特表 2024-510329 Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ＸＳＡＭＳ）を用いたメチルシトシン及びその誘導体の検出

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-06

(54)【発明の名称】Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ＸＳＡＭＳ）を用いたメチルシトシン及びその誘導体の検出

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/00 20060101AFI20240228BHJP

   C12Q 1/6869 20180101ALI20240228BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240228BHJP

   C07H 21/02 20060101ALI20240228BHJP

【ＦＩ】

C12N15/00 ZNA

C12Q1/6869

C12N15/11 Z

C07H21/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023557709

(86)(22)【出願日】2022-03-14

(85)【翻訳文提出日】2023-11-06

(86)【国際出願番号】 US2022020144

(87)【国際公開番号】W WO2022197593

(87)【国際公開日】2022-09-22

(31)【優先権主張番号】63/161,330

(32)【優先日】2021-03-15

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500358711

【氏名又は名称】イルミナ インコーポレイテッド

(71)【出願人】

【識別番号】502279294

【氏名又は名称】イルミナ ケンブリッジ リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100097456

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 徹

(72)【発明者】

【氏名】サラ シュルツァバージャー

(72)【発明者】

【氏名】シャオリン ウー

(72)【発明者】

【氏名】エリック ブルスタッド

(72)【発明者】

【氏名】ニアル ゴームリー

【テーマコード（参考）】

4B063

4C057

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QQ02

4B063QQ62

4B063QR06

4B063QR10

4B063QR42

4B063QS04

4B063QS24

4B063QS28

4C057AA05

4C057BB02

4C057DD03

4C057MM02

(57)【要約】

本明細書で提供される実施例は、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭｓ）を用いたメチルシトシン及びその誘導体の検出に関する。そのような検出を行うための組成物及び方法が開示される。標的ポリヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）及びメチルシトシン（ｍＣ）を含み得る。方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチド中のＣを脱アミノ化から保護することと、（ｂ）工程（ａ）の後に、標的ポリヌクレオチド中のｍＣを脱アミノ化してチミン（Ｔ）を形成することと、を含み得る。脱アミノ化からＣを保護することは、例えば、ｘＳＡＭから第１の保護基を付加するメチルトランスフェラーゼ酵素を使用して、Ｃの５位に保護基を付加することを含み得る。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

シトシン（Ｃ）及びメチルシトシン（ｍＣ）を含む標的ポリヌクレオチドを修飾する方法であって、
（ａ）前記標的ポリヌクレオチド中の前記Ｃを脱アミノ化から保護することと、
（ｂ）工程（ａ）の後に、前記標的ポリヌクレオチド中の前記ｍＣを脱アミノ化してチミン（Ｔ）を形成することと、
を含む、方法。

【請求項2】

前記Ｃを脱アミノ化から保護することが、前記Ｃの５位に第１の保護基を付加することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

第１のメチルトランスフェラーゼ酵素が、前記Ｃの５位に前記第１の保護基を付加する、請求項２に記載の方法。

【請求項4】

前記第１のメチルトランスフェラーゼ酵素が、以下の構造であって、

【化1】

式中、Ｘは、前記第１の保護基と、メチレン基であって、それを介して前記第１の保護基がスルホニウムイオン（Ｓ＋）に結合するメチレン基と、を含む、構造を有するＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭ）から前記第１の保護基を付加する、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記第１のメチルトランスフェラーゼ酵素が、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ｄａｍ、及びＣｐＧ（Ｍ．ＳｓｓＩ）からなる群から選択される、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記第１の保護基が、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含む、請求項２～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記ｍＣのメチル基が、前記ｍＣの５位へのＸの付加を阻害する、請求項２～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

シチジンデアミナーゼ酵素が、前記ｍＣを脱アミノ化する、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

Ｘが前記第１のメチルトランスフェラーゼ酵素内に収まり、前記シチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害する、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記シチジンデアミナーゼ酵素がＡＰＯＢＥＣを含む、請求項８又は請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記ＡＰＯＢＥＣが、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、及びＡＰＯＢＥＣ４からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記標的ポリヌクレオチドが、ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を更に含み、工程（ｂ）が、前記標的ポリヌクレオチド中の前記ｈｍＣを脱アミノ化してヒドロキシチミン（ｈＴ）を形成することを含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記標的ポリヌクレオチドがヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を更に含み、前記方法が、
（ｃ）工程（ｂ）の前に、前記標的ポリヌクレオチド中の前記ｈｍＣを脱アミノ化から保護すること
を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

工程（ｃ）が、工程（ａ）の後に実行される、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ｈｍＣを脱アミノ化から保護することが、第２の保護基を前記ｈｍＣの前記ヒドロキシメチル基に付加することを含む、請求項１３又は請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

酵素が、前記第２の保護基を前記ｈｍＣの前記ヒドロキシメチル基に付加する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記酵素が、β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）及びβ－アラビノシルトランスフェラーゼ（βＡＴ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記第２の保護基が糖を含む、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して工程（ａ）及び（ｂ）を実施することと、前記標的ポリヌクレオチドを含む第２の試料に対して工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を実施することと、を含む、請求項１３～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記標的ポリヌクレオチドが、ホルミルシトシン（ｆＣ）を更に含み、前記ｆＣのホルミル基が、工程（ｂ）中の前記ｆＣの脱アミノ化を阻害する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記標的ポリヌクレオチドがホルミルシトシン（ｆＣ）を更に含み、前記方法が、
（ｄ）工程（ｂ）の前に、前記ｆＣを、工程（ｂ）の間に脱アミノ化された保護されていないＣに変換して、ウラシル（Ｕ）を形成すること
を更に含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

チミンデグリコシラーゼ酵素がｆＣの塩基をＣで置換する、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して工程（ａ）及び（ｂ）を実施することと、前記標的ポリヌクレオチドを含む第３の試料に対して工程（ａ）、（ｂ）及び（ｄ）を実施することと、を含む、請求項２１又は２２に記載の方法。

【請求項24】

前記標的ポリヌクレオチドがカルボキシルシトシン（ｃａＣ）を更に含み、前記ｃａＣのカルボキシル基が、工程（ｂ）の間に前記ｆＣの脱アミノ化を阻害する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記標的ポリヌクレオチドがカルボキシルシトシン（ｃａＣ）を更に含み、前記方法が、
（ｅ）工程（ｂ）の前に、前記ｃａＣを、工程（ｂ）中に脱アミノ化される保護されていないＣに変換して、ウラシル（Ｕ）を形成すること
を更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

第２のメチルトランスフェラーゼ酵素がｃａＣからカルボキシル基を除去する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

チミンデグリコシラーゼ酵素がｃａＣの塩基をＣで置換する、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して工程（ａ）及び（ｂ）を実施することと、前記標的ポリヌクレオチドを含む第４の試料に対して工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｅ）を実施することと、を含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記標的ポリヌクレオチドがＤＮＡを含む、請求項１～２８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項30】

前記標的ポリヌクレオチドが第１及び第２アダプターを含む、請求項１～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記第１及び第２のアダプターが、工程（ａ）の前に前記標的ポリヌクレオチドに付加される、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記第１及び第２のアダプターが、工程（ｂ）の後に前記標的ポリヌクレオチドに付加される、請求項３０に記載の方法。

【請求項33】

標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、
請求項１～３２のいずれか一項に記載の標的ポリヌクレオチドを修飾することと、
前記修飾された標的ヌクレオチドの第１のアンプリコンであって、前記第１のアンプリコンが、前記保護されたＣに相補的な位置に第１のグアニン（Ｇ）と、前記Ｔに相補的な位置に第１のアデニン（Ａ）と、を含む、前記修飾された標的ヌクレオチドの第１のアンプリコンを生成することと、
前記第１のアンプリコンの第２のアンプリコンであって、前記第２のアンプリコンが、前記第１のＧに相補的な位置に第１の保護されていないＣと、前記第１のＡに相補的な位置に第１のチミン（Ｔ）とを含む、前記第１のアンプリコンの第２のアンプリコンを生成することと、
前記第１のアンプリコン、前記第２のアンプリコン、又は前記第１のアンプリコン及び前記第２のアンプリコンの両方を配列決定することと、
前記第１のアンプリコン中の前記第１のＡ、前記第２のアンプリコン中の前記第１のＴ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第１のＡ及び前記第２のアンプリコン中の前記第１のＴの両方に基づいて、前記ｍＣを同定することと、
を含む、方法。

【請求項34】

前記第１のアンプリコンが、前記ｈＴに相補的な位置に第２のＡを含み、前記第２のアンプリコンが、前記第２のＡに相補的な位置に第２のＴを含み、前記方法が、
前記第１のアンプリコン中の前記第２のＡ、前記第２のアンプリコン中の前記第２のＴ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第２のＡ及び前記第２のアンプリコン中の前記第２のＴの両方に基づいて、前記ｈｍＣを同定すること
を更に含む、請求項１２に従属する請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記第１のアンプリコンが、前記ｈｍＣと相補的な位置に第２のＧを含み、前記第２のアンプリコンが、前記第２のＧと相補的な位置に第２の保護されていないＣを含み、前記方法が、
第１のアンプリコン中の前記第２のＧ、前記第２アンプリコン中の前記第２の保護されていないＣ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第２のＧ及び前記第２のアンプリコン中の前記第２の保護されていないＣの両方に基づいて、前記ｈｍＣを同定することを更に含む、請求項１３に従属する請求項３３に記載の方法。

【請求項36】

前記第１のアンプリコンが、前記ｆＣに相補的な位置に第３のＧを含み、前記第２のアンプリコンが、前記第３のＧに相補的な位置に第３の保護されていないＣを含み、前記方法が、
前記第１のアンプリコン中の前記第３のＧ、前記第２のアンプリコン中の前記第３の保護されていないＣ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第３のＧ及び前記第２のアンプリコン中の前記第３の保護されていないＣの両方に基づいて、前記ｆＣを同定することを更に含む、請求項２０に従属する請求項３３に記載の方法。

【請求項37】

前記第１のアンプリコンが、前記Ｕに相補的な位置に第３のＡを含み、前記第２のアンプリコンが、前記第３のＡに相補的な位置に第３のＴを含み、前記方法が、
前記第１のアンプリコン中の前記第３のＡ、前記第２のアンプリコン中の前記第３のＴ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第３のＡ及び前記第２のアンプリコン中の前記第３のＴの両方に基づいて、前記ｆＣを同定することを更に含む、請求項２１に従属する請求項３３に記載の方法。

【請求項38】

前記第１のアンプリコンが、前記ｃａＣに相補的な位置に第４のＧを含み、前記第２のアンプリコンが、前記第４のＧに相補的な位置に第４の保護されていないＣを含み、前記方法が、
前記第１のアンプリコン中の前記第４のＧ、前記第２のアンプリコン中の前記第４の保護されていないＣ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第４のＧ及び前記第２のアンプリコン中の前記第４の保護されていないＣの両方に基づいて、前記ｃａＣを同定することを更に含む、請求項２４に従属する請求項３３に記載の方法。

【請求項39】

前記第１のアンプリコンが、前記Ｕに相補的な位置に第４のＡを含み、前記第２のアンプリコンが、前記第４のＡに相補的な位置に第４のＴを含み、前記方法が、
前記第１のアンプリコン中の前記第４のＡ、前記第２のアンプリコン中の前記第４のＴ、又は前記第１のアンプリコン中の前記第４のＡ及び前記第２のアンプリコン中の前記第４のＴの両方に基づいて、前記ｃａＣを同定することを更に含む、請求項２５に従属する請求項３３に記載の方法。

【請求項40】

細胞外液試料から単離されたポリヌクレオチドであって、
５位に保護基を含むシトシン（Ｃ）と、
チミン（Ｔ）と、
を含む、細胞外液試料から単離されたポリヌクレオチド。

【請求項41】

前記第１の保護基が、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含む、請求項４０に記載のポリヌクレオチド。

【請求項42】

ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を更に含む、請求項４０又は４１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項43】

前記ｈｍＣが第２の保護基を含む、請求項４０又は４１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項44】

前記第２の保護基が糖を含む、請求項４３に記載のポリヌクレオチド。

【請求項45】

ヒドロキシチミン（ｈＴ）を更に含む、請求項４０又は４１に記載のポリヌクレオチド。

【請求項46】

ホルミルシトシン（ｆＣ）を更に含む、請求項４０～４５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項47】

カルボキシルシトシン（ｃａＣ）を更に含む、請求項４０～４６のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項48】

ウラシル（Ｕ）を更に含む、請求項４０～４７のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項49】

ＤＮＡを含む、請求項４０～４８のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項50】

第１及び第２のアダプターを含む、請求項４０～４９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチド。

【請求項51】

以下の構造であって、

【化2】

式中、Ｘは、第１の保護基と、メチレン基であって、それを介して前記保護基がスルホニウムイオン（Ｓ＋）に結合するメチレン基と、を含む、構造を有するＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭ）。

【請求項52】

前記保護基が、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含む、請求項５１に記載のｘＳＡＭ。

【請求項53】

ポリヌクレオチドと、請求項５１又は請求項５２に記載のｘＳＡＭと、前記ポリヌクレオチド中のシトシンに前記ｘＳＡＭの前記保護基を付加するメチルトランスフェラーゼ酵素と、を含む組成物。

【請求項54】

細胞外液中に、単離されたポリヌクレオチド及びシチジンデアミナーゼ酵素を含む組成物であって、
前記ポリヌクレオチドが、（ｉ）５位に保護基を含むシトシン（Ｃ）、及び（ｉｉ）メチルシトシン（ｍＣ）又はヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含み、
前記シチジンデアミナーゼ酵素が、ｍＣを脱アミノ化してチミン（Ｔ）を形成するか、又はｈｍＣを脱アミノ化してヒドロキシチミン（ｈＴ）を形成する、組成物。

【請求項55】

細胞外液中に、単離されたポリヌクレオチド及びメチルトランスフェラーゼ酵素を含む組成物であって、
前記ポリヌクレオチドが、（ｉ）５位に保護基を含むシトシン（Ｃ）、及び（ｉｉ）ホルミルシトシン（ｆＣ）又はカルボキシルシトシン（ｃａＣ）を含み、
前記メチルトランスフェラーゼ酵素が、前記ｆＣ又はｃａＣをＣに変換すると、を含む、組成物。

【請求項56】

細胞外液中に、単離されたポリヌクレオチド及びβ－グルコシルトランスフェラーゼ（βGT）又はβ－アラビノシルトランスフェラーゼ（βAT）酵素を含む組成物であって
前記ポリヌクレオチドが、（ｉ）５位に第１の保護基を含むシトシン（Ｃ）、及び（ｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含む、単離されたポリヌクレオチドと、
βＧＴ又はβＡＴ酵素が、前記ｈｍＣに第２の保護基を付加する、組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月１５日に出願された「ＤＥＴＥＣＴＩＮＧ ＭＥＴＨＹＬＣＹＴＯＳＩＮＥ ＡＮＤ ＩＴＳ ＤＥＲＩＶＡＴＩＶＥＳ ＵＳＩＮＧ Ｓ－ＡＤＥＮＯＳＹＬ－Ｌ－ＭＥＴＨＩＯＮＩＮＥ ＡＮＡＬＯＧＳ（ｘＳＡＭＳ）」という名称の米国仮特許出願第６３／１６１，３３０号の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

本出願は、メチルシトシンを検出するための組成物及び方法に関する。

【0003】

配列表に関する記述
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含むテキストファイルの名称は、８５４９１０２５１６＿ＳＬ．ｔｘｔである。テキストファイルは２．０６ＫＢであり、２０２２年３月９日に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。

【背景技術】

【0004】

ヒトなどの生物内では、ゲノム中の選択されたシトシン（Ｃ）がメチル化され得る。例えば、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン（ＳＡＭ）は、メチルトランスフェラーゼ（ＭＴａｓｅ）と呼ばれる酵素によって触媒される様々な生物学的メチル化反応のための遍在性メチル供与体であることが知られている。酵素５－ＭＴａｓｅは、Ｄｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，「Ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ａｎｄ ｉｔｓ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，」Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ ５６：５１８２－５２００（２０１７）に記載されているような方法で、シトシンの５位にメチル基を付加して５－メチルシトシン（５ｍＣ）を形成することができ、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。別の酵素は、シトシンのメチル基を酸化して５ｍＣ誘導体５－ヒドロキシメチルシトシン（５ｈｍＣ）を形成することができ、５ｈｍＣを更に酸化して５ｍＣ誘導体５－ホルミルシトシン（５ｆＣ）及び５－カルボキシシトシン（５ｃａＣ）を形成することができる。

【0005】

５ｍＣ及び５ｈｍＣは、エピジェネティックマーカーと呼ばれる場合があり、ゲノム配列においてそれらを検出することが望ましい場合がある。５ｍＣ及び５ｈｍＣを検出するための現在のゴールドスタンダード方法は、バイサルファイトシーケンスであり、これは、配列中の任意の非メチル化Ｃをウラシル（Ｕ）に変換するが、５ｍＣ又は５ｈｍＣを対応するウラシル誘導体に変換しない。配列がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅される場合、ウラシルはチミジン（Ｔ）として増幅され、したがって非メチル化ＣはＴとして配列決定される。比較すると、５ｍＣ及び５ｈｍＣはＣとして増幅され、したがってＣとして配列決定される。したがって、配列中の任意のＣは、それらがＵに変換されなかったので、５ｍＣ又は５ｈｍＣに対応するものとして同定され得る。そのようなスキームは、任意の非メチル化ＣがＴに変換されるため、「３塩基」配列決定スキームと称され得る。しかしながら、このタイプのスキームは、配列複雑性を低減し、配列決定品質の低減、より低いマッピング率、及び配列の比較的不均一なカバレッジをもたらし得る。

【発明の概要】

【0006】

本明細書で提供される実施例は、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭｓ）を用いたメチルシトシン及びその誘導体の検出に関する。そのような検出を行うための組成物及び方法が開示される。

【0007】

本明細書のいくつかの例は、標的ポリヌクレオチドを修飾する方法を提供する。標的ポリヌクレオチドは、シトシン（Ｃ）及びメチルシトシン（ｍＣ）を含み得る。方法は、（ａ）標的ポリヌクレオチド中のＣを脱アミノ化から保護することを含み得る。方法は、（ｂ）工程（ａ）の後に、標的ポリヌクレオチド中のｍＣを脱アミノ化してチミン（Ｔ）を形成することを含み得る。

【0008】

いくつかの例では、脱アミノ化からＣを保護することは、Ｃの５位に第１の保護基を付加することを含む。いくつかの例では、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素は、Ｃの５位に第１の保護基を付加する。いくつかの例では、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素は、以下の構造であって、

【化1】

式中、Ｘは、第１の保護基と、メチレン基であって、それを介して第１の保護基がスルホニウムイオン（Ｓ＋）に結合するメチレン基と、を含む、
構造を有するＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭ）から第１の保護基を付加する。

【0009】

いくつかの例では、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素は、ＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ、ｄａｍ、及びＣｐＧ（Ｍ．ＳｓｓＩ）からなる群から選択される。

【0010】

いくつかの例では、第１の保護基は、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含む。

【0011】

いくつかの例では、ｍＣのメチル基は、ｍＣの５位へのＸの付加を阻害する。

【0012】

いくつかの例では、シチジンデアミナーゼ酵素は、ｍＣを脱アミノ化する。いくつかの例では、Ｘは、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素内に適合し、シチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害する。いくつかの例では、シチジンデアミナーゼ酵素は、ＡＰＯＢＥＣを含む。いくつかの例では、ＡＰＯＢＥＣは、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、及びＡＰＯＢＥＣ４からなる群から選択される。

【0013】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を更に含み、工程（ｂ）は、標的ポリヌクレオチド中のｈｍＣを脱アミノ化して、ヒドロキシチミン（ｈＴ）を形成することを含む。

【0014】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を更に含む。方法は、（ｃ）工程（ｂ）の前に、標的ポリヌクレオチド中のｈｍＣを脱アミノ化から保護することを更に含み得る。いくつかの実施形態では、工程（ｃ）は、工程（ａ）の後に実施される。いくつかの例では、脱アミノ化からｈｍＣを保護することは、ｈｍＣのヒドロキシメチル基に第２の保護基を付加することを含む。いくつかの例では、酵素は、ｈｍＣのヒドロキシメチル基に第２の保護基を付加する。いくつかの例では、酵素は、β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）及びβ－アラビノシルトランスフェラーゼ（βＡＴ）からなる群から選択される。いくつかの例では、第２の保護基は糖を含む。

【0015】

いくつかの例では、方法は、標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して工程（ａ）及び（ｂ）を実施することと、標的ポリヌクレオチドを含む第２の試料に対して工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）を実施することと、を含む。

【0016】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、ホルミルシトシン（ｆＣ）を更に含み、ｆＣのホルミル基は、工程（ｂ）中にｆＣの脱アミノ化を阻害する。

【0017】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、ホルミルシトシン（ｆＣ）を更に含み、方法は、（ｄ）工程（ｂ）の前に、ｆＣを、工程（ｂ）中に脱アミノ化される保護されていないＣに変換して、ウラシル（Ｕ）を形成することを更に含んでもよい。いくつかの例では、チミンデグリコシラーゼ酵素は、ｆＣの塩基をＣで置換する。

【0018】

いくつかの例では、方法は、標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して工程（ａ）及び（ｂ）を実施することと、標的ポリヌクレオチドを含む第３の試料に対して工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｄ）を実施することと、を含む。

【0019】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、カルボキシルシトシン（ｃａＣ）を更に含み、ｃａＣのカルボキシル基は、工程（ｂ）中にｆＣの脱アミノ化を阻害する。

【0020】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、カルボキシルシトシン（ｃａＣ）を更に含み、方法は、（ｅ）工程（ｂ）の前に、ｃａＣを、工程（ｂ）中に脱アミノ化される保護されていないＣに変換して、ウラシル（Ｕ）を形成することを更に含む。いくつかの例では、第３のメチルトランスフェラーゼ酵素は、ｃａＣからカルボキシル基を除去する。いくつかの例では、チミンデグリコシラーゼ酵素は、ｃａＣの塩基をＣで置換する。

【0021】

いくつかの例では、方法は、標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して工程（ａ）及び（ｂ）を実施することと、標的ポリヌクレオチドを含む第４の試料に対して工程（ａ）、（ｂ）、及び（ｅ）を実施することと、を含む。いくつかの例では、第３の試料は第４の試料であり、第２のメチルトランスフェラーゼは第３のメチルトランスフェラーゼである。

【0022】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。

【0023】

いくつかの例では、標的ポリヌクレオチドは、第１及び第２のアダプターを含む。いくつかの例では、第１及び第２のアダプターは、工程（ａ）の前に標的ポリヌクレオチドに付加される。いくつかの例では、第１及び第２のアダプターは、工程（ｂ）の後に標的ポリヌクレオチドに付加される。

【0024】

本明細書のいくつかの例は、標的ポリヌクレオチドを配列決定する方法を提供する。方法は、前述の方法のいずれかに従って標的ポリヌクレオチドを修飾することを含み得る。方法は、修飾された標的ヌクレオチドの第１のアンプリコンを生成することを含み得る。第１のアンプリコンは、保護されたＣに相補的な位置に第１のグアニン（Ｇ）、及びＴに相補的な位置に第１のアデニン（Ａ）を含み得る。方法は、第１のアンプリコンの第２のアンプリコンを生成することを含み得、第２のアンプリコンは、第１のＧに相補的な位置に第１の保護されていないＣ、及び第１のＡに相補的な位置に第１のチミン（Ｔ）を含む。方法は、第１のアンプリコン、第２のアンプリコン、又は第１のアンプリコン及び第２のアンプリコンの両方を配列決定することを含み得る。方法は、第１のアンプリコン中の第１のＡ、第２のアンプリコン中の第１のＴ、又は第１のアンプリコン中の第１のＡ及び第２のアンプリコン中の第１のＴの両方に基づいて、ｍＣを同定することを含み得る。

【0025】

いくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｈＴに相補的な位置に第２のＡを含み、第２のアンプリコンは、第２のＡに相補的な位置に第２のＴを含む。方法は、第１のアンプリコン中の第２のＡ、第２のアンプリコン中の第２のＴ、又は第１のアンプリコン中の第２のＡ及び第２のアンプリコン中の第２のＴの両方に基づいて、ｈｍＣを同定することを更に含み得る。

【0026】

いくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｈｍＣに相補的な位置に第２のＧを含み、第２のアンプリコンは、第２のＧに相補的な位置に第２の保護されていないＣを含む。方法は、第１のアンプリコン中の第２のＧ、第２のアンプリコン中の第２の保護されていないＣ、又は第１のアンプリコン中の第２のＧ及び第２のアンプリコン中の第２の保護されていないＣの両方に基づいて、ｈｍＣを同定することを更に含み得る。

【0027】

いくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｆＣに相補的な位置に第３のＧを含み、第２のアンプリコンは、第３のＧに相補的な位置に第３の保護されていないＣを含む。方法は、第１のアンプリコン中の第３のＧ、第２のアンプリコン中の第３の保護されていないＣ、又は第１のアンプリコン中の第３のＧ及び第２のアンプリコン中の第３の保護されていないＣの両方に基づいて、ｆＣを同定することを更に含み得る。

【0028】

いくつかの例では、第１のアンプリコンは、Ｕに相補的な位置に第３のＡを含み、第２のアンプリコンは、第３のＡに相補的な位置に第３のＴを含む。方法は、第１のアンプリコン中の第３のＡ、第２のアンプリコン中の第３のＴ、又は第１のアンプリコン中の第３のＡ及び第２のアンプリコン中の第３のＴの両方に基づいて、ｆＣを同定することを更に含み得る。

【0029】

いくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｃａＣに相補的な位置に第４のＧを含み、第２のアンプリコンは、第４のＧに相補的な位置に第４の保護されていないＣを含む。方法は、第１のアンプリコン中の第４のＧ、第２のアンプリコン中の第４の保護されていないＣ、又は第１のアンプリコン中の第４のＧ及び第２のアンプリコン中の第４の保護されていないＣの両方に基づいて、ｃａＣを同定することを更に含み得る。

【0030】

いくつかの例では、第１のアンプリコンは、Ｕに相補的な位置に第４のＡを含み、第２のアンプリコンは、第４のＡに相補的な位置に第４のＴを含む。方法は、第１のアンプリコン中の第４のＡ、第２のアンプリコン中の第４のＴ、又は第１のアンプリコン中の第４のＡ及び第２のアンプリコン中の第４のＴの両方に基づいて、ｃａＣを同定することを更に含み得る。

【0031】

本明細書のいくつかの例は、細胞外液試料から単離されたポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、５位に保護基を含むシトシン（Ｃ）；及びチミン（Ｔ）を含んでもよい。

【0032】

いくつかの例では、第１の保護基は、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含む。

【0033】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含む。いくつかの例では、ｈｍＣは、第２の保護基を含む。いくつかの例では、第２の保護基は糖を含む。

【0034】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、ヒドロキシチミン（ｈＴ）を含む。

【0035】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドはホルミルシトシン（ｆＣ）を含む。

【0036】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、カルボキシルシトシン（ｃａＣ）を含む。

【0037】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドはウラシル（Ｕ）を含む。

【0038】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドはＤＮＡを含む。

【0039】

いくつかの例では、ポリヌクレオチドは、第１及び第２のアダプターを含む。

【0040】

本明細書におけるいくつかの例は、以下の構造であって、

【化2】

式中、Ｘは、第１の保護基と、メチレン基であって、それを介して保護基がスルホニウムイオン（Ｓ＋）に結合するメチレン基と、を含む、
構造を有するＳ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭ）を提供する。

【0041】

いくつかの例では、保護基は、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含む。

【0042】

本明細書におけるいくつかの例は、ポリヌクレオチドと、前述のｘＳＡＭｓのいずれかと、ポリヌクレオチド中のシトシンにｘＳＡＭの保護基を付加するメチルトランスフェラーゼ酵素と、を含む組成物を提供する。

【0043】

本明細書のいくつかの例は、細胞外液中に単離ポリヌクレオチド及びシチジンデアミナーゼ酵素を含む組成物を提供する。ポリヌクレオチドは、（ｉ）５位に保護基を含むシトシン（Ｃ）、及び（ｉｉ）メチルシトシン（ｍＣ）又はヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含んでもよい。シチジンデアミナーゼ酵素は、ｍＣを脱アミノ化してチミン（Ｔ）を形成し得るか、又はｈｍＣを脱アミノ化してヒドロキシチミン（ｈＴ）を形成し得る。

【0044】

本明細書のいくつかの例は、細胞外液中に単離されたポリヌクレオチド及びメチルトランスフェラーゼ酵素を含む組成物を提供する。ポリヌクレオチドは、（ｉ）５位に保護基を含むシトシン（Ｃ）、及び（ｉｉ）ホルミルシトシン（ｆＣ）又はカルボキシルシトシン（ｃａＣ）を含んでもよい。組成物は、ｆＣ又はｃａＣをＣに変換する酵素を含んでもよい。

【0045】

本明細書のいくつかの例は、細胞外液中の単離されたポリヌクレオチド及びβ－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）又はβ－アラビノシルトランスフェラーゼ（βＡＴ）酵素を提供する。ポリヌクレオチドは、（ｉ）５位に第１の保護基を含むシトシン（Ｃ）、及び（ｉｉ）ヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含んでもよい。βＧＴ又はβＡＴ酵素は、ｈｍＣに第２の保護基を付加することができる。

【0046】

本明細書に記載されている利益を実現するため、本明細書に記載されている本開示の態様の各々の任意のそれぞれの特徴／例は、任意の適切な組み合わせで一緒に実施されてもよいこと、及びこれらの態様のいずれか１つ以上からの任意の特徴／例は、任意の適切な組み合わせで、本明細書に記載されている他の態様の特徴のいずれかと一緒に実施されてもよいことを理解すべきである。

【図面の簡単な説明】

【0047】

【図1】Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭｓ）を用いてメチルシトシン及びその誘導体を検出するための一連の反応を概略的に示す図である。

【0048】

【図2】図１の選択された反応を概略的に示す図である。

【0049】

【図3】ｘＳＡＭｓを用いて、メチルシトシン及びその誘導体を検出するための、及びメチルシトシン誘導体を互いに区別するための更なる一連の反応スキームを概略的に示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0050】

本明細書で提供される実施例は、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭｓ）を用いたメチルシトシン及びその誘導体の検出に関する。そのような検出を行うための組成物及び方法が開示される。

【0051】

本明細書で提供されるように、任意のメチルシトシン（ｍＣ）をチミン（Ｔ）に変換し、任意のヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）をヒドロキシチミン（ｈＴ）に変換するために使用される更なる反応に対して比較的安定であるＸＣを生成するために、保護基（Ｘ）が、ポリヌクレオチド配列中の任意の非メチル化シトシン（Ｃ）の５位に付加される。配列がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅される場合、Ｔ及びｈＴはチミン（Ｔ）として増幅され、したがってｍＣ及びその誘導体ｈｍＣはＴとして配列決定される。比較すると、非メチル化Ｃは増幅され、Ｃとして配列決定される。したがって、配列中の任意のＣは、Ｔに変換されていないので、Ｃに対応するものとして同定され得る。そのようなスキームは、任意の非メチル化ＣがＣとして配列決定されるので、「４塩基」配列決定スキームと称され得る。「３塩基」配列決定スキームと比較して、本スキームは配列の複雑さを維持し、配列決定品質の向上、より高いマッピング率、及び配列の比較的均一なカバレッジをもたらし得る。ｍＣ及びその誘導体を互いに区別するための更なる反応が提供され、したがって、ゲノム配列中の任意のエピジェネティックマーカーを特徴付けるための更なる分析ツールが提供される。

【0052】

最初に、本明細書で使用されるいくつかの用語を簡単に説明する。次に、ｘＳＡＭＳを用いてメチルシトシン及びその誘導体を検出するためのいくつかの例示的な組成物及び例示的な方法を説明する。

【0053】

用語
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、当該技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。「含むこと（including）」という用語、並びに「含む（include）」、「含む（includes）」及び「含まれた（included）」などの他の形態の使用は、限定ではない。「有すること（having）」という用語、並びに「有する（have）」、「有する（has）」及び「有した（had）」などの他の形態の使用は、限定ではない。本明細書で使用される場合、移行句中か又は請求項の本文中のいずれであっても、「含む（comprise）」及び「含む（comprising）」という用語は、オープンエンドの意味を有するものとして解釈されるべきである。すなわち、上記の用語は、語句「少なくとも有する」又は「少なくとも含む」と同義であると解釈されるべきである。例えば、プロセスの文脈において使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、プロセスが少なくとも列挙された工程を含むが、追加の工程を含み得ることを意味する。化合物、組成物、又はデバイスの文脈で使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、化合物、組成物、又はデバイスが少なくとも列挙された特徴又は構成要素を含むが、追加の特徴又は構成要素も含み得ることを意味する。

【0054】

本明細書全体を通して使用される「実質的に」、「およそ（approximately）」、及び「約」という用語は、処理のばらつきなどに起因する小さな変動を記載及び考慮するために使用されている。例えば、それらは、±５％以下など、±２％以下など、±１％以下など、±０．５％以下など、±０．２％以下など、±０．１％以下など、±０．０５％以下などの、±１０％以下を指し得る。

【0055】

本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズ」は、それらのポリマーの長さに沿って第１のポリヌクレオチドを第２のポリヌクレオチドに非共有結合させて、二重の鎖となった「二本鎖」を形成することを意図する。例えば、２つのＤＮＡポリヌクレオチド鎖は、相補的な塩基対合を介して会合し得る。第１及び第２のポリヌクレオチド間の会合の強度は、それらのポリヌクレオチド内のヌクレオチド配列間の相補性とともに増加する。ポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションの強度は、二重鎖の５０％が互いに解離する融解温度（Ｔｍ）によって特徴付けられ得る。

【0056】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、糖、及び少なくとも１つのホスフェート基を含み、一部の例では、核酸塩基もまた含む分子を意味することが意図される。核酸塩基を欠くヌクレオチドは、「脱塩基」と称され得る。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、修飾デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチド、修飾ペプチドヌクレオチド、修飾ホスフェート糖骨格ヌクレオチド、及びそれらの混合物を含む。ヌクレオチドの例には、アデノシン一リン酸（adenosine monophosphate、ＡＭＰ）、アデノシン二リン酸（adenosine diphosphate、ＡＤＰ）、アデノシン三リン酸（adenosine triphosphate、ＡＴＰ）、チミジン一リン酸（thymidine monophosphate、ＴＭＰ）、チミジン二リン酸（thymidine diphosphate、ＴＤＰ）、チミジン三リン酸（thymidine triphosphate、ＴＴＰ）、シチジン一リン酸（cytidine monophosphate、ＣＭＰ）、シチジン二リン酸（cytidine diphosphate、ＣＤＰ）、シチジン三リン酸（cytidine triphosphate、ＣＴＰ）、グアノシン一リン酸（guanosine monophosphate、ＧＭＰ）、グアノシン二リン酸（guanosine diphosphate、ＧＤＰ）、グアノシン三リン酸（guanosine triphosphate、ＧＴＰ）、ウリジン一リン酸（uridine monophosphate、ＵＭＰ）、ウリジン二リン酸（uridine diphosphate、ＵＤＰ）、ウリジン三リン酸（uridine triphosphate、ＵＴＰ）、デオキシアデノシン一リン酸（deoxyadenosine monophosphate、ｄＡＭＰ）、デオキシアデノシン二リン酸（deoxyadenosine diphosphate、ｄＡＤＰ）、デオキシアデノシン三リン酸（deoxyadenosine triphosphate、ｄＡＴＰ）、デオキシチミジン一リン酸（deoxythymidine monophosphate、ｄＴＭＰ）、デオキシチミジン二リン酸（deoxythymidine diphosphate、ｄＴＤＰ）、デオキシチミジン三リン酸（deoxythymidine triphosphate、ｄＴＴＰ）、デオキシシチジン二リン酸（deoxycytidine diphosphate、ｄＣＤＰ）、デオキシシチジン三リン酸（deoxycytidine triphosphate、ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン一リン酸（deoxyguanosine monophosphate、ｄＧＭＰ）、デオキシグアノシン二リン酸（deoxyguanosine diphosphate、ｄＧＤＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（deoxyguanosine triphosphate、ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン一リン酸（deoxyuridine monophosphate、ｄＵＭＰ）、デオキシウリジン二リン酸（deoxyuridine diphosphate、ｄＵＤＰ）及びデオキシウリジン三リン酸（deoxyuridine triphosphate、ｄＵＴＰ）が含まれる。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語はまた、天然に存在するヌクレオチドと比較して修飾された核酸塩基、糖及び／又はリン酸部分を含むタイプのヌクレオチドである、任意のヌクレオチドアナログを包含することが意図される。例となる修飾核酸塩基の例には、イノシン、キササニン、ヒポキササニン、イソシトシン、イソグアニン、２－アミノプリン、５－メチルシトシン、５－ヒドロキシメチルシトシン、２－アミノアデニン、６－メチルアデニン、６－メチルグアニン、２－プロピルグアニン、２－プロピルアデニン、２－チオウラシル、２－チオチミン、２－チオシトシン、１５－ハロウラシル、１５－ハロシトシン、５－プロピニルウラシル、５－プロピニルシトシン、６－アゾウラシル、６－アゾシトシン、６－アゾチミン、５－ウラシル、４－チオウラシル、８－ハロアデニン又はグアニン、８－アミノアデニン又はグアニン、８－チオールアデニン又はグアニン、８－チオアルキルアデニン又はグアニン、８－ヒドロキシルアデニン又はグアニン、５－ハロ置換ウラシル又はシトシン、７－メチルグアニン、７－メチルアデニン、８－アザグアニン、８－アザアデニン、７－デアザグアニン、７－デアザアデニン、３－デアザグアニン、３－デアザアデニンなどが含まれる。当技術において公知のとおり、ある特定のヌクレオチドアナログは、ポリヌクレオチド、例えば、アデノシン５’－ホスホスルフェートなどのヌクレオチドアナログに組み込まれた状態にはなり得ない。ヌクレオチドは、任意の好適な数のホスファート、例えば、３、４、５、６、又は６を超えるホスフェートを含み得る。

【0058】

本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」とは、相互に結合しているヌクレオチドの配列を含む分子を指す。ポリヌクレオチドは、ポリマーの非限定的な一例である。ポリヌクレオチドの例は、デオキシリボ核酸（deoxyribonucleic acid、ＤＮＡ）、リボ核酸（ribonucleic acid、ＲＮＡ）、及びそれらのアナログを含む。ポリヌクレオチドは、ＲＮＡ又は一重鎖ＤＮＡなどのヌクレオチドの一重鎖配列であり得、二重鎖ＤＮＡなどのヌクレオチドの二重鎖配列であるか、又はヌクレオチドの一重鎖及び二重鎖配列の混合物を含み得る。二本鎖ＤＮＡ（double stranded DNA、ｄｓＤＮＡ）は、ゲノムＤＮＡ、及びＰＣＲ及び増幅生成物を含む。一本鎖ＤＮＡ（single stranded DNA、ｓｓＤＮＡ）は、ｄｓＤＮＡに変換され得、その反対もあり得る。ポリヌクレオチドには、エナンチオマーＤＮＡなどの天然に存在しないＤＮＡが含まれ得る。ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの正確な配列は、既知であっても未知であってもよい。以下は、ポリヌクレオチドの例である：遺伝子又は遺伝子断片（例えば、プローブ、プライマー、発現配列タグ（expressed sequence tag、ＥＳＴ）、又は遺伝子発現連続分析（serial analysis of gene expression、ＳＡＧＥ）タグ）、ゲノムＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、エクソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（messenger RNA、ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、合成ポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、いかなる配列の単離されたＤＮＡ、いかなる配列の単離されたＲＮＡ、核酸プローブ、前述のいずれかのプライマー又は増幅されたコピー。

【0059】

本明細書で使用される場合、「ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドをポリヌクレオチドに重合することによってポリヌクレオチドを組み立てる活性部位を有する酵素を意味することが意図される。ポリメラーゼは、プライミングされた一重鎖標的ポリヌクレオチドに結合し、ヌクレオチドをプライマーに連続的に付加して成長させ、標的ポリヌクレオチドの配列に相補的な配列を有する「相補的コピー」ポリヌクレオチドを形成することができる。次いで、別のポリメラーゼ、又は同じポリメラーゼは、その相補的コピーポリヌクレオチドの相補的コピーを形成することによって、標的ヌクレオチドのコピーを形成することができる。かかるコピーのいずれも、本明細書では「アンプリコン」と称され得る。ＤＮＡポリメラーゼは、標的ポリヌクレオチドに結合し、次いで、標的ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド鎖の３’末端の遊離ヒドロキシル基に連続的に付加して成長させ（アンプリコン成長）つつ、標的ポリヌクレオチドを下流へ移動することができる。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型から相補的ＤＮＡ分子を合成し得、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型からＲＮＡ分子を合成し得る（転写）。ポリメラーゼは、短いＲＮＡ又はＤＮＡ鎖（プライマー）を使用して、鎖成長を開始し得る。いくつかのポリメラーゼは、それらが鎖に塩基を付加する部位の上流の鎖を置換し得る。かかるポリメラーゼは、鎖置換であるとも言われ得、これは、ポリメラーゼによって読み取られる鋳型鎖から相補鎖を除去する活性を有すると言われ得る。鎖置換活性を有する例示的なポリメラーゼには、Ｂｓｔ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））ポリメラーゼ、エキソ－クレノウポリメラーゼ又はシークエンシンググレードＴ７エキソ－ポリメラーゼの大きな断片が含まれるが、これらに限定されない。いくつかのポリメラーゼは、それらの前の鎖を切断し、それを成長する鎖に効果的に置き換える（５’エキソヌクレアーゼ活性）。いくつかのポリメラーゼは、それらの後ろの鎖を分解する活性を有する（３’エキソヌクレアーゼ活性）。いくつかの有用なポリメラーゼは、３’及び／又は５’エキソヌクレアーゼ活性を低減又は排除するために変異又は他の方法で修飾されている。

【0060】

本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、ヌクレオチドが遊離３’ＯＨ基を介して付加され得るポリヌクレオチドとして定義される。プライマーの長さは、任意の好適な数の塩基の長さであり得、天然及び／又は非天然ヌクレオチドの好適な組み合わせを含み得る。標的ポリヌクレオチドは、プライマーにハイブリダイズする（プライマーに相補的な配列を有する）「アダプター」を含み得、プライマーの遊離３’ＯＨ基にヌクレオチドを付加することによって相補的コピーポリヌクレオチドを生成するように増幅され得る。プライマーは、基板に結合され得る。

【0061】

本明細書で使用される場合、用語「基板」とは、本明細書に記載されている組成物のための支持体として使用される材料を指す。例となる基板材料は、ガラス、シリカ、プラスチック、石英、金属、金属酸化物、オルガノ－シリケート（例えば、多面体有機シルセスキオキサン（polyhedral organic silsesquioxanes、ＰＯＳＳ））、ポリアクリレート、酸化タンタル、相補型金属酸化膜半導体（complementary metal oxide semiconductor、ＣＭＯＳ）、又はそれらの組み合わせを含むことができる。ＰＯＳＳの一例は、Ｋｅｈａｇｉａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ８６（２００９），ｐｐ．７７６－７７８に記載されているものであり得、これは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。いくつかの例では、本出願に使用される基板は、ガラス、溶融シリカ、又は他のシリカ含有材料などのシリカベースの基板を含む。いくつかの例では、基板は、シリコン、窒化ケイ素、又は水素化シリコーンを含み得る。いくつかの例では、本出願において使用される基板は、ポリエチレン、ポリスチレン、ポリ（塩化ビニル）、ポリプロピレン、ナイロン、ポリエステル、ポリカーボネート、及びポリ（メタクリル酸メチル）などのブラスチック材料又は構成成分を含む。プラスチック材料の例は、ポリ（メタクリル酸メチル）、ポリスチレン、及び環式オレフィンポリマー基板を含む。いくつかの例では、基板は、シリカベースの材料若しくはプラスチック材料、又はそれらの組み合わせであるか、又はそれらを含む。特定の例では、基板は、ガラス又はケイ素系ポリマーを含む少なくとも１つの表面を有する。いくつかの例では、基板は金属を含み得る。一部のこのような例では、金属は金である。いくつかの例では、基板は、金属酸化物を含む少なくとも１つの表面を有する。一例では、表面は、酸化タンタル又は酸化スズを含む。アクリルアミド、エノン、又はアクリレートもまた、基板材料又は構成成分として利用することができる。他の基板材料としては、ガリウムヒ素、インジウムホスフィド、アルミニウム、セラミック、ポリイミド、石英、樹脂、ポリマー、石英、樹脂、ポリマー及びコポリマーが挙げられ得るが、これらに限定されない。いくつかの例では、基板及び／又は基板表面は、石英であり得るか、又は石英を含み得る。いくつかの他の例では、基板及び／又は基板表面は、ＧａＡｓ又はＩＴＯなどの半導体であり得るか、又はそれを含み得る。上述のリストは、本出願を例示することが意図されているが、本出願を限定するものではない。基板は、単一の材料又は複数の異なる材料を含み得る。基板は、複合材又は積層体であり得る。いくつかの例では、基板は、有機シリケート材料を含む。基板は、平坦、円形、球形、棒状、又は任意の他の好適な形状であり得る。基板は、剛性であってもよく、又は可撓性であってもよい。いくつかの例では、基板は、ビーズ又はフローセルである。

【0062】

いくつかの例では、表面はパターン化された表面である。「パターン化された表面」は、基板の露出層内又はその上における、異なる領域の配列を指す。例えば、１つ以上の領域は、１つ以上の捕捉プライマーが存在する特徴であり得る。この特徴は、捕捉プライマーが存在しない間隙領域によって分離され得る。いくつかの例では、パターンは、行及び列にある特徴のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は間隙領域の繰り返し配列であり得る。いくつかの例では、パターンは、特徴及び／又は間隙領域のランダム配列であり得る。いくつかの例では、基板は、表面にウェル（窪み）のアレイを含む。ウェルは、実質的に垂直な側壁によって提供され得る。ウェルは、フォトリソグラフィ、スタンピング技術、成形技術、及びマイクロエッチング技術を含むがこれらに限定されない様々な技術を使用して、当該技術分野において一般的に知られているように製造することができる。当該技術分野において理解されるように、使用される技術は、アレイ基板の組成物及び形状に依存する。

【0063】

基板のパターン付き表面内の特徴としては、パターン化された、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド）（ＰＡＺＡＭ）などの共有結合性のゲルが、ガラス、シリコン、プラスチック、又は他の適切な材料の上にアレイ状に並んだウェルなどが挙げられ得る。このプロセスは、シークエンシングのために使用されるゲルパッドを作成し、これは、多数のサイクルでシークエンシング操作にわたって安定であり得る。ポリマーをウェルに共有結合することは、様々な用途の間に、構造化基板の寿命全体にわたってゲルを構造化特徴部に維持するのに有用であり得る。しかしながら、多くの例では、ゲルは、ウェルに共有結合される必要はない。例えば、いくつかの条件では、構造化基板のどの部分にも共有結合されていないシランフリーのアクリルアミド（silane free acrylamide、ＳＦＡ）をゲル材料として使用することができる。

【0064】

特定の例では、構造化基板は、ウェル（例えば、マイクロウェル又はナノウェル）を用いて好適な材料をパターン化し、パターン化された材料をゲル材料（例えば、ＰＡＺＡＭ、ＳＦＡ、又はその化学修飾された変異体、例えばＳＦＡのアジド化型（アジド－ＳＦＡ）など）でコーティングし、ゲルでコーティングされた材料を、例えば化学的研磨又は機械的研磨によって研磨することによって作製することができ、それによって、ウェル内にゲルが保持されるが、ウェル間の構造化基板の表面の間隙領域からは、実質的に全てのゲルを除去されるか又は不活性化される。プライマーは、ゲル材料に結合され得る。次いで、複数の標的ポリヌクレオチド（例えば、断片化されたヒトゲノム又はその一部）を含む溶液を、個々の標的ポリヌクレオチドがゲル材料に付着したプライマーとの相互作用を介して個々のウェルにシードされるように、研磨された基板と接触させ得るが、標的ポリヌクレオチドは、ゲル材料が存在しないか又はそれが不活性であるため、間隙領域を占有しない。標的ポリヌクレオチドの増幅は、間隙領域内のゲルの不在又は不活性により、クラスタの外向きの移動を防止するため、ウェル内に限局され得る。このプロセスは、簡便な製造が可能であり、スケーラブルであり、また従来のマイクロ又はナノ製造方法を利用するものである。

【0065】

パターン化された基板としては、例えば、スライド又はチップにエッチングされたウェルが挙げられ得る。ウェルのエッチング及び幾何学形状のパターンは、様々な異なる形状及びサイズとすることができ、かかる特徴は、互いに物理的又は機能的に分離可能であり得る。かかる構造的特徴を有する特に有用な基板としては、ミクロスフェアなどの、固体粒子のサイズを選択し得るパターン化基板が挙げられる。これらの特性を有するパターン化基板の例は、ＢＥＡＤ ＡＲＲＡＹ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に関連して使用されるエッチング基板である。

【0066】

いくつかの例では、本明細書に記載されている基板は、フローセルの少なくとも一部を形成するか、又はフローセル内に位置するか、又はフローセルに結合されている。フローセルは、複数のレーン又は複数のセクターに分割されているフローチャンバを含んでもよい。本明細書に記載の方法及び組成物で使用され得るフローセル及びフローセルの製造のための基板の例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されているものが含まれるが、これらに限定されない。

【0067】

本明細書で使用するとき、用語「複数の」とは、２つ以上の異なるメンバーの集団を意味することを意図する。複数とは、小さい、中程度、大きい、から非常に大きいサイズまでの範囲であり得る。小さいサイズの複数とは、例えば、数メンバー～数十メンバーの範囲であり得る。中程度のサイズの複数とは、例えば、数十メンバー～約１００メンバー又は数百メンバーの範囲であり得る。大きい複数とは、例えば、約数百メンバー～約１０００メンバー、数千メンバー、及び数万メンバーの範囲であり得る。非常に大きな複数とは、例えば、数万メンバー～約数十万、数百万、数千万、又は数億以上のメンバーの範囲であり得る。したがって、複数は、２から１億をはるかに超えるメンバーのサイズの範囲、並びにメンバーの数によって測定される全てのサイズの間及び上記の例示的な範囲よりも大きい範囲であり得る。複数のポリヌクレオチドの例としては、例えば、約１×１０^５以上、５×１０^５以上又は１×１０^６以上の異なるポリヌクレオチドの集団が挙げられる。したがって、この用語の定義は、２より大きい全ての整数値を含むことが意図される。複数値の上限は、例えば、試料中のポリヌクレオチド配列の理論的多様性によって設定され得る。

【0068】

本明細書で使用される場合、用語「標的ポリヌクレオチド」は、分析又は動作の対象であるポリヌクレオチドを意味することが意図される。分析又は動作は、ポリヌクレオチドを増幅、配列決定、及び／又は他の手順に供することを含む。標的ポリヌクレオチドは、分析される標的配列に追加のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、プライマー結合部位として機能するアダプターを含む１つ以上のアダプターを含み得、それは、分析される標的ポリヌクレオチド配列の側方にある（flank）。

【0069】

「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は、本明細書においては交換可能に使用される。用語の違いは、特に明記しない限り、サイズ、配列、又は他の特性の任意の特定の違いを示すことを意図するものではない。説明を明確にするために、いくつかのポリヌクレオチド種を含む特定の方法又は組成物を説明する際に、１つの種のポリヌクレオチドを別の種と区別するために用語を使い分けてもよい。

【0070】

本明細書で使用するとき、用語「アンプリコン」は、ポリヌクレオチドに関して使用する場合、ポリヌクレオチドの複製による生成物を意味し、この生成物は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部と実質的に同じ又は相補的なヌクレオチド配列を有する。「増幅」及び「増幅すること」は、ポリヌクレオチドのアンプリコンを作製するプロセスを指す。標的ポリヌクレオチドの第１のアンプリコンは、典型的には相補的なコピーであり得る。追加的なアンプリコンは、第１のアンプリコンの生成後に、標的ポリヌクレオチド又は第１のアンプリコンから作成されたコピーである。後続のアンプリコンは、標的ポリヌクレオチドと実質的に相補的であるか、又は標的ポリヌクレオチドと実質的に同一である配列を有し得る。ポリヌクレオチドの（例えば、増幅アーチファクトによる）少数の変異が、そのポリヌクレオチドのアンプリコンを生成するときに起こり得ることは理解されるであろう。

【0071】

本明細書で使用される場合、「メチルシトシン」又は「ｍＣ」という用語は、メチル基（－ＣＨ_３又は－Ｍｅ）を含むシトシンを指す。メチル基はシトシンの５位に位置してもよく、その場合、ｍＣは５ｍＣと称され得る。

【0072】

本明細書で使用される場合、メチルシトシンの「誘導体」は、酸化メチル基を有するメチルシトシンを指す。酸化されたメチル基の非限定的な例は、ヒドロキシメチル（－ＣＨ_２ＯＨ）であり、その場合、ｍＣ誘導体は、ヒドロキシメチルシトシン又はｈｍＣと称され得る。酸化メチル基の別の非限定的な例はホルミル基（－ＣＨＯ）であり、この場合、ｍＣ誘導体はホルミルシトシン又はｆＣと称され得る。酸化メチル基の別の非限定的な例は、カルボキシル（－ＣＯＯＨ）であり、この場合、ｍＣ誘導体は、カルボキシルシトシン又はｃａＣと称され得る。酸化メチル基はシトシンの５位に位置してもよく、その場合、ｈｍＣは５ｈｍＣと呼ばれてもよく、ｆＣは５ｆＣと呼ばれてもよく、又はｃａＣは５ｃａＣと呼ばれてもよい。

【0073】

本明細書で使用される場合、チミン（T）の「誘導体」とは、酸化メチル基を有するチミンを指す。酸化メチル基の非限定的な例は、ヒドロキシメチル（－COH）であり、この場合、T誘導体は、ヒドロキシチミン又はhTと称され得る。酸化メチル基はチミンの5位に位置してもよく、この場合、hTは5hTと称されてもよい。

【0074】

本明細書で使用される場合、S－アデノシル－L－メチオニン（SAM）は、以下の構造を有する化合物を指す。

【化3】

スルホニウム（Ｓ＋）イオンに結合したメチル基は、上で参照したＤｅｅｎ ｅｔ ａｌ．に記載されているような方法でメチルトランスフェラーゼによってシトシンに転移させることができる。塩素（Ｃｌ－）などの対イオンが存在する可能性があるか、又はプロトンをＣＯＯＨから除去して中性原子を提供することができる。更に、溶液中のアミノ酸は、双性イオンアイソフォーム（ＣＯＯ－、ＮＨ３＋）であってもよい。

【0075】

本明細書で使用される場合、Ｓ－アデノシル－Ｌ－メチオニン類似体（ｘＳＡＭ）という用語は、以下の構造であって、

【化4】

式中、Ｘは、保護基と、メチレン基であって、それを介して保護基がＳに結合するメチレン基と、を含む、構造を有する化合物を指す。Ｘは、１つ以上の酵素の活性に適合していてもよく、１つ以上の酵素の活性を阻害していてもよい。例えば、本明細書においてより詳細に記載されるように、Ｘは、メチルトランスフェラーゼ酵素の活性と適合性であり得、その結果、メチルトランスフェラーゼは、Ｄｅｅｍ ｅｔ ａｌ．に記載されているのと同様の様式で、ｘＳＡＭに作用して、ｘＳＡＭのスルホニウムイオンに結合したＸをシトシンに移動させてＸＣを形成することができ、メチルトランスフェラーゼはＳＡＭに作用して、スルホニウム結合メチル基をシトシンに移動させてｍＣを形成する。それに加えて、又はその代わりに、Ｘは、シチジンデアミナーゼ酵素の活性と不適合であり得、その結果、シチジンデアミナーゼ酵素は、他の場合ではシチジンデアミナーゼがＣに作用してＵを形成し、ｍＣに作用してＴを形成し、又はｈｍＣに作用してｈＴを形成するのと同様の様式でＸＣを脱アミノ化するようにＸＣに作用し得ない。Ｘの非限定的な例としては、メチレンアルキン基

【化5】

メチレンカルボキシル基

【化6】

メチレンアミノ基

【化7】

メチレンヒドロキシメチル基

【化8】

メチレンイソプロピル基

【化9】

又はメチレン色素基

【化10】

が挙げられる。

【0076】

本明細書で使用使用される場合、「メチルトランスフェラーゼ酵素」又は「ＭＴａｓｅ」は、基質にメチル基を付加（又は「メチル化」）し得るか、又は基質からメチル基を除去（又は「脱メチル化」）し得る酵素を指す。いくつかのメチルトランスフェラーゼは、ＳＡＭ由来のメチル基（Ｍｅ）を基質（例えば、Ｃ）に付加し得、そしてまた、代替的に、ＸＳＡＭ由来の保護基（Ｘ）をこのような基質（例えば、Ｃ）に付加し得る。保護基ＸをＸＳＡＭからＣに付加するのに適したメチルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ．，「ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ（ＤＮＭＴｓ），ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｐａｉｒ，ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ，」Ａｄｖ Ｅｘｐ Ｍｅｄ Ｂｉｏｌ．７５４：３－２９（２０１３）に記載されているＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、及びＤＮＭＴ３Ｂなどの哺乳動物メチルトランスフェラーゼ、並びにＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）から市販されているｄａｍ及びＣｐＧ（Ｍ．ＳｓｓＩ）などの細菌メチルトランスフェラーゼが挙げられる。いくつかのメチルトランスフェラーゼは、ｃａＣなどの基質から酸化メチル基（ホルミル又はカルボキシルなど）を除去することができる。ＳＡＭの非存在下でｃａＣを脱炭酸し得るメチルトランスフェラーゼの非限定的な例としては、細菌Ｃ５－メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩ及びＭ．ＳｓｓＩが挙げられる（後者はまた、上記のような様式でＸＳＡＭ由来の保護基ＸをＣに付加するために使用され得る）。ｃａＣからカルボキシ基を除去してＣを形成するためのメチルトランスフェラーゼの使用の更なる詳細については、全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｌｉｕｔｋｅｖｉｃｉｕｔｅ ｅｔ ａｌ．，「Ｄｉｒｅｃｔ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｔｉｏｎ ｏｆ ５－ｃａｒｂｏｘｙｌｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂｙ ＤＮＡ Ｃ５－ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ，」Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１３６（１６）：５８８４－５８８７（２０１４）を参照されたい。

【0077】

本明細書で使用される場合、「チミンデグリコシダーゼ」（ＴＤＧ）は、ｆＣ又はｃａＣから塩基を切除し、切除された塩基をＣで置き換える酵素を指し、これは塩基除去修復（ＢＥＲ）と呼ばれ得る反応である。ＴＤＧ及びＢＥＲに関する更なる詳細については、全内容が、参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｏｈｌｉ ｅｔ ａｌ．，「ＴＥＴ ｅｎｚｙｍｅｓ，ＴＤＧ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｙｎａｍｉｃｓ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，」Ｎａｔｕｒｅ ５０２（７４７２）：４７２－４７９（２０１３）を参照されたい。

【0078】

本明細書で使用される場合、「シチジンデアミナーゼ酵素」は、シトシン及び／又は１つ以上のシトシン誘導体を脱アミノ化する酵素を指す。脱アミノ化は、シトシン又はシトシン誘導体の６位で行うことができる。例えば、シチジンデアミナーゼ酵素は、シトシンを脱アミノ化してＵを形成することができ、ｍＣを脱アミノ化してＴを形成することができ、並びに／あるいはｈｍＣを脱アミノ化してｈＴを形成することができる。シチジンデアミナーゼ酵素は、必ずしも全ての可能なシトシン誘導体を脱アミノ化しなくてもよい。例えば、シチジンデアミナーゼ酵素は、５位にＸを含むシトシンを脱アミノ化しなくてもよく、ｆＣを脱アミノ化してホルミルウリジン（ｆＵ）を形成しなくてもよく、及び／又はｃａＣを脱アミノ化してカルボキシウリジン（ｃａＵ）を形成しなくてもよい。シトシンを脱アミノ化してＵを形成し得る、ｍＣを脱アミノ化してＴを形成し得る、及び／又はｈｍＣを脱アミノ化してｈＴを形成し得る、並びにｆＣを脱アミノ化してｆＵを形成しなくてもよい、及び／又はｃａＣを脱アミノ化してｃａＵを形成しなくてもよいシチジンデアミナーゼ酵素の非限定的な例は、アポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ）である。そのようなＡＰＯＢＥＣの非限定的な例には、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ２、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｂ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｃ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｅ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｈ、及びＡＰＯＢＥＣ４が含まれる。

【0079】

本明細書で使用される場合、「β－グルコシルトランスフェラーゼ酵素」又は「βＧＴ」は、グルコース基（例えば、グルコース又はグルコース誘導体）をｈｍＣに、例えば、ｈｍＣの５位のヒドロキシメチル基に付加して、β－グルコシル－５－ヒドロキシメチルシトシン（１，２）を形成する酵素を指す。βＧＴの非限定的な例は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｓｗｉｔｃｈ，ＭＡ）から市販されているＴ４ファージβ－グルコシルトランスフェラーゼ（Ｔ－４ＢＧＴ）である。

【0080】

本明細書で使用される場合、「β－アラビノシルトランスフェラーゼ酵素」又は「βＡＴ」は、アラビノース基をｈｍＣに、例えばｈｍＣの５位のヒドロキシメチル基に付加して、アラビノシル－ｈｍＣを形成する酵素を指す。βＡＴの非限定的な例は、全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Ｔｈｏｍａｓ ｅｔ ａｌ．，「Ｔｈｅ ｏｄｄ ‘ＲＢ’Ｐｈａｇｅ－ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｒａｂｉｎｏｓｙｌａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｎｅｗ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｉｎ Ｔ４－ｌｉｋｅ ｐｈａｇｅ ＲＢ６９，」Ｖｉｒｕｓｅｓ １０（６）：３１３，１８ ｐａｇｅｓ（２０１８）に記載される、Ｔ４様ファージＲＢ６９ ＯＲＦ００３ｃである。

【0081】

本明細書中で使用される場合、「保護基」は、酵素の活性を阻害する化学基を意味することが意図される。例えば、メチレン基を介してシトシンの５位に結合される保護基は、他の場合ではシトシンを脱アミノ化してウラシルを形成するシチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害し得る。別の例として、ｈｍＣの５位のヒドロキシメチル基における保護基（例えば、グルコース又はアラビノースなどの糖）は、他の場合ではｈｍＣを脱アミノ化してヒドロキシチミンを形成するシチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害し得る。

【0082】

ｘＳＡＭＳを用いてメチルシトシン及びその誘導体を検出するための組成物及び方法
本明細書で提供されるいくつかの例は、ｘＳＡＭｓを用いたメチルシトシン及びその誘導体の検出に関する。そのような検出を行うための組成物及び方法が開示される。

【0083】

例えば、シトシン（Ｃ）及びメチルシトシン（ｍＣ）を含み、そしてまたヒドロキシメチルシトシン（ｈｍＣ）を含み得る配列を有する標的ポリヌクレオチドは、脱アミノ化からＣを保護し、次いでｍＣを脱アミノ化してチミン（Ｔ）を形成し、ｈｍＣを脱アミノ化してヒドロキシチミン（ｈＴ）を形成するような様式で修飾され得る。以下により詳細に記載されるような様式で、その後、配列がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅される場合、Ｔ及び任意のｈＴは、チミジン（Ｔ）として増幅され、したがって、ｍＣ及びｈｍＣは、Ｔとして配列決定され得る。比較において、非メチル化（及び保護）Ｃは、Ｃとして増幅され、配列決定される。したがって、配列中の任意のＣは、ｍＣ及びｈｍＣのようにＴ又はＴ誘導体に変換されていないので、Ｃに対応するものとして同定され得る。したがって、本方法は、非メチル化ＣがＣとして配列決定され得る「４塩基」配列決定法を提供し、したがって、その塩基によって保有されるゲノム情報を保存する。以下により詳細に記載されるような様式で、ｍＣ及びｈｍＣは、更なる反応スキームを使用して互いに区別され得る。

【0084】

図１は、ｘＳＡＭＳを用いてメチルシトシン（ｍＣ）及びその誘導体を検出するための一連の反応を概略的に示す。図１に示されるように、脱アミノ化からＣを保護することは、Ｃの５位に第１の保護基を付加することを含み得る。例えば、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素（ＭＴａｓｅ）は、ＸをＣの５位に付加して、図１に示されるような様式でＸＣを形成し得、ここで、Ｘは、保護基及びメチレン基を含み、メチレン基を介して保護基がＣに結合される。例示的には、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素は、以下の構造であって、

【化11】

式中、Ｘは、第１の保護基と、メチレン基であって、それを介して第１の保護基がスルホニウムイオンに結合するメチレン基と、を含む、構造を有するｘＳＡＭからＸを付加し得る。非限定的な例では、第１の保護基は、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含み得る。スルホニウムに結合した第１の保護基及びメチレン基を有するｘＳＡＭは、スルホニウムに結合したメチル基を有するＳＡＭの代わりに代理の補因子として働くことができ、したがって、メチルトランスフェラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の任意の非メチル化Ｃの５位にメチレン基（それに結合した第１の保護基を有する）を共有結合的に付着させて、５ＸＣを形成することができる。メチルトランスフェラーゼの作用中に、ポリヌクレオチド、ｘＳＡＭ、及びｘＳＡＭからのＸをポリヌクレオチド中のＣに付加するメチルトランスフェラーゼ酵素を含む組成物が形成され得る。適切な量のメチルトランスフェラーゼ及びｘＳＡＭが、細胞外液中でポリヌクレオチドと混合され得ることが理解される。例えば、ｘＳＡＭは化学量論的試薬であるため、少なくともゲノム試料中に存在するＣと同じ量のｘＳＡＭを添加してもよく、過剰のｘＳＡＭを添加してもよい。

【0085】

図１に示すように、メチルトランスフェラーゼは、標的ポリヌクレオチド中の任意のｍＣ及び／又は任意のｍＣ誘導体にＸを付加することができない場合がある（したがって、第１の保護基を付加することができない場合がある）ことに留意されたい。例えば、ｍＣのメチル基は、メチル基が既にその位置を占めているので、ｍＣの５位へのＸ（及び第１の保護基）の付加を阻害し得る。同様に、任意のｈｍＣのヒドロキシメチル基は、ｈｍＣの５位へのＸ（及び第１の保護基）の付加を阻害し得、任意のｆＣのホルミル基は、ｆＣの５位へのＸ（及び第１の保護基）の付加を阻害し得、任意のｃａＣのカルボキシル基は、ｃａＣの５位へのＸ（及び第１の保護基）の付加を阻害し得る。

【0086】

標的ポリヌクレオチド中のＣの保護に続いて、ｍＣ及び／又はその誘導体のいずれかを、例えばシチジンデアミナーゼ酵素を用いて脱アミノ化することができる。これに関して、第１の保護基は、第１のメチルトランスフェラーゼ酵素内に適合するように選択されてもよく、したがって第１のメチルトランスフェラーゼ酵素の活性と適合性であってもよいが、第１の保護基はシチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害し得る。更に、任意のｆＣのホルミル基は、シチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害し得、任意のｃａＣのカルボキシル基は、シチジンデアミナーゼ酵素の活性を阻害し得る。比較すると、ｍＣのメチル基及びｈｍＣのヒドロキシメチル基は、シチジンデアミナーゼ酵素の活性と適合し得る。したがって、図１に示されるように、ＸＣ、任意のｆＣ、及び任意のｃａＣは、シチジンデアミナーゼ酵素によって脱アミノ化され得ないが、任意のｍＣは脱アミノ化されてＴを形成し得、任意のｈｍＣは脱アミノ化されてｈＴを形成し得る。シチジンデアミナーゼ酵素の作用中に、細胞外液中にポリヌクレオチド及びシチジンデアミナーゼ酵素を含む組成物が形成され得る。ポリヌクレオチドは、ＸＣ及びｍＣ及び／又はｈｍＣを含み得る。シチジンデアミナーゼ酵素は、ｍＣを脱アミノ化してＴを形成するか、又はｈｍＣを脱アミノ化してｈＴを形成することができる。適切な量のシチジンデアミナーゼ酵素が、細胞外液中のポリヌクレオチドと混合され得ることが理解される。例えば、シチジンデアミナーゼは、触媒量で、例えば、脱アミノ化されるｍＣ及びｈｍＣの数より少ない量で添加され得る。

【0087】

図１に示すように、次にＰＣＲを行って標的ポリヌクレオチドのアンプリコンを生成することができる。アンプリコンの第１のセットにおいて、メチル化されていない保護されたＣはＣとして増幅されるが、Ｔ及びｈＴはＴとして増幅され、ｆＣ及びｃａＣはＣとして増幅される。相補的アンプリコンの第２のセットもまた、ＰＣＲを使用して生成され、ここで、メチル化されていない保護されたＣはＧとして増幅され、Ｔ及びｈＴはＡとして増幅され、ｆＣ及びｃａＣはＧとして増幅されることが理解されるであろう。次いで、アンプリコンは、合成による配列決定（ＳＢＳ）などの公知の技術を使用して配列決定され得る。ｍＣ及びｈｍＣが位置し、Ｔ及びｈＴが脱アミノ化を使用して生成され、Ｃが本ｘＳＡＭを使用して保護される標的ポリヌクレオチド中の位置は、得られたアンプリコンの配列を、ｍＣ及びｈｍＣが脱アミノ化されず、したがって、Ｃとして（又は相補的アンプリコンではＧとして）増幅され、配列決定されるアンプリコンの配列と比較することによって決定することができる。脱アミノ化アンプリコンにおいてＴ（又はＡ）であり、非脱アミノ化アンプリコンにおいてＣ（又はＧ）である塩基は、ｈＣ及び／又はｈｍＣに対応するものとして同定することができる。

【0088】

例えば、図２は、図１の選択された反応を概略的に示す。図２に、例示的なポリヌクレオチド配列ＣＣＧＴ（５ｈｍＣ）ＧＧＡＣ（ｍＣ）ＧＣ（配列番号１）を示す。他のＣは、メチルトランスフェラーゼ酵素によってｘＳＡＭから転移された保護基（Ｘ）を用いて保護される。次いで、シチジンデアミナーゼ酵素（例えば、ＡＰＯＢＥＣ）が、５ｈｍＣ及び５ｍＣを脱アミノ化するために使用され、配列ＣＣＧＴ（５ｈＴ）ＧＧＡＣ（Ｔ）ＧＣ（配列番号２）を生じ、これは、ＰＣＲによって増幅され、次いで、

【化12】

として配列決定され、ここで、太字のＴは、元の配列中の５ｈｍＣ及びｍＣに対応する。５ｈｍＣ及びｍＣの標的ポリヌクレオチドにおける存在及び位置は、配列

【化13】

（太字のＣは元の配列における５ｈｍＣ及びｍＣに対応する）を得るための保護及び脱アミノ化工程なしで標的ポリヌクレオチドを増幅及び配列決定することと、標的ポリヌクレオチドのこれらのアンプリコンの配列を、保護及び脱アミノ化後のアンプリコンの配列の配列と比較することと、によっても検出され得る。そのような比較を通して、太字のＣがＣからＴに「変換」されていることが分かり得、脱アミノ化が起こったこと、したがってｍＣ又はｈｍＣが元々それらの位置に存在していたことを示している。

【0089】

更に、上で更に述べたように、本開示は、メチルシトシン及び特定のその誘導体を互いに区別するための方法を提供する。例えば、図３は、ｘＳＡＭＳを用いて、ｍＣ及びその誘導体を検出するための、及びメチルシトシン誘導体を互いに区別するための反応スキームの更なるセットを概略的に示す。

【0090】

図３に示すように、ｍＣ及びｈｍＣは、ｘＳＡＭｓを用いてＣを保護した後であるが脱アミノ化の前に、追加の反応を用いて互いに区別することができる。そのような反応は、標的ポリヌクレオチド中のｈｍＣを脱アミノ化から保護し、したがって、ｈｍＣは脱アミノ化中にｈＴに変換されず（したがって、増幅され、Ｃとして配列決定され）、一方、ｍＣはＴに変換される（したがって、増幅され、Ｔとして配列決定される）。脱アミノ化からｈｍＣを保護することは、ｈｍＣのヒドロキシメチル基に第２の保護基を付加してｇｍＣを形成することを含み得る。実例として、β－グルコシルトランスフェラーゼ（βＧＴ）又はβ－アラビノシルトランスフェラーゼ（βＡＴ）酵素などの糖転移酵素は、ｈｍＣのヒドロキシメチル基に第２の保護基を付加することができる。第２の保護基は、糖供与体から転移された糖、例えば、グルコシル供与体から転移されたグルコース若しくはグルコース誘導体（例えば、ＵＤＰ－グルコース、若しくはＵＤＰ－６－アジド－グルコース）、又はアラビノース供与体から転移されたアラビノース（例えば、ＵＤＰ－アラビノース）を含み得、糖－メチルシトシン（ｓＭＣ）を形成する。糖転移酵素の作用の間、細胞外液中にポリヌクレオチド及び酵素を含む組成物が形成され得る。ポリヌクレオチドは、ＸＣ及びｈｍＣを含み得、酵素は、第２の保護基をｈｍＣに付加し得る。適切な量の酵素が、細胞外液中のポリヌクレオチドと混合され得ることが理解される。例えば、酵素を触媒量で付加してもよく、糖供与体を化学量論量又は過剰量で添加してもよい。

【0091】

次いで、ポリヌクレオチド中の保護されていないメチルシトシンは、例えば、図１を参照して記載されるような様式でシチジンデアミナーゼ酵素を使用して脱アミノ化されてＴを形成し得、次いで、配列が増幅され、配列決定され得る。６－アジド－グルコースなどのグルコース誘導体の使用は、例えば、内容全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，「Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｓｉｎｇｌｅ－ｍｏｌｅｃｕｌｅ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｉｍａｇｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ，」ＰＮＡＳ １１３（１６）：４３３８－４３４３（２０１６）に記載されているような様式での色素とアジドとのクリックケミストリー反応などを介して、グルコースへの更なる修飾を可能にし得ることに留意されたい。

【0092】

ｈｍＣをｍＣから区別するために、図１を参照して記載されるＣ保護及び脱アミノ化工程は、標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して行われ得、その後増幅及び配列決定が続き、図３を参照して記載されるＣ保護、ｈｍＣ保護、及び脱アミノ化工程は、標的ポリヌクレオチドを含む第２の試料に対して行われ得、その後増幅及び配列決定が続く。第１の試料由来のアンプリコンの配列は、第２の試料由来のアンプリコンの配列及び／又は元の配列のアンプリコンと比較され得る。このような比較を通して、元の配列と比較して、第１の試料においてＣからＴに「変換」されるＣは、ｍＣ又はｈｍＣに対応し、第１の試料と比較して、第２の試料においてＴからＣに同様に「変換」されないこのようなＣは、ｈｍＣに対応することが理解され得る。

【0093】

更に、又はあるいは、図３に示されるように、ｆＣ及びｃａＣは、ｘＳＡＭｓを使用してＣを保護した後であるが脱アミノ化の前に、１つ以上の更なる反応を使用して、Ｃから区別され得る。より具体的には、標的ポリヌクレオチドがｆＣ及び／又はｃａＣを含む場合、任意のｆＣ由来のホルミル基及び／又は任意のｃａＣ由来のカルボキシル基は、脱アミノ化前に除去されて、脱アミノ化されてＵを形成し得る保護されていないＣを形成し得る。カルボキシル基の除去は、本明細書の他の箇所に記載されるようなメチルトランスフェラーゼ酵素を使用して実施され得るか、又はｆＣ若しくはｃａＣの塩基は、本明細書の他の箇所に記載されるような様式でチミンデグリコシラーゼ（ＴＤＧ）を使用してＣで置換され得る。次いで、ポリヌクレオチド中の保護されていないＣは、例えば、図１を参照して記載されるような様式でシチジンデアミナーゼ酵素を使用して、脱アミノ化されてＵを形成し得、次いで、配列が増幅され、配列決定され得る。ｆＣ及び／又はｃａＣをＣから区別するために、図１を参照して記載されるＣ保護及び脱アミノ化工程は、標的ポリヌクレオチドを含む第１の試料に対して実施され得、増幅及び配列決定が続き、図３を参照して記載されるＣ保護、ｆＣ及び／又はｃａＣ脱保護、並びに脱アミノ化工程は、標的ポリヌクレオチドを含む第２の試料に対して実施され得、増幅及び配列決定が続く。第１の試料由来のアンプリコンの配列は、第２の試料由来のアンプリコンの配列及び／又は元の配列のアンプリコンと比較され得る。このような比較を通して、元の配列と比較して、第１の試料においてＣのままであるＣは、Ｃ、ｆＣ、又はｃａＣに対応し、第１の試料と比較して、第２の試料においてＣからＴに「変換」されるこのようなＣは、ｆＣ又はｃａＣに対応することが理解され得る。メチルトランスフェラーゼ又はＴＤＧ酵素の作用の間、細胞外液中にポリヌクレオチド及び酵素を含む組成物が形成され得る。ポリヌクレオチドは、ＸＣ及びｆＣ及び／又はｃａＣを含み得る。酵素は、ｆＣ及び／又はｃａＣをＣに変換してもよい。適切な量のメチルトランスフェラーゼ酵素が、例えば、触媒量で、細胞外液中のポリヌクレオチドと混合され得ることが理解される。

【0094】

本明細書に提供されるいくつかの例では、標的ポリヌクレオチドはＤＮＡを含むが、本発明の方法及び組成物は、ＲＮＡなどの任意の適切なタイプのポリヌクレオチド中のｍＣ及び／又はその誘導体を検出するために適切に修飾され得ることが理解される。ポリヌクレオチドは、細胞外液試料から単離され得、５位に第１の保護基を含むＣと、図１～２を参照して記載される反応スキームを使用して提供されるようなＴと、を含み得る。第１の保護基は、メチレン基を介してＣに結合されてもよく、例示的に、アルキン基、カルボキシル基、アミノ基、ヒドロキシメチル基、イソプロピル基、又は色素を含んでもよい。ポリヌクレオチドは、図３を参照して記載される反応スキームを使用して提供されるような、糖（例えば、グルコース又はアラビノース）などの第２の保護基を含み得るｈｍＣを更に含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドは、図１～２を参照して記載される反応スキームを使用して提供されるようなｈＴを更に含み得る。ポリヌクレオチドは、図１～２を参照して記載される反応スキームを使用して提供されるように、ホルミルシトシン（ｆＣ）を更に含んでもよく、及び／又はカルボキシルシトシン（ｃａＣ）を含んでもよい。あるいは、ポリヌクレオチドは、図３を参照して記載される反応スキームを使用して提供されるように、Ｕを含み得る。

【0095】

増幅及び配列決定を容易にするために、標的ポリヌクレオチドは、例えば、目的の配列に隣接する第１及び第２のアダプターを含んでもよい。このようなアダプターは、ｘＳＡＭＳを使用してＣを保護する前に標的ポリヌクレオチドに付加されてもよく、脱アミノ化工程後に標的ポリヌクレオチドに付加されてもよく、又は任意の他の適切な時点で付加されてもよい。

【0096】

本明細書に提供される任意の適切な様式で修飾される標的ポリヌクレオチドの配列決定に関するいくつかの更なる詳細を提供するために、修飾標的ヌクレオチドの第１及び第２の相補的アンプリコンが生成され得る。第１のアンプリコンは、保護されたＣ（ＸＣ）に相補的な位置に第１のＣ、及びＴに相補的な位置に第１のアデニン（Ａ）を含み得る。第２のアンプリコンは、第１のＧに相補的な位置に第１の保護されていないＣ、及び第１のＡに相補的な位置に第１のチミン（Ｔ）を含み得る。第１のアンプリコン、第２のアンプリコン、又は第１のアンプリコン及び第２のアンプリコンの両方が配列決定され得る。ｍＣは、例えば、図１及び２を参照して記載されるような様式で、第１のアンプリコン中の第１のＡ、第２のアンプリコン中の第１のＴ、又は第１のアンプリコン中の第１のＡ及び第２のアンプリコン中の第１のＴの両方に基づいて同定され得る。

【0097】

図１及び図２を参照して記載されるようないくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｈＴに相補的な位置に第２のＡを含み、第２のアンプリコンは、第２のＡに相補的な位置に第２のＴを含む。ｈｍＣは、第１のアンプリコン中の第２のＡ、第２のアンプリコン中の第２のＴ、又は第１のアンプリコン中の第２のＡ及び第２のアンプリコン中の第２のＴの両方に基づいて同定され得る。図３を参照して記載される追加の反応を使用するなどの他の例において、第１のアンプリコンは、ｈｍＣに相補的な位置に第２のＧを含み、第２のアンプリコンは、第２のＧに相補的な位置に第２の保護されていないＣを含む。ｈｍＣは、第１のアンプリコン中の第２のＧ、第２のアンプリコン中の第２の保護されていないＣ、又は第１のアンプリコン中の第２のＧ及び第２のアンプリコン中の第２の保護されていないＣの両方に基づいて同定され得る。

【0098】

図１及び２を参照して記載されるようないくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｆＣに相補的な位置に第３のＧを含み、第２のアンプリコンは、第３のＧに相補的な位置に第３の保護されていないＣを含む。ｆＣは、第１のアンプリコン中の第３のＧ、第２のアンプリコン中の第３の保護されていないＣ、又は第１のアンプリコン中の第３のＧ及び第２のアンプリコン中の第３の保護されていないＣの両方に基づいて同定され得る。図３を参照して記載される更なる反応を使用するような他の例において、第１のアンプリコンは、Ｕに相補的な位置に第３のＡを含み、第２のアンプリコンは、第３のＡに相補的な位置に第３のＴを含む。ｆＣは、第１のアンプリコン中の第３のＡ、第２のアンプリコン中の第３のＴ、又は第１のアンプリコン中の第３のＡ及び第２のアンプリコン中の第３のＴの両方に基づいて同定され得る。

【0099】

図１及び２を参照して記載されるようないくつかの例では、第１のアンプリコンは、ｃａＣに相補的な位置に第４のＧを含み、第２のアンプリコンは、第４のＧに相補的な位置に第４の保護されていないＣを含む。ｃａＣは、第１のアンプリコン中の第４のＧ、第２のアンプリコン中の第４の保護されていないＣ、又は第１のアンプリコン中の第４のＧ及び第２のアンプリコン中の第４の保護されていないＣの両方に基づいて同定され得る。図３を参照して記載される更なる反応を使用するような他の例において、第１のアンプリコンは、Ｕに相補的な位置に第４のＡを含み、第２のアンプリコンは、第４のＡに相補的な位置に第４のＴを含む。ｃａＣは、第１のアンプリコン中の第４のＡ、第２のアンプリコン中の第４のＴ、又は第１のアンプリコン中の第４のＡ及び第２のアンプリコン中の第４のＴの両方に基づいて同定され得る。

【0100】

更なるコメント
様々な例示的な例が上に記載されているが、様々な変更及び改変が、本発明から逸脱することなく、本明細書において行われ得ることは、当業者に明白であろう。添付の特許請求の範囲は、本発明の真の趣旨及び範囲内に収まる、このような変更及び改変の全てを包含することが意図される。

【0101】

本明細書に記載されている利益を実現するため、本明細書に記載されている本開示の態様の各々の任意のそれぞれの特徴／例は、任意の適切な組み合わせで一緒に実施されてもよいこと、及びこれらの態様のいずれか１つ以上からの任意の特徴／例は、任意の適切な組み合わせで、本明細書に記載されている他の態様の特徴のいずれかと一緒に実施されてもよいことを理解すべきである。

【図1】

【図2】

【図3】

【手続補正書】

【提出日】2023-12-05

【手続補正1】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】配列表

【補正方法】追加

【補正の内容】

【配列表】

2024510329000001.app

【国際調査報告】