｕｅｔ－１を除去するために３７℃条件でＤｐｎＩ（ＮＥＢ）を１時間処理し、その後クローニングホスト（ｃｌｏｎｉｎｇｈｏｓｔ）であるＥ．ｃｏｌｉＤＨ５αに挿入した後、作製したベクターを増幅して用いた。

【0060】

また、ｐＣＤＦｄｕｅｔ－１ベクターのアンピシリンカセットをカナマイシンカセットに置き換えるために、すべてのベクターＦ及びＲ（ａｌｌｖｅｃｔｏｒ－Ｆ、Ｒ）プライマー（配列番号９、１０）を用いてＤＮＡポリメラーゼ（Ｑ５（登録商標）Ｈｉｇｈ－ＦｉｄｅｌｉｔｙＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＮＥＢ）を用いた。９８℃で１０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃遺伝子サイズ１ｋｂ当たり３０秒間の条件で反応を設定し、前記サイクル（９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で遺伝子サイズ１ｋｂ当たり３０秒間反応）を３０回行い、最後に７２℃で５分間反応させる条件でベクター全体をリバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ反応を行った。これを残っている鋳型ベクターを除去するためにＤｐｎＩ（ＮＥＢ）を３７℃で１時間反応させ、カナマイシンカセットをカナマイシンＦ及びＲ（Ｋａｎａｍｙｃｉｎ－Ｆ、Ｒ）プライマー（配列番号１１、１２）を用いてＧＸＬＤＮＡポリメラーゼ（タカラバイオ社、日本）を用いて９８℃で３０秒間反応させ、９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で遺伝子サイズ１ｋｂ当たり３０秒間反応を設定し、前記サイクル（９８℃で１０秒間、５０℃で３０秒間、７２℃で遺伝子サイズ１ｋｂ当たり３０秒間反応）を３０回行い、最後に７２℃で５分間の条件で反応させた。リバース（Ｒｅｖｅｒｓｅ）ＰＣＲ反応したベクターとカナマイシンカセットをＩｎＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅ（タカラバイオ社、日本）を用いてｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法でクローニングし、最終的に作製した発現ベクターをｐＣＤＦＤｕｅｔ－１－Ｔａｃ－Ｋａｎベクターと命名した。

【0061】

その後、ｐＣＤＦＤｕｅｔ－１－Ｔａｃ－Ｋａｎベクター（図２）にＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩ制限酵素で処理した後に増幅したＡＢＰ－５酵素及びＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ遺伝子をＩｎＦｕｓｉｏｎＨＤＥｎｚｙｍｅ（タカラバイオ社、日本）を用いてｉｎ－ｆｕｓｉｏｎ法で挿入し、最終的にＥ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株に前記組換えベクターを挿入した。

【0062】

形質転換後、ＡＢＰ－５遺伝子を含むｐＣＤＦＤｕｅｔ－１－Ｔａｃ－Ｋａｎ挿入株を選択するために、５０μｇ／ｍＬの濃度のカナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）を含有するＬＢ培地に塗抹した後、３７℃の温度条件で一日間培養した。その後、ＢｉｏＦＡＣＴ社の２ＸＴａｑＰＣＲｐｒｅ－Ｍｉｘ製品及びＡＢＰ－５＿ＦとＡＢＰ－５＿Ｒプライマーまたは７β－ＨＳＤＨ－Ｆと７β－ＨＳＤＨ－Ｒプライマーを用いたコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）ＰＣＲを行い、最終的にＡＢＰ－５遺伝子及びＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ遺伝子を含むｐＣＤＦＤｕｅｔ－１－Ｔａｃ－Ｋａｎ挿入株を選択した。ＡＢＰ－５遺伝子を含むｐＣＤＦＤｕｅｔ－１－Ｔａｃ－Ｋａｎベクターを有する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５）を'Ｅ．ｃｏｌｉＡＢＰ－５'と命名し、２０２１年０９月１７日付で韓国生命工学研究院に寄託して寄託番号ＫＣＴＣ１４７１５ＢＰを付与された。また、当該菌株で発現し改良された７β－ＨＳＤＨをＡＢＰ－５と命名した。

【0063】

【表1】

【0064】

＜実施例２：ＡＢＰ－５酵素発現及び７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換率確認＞
前記実施例１で製造された、ＡＢＰ－５酵素発現遺伝子が過剰発現するように形質転換された組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉＡＢＰ－５（寄託番号ＫＣＴＣ１４７１５ＢＰ））を用いて組換えタンパク質の発現及び組換えタンパク質を用いた７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換を確認した。

【0065】

菌株（Ｅ．ｃｏｌｉＡＢＰ－５（寄託番号ＫＣＴＣ１４７１５ＢＰ））の増殖は、６００ｎｍ波長での光学濃度（ＯＤ値）を紫外可視分光光度計（ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＵＶ－１８００、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いて測定した。培養後、タンパク質分析は、ドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍｄｏｄｅｃｙｌｓｕｌｆａｔｅｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＩＮＴｅｔｒａｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）法を用いて行い、分析用ポリアクリルアミドゲル（ｐｏｌｙａｃｒｙｌｌａｍｉｄｅｇｅｌ）（Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮＴＧＸＰｒｅｃａｓｔＧｅｌｓ）及びサンプルバッファー（ｓａｍｐｌｅｂｕｆｆｅｒ）（２×ＬａｅｍｍｌｉＳａｍｐｌｅＢｕｆｆｅｒ）を用いて分析を行った。

【0066】

組換えタンパク質ＡＢＰ－５を用いた７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換を確認するために、ＵＦＬＣ（ＬＣ－２０ＡＤ、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）と培養液の３－ＨＰを分析するために高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣＣｈｒｏｍａｓｔｅｒ）（日立、日本）とＡＣＣＵＣＯＲＥＣ３０２．６ＵＭ２５０×２．１ＭＭＣＯＬＵＭＮを用いて分析を行い、視差屈折率検出器（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘｄｅｔｅｃｔｏｒ；ＲＩＤ）を用いて分析した。溶媒としては、１ＭＫ_２ＨＰＯ_４（ｐＨ３．０）２．２ｍＬ、ＨＰＬＣｗａｔｅｒ３７０ｍＬ、アセトニトリル（ａｃｅｔｏｎｉｔｒｉｌｅ）３００ｍＬ、メタノール４００ｍＬを混合し、その後、孔径０．２μｍフィルター（ｐｏｒｅｓｉｚｅｆｉｌｔｅｒ）で濾過（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）した後に用い、４０℃条件で毎分の０．４ｍＬの溶媒を使用する条件で分析を進行した。

【0067】

２－１．組換えタンパク質（ＡＢＰ－５）の発現とＳＤＳ－ＰＡＧＥ確認

【0068】

菌株（Ｅ．ｃｏｌｉＡＢＰ－５）の前培養にはＬＢ培地（Ｌｕｒｉａｂｅｒｔａｎｉｍｅｄｉｕｍ）を使用し、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）５０μｇ／Ｌ、グルコース０．５ｇ／Ｌ、グリセロール５ｇ／Ｌ及びラクトース２ｇ／Ｌを加えて使用した。接種に使用した菌株は－８０℃でグリセロールストック（ｇｌｙｃｅｒｏｌｓｔｏｃｋ）法により保存した菌株を使用し、ＬＢ培地に１％濃度で接種し、１８０ｒｐｍ、３７℃の条件で前培養を進行した。また、前培養後、対数期で回収し、滅菌蒸留水で２回洗浄して本培養に用いた。

【0069】

一方、ＡＢＰ－５酵素及び比較群であるＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ製造のために、２５０ｍＬの三角フラスコに５０ｍＬのＬＢ＿Ｋａｎ培地を使用した。培養は振盪フラスコ（ｂａｆｆｌｅｄｆｌａｓｋ）を用い、攪拌速度は１８０ｒｐｍとし、３７℃の温度条件で大腸菌培養及び酵素発現を進行した。

【0070】

各培養時間別に培養液を回収し、遠心分離して上清を除去した後、回収した大腸菌を滅菌蒸留水で２回洗浄し、５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）に再懸濁し、その後超音波破砕機を用いて破砕及びタンパク質発現を確認した（図３）。その結果、２時間後にＡＢＰ－５酵素及び比較群であるＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨの発現が円滑に進行することを確認した。

【0071】

２－２．Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及びＡＢＰ－５活性測定

【0072】

ＡＢＰ－５酵素の活性測定のためにＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及びＡＢＰ－５酵素発現を行った後、これを用いて７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換反応を用いて酵素活性を測定した。

【0073】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの酵素的変換の場合、補酵素としてＮＡＤＰＨを必要とする反応である。したがって、酵素活性を測定するためにＮＡＤＰＨが有する３４０ｎｍ波長帯の吸光度を用い、それを測定するために紫外可視分光光度計（ＵＶ－ｖｉｓｉｂｌｅｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ）（ＵＶ－１８００、ＳＨＩＭＡＤＺＵ）を用いた。

【0074】

酵素反応のためにＮＡＤＰＨ０．５ｍＭの濃度で添加し、反応緩衝溶液として５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）を使用した。基質７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡを１０ｇ／Ｌの濃度で添加し、Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及びＡＢＰ－５酵素の場合、細胞破砕液の状態で２μＬ添加し、最終２ｍＬ体積で反応を進行した。

【0075】

活性測定の場合、各酵素を添加した後、１分間隔で３４０ｎｍの吸光度の変化を測定した後、測定した吸光度変化値をＮＡＤＰＨ標準曲線（３４０ｎｍ、０．０１－０．１ｍＭＮＡＤＰＨ）に代入して酵素活性を測定した。細胞破砕液のタンパク質濃度を測定するために、ブラッドフォード（ｂｒａｄｆｏｒｄ）タンパク質定量法を使用し、各測定されたタンパク質濃度を測定した。

【0076】

Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及びＡＢＰ－５酵素活性を比較するために、Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及びＡＢＰ－５酵素遺伝子が挿入された発現ベクターが挿入された組換え大腸菌Ｅ．ｃｏｌｉＡＢＰ－５及びＥ．ｃｏｌｉＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨを用い、形質転換時に確保した１０個のコロニー（ｃｏｌｏｎｙ）を選別し、実施例２．１の発現方法で発現した後、組換え大腸菌で発現された組換え７β－ＨＳＤＨであるＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ及びＡＢＰ－５の活性測定を進行した（表２）。その結果、Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨの場合は平均４１．６２±４．５５Ｕ／ｍｇの活性を示し、ＡＢＰ－５の場合は４９．１３±４．７２Ｕ／ｍｇの活性を示し、既存の酵素に比べて活性が約１８．１０％向上されたことが確認できた。

【0077】

【表2】

【0078】

２－３．ＡＢＰ－５酵素及びＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨを用いた７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換

【0079】

発現されたＡＢＰ－５酵素及び比較群であるＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨを用いて７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換を行った。

【0080】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換に用いられる酵素である７β－ＨＳＤＨの場合、補酵素としてＮＡＤＰＨを必要とする。ただし、前記反応の場合、当量対当量反応であるため、変換しようとする７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡと同量のＮＡＤＰＨを必要とする。これにより、大量のＮＡＤＰＨが必要な非効率的な反応になる可能性があるため、これを解決するために、図４に示した補酵素再生系（Ｃｏ－ｆａｃｔｏｒｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）を含む反応系を構成した後、変換を進行した。

【0081】

変換反応のために５０ｍＭのリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）を使用し、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌ）、ＮＡＤＰＨ１ｍＭ、グルコース（Ｇｌｕｃｏｓｅ）２００ｍＭ、グルコース脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＧＤＨ）２Ｕ／ｍＬ、そしてＡＢＰ－５酵素またはＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ４Ｕ／ｍＬの条件で３０℃、１５０ｒｐｍ条件で反応を進行した。

【0082】

反応の結果、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ２０ｇ／Ｌ濃度までは両酵素ともＵＤＣＡへの変換率が１００％であることが確認された。しかしながら、Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨを用いた変換の場合、基質である７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡの濃度が３０ｇ／Ｌの場合５５．１２％、４０ｇ／Ｌの場合２３．５３％に変換率が減少し、５０ｇ／Ｌの濃度では５．３７％で基質濃度の増加に伴い変換率が減少することを確認した。

【0083】

これに対し、ＡＢＰ－５酵素を用いて変換を進行した場合、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡの濃度が３０ｇ／Ｌの場合１００％、４０ｇ／Ｌの場合９２．４４％に変換率が減少し、５０ｇ／Ｌの濃度では７９．８２％で、基質濃度増加に伴う変換率減少幅がＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨと比較して著しく低いことを確認した（図５）。すなわち、改良された酵素変異体は、既存の変換活性が維持される７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）濃度である２０ｇ／Ｌだけでなく、３０ｇ／Ｌの濃度でも同じ変換効率を示し、４０ｇ／Ｌ及び５０ｇ／Ｌの７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（７－ｋｅｔｏＬｉｔｈｏｃｈｏｌｉｃＡｃｉｄ）濃度でもＵＤＣＡへの変換が可能であることを確認した。

【0084】

このような結果をもとに、７β－ＨＳＤＨ酵素変異体であるＡＢＰ－５の場合、既存の酵素に比べて基質濃度の増加に伴う阻害に対して耐性を有していることを確認し、このような利点を活用して様々な工程上の利得をとることができると考えられる。

【0085】

＜実施例３：ｐＨ調節によるＡＢＰ－５酵素を用いた７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換＞
実施例２のように本発明で新規に開発した酵素ＡＢＰ－５を用いる場合、Ｒ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨを用いた場合と異なり、４０ｇ／Ｌ以上の７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ濃度で発生するＵＤＣＡへの変換阻害現象がある程度緩和されることを確認した。しかしながら、５０ｇ／Ｌ以上で７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ濃度が増加した場合、変換率が７９．８２％に大幅に減少する傾向が示された。

【0086】

７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡのＵＤＣＡへの変換に補酵素再生系として使用されるＧＤＨの場合、グルコースをグルコン酸に変換し、補酵素としてＮＡＤＰを用いる。したがって、反応が進行するにつれて蓄積するグルコン酸により反応液のｐＨが減少し、開始ｐＨ８．０で反応を開始する場合、終了時にｐＨが７．２まで減少する傾向が見られる。このようなｐＨの減少が活性阻害の原因であると考えられ、反応溶液のｐＨを毎時間測定してｐＨを８．０に再調整し、変換能を確認した。

【0087】

変換反応のために５０ｍＭリン酸緩衝溶液（ｐＨ８．０）を使用し、７－Ｋｅｔｏ－ＬＣＡ（１０、２０、３０、４０、または５０ｇ／Ｌ）、ＮＡＤＰＨ１ｍＭ、グルコース２００ｍＭ、グルコース脱水素酵素（Ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ；ＧＤＨ）２Ｕ／ｍＬ、そしてＡＢＰ－５酵素またはＲ．ｇｎａｖｕｓ株由来の７β－ＨＳＤＨ４Ｕ／ｍＬ条件で３０℃、１５０ｒｐｍ条件で反応を進行した。また、毎時間ｐＨ測定器（ＦｉｖｅＥａｓｙ、Ｍｅｔｔｌｅｒｔｏｌｅｄｏ）を用いて測定した後、５ＮＮａＯＨを用いて反応液のｐＨを８．０に滴定して変換を行った。その結果、既存のｐＨ調整をしなかった条件に比べ、４０ｇ／Ｌでは４．２％（９２．４４→９６．２４％）、そして５０ｇ／Ｌでは１２．４３％（７９．８２％→９２．４５％）変換率が向上することを確認した（図６）。

【0088】

上述した説明は例示のためのものであり、本発明が属する技術分野の通常の知識を有する者は、技術的思想や必須の特徴を変更することなく他の具体的な形態に容易に変形が可能であることが理解できるであろう。したがって、上述した実施形態はすべての点で例示的なものであり、限定的なものではないと理解すべきである。

【図1】