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特表2024-510532ＣＯＶＩＤ‐１９の発症を予防、治療、又は減弱するのに有用な、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質を発現する１つ又は複数の改変ＢＣＧ株を含有する免疫原性製剤
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-07
(54)【発明の名称】ＣＯＶＩＤ‐１９の発症を予防、治療、又は減弱するのに有用な、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質を発現する１つ又は複数の改変ＢＣＧ株を含有する免疫原性製剤
(51)【国際特許分類】
A61K 35/74 20150101AFI20240229BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240229BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240229BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240229BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240229BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240229BHJP
C12N 15/50 20060101ALN20240229BHJP
【ＦＩ】
A61K35/74 A ZNA
A61P31/14
A61P37/04
A61K39/215
A61K39/00 G
A61K39/00 E
A61K47/02
C12N15/50
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023563134
(86)(22)【出願日】2021-12-23
(85)【翻訳文提出日】2023-07-06
(86)【国際出願番号】 CL2021050123
(87)【国際公開番号】W WO2022133622
(87)【国際公開日】2022-06-30
(31)【優先権主張番号】3370-2020
(32)【優先日】2020-12-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CL
(31)【優先権主張番号】3346-2021
(32)【優先日】2021-12-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CL
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】515075496
【氏名又は名称】ポンティフィシア・ウニベルシダ・カトリカ・デ・チリ
(71)【出願人】
【識別番号】523239619
【氏名又は名称】ファンダシオン コペック ウニベルシダ カトリカ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】カレルギス パッラ、アレクシス
(72)【発明者】
【氏名】ブエノ レミレス、スーザン
(72)【発明者】
【氏名】グンザレス ムニョス、パブロ
(72)【発明者】
【氏名】レタマル ディアス、アンジェロ
(72)【発明者】
【氏名】ソト ラミレス、ホルヘ
【テーマコード（参考）】
4C076
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA29
4C076BB16
4C076BB31
4C076CC06
4C076CC35
4C076DD23Q
4C076FF04
4C076FF36
4C076FF61
4C076FF63
4C076GG06
4C085AA03
4C085BA71
4C085BB11
4C085CC07
4C085CC08
4C085DD01
4C085DD13
4C085DD62
4C085DD84
4C085EE01
4C085GG01
4C085GG04
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087BC29
4C087MA16
4C087MA63
4C087MA66
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB33
(57)【要約】
本発明は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）の１つ又は複数の改変組換え株を、１０４～１０９菌の間の濃度で含有する免疫原性製剤に関し、各ＢＣＧ株は、薬学的に許容される生理食塩水緩衝液中で、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の少なくとも１つのタンパク質又は免疫原性フラグメントを発現し、この製剤は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２感染を予防、治療又は減弱させるのに有用なワクチンを調製するのに役立つ。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＣＯＶＩＤ‐１９に対する保護を与える免疫原性製剤であって、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスの少なくとも１つのタンパク質又は免疫原性フラグメントを発現する、１用量当たり１０４～１０９ＣＦＵの量の、マイコバクテリウム・ボビス バチルス・カルメット・ゲラン（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）の少なくとも１つの弱毒化組換え株を、薬学的に許容される生理食塩水緩衝液中に含むことを特徴とする、上記免疫原性製剤。
【請求項2】
ＢＣＧによって発現されるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスのタンパク質又は免疫原性フラグメントが、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントに対応することを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性製剤。
【請求項3】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質又は免疫原性フラグメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に定義されるヌクレオチド配列の遺伝子産物と少なくとも７５％同一なアミノ酸配列に対応することを特徴とする、請求項２に記載の免疫原性製剤。
【請求項4】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質又は免疫原性フラグメントが、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に定義されるヌクレオチド配列の遺伝子産物と少なくとも９５％同一であることを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性製剤。
【請求項5】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ若しくはＳタンパク質又はそれらの免疫原性フラグメントをコードする遺伝子が、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧのゲノム中又は染色体外プラスミド中に、１つ以上のコピーで挿入されていることを特徴とする、請求項３又は４に記載の免疫原性製剤。
【請求項6】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ若しくはＳタンパク質又はそれらの免疫原性フラグメントをコードする遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４と少なくとも７５％同一のヌクレオチド配列に対応することを特徴とする、請求項５に記載の免疫原性製剤。
【請求項7】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ若しくはＳタンパク質又はそれらの免疫原性フラグメントをコードする遺伝子が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４と少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列に対応することを特徴とする、請求項６に記載の免疫原性製剤。
【請求項8】
遺伝子の発現が、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧの内因性又は外因性プロモーターによって、構成的又は誘導的に指令されることを特徴とする、請求項７に記載の免疫原性製剤。
【請求項9】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ若しくはＳタンパク質又はそれらの免疫原性フラグメントが、ＢＣＧによって、可溶性‐細胞質様式で、細胞外に分泌されて、又は細胞膜に結合したタンパク質として発現され得ることを特徴とする、請求項８に記載の免疫原性製剤。
【請求項10】
使用前の保存のために、凍結、凍結乾燥又は緩衝生理食塩水及び賦形剤によって安定化されることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性製剤。
【請求項11】
使用前の保存のために、凍結、凍結乾燥又は生理食塩水緩衝液及び賦形剤により安定化されることを特徴とする、請求項９に記載の免疫原性製剤。
【請求項12】
弱毒化組換え株がＢＣＧデンマーク株又はＢＣＧパスツール株であることを特徴とする、請求項１に記載の免疫原性製剤。
【請求項13】
組換え株が、ｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及び／又はｒＢＣＧ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２に相当することを特徴とする、請求項３に記載の免疫原性製剤。
【請求項14】
組換え株が、０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及び／又は０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２を含む、ただし、これらの株の少なくとも１つが存在することを特徴とする、請求項１３に記載の免疫原性製剤。
【請求項15】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２感染及び／又はＣＯＶＩＤ‐１９疾患の発症を予防、治療、又は減弱させるワクチンを調製するのに役立つことを特徴とする請求項１～１４のいずれかに記載の免疫原性製剤の使用であって、前記製剤が、生理学的に許容される生理食塩水で安定化されたマイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ）ＢＣＧの組換え弱毒化株の１ｘ１０４～１ｘ１０９コロニー形成単位を含有する、上記使用。
【請求項16】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の感染及び／又はＣＯＶＩＤ‐１９の発症を予防、治療又は減弱させるためのワクチンを調製し、生理的に許容される生理食塩水中で皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与するのに役立つことを特徴とする、請求項１５に記載の使用。
【請求項17】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２感染及び／又はＣＯＶＩＤ‐１９の発症を予防、治療、又は減弱させるためのワクチンが、最初の適用で投与され、その後に：ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスの少なくとも１つのタンパク質又は免疫原性フラグメントを発現する、１用量当たり１０４～１０９ＣＦＵの量の、マイコバクテリウム・ボビス・カルメット・ゲリン（ＢＣＧ）の弱毒化組換え株の製剤；
又は不活化ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスの免疫原性製剤；
又は精製ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスサブユニットの免疫原性製剤；
又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のペプチド免疫原性フラグメントを有する免疫原性製剤；
又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ ＤＮＡワクチンの免疫原性製剤；
又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＲＮＡワクチンの免疫原性製剤
を含有するブースターが投与され得ることを特徴とする、請求項１６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
ＣＯＶＩＤ‐１９の原因ウイルスであるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２に対するワクチンの調製に有用な免疫原性製剤が開示され、この製剤は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２感染の予防、治療、又は減弱に有用な、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の１つ以上のタンパク質又は免疫原性フラグメントを組換え発現する、マイコバクテリウム・ボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、ウシ型結核菌）、バチルス・カルメット・ゲラン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ、カルメット・ゲラン桿菌）（ＢＣＧ）の少なくとも１つの弱毒化株を含む。
【背景技術】
【0002】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２は、２０１９年１２月に中国湖北省武漢市で発見された呼吸器ウイルスである。ＣＯＶＩＤ‐１９（コロナウイルス疾患２０１９）と呼ばれる急性呼吸器症候群を生じ、密接な接触間でのヒト‐ヒト感染の証拠が確認された。配列解析により、この人獣共通感染症ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスは、コロナウイルスに典型的なゲノム構造を有し、β‐コロナウイルス群に属することが示された。
【0003】
この症候群の主な症状及び臨床徴候は、３８℃以上の発熱、呼吸困難、乾いた咳であり、肺炎の引き金となり、さらにひどい場合には死に至ることもある。このウイルスの平均死亡率は２０２０年の最初の４ヶ月間で約２％と低いものの、その感染力の高さから、世界的に公衆衛生上の大きな問題となっており、世界保健機関（ＷＨＯ）は２０２０年３月１１日にパンデミック宣言を行った。
【0004】
パンデミックと宣言されたＣＯＶＩＤ‐１９は、現在までに世界のほとんどの国で流行しているが、その影響はすべての国で同じではない。この違いは、数ある要因の中でも、各国がパンデミックに直面した政策やその政策の時期などによって説明できる部分もあるが、多くの研究者は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の罹患率及び死亡率の両方における影響の低さと、小児期のＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）ワクチン接種政策との関連性を指摘している。普遍的なＢＣＧワクチン接種政策をとっていない国（特に、イタリア、オランダ、米国など）は、普遍的で長年のＢＣＧ政策をとっている国に比べ、より深刻な影響を受けていることが報告されている。データによると、ＢＣＧワクチンは、その国で報告されているＣＯＶＩＤ‐１９の症例数を減少させることも示している（Ｃｏｖｉａｎ，Ｃ．，Ｒｅｔａｍａｌ‐Ｄｉａｚ，Ａ．，Ｂｕｅｎｏ，Ｓ．Ｍ．ａｎｄ Ｋａｌｅｒｇｉｓ，Ａ．Ｍ．，２０２０．Ｃｏｕｌｄ ＢＣＧ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｕｃｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ ｔｒａｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｆｏｒ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１，ｐ．９７０（ＢＣＧワクチン接種によりＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２に対する訓練された防御免疫が誘導される可能性。）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ａａｒｏｎ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＢＣＧ ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｐｏｌｉｃｙ ａｎｄ ｒｅｄｕｃｅｄ ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ ａｎｄ ｍｏｒｔａｌｉｔｙ ｆｏｒ ＣＯＶＩＤ－１９： ａｎ ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｔｕｄｙ．ｍｅｄＲｘｉｖ，２０２０（ＣＯＶＩＤ‐１９の普遍的ＢＣＧワクチン接種政策と罹患率及び死亡率の減少との相関：疫学的研究。）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
知られているように、ＣＯＶＩＤ‐１９を予防するために異なる技術に基づく様々なワクチンが開発されており、そのほとんどは成人への使用が承認されているが、そのうちのいくつかは３～６歳以降の小児患者を対象に緊急承認されている。
【0006】
ワクチン接種によってパンデミックの進行を遅らせることはできたが、現在までのところ、新生児や３歳未満の小児への適用が承認されたワクチンはない。さらに、新種の変異体の出現により、パンデミックは何年も続く可能性があり、私たちは感染の波や発生状況に応じて、年に１回又は複数回のワクチン接種を受けなければならない。
【課題を解決するための手段】
【0007】
このシナリオを踏まえ、本発明者らはＣＯＶＩＤ‐１９のための新しいワクチンを開発した。このワクチンはベクターとして、１００年以上前から実証されているＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）の弱毒株を使用し、新生児に安全に使用でき、アジュバントとして作用し、長期的な免疫をもたらす反応を誘導することが知られており、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質又は免疫原性フラグメントを発現するように変換することで、このウイルスに対する免疫を生成し、ＣＯＶＩＤ‐１９の発症を制御し、出生時から集団を保護することができる。
【図面の簡単な説明】
【0008】
【図1-A】ＰＣＲ法によるＥ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及びＭ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の組換えＢＣＧクローンの同定（特異的スプリッターを使用）。組換えＢＣＧ株のゲノム中の目的の遺伝子の同定は、目的の遺伝子それぞれに特異的なプライマーを用いて行った。その後、アンプリコンを１％アガロースゲルで分析し、予想されるサイズのアンプリコンを同定した（Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２については２２８ｂｐ、Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２については６６９ｂｐ）。「－ＣＯ２」は、菌がＣＯ２の非存在下で５％増殖したことを意味する。「＋ＣＯ２」は、菌がＣＯ２の存在下で５％増殖したことを意味する。「ＳＣ‐２」はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の略である。「ベータ」は、以前の試験で分離され、４０日間増殖し続けた菌株に相当し、Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２については陰性であったことを意味する。
【図1-B】特異的スプリッターを用いたＰＣＲによる組換えＢＣＧ株のＮ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及びＳ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の同定。組換えＢＣＧ株のゲノムからのＮ及びＳ遺伝子の同定は、目的の各遺伝子に対する特異的プライマーを用いて行った。その後、アンプリコンを１％アガロースゲルで分析し、予想されるサイズのアンプリコンを同定した（Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２では１２６０ｂｐ、Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２では３６４４ｂｐ）。「ＣＯ２」は、菌がＣＯ２の存在下で５％増殖したことを意味する。「ＳＣ‐２」はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の略である。
【図2】ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子を持つ組み換えＢＣＧからのタンパク質の抽出。各菌株のプロテオームと目的のウイルスタンパク質を比較すると、いずれの場合もクローン化されたタンパク質と同様の大きさのバンドが存在することが観察される。
【図3-A】組換えＢＣＧにおけるＮ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の発現。Ｎ遺伝子の転写産物のコピー数の評価は、ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で飽和培養して得られた１００ｎｇの全ＲＮＡから行った。
【図3-B】組換えＢＣＧからのＥ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ２遺伝子の発現。Ｅ遺伝子の転写産物のコピー数の評価は、ｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で飽和培養して得られた１００ｎｇの全ＲＮＡから行った。
【図3-C】組換えＢＣＧからのＭ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の発現。Ｍ遺伝子の転写産物のコピー数の評価は、ｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で飽和培養して得られた１００ｎｇの全ＲＮＡから行った。
【図3-D】組換えＢＣＧからのＳ１／２‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の発現。Ｓ１／２遺伝子の転写産物のコピー数の評価は、ｒＢＣＧ‐Ｓ１／２‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で飽和した培養から得られた１００ｎｇの全ＲＮＡから行った。 グラフ中の数字は、コンベンショナルＰＣＲで陽性と確認された株からの異なるＲＮＡサンプルを示す。（１）培養継代２におけるｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株のクローン１からのＲＮＡサンプル。（２）培養継代１におけるｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株のクローン２からのＲＮＡサンプル。（３）培養継代１におけるｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株のクローン１からのＲＮＡサンプル。「Ｎｅｇ」は陰性対照で、ＲＮＡを含まない反応に相当する。コピー数は、プラスミドｐＵＣ５７‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２であらかじめ標準化した標準曲線で各サンプルについて得られたＣＴを外挿することにより算出した。記号（＃）は培養継代に対応する。
【図4】組換えＢＣＧワクチン接種による抗ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２免疫応答の誘導を評価するための免疫化スケジュール。０日目と１４日目は、１ｘ１０８ＣＦＵ（Ｃｏｌｏｎｙ Ｆｏｒｍｉｎｇ Ｕｎｉｔ、コロニー形成単位）の用量を動物に接種した日である。日数の下にあるチューブは、血清を得るために血液サンプルを採取した実験内の時点に対応する。２１日目は実験の終点である。
【図5】組換えＢＣＧワクチン接種による抗ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２免疫応答の誘導を評価するための免疫化スケジュール。０日目は１ｘ１０５ＣＦＵの用量を動物に接種した日である。日数の下にあるチューブは、血清を得るために血液サンプルを採取した実験内の時点に対応する。２１日目は実験の終点に相当する。
【図6】ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２でのワクチン接種によるサイトカインの測定。免疫化スケジュールＮｏ２に従った動物の脾臓及びリンパ節から得られた樹状細胞と全Ｔリンパ球からなる共培養で分泌されるサイトカインを評価した。サイトカインＩＦＮ‐γは、共培養上清を１／１０に希釈してＥＬＩＳＡにより評価した。比色反応はＥＬＩＳＡリーダーで波長４５０ｎｍで評価した。Ｃｏｎ Ａは免疫応答を増強する刺激であり、陽性対照に相当する。
【図7】異なる処理を負荷した樹状細胞との共培養７２時間後のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面の活性化マーカーの評価。ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２によるワクチン接種が細胞性免疫応答を誘導するかどうかを評価するために、実験終了後、動物の脾臓から全Ｔリンパ球を精製した。次に、これらを７２時間、異なるペプチドと処理を負荷した樹状細胞と共培養した。この時間の後、活性化マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋、ＣＤ２５＋をフローサイトメトリーでＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面で評価した。上のパネルは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋マーカーのＣＤ４＋Ｔリンパ球に対応する。下のパネルは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋マーカーに対するＣＤ８＋Ｔ細胞に対応する。＊印のバーはＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ Ｎタンパク質に対する反応に対応し、＋印のバーは実験の活性化の陽性対照である対照Ｃｏｎ Ａに対応する。
【図8】ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２でのワクチン接種により誘導されたＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗Ｎ抗体の測定。１ｘ１０８ＣＦＵを２回用量で免疫化した動物から得られた血清から分泌された抗体を評価した。ウイルスのＮタンパク質に対する特異的抗体は，１／６００に希釈した血清を用いたＥＬＩＳＡで評価した．比色反応はＥＬＩＳＡリーダーで波長４５０ｎｍで評価した。
【図9】本発明の組換えＢＣＧ株のプール（混合物）によるワクチン接種による抗ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２免疫応答の誘導を評価するための免疫化スケジュール。０日目は、４ｘ１０５ＣＦＵの用量を動物にワクチン接種した日に相当する。１４日目は、精製タンパク質及び水酸化アルミニウム（Ａｌｕｍ）又はそれらの対照をそれぞれ投与したブースターに対応する。日数の下の記号は、血清採取のために血液を採取した実験中の時点に対応する。２４日目は実験の終点である。
【図10】ワクチン接種動物の体重曲線の決定。ｒＢＧＣ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＧＣ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＧＣ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＧＣ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の組換え株のプール（混合物）から４ｘ１０５ＣＦＵの用量を投与し、免疫化した動物の体重増加又は減少を２４日間モニターし、ワクチンが動物にとって安全かどうかを決定した。
【図11】組換えＢＣＧ株のプール（混合物）を４ｘ１０５ＣＦＵの用量でワクチン接種することにより誘導されるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗Ｎ抗体の測定。ウイルスのＮタンパク質に対する特異的抗体を、表１に示したすべての条件について、１／５に希釈した血清を用いたＥＬＩＳＡで評価した。比色反応はＥＬＩＳＡリーダーで波長４５０ｎｍで評価した。
【図12】組換えＢＣＧ株のプール（混合物）を４ｘ１０５ＣＦＵの用量でワクチン接種することにより誘導されるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗Ｓ抗体の測定。ウイルスのＳタンパク質に対する特異的抗体価は、表１に示したすべての条件について、１／１０から１／２５６０に希釈した血清を用いたＥＬＩＳＡで評価した。比色反応はＥＬＩＳＡリーダーで４５０ｎｍの波長で評価した。
【図13】ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｍ、Ｓ、又はＮ、Ｍ及びＳの混合物の異なる刺激で処理した樹状細胞との共培養７２時間後のＣＤ８＋Ｔリンパ球表面の活性化マーカーの評価。実験終了後、表２のスキームに従い、脾臓から全Ｔリンパ球を精製した。次に、これらを各種ペプチドを負荷した樹状細胞と７２時間共培養した。この時間後、活性化マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋、ＣＤ２５＋をフローサイトメトリーでＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面で評価した。
【図14】異なる刺激、Ｎ若しくはＳタンパク質、又は精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）で処理した樹状細胞との共培養７２時間後のＣＤ８＋Ｔリンパ球表面の活性化マーカーの評価。実験終了後、表３のスキームに従い、脾臓から全Ｔリンパ球を精製した。これらを、異なる刺激を負荷した樹状細胞と７２時間共培養した。この時間後、活性化マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋及びＣＤ２５＋をフローサイトメトリーでＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面で評価した。
【図15】１ｘ１０５ＣＦＵの用量でｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株のワクチン接種と組換えＮタンパク質＋Ａｌｕｍによるブースター、及び不活化ウイルスワクチンによって誘導されたＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗Ｎ抗体の測定。ウイルスのＮタンパク質に対する特異的抗体は、原液血清を用いＥＬＩＳＡ法で評価した。比色反応はＥＬＩＳＡリーダーで波長４５０ｎｍで評価した。
【発明を実施するための形態】
【0009】
本発明は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、好ましくはＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の異種ウイルス抗原の組換え発現を含むＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ株（ＢＣＧ）に基づく少なくとも１つの生きた弱毒化株を含む免疫原性製剤に対応する。
【0010】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２を含むコロナウイルス（ＣｏＶ）は、２６，０００から３７，０００塩基の一本鎖ポジティブセンスＲＮＡを含む。これはＲＮＡウイルスの中で最大の既知のゲノムである。ＣｏＶのゲノム構造は以下の通りである：尾部５’‐リーダー‐ＵＴＲ‐レプリカーゼ‐Ｓ（スパイク）‐Ｅ（エンベロープ）‐Ｍ（膜）‐Ｎ（ヌクレオキャプシド）‐３’ＵＴＲｐｏｌｙ（Ａ）。Ｍタンパク質とＥタンパク質はウイルスの組み立てに重要な役割を果たし、Ｎタンパク質はＲＮＡ合成に必要である。Ｓタンパク質（スパイク）は、受容体との結合とそれに続く宿主細胞へのウイルス侵入を担う。スパイクは高度にグリコシル化された三量体クラスＩ融合タンパク質で、Ｓ１とＳ２の２つのサブユニットを含む。本書では、Ｓ又はＳ１／Ｓ２と互換的に呼ぶ。
【0011】
より詳細には、本発明は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスのＮ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳの（ｒＢＣＧ）抗原を組換え的に発現するＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）の少なくとも１つの株を含む製剤に対応することを示すことができる。このＢＣＧワクチン株は、それが使われてきた年月にわたって驚くほど遺伝的に安定している。
【0012】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の目的の遺伝子は、標準的な遺伝子工学的手法によって、マイコバクテリウム中で組換え及び発現するｐＭＶ３６１ベクターにクローニングされ、得られたベクターでＢＣＧ株がエレクトロポレーションによって形質転換された。形質転換後、ウイルス抗原の発現レベルをウェスタンブロットによりタンパク質レベルで、ＲＴ‐ｑＰＣＲによりメッセンジャーＲＮＡレベルで評価した。さらに、形質転換株のゲノムＤＮＡを精製し、ＢＣＧゲノムにおける目的の遺伝子の組み込みを決定した。
【0013】
当業者にとっては、本発明者らによって選択されたものとは異なるベクター及び異なる変換技術が、このような変更が観察された結果の悪化を意味することなく、使用され得ることは明らかであり、このような変更は本発明の範囲内であると考えられる。
【0014】
具体的には、本発明は、ＣＯＶＩＤ‐１９に対する保護を与える免疫原性製剤であって、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスの少なくとも１つのタンパク質又は免疫原性フラグメントを発現する、１用量当たり１０４～１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）の間の量の、少なくとも１つの弱毒化されたマイコバクテリウム・ボビス バチルス・カルメット・ゲラン（ＢＣＧ）組換え株を、薬学的に許容される生理食塩水緩衝液中に含む、免疫原性製剤を目的とする。好ましくは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質又は免疫原性フラグメントは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳタンパク質又はそれらの免疫原性フラグメントに相当し、ここで、タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子の産物のアミノ酸配列と少なくとも７５％同一のアミノ酸配列を有する。そして好ましくは、タンパク質は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。
【0015】
配列番号１は、酵素ＢｓｔＢＩ及びＣｌａＩの制限部位を用いて、Ｎタンパク質をコードする遺伝子に対応する。配列番号２は、酵素ＢｓｔＢＩ及びＣｌａＩの制限部位を用いて、タンパク質Ｅをコードする遺伝子に対応する。配列番号３は、酵素ＢｓｔＢＩ及びＣｌａＩの制限部位を用いて、Ｍタンパク質をコードする遺伝子に対応する。配列番号４は、酵素ＭｆｅＩ及びＡｆｌＩＩの制限部位を用いて、Ｓタンパク質をコードする遺伝子に対応する。
【0016】
本発明の免疫原性製剤において、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ若しくはＳ又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子は、マイコバクテリウムＢＣＧのゲノム中又は染色体外プラスミド中に、１又は複数のコピーで挿入され、マイコバクテリウムＢＣＧの内因性又は外因性プロモーターによって、構成的又は誘導的に制御又は指令される。ここで、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ若しくはＳ又はそれらの免疫原性フラグメントをコードする遺伝子は、すべての中間的な選択肢を考慮すると、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４と少なくとも７５％同一であり、好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４と少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列に対応する。その結果、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ若しくはＳタンパク質又はそれらの免疫原性フラグメントは、ＢＣＧによって可溶性‐細胞質様式で、細胞外に分泌されて、又は細胞膜結合タンパク質として発現され得る。使用されるＢＣＧ株は、好ましくはＢＣＧデンマーク株（ＢＣＧ Ｄａｎｉｓｈ）又はＢＣＧパスツール株（ＢＣＧ Ｐａｓｔｅｕｒ）から選択される。
【0017】
本発明の実施態様において、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスのタンパク質又は免疫原性フラグメントは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子の産物として定義されるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ又はＳのタンパク質配列に関して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列に対応し、ここで、その差異は置換、欠失、付加又は挿入を含む。同様に、当業者にとっては、このタンパク質の発現を得るために、細菌は、前記タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターで形質転換されなければならないことが明らかであろう。ここで、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４に従って定義されるヌクレオチド配列、及び遺伝暗号の変性から生じるそれらの等価物に関して、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を含有するヌクレオチド配列を含む。
【0018】
当業者にとって、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスの変異体の場合、これらの変異体のウイルスタンパク質のペプチド配列に従って、特異的なワクチンを処方することができることは明らかであろう。ここで、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２変異体の前記ウイルスタンパク質が、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子の産物として定義されるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳタンパク質の配列と少なくとも７５％の同一性を有する場合、それらのワクチンは本発明の範囲内にあると考えられる。
【0019】
本発明の実施態様において、本発明の免疫原性製剤は、使用前の保存のために、凍結、凍結乾燥又は生理食塩水緩衝液及び注射用製剤のための賦形剤によって安定化される。適切な賦形剤の中には：グルタミン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム七水和物、リン酸水素カリウム、クエン酸一水和物、Ｌ‐アスパラギン一水和物、クエン酸鉄アンモニウム、グリセロール、及び注射用水、及び本発明を実施する時点で、当技術分野で利用可能な他の任意のものがある。
【0020】
本発明の別の実施態様では、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２による感染を予防、治療又は減弱させるワクチンを調製するために記載された免疫原性製剤の使用を保護し、ここで、前記製剤は、生理食塩水で安定化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧの組換え弱毒化株、の１ｘ１０４～１ｘ１０９ＣＦＵを含有する。このワクチンは、生理学的に許容される生理食塩水中で皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与することができる。
【0021】
周知のように、多くの場合、ＣＯＶＩＤ‐１９ワクチンは最初の接種後にブースターを必要とする。本発明の場合、初回接種から１～６ヶ月以内に、弱毒ウイルスワクチン、又は精製ウイルスサブユニット、又はペプチド免疫原性フラグメント、又はＤＮＡワクチン、又はＲＮＡワクチンですら前記ブースターを行うことが提案される。
【0022】
本発明のワクチンによるブースターは、ＢＣＧワクチンの初回接種から数年後に行うことができ、例えば、乳児の出生時に行うことができる。
【0023】
本発明で保護される製剤を作製するために、ＢＣＧのデンマーク（Ｄａｎｉｓｈ）株又はパスツール（Ｐａｓｔｅｕｒ）株を使用し、それをゲノムレベルで形質転換し、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳタンパク質をその複製サイクル中に構成的に発現させる。このタンパク質の合成は、細菌の複製能力に変化や障害をもたらさないので、ベクター株に対して毒性作用を及ぼすことはない。
【0024】
本発明の特筆すべき２つの特徴は、前臨床マウスモデルで評価した安全性プロファイルと免疫原性にある。免疫化したマウスの成長曲線と臨床症状から、このワクチンの投与は重大な副作用を起こさず、形質転換していないＢＣＧ又はＷＴ（英語の頭文字をとって野生型）と同様の効果を有することが示された。このワクチンの免疫原性に関しては、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の精製抗原Ｎ、Ｅ、Ｍ又はＳに対するＣＤ４＋及びＣＤ８＋特異的Ｔ細胞の増殖及び活性化が観察されており、免疫応答を生じさせ、免疫学的記憶を生成するのに不可欠な刺激である。
【0025】
本発明のワクチンについて観察された安全性及び免疫原性プロファイルは、それを安全な免疫化ツールとする。
【0026】
現在、乳幼児に特化したＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２感染の予防又は治療法として承認され、出生時から適用できる有効なワクチン又は治療法はない。本発明によるタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２を発現する組換えＢＣＧワクチンは、新生児を含む全ての年齢の個体に使用することができる。本発明はＣＯＶＩＤ‐１９を予防するために開発されたワクチンである。ＢＣＧは、新生児、小児及び成人において安全であることが示されているので、ワクチン開発のための良い手段である。ＢＣＧは低コストで容易に大量生産でき、温度変化にも安定である。さらに、ＢＣＧはアジュバントとして働き、ウイルスの排除に必要なＴｈ１応答（Ｔヘルパーリンパ球）を誘導する。他の製剤と異なり、ウイルスタンパク質が発現しているＢＣＧベクターは、ヒトで約１００年間広く使用されている。
【0027】
一実施形態では、ワクチンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子の産物のペプチド配列に関して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有する、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳを発現するｒＢＣＧ株の１ｘ１０４～１ｘ１０９ＣＦＵを含む。
【0028】
第２の実施形態において、ワクチンは、本発明による２つの株ｒＢＣＧの組合せの１ｘ１０４～１ｘ１０９ＣＦＵを含み、各株ｒＢＣＧは、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子の産物のペプチド配列に関して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有する、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ又はＳを発現する。ここで、組み合わせは、すべての可能な選択肢の中から選択される、すなわち、可能な対：ＮとＥ；ＮとＭ；ＮとＳ；ＥとＭ；ＥとＳ；ＭとＳのいずれかを有する形質転換株である。
【0029】
第３の実施形態において、ワクチンは、本発明による３つのｒＢＣＧ株の組合せの１ｘ１０４～１ｘ１０９ＣＦＵを含み、各ｒＢＣＧ株は、それぞれ配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子産物のペプチド配列に関して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有する、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ又はＳを発現する。ここで、組み合わせは、全ての可能な選択肢の中から選択される、すなわち、可能なトリオ：Ｎ、Ｅ及びＭ；Ｎ、Ｅ及びＳ；Ｍ、Ｅ及びＳ；Ｎ、Ｍ及びＳのいずれかを有する形質転換株である。
【0030】
第４の実施形態では、ワクチンは、本発明による４つのｒＢＣＧ株の組み合わせの１ｘ１０４～１ｘ１０９ＣＦＵを含み、各ｒＢＣＧ株は、配列番号１、配列番号２、配列番号３又は配列番号４の遺伝子の産物のペプチド配列に関して少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又はそれ以上の同一性を有する、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ又はＳを発現する。すなわち、Ｎ、Ｅ、Ｍ及びＳを有する形質転換株の組み合わせである。
【0031】
本発明のワクチンは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の１つ以上のタンパク質又は免疫原性フラグメント、特にＮタンパク質又はその免疫原性フラグメントを組換え又は異種様式で発現する、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ、好ましくはＢａｃｉｌｌｕｓ Ｃａｌｍｅｔｔｅ‐Ｇｕｅｒｉｎ（ＢＣＧ）、例えばＢＣＧ Ｄａｎｉｓｈ又はＰａｓｔｅｕｒ株の生きた弱毒化組換え株を含有する。本発明のワクチンは、記載された株の１用量あたり１ｘ１０４～１ｘ１０９ＣＦＵ（コロニー形成単位）を含み、投与前に凍結乾燥又は生理食塩水及び低温安定化賦形剤中で保存することができる。
【0032】
本発明の免疫原性製剤又はワクチンのための適切な安定化溶液の例は以下の通りである。
‐希釈Ｓａｕｔｏｎ ＳＳＩ溶液（１２５μｇのＭｇＳＯ４、１２５μｇのＫ２ＨＰＯ４、１ｍｇのＬ‐アスパラギン、１２．５μｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、１８．４ｍｇの８５％グリセロール、０．５ｍｇのクエン酸、１ｍｌのＨ２Ｏ中）、４℃；
‐ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ；２，７ｍＭのＫＣｌ；４，３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；１，４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，４）、－８０℃でＴｗｅｅｎ ８０ ０，０２％及びグリセロール２０％を添加；又は
‐体積溶液：乳糖２５％、Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ ａｎｄ Ｂｅｃｋ培地にグルコースとＴｗｅｅｎ ８０を添加したもの（ＰＢＧＴ：０．５ｇのアスパラギン、５．０ｇのリン酸一カリウム、１．５ｇのクエン酸マグネシウム、０．５ｇの硫酸カリウム、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ ８０、及び１０．０ｇのグルコース、蒸留水１リットルあたり）、凍結乾燥し、４℃～２５℃の温度範囲で保存。
‐希釈Ｓａｕｔｏｎ ＳＳＩ溶液（１２５μｇのＭｇＳＯ４、１２５μｇのＫ２ＨＰＯ４、１ｍｇのＬ‐アスパラギン、１２．５μｇのクエン酸第二鉄アンモニウム、１８．４ｍｇの８５％グリセロール、０．５ｍｇのクエン酸、１ｍｌのＨ２Ｏ中）、４℃；
‐ＰＢＳ（１３７ｍＭのＮａＣｌ；２，７ｍＭのＫＣｌ；４，３ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；１，４７ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７，４）、－８０℃でＴｗｅｅｎ ８０ ０，０２％及びグリセロール２０％を添加；又は
‐体積溶液：乳糖２５％、Ｐｒｏｓｋａｕｅｒ ａｎｄ Ｂｅｃｋ培地にグルコースとＴｗｅｅｎ ８０を添加したもの（ＰＢＧＴ：０．５ｇのアスパラギン、５．０ｇのリン酸一カリウム、１．５ｇのクエン酸マグネシウム、０．５ｇの硫酸カリウム、０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ ８０、及び１０．０ｇのグルコース、蒸留水１リットルあたり）、凍結乾燥し、４℃～２５℃の温度範囲で保存。
【0033】
本発明の組換え株を得るために、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳタンパク質又はその免疫原性フラグメントをコードする遺伝子をプラスミドに挿入し、これを任意の利用可能な技術によって細菌に組み込む。一実施形態では、プラスミドｐＭＶ３６１が使用され、エレクトロポレーションによって細菌に組み込まれ、マイコバクテリオファージのインテグラーゼの作用によって細菌ゲノムに組み込まれる。これらの遺伝子は染色体外プラスミド、例えばｐＭＶ２６１に挿入することもでき、これはエレクトロトランスフォーメーションによりマイコバクテリウムに組み込まれ、菌体内で染色体外に維持される。これらの遺伝子は１コピーでも複数コピーでもよく、その発現はＢＣＧの内因性プロモーター、例えばそれぞれｈｓｐ６０遺伝子のプロモーターとａｃｒ遺伝子のプロモーターなどの構成性又は誘導性プロモーターによって指令される。これらのタンパク質、あるいはＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の免疫原性フラグメントは、ＢＣＧ又は他の弱毒化されたマイコバクテリウム株によって、可溶性‐細胞質性、細胞外分泌性、あるいは膜結合性タンパク質として発現させることができる。
【0034】
本発明の製剤は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の感染及び／又はＣＯＶＩＤ‐１９疾患の発症を予防、治療、又は減弱させるためのワクチンを調製するために使用することができ、ここで、前記製剤は、生理学的に許容される生理食塩水で安定化されたＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧの組換え弱毒化株の１ｘ１０４～１ｘ１０９コロニー形成単位を含有する。前記ワクチンは、生理学的に許容される生理食塩水中で皮下に（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、経皮的に（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）又は皮下に（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）投与することができる。
【0035】
現在市販されているワクチンで知られているように、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ワクチンは初回接種の１ヵ月後に２回目の接種を必要とすることが多く、インフルエンザなど他の持続性又は季節性の病気と同様に、半年に１回又は年１回の接種によるブースター投与が毎年冬に必要となる可能性が高い。
【0036】
本発明のワクチンの場合、現在のＢＣＧによるブースターが５歳時に実施されていることを考慮すべきであり、ＣＯＶＩＤ‐１９に加えて結核も予防し続けるというワクチンの二価性を考慮すると、新生児や幼児に対するワクチン接種スケジュールでは、本発明のワクチンの接種から１～６ヶ月の間に、ＣＯＶＩＤ‐１９の最初のブースターを市販されている他のワクチンで行うことが可能であり、最も都合がよい。
【0037】
しかし、毎年のブースター、あるいは時間的にもっと間隔をあけたブースターには、もちろん本発明の製剤をブースターとして適用するのが便利であろう。
【0038】
最初の適用から１ヶ月目から６ヶ月目の間に最初のブースターとして適用され得るワクチンの中には、不活化ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルス、又は精製ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスサブユニット、又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のペプチド免疫原性フラグメント、又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ ＤＮＡワクチン、又はＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＲＮＡワクチンに基づくワクチンがある。
【実施例】
【0039】
これらの実施例は単なる例示であり、本発明の製造又は適用の範囲を限定することを意図するものではない。以下の説明において特定の用語が使用されているが、それらの使用は説明的なものであり、限定的なものではない。
【0040】
例Ｉ：ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳ遺伝子の組換えデンマークＢＣＧ株。
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質Ｎ、Ｅ、Ｓ及びＭの遺伝子を含有するＢＣＧについて、４つの発現ベクターを構築した。このために、細菌のゲノムに１回だけ組み込まれるプラスミドｐＭＶ３６１を使用した。
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質Ｎ、Ｅ、Ｓ及びＭの遺伝子を含有するＢＣＧについて、４つの発現ベクターを構築した。このために、細菌のゲノムに１回だけ組み込まれるプラスミドｐＭＶ３６１を使用した。
【0041】
各遺伝子をプラスミドに挿入するために、Ｎ、Ｅ、及びＭ遺伝子については、各遺伝子の５’末端にＢｓｔＢＩ（ＴＴＣＧＡＡ）、３’末端にＣｌａＩ（ＡＴＣＧＡＴ）という酵素の組み合わせを用いた。タンパク質Ｎを発現させるためにプラスミドに挿入される配列は、配列番号１に記載されている。タンパク質Ｅを発現するためにプラスミドに挿入されるものは、配列番号２に記載されており、タンパク質Ｍを発現するためにプラスミドに挿入されるものは、配列番号３に記載されている。
【0042】
スパイク、Ｓの遺伝子を挿入するために、遺伝子の５’末端にＭｆｅＩ（ＣＡＡＴＴＧ）、３’末端にＡｆｌＩＩ（ＣＴＴＡＡＧ）という酵素の組み合わせを用い、これをギブソンアセンブリー法を用いてｐＭＶ３６１ベクターにクローニングした。発現は配列番号４に記載されている：
【0043】
得られたプラスミドはそれぞれｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、及びｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２と呼ばれ、挿入された配列は内因性プロモーターの制御下で発現し、ＢＣＧ ｈｓｐ６０遺伝子を構成的に発現する。さらに、形質転換された細菌を選択するために、このプラスミドはカナマイシン耐性遺伝子を有する。
【0044】
プラスミドが挿入されたセグメントを含有していることを確認するために、各挿入物をプラスミドから切断し、得られたフラグメントが各場合において予想されたサイズを有することを電気泳動により確認した。これは、Ｅ遺伝子について２２６ｂｐのサイズ、Ｍ遺伝子について６６９ｂｐのサイズ、Ｎ遺伝子について１２６０ｂｐのサイズ、Ｓ１／Ｓ２遺伝子について４１２２ｂｐのサイズである。
【0045】
各ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質のプラスミドが得られたら、エレクトロコンピテントＢＣＧをＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ及びＳタンパク質を発現する統合発現プラスミドで形質転換した。
【0046】
得られたプラスミドを用いて、ＢＣＧエレクトロコンピテントデンマーク株の培養を、各プラスミドｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、及びｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２でエレクトロポレーションによりそれぞれ独立に形質転換した。
【0047】
形質転換により得られた組換えコロニーを、選択抗生物質としてカナマイシン２５ｕｇ／ｍＬを添加したＭｉｄｄｌｅｂｒｏｃｋ ７Ｈ９培地中、３７℃で２１日間独立に増殖させた。
【0048】
培養液をＯＤ６００ｎｍ＝１になるまで増殖させ、プラスミドｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、又はｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、及びｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で形質転換したＢＣＧを１１，０００ｒｐｍで２０分間遠心し（エッペンドルフ社製ローター モデル５７０２／Ｒ Ａ‐４‐３８）、ＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ；２．７ｍＭ ＫＣｌ；４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）に懸濁した。
【0049】
例ＩＩ：ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＮ、Ｅ、Ｍ又はＳ遺伝子に対する組換えＢＣＧ株の同一性の証明。
例Ｉで得られた各形質転換体の同一性を確認するために、さまざまな試験を行った。まず、カナマイシンを添加した７Ｈ１０培地を用いたプレートにおいて、各形質転換体について単離コロニーを得た。
例Ｉで得られた各形質転換体の同一性を確認するために、さまざまな試験を行った。まず、カナマイシンを添加した７Ｈ１０培地を用いたプレートにおいて、各形質転換体について単離コロニーを得た。
【0050】
最初に、微生物が本当にＢＣＧであることを確認するために、培養物中の１６Ｓ ＢＣＧのフラグメントとＩＳ６６１０挿入配列のフラグメントの存在をＰＣＲで評価した。これらのフラグメントはこの種の細菌にのみ存在し、真菌や培養物を汚染する可能性のある他の種類の微生物には存在しない。ＢＣＧゲノムに保存されているこれらの遺伝子をＰＣＲで増幅し、その後３％アガロースゲルで可視化することにより、組換えプラスミドｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、又はｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及びｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で形質転換した後に得られたコロニーのセットがＢＣＧに相当することを確認することに成功した。
【0051】
次に、形質転換株における目的の各ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質をコードする遺伝子の存在を評価した。これは、対応する株について、各ウイルス遺伝子Ｎ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳに特異的なスプリッターを用いたＰＣＲによって行われた。結果は図１に示されており、レーン「１」に陽性対照「＋」に類似したバンドが得られていることが観察される。
【0052】
得られた組換えＢＣＧの画分をタンパク質抽出プロトコールに供し、それぞれにおける組換えＮ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳ抗原の存在及び発現を評価した。このために、これらのＢＣＧを溶解緩衝液（Ｔｒｉｓ ５０ｍＭ、ＥＤＴＡ ５ｍＭ、ＳＤＳ ０．６％、１Ｘ プロテアーゼ阻害剤カクテル）に再懸濁し、氷上で３０秒間の超音波照射を６回行い、３０秒間の休息パルスを行った。
【0053】
各形質転換株のタンパク質画分を電気泳動で分析し、各菌株のプロテオームと対応するウイルスから単離したタンパク質を比較したゲルの写真を図２に示す。いずれの場合も、ＢＣＧが形質転換されたウイルスタンパク質と予想される分子量のタンパク質が存在することが観察される。
【0054】
ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＥ、Ｍ、Ｎ、又はＳタンパク質を特異的に認識するマウスモノクローナル抗体を用いて、免疫学的検査を行った。その後、比色反応を可能にするＨＲＰで標識した抗マウスヤギ抗体（ヤギ抗マウスＩｇＧ‐ＨＲＰ）を用いた。ウェスタンブロット試験及びドットブロット試験を行った結果、いずれの場合も、形質転換ＢＣＧ ｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、又はｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のそれぞれについて、対応するウイルスタンパク質が陽性であった。
【0055】
例ＩＩＩ：組換えＢＣＧ株におけるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のウイルスタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳの発現の評価。
ＢＣＧの組換え株の特徴を完全にするために、ＰＣＲによる遺伝子の同定、ウェスタンブロット及びドットブロットによる挿入されたタンパク質の発現の確認に加えて、本発明のワクチン株におけるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のウイルスタンパク質により生成された転写産物又はｍＲＮＡの定量をｑＰＣＲ法（定量的）により行った。
ＢＣＧの組換え株の特徴を完全にするために、ＰＣＲによる遺伝子の同定、ウェスタンブロット及びドットブロットによる挿入されたタンパク質の発現の確認に加えて、本発明のワクチン株におけるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のウイルスタンパク質により生成された転写産物又はｍＲＮＡの定量をｑＰＣＲ法（定量的）により行った。
【0056】
この方法により、ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、及びＳ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の全てのクローンが目的の遺伝子を発現していることを見出すことができた（図３において見ることができる）。この解析により、ワクチン株が発現している可能性のあるタンパク質の量を推定することが意図される。この情報により、将来の動物免疫化試験のための試験用量を推定することができる。
【0057】
ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の２クローンにおけるＮ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の転写産物数を評価した結果を図３Ａに示す。最初の継代培養では、クローン２の方が転写産物のコピー数が多かった。しかし、これをクローン１の培養継代２で得られたＲＮＡのサンプルで評価すると、最初の継代で得られたものに対して、転写産物の量に一桁の増加が観察された。
【0058】
Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の転写産物数を評価するために同様のアッセイを行い、評価した２つの継代培養について評価した遺伝子のコピー数の存在を観察した（図３Ｂ）。しかし、ｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株の２回目の継代培養で得られた転写産物量は、１回目の継代培養で得られた量に対して３桁多かった。
【0059】
Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子の発現も、他の遺伝子について述べたのと同じ方法で評価した。この試験から、２つの継代培養で評価したＭ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２遺伝子のコピー数の存在は同程度であることが観察された（図３Ｃ）。
【0060】
最後に、ＢＣＧの組換え株におけるプロテインＳ（スパイク）の発現を検出するために、条件を標準化した。このワクチン株の最初の継代培養を評価したところ、発現は認められたが、コピー数はあまり多くなかった（図３Ｄ）。
【0061】
例ＩＶ：免疫原性の製剤化
ｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２又はｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で形質転換した先の例で得られた組換えコロニーを、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｃｋ ７Ｈ９を補充した培養液中で３７℃で増殖させた、選択抗生物質としてカナマイシン２５ｕｇ／ｍＬを添加し、ＯＤ６００ｎｍ＝１まで培養した後、１１，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し（エッペンドルフ・ローター・モデル５７０２／Ｒ Ａ‐４‐３８）、ＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ；２．７ｍＭ ＫＣｌ；４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）に再懸濁した。
ｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２又はｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２で形質転換した先の例で得られた組換えコロニーを、Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｃｋ ７Ｈ９を補充した培養液中で３７℃で増殖させた、選択抗生物質としてカナマイシン２５ｕｇ／ｍＬを添加し、ＯＤ６００ｎｍ＝１まで培養した後、１１，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し（エッペンドルフ・ローター・モデル５７０２／Ｒ Ａ‐４‐３８）、ＰＢＳ溶液（１３７ｍＭ ＮａＣｌ；２．７ｍＭ ＫＣｌ；４．３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４；１．４７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ ７．４）に再懸濁した。
【0062】
特定の濃度、例えば１００μｌ当たり１０５又は１０８ＣＦＵのワクチンの用量を生成するために、用量バイアルから７Ｈ９培地を用いたプレートで連続希釈を行い、コロニー計数を行った。抗生物質無添加のＬＢ培地と７Ｈ９培地で用量のいくつかを播種することで、汚染物質の存在を除外した。最後に、用量がＣＦＵ数に関して正確であることが確認されると、動物にワクチンとして使用するまで－８０℃で保存された。
【0063】
組換えＢＣＧの用量は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のタンパク質Ｎ、Ｅ、Ｍ及び／又はＳについて作製され、ここでＢＣＧ株は、Ｎについては配列番号１、Ｅについては配列番号２、Ｍについては配列番号３又はＳ１／Ｓ２については配列番号４に示される配列を含有するプラスミドでＢＣＧ株を形質転換し、ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及びｒＢＣＧ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２と同定した。
【0064】
用量は、形質転換された細菌のうちの１つのみを含有するか、又はそれらのうちの２つの組み合わせ、又はそれらのうちの３つの組み合わせ、又は４つすべてを含有することができ、ここで、２つ以上の形質転換された細菌の各組み合わせにおいて、それぞれが任意の割合で存在することができる。すなわち、用量は、０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、及び０～１００％のｒＢＣＧ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２を含有し得る。
【0065】
このようにして調製された用量は、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射又は経皮（ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ）注射又は皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌ）注射によって動物にワクチン接種するために使用することができる。
【0066】
例Ｖ．ｒＢＣＧ株による動物の免疫化
例ＩＶで得られた組成物を用いて、２セットの免疫化試験を動物モデル（マウス）で実施した。実験デザインは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＥ、Ｎ、Ｍ及び／又はＳタンパク質のいずれかを発現する組換えＢＣＧ株によるワクチン接種によって誘導される細胞性免疫及び体液性免疫を評価するために開発された。
例ＩＶで得られた組成物を用いて、２セットの免疫化試験を動物モデル（マウス）で実施した。実験デザインは、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＥ、Ｎ、Ｍ及び／又はＳタンパク質のいずれかを発現する組換えＢＣＧ株によるワクチン接種によって誘導される細胞性免疫及び体液性免疫を評価するために開発された。
【0067】
最初の一連の分析は、図４の図に従って行われ、０日目と１４日目に１ｘ１０８ＣＦＵの用量を動物に２回ワクチン接種した。血液サンプルは７、１４、及び２１日目に採取し、２１日目に動物を安楽死させて実験を終了した。
【0068】
２回目の一連の分析は、図５のスキームに従い、０日目に１ｘ１０５ＣＦＵの用量で動物に１回のワクチン接種を行った。血液サンプルは７、１４、及び２１日目に採取し、２１日目に動物を安楽死させて実験を終了した。
【0069】
各場合において、ＣＦＵの用量は本発明の形質転換ＢＣＧに対応し、これは形質転換ＢＣＧ ｐＭＶ３６１／Ｎ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｅ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、ｐＭＶ３６１／Ｍ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２又はｐＭＶ３６１／Ｓ ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２に対応する。
【0070】
例ＶＩ：動物におけるｒＢＣＧ株ワクチンの効果
先の例で開発した両方の免疫化スキームにおけるｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株によるワクチン接種の効果を評価するために、異なるペプチドと処理物を負荷した樹状細胞（ＤＣ）と、ワクチン接種を受けた動物の二次リンパ器官（脾臓とリンパ節）からの精製Ｔリンパ球との間の共培養を７２時間行った。この時間後、細胞を異なる抗体で染色し、これらのＴリンパ球の活性化を評価した。さらに、活性化マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋及びＣＤ２５＋を、フローサイトメトリーによりＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面で評価した。さらに、共培養の上清からサイトカインをＥＬＩＳＡで評価した。
先の例で開発した両方の免疫化スキームにおけるｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株によるワクチン接種の効果を評価するために、異なるペプチドと処理物を負荷した樹状細胞（ＤＣ）と、ワクチン接種を受けた動物の二次リンパ器官（脾臓とリンパ節）からの精製Ｔリンパ球との間の共培養を７２時間行った。この時間後、細胞を異なる抗体で染色し、これらのＴリンパ球の活性化を評価した。さらに、活性化マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋及びＣＤ２５＋を、フローサイトメトリーによりＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面で評価した。さらに、共培養の上清からサイトカインをＥＬＩＳＡで評価した。
【0071】
２回目の免疫化スキームによる共培養から、異なる処理の上清中のサイトカインを評価した。最初に、サイトカインＩＬ‐２とＩＦＮ‐γが評価された。ＩＬ‐２はＴ細胞増殖の増加と相関するように評価され、ＩＦＮ‐γはワクチンによって促進された免疫応答と相関するように評価された。
【0072】
ＩＦＮ‐γを評価したところ、ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株をワクチン接種した動物は、免疫応答を抗ウイルスプロファイルに極性化するこのサイトカインの分泌をより促進することが決定された（図６参照）。
【0073】
ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２株によるワクチン接種が細胞性免疫応答を誘導するかどうかを評価するために、実験終了後、２回目の免疫化スケジュールから全Ｔリンパ球を脾臓から精製した。次に、これらを７２時間、異なるペプチドと処理物を負荷した樹状細胞と共培養した。この時間後、活性化マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋及びＣＤ２５＋を、フローサイトメトリーによりＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の表面で評価した。
【0074】
結果を図７に示す。ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ Ｎタンパク質（２０μｇ）に反応して、Ｔリンパ球が特異的に活性化されることがわかる。この結果は、評価したＣＤ４＋及びＴ ＣＤ８＋リンパ球すべてにおいて非常に顕著であり、特異的ウイルス抗原に対する反応は、陽性対照であるコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ）に対する反応と同様である。
【0075】
これらの結果は非常に重要で、ワクチンには、ウイルスに対する免疫応答の活性化を助けるＣＤ４＋Ｔリンパ球を促進し、同時に抗ウイルス作用を持つＣＤ８＋Ｔリンパ球を促進するポジティブな効果があることを意味している。
【0076】
これらの結果に加え、観察された細胞応答は、両方の免疫化スケジュールで誘導された抗体の測定で補足された。１ｘ１０８ＣＦＵの用量を２回投与した免疫化スケジュールでは、免疫化２４日後にＥＬＩＳＡによる抗Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗体の効率的な誘導が認められた。得られたデータから確認できたことは、ワクチン株ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２は刺激前に穏やかな抗体反応を促進することができるということであり、＊印のバーでは１４日目にわずかな増加が観察された。しかし、この増加は刺激後２４日目により顕著となり、組換え株ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２を接種した動物の血清から刺激に対する高い反応が観察された（図８）。
【0077】
例ＶＩＩ：ｒＢＣＧ株の混合物による動物の免疫化
動物モデル（マウス）を用いて、４つの形質転換株（２５％ｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、２５％ｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、２５％ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及び２５％ｒＢＣＧ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２）の混合物を含む例ＩＶで得られた組成物による一連の免疫化試験を行った。実験デザインは、本発明の製剤によるワクチン接種によって誘導される細胞性免疫及び体液性免疫を評価するために開発された。
動物モデル（マウス）を用いて、４つの形質転換株（２５％ｒＢＣＧ‐Ｅ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、２５％ｒＢＣＧ‐Ｍ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２、２５％ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２及び２５％ｒＢＣＧ‐Ｓ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２）の混合物を含む例ＩＶで得られた組成物による一連の免疫化試験を行った。実験デザインは、本発明の製剤によるワクチン接種によって誘導される細胞性免疫及び体液性免疫を評価するために開発された。
【0078】
これを実施するために、４×１０５総ＣＦＵ（本発明の組換え株の各々の１×１０５ＣＦＵ）の用量で免疫化を実施し、１４日後、動物を、水酸化アルミニウムアジュバントとともに投与された精製タンパク質Ｅ、Ｍ、Ｎ及びＳ、合計４０μｇ（各々１０μｇ）を用いたブースターに相当する２回目の免疫化に供した、実験のスキームを図９に示す。血液サンプルは免疫化後０日目、１４日目、２４日目に採取し、２４日目に動物を安楽死させて実験を終了した。
【0079】
【表1】
【0080】
例ＶＩＩＩ：動物におけるｒＢＣＧ株の混合物によるワクチンの効果
まず、本発明のワクチン接種スキームを受けた動物及びその対照の体重減少の評価を実施した。ここで、本発明のワクチンは、ＢＣＧの４つの組換え株を一緒にしたプール又は混合物に相当する。結果を図１０に示す。本発明のワクチン接種スキームは、動物の体重が経時的に減少しなかったので、安全であることが証明された。
まず、本発明のワクチン接種スキームを受けた動物及びその対照の体重減少の評価を実施した。ここで、本発明のワクチンは、ＢＣＧの４つの組換え株を一緒にしたプール又は混合物に相当する。結果を図１０に示す。本発明のワクチン接種スキームは、動物の体重が経時的に減少しなかったので、安全であることが証明された。
【0081】
０日目、１４日目及び２４日目に得られた血液サンプルから、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスのＮタンパク質に対する抗体の測定が行われ、ＢＣＧプールによるワクチン接種が動物の抗Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗体の増加を促進し、すべての対照群で得られた抗体よりも大きいことが観察された。この効果は、組換え株のプールと、組換えタンパク質（Ｎ、Ｍ及びＳ）とＡｌｕｍの混合物からなるブースターを用いて免疫化した、本発明に対応するグループにおいて、試験終了時（２４日目）に表向きにより大きくなることが観察された。試験動物から得られた血清中に存在する抗体は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２の組換えタンパク質Ｎ（ｒＮ）を標的として用い、比色反応を与える酵素ＨＲＰに結合した抗マウス抗体を用いたＥＬＩＳＡ法により評価した。試験動物の血清を１／５に希釈して使用した。比色反応はＥＬＩＳＡリーダーで波長４５０ｎｍで評価した。結果を図１１に示すが、本発明のワクチン接種スキームでは、実験の２４日目に抗Ｎ抗体の最良の産生が得られることがわかる。
【0082】
さらに、本発明の免疫化スキームが動物にＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスのＳタンパク質に対する抗体を発達させたかどうかを決定するために滴定を行った。このために、試験の２４日目に得られた血清が使用され、各実験群を構成する３匹の動物の血清を等しい割合で混合して、各群の動物について測定が行われた。この試験から、本発明のワクチン接種スキームを用いて行ったワクチン接種が、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２のＳタンパク質に対する強い抗体反応を促進することを決定することができた。ここで、抗体の産生は、図１２に示すように、他の実験グループについて観察されたものに関して、本発明のスキームにおいて顕著に高い。特に、この結果は、本発明の株のプールとウイルス組換えタンパク質のプール（Ｎ、Ｍ及びＳ）のブースターの組み合わせが、本発明の株（プール）のみの使用及び組換えタンパク質のみの使用よりも有意に多くの抗体を生成することを示している。
【0083】
本発明のスキームがＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ウイルスに対する抗体の生成を促進することが示されたので、細胞性免疫応答も評価し、抗ウイルス効果のＣＤ８＋Ｔリンパ球の活性化を評価した。このために、実験を終了した後、２４日目に、動物の脾臓から全Ｔリンパ球を精製した。評価条件を表２にまとめた。
【0084】
【表2】
【0085】
次いで、精製したＴリンパ球を、異なるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ペプチドを負荷した樹状細胞と７２時間共培養した。使用したペプチドは、Ｎ、Ｍ及びＳタンパク質、又はＮ、Ｍ及びＳの混合物に相当する。
【0086】
培養終了時、ＣＤ８＋Ｔリンパ球表面のＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋及びＣＤ２５＋活性化マーカーをフローサイトメトリーで評価した。結果を図１３に示す。
【0087】
この結果から、評価した異なる刺激（Ｎ、Ｍ及びＳ、又はそれらの混合物）は、ＣＤ８＋Ｔリンパ球を効果的に刺激し、ＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋、及びＣＤ２５＋マーカーの発現を増加させることが示された。具体的には、本発明のワクチン接種スキームである「ｒＢＣＧｓ ｐｏｏｌ／ｒＰｒｏｔｓ＋Ａｌｕｍ」を用いたグループでは、タンパク質Ｍ、Ｎ、及び共培養中のタンパク質の混合物の刺激に対して、マーカーＣＤ６９＋のより高い発現が認められた（図１３Ｂ）。一方、対象グループで２番目に多く発現した活性化マーカーはＣＤ７１＋であり、主にＳタンパク質の刺激と混合タンパク質に反応した（図１３Ｃ）。最後に、ＣＤ２５＋マーカーの発現においても、ＣＤ７１＋で観察されたのと同様の反応が観察された（図１３Ａ）。
【0088】
本研究で得られたデータは、異なるＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質を発現する組換えＢＣＧ株のプールの使用が、感染のないモデルにおいてＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２感染に対して有効であろう体液性及び細胞性免疫応答を促進することを示している。
【0089】
例ＩＸ．比較例：本発明のワクチン接種スキーム対不活化ウイルスワクチン。
本発明のワクチン接種スキームによって付与される免疫を比較的に確立するために、動物を本発明に従って免疫化し、同時に不活化ウイルスワクチンで免疫化する実験を行った。ワクチン接種スケジュールを表３に要約する。
本発明のワクチン接種スキームによって付与される免疫を比較的に確立するために、動物を本発明に従って免疫化し、同時に不活化ウイルスワクチンで免疫化する実験を行った。ワクチン接種スケジュールを表３に要約する。
【0090】
【表3】
【0091】
表３の免疫化スケジュールに基づいて、不活化ウイルスによるワクチン接種により生成した応答と比較して、我々のワクチン株ｒＢＣＧ‐Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２によるワクチン接種により誘導された免疫応答を評価した。
【0092】
実験終了後、動物の脾臓とリンパ節を採取し、これらから全Ｔリンパ球の精製を行った。次いで、これらのリンパ球を、あらかじめ様々な刺激を負荷した樹状細胞と７２時間共培養した。評価した処置は、陰性又は非処理対照（ＵＴ）、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ Ｎタンパク質、及び陽性感染マーカー又は陽性ＢＣＧ刺激対照として使用される精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）、及びＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ Ｓタンパク質とともに不活化ウイルスで免疫化したグループであった。結果を図１４に示すが、本発明のワクチン接種スキーム及び不活化ウイルスによる接種後、ＣＤ８＋Ｔリンパ球の同様の活性化が得られ、マーカーＣＤ６９＋、ＣＤ７１＋及びＣＤ２５＋の発現が増加していることがわかる。
【0093】
最後に、動物の血清中の抗Ｎ抗体の分泌を促進する両ワクチンの能力を評価した。これを決定するために、実験内の異なる時期に動物から得られた血清中に存在する抗Ｎ‐ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２抗体の総量を、間接ＥＬＩＳＡ法を用いて決定した。その結果、ワクチン接種スケジュールが完了すると、両グループ（本発明及び不活化ウイルスを接種したグループ）は、ＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２ Ｎタンパク質に対する抗体の分泌を同程度のレベルで刺激した（図１５）。
【0094】
これらの結果は、形質転換ＢＣＧ株がＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２タンパク質を構成的に発現することを示しており、従って、免疫原性製剤に使用すると、この組成物を受けた個体（動物又は人）がＳＡＲＳ‐ＣｏＶ‐２に対する免疫を発達させることができ、これによりＣＯＶＩＤ‐１９に対する防御が得られるであろう。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】