▶ オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-07
(54)【発明の名称】バイオマーカー
(51)【国際特許分類】
G01N 33/53 20060101AFI20240229BHJP
【ＦＩ】
G01N33/53 N
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555590
(86)(22)【出願日】2022-03-09
(85)【翻訳文提出日】2023-11-10
(86)【国際出願番号】 GB2022050614
(87)【国際公開番号】W WO2022189788
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】2103241.2
(32)【優先日】2021-03-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507226592
【氏名又は名称】オックスフォード ユニヴァーシティ イノヴェーション リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100122301
【弁理士】
【氏名又は名称】冨田 憲史
(74)【代理人】
【識別番号】100157956
【弁理士】
【氏名又は名称】稲井 史生
(72)【発明者】
【氏名】イラニ，サロシュ アール
(72)【発明者】
【氏名】ウォーターズ，パトリック
(57)【要約】
本発明は、抗体関連自己免疫疾患、特に、神経疾患、例えば、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）またはＬＧＩ１抗体脳炎を有する対象の病状を評価するためのバイオマーカーに関する。本発明は、抗体関連自己免疫疾患における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルに特に注目し、これを使用して対象が再発状態にあるかどうかを判定する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗体関連自己免疫疾患または抗体媒介自己免疫疾患であると診断されている対象の病状を判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在、および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む、方法。
【請求項2】
病状が、対象が再発状態にあるかどうかの判定、再発の可能性の判定、対象を治療すべきかどうかの判定、または対象が治療から利益を得る可能性が高いかどうかの判定である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
（ａ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在が、再発の可能性がより高いことを示すか、もしくは対象が再発状態にあることを示すか、もしくは対象を治療すべきであることを示すか、もしくは対象が治療から利益を得る可能性が高いことを示すか、または（ｂ）参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識する高レベルのＩｇＭアイソタイプ抗体もしくはこのレベルの未変化が、再発の可能性がより高いことを示すか、もしくは対象が再発状態にあることを示すか、もしくは対象を治療すべきであることを示すか、もしくは対象が治療から利益を得る可能性が高いことを示すか、または
（ｃ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の非存在が、再発の可能性がより低いことを示すか、もしくは対象が再発状態にないことを示すか、もしくは対象を治療すべきではないことを示すか、もしくは対象が治療から利益を得る可能性が高いしないことを示すか、または
（ｄ）参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識する低レベルのＩｇＭアイソタイプ抗体が、再発の可能性がより低いことを示すか、もしくは対象が再発状態にないことを示すか、もしくは対象を治療すべきではないことを示すか、もしくは対象が治療から利益を得る可能性が高いしないことを示す、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
対象から得られた生体試料に存在する特異的抗原を認識する１つまたは複数のＩｇＡクラスのレベルまたはこのレベルの変化を決定する工程をさらに含む、請求項１から３のいずれかに記載の方法。
【請求項5】
対象から得られた生体試料に存在する所与のＩｇにより認識される優勢なエピトープの変化を決定する工程をさらに含む、請求項１から４のいずれかに記載の方法。
【請求項6】
対象から得られた生体試料に存在する特異的抗原を認識する１つもしくは複数のＩｇＧサブクラスのレベルもしくはこのレベルの変化を決定する工程をさらに含むか、または特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在を決定する代わりに、対象から得られた生体試料に存在する特異的抗原を認識する１つもしくは複数のＩｇＧサブクラスのレベルもしくはこのレベルの変化を決定する工程を代替的に含むか、または
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在を決定する代わりに、特異的抗原を認識する抗体の優勢なＩｇＧサブクラスのスイッチが起きているかどうかを判定する工程を含む、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＧサブクラスのレベルと比較した特異的抗原を認識する所与のＩｇＧサブクラスのレベルの上昇が、再発の可能性がより高いことを示すか、もしくは対象が再発状態にあることを示すか、もしくは対象を治療すべきであることを示すか、もしくは対象が治療から利益を得る可能性が高いことを示すか、または参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＧサブクラスのレベルと比較して特異的抗原を認識する所与のＩｇＧサブクラスのレベルが上昇しない場合、再発の可能性がより低いことを示すか、もしくは対象が再発状態にないことを示すか、もしくは対象を治療すべきではないことを示すか、もしくは対象が治療から利益を得る可能性が高くないことを示す、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ＩｇＧサブクラスが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３および／またはＩｇＧ４の１つまたは複数、例えばすべてである、請求項６または７のいずれかに記載の方法。
【請求項9】
抗体媒介自己免疫疾患が、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）または脳炎である、請求項１から８のいずれかに記載の方法。
【請求項10】
抗体媒介自己免疫疾患がＮＭＯＳＤである場合、特異的抗原が、ＡＱＰ４であり、および／または抗体媒介自己免疫疾患が脳炎である場合、特異的抗原が、ＬＧＩ１であり、抗体媒介自己免疫疾患が脳炎である場合、方法が、ＣＸＣＬ１３のレベルまたは存在を決定することをさらに含んでもよい、請求項１から９のいずれかに記載の方法。
【請求項11】
抗体媒介自己免疫疾患がＮＭＯＳＤである場合、治療が、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブ、オファツムマブもしくはオクレリズマブ、ステロイド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、ＩＬ－６Ｒを認識するかもしくはＩＬ－６Ｒ活性を低下させるｍＡＢ等の薬剤、ＣＤ１９を認識するかもしくはＣＤ１９活性を低下させるｍＡｂ等の薬剤、補体経路成分の機能を変化させる薬剤（例えば、エクリズマブ）、およびボルテゾミブ等の１つもしくは複数であり、ならびに／または抗体媒介自己免疫疾患が脳炎である場合、治療を１つもしくは複数の免疫治療薬、例えば、コルチコステロイド、免疫グロブリン静注、血漿交換、Ｂ細胞枯渇剤［例えば、リツキシマブ（ＲＴＸ）およびイネビリズマブ］、ＩｇＧ枯渇剤（例えば、ＦｃＲｎ阻害物質）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチルおよびサトラリズマブと併用する、請求項１から１０のいずれかに記載の方法。
【請求項12】
参照試料が、対象から得られた血液、血清、血漿、唾液、リンパ節吸引液、例えば、深頸リンパ節吸引液、または脳脊髄液試料である、請求項３から１１のいずれかに記載の方法。
【請求項13】
参照試料が、対象から得られたリンパ節吸引液、例えば、深頸リンパ節吸引液である、請求項３から１２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオマーカーおよびその使用に関する。特に、抗体関連自己免疫疾患、特に、神経疾患、より詳細には、抗体媒介自己免疫疾患、例えば、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）またはＬＧＩ１抗体脳炎を有する対象の病状を評価するためのバイオマーカーに関する。
【背景技術】
【0002】
視神経脊髄炎スペクトラム障害は、アクアポリン４（ＡＱＰ４）の細胞外ドメインを認識するＩｇＧ自己抗体により引き起こされる。したがって、ＡＱＰ４の細胞外ドメインを認識するＩｇＧ自己抗体の存在は、ＮＭＯＳＤの診断において有用である。
【0003】
ロイシンリッチグリオーマ不活性化タンパク質１（ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｇｌｉｏｍａ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ １）（ＬＧＩ１）を認識するＩｇＧ自己抗体を使用して、患者がてんかん発作、認知障害、末梢神経障害および睡眠障害：ＬＧＩ１抗体脳炎（または抗ＬＧＩ１抗体脳炎）を示す異なる疾病を診断する。ＬＧＩ１自己抗体は、免疫組織化学的および細胞系アッセイを含む多様な方法を使用して検出される。ＬＧＩ１抗体脳炎を有する患者は、コルチコステロイド、免疫グロブリン静注、血漿交換、Ｂ細胞枯渇剤［例えば、リツキシマブ（ＲＴＸ）およびイネビリズマブ］、ＩｇＧ枯渇剤（例えば、ＦｃＲｎ阻害物質）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチルおよびサトラリズマブを含む免疫治療薬に良好に応答し得る。患者の大多数が改善する一方、再発が一般的であり、およそ１０～４０％の割合で発症する。
【0004】
ＡＱＰ４－ＩｇＧは主に、ＩｇＧ１サブクラスの免疫グロブリンであり、この主要な発症機構は、補体により媒介される星状膠細胞の損傷を介する可能性が高い。他の兆候が認識されても、典型的には、脊髄炎および／または視神経炎の離散性の臨床的再発により、患者の身体障害が生じる。治療しなければ、ＮＭＯＳＤを有する患者は、平均で１年に１～５回再発し、各再発とともに生じる身体障害の自然増加を含む健康の段階的悪化を伴う。脳幹を侵す発作により、小さいが死のリスクも存在する。年間再発率は、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、エクリズマブ、サトラリズマブ、イネビリズマブおよび抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるリツキシマブ（ＲＴＸ）（ＣＡＳ１７４７２２－３１－７）を含む多様な免疫治療薬により部分的に低下する。ＮＭＯＳＤを有するほとんどの患者は、このような選ばれた薬物により、生涯にわたって治療され、これらはすべて、場合により重大な異なる副作用を伴う。したがって、このような薬物を処方する場合、警戒レベルが必要とされ、可能であれば、不必要な治療を回避すべきである。
【0005】
ＲＴＸ治療は高額であり、通常、およそ６カ月毎、および／またはＣＤ１９／ＣＤ２７細胞数が増加した場合に投与する。ＲＴＸにより、循環するＢ細胞は効率的に枯渇するが、典型的ＣＤ２０陰性形質細胞は温存され、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベルは着実には低下しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
抗体媒介自己免疫疾患を有する患者の病状を判定するためのさらなるバイオマーカーの必要性が当技術分野において存在する。したがって、抗体媒介自己免疫疾患を有する個体における病状の指標とするために使用し得る１つまたは複数のバイオマーカーを提供することが本発明の目的である。例えば、抗体媒介自己免疫疾患を有する個体が、所与の時点で治療から利益を得る可能性が高いか否かを判定し、および／または抗体媒介自己免疫疾患を有する個体が、再発しているか否かを判定するためにも使用し得るバイオマーカーが挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【0007】
ある態様では、抗体関連自己免疫疾患であると診断されている対象の病状を判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在を決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在を決定することと
を含む、方法を提供する。
【0008】
任意の態様では、抗体関連自己免疫疾患は、神経性自己免疫疾患であり得る。任意の態様の抗体関連自己免疫疾患は、ＮＭＯＳＤ、自己免疫性脳炎の型、例えば、ＮＭＤＡＲ抗体脳炎、尋常性天疱瘡、重症筋無力症、グレーブス病、１型糖尿病、グッドパスチャー症候群、アジソン症候群、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、血栓性血小板減少性紫斑病、血管炎、関節リウマチ、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシー、シェーグレン症候群および悪性貧血からなる群から選択され得る。
【0009】
別の態様では、抗体媒介自己免疫疾患であると診断されている対象の病状を判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在を決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在を決定することと
を含む、方法を提供する。
【0010】
任意の態様の抗体媒介自己免疫疾患は、胚中心反応により駆動し得る。任意の態様の抗体媒介自己免疫疾患は、ＮＭＯＳＤまたは脳炎であり得る。
【0011】
好ましくは、任意の態様の抗体媒介自己免疫疾患は、ＮＭＯＳＤまたは脳炎であり得る。
【0012】
抗体関連自己免疫疾患または抗体媒介自己免疫疾患が脳炎である場合、特異的抗原は、ＬＧＩ１であり得る。
【0013】
抗体関連自己免疫疾患または抗体媒介自己免疫疾患がＮＭＯＳＤである場合、特異的抗原は、ＡＱＰ４であり得る。
【0014】
抗体関連自己免疫疾患が尋常性天疱瘡である場合、特異的抗原は、デスモグレイン、例えば、デスモグレイン１、デスモグレイン２、デスモグレイン３、デスモグレイン４であり得る。
【0015】
抗体関連自己免疫疾患が重症筋無力症である場合、特異的抗原は、アセチルコリン受容体または筋特異的キナーゼ（ＭｕＳＫ）であり得る。
【0016】
抗体関連自己免疫疾患がグレーブス病である場合、特異的抗原は、サイロトロピン（ＴＳＨ）受容体であり得る。
【0017】
抗体関連自己免疫疾患が１型糖尿病、全身硬直症候群スペクトラム障害、運動失調または発作性障害である場合、特異的抗原は、グルタミン酸デカルボキシラーゼであり得る。
【0018】
抗体関連自己免疫疾患がグッドパスチャー症候群である場合、特異的抗原は、コラーゲンであり得る。
【0019】
抗体関連自己免疫疾患がアジソン症候群である場合、特異的抗原は、２１ヒドロキシラーゼであり得る。
【0020】
抗体関連自己免疫疾患がＮＭＤＡＲ抗体脳炎である場合、特異的抗原は、ＮＭＤＡ受容体のＮＲ１サブユニットであり得る。
【0021】
抗体関連自己免疫疾患が全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である場合、特異的抗原は、ＤＮＡまたはＳｍｉｔｈ（Ｓｍ）もしくはリボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）であり得る。
【0022】
抗体関連自己免疫疾患が血栓性血小板減少性紫斑病である場合、特異的抗原は、ＡＤＡＭＴＳ１３であり得る。
【0023】
抗体関連自己免疫疾患が血管炎である場合、特異的抗原は、プロテイナーゼ３およびミエロペルオキシダーゼであり得る。
【0024】
抗体関連自己免疫疾患が関節リウマチである場合、特異的抗原は、１つまたは複数のシトルリン化タンパク質であり得る。
【0025】
抗体関連自己免疫疾患が慢性炎症性脱髄性多発ニューロパシーである場合、特異的抗原は、１つまたは複数のニューロファシン（ｎｅｕｒｏｆａｓｃｉｎ）、コンタクチンまたはｃａｓｐｒであり得る。
【0026】
抗体関連自己免疫疾患がシェーグレン症候群である場合、特異的抗原は、Ｒｏ（ＳＳＡ）および／またはＬａ（ＳＳＢ）であり得る。
【0027】
抗体関連自己免疫疾患が悪性貧血である場合、特異的抗原は、壁細胞上に発現し得る。
【0028】
任意の態様の実施形態では、特異的抗原がＬＧＩ１である場合、方法は、ＣＸＣＬ１３のレベルまたは存在を決定することを、さらにまたは代替的に含み得る。
【0029】
病状の判定は、再発の可能性の決定を含み得る。
【0030】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在および／またはＣＸＣＬ１３の存在は、再発の可能性がより高いことを示し得る。参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルの上昇および／またはＣＸＣＬ１３のレベルの上昇は、再発の可能性がより高いことを示し得る。この結果、対象の再発を治療してもよく、したがって、この判定は、治療薬の投与、既に投与されている治療薬の増加、または治療薬の変更となり得る。
【0031】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の非存在および／またはＣＸＣＬ１３の非存在は、再発の可能性がより低いことを示し得る。参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルの低下もしくは不変および／またはＣＸＣＬ１３のレベルの低下もしくは不変は、再発の可能性がより低いことを示し得る。この結果、対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療の非施術、さらなる治療の非施術、または治療の削減を含み得る。
【0032】
病状の判定は、対象が再発状態にあるかどうかの判定を含み得る。
【0033】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在および／またはＣＸＣＬ１３の存在は、対象が再発状態にあることを示し得る。参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルの上昇および／またはＣＸＣＬ１３のレベルの上昇は、対象が再発状態にあることを示し得る。この結果、対象の再発を治療してもよく、したがって、この判定は、治療薬の投与、既に投与されている治療薬の増加、または治療薬の変更となり得る。
【0034】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の非存在および／またはＣＸＣＬ１３の非存在は、対象が再発状態にないことを示し得る。参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルの低下および／またはＣＸＣＬ１３のレベルの低下もしくは不変は、対象が再発状態にないことを示し得る。この結果、対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療の非施術、さらなる治療の非施術、または治療の削減を含み得る。
【0035】
病状の判定は、対象を治療すべきか、さらなる治療を施術すべきではないか、または治療を削減すべきかの判定を含み得る。
【0036】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在および／またはＣＸＣＬ１３の存在は、対象を治療すべきであることを示し得る。参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルの上昇および／またはＣＸＣＬ１３のレベルの上昇は、対象を治療すべきであり、したがって、この判定が、治療薬の投与、既に投与されている治療薬の増加、または治療薬の変更であり得ることを示し得る。
【0037】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の非存在および／またはＣＸＣＬ１３の非存在は、対象を治療すべきではないか、さらなる治療を施術すべきではないか、または治療を削減すべきであることを示し得る。参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルと比べた、対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルの低下もしくは不変および／またはＣＸＣＬ１３のレベルの低下もしくは不変は、対象を治療すべきであり、したがって、この判定が、治療の非施術、さらなる治療の非施術、または治療の削減を含み得ることを示し得る。
【0038】
ある態様では、抗体媒介自己免疫疾患であると診断されている対象の病状を判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在、および／またはＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在、および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在、および／またはＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在、および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む方法を提供する。
【0039】
好ましくは、ａ）では、ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在は、ＮＭＯＳＤであると既に診断された対象において決定する。
【0040】
好ましくは、ｂ）では、ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在は、ＬＧＩ１脳炎であると既に診断された対象において決定する。
【0041】
別の態様では、抗体関連自己免疫疾患であると診断された対象が再発状態にあるかどうかを判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0042】
別の態様では、抗体媒介自己免疫疾患であると診断された対象が再発状態にあるかどうかを判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0043】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在する場合、対象は再発状態にあると判定し得る。対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象は再発状態にあると判定し得る。この結果、再発状態にあると判定された対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療薬の投与、既に投与されている治療薬の増加、または治療薬の変更となり得る。
【0044】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在しない場合、対象は再発状態にないと判定し得る。対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象は再発状態にないと判定し得る。この結果、再発状態にないと判定された対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療の非施術、さらなる治療の非施術、または治療の削減を含み得る。
【0045】
任意の態様では、抗体媒介自己免疫疾患がＮＭＯＳＤである場合、治療は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブ、オファツムマブまたはオクレリズマブであり得る。他の治療は、例えば、ステロイド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、ＩＬ－６Ｒを認識するかもしくはＩＬ－６Ｒ活性を低下させるｍＡＢ等の薬剤、ＣＤ１９を認識するかもしくはＣＤ１９活性を低下させるｍＡｂ等の薬剤、補体経路成分の機能を変化させる薬剤（例えば、エクリズマブ）、またはボルテゾミブを含む。
【0046】
任意の態様では、抗体媒介自己免疫疾患が脳炎である場合、治療は、１つまたは複数の免疫治療薬、例えば、コルチコステロイド、免疫グロブリン静注、血漿交換、Ｂ細胞枯渇剤［例えば、リツキシマブ（ＲＴＸ）およびイネビリズマブ］、ＩｇＧ枯渇剤（例えば、ＦｃＲｎ阻害物質）、シクロホスファミド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチルおよびサトラリズマブと併用し得る。
【0047】
別の態様では、抗体媒介自己免疫疾患であると診断された対象が再発状態にあるかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む方法を提供する。
【0048】
別の態様では、ＮＭＯＳＤであると診断された対象が再発状態にあるかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
【0049】
ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在する場合、対象は再発状態にあると判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも高い場合、対象は再発状態にあると判定し得る。
【0050】
この結果、再発状態にあると判定された対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療薬の投与、既に投与されている治療薬の増加、または治療薬の変更となり得る。
【0051】
ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在しない場合、対象は再発状態にないと判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象は再発状態にあると判定し得る。この結果、再発状態にないと判定された対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療の非施術、さらなる治療の非施術、または治療の削減を含み得る。
【0052】
別の態様では、脳炎であると診断された対象が再発状態にあるかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
【0053】
脳炎は、ＬＧＩ１を認識するＩｇＧアイソタイプ抗体の存在により媒介および／または診断され得る。
【0054】
ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在する場合、対象は再発状態にあると判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象は再発状態にあると判定し得る。
【0055】
この結果、再発状態にあると判定された対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療薬の投与、既に投与されている治療薬の増加、または治療薬の変更となり得る。
【0056】
ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在しない場合、対象は再発状態にあると判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象は再発状態にあると判定し得る。この結果、再発状態にないと判定された対象を治療してもよく、したがって、この判定は、治療の非施術、さらなる治療の非施術、または治療の削減を含み得る。
【0057】
別の態様では、抗体関連自己免疫疾患であると診断された対象を治療するかどうかを判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0058】
別の態様では、抗体媒介自己免疫疾患であると診断された対象を治療するかどうかを判定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３抗原の存在もしくはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３抗原の存在もしくはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0059】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在する場合、対象を治療すべきであることを判定し得る。対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象を治療すべきであることを判定し得る。
【0060】
特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在しない場合、対象を治療すべきではないか、さらには、さらなる治療は必要としないか、または施術する治療を削減可能であることを判定し得る。対象から得られた生体試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象を治療すべきではないか、さらなる治療は必要としないか、または施術する治療を削減可能であることを判定し得る。
【0061】
別の態様では、抗体媒介自己免疫疾患であると診断された対象を治療するかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＬＧＩ１を認識する１つもしくは複数のＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＬＧＩ１を認識する１つもしくは複数のＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルもしくは存在および／またはＣＸＣＬ１３のレベルもしくは存在を決定することと
を含む方法を提供する。
【0062】
別の態様では、ＮＭＯＳＤであると診断された対象を治療するかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
【0063】
ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在する場合、対象を治療すべきであることを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも高い場合、対象を治療すべきであることを判定し得る。
【0064】
ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在しない場合、対象を治療すべきではないことを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象を治療すべきではないことを判定し得る。
【0065】
別の態様では、脳炎であると診断された対象を治療するかどうかを判定する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと
を含む方法を提供する。
【0066】
脳炎は、ＬＧＩ１を認識するＩｇＧアイソタイプ抗体の存在により媒介および／または診断され得る。
【0067】
ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在する場合、対象を治療すべきであることを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象を治療すべきであることを判定し得る。
【0068】
ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在しない場合、対象を治療すべきではないことを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象を治療すべきではないことを判定し得る。
【0069】
別の態様では、抗体関連自己免疫疾患であると診断されている対象を同定する方法であって、抗体が、特異的抗原を認識し、対象が、治療から利益を得る可能性が高く、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0070】
別の態様では、ＮＭＯＳＤであると診断されている対象を同定する方法であって、対象が、治療から利益を得る可能性が高く、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0071】
ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在する場合、対象が治療から利益を得る可能性が高いことを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも高い場合、対象が治療から利益を得る可能性が高いことを判定し得る。
【0072】
ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在しない場合、対象がさらなる治療から利益を得る可能性が高くないか、または治療を削減し得ることを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象がさらなる治療から利益を得る可能性が高くないか、または治療を削減し得ることを判定し得る。
【0073】
別の態様では、脳炎であると診断されている対象を同定する方法であって、対象が、治療から利益を得る可能性が高く、方法が、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと
を含む、方法を提供する。
【0074】
脳炎は、ＬＧＩ１を認識するＩｇＧアイソタイプ抗体の存在により媒介および／または診断され得る。
【0075】
ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在する場合、対象が治療から利益を得る可能性が高いことを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象が治療から利益を得る可能性が高いことを判定し得る。
【0076】
ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／またはＣＸＣＬ１３が存在しない場合、患者がさらなる治療から利益を得る可能性が高くないか、または治療を削減し得ることを判定し得る。対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３のレベルよりも低いか、またはこれと同一である場合、対象がさらなる治療から利益を得る可能性が高くないか、または治療を削減し得ることを判定し得る。
【0077】
別の態様では、ＮＭＯＳＤであると診断されている対象を治療する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと、
ｃ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在する場合、または対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも高い場合、対象を治療することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在またはレベルを決定することと、
ｃ）ＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体が存在する場合、または対象から得られた生体試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルが、参照試料におけるＡＱＰ４を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルよりも高い場合、対象を治療することと
を含む方法を提供する。
【0078】
別の態様では、脳炎であると診断されている対象を治療する方法であって、
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと、
ｃ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／もしくはＣＸＣＬ１３が存在する場合、または対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／もしくはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／もしくはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象の脳炎を治療することと
を含む方法を提供する。
ａ）対象から得られた生体試料を用意することと、
ｂ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の存在もしくはレベルおよび／またはＣＸＣＬ１３の存在もしくはレベルを決定することと、
ｃ）ＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体および／もしくはＣＸＣＬ１３が存在する場合、または対象から得られた生体試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／もしくはＣＸＣＬ１３のレベルが、参照試料におけるＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルおよび／もしくはＣＸＣＬ１３のレベルよりも高い場合、対象の脳炎を治療することと
を含む方法を提供する。
【0079】
脳炎は、ＬＧＩ１を認識するＩｇＧアイソタイプ抗体の存在により媒介および／または診断され得る。
【0080】
任意の態様の方法は、対象から得られた生体試料に存在する特異的抗原を認識する１つまたは複数の他のＩｇアイソタイプのレベルまたはこのレベルの変化を決定する工程をさらに含み得る。１つまたは複数のＩｇアイソタイプは、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＤであり得る。
【0081】
任意の態様の方法は、対象から得られた生体試料に存在する１つまたは複数のIgアイソタイプにより認識される優勢なエピトープの変化を決定する工程をさらに含み得る。１つまたは複数のＩｇアイソタイプは、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡおよび／またはＩｇＤであり得る。
【0082】
任意の態様の方法は、対象から得られた生体試料に存在する特異的抗原を認識する１つまたは複数のＩｇＧサブクラスのレベルまたはこのレベルの変化を決定する工程をさらに含み得る。加えて、またはあるいは、任意の態様の方法は、特異的抗原を認識する抗体の優勢なＩｇＧサブクラスのスイッチが起きているかどうかを判定する工程をさらに含み得る。
【0083】
あるいは、特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在を決定する代わりに、任意の態様の方法は、対象から得られた生体試料に存在する特異的抗原を認識する１つまたは複数のＩｇＧサブクラスのレベルまたはこのレベルの変化を決定する工程を含み得る。
【0084】
あるいは、特異的抗原を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベルまたは存在を決定する代わりに、任意の態様の方法は、特異的抗原を認識する抗体の優勢なＩｇＧサブクラスのスイッチが起きているかどうかを判定する工程を含み得る。
【0085】
参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＧサブクラスのレベルと比較した特異的抗原を認識する所与のＩｇＧサブクラスのレベルの変化、例えば、上昇もしくは低下、または特異的抗原を認識するＩｇＧ抗体の優勢なＩｇＧサブクラスにおけるスイッチは、再発の可能性がより高いこと、または対象が再発状態にあること、または対象を治療すべきであること、または対象が治療から利益を得る可能性が高いことを示し得る。この結果、対象を治療し得る。治療は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブと併用し得る。あるいは、または加えて、治療は、抗ＣＤ２０抗体、例えば、リツキシマブ、オファツムマブまたはオクレリズマブ、ステロイド、アザチオプリン、ミコフェノール酸モフェチル、ＩＬ－６Ｒを認識するかまたはＩＬ－６Ｒ活性を低下させるｍＡＢ等の薬剤、ＣＤ１９を認識するかまたはＣＤ１９活性を低下させるｍＡｂ等の薬剤、補体経路成分の機能を変化させる薬剤（例えば、エクリズマブ）、およびボルテゾミブ等の１つまたは複数と併用し得る。
【0086】
参照試料における特異的抗原を認識するＩｇＧサブクラスのレベルと比較した特異的抗原を認識する所与のＩｇＧサブクラスのレベルの変化は、特異的抗原を認識するＩｇＧサブクラスのレベルの約１０％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、約５０％以上の上昇または低下であり得る。
【0087】
特異的抗原を認識する所与のＩｇＧサブクラスのレベルの上昇は、試料における特異的抗原を認識する総ＩｇＧの少なくとも約５０％以上、少なくとも約６０％以上、少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％以上、少なくとも約９０％以上への上昇であり得る。
【0088】
一例では、特異的抗原を認識する所与のＩｇＧサブクラスのレベルが、試料における特異的抗原を認識する総ＩｇＧの例えば、少なくとも約５０％以上、少なくとも約６０％以上、少なくとも約７０％以上、少なくとも約８０％以上、少なくとも約９０％以上に上昇しない場合には、これは、再発のリスクが低く、対象が再発状態になく、したがって、対象を治療する必要はない可能性を有するか、または対象がさらなる治療を必要としない可能性を有するか、または施術する治療を削減し得ることを示し得る。
【0089】
特異的抗原は、ＡＱＰ４であり得る。特には、抗体媒介自己免疫疾患がＮＭＯＳＤである場合、特異的抗原は、ＡＱＰ４であり得る。
【0090】
ＩｇＧサブクラスは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４であり得る。
【0091】
任意の態様の抗体媒介自己免疫疾患は、対象におけるＬＧＩ１、ＣＡＳＰＲ２およびＮＭＤＡ受容体に対する抗体の存在またはこのレベル上昇と関連する自己免疫性脳炎であり得る。
【0092】
本発明は、抗体媒介自己免疫疾患において、抗体媒介自己免疫疾患に臨床的に関係づけられる特異的抗原、例えば、ＮＭＯＳＤではＡＱＰ４および／または脳炎ではＬＧＩ１を認識するＩｇＭの出現またはこのレベルの上昇が、対象が再発状態にあるかまたは再発しかかっている可能性が高いことの、ロバストであり統計学的に有意な指標または予測因子であるという実証に基づく。また、強力な陰性適中度（ｐｒｅｄｉｃａｔｉｖｅ ｖａｌｕｅ）は、特異的抗原を認識するＩｇＭの非存在および／またはＣＸＣＬ１３のレベルに注目することにより実証することができる。また、発明者らは、再発または非再発の適中度を、試料における異なるＩｇＧサブクラスの相対レベルを測定することにより強化することが可能であることを実証する。優勢なＩｇＧサブクラスにおけるスイッチは、対象が再発状態にあるかまたは再発しかかっている可能性が高い、さらなる陽性指標であり、一方、優勢なＩｇＧサブクラスにおける未変化により、再発の陰性予測因子値（ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ ｖａｌｕｅ）が強化され得ることを実証する。したがって、本発明により、対象を治療するか否か、またはこれらの治療を変更するどうかの意思決定を行うことが可能となる。これにより、再発状態にあるかまたは再発しかかっている可能性が高い患者における再発の臨床的兆候の重症度の低下が可能となる可能性を有し、一方、本明細書に開示の任意の方法の前後に再発状態になく、および／または再発しかかっている可能性が高くない患者を治療しない決定により、不必要な治療、不必要な副作用および不必要な消費を防ぎ得る。例えば、ＮＭＯＳＤを有する患者のためのリツキシマブ治療は、非常に高額であり得る。また、抗体媒介自己免疫疾患のための治療は、重大な副作用を有し、したがって、不必要な治療を回避させることは重要である。
【0093】
一般的定義
用語「抗体関連自己免疫疾患」は、特異的抗原に対する抗体の存在またはこのレベルの上昇が、疾患に関連づけられる自己免疫疾患を指す。このような抗体は、疾患の確立または進行に寄与する可能性を有しても有しなくてもよい。すなわち、抗体は、自己免疫疾患に相関性であって、この原因ではない可能性を有する。
用語「抗体関連自己免疫疾患」は、特異的抗原に対する抗体の存在またはこのレベルの上昇が、疾患に関連づけられる自己免疫疾患を指す。このような抗体は、疾患の確立または進行に寄与する可能性を有しても有しなくてもよい。すなわち、抗体は、自己免疫疾患に相関性であって、この原因ではない可能性を有する。
【0094】
用語「抗体媒介自己免疫疾患」は、特異的抗原に対する抗体の存在またはこのレベルの上昇が、疾患の確立もしくは進行および／または疾患の１つもしくは複数の症候に寄与する自己免疫疾患を指す。
【0095】
用語「再発」は、抗体産生の増加により典型的に引き起こされる抗体媒介自己免疫疾患と関連する臨床的兆候（１つまたは複数）の再発症を指す。
【0096】
用語「高い」および「より高い」は、本明細書において使用する場合、測定するパラメーターの少なくとも１０％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも１００％以上、少なくとも２０００％以上、少なくとも５００％以上、少なくとも１０００％以上の上昇を指し得る。あるいは、用語「高い」および「より高い」は、本明細書において使用する場合、測定するパラメーターの少なくとも２倍以上、少なくとも５倍以上、少なくとも１０倍以上、少なくとも２０倍以上、少なくとも５０倍以上、少なくとも１００倍以上、少なくとも５００倍以上、少なくとも１０００倍以上、少なくとも１００００倍以上の上昇を指し得る。
【0097】
用語「低い」および「より低い」は、本明細書において使用する場合、測定するパラメーターの少なくとも１０％以上、少なくとも２０％以上、少なくとも３０％以上、少なくとも４０％以上、少なくとも５０％以上、少なくとも６００％以上、少なくとも７０％以上、少なくとも８００％以上、少なくとも９０％以上の低下を指し得る。
【0098】
用語「生体試料」は、目的の対象から得られる生体液の試料を指す。好ましい生体試料としては、血液、血清、血漿、唾液、リンパ節吸引液、例えば、深頸リンパ節吸引液および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。加えて当業者は、分画または精製手順、例えば、全血を血清または血漿成分に分離した後に一部の検査試料がさらに容易に解析されることを理解している。好ましくは、生体試料は、血液またはリンパ節吸引液、例えば、深頸リンパ節吸引液由来である。本明細書に示すデータは、胚中心反応を含む根底にある生体機構を示唆し、したがって、リンパ節吸引液により、ＩｇＭおよびＩｇＧのサブクラスのレベルの変化のさらに直接的な尺度がもたらされ得る。胚中心は、エピトープ多様化およびアイソタイプスイッチング（クラススイッチ組換えとも呼ぶ）の部位であることも知られ、ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラススイッチの存在または増加が、胚中心の他の特徴である可能性がある。
【0099】
生体試料は、対象から得られた血漿試料であり得る。
【0100】
本明細書において使用する場合、「参照試料」は、例えば、対象が再発状態にないと判定された場合の、異なる時点において対象から得られた対応する試料、例えば、血液試料またはリンパ節吸引液、例えば、深頸リンパ節吸引液であり得る。あるいは、参照試料は、第１の対象と同一の抗体媒介自己免疫疾患であると診断されていない異なる対象から得られた対応する試料、例えば、血液試料またはリンパ節吸引液、例えば、深頸リンパ節吸引液であり得る。
【0101】
試料を得る工程は、好ましくは、本発明の一部を形成しない。
【0102】
用語「レベル」は、本明細書において使用する場合、特異的抗原、例えば、ＡＱＰ４および／もしくはＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体の量もしくは濃度、または生体試料に含まれるＣＸＣＬ１３の量もしくは濃度を指す。
【0103】
句「病状」は、抗体媒介自己免疫疾患の任意の兆候を含む。好ましくは、病状は、対象における再発の存在もしくは可能性、および／または対象が治療から利益を得るかどうかを指す。
【0104】
特異的抗原、例えば、ＡＱＰ４および／もしくはＬＧＩ１を認識するＩｇＭアイソタイプ抗体のレベル、ならびに／またはＣＸＣＬ１３のレベルは、任意の適する方法により評価し得る。例えば、タンパク質レベルを決定する場合、免疫測定、分光測定、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、免疫沈降、スロットまたはドットブロットアッセイ、等電点電気泳動、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび抗体マイクロアレイ免疫組織染色、放射免疫測定（ＲＩＡ）、蛍光免疫測定、アビジン－ビオチンまたはストレプトアビジン－ビオチン系等を使用する免疫測定、ならびにこれらの組合せを含む群のいずれかを使用し得る。このような方法は、当業者に周知である。他の方法をも使用し得る。
【0105】
本明細書に記載の方法は、インビトロ（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で実行し得る。
【0106】
対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、サル、類人猿、げっ歯動物、ハムスター、ラットまたはモルモットであり得る。好ましくは、対象は、ヒトである。
【0107】
当業者は、本発明のいずれか１つの実施形態および／または態様の好ましい特徴を、本発明の他のすべての実施形態および／または態様に適用し得ることを理解する。
【0108】
ここで、添付の図面を参照して、単なる例として本発明の詳細な説明に進む。
【図面の簡単な説明】
【0109】
【図1-1】図１は、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）を有する患者における再発およびリツキシマブ（ＲＴＸ）投与との血清学的関連性を実証する。Ａ．ゼロ時点のＲＴＸを投与したＮＭＯＳＤ患者３５人における再発に対するＲＴＸ投与の作用。リンパ節（ＬＮ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料採取のタイミングを示す（星）。Ｂ．ＲＴＸ前およびＲＴＸ後の患者間で（ｐ＜０．００１）ならびにＲＴＸを投与しない患者と（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定）比較した最後の経過観察における年間再発率（ＡＲＲ）。Ｃ．アクアポリン４免疫グロブリンＧ（ＡＱＰ４－ＩｇＧ）エンドポイント希釈は、数回のＲＴＸ注入後に低下しなかった（ｐ＝０．９９、クラスカル・ウォリス検定）。Ｄ．ＲＴＸを投与したか（ｎ＝２２）またはＲＴＸに対してナイーブ（ｎ＝２８）のいずれかの患者における再発（ｘ）および優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラス間の関連性（全ＡＱＰ４－ＩｇＧの５０％超、上パネル）、ＡＱＰ４－ＩｇＭレベル（中央パネル）および全ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル（下パネル）を表すヒートマップ。Ｅ．第１のＲＴＸ注入前の日数を示す負の値を有する個々の患者（６、７および１０）における詳細な例。
【図1-2】図１は、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）を有する患者における再発およびリツキシマブ（ＲＴＸ）投与との血清学的関連性を実証する。Ａ．ゼロ時点のＲＴＸを投与したＮＭＯＳＤ患者３５人における再発に対するＲＴＸ投与の作用。リンパ節（ＬＮ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料採取のタイミングを示す（星）。Ｂ．ＲＴＸ前およびＲＴＸ後の患者間で（ｐ＜０．００１）ならびにＲＴＸを投与しない患者と（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定）比較した最後の経過観察における年間再発率（ＡＲＲ）。Ｃ．アクアポリン４免疫グロブリンＧ（ＡＱＰ４－ＩｇＧ）エンドポイント希釈は、数回のＲＴＸ注入後に低下しなかった（ｐ＝０．９９、クラスカル・ウォリス検定）。Ｄ．ＲＴＸを投与したか（ｎ＝２２）またはＲＴＸに対してナイーブ（ｎ＝２８）のいずれかの患者における再発（ｘ）および優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラス間の関連性（全ＡＱＰ４－ＩｇＧの５０％超、上パネル）、ＡＱＰ４－ＩｇＭレベル（中央パネル）および全ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル（下パネル）を表すヒートマップ。Ｅ．第１のＲＴＸ注入前の日数を示す負の値を有する個々の患者（６、７および１０）における詳細な例。
【図1-3】図１は、視神経脊髄炎スペクトラム障害（ＮＭＯＳＤ）を有する患者における再発およびリツキシマブ（ＲＴＸ）投与との血清学的関連性を実証する。Ａ．ゼロ時点のＲＴＸを投与したＮＭＯＳＤ患者３５人における再発に対するＲＴＸ投与の作用。リンパ節（ＬＮ）および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料採取のタイミングを示す（星）。Ｂ．ＲＴＸ前およびＲＴＸ後の患者間で（ｐ＜０．００１）ならびにＲＴＸを投与しない患者と（ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定）比較した最後の経過観察における年間再発率（ＡＲＲ）。Ｃ．アクアポリン４免疫グロブリンＧ（ＡＱＰ４－ＩｇＧ）エンドポイント希釈は、数回のＲＴＸ注入後に低下しなかった（ｐ＝０．９９、クラスカル・ウォリス検定）。Ｄ．ＲＴＸを投与したか（ｎ＝２２）またはＲＴＸに対してナイーブ（ｎ＝２８）のいずれかの患者における再発（ｘ）および優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラス間の関連性（全ＡＱＰ４－ＩｇＧの５０％超、上パネル）、ＡＱＰ４－ＩｇＭレベル（中央パネル）および全ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル（下パネル）を表すヒートマップ。Ｅ．第１のＲＴＸ注入前の日数を示す負の値を有する個々の患者（６、７および１０）における詳細な例。
【図2-1】図２は、頸部リンパ節吸引液が、ＲＴＸ投与後に抑制されるＡＱＰ４抗体を含むことを示す。Ａ．解剖学的レベルにわたる頸部リンパ節（ＬＮ）を超音波ガイド下で吸引した。また、対応する血液を試料採取し、両部位から細胞性および可溶性画分が生じた。Ｂ．著しく異なるレベルの総ＩｇＧ（塗りつぶした記号）およびＩｇＭ（空の記号）を、ＬＮ吸引液（記号の輪郭が薄いもの、ＩｇＧ希釈１：８００；ＩｇＭ希釈１：１００）対ＮＭＯＳＤ患者の対応する血清（記号の輪郭が濃いもの、ＩｇＧ希釈１：１０００００；ＩｇＭ希釈１：６４００）において測定した。Ｃ．ＰＢＭＣおよびＬＮ細胞集団間の差が、単球：リンパ球の比ならびに移行期Ｂ細胞および濾胞ヘルパーＴ（ＴｆＨ）細胞の両方の出現頻度により強調され（すべてｐ＜０．００１、ウィルコクソン符号順位検定）、超音波試料採取により、夾雑がわずかであったことが確認される。Ｄ．ＡＱＰ４増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）トランスフェクト生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（緑色）の表面およびマウス生星状膠細胞（グリア線維酸性タンパク質、ＧＦＡＰ、緑色により同定）の表面に（抗ヒトＩｇＧ、赤色を）結合させることにより吸引液においてＡＱＰ４－ＩｇＧを検出した。Ｅ．血清（濃く塗りつぶした棒）およびＬＮ吸引液（薄く塗りつぶした棒）におけるＡＱＰ４－ＩｇＧレベルを、ＲＴＸに対してナイーブな患者（ｎ＝７、このうち２人：患者５および９はＲＴＸ投与を開始）において、ＲＴＸ注入１回の後０．５～６カ月（ｎ＝４）およびＲＴＸ注入２回以上の後０．５～１３カ月（ｎ＝７、長期的に試料採取した２人：患者２および４を含む）に測定した。Ｆ．ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル（エンドポイント希釈）：総ＩｇＧレベルの比を、ＬＮおよび血清について算出した（ｐ＝０．０２、ウィルコクソン符号順位検定）。図２Ｅでは、大型の点により、検出可能なＡＱＰ４－ＩｇＧを有するＲＴＸ処置患者２人を同定する。（Ｇ）ＬＮ吸引液（ｐ＝０．０４、マン・ホイットニーＵ検定）および血清（非有意）の絶対ＡＱＰ４－ＩｇＧレベルにおけるＲＴＸを受けた患者対受けなかった患者の比較。
【図2-2】図２は、頸部リンパ節吸引液が、ＲＴＸ投与後に抑制されるＡＱＰ４抗体を含むことを示す。Ａ．解剖学的レベルにわたる頸部リンパ節（ＬＮ）を超音波ガイド下で吸引した。また、対応する血液を試料採取し、両部位から細胞性および可溶性画分が生じた。Ｂ．著しく異なるレベルの総ＩｇＧ（塗りつぶした記号）およびＩｇＭ（空の記号）を、ＬＮ吸引液（記号の輪郭が薄いもの、ＩｇＧ希釈１：８００；ＩｇＭ希釈１：１００）対ＮＭＯＳＤ患者の対応する血清（記号の輪郭が濃いもの、ＩｇＧ希釈１：１０００００；ＩｇＭ希釈１：６４００）において測定した。Ｃ．ＰＢＭＣおよびＬＮ細胞集団間の差が、単球：リンパ球の比ならびに移行期Ｂ細胞および濾胞ヘルパーＴ（ＴｆＨ）細胞の両方の出現頻度により強調され（すべてｐ＜０．００１、ウィルコクソン符号順位検定）、超音波試料採取により、夾雑がわずかであったことが確認される。Ｄ．ＡＱＰ４増強緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）トランスフェクト生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（緑色）の表面およびマウス生星状膠細胞（グリア線維酸性タンパク質、ＧＦＡＰ、緑色により同定）の表面に（抗ヒトＩｇＧ、赤色を）結合させることにより吸引液においてＡＱＰ４－ＩｇＧを検出した。Ｅ．血清（濃く塗りつぶした棒）およびＬＮ吸引液（薄く塗りつぶした棒）におけるＡＱＰ４－ＩｇＧレベルを、ＲＴＸに対してナイーブな患者（ｎ＝７、このうち２人：患者５および９はＲＴＸ投与を開始）において、ＲＴＸ注入１回の後０．５～６カ月（ｎ＝４）およびＲＴＸ注入２回以上の後０．５～１３カ月（ｎ＝７、長期的に試料採取した２人：患者２および４を含む）に測定した。Ｆ．ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル（エンドポイント希釈）：総ＩｇＧレベルの比を、ＬＮおよび血清について算出した（ｐ＝０．０２、ウィルコクソン符号順位検定）。図２Ｅでは、大型の点により、検出可能なＡＱＰ４－ＩｇＧを有するＲＴＸ処置患者２人を同定する。（Ｇ）ＬＮ吸引液（ｐ＝０．０４、マン・ホイットニーＵ検定）および血清（非有意）の絶対ＡＱＰ４－ＩｇＧレベルにおけるＲＴＸを受けた患者対受けなかった患者の比較。
【図3】図３は、ＮＭＯＳＤを有する患者のリンパ節および血液由来のアクアポリン４特異的Ｂ細胞の特性決定を示す。Ａ．対応する血液（左）およびＬＮ（右）試料の単一Ｂ細胞（ＣＤ３－ＣＤ１９＋）を検出抗体で標識し、単一細胞としてインデックスソーティングし、培養した。２２日目までに、細胞の約５０％が増殖し、抗体分泌細胞に分化する（ＣＤ１９細胞をゲーティングしてＣＤ２７、ＣＤ３８およびＣＤ１３８発現を示した）。インデックス作成により、本来のＢ細胞サブセット：ナイーブ、二重陰性（ＤＮ）、ＩｇＤ－およびＩｇＤ＋メモリー（Ｍｅｍ）が明らかとなった。Ｂ．ＡＱＰ４反応性ＩｇＧ／Ｍ上清を、表面ＡＱＰ４－ＥＧＦＰを発現する生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（緑色）に対する反応性（赤色）により同定した。Ｃ．患者３人からＬＮ（薄く塗りつぶした棒）およびＰＢＭＣ（濃く塗りつぶした棒）において検出されたＡＱＰ４特異的Ｂ細胞出現頻度。Ｄ．このようなＡＱＰ４特異的Ｂ細胞受容体１１種の重および軽鎖（７および１１はそれぞれシーケンシング）は、４つすべてのＢ細胞サブセットから生じ、多様な遺伝子ファミリー（重可変ＩＧＨＶ３は三角およびＩＧＨＶ４は菱形）ならびに軽鎖の用途（カッパまたはラムダはそれぞれ四角および円）を示した。また、上清において検出されたアイソタイプ（ＡＱＰ４－ＩｇＭ／ＩｇＧ、三角および円）ならびに源組織（ＬＮまたはＰＢＭＣ、中空および塗りつぶした形）を示す。
【図4】図４は、リツキシマブ投与後に節内Ｂ細胞が急速かつ効率的に枯渇することを実証する。Ａ．ＲＴＸ投与後、ＬＮ（薄く塗りつぶした円、ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定）および血液（濃く塗りつぶした円、ｐ＜０．００１、マン・ホイットニーＵ検定）両方のＢ細胞（ＣＤ１４－ＤＡＰＩ－ＣＤ３－ＣＤ１９＋）は、著しく枯渇した。Ｂ．ＬＮにおける枯渇は、ＲＴＸ注入２回以上対１回のみの後に患者においてさらに明白となった（ｐ＝０．０４、マン・ホイットニーＵ検定）。Ｃ．第１のＲＴＸ注入前後に試料採取した患者２人（患者５および９）ならびにＲＴＸ注入後に経時的時点で試料採取した２人（患者２および４）では、ＬＮ吸引液におけるＡＱＰ４－ＩｇＧ（中央）およびＬＮ Ｂ細胞出現頻度（右）の両方の著しい低下とは対照的に、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル（左）は不変であった。
【図5-1】図５は、試料採取および検査手順およびフローサイトメトリーゲーティング戦略の概要を提供する。Ａ．ＲＴＸ投与有り無しの患者および疾患対照間で試料がどのように分布したかを示すベン図。中央右の領域の患者２人は、第１のＲＴＸ投与前後の両方において、ＬＮ吸引を含む評価を実施した個体を表す。外側下の円内のみの個体は、ＬＮ吸引を受けた疾患対照１４人を表す。Ｂ．ゲーティング戦略。ＬＮ／ＰＢＭＣ試料対３６種中２３種についてのＣＤ４５染色が利用可能であった。パネルに含まれない場合、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７および／またはＣＤ３８のいずれかに対して陽性であれば、現象は認められた（「ブールゲート（Ｂｏｏｌｅａｎ ｇａｔｅ）」）。ＣＤ４５陽性集団の表現型を示す代表的な例またはブールゲート範囲内の現象は、特定不能であった。Ｃ．フローサイトメトリーデータ解析のための包括的ゲーティング戦略。濃い輪郭で仕切られたゲートは、調査した集団を表す。
【図5-2】図５は、試料採取および検査手順およびフローサイトメトリーゲーティング戦略の概要を提供する。Ａ．ＲＴＸ投与有り無しの患者および疾患対照間で試料がどのように分布したかを示すベン図。中央右の領域の患者２人は、第１のＲＴＸ投与前後の両方において、ＬＮ吸引を含む評価を実施した個体を表す。外側下の円内のみの個体は、ＬＮ吸引を受けた疾患対照１４人を表す。Ｂ．ゲーティング戦略。ＬＮ／ＰＢＭＣ試料対３６種中２３種についてのＣＤ４５染色が利用可能であった。パネルに含まれない場合、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２７および／またはＣＤ３８のいずれかに対して陽性であれば、現象は認められた（「ブールゲート（Ｂｏｏｌｅａｎ ｇａｔｅ）」）。ＣＤ４５陽性集団の表現型を示す代表的な例またはブールゲート範囲内の現象は、特定不能であった。Ｃ．フローサイトメトリーデータ解析のための包括的ゲーティング戦略。濃い輪郭で仕切られたゲートは、調査した集団を表す。
【図6】図６では、ＲＴＸ投与が、ＬＮ吸引液および対応する血清における検出可能なＡＱＰ４－ＩｇＧ／Ｍの非存在と関連することを実証する。ＲＴＸナイーブＮＭＯＳＤ患者７人由来の対応する血清およびＬＮ吸引液の両方は、検出可能な表面星状膠細胞結合（およびＡＱＰ４－ＩｇＧ、例えば、図２Ｄ）を含んだ。加えて、このようなＬＮ吸引液２／７種は、ＡＱＰ４－ＩｇＭを含み、対応する血清では、これらは検出されなかった。対照的に、星状膠細胞結合は、ＲＴＸを投与した患者由来のＬＮ吸引液２／１１種においてのみ検出された。ＧＦＡＰに特異的な市販の抗体により、これらが星状膠細胞として名付けられたことが確認された。スケールバー１０μｍ。
【図7】図７は、ＡＱＰ４発現Ｂ細胞の表現型のインデックス作成を示す。左側のプロットの点は、ＰＢＭＣにおいて見出された細胞を表し、一方、右側のプロット点上の点は、ＬＮにおいて見出された細胞を患者３人にわたって表す。
【図8】図８は、疾患対照およびＲＴＸ後またはＲＴＸ対してナイーブなＮＭＯＳＤ患者にわたって比較したＰＢＭＣおよびＬＮにおけるＢおよびＴ細胞サブセット出現頻度を示す。Ａ．ＩｇＤ＋ＣＤ２７－ナイーブおよびＩｇＤ－ＣＤ２７＋メモリーＢ細胞サブセット出現頻度を全ＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセンテージとして表す。Ｂ：ＣＤ２０＋ＣＤ３＋サブセット出現頻度（ＣＤ２０＋Ｔ細胞）を全ＣＤ３＋細胞のパーセンテージとして表す。Ｃ．ＣＤ１９＋ＣＤ２０－ＣＤ３８＋抗体分泌細胞（ＡＳＣ）サブセット出現頻度を全ＣＤ１９＋Ｂ細胞のパーセンテージとして表す。Ｄ．ＣＤ４＋ＣＸＣＲ５＋ＰＤ－１＋＋濾胞ヘルパーＴサブセット出現頻度を全ＣＤ３＋細胞のパーセンテージとして表す。すべての集団では、親集団において５０細胞超を有する個体のみ（すなわち、ＣＤ１９＋またはＣＤ３＋）が含まれた。Ｂ細胞現象６７０４の中央値（範囲６１～９９６２９）を解析した。全２０の比較についてベンジャミン・ホッホバーグ補正（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）後に統計学的解析とマン・ホイットニーＵ検定を行った。
【図9-1】図９は、頸部リンパ節穿刺吸引（ＦＮＡ）を受けた患者の臨床的特性の概要を述べる。ＲＴＸで処置したＮＭＯＳＤ患者９人およびＲＴＸ対してナイーブなＮＭＯＳＤ患者５人においてＦＮＡを実施した（全体的に見て、疾患状態に入って５９カ月の中央値において試料採取した；範囲２１～１８０）。また、他の自己免疫性および非自己免疫性神経症状を有する患者１４人においてＦＮＡを実施した。ＦＮＡは、患者２人（ＮＭＯＳＤ＃５、ＮＭＯＳＤ＃９）においてＲＴＸ前後に、および他の患者２人（ＮＭＯＳＤ＃２、ＮＭＯＳＤ＃４）においてＲＴＸ後の２つの時点で実施した。このような患者４人では、ＦＮＡは、同一のリンパ節由来であった。全体的に見て、頸部リンパ節の解剖学的レベルＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶを試料採取した。ＡＲＲ＝年間再発率、ＡＺＡ＝アザチオプリン、ＣｙＰ＝シクロホスファミド、ＦＮＡ＝穿刺吸引、ＧＡＤ－Ａｂ－Ｅ＝グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体脳炎、ＧｌｙＲ－Ａｂ－Ｅ＝グリシン受容体抗体脳炎、ＬＧＩ１－Ａｂ－Ｅ＝ロイシンリッチグリオーマ不活性化１抗体脳炎、ＭＭＦ＝ミコフェノール酸モフェチル、ＭＴＸ＝ミトキサントロン、ＮＭＤＡＲ－Ａｂ－Ｅ＝Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体抗体脳炎、ＮＭＯＳＤ＝視神経脊髄炎スペクトラム障害、Ｐｒｅｄ＝プレドニゾン、ＲＴＸ＝リツキシマブ。
【図9-2】図９は、頸部リンパ節穿刺吸引（ＦＮＡ）を受けた患者の臨床的特性の概要を述べる。ＲＴＸで処置したＮＭＯＳＤ患者９人およびＲＴＸ対してナイーブなＮＭＯＳＤ患者５人においてＦＮＡを実施した（全体的に見て、疾患状態に入って５９カ月の中央値において試料採取した；範囲２１～１８０）。また、他の自己免疫性および非自己免疫性神経症状を有する患者１４人においてＦＮＡを実施した。ＦＮＡは、患者２人（ＮＭＯＳＤ＃５、ＮＭＯＳＤ＃９）においてＲＴＸ前後に、および他の患者２人（ＮＭＯＳＤ＃２、ＮＭＯＳＤ＃４）においてＲＴＸ後の２つの時点で実施した。このような患者４人では、ＦＮＡは、同一のリンパ節由来であった。全体的に見て、頸部リンパ節の解剖学的レベルＩ、ＩＩ、ＩＩＩおよびＶを試料採取した。ＡＲＲ＝年間再発率、ＡＺＡ＝アザチオプリン、ＣｙＰ＝シクロホスファミド、ＦＮＡ＝穿刺吸引、ＧＡＤ－Ａｂ－Ｅ＝グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体脳炎、ＧｌｙＲ－Ａｂ－Ｅ＝グリシン受容体抗体脳炎、ＬＧＩ１－Ａｂ－Ｅ＝ロイシンリッチグリオーマ不活性化１抗体脳炎、ＭＭＦ＝ミコフェノール酸モフェチル、ＭＴＸ＝ミトキサントロン、ＮＭＤＡＲ－Ａｂ－Ｅ＝Ｎ－メチル－Ｄ－アスパラギン酸受容体抗体脳炎、ＮＭＯＳＤ＝視神経脊髄炎スペクトラム障害、Ｐｒｅｄ＝プレドニゾン、ＲＴＸ＝リツキシマブ。
【図10】図１０は、単一Ｂ細胞培養物から回収したＡＱＰ４特異的Ｂ細胞受容体配列の特性を実証する。表は、患者数、Ｂ細胞サブセット（ナイーブ［ＣＤ２７－ＩｇＤ＋］、二重陰性［ＣＤ２７－ＩｇＤ－］、ＩｇＤ＋メモリー［ＣＤ２７＋ＩｇＤ＋］、ＩｇＤ－メモリー［ＣＤ２７＋ＩｇＤ－］）を単離した組織、ならびに重鎖（培養物において検出されたアイソタイプ、予測ＶおよびＪ遺伝子アレル、ならびに可変領域変異の総数；www.imgt.com）および軽鎖（ラムダまたはカッパ；予測ＶおよびＪ遺伝子アレル、ならびに可変領域変異の総数；www.imgt.com）の両方の特性を示す。４つのＢ細胞からは、重鎖は、増幅しなかった（Ｎ／Ａ）。
【図11】図１１は、ＡＱＰ４ＩｇＭ力価の異なるカットオフによる感度および（１－特異度）を示す受信者動作特性曲線である。両方のｌｏｇ力価、ＡＱＰ４－ＩｇＭの存在およびレベルの変化により、再発が強力に予測された（ＡＵＣ０．６７）。
【図13-1】図１３は、スライディングウインドウプロット（試料幅３０）におけるＡＱＰ４－ＩｇＧのパーセンテージ差の要約により再発試料の割合を実証する。クラススイッチングの代替としてのすべてのＩｇＧサブクラスにわたる％変化の要約。これは、ＡＱＰ４ＩｇＭが上昇した試料（ＡＵＣ＝０．５７）を除外する場合、適中度を示す。これは、ＩｇＧサブクラススイッチングの規模は再発リスクと関連するが、ＡＱＰ４－ＩｇＭが上昇しない試料においてのみであることを示す。これは、ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラススイッチングの変化は再発のリスク因子として作用し得るが、最も強力な予測因子は、ＩｇＭレベルの上昇およびＩｇＧサブクラススイッチングの両方の組合せであることを示唆する。試料の割合が、ＡＱＰ４－ＩｇＭまたはＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラススイッチのいずれかの非存在下で再発と関連することを考慮すると、データは、他の未測定の変数、例えば、検出可能なＩｇＭ／ＩｇＧサブクラス差が存在しない場合のＩｇＡクラススイッチングまたはエピトープ変化が存在し得ることを示唆する。
【図13-2】図１３は、スライディングウインドウプロット（試料幅３０）におけるＡＱＰ４－ＩｇＧのパーセンテージ差の要約により再発試料の割合を実証する。クラススイッチングの代替としてのすべてのＩｇＧサブクラスにわたる％変化の要約。これは、ＡＱＰ４ＩｇＭが上昇した試料（ＡＵＣ＝０．５７）を除外する場合、適中度を示す。これは、ＩｇＧサブクラススイッチングの規模は再発リスクと関連するが、ＡＱＰ４－ＩｇＭが上昇しない試料においてのみであることを示す。これは、ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラススイッチングの変化は再発のリスク因子として作用し得るが、最も強力な予測因子は、ＩｇＭレベルの上昇およびＩｇＧサブクラススイッチングの両方の組合せであることを示唆する。試料の割合が、ＡＱＰ４－ＩｇＭまたはＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラススイッチのいずれかの非存在下で再発と関連することを考慮すると、データは、他の未測定の変数、例えば、検出可能なＩｇＭ／ＩｇＧサブクラス差が存在しない場合のＩｇＡクラススイッチングまたはエピトープ変化が存在し得ることを示唆する。
【図14】図１４は、感度および（１－特異度）を示す再発確率約ｌｏｇ２（ＡＱＰ４－ＩｇＭ差）＋ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラス差の一般線形モデルにより生成したスコアのＲＯＣプロットである。内図は、再発確率に対するこのスコアのスライディングウインドウプロットを示す。ＡＱＰ４ ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラス％変化の一般線形モデル（外図）の重みづけに基づくスコアの組合せスコアは、良好な予測強度を示した（ＡＵＣ＝０．７３）。最適閾値（０．１９９）では、感度は０．７８であり、特異度は０．６９である。
【図15】図１５は、時間枠を設定し、対象由来の経時的試料間を考慮した、ＡＱＰ４ ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラス％変化の組合せについての一般線形モデルスコアに対する陽性適中度および陰性適中度のプロットを示す。非常に強力な陰性適中度０．９４を実証する。ＰＰＶ＝陽性予測因子値、下線。ＮＰＶ＝陰性予測因子値、上線。
【図16】図１６は、再発確率約ｌｏｇ２（ＡＱＰ４－ＩｇＭ）＋ＡＱＰ４－ＩｇＧ１％の一般線形モデルのスコアを示すＲＯＣ曲線を示す。図１５と比較して、対象由来の経時的試料間を考慮せず、各試料を独立的データ点として処理する。内図は、再発確率に対するこのスコアのスライディングウインドウプロットを示す。全ＡＱＰ４－ＩｇＧのＡＱＰ４ ＩｇＭおよびＡＱＰ４－ＩｇＧ１％は、一般化線形モデルにおいて最も有意な関係性であった（ＡＵＣ＝０．７１）。最適閾値（－０．４３５）では、感度は０．７０であり、特異度は０．７２である。
【図17】図１７は、一般線形モデルスコアに対する陽性適中度および陰性適中度のプロットであり、これは対象由来の経時的試料間を考慮せず、各試料を独立的データ点として処理する。閾値＞１．２３における陽性適中度（陽性適中度＝０．８１、陰性適中度＝０．８３）。ＲＯＣ曲線の最適閾値では、陽性適中度＝０．３７、陰性適中度＝０．９１。ＰＰＶ＝陽性予測因子値、下線。ＮＰＶ＝陰性予測因子値、上線（ｔｏｐ ｌｉｍｅ）。
【図18】ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスの検出。ＮＭＯＳＤ患者４人におけるＡＱＰ４－ＩｇＧ１－４サブクラス検出のフローサイトメトリーゲーティングおよび代表的な例。ＡＱＰ４＝アクアポリン４、ＩｇＧ＝免疫グロブリンＧ、ＮＭＯＳＤ＝視神経脊髄炎スペクトラム障害。
【図19】細胞系アッセイによるＡＱＰ４－ＩｇＭの検出。ＩｇＧの枯渇後、ＡＱＰ４－ＥＧＦＰトランスフェクト生ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（緑色）の表面に（抗ヒトＩｇＭ、赤色を）結合させることにより血清においてＡＱＰ４－ＩｇＭを検出した。ＡＱＰ４＝アクアポリン４、ＥＧＦＰ＝増強緑色蛍光タンパク質、ＨＥＫ＝ヒト胚性腎臓、ＩｇＭ＝免疫グロブリンＭ。
【図20】図２０では、非再発に対して再発ＬＧＩ１自己抗体患者由来の血清におけるＣＸＣＬ１３レベルが有意により高くなり、再発した患者が、カットオフを超えるＣＸＣＬ１３レベルをより頻繁に示したことを実証する（血清の７０％対非再発患者由来の血清の３０％；ｐ＜０．０００１）。ＬＧＩ１抗体患者４８人の血清試料１４２種（患者／試料のサブセット）からＣＸＣＬ１３を測定した。健常対照試料３７種から、ＣＸＣＬ１３レベルについて（１４５ｐｇ／ｍｌ）平均プラス３標準偏差のカットオフを得た。これに基づくと、大型のコホートでは、陽性ＣＸＣＬ１３試料５９／８７種（６８％）が再発患者由来であり、再発患者由来の試料５９／８４種（７０％）がＣＸＣＬ１３陽性であった（ともにｐ＜０．０００１；フィッシャーの直接検定；図２０）。
【発明を実施するための形態】
【0110】
方法および材料
参加者
ＮＭＯＳＤを有する患者６３人のケースノートから臨床情報を遡及的に収集し、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧ，７を選択して利用可能な長期的血清試料を－８０℃で保存した。詳細は、人口動態、臨床的特徴、医薬投与のタイミングおよび再発日を含み、これから年間再発率（ＡＲＲ）を算出した（表１および２）。３５／６３人に静脈内ＲＴＸを投与した：最初に１ｇを開始から２週間に分けて２回、その後、検出可能な循環ＣＤ１９＋数の回復に基づいて１ｇを維持間隔で投与する。書面によるインフォームドコンセントをすべての参加者から得（倫理審査による承認：ＲＥＣ１６／ＹＨ／００１３、ＲＥＣ１６／ＳＣ／０２２４およびＲＥＣ１４／ＳＣ／００５）、１４人は他の神経学的状態を有した［自己免疫性脳炎（ｎ＝１１）および片頭痛（ｎ＝３）］。
参加者
ＮＭＯＳＤを有する患者６３人のケースノートから臨床情報を遡及的に収集し、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧ，７を選択して利用可能な長期的血清試料を－８０℃で保存した。詳細は、人口動態、臨床的特徴、医薬投与のタイミングおよび再発日を含み、これから年間再発率（ＡＲＲ）を算出した（表１および２）。３５／６３人に静脈内ＲＴＸを投与した：最初に１ｇを開始から２週間に分けて２回、その後、検出可能な循環ＣＤ１９＋数の回復に基づいて１ｇを維持間隔で投与する。書面によるインフォームドコンセントをすべての参加者から得（倫理審査による承認：ＲＥＣ１６／ＹＨ／００１３、ＲＥＣ１６／ＳＣ／０２２４およびＲＥＣ１４／ＳＣ／００５）、１４人は他の神経学的状態を有した［自己免疫性脳炎（ｎ＝１１）および片頭痛（ｎ＝３）］。
【0111】
穿刺吸引（ＦＮＡ）手順
超音波を使用してｄＣＬＮ（深頸リンパ節；レベルＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＶ、図２および９）を位置決めし、これを２３Ｇの針による可視化の下で評価した。２回の経過後、吸引液をＰＢＳで希釈し、遠心分離して細胞性および可溶性画分を分離した。可溶性画分を総ＩｇＧ／ＭおよびＡＱＰ４－ＩｇＧ／Ｍ（１：５希釈）について以下のように検査し、無希釈試料により陽性結果を確認した。ＦＮＡにより回収した生細胞数の中央値は、１．５×１０６個細胞であった（範囲：２．４×１０５～３．５×１０６）。血清およびｄＣＬＮアッセイの全解析結果は、図５Ａに示す。
超音波を使用してｄＣＬＮ（深頸リンパ節；レベルＩ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＶ、図２および９）を位置決めし、これを２３Ｇの針による可視化の下で評価した。２回の経過後、吸引液をＰＢＳで希釈し、遠心分離して細胞性および可溶性画分を分離した。可溶性画分を総ＩｇＧ／ＭおよびＡＱＰ４－ＩｇＧ／Ｍ（１：５希釈）について以下のように検査し、無希釈試料により陽性結果を確認した。ＦＮＡにより回収した生細胞数の中央値は、１．５×１０６個細胞であった（範囲：２．４×１０５～３．５×１０６）。血清およびｄＣＬＮアッセイの全解析結果は、図５Ａに示す。
【0112】
抗体検出方法
ＡＱＰ４。患者６３人から、十分に検証された免疫蛍光に基づく生細胞系アッセイを使用してＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＡＱＰ４－ＩｇＭについて血清試料合計４０６種を検査した２７。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトして表面ＡＱＰ４を発現させ（Ｍ２３アイソフォーム、増強した緑色蛍光タンパク質；ＥＧＦＰにＣ末端で融合させた）、患者血清（出発希釈１：２０）またはリンパ節吸引液（出発希釈１：５０）とともにインキュベートした後、固定および洗浄した。その後、ＩｇＭ（Ａ２１２１６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＩｇＧ（７０９－５８５－０９８；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）のＦｃ領域を標的とするＡｌｅｘａｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体により、可視化による検出が可能となった。すべての試料を滴定してエンドポイント希釈を行った。ＡＱＰ４－ＩｇＭの決定前に、プロテインＧセファロースビーズ（１７－０６１８－０１；ＧＥ、ＵＫ）を使用してＩｇＧを枯渇させ、おそらくは未分画の血清におけるＩｇＧ－ＩｇＭ交差競合を防いだ。
ＡＱＰ４。患者６３人から、十分に検証された免疫蛍光に基づく生細胞系アッセイを使用してＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＡＱＰ４－ＩｇＭについて血清試料合計４０６種を検査した２７。簡潔には、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトして表面ＡＱＰ４を発現させ（Ｍ２３アイソフォーム、増強した緑色蛍光タンパク質；ＥＧＦＰにＣ末端で融合させた）、患者血清（出発希釈１：２０）またはリンパ節吸引液（出発希釈１：５０）とともにインキュベートした後、固定および洗浄した。その後、ＩｇＭ（Ａ２１２１６；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＩｇＧ（７０９－５８５－０９８；Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）のＦｃ領域を標的とするＡｌｅｘａｆｌｕｏｒコンジュゲート二次抗体により、可視化による検出が可能となった。すべての試料を滴定してエンドポイント希釈を行った。ＡＱＰ４－ＩｇＭの決定前に、プロテインＧセファロースビーズ（１７－０６１８－０１；ＧＥ、ＵＫ）を使用してＩｇＧを枯渇させ、おそらくは未分画の血清におけるＩｇＧ－ＩｇＭ交差競合を防いだ。
【0113】
ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスを定量化するために、患者５０／６３人からのエンドポイント希釈＞１：２０（１：５０～１：４００００）によるすべての血清３１６／４０６種を使用して、懸濁液において一過性にトランスフェクトしたＡＱＰ４－ＥＧＦＰ発現ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を標識し、洗浄および固定後、結合したＩｇＧを、サブクラス特異的抗体［ＩｇＧ１ヒンジ－ＡＦ６４７（９０５２－３１）、ＩｇＧ２Ｆｃ－ＡＦ ６４７（９０７０－３１）、ＩｇＧ３ヒンジ－ＡＦ ６４７（９２１０－３１）、ＩｇＧ４Ｆｃ－ＰＥ（９２００－０９）、ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ］により検出した。その後、ＤＡＰＩを加えた後、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターにより解析した。これまでに記載のように、他の抗体では、ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスレベルを、トランスフェクト細胞（単一細胞／生存可能／ＧＦＰ陽性ゲート）マイナス非トランスフェクト細胞（単一細胞／生存可能／ＧＦＰ陰性ゲート）のデルタ蛍光強度中央値により算出し、正規化抗体結合能を、較正ビーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ Ｓｉｍｐｌｙ Ｃｅｌｌｕｌａｒミクロスフェア；ＢａｎｇｓＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により算出した２８。カットオフは、各サブクラスについて、健常対照血清試料１０種を使用して決定した（平均値プラス３標準偏差、ＳＤ）。
【0114】
総ＩｇＧおよび総ＩｇＭは、ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）により測定した。
【0115】
ＬＧＩ１。ＬＧＩ１－ＩｇＧおよびＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体を、これまでに記載のように（Irani et al., 2010, Brain, 133:2734-2748）、ＬＧＩ１自己抗体患者１１２人（２０人再発）、健常対照６０人およびＮＭＤＡＲ自己抗体患者３０人由来のＩｇＧ枯渇血清試料４２０種における生細胞系アッセイにより追求した。ＩｇＧ枯渇を行って、おそらくは、さらなる高親和性ＩｇＧによる、これらの結合の阻害を防いだ。
【0116】
星状膠細胞および神経細胞の一次ラット培養物
混合した神経細胞－星状膠細胞培養物を、これまでに記載のように、胎生期１８日のラット海馬から調製した２９。簡潔には、海馬をトリプシンで分解し、機械的に解離させ、抗増殖添加物を有しないｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地／Ｂ２７サプリメント（１：５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともにプレーティングした。インビトロで２１～２８日後、ともに条件培地で希釈した患者血清（１：１００）またはｄＣＬＮ上清（１：５０）を生細胞とともに３０分間３７℃でインキュベートし、４％のＰＦＡで固定した。結合したヒト抗体を可視化するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ交差吸収非コンジュゲート二次抗体のいずれかを適用した後（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；１：７５０）、蛍光コンジュゲート三次抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－５６８；Ａ－１１０５７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を適用した。星状膠細胞を同定するために、細胞を透過処理し（０．１％のトリトン－Ｘ－１００）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；ＤＡＫＯ、Ｚ０３３４；１：２０００）を認識する市販の抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ検出二次抗体（ＡＦ４８８、Ａ－１１００８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；１：７５０）とともにインキュベートした。
混合した神経細胞－星状膠細胞培養物を、これまでに記載のように、胎生期１８日のラット海馬から調製した２９。簡潔には、海馬をトリプシンで分解し、機械的に解離させ、抗増殖添加物を有しないｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地／Ｂ２７サプリメント（１：５０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）とともにプレーティングした。インビトロで２１～２８日後、ともに条件培地で希釈した患者血清（１：１００）またはｄＣＬＮ上清（１：５０）を生細胞とともに３０分間３７℃でインキュベートし、４％のＰＦＡで固定した。結合したヒト抗体を可視化するために、ヤギ抗ヒトＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃ交差吸収非コンジュゲート二次抗体のいずれかを適用した後（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；１：７５０）、蛍光コンジュゲート三次抗体（ロバ抗ヤギＩｇＧ、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ－５６８；Ａ－１１０５７、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を適用した。星状膠細胞を同定するために、細胞を透過処理し（０．１％のトリトン－Ｘ－１００）、グリア線維酸性タンパク質（ＧＦＡＰ；ＤＡＫＯ、Ｚ０３３４；１：２０００）を認識する市販の抗体およびヤギ抗ウサギＩｇＧ検出二次抗体（ＡＦ４８８、Ａ－１１００８、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ；１：７５０）とともにインキュベートした。
【0117】
フローサイトメトリーおよびセルソーティング
新鮮なＬＮ単核細胞および対応する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配上で単離した。細胞を正常マウス血清とともにインキュベートして非特異的結合をブロッキングし、市販の蛍光色素コンジュゲート抗体：ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４（ＨＣＤ１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５（ＨＩ３０、ＡＦ７００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ１、ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２０（２Ｈ７、ＢＶ７１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２４（ＭＬ５、ＢＶ５１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２７（Ｏ３２３、ＢＶ６０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩｇＤ（ＩＡ６－２、ＦＩＴＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２、ＰＥ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４、ＰＥ－ＣＦ５９４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＸＣＲ５（Ｊ２５２Ｄ４、ＰＥ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＤ－１（ＲＭＰ１－３０、ＡＰＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により表面表現型を決定した。その後、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩを加えた後、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターにより解析した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して手動でゲーティングした（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．；図５Ｂ～Ｃ）。
新鮮なＬＮ単核細胞および対応する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をフィコール密度勾配上で単離した。細胞を正常マウス血清とともにインキュベートして非特異的結合をブロッキングし、市販の蛍光色素コンジュゲート抗体：ＣＤ３（ＵＣＨＴ１、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１４（ＨＣＤ１４、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｂｌｕｅ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ４５（ＨＩ３０、ＡＦ７００、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ１９（ＳＪ２５Ｃ１、ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ２０（２Ｈ７、ＢＶ７１１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２４（ＭＬ５、ＢＶ５１０、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＣＤ２７（Ｏ３２３、ＢＶ６０５、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ＩｇＤ（ＩＡ６－２、ＦＩＴＣ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ３８（ＨＩＴ２、ＰＥ、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４、ＰＥ－ＣＦ５９４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＣＸＣＲ５（Ｊ２５２Ｄ４、ＰＥ－Ｃｙ７、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）およびＰＤ－１（ＲＭＰ１－３０、ＡＰＣ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）により表面表現型を決定した。その後、細胞を洗浄し、ＤＡＰＩを加えた後、Ａｔｔｕｎｅ ＮｘＴフローサイトメーターにより解析した。フローサイトメトリーデータは、ＦｌｏｗＪｏソフトウェアを使用して手動でゲーティングした（Ｔｒｅｅｓｔａｒ Ｉｎｃ．；図５Ｂ～Ｃ）。
【0118】
単一Ｂ細胞培養物および免疫グロブリン鎖の回収
ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩを使用して、ＣＤ１９、ＩｇＤおよびＣＤ２７を認識する上記の抗体で予め標識したＢ細胞を９６ウェルプレートの個々のウェル内にインデックスソーティングした。このウェルでは、これらを、１０％のＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、β－メルカプトエタノール、ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＥＰＥＳ（１Ｍ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（１００×；Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＧｌｕｔａｍａｘ（１００×、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒ Ｇ Ｋｅｌｓｏｅより寄贈）中でＭＳ４０Ｌ低支持細胞とともに培養した。培養物に組換えヒトＩＬ－２（１００μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（１００μｇ／ｍＬ）、ＢＡＦＦ（１００μｇ／ｍＬ）およびＩＬ－２１（５０μｇ／ｍＬ、すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充し、培地の半分を週２回交換しながら３７℃で５％ＣＯ２に維持した。２２日目に培養上清を採取して、ＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＩｇＭ検出を行った。ＦｌｏＪｏソフトウェアにより、陽性ウェルに対応する細胞をこれらの表面表現型と関連づけた。このようなウェルから、転写物を保存し（ｘ）、これまでに記載のように、重および軽鎖ＰＣＲを実施した３０。最終的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast and www.imgt.orgを使用してＡＱＰ４特異的可変領域配列を解析した。
ＦＡＣＳ ＡｒｉａＩＩＩを使用して、ＣＤ１９、ＩｇＤおよびＣＤ２７を認識する上記の抗体で予め標識したＢ細胞を９６ウェルプレートの個々のウェル内にインデックスソーティングした。このウェルでは、これらを、１０％のＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、β－メルカプトエタノール、ペニシリン－ストレプトマイシン（１０，０００Ｕ／ｍＬ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＨＥＰＥＳ（１Ｍ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ピルビン酸ナトリウム（１００ｍＭ、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（１００×；Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）およびＧｌｕｔａｍａｘ（１００×、Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含むＲＰＭＩ１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｄｒ Ｇ Ｋｅｌｓｏｅより寄贈）中でＭＳ４０Ｌ低支持細胞とともに培養した。培養物に組換えヒトＩＬ－２（１００μｇ／ｍＬ）、ＩＬ－４（１００μｇ／ｍＬ）、ＢＡＦＦ（１００μｇ／ｍＬ）およびＩＬ－２１（５０μｇ／ｍＬ、すべてＰｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補充し、培地の半分を週２回交換しながら３７℃で５％ＣＯ２に維持した。２２日目に培養上清を採取して、ＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＩｇＭ検出を行った。ＦｌｏＪｏソフトウェアにより、陽性ウェルに対応する細胞をこれらの表面表現型と関連づけた。このようなウェルから、転写物を保存し（ｘ）、これまでに記載のように、重および軽鎖ＰＣＲを実施した３０。最終的には、www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast and www.imgt.orgを使用してＡＱＰ４特異的可変領域配列を解析した。
【0119】
統計学的解析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ８；ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｒ（R Core Team R: A language and environment for statistical computing, 2017）およびＡｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒを使用して統計学的解析およびデータの提示を行った。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖ８；ＧｒａｐｈＰａｄＳｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）、Ｒ（R Core Team R: A language and environment for statistical computing, 2017）およびＡｄｏｂｅ Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｏｒを使用して統計学的解析およびデータの提示を行った。
【実施例】
【0120】
［実施例１］
【0121】
臨床的再発と関連するＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスおよびＡＱＰ４－ＩｇＭ動態
ＮＭＯＳＤ患者６３人中３５人におけるＲＴＸ投与（患者１人あたり注入中央値７回、範囲１～１４）は、ＡＲＲの有意な低下（ｐ＜０．００１；マン・ホイットニーＵ検定、図１Ａ～Ｂ）および３１／３５人（８９％）における他の免疫治療薬中断の成功の両方と関連した９，３１。また、予想通り、長期的ＲＴＸ注入（経過観察中央値５０カ月、範囲２０～１３５）は、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル中央値の有意な低下とは関連しなかった（図１Ｃ）。
ＮＭＯＳＤ患者６３人中３５人におけるＲＴＸ投与（患者１人あたり注入中央値７回、範囲１～１４）は、ＡＲＲの有意な低下（ｐ＜０．００１；マン・ホイットニーＵ検定、図１Ａ～Ｂ）および３１／３５人（８９％）における他の免疫治療薬中断の成功の両方と関連した９，３１。また、予想通り、長期的ＲＴＸ注入（経過観察中央値５０カ月、範囲２０～１３５）は、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル中央値の有意な低下とは関連しなかった（図１Ｃ）。
【0122】
末梢血により、この臨床的血清学的解離への洞察がもたらされるかどうかを判定するために、患者５０人における利用可能な長期的試料からのＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスおよびＡＱＰ４－ＩｇＭレベルを測定した（図１Ｄ～Ｅ）。ＩｇＭは５日の半減期を有するため、ＩｇＧサブクラスの移行は活性クラススイッチ組換えを示唆する。したがって、これはともに最近のＧＣ（胚中心）活性の代替を表す。ＲＴＸ処置患者１０／２２人（４６％）およびＲＴＸを受けなかった患者１７／２８人（６１％）は、これらの疾患過程を通じてＡＱＰ４－ＩｇＧのＩｇＧ１優勢が排他的に認識されたことを示した。したがって全体的に見て、ＩｇＧ３＞２＞４は、患者２３／５０人（４６％）における少なくともある時点からの優位な血清ＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスであった。優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスのスイッチは、臨床的再発が２４／６１人（３９％）の時点の前後に認められたが、４０／２５５人（１６％）の時点のみが再発とは結びつかなかった（ｐ＝０．０００１、フィッシャーの直接検定）。再発前後のＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスのこの移行によってナイーブＢ細胞のデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）でのＧＣ反応開始が表される場合、１つの予測は、ＡＱＰ４－ＩｇＭをも生成されるはずであるということであり得る。実際、複数の時点にわたって、患者２２／５０人（４４％）において血清ＡＱＰ４－ＩｇＭが検出され、優先的には、再発２９／６１人（４８％）と関連し、これに対して採取した試料のわずかに３７／３１６種（１２％）が再発とは結びつかなかった（ｐ＜０．０００１、フィッシャーの直接検定）。再発とは対照的に、リツキシマブ投与は、ＡＱＰ４－ＩｇＭまたは優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスの移行のいずれとも有意には関連しなかった（データ非提示）。全体的に見て、ＡＱＰ４－ＩｇＭまたは変化した優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスいずれかの存在は、再発と密接に関連した（４３／６１対７３／２５５；オッズ比６．０（範囲３．３～１０．８）；ｐ＜０．０００１）。同様の所見が、個体においてロバスト性を維持した。例えば、個々の患者３人では、優勢なサブクラスのスイッチは、一部の再発の前後に観察され（患者７および１０）、ＡＱＰ４－ＩｇＭスパイクの全体での再発生は、患者６における再発と関連することが多かった。まとめると、このような知見により、ＧＣ活性が、再発時点前後におけるＡＱＰ４抗体産生の源として意味づけられる。
［実施例２］
［実施例２］
【0123】
ＮＭＯＳＤを有する患者由来のｄＣＬＮ吸引液において観察されるＡＱＰ４－ＩｇＧの局所合成がＲＴＸにより抑制される
患者において仮説を直接検査するために、ｄＣＬＮ吸引３６回を、ＮＭＯＳＤを有する患者１４人（ｎ＝１８吸引）および疾患対照１４人（ｎ＝１８吸引）において実施した（図２および図９）。個体における血清対ｄＣＬＮ吸引液の比較により、約１５００分の１および約５００分の１に低下した総ＩｇＧおよびＩｇＭレベルが、それぞれ示された（図２Ｂ）。さらに、著しく異なるリンパ球集団がｄＣＬＮおよびＰＢＭＣにおいて観察されたことにより、最小限の血液夾雑が確認され（図２Ｃ）、ｄＣＬＮでは、単球（ｐ＜０．０００１）および移行期Ｂ細胞の割合は低いが（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２４＋ＣＤ３８＋；ｐ＜０．０００１）、濾胞ヘルパーＴ細胞の出現頻度は高いことが示された（Ｔｆｈ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋、ｐ＜０．０００１、すべてウィルコクソン符号順位検定）（２６）。
患者において仮説を直接検査するために、ｄＣＬＮ吸引３６回を、ＮＭＯＳＤを有する患者１４人（ｎ＝１８吸引）および疾患対照１４人（ｎ＝１８吸引）において実施した（図２および図９）。個体における血清対ｄＣＬＮ吸引液の比較により、約１５００分の１および約５００分の１に低下した総ＩｇＧおよびＩｇＭレベルが、それぞれ示された（図２Ｂ）。さらに、著しく異なるリンパ球集団がｄＣＬＮおよびＰＢＭＣにおいて観察されたことにより、最小限の血液夾雑が確認され（図２Ｃ）、ｄＣＬＮでは、単球（ｐ＜０．０００１）および移行期Ｂ細胞の割合は低いが（ＣＤ１９＋ＣＤ２０＋ＣＤ２４＋ＣＤ３８＋；ｐ＜０．０００１）、濾胞ヘルパーＴ細胞の出現頻度は高いことが示された（Ｔｆｈ；ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＰＤ－１＋ＣＸＣＲ５＋、ｐ＜０．０００１、すべてウィルコクソン符号順位検定）（２６）。
【0124】
ＲＴＸナイーブＮＭＯＳＤ患者由来のｄＣＬＮ吸引液では、試料７／７種（１００％）においてＡＱＰ４－ＩｇＧが示され、ＨＥＫ２９３Ｔ発現ＡＱＰ４の細胞外ドメインおよび生星状膠細胞表面へのＩｇＧ結合により検出された（図２Ｄ）。このような患者７人では、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧは、エンドポイント希釈１：１００～１：３２００（中央値１：４００）の範囲に及び、ＡＱＰ４－ＩｇＧ：総ＩｇＧレベルの比は、ｄＣＬＮ吸引液において対応する血清に対して有意により高くなった（ｐ＝０．０２；ウィルコクソン符号順位検定、図２Ｄ～Ｇ）。このような知見は、局所（「節内」）ＡＱＰ４－ＩｇＧ合成を示す。この概念は、対応する血清では検出されなかったが、ｄＣＬＮ吸引液２種におけるＡＱＰ４－ＩｇＭの所見により、さらに支持された（図２Ｄおよび図６）。このような知見とは対照的に、ＲＴＸ投与後、数カ月にわたって試料採取したｄＣＬＮ吸引液のわずかに２／１１種（１８％）からＡＱＰ４－ＩｇＧが検出された（図２Ｅ～Ｇ；ｐ＝０．００２、フィッシャーの直接検定）。このような集団的所見により、ＡＱＰ４－ＩｇＧの節内合成がＲＴＸによって効率的に抑制されることが示される。したがって、ＲＴＸによるｄＣＬＮにおけるＡＱＰ４特異的Ｂ細胞の除去は、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベルを変化させずに、この臨床的有効性を説明する１つの機構を表し得る。
［実施例３］
［実施例３］
【0125】
ＬＮおよび血液におけるＡＱＰ４特異的Ｂ細胞
Ｂ細胞サブセットにおけるＡＱＰ４特異度を同定するために、ｄＣＬＮおよび循環器の両方由来の単一Ｂ細胞をインデックスソーティングし、複数のクローン関連抗体分泌細胞への増殖および分化を誘導するサイトカインに個々に曝露した（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋、および頻繁にはＣＤ１３８＋；図３Ａ）。このようにして２２日後、ＡＱＰ４反応性について培養上清を評価した。患者３人由来の培養Ｂ細胞８２９３種中１１種が、ＡＱＰ４－ＩｇＭまたはＧのいずれかを分泌した（図３Ｂ）。このような培養物の約５０％の「捕捉率」（データ非提示）考慮すると、血液およびＬＮ由来のＣＤ１９＋Ｂ細胞の約０．２％がＡＱＰ４特異性を示した（図３Ｃ）。細胞インデックス作成により、ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞がナイーブ（ｎ＝４）、二重陰性（ｎ＝１）、ＩｇＤ＋メモリー（ｎ＝２）およびＩｇＤ－メモリー（ｎ＝４）集団に由来することが明らかとなった（図３ＡおよびＤ、図７）。３つすべてのｄＣＬＮ ＡＱＰ４抗体は、メモリーサブセット中から生じ、上清においてＩｇＧとして検出される、わずかに２つのＡＱＰ４反応性を含んだ。ナイーブＢ細胞由来の同族の重および軽鎖対は未変異であり、二重陰性、ＩｇＤ＋メモリーおよびＩｇＤ－メモリー細胞により変異荷重の上昇が観察された。すべては、高度に可変のＶ（Ｄ）Ｊアレルの用途を示し、約２：１のカッパ：ラムダ鎖を発現した（図３Ｄおよび図１０）。要約すると、ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞は、複数の初期および後期Ｂ細胞サブセットから生じる遺伝的に多様な系列内の、ＮＭＯＳＤを有する患者由来のＰＢＭＣおよびｄＣＬＮの両方において検出された。
［実施例４］
Ｂ細胞サブセットにおけるＡＱＰ４特異度を同定するために、ｄＣＬＮおよび循環器の両方由来の単一Ｂ細胞をインデックスソーティングし、複数のクローン関連抗体分泌細胞への増殖および分化を誘導するサイトカインに個々に曝露した（ＣＤ１９＋ＣＤ２７＋＋ＣＤ３８＋＋、および頻繁にはＣＤ１３８＋；図３Ａ）。このようにして２２日後、ＡＱＰ４反応性について培養上清を評価した。患者３人由来の培養Ｂ細胞８２９３種中１１種が、ＡＱＰ４－ＩｇＭまたはＧのいずれかを分泌した（図３Ｂ）。このような培養物の約５０％の「捕捉率」（データ非提示）考慮すると、血液およびＬＮ由来のＣＤ１９＋Ｂ細胞の約０．２％がＡＱＰ４特異性を示した（図３Ｃ）。細胞インデックス作成により、ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞がナイーブ（ｎ＝４）、二重陰性（ｎ＝１）、ＩｇＤ＋メモリー（ｎ＝２）およびＩｇＤ－メモリー（ｎ＝４）集団に由来することが明らかとなった（図３ＡおよびＤ、図７）。３つすべてのｄＣＬＮ ＡＱＰ４抗体は、メモリーサブセット中から生じ、上清においてＩｇＧとして検出される、わずかに２つのＡＱＰ４反応性を含んだ。ナイーブＢ細胞由来の同族の重および軽鎖対は未変異であり、二重陰性、ＩｇＤ＋メモリーおよびＩｇＤ－メモリー細胞により変異荷重の上昇が観察された。すべては、高度に可変のＶ（Ｄ）Ｊアレルの用途を示し、約２：１のカッパ：ラムダ鎖を発現した（図３Ｄおよび図１０）。要約すると、ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞は、複数の初期および後期Ｂ細胞サブセットから生じる遺伝的に多様な系列内の、ＮＭＯＳＤを有する患者由来のＰＢＭＣおよびｄＣＬＮの両方において検出された。
［実施例４］
【0126】
ＲＴＸ後のｄＣＬＮ由来Ｂ細胞の有効な枯渇
ＲＴＸ投与は、ＰＢＭＣおよびｄＣＬＮの両方により観察されたＣＤ１９＋Ｂ細胞の明白な減少と密接に関連した（ｐ＜０．００１、マン ホイットニーＵ検定、図４Ａ）。Ｂ細胞サブセット組成物は、未変化であった（図８Ａ）。疾患対照とは対照的に、抗体分泌細胞またはＴｆＨ出現頻度を有意には変化させずに（図８Ｃ～Ｄ）、ＰＢＭＣおよびｄＣＬＮの両方からのＣＤ２０＋Ｔ細胞出現頻度における中程度の低下が存在した（図８Ｂ）。節内Ｂ細胞枯渇は、２回以上のＲＴＸ注入を受けたＮＭＯＳＤ患者（ｄＣＬＮ Ｂ細胞平均１４細胞、範囲０～５６）対単回注入を受けた患者（ｄＣＬＮ Ｂ細胞平均８４細胞、範囲９～２３０；ｐ＝０．０４、マン ホイットニーＵ検定）またはＲＴＸに対してナイーブである患者（ｄＣＬＮ Ｂ細胞平均１８８１７細胞、範囲１６０２～６５２７６；ｐ＝０．０００１、マン ホイットニーＵ検定）において最も著しかった。一部の循環Ｂ細胞が初期に再増殖したにもかかわらず、節内Ｂ細胞枯渇は、ＲＴＸ投与から数カ月間持続した（図４Ｂ）。このような結果を個体において長期的に確認するために、血液および同一ｄＣＬＮの対応する試料採取を、ＲＴＸ投与前後の両方（ｎ＝２）およびＲＴＸ後２回（ｎ＝２、図４Ｄ）の２つの場合に受けた患者４人由来のＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＢ細胞データを解析した。すべての場合では、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベルは未変化であったが、ｄＣＬＮのＡＱＰ４－ＩｇＧレベルは、エンドポイント希釈１：１００～１：２５０から未検出まで低下し、ｄＣＬＮ Ｂ細胞集団は、（ｎ＝２）となるか、または未検出のままであった（ｎ＝２）。
［実施例５］
ＲＴＸ投与は、ＰＢＭＣおよびｄＣＬＮの両方により観察されたＣＤ１９＋Ｂ細胞の明白な減少と密接に関連した（ｐ＜０．００１、マン ホイットニーＵ検定、図４Ａ）。Ｂ細胞サブセット組成物は、未変化であった（図８Ａ）。疾患対照とは対照的に、抗体分泌細胞またはＴｆＨ出現頻度を有意には変化させずに（図８Ｃ～Ｄ）、ＰＢＭＣおよびｄＣＬＮの両方からのＣＤ２０＋Ｔ細胞出現頻度における中程度の低下が存在した（図８Ｂ）。節内Ｂ細胞枯渇は、２回以上のＲＴＸ注入を受けたＮＭＯＳＤ患者（ｄＣＬＮ Ｂ細胞平均１４細胞、範囲０～５６）対単回注入を受けた患者（ｄＣＬＮ Ｂ細胞平均８４細胞、範囲９～２３０；ｐ＝０．０４、マン ホイットニーＵ検定）またはＲＴＸに対してナイーブである患者（ｄＣＬＮ Ｂ細胞平均１８８１７細胞、範囲１６０２～６５２７６；ｐ＝０．０００１、マン ホイットニーＵ検定）において最も著しかった。一部の循環Ｂ細胞が初期に再増殖したにもかかわらず、節内Ｂ細胞枯渇は、ＲＴＸ投与から数カ月間持続した（図４Ｂ）。このような結果を個体において長期的に確認するために、血液および同一ｄＣＬＮの対応する試料採取を、ＲＴＸ投与前後の両方（ｎ＝２）およびＲＴＸ後２回（ｎ＝２、図４Ｄ）の２つの場合に受けた患者４人由来のＡＱＰ４－ＩｇＧおよびＢ細胞データを解析した。すべての場合では、血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベルは未変化であったが、ｄＣＬＮのＡＱＰ４－ＩｇＧレベルは、エンドポイント希釈１：１００～１：２５０から未検出まで低下し、ｄＣＬＮ Ｂ細胞集団は、（ｎ＝２）となるか、または未検出のままであった（ｎ＝２）。
［実施例５］
【0127】
ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラスの変化の組合せ測定により再発の強力な予測力がもたらされる
図１１～１７は、ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラス％の組合せまたはＩｇＧスイッチングにより、再発の最も強力な予測力がもたらされることを実証する。二値スコアを超える連続スコアの１つの利点は、閾値を調整して、臨床適用により必要に応じて感度、特異度、陽性適中度または陰性適中度を最大化することが可能であることである。このようなパラメーターは、０．９４の陰性予測力および０．８１の陽性適中度に達し得る。したがって、これらは、臨床的意思決定の有効なツールとなる。
［実施例６］
図１１～１７は、ＩｇＭおよびＩｇＧサブクラス％の組合せまたはＩｇＧスイッチングにより、再発の最も強力な予測力がもたらされることを実証する。二値スコアを超える連続スコアの１つの利点は、閾値を調整して、臨床適用により必要に応じて感度、特異度、陽性適中度または陰性適中度を最大化することが可能であることである。このようなパラメーターは、０．９４の陰性予測力および０．８１の陽性適中度に達し得る。したがって、これらは、臨床的意思決定の有効なツールとなる。
［実施例６］
【0128】
ＬＧＩ１－ＩｇＭは再発を示す
データは、ＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体がＡＱＰ４－ＩｇＭ抗体と類似の臨床的関連性を示すことを実証する。ＡＱＰ４抗体を有する患者とは対照的に、ＬＧＩ１抗体を有する患者は典型的には、高齢男性であり、発症年齢中央値がおよそ６５歳であり、男性：女性比は２：１である。さらに、文献に報告された患者のおよそ１０～４０％が、再発を示す。したがって、自己抗原特異的ＩｇＭの有用性は、広範な人口動態および頻繁に再発する疾患に対して重要である。
データは、ＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体がＡＱＰ４－ＩｇＭ抗体と類似の臨床的関連性を示すことを実証する。ＡＱＰ４抗体を有する患者とは対照的に、ＬＧＩ１抗体を有する患者は典型的には、高齢男性であり、発症年齢中央値がおよそ６５歳であり、男性：女性比は２：１である。さらに、文献に報告された患者のおよそ１０～４０％が、再発を示す。したがって、自己抗原特異的ＩｇＭの有用性は、広範な人口動態および頻繁に再発する疾患に対して重要である。
【0129】
各患者から入手可能な第１の試料から、ＬＧＩ１－ＩｇＧ抗体が予想通り検出された。プロテインＧビーズを使用したＩｇＧ枯渇後、このようなＬＧＩ１自己抗体患者血清では検出可能なＬＧＩ１－ＩｇＧ抗体が欠如しており、完全な枯渇が確認された。健常対照でもＮＭＤＡＲ自己抗体患者でも、検出可能なＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体を有しなかった。患者８／１１２人由来の試料１６／４２０種は、検出可能なＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体を示し、１：２０～１：１６０の範囲の最終力価を有した。
【0130】
【表1】
【0131】
ＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体を有する患者７／８人が再発し、これと比較して１／１０４人が再発しなかった（ｐ＜０．０００１；フィッシャーの直接検定）。５／７の場合において、再発から４週間以内に、ＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体を有する再発した患者７人から、これらが検出された。ＬＧＩ１－ＩｇＭ抗体を有しない患者１０４人中わずかに２人が、再発した（ｐ＜０．０００１；フィッシャーの直接検定）。
【0132】
これは、再発に対するＬＧＩ１－ＩｇＭの非常に高いオッズ比（３５７；２７～３９４７）とともに９８％を超える特異度および９９％を超える陰性適中度を有することに等しい。
【0133】
【表2】
【0134】
ＣＸＣＬ１３は再発を示す
上に考察したデータにより、抗原特異的ＩｇＭが、活性な胚中心反応の有効な代替尺度であることが実証される。胚中心活性の別の十分に確立されたマーカーは、サイトカイン（ＣＸＣＬ１３）であり、濾胞樹状細胞および濾胞ヘルパーＴ細胞を含む胚中心反応に参加する細胞により産生される。
上に考察したデータにより、抗原特異的ＩｇＭが、活性な胚中心反応の有効な代替尺度であることが実証される。胚中心活性の別の十分に確立されたマーカーは、サイトカイン（ＣＸＣＬ１３）であり、濾胞樹状細胞および濾胞ヘルパーＴ細胞を含む胚中心反応に参加する細胞により産生される。
【0135】
したがって、患者／試料のサブセット（ＬＧＩ１抗体患者４８人の血清試料１４２種）からＣＸＣＬ１３を測定した。健常対照試料３７種から、ＣＸＣＬ１３レベルについて（１４５ｐｇ／ｍｌ）平均プラス３標準偏差のカットオフを得た。これに基づくと、大型のコホートでは、陽性ＣＸＣＬ１３試料５９／８７種（６８％）が再発患者由来であり、再発患者由来の試料５９／８４種（７０％）がＣＸＣＬ１３陽性であった（ともにｐ＜０．０００１；フィッシャーの直接検定；図２０）。
【0136】
【表3】
【0137】
血清ＣＸＣＬ１３レベルは、再発ＬＧＩ１自己抗体患者由来の血清において非再発ＬＧＩ１自己抗体患者に対して有意により高くなり、再発患者は、カットオフを超えるＣＸＣＬ１３レベルをより頻繁に示した（血清の７０％対非再発患者由来の血清の３０％；ｐ＜０．０００１）。
【0138】
さらに個々の患者では、ＬＧＩ１自己抗体が非常に低いかまたは検出不能となった後、特に、治療抵抗性疾患を有する患者において、ＣＸＣＬ１３レベルの持続的上昇が観察された（図２１）。
【0139】
【表4】
【0140】
【表5】
【0141】
考察
ＮＭＯＳＤを有する患者からの血液の試料採取により、優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスおよびＡＱＰ４特異的ＩｇＭのスイッチが、臨床的再発と特に累積的に関連することが明らかとなった。このようなパラメーターはともに、ＧＣ活性の産物であると考えられ得る。ＮＭＯＳＤを有する患者におけるｄＣＬＮにより、節内ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞の証拠およびＡＱＰ４－ＩｇＧの節内合成の特徴がもたらされ、これによりＧＣ活性が、このＡＱＰ４特異的自己免疫化への鍵であることが直接示された。この観察所見は、数年にわたるさまざまな時点で得られた試料に由来したため、ＡＱＰ４自己抗体が疾患過程を通じたＧＣ活性により生成されるという概念を支持する。治療的に重要なことには、ＲＴＸの投与によりｄＣＬＮ常在Ｂ細胞の枯渇に成功し、ＧＣ活性の破壊におけるこの潜在的治療的価値を示した。血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル低下の作用がわずかであるにもかかわらず、この推定的作用機構によって、急速な臨床的有効性が説明され得る。さらに広範には、この試験は、臨床試験に有用な直接的尺度を含む、ＧＣ活性の複数のバイオマーカーを決定する、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのヒトにおけるパラダイムを提示する。今後は、このパラダイムの翻訳が、他の自己免疫状態の生物学および他の自己免疫治療薬の作用機構ならびに感染性疾患のためのワクチン接種のより良い理解に役立ち得る３３。
ＮＭＯＳＤを有する患者からの血液の試料採取により、優位なＡＱＰ４－ＩｇＧサブクラスおよびＡＱＰ４特異的ＩｇＭのスイッチが、臨床的再発と特に累積的に関連することが明らかとなった。このようなパラメーターはともに、ＧＣ活性の産物であると考えられ得る。ＮＭＯＳＤを有する患者におけるｄＣＬＮにより、節内ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞の証拠およびＡＱＰ４－ＩｇＧの節内合成の特徴がもたらされ、これによりＧＣ活性が、このＡＱＰ４特異的自己免疫化への鍵であることが直接示された。この観察所見は、数年にわたるさまざまな時点で得られた試料に由来したため、ＡＱＰ４自己抗体が疾患過程を通じたＧＣ活性により生成されるという概念を支持する。治療的に重要なことには、ＲＴＸの投与によりｄＣＬＮ常在Ｂ細胞の枯渇に成功し、ＧＣ活性の破壊におけるこの潜在的治療的価値を示した。血清ＡＱＰ４－ＩｇＧレベル低下の作用がわずかであるにもかかわらず、この推定的作用機構によって、急速な臨床的有効性が説明され得る。さらに広範には、この試験は、臨床試験に有用な直接的尺度を含む、ＧＣ活性の複数のバイオマーカーを決定する、インビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのヒトにおけるパラダイムを提示する。今後は、このパラダイムの翻訳が、他の自己免疫状態の生物学および他の自己免疫治療薬の作用機構ならびに感染性疾患のためのワクチン接種のより良い理解に役立ち得る３３。
【0142】
利用可能な研究と並行して、このような所見により、ＮＭＯＳＤを有する患者における古典的抗原特異的ＧＣ反応の多くの要素が同定される。第１に、Ｂ細胞耐性の初期の低下が、ＮＭＯＳＤにおいて観察されていた。これは、ＮＭＯＳＤ ＰＢＭＣ由来の未変異でＩｇＭを発現するナイーブなＡＱＰ４特異的Ｂ細胞の最終的単離、ならびにくも膜下腔内ＡＱＰ４特異的細胞と末梢性二重陰性およびナイーブＢ細胞との間の推定変異段差に基づく系列樹の構築の成功と一致している。未変異ナイーブＢＣＲは、ＡＱＰ４に対して低親和性を有する可能性が高く、ＧＣの開始時にＡＱＰ４エピトープに結合する第１のリンパ球であり得る。臨床的再発では、観察されたＡＱＰ４－ＩｇＭのスパイクは、ＧＣ活性が、ＩｇＧ＋メモリーＢ細胞の再活性化ではなく、ナイーブＢ細胞の優先的動員により駆動することを示唆する。検出されるＩｇＭ＋メモリーＢ細胞は役割を果たし得るが、ＧＣに再進入するメモリーＢ細胞の希少性は、最近の実験マウスデータにより強調される。その後、ＡＱＰ４特異的Ｔ細胞の助けを借りて、このようなナイーブＡＱＰ４特異的Ｂ細胞は、分化して、より高親和性のＡＱＰ４特異的メモリーＢ細胞に変異する可能性が高く、このメモリーＢ細胞は、血液およびｄＣＬＮの両方から捕捉される。ＡＱＰ４特異的Ｂ細胞の全出現頻度は、ほとんどの慢性抗微生物応答よりもはるかに高く、ＮＭＯＳＤ患者におけるＧＣが、ＡＱＰ４特異的自己免疫化により頻繁に占有されることを示唆する。
【0143】
ｄＣＬＮは、ＣＮＳリンパ液を直接排出するため、ＣＮＳ優勢抗原により駆動する疾患においてＧＣの有望な部位として提唱される。ｄＣＬＮは、ＣＮＳ発現ＡＱＰ４に遭遇する第１の末梢構造であり得る。ヒトｄＣＬＮに基づくＧＣからのＡＱＰ４抗原の検出は、吸引液の血液汚染が最小であると思われることを特に考慮すれば、いまや現実的な目標である。しかし、ＮＭＯＳＤを有する患者２人の眼窩における異所性ＧＣの組織学的特徴が記載されており、ＡＱＰ４－Ｂ細胞は、ＣＮＳへの遊走後、ＣＮＳの高ＡＱＰ４部位に散在する可能性がある。
【0144】
なおさらに、データにより、ＬＧＩ１－ＩｇＭが、典型的には発作から４週間以内の再発に対する９８％を超える特異度および９９％を超える陰性適中度と関連することが実証される。したがって、これらにより、再発の特異的予測バイオマーカーをも提供される。これらの存在により、ＬＧＩ１抗体脳炎を有する患者において免疫抑制が向上すると考える動機がもたらされる。
【0145】
また、胚中心反応の別のマーカー（ＣＸＣＬ１３）は、ＬＧＩ１抗体脳炎を有する患者、特には、再発した患者において上昇することが実証される。これらは、ＬＧＩ１抗体がもはや上昇しなくなると、免疫治療抵抗性患者において上昇を維持し得る。したがって、さらなる免疫抑制の使用の誘因となる、さらに独立的かつ有用なバイオマーカーが提供される。また、この手法により、ＣＸＣＬ１３特異的治療薬による精密医療の潜在的有用性の特異的上昇が予測される。
【0146】
結論として、この試験では、所与の抗体媒介自己免疫疾患に臨床的に適切であることが知られる抗原、例えば、ＮＭＯＳＤにおけるＡＱＰ４を認識する、ＩｇＭ抗体の出現もしくは上昇および／または優勢なＩｇＧサブクラスの変化が、対象が再発状態にあるかもしくは再発しかかっており、および／または対象の所与の抗体媒介自己免疫疾患を治療すべきであることの、統計学的に有意な指標であることを実証する。詳細には、データは、例えば、疾患過程中におけるＡＱＰ４－ＩｇＭ、ＬＧＩ１－ＩｇＭまたはＣＸＣＬ１３の出現または上昇は、患者が再発する可能性が高いことを示唆する一方、ＩｇＭ抗体またはサイトカインの検出可能な上昇または存在を有する場合、患者が再発しない強力な可能性を有することを示唆する。この知見は、患者を監視し、治療薬の段階的増加の根拠を評価し、根底にある疾患の生態を直接理解することを目指すための意義を有する。例えば、再発状態にある可能性が高くない患者の同定により、高額な治療の必要性が排除され、患者に従来の免疫治療薬の副作用を回避させる。ＧＣを中心としたバイオマーカーは、直ちに臨床段階に入る可能性を有し、抗体媒介自己免疫疾患のための精密医療への手段となり得る。
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13-1】
【図13-2】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【国際調査報告】