特表 2024-510422 ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼの選択的不活化剤としての３－アミノ－４，４－ジハロシクロペンタ－１－エンカルボン酸

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-07

(54)【発明の名称】ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼの選択的不活化剤としての３－アミノ－４，４－ジハロシクロペンタ－１－エンカルボン酸

(51)【国際特許分類】

   C07C 229/48 20060101AFI20240229BHJP

   A61K 31/196 20060101ALI20240229BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240229BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240229BHJP

   A61P 1/16 20060101ALI20240229BHJP

   A61P 11/00 20060101ALI20240229BHJP

【ＦＩ】

C07C229/48 CSP

A61K31/196

A61P43/00 111

A61P35/00

A61P1/16

A61P11/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553735

(86)(22)【出願日】2022-03-03

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 US2022018753

(87)【国際公開番号】W WO2022187523

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】63/156,147

(32)【優先日】2021-03-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500041019

【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100150810

【弁理士】

【氏名又は名称】武居 良太郎

(72)【発明者】

【氏名】リチャード ビー．シルバーマン

(72)【発明者】

【氏名】シーダ シェン

【テーマコード（参考）】

4C206

4H006

【Ｆターム（参考）】

4C206AA01

4C206AA02

4C206AA03

4C206FA44

4C206KA01

4C206MA01

4C206MA04

4C206NA14

4C206ZA59

4C206ZA75

4C206ZB26

4C206ZC20

4H006AA01

4H006AB20

(57)【要約】

アミノ、フルオロ置換されたシクロペンテンカルボン酸化合物が開示される。開示される化合物及びその組成物は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）活性を調節する方法に利用することができ、ｈＯＡＴ活性に関連する疾患若しくは障害、又は細胞増殖性疾患及び障害などの発現を治療するための方法を含む。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

次の式：

【化1】

〔式中、
二重結合がα炭素とε炭素の間、又はα炭素とβ炭素の間に存在し、
Ｒ^１及びＲ^２の各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩなどのハロゲンから独立して選択される〕
の化合物、又はその解離形態、非プロトン化形態、双性イオン形態、若しくは塩。

【請求項2】

アンモニウム部分及びカルボキシレート部分を含む双性イオン形態である、請求項１に記載の化合物。

【請求項3】

二重結合がα炭素とε炭素の間にある、請求項１に記載の化合物。

【請求項4】

二重結合がα炭素とβ炭素の間にある、請求項１に記載の化合物。

【請求項5】

Ｒ^１及びＲ^２のうちの少なくとも１つがＦである、請求項１に記載の化合物。

【請求項6】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項５に記載の化合物。

【請求項7】

アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項６に記載の化合物。

【請求項8】

薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中の請求項１に記載の化合物。

【請求項9】

式：

【化2】

〔式中、
Ｒ^１及びＲ^２のうちの少なくとも１つがＦである〕
である、請求項１に記載の化合物。

【請求項10】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項９に記載の化合物。

【請求項11】

式：

【化3】

である、請求項１に記載の化合物。

【請求項12】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項１１に記載の化合物。

【請求項13】

式：

【化4】

である、請求項１に記載の化合物。

【請求項14】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項１３に記載の化合物。

【請求項15】

（ｉ）請求項１に記載の化合物；及び（ｉｉ）薬学的に適した担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【請求項16】

ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）活性を調節する方法であって、該方法は、請求項１に記載の化合物をｈＯＡＴを含む培地と接触させることを含み、該化合物がｈＯＡＴ活性を調節するのに十分な量で存在する、方法。

【請求項17】

ヒトがんによって発現されるｈＯＡＴの活性を減少させる方法であって、該方法は、ｈＯＡＴを発現するがんを有効量の請求項１に記載の化合物と接触させてｈＯＡＴ活性を減少させることを含む、方法。

【請求項18】

治療有効量の請求項１に記載の化合物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法。

【請求項19】

がんが肝細胞癌腫（ＨＣＣ）である、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

がんが非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、請求項１８に記載の方法。

【請求項21】

がんが、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）の発現又は過剰発現によって特徴付けられる、請求項１８に記載の方法。

【請求項22】

化合物が、アンモニウム部分及びカルボキシレート部分を含む双性イオン形態である、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

二重結合がα炭素とε炭素の間にある、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

二重結合がα炭素とβ炭素の間にある、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

Ｒ^１及びＲ^２のうちの少なくとも１つがＦである、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

アンモニウム塩が、プロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

化合物が、薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中にある、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

化合物が、式：

【化5】

〔式中、
Ｒ^１及びＲ^２のうちの少なくとも１つがＦである〕
を有する、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項２７に記載の方法。

【請求項31】

化合物が、式：

【化6】

を有する、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

化合物が、式：

【化7】

を有する、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項34】

化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、請求項３３に記載の化合物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願との相互参照
本出願は、２０２１年３月３日に出願された米国特許出願第６３／１５６，１４７号に対する優先権の利益を主張するものであって、その内容全体が参照により援用される。

【0002】

連邦政府資金による研究又は開発に関する声明
本発明は、保健社会福祉省、国立衛生研究所及び国立薬物乱用研究所によって授与されたＤＡ０３０６０４に基づく政府の支援を受けてなされた。
政府は、本発明に関して一定の権利を有する。

【背景技術】

【0003】

トオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ；ＥＣ２．６．１．１３）は２つの共役アミノ基転移反応を触媒するピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）依存酵素であり、Ｌ－オルニチン（Ｌ－Ｏｒｎ）を変換してＬ－グルタミン酸－γ－セミアルデヒド（Ｌ－ＧＳＡ）を生成し、後半反応でα－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）からＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）を生成した^１。得られた中間体Ｌ－ＧＳＡはΔ１－ピロリン－５－カルボン酸（Ｐ５Ｃ）の自発平衡種であるが、Ｐ５ＣはＰ５Ｃレダクターゼ（ＰＹＣＲ）によって触媒されるＬ－プロリンを与えることができる^２。一方、生成されたＬ－Ｇｌｕはピロリン－５－カルボキシラートシンターゼ（Ｐ５ＣＳ）によってもＰ５Ｃに変換され、プロリン代謝に関与する。プロリン生合成は、プロリン消費の加速、ヒドロキシプロリン蓄積、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルの増加及びＨＣＣの予後不良との相関を特徴とする、肝細胞がん（ＨＣＣ）のヒト腫瘍組織における最も実質的に変化したアミノ酸代謝として同定された^３。さらに、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）はＬ－ＧｌｕのＬ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｎ）への変換を触媒する^４。Ｌ－Ｇｌｎは、がん細胞が同化過程を支持するために高度に必要とされ、細胞増殖を促進する。

【0004】

ＨＣＣは主な肝臓悪性腫瘍であり、世界中でがん関連死亡の最も一般的な原因の１つである。以前の研究では、ＤＮＡマイクロアレイ解析により同定されたＰｓａｍｍｏｍｙｓ ｏｂｅｓｕｓ（サンドラット）由来の自然発生ＨＣＣ発生肝臓における７つの過剰発現遺伝子の１つとしてＯＡＴ遺伝子を同定した^５。さらに、選択的ｈＯＡＴメカニズムに基づく不活化剤（ＭＢＩ）ＢＣＦ_３（１）の処理（０．１及び１．０ｍｇ／ｋｇ；ＰＯ）は、ＨＣＣマウスモデル^５において血清ＡＦＰレベルを著しく低下させ、腫瘍増殖を阻害し、薬理学的選択的ｈＯＡＴ阻害の抗腫瘍効果を強調した。ＭＢＩは、最初は標的酵素の代替基質として作用し、次に、特異的共有結合修飾、強結合静電相互作用、又はその他の機能的に不可逆的な阻害を介して酵素をさらに不活性化することができる活性種に変換される分子の一種である^６－７。ＭＢＩは、典型的には、標的酵素の活性部位との最初の結合の前には反応せず、それによって、通常、顕著な標的特異性及び選択性を示す^８。全体として、ｈＯＡＴはＨＣＣの潜在的治療標的と考えられ、ｈＯＡＴを選択的に不活化することは、有効なＨＣＣ治療を発見するための新しい機会を提供する可能性がある。

【0005】

しかしながら、ｈＯＡＴの選択的ＭＢＩを発見するための主な課題は、他のアミノトランスフェラー^６ゼ、特にｈＯＡＴと高い構造的類似性を有するγ－アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ－ＡＴ）に対する不可逆的阻害を克服することである^１。ホモ二量体構造の活性部位ポケットには２つの有意差しかない：ｈＯＡＴ中のＴｙｒ８５とＴｙｒ５５はそれぞれＧＡＢＡ－ＡＴ中のＩｌｅ７２とＰｈｅ３５１^＊で置換される^１。さらに、Ｉｌｅ７２及びＰｈｅ３５１^＊は、ｈＯＡＴと比較してＧＡＢＡ－ＡＴの活性部位がわずかに狭いが疎水性が高いことに関与している。対照的に、Ｔｙｒ５５のヒドロキシル基は基質の荷電Ｃ－２アミノ基と相互作用する水素結合受容体として働くが、Ｔｙｒ８５は基質特異性の重要な決定因子であり、かさ高い基質を採用するためにコンホメーション的に柔軟である^１。

【0006】

これら２つのアミノトランスフェラーゼ間の高い類似性に従い、ｈＯＡＴに対する予備的スクリーニングをストックＧＡＢＡ－ＡＴ阻害剤を用いて以前に行った^５。弾頭としてビス（トリフルオロメチル）基を有するＢＣＦ_３（１）と呼ばれるシクロペンタン系類似体は、ｈＯＡＴの選択的ＭＢＩであると同定されたが、ＧＡＢＡ－ＡＴに対するｍｍｏｌの可逆的阻害のみを示した。最近の機構的研究は、そのトリフルオロメチル基の１つがフッ化物イオンの脱離を起こし、リガンドが共役付加を通じて触媒Ｌｙｓ２９２を共有結合的に修飾することを明らかにした^９－１０。立体的なかさばるビス（トリフルオロメチル）基は、ＧＡＢＡ－ＡＴの比較的狭いポケットにアクセスするのが容易ではなく、リガンドと酵素との間の最初の結合ポーズに影響を及ぼし、これがＧＡＢＡ－ＡＴに対する可逆的阻害の原因である可能性があると考えられる。ＢＣＦ_３は、上述のようにインビボで有効であることが実証されており^５、ＨＣＣ患者由来の異種移植（ＰＤＸ）モデルにおける広範なＩＮＤ標識毒性評価及び有効性試験で検討されている。同様の戦略に基づき、環系を拡大して試験し、さらにジフルオロ基を有するシクロヘキセンベースの類似体ＷＺ－２－０５１（２）を発見した^１１。ＷＺ－２－０５１は、ＢＣＦ_３と比較してｈＯＡＴに対する不活化効率（ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ比により定義）が２３倍向上したが、ＧＡＢＡ－ＡＴより１３．３倍選択性を示した。その後の機構的研究は、ＷＺ－２－０５１が２段階フッ化物イオン脱離を受け、最終的に付加－芳香族化メカニズムを介してｈＯＡＴを不活性化することを明らかにした^１１。選択的ｈＯＡＴ不活性化剤のさらなる例は、ｈＯＡＴ基質Ｌ－Ｏｒｎの構造及び非選択的ＧＡＢＡ－ＡＴ不活性化剤ＡＦＰＡの構造に刺激された５－ＦＭＯｒｎ（３）であり^１２、三元付加物を形成することによってエナミン経路を介してｈＯＡＴを不活性化する^１３。

【0007】

５－ＦＭＯｒｎのα－アミノ基はｈＯＡＴ結晶錯体（ＰＤＢ侵入２ＯＡＴ）においてＴｙｒ５５のフェノール基と強い水素結合を形成することに留意すべきである^１４。さらに、ＢＣＦ_３（ＰＤＢ侵入６ＯＩＡ）及びＷＺ－２－０５１（ＰＤＢ侵入６Ｖ８Ｃ）とのｈＯＡＴ結晶錯体におけるそれらのカルボキシラート基とＴｙｒ５５の間の水素結合が観察され^９，１１、それにより、Ｔｙｒ５５との相互作用がリガンド特異性及び選択性において重要な役割を果たすことが示された。しかし、公表されているｈＯＡＴ不活化剤のうち、ｈＯＡＴに対する強力な不可逆的阻害、ＧＡＢＡ－ＡＴに対する弱い可逆的阻害（Ｋ_ｉ＝４．２ｍＭ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐ－ＡＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａ－ＡＴ）に対する阻害を最大４ｍＭまで示さず、有望なｈＯＡＴ選択性をもたらす^５。従って、ｈＯＡＴの新規選択的ＭＢＩを発見することは、ＨＣＣの潜在的治療アプローチとしてのｈＯＡＴ不活化剤の研究を促進するであろう。

【0008】

２０００年に、（１Ｒ，４Ｓ）－４－アミノ－３，３－ジフルオロシクロペンタンカルボン酸（４）はＧＡＢＡ－ＡＴに対する可逆的阻害剤であることが分かった（Ｋ_ｉ＝０．１９ｍＭ）^１５。１５年後、それはさらにｈＯＡＴ不活化剤であることが証明された。しかしながら、化合物４はｈＯＡＴに対して高い結合親和性（ＫＩ＝７．８ｍＭ）を示し、ｈＯＡＴに対して低い最高不活性化速度（ｋ_{ｉｎａｃｔ}＝０．０２分^－１）を示し、最終的には中程度の不活性化効率（ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ＝０．００３分^－１ｍＭ^－１）を引き起こし、不活性化及びターンオーバーメカニズムの解明には限界がある。

【0009】

本技術は、高度に強力で選択的なｈＯＡＴ不活性化剤であることが実証されている４のシクロペンタン環系に追加の二重結合を組み込むことにより、ＳＳ－１－１４８（６）を含む新規なシクロペンテン系類似体を提供する。結晶化、タンパク質及び分子質量分析、過渡状態測定、及び計算シミュレーションを利用した機構研究により、ＳＳ－１－１４８の新規非共有不活性化機構を明らかにした。

【発明の概要】

【0010】

開示されているのは、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）の選択的阻害のための化合物、組成物及び関連する使用方法である。開示された化合物、組成物、及び方法は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）に関連する疾患及び障害を治療するために利用することができる。

【0011】

開示された化合物は、置換シクロペンテン化合物として記載することができる。特に、開示された化合物は、アミノ、ハロ置換シクロペンテンカルボン酸化合物として記載することができる。開示された化合物及びその組成物は、ｈＯＡＴ活性又は細胞増殖性疾患及び障害などの発現に関連する疾患又は障害を治療する方法を含む、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）活性を調節する方法に利用することができる。

【0012】

開示された化合物は、次の式の化合物、又は解離型、非プロトン化型、双性イオン型、又はそれらの塩に向けることができる。

【0013】

【化1】

【0014】

式中、α炭素とε炭素の間、又はα炭素とβ炭素の間に二重結合が存在する。

【0015】

【化2】

【0016】

式中、Ｒ^１及びＲ^２の各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩのようなハロゲンから独立して選択される。

【0017】

示されているように、開示された化合物は、プロトン化されて、例えば、アンモニウム部分を形成することができ、場合により、化合物が塩として存在する。開示された化合物はまた、非プロトン化及び／又は解離されてもよく、例えば、カルボン酸部分がカルボン酸部分から解離され、場合により、化合物が塩として存在する。開示された化合物は、化合物がプロトン化されたアンモニウム部分及び解離されたカルボキシレート部分を含み、場合により化合物が塩として存在する双性イオン形態であってもよい。

【0018】

開示された化合物及び組成物は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）活性を調節する方法に利用することができる。このような方法は、以下の式の化合物又は解離型、双性イオン型、又はそれらの塩などの本明細書に開示される化合物を提供し、ｈＯＡＴを化合物と接触させることを含むことができる。

【0019】

【化3】

【0020】

式中、α炭素とε炭素の間、又はα炭素とβ炭素の間に二重結合が存在し、Ｒ^１及びＲ^２の各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩのようなハロゲンから独立して選択される。

【0021】

ある実施形態において、開示された方法は、限定されるものではないが、肝細胞がん（ＨＣＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、又はｈＯＡＴを発現若しくは過剰発現する他のがんを含む、がんによって発現されるｈＯＡＴの活性を低下させることを指向することができる。このような方法は、以下の式の化合物又は解離型、非プロトン化型、双性イオン型、又はそれらの塩などの本明細書に開示される化合物を提供し、がんを化合物と接触させることを含むことができる。

【0022】

【化4】

【0023】

式中、α炭素とε炭素の間、又はα炭素とβ炭素の間に二重結合が存在し、Ｒ^１及びＲ^２の各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩのようなハロゲンから独立して選択される。

【0024】

ある実施形態において、開示された方法は、それを必要とする対象における細胞増殖性疾患又は障害を治療することを指向することができる。適切な細胞増殖性疾患及び障害には、限定されるものではないが、肝細胞がん（ＨＣＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）などのｈＯＡＴを発現又は過剰発現するがんが含まれ得る。このような方法は、以下の式の化合物又は解離型、プロトン化されていない型、双性イオン型、又はそれらの塩をその必要とする対象に投与することを含むことができる。

【0025】

【化5】

【0026】

式中、α炭素とε炭素の間、又はα炭素とβ炭素の間に二重結合が存在し、Ｒ^１及びＲ^２の各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩのようなハロゲンから独立して選択される。

【0027】

本明細書に開示された化合物は、立体化学的又は立体配置上の制限なしであり、立体化学的又は立体配置上の制限が示されない限り、すべての立体化学的又は立体配置上の異性体を包含する。以下に例示及び説明するように、そのような化合物及び／又はそれらの中間体は、単一のエナンチオマー、異性体を分離することができるラセミ混合物、又は対応するエナンチオマーを分離することができるジアステレオマーとして入手可能である。従って、任意の立体中心は、任意の他の立体中心に対して、（Ｓ）又は（Ｒ）であり得る。別の考察として、種々の化合物は、酸又は塩基塩として、例えばアミノ基で部分的又は完全にプロトン化されてアンモニウム部分を形成する、及び／又は部分的又は完全に解離されて、例えばカルボキシル基で存在し、カルボキシレート置換基又は部分を形成することができる。特定のそのような実施形態において、アンモニウム置換基又は部分に関して、対イオンは、プロトン酸の共役塩基であり得る。特定のそのような又は他の実施形態において、カルボキシレート置換基又は部分に関して、対イオンは、アルカリ、アルカリ土類又はアンモニウムカチオンであり得る。さらに、本明細書に開示される任意の１つ以上の化合物を、治療方法又は薬剤と共に使用するための薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物の一部として提供することができることが当業者によって理解されるであろう。

【0028】

ある実施形態において、開示された方法は、ｈＯＡＴ活性及び／又は過剰発現に関連する疾患又は障害（細胞増殖性疾患及びｈＯＡＴ活性及び／又は発現又は過剰発現に関連するがんなどの障害を含む）に関する。適切な疾患及び障害には、限定されるものではないが、細胞増殖性疾患及び障害が含まれ、これらには、このような治療を必要とするヒト対象における肝細胞がん及び非小細胞肺がんが含まれるが、これらに限定されない。ある実施形態において、そのような化合物は、医薬組成物の一部として提供することができる。

【0029】

ある実施形態において、開示された方法は、がん（例えば、肝細胞がん（ＨＣＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ））によって発現されるヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼの活性を低下又は調節することを目的とする。そのような方法は、上述又は本明細書の他の箇所に記載された種類の化合物を提供する工程、及びヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼを発現するがんを含む細胞媒体と、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ活性を低下させるのに有効な量のそのような化合物と、そのような化合物とを接触させる工程を含むことができる。ある実施形態において、そのような化合物は、医薬組成物の一部として提供することができる。いずれにせよ、そのような接触はインビトロ又はインビボであり得る。

【0030】

より一般的には、開示された方法は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼを阻害又は不活性化することを目的とすることができる。そのような方法は、医薬組成物の一部であるか否かにかかわらず、上述又は下記に記載された種類の化合物を提供する工程、及びヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼと接触するための有効量のそのような化合物を投与する工程を含むことができる。このような接触は、当技術分野で理解されるように、実験目的及び／又は研究目的のために、又は１以上のインビボ又は生理学的条件をシミュレートするように設計され得る。そのような化合物には、以下の実施例、参考図、引用文献、及び／又は付随する合成スキームによって例示されるものが含まれるが、これらに限定されない。特定のそのような実施形態において、そのような化合物及び／又はその組み合わせは、ｈＯＡＴ、細胞増殖及び／又は腫瘍増殖を阻害するのに少なくとも部分的に十分な量で存在することができる。

【図面の簡単な説明】

【0031】

【図1】ｈＯＡＴと関連代謝経路（Ａ）；ｈＯＡＴメカニズムに基づく不活化剤ＢＣＦ_３（１）、ＷＺ－２－０５１（２）及び５－ＦＭＯｒｎ（３）（Ｂ）の構造。

【図2】ｈＯＡＴ（Ａ；ＰＤＢエントリー１ＯＡＴ）とＧＡＢＡ－ＡＴ（Ｂ；ＰＤＢエントリー１ＯＨＶ）の活性部位比較。Ｃ）ｈＯＡＴ不活性化因子４～６の構造。

【図3A】ｈＯＡＴ（Ａ）及びＧＡＢＡ－ＡＴ（Ｂ）中のＳＳ－１－１４８の主要代謝物。

【図3B】ｈＯＡＴ（Ａ）及びＧＡＢＡ－ＡＴ（Ｂ）中のＳＳ－１－１４８の主要代謝物。

【図4】化合物ＳＳ－１－１４８を用いた浸漬実験（Ａ、ＰＤＢ侵入７ＬＫ１）及び共結晶化（Ｂ、ＰＤＢ侵入７ＬＫ０）から生じるｈＯＡＴの結晶構造。ＳＳ－１－１４８の浸漬構造は２つの立体配座で示されている。１つはカルボキシラート基がＴｙｒ５５と相互作用する構造（コンホメーションＡ）であり、もう１つはカルボキシラートがＡｒｇ４１３と塩橋を形成する構造（コンホメーションＢ）である。この特定の鎖については、立体配座の占有率は０．５１（コンホメーションＡ）と０．４９（コンホメーションＢ）である。ｈＯＡＴ残基及びＳＳ－１－１４８は棒状に表示されている。六角形の原子間のＨ－結合距離は破線で示されている。

【図5A】ＳＳ－１－１４８により不活性化されたｈＯＡＴの変性、無傷（Ａ）及び天然（Ｂ）タンパク質質質質量分析。

【図5B-1】ＳＳ－１－１４８により不活性化されたｈＯＡＴの変性、無傷（Ａ）及び天然（Ｂ）タンパク質質質質量分析。

【図5B-2】ＳＳ－１－１４８により不活性化されたｈＯＡＴの変性、無傷（Ａ）及び天然（Ｂ）タンパク質質質質量分析。

【図6】ＳＳ－１－１４８と反応するｈＯＡＴの２７５，４２０，５６０ｎｍで観察された過渡状態吸収変化。ＯＡＴ（１２．７μＭ最終）をＳＳ－１－１４８（１２６、２５１、５０２、１００４、２００８、４０１６μＭ）と混合し、ＣＣＤスペクトルを時間枠０．００９～４９．２秒間収集した。（Ａ）４２０ｎｍで観測されたデータは、支持情報に記述された式（３）に従って３つの指数項の線形結合に適合する。矢印は、インヒビター濃度を増加させるために観察される振幅の傾向を示す。（Ｂ）４２０ｎｍで観測された第一相の観測された速度定数依存性は支持情報に記述された式（５）に適合した。ｋ２及びｋ３の値は、図５Ａの適合から得られる平均値である。フィットは赤色のダッシュで表示されます。（Ｃ）５６０ｎｍで観察されたデータ。曲がった矢印は、阻害剤濃度を増加させるために観察された振幅の傾向を示す。これらのデータは、支持情報に記載された式（４）に従って、２つ（１００４、２００８、及び４０１６μＭ）又は３つ（１２６、２５１、及び５０２μＭ）の指数項の線形結合に適合した。フィットは赤色のダッシュで表示されます。（Ｄ）８０３２μＭ ＳＳ－１－１４８の存在下で得られた２０００秒にわたる２７５ｎｍでの観測データは、支持情報の方程式（４）に従って２つの指数項の線形結合に適合した。フィットは赤色のダッシュで表示されます。

【図7A-B】ＳＳ－１－１４８と反応するｈＯＡＴで観測された過渡状態吸収変化の特異値分解（ＳＶＤ）による部分分解。ｈＯＡＴ（６．９４μＭ；最終濃度）を、１０℃でＳＳ－１－１４８（１０４０μＭ；最終濃度）を有する停止流分光光度計中で反応させ、４桁の大きさにわたる速度を分析するのに十分な時間分解能を得るために、平均化された短時間及び長時間フレームデータセットを一緒にスプライシングすることにより、２５０～８００ｎｍ及び０．０１３７～９８４３秒にわたる複合ＣＣＤ吸光度データセットを調製した。これらのデータは、速度定数が単一波長分析から決定されたものに制約される線形非可逆４段階モデルに適合した（図６）。ＳＶＤ分析（Ａ）から導いたデコンボリューション複合スペクトル。データセット（Ｂ）に適合するために使用した速度定数に基づく種濃度プロファイル。

【図7C】分析したデータセット（Ｃ）からのスペクトルのサブセットの三次元図。

【図8】ＤＦＴ／Ｂ３ＬＹＰ法（Ａ）を用いたＣγ位置における水素の理論的ｐＫａ計算と、中間体の静電ポテンシャルとＣ_δ及びＣ_４’位置（Ｂ）のＥＳＰ電荷に符号化された電子密度マップ。

【図9】ＳＳ－１－１４８によるｈＯＡＴの滴定。酵素活性の消失を、酵素濃度に対する不活性化の比の関数として測定した。直線回帰を曲線の直線部分で用いて、回転数（分配比＝回転数－１）であるＸ切片を得た。

【図10】種々の濃度のＳＳ－１－１４８によりｈＯＡＴの時間依存透析が部分的又は完全に阻害された。

【図11】中間体を４σレベルに浸漬したＳＳ－１－１４８のポーダーマップ。

【図12】４σレベルのＳＳ－１－１４８共結晶のポーダーマップ。

【図13】天然の未修飾ｈＯＡＴをネイティブＭＳが調べた。左：未処理ｈＯＡＴ；右：衝突解離エネルギーを印加した未処理ｈＯＡＴ（ＮＣＥ：１５）。

【図14-1】Ｍ７及び関連する互変異性体に対するＧｉｂｂの自由エネルギー。

【図14-2】Ｍ７及び関連する互変異性体に対するＧｉｂｂの自由エネルギー。

【図15-1】ｈＯＡＴ中の４－６の主要代謝物。（Ａ）ｈＯＡＴ中の４の一次代謝産物。（Ｂ）ｈＯＡＴ中の５の一次代謝産物。ｈＯＡＴにおけるＳＳ－１－１４８（６）の一次代謝産物（Ｃ）。

【図15-2】ｈＯＡＴ中の４－６の主要代謝物。

【図15-3】ｈＯＡＴ中の４－６の主要代謝物。

【図15-4】ｈＯＡＴ中の４－６の主要代謝物。

【発明を実施するための形態】

【0032】

開示された主題事項は、以下のような定義及び用語を用いてさらに記述することができる。本明細書で使用される定義及び用語は、特定の実施形態のみを説明する目的であり、限定することを意図しない。

【0033】

本明細書及び請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が明確に別段の指示をしない限り、複数形を含む。例えば、用語「置換基」は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、「１つ以上の置換基」を意味すると解釈されるべきである。

【0034】

本明細書で使用される［００３８］本明細書では、「約」、「約」、「実質的」、及び「有意」は、当業者によって理解され、それらが使用される文脈によってある程度変化するであろう。用語が使用される文脈が与えられた場合、当業者にとって明確でない用語の使用がある場合、「約」及び「約」は、特定の用語の±１０％までを意味し、「実質的に」及び「有意に」は、特定の用語の±１０％を超えるか又は超えることを意味する。

【0035】

本明細書で使用されるように、用語「含む（include）」及び「含んでいる（including）」は、用語「含む（comprise）」及び「含んでいる（comprising）」と同じ意味を有する。用語「含む（comprise）」及び「含んでいる（comprising）」は、クレームに記載された構成要素にさらに追加の構成要素を含めることを可能にする「オープンな」移行用語であると解釈されるべきである。用語「なる（consist）」及び「からなる（consisting of）」は、クレームに記載された構成要素以外の追加構成要素を含めることを許容しない「閉じた」移行用語であると解釈されるべきである。「本質的になる（consisting essentially of）」という用語は、部分的に閉じられていると解釈されるべきであり、クレームされた主題事項の性質を根本的に変化させない追加の構成要素のみを含めることができる。

【0036】

文言「そのようなもの」は「例えば、含む」と解釈されるべきであり、さらに、「そのようなもの」を含むがこれらに限定されない任意の全ての例示的な言語の使用は、単にクレームされた主題事項をより良く照明することを意図し、クレームされた主題事項の範囲を限定するものではない。

【0037】

さらに、「Ａ、Ｂ、Ｃ等のうちの少なくとも１つ」に類似する慣例が使用される場合には、一般に、このような構造は、当該慣例を当業者が理解するという意味で意図される（例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃのうちの少なくとも１つを有するシステムは、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢの間、ＡとＣの間、ＢとＣの間、及び／又はＡ、ＢとＣの間を有するシステムを含むが、これらに限定されない）。明細書又は図面のいずれかにおいて、２つ以上の代替用語を提示する実質的に任意の分離語及び／又は語句は、用語のいずれか、又は両方の用語のいずれか、又はいずれかの用語の１つを含める可能性を考慮するように理解されるべきであることが、当業者によってさらに理解されるであろう。例えば、語句「Ａ又はＢ」は、「Ａ」又は「Ｂ」又は「Ａ及びＢ」の可能性を含むと理解されるであろう。

【0038】

「最大」、「少なくとも」、「より多い」、「より少ない」等のようなすべての言語は、列挙された数を含み、続いて範囲及びサブ範囲に分解することができる範囲を指す。範囲は、個々のメンバーを含む。従って、例えば、１～３のメンバーを有するグループは、１、２、又は３のメンバーを有するグループを指す。同様に、６個のメンバーを有するグループは、１、２、３、４、又は６個のメンバーを有するグループなどを指す。

【0039】

モード動詞は、同一内に含まれる複数の説明された実施形態又は特徴のうちの１つ又は複数のオプション又は選択の好ましい使用又は選択を指す。同じ中に含まれる特定の実施形態又は特徴に関する選択肢又は選択肢が開示されていない場合、モード動詞は、同じ中に含まれる説明された実施形態又は特徴の製造又は使用方法及びアスペクトに関する肯定的な行為、又は同じ中に含まれる説明された実施形態又は特徴に関する特定のスキルを使用する確定的な決定を指すことができる。後者の文脈では、法助動詞「ｍａｙ」は助動詞「ｃａｎ」と同じ意味と含意を有する。

【0040】

本明細書中で使用されるように、「それを必要とする対象」は、ヒト及び／又は非ヒト動物を含み得る。「それを必要とする対象」は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）活性に関連する疾患又は障害を有する対象を含み得る。「それを必要とする対象」は、限定されるものではないが、肝細胞がん（ＨＣＣ）を含み得る、細胞増殖性疾患又は障害を有する対象を含み得る。

【0041】

化学物質
新規化学物質及び化学物質の用途が本明細書に開示される。化学物質は、当該技術分野で公知の用語を用いて記載することができ、以下にさらに説明する。

【0042】

本明細書で使用する場合、ダッシュ「－」又はアスタリスク「^＊」又はプラス記号「＋」を使用して、任意のラジカル基又は置換基に対する結合点を指定することができる。

【0043】

本明細書で意図される用語「アルキル」は、そのすべての異性体形、例えば、本明細書ではそれぞれＣ１～Ｃ１２アルキル、Ｃ１～Ｃ１０－アルキル、及びＣ１～Ｃ６－アルキルと呼ばれる、１～１２、１～１０、又は１～６炭素原子の直鎖又は分枝鎖基中の直鎖又は分枝アルキルラジカルを含む。

【0044】

用語「アルキレン」は、直鎖又は分枝アルキル基（すなわち、直鎖又は分枝Ｃ１～Ｃ６アルキル基のジラジカル）のジラジカルを指す。例示的なアルキレン基としては、－ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_２－、－ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－、－ＣＨ_２ＣＨ（ＣＨ_３）ＣＨ_２－、－ＣＨ（ＣＨ_２ＣＨ_３）ＣＨ_２ＣＨ_３などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0045】

用語「ハロ」は、ハロゲン置換（例えば、－Ｆ、－Ｃｌ、－Ｂｒ、又は－Ｉ）を指す。用語「ハロアルキル」とは、少なくとも１つのハロゲンで置換されたアルキル基を指す。例えば、－ＣＨ_２Ｆ、－ＣＨＦ_２、－ＣＦ_３、－ＣＨ_２ＣＦ_３、－ＣＦ_２ＣＦ_３などである。

【0046】

本明細書中で使用される用語「ヘテロアルキル」は、少なくとも１つの炭素原子がヘテロ原子（例えば、Ｏ、Ｎ、又はＳ原子）で置換されている「アルキル」基を指す。ヘテロアルキル基の１つのタイプは、「アルコキシ」基である。

【0047】

本明細書中で使用される用語「アルケニル」は、本明細書中でそれぞれＣ２～Ｃ１２－アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０－アルケニル、及びＣ２～Ｃ６－アルケニルと称する、２～１２、２～１０、又は２～６炭素原子の直鎖又は分枝鎖基などの少なくとも１つの炭素－炭素二重結合を有する不飽和直鎖又は分枝鎖炭化水素を指す。

【0048】

用語「アルキニル」とは、本明細書において、それぞれＣ２～Ｃ１２－アルキニル、Ｃ２～Ｃ１０－アルキニル、及びＣ２～Ｃ６－アルキニルと称する、２～１２、２～１０、又は２～６炭素原子の直鎖又は分枝鎖基のような、少なくとも１つの炭素－炭素三重結合を有する不飽和直鎖又は分枝鎖炭化水素を指す。

【0049】

用語「シクロアルキル」とは、シクロアルカンから誘導された、本明細書中で「Ｃ４～８－シクロアルキル」と称する、３～１２、３～８、４～８、又は４～６炭素の一価飽和環式、二環式、又は橋かけ環式（例えば、アダマンチル）炭化水素基を指す。特記しない限り、シクロアルキル基は、１以上の環位置で、例えばアルカノイル、アルコキシ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド又はカルボキシアミド、アミノ、アリールアルキル、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カルボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、ホルミル、エーテル、ハロアルキル、ヘテロアリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、リン酸塩、ホスホナート、ホスフィナート、スルフェート、スルホンアミド、スルホニル又はチオカルボニルで任意に置換される。ある実施形態において、シクロアルキル基は置換されていない、すなわち、置換されていない。

【0050】

用語「００５５」は、シクロアルカンの少なくとも１つの炭素が、例えばＮ、Ｏ、及び／又はＳのようなヘテロ原子で置換されている、３～１２、３～８、４～８、又は４～６炭素の一価飽和環式、二環式、又は架橋環式炭化水素基を指す。

【0051】

用語「シクロアルキレン」は、１つ以上の環結合で不飽和であるシクロアルキル基を指す。

【0052】

用語「部分的に不飽和のカルボシクリル」とは、少なくとも１つのカルボシクリルの環が芳香族でない環原子間の少なくとも１つの二重結合を含む単価の環状炭化水素を指す。部分的に不飽和なカルボシクリルは、炭素原子の番号に従って特徴付けることができる。例えば、部分的に不飽和なカルボシクリルは、５～１４、５～１２、５～８、又は５～６環炭素原子を含有することができ、従って、それぞれ、５～１４、５～１２、５～８、又は５～６員の部分的に不飽和なカルボシクリルと呼ばれる。部分的に不飽和なカルボシクリルは、単環式炭素環、二環式炭素環、三環式炭素環、橋かけ炭素環、スピロ環式炭素環、又は他の炭素環系の形態であってもよい。例示的な部分不飽和カルボシクリル基には、シクロアルケニル基及び部分的に不飽和である二環式カルボシクリル基が含まれる。特記しない限り、部分的に不飽和なカルボシクリル基は、１以上の環位置で、例えばアルカノイル、アルコキシ、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド又はカルボキシアミド、アミノ、アリールアルキル、アリールアルキル、アジド、カルバメート、カルボネート、カルボキシ、シアノ、シクロアルキル、エステル、ホルミル、エーテル、ハロゲン、ヘテロアリール、ヘテロアリール、ヒドロキシル、イミノ、ケトン、ニトロ、リン酸塩、ホスホナート、ホスフィナート、スルフェート、スルホンアミド、スルホニル又はチオカルボニルで置換されてもよい。ある実施形態において、部分的不飽和カルボシクリルは置換されていない、すなわち、置換されていない。

【0053】

用語「アリール」は技術的に認識されており、炭素環式及び／又は複素環式芳香族基を指す。代表的なアリール基としては、フェニル、ナフチル、アントラセニル、ピリジニル、キノリニル、フラニル、チオニルなどが挙げられる。用語「アリール」は、２つ以上の炭素が２つの隣接する環に共通であり（環は「縮合環」）、ここで、環の少なくとも１つは芳香族であり、そして、例えば、他の環は、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、及び／又はアリールであり得る、２つ以上の炭素環を有する多環式環系を含む。特記しない限り、芳香族環は、１以上の環位置で、例えば、ハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド又はカルボキシアミド、カルボキシル酸、－Ｃ（Ｏ）アルキル、－ＣＯ２アルキル、カルボニル、カルボキシル、アルキルチオ、スルホニル、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリール部分、－ＣＦ_３、－ＣＮなどで置換されてもよい。ある実施形態において、芳香族環は、ハロゲン、アルキル、ヒドロキシル、又はアルコキシルで１つ以上の環位置で置換される。特定の他の実施形態では、芳香族環は置換されていない、すなわち、置換されていない。ある実施形態において、アリール基は、６～１０員環構造である。

【0054】

用語「ヘテロシクリル」及び「複素環基」は、技術的に認識されており、飽和、部分的に不飽和、又は芳香族の３～１０員環構造、あるいは３～７員環を指し、その環構造は、窒素、酸素、及び硫黄などの１～４個のヘテロ原子を含む。ヘテロシクリル基中の環原子数は、５Ｃｘ～Ｃｘ命名法を用いて指定することができる。ｘは環原子数を指定する整数である。例えば、Ｃ３～Ｃ７ヘテロシクリル基は、窒素、酸素、及び硫黄のような１～４個のヘテロ原子を含む飽和又は部分的に不飽和の３～７員環構造を指す。「Ｃ３～Ｃ７」という名称は、複素環が、環原子位置を占めるヘテロ原子を含めて、３～７個の環原子を含むことを示す。

【0055】

用語「アミン」及び「アミノ」は、技術的に認識されており、置換されていないアミン及び置換されたアミン（例えば、モノ置換アミン又はジ置換アミン）の両方を指し、置換基は、例えば、アルキル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アルケニル、及びアリールを含み得る。

【0056】

用語「アルコキシ」又は「アルコキシル」は、技術的に認識されており、酸素ラジカルがそれに結合している上記定義のアルキル基を指す。代表的なアルコキシ基としては、メトキシ、エトキシ、ｔｅｒｔ－ブトキシなどが挙げられる。

【0057】

エーテルは、酸素によって共有結合された２つの炭化水素である。従って、エーテルをアルキル化するアルキルの置換基は、－Ｏ－アルキル、－Ｏ－アルケニル、－Ｏ－アルキニル等で表されるアルコキシルであるか又はアルキルに類似している。

【0058】

本明細書中で使用される用語「カルボニル」は、ラジカル－Ｃ（Ｏ）－を指す。

【0059】

用語「オキソ」は、２価の酸素原子－Ｏ－を指す。

【0060】

本明細書中で使用される用語「カルボキシ」又は「カルボキシル」は、ラジカル－ＣＯＯＨ又はその対応する塩、例えば－ＣＯＯＮａなどを指す。「カルボキシアルキルエステル」は、部分－Ｃ（Ｏ）Ｏ－Ｒを有する化合物を指し、ここで、Ｒはアルキルである。

【0061】

本明細書中で使用される用語「カルボキサミド」は、ラジカル－Ｃ（Ｏ）ＮＲＲ’を指し、ここで、Ｒ及びＲ’は同じであっても異なっていてもよい。Ｒ及びＲ’は、例えば、独立して、水素、アルキル、アリール、アリールアルキル、シクロアルキル、ホルミル、ハロアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロシクリルであり得る。

【0062】

用語「アミド（amide）」又は「アミド（amido）」又は「アミジル（amidyl）」は、本明細書中で使用される場合、－Ｒ^１Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＯＢ）－、－Ｒ^１Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲＯＤ）Ｒ^３－、－Ｃ（Ｏ）ＮＲ^２Ｒ^３、又は－Ｃ（Ｏ）ＮＨ２の形態の基を指し、ここで、Ｒ^１、Ｒ^２及びＲ^３は、それぞれ独立して、水素、アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アミド、アミド、アリール、アリールアルキル、カルバメート、シクロアルキル、エステル、エーテル、ホルミル、ハロゲン、ハロアルキル、ヘテロアリール、水素、ヒドロキシル、ケトン又はニトロである。

【0063】

本開示の化合物は異性体であり得る。いくつかの実施形態において、開示された化合物は、異性体として純粋であり得、ここで、化合物は、化合物の異性体混合物内の全ての化合物の約９９％よりも大きいことを表す。また、本明細書では、所定の化合物の単一異性体を少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％含むことができる組成物を含む、本質的に純粋な異性体化合物及び／又は異性体的に濃縮された組成物からなる、又はそれらからなる組成物も意図される。

【0064】

本開示の化合物は、１以上のキラル中心及び／又は二重結合を含んでもよく、従って、幾何異性体、エナンチオマー又はジアステレオマーのような立体異性体として存在する。本明細書で使用される場合、用語「立体異性体」は、全ての幾何異性体、鏡像異性体又はジアステレオマーからなる。これらの化合物は、キラル又はキラル炭素原子の周りの置換基の立体配置及び観察される旋光度に依存して、「Ｒ」又は「Ｓ」、又は「＋」又は「－」の記号で表すことができる。開示された化合物は、種々の立体異性体及びそれらの混合物を包含する。立体異性体には、エナンチオマー及びジアステレオマーが含まれる。鏡像異性体又はジアステレオマーの混合物は、命名法において「（±）」と称することができるが、当業者は、構造が暗黙のうちにカイラル中心を示すことができることを認識するであろう。化学構造の図示、例えば一般的な化学構造は、特に断らない限り、特定の化合物のすべての立体異性体形態を包含することが理解される。また、本明細書では、所定の化合物の単一のエナンチオマー（例えば、所定の化合物の少なくとも約９５％のＲエナンチオマー）を含み、少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％から構成され得る組成物から本質的に構成されるか、又はエナンチオマーを豊富に含む組成物及び／又は組成物から構成される組成物も意図される。

【0065】

開示された化合物の種々の非限定的実施形態及び使用方法は、ＯＡＴの触媒メカニズム及びＧＡＢＡ－ＡＴ及びＯＡＴの不活性化メカニズムを理解することによって考慮することができる。いくつかの実施形態において、開示された主題は、本明細書ではまとめて担体と称される１以上の生理学的に許容される又は許容される希釈剤、担体、アジュバント又はビヒクルと共に組成物に製剤化された、上述の１以上のＯＡＴ阻害剤に関する。このような接触又は投与に適した組成物は、無菌であるか否かにかかわらず、生理学的に許容される水性又は非水性溶液、分散液、懸濁液又はエマルジョンを含むことができる。得られた組成物は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼとの投与又は接触のために、本明細書に記載された種々の方法と共に、得ることができる。医薬組成物と共に「接触させる」か否かは、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ及び１つ以上の阻害剤化合物が、そのような阻害剤化合物を酵素に結合及び／又は複合させる目的で一緒にされることを意味する。ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼを阻害するのに有効な化合物の量は経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の範囲内である。ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ活性の阻害又は他の作用には、ＯＡＴ活性、グルタミン酸産生、グルタミン合成、細胞増殖及び／又は腫瘍増殖の減少、緩和及び／又は調節のほか、除去が含まれる。

【0066】

当業者には、投与量は、特定の阻害剤化合物の活性、病態、投与経路、治療期間、及び医学及び薬学分野で周知の同様の因子によって変化することが理解される。一般に、適切な用量は、治療効果又は予防効果をもたらすのに有効な最低用量である量であろう。所望であれば、そのような化合物、その薬学的に許容される塩、又は関連組成物の有効用量を、２つ以上のサブ用量で、適切な期間にわたって別々に投与することができる。

【0067】

薬学的製剤又は組成物を調製する方法は、阻害剤化合物を担体、及び場合により１以上の追加のアジュバント又は成分と結合させる工程を含む。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに記載されているような標準的な医薬製剤技術を使用することができる。

【0068】

組成又は処方にかかわらず、当業者は、薬剤投与のための種々の経路を、そのような薬剤を投与に適したものにする際に考慮すべき対応する因子及びパラメータと共に認識するであろう。従って、１以上の非限定的実施形態に関して、開示された化合物は、ｈＯＡＴ活性、発現、又は過剰発現に関連する疾患又は障害の治療又は予防における治療的使用のための薬剤の製造のための阻害化合物として利用することができる。適切な疾患又は障害には、細胞増殖性疾患又は障害が含まれ得、これらには、限定されるものではないが、肝細胞がん（ＨＣＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）が含まれ得る。

【0069】

一般に、様々な実施形態に関して、開示された主題は、病的増殖性障害の治療のための方法を対象とすることができる。本明細書中で使用される場合、用語「障害」とは、正常な機能の障害が存在する状態を指す。「病気」とは、患者や接触者に不快感、機能障害、苦痛を与える身体や精神の異常状態を指す。しばしば、この用語は、損傷、障害、症候群、症状、逸脱行動、及び構造と機能の非定型的変化を包含するために広く用いられ、他の文脈では、これらは区別可能なカテゴリーと考えられる。用語「疾患」、「障害」、「状態」及び「病気」は、本明細書において同様に使用されることに留意されたい。

【0070】

ある実施形態によれば、開示された方法は、ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）を発現する悪性増殖性障害を含む悪性増殖性障害の治療に特に適用可能であり得る。本明細書中で使用される場合、「がん」、「腫瘍」及び「悪性腫瘍」は全て、組織又は器官の過形成に等価である。組織がリンパ系又は免疫系の一部である場合、悪性細胞は、循環細胞の非固形腫瘍を含み得る。他の組織又は臓器の悪性腫瘍は、固形腫瘍を引き起こすことがある。従って、本明細書に開示された化合物、組成物、及び方法は、非固形及び固形腫瘍の治療に使用することができる。

【0071】

本明細書で意図される悪性腫瘍は、ｈＯＡＴを発現する黒色腫、がん腫、白血病、リンパ腫及び肉腫からなる群から選択され得る。ＯＡＴを発現する悪性腫瘍（白血病、リンパ腫及び骨髄増殖性障害を含む）、低形成性及び再生不良性貧血（ウイルス誘発性及び特発性の両方）、骨髄異形成症候群、あらゆるタイプの腫瘍随伴症候群（免疫媒介性及び特発性の両方）及び固形腫瘍（膀胱、直腸、胃、子宮頸部、卵巣、腎臓、肺、肝臓、乳房、結腸、前立腺、消化管、膵臓及びカルポシを含む）を含むが、これらに限定されない、本明細書に開示される方法によって治療することができる悪性腫瘍を含むことができる。より具体的には、特定の実施形態によれば、非固形がん、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、肥満細胞白血病、有毛細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫及び多発性骨髄腫などの造血器悪性腫瘍の治療又は抑制のための方法、ならびに口唇及び口腔、咽頭、喉頭、副鼻腔、大唾液腺、甲状腺、食道、胃の腫瘍などの固形腫瘍の治療又は抑制のために、化合物及び組成物を併用することができる。小腸、結腸、結腸、結腸、直腸、結腸管、肝臓、肛門管、結腸、肛門管、肝臓、肛門管膨大部、膵臓、胸膜中皮腫、骨、軟部組織肉腫、がん及び皮膚、乳房、外陰部、外陰部、膣、子宮頸部、子宮体、卵管、卵巣、卵管、妊娠性絨毛腫瘍、陰茎、前立腺、精巣、腎盂、腎臓、尿管、尿管、尿道、眼瞼がん、結膜がん、悪性黒色腫、結膜悪性黒色腫、網膜芽細胞腫、涙腺がん、涙腺がん、脳肉腫、眼窩、脳、脊髄、血管系、血管肉腫、カポジ肉腫。

【0072】

本明細書に開示された化合物及び組成物は、当技術分野で公知の治療方法で投与することができ、従って、種々のそのような化合物及び組成物は、任意の適切な方法で、そのような方法と共に投与することができる。例えば、投与は、経口投与、静脈内投与、動脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、腹腔内投与、非経口投与、経皮投与、膣内投与、鼻腔内投与、粘膜投与、舌下投与、局所投与、直腸投与又は皮下投与、又はそれらの任意の組合せを含み得る。

【0073】

いくつかの実施形態によれば、処置された対象は、哺乳動物対象であり得る。本明細書に開示された方法は、特に、ヒトにおける増殖性障害の治療を意図しているが、他の哺乳動物も含まれる。非限定的な例として、哺乳動物対象としては、サル、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、マウス、ラット及びブタが挙げられる。

【0074】

本明細書及び請求項で使用される用語「治療、治療、治療」は、病的障害を有する対象における疾患活動性の１以上の臨床的指標を改善することを意味する。「治療」とは、治療的処置をいう。治療を必要とするのは、何らかの病的障害を有する哺乳動物被験者である。「患者」又は「必要な対象」とは、本明細書に記載される種類の化合物又は任意の医薬組成物の投与が、そのような負荷を防止、克服、調節又は減速するために望ましい任意の哺乳動物を意味する。「予防的（preventive）治療」又は「予防的（prophylactic）治療」を提供することは、何か、特に状態又は疾患に対して防御又は予防するために、防御的な方法で作用することである。

【0075】

より一般的には、開示された方法は、ＯＡＴ活性に関連する悪性病理学的増殖性障害の開始、進行及び／又は転移（例えば、他の部位からの肝臓又は他の臓器又は組織からの肝臓への）に影響を与え、調節し、減少させ、阻害し、及び／又は予防することを目的とすることができる。（例えば、Lucero OM, Dawson DW, Moon RT, et al. A re-evaluation of the "oncogenic" nature of Wnt/beta-catenin signaling in melanoma and other cancers. Curr Oncol Rep 2010, 12, 314-318; Liu Wei; Le Anne; Hancock Chad; Lane Andrew N; Dang Chi V; Fan Teresa W-M; Phang James M. Reprogramming of proline and glutamine metabolism contributes to the proliferative and metabolic responses regulated by oncogenic transcription factor cMYC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2012, 109(23), 8983-8988; and Tong, Xuemei; Zhao, Fangping; Thompson, Craig B. The molecular determinants of de novo nucleotide biosynthesis in cancer cells. Curr. Opin. Genet. Devel. 2009, 19(1), 32-3を参照されたい）。

【0076】

例示的な実施形態
以下の実施形態は例示的なものであり、クレームされた主題事項の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【0077】

実施形態１．次の式の化合物又は解離型、双性イオン型若しくはその塩。

【0078】

【化6】

【0079】

式中、α炭素とε炭素の間、又はα炭素とβ炭素の間に二重結合が存在し、Ｒ^１及びＲ^２の各々は、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、及びＩのようなハロゲンから独立して選択される。

【0080】

実施形態２．アンモニウム部分及びカルボキシレート部分を含む双性イオン形態の実施形態１に記載の化合物。

【0081】

実施形態３．二重結合がα炭素とε炭素との間にある、実施形態１に記載の化合物。

【0082】

実施形態４．二重結合がα炭素とβ炭素の間にある、実施形態１に記載の化合物。

【0083】

Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つがＦである、実施形態１に記載の化合物。

【0084】

実施形態６．化合物が、アンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施形態に５記載の化合物。

【0085】

実施形態７．アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施形態６に記載の化合物。

【0086】

実施形態８．薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中の実施形態１に記載の化合物。

【0087】

実施形態９．式の実施形態１の化合物：

【0088】

【化7】

【0089】

式中、Ｒ^１及びＲ^２のうちの少なくとも１つがＦである。

【0090】

実施形態１０．Ｒ^１及びＲ^２の各々がＦである、実施形態９に記載の化合物。

【0091】

実施形態１１．以下の式である実施形態１の化合物。

【0092】

【化8】

【0093】

実施形態１２．以下の式である実施形態１の化合物。

【0094】

【化9】

【0095】

実施形態１２．化合物がアンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施形態９に記載の化合物。

【0096】

実施形態１４．アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施形態１３に記載の化合物。

【0097】

実施形態１５．薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中の実施形態９に記載の化合物。

【0098】

実施形態１６．化合物がアンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施形態１１又は１２に記載の化合物。

【0099】

実施形態１７．アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施形態１６に記載の化合物。

【0100】

実施形態１８．薬学的に許容される担体成分を含む医薬組成物中の実施形態１１又は１２に記載の化合物。

【0101】

実施形態１９．（ｉ）実施形態１の化合物；及び（ｉｉ）薬学的に適切な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【0102】

実施形態２０．（ｉ）実施形態９の化合物；及び（ｉｉ）薬学的に適切な担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【0103】

実施形態２１．（ｉ）実施形態１１又は１２の化合物；及び（ｉｉ）薬学的に適した担体、希釈剤又は賦形剤を含む、医薬組成物。

【0104】

実施形態２２．ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）活性を調節する方法であって、実施形態１の化合物を、ｈＯＡＴを含む培地と接触させることを含み、ここで、該化合物は、ｈＯＡＴ活性を調節するのに十分な量で存在する、方法。

【0105】

実施形態２３．二重結合がα炭素とε炭素の間にある、実施形態２２に記載の方法。

【0106】

実施形態２４．二重結合がα炭素とβ炭素の間にある、実施形態２２に記載の方法。

【0107】

実施形態２５．Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つがＦである、実施形態２２に記載の方法。

【0108】

実施形態２６．化合物がアンモニウム置換基、カルボキシレート置換基、及びそれらの組み合わせから選択される置換基を含む塩である、実施形態２２に記載の方法。

【0109】

実施形態２７．アンモニウム塩がプロトン酸の共役塩基である対イオンを有する、実施形態２６に記載の方法。

【0110】

実施形態２２．接触がインビボである、実施形態２２に記載の方法。

【0111】

実施形態２９．ヒトがんによって発現されるｈＯＡＴの活性を低下させる方法であって、ｈＯＡＴを発現するがんと、実施形態１の化合物を接触させることを含み、ここで、該化合物はｈＯＡＴ活性を低下させるのに有効な量で存在する、方法。

【0112】

実施形態３０．二重結合がα炭素とε炭素との間にある、実施形態２９に記載の方法。

【0113】

実施形態３１．二重結合がα炭素とβ炭素の間にある、実施形態２９に記載の方法。

【0114】

実施形態３２．Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つがＦである、実施形態２９に記載の方法。

【0115】

実施形態３３．化合物が医薬組成物中に提供される、実施形態３２記載の方法。

【0116】

実施形態３４．接触がインビボである、実施形態３３に記載の方法。

【0117】

実施形態３５．接触が、それを必要とするヒト対象との接触である、実施形態３４に記載の方法。

【0118】

実施形態３６．実施形態１の化合物の治療有効量を対象に投与することを含む、それを必要とする対象におけるがんを治療するための方法。

【0119】

実施形態３７．二重結合がα炭素とε炭素の間にある、実施形態３６に記載の方法。

【0120】

実施形態３８．二重結合がα炭素とβ炭素の間にある、実施形態３６に記載の方法。

【0121】

実施形態３９．Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つＦであるが、実施形態３６に記載の方法。

【0122】

実施形態４０．化合物が式の化合物である、実施形態３６に記載の方法

【0123】

【化10】

【0124】

実施形態４１．化合物が以下の式：

【0125】

【化11】

【0126】

〔式中、Ｒ^１及びＲ^２の少なくとも１つがＦである〕
の化合物又はその塩である、実施形態３６に記載の方法。

【0127】

実施形態４２．Ｒ^１及びＲ^２のそれぞれがＦである、実施形態３６に記載の方法。

【0128】

実施形態４３．がんがヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ）の発現又は過剰発現によって特徴付けられる、実施形態３６に記載の方法。

【0129】

実施形態４４．がんが肝細胞がんである、実施形態３６記載の方法。

【0130】

実施形態４５．がんが非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である、実施形態３６に記載の方法。

【実施例】

【0131】

以下の実施例は例示的なものであり、クレームされた主題事項の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。以下の非限定的な実施例及びデータは、開示された化合物、組成物、及び方法に関連する種々の態様及び特徴を例示し、これには、限定されるものではないが、肝細胞がん（ＨＣＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む細胞増殖性疾患及び障害などの、ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼ活性のｈＯＡＴ活性、発現又は過剰発現、及び／又は低下に関連する疾患及び障害の治療が含まれる。本発明の有用性は、それとともに使用できるいくつかの化合物及び組成物の使用を通して例示されているが、本発明の範囲に相応するように、同等の結果が種々の他の化合物を用いて得られることは、当業者には理解されるであろう。

【0132】

実施例１
タイトル－ヒトオルニチンアミノトランスフェラーゼの選択的機構に基づく不活性化剤、ＳＳ－１－１４８の発見とメカニズム研究
導入
ヒトオルニチンδ－アミノトランスフェラーゼ（ｈＯＡＴ；ＥＣ２．６．１．１３）は２つの共役アミノ基転移反応を触媒するピリドキサール－５’－リン酸（ＰＬＰ）依存性酵素であり、Ｌ－オルニチン（Ｌ－Ｏｒｎ）を変換してＬ－グルタミン酸－γ－セミアルデヒド（Ｌ－ＧＳＡ）を後半反応におけるα－ケトグルタル酸（α－ＫＧ）からのＬ－グルタミン酸（Ｌ－Ｇｌｕ）の生成との前半反応において生成する（図１Ａ）^１。得られた中間体Ｌ－ＧＳＡはΔ１－ピロリン－５－カルボン酸（Ｐ５Ｃ）の自発平衡種であるが、Ｐ５ＣはＰ５Ｃレダクターゼ（ＰＹＣＲ）によって触媒されるＬ－プロリンを与えることができる^２。一方、生成されたＬ－Ｇｌｕはピロリン－５－カルボキシラートシンターゼ（Ｐ５ＣＳ）によってもＰ５Ｃに変換され、プロリン代謝に関与する（図１Ａ）^２。プロリン生合成は、プロリン消費の加速、ヒドロキシプロリン蓄積、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）レベルの増加及びＨＣＣの予後不良との相関を特徴とする、肝細胞がん（ＨＣＣ）のヒト腫瘍組織における最も実質的に変化したアミノ酸代謝として同定された^３。さらに、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）はＬ－ＧｌｕのＬ－グルタミン（Ｌ－Ｇｌｎ）への変換を触媒する^４。Ｌ－Ｇｌｎは、がん細胞が同化過程を支持するために高度に必要とされ、細胞増殖を促進する。

【0133】

ＨＣＣは主な肝臓悪性腫瘍であり、世界中でがん関連死亡の最も一般的な原因の１つである。著者らの以前の研究は、ＤＮＡマイクロアレイ解析により同定されたＰｓａｍｍｏｍｙｓ ｏｂｅｓｕｓ（サンドラット）由来の自然発生ＨＣＣ発達肝臓における７つの過剰発現遺伝子の１つとしてＯＡＴ遺伝子を同定した^５。さらに、選択的ｈＯＡＴメカニズムに基づく不活化剤（ＭＢＩ）ＢＣＦ_３（１）の処理（０．１及び１．０ｍｇ／ｋｇ；ＰＯ）は、ＨＣＣマウスモデルにおいて血清ＡＦＰレベルを著しく低下させ、腫瘍増殖を阻害し、薬理学的選択的ｈＯＡＴ阻害の抗腫瘍効果を強調した^５。ＭＢＩは、最初は標的酵素の代替基質として作用し、次に、特異的共有結合修飾、強結合静電相互作用、又はその他の機能的に不可逆的な阻害を介して酵素をさらに不活性化することができる活性種に変換される分子の一種である^６－７。ＭＢＩは、典型的には、標的酵素の活性部位との最初の結合の前には反応せず、それによって、通常、顕著な標的特異性及び選択性を示す^８。全体として、ｈＯＡＴはＨＣＣの潜在的治療標的と考えられ、ｈＯＡＴを選択的に不活化することは、有効なＨＣＣ治療を発見するための新しい機会を提供する可能性がある。

【0134】

しかし、ｈＯＡＴの選択的ＭＢＩを発見するための主要な課題は、他のアミノトランスフェラーゼ^６、特にｈＯＡＴと高い構造的類似性を有するγ－アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ－ＡＴ）に対する不可逆的阻害を克服することである^１。ホモ二量体構造の活性部位ポケットには２つの有意差しかない。ｈＯＡＴのＴｙｒ８５とＴｙｒ５５はそれぞれＧＡＢＡ－ＡＴのＩｌｅ７２とＰｈｅ３５１^＊に置き換わっている（図２）^１。さらに、Ｉｌｅ７２及びＰｈｅ３５１^＊は、ｈＯＡＴと比較してＧＡＢＡ－ＡＴの活性部位がわずかに狭いが疎水性が高いことに関与している。対照的に、Ｔｙｒ５５のヒドロキシル基は基質の荷電Ｃ－２アミノ基と相互作用する水素結合受容体として働くが、Ｔｙｒ８５は基質特異性の重要な決定因子であり、かさ高い基質を採用するためにコンホメーション的に柔軟である^１。

【0135】

これら２つのアミノトランスフェラーゼ間の高い類似性に従い、ｈＯＡＴに対する予備的スクリーニングを、著者らのストックＧＡＢＡ－ＡＴ阻害剤を用いて以前に行った^５。弾頭としてビス（トリフルオロメチル）基を有するＢＣＦ_３（１、図１Ｂ）と呼ばれるシクロペンタンベースの類似体は、ｈＯＡＴの選択的ＭＢＩであると同定されたが、ＧＡＢＡ－ＡＴに対するｍｍｏｌの可逆的阻害のみを示した。最近の機構的研究は、そのトリフルオロメチル基の１つがフッ化物イオン脱離を起こし、リガンドが共役付加を介して触媒Ｌｙｓ２９２を共有結合的に修飾することを明らかにした（スキーム１Ａ）^９－１０。立体的なかさばるビス（トリフルオロメチル）基は、ＧＡＢＡ－ＡＴの比較的狭いポケットにアクセスするのが容易ではなく、リガンドと酵素との間の最初の結合ポーズに影響を及ぼし、これがＧＡＢＡ－ＡＴに対する可逆的阻害の原因である可能性があると考えられる。ＢＣＦ_３は、上述のようにインビボで有効であることが実証されており、ＨＣＣ患者由来の異種移植（ＰＤＸ）モデルにおける広範なＩＮＤ標識毒性評価及び有効性試験で検討されている。シクロヘキセンベースの類似体ＷＺ－２－０５１（２、図１Ｂ）は、拡大環系及びジフルオロ基を有する^１１。ＷＺ－２－０５１は、ＢＣＦ_３と比較してｈＯＡＴに対する不活化効率（ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ比により定義）が２３倍向上したが、ＧＡＢＡ－ＡＴより１３．３倍選択性を示した。その後の機構的研究は、ＷＺ－２－０５１が２段階フッ化物イオン脱離を受け、最後に付加－芳香族化メカニズム（スキーム１Ｂ）を介してｈＯＡＴを不活性化することを明らかにした^１１。選択的ｈＯＡＴ不活性化剤のさらなる例は、ｈＯＡＴ基質Ｌ－Ｏｒｎの構造及び非選択的ＧＡＢＡ－ＡＴ不活性化剤ＡＦＰＡの構造に刺激された５－ＦＭＯｒｎ（３）であり^１２、三元付加物を形成することによってエナミン経路を介してｈＯＡＴを不活性化する（スキーム１Ｃ）^１３。

【0136】

【化12】

【0137】

５－ＦＭＯｒｎのα－アミノ基はｈＯＡＴ結晶錯体（ＰＤＢ侵入２ＯＡＴ）においてＴｙｒ５５のフェノール基と強い水素結合を形成することに留意すべきである^１４。さらに、ＢＣＦ_３（ＰＤＢエントリー６ＯＩＡ）及びＷＺ－２－０５１（ＰＤＢエントリー６Ｖ８Ｃ）とのｈＯＡＴ結晶錯体におけるそれらのカルボキシラート基とＴｙｒ５５の間の水素結合が観察され^９，１１、それにより、Ｔｙｒ５５との相互作用がリガンド特異性及び選択性において重要な役割を果たすことが示された。しかし、公表されているｈＯＡＴ不活化剤のうち、ｈＯＡＴに対する強力な不可逆的阻害、ＧＡＢＡ－ＡＴに対する弱い可逆的阻害（Ｋ_ｉ＝４．２ｍＭ）、及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐ－ＡＴ）及びアラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａ－ＡＴ）に対する阻害を最大４ｍＭまで示さず、有望なｈＯＡＴ選択性をもたらす^５。従って、ｈＯＡＴの新規選択的ＭＢＩを発見することは、ＨＣＣの潜在的治療アプローチとしてのｈＯＡＴ不活化剤の研究を促進するであろう。

【0138】

２０００年に、（１Ｒ，４Ｓ）－４－アミノ－３，３－ジフルオロシクロペンタンカルボン酸（４，図２Ｃ）はＧＡＢＡ－ＡＴに対する可逆的阻害剤であることがわかった（Ｋ_ｉ＝０．１９ｍＭ）^１５。１５年後、それはさらにｈＯＡＴ不活化剤であることが証明された^５。しかしながら、化合物４はｈＯＡＴに対して高い結合親和性（Ｋ_Ｉ＝７．８ｍＭ）を示し、ｈＯＡＴに対して低い最高不活性化速度（ｋ_{ｉｎａｃｔ}＝０．０２分^－１）を示し、最終的には中程度の不活性化効率（ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ＝０．００３分^－１ｍＭ^－１）を引き起こし、不活性化及びターンオーバーメカニズムの解明には限界がある。

【0139】

本技術は、高度に強力で選択的なｈＯＡＴ不活性化剤であることが実証されている４のシクロペンタン環系に追加の二重結合を組み込むことによって、ＳＳ－１－１４８（６）を含む新規なシクロペンテン系類似体を提供する。結晶化、タンパク質及び分子質量分析、過渡状態測定、及び計算シミュレーションを利用した機構研究により、ＳＳ－１－１４８の新規非共有不活性化機構を明らかにした。

【0140】

結果と考察
ジフルオロ基を有するシクロペンテン類似体５及び６の合成
二重結合を取り込むことは、不活性化効率を改善するための効果的な戦略であることが実証されており、これは、最初の外部アルジミンの立体配置及びα，β－不飽和カルボキシラートによる補助プロトンの酸性度に影響する^{１６－１７}。したがって、このアプローチをより強力なｈＯＡＴ不活性化剤の開発に適用するために、ジフルオロ基を有するシクロペンテン系類似体５及び６を、親化合物４（図２Ｃ）の構造に基づいて設計した。

【0141】

スキーム２．４及び５への合成経路^ａ。試薬及び条件。（ａ）ｉ）ｐ－アニシルアルコール、濃ＨＣｌ、ｒｔ；ｉｉ）ＮａＨ、ＴＢＡＩ、ＴＨＦ／ＤＭＦ（１０：１）、０℃－ｒｔ；（ｂ）ＤＢＤＭＨ、Ａｃ_２Ｏ、ｒｔ；（ｃ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ、ｒｔ；（ｄ）（ＣＯＣｌ）２、ＤＭＳＯ、ＴＥＡ、ＴＨＦ、-７８℃－ｒｔ；（ｅ）Ｂｕ_３ＳｎＨ、ＡＩＢＮ、ベンゼン、還流；（ｆ）Ｄｅｏｘｏ－Ｆｌｕｏｒ（トルエン中２．７Ｍ）、ＴＨＦ、１２０℃（ＭＷ）；（ｇ）セリックアンモニウム硝酸塩、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ、ｒｔ；（ｈ）４Ｎ ＨＣｌ、ＡｃＯＨ、７０℃；（ｉ）ｉ）ＥｔＯＨ中ＨＣｌ（１．２Ｍ）、７０℃；ｉｉ）Ｂｏｃ_２Ｏ、ＴＥＡ、ＤＣＭ、ｒｔ；（ｊ）ＰｈＳｅＣｌ、ＫＨＭＤＳ（３．０当量、トルエン中０．５Ｍ）、-７８℃－ｒｔ；（ｋ）４Ｎ ＨＣｌ、ＡｃＯＨ、７０℃。

【0142】

【化13】

【0143】

化合物５を製造するための合成経路は、（１Ｒ）－（－）－２－アザビシクロ［２．２．１ヘプト－５－エン－３－オン（７；ビンスラクタム^１８；ＣＡＳ＃：７９２００－５６－９）から開始し、以前に開発した手順に従って鍵となる二環式中間体９を与える^１５。次に、９のアセチル基を酸性条件下でヒドロキシル基に変換し、次にＳｗｅｒｎ酸化し、ケトン中間体１１を得た。その後、文献の手順に基づき、脱水素反応により１１の橋頭位のブロモ基を水素に置き換え、Ｂｕ_３ＳｎＨ／ＡＩＢＮ条件下で１２を生成させた^１５。中間体１２をさらにマイクロ波条件下でＤｅｏｘｏ－Ｆｌｕｏｒ試薬と反応させて、ジフルオロ中間体１３を得た。次に、１３に硝酸アンモニウムセリウム（ＣＡＭ）を用いてＰＭＢ脱保護を行い、得られたラクタム１４をＨＣｌ／ＥｔＯＨで処理して還流条件下でエチルエステルシクロペンタンを得た。Ｂｏｃ保護基の導入に従い、中間体１５を得た。興味深いことに、フォローアップα－脱離反応のためにＫＨＭＤＳ（３．０当量）条件下で１５のカルボキシラート基のα－位置にセレネニル基を有する１５の中間体を調製しようとしたとき、α、ε－共役カルボキシラート基を有する中間体１６を唯一の生成物として直接得た^１６。１Ｄ及び２Ｄ ＮＭＲを行い、１６の構造を検証した。最終的に、酸性条件下での脱保護後に、新しいシクロペンテン系類似体５を適宜得た。親シクロペンタンベースの類似体４も中間体１４から調製し、容易に１段階酸性加水分解を行い、その後の動態研究で新しい類似体及びＢＣＦ_３と共に評価した。

【0144】

スキーム３．６ａへの合成経路^ａ。試薬及び条件。（ａ）ｍ－ＣＰＢＡ、ＣＨＣｌ_３、還流；（ｂ）ＢＦ_３・ＯＥｔ２、ＡｃＯＨ、ＤＣＭ、ｒｔ；（ｃ）ＭＯＭＣｌ、ＤＩＰＥＡ、ＤＣＭ、ｒｔ；（ｄ）Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ／Ｈ_２Ｏ、ｒｔ；（ｅ）（ＣＯＣｌ）２、ＤＭＳＯ、ＴＥＡ、ＴＨＦ、-７８℃－ｒｔ；（ｆ）Ｄｅｏｘｏ－Ｆｌｕｏｒ（トルエン中２．７Ｍ）、ＴＨＦ、１２０℃（ＭＷ）；（ｇ）セラミックアンモニウム硝酸塩，ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ、ｒｔ；（ｈ）ｉ）ＨＣｌ（ＭｅＯＨ中１．２Ｍ）、８５℃、シール；ｉｉ）Ｂｏｃ_２Ｏ、ＭｅＯＨ、ｒｔ；（ｉ）Ｂｕｒｇｅｓｓ試薬、ＴＨＦ、７０℃；（ｌ）４Ｎ ＨＣｌ、ＡｃＯＨ、７０℃。

【0145】

【化14】

【0146】

６を調製する合成経路は、ＰＭＢ保護ビンスラクタム８からの重要な二環中間体２０の合成から出発して、最近発表された効率的な手順に従った^１。次に、２０のヒドロキシル基をＳｗｅｒｎ酸化によりケトン中間体２１に変換した。ジフルオロ中間体２２は、上記と同じフッ素化条件によって得られた。さらに、２２のＰＭＢ群をＣＡＭ条件下で除去し、続いてラクタム加水分解及びシクロペンタン中間体２４を得るＢｏｃ保護を行った。２４のメチルカルボキシレート基のβ位のヒドロキシル基を還流条件下でＢｕｒｇｅｓｓ試薬^{１９－２０}を用いて脱水し、α、β－共役カルボキシレート基を含むシクロペンテン中間体２５を形成した。最終生成物６を、従って、上記の脱保護条件に従って得た。

【0147】

類似体４～６の反応速度論的研究。表１の速度論的結果は、３つのジフルオロベースの化合物４～６すべてがｈＯＡＴに対して不可逆的阻害を示したが、ＧＡＢＡ－ＡＴに対しては可逆的阻害を示し、それらが選択的ｈＯＡＴ不活性化剤であることを示している。さらに、ｈＯＡＴの高ｍｍｏｌ結合親和性（Ｋ_Ｉ）を示した４及び５と比較して、６は有意な改良を示した（ＫＩ＝０．０６ｍＭ）。分配比の決定及びフッ化物イオン放出の結果（表１）は、４及び５の大部分が、大量のフッ化物イオンを放出し、その高い結合親和性をもたらす一方で、不活性化経路よりもむしろ代替ターンオーバー経路に関与することを明らかにした。一方、６は４及び５に対して最高速度定数（ｋ_{ｉｎａｃｔ}）を示し、それにより親化合物４に対して６の優れた不活化効率（ｋ_{ｉｎａｃｔ}／Ｋ_Ｉ）をもたらした（１．３３３対０．００３分^－１ｍＭ^－１；４４４倍の改善）。さらに、ＧＡＢＡ－ＡＴに対するシクロペンテンベースの５及び６の阻害活性は、シクロペンタンベースの４よりも約１０倍弱く、ＧＡＢＡ－ＡＴよりも高い選択性を示唆することも注目された。ＳＳ－１－１４８と命名された化合物６は、前臨床段階ＢＣＦ_３と比較してＧＡＢＡ－ＡＴに対する可逆的阻害を保持しながら、ｈＯＡＴに対して同等の不活性化効率を示した。ＳＳ－１－１４８も１０ｍＭまでＡｓｐ－ＡＴとＡｌａ－ＡＴに対して顕著な阻害を示さなかった。したがって、ｈＯＡＴにおけるＳＳ－１－１４８の潜在的不活性化とターンオーバーメカニズムの解明は興味深い。

【0148】

【表1】

【0149】

ＳＳ－１－１４８の不活化機構経路案（６）。他の関連するＧＡＢＡ－ＡＴ／ｈＯＡＴ不活化剤のこれまでの機構的研究に基づいて、３つの可能な経路が最初に提唱され^７，１１、スキーム４にまとめられている。不活性化の開始時に、ＳＳ－１－１４８は内部アルジミンＬｙｓ２９２－ＰＬＰからＰＬＰ部分を捕捉し、外部アルジミンＭ１を形成した。その後、Ｍ１は脱プロトン化を行ってキノノイド種Ｍ２を形成し、続いてフッ化物イオン脱離段階を経て、以下の３つの経路で共通の中間体Ｍ３が得られた。経路ａは、シクロヘキセンベースの類似体ＷＺ－２－０５１に基づく最近の知見に基づいて提案された^１１。中間体Ｍ３の求電子性Ｃ_δ位置はＬｙｓ２９２によって攻撃され、共役付加を介して共有結合（Ｍ４）を形成した。キノノイド種Ｍ４は、第２のフッ化物イオン脱離が起こり、最終付加物Ｍ５（スキーム４）を与える。経路ｂは、ＧＡＢＡ－ＡＴにおけるＣＰＰ－１１５及びＯＶ３２９の不活性化メカニズムに刺激される。このメカニズムは、活性部位のカルボキシラートとアルギニン残基との間に強い静電的相互作用をもたらす水を介したメカニズムによって達成される^{１６，２１}。Ｌｙｓ２９２によって触媒される水分子は中間体Ｍ３の求電子性Ｃ_δ位置を攻撃し、次に、ｈＯＡＴ中の残基との共有結合を確立するのではなく、エノール／カルボニル基（Ｍ７）を与える別のフッ化物イオン脱離工程を行う。経路ｃは、典型的なエナミンメカニズムに従って提案される^２２。Ｌｙｓ２９２はＣ_δ位置の代わりにアルジミンのＣ_４’位置を攻撃し、エナミン中間体Ｍ９を放出し、これは内部アルジミン（ＰＬＰ－Ｌｙｓ２９２）のイミン結合を再結合し、共有結合付加物Ｍ１０を生成する。

【0150】

【化15】

【0151】

ｈＯＡＴ及びＧＡＢＡ－ＡＴを用いたＳＳ－１－１４８の妥当な代謝回転機構。ＳＳ－１－１４８は比較的高い分配比（３３．９倍、表１及び図９）を示し、ＳＳ－１－１４８の３４．９当量が、化合物の各等価物について活性部位当たりに転倒し、不活性化に至ったことを示した。さらに、不活性化事象毎に３３．９±０．８当量のフッ化物イオン（表１）が放出されることから、一次代謝回転経路は１つのフッ化物イオン除去段階のみで起こることが示唆される。以前、静電ポテンシャル（ＥＳＰ）電荷計算を行い、フッ素原子がエナミン中間体（Ｍ８の構造に類似）の求核性を明らかに減少させ^１１、エナミン付加の発生を妨げることを示した。ｈＯＡＴにおけるＳＳ－１－１４８のメタボロミクス研究（図３Ａ）は、一次代謝産物の分子量とフラグメンテーションが、エナミン中間体Ｍ８からの対応する加水分解生成物であるスキーム５のＭ１０の構造と一致することを示した。したがって、スキーム４の経路ｃはｈＯＡＴにおけるＳＳ－１－１４８の主要な代謝回転経路であると考えた。一方、ＧＡＢＡ－ＡＴ中のＳＳ－１－１４８の主要代謝物が同定された。図３Ｂに示す分子量及びフラグメンテーションは、ＳＳ－１－１４８が基質として作用し、ジフルオロ基を有するケトンＭ１１を生成することを示唆する（スキーム５）。

【0152】

非不活化経路の主要中間体を捕獲するために、ｈＯＡＴホロ酵素結晶を用いてＳＳ－１－１４８溶液を用いた１時間浸漬実験を行った。ｈＯＡＴ構造は、以前に報告された構造（ＰＤＢエントリー１ＯＡＴ）からの分子置換によって解いた。ＳＳ－１－１４８浸漬構造の空間群はＰ ３_２ ２ １であり、構造はタンパク質単量体の３コピーを１つの非対称ユニットに含むことが分かった。図４Ａ及び図１１に示す結晶構造（ＰＤＢエントリー７ＬＫ１）は、ＰＬＰがＳＳ－１－１４８に共有結合していることを示し、一方、浸漬結晶ではＬｙｓ２９２とＳＳ－１－１４８の間の共有結合が明らかになった。Ｌｙｓ２９２とＳＳ－１－１４８の間の共有結合は、以前のｈＯＡＴ／配位子結晶では観察されなかった安定なゲム－ジアミン種を表す^{９－１１，２３}。この観察はさらに、エナミン中間体Ｍ８のゲムジアミン前駆体（Ｍ１２又はＭ１３、スキーム５）を検証した。さらに、ＳＳ－１－１４８のカルボキシラート基の位置が異なる浸漬結晶において、この中間体の２つの構造立体配座が観察された。第一の立体配座はＴｙｒ５５とＳＳ－１－１４８のカルボキシラートの間に水素結合を形成し、第二の立体配座はＡｒｇ４１３と塩橋を形成する。中間体構造の二つの選択的立体配座に関する結論は、Ａｒｇ４１３とＴｙｒ５５の近傍の正の密度と、それ自体の単一立体配座に対する比較的高いＢ因子に基づいていた。別の説明としては、タンパク質の活性部位と異なるやり方で相互作用する可能性のある、２つの異なる、しかし構造的に類似した中間体種が挙げられる。

【0153】

【化16】

【0154】

全体的に、証拠によれば、ｈＯＡＴ及びＧＡＢＡ－ＡＴにおけるＳＳ－１－１４８の主要代謝回転機構はそれぞれスキーム５で提唱されている。Ｌｙｓ２９２からＰＬＰリガンドを捕捉した後、Ｍ１は脱プロトン化を受け、得られたキノノイドＭ２はｈＯＡＴ中でフッ化物イオン脱離（経路ａ；スキーム５）を起こし、モノフッ素を有するアルジミン中間体Ｍ３を与える。Ｍ３の大部分は、Ｃ４’位置でＬｙｓ２９２によって攻撃され、最初のゲム－ジアミンＭ１２を形成し、続いてプロトン移動により第２のゲム－ジアミンＭ１３が得られ^{２４－２５}、さらにエナミン代謝物Ｍ８及び内部アルジミンに変換される。最終的に、Ｍ８はｈＯＡＴ中のＳＳ－１－１４８の主要代謝産物としてケトンＭ１０に加水分解する。一方、キノノイド中間体Ｍ２は電子伝達を受けてケチミンＭ１４を生成するだけで、ＧＡＢＡ－ＡＴの主要代謝物としてＰＭＰとＭ１１を放出する。ＧＡＢＡ－ＡＴにおけるＳＳ－１－１４８の挙動は、フッ化物イオンを除去せずにアミノ転移反応に似ており、ＧＡＢＡ－ＡＴに対するその可逆的阻害と一致している。ｈＯＡＴとＧＡＢＡ－ＡＴとの間の構造的相違により、上述の既知の選択的ｈＯＡＴ不活性化剤（１～３）は、ＧＡＢＡ－ＡＴよりもリガンド特異性及び選択性を改善するためにかさ高い部分又はα－アミノ基を含むことに留意されたい。しかし、ＳＳ－１－１４８の選択性は基質ＧＡＢＡとの競合関係に関連している。

【0155】

ｈＯＡＴによるＳＳ－１－１４８の考えられる不活性化機構。ＳＳ－１－１４８によるｈＯＡＴ阻害の不可逆性を、過剰なＰＬＰとα－ＫＧからなる緩衝液に対して４８時間までの時間依存透析実験により評価した（図１０）。ｈＯＡＴの残りの活性は変化せず、ＳＳ－１－１４８がｈＯＡＴ不可逆阻害剤であることを示した。不活化反応における最終生成物の構造を明らかにするために、著者らは過剰量のＳＳ－１－１４８とｈＯＡＴを共結晶化した。結晶構造（ＰＤＢエントリ７ＬＫ０）は上記と同様の方法で解き、ＳＳ－１－１４８共結晶の空間群（図４Ｂ及び図１２）はＰ ３_１ １ ２であることが分かった。また、１つの非対称単位に３コピーのタンパク質単量体が含まれている。図４Ａに示す浸漬結晶構造と同様に、ＰＬＰは共結晶構造中のＳＳ－１－１４８部分に共有結合している。しかし、Ｌｙｓ２９２と最終生成物との間に共有結合は認められない。さらに、天然酵素（ｈｏｌｏ－ｈＯＡＴ）の公表された結晶構造において、Ａｒｇ４１３は一般的にＧｌｕ２３５と塩橋を形成し、これは異なる不活性化剤を有するｈＯＡＴのいくつかの共結晶に対して無傷であることが分かった^{１４，２３，２６}。ｈＯＡＴ／ＳＳ－１－１４８浸漬結果（図４Ａ）では、Ａｒｇ４１３－Ｇｌｕ２３５の塩橋は、１つの中間体とＡｒｇ４１３のカルボキシラートの間に代替塩橋が存在するために壊れた。興味深いことに、Ａｒｇ４１３－Ｇｌｕ２３５塩橋もｈＯＡＴ／ＳＳ－１－１４８共結晶中で切断されることが見出されたが、Ａｒｇ４１３と配位子間の直接的相互作用は観察されなかった。代わりに、Ａｒｇ４１３、Ｇｌｎ２６６、及び最終生成物は同じ水分子に水素結合している。さらに、リガンドの酸素基は、２．９Åの距離でＧｌｕ２３５との水素結合を示し（図４Ｂ）、これは、ｈＯＡＴポケット内のリガンドの安定化に寄与し得る。ｈＯＡＴ／ＳＳ－１－１４８共結晶中の配位子構造は、不活性化がスキーム４の経路Ｂに帰せられ、Ｍ７の構造に近い最終生成物（理論質量：３７０．０６Ｄａ）を生成することを示す。

【0156】

無傷タンパク質質量分析（無傷ＭＳ）は、ｈＯＡＴ不活化剤の不活化機構を解明するために以前に適用された^９，１１。ここでは、ＳＳ－１－１４８により完全に不活化されたｈＯＡＴ試料を用いた変性、無傷ＬＣ－ＭＳ（図５Ａ、右）実験を通して、ｈＯＡＴのわずか１６％が共有結合的に修飾され、３７０．０１Ｄａの質量シフトを導いた。ｈＯＡＴの大部分は未修飾のままであり（図５Ａ、上）、対照としての天然ｈＯＡＴと比較した（図５Ａ、下）。付加物質量（３７０．０１Ｄａ）は、非共有形態Ｍ７と平衡にあり得るゲムジアミンＭ１５（３７０．０６Ｄａ；スキーム６）の理論質量と同一であることが分かった。しかし、酵素が完全に不活性化されているこれらの条件下では、共有結合的に付加された酵素の存在量がより多くなると予想される。このように、この知見は、ｈＯＡＴとＳＳ－１－１４８の間の主要な非共有、不活性化メカニズムを支持した。

【0157】

天然タンパク質質量分析（天然ＭＳ）をさらに用いて、気相中に保存される溶液状態の非共有タンパク質相互作用を同定し、ｈＯＡＴ中のＳＳ－１－１４８生成物の結合を特性化した。図５Ｂに示される結果は、未修飾ｈＯＡＴが、理論的ａｐｏ－ｈＯＡＴ二量体より４５９Ｄａ大きい二量体（９２，７３７±２Ｄａ）として現れることを示す。この質量シフトは、二量体の２つの活性部位における２つのＰＬＰ結合内部アルジミン（４５９Ｄａシフトを観測；４６０Ｄａ理論的）と一致する。未修飾ｈＯＡＴのタンパク質分解形態（図５Ｂ、未修飾ｈＯＡＴ（^＊））も観察されたが、対照条件下でのみ観察された。対照的に、ＳＳ－１－１４８により完全に不活化された天然の二量体ｈＯＡＴ試料は、７４２Ｄａと７７８Ｄａの質量シフトに対応する９３、０２０±４Ｄａと９３、０５６±３Ｄａの２つの高量質量で観察された（図５Ｂ、ｈＯＡＴ＋ＳＳ－１－１－１４８（左））。塩付加物に起因する可能性のある、より大量の種が観察された（図５Ｂ、ｈＯＡＴ＋ＳＳ－１－１－１４８（左）（^＊））。未修飾、ａｐｏ－ｈＯＡＴ又はＰＬＰ結合ｈＯＡＴは観察されなかった。観測された９３，０２０±４Ｄａ質量は両方の活性部位（理論的には９３，０１８Ｄａ）におけるＭ７（３７０．０６Ｄａ）の理論質量と一致した。さらに、９３，０５６±３Ｄａの観測された質量はＭ７と両タンパク質鎖の活性部位水（理論的には９３，０５６Ｄａ）と一致し、最終生成物と共結晶構造で観察された主要な水分子を検証した（図４Ｂ）。

【0158】

質量分析によるＳＳ－１－１４８－ｈＯＡＴ相互作用をさらに調べるために、高エネルギー衝突解離（ＨＣＤ）を未修飾に適用し、別々に処理したｈＯＡＴを用いてタンパク質－リガンド相互作用を解離し、酵素複合体からリガンドを放出した。サブタンパク質分解解離条件（ＨＣＤ ＮＣＥ：１５）下では、未修飾ｈＯＡＴでは質量欠損は観察されなかった（図１３）。しかし、これらの同じ解離条件下で、ＳＳ－１１４８不活化ｈＯＡＴについて２つの追加質量が生成された（図５Ｂ、ｈＯＡＴ＋ＳＳ－１－１－１４８（右））。ａｐｏ－ｈＯＡＴと一致する質量が４５％の相対存在量で観察された（観察：９２，２７５±４Ｄａ；理論：９２，２７８Ｄａ）。９２，５９７±５Ｄａの第２の質量が１００％の相対的存在量で観察された。以前に観察されたＭ７及び１つの水分子に結合した各活性部位と一致する二量体質量と比較して、この種は４５７Ｄａの質量欠損を有する。厳密には、存在量の大きな質量変化は、タンパク質二量体からの単一のＭ７±Ｈ_２Ｏ付加体の喪失（Ｍ７－ｈＯＡＴの理論質量：９２，６４８Ｄａ；１Ｍ７－ｈＯＡＴ＋Ｈ_２Ｏの理論質量：９２，６６６Ｄａ）によって説明できない。しかし、ＨＣＤ活性化を介して観察された質量欠陥は、両活性部位からのＰＬＰの消失によって説明できるが、活性部位水及びＳＳ－１－１４８部分は保持される（観察：４５７Ｄａ；理論的：４６０Ｄａ）。同一の衝突エネルギーが修飾されていないタンパク質二量体からＰＬＰを放出しないことを考えると、この発見は驚くべきことである。しかしながら、ＳＳ－１－１４８と水のＴｙｒ５５、Ｇｌｕ２３５、Ｇｌｎ２６６とＡｒｇ４１３への結合を同定した共結晶構造に基づいて、タンパク質安定性はＳＳ－１－１４８結合時に増加し、気相ではこれらの相互作用の遮断はＰＬＰの開裂に比べて好ましくない。

【0159】

天然ＭＳで観察されたアポ酵素がなく、ｈＯＡＴの約８４％が変性条件下でアポ酵素状態であったことから、結果は、非共有結合Ｍ７が不活性化後の第一形態である一方、共有結合Ｍ１５はＭ７と平衡状態にある小さな形態であることを示した。したがって、水媒介経路ｂ（スキーム４）から生成したＭ７は不活化後のＳＳ－１－１４８の最終生成物であると思われる。しかし、その高度に共役した構造を考えると、Ｍ７は互変異性化を起こしやすい。したがって、ＭＯＰＡＣ上でギプス自由エネルギー計算を行い、ｈＯＡＴの活性部位におけるＭ７及び関連する互変異性体の安定性を評価した。図１４に示された結果は、エノール形Ｍ７（ΔＧ^ｏ＝－２６．３６ｋｃａｌ ｍｏｌ^－１）と比較して、その対応するケトン（互変異性体５、ΔＧ^ｏ＝－４８．０７ｋｃａｌ ｍｏｌ^－１）及びケチミン（互変異性体８、ΔＧ^ｏ＝－４９．８９ｋｃａｌ－１）は、活性部位において比較的安定であることを示唆している。さらに、約２７５ｎｍでの吸光度を示す化学種が、その後の過渡状態測定（図７Ｃ）において最終生成物として決定され、それにより、吸光度がＳＳ－１－１４８の最終形態として４２０ｎｍで適切であることをすべての外部アルジミン（例えば、Ｍ７及び互変異性体５）を除外したことに留意すべきである。他方、上記の結果は、最終状態がゲムジアミン又はケチミンのようなものである一方、それらの典型的な吸光度は約３３０～３４０ｎｍに現れることを示している。文献によれば、プロトン化されたアルジミン及び脱プロトン化されたヒドロキシルを含むケトエナミン部分と比較して、ヒドロキシル及びアルジミン基の中性状態を有するエノリミンは、有意に低い吸収極大（４１０ｎｍ対３３０ｎｍ）を示す^３０。まとめると、Ｍ７と平衡状態にあるジェムジアミンＭ１５とＭ７から互変異性化されたケチミンＭ１８の両方は、それぞれＭ１６とＭ１９を形成するために電子移動の余分な段階を経る可能性がある。ゲムジアミンＭ１６とケチミンＭ１９の中性状態のために、それらの吸収極大は３３０ｎｍから２７５ｎｍに低下することができ、それにより過渡状態測定で観察された最終種の吸光度に一致する。

【0160】

全体として、ｈＯＡＴ中のＳＳ－１－１４８の不活性化経路をスキーム６にまとめた。最初の外部アルジミンＭ１はＬｙｓ２９２によって触媒される脱プロトン化を起こし、最初のキノノイドＭ２を生成する。フッ化物イオン脱離に続いて、Ｍ２からモノフルオロアルジミンＭ３を得る。Ｍ３の大部分（約９７％；分配比で決定）のＣ４’位置はＬｙｓ２９２によって攻撃され、エナミン代謝産物が放出され、それが加水分解して一次代謝産物としてケトンＭ１０になる（経路ａ；スキーム５及び６）。少量のＭ３（約３％）のＣ_δは水を介した求核攻撃（経路ｂ；スキーム６）を受け、第二のキノノイドＭ６が生成する。中間体Ｍ６はさらに別のフッ化物イオン脱離を起こしてＭ７を生成する。その後、少量のＭ７（約１６％）がゲムジアミン型（Ｍ１５）を介してＣ４’位置のＬｙｓ２９２に共有結合する（経路ｃ；スキーム６）。生成されたｇｅｍ－ジアミンＭ１５は、Ｍ７と平衡にあり得るが、一方、より安定な状態として中性のｇｅｍ－ジアミン形態１６を生成するために、さらに電子移動が起こり得る。一方、Ｍ７の大部分（～８４％）は互変異性化してより好ましいケチミンＭ１８となり、続いて電子移動が起こり、ケチミンＭ１９が一次最終生成物となる（経路ｄ；スキーム６）。

【0161】

【化17】

【0162】

ＳＳ－１－１４８により阻害されたｈＯＡＴの過渡状態測定。提案したメカニズムには種々の過渡状態が関与しているので、ＳＳ－１－１４８によるｈＯＡＴ阻害の速度論を捕捉するために、その後高速混合分光光度測定を行った。このアプローチは、ＰＬＰ依存性トランスアミナーゼ反応において連続的に蓄積する共役種を利用する^１０。ＳＳ－１－１４８で起こる阻害反応は、反応の進行の異なる段階で得られた上述のＸ線構造と組み合わせて解釈された（下記参照）。図６及び７に示す実験データは、ＳＳ－１－１４８とｈＯＡＴとの反応が複雑であることを示している。４つの識別可能な相が、少なくとも２つの平行反応経路の証拠で観察され（図６）、このことは、引き出された機構的結論は必然的に未決定のモデルから導かれることを示している。停止フロー装置のデッドタイム内で、ＳＳ－１－１４８とｈＯＡＴとの反応は、外部アルジミン（図７Ａ－Ｂ（Ａ））と一致するスペクトル（約４２０ｎｍ）を形成した。ＳＳ－１－１４８によるｈＯＡＴの滴定は、デッドタイムで形成されたアルジミンとおそらく相加的である第２の外部アルジミン寄与の蓄積の速度及び程度を調節した（図７Ａ－Ｂ（Ｂ））。第二の外部アルジミンは速度依存性を示し、二分子反応（６．２×１０^３Ｍ^－１ｓ^－１）を示す。このことは、ＳＳ－１－１４８がｈＯＡＴと少なくとも２つの経路で結合し、平行反応経路を生じることを示唆している（図６Ａ－Ｂ）。組み合わせた外部アルジミンスペクトルの強さは、０．４ｓ－１（図６Ａ－Ｂ及び７Ａ－Ｂ）におけるキノノノイド種（約５６０ｎｍ）のスペクトル転移特性の蓄積と共に部分的に減衰する。見かけのキノノイド種は、外部アルジミン遷移の同時及び部分的崩壊と共に形成され、第２の外部アルジミン蓄積とほぼ等しい振幅である。このことは、これらの化学種が同じ反応経路にあることを示唆している。

【0163】

スキーム６で提案された最初の外部アルジミンＭ１及び段階的フッ化物脱離工程の脱プロトン化は、典型的には、Ｅ１ＣＢメカニズム脱離と考えられることが報告されている^{３１－３２}。フッ素及びアルジミンのプロトン化窒素の電子求引効果は、脱離反応中に生成したカルバニオン状態を安定化することができる^{３２－３３}。一方、キノノノイド過渡状態Ｍ２は、第一及び第二の外部アルジミン（Ｍ１及びＭ３）の間に形成されると考えられる。しかし、ストップドフロー実験結果は、Ｍ１中の反ペリプレーナ水素とフッ素が、プロトンの喪失、フッ化物イオンの放出、及びより好ましいフッ化物除去経路としてのアルケンの生成と同時に異常なＬｙｓ２９２支援Ｅ２機構を受け^３１、単一過渡状態として第２の外部アルジミンＭ３を与えることを示唆する（経路ｅ；スキーム６）。この結果は、他の関連ＰＬＰ依存性アミノトランスフェラーゼ不活化剤の以前の機構的研究で実験的に観察されたことはない^１，７。

【0164】

キノノノイド吸光係数を約３０ｍＭ^－１ｃｍ^－１と仮定すると、観察されたキノノノイドの分数蓄積は１ｍＭ ＳＳ－１－１４８で全反応種の約２０％である。その後、キノノイドは０．０９ｓ^－１の速度で減衰し、一方、外部アルジミン種に帰属される残留遷移は広がり、持続する（図７Ａ－Ｂ（Ｄ））。キノノイドＭ６は、代謝回転（経路ａ；スキーム５）及び不活性化（経路ｂ；スキーム６）機構に基づいて観察できる最初のキノノイド種（約５６０ｎｍ）であると思われる。観測された最終相は０．００７ｓ^－１の速度定数で起こる。この段階では、図式６の最終生成物として提唱されたゲムジアミンＭ１６及びケチミンＭ１９と一致して、薬２７５ｎｍでの吸収強度の顕著な増加を伴う外部アルジミン崩壊の特徴が共役の喪失を示す（図７Ａ－Ｂ（Ｅ））。

【0165】

まとめると、これらのデータは、複数の異なる外部アルジミン種から成る支配的経路を支持しており、これらは最終的には共役性の低い生成物に分解する（代謝回転機構；経路ｅ；及びスキーム６）。また、最初の外部アルジミンを形成する第２の副経路は、よりゆっくりであるが、その後キノノイド中間体を経て分解し、非共役生成物を形成する（不活性化機構；経路ｂ－ｅ；スキーム６）。図７Ｃに示すデータは、各経路の割合がＳＳ－１－１４８の濃度に依存することを示している。高濃度のＳＳ－１－１４８はキノノイド種の蓄積を減少させるが、観察された蓄積と減衰の速度を変化させず、より迅速で優性な経路がより高いＳＳ－１－１４８濃度で酵素のより大きな画分を隔離することを示唆した。

【0166】

ＳＳ－１－１４８の共役アルケンの意義。ＳＳ－１－１４８（６）の不活性化及び代謝回転のメカニズムをよりよく理解した後、類似体４～６を比較するために計算を行った。本発明者らの以前の研究は、シクロペンタン環系に余分な二重結合を取り込むことがα、β－共役カルボキシラートを確立し、補助プロトンの酸性度の増加による脱プロトン化段階を促進し、速度定数を増加させることを明らかにした^{１６－１７}。２９８ＫにおけるＤＦＴ／Ｂ３ＬＹＰ法^３４を用いて理論的ｐＫａ計算を行い、ジフルオロ類似体４～６のＣγ位置におけるプロトンの酸性度を予測した（図２Ｃ）。図８Ａに示された結果は、α、β－共役カルボキシラート系を有するＰＬＰ結合ＳＳ－１－１４８（Ｍ１）のＣγ水素が３つの類似体の中で最も低いｐＫａ値を示し、一方、ＰＬＰ結合５（Ｍ１）中の対応するプロトンのｐＫａ値は、親シクロペンタン４（Ｍ１’）に対するＣ_α及びＣ_ε位置での導入二重結合により顕著に影響されないことを示唆する。これらの特徴的なｋ_{ｉｎａｃｔ}値（表１）を総合すると、これらの知見は、Ｃγ位置のより酸性の水素がＳＳ－１－１４８（Ｍ１）の最初の外部アルジミンを促進し、典型的なＥ１ＣＢ脱離反応よりもＥ２フッ化物イオン脱離段階を開始させ、それによりその改善された速度定数に寄与することを示唆する。

【0167】

分配比測定及びフッ化物イオン放出の結果（表１）は、４及び５が大量のフッ化物イオンを放出する一方で不活性化経路よりもむしろ主に第二代謝回転経路に関与することを明らかにした。電子密度マップ及びＥＳＰ電荷計算^１１（図８Ｂ）は、ＳＳ－１－１４８（６）の過渡状態Ｍ３におけるＣ_δの求電子性が対応する過渡状態４及び５（Ｍ３’は４、Ｍ３’は５）におけるそれよりもはるかに高く、Ｍ３のＣ_δ位置が他の２つの中間体におけるそれよりも反応性が高いことを示している。一方、Ｍ３’及びＭ３’’のアルジミン結合におけるＣ４’位置は、Ｍ３の結果よりもはるかに大きい同等の求電子性を示し、これは、Ｍ３’及びＭ３’’が触媒Ｌｙｓ２９２によって攻撃され、それらのターンオーバー経路をトリガし、最終的に４及び５の有意に高い分配比をもたらすことを示す。さらに、ｈＯＡＴにおけるさらなるメタボロミクス研究は、ｈＯＡＴにおけるＳＳ－１－１４８と同様に、シクロペンテン類似体５がその主要代謝物として単一フッ素を有するケトンを生成することを明らかにした（Ｍ５－１、図１５Ｂ）。対照的に、シクロペンタン４は、モノフッ化ケトン（Ｍ４－１、図１５Ａ）を形成するだけでなく、ヒドロキシル基を有するケトン代謝物（Ｍ４－２、図１５Ａ）を生成したが、これはシクロペンテン類似体のメタボロミクスの結果では検出されなかった。スキーム６のＳＳ－１－１４８の提案したメカニズムによれば、取り込まれた二重結合も共役系の安定化に重要な役割を果たすと考えられる。

【0168】

結論
以前は、（Ｓ）－３－アミノ－４，４－ジフルオロシクロヘックス－１－エンカルボン酸（ＷＺ－２－０５１，２）は共有結合付加－芳香族化メカニズムを介してｈＯＡＴを不活性化した（スキーム１Ｂ）。しかし、それでもＧＡＢＡ－ＡＴに対する明らかな無責任な阻害を示す。（Ｓ）－３－アミノ－４，４－ジフルオロシクロペンタ－１－エンカルボン酸（ＳＳ－１－１４８，６）は前臨床段階選択的ｈＯＡＴ不活化剤ＢＣＦ_３と同等の不活化効率を示すことが同定され、ＧＡＢＡ－ＡＴの可逆的阻害剤であることが実証された。速度論的研究及び計算により、シクロペンテン環中のＳＳ－１－１４８の共役アルケンが高いｈＯＡＴ不活性化効率を保持することを支持する証拠が得られた。浸漬結晶中のＬｙｓ２９２との一時的なゲム－ジアミン中間体共有結合と共結晶錯体中の安定な非共有結合最終生成物を捕捉するために、２つの結晶学的アプローチを行った。ｈＯＡＴ中のＡｒｇ４１３－Ｇｌｕ２３５の臨界塩架橋は両方の結晶錯体で破壊されることが分かった。さらに、天然／無傷のＭＳ実験は、ＳＳ－１－１４８の主要な不活性化機構としての非共有結合経路、及び非共有結合形態と平衡にあるゲム－ジアミン構造であり得る軽微な形態として観察される共有結合修飾をさらに支持する。最後に、停止流れ実験は、ＳＳ－１－１４８の最初の外部アルジミンが典型的なＥ１ＣＢ脱離反応の代わりに異常なＥ２フッ化物イオン脱離を起こし、単一過渡状態として第２の外部アルジミンを形成することを示唆した。包括的なメカニズム研究は、ＳＳ－１－１４８が主に水媒介メカニズムを介して非共有的にｈＯＡＴを不活性化することを示した。さらに、予備評価は、ＳＳ－１－１４８が良好なＤＭＰＫ特性（データは示さず）を示すことを示唆し、ＨＣＣのＰＤＸマウスモデルで検討中である。

【0169】

略語
ＡＦＰＡ、（Ｓ）－４－アミノ－５－フルオロペンタン酸；Ｂｏｃ_２Ｏ、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル；Ｄｅｏｘｏ－Ｆｌｕｏｒ、ビス（２－メトキシエチル）アミノ硫黄三フッ化物；ＤＭＰＫ、薬物代謝及び薬物動態；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＢＤＭＨ、１，３－ジブロモ－５，５－ジメチルヒダントイン；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＩＮＤ、治験中の新薬申請；ＰＯ、経口投与；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＴＥＡ、トリエチルアミン；ＴＢＡＩ、テトラ－ｎ－ヨウ化ブチルアンモニウム。

【0170】

参考文献
1. Lee, H.; Juncosa, J. I.; Silverman, R. B., Ornithine aminotransferase versus GABA aminotransferase: implications for the design of new anticancer drugs. Med Res Rev 2015, 35 (2), 286-305.
2. Tanner, J. J.; Fendt, S. M.; Becker, D. F., The Proline Cycle As a Potential Cancer Therapy Target. Biochemistry 2018, 57 (25), 3433-3444.
3. Tang, L.; Zeng, J.; Geng, P.; Fang, C.; Wang, Y.; Sun, M.; Wang, C.; Wang, J.; Yin, P.; Hu, C.; Guo, L.; Yu, J.; Gao, P.; Li, E.; Zhuang, Z.; Xu, G.; Liu, Y., Global Metabolic Profiling Identifies a Pivotal Role of Proline and Hydroxyproline Metabolism in Supporting Hypoxic Response in Hepatocellular Carcinoma. Clin Cancer Res 2018, 24 (2), 474-485.
4. Cadoret, A.; Ovejero, C.; Terris, B.; Souil, E.; Levy, L.; Lamers, W. H.; Kitajewski, J.; Kahn, A.; Perret, C., New targets of beta-catenin signaling in the liver are involved in the glutamine metabolism. Oncogene 2002, 21 (54), 8293-301.
5. Zigmond, E.; Ben Ya'acov, A.; Lee, H.; Lichtenstein, Y.; Shalev, Z.; Smith, Y.; Zolotarov, L.; Ziv, E.; Kalman, R.; Le, H. V.; Lu, H.; Silverman, R. B.; Ilan, Y., Suppression of Hepatocellular Carcinoma by Inhibition of Overexpressed Ornithine Aminotransferase. ACS Med Chem Lett 2015, 6 (8), 840-4.
6. Eliot, A. C.; Kirsch, J. F., Pyridoxal phosphate enzymes: mechanistic, structural, and evolutionary considerations. Annu Rev Biochem 2004, 73, 383-415.
7. Silverman, R. B., Design and Mechanism of GABA Aminotransferase Inactivators. Treatments for Epilepsies and Addictions. Chem Rev 2018, 118 (7), 4037-4070.
8. Pan, Y.; Gerasimov, M. R.; Kvist, T.; Wellendorph, P.; Madsen, K. K.; Pera, E.; Lee, H.; Schousboe, A.; Chebib, M.; Brauner-Osborne, H.; Craft, C. M.; Brodie, J. D.; Schiffer, W. K.; Dewey, S. L.; Miller, S. R.; Silverman, R. B., (1S, 3S)-3-amino-4-difluoromethylenyl-1-cyclopentanoic acid (CPP-115), a potent gamma-aminobutyric acid aminotransferase inactivator for the treatment of cocaine addiction. J Med Chem 2012, 55 (1), 357-66.
9. Moschitto, M. J.; Doubleday, P. F.; Catlin, D. S.; Kelleher, N. L.; Liu, D.; Silverman, R. B., Mechanism of Inactivation of Ornithine Aminotransferase by (1S,3S)-3-Amino-4-(hexafluoropropan-2-ylidenyl)cyclopentane-1-carboxylic Acid. J Am Chem Soc 2019, 141 (27), 10711-10721.
10. Butrin, A.; Beaupre, B. A.; Kadamandla, N.; Zhao, P.; Shen, S.; Silverman, R. B.; Moran, G. R.; Liu, D., Structural and Kinetic Analyses Reveal the Dual Inhibition Modes of Ornithine Aminotransferase by (1S,3S)-3-Amino-4-(hexafluoropropan-2-ylidenyl)-cyclopentane-1-carboxylic Acid (BCＦ_３). ACS Chemical Biology 2020.
11. Zhu, W.; Doubleday, P. F.; Catlin, D. S.; Weerawarna, P. M.; Butrin, A.; Shen, S.; Wawrzak, Z.; Kelleher, N. L.; Liu, D.; Silverman, R. B., A Remarkable Difference That One Fluorine Atom Confers on the Mechanisms of Inactivation of Human Ornithine Aminotransferase by Two Cyclohexene Analogues of gamma-Aminobutyric Acid. J Am Chem Soc 2020, 142 (10), 4892-4903.
12. Daune, G.; Gerhart, F.; Seiler, N., 5-Fluoromethylornithine, an irreversible and specific inhibitor of L-ornithine:2-oxo-acid aminotransferase. Biochem J 1988, 253 (2), 481-8.
13. Bolkenius, F. N.; Knodgen, B.; Seiler, N., DL-canaline and 5-fluoromethylornithine. Comparison of two inactivators of ornithine aminotransferase. Biochem J 1990, 268 (2), 409-14.
14. Storici, P.; Capitani, G.; Muller, R.; Schirmer, T.; Jansonius, J. N., Crystal structure of human ornithine aminotransferase complexed with the highly specific and potent inhibitor 5-fluoromethylornithine. J Mol Biol 1999, 285 (1), 297-309.
15. Qiu, J.; Silverman, R. B., A new class of conformationally rigid analogues of 4-amino-5-halopentanoic acids, potent inactivators of gamma-aminobutyric acid aminotransferase. J Med Chem 2000, 43 (4), 706-20.
16. Juncosa, J. I.; Takaya, K.; Le, H. V.; Moschitto, M. J.; Weerawarna, P. M.; Mascarenhas, R.; Liu, D.; Dewey, S. L.; Silverman, R. B., Design and Mechanism of (S)-3-Amino-4-(difluoromethylenyl)cyclopent-1-ene-1-carboxylic Acid, a Highly Potent gamma-Aminobutyric Acid Aminotransferase Inactivator for the Treatment of Addiction. J Am Chem Soc 2018, 140 (6), 2151-2164.
17. Shen, S.; Doubleday, P. F.; Weerawarna, P. M.; Zhu, W.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B., Mechanism-Based Design of 3-Amino-4-Halocyclopentenecarboxylic Acids as Inactivators of GABA Aminotransferase. ACS Med Chem Lett 2020, 11 (10), 1949-1955.
18. Singh, R.; Vince, R., 2-Azabicyclo[2.2.1]hept-5-en-3-one: chemical profile of a versatile synthetic building block and its impact on the development of therapeutics. Chem Rev 2012, 112 (8), 4642-86.
19. Wang, B. L.; Gao, H. T.; Li, W. D., Total synthesis of (+)-iresin. J Org Chem 2015, 80 (10), 5296-301.
20. Gross, L. J.; Stark, C. B. W., Regioselective dehydration of alpha-hydroxymethyl tetrahydrofurans using Burgess' reagent under microwave irradiation. Org Biomol Chem 2017, 15 (20), 4282-4285.
21. Lee, H.; Doud, E. H.; Wu, R.; Sanishvili, R.; Juncosa, J. I.; Liu, D.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B., Mechanism of inactivation of gamma-aminobutyric acid aminotransferase by (1S,3S)-3-amino-4-difluoromethylene-1-cyclopentanoic acid (CPP-115). J Am Chem Soc 2015, 137 (7), 2628-40.
22. Shen, S.; Doubleday, P. F.; Weerawarna, P. M.; Zhu, W.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B., Mechanism-Based Design of 3-Amino-4-Halocyclopentenecarboxylic Acids as Inactivators of GABA Aminotransferase. ACS Medicinal Chemistry Letters 2020.
23. Mascarenhas, R.; Le, H. V.; Clevenger, K. D.; Lehrer, H. J.; Ringe, D.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B.; Liu, D., Selective Targeting by a Mechanism-Based Inactivator against Pyridoxal 5'-Phosphate-Dependent Enzymes: Mechanisms of Inactivation and Alternative Turnover. Biochemistry 2017, 56 (37), 4951-4961.
24. Di Salvo, M. L.; Scarsdale, J. N.; Kazanina, G.; Contestabile, R.; Schirch, V.; Wright, H. T., Structure-based mechanism for early PLP-mediated steps of rabbit cytosolic serine hydroxymethyltransferase reaction. Biomed Res Int 2013, 2013, 458571.
25. Soniya, K.; Awasthi, S.; Nair, N. N.; Chandra, A., Transimination Reaction at the Active Site of Aspartate Aminotransferase: A Proton Hopping Mechanism through Pyridoxal 5′-Phosphate. ACS Catalysis 2019, 9 (7), 6276-6283.
26. Shah, S. A.; Shen, B. W.; Brunger, A. T., Human ornithine aminotransferase complexed with L-canaline and gabaculine: structural basis for substrate recognition. Structure 1997, 5 (8), 1067-75.
27. Leney, A. C.; Heck, A. J., Native Mass Spectrometry: What is in the Name? J Am Soc Mass Spectrom 2017, 28 (1), 5-13.
28. Stewart, J. J., MOPAC: a semiempirical molecular orbital program. J Comput Aided Mol Des 1990, 4 (1), 1-105.
29. Karsten, W. E.; Ohshiro, T.; Izumi, Y.; Cook, P. F., Reaction of serine-glyoxylate aminotransferase with the alternative substrate ketomalonate indicates rate-limiting protonation of a quinonoid intermediate. Biochemistry 2005, 44 (48), 15930-6.
30. Thibodeaux, C. J.; Liu, H. W., Mechanistic studies of 1-aminocyclopropane-1-carboxylate deaminase: characterization of an unusual pyridoxal 5'-phosphate-dependent reaction. Biochemistry 2011, 50 (11), 1950-62.
31. Clift, M. D.; Ji, H.; Deniau, G. P.; O'Hagan, D.; Silverman, R. B., Enantiomers of 4-amino-3-fluorobutanoic acid as substrates for gamma-aminobutyric acid aminotransferase. Conformational probes for GABA binding. Biochemistry 2007, 46 (48), 13819-28.
32. Gokcan, H.; Konuklar, F. A., Theoretical study on HF elimination and aromatization mechanisms: a case of pyridoxal 5' phosphate-dependent enzyme. J Org Chem 2012, 77 (13), 5533-43.
33. Alunni, S.; De Angelis, F.; Ottavi, L.; Papavasileiou, M.; Tarantelli, F., Evidence of a borderline region between E1cb and E2 elimination reaction mechanisms: a combined experimental and theoretical study of systems activated by the pyridine ring. J Am Chem Soc 2005, 127 (43), 15151-60.
34. Ghalami-Choobar, B.; Dezhampanah, H.; Nikparsa, P.; Ghiami-Shomami, A., Theoretical calculation of the pKa values of some drugs in aqueous solution. International Journal of Quantum Chemistry 2012, 112 (10), 2275-2280.

【0171】

実施例２－実施例１のＤＭＰＫ結果

【0172】

【表2】

【0173】

実施例３－実施例１の補足資料

【0174】

補足表

【0175】

【表3】

【0176】

４－６の合成
一般手順
市販の試薬及び溶媒をさらに精製することなく使用した。全ての反応を０．２５ｍｍのＳｉｌｉＣｙｃｌｅ過硬２５０μＭ ＴＬＣプレート（６０Ｆ_２５４）を用いた薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によりモニターし、スポットをＵＶ（２５４ｎｍ）及びモリブデン酸セリウムアンモニウム又はニンヒドリン染色下で可視化した。シリカカラム及び逆相Ｃ－１８カラムを用いてＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）Ｒｆシステム（Ｔｅｌｅｄｙｎｅ ＩＳＣＯ）上でフラッシュクロマトグラフィーを実施した。分析用ＨＰＬＣを用いて、以下の条件下で、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０シリーズ装置を用いて最終生成物の純度を測定した：カラム、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｔｅｘ Ｃ－１８カラム（５０×２．１ｍｍ、２．６μｍ）；移動相、０．９ｍＬ／分の流速で６分間、０．０５％のＴＦＡを含有する５～１００％アセトニトリル／水；２５４ｎｍでのＵＶ検出。インビトロ生物学的試験のために試験された全化合物の純度は、ＨＰＬＣ分析により＞９５％であった。Ｂｒｕｋｅｒ ＡＶＡＮＣＥ ＩＩＩ ５００ＭＨｚシステム及びＢｒｕｋｅｒ ＮＥＯコンソールｗ／ＱＣＩ－Ｆクライオプローブ６００ＭＨｚシステムを用いて、^１Ｈ、^１３Ｃ、及び２Ｄ ＮＭＲスペクトルを得た。化学シフトは、ＣＤＣｌ_３（^１Ｈ ＮＭＲでδ＝７．２６、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでδ＝７７．１６）、ＣＤ_３ＯＤ（^１Ｈ ＮＭＲでδ＝３．３１、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでδ＝４９．１５）、ＤＭＳＯ－ｄ６（^１Ｈ ＮＭＲでδ＝２．５０、^１３Ｃ ＮＭＲスペクトルでδ＝３９．５２）に対して報告された。多重性のために以下の略語を使用した：ｓ＝一重項、ｄ＝二重項、ｔ＝三重項、ｑ＝四重項、ｍ＝多重項、ｄｄ＝二重項、ｄｄ＝二重項、ｄｔ＝三重項、ｄｑ＝三重項の二重項、ｄｄ＝四重項の二重項、ｄｄｔ＝三重項の二重項、ｄｄｄ＝二重項の二重項、ｄｄｄｄ＝二重項の二重項、ｄｄｔ＝三重項の二重項の二重項、ｂｒ＝幅広い一重項。前述のＡｇｉｌｅｎｔ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ １２６０ ＨＰＬＣシステムを用いた大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）を用いて、正イオンモードのＴｈｅｒｍｏ ＴＳＱ量子システムを用いて低分解能質量スペクトル（ＬＲＭＳ）を得た。Ａｇｉｌｅｎｔ Ｇ１３１２Ａ ＨＰＬＣポンプを用いたエレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）と、ノースウエスタン大学総合分子構造教育研究センター（ＩＭＳＥＲＣ）のＡｇｉｌｅｎｔ Ｇ１３６７Ｂ自動注入器を用いて、正イオンモードのＡｇｉｌｅｎｔ ６２１０ ＬＣ－ＴＯＦ分光計で高分解能質量スペクトル（ＨＲＭＳ）を得た。

【0177】

【化18】

【0178】

（１Ｒ，４Ｓ）－２－（４－メトキシベンジル）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプト－５－エン－３－オン（８）^２。（ｉ）ｐ－アニシルアルコール（１０ｍＬ）及び濃塩酸（１５ｍＬ）を、１００ｍＬの丸底３つのネック付きフラスコに室温で溶解した。得られた混合物を室温でさらに１時間撹拌した。反応終了後、溶液を氷中に注ぎ、ＥｔＯＡｃ（２０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、飽和状態で洗浄した。Ｎａ_２ＣＯ_３溶液及びブラインをＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧濃縮する。新鮮な４－メトキシベンジルクロリドを無色油状物（９．２ｇ、５２％）として得、さらなる精製なしで次の工程に直接使用した。（ｉｉ）乾燥ＴＨＦ（３００ｍＬ）中の（１Ｒ）－（－）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプト－５－エン－３－オン（１、ＣＡＳ＃７９２００－５６－９、５．８ｇ、５３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、氷浴中にＤＭＦ（３０ｍＬ）中に懸濁したＮａＨ（６０％、３．１８ｇ、８０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を同じ温度で３０分間撹拌し、次に、４－メトキシベンジルクロリド（９．２ｇ、６３．６ｍｍｏｌ）及びＴＢＡＩ（１．９６ｇ、５．３ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、得られた混合物を室温にゆっくりと温め、さらに３時間撹拌した。反応終了後、溶液を水（２００ｍＬ）でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、飽和状態で洗浄した。Ｎａ_２ＣＯ_３溶液及びブラインをＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧濃縮する。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～５０％）により精製し、無色油状物として８（７．８ｇ、６５％）を得た。¹H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 7.12 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.62 - 6.50 (m, 2H), 4.24 (d, J = 14.6 Hz, ¹H), 4.16 (q, J = 1.9 Hz, ¹H), 4.10 (d, J = 14.6 Hz, ¹H), 3.77 (s, 3H), 3.32 - 3.30 (m, ¹H), 2.25 (dt, J = 7.7, 1.8 Hz, ¹H), 2.07 (dt, J = 7.7, 1.6 Hz, ¹H). ¹³C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 182.5, 160.8, 141.6, 137.6, 130.9 (2C), 129.2, 115.0 (2C), 64.6, 60.0, 55.9, 55.1, 47.8。Ｃ_１４Ｈ_１６ＮＯ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、２３０．１２；実測値、２３０．２１；ＴＲ＝２．２８分。

【0179】

【化19】

【0180】

（１Ｒ，４Ｒ，７Ｒ）－７－ブロモ－２－（４－メトキシベンジル）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－３，６－ジオン（１１）。ＤＣＭ（２００ｍＬ）中の塩化オキサリル（３．６９ｍＬ、４２．９ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下－７８℃でＤＭＳＯ（５．０ｍＬ、７０．６ｍｍｏｌ）をゆっくり添加した。－７８℃で１０分間撹拌した後、ＤＣＭ（２００ｍＬ）に溶解した１０（１０．０ｇ、３０．７ｍｍｏｌ）を同じ温度で得られた混合物に加え、次に－７８℃でさらに１０分間撹拌した。次に、ＴＥＡ（３０ｍＬ、２１５ｍｍｏｌ）を滴下した。
添加の完了後、反応物を－７８℃で１０分間撹拌し、室温まで加温し、１Ｎ ＮＨ_４Ｃｌでクエンチした。有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をＥｔＯＨで洗浄して、１１（７．８ｇ、７３％）を茶色固形物として得、さらに精製せずに次の工程で使用した。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.22 - 6.99 (m, 2H), 6.92 - 6.75 (m, 2H), 4.72 (d, J = 14.7 Hz, ¹H), 4.35 (d, J = 2.3 Hz, ¹H), 3.94 (d, J = 14.7 Hz, ¹H), 3.80 (s, 3H), 3.66 (d, J = 2.0 Hz, ¹H), 3.16 (dt, J = 4.1, 2.0 Hz, ¹H), 2.71 (dd, J = 17.8, 4.2 Hz, ¹H), 2.22 (dd, J = 17.9, 2.5 Hz, ¹H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 202.9, 172.6, 159.6, 129.8 (2C), 127.0, 114.4 (2C), 68.4, 55.3, 49.0, 48.2, 45.3, 32.1。Ｃ_１４Ｈ_１５ＢｒＮＯ_３［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、３２４．０２；実測値、３２４．３３；ＴＲ＝２．４０分。

【0181】

【化20】

【0182】

（１Ｓ，４Ｒ）－２－（４－メトキシベンジル）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－３，６－ジオン（１２）。ベンゼン（１００ｍＬ）中の１１（６．０ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でＢｎ_３ＳｎＨ（７ｍＬ、２６．０ｍｍｏｌ）及びＡＩＢＮ（１５１ｍｇ、０．９２５ｍｍｏｌ）を添加した。次に、得られた混合物を加熱して一晩還流させた。反応終了後、溶液を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１００ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～５０％）により精製して、１２（３．１ｇ、６８％）をオフホワイト固形物として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.22 - 7.13 (m, 2H), 6.89 - 6.80 (m, 2H), 4.70 (d, J = 14.8 Hz, ¹H), 3.88 (d, J = 14.8 Hz, ¹H), 3.80 (d, J = 1.1 Hz, 3H), 3.56 (q, J = 1.7 Hz, ¹H), 3.03 (qd, J = 2.3, 1.4 Hz, ¹H), 2.30 - 2.22 (m, ¹H), 2.18 (td, J = 4.0, 3.4, 2.1 Hz, 2H), 1.86 (dt, J = 10.7, 1.5 Hz, ¹H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 206.2, 176.6, 159.4, 129.7 (2C), 127.9, 114.2 (2C), 64.6, 55.3, 45.1, 42.5, 39.1, 35.2。Ｃ_１４Ｈ_１６ＮＯ_３［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、２４６．１１；実測値、２４６．１０；ＴＲ＝１．８１分。

【0183】

【化21】

【0184】

（１Ｓ，４Ｒ）－６，６－ジフルオロ－２－（４－メトキシベンジル）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－３－オン（１３）。１２（２４５ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）をマイクロ波管中のＴＨＦ（３ｍＬ）に溶解し、次に、Ｄｅｏｘｏ－Ｆｌｕｏｒ（１．１１ｍＬ、３．０ｍｍｏｌ、トルエン中２．７Ｍ）を室温で添加した。得られた混合物をマイクロ波反応器中で１２０℃で４０分間加熱した。反応の完了後、溶液を飽和状態でクエンチした。ＮａＨＣＯ_３液をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。残渣をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～１００％）で精製して、１３（１９０ｍｇ、７１％）を無色油状物として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.26 - 7.12 (m, 2H), 6.99 - 6.73 (m, 2H), 4.99 (d, J = 14.9 Hz, ¹H), 3.81 (s, 3H), 3.78 (s, ¹H), 3.61 (d, J = 2.0 Hz, ¹H), 2.85 (dq, J = 3.9, 1.8 Hz, ¹H), 2.32 - 2.10 (m, 2H), 2.01 (dtd, J = 10.4, 3.6, 1.8 Hz, ¹H), 1.85 (ddd, J = 10.6, 3.8, 1.9 Hz, ¹H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 175.9, 159.2, 129.5 (2C), 130.05 (t, J = 260.4 Hz), 128.2, 114.2 (2C), 61.47 (dd, J = 32.7, 21.0 Hz), 45.35 (d, J = 2.7 Hz), 43.69 (t, J = 4.0 Hz), 38.86 (d, J = 3.9 Hz), 36.7 (t, J = 23.9 Hz)。Ｃ_１４Ｈ_１６Ｆ_２ＮＯ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、２６８．１１；実測値、２６８．０７；ＴＲ＝２．３６分。

【0185】

【化22】

【0186】

（１Ｓ，４Ｒ）－６，６－ジフルオロ－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－３－オン（１４）。ＣＨ_３ＣＮ（８ｍＬ）中の１３（１９０ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温で硝酸セリンアンモニウムの水溶液（３ｍＬ水中１．１６ｇ、２．１０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、出発物質が完全に消失するまで２時間撹拌した。残渣をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、飽和状態で洗浄した。Ｎａ_２ＣＯ_３溶液及びブラインをＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧濃縮する。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～１００％）で精製して、１４（６０ｍｇ、５７％）を白色粉末として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5.69 (br s, ¹H), 3.82 (t, J = 1.9 Hz, ¹H), 2.77 (dd, J = 4.5, 2.3 Hz, ¹H), 2.35 - 2.21 (m, ¹H), 2.23 - 2.16 (m, ¹H), 2.17 - 2.03 (m, ¹H), 1.98 (ddq, J = 10.5, 3.6, 1.7 Hz, ¹H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 179.0, 128.8 (t, J = 258.6 Hz), 59.4 (dd, J = 33.2, 22.6 Hz), 43.6 (t, J = 4.0 Hz), 39.1 (d, J = 3.1 Hz), 36.97 (dd, J = 25.1, 23.4 Hz)。Ｃ_６Ｈ_８Ｆ_２ＮＯ［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、１４８．０６；実測値、１４８．０２；ＴＲ＝０．３３分。

【0187】

【化23】

【0188】

（１Ｒ，４Ｓ）－エチル４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３，３－ジフルオロシクロペンタンカルボン酸塩（１５）。（ｉ）１４（１５０ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を、室温でＨＣｌエタノール溶液（２ｍＬ、１．２Ｍ）に溶解した。得られた混合物を圧力管中で８５℃で一晩加熱した。反応完了後、過剰の溶媒を真空下で除去した。粗生成物を淡黄色固体として得、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。（ｉｉ）ＭｅＯＨ（５ｍＬ）中の中間体の撹拌溶液に、室温でＢｏｃ_２Ｏ（３２７ｍｇ、１．５０ｍｍｏｌ）及びＴＥＡ（０．２１ｍＬ、１．５０ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を室温で２時間撹拌した。反応終了後、過剰の溶媒を真空下で除去し、残渣を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～１００％）で精製して、１５を白色固体（２４０ｍｇ、２段階で８２％）として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5.14 - 4.64 (m, ¹H), 4.27 - 4.19 (m, ¹H), 4.16 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.01 - 2.85 (m, ¹H), 2.56 - 2.32 (m, 3H), 1.77 (dtd, J = 12.1, 10.0, 1.8 Hz, ¹H), 1.45 (s, 9H), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 173.5, 155.1, 127.2 (dd, J = 255.6, 250.9 Hz), 80.2, 61.7, 55.2 (dd, J = 26.0, 20.6 Hz), 36.3, 35.8 (t, J = 25.8 Hz), 32.9 (d, J = 4.5 Hz), 28.3 (3C), 14.1。Ｃ_８Ｈ_１４Ｆ_２ＮＯ_２［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、１９４．１０；実測値、１９３．９９；ＴＲ＝２．６７分。

【0189】

【化24】

【0190】

（Ｓ）－エチル４－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－３，３－ジフルオロシクロペンタ－１－エンカルボキシレート（１６）。ＴＨＦ（８ｍＬ）中の１５（１００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、－７８℃でＫＨＭＤＳ（２．０ｍＬ、トルエン中０．５Ｍ）を添加した。得られた混合物を－７８℃で２時間撹拌し、次に、温度でＴＨＦ（２ｍＬ）溶液中で塩化フェニル（７８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を添加した。反応物を室温にゆっくりと温め、さらに６時間撹拌した。反応物を飽和水性ＮＨ_４Ｃｌでクエンチし、ＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～１００％）で精製して、１６（２０ｍｇ、２０％）を白色固体として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 6.60 (s, ¹H), 4.91 (d, J = 9.0 Hz, ¹H), 4.57 - 4.53 (m, ¹H), 4.26 (q, J = 7.1 Hz, 2H), 3.17 (dt, J = 16.1, 7.4 Hz, ¹H), 2.42 (ddt, J = 14.8, 6.1, 3.0 Hz, ¹H), 1.47 (s, 9H), 1.32 (t, J = 7.1 Hz, 3H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 163.1, 155.1, 143.1 (t, J = 10.1 Hz), 132.44 (dd, J = 30.7, 24.6 Hz), 127.2 (t, J = 251.0 Hz), 80.4, 61.5, 54.5 (t, J = 20.9 Hz), 35.8, 28.3 (3C), 14.1。Ｃ_８Ｈ_１２Ｆ_２ＮＯ_２［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、１９２．０８；実測値、１９１．９６；ＴＲ＝２．７１分。

【0191】

【化25】

【0192】

（Ｓ）－４－アミノ－３，３－ジフルオロシクロペンタ－１－エンカルボン酸（５）
ＡｃＯＨ（１ｍＬ）中の１６（２０ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温で４Ｎ ＨＣｌ（１ｍＬ）を添加した。得られた混合物を７０℃で一晩加熱した。反応完了後、過剰の溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（Ｃ１８逆カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ：０～５％）により精製して、５を白色粉末塩酸塩（１０ｍｇ、７１％）として得た。¹H NMR (600 MHz, CD3OD) δ 6.65 (s, ¹H), 4.22 (dq, J = 13.2, 7.1, 6.7 Hz, ¹H), 3.28 - 3.21 (m, ¹H), 2.80 - 2.64 (m, ¹H)。¹³C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 165.23, 145.84 (dd, J = 11.3, 9.5 Hz), 131.65 (dd, J = 29.4, 25.5 Hz), 129.21 (t, J = 248.6 Hz), 54.50 (dd, J = 31.3, 20.0 Hz), 34.64 (d, J = 2.2 Hz)。Ｃ_６Ｈ_８ＦＮＯ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値、１６４．０５１８；実測値、１６４．０５１６。

【0193】

【化26】

【0194】

（１Ｒ，４Ｓ）－４－アミノ－３，３－ジフルオロシクロペンタンカルボン酸塩（４）。１４（６０ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を４Ｎ ＨＣｌ（４ｍＬ）に室温で溶解した。得られた混合物を７０℃で１時間加熱した。反応完了後、過剰の溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（Ｃ１８逆カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ：０～５％）により精製し、４を白色粉末塩酸塩（６０ｍｇ、８９％）として得た。¹H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 3.93 (qd, J = 11.4, 7.8 Hz, ¹H), 3.16 (tt, J = 10.0, 8.2 Hz, ¹H), 2.69 - 2.47 (m, 3H), 2.04 (dtd, J = 12.3, 10.7, 1.4 Hz, ¹H)。¹³C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 175.5, 128.3 (dd, J = 255.0, 252.6 Hz), 55.8 (dd, J = 29.6, 20.7 Hz), 37.9 (t, J = 4.5 Hz), 37.2 (t, J = 24.8 Hz), 31.9 (d, J = 4.8 Hz)。Ｃ_６Ｈ_１０ＦＮＯ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値、１６６．０６７４；実測値、１６６．０６７１。

【0195】

【化27】

【0196】

（１Ｓ，４Ｓ，７Ｒ）－２－（４－メトキシベンジル）－７－（メトキシメトキシ）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－３，６－ジオン（２１）を、１２の合成手順に従って２０（１２．０ｇ、３９ｍｍｏｌ）から調製し、無色油状物（１０．８ｇ、９１％）として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.20 - 7.04 (m, 2H), 6.97 - 6.77 (m, 2H), 4.64 (d, J = 6.9 Hz, ¹H), 4.62 (d, J = 14.8 Hz, ¹H), 4.59 (d, J = 6.9 Hz, ¹H), 4.17 (q, J = 2.2 Hz, ¹H), 4.02 (d, J = 14.8 Hz, ¹H), 3.80 (s, 3H), 3.59 (t, J = 1.9 Hz, ¹H), 3.30 (d, J = 1.7 Hz, 3H), 3.11 - 3.05 (m, ¹H), 2.51 (dd, J = 17.5, 4.3 Hz, ¹H), 2.14 (dd, J = 17.4, 1.9 Hz, ¹H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 206.0, 173.4, 159.4, 129.7 (2C), 127.7, 114.3 (2C), 96.2, 80.5, 66.6, 56.3, 55.3, 46.9, 45.0, 31.5。Ｃ_１６Ｈ_２０ＮＯ_５［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、３０６．１３；実測値、３０６．３９；ＴＲ＝２．３６分。

【0197】

【化28】

【0198】

（１Ｓ，４Ｓ，７Ｒ）－６，６－ジフルオロ－２－（４－メトキシベンジル）－７－（メトキシメトキシ）－２－アザビシクロ［２．２．１］－ヘプタン－３－オン（１８）を、１３の合成手順に従って１７（６７０ｍｇ、２．２０ｍｍｏｌ）から合成し、褐色油状物（４９０ｍｇ、７２％）として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 7.15 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 6.87 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.02 (d, J = 14.9 Hz, ¹H), 4.59 (s, 3H), 4.03 (dt, J = 4.7, 2.0 Hz, ¹H), 3.80 (s, 3H), 3.79 (d, J = 14.9 Hz, ¹H), 3.58 (q, J = 1.8 Hz, ¹H), 3.48 - 3.34 (m, 2H), 3.33 (s, 3H), 2.96 - 2.84 (m, ¹H), 2.57 (dddd, J = 18.0, 13.8, 9.4, 4.3 Hz, ¹H), 2.16 (dddd, J = 15.9, 13.7, 6.2, 1.7 Hz, ¹H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 172.5, 159.3, 129.72 (dd, J = 274, 254 Hz), 129.6 (2C), 127.8, 114.3 (2C), 95.9, 81.2 (d, J = 4.0 Hz), 62.4 (dd, J = 29.9, 20.3 Hz), 56.2 (d, J = 1.7 Hz), 55.3, 48.5 (t, J = 3.8 Hz), 45.3 (d, J = 2.6 Hz), 34.8 (t, J = 24.7 Hz)。Ｃ_１６Ｈ_２０Ｆ_２ＮＯ_４［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、３２８．１４；実測値、３２８．４６；ＴＲ＝２．５８分。

【0199】

【化29】

【0200】

（１Ｓ，４Ｓ，７Ｒ）－６，６－ジフルオロ－７－（メトキシメトキシ）－２－アザビシクロ［２．２．１］ヘプタン－３－オン（２３）。ＣＨ_３ＣＮ（４０ｍＬ）中の２２（９００ｍｇ、２．７５ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温で硝酸セリンアンモニウムの水溶液（１２ｍＬの水中４．５２ｇ、８．２６ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合物を、出発物質が完全に消失するまで２時間撹拌した。残渣をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、飽和状態で洗浄した。Ｎａ_２ＣＯ_３溶液及びブラインをＮａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧濃縮する。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ－ヘキサン：０～１００％）で精製して、２３（３４０ｍｇ、６０％）を淡黄色固体として得た。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5.91 (s, ¹H), 4.70 (s, 2H), 4.29 - 4.16 (m, ¹H), 3.83 (q, J = 2.0 Hz, ¹H), 3.41 (s, 3H), 2.84 (dt, J = 3.9, 1.9 Hz, ¹H), 2.62 (dddd, J = 18.3, 13.6, 8.9, 4.4 Hz, ¹H), 2.13 (dddd, J = 15.8, 13.8, 6.2, 1.8 Hz, ¹H). ¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 175.0, 128.2 (dd, J = 263, 253 Hz), 96.2, 81.7 (d, J = 3.3 Hz), 60.5 (dd, J = 30.5, 21.6 Hz), 56.24 (d, J = 1.8 Hz), 48.66 (dt, J = 4.1, 1.5 Hz), 34.11 (dd, J = 25.7, 24.2 Hz)。Ｃ_８Ｈ_１２Ｆ_２ＮＯ_３［Ｍ＋Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、２０８．０８；実測値、２００８．０７；ＴＲ＝０．７９分。

【0201】

【化30】

【0202】

（１Ｓ，２Ｒ，３Ｓ）－メチル３－（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４，４－ジフルオロ－２－ヒドロキシシクロペンタンカルボン酸塩（２４）。（ｉ）２３を室温でＨＣｌメタノール溶液（１．２Ｍ）に溶解した。次に、得られた混合物を圧力管中で８５℃で一晩加熱した。反応完了後、過剰の溶媒を真空下で除去し、次に残渣を飽和状態で中和した。ＮａＨＣＯ_３液をＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物を淡黄色固体（１６０ｍｇ、７０％）として得、さらに精製することなく次の工程に直接使用した。（ｉｉ）ＭｅＯＨ（１０ｍＬ）中の中間体（１６０ｍｇ、０．８２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でＢｏｃ_２Ｏ（２６８ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）を添加した。次に、得られた混合物を室温で一晩撹拌した。反応終了後、過剰の溶媒を真空下で除去し、次に、残渣を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮し、２４をオフホワイトの固体（２３０ｍｇ、９５％）として得、さらに精製することなく、次の工程に直接的に使用した。¹H NMR (500 MHz, CDCl₃) δ 5.07 (s, ¹H), 4.19 (t, J = 8.4 Hz, ¹H), 4.13 (s, ¹H), 4.09 - 3.98 (m, ¹H), 3.76 (s, 3H), 2.92 (q, J = 9.4 Hz, ¹H), 2.67 - 2.39 (m, 2H), 1.46 (s, 9H)。¹³C NMR (126 MHz, CDCl₃) δ 172.5, 156.7, 124.4 (t, J = 254 Hz), 81.2, 77.8 (d, J = 6.9 Hz), 62.9 (dd, J = 25.2, 17.9 Hz), 52.6, 44.6, 35.0 (t, J = 26.0 Hz), 28.2 (3C)。Ｃ_７Ｈ_１２Ｆ_２ＮＯ_３［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）計算値、１９６．０８；実測値、１９６．０３；ＴＲ＝２．２０分。

【0203】

【化31】

【0204】

（Ｓ）－メチル３－（（（ｔｅｒｔ－ブトキシカルボニル）アミノ）－４，４－ジフルオロシクロペンタ－１－エンカルボキシレート（２５）。ＴＨＦ（５ｍＬ）中の２４（２３０ｍｇ、０．７８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、アルゴン雰囲気下室温でＢｕｒｇｅｓｓ試薬（５８０ｍｇ、２．４４ｍｍｏｌ）を添加した。次に、得られた混合物を４時間加熱還流した。反応終了後、溶液を水でクエンチし、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ×３）で抽出した。合わせた有機層を分離し、ブラインで洗浄し、Ｎａ_２ＳＯ_４で乾燥し、減圧下で濃縮した。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ／ヘキサン：０～１００％）で精製して、オフホワイト固体として２５（１１０ｍｇ、４９％）を得た。Ｃ_７Ｈ_１０Ｆ_２ＮＯ_２［Ｍ－Ｂｏｃ＋２Ｈ］^＋のＬＲＭＳ（ＡＰＣＩ）の計算値、１７８．０７；実測値、１７７．８６；ＴＲ＝２．６５分。

【0205】

【化32】

【0206】

（Ｓ）－３－アミノ－４，４－ジフルオロシクロペンタ－１－エンカルボン酸塩（ＳＳ－１－１４８，６）。酢酸（１０ｍＬ）中の２５（２００ｍｇ、０．７２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温で４Ｎ ＨＣｌ（１０ｍＬ）を添加した。得られた混合物を７０℃で一晩加熱した。反応完了後、過剰の溶媒を真空下で除去した。粗生成物をＣｏｍｂｉ－Ｆｌａｓｈ（登録商標）クロマトグラフィー（Ｃ１８逆カラム、ＣＨ_３ＣＮ／Ｈ_２Ｏ：０～５％）により精製し、６を白色粉末ＨＣｌ塩（７２ｍｇ、５０％）として得た。¹H NMR (500 MHz, CD3OD) δ 6.58 (s, ¹H), 4.77 - 4.67 (m, ¹H), 3.29 - 3.16 (m, 2H). ¹³C NMR (126 MHz, CD3OD) δ 165.2, 140.0, 133.4, 128.0 (t, J = 254.8 Hz), 61.0 (dd, J = 35.5, 20.7 Hz), 41.64 (t, J = 27.1 Hz)。Ｃ_６Ｈ_８ＦＮＯ_２［Ｍ＋Ｈ］^＋のＨＲＭＳ（ＥＳＩ）計算値、１６４．０５１８；実測値、１６４．０５１７。

【0207】

ｈＯＡＴの発現及び精製
ｈＯＡＴを発現させ、以前に発表されたプロトコールを用いて精製した。簡単に説明すると、ｐＭＡＬ－ｔ－ｈＯＡＴプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、１００μｇ／ｍＬアンピシリンを補充したＬｙｓｏｇｅｎｙ Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）培地中で振とうしながら３７℃でインキュベートした。培養ＯＤ６００が０．７に達したとき、０．３ｍＭのイソプロピルβ－Ｄ－１－チオガラクトピラノシドの添加によりＭＢＰ－ｔ－ｈＯＡＴ融合タンパク質の発現を誘導し、更に１６～１８時間２５℃でインキュベートし、遠心分離により細胞を回収し、２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、及び１００μＭのＰＬＰ、ｐＨ７．４からなる緩衝液Ａで洗浄し、液体窒素中でフラッシュ凍結し、－８０℃で保存した後、凍結細胞ペレットを解凍し、緩衝液Ａ中で超音波処理し、４０，０００×ｇで２０分間遠心分離した。得られた上清を、緩衝液Ａで予め平衡化したアミロースアフィニティーカラム上にロードし、カラムを徹底的に洗浄し、ＭＢＰ－ｔ－ｈＯＡＴ融合タンパク質を、１０ｍＭマルトースでカラムから溶出させた。融合タンパク質を含む画分を合わせ、ＴＥＶプロテアーゼで処理してＭＢＰタグを除去した。切断されたｈＯＡＴタンパク質を回収し、遠心フィルターを用いて濃縮した。次に、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ－２００ＰＧカラムを用いるサイズ排除クロマトグラフィーにより、タンパク質をさらに精製した。カラムを予め平衡化し、タンパク質を、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００μＭ ＰＬＰ、及び３００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５を含有する緩衝液中で溶出させた。

【0208】

速度論的研究のためのアミノトランスフェラーゼ及び補酵素
酵素精製及びアッセイのためのすべての試薬は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州セントルイス）から購入した。ヒトＯＡＴ（０．６７２ｍｇ／ｍＬ）を、上述の手順に従ってＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞から精製し、補酵素ヒト組換えピロリン５－カルボキシレートレダクターゼ（ＰＹＣＲ^１）を発現させ、増殖させ、文献手順に従って精製した。γ－アミノ酪酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＡＢＡ－ＡＴ、０．４ｍｇ／ｍＬ）は前述の手順に従ってブタ脳から精製し、補酵素コハク酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ＳＳＤＨ）はＧＡＢａｓｅ（カタログ番号Ｇ７５０９－２５ＵＮ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）から精製した。ＳＳＤＨとＧＡＢＡ－ＡＴの市販の混合物を既知の手順で使用する。市販のブタ心臓由来のＬ－アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐ－ＡＴ）（カタログ番号Ｇ２７５１－２ＫＵ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及びブタ由来の所望のアッセイ補酵素リンゴ酸デヒドロゲナーゼ（カタログ番号Ｍ２６３４－５ＫＵ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びブタ心臓由来のＬ－アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａ－ＡＴ）（カタログ番号 Ｇ８２５５－２００ＵＮ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）及び所望のアッセイであるブタ由来の補酵素乳酸デヒドロゲナーゼ（カタログ番号４２７２１１－５０ＫＵ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をさらに精製せずに直接使用した。不活化、分配比、及び透析実験のためのすべての酵素アッセイを、透明な９６ウェルプレートを有するＳｙｎｅｒｇｙ Ｈ１ハイブリッドマルチモードマイクロプレートリーダー（Ｂｉｏｔｅｋ、米国）で記録した。

【0209】

ｈＯＡＴの時間依存性阻害剤としての化合物の評価
ｈＯＡＴに対する時間依存性不活化を、以前に公開された最適化手順を用いて実施した。１０μＬのｈＯＡＴ（０．０２５ｍｇ／ｍＬ）を、１００ｍＭピロリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０、５ｍＭ α－ケトグルタル酸、及び５ｍＭβ－メルカプトエタノール）中、１０μＬの種々の濃度の試験化合物と共に、９６ウェルプレート中２５℃で予めインキュベートした。時間間隔で、上記ピロリン酸カリウム緩衝液中のＰＹＣＲ^１（０．５μｇ）、１ｍＭ ＮＡＤＨ、及び２５ｍＭ Ｌ－オルニチンを含有するアッセイ溶液８０μＬをインキュベーション混合物に添加し、３７℃で３０分間、ＯＡＴ活性をアッセイした。ＮＡＤＨのＮＡＤＯＡへの変換に基づく３４０ｎｍでの３７℃でのＵＶ吸光度の変化をマイクロプレートリーダーによりモニターした。すべてのアッセイを二重に行い、各インヒビター濃度における各プレインキュベーション時間における残りのＯＡＴ活性を平均化した。残りのＯＡＴ活性のパーセンテージの自然対数を、各インヒビター濃度におけるプレインキュベーション時間に対してプロットして、各濃度についてのｋ_ｏｂｓ（傾き）値を得た。ｋ_ｏｂｓ値は、それぞれの阻害剤濃度での不活化を表す速度定数である。ｋ_ｏｂｓは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を用いた非線形回帰分析を用いて阻害剤濃度に対して再移植される。Ｋ_Ｉとｋ_{ｉｎａｃｔ}値は、式（１）

【0210】

【数1】

【0211】

から推定され、ここで、ｋ_{ｉｎａｃｔ}は不活化の最大速度であり、Ｋ_Ｉは不活化の最大半分に必要な阻害濃度であり、［Ｉ］は試験化合物のプレインキュベーション濃度である。

【0212】

ＧＡＢＡ－ＡＴの可逆的阻害剤としての化合物の評価
阻害定数（Ｋ_ｉ）は、ＳＳＤＨと組み合わせたアッセイを用いて、試験化合物の０～２０ｍＭ濃度の存在下でＧＡＢＡ－ＡＴ活性をモニターすることにより決定した。９６ウェルプレートに、５０ｍＭピロリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．５、５ｍＭ α－ケトグルタル酸、及び５ｍＭβ－メルカプトエタノール）中に、過剰のＳＳＤＨ、１ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１１．１ｍＭ ＧＡＢＡ、及び１０μＬの種々の濃度の試験化合物を含有する８０μＬのアッセイ混合物を装填した。混合物を２５℃で１分間インキュベートした後、上記ピロリン酸カリウム緩衝液中のＧＡＢＡ－ＡＴ（０．０３ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを９６ウェルプレートに添加した。マイクロプレートを２５℃で１分間振とうし、ＮＡＤＰＯＡからＮＡＤＰＨへの変換に基づいて、２５℃で３４０ｎｍにおける吸光度の変化を観察することにより、残りの酵素活性を決定した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８．０を用いた非線形回帰分析を用いて、半最大発育阻止濃度（ＩＣ_５０）値を得た。その後のＫｉ値を式（２）を用いて決定した。
すべてのアッセイを２回実施した。

【0213】

【数2】

【0214】

ここで［Ｓ］は基質ＧＡＢＡの最終濃度（８．８８ｍＭ）であり、ＫｍはＭｉｃｈａｅｌｉｓ－Ｍｅｎｔｅｎ定数であり、ブタ脳から単離したこのバッチのＧＡＢＡ－ＡＴについて２．６０ｍＭであると決定された。

【0215】

ＳＳ－１－１４８によるＡｓｐ－ＡＴとＡｌａ－ＡＴの阻害
９６ウェルプレートに、ｐＨ７．４で１００ｍＭリン酸カリウム、５．５５ｍＭ α－ケトグルタル酸、１．１１ｍＭ ＮＡＤＨ、５．５５ｍＭ Ｌ－アスパラギン酸、５．５５ｍＭリンゴ酸デヒドロゲナーゼ、及び種々の濃度のＳＳ－１－１４８を含む９０μＬのアッセイ混合物を装填した。混合物を室温で数分間インキュベートした後、１０μＬのＡｓｐ－ＡＴ（ｐＨ７．４の１００ｍＭリン酸カリウム中２．０単位／ｍＬ）を添加した。プレートを室温で１分間振とうし、ＮＡＤＨのＮＡＤＯＡへの変換に基づいて１０秒ごとに３４０ｎｍで９０分間吸光度を測定した。残りのＡｓｐ－ＡＴ活性パーセンテージは、対応する濃度に従って計算した。すべてのアッセイを２回実施した。ＳＳ－１－１４８によるＡｌａ－ＡＴの阻害を決定するためのアッセイ条件は、Ｌ－アラニンを基質として用い、乳酸デヒドロゲナーゼを補酵素として用いた以外はＬ－アスパラギン酸と同一であった。

【0216】

透析アッセイ
透析実験は以前のプロトコールを用いて行った^８－１０。

【0217】

分配比実験
以前のプロトコールを用いて分配比を計算した^８－１０。

【0218】

フッ化物イオン放出アッセイ
フッ化物イオン放出アッセイは、以前のプロトコールを用いて行った^１０。試料中の酵素の最終濃度は、ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ：２３２２５）を介して測定した。電圧（Ｖ，ｍＶ）の検量線を種々の濃度のＮａＦ（Ｆ，μＭ）から作成した。フッ化物イオン濃度の正確な検出のために、１０μＭのフッ化物イオンを各対照及び試料に添加した。活性部位当たりに放出されるフッ化物イオンの数は、フッ化物イオン放出濃度と酵素濃度の比によって計算した。

【0219】

天然タンパク質質量分析
Ｄ－Ｔｕｂｅ（商標）Ｄｉａｌｙｚｅｒ Ｍｉｎｉ（ＭＷＣＯ１２－１４ＫＤａ；Ｌｏｔ＃：３４５２４６；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）中の処理及び未修飾ｈＯＡＴ試料を、１００ｍＭ ＮＨ_４ＯＡｃに対する透析により別々に、４℃で９６時間脱塩した。脱塩試料を＋１５００～＋２０００Ｖのスプレー電圧のＮａｎｏｓｐｒａｙ Ｆｌｅｘ Ｉｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を備えたＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｕｌｔｒａ Ｈｉｇｈ Ｍａｓｓ Ｒａｎｇｅ（ＵＨＭＲ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計に別々に導入した。イオン移送管を３１０℃に設定した。質量分析計を＋ＥＳＩモードで運転した。２００マイクロスキャンで４０００～１０，０００ｍ／ｚから収集したフルスキャンデータと、３５，０００又は１７，５００（２００ｍ／ｚで）のＯｒｂｉｔｒａｐ分解能及び１ｅ６チャージのターゲットＡＧＣを用いた。ＳレンズＲＦレベルは２００％に設定し、延長トラッピングは１００に設定した。タンパク質二量体から付加物を放出するために、ＨＣＤ衝突活性化を５～１５に設定した正規化衝突エネルギー（ＮＣＥ）で適用した。各実験からの生スペクトルを、複数のスキャンにわたって合計した。質量デコンボリューションは、ゼロ電荷質量及び関連質量標準偏差を生成するために、ｍＭａｓｓ及び／又はＵｎｉＤｅｃを用いて実施した。

【0220】

無傷タンパク質質量分析及び代謝
処理及び非修飾の精製ｈＯＡＴ試料を、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ １０ＫＤａ分子量スピンフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上の最適グレード水（Ｆｉｓｈｅｒ）で１０回脱塩した。タンパク質をクロマトグラフィーで分離するために、Ｄｉｏｎｅｘ Ｕｌｔｉｍａｔｅ３０００液体クロマトグラフィーシステム（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を用いて、タンパク質０．５μｇを３ｃｍのＰＬＲＰ－Ｓ（Ａｇｉｌｅｎｔ）トラップカラムに装填した。タンパク質分析物を１０％溶媒Ｂ（９５％アセトニトリル／５％ ２Ｏ／０．２％ギ酸）及び９０％溶媒Ａ（５％アセトニトリル／９５％Ｈ_２Ｏ／０．２％ギ酸）の１０分間のアイソクラティック勾配で洗浄した。タンパク質を、ＰＬＲＰ－Ｓ樹脂（Ａｇｉｌｅｎｔ）を充填した長さ７５μｍ ＩＤ×１５ｃｍのナノ細孔キャピラリーカラムで自家製に分離した。ＬＣ系は、以下の勾配で０．３μＬ／分の流速で操作した：０～１０分、１０％溶媒Ｂ；１０～１２分、～４０％溶媒Ｂ；１２～２２分、～９０％溶媒Ｂ；２２～２４分、９０％溶媒Ｂ；２４～２６分、～１０％溶媒Ｂ；２６～３０分、１０％溶媒Ｂで２６～３０分のアイソクラティック。ｈＯＡＴ試料をＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｏｒｂｉｔｒａｐ Ｆｕｓｉｏｎ Ｌｕｍｏｓ又はＥｃｌｉｐｓｅ質量分析計に導入し、前述のように全ＭＳデータを取得した。前述したように、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）上で、小分子及び代謝物の質量を同定し、正及び負モードの高分解能ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより特徴付けた。

【0221】

ＳＳ－１－１４８によるｈＯＡＴの［０２６３］結晶化及び結晶浸漬
ｈＯＡＴ結晶浸漬。ホロ酵素結晶をまず懸垂液滴蒸気拡散法により成長させた。１滴中にタンパク質２μＬ及びウェル溶液２μＬを含有した。最良の結晶化条件は、１０％ＰＥＧ８０００、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含んでいた。ホロ酵素結晶が最大サイズに達すると、１６ｍＭ ＳＳ－１－１４８の２μＬを結晶で滴に添加した。ＳＳ－１－１４８添加の最初の５分以内に、ｈＯＡＴ結晶は黄色から青色に変色した。結晶を１時間浸漬し、凍結保護溶液（３０％グリセロールを添加したウェル溶液）に移し、次に液体窒素中でフラッシュ凍結した。

【0222】

ｈＯＡＴ共結晶化。精製後、ｈＯＡＴを、５ｍＭ α－ケトグルタル酸を供給する結晶化緩衝液（５０ｍＭトリシンｐＨ７．８）中に緩衝液交換した。次に、タンパク質を６ｍｇ／ｍＬに濃縮した。以前に報告された結晶化条件^８を、ＰＥＧ６０００（８～１２％）、ＮａＣｌ（１００～２５０ｍＭ）、グリセロール（０～１０％）及び１００ｍＭトリシンｐＨ７．８を緩衝液として一定に保つことにより懸垂液滴蒸気拡散法を用いて最適化した。懸垂１滴につき、２μＬのタンパク質溶液を等容量のウェル溶液及び０．５μＬの１０ｍＭ ＳＳ－１－１４８と混合した。１０％ＰＥＧ８０００、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロールを含む最終条件下で、最高の形態とサイズの結晶が成長した。結晶を凍結保護液（３０％グリセロールを添加したウェル溶液）に移し、その後液体窒素中でフラッシュ凍結した。

【0223】

Ｘ線回折及びデータ処理。アルゴンヌ国立研究所のＡｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ ＳｏｕｒｃｅのＬＳ－ＣＡＴビームライン２１－ＩＤ－Ｄで単色Ｘ線回折データを収集した。Ｄｅｃｔｒｉｓ Ｅｉｇｅｒ ９Ｍ検出器を用いて、波長１．１２７Å、温度１００Ｋでデータを収集した。データセットを処理し、ａｕｔｏＰＲＯＣソフトウェアで解析した。

【0224】

モデルの構築及び改良。Ｐｈｅｎｉｘ中のＰｈａｓｅｒを用いた分子置換によりｈＯＡＴ構造を解いた。最初の検索モデルは、以前に発表されたｈＯＡＴの構造（ＰＤＢコード：１ＯＡＴ）であった。最低のＲｆｒｅｅ／Ｒファクター値が達成されるまでの反復過程として、ＣｏｏｔとＰｈｅｎｉｘでモデル構築と改良をそれぞれ達成した。ＵＣＳＦキメラを用いて構造図を作成した^１９。

【0225】

過渡状態法。
Ｈｉｔｅｃｈ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＴｇＫ）停止流分光光度計と電荷結合素子検出（２６０～８００ｎｍ）を組み合わせた過渡状態でＳＳ－１－１４８とｈＯＡＴの反応を観察した。ｈＯＡＴ（１２．６８μＭ）を５０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び２００ｍＭのＮａＣｌを含む緩衝液（ｐＨ７．５）中で種々の濃度（１２５、２５１、５０２、１００４、２００８、４０１６、８０３２μＭ）のＳＳ－１－１４８と１０℃で反応させた。阻害剤の各濃度について、ＣＣＤスペクトルデータセットを５０秒間重複して収集し、重複を平均した。阻害剤の最高濃度（８ｍＭ）について、２つの時間枠（０．００２５～１２．４秒及び０．００２５～２４８０秒）について重複ＣＣＤデータセットを得た。任意の時間枠についての複製データセットを平均化し、次に１２秒で一緒にスプライシングして、１つのデータセットを形成し、迅速で遅いプロセスを適切に記述するのに十分な時間分解能を有した。ハイブリッドデータセットを、ＫｉｎＴｅｋ ＥｘｐｌｏｒｅｒソフトウェアのＳｐｅｃｔｒａｆｉｔ特異値分解モジュールを用いて線形４種モデルに基づいてデコンボリューションした。この過程において、速度定数は、式（３）、（４）及び（５）に従って連続した一次過程を仮定する単一波長について抽出されたデータに分析的適合を用いて測定された値に固定された。抗体は吸光度であり、Ａｘは観察された各相に関連する振幅であり、ｋｘは対応する速度定数であり、Ｃは吸光度の終点である。

【0226】

【数3】

【0227】

ギブス自由エネルギー計算
ＭＯＰＡＣ ２０１６は、量子理論と熱力学の概念に基づく計算化学ソフトウェアであり、いくつかの進歩した数学の概念を用いている。これは、固体状態、ナノ構造、分子構造及びそれらの反応の研究に使用される半経験的分子軌道パッケージである^{２０－２１}。この文脈において、ＭＯＰＡＣ ２０１６は、Ｍ７の各互変異性形の分子幾何学を設定し（図１４）、続いてＰＭ７半経験的方法を通して最適化するために使用されてきた。水分子による溶媒和は計算に考慮されなかった。図１４に示した各互変異性体の結合自由エネルギーについて、分子力学エネルギー、極性及び非極性エネルギー、及びエントロピーの組み合わせを考察した。エンタルピー（ΔＨ^ｏ）とエントロピー（ΔＳ^ｏ）はそれぞれの互変異性体のΔＧ^ｏ値に寄与し、ギブス自由エネルギー方程式、ΔＧ^ｏ＝ΔＨ^ｏ－ＴΔＳ^ｏによって決定される。

【0228】

理論的ｐＫ _ａ 計算
Ｍ１、Ｍ１’、及びＭ１’’の中性及び脱プロトン化種の幾何学は、理論のＤＦＴ Ｂ３ＬＹＰ／６－３１Ｇ^＊＊レベルを用いて完全に最適化された。調べたすべての化合物について、化合物の気相Ｇｉｂｂｓ自由エネルギー変化（ΔＧ^ｏｇ）をＧａｕｓｓｉａｎ０９ソフトウエアを用いて計算した^２２。溶媒和自由エネルギーを、同じレベルの理論と基底集合（Ｂ３ＬＹＰ／６－３１Ｇ^＊＊）を用いて分極可能連続体モデル（ＰＣＭ）を適用して計算した。ＰＣＭ計算は、溶媒キャビティを構築するときに溶媒和のギブス自由エネルギーを計算するときにＵＡＨＦ原子半径とともに使用された。ｐＫａ値は、以下の式（６）、（７）、及び（８）と、Ｇｈａｌａｍｉ－Ｃｈｏｏｂａｒらによって提示された熱力学サイクルＡを適用して得られた。

【0229】

【数4】

【0230】

静電ポテンシャル（ＥＳＰ）電荷計算
Ｓｐａｒｔａｎ’１４ソフトウェア（Ｗａｖｅｆｕｃｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．，２０１４）を用いてＭ１，Ｍ１’，Ｍ１’’の三次元（３Ｄ）分子モデルを構築した。Ｍｅｒｃｋ分子力場（ＭＭＦＦ９４）を用いた分子力学により構築構造を精緻化した。次に、最も低いエネルギー配座異性体を選択し、平衡幾何学と分子軌道を６－３１Ｇ^＊理論レベルのＨａｒｔｒｅｅ－Ｆｏｃｋ（ＨＦ）を用いて計算した。Ｓｐａｒｔａｎ’１４はまた、電子密度及び静電ポテンシャルマップを生成するために使用された。

【0231】

略語
Ｂｏｃ_２Ｏ、二炭酸ジ－ｔｅｒｔ－ブチル；Ｄｅｏｘｏ－Ｆｌｕｏｒ、ビス（２－メトキシエチル）アミノ硫黄三フッ化物；ＤＭＰＫ、薬物代謝及び薬物動態；ＤＩＰＥＡ、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン；ＤＢＤＭＨ、１，３－ジブロモ－５，５－ジメチルヒダントイン；ＤＭＦ、ジメチルホルムアミド；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＤＣＭ、ジクロロメタン；ＴＨＦ、テトラヒドロフラン；ＴＥＡ、トリエチルアミン；ＴＢＡＩ、テトラ－ｎ－ヨウ化ブチルアンモニウム。

【0232】

参考文献
1. Lu, H.; Silverman, R. B., Fluorinated conformationally restricted gamma-aminobutyric acid aminotransferase inhibitors. J Med Chem 2006, 49 (25), 7404-12.
2. Shen, S.; Doubleday, P. F.; Weerawarna, P. M.; Zhu, W.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B., Mechanism-Based Design of 3-Amino-4-Halocyclopentenecarboxylic Acids as Inactivators of GABA Aminotransferase. ACS Med Chem Lett 2020, 11 (10), 1949-1955.
3. Mascarenhas, R.; Le, H. V.; Clevenger, K. D.; Lehrer, H. J.; Ringe, D.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B.; Liu, D., Selective Targeting by a Mechanism-Based Inactivator against Pyridoxal 5'-Phosphate-Dependent Enzymes: Mechanisms of Inactivation and Alternative Turnover. Biochemistry 2017, 56 (37), 4951-4961.
4. Christensen, E. M.; Patel, S. M.; Korasick, D. A.; Campbell, A. C.; Krause, K. L.; Becker, D. F.; Tanner, J. J., Resolving the cofactor-binding site in the proline biosynthetic enzyme human pyrroline-5-carboxylate reductase 1. J Biol Chem 2017, 292 (17), 7233-7243.
5. Koo, Y. K.; Nandi, D.; Silverman, R. B., The multiple active enzyme species of gamma-aminobutyric acid aminotransferase are not isozymes. Arch Biochem Biophys 2000, 374 (2), 248-54.
6. Silverman, R. B.; Bichler, K. A.; Leon, A. J. J. Am. Chem. Soc. 1996, 118 (6), 1241-52.
7. Juncosa, J. I.; Lee, H.; Silverman, R. B., Two continuous coupled assays for ornithine-delta-aminotransferase. Anal Biochem 2013, 440 (2), 145-9.
8. Moschitto, M. J.; Doubleday, P. F.; Catlin, D. S.; Kelleher, N. L.; Liu, D.; Silverman, R. B., Mechanism of Inactivation of Ornithine Aminotransferase by (1S,3S)-3-Amino-4-(hexafluoropropan-2-ylidenyl)cyclopentane-1-carboxylic Acid. J Am Chem Soc 2019, 141 (27), 10711-10721.
9. Juncosa, J. I.; Takaya, K.; Le, H. V.; Moschitto, M. J.; Weerawarna, P. M.; Mascarenhas, R.; Liu, D. L.; Dewey, S. L.; Silverman, R. B., Design and Mechanism of (S)-3-Amino-4-(difluoromethylenyl)cyclopent-1-ene-1-carboxylic Acid, a Highly Potent gamma-Aminobutyric Acid Aminotransferase Inactivator for the Treatment of Addiction. J Am Chem Soc 2018, 140 (6), 2151-2164.
10. Lee, H.; Doud, E. H.; Wu, R.; Sanishvili, R.; Juncosa, J. I.; Liu, D. L.; Kelleher, N. L.; Silverman, R. B., Mechanism of Inactivation of gamma-Aminobutyric Acid Aminotransferase by (1S,3S)-3-Amino-4-difluoromethylene-1-cyclopentanoic Acid (CPP-115). J Am Chem Soc 2015, 137 (7), 2628-2640.
11. Niedermeyer, T. H.; Strohalm, M., mMass as a software tool for the annotation of cyclic peptide tandem mass spectra. PLoS One 2012, 7 (9), e44913.
12. Marty, M. T.; Baldwin, A. J.; Marklund, E. G.; Hochberg, G. K.; Benesch, J. L.; Robinson, C. V., Bayesian deconvolution of mass and ion mobility spectra: from binary interactions to polydisperse ensembles. Anal Chem 2015, 87 (8), 4370-6.
13. Zhu, W.; Doubleday, P. F.; Catlin, D. S.; Weerawarna, P. M.; Butrin, A.; Shen, S.; Wawrzak, Z.; Kelleher, N. L.; Liu, D.; Silverman, R. B., A Remarkable Difference That One Fluorine Atom Confers on the Mechanisms of Inactivation of Human Ornithine Aminotransferase by Two Cyclohexene Analogues of gamma-Aminobutyric Acid. J Am Chem Soc 2020, 142 (10), 4892-4903.
14. Vonrhein, C.; Flensburg, C.; Keller, P.; Sharff, A.; Smart, O.; Paciorek, W.; Womack, T.; Bricogne, G., Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2011, 67 (Pt 4), 293-302.
15. McCoy, A. J.; Grosse-Kunstleve, R. W.; Adams, P. D.; Winn, M. D.; Storoni, L. C.; Read, R. J., Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr 2007, 40 (Pt 4), 658-674.
16. Shen, B. W.; Hennig, M.; Hohenester, E.; Jansonius, J. N.; Schirmer, T., Crystal structure of human recombinant ornithine aminotransferase. J Mol Biol 1998, 277 (1), 81-102.
17. Emsley, P.; Lohkamp, B.; Scott, W. G.; Cowtan, K., Features and development of Coot. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 2010, 66 (Pt 4), 486-501.
18. Liebschner, D.; Afonine, P. V.; Baker, M. L.; Bunkoczi, G.; Chen, V. B.; Croll, T. I.; Hintze, B.; Hung, L. W.; Jain, S.; McCoy, A. J.; Moriarty, N. W.; Oeffner, R. D.; Poon, B. K.; Prisant, M. G.; Read, R. J.; Richardson, J. S.; Richardson, D. C.; Sammito, M. D.; Sobolev, O. V.; Stockwell, D. H.; Terwilliger, T. C.; Urzhumtsev, A. G.; Videau, L. L.; Williams, C. J.; Adams, P. D., Macromolecular structure determination using X-rays, neutrons and electrons: recent developments in Phenix. Acta Crystallogr D Struct Biol 2019, 75 (Pt 10), 861-877.
19. Pettersen, E. F.; Goddard, T. D.; Huang, C. C.; Couch, G. S.; Greenblatt, D. M.; Meng, E. C.; Ferrin, T. E., UCSF Chimera--a visualization system for exploratory research and analysis. J Comput Chem 2004, 25 (13), 1605-12.
20. Dewar, M. J. S.; Thiel, W., Ground states of molecules. 39. MNDO results for molecules containing hydrogen, carbon, nitrogen, and oxygen. Journal of the American Chemical Society 1977, 99 (15), 4907-4917.
21. Stewart, J. J. P., Optimization of parameters for semiempirical methods VI: more modifications to the NDDO approximations and re-optimization of parameters. Journal of Molecular Modeling 2013, 19 (1), 1-32.
22. Gaussian 09, Revision A.02, M. J. Frisch, G. W. Trucks, H. B. Schlegel, G. E. Scuseria, M. A. Robb, J. R. Cheeseman, G. Scalmani, V. Barone, G. A. Petersson, H. Nakatsuji, X. Li, M. Caricato, A. Marenich, J. Bloino, B. G. Janesko, R. Gomperts, B. Mennucci, H. P. Hratchian, J. V. Ortiz, A. F. Izmaylov, J. L. Sonnenberg, D. Williams-Young, F. Ding, F. Lipparini, F. Egidi, J. Goings, B. Peng, A. Petrone, T. Henderson, D. Ranasinghe, V. G. Zakrzewski, J. Gao, N. Rega, G. Zheng, W. Liang, M. Hada, M. Ehara, K. Toyota, R. Fukuda, J. Hasegawa, M. Ishida, T. Nakajima, Y. Honda, O. Kitao, H. Nakai, T. Vreven, K. Throssell, J. A. Montgomery, Jr., J. E. Peralta, F. Ogliaro, M. Bearpark, J. J. Heyd, E. Brothers, K. N. Kudin, V. N. Staroverov, T. Keith, R. Kobayashi, J. Normand, K. Raghavachari, A. Rendell, J. C. Burant, S. S. Iyengar, J. Tomasi, M. Cossi, J. M. Millam, M. Klene, C. Adamo, R. Cammi, J. W. Ochterski, R. L. Martin, K. Morokuma, O. Farkas, J. B. Foresman, and D. J. Fox, Gaussian, Inc., Wallingford CT, 2016.
23. Ghalami-Choobar, B.; Dezhampanah, H.; Nikparsa, P.; Ghiami-Shomami, A., Theoretical calculation of the pKa values of some drugs in aqueous solution. International Journal of Quantum Chemistry 2012, 112 (10), 2275-2280.

【0233】

本開示によれば、構造的、立体化学的及び／又は立体配置的に変化する種々の他の化合物は、当業者に公知であり理解されるような修飾、このような手順、技術及び修飾を、任意の対応する試薬又は出発物質の商業的又は合成的利用可能性によってのみ制限されるような、そのような組み込まれた合成方法及び技術、又はそれらの直接的修飾によって利用可能である。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図4A】

【図4B】

【図5A】

【図5B-1】

【図5B-2】

【図6】

【図7A-B】

【図7C】

【図8-1】

【図8-2】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14-1】

【図14-2】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図15-4】

【国際調査報告】