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特表2024-510374ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体または抽出物を含む組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-07
(54)【発明の名称】ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体または抽出物を含む組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 35/747 20150101AFI20240229BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240229BHJP
A23L 33/135 20160101ALI20240229BHJP
A23L 33/10 20160101ALI20240229BHJP
C12P 19/04 20060101ALI20240229BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240229BHJP
A61P 3/10 20060101ALI20240229BHJP
A61P 3/06 20060101ALI20240229BHJP
A61P 3/04 20060101ALI20240229BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240229BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
A61K35/747
C12N1/20 E ZNA
A23L33/135
A23L33/10
C12N1/20 C
C12P19/04 C
A61P3/00
A61P3/10
A61P3/06
A61P3/04
A61P29/00
A61P1/16
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547212
(86)(22)【出願日】2022-02-04
(85)【翻訳文提出日】2023-08-03
(86)【国際出願番号】 KR2022001731
(87)【国際公開番号】W WO2022169283
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】10-2021-0016012
(32)【優先日】2021-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2022-0014543
(32)【優先日】2022-02-04
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518355261
【氏名又は名称】ネオレーゲン バイオテック
【氏名又は名称原語表記】ＮＥＯＲＥＧＥＮ ＢＩＯＴＥＣＨ
【住所又は居所原語表記】（Ｓｅｏｕｌ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｅｏｄｕｎ－ｄｏｎｇ）２－１０１，Ｂｕｓｉｎｅｓｓ Ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ，８９，Ｓｅｏｈｏ－ｒｏ，Ｇｗｏｎｓｅｏｎ－ｇｕ，Ｓｕｗｏｎ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ １６６１４，Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】100137095
【弁理士】
【氏名又は名称】江部 武史
(74)【代理人】
【識別番号】100091627
【弁理士】
【氏名又は名称】朝比 一夫
(72)【発明者】
【氏名】ソ， ジョン ミン
(72)【発明者】
【氏名】リ， ジェ フン
【テーマコード（参考）】
4B018
4B064
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B018MD27
4B018MD85
4B064AF11
4B064AF12
4B064CA02
4B064DA03
4B064DA06
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4B065AA30X
4B065BB15
4B065BB18
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4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC56
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4C087MA52
4C087NA14
4C087ZA70
4C087ZA75
4C087ZB11
4C087ZC21
4C087ZC33
4C087ZC35
(57)【要約】
本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体または抽出物を含む組成物に関するものであり、より詳しくは、ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含むことにより、炎症反応の抑制、脂肪生成の抑制、細胞内ブドウ糖取り込みの抑制、インスリン抵抗性の減少および肝脂肪症の減少効果を示すことができ、代謝性疾患の治療または予防効果を示すことができる。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む代謝性疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【請求項2】
前記ラクトバチルスプランタラムは、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（受託番号ＫＣＴＣ１３４９７ＢＰ）、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項3】
前記多糖体は、細胞内多糖体または細胞外多糖体のうちの少なくとも１つである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項4】
前記多糖体は、グルコースである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項5】
前記ラクトバチルスプランタラム抽出物は、前記ラクトバチルスプランタラムの超音波破砕物である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項6】
前記代謝性疾患は、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂質血症、脂肪肝、肥満および炎症からなる群より選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項7】
ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む代謝性疾患の予防または改善用の食品組成物。
【請求項8】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を個体に投与するステップ；を含む代謝性疾患の予防または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
世界保健機関（ＷＨＯ）によると、プロバイオティクス（probiotics）は「適切な量を投与したときに宿主に健康上の利益をもたらす生きた微生物」と定義される。プロバイオティクス市場は、腸の健康改善、インスリン抵抗性の予防などの効果で、２０１６年から２０２０年まで世界的に３７％成長すると予想される。しかし、最近の研究によると、プロバイオティクスを定期的に摂取する場合、予期しない副作用が発生する可能性がある。プロバイオティクスの投与は、例えば、感染、望まない炎症反応、およびプロバイオティクスから天然宿主微生物への遺伝子送達を引き起こす可能性がある。
【0003】
前述のプロバイオティクスの副作用を最小限に抑えるために、最近ではポストバイオティクス（postbiotics）への関心が高まっている。「単純代謝産物」または「無細胞上清液」としても知られているポストバイオティクスは、生きた乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）が分泌する生理活性化合物であることが確認される。ポストバイオティクスには、代謝産物、機能性タンパク質、細胞溶解物および短鎖脂肪酸などの機能性生理活性化合物が含まれ得る。ポストバイオティクスは、抗生物質耐性遺伝子を宿主に送達する危険なしにプロバイオティクスの効果を示すことができるので、プロバイオティクスの代用として利用することができる。また、ポストバイオティクスは、乳幼児において肺炎、髄膜炎などのＬＡＢ関連感染のリスクが少ないため、５歳未満の子供に勧めることができる。さらに、ポストバイオティクスは広範囲のｐＨと温度において安定であり、個々の成分に分離できるので、インビトロ（in vitro）およびインビボ（in vivo）の研究に適しており、商用化が容易である。最近の研究では、乳酸菌が分泌するポストバイオティクスの一つである細胞外多糖体（Expolysaccharide，EPS）は、腸上皮細胞内で抗ウイルス効果を示すことが報告されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を提供することを目的とする。
【0005】
本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む代謝性疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供することを目的とする。
【0006】
本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む代謝性疾患の予防または改善用の食品組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0007】
１．ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む代謝性疾患の予防または治療用の薬学組成物。
【0008】
２．前記項目１において、前記ラクトバチルスプランタラムは、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（受託番号ＫＣＴＣ１３４９７ＢＰ）、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３からなる群より選択される少なくとも１つである薬学組成物。
【0009】
３．前記項目１において、前記多糖体は、細胞内多糖体または細胞外多糖体の少なくとも１つである薬学組成物。
【0010】
４．前記項目１において、前記多糖体はグルコースである薬学組成物。
【0011】
５．前記項目１において、前記ラクトバチルスプランタラム抽出物は、前記ラクトバチルスプランタラムの超音波破砕物である薬学組成物。
【0012】
６．前記項目１において、前記代謝性疾患は、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂質血症、脂肪肝、肥満および炎症からなる群より選択される少なくとも１つである薬学組成物。
【0013】
７．ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む代謝性疾患の予防または改善用の食品組成物。
【発明の効果】
【0014】
本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物は、炎症反応を抑制することができる。本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物は、ＬＰＳとＴＬＲ４の相互作用を抑制することによって抗炎症効果を示すことができる。
【0015】
また、本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物は、脂肪生成の抑制、細胞内ブドウ糖取り込みの抑制、インスリン抵抗性の減少および肝脂肪症の減少効果を示すことができ、代謝性疾患の改善効果を示すことができる。本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物は、ＴＬＲ２と相互作用してＡＭＰＫ経路を活性化することによって脂肪の生成を抑制することができる。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【発明を実施するための形態】
【0017】
本発明は、ラクトバチルスプランタラム（Lactobacillus plantarum）由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む炎症または代謝性疾患の予防または治療用の薬学組成物を提供する。
【0018】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ポストバイオティクスの一つであってもよい。用語「ポストバイオティクス（postbiotics）」とは、プロバイオティクス（probiotics）の代謝、発酵などによって生成される物質を意味し、短鎖脂肪酸、抗菌ペプチド、ビタミンＢ、ビタミンＫ、複合アミノ酸、ペプチド、神経伝達物質、酵素、ミネラル、タイコ酸（teichoic acid）、多糖体、細胞表面タンパク質などを含むことができ、これらはそれぞれ異なる機能を示すことができる。
【0019】
ラクトバチルスプランタラム菌、前記菌を含む培養液などのプロバイオティクスは生きている菌が含まれているため、免疫力が弱くなった個体において菌血症のような安全性の問題を起こす可能性があるのに対し、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、菌を含むことによって発生し得る副作用を回避することができ、優れた安全性を示すことができる。また、プロバイオティクスは、生産時点から消費期限まで生きている菌の数（ＣＦＵ）が一定に維持されず、継続的に減少してその機能性が維持されにくいのに対し、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、機能性を示す成分の容量が製造時から一定に維持され、その機能性を一貫して維持することができる。具体的には、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ラクトバチルスプランタラム菌や菌を含む培養液に比べて、熱、湿度、ｐＨなどの外部環境の変化に影響されず、多様な条件下で機能を維持することができる。したがって、ラクトバチルスプランタラムから分離された多糖体は、製品として商用化するのに適している。一実施形態により、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、熱、湿度、ｐＨなどの外部環境の変化に影響されずに安定性を示すことを確認した。
【0020】
ラクトバチルスプランタラムは、公知の菌株であってもよく、例えば、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（受託番号ＫＣＴＣ１３４９７ＢＰ）、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0021】
ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（受託番号ＫＣＴＣ１３４９７ＢＰ）は、韓国生命工学研究院 生物資源センターに２０１８年３月１５日に寄託番号ＫＣＴＣ１３４９７ＢＰとして寄託されている（寄託機関名：韓国生命工学研究院、受託番号：ＫＣＴＣ１３４９７ＢＰ、受託日：２０１８年３月１５日）。
【0022】
用語「多糖体（polysaccharide）」とは、単糖類３個以上がグリコシド結合によって大きな分子を作っている糖類を総称するものであり、加水分解すると、単糖類（monosaccharide）となる。
【0023】
多糖体は、乳酸菌を含む微生物が生育過程で生産および排出する高分子多糖体であれば、その種類を限定しない。例えば、多糖体は、細胞外多糖体（exopolysaccharides，EPS）、細胞内多糖体または構造多糖体であってもよく、具体的には、多糖体は細胞外多糖体または細胞内多糖体である。
【0024】
例えば、多糖体は、ラクトバチルスプランタラムの培養液から回収されたものであってもよい。多糖体は、ラクトバチルスプランタラムが発酵中に培養液に排出した代謝産物であり、培養液から回収されたものであってもよい。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム菌株を培地で培養して得られた培養液から分離することができ、具体的には、菌株が除去された培養液でタンパク質を変性させた後に除去し、エタノールを添加して多糖体を分離することができる。
【0025】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ラクトバチルスプランタラム菌株抽出物から分離されたものであってもよい。例えば、多糖体はラクトバチルスプランタラム菌株の破砕物から分離されたものであってもよい。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム菌株を超音波破砕して得られた抽出物（「破砕物」ともいう。）でタンパク質を変性させた後、上澄み液を収集してエタノールを添加して分離したものであってもよい。
【0026】
微生物を用いた多糖体の生産は、培養時間、培養ｐＨ、培養温度、Ｏ２濃度、攪拌などの環境要因と炭素源の種類及び濃度、窒素源の種類及び濃度、リン酸、硫黄、カリウム、マグネシウム、鉄、カルシウムのような栄養素の含有量と培養方法によって影響を受ける可能性がある。
【0027】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ラクトバチルスプランタラムに由来するものであれば十分であり、菌株の種類は限定されない。
【0028】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ホモジニアス多糖体（homogenus polysaccharide）であってもよい。
【0029】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、グルコースであってもよい。
【0030】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、グルコースホモジニアス多糖体であってもよい。
【0031】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、３×１０４Ｄａ～１２×１０４Ｄａ、４×１０４Ｄａ～１１×１０４Ｄａ、５×１０４Ｄａ～１０×１０４Ｄａ、６×１０４Ｄａ～９×１０４Ｄａ、または７×１０４Ｄａ～８×１０４Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）を有することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、７．５７×１０４Ｄａの重量平均分子量を有するものであってもよい。
【0032】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、０．０１×１０４Ｄａ～６×１０４Ｄａ、０．０５×１０４Ｄａ～５×１０４Ｄａ、０．１×１０４Ｄａ～４×１０４Ｄａ、０．５×１０４Ｄａ～３×１０４Ｄａ、または１×１０４Ｄａ～２×１０４Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）を有することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、１．８４×１０４Ｄａの数平均分子量を有するものであってもよい。
【0033】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、２．５～６、３～５．５、３．５～５、または４～４．５の多分散指数（ＰＤＩ）を有することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、４．１２の多分散指数を有するものであってもよい。
【0034】
一実施形態では、ラクトバチルスプランタラムから分離した多糖体の固有の特性を高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）、薄層クロマトグラフィー（Thin layer chromatography，TLC）、ＦＴＩＲ（Fourier－Transform Infrared Spectroscopy）、ゲル浸透クロマトグラフィー（GPC）などにより分析した。
【0035】
本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、優れた抗炎症効果を示す。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、炎症性サイトカインを抑制することができる。例えば、ラクトバチルスプランタラム由来の細胞外多糖体は、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１αなどの発現レベルを減少させることができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、炎症の主な媒介体として知られているＣＯＸ－２と誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現レベルを減少させることができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ＮＦ－κＢのリン酸化および核への転位を抑制することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ＭＡＰＫファミリータンパク質、例えばＪＮＫ、ＥＲＫまたはｐ３８などのリン酸化を抑制することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、Ｎｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｅ２－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２（ＮＲＦ２）およびヘム酸素添加酵素（Heme Oxygenase－1，HO－1）の発現を抑制することができる。本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ＬＰＳとＴＬＲ４の相互作用を抑制して抗炎症効果を示すことができる。
【0036】
本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、優れた抗肥満効果を示す。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、脂肪生成の抑制、細胞内ブドウ糖取り込みの抑制効果を示すことができる。本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ＴＬＲ２と相互作用してＡＭＰＫ経路を活性化することによって脂肪生成を抑制することができる。
【0037】
本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、優れたインスリン抵抗性または肝脂肪阻害効果を示すことができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、空腹時血糖、空腹時インスリン、レプチン、レジスチンを減少させることができ、肝における脂肪蓄積を阻害することができる。
【0038】
本発明のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、アルコール沈殿法を用いて精製することができる。
【0039】
例えば、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ラクトバチルスプランタラム培養液に酢酸を添加した後、アルコールを添加して沈殿物を分離するステップ；を含む方法により得ることができる。
【0040】
他の例では、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、ラクトバチルスプランタラム抽出物に酢酸を添加した後、アルコールを添加して沈殿物を分離するステップ；を含む方法により得ることができる。
【0041】
前記方法は、アルコールを添加して沈殿物を分離するステップの後に、前記沈殿物に精製水を投入して透析するステップをさらに含むことができる。
【0042】
酢酸は、トリクロロ酢酸であってもよい。酢酸を処理して培養液中のタンパク質の含有量を変性させることができる。
【0043】
アルコールはＣ１～Ｃ４のアルコールであってもよく、一実施形態によれば、エタノールであってもよい。アルコールを添加して核酸を分解することができる。アルコールは、無水エタノールであってもよい。
【0044】
ラクトバチルスプランタラム抽出物は、ラクトバチルスプランタラムの破砕物であってもよく、例えば、ラクトバチルスプランタラムの破砕物を凍結乾燥して得られたパウダーまたはその溶液若しくは分散液であってもよい。
【0045】
ラクトバチルスプランタラム抽出物は、ラクトバチルスプランタラムの超音波破砕物であってもよい。
【0046】
ラクトバチルスプランタラム抽出物は、ラクトバチルスプランタラム菌株を超音波粉砕機で超音波処理して得られる抽出物であれば、菌株の種類を限定しない。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム抽出物は、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４抽出物、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１抽出物、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４抽出物、またはラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３抽出物であってもよい。
【0047】
ラクトバチルスプランタラム抽出物は、培養培地で培養されたラクトバチルスプランタラムに超音波処理して得られたものであってもよい。ラクトバチルスプランタラム抽出物は、培養された超音波処理済みのラクトバチルスプランタラムから細胞壁成分および他の残留物が除去されたものであってもよい。超音波処理は、０℃以下で行うことができる。
【0048】
本発明のラクトバチルスプランタラム抽出物は、優れた抗炎症効果を示すことができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム抽出物は、肝または脂肪組織におけるレプチン、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、レジスチンのような炎症誘発マーカーの発現を減少させることができ、アディポネクチンおよびアルギナーゼ１（Ａｒｇ１）のような抗炎症マーカーの発現を増加させることができる。
【0049】
本発明のラクトバチルスプランタラム抽出物は、優れた抗肥満効果を示すことができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム抽出物は、前駆脂肪細胞の脂肪細胞への分化を抑制することができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム抽出物は、脂肪生成の抑制、細胞内ブドウ糖取り込みの抑制効果を示すことができる。
【0050】
本発明のラクトバチルスプランタラム抽出物は、優れたインスリン抵抗性または肝脂肪阻害効果を示すことができる。一実施形態によれば、ラクトバチルスプランタラム抽出物は、空腹時血糖、空腹時インスリン、レプチン、レジスチンを減少させることができ、肝における脂肪蓄積を阻害することができる。
【0051】
代謝性疾患は、インスリン抵抗性、２型糖尿病、高脂質血症、脂肪肝、肥満および炎症からなる群より選択される少なくとも１つであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0052】
薬学組成物は、経口および非経口の様々な製剤で投与することができ、製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して製造することができる。
【0053】
用語「治療」とは、治癒だけでなく、軽度の緩和、実質的な緩和、大規模な緩和を含む任意の程度の緩和を含み、治療されるべき症状に罹患している対象体または患者に有益な効果をもたらす処置を指し、緩和の程度は、少なくとも軽度の緩和である。
【0054】
用語「予防」とは、全体の予防だけでなく、症状の発症または再発の可能性の軽度の、実質的な、又は大規模な減少を含み、予防されるべき症状または再発の可能性の任意の程度の減少をもたらす予防的措置を指し、可能性の減少の程度は、少なくとも軽度の減少である。
【0055】
また、本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を含む炎症または代謝性疾患の予防または改善用の食品組成物を提供する。
【0056】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体、ラクトバチルスプランタラム抽出物、および炎症または代謝性疾患については、前述の通りであるので具体的な説明を省略する。
【0057】
食品組成物の形態は特に限定されず、例えば、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、餅、チョコレート、キャンディー類、スナック類、菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、アルコール飲料およびビタミン複合剤、乳製品および乳加工製品などであってもよい。
【0058】
さらに、本発明は、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体またはラクトバチルスプランタラム抽出物を個体に投与するステップ；を含む、炎症または代謝性疾患の予防または治療方法を提供する。
【0059】
ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体、ラクトバチルスプランタラム抽出物、および炎症または代謝性疾患については、前述の通りであるので具体的な説明を省略する。
【0060】
個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギ、またはネコであってもよい。
【0061】
投与は当業界で知られている方法によって行うことができる。投与は、例えば、経口、静脈内、筋肉内、経皮（transdermal）、粘膜、鼻腔内（intranasal）、気管内（intratracheal）または皮下投与などの経路で、任意の手段によって個体に直接投与することができる。投与は全身的または局部的に行うことができる。投与は局所投与であってもよい。
【0062】
以下、実施例を挙げて本発明の構成及び効果についてより具体的に説明するが、これらの実施例は、本発明の理解を助けるために例示を目的として提供されるものであり、本発明の範囲および範囲を限定するものではない。
【0063】
Ｉ．ラクトバチルスプランタラム抽出物の製造
１．実施例１：ラクトバチルスプランタラムＬ－１４抽出物
ネオレーゲン・バイオテック（韓国、ギョンギ－ド）から入手したラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（本発明の説明内では「Ｌ－１４」ともいう。）（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）をＭＲＳ培地において３７℃で１８時間予備培養した。次いで、これらを５００ｍＬ ＭＲＳブロスに１％接種し、３７℃で１８時間培養した。培養したＬ－１４を遠心分離機（４℃で１０分間１０，０００ｇ）で回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、蒸留水で洗浄してＭＲＳブロスとＰＢＳを完全に除去した。２０ｍＬの蒸留水に再懸濁したＬ－１４を、超音波粉砕機を用いて氷上で３０分間超音波処理した。細胞壁成分および他の残留物を除去するために、４℃において１０，０００ｇで２０分間遠心分離した後、ペレットを廃棄した。上澄み液をろ過（０．２μｍ）し、－８０℃で一晩凍結した。次いで、凍結乾燥してＬ－１４抽出物を得た（実施例１）。得られたＬ－１４抽出物は、使用前にＰＢＳで再構成した。また、Ｌ－１４抽出物（Ｎ６０、実施例２－１）をｐＨ７．０に調整（以下、「Ｐ６０」）するか、または９０℃で３０分間培養（以下、「Ｈ６０」）し、Ｌ－１４抽出物中で有効な分子の特性を確認した。
１．実施例１：ラクトバチルスプランタラムＬ－１４抽出物
ネオレーゲン・バイオテック（韓国、ギョンギ－ド）から入手したラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（本発明の説明内では「Ｌ－１４」ともいう。）（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）をＭＲＳ培地において３７℃で１８時間予備培養した。次いで、これらを５００ｍＬ ＭＲＳブロスに１％接種し、３７℃で１８時間培養した。培養したＬ－１４を遠心分離機（４℃で１０分間１０，０００ｇ）で回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。その後、蒸留水で洗浄してＭＲＳブロスとＰＢＳを完全に除去した。２０ｍＬの蒸留水に再懸濁したＬ－１４を、超音波粉砕機を用いて氷上で３０分間超音波処理した。細胞壁成分および他の残留物を除去するために、４℃において１０，０００ｇで２０分間遠心分離した後、ペレットを廃棄した。上澄み液をろ過（０．２μｍ）し、－８０℃で一晩凍結した。次いで、凍結乾燥してＬ－１４抽出物を得た（実施例１）。得られたＬ－１４抽出物は、使用前にＰＢＳで再構成した。また、Ｌ－１４抽出物（Ｎ６０、実施例２－１）をｐＨ７．０に調整（以下、「Ｐ６０」）するか、または９０℃で３０分間培養（以下、「Ｈ６０」）し、Ｌ－１４抽出物中で有効な分子の特性を確認した。
【0064】
２．実施例２：ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１抽出物
実施例１の製造方法と同様にして製造する一方、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の代わりにラクトバチルスプランタラムｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ（菌株番号：ＡＴＣＣ１０２４１）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１抽出物（実施例２）を製造した。
実施例１の製造方法と同様にして製造する一方、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の代わりにラクトバチルスプランタラムｓｕｂｓｐ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ（菌株番号：ＡＴＣＣ１０２４１）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１抽出物（実施例２）を製造した。
【0065】
３．実施例３：ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４抽出物
実施例１の製造方法と同様にして製造する一方、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の代わりにラクトバチルスプランタラム（菌株番号：ＮＣＤＯ７０４）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４抽出物（実施例３）を製造した。
実施例１の製造方法と同様にして製造する一方、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の代わりにラクトバチルスプランタラム（菌株番号：ＮＣＤＯ７０４）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４抽出物（実施例３）を製造した。
【0066】
４．実施例４：ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３抽出物
実施例１の製造方法と同様にして製造する一方、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の代わりにラクトバチルスプランタラム（菌株番号：ＮＣＤＯ１１９３）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３抽出物（実施例４）を製造した。
実施例１の製造方法と同様にして製造する一方、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の代わりにラクトバチルスプランタラム（菌株番号：ＮＣＤＯ１１９３）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３抽出物（実施例４）を製造した。
【0067】
ＩＩ．ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の製造
１．実施例５：ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）由来の細胞外多糖体
ネオレーゲン・バイオテック（韓国、ギョンギ－ド）から入手したラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ、以下「Ｌ－１４」ともいう。）をデキストロース（dextrose）２％、動物組織のペプシン消化物（peptic digest）１％、牛肉抽出物１％、酵母抽出物０．５％、酢酸ナトリウム０．５％、リン酸二ナトリウム０．２％、クエン酸アンモニウム０．２％、ポリソルベート８０ ０．１％、硫酸マグネシウム０．０１％、マンガン０．００５％および硫酸塩０．００５％を含むＭＲＳ培地（Hardy Diagnostics，SantaMaria，CA，USA）において３０℃で１８時間培養した。Ｌ－１４培養培地を１０，０００ｇで２０分間遠心分離して分離した。次いで、培地の上澄み液を分離し、トリクロロ酢酸を添加して３７℃で１時間Ｌ－１４培養培地のタンパク質を変性させた。次に、変性タンパク質を除去するために１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、上澄み液のみを無水エタノールと混合した。無水エタノールと混合して生成した沈殿物を回収し、４℃で２４～４８時間、蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いた透析によって培地成分及び他の物質を完全に除去した。次に、透析した溶液を減圧下で凍結乾燥（lyophilize）してＬ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）を取得し、後続する実験のためにＥＰＳを蒸留水に再懸濁して－８０℃で保存した。
１．実施例５：ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）由来の細胞外多糖体
ネオレーゲン・バイオテック（韓国、ギョンギ－ド）から入手したラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ、以下「Ｌ－１４」ともいう。）をデキストロース（dextrose）２％、動物組織のペプシン消化物（peptic digest）１％、牛肉抽出物１％、酵母抽出物０．５％、酢酸ナトリウム０．５％、リン酸二ナトリウム０．２％、クエン酸アンモニウム０．２％、ポリソルベート８０ ０．１％、硫酸マグネシウム０．０１％、マンガン０．００５％および硫酸塩０．００５％を含むＭＲＳ培地（Hardy Diagnostics，SantaMaria，CA，USA）において３０℃で１８時間培養した。Ｌ－１４培養培地を１０，０００ｇで２０分間遠心分離して分離した。次いで、培地の上澄み液を分離し、トリクロロ酢酸を添加して３７℃で１時間Ｌ－１４培養培地のタンパク質を変性させた。次に、変性タンパク質を除去するために１０，０００ｇで２０分間遠心分離し、上澄み液のみを無水エタノールと混合した。無水エタノールと混合して生成した沈殿物を回収し、４℃で２４～４８時間、蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を用いた透析によって培地成分及び他の物質を完全に除去した。次に、透析した溶液を減圧下で凍結乾燥（lyophilize）してＬ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）を取得し、後続する実験のためにＥＰＳを蒸留水に再懸濁して－８０℃で保存した。
【0068】
２．実施例６：ラクトバチルスプランタラムＬ－１４（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）由来の多糖体
前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）に、最終濃度が１４％（ｖ／ｖ）となるようにトリクロロ酢酸を添加してタンパク質含有量を変性させた。Ｌ－１４抽出物を９０ｒｐｍの振盪培養器において３７℃で３０分間培養し、８，０００ｇで２０分間遠心分離した。上澄み液を収集し、最終濃度が６７％（ｖ／ｖ）になるように冷たい無水エタノールを加えた。混合物を４℃で２４時間培養し、沈殿物を収集した。沈殿物と同じ体積の蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を添加した。Ｓｔａｎｄａｒｄ ＲＣ ｔｕｂｉｎｇ（molecular weight cut－off：3.5 kDa；Spectrum Chemical，New Brunswick，NJ，USA）を用いて２日間、水を１日に２回交換しながら溶液を透析し、透析液をろ過（０．２μｍ）した。次いで、凍結乾燥してＬ－１４由来の多糖体を得た（実施例６）。得られた実施例６の多糖体は、使用前にＰＢＳで再構成した。
前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）に、最終濃度が１４％（ｖ／ｖ）となるようにトリクロロ酢酸を添加してタンパク質含有量を変性させた。Ｌ－１４抽出物を９０ｒｐｍの振盪培養器において３７℃で３０分間培養し、８，０００ｇで２０分間遠心分離した。上澄み液を収集し、最終濃度が６７％（ｖ／ｖ）になるように冷たい無水エタノールを加えた。混合物を４℃で２４時間培養し、沈殿物を収集した。沈殿物と同じ体積の蒸留水（Ｄ．Ｗ．）を添加した。Ｓｔａｎｄａｒｄ ＲＣ ｔｕｂｉｎｇ（molecular weight cut－off：3.5 kDa；Spectrum Chemical，New Brunswick，NJ，USA）を用いて２日間、水を１日に２回交換しながら溶液を透析し、透析液をろ過（０．２μｍ）した。次いで、凍結乾燥してＬ－１４由来の多糖体を得た（実施例６）。得られた実施例６の多糖体は、使用前にＰＢＳで再構成した。
【0069】
３．実施例７：ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１由来の多糖体
前記実施例６の方法と同様にする一方、前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）の代わりに前記「Ｉ．２．」の方法で製造された抽出物（実施例２）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１由来の多糖体（実施例７）を製造した。
前記実施例６の方法と同様にする一方、前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）の代わりに前記「Ｉ．２．」の方法で製造された抽出物（実施例２）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＡＴＣＣ１０２４１由来の多糖体（実施例７）を製造した。
【0070】
４．実施例８：ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４由来の多糖体
前記実施例６の方法と同様にする一方、前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）の代わりに前記「Ｉ．３．」の方法で製造された抽出物（実施例３）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４由来の多糖体（実施例８）を製造した。
前記実施例６の方法と同様にする一方、前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）の代わりに前記「Ｉ．３．」の方法で製造された抽出物（実施例３）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ７０４由来の多糖体（実施例８）を製造した。
【0071】
５．実施例９：ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３由来の多糖体
前記実施例６の方法と同様にする一方、前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）の代わりに前記「Ｉ．４．」の方法で製造された抽出物（実施例４）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３由来の多糖体（実施例９）を製造した。
前記実施例６の方法と同様にする一方、前記「Ｉ．１．」の方法で製造されたＬ－１４抽出物（実施例１）の代わりに前記「Ｉ．４．」の方法で製造された抽出物（実施例４）を用いて、ラクトバチルスプランタラムＮＣＤＯ１１９３由来の多糖体（実施例９）を製造した。
【0072】
ＩＩＩ．ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の分析
１．高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）
前記「ＩＩ．」の方法で分離されたラクトバチルスプランタラム由来の多糖体が均一な多糖類であるかを識別するために、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）サイズ排除クロマトグラフィーにより多糖体を分析した。具体的には、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（GE Healthcare）でＰＢＳを用いてサイズ排除クロマトグラフィーによりＥＰＳ（３０ｍｇ／ｍＬ）を分離し、ＡＫＴＡ高速タンパク質液体クロマトグラフィー（GE Healthcare）により分析した。その結果、分離されたラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、単一の対称ピークを生成した。これは、多糖体が均質な多糖類であることを示す（図１Ａ（実施例５）及び図１９（実施例６））。
１．高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）
前記「ＩＩ．」の方法で分離されたラクトバチルスプランタラム由来の多糖体が均一な多糖類であるかを識別するために、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（Fast Protein Liquid Chromatography，FPLC）サイズ排除クロマトグラフィーにより多糖体を分析した。具体的には、ＨｉＬｏａｄ（登録商標）１６／６００ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ｐｇカラム（GE Healthcare）でＰＢＳを用いてサイズ排除クロマトグラフィーによりＥＰＳ（３０ｍｇ／ｍＬ）を分離し、ＡＫＴＡ高速タンパク質液体クロマトグラフィー（GE Healthcare）により分析した。その結果、分離されたラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、単一の対称ピークを生成した。これは、多糖体が均質な多糖類であることを示す（図１Ａ（実施例５）及び図１９（実施例６））。
【0073】
２．薄層クロマトグラフィー（Thin layer chromatography，TLC）とベネディクトのテスト（Benedict's test）
前記「ＩＩ．」の方法で分離された多糖体の単糖類の組成を確認するために、１０ｍｇの多糖体を１００℃で４時間、１ｍＬ硫酸（２Ｎ）で加水分解した。残留硫酸を十分なＢａＣＯ３で１２時間中和した。ＥＰＳ加水分解物をｐＨ７に調整した後、分析のために凍結乾燥した。ＥＰＳ加水分解物をＴＬＣシリカゲル（Merck，Darmstadt，Germany）で処理し、ｎ－ブタノール：メタノール：２５％アンモニア溶液：ＤＷ（５：４：２：１）から構成されたバッファーに移した。ＥＰＳの構成を可視化するために、ゲルをアニリン－ジフェニルアミン試薬に浸し、１１０℃のオーブン中で５分間焼いた。ベネディクトのテスト（Benedict's test）を行うために、多糖体と多糖体加水分解物を同じ定量のベネディクト試薬（BIOZOA Biological Supply，Seoul，Korea）と混合した後、沸騰水に加熱した。多糖体の単糖類成分は、薄層クロマトグラフィー（Thin layer chromatography，TLC）により決定した。多糖体の加水分解物は、標準物質であるブドウ糖と同じ点で発現した（図１Ｂ、実施例５）。ベネディクトのテストの結果、多糖体の加水分解物は試薬の色を橙色－赤色に変えた。さらに、多糖体は試薬の色を緑色に変えた（図１Ｃ、実施例５）。このような結果から、分離された多糖体は主にブドウ糖で構成されていることが分かった。
前記「ＩＩ．」の方法で分離された多糖体の単糖類の組成を確認するために、１０ｍｇの多糖体を１００℃で４時間、１ｍＬ硫酸（２Ｎ）で加水分解した。残留硫酸を十分なＢａＣＯ３で１２時間中和した。ＥＰＳ加水分解物をｐＨ７に調整した後、分析のために凍結乾燥した。ＥＰＳ加水分解物をＴＬＣシリカゲル（Merck，Darmstadt，Germany）で処理し、ｎ－ブタノール：メタノール：２５％アンモニア溶液：ＤＷ（５：４：２：１）から構成されたバッファーに移した。ＥＰＳの構成を可視化するために、ゲルをアニリン－ジフェニルアミン試薬に浸し、１１０℃のオーブン中で５分間焼いた。ベネディクトのテスト（Benedict's test）を行うために、多糖体と多糖体加水分解物を同じ定量のベネディクト試薬（BIOZOA Biological Supply，Seoul，Korea）と混合した後、沸騰水に加熱した。多糖体の単糖類成分は、薄層クロマトグラフィー（Thin layer chromatography，TLC）により決定した。多糖体の加水分解物は、標準物質であるブドウ糖と同じ点で発現した（図１Ｂ、実施例５）。ベネディクトのテストの結果、多糖体の加水分解物は試薬の色を橙色－赤色に変えた。さらに、多糖体は試薬の色を緑色に変えた（図１Ｃ、実施例５）。このような結果から、分離された多糖体は主にブドウ糖で構成されていることが分かった。
【0074】
３．フーリエ変換型赤外分光（Fourier－transform infrared spectroscopy，FTIR）およびゲル浸透クロマトグラフィー（Gel Permeation Chromatography，GPC）
ソウル大学国立大学間研究施設センターでは、４０００～５００ｃｍ－１の吸収範囲において、ＴＥＮＳＯＲ２７ ＦＴＩＲ（Bruker，Bilerica，MA，USA）を用いて多糖体の構造的特性を分析した。また、多糖体の分子量を決定するために、４０℃で１２０Å、５００Åおよび１０００Åのカラム（Waters，Milford，MA，USA）付きのＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＲＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）を用いてＧＰＣ分析を行った。実験データはプルランで補正し、クロマトグラフィーデータシステム（Chromeleon 6.8 Extention－pak）で処理した。多糖体は、Ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ ０．１Ｍ ｉｎ ｗａｔｅｒを用いて溶離し、１ｍＬ／分の流速で作動した。
ソウル大学国立大学間研究施設センターでは、４０００～５００ｃｍ－１の吸収範囲において、ＴＥＮＳＯＲ２７ ＦＴＩＲ（Bruker，Bilerica，MA，USA）を用いて多糖体の構造的特性を分析した。また、多糖体の分子量を決定するために、４０℃で１２０Å、５００Åおよび１０００Åのカラム（Waters，Milford，MA，USA）付きのＤｉｏｎｅｘ ＨＰＬＣ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００ ＲＩ Ｓｙｓｔｅｍ（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）を用いてＧＰＣ分析を行った。実験データはプルランで補正し、クロマトグラフィーデータシステム（Chromeleon 6.8 Extention－pak）で処理した。多糖体は、Ｓｏｄｉｕｍ ａｚｉｄｅ ０．１Ｍ ｉｎ ｗａｔｅｒを用いて溶離し、１ｍＬ／分の流速で作動した。
【0075】
実施例５の多糖体のＦＴＩＲ結果は、３５００ｃｍ－１から５００ｃｍ－１までの複雑なピークパターンを示した。そのうち、３３０７．３１ｃｍ－１のピークはＯ－Ｈ基、２９３５．１ｃｍ－１のピークはメチル基の弱いＣ－Ｈ伸縮ピーク、１６４８．８８ｃｍ－１のピークはＣ＝Ｏ伸縮ピークのようなブドウ糖の特徴的なグループを示す。また、最も強い吸収帯である１０３２．５８ｃｍ－１のピークは、Ｃ－Ｏ結合とＯ－Ｈ結合を示す。９１１．９８ｃｍ－１および８１２．２８ｃｍ－１のピークは、炭水化物の側面グループを示す（図１Ｄ、実施例５）。このような結果から、分離された多糖体がブドウ糖を主成分とする多糖類の吸収ピークを有していることを確認した。また、ＧＰＣによる分子量の計算結果、実施例５の多糖体は、１．８４×１０４Ｄａの数平均分子量（Ｍｎ）、７．５７×１０４Ｄａの重量平均分子量（Ｍｗ）、３．７４×１０５ＤａのＺ平均分子量（Ｍｚ）および４．１２の多分散指数（ＰＤＩ）を示した（図１Ｅ）。このような結果から、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体は、主にブドウ糖で構成される均質な多糖類であることを確認した。
【0076】
ＩＶ．ラクトバチルスプランタラム抽出物またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の抗炎症効果の確認
１．実験方法
（１）細胞培養、材料および統計
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手した。細胞を１０％ウシ胎児血清（HyClone，Logan，UT，USA）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco，Grand Island，NY，USA）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's media）（WELGENE，テグ市，韓国）、５％ ＣＯ２加湿雰囲気のインキュベーターで３７℃の条件下で培養した。抗体の購入先は以下の通りである：ｐｈｏｓｐｈｏ－ＮＦ－κＢ、ＮＦ－κＢ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８、p３８、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＮＫ、ＪＮＫおよびＣＯＸ－２は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Danvers，MA，USA）、ＨＯ－１は、Ａｂｃａｍ（Cambridge，UK）、ＮＲＦ２およびＴＬＲ４は、Ｃｕｓａｂｉｏ（Wuhan，China）、ｉＮＯＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad，CA，USA）、ＭｙＤ８８は、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Centennial，CO，USA）、ＧＡＰＤＨは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（San Diego，CA，USA）から購入した。全てのデータは３つの独立した実験によって得られ、平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。統計的な分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ ＡＮＯＶＡを用いて決定し、有意性は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１と定義した。
１．実験方法
（１）細胞培養、材料および統計
マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７は、ＡＴＣＣ（American Type Culture Collection）から入手した。細胞を１０％ウシ胎児血清（HyClone，Logan，UT，USA）と１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Gibco，Grand Island，NY，USA）を含むＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's media）（WELGENE，テグ市，韓国）、５％ ＣＯ２加湿雰囲気のインキュベーターで３７℃の条件下で培養した。抗体の購入先は以下の通りである：ｐｈｏｓｐｈｏ－ＮＦ－κＢ、ＮＦ－κＢ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＥＲＫ、ＥＲＫ、ｐｈｏｓｐｈｏ－ｐ３８、p３８、ｐｈｏｓｐｈｏ－ＪＮＫ、ＪＮＫおよびＣＯＸ－２は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Danvers，MA，USA）、ＨＯ－１は、Ａｂｃａｍ（Cambridge，UK）、ＮＲＦ２およびＴＬＲ４は、Ｃｕｓａｂｉｏ（Wuhan，China）、ｉＮＯＳは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Carlsbad，CA，USA）、ＭｙＤ８８は、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Centennial，CO，USA）、ＧＡＰＤＨは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（San Diego，CA，USA）から購入した。全てのデータは３つの独立した実験によって得られ、平均±標準偏差（ＳＤ）として示す。統計的な分析は、ｕｎｐａｉｒｅｄ ＡＮＯＶＡを用いて決定し、有意性は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１と定義した。
【0077】
（２）細胞生存力の分析
ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株の細胞生存力に対する効果を確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２．０×１０３細胞の密度で播種した。１日経過後、培地を、Ｌ－１４菌株を含む培地に交換し、さらに６時間培養した。次いで、Ｌ－１４菌株を含む培地を、ＬＰＳを含む新しい培地に交換し、６時間、表示された濃度で炎症反応を誘導した。細胞生存率は、Ｑｕａｎｔｉ－ＭａｘＷＳＴ－８細胞生存率キット（BIOMAX，Seoul，Korea）を用いて確認した。
ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株の細胞生存力に対する効果を確認するために、ＲＡＷ２６４．７細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり２．０×１０３細胞の密度で播種した。１日経過後、培地を、Ｌ－１４菌株を含む培地に交換し、さらに６時間培養した。次いで、Ｌ－１４菌株を含む培地を、ＬＰＳを含む新しい培地に交換し、６時間、表示された濃度で炎症反応を誘導した。細胞生存率は、Ｑｕａｎｔｉ－ＭａｘＷＳＴ－８細胞生存率キット（BIOMAX，Seoul，Korea）を用いて確認した。
【0078】
また、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）の細胞生存力に対する効果を確認するために、接種された細胞を様々な濃度のＬ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）を含有する培地で１日間培養した。生存力は同じキットで確認した。
【0079】
（３）ＥＬＩＳＡ
ＲＡＷ２６４．７細胞を１ウェル当たり２．０×１０５細胞の密度で１２ウェルプレートに接種した。次いで、培地を１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ濃度のＬ－１４菌株が接種された培地に交換し、６時間維持した。その後、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで徹底的に３回洗浄した。炎症を誘発するために、洗浄した細胞を、ＬＰＳ（１ｇ／ｍＬ）を含む培地で培養し、６時間維持した。各ウェルで得られた培養液を１０，０００ｇで３分間遠心分離し、上澄み液を集めた。サイトカインは、製造メーカーの指針に従ってＥＬＩＳＡＭＡＸ－Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ（BioLegend）によって定量化した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を１ウェル当たり２．０×１０５細胞の密度で１２ウェルプレートに接種した。次いで、培地を１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬ濃度のＬ－１４菌株が接種された培地に交換し、６時間維持した。その後、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭで徹底的に３回洗浄した。炎症を誘発するために、洗浄した細胞を、ＬＰＳ（１ｇ／ｍＬ）を含む培地で培養し、６時間維持した。各ウェルで得られた培養液を１０，０００ｇで３分間遠心分離し、上澄み液を集めた。サイトカインは、製造メーカーの指針に従ってＥＬＩＳＡＭＡＸ－Ｄｅｌｕｘｅ Ｓｅｔ（BioLegend）によって定量化した。
【0080】
さらに、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）の前処理が、ＬＰＳによるサイトカインの誘導を減少させたかどうかを調べるために、ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ウェルプレートに２４時間接種した。細胞をＬ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）で６時間前処理した後、培養された培地を１８時間、ＬＰＳを含む新鮮な培地に交換して炎症反応を誘導した。培養培地中のサイトカインを前述のようにして定量化した。
【0081】
（４）クリスタルバイオレット染色
ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ウェルプレートに接種し、１日間培養した。ＥＰＳ前処理が細胞の形態に影響を及ぼし、ＬＰＳによって誘導された形態学的変化を抑制するかどうかを調べるために、細胞をＥＰＳ（実施例５）で６時間処理し、培養培地を１８時間、ＬＰＳ（１ｇ／ｍＬ）を含む新鮮な培地に交換した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液（Sigma－Aldrich，Saint Louis，MO，USA）で染色した。ＥＶＯＳ ＣＬ Ｃｏｒｅ顕微鏡（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）を用いて、形態学的変化を１００倍率で測定した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を１２ウェルプレートに接種し、１日間培養した。ＥＰＳ前処理が細胞の形態に影響を及ぼし、ＬＰＳによって誘導された形態学的変化を抑制するかどうかを調べるために、細胞をＥＰＳ（実施例５）で６時間処理し、培養培地を１８時間、ＬＰＳ（１ｇ／ｍＬ）を含む新鮮な培地に交換した。次いで、細胞をＰＢＳで洗浄し、クリスタルバイオレット溶液（Sigma－Aldrich，Saint Louis，MO，USA）で染色した。ＥＶＯＳ ＣＬ Ｃｏｒｅ顕微鏡（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）を用いて、形態学的変化を１００倍率で測定した。
【0082】
（５）ウェスタンブロット
プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤カクテルと共に、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ １×Ｒｅａｇｅｎｔ（Promega，Fitchburg，WI，USA）を用いて、ＬＰＳで処理したＲＡＷ２６４．７細胞からタンパク質を分離した。細胞質および核タンパク質は、製造メーカーの指針に従って、ＥｘＫｉｎｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Abbkine，Wuhan，China）を用いて得た。総タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ－ＢＣＡタンパク質分析キット（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）で定量化した。次いで、変性されたタンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。室温（ＲＴ）で１時間遮断した後、膜を適切な一次抗体（１：１０００）を含む脱脂乳において４℃で一晩培養した。メンブレンは、０．１％トリス緩衝生理食塩水を用いて洗浄した。Ｔｗｅｅｎ ２０（Sigma）および二次抗体（１：２０００）を含む脱脂乳において室温でさらに１時間培養した。ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Daeil Lab Service，Seoul，Korea）を用いてタンパク質シグナルを検出した。
プロテアーゼ阻害剤カクテル及びホスファターゼ阻害剤カクテルと共に、Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ １×Ｒｅａｇｅｎｔ（Promega，Fitchburg，WI，USA）を用いて、ＬＰＳで処理したＲＡＷ２６４．７細胞からタンパク質を分離した。細胞質および核タンパク質は、製造メーカーの指針に従って、ＥｘＫｉｎｅ－Ｎｕｃｌｅａｒ ａｎｄ Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Abbkine，Wuhan，China）を用いて得た。総タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ－ＢＣＡタンパク質分析キット（Thermo Scientific，Waltham，MA，USA）で定量化した。次いで、変性されたタンパク質を１２％ドデシル硫酸ナトリウム－ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。室温（ＲＴ）で１時間遮断した後、膜を適切な一次抗体（１：１０００）を含む脱脂乳において４℃で一晩培養した。メンブレンは、０．１％トリス緩衝生理食塩水を用いて洗浄した。Ｔｗｅｅｎ ２０（Sigma）および二次抗体（１：２０００）を含む脱脂乳において室温でさらに１時間培養した。ＥＣＬ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Daeil Lab Service，Seoul，Korea）を用いてタンパク質シグナルを検出した。
【0083】
（６）免疫蛍光（ＩＦ）の分析
ＲＡＷ２６４．７細胞を６ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０６個細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。ＥＰＳ（実施例５）で前処理した細胞を、ＬＰＳを含有する新鮮な培地で培養し、掻き取って回収した。４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Sigma）で透過化した後、細胞を３％ウシ血清アルブミン（BSA，Bovogen，East Keilor，Australia）で１時間ブロックした。次いで、ＰＥ接合されたｉＮＯＳ抗体と共にインキュベートした。洗浄した細胞をＮｕｃＢｌｕｅ－Ｓｔａｉｎを含むＰｒｏＬｏｎｇ－Ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Invitrogen）で装着した。また、ＮＦ－κＢの転位を可視化するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をＥＰＳで２時間前処理し、炎症反応をＬＰＳ（１ｇ／ｍＬ）で１時間刺激した。同様の方法で分離された細胞を製造した。ブロックを１時間行った後、細胞を４℃で１８時間ＮＦ－Ｂ抗体（１：２００）と共に培養した。次いで、細胞を徹底的に洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合二次抗体と共に３％ＢＳＡにおいて室温で３０分間培養した。同じ菌株を用いて細胞を装着した。全てのスライドは、ＬＳＭ ８００共焦点レーザー走査顕微鏡２９３（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）を用いて分析した。
ＲＡＷ２６４．７細胞を６ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０６個細胞の密度で播種し、一晩インキュベートした。ＥＰＳ（実施例５）で前処理した細胞を、ＬＰＳを含有する新鮮な培地で培養し、掻き取って回収した。４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Sigma）で透過化した後、細胞を３％ウシ血清アルブミン（BSA，Bovogen，East Keilor，Australia）で１時間ブロックした。次いで、ＰＥ接合されたｉＮＯＳ抗体と共にインキュベートした。洗浄した細胞をＮｕｃＢｌｕｅ－Ｓｔａｉｎを含むＰｒｏＬｏｎｇ－Ｇｌａｓｓ Ａｎｔｉｆａｄｅ Ｍｏｕｎｔａｎｔ（Invitrogen）で装着した。また、ＮＦ－κＢの転位を可視化するために、ＲＡＷ２６４．７細胞をＥＰＳで２時間前処理し、炎症反応をＬＰＳ（１ｇ／ｍＬ）で１時間刺激した。同様の方法で分離された細胞を製造した。ブロックを１時間行った後、細胞を４℃で１８時間ＮＦ－Ｂ抗体（１：２００）と共に培養した。次いで、細胞を徹底的に洗浄し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８接合二次抗体と共に３％ＢＳＡにおいて室温で３０分間培養した。同じ菌株を用いて細胞を装着した。全てのスライドは、ＬＳＭ ８００共焦点レーザー走査顕微鏡２９３（Carl Zeiss，Oberkochen，Germany）を用いて分析した。
【0084】
２．実験の結果
（１）ラクトバチルスプランタラム菌株から分泌される代謝産物のマウスマクロファージにおけるＬＰＳによる炎症反応抑制効果の確認
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７（American Type Culture Collection）でＬＰＳにより誘導されたサイトカインを定量化し、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の炎症反応抑制効果を確認した。１２ウェルプレートに播種した細胞をＬ－１４菌株と６時間共培養し、炎症誘発マーカーであるＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＭＣＰ－１（monocyte chemoattractant protein-1）をＬＰＳ処理によって誘導した。その結果、ＬＰＳ処理により、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＭＣＰ－１の発現レベルが増加したが、Ｌ－１４単独処理によっては増加しなかった。炎症性サイトカインの放出は、対照群（ＬＰＳ処理群）と比較して、Ｌ－１４と共培養された細胞において有意に減少した（図２Ａ）。また、Ｌ－１４菌株が細胞増殖に影響を及ぼして炎症性サイトカインが減少しないのではないかを確認するために、同じ培養条件で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞の生存力を定量化した。その結果、細胞生存力はＬ－１４またはＬＰＳによる影響を受けなかった（図２Ｂ）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４から分泌される代謝産物は、免疫細胞と直接相互作用して抗炎症効果を示すことを示唆している。
（１）ラクトバチルスプランタラム菌株から分泌される代謝産物のマウスマクロファージにおけるＬＰＳによる炎症反応抑制効果の確認
酵素結合免疫吸着アッセイ（ELISA）により、マウスマクロファージＲＡＷ２６４．７（American Type Culture Collection）でＬＰＳにより誘導されたサイトカインを定量化し、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４菌株（ＫＴＣＴ１３４９７ＢＰ）の炎症反応抑制効果を確認した。１２ウェルプレートに播種した細胞をＬ－１４菌株と６時間共培養し、炎症誘発マーカーであるＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＭＣＰ－１（monocyte chemoattractant protein-1）をＬＰＳ処理によって誘導した。その結果、ＬＰＳ処理により、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＭＣＰ－１の発現レベルが増加したが、Ｌ－１４単独処理によっては増加しなかった。炎症性サイトカインの放出は、対照群（ＬＰＳ処理群）と比較して、Ｌ－１４と共培養された細胞において有意に減少した（図２Ａ）。また、Ｌ－１４菌株が細胞増殖に影響を及ぼして炎症性サイトカインが減少しないのではないかを確認するために、同じ培養条件で培養されたＲＡＷ２６４．７細胞の生存力を定量化した。その結果、細胞生存力はＬ－１４またはＬＰＳによる影響を受けなかった（図２Ｂ）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラムＬ－１４から分泌される代謝産物は、免疫細胞と直接相互作用して抗炎症効果を示すことを示唆している。
【0085】
（２）ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳのマウスマクロファージにおけるＬＰＳによる形態学的変化の抑制効果の確認
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳがＬＰＳによって誘導された形態学的変化を抑制するかどうかを確認するために、マウスマクロファージに実施例５のＥＰＳを６時間前処理した後、ＬＰＳで１８時間形態学的変化を刺激した後、細胞の形態を確認した。クリスタルバイオレット染色の結果、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）がＬＰＳ処理による細胞の形態学的変化を緩和した（図３Ａ、図３において、ＥＰＳ１００は実施例５の１００μｇ／ｍｌ処理、ＥＰＳ２００は実施例５の２００μｇ／ｍｌ処理を意味する。）。また、ＲＡＷ２６４．７細胞をより高い濃度のＥＰＳで１日間処理した場合、細胞生存力は影響を受けないままで維持された（図３Ｂ）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳは、細胞生存力に影響を及ぼさずにマウスマクロファージにおけるＬＰＳで誘導された形態学的変化を抑制することを示す。
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳがＬＰＳによって誘導された形態学的変化を抑制するかどうかを確認するために、マウスマクロファージに実施例５のＥＰＳを６時間前処理した後、ＬＰＳで１８時間形態学的変化を刺激した後、細胞の形態を確認した。クリスタルバイオレット染色の結果、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）がＬＰＳ処理による細胞の形態学的変化を緩和した（図３Ａ、図３において、ＥＰＳ１００は実施例５の１００μｇ／ｍｌ処理、ＥＰＳ２００は実施例５の２００μｇ／ｍｌ処理を意味する。）。また、ＲＡＷ２６４．７細胞をより高い濃度のＥＰＳで１日間処理した場合、細胞生存力は影響を受けないままで維持された（図３Ｂ）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳは、細胞生存力に影響を及ぼさずにマウスマクロファージにおけるＬＰＳで誘導された形態学的変化を抑制することを示す。
【0086】
（３）ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳのマウスマクロファージにおけるＬＰＳによる炎症反応抑制効果の確認
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＬＰＳ刺激による炎症反応を抑制するかどうかを確認するために、実施例５のＥＰＳで前処理したＲＡＷ２６４．７細胞で産生された前炎症性サイトカインを定量化した。サイトカインの定量化の結果、Ｌ－１４由来のＥＰＳの前処理は、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βのレベルを弱め、特にＩＬ－１βを対照群の発現レベルと類似したレベルに減少させた（図４Ａ、図４において、ＥＰＳは実施例５を意味する。）。また、ウェスタンブロットにより、実施例５のＥＰＳが前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞における炎症の主な媒介体として知られているＣＯＸ－２および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現レベルを分析した。ＬＰＳの処理後、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳタンパク質の発現レベルが増加したが、これらの発現レベルはＥＰＳ前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞において抑制された（図４Ｂ）。さらに、免疫蛍光（ＩＦ）分析により、実施例５のＥＰＳが前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳ誘導型ｉＮＯＳの発現レベルを分析した。分析の結果、ＬＰＳ処理後、ＬＰＳ誘導型ｉＮＯＳの発現が増加したが、ＥＰＳ前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳ誘導型ｉＮＯＳの発現が減少した（図４Ｃ）。このような結果から、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳは、ＬＰＳ誘導炎症反応に対して抑制効果を示すことを確認した。
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＬＰＳ刺激による炎症反応を抑制するかどうかを確認するために、実施例５のＥＰＳで前処理したＲＡＷ２６４．７細胞で産生された前炎症性サイトカインを定量化した。サイトカインの定量化の結果、Ｌ－１４由来のＥＰＳの前処理は、ＩＬ－６、ＴＮＦ－αおよびＩＬ－１βのレベルを弱め、特にＩＬ－１βを対照群の発現レベルと類似したレベルに減少させた（図４Ａ、図４において、ＥＰＳは実施例５を意味する。）。また、ウェスタンブロットにより、実施例５のＥＰＳが前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞における炎症の主な媒介体として知られているＣＯＸ－２および誘導型一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）の発現レベルを分析した。ＬＰＳの処理後、ＣＯＸ－２およびｉＮＯＳタンパク質の発現レベルが増加したが、これらの発現レベルはＥＰＳ前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞において抑制された（図４Ｂ）。さらに、免疫蛍光（ＩＦ）分析により、実施例５のＥＰＳが前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳ誘導型ｉＮＯＳの発現レベルを分析した。分析の結果、ＬＰＳ処理後、ＬＰＳ誘導型ｉＮＯＳの発現が増加したが、ＥＰＳ前処理されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＬＰＳ誘導型ｉＮＯＳの発現が減少した（図４Ｃ）。このような結果から、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳは、ＬＰＳ誘導炎症反応に対して抑制効果を示すことを確認した。
【0087】
（４）ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳのマウスマクロファージにおけるＬＰＳによるＮＦ－κＢの核転位（Nuclear Translocation）抑制効果の確認
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＬＰＳによって誘導されたＮＦ－κＢの核への転位およびリン酸化を抑制するかどうかを確認するために、実施例５のＥＰＳで前処理したＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳで炎症反応を誘導した後、ＮＦ－κＢの発現レベルおよびリン酸化された形態の位置を分析した。その結果、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）前処理により、ｐ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢ比率は減少した（図５Ａ、図５において、ＥＰＳは実施例５を意味する。）。Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）自体は、ＮＦ－κＢのリン酸化を促進しなかった。一方、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）は、全ての濃度においてＮＦ－κＢのＬＰＳ誘導核転位を抑制した（図５Ｂ）。一貫して、ＮＦ－κＢの核への転位は、ＬＰＳによって誘導されたが、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）の前処理によって減少した（図５Ｃ、図５Ｃにおいて、ＥＰＳ１００は実施例５の１００ｕｇ／ｍｌ処理、ＥＰＳ２００は実施例５の２００μｇ／ｍｌ処理を意味する。）。
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＬＰＳによって誘導されたＮＦ－κＢの核への転位およびリン酸化を抑制するかどうかを確認するために、実施例５のＥＰＳで前処理したＲＡＷ２６４．７細胞にＬＰＳで炎症反応を誘導した後、ＮＦ－κＢの発現レベルおよびリン酸化された形態の位置を分析した。その結果、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）前処理により、ｐ－ＮＦ－κＢ／ＮＦ－κＢ比率は減少した（図５Ａ、図５において、ＥＰＳは実施例５を意味する。）。Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）自体は、ＮＦ－κＢのリン酸化を促進しなかった。一方、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）は、全ての濃度においてＮＦ－κＢのＬＰＳ誘導核転位を抑制した（図５Ｂ）。一貫して、ＮＦ－κＢの核への転位は、ＬＰＳによって誘導されたが、Ｌ－１４由来のＥＰＳ（実施例５）の前処理によって減少した（図５Ｃ、図５Ｃにおいて、ＥＰＳ１００は実施例５の１００ｕｇ／ｍｌ処理、ＥＰＳ２００は実施例５の２００μｇ／ｍｌ処理を意味する。）。
【0088】
（５）ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳのマウスマクロファージにおける炎症抑制経路の確認
１）ＭＡＰキナーゼ（mitogen－activated protein kinase，MAPK）およびＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｅ２－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２／Ｈｅｍｅ Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１（NRF2／HO－1）経路の調節
ＭＡＰＫおよびＮＲＦ２／ＨＯ－１経路は、マウスマクロファージにおける炎症反応の主な調節因子として知られている。まず、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳがＬＰＳで誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞でＭＡＰＫ経路を抑制できるかどうかを確認するために、ＭＡＰＫファミリータンパク質（ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８）のリン酸化をウェスタンブロットにより分析した。その結果、実施例５のＥＰＳは、１００ｇ／ｍＬの濃度でもＪＮＫ及びＥＲＫのリン酸化を有意に抑制した（図６Ａ、図６においてＥＰＳは実施例５を意味する。）。ｐ３８のリン酸化は、実施例５のＥＰＳを２００ｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に抑制された。また、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳの抗炎症効果がＮＲＦ２／ＨＯ－１経路によって媒介されるかを確認するために、ＮＲＦ２、ＨＯ－１マーカーのタンパク質発現レベルを確認した。その結果、ＨＯ－１およびＮＦＲ２の発現レベルは、ＬＰＳの有無に関係なく増加した（図６Ｂ）。さらに、実施例５のＥＰＳは、炎症反応を媒介する主な経路として知られているＮＲＦ２の核への転位を増加させた（図６Ｃ）。すなわち、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳは、ＭＡＰＫ系のタンパク質のリン酸化を抑制し、ＬＰＳで誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＲＦ２／ＨＯ－１の発現を向上させた。
１）ＭＡＰキナーゼ（mitogen－activated protein kinase，MAPK）およびＮｕｃｌｅａｒ Ｆａｃｔｏｒ Ｅ２－Ｒｅｌａｔｅｄ Ｆａｃｔｏｒ ２／Ｈｅｍｅ Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ－１（NRF2／HO－1）経路の調節
ＭＡＰＫおよびＮＲＦ２／ＨＯ－１経路は、マウスマクロファージにおける炎症反応の主な調節因子として知られている。まず、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳがＬＰＳで誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞でＭＡＰＫ経路を抑制できるかどうかを確認するために、ＭＡＰＫファミリータンパク質（ＪＮＫ、ＥＲＫおよびｐ３８）のリン酸化をウェスタンブロットにより分析した。その結果、実施例５のＥＰＳは、１００ｇ／ｍＬの濃度でもＪＮＫ及びＥＲＫのリン酸化を有意に抑制した（図６Ａ、図６においてＥＰＳは実施例５を意味する。）。ｐ３８のリン酸化は、実施例５のＥＰＳを２００ｇ／ｍＬの濃度で処理した場合に抑制された。また、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳの抗炎症効果がＮＲＦ２／ＨＯ－１経路によって媒介されるかを確認するために、ＮＲＦ２、ＨＯ－１マーカーのタンパク質発現レベルを確認した。その結果、ＨＯ－１およびＮＦＲ２の発現レベルは、ＬＰＳの有無に関係なく増加した（図６Ｂ）。さらに、実施例５のＥＰＳは、炎症反応を媒介する主な経路として知られているＮＲＦ２の核への転位を増加させた（図６Ｃ）。すなわち、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳは、ＭＡＰＫ系のタンパク質のリン酸化を抑制し、ＬＰＳで誘導されたＲＡＷ２６４．７細胞におけるＮＲＦ２／ＨＯ－１の発現を向上させた。
【0089】
２）ＬＰＳとＴＬＲ４との相互作用の抑制
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＴＬＲ４による炎症反応を抑制するかどうかを調べるために、ＲＡＷ２６４．７細胞に実施例５のＥＰＳおよびＬＰＳを処理した後、ＴＬＲ４の発現程度を分析した。その結果、ＬＰＳによって上方制御されたＴＬＲ４は、ＥＰＳ（全ての濃度）によって減少した（図７Ａ、図７においてＥＰＳは実施例５を意味する。）。また、ＴＬＲ４経路を遮断することが確認されたＴＡＫ－２４２を用いて、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳがＴＬＲ４と相互作用する方法を確認した。興味深いことに、ＲＡＷ２６４．７細胞にＥＰＳのみを処理した場合、ＴＬＲ４のタンパク質発現は、無処理対照群よりもさらに抑制された（図７Ｂ）。ＥＰＳはまた、ＴＡＫ－２４２処理群で観察されたものと同様に、ＬＰＳで誘導された群におけるＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の発現レベルを抑制した。ＣＯＸ－２の発現は、ＴＡＫ－２４２によって抑制され、ＥＰＳによっても同様な方式で抑制された。一貫して、ＥＰＳは、ＴＡＫ－２４２がそれらを下方制御するほど培地から分泌されたサイトカインＩＬ－１、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの発現を有意に減少させた（図７Ｃ）。前記の結果は、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＬＰＳ処理されたＲＡＷ２６４．７細胞においてＴＬＲ４によって抗炎症効果を示すことを示唆している。
ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＴＬＲ４による炎症反応を抑制するかどうかを調べるために、ＲＡＷ２６４．７細胞に実施例５のＥＰＳおよびＬＰＳを処理した後、ＴＬＲ４の発現程度を分析した。その結果、ＬＰＳによって上方制御されたＴＬＲ４は、ＥＰＳ（全ての濃度）によって減少した（図７Ａ、図７においてＥＰＳは実施例５を意味する。）。また、ＴＬＲ４経路を遮断することが確認されたＴＡＫ－２４２を用いて、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳがＴＬＲ４と相互作用する方法を確認した。興味深いことに、ＲＡＷ２６４．７細胞にＥＰＳのみを処理した場合、ＴＬＲ４のタンパク質発現は、無処理対照群よりもさらに抑制された（図７Ｂ）。ＥＰＳはまた、ＴＡＫ－２４２処理群で観察されたものと同様に、ＬＰＳで誘導された群におけるＴＬＲ４およびＭｙＤ８８の発現レベルを抑制した。ＣＯＸ－２の発現は、ＴＡＫ－２４２によって抑制され、ＥＰＳによっても同様な方式で抑制された。一貫して、ＥＰＳは、ＴＡＫ－２４２がそれらを下方制御するほど培地から分泌されたサイトカインＩＬ－１、ＩＬ－６およびＴＮＦ－αの発現を有意に減少させた（図７Ｃ）。前記の結果は、ラクトバチルスプランタラム由来のＥＰＳが、ＬＰＳ処理されたＲＡＷ２６４．７細胞においてＴＬＲ４によって抗炎症効果を示すことを示唆している。
【0090】
Ｖ．ラクトバチルスプランタラム抽出物またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の抗肥満、インスリン抵抗、脂肪肝阻害効果の確認
１．実験方法
（１）細胞培養、材料および統計
３Ｔ３－Ｌ１細胞株およびｈＢＭ－ＭＳＣは、それぞれＡＴＣＣ（American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA）およびＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Heidelberg，Germany）から入手した。３Ｔ３－Ｌ１細胞を４．５ｇ／Ｌ Ｄ－グルコース、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）（GE Healthcare，Chicago，IL，USA）で培養した。３Ｔ３－Ｌ１細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気を含むインキュベーターにおいて３７℃で培養した。
１．実験方法
（１）細胞培養、材料および統計
３Ｔ３－Ｌ１細胞株およびｈＢＭ－ＭＳＣは、それぞれＡＴＣＣ（American Type Culture Collection，Manassas，VA，USA）およびＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Heidelberg，Germany）から入手した。３Ｔ３－Ｌ１細胞を４．５ｇ／Ｌ Ｄ－グルコース、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ、３．７ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、４ｍＭ Ｌ－グルタミン、および１ｍＭピルビン酸ナトリウムを含有するＤＭＥＭ（Dulbecco's modified Eagle's medium）（GE Healthcare，Chicago，IL，USA）で培養した。３Ｔ３－Ｌ１細胞を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気を含むインキュベーターにおいて３７℃で培養した。
【0091】
６０％ｋｃａｌ脂肪を含有するＲｏｄｅｎｔ ＤｉｅｔをＲｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉｅｔｓ（New Brunswick，NJ，USA）から購入した。ＡＩＣＡＲおよびＣＣは、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ（Houston，TX，USA）から購入し、Ｃ２９は、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ann Arbor，MI，USA）から購入した。インスリン、レプチン、アディポネクチンおよびレジスチンＥＬＩＳＡキットは、ＣＵＳＡＢＩＯ（中国、フーベイ）から購入し、ＩＦＮ－γ、ＩＬ－６およびＭＣＰ１ ＥＬＩＳＡキットは、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（San Diego，CA，USA）から購入した。抗体の購入先は以下の通りである：Ａｋｔ、ウサギＩｇＧアイソタイプおよびヤギＩｇＧアイソタイプ抗体は、Ｂｉｏｓｓ（Woburn，MA，USA）；ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＢＰ４、ｔ－ＡＭＰＫα、ｐ－ＡＭＰＫα、ｔ－ＡＣＣ、ｐ－ＡＣＣ、ＦＡＳ、ｐ－ＮＦ－κＢ、ｔ－ＮＦ－κＢ、ｐ－ＡＫＴ、ｔ－ＡＫＴ、ｔ－ＡＳ１６０、ｐ－ＡＳ１６０およびＭｙＤ８８抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Danvers，MA，USA）；Ａｒｇ１、ＡＴＧＬ、ＩＬ－６、ＴＮＦ－α、ＴＬＲ２抗体は、ＣＵＳＡＢＩＯ；ＳＲＥＢＰ－１ｃ抗体は、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ（Centennial，CO，USA）；レプチン（leptin）及びレジスチン（resistin）抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis，MN，USA）；β－アクチン（actin）、ＧＡＰＤＨおよびＳＣＤ１抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Dallas，TX，USA）から購入した。
【0092】
統計分析は、ＳＰＳＳソフトウェア（バージョン25.0；SPSS Inc.，Chicago，Illinois）およびＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５（GraphPad，CA，USA）を用いて行った。データは、平均±標準偏差として示した。統計分析はＡＮＯＶＡを用いて決定し、有意性は＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１と定義した。
【0093】
（２）３Ｔ３－Ｌ１細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣの分化；並びに、脂肪蓄積およびトリアシルグリセロールの分析
３Ｔ３－Ｌ１細胞またはｈＢＭ－ＭＳＣを培地の２４ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０５個細胞の密度で播種した。細胞が融合してから２日後、培地をα－ＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐ／Ｓ、１ｕＭデキサメタゾン、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン、１００ｕＭインドメタシン、１０ｍｇ／ｍＬインスリン、およびラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）、ｐＨ７．０に調整したラクトバチルスプランタラム抽出物（Ｐ６０）、および９０℃で３０分間培養したラクトバチルスプランタラム抽出物（Ｈ６０）を含有する脂肪生成誘導培地（ＭＤＩ）に交換した。最初の脂肪生成誘導から４日後、α－ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍＬインスリン、および抽出物を含む脂肪生成維持培地に培地を交換した。脂肪分化中に２日ごとに培地を交換し、３Ｔ３－Ｌ１細胞とｈＢＭ－ＭＳＣをそれぞれ１２日および７日間維持した。１２日後、脂質蓄積を比較するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞とｈＢＭ－ＭＳＣをＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、次いでオイルレッドＯ溶液で３０分間染色した。染色した脂肪細胞をＥＶＯＳ ＣＬ Ｃｏｒｅ顕微鏡（Life Technologies）で２００倍拡大して観察した。相対的脂質蓄積を比較するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣのオイルレッドＯをイソプロパノールに溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて５００ｎｍにおける吸光度を測定して定量化した。結果は、対照群の値を１．０とし、それに対する百分率として分析した。相対的脂質蓄積を示す式は、（Ａｓａｍｐｌｅ－Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ－Ａｂｌａｎｋ）であった。また、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、製造メーカーの指針に従ってＴＡＧ分析キット（Cayman Chemical）で定量した。
３Ｔ３－Ｌ１細胞またはｈＢＭ－ＭＳＣを培地の２４ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０５個細胞の密度で播種した。細胞が融合してから２日後、培地をα－ＭＥＭ、１０％ ＦＢＳ、１％ Ｐ／Ｓ、１ｕＭデキサメタゾン、０．５ｍＭイソブチルメチルキサンチン、１００ｕＭインドメタシン、１０ｍｇ／ｍＬインスリン、およびラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）、ｐＨ７．０に調整したラクトバチルスプランタラム抽出物（Ｐ６０）、および９０℃で３０分間培養したラクトバチルスプランタラム抽出物（Ｈ６０）を含有する脂肪生成誘導培地（ＭＤＩ）に交換した。最初の脂肪生成誘導から４日後、α－ＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０ｍｇ／ｍＬインスリン、および抽出物を含む脂肪生成維持培地に培地を交換した。脂肪分化中に２日ごとに培地を交換し、３Ｔ３－Ｌ１細胞とｈＢＭ－ＭＳＣをそれぞれ１２日および７日間維持した。１２日後、脂質蓄積を比較するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞とｈＢＭ－ＭＳＣをＰＢＳで洗浄し、４％ホルムアルデヒドで固定し、次いでオイルレッドＯ溶液で３０分間染色した。染色した脂肪細胞をＥＶＯＳ ＣＬ Ｃｏｒｅ顕微鏡（Life Technologies）で２００倍拡大して観察した。相対的脂質蓄積を比較するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣのオイルレッドＯをイソプロパノールに溶解し、マイクロプレートリーダーを用いて５００ｎｍにおける吸光度を測定して定量化した。結果は、対照群の値を１．０とし、それに対する百分率として分析した。相対的脂質蓄積を示す式は、（Ａｓａｍｐｌｅ－Ａｂｌａｎｋ）／（Ａｃｏｎｔｒｏｌ－Ａｂｌａｎｋ）であった。また、トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、製造メーカーの指針に従ってＴＡＧ分析キット（Cayman Chemical）で定量した。
【0094】
（３）細胞生存力の分析
３Ｔ３－Ｌ１細胞を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０３個細胞の密度で播種した。２４時間後、培地を様々な濃度のラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）に交換し、４日間維持した。細胞生存力は、ＷＳＴ－１細胞生存力分析キット（DONGIN LS CO., LTD，Seoul，Korea）で確認した。
３Ｔ３－Ｌ１細胞を、９６ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０３個細胞の密度で播種した。２４時間後、培地を様々な濃度のラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）に交換し、４日間維持した。細胞生存力は、ＷＳＴ－１細胞生存力分析キット（DONGIN LS CO., LTD，Seoul，Korea）で確認した。
【0095】
（４）ウェスタンブロット分析
３Ｔ３－Ｌ１細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣを条件に従って回収し、氷上でプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤（ＭＣＥ）の混合物を含有するＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ １Ｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Promega）に５分間溶解した。不溶性の破片を４℃において１５分間１５，０００ｇで遠心分離して除去した。分離した上澄み液から合計１０～４０μｇのタンパク質を８～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。膜を室温で１時間、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．１％ツイン２０トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中で培養した。膜を４℃で一次抗体と共に５％ＢＳＡ－ＴＢＳＴで一晩培養した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）が結合した５％ＢＳＡ－ＴＢＳＴにおいて室温で１時間培養した。膜のタンパク質シグナルをＥＣＬウェスタンブロット基質（DAEILLAB SERVICE）で展開して分析した。全ての実験は３回繰り返した。
３Ｔ３－Ｌ１細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣを条件に従って回収し、氷上でプロテアーゼとホスファターゼ阻害剤（ＭＣＥ）の混合物を含有するＣｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｌｙｓｉｓ １Ｘ Ｒｅａｇｅｎｔ（Promega）に５分間溶解した。不溶性の破片を４℃において１５分間１５，０００ｇで遠心分離して除去した。分離した上澄み液から合計１０～４０μｇのタンパク質を８～１２％ＳＤＳ－ＰＡＧＥを用いて分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜に移した。膜を室温で１時間、５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する０．１％ツイン２０トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳＴ）中で培養した。膜を４℃で一次抗体と共に５％ＢＳＡ－ＴＢＳＴで一晩培養した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase）が結合した５％ＢＳＡ－ＴＢＳＴにおいて室温で１時間培養した。膜のタンパク質シグナルをＥＣＬウェスタンブロット基質（DAEILLAB SERVICE）で展開して分析した。全ての実験は３回繰り返した。
【0096】
（５）リアルタイム定量的ＰＣＲ
３Ｔ３－Ｌ１細胞からｍＲＮＡを分離し、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭＲＮＡｍｉｎｉｋｉｔ（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）を用いて、ラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）と培養し、ｃＤＮＡキット（Promega，Madison，WI，US）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Applied Biosystems，Foster City CA，USA）を用いて、ＴＢグリーンミックス（TAKARA，Shinga，Japan）でｃＤＮＡを増幅して分析した。ＲＴ－ｑＰＣＲに使用したプライマーを下記表１に示す。
３Ｔ３－Ｌ１細胞からｍＲＮＡを分離し、ＰｕｒｅＬｉｎｋＴＭＲＮＡｍｉｎｉｋｉｔ（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）を用いて、ラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）と培養し、ｃＤＮＡキット（Promega，Madison，WI，US）を用いてｃＤＮＡに逆転写した。次いで、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓＴＭＲｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Applied Biosystems，Foster City CA，USA）を用いて、ＴＢグリーンミックス（TAKARA，Shinga，Japan）でｃＤＮＡを増幅して分析した。ＲＴ－ｑＰＣＲに使用したプライマーを下記表１に示す。
【0097】
【表1】
【0098】
（６）動物、食事および研究設計
動物研究は、ソウル大学歯医科大学公認の動物施設センターで行われた。動物を対象とする手続きは、動物実験に関する韓国法規に基づいて行われ、研究はソウル大学動物管理委員会（ＳＮＵ－１８０３０９－１）の承認を受けた。
動物研究は、ソウル大学歯医科大学公認の動物施設センターで行われた。動物を対象とする手続きは、動物実験に関する韓国法規に基づいて行われ、研究はソウル大学動物管理委員会（ＳＮＵ－１８０３０９－１）の承認を受けた。
【0099】
４週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ雄マウスをＯｒｉｅｎｔ Ｂｉｏ（韓国、城南市）から購入した。マウスをランダムに３つのグループに分けた：（ｉ）正常食（ｎｏｒｍａｌ ｄｉｅｔ：ＮＤ、ｎ＝６）；（ｉｉ）高脂肪食（ｈｉｇｈ ｆａｔ ｄｉｅｔ，ＨＦＤ）（ｎ＝７）；（ｉｉｉ）Ｌ－１４食（Ｌ－１４抽出物（実施例１）を処理した高脂肪食（ＨＦＤ））（ｎ＝８）。マウスにＮＤまたはＨＦＤをさらに７週間供給し、マウスが水を自由に利用できるようにした。Ｌ－１４食群に、Ｌ－１４抽出物（５００ｍｇ／ｋｇ体重）を動物研究期間中２日毎に針カテーテルで経口投与した。他の２つのグループには、同じストレスを与えるために同じ条件下でＰＢＳを経口投与した。体重と食物摂取量を２日に１回測定した。７週間の摂食および投与後、マウスを一晩絶食させ、安楽死させた。表皮（Epididymal）および鼠径部（inguinal）の白色脂肪組織を採取して重量を測定した。肝および血清は、さらなる研究のために直ちに分離した。ＳｕｐｅｒＦａｓｔＰｒｅｐ－２ＴＭ（MP Biomedicals，Irvine，CA，USA）を用いてマウス脂肪組織から総タンパク質を分離し、ウェスタンブロット分析を行った。Ｋｏｒｅａ Ｍｏｕｓｅ Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ Ｃｅｎｔｅｒ（Seoul，Korea）で血清の生化学的分析を行い、製造メーカーの指針に従ってＥＬＩＳＡキットを用いてマウス血清中のホルモンとサイトカインを定量した。
【0100】
（７）マウス表皮の白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）および肝組織学
マウスのｅＷＡＴおよび肝を滅菌ＰＢＳで２回すすぎ、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに一晩固定した。組織を５μｍの断片に切断し、パラフィンブロックに挿入し、接着顕微鏡（Paul Marienfeld，Lauda－Konigshofen，Germany）に配置した。ワックスを除去し、再水和した部分をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学のために、セクションの抗原をクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で満たされた圧力容器で１０分間回収した。セクションを室温で２０分間、ＢＬＯＸＡＬＬ（登録商標）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Vector Laboratories，Burlingame、CA，USA）に浸漬し、２．５％正常ウマ血清（normal horse serum）で培養して非特異的結合を減らした。抗体を２．５％の正常ウマ血清（normal horse serum）で１：１００－２００に希釈し、セクションを希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ウサギＩｇＧ抗体およびヤギＩｇＧ抗体は、陰性対照群として使用した。次いで、セクションを室温で３０分間ＩｍｍＰＲＥＳＳポリマー抗ウサギＩｇＧ試薬および抗ヤギＩｇＧ試薬と共にインキュベートした。セクションをＩｍｍＰＡＣＴ（登録商標）ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（HRP）基質（Vector Laboratories）で染色し、次いでヘマトキシリンで軽く対照染色した。顕微鏡（BX50，Olympus，Tokyo，Japan）で画像を得た。
マウスのｅＷＡＴおよび肝を滅菌ＰＢＳで２回すすぎ、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドに一晩固定した。組織を５μｍの断片に切断し、パラフィンブロックに挿入し、接着顕微鏡（Paul Marienfeld，Lauda－Konigshofen，Germany）に配置した。ワックスを除去し、再水和した部分をヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。免疫組織化学のために、セクションの抗原をクエン酸緩衝液（ｐＨ７．０）で満たされた圧力容器で１０分間回収した。セクションを室温で２０分間、ＢＬＯＸＡＬＬ（登録商標）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Vector Laboratories，Burlingame、CA，USA）に浸漬し、２．５％正常ウマ血清（normal horse serum）で培養して非特異的結合を減らした。抗体を２．５％の正常ウマ血清（normal horse serum）で１：１００－２００に希釈し、セクションを希釈した一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートした。ウサギＩｇＧ抗体およびヤギＩｇＧ抗体は、陰性対照群として使用した。次いで、セクションを室温で３０分間ＩｍｍＰＲＥＳＳポリマー抗ウサギＩｇＧ試薬および抗ヤギＩｇＧ試薬と共にインキュベートした。セクションをＩｍｍＰＡＣＴ（登録商標）ＤＡＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（HRP）基質（Vector Laboratories）で染色し、次いでヘマトキシリンで軽く対照染色した。顕微鏡（BX50，Olympus，Tokyo，Japan）で画像を得た。
【0101】
（８）ラクトバチルスプランタラム抽出物とラクトバチルスプランタラム由来の多糖体がＡＭＰＫおよびＴＬＲ２シグナル経路に及ぼす影響の分析
３Ｔ３－Ｌ１細胞を培地の２４ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０５個細胞の密度で播種した。細胞が融合してから２日後、培地を１時間、ＤＭＥＭおよび１％Ｐ／Ｓのみを含有する飢餓培地に交換した。飢餓状態の後、培地を２５０μＭ ５－アミノイミダゾール－４－カルボキシアミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、５μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ（ＣＣ）および５０μＭ Ｃ２９を含む一般の培地に交換し、細胞を２時間培養した。Ｌ－１４抽出物（実施例１）またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体（実施例６～９）を用いて、ＭＤＩにおいて細胞が成熟脂肪細胞に分化するように誘導した。ＡＩＣＡＲおよびＣ２９を２日ごとに処理し、ＣＣは全期間にわたってさらなる処理を行わなかった。１２日後、ＡＭＰＫおよびＴＬＲ２シグナル伝達経路によるＬ－１４抽出物またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の脂肪生成抑制効果を、オイルレッドＯ染色およびＴＡＧ分析によって分析した。さらに、脂肪分化の初期段階におけるＬ－１４抽出物またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の効果を確認するために、４日目にタンパク質を分離し、ウェスタンブロットで分析した。
３Ｔ３－Ｌ１細胞を培地の２４ウェルプレートに１ウェル当たり１．０×１０５個細胞の密度で播種した。細胞が融合してから２日後、培地を１時間、ＤＭＥＭおよび１％Ｐ／Ｓのみを含有する飢餓培地に交換した。飢餓状態の後、培地を２５０μＭ ５－アミノイミダゾール－４－カルボキシアミドリボヌクレオチド（ＡＩＣＡＲ）、５μＭ Ｃｏｍｐｏｕｎｄ Ｃ（ＣＣ）および５０μＭ Ｃ２９を含む一般の培地に交換し、細胞を２時間培養した。Ｌ－１４抽出物（実施例１）またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体（実施例６～９）を用いて、ＭＤＩにおいて細胞が成熟脂肪細胞に分化するように誘導した。ＡＩＣＡＲおよびＣ２９を２日ごとに処理し、ＣＣは全期間にわたってさらなる処理を行わなかった。１２日後、ＡＭＰＫおよびＴＬＲ２シグナル伝達経路によるＬ－１４抽出物またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の脂肪生成抑制効果を、オイルレッドＯ染色およびＴＡＧ分析によって分析した。さらに、脂肪分化の初期段階におけるＬ－１４抽出物またはラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の効果を確認するために、４日目にタンパク質を分離し、ウェスタンブロットで分析した。
【0102】
２．実験の結果
（１）ラクトバチルスプランタラム抽出物の３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣの成熟脂肪細胞への分化抑制効果の確認
ラクトバチルスプランタラム抽出物が脂肪生成抑制効果を示すかどうかを確認するために、以下の実験を行った。３Ｔ３－Ｌ１細胞に、脂肪分化過程で２日毎に２０及び６０μｇ／ｍＬ濃度のラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）を処理した（図８Ａ）。オイルレッドＯ染色の結果、脂質蓄積はＬ－１４抽出物によって用量依存的に抑制された（図８Ｂ及び８Ｃ、スケールバー＝１００μｍ、図８Ｂ及び８Ｃは実施例１の実験結果を示す。）。また、ＴＡＧアッセイによりラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）がＴＡＧ保存を抑制することを確認した（図８Ｄ及び図１６、８Ｄ及び図１６はそれぞれ、順に実施例１及び実施例２～４の実験結果を示す。）。各乳酸菌株の１Ｌ培養液を基準で抽出されて出てくる菌体タンパク質含有量を基準でそれぞれＬ－１４（３２．０１５ｍｇ）、ＡＣＴＴ１０２４１（２３．２４７ｍｇ）、ＮＣＤＯ７１（１９．１８１ｍｇ）、ＮＣＤＯ１１９３（１７．５３２ｍｇ）の量を得ることができ、同じ培養体積を基準でＬ－１４の方が最も速い成長率で高い菌体量が得られた。菌体抽出物定量したタンパク質を基準で同じタンパク質量を処理した場合、対照群と比較して７５％程度の減少効果を示すことを確認することができた。すなわち、７５％程度の減少効果を示すのに必要な量は、１Ｌ培養した菌体のタンパク質を基準とした希釈倍数（２５μｇ／ｍｌの濃度に相当）は、それぞれＬ－１４（１２８０倍希釈量_１２８０ｘ）、ＡＣＴＴ１０２４１（９３０倍希釈量_９３０ｘ）、ＮＣＤＯ７１（７６７倍希釈量_７６７ｘ）、ＮＣＤＯ１１９３（７０１倍希釈量_７０１ｘ）の通りである。このことから、ラクトバチルスプランタラム菌株の中で、Ｌ－１４種菌が最も多くの抗肥満物質を生産できることが分かった。Ｌ－１４抽出物（実施例１）は、３Ｔ３－Ｌ１細胞の細胞生存力に影響を与えなかった（図８Ｅ）。これは、脂肪細胞分化に対する抑制効果がＬ－１４抽出物（実施例１）の細胞毒性によるものではないことを意味する。さらに、ウェスタンブロット分析により、Ｌ－１４抽出物（実施例１）が主な脂肪生成マーカーとして知られているペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（peroxisome proliferator－activated receptor γ，PPARγ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（CCAAT－enhancer－binding proteins α，C/EBPα）、及び脂肪酸結合タンパク質４（fatty acid－binding protein 4，FABP4）のタンパク質発現を減少させることを確認した（図８Ｆ）。また、ＲＴ－ｑＰＣＲにより確認した結果、ウェスタンブロットの結果と一貫して、Ｌ－１４抽出物（実施例１）が３Ｔ３－Ｌ１細胞においてＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＢ４、脂肪タンパク質リパーゼ（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸合成酵素（fatty acid synthase，FAS）、グリセロール－３リン酸脱水素酵素（glycerol－3－phosphate dehydrogenase，GPDH）、ＣＤ３６を含む脂肪生成分化マーカーの遺伝子発現を有意に減少させた（図８Ｇ、図８Ｈ）。前記マーカーは、脂肪生成分化の初期段階（０～４日目）でＬ－１４抽出物（実施例１）によって既に減少していた。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム抽出物による脂肪生成の抑制は、分化初期に脂肪生成因子の発現を減少させることによって発生し得ることを示している。図８中の「ＮＣ」とは、陰性対照群として正常培地で培養された細胞を意味する。
（１）ラクトバチルスプランタラム抽出物の３Ｔ３－Ｌ１脂肪前駆細胞およびｈＢＭ－ＭＳＣの成熟脂肪細胞への分化抑制効果の確認
ラクトバチルスプランタラム抽出物が脂肪生成抑制効果を示すかどうかを確認するために、以下の実験を行った。３Ｔ３－Ｌ１細胞に、脂肪分化過程で２日毎に２０及び６０μｇ／ｍＬ濃度のラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）を処理した（図８Ａ）。オイルレッドＯ染色の結果、脂質蓄積はＬ－１４抽出物によって用量依存的に抑制された（図８Ｂ及び８Ｃ、スケールバー＝１００μｍ、図８Ｂ及び８Ｃは実施例１の実験結果を示す。）。また、ＴＡＧアッセイによりラクトバチルスプランタラム抽出物（実施例１～４）がＴＡＧ保存を抑制することを確認した（図８Ｄ及び図１６、８Ｄ及び図１６はそれぞれ、順に実施例１及び実施例２～４の実験結果を示す。）。各乳酸菌株の１Ｌ培養液を基準で抽出されて出てくる菌体タンパク質含有量を基準でそれぞれＬ－１４（３２．０１５ｍｇ）、ＡＣＴＴ１０２４１（２３．２４７ｍｇ）、ＮＣＤＯ７１（１９．１８１ｍｇ）、ＮＣＤＯ１１９３（１７．５３２ｍｇ）の量を得ることができ、同じ培養体積を基準でＬ－１４の方が最も速い成長率で高い菌体量が得られた。菌体抽出物定量したタンパク質を基準で同じタンパク質量を処理した場合、対照群と比較して７５％程度の減少効果を示すことを確認することができた。すなわち、７５％程度の減少効果を示すのに必要な量は、１Ｌ培養した菌体のタンパク質を基準とした希釈倍数（２５μｇ／ｍｌの濃度に相当）は、それぞれＬ－１４（１２８０倍希釈量_１２８０ｘ）、ＡＣＴＴ１０２４１（９３０倍希釈量_９３０ｘ）、ＮＣＤＯ７１（７６７倍希釈量_７６７ｘ）、ＮＣＤＯ１１９３（７０１倍希釈量_７０１ｘ）の通りである。このことから、ラクトバチルスプランタラム菌株の中で、Ｌ－１４種菌が最も多くの抗肥満物質を生産できることが分かった。Ｌ－１４抽出物（実施例１）は、３Ｔ３－Ｌ１細胞の細胞生存力に影響を与えなかった（図８Ｅ）。これは、脂肪細胞分化に対する抑制効果がＬ－１４抽出物（実施例１）の細胞毒性によるものではないことを意味する。さらに、ウェスタンブロット分析により、Ｌ－１４抽出物（実施例１）が主な脂肪生成マーカーとして知られているペルオキシソーム増殖因子活性化受容体γ（peroxisome proliferator－activated receptor γ，PPARγ）、ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質α（CCAAT－enhancer－binding proteins α，C/EBPα）、及び脂肪酸結合タンパク質４（fatty acid－binding protein 4，FABP4）のタンパク質発現を減少させることを確認した（図８Ｆ）。また、ＲＴ－ｑＰＣＲにより確認した結果、ウェスタンブロットの結果と一貫して、Ｌ－１４抽出物（実施例１）が３Ｔ３－Ｌ１細胞においてＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＢ４、脂肪タンパク質リパーゼ（lipoprotein lipase，LPL）、脂肪酸合成酵素（fatty acid synthase，FAS）、グリセロール－３リン酸脱水素酵素（glycerol－3－phosphate dehydrogenase，GPDH）、ＣＤ３６を含む脂肪生成分化マーカーの遺伝子発現を有意に減少させた（図８Ｇ、図８Ｈ）。前記マーカーは、脂肪生成分化の初期段階（０～４日目）でＬ－１４抽出物（実施例１）によって既に減少していた。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム抽出物による脂肪生成の抑制は、分化初期に脂肪生成因子の発現を減少させることによって発生し得ることを示している。図８中の「ＮＣ」とは、陰性対照群として正常培地で培養された細胞を意味する。
【0103】
（２）ラクトバチルスプランタラム抽出物のＨＦＤマウスモデルにおける体重増加および炎症誘発マーカーの発現抑制効果の確認
生体内でのラクトバチルスプランタラム抽出物摂取の効果を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをランダムに３つのグループに分けた：正常食（ｎ＝６）、高脂肪食（ＨＦＤ）（ｎ＝７）およびＬ－１４食（Ｌ－１４抽出物（実施例１）を処理した高脂肪食（ＨＦＤ））（ｎ＝８）。Ｌ－１４食群にＬ－１４抽出物（実施例１）（５００ｍｇ／ｋｇ体重）を動物研究期間中２日毎に針カテーテルで経口投与した。他の２つのグループには、同じストレスを与えるために同じ条件下でＰＢＳを経口投与した。経口投与の結果、マウスの平均体重は３６日後に有意な差を示した。特に、Ｌ－１４食群の体重（３１．５１±１．９６ｇ）は、ＨＦＤ群の体重（３５．１４±３．１８ｇ）と有意な差を示した（図９Ａ及び図９Ｂ、図９において、ＮＤは正常食群、ＨＦＤは高脂肪食群、ＨＦＤ＋Ｌ－１４はＬ－１４食群を意味する。）。Ｌ－１４抽出物の経口投与後、食物摂取量には大きな変化がなかった（図９Ｃ）。Ｌ－１４食群では、ＨＦＤ群と比較して表皮の白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）（１．１０±０．１４ v．s．０．８１±０．１０ｇ）および鼠径部（inguinal）の白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）（０．９９±０．１９ v．s．０．６７±０．１２ｇ）の脂肪量を大幅に減少させた（図９Ｄ及び９Ｅ）。Ｈ＆Ｅ染色により、ｅＷＡＴの脂肪細胞サイズがＨＦＤ群よりもＬ－１４食群において顕著に小さいことを確認した（図９Ｆ、スケールバー＝１００μｍ）。また、Ｌ－１４食群の脂肪組織において、レプチン、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、レジスチンのような炎症誘発マーカーの発現が減少し、アディポネクチンおよびアルギナーゼ１（Ａｒｇ１）のような抗炎症マーカーの発現が増加した（図９Ｆ及び図９Ｇ）。
生体内でのラクトバチルスプランタラム抽出物摂取の効果を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスをランダムに３つのグループに分けた：正常食（ｎ＝６）、高脂肪食（ＨＦＤ）（ｎ＝７）およびＬ－１４食（Ｌ－１４抽出物（実施例１）を処理した高脂肪食（ＨＦＤ））（ｎ＝８）。Ｌ－１４食群にＬ－１４抽出物（実施例１）（５００ｍｇ／ｋｇ体重）を動物研究期間中２日毎に針カテーテルで経口投与した。他の２つのグループには、同じストレスを与えるために同じ条件下でＰＢＳを経口投与した。経口投与の結果、マウスの平均体重は３６日後に有意な差を示した。特に、Ｌ－１４食群の体重（３１．５１±１．９６ｇ）は、ＨＦＤ群の体重（３５．１４±３．１８ｇ）と有意な差を示した（図９Ａ及び図９Ｂ、図９において、ＮＤは正常食群、ＨＦＤは高脂肪食群、ＨＦＤ＋Ｌ－１４はＬ－１４食群を意味する。）。Ｌ－１４抽出物の経口投与後、食物摂取量には大きな変化がなかった（図９Ｃ）。Ｌ－１４食群では、ＨＦＤ群と比較して表皮の白色脂肪組織（ｅＷＡＴ）（１．１０±０．１４ v．s．０．８１±０．１０ｇ）および鼠径部（inguinal）の白色脂肪組織（ｉＷＡＴ）（０．９９±０．１９ v．s．０．６７±０．１２ｇ）の脂肪量を大幅に減少させた（図９Ｄ及び９Ｅ）。Ｈ＆Ｅ染色により、ｅＷＡＴの脂肪細胞サイズがＨＦＤ群よりもＬ－１４食群において顕著に小さいことを確認した（図９Ｆ、スケールバー＝１００μｍ）。また、Ｌ－１４食群の脂肪組織において、レプチン、インターロイキン－６（ＩＬ－６）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、レジスチンのような炎症誘発マーカーの発現が減少し、アディポネクチンおよびアルギナーゼ１（Ａｒｇ１）のような抗炎症マーカーの発現が増加した（図９Ｆ及び図９Ｇ）。
【0104】
（３）ラクトバチルスプランタラム抽出物のインスリン抵抗性マーカーおよび肝脂肪阻害効果の確認
血液化学検査およびＥＬＩＳＡにより、ラクトバチルスプランタラム抽出物のインスリン抵抗性マーカーおよび肝脂肪症の減少効果を確認した。血液化学検査により、ＨＦＤ群と比較してＬ－１４食マウスにおいて低密度リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ－ｃ）およびＴＡＧのレベルが顕著に減少し、高密度リポタンパクコレステロール（ＨＤＬ－ｃ）のレベルが並列に増加（ｐ＜０．０５６）することを確認した（図１０Ａ、図１０において、ＮＤは正常食群、ＨＦＤは高脂肪食群、ＨＦＤ＋Ｌ－１４はＬ－１４食群を意味する。）。一貫して、Ｌ－１４抽出物（実施例１）によって総コレステロールが減少し、血清中のインスリン抵抗性マーカーであるＴＡＧ／ＨＤＬ－ｃの割合も有意に減少することを確認した（図１０Ｂ）。空腹時血糖、空腹時インスリン、レプチン、レジスチンは減少しているのに対して、ＧＯＴ（ＡＳＴ）、ＧＰＴ（ＡＬＴ）、アディポネクチン、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、ＩＬ－６、ＭＣＰ１（monocyte chemoattractant protein 1）は有意な変化がなかった（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。また、Ｌ－１４抽出物（実施例１）が肝に与える影響を確認するために、ＨＦＤモデルから分離した肝組織サンプルを組織学的に分析した。Ｈ＆Ｅ染色の結果、Ｌ－１４抽出物（実施例１）がＨＦＤによって誘導された肝脂肪症を弱めることを確認した（図１０Ｅ、スケールバー＝１００μｍ）。さらに、ＳｕｐｅｒＦａｓｔＰｒｅｐ－２ＴＭ（MP Biomedicals，Irvine，CA，USA）を用いてマウスおよび肝から総タンパク質を分離し、ウェスタンブロットで分析した。Ｌ－１４抽出物（実施例１）はＭＣＰ１およびＩＬ－６の発現を抑制する一方、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を活性化することを確認した。Ａｒｇ１と脂肪分解に関与するＡＴＧＬ（adipose triglyceride lipase）の発現には有意な変化がなかったが、肝でのＩＬ－６の発現はＬ－１４抽出物によって減少した（図１０Ｆ）。前述したＴＡＧ阻害効果のように、実施例１と同じラクトバチルスプランタラム抽出物である実施例２～４においても、このようなインスリン抵抗性マーカーおよび肝脂肪阻害効果が示されることを十分に予測することができる。
血液化学検査およびＥＬＩＳＡにより、ラクトバチルスプランタラム抽出物のインスリン抵抗性マーカーおよび肝脂肪症の減少効果を確認した。血液化学検査により、ＨＦＤ群と比較してＬ－１４食マウスにおいて低密度リポタンパクコレステロール（ＬＤＬ－ｃ）およびＴＡＧのレベルが顕著に減少し、高密度リポタンパクコレステロール（ＨＤＬ－ｃ）のレベルが並列に増加（ｐ＜０．０５６）することを確認した（図１０Ａ、図１０において、ＮＤは正常食群、ＨＦＤは高脂肪食群、ＨＦＤ＋Ｌ－１４はＬ－１４食群を意味する。）。一貫して、Ｌ－１４抽出物（実施例１）によって総コレステロールが減少し、血清中のインスリン抵抗性マーカーであるＴＡＧ／ＨＤＬ－ｃの割合も有意に減少することを確認した（図１０Ｂ）。空腹時血糖、空腹時インスリン、レプチン、レジスチンは減少しているのに対して、ＧＯＴ（ＡＳＴ）、ＧＰＴ（ＡＬＴ）、アディポネクチン、インターフェロンγ（ＩＦＮ－γ）、ＩＬ－６、ＭＣＰ１（monocyte chemoattractant protein 1）は有意な変化がなかった（図１０Ｃ及び１０Ｄ）。また、Ｌ－１４抽出物（実施例１）が肝に与える影響を確認するために、ＨＦＤモデルから分離した肝組織サンプルを組織学的に分析した。Ｈ＆Ｅ染色の結果、Ｌ－１４抽出物（実施例１）がＨＦＤによって誘導された肝脂肪症を弱めることを確認した（図１０Ｅ、スケールバー＝１００μｍ）。さらに、ＳｕｐｅｒＦａｓｔＰｒｅｐ－２ＴＭ（MP Biomedicals，Irvine，CA，USA）を用いてマウスおよび肝から総タンパク質を分離し、ウェスタンブロットで分析した。Ｌ－１４抽出物（実施例１）はＭＣＰ１およびＩＬ－６の発現を抑制する一方、ＡＭＰＫシグナル伝達経路を活性化することを確認した。Ａｒｇ１と脂肪分解に関与するＡＴＧＬ（adipose triglyceride lipase）の発現には有意な変化がなかったが、肝でのＩＬ－６の発現はＬ－１４抽出物によって減少した（図１０Ｆ）。前述したＴＡＧ阻害効果のように、実施例１と同じラクトバチルスプランタラム抽出物である実施例２～４においても、このようなインスリン抵抗性マーカーおよび肝脂肪阻害効果が示されることを十分に予測することができる。
【0105】
（４）ラクトバチルスプランタラム抽出物の脂肪分化初期段階における脂肪生成抑制効果の確認
脂肪生成分化に対するラクトバチルスプランタラム抽出物の抑制効果がＡＭＰＫシグナル伝達経路によって媒介されるかどうかを確認するために、ＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲおよびＡＭＰＫ阻害剤であるＣＣと共に、Ｌ－１４抽出物（実施例１）を３Ｔ３－Ｌ１細胞に処理した。その結果、ＡＩＣＡＲは分化後の３Ｔ３－Ｌ１細胞の脂質含有量を有意に減少させ、追加のＬ－１４抽出物（実施例１）処理はＡＩＣＡＲの抑制効果を向上させた。ＣＣは３Ｔ３－Ｌ１細胞における脂質蓄積に影響を及ぼさなかったが、Ｌ－１４抽出物（実施例１）はＡＭＰＫ抑制条件下でもＴＡＧを減少させた（図１１Ａ及び図１１Ｂ、スケールバー＝１００μｍ、図１１においてＬ１４は実施例１を意味する。）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム抽出物の抗脂肪生成効果がＡＭＰＫシグナル伝達経路によって媒介されることを示唆している。ラクトバチルスプランタラム抽出物によって脂肪分化の初期段階（Ｄａｙ０－４）でＡＭＰＫ経路が活性化できるかどうかを確認するために、マーカーをウェスタンブロットで分析した。ＡＭＰＫ経路は、４日以内にＡＩＣＡＲおよびＬ－１４抽出物（実施例１）によって相乗的に活性化された。その結果、ＰＰＡＲγおよびＦＡＢＰ４などの脂肪生成マーカーの発現が有意に減少した（図１１Ｃ）。さらに、Ｌ－１４抽出物（実施例１）は、ＣＣによって抑制されたＡＭＰＫαのリン酸化を増加させた。ＡＩＣＡＲとＬ－１４抽出物（実施例１）を同時に処理すると、ＴＡＧ蓄積が相乗的に抑制された。また、Ｌ－１４抽出物（実施例１）は、分化初期（４日目）にＡＭＰＫシグナル伝達経路を上方制御してヒト骨髄間葉幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）の脂肪生成分化を抑制した（図１２、図１２においてＬ１４は実施例１を意味する。）。具体的には、オイルレッドＯ染色により、Ｌ－１４抽出物（実施例１）がｈＢＭ－ＭＳＣで脂質蓄積を抑制することを確認した（スケールバー＝１００μｍ）（図１２Ｃ）。ＴＡＧアッセイにより、Ｌ－１４抽出物（実施例１）がＴＡＧ保存を抑制することを確認した（図１２Ｄ）。脂肪分化マーカー（ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＢＰ４、レプチン、ＧＰＤＨおよびＣＤ３６）の遺伝子発現もＬ－１４抽出物（実施例１）によって減少した（図１２Ｅ）。Ｌ－１４抽出物（実施例１）を４日間培養したｈＢＭ－ＭＳＣにおける主な脂肪生成マーカーおよびアディポネクチンのタンパク質発現は減少し、ＡＭＰＫシグナル伝達経路マーカーの発現は増加した（図１２Ｆ）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム抽出物が脂肪分化の初期段階でＡＭＰＫシグナル伝達経路を上方制御し、マウス脂肪前駆細胞とｈＢＭ－ＭＳＣが成熟脂肪細胞に分化することを抑制することを示唆している。
脂肪生成分化に対するラクトバチルスプランタラム抽出物の抑制効果がＡＭＰＫシグナル伝達経路によって媒介されるかどうかを確認するために、ＡＭＰＫ活性化剤であるＡＩＣＡＲおよびＡＭＰＫ阻害剤であるＣＣと共に、Ｌ－１４抽出物（実施例１）を３Ｔ３－Ｌ１細胞に処理した。その結果、ＡＩＣＡＲは分化後の３Ｔ３－Ｌ１細胞の脂質含有量を有意に減少させ、追加のＬ－１４抽出物（実施例１）処理はＡＩＣＡＲの抑制効果を向上させた。ＣＣは３Ｔ３－Ｌ１細胞における脂質蓄積に影響を及ぼさなかったが、Ｌ－１４抽出物（実施例１）はＡＭＰＫ抑制条件下でもＴＡＧを減少させた（図１１Ａ及び図１１Ｂ、スケールバー＝１００μｍ、図１１においてＬ１４は実施例１を意味する。）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム抽出物の抗脂肪生成効果がＡＭＰＫシグナル伝達経路によって媒介されることを示唆している。ラクトバチルスプランタラム抽出物によって脂肪分化の初期段階（Ｄａｙ０－４）でＡＭＰＫ経路が活性化できるかどうかを確認するために、マーカーをウェスタンブロットで分析した。ＡＭＰＫ経路は、４日以内にＡＩＣＡＲおよびＬ－１４抽出物（実施例１）によって相乗的に活性化された。その結果、ＰＰＡＲγおよびＦＡＢＰ４などの脂肪生成マーカーの発現が有意に減少した（図１１Ｃ）。さらに、Ｌ－１４抽出物（実施例１）は、ＣＣによって抑制されたＡＭＰＫαのリン酸化を増加させた。ＡＩＣＡＲとＬ－１４抽出物（実施例１）を同時に処理すると、ＴＡＧ蓄積が相乗的に抑制された。また、Ｌ－１４抽出物（実施例１）は、分化初期（４日目）にＡＭＰＫシグナル伝達経路を上方制御してヒト骨髄間葉幹細胞（ＢＭ－ＭＳＣ）の脂肪生成分化を抑制した（図１２、図１２においてＬ１４は実施例１を意味する。）。具体的には、オイルレッドＯ染色により、Ｌ－１４抽出物（実施例１）がｈＢＭ－ＭＳＣで脂質蓄積を抑制することを確認した（スケールバー＝１００μｍ）（図１２Ｃ）。ＴＡＧアッセイにより、Ｌ－１４抽出物（実施例１）がＴＡＧ保存を抑制することを確認した（図１２Ｄ）。脂肪分化マーカー（ＰＰＡＲγ、Ｃ／ＥＢＰα、ＦＡＢＰ４、レプチン、ＧＰＤＨおよびＣＤ３６）の遺伝子発現もＬ－１４抽出物（実施例１）によって減少した（図１２Ｅ）。Ｌ－１４抽出物（実施例１）を４日間培養したｈＢＭ－ＭＳＣにおける主な脂肪生成マーカーおよびアディポネクチンのタンパク質発現は減少し、ＡＭＰＫシグナル伝達経路マーカーの発現は増加した（図１２Ｆ）。このような結果は、ラクトバチルスプランタラム抽出物が脂肪分化の初期段階でＡＭＰＫシグナル伝達経路を上方制御し、マウス脂肪前駆細胞とｈＢＭ－ＭＳＣが成熟脂肪細胞に分化することを抑制することを示唆している。
【0106】
（５）ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の脂肪生成分化調節効果の確認
ラクトバチルスプランタラム抽出物において脂肪生成抑制効果を示す分子が何であるかを確認するために、過酷な温度条件やｐＨ条件に暴露されたラクトバチルスプランタラム抽出物（Ｈ６０、Ｐ６０）の脂肪生成抑制効果を確認した。その結果、ラクトバチルスプランタラム抽出物の脂肪生成抑制効果は、過酷な温度条件でｐＨ変化や培養によって変化せず、これは脂肪生成抑制効果を有する有効分子が熱に安定であることを意味する（図１３、スケールバー＝１００μｍ）。
ラクトバチルスプランタラム抽出物において脂肪生成抑制効果を示す分子が何であるかを確認するために、過酷な温度条件やｐＨ条件に暴露されたラクトバチルスプランタラム抽出物（Ｈ６０、Ｐ６０）の脂肪生成抑制効果を確認した。その結果、ラクトバチルスプランタラム抽出物の脂肪生成抑制効果は、過酷な温度条件でｐＨ変化や培養によって変化せず、これは脂肪生成抑制効果を有する有効分子が熱に安定であることを意味する（図１３、スケールバー＝１００μｍ）。
【0107】
実施例５～９のラクトバチルスプランタラム由来の多糖体が脂質蓄積を抑制できるかどうかを確認するために、３Ｔ３－Ｌ１細胞をＥＰＳと共にＭＤＩで１２日間培養し分析した。脂質蓄積分析およびＴＡＧ分析の結果、４種類のラクトバチルスプランタラム菌株由来の多糖体がいずれも脂肪生成抑制効果を有することを確認した（図１４Ａ～１４Ｃ及び図１５、図１４は実施例６の実験結果を示し、図１５は実施例７～９の実験結果を示す。）。また、ウェスタンブロット分析により、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体がＡＭＰＫ経路を上方制御し、脂肪生成マーカーとアディポネクチンの発現を下方制御することを確認した。さらに、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体が細胞内ブドウ糖取り込みに関連していることが知られているＡＫＴ（Protein kinase B）と１６０ｋＤａのＡｋｔ基質（ＡＳ１６０）のリン酸化を増加させることを確認した（図１４Ｄ）。さらに、細胞内のどの受容体がラクトバチルスプランタラム由来の多糖体と相互作用するかを確認するために、ＴＬＲ２阻害剤Ｃ２９を使用してさらなる研究を行った。その結果、脂質蓄積はＣ２９の影響を受けなかったが、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体の脂肪生成抑制効果はＣ２９処理群で有意に減少した（図１４Ｅ及び図１４Ｆ）。さらに、ＴＬＲ２およびＭｙＤ８８（myeloid differentiation primary response 88）の発現がＣ２９によって抑制された初期段階（４日目）において、ＥＰＳによるＡＭＰＫ経路の活性化が抑制された。これは、ラクトバチルスプランタラム由来の多糖体がＴＬＲ２と相互作用してＡＭＰＫ経路を活性化し、結果として脂肪生成を抑制することを意味する（図１４Ｇ）。
【0108】
［微生物寄託証］
【図1】
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【図5】
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【図8】
【図9】
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【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【配列表】
【国際調査報告】