特表 2024-510521 細胞せん断損傷を低減する細胞ゲル製剤及び細胞せん断損傷を低減する方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-07

(54)【発明の名称】細胞せん断損傷を低減する細胞ゲル製剤及び細胞せん断損傷を低減する方法

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/28 20150101AFI20240229BHJP

   A61P 19/02 20060101ALI20240229BHJP

   A61P 29/00 20060101ALI20240229BHJP

   A61K 9/06 20060101ALI20240229BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240229BHJP

   A61L 27/52 20060101ALI20240229BHJP

   A61L 27/20 20060101ALI20240229BHJP

   A61L 27/38 20060101ALI20240229BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240229BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240229BHJP

【ＦＩ】

A61K35/28

A61P19/02

A61P29/00

A61K9/06

A61K47/36

A61L27/52

A61L27/20

A61L27/38 112

A61K45/00

A61P43/00 121

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558895

(86)(22)【出願日】2021-10-08

(85)【翻訳文提出日】2023-09-25

(86)【国際出願番号】 CN2021122674

(87)【国際公開番号】W WO2022213562

(87)【国際公開日】2022-10-13

(31)【優先権主張番号】202110386052.7

(32)【優先日】2021-04-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513322718

【氏名又は名称】清華大学

【氏名又は名称原語表記】ＴＳＩＮＧＨＵＡ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ

【住所又は居所原語表記】１ Ｑｉｎｇｈｕａｙｕａｎ， Ｈａｉｄｉａｎ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ， Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８４， Ｃｈｉｎａ

(74)【代理人】

【識別番号】110002871

【氏名又は名称】弁理士法人坂本国際特許商標事務所

(72)【発明者】

【氏名】リウ、ドンシェン

(72)【発明者】

【氏名】ユ、ジャクォ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、ボ

(72)【発明者】

【氏名】ヤン、シン

(72)【発明者】

【氏名】リ、ユジェ

(72)【発明者】

【氏名】シュウ、ビニ

(72)【発明者】

【氏名】リ、シン

【テーマコード（参考）】

4C076

4C081

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C076AA09

4C076BB11

4C076BB32

4C076CC29

4C076CC50

4C076EE30

4C076FF63

4C081AB05

4C081BA12

4C081CD012

4C081CD34

4C081DA12

4C084AA19

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZA961

4C084ZA962

4C084ZB111

4C084ZB112

4C084ZC75

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB44

4C087BB63

4C087MA02

4C087MA28

4C087MA66

4C087MA67

4C087NA03

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZA96

4C087ZB11

4C087ZC75

(57)【要約】

本発明は、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを含む、関節内注射による急性または慢性の骨関節炎および／またはその症状の治療および／または予防のための細胞ゲル製剤；前記細胞ゲル製剤を使用して急性および慢性の骨関節炎および関連する炎症由来の症状（特に、骨関節の疼痛、可動性または機能の減少）を治療または予防する方法；ならびに前記核酸ハイドロゲルを使用してせん断環境下における細胞のせん断損傷を低減する方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを含む、細胞ゲル製剤。

【請求項2】

前記核酸ハイドロゲルは、足場コアおよび前記足場コアに結合する少なくとも３つの一本鎖核酸を含み、各一本鎖核酸は少なくとも１つの足場粘着末端を有する、足場ユニット；
架橋コアおよび前記架橋コアに結合する少なくとも２つの一本鎖核酸を含み、各一本鎖核酸は少なくとも１つの架橋粘着末端を有する、架橋ユニット；および
水性媒体を含み、
記足場ユニットおよび前記架橋ユニットは、前記足場粘着末端及び前記架橋粘着末端の相補的塩基対合による架橋により、三次元空間網目構造を形成する、請求項１に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項3】

前記足場ユニットは、足場コアと前記足場コアに結合する少なくとも３つの一本鎖核酸とを含み、各一本鎖核酸は少なくとも１つの足場粘着末端を有し；前記足場コアは核酸であり；前記足場コアとしての核酸は、相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域の長さは、４～１５０ｂｐである、請求項１～２のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項4】

前記架橋ユニットは、架橋コアおよび架橋コアに結合する少なくとも２つの一本鎖Ｌ－核酸を含み、各一本鎖Ｌ－核酸は、少なくとも１つの架橋粘着末端を有し；前記架橋コアは核酸であり；前記架橋コアとしての核酸は、相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域の長さは、４～１５０ｂｐである、請求項１～３のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項5】

前記核酸ハイドロゲル中の足場ユニットと架橋ユニットとのモル比は２：１～１：３である、請求項１～４のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項6】

前記足場ユニット、前記架橋ユニットおよび前記三次元空間網目構造は、生理学的条件下（３７℃、ｐＨ７．２～７．４、０．９ｗｔ％ＮａＣｌ、等張）で安定な架橋状態にある、請求項１～５のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項7】

前記核酸ハイドロゲルは、２５℃、ひずみ１％のひずみ振幅で、周波数掃引により測定された、０．１から１００ｒａｄ／ｓのすべてのひずみ値での、損失弾性率Ｇ”よりも優位な貯蔵弾性率Ｇ’を有する、請求項１～６のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項8】

前記核酸ハイドロゲルの足場ユニットまたは架橋ユニットは、ＣｐＧ配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項9】

前記間葉系幹細胞は、前記核酸ハイドロゲル中に包埋または分散される、請求項１～８のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項10】

前記間葉系幹細胞の密度は、１０^５～１０^８個細胞／ｍＬ（毎ミリリットル細胞ゲル製剤）である、請求項１～９のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項11】

さらに抗炎症剤を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤。

【請求項12】

急性および慢性の骨関節炎および関連する炎症由来の症状を治療または予防するための医薬の製造のための、請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤の使用。

【請求項13】

請求項１～１１のいずれか１項に記載の細胞ゲル製剤を使用して、せん断環境における細胞のせん断損傷を低減する方法であって、前記方法が
（ｉ）足場ユニットおよび架橋ユニットを含む核酸ハイドロゲルを提供すること、および（ｉｉ）間葉系幹細胞を核酸ハイドロゲルに担持させること、を含むか；または、
（ｉ）核酸ハイドロゲルの足場ユニットおよび架橋ユニットを別々に調製すること、および（ｉｉ）間葉系幹細胞を足場ユニットおよび架橋ユニットと混合し、自己組織化により本発明の細胞ゲル製剤を得ること、を含む、方法。

【請求項14】

前記細胞ゲル製剤をせん断環境に供することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記せん断環境は、注射過程および関節内の内部摩擦を含む、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを含む、関節内注射による急性または慢性の骨関節炎および／またはその症状の治療および／または予防のための細胞ゲル製剤；前記細胞ゲル製剤を使用して急性および慢性の骨関節炎および関連する炎症由来の症状（特に、骨関節の疼痛、可動性または機能の減少）を治療または予防する方法；ならびに前記核酸ハイドロゲルを使用してせん断環境下における細胞のせん断損傷を低減する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

骨関節炎（ＯＡ）は、関節軟骨の退行性変化と続発性骨過形成を特徴とする慢性疾患である。軟骨細胞の再生能力は限られているため、軟骨の退行性変化は不可逆的である。間葉系幹細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ、ＭＳＣ）は軟骨を修復し、退行性変化を遅延させるある程度の効果が確認されており、骨関節炎や軟骨欠損の治療において重要な意義を有している。

【0003】

現在、細胞治療は臨床応用が期待される治療法の一つであり、従来の細胞治療では、細胞送達媒体として水性溶液が用いられている。例えば、従来の骨関節の細胞治療では、細胞の懸濁液を注射器で関節腔内に注射し、生物学的治療効果を発揮させる。しかし、細胞を水性溶液で送達する過程では、注射後数時間から数日のうちに大量の細胞が死滅してしまう。現在のところ、転移過程における大量の細胞死の原因として、３つのメカニズムが広く受け入れられている：注射過程で細胞が受けるせん断力によって細胞死を引き起こすこと；成長因子の不足によって定着依存性の細胞が死滅すること；注射された外来細胞は宿主組織内の血管にアクセスしにくいため、宿主組織からの栄養補給の不足によって細胞死を引き起こすこと。その中でも、注射過程における機械的せん断力は細胞死の重要な原因である。細胞を生理食塩水のようなニュートン流体中に注射すると、細胞はシリンジ内でのせん断力と引張力を受ける。これは、シリンジ内壁と流体との界面における流動抵抗によるもので、シリンジ中心部の流速は内壁付近の流速よりも速いからである。さらに、注射に使用される針の直径は、通常、シリンジの直径よりも小さいため、シリンジと針の界面における引張力が飛躍的に増大する。これらの力の不均等な分布は、細胞に巨大なせん断応力を与え、その結果、細胞膜が破裂し、一部の壊死細胞が急速に死滅してしまう他、アポトーシス過程を誘発し、宿主に注射された細胞がさらに死滅する可能性もある。さらに、注射過程におけるせん断力の存在は、細胞の遺伝子発現や表現型などにも影響を及ぼす可能性があり、特に幹細胞の分化に重要な影響を及ぼす。

【0004】

せん断減粘性生体材料は、せん断応力の存在により液化してシリンジ内壁面に潤滑層を形成し、材料全体の流動抵抗を減少させることができ、さらに注射過程中に、該材料はシリンジの中心部と端部で同様の流速を有し、プラグフローを形成することにより、せん断応力を減少させることができる。これにより、注射過程中に細胞に機械的保護を与え、細胞にかかるせん断力を減少させることができるため、細胞の生存率を向上させ、細胞内の遺伝子発現などに対するせん断力の影響を減少させることができる。このような生体材料としては、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウムなどをベースに調製された天然高分子や超分子ハイドロゲル、及びポリペプチドベースの超分子ハイドロゲルなどが挙げられる。これらの材料は、一定のせん断減粘性を有するものの、潜在的な生物学的安全性の問題及び構造上の透過性の不足などの欠点があるため、細胞培養や組織再生でのさらなる応用が妨げられている。

【0005】

注射過程におけるせん断による細胞損傷に加え、関節内に注射された細胞は、関節内の摩擦などのせん断環境により損傷を受け、治療効果に影響を及ぼすこともある。このように、せん断環境下での細胞損傷をさらに低減するために、せん断減粘性をさらに向上させることが必要とされている。

【0006】

また、従来の細胞治療における水性溶液を用いた細胞注射過程におけるせん断による細胞損傷により、細胞の生存率や治療効果が大きく低下するという問題や、既存のせん断減粘性材料は潜在的な生物学的安全性の問題及び構造上の透過性の不足という問題に対し、骨関節炎の治療において、細胞のせん断損傷をさらに低減することができる方法、並びに細胞のせん断損傷を低減することと同時に、骨関節炎の治療に必要な良好な生体適合性などの望ましい性能を有する細胞製剤の開発が急務となっている。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0007】

【非特許文献1】Piuzzi, N. S.; Ng, M.; Chughtai, M.; Khlopas, A.; Ramkumar, P. N.; Harwin, S. F.; Mont, M. A.; Bauer, T. W.; Muschler, G. F., Accelerated Growth of Cellular Therapy Trials in Musculoskeletal Disorders: An Analysis of the NIH Clinical Trials Data Bank. Orthopedics 2019, 42 (2), e144-e150.

【非特許文献2】Jones, I. A.; Togashi, R.; Wilson, M. L.; Heckmann, N.; Vangsness, C. T., Jr., Intra-articular treatment options for knee osteoarthritis. Nat Rev Rheumatol 2019, 15 (2), 77-90.

【非特許文献3】Ng, J.; Little, C. B.; Woods, S.; Whittle, S.; Lee, F. Y.; Gronthos, S.; Mukherjee, S.; Hunter, D. J.; Worthley, D. L., Stem cell directed therapies for osteoarthritis: The promise and the practice: Concise review. Stem Cells 2019.

【非特許文献4】Mitrousis, N.; Fokina, A. & Shoichet, M.S. Biomaterials for cell transplantation. Nat Rev Mater 2018, 3, 441-456.

【非特許文献5】Yan, C.; Mackay M. E.; Czymmek K.; Nagarkar R. P.; Schneider J. P.; and Pochan D. J., Injectable Solid peptide hydrogel as a cell carrier: effects of shear flow on hydrogels and cell payload. Langmuir 2012 28 (14), 6076-6087.

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0008】

本発明者らは、特定の核酸超分子ハイドロゲルを細胞送達媒体として用いた場合、当該核酸ハイドロゲルが治療細胞をほぼ１００％保護し、細胞注射過程および関節内を模擬したせん断環境での細胞生存率が９９％以上と高くなることを見出した。本発明者らは、核酸ハイドロゲルが独特な三次元網目構造を有し、優れたせん断減粘性を有するため、細胞せん断損傷を著しく低減し、細胞に抗せん断保護を与え、せん断環境下での細胞生存率を向上させ、細胞治療の有効性を向上させることができることを見出した。一方、ヒアルロン酸、アルギン酸ナトリウム等をベースに調製された天然高分子や超分子ハイドロゲルと比較して、本発明の核酸超分子ハイドロゲルは、ゲル化が速く、良好な生体適合性と透過性など、軟骨組織工学に適した優れた特性を有するため、骨関節炎のための細胞ゲル製剤の形成に適している。

【0009】

以上の知見に基づき、本発明を完成するに至った。

【0010】

具体的に，本発明は、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを含む、関節内注射による急性または慢性の骨関節炎および／またはその症状の治療および／または予防のための細胞ゲル製剤；前記細胞ゲル製剤を使用して急性および慢性の骨関節炎および関連する炎症由来の症状（特に、骨関節の疼痛、可動性または機能の減少）を治療または予防する方法；ならびに前記核酸ハイドロゲルを使用してせん断環境下における細胞のせん断損傷を低減する方法に関する。

【0011】

本発明の細胞ゲル製剤は、注射過程や関節内の摩擦などのせん断環境による細胞のせん断損傷を低減することができ、前記細胞ゲル製剤中の細胞はせん断環境下でもほとんど損傷しない。具体的には、本発明の核酸ハイドロゲルは、細胞注射過程において、細胞に抗せん断保護を与え、従来の注射法に比べて、細胞の生存率が８５％から９９％以上に向上し；核酸ハイドロゲルは、模擬した関節せん断環境中で細胞に抗せん断保護を与え、培養液中の細胞に比べて、細胞の生存率が７５％から９９％以上に向上し；並びに、本発明の核酸ハイドロゲルによって送達された細胞のウサギの膝骨関節炎の治療効果は、従来の細胞治療よりも著しく優れている。

【図面の簡単な説明】

【0012】

【図1】細胞を含まないハイドロゲルおよび間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルのレオロジー特性（時間掃引及びひずみ掃引を含む）のテストグラフである。

【図2】従来の注射法と核酸ハイドロゲルを使用した細胞注射の過程図と、両注射法の注射前後にＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ染色により細胞を標識することによって決定された生存率を示す図である。

【図3】両注射法による注射前後の細胞の生存率の統計グラフである。

【図4】関節せん断環境を模擬する過程図と、培地中及びハイドロゲル中で摩擦した前後にＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ染色により細胞を標識して測定した生存率を示す図である。

【図5】培地中及びハイドロゲル中で、模擬した関節せん断環境で摩擦した前後の細胞の生存率の統計グラフである。

【図6】ウサギの膝骨関節炎の治療のために、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを膝関節内注射により投与したから１２週間後と２４週間後の膝関節の全体図である。

【図7】ウサギの膝骨関節炎の治療のために、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを膝関節内注射により投与したから１２週間後と２４週間後の膝関節の組織染色図である。

【図8】異なる核酸固形分含量の、注射後の細胞の生存率に対する影響を示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0013】

本明細書に記載されている科学技術用語は、当業者が一般に理解している用語と同じ意味を有するが、矛盾する場合には、本明細書の定義に準ずる。

【0014】

第１の態様において、本発明は、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを含む、関節内注射による急性または慢性の骨関節炎および／またはその症状の治療および／または予防のための細胞ゲル製剤に関する。

【0015】

一実施形態において、前記核酸ハイドロゲルは、足場コアおよび前記足場コアに結合する少なくとも３つの一本鎖核酸を含み、各一本鎖核酸は少なくとも１つの足場粘着末端を有する、足場ユニット；架橋コアおよび前記架橋コアに結合する少なくとも２つの一本鎖核酸を含み、各一本鎖核酸は少なくとも１つの架橋粘着末端を有する、架橋ユニット； および水性媒体を含み、前記足場ユニットおよび前記架橋ユニットは、前記足場粘着末端及び前記架橋粘着末端の相補的塩基対合による架橋により、三次元空間網目構造を形成する。

【0016】

一実施形態において、前記核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ）などを含み、好ましくは、デオキシリボ核酸（すなわち、ＤＮＡ）である。核酸は、天然のＤ－核酸であってもＬ－核酸であってもよく、Ｌ－核酸は、Ｌ－ヌクレオチドが重合したＬ－核酸を指す。具体的には、Ｌ－ＤＮＡは、Ｌ－デオキシリボヌクレオチドが重合したＤＮＡを指す。好ましくは、Ｌ－核酸である。

【0017】

一実施形態において、前記足場ユニットは、足場コアと前記足場コアに結合する少なくとも３つの一本鎖核酸とを含み、各一本鎖核酸は少なくとも１つの足場粘着末端を有する。好ましくは、足場コアは核酸であり、具体的は、Ｄ－核酸またはＬ－核酸であってもよく、さらに具体的には、Ｄ－ＤＮＡまたはＬ－ＤＮＡであってもよい。一実施形態において、足場コアとしての核酸は、相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域の長さは、４～１５０ｂｐであってもよく、好ましくは５～５０ｂｐ、より好ましくは６～３０ｂｐ、さらに好ましくは８～２０ｂｐであってもよい。

【0018】

一実施形態において、前記足場コアはポリペプチドであってもよく、これは、２つ以上のアミノ酸がペプチド結合によって連結された化合物である。足場コアとしてのポリペプチドは、具体的には、ジペプチド、トリペプチド、テトラペプチドなどを包含する。さらに、本発明のポリペプチドには、オリゴペプチド、タンパク質、蛋白質なども包含されている。

【0019】

一実施形態において、前記架橋ユニットは、架橋コアおよび前記架橋コアに結合する少なくとも２つの一本鎖Ｌ－核酸を含み、各一本鎖Ｌ－核酸は、少なくとも１つの架橋粘着末端を有する。好ましくは、前記架橋コアは核酸であってもよく、具体的にはＤ－核酸またはＬ－核酸であってもよく、さらに具体的にはＤ－ＤＮＡまたはＬ－ＤＮＡであってもよい。一実施形態において、架橋コアとしての核酸は、相補的対合領域を有し、前記相補的対合領域の長さは、４～１５０ｂｐであってもよく、好ましくは５～５０ｂｐ、より好ましくは６～３０ｂｐ、さらに好ましくは８～２０ｂｐであってもよい。

【0020】

一実施形態において、前記足場粘着末端または架橋粘着末端は４ｎｔ以上の長さを有し、こうなると、生理学的条件下で容易に安定な架橋状態にする。好ましくは、足場粘着末端または架橋粘着末端の長さは１５０ｎｔ以下、好ましくは５０ｎｔ以下、より好ましくは３０ｎｔ以下、より好ましくは３０～５０ｎｔ、より好ましくは２０ｎｔ以下である。

【0021】

一実施形態において、足場コアと架橋コアが同じであり、足場コアに結合する一本鎖核酸と架橋コアに結合する一本鎖核酸が同じ、例えば、同じＬ－核酸であり；足場コアに結合する一本鎖核酸の数と架橋コアに結合する一本鎖核酸の数（いずれも≧３）が同じである場合、足場ユニットと架橋ユニットは同じである。したがって、一実施形態において、足場ユニットと架橋ユニットは同じである。一実施形態において、足場単位と架橋単位は異なる。

【0022】

実施形態において、前記核酸ハイドロゲル中の足場ユニットと架橋ユニットとのモル比は、２：１～１：３、好ましくは１：１～１：２、より好ましくは１：１．５である。

【0023】

一実施形態において、前記足場ユニットおよび前記架橋ユニットは、前記足場粘着末端及び前記架橋粘着末端の相補的塩基対合による架橋により、三次元空間網目構造を形成する。好ましくは、足場ユニット、架橋ユニットおよび三次元空間網目構造は、生理学的条件下（３７℃、ｐＨ７．２～７．４、０．９ｗｔ％ＮａＣｌ、等張）で安定な架橋状態にある。

【0024】

一実施形態において、水性媒体は水または水溶液を指す。前記水溶液としては、緩衝塩を含む緩衝液が好ましい。前記水溶液は、好ましくは、生理学的条件（３７℃、ｐＨ７．２～７．４、０．９ｗｔ％ＮａＣｌ、等張）などの幹細胞の生体内微小環境に類似した環境を形成することができる。

【0025】

一実施形態において、前記核酸ハイドロゲルは好適な機械的強度を有し、例えば、機械的強度は０．１Ｐａ以上、好ましくは１Ｐａ以上、より好ましくは１０Ｐａ以上であってもよく、好ましくは１００００Ｐａ以下、より好ましくは１０００Ｐａ以下であってもよい。

【0026】

一実施形態において、核酸ハイドロゲルは、２５℃、ひずみ１％のひずみ振幅で、周波数掃引により測定された、０．１から１００ｒａｄ／ｓのすべてのひずみ値での、損失弾性率Ｇ”よりも優位な貯蔵弾性率Ｇ’を有する。好ましくは、０．１から１００ｒａｄ／ｓのひずみ値での損失弾性率Ｇ”に対する貯蔵弾性率Ｇ’の比は２より大きく、より好ましくは１０より大きい。

【0027】

一実施形態において、本発明の核酸ハイドロゲルは、望ましい安定性を有してもよく、例えば、制限エンドヌクレアーゼの存在下で、２４時間、好ましくは３６時間、より好ましくは４８時間、またはそれ以上の時間、その構造を安定に維持し得る。

【0028】

一実施形態において、前記核酸ハイドロゲルの足場ユニットまたは架橋ユニットは、ＣｐＧ配列を含むことができる。ＣｐＧ配列は、シトシン－リン酸－グアノシン（ＣｐＧ）ジヌクレオチドをコアとする回文配列であり、５’末端に２つのプリン、３’末端に２つのピリミジン、すなわち５’－ＰｕｒＰｕｒ－ＣＧ－ＰｙｒＰｙｒ－３’を有する。ＣｐＧ配列は哺乳類細胞に認識され、補体の活性化、貪食作用、炎症性サイトカイン遺伝子の発現など、一連の生体防御機構を引き起こすことができる。現在、既知の強い免疫刺激作用を有するＣｐＧ配列としては、例えば５’－ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ－３’などが挙げられる。

【0029】

一実施形態において、前記足場ユニットの配列は５’－ＣＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＣＣＡＣＧＣＴＧＴＣＣＴＡＡＣＣＡＴＧＡＣＣＧＴＣＧＡＡＧ－３’、５’－ＣＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＴＣＧＡＣＧＧＴＣＡＴＧＴＡＣＴＡＧＡＴＣＡＧＡＧＧ－３’または５’－ＣＧＡＴＴＧＡＣＴＣＴＣＣＣＴＣＴＧＡＴＣＴＡＧＴＡＧＴＴＡＧＧＡＣＡＧＣＧＴＧ－３’である。一実施形態において、前記架橋ユニットの配列は５’－ＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＴＣＴＡＴＴＣＧＣＡＴＧＡＧＡＡＴＴＣＣＡＴＴＣＡＣＣＧＴＡＡＧ－３’または５’－ＧＡＧＡＧＴＣＡＡＴＣＧＣＴＴＡＣＧＧＴＧＡＡＴＧＧＡＡＴＴＣＴＣＡＴＧＣＧＡＡＴＡＧＡ－３’である。

【0030】

本発明の核酸ハイドロゲルは、ＣＮ２０１６１０７４０７５４Ｘに記載の方法により調製することができ、例えば、ＤＮＡ一本鎖（すなわち、前記足場ユニットおよび前記架橋ユニット）を別々に調製し、次いでそれらを混合し、自己組織化により本発明のハイドロゲルを得ることができ；あるいは、前記足場ユニットおよび架橋ユニットを別々に前記水性媒体と混合して、足場ユニットの水性媒体溶液および架橋ユニットの水性媒体溶液を得、次いで、２つの溶液を混合して架橋させ、三次元空間網目構造を形成させてことにより、本発明のハイドロゲルを得ることもできる。

【0031】

一実施形態において、前記間葉系幹細胞は、前記核酸ハイドロゲル中に包埋または分散される。好ましくは、前記間葉系幹細胞は、前記核酸ハイドロゲル中に包埋される。

【0032】

一実施形態において、前記間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯または胎盤に由来する。前記間葉系幹細胞は、骨髄間葉系幹細胞、脂肪間葉系幹細胞、末梢血間葉系幹細胞、滑膜間葉系幹細胞、臍帯間葉系幹細胞、および臍帯血間葉系幹細胞のいずれか１つに由来する。前記間葉系幹細胞は、望ましい抗炎症性能と再生性能を有する。

【0033】

一実施形態において、前記間葉系幹細胞の密度は、１０^５～１０^８個細胞／ｍＬ（毎ミリリットル細胞ゲル製剤）であり、好ましくは、２×１０^７～５×１０^７個細胞／ｍＬであり、より好ましくは、１×１０^７個／ｍＬである。

【0034】

一実施形態において、前記ゲルは、注射過程中に細胞を保護するために、０．７～５．０％（質量／体積比、ゲル１ｍｌあたりの核酸固形分）の核酸固形分含量を有する。核酸固形分が０．７％（質量％）未満では、ゲルを形成することができず、ゲル中の核酸含量が５．０％より大きいと、強度が高く、注射過程中の抵抗が過大となるため、注射が困難となる。好ましい実施形態では、核酸固形分は１．５～４．０％、２．０～４．０％、３．０～４．０％、３．５～４．０％、または３．８％である。

【0035】

一実施形態において、前記間葉系幹細胞は、核酸ハイドロゲルが形成された後にハイドロゲル中に添加または混合され、それによって前記細胞ゲル製剤が形成される。一実施形態において、前記間葉系幹細胞をＤＮＡアセンブリと混合し、常法に従って間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを形成する。一実施形態において、前記間葉系幹細胞をＤＮＡ一本鎖（足場ユニット３個と架橋ユニット２個）と混合し、先ずは細胞を担持したＤＮＡアセンブリを形成し、次いで核酸ハイドロゲルを形成する。

【0036】

一実施形態において、前記細胞ゲル調製物はさらに抗炎症剤を含み、前記抗炎症剤は好ましくはステロイド性抗炎症化合物（例えば、プレドニゾロン、デキサメタゾン、ベタメタゾンおよびトリアムシノロン）、非ステロイド性抗炎症化合物（例えば、イブプロフェン、ジクロフェナク、ナプロキセンなど）、抗リウマチ薬（例えば、メトトレキサート、レフルノミドなど）、抗ＣＤ２０薬、抗サイトカイン薬（例えば、抗ＩＬ１薬、抗ＩＬ６薬、抗ＩＬ－１７薬）、抗ＴＮＦ薬（例えば、インフリキシマブ、エタネルセプト、アダリムマブ、リツキシマブなど）、またはそれらの混合物から選択される。

【0037】

第２の態様において、本発明は、前記細胞ゲル製剤を使用して急性および慢性の骨関節炎および関連する炎症由来の症状（特に、骨関節の疼痛、可動性または機能の減少）を治療または予防する方法に関する。一実施形態において、前記疾患または症状は、例えば、骨関節炎、退行性関節炎、膝関節疾患、股関節の退行性関節疾患、ならびに自己免疫疾患（特に、関節リウマチおよび全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ））、脊椎関節症、リウマチ性多発筋痛、強直性脊椎炎、ライター症候群、乾癬性関節症、腸疾患性関節炎（出血性大腸炎及びクローン病などの炎症性腸疾患に関係する）、神経障害性関節症、急性リウマチ熱、痛風、軟骨石灰化症、カルシウムヒドロキシアパタイトの結晶沈着疾患、ライム病などの関節が関与する他の炎症性全身状態、ならびに他の全ての退行性関節疾患から選択される。

【0038】

第３の態様において、本発明は、核酸ハイドロゲルを使用してせん断環境における細胞のせん断損傷を低減する方法に関し、方法は、（ｉ）足場ユニットおよび架橋ユニットを含む核酸ハイドロゲルを提供すること、および（ｉｉ）間葉系幹細胞を核酸ハイドロゲルに担持させることを含むか；または、（ｉ）核酸ハイドロゲルの足場ユニットおよび架橋ユニットを別々に調製すること、および（ｉｉ）間葉系幹細胞を足場ユニットおよび架橋ユニットと混合し、自己組織化により本発明の細胞ゲル製剤を得ることを含むか；または、細胞注射試験等により、細胞を担持した核酸ハイドロゲルの細胞に対する抗せん断保護効果を測定することを含む。

【0039】

第４の態様において、本発明は、急性および慢性の骨関節炎および関連する炎症由来の症状を治療または予防するための医薬の製造のための細胞ゲル製剤の使用に関する。

【0040】

一実施形態において、核酸ハイドロゲルは上記の通りである。一実施形態において、前記間葉系幹細胞は、前記核酸ハイドロゲル中に包埋または分散される。一実施形態において、せん断環境は、注射過程および関節内の内部摩擦を含む。

【実施例】

【0041】

実験材料
核酸ハイドロゲルは、ＣＮ２０１６１０７４０７５４Ｘに開示された方法を用いて調製した。まず、表１に示されるＤＮＡ一本鎖（Ｙ１、Ｙ２およびＹ３）および（Ｌ１ＣおよびＬ２Ｃ）を、それぞれ、水性媒体中で自己組織化させ、ＤＮＡアセンブリ（これは、足場ユニット１ｍｍｏｌ／Ｌおよび架橋ユニット１．５ｍｍｏｌ／Ｌである）になり、次いで、ＤＮＡアセンブリを混合して、所望のＤＮＡハイドロゲルサンプル（すなわち、核酸ハイドロゲル）を形成した。

【0042】

【表1】

【0043】

細胞培養培地は最小必須培地（ＭＥＭ）α（Ｇｉｂｃｏ， Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ， ＵＳＡ）を用いた。

【0044】

Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ細胞染色キットはＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ（Ｓｏｌａｒｂｉｏ， Ｓｏｌａｒｂｉｏ， Ｂｅｉｊｉｎｇ）を用いた。

【0045】

レオロジー特性はＫｏｍｅｘｕｓレオメーター（Ｍａｌｖｅｒｎ社製）を用いて測定し；細胞画像はＬＳＭ ７１０Ｍｅｔａレーザー走査型共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ、ドイツ）を用いて取得した。

【0046】

実施例１：間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルの調製
上記表１のＹ－足場ユニット１ ｍｍｏｌ／Ｌを、一定量の幹細胞（実験室で抽出したウサギの骨髄間葉系幹細胞に由来）懸濁液に完全に溶解させ、上記表１の架橋ユニット１．５ ｍｍｏｌ／Ｌを等容量の溶液に完全に溶解させ、これらの２つを混合し、ゲルを形成させた（ゲルは、数秒後に形成することができた）。得られた核酸ハイドロゲルの最終細胞濃度は１×１０^７細胞／ｍｌであり、核酸固形分含量は３．８％（質量％）であった。

【0047】

実施例２： 細胞を担持した核酸ハイドロゲルのレオロジー試験
実施例１で調製した間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを薬さじで取り出し、レオメーターの試験板の上に置いた。ハイドロゲル試料に接触するように、レオメーターのコーンプレートをゆっくりと下降するように調整し、最終的にコーンプレートと板の間の距離を１５０μｍに固定した。

【0048】

このセクションでは、合計２種類のレオロジーテストを行った。

【0049】

１つ目は時間掃引（Ｔｉｍｅ ｓｃａｎ）試験であり、すなわち、掃引周波数一定で、一定時間内で試料を連続的にせん断処理し、試料のせん断抵抗能力を試験し、さらに、損失弾性率に対する貯蔵弾性率の比を比較することによって、異なる試料の機械的強度を反映させた。この実験で設定したパラメーターは、ひずみ＝１％、周波数＝１Ｈｚ、温度２５℃一定である。

【0050】

２つ目はひずみ掃引（ｓｔｒａｉｎ ｓｗｅｅｐ）試験であり、異なるひずみ下での異なる試料の貯蔵弾性率と損失弾性率の変化傾向を測定することにより、試料がせん断減粘挙動を有するかどうかを反映させた。この実験で設定したパラメータは、ひずみ範囲＝０．１～１０００％、周波数＝１Ｈｚ、温度２５℃一定である。

【0051】

図１Ａと図１Ｂは細胞を含まないハイドロゲルの時間モードとひずみモードでのレオロジーテストの結果を示し、図１Ｃと図１Ｄは細胞を含むハイドロゲルの時間モードとひずみモードでのレオロジーテストの結果を示す。図１からわかるように、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルは、細胞を支持するための良好な機械的強度を保ちつつ、せん断減粘性を有している。

【0052】

実施例３：細胞を担持した核酸ハイドロゲルの細胞に対するせん断保護
この実施例では、実施例１で調製した核酸ハイドロゲルの、細胞注射過程および模擬した関節せん断環境での抗せん断保護効果について調べた。

【0053】

２９Ｇのインスリンシリンジ（針の直径がわずか３３０μｍ）を用いて、実施例１の細胞を担持した核酸ハイドロゲルについて、細胞の注射試験を行い、同時に培地中の細胞を対照とした。細胞生存率を注射後のＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色により特徴づけられた。実験結果は図２と図３に示される通りである。図２は、従来の注射法と核酸ハイドロゲルによる細胞注射の過程図と、両注射法の注射前後にＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ染色により細胞を標識することによって決定された生存率を示す。図２において、Ａ行は注射法、Ｂ行は生細胞の分布（生細胞は緑色の明るいスポット（原画像）または白色のスポット（白黒画像））を示し、Ｃ行は死細胞の分布（死細胞は赤色の明るいスポット（原画像）または薄い灰色のスポット（白黒画像））を示し、Ｄ行は生細胞／死細胞の分布を示す。便宜上、死細胞だけの分布をＣ行で示した。図２のＣ行からわかるように、従来の注射法で注射する前には、例えば図２の領域１Ｃのように、もうすでに多くの死細胞が見られたのに対し、核酸ハイドロゲルで保護した注射をする前には、例えば図２の領域３Ｃのように、死細胞は見られなかった。注射した後、従来の注射法では、例えば図２の領域２Ｃのように大量の細胞死をもたらしたのに対し、核酸ハイドロゲルで保護して注射した後、例えば図２の領域４Ｃのようにほとんど細胞死は見られなかった。このことから、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲル自身が細胞に保護を与える（すなわち、注射前の保護）ことができることを示しており、さらに、注射後の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルの、細胞に対する保護効果が特に著しいことが明らかとなった。

【0054】

関節内のせん断環境を模擬するために、実施例１の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを互いに３３０μｍの距離を有する２枚のカバースリップの間に配置し、２枚のカバースリップを双方向にスライドさせることにより関節内のせん断環境を模擬した。双方向スライドを２分間行った後、細胞の生存率をＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色により特徴づけられた。実験結果は図４と図５に示される通りである。図４は、関節せん断環境を模擬する過程図と、水性媒体培地中及びハイドロゲル中で細胞を摩擦させた前後で、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭ／ＰＩ染色により細胞を標識して測定した生存率を示す。水溶液中での摩擦は、例えば、図４の領域２Ａのように、大量な細胞死をもたらした（死細胞は、赤色の明るいスポット（原画像）または薄い灰色のスポット（白黒画像））のに対し、核酸ハイドロゲルでは死細胞はほとんど観察されなかった。

【0055】

この２つの実験結果から、細胞懸濁液を直接注射する場合と比較して、核酸ハイドロゲルは注射過程および模擬した関節せん断環境で細胞に抗せん断保護を与え、死細胞の発生がほとんど観察されず、せん断環境下での細胞の生存率が大幅に向上することが明らかとなった。具体的には、核酸ハイドロゲルは、細胞注射過程において、細胞に抗せん断保護を与え、従来の注射法に比べて細胞の生存率が８５％から９９％以上に向上し、核酸ハイドロゲルは、模擬した関節せん断環境中で細胞に抗せん断保護を与え、細胞の生存率は培養液中のものと比較して７５％から９９％以上に向上した。

【0056】

実施例４：間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルの膝関節内注射によるウサギの膝骨関節炎の治療
骨格が成熟した雄ニュージーランドウサギ（年齢：６ヵ月齢、体重：３．５±０．５Ｋｇ、ｎ＝６０）を北京大学動物実験センターから購入した。前十字靭帯切断および内側半月板切除により、ウサギに骨関節炎を誘発した。すべての動物実験手順は、北京大学動物ケアと使用委員会の承認を得ており、実験動物のケアと使用に関するガイドライン（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｐｒｅｓｓ、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ Ｐｒｅｓｓ， Ｎｏ．８５－２３、１９９６年改訂）に従ったものである。具体的な手順は以下の通りである。麻酔と通常の無菌的準備の後、膝蓋骨内側切開から関節腔に入り、前十字靭帯を切断し、内側半月板を完全に切除した。膝関節の安定性の低下は前方引き出しテストによって確認した。手術後、すべての動物を対応するウサギケージに戻し、自由に動けるようにし、必要な感染予防と疼痛緩和治療を行い、膝関節の機能回復を行った。

【0057】

すべての動物を無作為に以下を含む５つの群に分け、それぞれ左膝に、手術と注射による治療を行った：１． Ｓｈａｍ群：単に皮膚を切開し、縫合した；２． Ｂｌａｎｋ群：単に膝骨関節炎モデル手術をウサギに行った；３． ＰＤＳ群：ウサギの膝骨関節炎に核酸ハイドロゲルのみを注射した；４． ＭＳＣｓ群：ウサギの膝骨関節炎に間葉系幹細胞のみを注射した；５． Ｈｙｂｒｉｄ群：ウサギの膝骨関節炎に間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを注射した。注射はすべて、ウサギの膝骨関節炎モデル手術後８週目に、週１回、計３回行った。ＰＤＳ群には毎回、膝あたり２００μｌの核酸ハイドロゲルを注射し、ＭＳＣｓ群には毎回、膝あたり２００μｌの細胞の基礎培地懸濁液を注射し（細胞濃度１×１０^７細胞／ｍｌ）、Ｈｙｂｒｉｄ群には毎回、膝あたり２００μｌの実施例１の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲル（細胞濃度１×１０^７細胞／ｍｌ）を注射した。注射治療終了後１２週目と２４週目に、各群のウサギを安楽死させ、さらなる研究のために膝関節サンプルを採取した。

【0058】

一般的な観察結果からわかるように、Ｂｌａｎｋ群とＰＤＳ群では、時間の経過とともに悪化する軟骨びらんおよび軟骨欠損が認められのに対し、ＭＳＣｓ治療群とＨｙｂｒｉｄ治療群での軟骨損傷は有意に改善され、ここでＨｙｂｒｉｄ群の一般的な観察結果は、より正常な軟骨（Ｓｈａｍ群）に近いものであった。サンプル組織はさらに、Ｈ＆Ｅ、サフラニンＯ－ファストグリーン、トルイジンブルー染色、及びＩＩ型コラーゲン免疫組織化学に供された。ＭＳＣｓ治療群と比較して、間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲル治療群（Ｈｙｂｒｉｄ群）の軟骨形態及びＩＩ型コラーゲン発現は、特に２４週目において、より正常軟骨組織のそれに近いものであった。同様に、軟骨表面の微細構造を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）で観察したところ、従来の間葉系幹細胞を担持した水性溶液治療群（ＭＳＣｓ群）の軟骨表面は、ひび割れはなかったが、依然として多数の丘が認められた。一方、Ｈｙｂｒｉｄ群の軟骨表面は滑らかで、小さな凹凸があるだけであった。結果は図６と図７に示される通りである。

【0059】

実施例５：間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルに対する核酸固形分の影響
実施例１と同様に、核酸固形分０．９５％、１．９％、４．２％の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルを調製し、これら３種類の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルについて、実施例３と同様に、細胞注射過程における細胞に対する抗せん断保護効果を試験した。注射２４時間後、核酸固形分３．８％のものと同様に、核酸固形分０．９５％、１．９％、４．２％の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルでは、死細胞は認められなかった。しかし、同様に調製した場合、核酸固形分３．８％の間葉系幹細胞を担持した核酸ハイドロゲルの方が、より均一な細胞分布、より好適な核酸強度及び好ましい注射性が得られた。結果は図８に示される通りである。

【0060】

以上、本発明の実施例を示して説明したが、上記の実施例は、例示的なものであり、本発明を限定するものとは解釈されないことを理解し、当業者は、本発明の範囲内において、上記実施形態を変更、修正、置換、および変形することができる。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【国際調査報告】