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特表2024-510388多能性細胞を培養して前駆細胞または成熟筋細胞に分化させる方法、および前記細胞を含む組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-07
(54)【発明の名称】多能性細胞を培養して前駆細胞または成熟筋細胞に分化させる方法、および前記細胞を含む組成物
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240229BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240229BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/077
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550325
(86)(22)【出願日】2022-03-20
(85)【翻訳文提出日】2023-10-20
(86)【国際出願番号】 IL2022050310
(87)【国際公開番号】W WO2022201147
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/164,047
(32)【優先日】2021-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501177609
【氏名又は名称】ラモット・アット・テル・アビブ・ユニバーシテイ・リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＲＡＭＯＴ ＡＴ ＴＥＬ ＡＶＩＶ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＬＴＤ．
(74)【代理人】
【識別番号】110003926
【氏名又は名称】弁理士法人イノベンティア
(72)【発明者】
【氏名】ナックマン、 イフタック
(72)【発明者】
【氏名】サヴヨン、 ガーヤ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065BC01
4B065CA41
(57)【要約】
本明細書に提供されるのは、成熟筋前駆細胞および／または成熟筋細胞を含む人工培養体節、それを得る方法、および成熟筋細胞を含む培養肉を迅速かつ大規模に生産する方法である。
【選択図】図２Ａ
【選択図】図２Ａ
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）胚性幹細胞を培地に懸濁して、球状の凝集体を得るステップと、（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックスまたはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む凝集体を得るステップと、を含む、体節を生成する方法。
【請求項2】
前記ステップ（ａ）の培地に、インスリン、ノックアウト血清代替物、トランスフェリン－セレン、およびＢＭＰ４のうちの１つ以上を添加することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記Ｗｎｔ活性化剤は、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ｗｎｔ３ａ、およびＲｓｐｏ３からなる群から選択される、請求項１～２のいずれかに記載の方法。
【請求項4】
前記少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加することは、前記球状の凝集体を得た後１２～３６時間以内に行われる、請求項１～３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
前記Ｗｎｔ活性化剤を除去することは、８～３６時間の範囲内に行われる、請求項１～４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の出現後に少なくとも１つのＮｏｄａｌ阻害剤を前記培地に添加することをさらに含む、請求項１～５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記細胞外マトリックスまたはその成分の量は、１～１５％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である、請求項１～６のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
前記ステップ（ｄ）においてＷｎｔ活性化剤とＢＭＰ阻害剤とからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を添加することをさらに含む、請求項１～７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
前記複数の体節を取得した後、前記細胞外マトリックスまたはその成分を除去することをさらに含む、請求項１～８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
（ａ）胚性幹細胞を培地中で繁殖させて球状の凝集体を得るステップと、（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックスまたはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む凝集体を得るステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）の前記培地に、１つ以上の成長因子を添加してその濃度が３０ｎｇ／ｍｌ未満となるようにし、それによって筋原性前駆体を得るステップと、を含む、筋原性前駆体を生成する方法。
【請求項11】
前記１つ以上の成長因子としては、ＨＧＦ、ＩＧＦ、およびＦＧＦ２がある、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ステップ（ａ）は懸濁状態で行われる、請求項１０～１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
前記ステップ（ｄ）の前記培地に、ＢＭＰ阻害剤とＷｎｔ活性化剤とから選択される少なくとも１つの化合物を添加することをさらに含む、請求項１０～１２のいずれかに記載の方法。
【請求項14】
前記ステップ（ｄ）よりも前に、前記細胞外マトリックスまたはその成分を除去することをさらに含む、請求項１０～１３のいずれかに記載の方法。
【請求項15】
前記成長因子それぞれの濃度は、約１～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１０～１４のいずれかに記載の方法。
【請求項16】
前記１つ以上の成長因子はＩＧＦであり、前記ＩＧＦの濃度は、１～５ｎｇ／ｍｌの範囲内である、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記筋原性前駆体は筋芽細胞および筋細胞を含む、請求項１０～１６のいずれかに記載の方法。
【請求項18】
前記ステップ（ａ）の培地に、インスリン、ノックアウト血清代替物、トランスフェリン－セレン、およびＢＭＰ４のうちの１つ以上を添加することをさらに含む、請求項１０～１７のいずれかに記載の方法。
【請求項19】
前記Ｗｎｔ活性化剤は、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ｒｓｐｏ３、およびＷｎｔ３ａからなる群から選択される、請求項１０～１８のいずれかに記載の方法。
【請求項20】
前記少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加することは、前記球状の凝集体を得た後１２～３６時間以内に行われる、請求項１０～１９のいずれかに記載の方法。
【請求項21】
前記Ｗｎｔ活性化剤を除去することは、８～３６時間の範囲内に行われる、請求項１０～２０のいずれかに記載の方法。
【請求項22】
前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の出現後に少なくとも１つのＮｏｄａｌ阻害剤を前記培地に添加することをさらに含む、請求項１０～２１のいずれかに記載の方法。
【請求項23】
前記細胞外マトリックスまたはその成分の量は、１～１５％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である、請求項１０～２２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本明細書に提供されるのは、成熟筋前駆細胞および／または成熟筋細胞を含む人工培養体節、それを得る方法、および成熟筋細胞を含む培養肉を迅速かつ大規模に生産する方法である。
【背景技術】
【0002】
食肉産業は環境と気候の悪化の主な原因のひとつである。世界人口の成長と需要の増加により、食肉消費量は１９９９年から２０５０年の間に倍増すると予想されている。この産業はまた、抗生物質耐性や人獣共通感染症の発症にも大きく関係している。完全な植物ベースの食事は、環境への影響を軽減するための良い選択肢と考えられうるが、肉がまだ手に入る間は、そのような食事に世界の人口のほとんどが自発的に適応することはないだろうと考えられる多くの理由がある。培養肉は、細胞培養を用いて体外で生産され、安価で倫理的、かつ環境に優しい食肉の代替生産方法を提供するものである。しかし同時に、特徴的な味、食感、栄養価を有し、さらには動物由来の製品と同じ生物学的起源を保っている。骨格筋がほとんどの動物の肉において使用される主要な食用組織であるため、培養食肉を効率的に生産するためには、体外で大量の骨格筋を生成する必要がある。
【0003】
Ｓｃｈｍｉｄｔら（Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，７６：２５５９－２５７０，２０１９）は、骨格筋の幹細胞である衛星細胞からの骨格筋再生を開示している。
【0004】
Ｓｕｚｕｋｉら（Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ，９６：７０－８１，２０１７）は、１００ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ－２および１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦを追加した培地中で、６週間を超える長い分化期間を通して自由浮遊球状培養を用いて、ヒト多能性細胞から直接（遺伝子組換えなしに）筋原性前駆体を誘導するプロトコルを開示している。
【0005】
Ｎａｃｈｍａｎら（ｂｉｏＲｘｉｖ，７２８６４２，２０１９）は、中胚葉前駆細胞集団の中から発生する胚体内胚葉細胞を支配する基本的な規則には、Ｅ－カドヘリンのアップレギュレーションに先行するＳｏｘ１７＋細胞の自己選別が関与しており、高発現Ｂｒａ細胞の少数の亜集団は外部からのＷｎｔシグナルとは無関係にＳｏｘ１７＋の生死に関与することを開示している。
【0006】
体外筋細胞を、好ましくは組織構造内で生産するための効率的で、迅速で、費用対効果の高いプロセスが求められているが、このニーズは満たされていない。
【発明の概要】
【0007】
本明細書では、体節、筋原性前駆体、筋細胞および筋組織を培養下で生成するための、発生経路に基づいた無血清でゲノム改変の無いプロトコルが提供される。このプロトコルには、胚性幹細胞から始まる三次元浮遊細胞培養内での筋分化誘導が含まれる。さらに、筋細胞を含む培養体節および体節様構造が提供される。
【0008】
有利なことに、培養肉製品の調製のための本明細書に開示されたプロトコルは、マイクロスケールでの胚の三次元発生システムの自己組織化特性を、バイオテクノロジー的解決策と組み合わせたものであり、肉製品の大量生産およびオルガノイド培養内での筋組織の成熟に非常に適している。このプロトコルは、既存の確立された筋分化プロトコルと、食品生産のスケールアップおよび安全性要件との間の大きな解離を解消する。
【0009】
驚くべきことに、本明細書に開示されたプロトコルは、胚において椎骨および骨格筋を生じさせる密閉構造である体節および体節様構造を生成する。体節の生成には大きな利点がある。第一に、体節の生成は、本明細書に開示されたプロトコル（方法／プロセス）が、三次元懸濁オルガノイドフォーマットにおいて、多能性（ＥＳ）細胞から完全に分化した骨格筋細胞までの胚発生中に細胞が経る発生段階をよく模倣していることを示す。その結果、本明細書で生産される培養組織は、「本物の」肉の特徴をすべて含んでいる。すなわち、主に筋組織でできているが、家畜から生産される肉の構造と味に貢献する脂肪細胞、結合組織、血液も含んでいる。第二に、生産プロセスにおいて体節が存在することで、オルガノイド内シグナル伝達が行われ、外部からの追加とは無関係に必要な分化が促進される。したがって、培地に追加するために使用される成長因子の量はわずかである（例えば、約１０ｎｇ／ｍｌのオーダー）。したがって、本明細書に開示されたプロトコルは、（培養組織の生産において通常大きな出費となる）高価な成長因子を大量に必要としないため、費用対効果が高い。
【0010】
意外なことに、本明細書に開示されたプロトコルを多能性細胞に適用すると、約２０ｎｇ／ｍｌ以下のＦＧＦ－２およびＥＧＦ成長因子を用いて、例えばわずか２週間という短期間で筋原性前駆体が産生される。
【0011】
さらに、体節形成や筋肉形成を含む発生過程は脊椎動物の間で高度に保存されているため、胚発生ガイドラインに従った本明細書に開示されたプロトコルは、あらゆる家畜種の前駆細胞から培養肉を生産するために首尾よく実施することができる。
【0012】
最後に、本プロトコルは幹細胞から開始し、筋原性前駆体を取得するまで、懸濁状態での分化（例えば、大規模バイオリアクターや従来のステアラーでも）を可能にする。
【0013】
いくつかの実施形態によれば、上記の観点から、本明細書に開示されたプロトコルは、迅速で、費用対効果が高く、再現性があり、大規模バイオリアクターに適しており、しかも家畜肉の特徴を含む培養肉を生産することができ、培養筋原性前駆体および培養肉の工業的製造に非常に適している。
【0014】
開示されたプロトコルは一連のステップで構成され、各ステップは、中胚葉、前体節中胚葉、筋原性前駆体、成熟筋細胞など、関連する発生段階の筋原性系統が感知する生体内のシグナル伝達環境を効率的に模倣しようとするものである。プロトコルの第１のステップは、懸濁状態での凝集体の分化に続いて、第一培地下でｍＥＳ細胞を凝集させることを含み、前記培地は、以下でさらに詳述かつ例示するように、いくつかの連続するステップの間で変更してもよい。
【0015】
いくつかの実施形態によれば、体節を生成する方法が提供され、前記方法は、
（ａ）胚性幹細胞を培地に懸濁して、実質的に球状である凝集体を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックスまたはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む凝集体を得るステップと、を含む。
（ａ）胚性幹細胞を培地に懸濁して、実質的に球状である凝集体を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックスまたはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む凝集体を得るステップと、を含む。
【0016】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記ステップ（ａ）の培地に、インスリン、ノックアウト血清代替物、トランスフェリン－セレン、およびＢＭＰ４のうちの１つ以上を添加することをさらに含む。
【0017】
いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤は、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ｗｎｔ３ａ、およびＲｓｐｏ３からなる群から選択される。
【0018】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地へ添加することは、前記実質的に球状である凝集体を得た後１２～３６時間以内に行われる。
【0019】
いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤を除去することは、前記Ｗｎｔ活性化剤の添加後８～３６時間以内に行われる。いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤を除去することは、前記Ｗｎｔ活性化剤の添加後１２～３６時間以内に行われる。
【0020】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の出現後に少なくとも１つのＮｏｄａｌ阻害剤を前記培地に添加することをさらに含んでもよい。
【0021】
いくつかの実施形態によれば、前記細胞外マトリックスまたはその成分の量は、約１～１５％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。
【0022】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記ステップ（ｄ）においてＷｎｔ活性化剤とＢＭＰ阻害剤とからなる群から選択される少なくとも１つの化合物を添加することをさらに含んでもよい。
【0023】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記複数の体節を取得した後、前記細胞外マトリックスまたはその成分を除去することをさらに含んでもよい。
【0024】
いくつかの実施形態によれば、筋原性前駆体を生成する方法が提供され、前記方法は、
（ａ）胚性幹細胞を培地中で繁殖させて球状の凝集体を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックスまたはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む凝集体を得るステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）の前記培地に、１つ以上の成長因子を添加してその濃度が３０ｎｇ／ｍｌ未満となるようにし、それによって筋原性前駆体を得るステップと、を含む。
（ａ）胚性幹細胞を培地中で繁殖させて球状の凝集体を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックスまたはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む凝集体を得るステップと、
（ｆ）前記ステップ（ｅ）の前記培地に、１つ以上の成長因子を添加してその濃度が３０ｎｇ／ｍｌ未満となるようにし、それによって筋原性前駆体を得るステップと、を含む。
【0025】
いくつかの実施形態によれば、前記１つ以上の成長因子としては、ＨＧＦ、ＩＧＦ、およびＦＧＦ２があってもよい。
【0026】
いくつかの実施形態によれば、前記ステップ（ａ）は懸濁状態で行われてもよい。
【0027】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記ステップ（ｄ）の培地に、ＢＭＰ阻害剤およびＷｎｔ活性化剤から選択される少なくとも１つの化合物を添加することをさらに含み得る。いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤は、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ｒｓｐｏ３、およびＷｎｔ３ａからなる群から選択される。
【0028】
いくつかの実施形態によれば、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地へ添加することは、前記球状の凝集体を得た後１２～３６時間以内に行われる。
【0029】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記ステップ（ｅ）の前に、前記細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはその成分を除去することをさらに含んでもよい。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記ステップ（ｆ）の前に、前記細胞外マトリックスまたはその成分を除去することをさらに含んでもよい。
【0030】
いくつかの実施形態によれば、前記成長因子それぞれの濃度は、約１～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
【0031】
いくつかの実施形態によれば、前記１つ以上の成長因子はＩＧＦであり、前記ＩＧＦの濃度は、約１～５ｎｇ／ｍｌの範囲内である。
【0032】
いくつかの実施形態によれば、前記筋原性前駆体は筋芽細胞および筋細胞を含む。
【0033】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記ステップ（ａ）の培地へ、インスリン、ノックアウト血清代替物、トランスフェリン－セレン、およびＢＭＰ４のうちの１つ以上を添加することをさらに含んでもよい。
【0034】
いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤を除去することは、約８～３６時間内に行われてもよい。いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤を除去することは、前記Ｗｎｔ活性化剤の添加後約１２～３６時間以内に行われてもよい。
【0035】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の出現後に少なくとも１つのＮｏｄａｌ阻害剤を前記培地に添加することをさらに含んでもよい。
【0036】
いくつかの実施形態によれば、前記細胞外マトリックスまたはその成分の量は、約１～１５％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内であってもよい。
【0037】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示された方法によって調製された、成熟筋前駆細胞および／または成熟筋細胞を含む培養体節が提供される。
【0038】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明、実施例および図面から明らかになるであろう。
【0039】
本開示の特定の実施形態は、上記の利点の一部またはすべて、一部を含むか、あるいは全く含まないことがある。１つ以上の他の技術的利点は、本明細書に含まれる図、説明、および特許請求の範囲から当業者には容易に明らかとなるであろう。さらに、特定の利点を上に列挙したが、様々な実施形態は、列挙した利点のすべて、一部を含むか、あるいは全く含まないことがある。
【図面の簡単な説明】
【0040】
本開示のいくつかの実施形態は、添付の図面を参照して本明細書で説明される。この説明は、図とともに、いくつかの実施形態がどのように実施され得るかを当業者に明らかにする。図は例示的説明のためのものであり、本開示の基本的理解に必要な以上に詳細に実施形態の構造的詳細を示そうとするものではない。分かりやすくするため、図に描かれている物体の一部は縮尺どおりではない。
図は以下のとおりである。
図は以下のとおりである。
【0041】
図１Ａは、開示されたプロトコルのステップ２の後に、プレートに播種したＥＳＣ細胞から得られた、中胚葉細胞（ブラキウリ陽性細胞（Ｂｒａ－ＧＦＰ）、上のパネル）および内胚葉細胞（Ｓｏｘ１７陽性細胞（Ｓｏｘ－ＲＦＰ）、中央のパネル）を含む凝集体を示す。
【0042】
図１Ｂは、開示されたプロトコルのステップ２の後に、懸濁状態でＥＳＣ細胞から得られた、中胚葉細胞（ブラキウリ陽性細胞、細い矢印）および内胚葉細胞（Ｓｏｘ１７陽性細胞、太い白い矢印）を含む凝集体を示す。
【0043】
図２Ａは、開示されたプロトコルのステップ３の間に形成されたマウス三次元オルガノイドにおける後部前体節中胚葉（ｐＰＳＭ）の時空間パターンを表す。前記オルガノイドはＭｓｇｎ１－ＹＦＰ ｍＥＳ細胞から凝集され、懸濁状態で６日間培養される。スケールバーは１００μｍ。
【0044】
図２Ｂは、開示されたプロトコルのステップ３の間に形成された２０個のオルガノイドについて測定した、絶対オルガノイド長（左パネル）および正規化オルガノイド長（右パネル）に対して、蛍光レベルをプロットしたものである。Ｍｓｇｎ１－ＹＦＰはｐＰＳＭを標識する。
【0045】
図２Ｃは２つのクラスターからなる細長いオルガノイドを表す。Ｍｓｇｎ１＋細胞が移動して２つのクラスターを形成している。
【0046】
図２Ｄは３つのクラスターからなるオルガノイドを表す。Ｍｓｇｎ１＋細胞が移動して、３つのクラスターを形成し、それらはすべて前記オルガノイドの中心から伸びている。
【0047】
図２Ｅは、オルガノイドあたりのＭｓｇｎ１＋クラスター数のヒストグラムを表す。
【0048】
図３Ａは、ステップ３で形成された５日目のオルガノイドを固定し、ブラキウリを免疫染色したもの（左／後極に位置し、灰色の矢印で示す）を表し、Ｍｓｇｎ１－ＹＦＰはｐＰＳＭを標識する（明るい領域、破線の矢印で示す）。
【0049】
【0050】
図３Ｃは、ｍＥＳＣ由来オルガノイドのＰＳＭへの分化の４日目（黒の列）と６日目（グレーの列）における、ｐＰＳＭ関連遺伝子のデルタＣＴ平均値を表す。
【0051】
図３Ｄは、分化６日目の、Ｐａｘ３（右パネル）について免疫染色されたＭｓｇｎ１－ＹＦＰ ｍＥＳＣオルガノイド（中央パネル）の例示的な画像を表す。スケールバーは１００μｍである。
【0052】
図３Ｅは、分化６日目の、Ｎ－カドヘリン（Ｃｄｈ２、右パネル）について免疫染色されたＭｓｇｎ１－ＹＦＰ ｍＥＳＣオルガノイド（中央パネル）の例示的な画像を表す。スケールバーは１００μｍである。
【0053】
【0054】
図５Ａ～図５Ｃは、ステップ４の最後に得られた細長い凝集体の画像で、体節マーカー（Ｐａｘ３）で染色し、２つのｚ切片（左、中央）と明視野（右）で画像化したものである。体節には番号を付している。太い白い矢印はＳｏｘ１７－ＲＦＰ陽性領域を指し、内胚葉を示す。スケールバーは１００μｍ。
【0055】
図５Ｄは、ステップ４の最後に得られた細長い凝集体の画像を表し、ブラキウリＧＦＰとＳｏｘ１７－ＲＦＰの陽性領域があり、それぞれ中胚葉と内胚葉を標識している。体節は、前部領域の円形構造を指す小さな白い矢印によって示される。スケールバーは１００μｍである。
【0056】
図６Ａは、ステップ５の最後に得られた凝集体の画像を表しており、前記凝集体は、筋原性前駆体マーカーで染色されている。Ｐａｘ７（凝集体の上半分の明るい領域）と、Ｓｏｘ１７－ＲＦＰ陽性内胚葉領域（左下、白い矢印でマーク）がある。スケールバーは１００μｍである。
【0057】
図６Ｂは、ステップ５の最後に得られた凝集体の画像を表しており、前記凝集体は、筋芽細胞マーカーＭｙｏＤで染色されている（明るい領域）。スケールバーは１００μｍである。
【0058】
図６Ｃは、ステップ５の最後に得られた凝集体の画像を表しており、前記凝集体は、筋細胞マーカーＭｙｏＧで染色されている（明るい領域）。スケールバーは１００μｍである。
【0059】
図６Ｄは成熟した体節の画像を表し、黒い矢印は代表的な体節を指している。スケールバーは１００μｍである。
【発明を実施するための形態】
【0060】
本明細書の教示の原理、使用法および実装は、添付の説明および図を参照することでよりよく理解できるであろう。本明細書に記載された説明および図を熟読すれば、当業者であれば、過度の努力や実験をすることなく、本明細書の教示を実施することができるであろう。図中、同じ参照数字は全体を通して同じ部分を示す。図中、同じ参照数字は全体を通して同じ部分を示す。
【0061】
細胞ベースの食肉科学はここ数年で進化したが、大量の骨格筋組織を得ることは大きな課題である。そのためには、大規模に実現可能で効率的な増殖と筋分化のプロセスが必要である。懸濁培養法はスケールアップに最も期待できる方法であるが、現在は物理的なアンカーポイントが必要であるため、筋分化には障害となる。
【0062】
近年、細胞組成物を含む本来の臓器の様々な側面を模倣した、小さな臓器のような三次元構造体（オルガノイドと呼ばれる）の三次元懸濁培養が飛躍的に進歩している。オルガノイドシステムの多くは胚性幹細胞から始まり、開始から終了までの完全な分化プロセスを提供し、胚プロセスをある程度模倣し、動物から開始細胞集団を繰り返し採取する必要が無い。
【0063】
簡単に説明すると、培養肉の生産には主に２つのアプローチがある。（１）衛星細胞から開始する。培養衛星細胞の相対的な利点は、筋細胞への分化が比較的早く容易であることである。しかし、衛星細胞は有糸分裂後（終末分化後）の細胞であるため増殖せず、それらを開始細胞として使用することは大量生産には不向きである。（２）多能性細胞（胚性幹細胞）から開始する。多能性細胞を使用する利点は、その卓越した長期増殖能と、適切な条件に曝されると分化に向かう能力である。しかし、これらの細胞が成熟筋細胞に分化する過程には非常に長い時間がかかる（１ヵ月を超える期間、通常６週間を超える期間）。
【0064】
主要な課題は、大量の筋細胞を効率的に成長させることであり、好ましくは、筋組織（約９０％）を主成分とし、脂肪細胞、血液、結合組織の組み合わせをさらに含む、肉製品の内容に類似した培養肉という組織内で増殖させることである。現在の解決策は主に、成体の前駆細胞（衛星細胞など）を出発点とし、単一細胞タイプの分化プロトコルに依存しているため、増殖能力と完全な組織構造への類似性の両方に限界がある。したがって、大規模に実現可能で効率的な増殖と筋分化のプロセスが求められている。
【0065】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されたプロトコルを利用することで、主にこのプロトコルが体細胞を産生するため、肉製品の様々な成分を含む培養肉を生産することができる。
【0066】
本明細書で使用される「プロトコル」という用語は、体節および三次元食用オルガノイドを取得するためのプロトコルの文脈において、「方法」または「プロセス」という用語と交換可能である。
【0067】
現在までに知られている筋分化プロトコルは、二次元接着培養に基づいているか、効率がよくないかのどちらかである。多くのプロトコルは、特定の重要遺伝子を活性化するために、血清および／または遺伝子改変を用いる。開始細胞の種類として部分的に分化した細胞（衛星細胞など）を使用するものもあり、これらの開始細胞の増殖速度と能力に制限がかかる場合がある。本明細書に開示されたプロトコルは、シグナル伝達のみの分化プロトコルと懸濁３Ｄ培養システム（ＥＳ細胞から開始）とを組み合わせており、その結果、大規模に実現可能であり、血清および他の動物由来因子を含まない効率的な筋分化法が得られる。多能性幹細胞を使用することで、動物から開始細胞集団を繰り返し採取する必要がなくなる。
【0068】
いくつかの実施形態によれば、体節を生成する方法が提供され、前記方法は、
（ａ）胚性幹細胞を培地に懸濁して、実質的にまたは十分に球状である凝集体を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む／有する凝集体を得るステップと、を含む。
（ａ）胚性幹細胞を培地に懸濁して、実質的にまたは十分に球状である凝集体を得るステップと、
（ｂ）少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤を前記培地に添加して、中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む凝集体を得るステップと、
（ｃ）前記Ｗｎｔ活性化剤を除去するステップと、
（ｄ）前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の形態を観察し、前記凝集体が卵様の形態を有する場合には、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはその成分を添加して、傍軸中胚葉を含む凝集体を得るステップと、
（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それによって複数の体節を含む／有する凝集体を得るステップと、を含む。
【0069】
いくつかの実施形態によれば、本明細書で用いる「繁殖」および「懸濁」という用語は、多能性細胞の増殖および多能性を維持するのに適した条件下で、二次元培養で、または懸濁状態で（三次元）培養することをいう。細胞増殖は一般に、凝集体のサイズを増加させてより大きな凝集体を形成するが、この凝集体を常に機械的または酵素的に小さな凝集体に解離させることで、細胞増殖を培養内に維持し、細胞数を増加させることができる。通常、維持培養で凝集体の中で培養された細胞は、多能性のマーカーを維持している。多能性は、細胞の多能性特性を評価することで、部分的に決定することができる。多能性の特徴には、（ｉ）多能性幹細胞の形態、（ｉｉ）無制限に自己再生する可能性、（ｉｉｉ）多能性幹細胞マーカーの発現であって、多能性幹細胞マーカーの例としては、ＳＳＥＡ１（マウスのみ）、ＳＳＥＡ３／４、ＳＳＥＡ５、ＴＲＡ１－６０／８１、ＴＲＡ１－８５、ＴＲＡ２－５４、ＧＣＴＭ－２、ＴＧ３４３、ＴＧ３０、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ１３３／プロミン、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ５６、ＣＤ７３、ＣＤ９０、ＣＤ１０５、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＣＤ３０、および／またはＣＤ５０があるが、これらに限定されるわけではない、（ｉｖ）３つすべての体細胞系統（外胚葉、中胚葉、内胚葉）に分化する能力、（ｖ）前記３つの体細胞系統からなる奇形腫の形成、および（ｖｉ）前記３つの体細胞系統からの細胞からなる胚様体の形成、が含まれるが、これらに限定されるわけではない。前記多能性幹細胞の凝集体は、分化を誘導するためにさらなる分化の合図を必要とする。
【0070】
いくつかの実施形態によれば、前記方法のステップ（ａ）の終わりに、複数の球状凝集体が得られる。いくつかの実施形態によれば、前記ステップ（ａ）の最後に得られる複数の球状凝集体は、少なくとも５０個の球状凝集体、少なくとも１００個の球状凝集体、少なくとも１５０個の球状凝集体、少なくとも２００個の球状凝集体、少なくとも２５０個の球状凝集体、少なくとも３００個の球状凝集体、約３００個の球状凝集体を含む。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0071】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所定の（記載された）値の近傍（およびそれを含む）の値の連続した範囲内の数量またはパラメータ（たとえば、量、パーセンテージ、長さ）の値を指定するために使用される場合がある。いくつかの実施形態によれば、「約」は、パラメータの値が所定の値の８０％と１２０％との間であることを指定してもよい。いくつかの実施形態によれば、「約」は、パラメータの値が所定の値の９０％と１１０％との間であることを指定してもよい。いくつかの実施形態によれば、「約」は、パラメータの値が所定の値の９５％と１０５％との間であることを指定してもよい。
【0072】
本明細書で使用される「多能性幹細胞」、「胚性幹細胞」およびＥＳＣという用語は交換可能である。
【0073】
いくつかの実施形態によれば、胚性幹細胞は家畜に由来する。いくつかの実施形態によれば、胚性幹細胞は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、魚、ブタおよび家禽からなる群から選択される動物に由来する。
【0074】
本明細書で使用される胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、遺伝子操作を受けていないことが理解されよう。
【0075】
多能性幹細胞の形態は、胚性幹細胞の古典的な形態学的特徴を有する。正常な胚性幹細胞の形態は、円形（球形）で小さいこと、細胞質に対する核の比率が高いこと、核小体が顕著に存在すること、典型的な細胞間の間隔があることが特徴である。対照的に、本明細書に開示される方法のステップ（ｂ）によって得られる中胚葉細胞および内胚葉細胞を含む凝集体は、以下に示すように、例えば、図２Ａ、４．５日目に示すように、卵様の形態を有する。
【0076】
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ａ）は培養プレート（たとえば、シャーレおよび／またはマルチウェルプレート）上で行われる。このように、いくつかの実施形態によれば、胚性幹細胞は、培養プレート内で接着性細胞培養物を形成する。いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ステップ（ａ）の前記培地に、インスリン、トランスフェリン－セレン、ノックアウト血清代替物、およびＢＭＰ４のうちの１つ以上を添加することをさらに含んでもよい。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0077】
前記オルガノイド／凝集体内のＰＳＭ細胞の画分を増加させるために、ステップ（ａ）の前記培地に、インスリン、トランスフェリン－セレン、ノックアウト血清代替物、およびＢＭＰ４のうちの１つ以上を添加するステップを行う。したがって、ステップ（ａ）の前記培地にインスリン、トランスフェリン－セレン、ノックアウト血清代替物、および／またはＢＭＰ４を追加すると、本明細書に開示されたプロトコルの品質が向上する。
【0078】
いくつかの実施形態によれば、インスリンを培地に添加してもよい。いくつかの実施形態によれば、前記培地に添加されるインスリンの濃度は、５～１５μｌ／ｍｌ、５～１３μｌ／ｍｌ、７～１３μｌ／ｍｌ、７～１２μｌ／ｍｌ、５～１２μｌ／ｍｌの範囲内、約７μｌ／ｍｌ、または約１０μｌ／ｍｌである。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0079】
いくつかの実施形態によれば、トランスフェリン－セレンを培地に添加してもよい。いくつかの実施形態によれば、培地に添加されるトランスフェリン－セレンの濃度は、０．１％～５％、０．２％～４％、０．２％～３％、０．５％～３％、０．５％～２％、０．８％～３％、０．８％～２％の範囲内、約２％、約１．５％、または約１％である。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0080】
いくつかの実施形態によれば、ＢＭＰ４を培地に添加してもよい。いくつかの実施形態によれば、前記培地に添加されるＢＭＰ４の濃度は、５～１５μｌ／ｍｌ、５～１３μｌ／ｍｌ、７～１３μｌ／ｍｌ、７～１２μｌ／ｍｌ、５～１２μｌ／ｍｌの範囲内、約７μｌ／ｍｌ、または約１０μｌ／ｍｌである。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0081】
いくつかの実施形態によれば、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を培地に添加してもよい。
【0082】
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ａ）はＮ２Ｂ２７培地で行われてもよい。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ａ）は、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、インスリン、およびＢＭＰ４のうちの少なくとも１つを追加した培地で行われてもよい。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ａ）は低濃度のインスリンを追加した培地で行われてもよい。いくつかの実施形態によれば、前記低濃度のインスリンは、約１～２５μｇ／ｍｌのインスリン、約１～２０μｇ／ｍｌのインスリン、約１～１５μｇ／ｍｌのインスリン、約５～２５μｇ／ｍｌのインスリン、または約５～２０μｇ／ｍｌのインスリンの範囲内である。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0083】
いくつかの実施形態によれば、前記細胞は、前記プレートを回転させることによって懸濁状態に維持される。
【0084】
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｂ）で添加されるＷｎｔ活性化剤は、Ｃｈｉｒ９９０２１、Ｒｓｐｏ３、およびＷｎｔ３ａからなる群から選択される。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0085】
いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｂ）において添加されるＷｎｔ活性化剤の濃度は、約０．５～１０μＭ、０．５～７μＭ、０．７～１０μＭ、０．７～７μＭ、１～７μＭ、または１～５μＭの範囲内である。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0086】
いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤は、培養物中で複数の凝集体が形成されてから約２４時間後にステップ（ｂ）で添加される。いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤は、懸濁状態で複数の凝集体が形成されてから約２４時間後にステップ（ｂ）で添加される。
【0087】
いくつかの実施形態によれば、前記Ｗｎｔ活性化剤は、前記培地に添加されてから約１日以内、添加されてから８～３６時間以内、添加されてから１２～３６時間以内、添加されてから１８～３０時間以内、添加されてから約２４時間以内に培地から除去される。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。いくつかの実施形態では、前記Ｗｎｔ活性化剤の除去は、前記培地を、前記Ｗｎｔ活性化剤を欠く同様の培地で置き換えることによって達成してもよい。
【0088】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、前記中胚葉細胞と内胚葉細胞とを含む前記凝集体の出現後に少なくとも１つのＮｏｄａｌ阻害剤を前記培地に添加することをさらに含んでもよい。前記培地に少なくとも１つのＮｏｄａｌ阻害剤を追加することは、胚体内胚葉などの非体細胞集団の拡大を抑制するのに役立つ。
【0089】
いくつかの実施形態によれば、前記阻害剤は、ＳＢ－４３１５４２およびＳＢ－５０５１２４からなる群から選択される。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｂ）で添加されるＮｏｄａｌ阻害剤の濃度は、２００ｎＭ、５０～７００ｎＭ、５～１５μＭ、５～１２μＭ、７～１５μＭ、７～１２μＭの範囲内であるか、約７μＭ、または約１０μＭである。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0090】
いくつかの実施形態によれば、足場マトリックス（細胞外マトリックス）、またはその成分は、前記懸濁液中の凝集体に組み込まれる。いくつかの実施形態によれば、前記培地は、低濃度、具体的には、約２０％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満、１５％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満、１０％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満、８％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満、５％ｖｏｌ／ｖｏｌ未満の、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）またはその成分を含む。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約１～１５％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約１～１２％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約２～１２％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約３～１３％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約２～１２％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約３～１１％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約３～１０％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約４～１０％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、前記培地中のＥＣＭの量は、約５～１０％ｖｏｌ／ｖｏｌの範囲内である。
【0091】
いくつかの実施形態によれば、前記ＥＣＭはＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含む。いくつかの実施形態によれば、前記培地は前記ＥＣＭの成分を含む。いくつかの実施形態によれば、前記ＥＣＭの成分としては、フィブロネクチン、コラーゲン、およびラミニンがあるが、これらに限定されるわけではない。
【0092】
いくつかの実施形態によれば、前記ＥＣＭまたはその成分の添加は、卵様の形態を有する凝集体を観察した後に行われる。したがって、前記プロトコルは、前記ＥＣＭまたはその成分を添加するためのランダム／一定のタイミングに基づいていない。適切なタイミングはバッチごとに変化することが判明しており、驚くべきことに、前記凝集体の観察に基づいてＥＣＭまたはその成分を追加するのが最善だからである。理想的なタイミングは、凝集体が卵様の形態を呈するときである。
【0093】
ＥＣＭまたはその成分を添加すると、傍軸中胚葉細胞が形成される。いくつかの実施形態によれば、前記ＥＣＭまたはその成分は、凝集体内での傍軸中胚葉細胞の形成後に培地から除去される。培地からのＥＣＭまたはその成分の除去は、開示されたプロトコルにさらなる利点をもたらす。その利点とは、前記所望の結果を損なうことなく、プロトコル全体の総コストを削減することである。
【0094】
いくつかの実施形態によれば、培地中に前記ＥＣＭまたはその成分を維持する選択肢もある。
【0095】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ステップ（ｄ）において少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤および／または少なくとも１つのＢＭＰ阻害剤を培地に添加することをさらに含んでもよい。したがって、いくつかの実施形態によれば、前記方法は、ステップ（ｄ）における培地は、少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤および／または少なくとも１つのＢＭＰ阻害剤をさらに含んでもよい。ステップ（ｄ）の培地、すなわち前記ＥＣＭまたはその成分を含む培地に、Ｗｎｔ活性化剤および／またはＢＭＰ阻害剤を追加することは、体節形成の収率を向上させることができるため有益である。さらに、この段階でＷｎｔ活性化剤（単数または複数）および／またはＢＭＰ阻害剤（単数または複数）を前記培地に添加すると、前記培地の全体的な粘度が低下し、それによって混合懸濁液条件での成長が促進され、これは工業規模のバイオリアクターに特に適している。
【0096】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのＷｎｔ活性化剤は、Ｃｈｉｒ９９２０１およびＲｓｐｏ３から選択される。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0097】
いくつかの実施形態によれば、前記少なくとも１つのＢＭＰ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９およびＮｏｇｇｉｎから選択される。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0098】
いくつかの実施形態によれば、複数のオルガノイドが、分化プロセスの最後に足場マトリックスに埋め込まれる。
【0099】
本明細書で使用される「凝集体」、「三次元オルガノイド」および「オルガノイド」という用語は互換可能である。
【0100】
いくつかの実施形態によれば、筋原性前駆体を生成するための方法が提供され、前記方法は、体節を取得するための上記のステップを含み、（ｅ）前記ステップ（ｄ）の凝集体を１０～４８時間インキュベートし、それにより、複数の体節を含む凝集体を得るステップと、（ｆ）１つ以上の成長因子を添加してその濃度が約３０ｎｇ／ｍｌ未満となるようにし、それによって筋原性前駆体を得るステップとをさらに含む。
【0101】
いくつかの実施形態によれば、前記１つ以上の成長因子には、ＨＧＦ、ＩＧＦ、およびＦＧＦ２などがあるが、これらに限定されず、前記１つ以上の成長因子の濃度は、約１～２５ｎｇ／ｍｌの範囲内である。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）の培地には、ＢＭＰ阻害剤およびＷｎｔ活性化剤から選択される少なくとも１つの化合物がさらに追加される。
【0102】
いくつかの実施形態によれば、前記１つ以上の成長因子にはＨＧＦが含まれてもよい。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）の培地に添加されるＨＧＦの濃度は、５～１５μｌ／ｍｌ、５～１３μｌ／ｍｌ、７～１３μｌ／ｍｌ、７～１２μｌ／ｍｌ、５～１２μｌ／ｍｌの範囲内、約７μｌ／ｍｌ、または約１０μｌ／ｍｌである。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0103】
いくつかの実施形態によれば、前記１つ以上の成長因子にはＩＧＦが含まれてもよい。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）の培地に添加されるＩＧＦの濃度は、約０．５～５μｌ／ｍｌ、０．５～３μｌ／ｍｌ、０．７～３μｌ／ｍｌ、０．７～２．５μｌ／ｍｌ、１～２．５μｌ／ｍｌの範囲内、約２．５μｌ／ｍｌ、または約２μｌ／ｍｌである。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0104】
いくつかの実施形態によれば、前記１つ以上の成長因子にはＦＧＦ２が含まれてもよい。いくつかの実施形態によれば、ステップ（ｆ）の培地に添加されるＦＧＦ２の濃度は、約１０～２５μｌ／ｍｌ、１２～２５μｌ／ｍｌ、１２～２３μｌ／ｍｌ、１５～２５μｌ／ｍｌ、１５～２３μｌ／ｍｌの範囲内、約２５μｌ／ｍｌ、または約２０μｌ／ｍｌである。可能な各構成は、別個の実施形態を代表する。
【0105】
いくつかの実施形態によれば、前記得られた筋原性前駆体は筋芽細胞、筋細胞、および衛星細胞を含む。
【0106】
筋細胞の成熟は、（半）硬質表面への細胞の固定に依存することが実証されており、骨構造への固定を模倣しているようである。したがって、本明細書に開示された方法は、筋細胞の成熟のアンカーポイントを生成することを目的として、後期段階のオルガノイドを食用マトリックスに埋め込むステップをさらに含んでもよい。任意のマトリックスとしては、菌糸体、アルギン酸塩、およびセルロース（例えば、脱細胞化リンゴ由来）などがあるが、これらに限定されるわけではない。
【0107】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、懸濁された三次元オルガノイドにおける分化をモニタリングすることをさらに含む。
【0108】
いくつかの実施形態によれば、前記モニタリングは、高スループット二光子３Ｄイメージング、ＧＦＰタグ付き発生マーカー（Ｍｓｇｎ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７など）を用いたライブイメージング、および、マーカータンパク質に対する免疫染色からなる群から選択される少なくとも１つの技術を使用して行われてもよい。
【0109】
また、オルガノイド内の筋系細胞の画分に関して効率のボトルネックを特定する目的で、プロセスのさまざまな段階における細胞組成物をモニターするために、イメージングが使用される。
【0110】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、異なる時点における三次元オルガノイド内の細胞集団を特徴付けることをさらに含んでもよい。
【0111】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、異なる時点における三次元オルガノイド内の細胞集団の空間的構成を特徴付けることをさらに含んでもよい。
【0112】
いくつかの実施形態によれば、三次元オルガノイドにおける細胞集団を特徴付けることは、様々な方法によって実行されてもよく、前記方法の例としてはＲＴ－ＰＣＲおよびＦＩＳＨがあるが、これらに限定されるわけではない。
【0113】
いくつかの実施形態によれば、前記方法は、三次元オルガノイドの栄養プロファイリングをさらに含んでもよい。栄養プロファイリングには、ＧＣ、ＨＰＬＣ、コールドＥＩを用いたＧＣ－ＭＳなど、さまざまなアプローチが適用できる。
【0114】
いくつかの実施形態によれば、三次元オルガノイドは、ハンギングドロップ、回転懸濁、自由懸濁、パターン化マイクロウェル、およびハイスループット９６ウェルからなる群から選択される形式である。
【0115】
いくつかの実施形態によれば、本明細書に開示されたプロトコルによって得られる、成熟筋前駆細胞または成熟筋細胞を含む培養体節および培養組織が提供される。
【0116】
本出願の明細書および特許請求の範囲において、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「有する（ｈａｖｅ）」という語およびその形は、その語が関連付けられ得るリストのメンバーに限定されない
【0117】
当業者であれば、本発明が、その目的を実行し、言及された目的および利点、ならびに本発明に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書で提供される例は、好ましい実施形態を代表するものであり、例示的なものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【0118】
実施例１ 体節および筋原性前駆体の生成のためのプロトコル
【0119】
本明細書で開示された３Ｄ分化モデルは、業界レベルのスケールアッププロセスおよび他の食用種への適応の基礎を形成する。本明細書に開示されるような完全懸濁、細胞クラスターベースのプロトコルは、サイズに制限のないバイオリアクターに組み込むことができる。さらに、前記プロトコルは血清を使用せず、遺伝子組換えを伴わないため、工業的処理に適したものになっている。
【0120】
以下のプロトコルにより、数日で筋原性前駆体が提供される。前記プロトコルは以下のステップを含む。
【0121】
ステップ１－ＥＳＣ凝集体の形成。ＥＳＣをＮ２Ｂ２７またはＮＤＩＦＦ培地に播種し（たとえば、ＵＬＡ ｕ－ボトムプレート、図１Ａ）、５０～３００個のＥＳＣの凝集球を得た。前記培地には、インスリン（例えば１０ｍｌ／ｍｌ）、トランスフェリン－セレン（例えば１％）、およびＢＭＰ４（例えば１０ｎｇ／ｍｌ）のうちの１つ以上を追加してもよい。また、ノックアウト血清代替物（ＫＳＲ）を１～５％、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を１０～３０μｇ／ｍｌ、低濃度インスリンを５～１５μｇ／ｍｌ、ＢＭＰ４を５～１５ｎｇ／ｍｌを追加したＮ２Ｂ２７培地中で、ＥＳＣを１０Ｋ～３０Ｋ細胞／ｍｌの密度で培養し、２０～３００個のＥＳＣの凝集球を得た（図１Ｂ）。好ましくは、例えば１００－３００ｒｐｍの速度でプレートを回転させることにより、細胞を懸濁状態に保つべきである。
【0122】
ステップ２－胚葉形成。このステップは、複数の凝集体が形成されてから約１日後、または直径５０～２００μｍの複数の浮遊細胞凝集球が各ウェルで生成された後に、行われた。ステップ２では、Ｗｎｔ活性化剤Ｃｈｉｒ９９０２１（１～５ｍＭ）またはＲｓｐｏ３（１０～３０ｎｇ／ｍｌ）またはＷｎｔ３ａ（５０～３００ｎｇ／ｍｌ）を培地に約１２～２４時間添加することによって、Ｗｎｔ経路を活性化した。その後、Ｗｎｔ活性化剤を含む培地を除去し、Ｗｎｔ活性化剤を含まない新しい培地と交換した。
【0123】
Ｗｎｔ活性化剤の添加により中胚葉系統への分化が促進され、その結果、図１Ａおよび図１Ｂに示されるように、当該ステップの終わりには中胚葉細胞（ブラキウリＧＦＰによるマーキングされる。例えば図１Ｂにおいて細い矢印が示す）と内胚葉細胞（Ｓｏｘ１７ ＲＦＰでマーキングされる。図１Ｂにおいて太い矢印が示す）が、凝集体中に見られた。ステップ２および胚葉形成の終わりに得られる凝集体の形態は、図１Ｂに見られるように、典型的には卵様の形態であることに留意されたい。
【0124】
ステップ３Ａ－傍軸中胚葉（ＰＳＭ、前体節中胚葉とも称される）の形成。ＰＳＭ細胞は、最初の中胚葉細胞（ブラキウリ陽性細胞）が出現してから１～２日以内に見られ、マーカーＭｅｓｏｇｅｎｉｎ１（Ｍｓｇｎ１）を使用して識別することができた（図２Ａ～２Ｅおよび図４Ａ～４Ｃ）。図２Ａに示すように、前記細胞は最初は凝集体内でランダムに広がり（図２Ａ、左パネル、４日目）、徐々に凝集体の１つの場所に集中する。
【0125】
最初のＰＳＭ細胞が出現してから１日から２日後、傍軸中胚葉の成熟と並行して、凝集体の形態は円形、球形から卵形に変化した（たとえば、図２Ａ中央パネル、図２Ｃ、および図２Ｆ）。この段階のＰＳＭ細胞は移動し、前記凝集体内の１つ（またはいくつか）の極に集合した（「ＰＳＭ分極」とも呼ばれる）（例えば、図２Ａおよび２Ｄ、明るい領域）。
【0126】
凝集体の形態が球形から卵様の形態に変化したら、５～１０％のマトリゲルなどの低パーセンテージの細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、またはフィブロネクチン、コラーゲン、および／またはラミニンのＥＣＭ成分の１つを追加する。必要に応じて、中胚葉細胞の発生から１２～２４時間後に、次の１つまたは複数を培地に添加してもよい。
（ａ）Ｎｏｄａｌ阻害剤（たとえば、５－１５μＭ ＳＢ－４３１５４２）。
（ｂ）高濃度のＷｎｔ活性化剤（たとえば、Ｃｈｉｒ９９２０１、またはＲｓｐｏ３）であって、通常はそれぞれ３μＭ～９μＭ、および２０～６０ｎｇ／ｍｌの範囲内のもの。
（ｃ）ＢＭＰ阻害剤（たとえば、ＬＤＮ１９３１８９、またはＮｏｇｇｉｎ）。
（ａ）Ｎｏｄａｌ阻害剤（たとえば、５－１５μＭ ＳＢ－４３１５４２）。
（ｂ）高濃度のＷｎｔ活性化剤（たとえば、Ｃｈｉｒ９９２０１、またはＲｓｐｏ３）であって、通常はそれぞれ３μＭ～９μＭ、および２０～６０ｎｇ／ｍｌの範囲内のもの。
（ｃ）ＢＭＰ阻害剤（たとえば、ＬＤＮ１９３１８９、またはＮｏｇｇｉｎ）。
【0127】
ステップ３Ｂ－ＰＳＭの成熟とＰａｘ３陽性である前体節中胚葉（ａＰＳＭ）細胞の形成は、前述の（ステップ３Ａ）ＰＳＭ分極と並行して起こる。前記ａＰＳＭ細胞は、凝集体内のＰＳＭドメインの前極で生成された（たとえば、図３Ａおよび３Ｂ）。これらの細胞は、体節を生じさせてその後に筋原性前駆体を生じさせることができる。
【0128】
ステップ４－体節形成および軸伸長形成された傍軸中胚葉凝集体が完全に伸長し、体節様構造（それぞれ、図５Ａ～図５Ｂおよび図５Ｄにおいて番号が付けられ、指し示されている）を含んだ後、約１または２日後にＥＣＭ（またはＥＣＭ成分）を培地から除去した。ただし、ＥＣＭの除去は任意である。さらに、球形（例えば、図１Ａ）から、卵形（例えば、図２Ｃ）を経て、図５Ａ～図５Ｄに示される細長い形状へ形態変化しているが、これは、本明細書に開示されたプロトコルが胚発生に似ていることを示していることに留意されたい。
【0129】
ステップ５－筋原性前駆体の形成。体節様構造の形成から約１～２日後、以下の成長因子（ＧＦ）うちの１つ以上の低濃度のものを培地に添加した。１０ｎｇ／ｍｌ ＨＧＦ、２ｎｇ／ｍｌ ＩＧＦ、２０ｎｇ／ｍｌ ＦＧＦ２必要に応じて、前記ＧＦは前のステップで述べたように、単独で、またはＢＭＰ阻害剤、Ｗｎｔ活性化剤およびＥＣＭのうちの１つ以上と組み合わせて、添加される。
【0130】
このステップの終了時、ＧＦの添加から約１～２日後、筋芽細胞、筋細胞などの筋原性前駆体が成熟体節に観察された（図６Ａ～６Ｄ）。
【0131】
プロトコル全体を通じて、培地は一日おきに交換した。
【0132】
実施例２ 傍軸中胚葉分化の段階特異的マーカーの空間的発現
【0133】
生体外モデルの分子および細胞の特性を胚と比較した。隣接する細胞層が筋組織の形成に不可欠なシグナル伝達と機械的支持を提供するので、この比較は非常に重要である。
【0134】
この目的のために、傍軸中胚葉分化の段階特異的マーカー（ブラキウリ／Ｔ、Ｍｓｇｎ１、Ｐａｘ３、Ｍｅｓｐ２、Ｍｅｏｘ１）、体節（Ｕｎｃｘ、Ｔｂｘ１８）、筋前駆体（Ｐａｘ７）、筋細胞（ＭｙｏＧ）、および成熟筋細胞（ｆａｓｔ ＭＨＣ）の空間的発現を特徴付けた。これは、ブラキウリ、Ｍｓｇｎ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、ＭｙｏＧなどの既存の蛍光ライブマーカー細胞株、またはマーカー特異的抗体による免疫染色を使用して行った。
【0135】
蛍光ｉｎ－ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用して、各段階で事前に選択された遺伝子の拡張セットについてのさまざまな段階での空間ｍＲＮＡ発現マップも取得した。この方法は、検証された抗体が存在しない遺伝子には不可欠である。これは、抗体の入手可能性が特に限定的なウシやニワトリなどの非モデル生物では重要になる。
【0136】
本発明を特定の実施形態を参照して開示したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって本発明の他の実施形態および変形が考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、そのようなすべての実施形態および同等の変形を含むように解釈されることを意図している。
【0137】
特段の定めがない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が関係する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾がある場合には、定義を含め、特許明細書が優先される。本明細書で使用する場合、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味する。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図4A-4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【国際調査報告】