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▶ クイーン メアリー ユニバーシティ オブ ロンドンの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-08
(54)【発明の名称】処置
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20240301BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240301BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240301BHJP
A61P 37/02 20060101ALI20240301BHJP
A61K 38/08 20190101ALI20240301BHJP
A61K 33/243 20190101ALI20240301BHJP
A61K 31/282 20060101ALI20240301BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240301BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240301BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240301BHJP
C07K 4/00 20060101ALI20240301BHJP
C07K 7/06 20060101ALI20240301BHJP
C07K 7/64 20060101ALI20240301BHJP
C12N 5/10 20060101ALN20240301BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240301BHJP
C07K 14/705 20060101ALN20240301BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06
A61P35/00 ZNA
A61P43/00 121
A61P37/02
A61K38/08
A61K33/243
A61K31/282
A61K39/395 T
A61K35/17
C07K16/28
C07K4/00
C07K7/06
C07K7/64
C12N5/10
C12N5/0783
C07K14/705
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554014
(86)(22)【出願日】2022-03-07
(85)【翻訳文提出日】2023-11-02
(86)【国際出願番号】 GB2022050592
(87)【国際公開番号】W WO2022185081
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】2103122.4
(32)【優先日】2021-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515200272
【氏名又は名称】クイーン メアリー ユニバーシティ オブ ロンドン
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ホディバラ － ディルケ、カイルバーン
(72)【発明者】
【氏名】フェリックス、ホセ マヌエル ムニョス
【テーマコード（参考）】
4B065
4C084
4C085
4C086
4C087
4C206
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065CA24
4B065CA25
4B065CA44
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA20
4C084AA24
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA09
4C084BA17
4C084BA23
4C084BA24
4C084BA31
4C084DA27
4C084MA52
4C084MA66
4C084NA14
4C084ZB072
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC412
4C084ZC751
4C085AA14
4C085BB01
4C085BB11
4C085EE03
4C086AA01
4C086AA02
4C086HA12
4C086MA03
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZB26
4C086ZC75
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB65
4C087MA02
4C087NA05
4C087ZB26
4C087ZC75
4C206AA01
4C206AA02
4C206JB14
4C206MA03
4C206MA04
4C206NA05
4C206ZB26
4C206ZC75
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045BA30
4H045BA41
4H045DA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせたαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤による患者のがんの処置に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
患者のがんを治療する方法において使用するためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤であって、該方法が、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤を患者に投与することをさらに含む、上記αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項2】
少なくとも１つの免疫療法剤及び少なくとも１つの化学療法剤を患者に投与することをさらに含む、請求項１に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項3】
がんが固形がんである、請求項１又は２に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項4】
がんが肺がん、任意で非小細胞肺がんである、請求項３に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項5】
がんが非血管新生性である、及び／又は血管コ－オプション（ｖｅｓｓｅｌ ｃｏ－ｏｐｔｉｏｎ）を示す、請求項１～４のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項6】
がんが免疫療法に対して難治性である、請求項１～５のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項7】
前記方法が、がんからの患者の生存を増強する、請求項１～６のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項8】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の投与が、がんの免疫浸潤を増加させる、請求項１～７のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項9】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物質（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）、タンパク質又は抗体である、請求項１～８のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項10】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が、ＲＧＤモチーフを含むペプチド又はそのペプチド模倣物質であり、任意でペプチド又はペプチド模倣物質は約５～約８アミノ酸長の環状ペプチド又はそのペプチド模倣物質であってもよく、任意でペプチド又はペプチド模倣物質はペンタペプチド若しくはヘキサペプチド又はそのペプチド模倣物質であってもよい、請求項９に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項11】
（ａ）ペプチド若しくはペプチド模倣物質が、少なくとも１つのＮ－アルキル化アミノ酸残基、任意で少なくとも１つのＮ－メチル化アミノ酸残基を含むペプチド若しくはそのペプチド模倣物質である、（ｂ）ペプチド若しくはペプチド模倣物質が、少なくとも１つのＤ－アミノ酸若しくはＧｌｙを含むペプチド、若しくはそのペプチド模倣物質であり、好ましくは、該ペプチド若しくはペプチド模倣物質が少なくとも１つのβＩＩ’ターンを含み、少なくとも１つのＤ－アミノ酸若しくはＧｌｙが、βＩＩ’ターンのｉ＋１位に提供され、及び／又は
（ｃ）ペプチド若しくはペプチド模倣物質が、任意でＶａｌ若しくはＰｈｅから選択されてもよい少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基を含むペプチド、又はそのペプチド模倣物質である、
請求項１０に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項12】
ペプチドが、シレンギチド若しくはその誘導体若しくは類似体若しくはペプチド模倣物質、又は以下のペプチドの１つ若しくはその誘導体若しくは類似体若しくはペプチド模倣物質：ａ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＡ（配列番号１）；
ｂ．＊ｒＧＤＡＡ＊Ａ（配列番号１３）；
ｃ．＊ａＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号２）；
ｄ．ｒＧ＊ＤＡ＊ＡＡ（配列番号３）；
ｅ．ｒＧＤＡ＊Ａ＊Ａ（配列番号４）；
ｆ．＊ｖＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号５）；
ｇ．＊ｆＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号６）；
ｈ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＶ（配列番号７）；及び
ｉ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＦ（配列番号８）；
（＊は、次のアミノ酸のＮ－メチル化を表し、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、ｒはＤ立体配置のアルギニンであり、Ａはアラニンであり、ａはＤ立体配置のアラニンであり、Ｖはバリンであり、ｖはＤ立体配置のバリンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、かつｆはＤ立体配置のフェニルアラニンであり、好ましくは、ペプチドは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ２４～３１及び３６のいずれか１つの環状ペプチド又はその誘導体若しくは類似体若しくはペプチド模倣物質である）
から選択される、請求項１０又は１１に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項13】
ペプチドが、＊ｖＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号５）、配列番号２８の環状ペプチド、又はこれらのいずれかの誘導体若しくは類似体若しくはペプチド模倣物質である、請求項１２に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項14】
ペプチド又はペプチド模倣物質がプロドラッグの形態であるか、又はコンジュゲート若しくは融合タンパク質として提供される、請求項９～１３のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項15】
プロドラッグが、ペプチド若しくはペプチド模倣物質の正味電荷を減少させる少なくとも１つの部分を含む、及び／又は以下の部分若しくは部分の群：（ｉ）－ＣＯ２Ｒ部分（Ｒはアルキルである）；
（ｉｉ）任意でアルギニン残基に連結されていてもよい、ヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分；
（ｉｉｉ）Ａｓｐのメチル若しくはアルキルエステルなどの、メチルエステル部分（ＯＭｅ）若しくは他のアルキルエステル部分；
（ｉｖ）ヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）及びエステル（ＯＭｅ）部分；並びに／又は
（ｖ）２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分；
のうちの少なくとも１つを含み、
任意で、該プロドラッグが、式：ｃ（＊ｖＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ）（配列番号９）、ｃ（＊ａＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ）（配列番号１０）、ｃ（＊ｒ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊ＡＡ）（配列番号１１）又はｃ（ｒ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ＊Ａ）（配列番号１２）を有してもよい、
請求項１４に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項16】
小分子、ペプチド又はペプチド模倣物質が経口投与される、請求項９～１５のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項17】
ペプチド又はペプチド模倣物質が、該ペプチド又はペプチド模倣物質、薬学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤を含む医薬組成物として投与される、請求項９～１６のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項18】
少なくとも１つの免疫療法剤がＣＤ８＋Ｔ細胞抗がん応答を誘導する、請求項１～１７のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項19】
少なくとも１つの免疫療法剤が、１種又は複数種のチェックポイント阻害剤を含み、任意で、該チェックポイント阻害剤が、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－Ｌ１の、リガンドとの相互作用を標的としてもよい、請求項１～１８のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項20】
チェックポイント阻害剤が、抗体又はＣＡＲ－Ｔ細胞、任意で、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１若しくはＣＴＬＡ４を結合する抗体又はＣＡＲ－Ｔ細胞である、請求項１９に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項21】
少なくとも１つの化学療法剤が、少なくとも１つのアルキル化剤、任意でシスプラチン、カルボプラチン又はこれらのいずれかの誘導体を含む、請求項２又は請求項２に従属する請求項３～２０のいずれか一項に記載の使用のためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。
【請求項22】
患者のがんを治療する方法において使用するための少なくとも１つの免疫療法剤であって、該方法が、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を患者に投与することをさらに含み、任意で、少なくとも１つの免疫療法剤が請求項１８～２０のいずれか一項に定義されるとおりであってもよく、並びに／或いはαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が請求項８～１５のいずれか一項に定義されるとおりであってもよい、上記免疫療法剤。
【請求項23】
患者のがんを治療する方法であって、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤とを投与することを含み、任意で、少なくとも１つの免疫療法剤が請求項１８～２０のいずれか一項に定義されるとおりであってもよく、並びに／或いはαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が請求項８～１５のいずれか一項に定義されるとおりであってもよい、上記方法。
【請求項24】
がんの処置のための医薬品の製造におけるαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の使用であって、処置が少なくとも１つの免疫療法剤の投与をさらに含み、任意で、少なくとも１つの免疫治療剤が請求項１８～２０のいずれか一項に定義されるとおりであってもよく、並びに／或いはαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が請求項８～１５のいずれか一項に定義されるとおりであってもよい、上記使用。
【請求項25】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤と少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤との組み合わせであって、任意で、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が請求項８～１５のいずれか一項に定義されるとおりであってもよく、少なくとも１つの免疫療法剤が請求項１８～２０のいずれか一項に定義されるとおりであってもよく、並びに／或いは少なくとも１つの化学療法剤が請求項２１に定義されるとおりであってもよい、上記組み合わせ。
【請求項26】
患者のがんを治療する方法において使用するためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤であって、該方法が、少なくとも１つの化学療法剤を投与することをさらに含み、任意で、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が請求項８～１５のいずれか一項に定義されるとおりであってもよく、がんが請求項４若しくは５に定義されるとおりであってもよく、並びに／或いは少なくとも１つの化学療法剤が請求項２１に定義されるとおりであってもよい、上記αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の、患者のがんを処置（治療）するための医学的使用であって、処置は、少なくとも１つの免疫療法剤を患者に投与することをさらに含む、医学的使用に関する。本発明はまた、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせた、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の、がんの処置のための医学的使用に関する。本発明はさらに、上記の薬剤によるがんの処置方法、及びこの処置方法において有用な組み合わせ製品に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫療法及び化学療法などの既存の治療に対する応答が不良ながんを含む、がんに対する新しい治療を提供することは極めて重要である。既存の薬剤の用量／副作用を低減することができる併用療法も必要とされている。肺がんは、現在、がん死亡の主な原因である。非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）は、全ての肺がんのうち８０％超を占め、しばしば不良な予後を伴う進行した疾患として現れる。診断時に、ＮＳＣＬＣ患者の７５％は進行した疾患（ステージＩＩＩ～ＩＶ）を呈する（１）。これらの進行したがんは手術不能である。
【0003】
免疫療法の導入は、おそらく、ＮＳＣＬＣ患者の処置結果の改善に最も寄与した（２）が、これにもかかわらず、治療に対する耐性及び毒性作用はなお大きな障害である。抗ＰＤ－１（プログラム細胞死タンパク質１）及び抗ＣＴＬＡ－４（細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４）抗体による免疫チェックポイントの遮断は、全生存期間のさらなる１３ヶ月の改善をもたらすにすぎず、患者の２０～３０％しか応答しない。
【0004】
より最近では、ネオアンチゲン発現を増強するシスプラチンなどの化学療法を免疫療法と組み合わせることはいくらか有望であったが（３）、障害には、（１）不十分な送達及び酸素負荷による免疫療法の有効性の欠如（４）；（２）腫瘍内への不良なＴ細胞浸潤（５）；（３）Ｔ細胞の不良な腫瘍内活性化（６）；及び（４）処置の早期終了を強いることがある重度の自己免疫応答の発症（７）がなお含まれる。したがって、副作用を低減しながら、ＮＳＣＬＣの処置のための免疫療法の有効性を増大させる方法を見出す緊急の必要性が存在する。
【0005】
Ｔ細胞による不十分な腫瘍浸潤及びより低いレベルのＰＤ－Ｌ１（プログラム死リガンド－１）は、免疫療法に対する不良な応答と関連する（８）。ＣＤ８＋細胞の増加したレベル又はＣＤ８＋／制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇｓ）比の増加は、腫瘍を免疫チェックポイント遮断に対して増感させる（９）。低酸素腫瘍はＴｒｅｇｓによって高度に浸潤されるが、ＣＤ８＋細胞は存在しない（１０）。血管新生腫瘍血管系は無秩序であり、腫瘍内低酸素症を促進する不規則な漏出性の血管を有する。血管コ－オプション（ｖｅｓｓｅｌ ｃｏ－ｏｐｔｉｏｎ）／血管再構築は、腫瘍細胞が既存の血管を乗っ取って腫瘍成長を支える非血管新生性の機序である（１１）。肺では、腫瘍細胞は、血管新生に加えて、腫瘍に酸素を与えるために血管コ－オプション戦略を採ることができる（１２、１３）。この観察は、このような肺がんが抗血管新生療法に対して少なくとも部分的に耐性であると推測されることを示唆している。実際、ヒト原発性肺がんでは、組織病理学的分析は、血管コ－オプション性の間質性成長パターンの増加したレベルが不良な転帰と関連するという証拠を明らかにした（１４）。
【0006】
以前の研究は、静脈内投与された低用量のシレンギチド（αｖβ３／αｖβ５を標的とするＲＧＤ模倣物質）と、最適を下回る用量のゲムシタビン及びベラパミルとの組み合わせ処置が血管密度を増加させ、ゲムシタビン代謝を増強し、したがってゲムシタビンの副作用を軽減しながらがん制御を改善するための戦略を提供することを実証した（２０）。
【0007】
免疫療法薬及び化学療法薬の有効性／免疫療法薬及び化学療法薬に対する応答性を増大させ、それらの副作用を軽減する組み合わせ処置が必要とされている。
【発明の概要】
【0008】
本発明者らは、驚くべきことに、経口的に利用可能なＲＧＤ模倣物質ヘキサペプチドプロドラッグ２９Ｐによって例示されるようなαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が、免疫療法の有効性を改善することができ、化学療法の有効性も改善することができることを示した。ＮＳＣＬＣのＫ－ＲａｓＬＳＬ－Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌ／ｆｌ（ＫＰ）マウスモデルを使用して、本発明者らは、２９Ｐが、抗ＰＤ１及び抗ＣＴＬＡを使用する標準治療シスプラチン及び免疫チェックポイント遮断に対して動物を増感させ、有害な副作用を軽減しながら腫瘍量の低下及び延長された生存期間をもたらすことを実証した。２９Ｐ処置は肺腫瘍成長パターンを改変し、低酸素を軽減させながら、血管密度、腫瘍灌流並びにＴ細胞浸潤及び活性化の増加をもたらす。
【0009】
観察された効果はまた、非血管新生性であり、抗血管新生療法に抵抗性であるがんを含む、免疫療法及び／又は化学療法が用いられる他のがんにおける処置を改善するのに有用であると予想される。観察された効果はまた、より低用量の免疫療法剤及び／又は化学療法剤を治療的に使用することができるように免疫療法及び／又は化学療法の処置効果の増強を可能にし、このような薬剤の毒性及び副作用の軽減を可能にする。
【0010】
したがって、本発明は、患者のがんを処置する方法において使用するためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤であって、前記方法は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は化学療法剤を患者に投与することをさらに含む、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を提供する。本発明はさらに、患者のがんを処置する方法において使用するための少なくとも１つの免疫療法剤であって、前記方法は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を患者に投与することをさらに含む、免疫療法剤を提供する。本発明はさらに、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤並びに少なくとも１つの免疫療法剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法を提供する。本発明はさらに、がんを処置するための医薬品の製造におけるαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の使用であって、処置が少なくとも１つの免疫療法剤の投与をさらに含む使用を提供する。本発明はまた、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤との組み合わせを提供する。本発明はさらに、患者のがんを処置する方法において使用するためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤であって、前記方法は、少なくとも１つの化学療法剤を投与することをさらに含む、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0011】
【図1】図１は、ＫＰ腫瘍が血管コ－オプション成長パターンを示し、ＶＥＧＦＲ２阻害に対して応答しないことを示す。（Ａ）ＫＰ腫瘍は、血管コ－オプション成長パターン：肺胞成長パターン（中央のパネル）及び間質性成長パターン（下のパネル）を示す。（Ｂ）ヘマトキシリン－エオシン（上のパネル）及び二重ポドプラニン／ＣＤ３１免疫染色で染色されたヒトＮＳＣＬＣ切片、肺胞及び間質性成長パターンが患者に生じることを確認した。（Ｃ）ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、ＫＰマウスをＤＣ１０１（６００μｇ／マウス、週に２回、３週間）で処置した。プラセボ又はＤＣ１０１のいずれかで処置されたＫＰマウスからの、腫瘍を持った肺のヘマトキシリン－エオシン及びエンドムチン染色の代表的な画像（左）。病巣の数、腫瘍量及び血管密度の定量（右）は、有意な差がないことを確認する。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、対応のないスチューデントのｔ検定及びマン・ホイットニー検定、腫瘍量及び病巣の数についてはｎ＝７プラセボ、ｎ＝８ＤＣ１０１、血管密度はそれぞれｎ＝６動物の動物あたりｎ＞４の視野に基づく。スケールバー：ＩＦで５０μｍ。
【図2】図２は、ＫＰ腫瘍に対する２９Ｐ処置の血管効果を示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、ＫＰマウスを２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ、週に２回、３週間）で処置した。（Ａ）ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像（左）及び腫瘍病巣の数及び腫瘍量の定量化（右）、有意な差を示さなかった。（Ｂ）ポドプラニン／エンドムチン免疫蛍光（上）及びエンドムチン免疫組織化学染色（下）の代表的な画像。間質性成長パターン及び血管密度を示す腫瘍の百分率の定量化（右パネル）。（Ｃ）２９Ｐで処置されたマウスにおけるポドプラニン／エンドムチン免疫蛍光の代表的な画像、２つの異なる血管成長パターンを示す。血管密度の定量化（右）。（Ｄ～Ｇ）ＰＥ－ＰＥＣＡＭ／エンドムチン二重免疫染色及び視野当たりの灌流された血管の数の代表的な画像（左）及び定量化（右）（Ｄ）、ＰＥ－ＰＥＣＡＭ／Ｈｏｅｃｈｓｔ二重免疫染色及び相対Ｈｏｅｃｈｓｔ強度（Ｅ）、Ｇｌｕｔ１免疫組織化学的染色及びＧｌｕｔ１発現レベル（Ｆ）、ＣＤ３免疫組織化学的染色及びフローサイトメトリー分析（Ｇ）；プラセボ対２９Ｐ処置マウス。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ａ、Ｂ、Ｄ～Ｇ）対応のないスチューデントのｔ検定、（Ｃ）二元配置ＡＮＯＶＡとＳｉｄａｋの多重比較検定、処置当たりｎ＝５～８、血管密度はそれぞれｎ＝７～８動物の動物あたりｎ＞４の視野に基づくスケールバー：ＩＦ低倍率で５００μｍ、ＩＦ高倍率で５０μｍ。
【図3】図３は、２９Ｐ処置がＫＰ腫瘍を現在の免疫療法及び化学療法に対して増感させることを示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、例に記載されている頻度で、プラセボ（生理食塩水）又はアイソタイプ抗体（１００μｇ／マウス）、並びにシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ［Ｃｉｓ６］又は３ｍｇ／ｋｇ［Ｃｉｓ３］）、ＰＤ－１ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）、ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（１００μｇ／マウス）及び２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）の組み合わせでＫＰマウスを処置した。（Ａ、Ｂ、Ｅ）ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像並びに腫瘍病巣の数及び腫瘍量の定量化。（Ｃ）Ｃｉｓ３、ＰＤ－１＋ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ及び２９Ｐの４重の組み合わせで処置されたマウスにおける有意な延命効果を示すカプラン・マイヤー（Ｋａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ）グラフ。（Ｄ）プラセボ、２９Ｐ、Ｃｉｓ６／α－ＰＤ－１＋α－ＣＴＬＡ－４及びＣｉｓ３／α－ＰＤ－１＋α－ＣＴＬＡ－４／２９ＰでＣ５７／ＢＬ６マウスを処置した。マウス体重の定量化、リンパ球の血液学的分析及び腎臓損傷応答の指標であるクレアチニンの生化学的分析は、低用量シスプラチン（Ｃｉｓ３）との４重の組み合わせに対して、有意に改善されたパラメータを示す。（Ｆ）ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像（左）並びにマウスの体重及び腫瘍量の定量化（右）。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。（Ａ、Ｂ、Ｄ～Ｆ）通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、正規分布していないデータについては、クラスカル・ウォリス検定とダンの多重比較検定、（Ｃ）マンテル・コックス検定、処置あたりｎ＝５～８。スケールバー：Ｈ＆Ｅ染色で５ｍｍ。
【図4】図４は、２９Ｐ処置が腫瘍成長パターンを改変し、血管密度を増加させ、腫瘍低酸素を低下させることを示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、プラセボ（生理食塩水、［Ａ］）又はアイソタイプ抗体（１００μｇ／マウス［Ｂ］）並びにシスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ［Ｃｉｓ３］）、ＰＤ－１ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）、ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（１００μｇ／マウス）及び２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）の組み合わせでＫＰマウスを３週間処置し、さらに１週間の処置停止後に採取した。肺のポドプラニン／エンドムチン二重免疫蛍光染色（Ａ、Ｂの一番上の列）、エンドムチン免疫組織化学染色（Ｂの２列目）、Ｇｌｕｔ１免疫組織化学染色（Ｂの３列目）、又はＰＤ－Ｌ１免疫組織化学染色（Ｂの一番下の列）の代表的な画像（左）及びマウスにおける腫瘍成長パターン（Ａ、Ｂの一番上の列）、血管密度（Ｂの２列目）、Ｇｌｕｔ１発現強度（Ｂの３列目）、又は高いＰＤ－Ｌ１発現を示す病巣の数（Ｂの一番下の列）の定量化（右）。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１、通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、処置あたりｎ＝６～９、血管密度はそれぞれｎ≧６の動物の動物あたりｎ≧５の視野に基づく。スケールバー：ＩＦで２５０μｍ。
【図5】図５は、２９Ｐ処置が免疫許容性腫瘍微小環境を誘導することを示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、プラセボ（生理食塩水、［Ａ］）又はアイソタイプ抗体（１００μｇ／マウス［Ｂ］）並びにシスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ［Ｃｉｓ３］）、ＰＤ－１ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）、ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（１００μｇ／マウス）及び２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）の組み合わせでＫＰマウスを３週間処置し、さらに１週間の処置停止後に採取した。（Ａ、Ｂ）肺のＣＤ３及びＣＤ８免疫組織化学染色の代表的な画像（左）、並びにＣＤ３＋又はＣＤ８＋細胞によって浸潤された病変の数及び面積当たりのＣＤ８＋細胞の数の定量化（右）。（Ｃ）腫瘍負荷肺におけるリンパ系及び骨髄系細胞集団のフローサイトメトリー分析、結果は組織１ｍｇ当たりの細胞の絶対数（ｘ１０５）の平均±ＳＥＭとして示され、ＮＴ＝非腫瘍（対照動物からの、腫瘍を含まない肺）。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、正規分布していないデータについては、クラスカル・ウォリス検定とダンの多重比較検定、処置あたりｎ＝５～８、ＣＤ８＋細胞／面積については、動物あたりｎ＝５領域、処置あたりｎ＝３～７動物。
【図6】図６は、２９Ｐによって誘導された効果がＶＥＧＦＲ２依存性であることを示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、プラセボ、２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）又は２９Ｐ及びＤＣ１０１（６００μｇ／マウス）で、週に２回、３週間、ＫＰマウスを処置した。（Ａ）ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像（上の列）、エンドムチン免疫組織化学染色（中央の列）、ポドプラニン／エンドムチン二重免疫蛍光染色（下の列）並びに腫瘍量、血管密度及び腫瘍成長パターンの定量化（左）。ポドプラニン／エンドムチン二重免疫組織化学染色の代表的な画像［腫瘍病変は破線によって示されている］及び腫瘍成長パターンによる病変サイズの定量化（右）。（Ｂ、Ｃ）エンドムチン／Ｋｉ６７二重（Ｂ）及びエンドムチン／Ｋｉ６７／ポドプラニン三重（Ｃ）免疫蛍光染色の代表的な画像（上の列）及び増殖性内皮細胞の定量（下）。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。対応のないスチューデントのｔ検定、処置あたりｎ＝６～８、血管密度はそれぞれｎ≧６の動物の動物あたりｎ≧５の視野に基づく、Ｋｉ６７＋エンドムチン＋は、ｎ＝６～７の動物の動物あたりｎ＝１０（Ｂ）／ｎ＝２～５（Ｃ）の視野に基づく。スケールバー：ＩＦで１００μｍ（Ａ、Ｃ）、ＩＦで５０μｍ（Ｂ）。
【図7】図７は、ＣＤ８＋細胞及びＩＬ－１８－ＩＦＮ－γ－ＣＸＣＬ９軸の枯渇が２９Ｐの抗腫瘍効果を逆転させることを示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、パネル内に示されているように、アイソタイプ抗体（１００μｇ／マウス）、並びにシスプラチン（６ｍｇ／ｋｇ［Ｃｉｓ６］）、ＰＤ－１ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）、ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（１００μｇ／マウス）、ＣＤ８αｍＡｂ（２００μｇ／マウス）、ＩＦＮ－γｍＡｂ、抗ＣＸＣＬ９ｍＡｂ、抗ＩＬ－１８ｍＡｂ及び２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）の組み合わせでＫＰマウスを３週間処置した。（Ａ～Ｅ）ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像（左）並びに病巣の数及び腫瘍量の定量化（右）。（Ｄ、下パネル）ＣＤ８免疫組織化学染色の代表的な画像（左）及び面積あたりの、腫瘍病変部中に浸潤したＣＤ８＋細胞の数の定量化（右）。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、正規分布していないデータについては、クラスカル・ウォリス検定とダンの多重比較検定、処置あたりｎ＝７～１４。
【図8】図８は、図１に関連し、間質性成長パターンが起こっている腫瘍の経時的な分析を示す。（Ａ）ＫＰ腫瘍を有するマウスを屠殺し、ウイルスＣｒｅ感染の６３、７０、７７及び８３日後に肺を採取した（ｔｈａｒｖｅｓｔｅｄ）。ヘマトキシリン－エオシン染色は、腫瘍量の増加（上）、病巣の数及び腫瘍量の定量化（下）を示す。（Ｂ）示されている時点で採取された肺の代表的なポドプラニン免疫蛍光染色（上）及び間質性腫瘍成長の定量化（下）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、全ての群を６３日間と比較、処置あたりｎ＝４～５の動物。スケールバー：ＩＦで５００μｍ。
【図9】図９は、図２に関連し、２９Ｐ処置後の腫瘍成長及び腫瘍進行の分析を示す。（Ａ）ウイルスＣｒｅ感染の５６日後での、ＫＰ腫瘍を有するマウスのヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像。より高い倍率の写真は、これらのＫＰ腫瘍における肺腺腫（左の写真）及び肺腺がん（右の写真）を示す。（Ｂ）ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、ＫＰマウスを２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ、週に１回）で処置した。ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像（上）及び腫瘍病巣の数及び腫瘍量の定量化（下）、有意な差を示さなかった。（Ｃ、Ｄ）ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像、異なる腫瘍グレードを示す（Ｃ）及び２９Ｐでの処置後のグレードの定量化、プラセボで処置されたマウスと差を示さない（Ｄ）；グレード０（過形成）、グレード１～２（腺腫）、グレード３～４（腺がん）及びグレード５（線維形成性腫瘍）。（Ｅ）エンドムチン／α－ＳＭＡ二重免疫蛍光染色の代表的な画像（左）及びα－ＳＭＡ＋血管周囲細胞によって覆われた血管の定量化。（Ｆ）異なる用量の２９Ｐ後のＫＰ肺腫瘍細胞の細胞生存分析。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。対応のないスチューデントのｔ検定、処置あたりｎ＝７～９（Ｂ、Ｅ）、カイ二乗検定（Ｄ）。スケールバー：低倍率では１００μｍ、高倍率（Ｃ）では５０μｍ。
【図10】図１０は、図３に関連し、２９ＰがＰＤ－１との組み合わせで腫瘍成長を制御することを示す。（Ａ）ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、アイソタイプ抗体（１００μｇ／マウス）、ＰＤ－１ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）単独又はＰＤ－１及び２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）で、方法に記載されている頻度でＫＰマウスを処置した。ヘマトキシリン－エオシン染色された肺の代表的な画像（上）並びに腫瘍病巣の数及び腫瘍量の定量化（下）。（Ｂ）異なる濃度のシスプラチン又はシスプラチン及び２ｎＭの２９Ｐに曝露されたヒトＡ４５９細胞及びマウスＫＰ肺腫瘍細胞の細胞生存分析。Ｎ．Ｓ．有意でない／ｐ＞０．０５、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、正規分布していないデータについては、クラスカル・ウォリス検定とダンの多重比較検定、処置あたりｎ＝９の動物、条件あたりｎ＝６～８の独立した試料。ｇ。
【図11】図１１は、図５に関連し、２９Ｐ処置が間質性腫瘍病変内へのＣＤ３＋細胞の浸潤を促進することを示す。ウイルスＣｒｅ感染の５６日後から、アイソタイプ抗体（１００μｇ／マウス）並びにＰＤ－１ｍＡｂ（２００μｇ／マウス）、ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（１００μｇ／マウス）及び２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）の組み合わせでＫＰマウスを３週間処置し、さらに１週間の処置停止後に採取した。肺のＣＤ３／ポドプラニン／エンドムチン三重免疫蛍光染色の代表的な画像（上）及びＣＤ３＋細胞によって浸潤された間質性病変の数の定量化（下）。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。通常の一元配置ＡＮＯＶＡとテューキーの多重比較検定、処置あたりｎ＝６～８の動物からのｎ＝２～２３の病変。スケールバー：１００μｍ。
【0012】
配列の簡単な説明
本明細書及び配列表に示される配列番号１～４６は、ペプチド及びプロドラッグのアミノ酸配列である。
本明細書及び配列表に示される配列番号１～４６は、ペプチド及びプロドラッグのアミノ酸配列である。
【発明を実施するための形態】
【0013】
開示された生成物及び方法の異なる用途は、当技術分野における具体的なニーズに合わせて調整され得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、本発明の特定の態様を記載することのみを目的としており、限定することを意図していないことも理解されたい。
【0014】
さらに、本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別段の指示をしない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤（ａｎ αｖβ３－ａｎｄ／ｏｒ αｖβ５－ｉｎｔｅｇｒｉｎ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」への言及は、２つ又はそれより多くのこのような薬剤などを含む。
【0015】
本明細書で引用される全ての刊行物、特許及び特許出願は、上記又は下記であるかを問わず、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【0016】
がんの処置
本発明は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤並びに少なくとも１つの免疫療法剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法を提供する。本発明はまた、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤並びに少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法を提供する。本明細書におけるがんの処置への言及は、１種又は複数種の腫瘍の処置を含む。本発明の方法は、好ましくは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤、少なくとも１つの免疫療法剤及び少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含み得る。
本発明は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤並びに少なくとも１つの免疫療法剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法を提供する。本発明はまた、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤並びに少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法を提供する。本明細書におけるがんの処置への言及は、１種又は複数種の腫瘍の処置を含む。本発明の方法は、好ましくは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤、少なくとも１つの免疫療法剤及び少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含み得る。
【0017】
本発明はまた、本明細書に記載されている処置の方法に対応し、本発明の方法に関して本明細書に記載されている任意の特徴を組み入れる医学的使用を提供する。したがって、本発明は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法において使用するためのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を提供する。本発明はまた、少なくとも１つのαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を投与することを含む、患者のがんを処置する方法において使用するための少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤を提供する。本発明はまた、がんを処置するための医薬品の製造におけるαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の使用であって、処置は少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の投与をさらに含む使用を提供する。本発明はさらに、がんを処置するための医薬品の製造における少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の使用であって、処置はαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の投与をさらに含む使用を提供する。
【0018】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、任意の手段によって、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせてがんを処置するのに適した様式でαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを標的化する任意の作用物質であり得る。典型的には、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、がんを処置する上で少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の有効性を増強する。少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の非存在下でがんを処置することができないこと、又はがんを効果的に処置することができないことがあり得る。
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、任意の手段によって、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせてがんを処置するのに適した様式でαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを標的化する任意の作用物質であり得る。典型的には、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、がんを処置する上で少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の有効性を増強する。少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の非存在下でがんを処置することができないこと、又はがんを効果的に処置することができないことがあり得る。
【0019】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて使用される場合、がんからの患者の生存を増強し得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて使用される場合、腫瘍量を低下させ得るか、又は腫瘍病巣の数を低下させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤での処置に対してがんを増感させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、がんに対する治療効果のために必要とされる少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の用量を低下させ得る。したがって、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、がんの処置における少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の副作用及び／又は毒性を軽減させ得る。
【0020】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、本発明に従って組み合わせて、すなわち少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて使用される場合、抗がん又は抗腫瘍免疫応答を増加させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、がん又は腫瘍における免疫細胞、典型的には活性化された免疫細胞の浸潤を増加させ得る。したがって、がん又は腫瘍におけるこのような免疫細胞のレベルは、薬剤の投与によって増加され得る。免疫細胞には、典型的には、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８＋Ｔ細胞、典型的には、活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞が含まれる。したがって、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、腫瘍炎症を増加させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、免疫許容性の腫瘍微小環境を促進し得る。したがって、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、免疫細胞（Ｔ細胞など）浸潤を媒介する分子などの、がん又は腫瘍における免疫応答に関連する分子の上方制御を促進し得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、１つ又は複数のサイトカイン、ケモカイン及びそれらの受容体、例えば、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＲ５、ＣＸＣＲ３、ＣＣＬ５、ＣＣＬ９、ＣＣＬ１０、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－１８の１つ又は複数の上方制御を促進し得る。好ましくは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－γ及びＣＸＣＬ９のうちの１つ、２つ又は３つ全てを上方制御し得、これらは、観察された効果に対して特に重要性を有するとして例において例示されている。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、上記のように分子を上方調節し得、Ｔ細胞、好ましくは活性化されたＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤も増加させ得る。
【0021】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、これらに加えて又はこれらに代えて、腫瘍灌流を増加させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、がん又は腫瘍における低酸素を低減させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、これらに加えて又はこれらに代えて、がん又は腫瘍中の血管密度を増加させ得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、これらに加えて又はこれらに代えて、血管コ－オプションを示すがん又は腫瘍などの非血管新生性がん又は腫瘍を含むがん又は腫瘍における血管新生を促進し得る。
【0022】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、これらに加えて又はこれらに代えて、がん又は腫瘍におけるＰＤ－Ｌ１発現を上方制御し得る。
【0023】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の上記の機能的特性は、例に記載されている技術及びマウスモデルの使用によるなど、当業者によって容易に評価され得る。
【0024】
典型的には、インテグリン標的化剤は、変化したシグナル伝達及び／又は遺伝子発現を誘導するが、インテグリン接着機能に影響を及ぼさないことがあり得る。この薬剤は、他の受容体シグナル伝達経路を交差活性化させ得る。
【0025】
標的化剤は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン、並びに任意にさらなるインテグリンを標的とし得る。この薬剤は、αｖβ１、α２β１、α３β１、αｖβ６、αｖβ８及び／又はαｖβ１などの、がん又は腫瘍において発現又は過剰発現される１種又は複数種のさらなるインテグリンを結合し得る。
【0026】
典型的には、この薬剤は、αｖβ３－インテグリンを標的とし、任意にαｖβ５－インテグリンなどの他のインテグリンも標的とし得る。好ましくは、この薬剤は、他のインテグリンよりもαｖβ３－インテグリンに対して（及び任意でαｖβ５－インテグリンに対しても）選択的であり、αＩＩｂβ３などの血小板インテグリンに対して高い結合親和性を示さない。いくつかの態様において、標的化剤はまた、インテグリンαｖβ６、αｖβ８及びαｖβ１のうちの１種又は複数種を、典型的にはαｖβ３と比較して低下した親和性で標的とし得る。
【0027】
この薬剤は、（５ｋＤａ未満の有機化合物、例えばＳＢ－２７３００５（ＣＡＳ番号２０５６７８－３１－５）、ＳＢ－２６７２６８（ＣＡＳ番号２０５６７８－２６－８）又はＭＫ－０４２９（ＣＡＳ番号２２７９６３－１５－７））、ペプチド、タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドなどの）小分子リガンドなどの任意の種類の分子であり得る。
【0028】
典型的には、この薬剤は、小分子リガンド、ペプチド、タンパク質又は抗体である。このような薬剤は、典型的には、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンに直接特異的に結合するが、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを間接的に標的とし、上記の効果を与える薬剤も使用され得る。その標的（αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン）に優先的な又は高い親和性で結合するが、他の標的には実質的に結合しない、結合しない、又は低い親和性でのみ結合する場合に、薬剤は、その標的に特異的に結合する。例えば、その標的タンパク質に優先的な又は高い親和性で結合するが、他のヒト抗原には実質的に結合しない、結合しない、又は低い親和性でのみ結合する場合に、抗体は、標的タンパク質を「特異的に結合する」。
【0029】
抗体は、１×１０－７Ｍ以下、より好ましくは５×１０－８Ｍ以下、より好ましくは１×１０－８Ｍ以下又はより好ましくは５×１０－９Ｍ以下のＫｄで結合すれば、優先的な又は高い親和性で結合する。抗体は、１×１０－６Ｍ以上、より好ましくは１×１０－５Ｍ以上、より好ましくは１×１０－４Ｍ以上、より好ましくは１×１０－３Ｍ以上、さらにより好ましくは１×１０－２Ｍ以上のＫｄで結合すれば、低い親和性で結合する。
【0030】
抗体は、例えば、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、ＣＤＲ移植抗体又はヒト化抗体であり得る。抗体は、完全な状態の免疫グロブリン分子又はＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２又はＦｖ断片などのその断片であり得る。
【0031】
好ましくは、薬剤はペプチドである。本明細書で使用される「ペプチド」という用語は、天然の（遺伝的にコードされた）、非天然の、及び／又は化学的に修飾されたアミノ酸残基の鎖を包含することを意味する。アミノ酸残基は、当技術分野で一般的に知られているように、本明細書及び特許請求の範囲を通じて１文字又は３文字のコードのいずれかによって表される。
【0032】
本明細書に記載されるペプチドの配列におけるアミノ酸は、典型的には、当技術分野で公知のように一文字によって表され、小文字は、Ｄ立体配置での対応するアミノ酸（及び大文字はＬ配置）を表す。文字が続くアスタリスク記号は、対応するアミノ酸がＮ－メチル化されていることを意味する。
【0033】
本明細書に記載されているペプチドは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９又は２０アミノ酸長であり得る。本明細書に記載されているペプチドは、４～１０、５～１９、５～１８、１５～１７、５～１６、５～１５、５～１４、５～１３、５～１２、５～１１、５～１０、５～９、５～８又は５～７アミノ酸の長さであり得る。
【0034】
本明細書に記載されているペプチドは、典型的には環化されている。「シクロ」又は「環状」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ペプチドが環化されていることを示すことを意図する。限定されないが、頭－尾環化、側鎖－側鎖、側鎖－末端、ジスルフィド架橋、又は骨格環化、好ましくは頭－尾環化を含む任意の種類の環化が適用され得る。いくつかの態様において、ペプチドは、頭－尾環化を含む、すなわち、アミノ末端アミノ基の原子とペプチドのカルボキシル末端との間に共有結合を有する。ペプチド配列が記載された括弧がその後に続く「ｃ」の文字は、前記ペプチドが環状であることを意味する。インテグリン標的化環状ペプチドを含む環状ペプチドの設計原理は当技術分野で周知であり、例えば、Ｗｅｉｄｅ ｅｔ ａｌ（Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｃｕｒｒ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００７，２７２，１－４０）及びＫｅｓｓｌｅｒ（ＡＣＩＥ １９８２，２１，５１２－５２３）に記載されている。
【0035】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを標的とする典型的な環状ペプチドは、配列モチーフＲＧＤを含む。Ｒ及び／又はＤは、Ｌ－又はＤ－アミノ酸であり得る。モチーフ中のアミノ酸は、標的化剤としてのペプチドの活性と適合する限り、修飾されていてもよく、例えば、修飾の導入は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを標的とする、環状ペプチドの能力を損なうべきではない。例えば、Ａｒｇ中のアミノ酸のアルファ炭素からグアニジニウム官能基への脂肪族鎖の長さは変更され得る。
【0036】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを標的とするペプチドの能力は、様々な方法を用いて決定され得る。例えば、本明細書に記載されているペプチドの、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンを標的とする能力は、ＥＬＩＳＡ（例えば、Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１７；７：３９８０５を参照）、細胞アッセイ又は力場顕微鏡法によって決定され得る。
【0037】
配列モチーフＲＧＤを含む環状ペプチドは、典型的には、約５～約８アミノ酸長である。このような環状ペプチドは、５、６、７又は８アミノ酸長、例えば５～７、５～６、６～７又は６～８アミノ酸長であり得る。好ましくは、ペプチドはペンタペプチド又はヘキサペプチドである。ペプチドは、２つのβターンを含み得る。
【0038】
上記環状ペプチドは、少なくとも１つのＮ－アルキル化（例えば、Ｎ－メチル化）アミノ酸残基、例えば、少なくとも２つ又は少なくとも３つのＮ－アルキル化又はＮ－メチル化を含み得る。Ｎ－アルキル化（Ｎ－メチル化など）は、ペプチド立体構造を拘束させること及び／又は代謝安定性を増加させることを補助し得る。前記ペプチドは、４つ又は５つのＮ－アルキル化又はＮ－メチル化を含み得る。環状ペプチドは、上記の指定された数のＮ－アルキル化又はＮ－メチル化を含むヘキサペプチドであり得る。Ｎ－アルキル化又はＮ－メチル化は、（１，５）、（１，６）、（３，５）及び（５，６）からなる群から選択される位置に存在し得る。
【0039】
上記環状ペプチドは、少なくとも１つのＤ－アミノ酸を含み得る。環状ペプチドは、Ｄ立体配置の少なくとも１つのアミノ酸を含むＮ－メチル化環状ペンタペプチド又はヘキサペプチドであり得る。このようなペプチドは、Ｄ立体配置の少なくとも１つのアラニン残基、Ｄ立体配置の少なくとも１つのバリン残基又は少なくとも１つのフェニルアラニン残基を含み得る。Ｄ立体配置のアミノ酸は、ペプチド中の位置番号１又はβＩＩ’ターンのｉ＋１位に存在し得る。
【0040】
上記環状ペプチドは、少なくとも１つのβ－アミノ酸又はγ－アミノ酸を含み得る。上記環状ペプチドは、好ましくはＶａｌ又はＰｈｅから選択される少なくとも１つの疎水性アミノ酸残基（Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔなど）をさらに含み得る。
【0041】
ペプチドは、シレンギチド（ｃ（ｆ＊ＶＲＧＤ）又はアミノ酸がＬ若しくはＤ立体配置に変更されている、ｆ及び／若しくはＶが別の疎水性アミノ酸（Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔなど）若しくはＧｌｙに置換されている、若しくはペプチドが、指定されたＮ－Ｍｅに対する代替のＮ－アルキル化若しくは追加のＮ－アルキル化若しくはＮ－メチル化を含む誘導体若しくは類似体を含む、その誘導体若しくは類似体であり得る。典型的には、Ｄ－アミノ酸又はＧｌｙは、βＩＩ’ターンのｉ＋１位に提供される（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９３，１５，２３５－２５１）。
【0042】
ペプチドは、以下のペプチドの１つ若しくはその誘導体若しくは類似体：
ａ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＡ（配列番号１）；
ｂ．＊ｒＧＤＡＡ＊Ａ（配列番号１３）；
ｃ．＊ａＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号２）；
ｄ．ｒＧ＊ＤＡ＊ＡＡ（配列番号３）；
ｅ．ｒＧＤＡ＊Ａ＊Ａ（配列番号４）；
ｆ．＊ｖＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号５）；
ｇ．＊ｆＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号６）；
ｈ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＶ（配列番号７）；
ｉ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＦ（配列番号８）；
ｊ．ＬＰＰＦＲＧＤＬＡ（配列番号１７）；
ｋ．ＬＰＰＧＬＲＧＤ（配列番号１８）；
ｌ．ａＡＡＡＡＡ（配列番号１９）；又は
ｍ．ｆ＊ＶＲＧＤ（配列番号２０）
であり得、
＊は、次のアミノ酸のＮ－メチル化を表し、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、ｒはＤ立体配置のアルギニンであり、Ａはアラニンであり、ａはＤ立体配置のアラニンであり、Ｖはバリンであり、ｖはＤ立体配置のバリンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、ｆはＤ立体配置のフェニルアラニンである。
ａ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＡ（配列番号１）；
ｂ．＊ｒＧＤＡＡ＊Ａ（配列番号１３）；
ｃ．＊ａＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号２）；
ｄ．ｒＧ＊ＤＡ＊ＡＡ（配列番号３）；
ｅ．ｒＧＤＡ＊Ａ＊Ａ（配列番号４）；
ｆ．＊ｖＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号５）；
ｇ．＊ｆＲＧＤＡ＊Ａ（配列番号６）；
ｈ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＶ（配列番号７）；
ｉ．＊ｒＧＤＡ＊ＡＦ（配列番号８）；
ｊ．ＬＰＰＦＲＧＤＬＡ（配列番号１７）；
ｋ．ＬＰＰＧＬＲＧＤ（配列番号１８）；
ｌ．ａＡＡＡＡＡ（配列番号１９）；又は
ｍ．ｆ＊ＶＲＧＤ（配列番号２０）
であり得、
＊は、次のアミノ酸のＮ－メチル化を表し、Ｒはアルギニンであり、Ｇはグリシンであり、Ｄはアスパラギン酸であり、ｒはＤ立体配置のアルギニンであり、Ａはアラニンであり、ａはＤ立体配置のアラニンであり、Ｖはバリンであり、ｖはＤ立体配置のバリンであり、Ｆはフェニルアラニンであり、ｆはＤ立体配置のフェニルアラニンである。
【0043】
上述のように、本発明のペプチドは、典型的には環化されている。したがって、本発明はまた、配列番号９～１２、２４～３１及び３６～４６の環状ペプチドに関する。例として、配列番号９～１２のペプチドの非環化バージョンは、配列番号３２～３５としても記載される。
【0044】
ａ．及びｃ．～ｇ．のペプチドは、国際公開第２０１９０５８３７４号にも記載されており、特にプロドラッグとして製剤化された場合、高い親和性、高い選択性及び代謝安定性、高い安定性及び経口投与への適合性などの改善された具体的特性を示すことが示されている。好ましいペプチドは、所定の位置にＤ－アミノ酸を含み、Ｐｈｅ又はＶａｌを含むように最適化された。特に好ましいペプチドは、ペプチドｆ．（配列番号５）である。
【0045】
ａ．～ｈ．の上記ペプチドの誘導体又は類似体には、代替のＤ－アミノ酸若しくはＧｌｙが１位に含まれる、及び／又は１つ若しくは複数のアラニン残基が他のアミノ酸に、典型的には他の非荷電アミノ酸、嵩高い側鎖を有さないアミノ酸（例えば、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）及び／若しくは非天然アミノ酸に置換されているペプチドが含まれる。誘導体又は類似体は、指定されたＮ－Ｍｅに対する代替的なＮ－アルキル化又は追加のＮ－アルキル化若しくはＮ－メチル化を含み得る。ａ．～ｆ．のペプチドがＰｈｅ又はＤ－Ｐｈｅを含む場合、これはＴｙｒ又はＤ－Ｔｙｒに置換され得る。誘導体又は類似体は、典型的には、（Ｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １９９３，１５，２３５－２５１に記載されているように）βＩＩ’ターンのｉ＋１位又はペプチド中の１位にＤ－アミノ酸又はＧｌｙを含む。
【0046】
いずれの上記ペプチドの誘導体又は類似体も、典型的には、標的化剤としてのペプチドの活性を保存又は増強し、当業者によって、当技術分野で公知である、及び例に記載されている方法を用いて活性について検証され得る。
【0047】
いずれの上記ペプチドのペプチド模倣物質も本明細書に記載されている。ペプチド模倣物質の設計のための原理は、当技術分野で周知である。例えば、Ｋａｐｐ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．：２０１７ ７：３９８０５，Ｎｅｕｂａｕｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ ２０１４，５７，３４１０及びＩｎｔｅｒｖｏｌｌ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｍ Ｌｅｔ ２００６，１６，６１９０－９３に記載されているインテグリン結合剤の文脈に含める。
【0048】
上記のペプチド及びペプチド模倣物質の塩、並びにペプチド及びペプチド模倣物質の類似体及び化学的誘導体も本明細書に記載されている。
【0049】
本明細書で使用される場合、「塩」という用語は、カルボキシル基の塩と、ペプチド分子のアミノ基又はグアニド基の酸付加塩の両方を指す。カルボキシル基の塩は、当技術分野で公知の手段によって形成され得、無機塩、例えばナトリウム、カルシウム、アンモニウム、鉄又は亜鉛塩など、及び、例えばトリエタノールアミン、ピペリジン、プロカインなどのアミンと形成された塩などの、有機塩基との塩が挙げられる。酸付加塩としては、例えば、酢酸又はシュウ酸などの鉱酸との塩が挙げられる。塩は、ここでは、カルシウム鉱物のヒドロゲル形成及び／又はミネラル化を増強するためにペプチド溶液に添加されるイオン性成分も記載する。薬学的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するものなどの遊離アミノ基と形成されたもの、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するものなどの遊離のカルボキシル基と形成されたものが挙げられる。
【0050】
ペプチドは、組換え法及び合成法を含む、当技術分野で公知の任意の方法によって生産され得る。合成方法としては、固相合成、部分固相合成、断片縮合又は古典的溶液合成が挙げられる。固相ペプチド合成手順は当業者に周知であり、例えば、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４），Ｂｉｒｏｎ＆Ｋｅｓｓｌｅｒ（Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２００５，７０，５１８３－５１８９）及びＣｈａｔｔｅｒｊｅｅ ｅｔ ａｌ（Ｎａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２０１２，７（３），４３２－４４４）によって記載されている。いくつかの態様において、合成ペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製される（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ．ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．Ｎ．Ｙ．）。
【0051】
ペプチドはまた、プロドラッグの形態で提供され得、又はコンジュゲート若しくは融合タンパク質として提供される。本明細書で使用される「プロドラッグ」という用語は、対象において１つ又は複数の代謝過程を介して活性を有する状態になる活性を有する薬剤の不活性な又は比較的活性の低い形態を指す。本明細書に開示されるペプチドのプロドラッグは、第一級アルコールのエステル及び／又はカルバマートを含めるためのアミノ酸及び／又はアミノ酸残基の修飾を含み得る。いくつかの態様において及び一般に、アミン部分を有するアミノ側鎖は、－ＮＨＣＯ２Ｒ部分を有するカルバマートに修飾されるのに対して、カルボキシラート部分を有するアミノ側鎖は、－ＣＯ２Ｒ部分を有するエステルに修飾される。
【0052】
上記ペプチドのプロドラッグは、正味の中性電荷を有し得、好ましくは生理的ｐＨで電荷を有さない。プロドラッグは、ペプチドの正味電荷を低下させる少なくとも１つの部分を含み得る。例えば、ペプチド（Ｎ－メチル化環状ヘキサペプチドなど）は、ペプチド中のアミノ酸の電荷を遮蔽する少なくとも１つの分子に連結され得る。ペプチドは、ペプチドの配列に直接又はスペーサー若しくはリンカーを介して結合された透過性増強部分を含み得る。スペーサー又はリンカーは、プロテアーゼ特異的切断部位を含み得る。
【0053】
プロドラッグは、（透過性増強部分としても記載される）以下の部分又は部分の群：
（ｉ）－ＣＯ２Ｒ部分、Ｒはアルキルである；
（ｉｉ）任意でアルギニン残基に連結されてもよいペンタ、ヘキシル若しくはヘプタオキシカルボニル部分；
（ｉｉｉ）メチルエステル部分（ＯＭｅ）若しくは他のアルキルエステル部分、例えばＡｓｐのメチル若しくはアルキルエステル；
（ｉｖ）ペンタ、ヘキシル若しくはヘプタオキシカルボニル及びエステル（ＯＭｅ）部分；並びに／又は
（ｖ）２つのペンタ、ヘキシル若しくはヘプタオキシカルボニル部分、例えば２つのヘキシルオキシカルボニル部分；
のうちの少なくとも１つを含み得る。
（ｉ）－ＣＯ２Ｒ部分、Ｒはアルキルである；
（ｉｉ）任意でアルギニン残基に連結されてもよいペンタ、ヘキシル若しくはヘプタオキシカルボニル部分；
（ｉｉｉ）メチルエステル部分（ＯＭｅ）若しくは他のアルキルエステル部分、例えばＡｓｐのメチル若しくはアルキルエステル；
（ｉｖ）ペンタ、ヘキシル若しくはヘプタオキシカルボニル及びエステル（ＯＭｅ）部分；並びに／又は
（ｖ）２つのペンタ、ヘキシル若しくはヘプタオキシカルボニル部分、例えば２つのヘキシルオキシカルボニル部分；
のうちの少なくとも１つを含み得る。
【0054】
少なくとも１つの－ＣＯ２Ｒ部分は、Ａ．Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ－Ｋｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ２０１８，１５．３４６８－３４７７）によって記載されたＲＧＤシクロヘキサペプチドなどの、ペプチド、好ましくはＮ－メチル化環状ヘキサペプチドの少なくとも１つのアミノ酸側鎖（アルギニン側鎖など）の窒素原子に共有結合され得る。
【0055】
プロドラッグは、部分：
を含み得、式中、破線は、部分とＮ－メチル化環状ヘキサペプチドなどのペプチドの骨格との間の共有結合を示す。いくつかの態様によれば、破線は、部分と、Ｎ－メチル化環状ヘキサペプチドなどのペプチドのα－炭素との間の共有結合を表す。
【化1】
を含み得、式中、破線は、部分とＮ－メチル化環状ヘキサペプチドなどのペプチドの骨格との間の共有結合を示す。いくつかの態様によれば、破線は、部分と、Ｎ－メチル化環状ヘキサペプチドなどのペプチドのα－炭素との間の共有結合を表す。
【0056】
上記部分のＲは、第一級アルキル基であり得る。Ｒは、ｎ－ヘキシル又はｎ－Ｃ１４Ｈ２９（ミリスチル）などの任意のアルキル基であり得る。
【0057】
透過性増強部分は、ペンタ、ヘキシル又はヘプタオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分などのオキシカルボニル部分であり得る。全ての構造中のＨｏｃは、構造：
を有するヘキシルオキシカルボニル残基を示す。
【化2】
を有するヘキシルオキシカルボニル残基を示す。
【0058】
ペプチドのＡｒｇのグアニジン基は、１つのＨｏｃ又は２つのＨｏｃ部分で遮蔽され得る。
【0059】
別のプロドラッグ修飾では、ペプチドは、Ａｓｐのメチル又はアルキルエステルなど、メチルエステル部分（ＯＭｅ）又はその他のアルキルエステル部分を含み得る。ペプチドは、式ＣＨ２ＣＯＯＭｅを有する少なくとも１つの側鎖を含み得る。
【0060】
特定の局面では、ペプチドのプロドラッグは、式：ｃ（＊ｖＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ）（配列番号９、（本明細書では２９Ｐとも記載される））、ｃ（＊ａＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ）（配列番号１０）、ｃ（＊ｒ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊ＡＡ）（配列番号１１）ｃ（ｒ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ＊Ａ）（配列番号１２）、＊ｆＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ（配列番号１４）、ＬＰＰＦＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤＬＡ（配列番号１５）、ＬＰＰＧＬＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（配列番号１６）、＊ｖＲ（Ｈｏｃ）ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ（配列番号２１）、ａ＊ＡＡ（Ｈｏｃ）２ＡＡＡ（配列番号２２）又はｆ＊ＶＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（配列番号２３）を有し得る。
【0061】
好ましいαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化ペプチドの提供に関するさらなる情報は、国際公開第２０１９０５８３７４号及びＷｅｉｎｍｕｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ（Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１７，５６，１６４０５－１６４０９）に提供されており、その開示（文献に記載されている全ての設計されたペプチドを含む）は参照により本明細書に組み入れられる。
【0062】
免疫療法
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、典型的には、少なくとも１つの免疫療法剤と、すなわち免疫療法と組み合わせて使用される。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の、少なくとも１つの免疫療法剤と組み合わせた使用は、典型的には、免疫療法剤の活性を増強する。免疫療法剤又は免疫療法は、典型的には抗がん又は抗腫瘍応答によってがんを処置することができる任意の免疫療法剤又は免疫療法であり得る。好ましくは、免疫療法剤は、エフェクターＴ細胞（典型的にはＣＤ８＋Ｔ細胞）の抗がん又は抗腫瘍応答を増強することによってがんを処置する。エフェクターＴ細胞活性化は、通常、ＭＨＣ複合体によって提示される抗原性ペプチドを認識するＴ細胞受容体によって引き金が引かれる。次いで、達成される活性化の種類及びレベルは、エフェクターＴ細胞応答を刺激するシグナルとエフェクターＴ細胞応答を阻害するシグナルとの間のバランスによって決定される。
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、典型的には、少なくとも１つの免疫療法剤と、すなわち免疫療法と組み合わせて使用される。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の、少なくとも１つの免疫療法剤と組み合わせた使用は、典型的には、免疫療法剤の活性を増強する。免疫療法剤又は免疫療法は、典型的には抗がん又は抗腫瘍応答によってがんを処置することができる任意の免疫療法剤又は免疫療法であり得る。好ましくは、免疫療法剤は、エフェクターＴ細胞（典型的にはＣＤ８＋Ｔ細胞）の抗がん又は抗腫瘍応答を増強することによってがんを処置する。エフェクターＴ細胞活性化は、通常、ＭＨＣ複合体によって提示される抗原性ペプチドを認識するＴ細胞受容体によって引き金が引かれる。次いで、達成される活性化の種類及びレベルは、エフェクターＴ細胞応答を刺激するシグナルとエフェクターＴ細胞応答を阻害するシグナルとの間のバランスによって決定される。
【0063】
「免疫系チェックポイント」という用語は、本明細書では、エフェクターＴ細胞応答の阻害に有利になるようにバランスを変化させる任意の分子的相互作用を指すために使用される。すなわち、それが起こるとエフェクターＴ細胞の活性化を負に調節する分子的相互作用である。このような相互作用は、リガンドと、阻害性シグナルをエフェクターＴ細胞に伝達する細胞表面受容体との間の相互作用など、直接的であり得る。又は、このような相互作用は、リガンドと相互作用の遮断若しくは阻害がなければ活性化シグナルをエフェクターＴ細胞に伝達する細胞表面受容体との間の相互作用の遮断若しくは阻害、又は阻害性分子若しくは細胞の上方制御若しくはエフェクターＴ細胞によって必要とされる代謝産物の酵素による枯渇を促進する相互作用、又はこれらの任意の組み合わせなど、間接的であり得る。
【0064】
免疫系チェックポイントの例には、
ａ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）とその基質との相互作用；
ｂ）ＰＤ１とＰＤＬ１及び／又はＰＤ１とＰＤＬ２との間の相互作用；
ｃ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８６及び／又はＣＴＬＡ４とＣＤ８０との間の相互作用；
ｄ）Ｂ７－Ｈ３及び／又はＢ７－Ｈ４とそれらのそれぞれのリガンドとの間の相互作用；
ｅ）ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用；
ｆ）ＧＡＬ９とＴＩＭ３との相互作用；
ｇ）ＭＨＣクラスＩ又はＩＩとＬＡＧ３との間の相互作用；及び
ｈ）ＭＨＣクラスＩ又はＩＩとＫＩＲとの間の相互作用
が含まれる。
ａ）インドールアミン２，３－ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ１）とその基質との相互作用；
ｂ）ＰＤ１とＰＤＬ１及び／又はＰＤ１とＰＤＬ２との間の相互作用；
ｃ）ＣＴＬＡ４とＣＤ８６及び／又はＣＴＬＡ４とＣＤ８０との間の相互作用；
ｄ）Ｂ７－Ｈ３及び／又はＢ７－Ｈ４とそれらのそれぞれのリガンドとの間の相互作用；
ｅ）ＨＶＥＭとＢＴＬＡとの間の相互作用；
ｆ）ＧＡＬ９とＴＩＭ３との相互作用；
ｇ）ＭＨＣクラスＩ又はＩＩとＬＡＧ３との間の相互作用；及び
ｈ）ＭＨＣクラスＩ又はＩＩとＫＩＲとの間の相互作用
が含まれる。
【0065】
免疫療法剤は、任意の免疫系チェックポイント阻害剤、例えば上記チェックポイントのいずれもの任意の阻害剤であり得る。本発明において好ましいチェックポイントは、ＰＤ１とそのリガンドＰＤ－Ｌ１及びＰＤ－Ｌ２のいずれかとの間の相互作用である。ＰＤ１は、エフェクターＴ細胞上に発現される。いずれかのリガンドとの結合は、活性化を下方制御するシグナルをもたらす。リガンドは、いくつかの腫瘍によって発現される。ＰＤ－Ｌ１は、特に、黒色腫、乳房、膀胱、結腸（ｃｏｌｏｎ）、卵巣、子宮及び肉腫を含む多くの固形腫瘍によって発現される。したがって、これらの腫瘍は、Ｔ細胞上の阻害性ＰＤ１受容体の活性化を通じて、免疫によって媒介される抗腫瘍効果を下方制御し得る。ＰＤ１とそのリガンドの一方又は両方との間の相互作用を遮断することによって、免疫応答のチェックポイントが除去され、増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答をもたらし得る。したがって、ＰＤ１及びそのリガンドは、好ましくは本発明の方法において免疫療法剤によって標的とされ得る免疫系チェックポイントの成分の例である。
【0066】
本発明における別の好ましいチェックポイントは、Ｔ細胞受容体ＣＴＬＡ－４とそのリガンドであるＢ７タンパク質（Ｂ７－１及びＢ７－２）との間の相互作用である。ＣＴＬＡ－４は通常、初期活性化後にＴ細胞表面上で上方制御され、リガンド結合はさらなる／継続する活性化を阻害するシグナルをもたらす。ＣＴＬＡ－４は、同じくＴ細胞表面上に発現されるが活性化を上方制御する受容体ＣＤ２８と、Ｂ７タンパク質への結合について競合する。したがって、Ｂ７タンパク質とのＣＴＬＡ－４相互作用を遮断するが、Ｂ７タンパク質とのＣＤ２８相互作用を遮断しないことによって、免疫応答の正常なチェックポイントの１つが除去され、増強された抗腫瘍Ｔ細胞応答をもたらし得る。したがって、ＣＴＬＡ４及びそのリガンドは、好ましくは本発明の方法において標的とされ得る免疫系チェックポイントの成分の例である。
【0067】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、２つ以上の免疫系チェックポイントの阻害剤と、例えば、ＰＤ１とそのリガンドとの間の相互作用の阻害剤及びＣＴＬＡ４とそのリガンドとの間の相互作用の阻害剤と組み合わせて使用され得る。
【0068】
免疫療法剤は、チェックポイントの成分に結合するか、又はさもなければチェックポイントの成分を修飾することによってチェックポイントを遮断又は阻害し、それによってチェックポイントの活性を遮断又は阻害し得る。薬剤は、チェックポイントの成分に特異的に結合する抗体若しくは小分子阻害剤又は他の結合剤であり得る。関心対象の標的を特異的に結合する抗体及び他の結合剤のタイプの一般的な結合特性及び例は上に提供されており、チェックポイント成分に結合する抗体及び他の結合剤に対しても適用され得る。他の結合剤には、チェックポイントの成分を結合するＣＡＲ Ｔ細胞が含まれ得る。例は、ＰＤ－Ｌ１及び／又はＰＤ－Ｌ２に結合するＰＤ１の抗体、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくは小分子阻害剤（抗ＰＤ１又は抗ＰＤ－Ｌ１抗体など）、又はＢ７－１及び／若しくはＢ７－２に結合するＣＴＬＡ４の抗体、ＣＡＲ Ｔ細胞若しくは小分子阻害剤（抗ＣＴＬＡ４抗体など）である。Ｂ７タンパク質とのＣＴＬＡ－４相互作用を遮断又は阻害し、本発明に従って組み合わせて使用され得る好ましい抗体には、イピリムマブ（ｉｐｉｌｕｍｕｍａｂ）、トレメリムマブ又は国際公開第２０１４／２０７０６３号に開示されている抗体のいずれもが含まれる。他の分子としては、ポリペプチド又は可溶性変異体ＣＤ８６ポリペプチドが挙げられる。ＰＤ－Ｌ１とのＰＤ１相互作用を遮断又は阻害し、本発明に従って組み合わせて使用され得る好ましい抗体又は他の薬剤としては、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ラムブロリズマブ、セミプリマブ、ピジルズマブ、トリパリマブ及びＡＭＰ－２２４が挙げられる。抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、ＭＥＤＩ－４７３６及びＭＰＤＬ３２８０Ａが挙げられる。
【0069】
上記の免疫療法剤は、本明細書に記載されている任意のαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤、好ましくは上記の配列ＲＧＤを含む約５～約８アミノ酸長の環状ペプチド、例えばシレンギチド（ｃｉｌｅｎｇｅｔｉｄｅ）又は配列番号１～２３のペプチド及びプロドラッグのいずれも並びにそれらの誘導体及び類似体、及びそれらのペプチド模倣物質、特に好ましくは配列番号５のペプチド又は配列番号９のプロドラッグ又はそれらのいずれかの誘導体、類似体又はペプチド模倣物質との組み合わせについて記載されている。上記の免疫療法剤は、上記のαｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤並びに以下に記載される任意の化学療法剤、特に好ましくはシスプラチン、カルボプラチン、ペメトレキセド又はそれらのいずれかの誘導体との組み合わせについてさらに記載される。
【0070】
化学療法
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、これに加えて又はこれに代えて、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて使用され得る。好ましくは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの化学療法剤及び少なくとも１つの免疫療法剤と組み合わせて使用され得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせた使用は、典型的には、化学療法剤の活性を増強する。
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、これに加えて又はこれに代えて、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて使用され得る。好ましくは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの化学療法剤及び少なくとも１つの免疫療法剤と組み合わせて使用され得る。αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせた使用は、典型的には、化学療法剤の活性を増強する。
【0071】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、任意の化学療法剤、例えば関心対象のがんの処置において有用な任意の化学療法剤と組み合わせて使用され得る。当業者は、特定の種類のがんの処置に適した化学療法剤を選択することができる。抗がん剤などの化学療法剤には、シスプラチン（ｃｉｓ－ＤＤＰ）及びカルボプラチンなどの白金配位錯体、メクロレタミン（ＨＮ２）、シクロホスファミド、イホスファミド、メルファラン（Ｌ－サルコリシン）及びクロラムブシルなどのナイトロジェンマスタードを含むアルキル化剤；エチレンイミン及びヘキサメチルメラミンなどのメチルメラミン、チオテパ；ブスルファンなどのアルキルスルホナート；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、セムスチン（メチル－ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン（ストレプトゾトシン）などのニトロソ尿素；並びにデカルバジン（ＤＴＩＣ；ジメチルトリアゼノイミダゾール－カルボキサミド）などのトリアゼン；ゲムシタビン及びメトトレキサート（アメトプテリン）などの葉酸類似体、ペメトレキセドを含む代謝拮抗薬；フルオロウラシル（５－フルオロウラシル；５－ＦＵ）、フロクスウリジン（フルオロデオキシウリジン；ＦＵｄＲ）及びシタラビン（シトシンアラビノシド）などのピリミジン類似体；並びにメルカプトプリン（６－メルカプトプリン；６ＭＰ）などのプリン類似体及び関連する阻害剤、チオグアニン（６－チオグアニン；ＴＧ）及びペントスタチン（２’－デオキシコホルマイシン）；ビンブラスチン（ＶＬＢ）及びビンクリスチンなどのビンカアルカロイドを含む天然産物；エトポシド及びテニポシドなどのエピポドフィロトキシン；ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ）、ダウノルビシン（ダウノマイシン；ルビドマイシン）、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）、マイトマイシン（マイトマイシンＣ）などの抗生物質；Ｌ－アスパラギナーゼなどの酵素；並びにインターフェロンアルフェノームなどの生物学的応答修飾因子；ミトキサントロン及びアントラサイクリンなどのアントラセンジオンを含む種々の薬剤；ヒドロキシ尿素などの置換された尿素；プロカルバジン（Ｎ－メチルヒドラジン、ＭＩＨ）などのメチルヒドラジン誘導体；並びにミトタン（ｏ，ｐ’－ＤＤＤ）及びアミノグルテチミド等の副腎皮質抑制剤；タキソール及び類似体／誘導体；並びにフルタミド及びタモキシフェンなどのホルモンアゴニスト／アンタゴニストが含まれる。
【0072】
好ましい化学療法剤には、アルキル化剤、特にシスプラチン、カルボプラチン及びこれらの誘導体、並びにゲムシタビン及びペメトレキセドなどの代謝拮抗剤、並びにシスプラチン、カルボプラチン又はこれらの誘導体及びペメトレキセド又はその誘導体などのこれらのいずれかの組み合わせが含まれる。
【0073】
いくつかの態様において、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、免疫療法剤のさらなる使用なしに、少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて使用される。このような態様において、少なくとも１つの化学療法剤は、アルキル化剤、特にシスプラチン、カルボプラチン及びこれらの誘導体であり得、又はペメトレキセド若しくはその誘導体、又はそれらのいずれかの組み合わせであり得、方法は、ゲムシタビンの使用を含まないか、又は任意の他の化学療法剤の使用を含まない。このような態様において、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤はさらに、上記ａ．～ｍ．のペプチド又はその環化されたバージョン、好ましくはｆ．のペプチド又はその環化されたバージョンであり得る。このような態様において、これに加えて又はこれに代えて、がんは、以下で論じられるように、血管コ－オプションを示すがんなどの非血管新生性がんであり得る。がんは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の非存在下で化学療法剤に対して難治性であり得る。がんは、以下で論述されるようにＮＳＣＬＣであり得る。
【0074】
がん
がんは、任意のがん又は腫瘍であり得る。がん又は腫瘍は、免疫療法及び／又は化学療法による処置に関して以前に記載された任意のがん又は腫瘍であり得る。
がんは、任意のがん又は腫瘍であり得る。がん又は腫瘍は、免疫療法及び／又は化学療法による処置に関して以前に記載された任意のがん又は腫瘍であり得る。
【0075】
がん又は腫瘍は、典型的には、固形がん又は腫瘍である。固形がん又は腫瘍は、例えば、乳房、膵臓（膵管など）、膀胱、腎臓、肝臓、結腸、肺、前立腺、頭部及び頸部、卵巣、子宮、扁平上皮皮膚、中皮腫、肉腫又は黒色腫であり得る。がんは、ホジキンリンパ腫などの血液がんであり得る。
【0076】
がん又は腫瘍は、上記の免疫療法剤及び／又は化学療法剤による処置に対して、不十分に応答性、非応答性又は難治性であり得る。がん又は腫瘍は、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４又はＰＤ－Ｌ１の、リガンドとの相互作用を標的とするものなど、上記のチェックポイント阻害剤による処置に対して不十分に応答性、非応答性又は難治性であり得る。がん又は腫瘍は、治療用量での副作用及び／又は毒性に基づいて、上記の免疫療法剤及び／又は化学療法剤での処置に適していないと以前に記載されたものであり得る。がん又は腫瘍は、これに加えて又はこれに代えて、抗血管新生剤による処置に対して不十分に応答性、非応答性又は難治性であり得る。
【0077】
がん又は腫瘍は、非血管新生性であり得る。したがって、がん又は腫瘍は、不十分な血管新生化を有し得る。がん又は腫瘍は、新血管新生化を示さないことがあり得る。がん又は腫瘍は、低酸素を示し得る。がん又は腫瘍は、異常な灌流を有し得る。がん又は腫瘍は、血管コ－オプションを示し得る。
【0078】
がん又は腫瘍は、好ましくは、肺がん、最も好ましくはＮＳＣＬＣである。ＮＳＣＬＣは、ステージＩＩＩ又はＩＶ ＮＳＣＬＣなどの進行型ＮＳＣＬＣであり得る。がんは、小細胞肺がんであり得る。肺がんは、切除不能であり得る。肺がんは、非血管新生性であり得、及び／又は血管コ－オプションを示し得る。肺がんは、肺胞及び／又は間質性腫瘍の成長を含み得る。肺がんは、原発性肺がん、又は乳がん若しくは膵がんなどの、肺に広がった任意の続発性がんであり得る。
【0079】
患者は、典型的にはヒトである。しかしながら、患者は、ウマ、ウシ、ヒツジ、魚、ニワトリ若しくはブタなどの商業的に飼育された動物、マウス若しくはラットなどの実験動物、又はモルモット、ハムスター、ウサギ、ネコ若しくはイヌなどのペットなどの別の哺乳動物であり得る。
【0080】
患者は、以前にがんと診断されたことがあり得、又はがんの１種若しくは複数種の症候を示し得る。患者は、本明細書に記載されている免疫療法及び／又は化学療法で以前に処置されたことがあり得、前記処置に対して不十分に応答性又は非応答性であると判定されたことがあり得る。患者は、非血管新生性である及び／又は血管コ－オプションを示すがんを有すると判定されたことがあり得る。
【0081】
医薬組成物
本明細書に記載されている薬剤は、医薬組成物に製剤化され得る。上記の方法及び医学的使用は、典型的には、医薬組成物の投与を含む。組成物は、治療活性成分に加えて、薬学的に許容される、賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。薬学的担体又は希釈剤は、例えば、等張溶液であり得る。
本明細書に記載されている薬剤は、医薬組成物に製剤化され得る。上記の方法及び医学的使用は、典型的には、医薬組成物の投与を含む。組成物は、治療活性成分に加えて、薬学的に許容される、賦形剤、担体、希釈剤、緩衝剤、安定剤又は当業者に周知の他の材料を含み得る。このような材料は非毒性であるべきであり、有効成分の有効性を妨げるべきではない。薬学的担体又は希釈剤は、例えば、等張溶液であり得る。
【0082】
「薬学的に許容される」という用語は、連邦政府若しくは州政府などの規制機関によって承認されていること、又は動物、より具体的にはヒトにおける使用に関して米国薬局方若しくは他の一般に認識されている薬局方に掲載されていることを意味する。「担体」という用語は、それとともに治療化合物が投与される希釈剤、補助剤、賦形剤又はビヒクルを指す。このような薬学的担体は、無菌の液体、例えば水及び石油、動物、植物又は合成起源の油、例えば落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などを含む油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒であり得る。適切な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが含まれる。組成物は、所望であれば、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はアセタート、シトラート若しくはホスファートなどのｐＨ緩衝剤も含有することができる。アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの酸化防止剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの、等張性を調整するための薬剤も想定される。
【0083】
担体又は他の物質の正確な性質は、投与経路、例えば経口、静脈内、皮膚又は皮下、経鼻、筋肉内及び腹腔内経路に依存し得る。適切な薬学的担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」に記載されている。このような組成物は、対象への適切な投与のための形態を提供するために、適切な量の担体とともに、好ましくは実質的に精製された形態で、治療有効量の本発明のペプチドを含有する。適切な組成物及び投与方法の例は、Ｅｓｓｅｋｕ ａｎｄ Ａｄｅｙｅｙｅ（２０１１）及びＶａｎ ｄｅｎ Ｍｏｏｔｅｒ Ｇ．（２００６）に提供されている。
【0084】
例えば、固体経口形態は、活性物質とともに、希釈剤、例えばラクトース、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチ又はジャガイモデンプン；潤滑剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム若しくはステアリン酸カルシウム、及び／又はポリエチレングリコール；結合剤；例えば、デンプン、アラビアガム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギナート又はデンプングリコール酸ナトリウム；発泡混合物；染料；甘味料；湿潤剤、例えばレシチン、ポリソルベート、ラウリルサルファート；並びに、一般に、薬学的製剤中で使用される非毒性及び薬理学的に不活性な物質を含有し得る。このような薬学的製調製物は、例えば、混合、造粒、打錠、糖衣又はフィルムコーティングプロセスによって公知の様式で製造され得る。
【0085】
経口製剤は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの、通常使用される賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は散剤の形態をとり、１０％～９５％、好ましくは２５％～７０％の活性成分を含有する。医薬組成物が凍結乾燥される場合、凍結乾燥された材料は、投与前に再構成され得る、例えば、懸濁液。再構成は、好ましくは緩衝液中で行われる。
【0086】
個体への経口投与のためのカプセル剤、錠剤及び丸剤は、例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｓ」、Ｅｕｄｒａｇｉｔ「Ｌ」、酢酸セルロース、酢酸フタル酸セルロース又はヒドロキシプロピルメチルセルロースを含む腸溶コーティングを備え得る。
【0087】
経口投与のための液体分散液は、シロップ、エマルジョン又は懸濁液であり得る。シロップは、担体として、例えば、サッカロース又はグリセリン及び／若しくはマンニトール及び／若しくはソルビトールとサッカロースを含有し得る。
【0088】
懸濁液及びエマルジョンは、担体として、例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又はポリビニルアルコールを含有し得る。筋肉内注射用の懸濁液又は溶液は、活性物質とともに、薬学的に許容される担体、例えば無菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、及び所望であれば適切な量の塩酸リドカインを含有し得る。
【0089】
静脈内投与又は注入のための溶液は、担体として、例えば無菌水を含有し得、又は好ましくは無菌水性等張生理食塩水溶液の形態であり得る。
【0090】
坐剤の場合、従来の結合剤及び担体は、例えば、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含み得、このような坐剤は、０．５％～１０％、好ましくは１％～２％の範囲で活性成分を含有する混合物から形成され得る。
【0091】
医薬組成物（経口投与用組成物など）は、吸収促進剤を含み得る。医薬組成物は、脂質を含み得る。医薬組成物は、自己ナノ乳化薬物送達系（ＳＮＥＤＤＳ）又はＰｒｏ－ＮａｎｏＬｉｐｏｓｐｈｅｒｅ（ＰＮＬ）を含み得る。本明細書で使用されるＳＮＥＤＤＳ（自己ナノ乳化薬物送達系）という用語は、透明なナノエマルジョンを自発的に形成する、油、界面活性剤、薬物及び／又は共溶媒から構成される無水均質液体混合物を指す。本明細書で使用されるＰＮＬ（Ｐｒｏ－ＮａｎｏＬｉｐｏｓｐｈｅｒｅ）という用語は、薬物、トリグリセリド、リン脂質、界面活を基礎とする送達系を指す。
【0092】
投与及び用量
本明細書に記載されている薬剤又は前記薬剤を含む医薬組成物は、がんを処置するために投与される。投与は、典型的には「治療有効量」でされ、これは、個体に利益を示すのに十分であり、例えば、１つ若しくは複数の症候を改善するための、生存を強化するための、寛解を誘導若しくは延長するための、又は再発（ｒｅｌａｐｓｅ）若しくは再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）を遅延させるための有効量である。
本明細書に記載されている薬剤又は前記薬剤を含む医薬組成物は、がんを処置するために投与される。投与は、典型的には「治療有効量」でされ、これは、個体に利益を示すのに十分であり、例えば、１つ若しくは複数の症候を改善するための、生存を強化するための、寛解を誘導若しくは延長するための、又は再発（ｒｅｌａｐｓｅ）若しくは再発（ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ）を遅延させるための有効量である。
【0093】
薬剤又は医薬組成物は、経口、静脈内、皮膚若しくは皮下、経鼻、筋肉内又は腹腔内経路を含む任意の経路によって投与され得る。
【0094】
各薬剤の用量は、様々なパラメータに従って、特に使用される物質；処置されるべき個体の年齢、性別、体重及び症状；投与経路；並びに必要とされるレジメンに従って決定され得る。医師は、任意の特定の個体に対して、必要とされる投与経路及び投与量を決定することができるであろう。特定の障害又は症状の処置において有効である薬剤の量は、障害又は症状の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定され得る。さらに、最適な投与量範囲を特定するのを補助するために、任意で、インビトロアッセイが使用され得る。製剤において使用されるべき正確な用量は、疾患又は障害の重篤度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。本明細書に記載されている薬剤の毒性及び治療有効性は、細胞培養物又は実験動物における標準的な薬学的手順によって、例えば、対象化合物についてＩＣ５０（５０％阻害を提供する濃度）及びＬＤ５０（試験された動物の５０％に死を引き起こす致死量）を決定することによって決定され得る。これらの細胞培養アッセイ及び動物研究から得られたデータは、ヒトで使用するための投与量の範囲を定める上で使用され得る。
【0095】
本明細書に記載される薬剤の典型的な１日用量は、薬剤の性質及び上述の条件に応じて、体重１ｋｇ当たり約０．１～５０ｍｇである。ペプチドを含む医薬組成物の投与に関して当技術分野で記載されている一般用量量は、約０．１μｇ／ｋｇ～約２０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲である。活性成分の量は、約１０～５０００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。用量は、単回用量として提供され得、又は例えば規則的な間隔で服用される複数回用量として提供され得る。投与量は、例えば、毎週、隔週、毎月又は隔月のレジメンで投与され得る。上記の技術及びプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０００，ｐｕｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓに見出すことができる。
【0096】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤は、同時に、別々に、又は逐次に投与され得る。各薬剤は、同一の又は異なる投与経路によって投与され得る。各薬剤は、薬剤の投与を含む処置の異なる段階で投与され得る。
【0097】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤の投与は、治療有効性のために必要とされる少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の用量の低下を可能にし得、したがって、より高用量でのこのような薬剤の副作用及び／又は毒性を有益に低下させ得る。したがって、本発明はまた、がんの処置のために必要とされる、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の用量を低下させる方法であって、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤を前記少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて投与することを含む方法を提供する。この方法は、第１の用量の少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤を上記の組み合わせで投与し、次いで、第２のより低い用量の少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤を上記の組み合わせで投与する工程と、第２のより低い用量が治療有効性を有することを決定する工程と、任意で、第２のより低い用量が副作用及び／又は毒性が低下していることをさらに決定する工程とを含み得る。
【0098】
本発明の方法において、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、上記のこのような薬剤の機能的特性の１つ又は複数を誘導するのに、並びに少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の有効性を増強するのに有効な用量で投与される。用量は、典型的には、インテグリン接着を阻害することなくαｖβ３－及び／又はαｖβ５インテグリンシグナル伝達を変化させるのに有効である。
【0099】
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤が、上記の配列ＲＧＤを含む約５～約８アミノ酸長の環状ペプチド、例えばシレンギチド（cilengetide）、又は配列番号１～２３のペプチド及びプロドラッグ及びこれらの誘導体及び類似体のいずれか、並びにこれらのペプチド模倣物質である場合には、ペプチドは、対象体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で投与され得る。ペプチドは、約０．０１、０．０５、０．１、０．５、０．７、１又は２ｍｇ／対象体重のｋｇ～約０．０５、０．１、０．５、０．７、１、２、５、１０、１５、２０、５０、１００、２５０又は５００ｍｇ／対象体重のｋｇの範囲の用量で投与され得る。ペプチドは、０．１、１、１０、２０、３０、５０、１００、２００、４００、５００、７００、９００又は１０００ｎｇ／対象体重のｋｇ～約１００、２００、４００、５００、７００、９００、１０００、１２００、１４００、１７００又は２０００ｎｇ／対象体重のｋｇの範囲の用量で投与され得る。ペプチドは、約２０ｎｇ／対象体重のｋｇ～約１００ｎｇ／対象体重のｋｇの範囲の用量で投与され得る。ペプチドは、約５０μｇ／ｋｇ～約４００μｇ／ｋｇ、例えば約５０μｇ／ｋｇ～約３００μｇ／ｋｇ、約１００μｇ／ｋｇ～約３００μｇ／ｋｇ又は約１００μｇ／ｋｇ～約２５０μｇ／ｋｇのマウス用量量に対応するヒト用量量で投与され得る。５０μｇ／ｋｇ未満又は４００μｇ／ｋｇ超のヒト用量量、例えば約１０μｇ／ｋｇ～約７００μｇ／ｋｇの用量量も投与され得る。
【0100】
ペプチドは、約０．００１ｍｇ／対象体重のｋｇ～約５００ｍｇ／対象体重のｋｇ、例えば、約０．１ｍｇ／対象体重のｋｇ～約５００ｍｇ／対象体重のｋｇの範囲の用量で経口投与され得る。
【0101】
組み合わせ
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて、本発明の方法及び医学的使用において投与される。関連する局面において、本発明は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の組み合わせを、製品自体として提供する。上記の組み合わせは、αｖβ３－及び／若しくはαｖβ５－インテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／若しくは少なくとも１つの化学療法剤とを含む組成物、又は異なる用量形態のインテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／若しくは少なくとも１つの化学療法剤とを含む製品の形態を取り得る。組み合わせは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンインテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤とを、任意で、本発明の方法における投与のための説明書と一緒に含むキットであり得る。少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤と同時に、別々に、又は逐次に投与するためのものであり得る。
αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤は、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤と組み合わせて、本発明の方法及び医学的使用において投与される。関連する局面において、本発明は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤の組み合わせを、製品自体として提供する。上記の組み合わせは、αｖβ３－及び／若しくはαｖβ５－インテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／若しくは少なくとも１つの化学療法剤とを含む組成物、又は異なる用量形態のインテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／若しくは少なくとも１つの化学療法剤とを含む製品の形態を取り得る。組み合わせは、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリンインテグリン標的化剤と、少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤とを、任意で、本発明の方法における投与のための説明書と一緒に含むキットであり得る。少なくとも１つの免疫療法剤及び／又は少なくとも１つの化学療法剤は、αｖβ３－及び／又はαｖβ５－インテグリン標的化剤と同時に、別々に、又は逐次に投与するためのものであり得る。
【0102】
例
以下の例は、本発明を例示するために提供される。
以下の例は、本発明を例示するために提供される。
【0103】
材料及び方法
非小細胞肺がんのコンディショナルマウスモデル
ＫｒａｓＬＳＬ－Ｇ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＰと呼ばれる）を使用して、以前に記載されたように、Ａｄ－Ｃｒｅ（Ｃｒｅリコンビナーゼアデノウイルス）５×１０７ＰＦＵを投与することによって肺腺がんを作製した（ＤｕＰａｇｅ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｐｆｉｒｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）。アデノウイルス感染の５６日後に、異なる組み合わせ：週に１回、２９Ｐと組み合わせて又は組み合わせずに、シスプラチン６ｍｇ／Ｋｇ（Ｃｉｓ６）又はシスプラチン３ｍｇ／Ｋｇ（Ｃｉｓ３）；週に２回α－ＰＤ－１ ２００μｇ／マウス及びα－ＣＴＬＡ－４ １００μｇ／マウス、又はシスプラチン／２９Ｐと免疫療法の組み合わせ；週に２回抗ＶＥＧＦＲ２（ＤＣ１０１）６００μｇ／マウス、又は週に２回組み合わせＤＣ１０１／２９Ｐを使用してマウスを処置した。
非小細胞肺がんのコンディショナルマウスモデル
ＫｒａｓＬＳＬ－Ｇ１２Ｄ／＋；Ｔｒｐ５３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＫＰと呼ばれる）を使用して、以前に記載されたように、Ａｄ－Ｃｒｅ（Ｃｒｅリコンビナーゼアデノウイルス）５×１０７ＰＦＵを投与することによって肺腺がんを作製した（ＤｕＰａｇｅ ｅｔ ａｌ，２００９；Ｃｏｒｔｅｚ－Ｒｅｔａｍｏｚｏ ｅｔ ａｌ，２０１３；Ｐｆｉｒｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ，２０１６）。アデノウイルス感染の５６日後に、異なる組み合わせ：週に１回、２９Ｐと組み合わせて又は組み合わせずに、シスプラチン６ｍｇ／Ｋｇ（Ｃｉｓ６）又はシスプラチン３ｍｇ／Ｋｇ（Ｃｉｓ３）；週に２回α－ＰＤ－１ ２００μｇ／マウス及びα－ＣＴＬＡ－４ １００μｇ／マウス、又はシスプラチン／２９Ｐと免疫療法の組み合わせ；週に２回抗ＶＥＧＦＲ２（ＤＣ１０１）６００μｇ／マウス、又は週に２回組み合わせＤＣ１０１／２９Ｐを使用してマウスを処置した。
【0104】
異種移植モデル
Ｃ５７／ＢＬ６Ｊの側腹部に０．５×１０６個のルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞を皮下注射して、腫瘍血管新生を示すＬＬＣ皮下腫瘍を作製した。週に３回、ノギスを使用することによって腫瘍成長を測定し、以下の式を用いて腫瘍体積を計算した：腫瘍体積＝長さ×幅×幅×０．５２。腫瘍が５０ｍｍ３に達したら、ＬＬＣ腫瘍を有するマウスをアイソタイプ又はＤＣ１０１ ８００μｇ／マウスのいずれかで週に２回処置した。
Ｃ５７／ＢＬ６Ｊの側腹部に０．５×１０６個のルイス肺がん（ＬＬＣ）細胞を皮下注射して、腫瘍血管新生を示すＬＬＣ皮下腫瘍を作製した。週に３回、ノギスを使用することによって腫瘍成長を測定し、以下の式を用いて腫瘍体積を計算した：腫瘍体積＝長さ×幅×幅×０．５２。腫瘍が５０ｍｍ３に達したら、ＬＬＣ腫瘍を有するマウスをアイソタイプ又はＤＣ１０１ ８００μｇ／マウスのいずれかで週に２回処置した。
【0105】
処置
Ｂａｒｔｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの薬局から、シスプラチン（１００ｍｇ／１００ｍｌ、Ｔｅｖａ）、ベラパミル（４０ｍｇ／５ｍｌ Ｚｏｌｖｅｒａ、Ｒｏｓｅｍａｎｔ）を購入し、３ヶ月以内に使用した。Ｈｏｒｓｔ Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｌａｂから２９：ｃ（＊ｖＲＧＤＡ＊Ａ）及びそのプロドラッグ２９Ｐ、ｃ（＊ｖＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ）を購入した。ＰＤ－１ｍＡｂ（クローン－２９Ｆ．１Ａ１２）（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）２００μｇ／マウスを週に２回、３週間にわたって投与した。
Ｂａｒｔｓ Ｈｏｓｐｉｔａｌの薬局から、シスプラチン（１００ｍｇ／１００ｍｌ、Ｔｅｖａ）、ベラパミル（４０ｍｇ／５ｍｌ Ｚｏｌｖｅｒａ、Ｒｏｓｅｍａｎｔ）を購入し、３ヶ月以内に使用した。Ｈｏｒｓｔ Ｋｅｓｓｌｅｒ Ｌａｂから２９：ｃ（＊ｖＲＧＤＡ＊Ａ）及びそのプロドラッグ２９Ｐ、ｃ（＊ｖＲ（Ｈｏｃ）２ＧＤ（ＯＭｅ）Ａ＊Ａ）を購入した。ＰＤ－１ｍＡｂ（クローン－２９Ｆ．１Ａ１２）（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）２００μｇ／マウスを週に２回、３週間にわたって投与した。
【0106】
ＣＴＬＡ－４ｍＡｂ（クローン－９Ｄ９）（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）１００μｇ／マウスを週に２回、３週間にわたって投与した。ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ対照、抗トリニトロフェノール（クローン２Ａ３）（Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）１００μｇ／マウスを週に２回、３週間投与した。シスプラチン単独処置を週に１回投与した。シスプラチンと組み合わせた場合には週に１回、又は免疫療法、中和抗体若しくはＤＣ１０１と組み合わせた場合には週に２回、２９Ｐを投与した。多剤併用処置については、２９Ｐ及びシスプラチンを週に１回同じ日に与え、２９Ｐ／シスプラチン投与の２日後及び６日後に、週に２回、免疫療法を与えた。
【0107】
細胞株
肺腺がん細胞株ＫＰ５３ Ｆ１は、Ｃ５７ＢＬ／６ＫＰマウスの肺腫瘍に由来し、ＵＣＬ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）のＤｒ．ＳＡ．Ｑｕｅｚａｄａからいただいた。
肺腺がん細胞株ＫＰ５３ Ｆ１は、Ｃ５７ＢＬ／６ＫＰマウスの肺腫瘍に由来し、ＵＣＬ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｒｅ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｌｏｎｄｏｎ、ＵＫ）のＤｒ．ＳＡ．Ｑｕｅｚａｄａからいただいた。
【0108】
Ａ５４９及びＬＬＣ細胞をＡＴＣＣから購入した。マウス肺内皮細胞（ＥＣ）を得て、前述のように培養した（３４）。
【0109】
細胞生存アッセイ：
製造者の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ３５８２）を使用して、Ａ５４９又はＫＰ細胞の生存を分析した。簡潔には、１０００個の細胞を９６ウェルプレーティングに播種した。翌日、細胞を処理し、処理の７２時間後に溶液試薬を添加した。４９０ｎｍの波長を用いてプレートを読み取った。
製造者の説明書に従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ９６（登録商標）Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＃Ｇ３５８２）を使用して、Ａ５４９又はＫＰ細胞の生存を分析した。簡潔には、１０００個の細胞を９６ウェルプレーティングに播種した。翌日、細胞を処理し、処理の７２時間後に溶液試薬を添加した。４９０ｎｍの波長を用いてプレートを読み取った。
【0110】
ＶＥＧＦＲ２不活性化
ＶＥＧＦＲ２不活性化のために、週に２回、３週間にわたってＫＰマウスに抗ＶＥＧＦＲ２（クローンＤＣ１０１、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を投与した。
ＶＥＧＦＲ２不活性化のために、週に２回、３週間にわたってＫＰマウスに抗ＶＥＧＦＲ２（クローンＤＣ１０１、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を投与した。
【0111】
インビボでのＣＤ８＋細胞枯渇
ＣＤ８＋細胞を枯渇させるために、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、抗ＣＤ８αｍＡｂ（クローンＹＴＳ１６９．４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、ＫＰマウスに腹腔内投与した。
ＣＤ８＋細胞を枯渇させるために、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、抗ＣＤ８αｍＡｂ（クローンＹＴＳ１６９．４、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、ＫＰマウスに腹腔内投与した。
【0112】
インビボでのインターフェロン－γ、ＣＸＣＬ９及びＩＬ－１８の不活性化
ＩＦＮ－γを枯渇させるために、抗ＩＦＮ－γｍＡｂ（ＸＭＧ１．２、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、ＫＰマウスに腹腔内投与した。ＣＸＣＬ９を枯渇させるために、抗ＣＸＣＬ９ｍＡｂ（ＭＩＧ－２Ｆ５．５、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、ＫＰマウスに腹腔内投与した。ＩＬ－１８を枯渇させるために、抗ＩＬ－１８ｍＡｂ（クローンＹｌＧＩＦ７３－１Ｇ７、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、ＫＰマウスに腹腔内投与した。
ＩＦＮ－γを枯渇させるために、抗ＩＦＮ－γｍＡｂ（ＸＭＧ１．２、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、ＫＰマウスに腹腔内投与した。ＣＸＣＬ９を枯渇させるために、抗ＣＸＣＬ９ｍＡｂ（ＭＩＧ－２Ｆ５．５、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、ＫＰマウスに腹腔内投与した。ＩＬ－１８を枯渇させるために、抗ＩＬ－１８ｍＡｂ（クローンＹｌＧＩＦ７３－１Ｇ７、Ｂｉｏ Ｘ Ｃｅｌｌ）を、処置の最初の日の後及び実験の終わりまで、週に２回、ＫＰマウスに腹腔内投与した。
【0113】
免疫組織化学及び免疫蛍光
組織をホルマリン中で２４時間固定し、７０％エタノールに移した。沸騰している１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中で組織をパラフィン包埋し、切片にし、脱ろうし、マスキングを除去した。ＰＢＳ中で切片を３回洗浄し、５％正常ヤギ血清で１時間ブロックし、一次抗体：ラットモノクローナルエンドムチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ－ｓｃ－６５４９５）、ウサギポリクローナル抗Ｇｌｕｔ１（Ａｂｃａｍ－ａｂ６５２）、ウサギポリクローナルカルボニックアンヒドラーゼＩＸ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ－ＮＢ１００－４１７）、マウスモノクローナル抗α－平滑筋アクチンＣｙ３コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ－Ｃ６１９８）、ウサギモノクローナルＫｉ６７（Ａｂｃａｍ－ａｂ１６６６７）、ウサギポリクローナル抗ＣＤ３（ＤＡＫＯ、Ａ０４５２０１－２）、ラットモノクローナル抗ＣＤ３（ＢｉｏＲａｄ ＩＢＬ－３／１６）、ウサギポリクローナル抗ＣＤ８（ａｂｃａｍ、ａｂ２０３０３５）、ラットモノクローナル抗ＣＤ８ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４ＳＭ１５）、ラットモノクローナル抗Ｆ４／８０（ａｂｃａｍ、ａｂ６６４０）、ラットモノクローナル抗Ｌｙ６Ｇ（ａｂｃａｍ、ａｂ２５３７７）とインキュベートした。次いで、切片を洗浄し、二次フルオロフォア又はビオチン化二次抗体と４５分間インキュベートした。組織切片の免疫組織化学のために、酵素的アビジン－ビオチン複合体（ＡＢＣ）－３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。核をヘマトキシリンで対比染色した。
組織をホルマリン中で２４時間固定し、７０％エタノールに移した。沸騰している１０ｍＭクエン酸緩衝液ｐＨ６．０中で組織をパラフィン包埋し、切片にし、脱ろうし、マスキングを除去した。ＰＢＳ中で切片を３回洗浄し、５％正常ヤギ血清で１時間ブロックし、一次抗体：ラットモノクローナルエンドムチン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ－ｓｃ－６５４９５）、ウサギポリクローナル抗Ｇｌｕｔ１（Ａｂｃａｍ－ａｂ６５２）、ウサギポリクローナルカルボニックアンヒドラーゼＩＸ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ－ＮＢ１００－４１７）、マウスモノクローナル抗α－平滑筋アクチンＣｙ３コンジュゲート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ－Ｃ６１９８）、ウサギモノクローナルＫｉ６７（Ａｂｃａｍ－ａｂ１６６６７）、ウサギポリクローナル抗ＣＤ３（ＤＡＫＯ、Ａ０４５２０１－２）、ラットモノクローナル抗ＣＤ３（ＢｉｏＲａｄ ＩＢＬ－３／１６）、ウサギポリクローナル抗ＣＤ８（ａｂｃａｍ、ａｂ２０３０３５）、ラットモノクローナル抗ＣＤ８ａ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、４ＳＭ１５）、ラットモノクローナル抗Ｆ４／８０（ａｂｃａｍ、ａｂ６６４０）、ラットモノクローナル抗Ｌｙ６Ｇ（ａｂｃａｍ、ａｂ２５３７７）とインキュベートした。次いで、切片を洗浄し、二次フルオロフォア又はビオチン化二次抗体と４５分間インキュベートした。組織切片の免疫組織化学のために、酵素的アビジン－ビオチン複合体（ＡＢＣ）－３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）染色（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。核をヘマトキシリンで対比染色した。
【0114】
血管灌流
屠殺の１０分前に、ＰＥをコンジュゲートした２０μｇのマウスモノクローナル抗ＰＥ－ＰＥＣＡＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－１０２４０８）を、尾静脈を介してマウスに注射することによって、血管灌流を可視化した。腫瘍を急速凍結し、切片にし、エンドムチンについて染色した。灌流された血管の総数（ＰＥ－ＰＥＣＡＭ陽性）及び二重陽性血管の％は、血管灌流の指標を提供した。
屠殺の１０分前に、ＰＥをコンジュゲートした２０μｇのマウスモノクローナル抗ＰＥ－ＰＥＣＡＭ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ－１０２４０８）を、尾静脈を介してマウスに注射することによって、血管灌流を可視化した。腫瘍を急速凍結し、切片にし、エンドムチンについて染色した。灌流された血管の総数（ＰＥ－ＰＥＣＡＭ陽性）及び二重陽性血管の％は、血管灌流の指標を提供した。
【0115】
血管透過性
上記のように、屠殺及び抗ＰＥ－ＰＥＣＡＭの１分前に、尾静脈を介してマウスにＨｏｅｃｈｓｔ色素（０．４ｍｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射することによって、血管外の拡散を試験した。腫瘍を急速凍結した。Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡法（ＬＳＭ５１０ＭＥ－ＴＡ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１００μｍ厚の切片を分析した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、各１００μｍのスタックに対してＰＥ－ＰＥＣＡＭ及びＨｏｅｃｈｓｔ染色の平均画素数を計算した。
上記のように、屠殺及び抗ＰＥ－ＰＥＣＡＭの１分前に、尾静脈を介してマウスにＨｏｅｃｈｓｔ色素（０．４ｍｇ、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を注射することによって、血管外の拡散を試験した。腫瘍を急速凍結した。Ａｘｉｏｐｌａｎ顕微鏡法（ＬＳＭ５１０ＭＥ－ＴＡ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ）を用いて、１００μｍ厚の切片を分析した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、各１００μｍのスタックに対してＰＥ－ＰＥＣＡＭ及びＨｏｅｃｈｓｔ染色の平均画素数を計算した。
【0116】
フローサイトメトリーによるＫＰ腫瘍を有する肺の表現型分析。
腫瘍を切り刻み、ＤＮａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を含有する酵素カクテル中で、３７℃で２０分間インキュベートした。ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ）中のリベラーゼ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、膵臓腫瘍の単一細胞懸濁液を作製した。乳房腫瘍については、ＰＢＳ中のコラゲナーゼ／ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して単一細胞懸濁液を作製した。
腫瘍を切り刻み、ＤＮａｓｅ（０．５ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を含有する酵素カクテル中で、３７℃で２０分間インキュベートした。ＨＢＳＳ（Ｓｉｇｍａ）中のリベラーゼ（２ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して、膵臓腫瘍の単一細胞懸濁液を作製した。乳房腫瘍については、ＰＢＳ中のコラゲナーゼ／ディスパーゼ（１ｍｇ／ｍｌ、Ｓｉｇｍａ）を使用して単一細胞懸濁液を作製した。
【0117】
７０μＭフィルター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）に細胞を通し、２％ウシ胎児血清及び２ｍＭＥＤＴＡを補充したＰＢＳで洗浄し、計数し、直ちにフローサイトメトリーのために使用した。細胞を特異的抗体で染色する前に、Ｆｃγ Ｒ ＩＩＩ／ＩＩ ＴｒｕＳｔａｉｎ ｆｃＸ（９３、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で非特異的結合部位をブロックした。２％ウシ胎児血清及び２ｍＭＥＤＴＡを補充したＰＢＳ中で染色を実施した。
【0118】
以下の蛍光色素コンジュゲート抗体を使用した：Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄの抗ＣＤ４５（３０－Ｆ１１）、抗ＣＤ３（１４５－２Ｃ１１）、抗ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）、抗ＣＤ８（５３－６．７）、抗ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）、抗ＣＤ４４（ＩＭ７）、抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ－１４）、抗ＣＤ１９（６Ｄ５）、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）、抗Ｆ４／８０（ＢＭ８）；ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅの抗ＰＤ１（ＲＭＰ１－３０）、抗Ｇｒ１（ＲＢ６－８Ｃ５）及び抗Ｌｙ６Ｃ（ＨＫ１．４）。生きた細胞と死細胞を識別するために、固定可能な生存色素（ＦＶＤ）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した。ＢＤ ＦＡＣＳＤＩＶＡソフトウェア（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＢＤ ＬＳＲＩＩシステムで取得及び分析を行った。ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（バージョン１０．０．８ ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ）を使用して細胞のパーセンテージを分析した。ＦＶＤ及びＳＳＣゲーティングに基づいて死細胞を分析から除外した。ＦＳＣ面積対ＦＳＣ幅についてゲーティングすることによって、細胞ダブレットを分析から除外した。データ解析において白血球のみを含めるために、ＣＤ４５＋細胞を使用した。
【0119】
ＲＮＡ抽出及びＲＮＡｓｅｑ分析
プラセボ又は２９Ｐのいずれかで処理されたＫＰ腫瘍を有する凍結肺からＲＮＡを抽出し、プラセボ又は２９のいずれかでＫＰ細胞を処理し、ＭＬＥＣを２９で処理するか、又は処理しなかった。３つの事例において、ＲＮＡの抽出は製造者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）に従って行われた。ＫＰ腫瘍を有する肺をポリトロンホモジナイザを用いて抽出前に消化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００プラットフォームでＢａｒｔｓ及びＬｏｎｄｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｒｅによって、ＲＮＡ－Ｓｅｑを行った。
プラセボ又は２９Ｐのいずれかで処理されたＫＰ腫瘍を有する凍結肺からＲＮＡを抽出し、プラセボ又は２９のいずれかでＫＰ細胞を処理し、ＭＬＥＣを２９で処理するか、又は処理しなかった。３つの事例において、ＲＮＡの抽出は製造者の説明書（Ｑｉａｇｅｎ、Ｍａｎｃｈｅｓｔｅｒ、ＵＫ）に従って行われた。ＫＰ腫瘍を有する肺をポリトロンホモジナイザを用いて抽出前に消化した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００プラットフォームでＢａｒｔｓ及びＬｏｎｄｏｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｃｅｎｔｒｅによって、ＲＮＡ－Ｓｅｑを行った。
【0120】
倫理規定
全ての手順は、所属する機関の動物倫理委員会、ロンドンのＱｕｅｅｎ Ｍａｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認され、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅの規則に従って実行された。
全ての手順は、所属する機関の動物倫理委員会、ロンドンのＱｕｅｅｎ Ｍａｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認され、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ Ｈｏｍｅ Ｏｆｆｉｃｅの規則に従って実行された。
【0121】
統計解析
別段の指示がない限り、データは、個々の動物を単一のデータ点としてプロットすることによって示され、バーは平均を示し、エラーバーは平均の標準誤差を示す。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。最初に分布の正規性についてデータを評価した。正規分布するデータを有する２つの群の比較については、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用し、分布が正規でないデータについては、マン・ホイットニー検定を使用した。２つを超える群の比較については、正規分布するデータについては一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、正規分布していないデータについては、クラスカル・ウォリスを使用した。図の凡例に別段の指示がない限り、全ての平均を互いに比較した。多重比較のための事後検定を用いてＰ値を調整した。カイ二乗検定を使用して、観察された組織学的腫瘍グレードを比較し、マンテル・コックスを使用して、生存の差を評価した。ｐ＜０．０５であれば、平均の差を統計学的に有意とみなした。使用された個々の検定及びｎ個数は、各図の凡例に示されている。
別段の指示がない限り、データは、個々の動物を単一のデータ点としてプロットすることによって示され、バーは平均を示し、エラーバーは平均の標準誤差を示す。全てのデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して分析した。最初に分布の正規性についてデータを評価した。正規分布するデータを有する２つの群の比較については、対応のない両側スチューデントｔ検定を使用し、分布が正規でないデータについては、マン・ホイットニー検定を使用した。２つを超える群の比較については、正規分布するデータについては一元配置又は二元配置ＡＮＯＶＡを使用し、正規分布していないデータについては、クラスカル・ウォリスを使用した。図の凡例に別段の指示がない限り、全ての平均を互いに比較した。多重比較のための事後検定を用いてＰ値を調整した。カイ二乗検定を使用して、観察された組織学的腫瘍グレードを比較し、マンテル・コックスを使用して、生存の差を評価した。ｐ＜０．０５であれば、平均の差を統計学的に有意とみなした。使用された個々の検定及びｎ個数は、各図の凡例に示されている。
【0122】
例１－ＫｒａｓＬＳＬ－Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌ／ｆｌマウス中の肺がんは、血管コ－オプション成長パターンを示し、抗ＶＥＧＦＲ２療法に応答しない
肺がんに対する２９Ｐ処置による血管調節の効果を調べるために、まず、本発明者らは、腫瘍を有するＫｒａｓＬＳＬ－Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌ／ｆｌ（ＫＰ）マウスにおける血管成長パターンを確定した。それぞれ肺実質及び内皮を染色するポドプラニン及びエンドムチンタンパク質発現の二重免疫蛍光分析は、ＫＰマウスが非血管新生性肺胞及び間質性腫瘍成長パターンを示すことを実証した。肺胞成長パターンは、肺胞内での腫瘍細胞成長を伴い、圧縮された間質腔及び血管をもたらすのに対して、間質性成長パターンは、肺胞内ではなく間質腔内での腫瘍細胞成長を特徴とする（図１Ａ）。さらなる結果では、間質性成長パターンを有する腫瘍の存在は、アデノウイルスＣｒｅ投与の６３～８４日後に増加し、間質性成長パターンと腫瘍進行の相関を示した。ポドプラニン及び内皮細胞マーカーＣＤ３１の二重免疫染色により、ヒト非小細胞肺がん試料における間質性成長の類似のパターンが明らかになり（図１Ｂ）、ＮＳＣＬＣ研究に対するＫＰマウスモデルの適合性が強調された。血管新生性血管成長ではなく腫瘍血管コ－オプションへの偏りが観察されたことと一致して、本発明者らは、抗ＶＥＧＦＲ２（ＤＣ１０１（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，３：９１－１０９，１９９５））抗体による腫瘍負荷ＫＰマウスの処置が、肺腫瘍病巣の数、全体的な腫瘍量又は１視野当たりの微小血管の数に有意な効果を及ぼさないことを見出した（図１Ｃ）。合わせると、これらのデータは、ＫＰ肺腫瘍の新血管新生がヒト非小細胞肺がんの新血管新生と同様であること、及びこれらが抗ＶＥＧＦＲ２抗体を使用した抗血管新生処置に対して応答しないことを示唆した。
肺がんに対する２９Ｐ処置による血管調節の効果を調べるために、まず、本発明者らは、腫瘍を有するＫｒａｓＬＳＬ－Ｇ１２Ｄ／＋；ｐ５３ｆｌ／ｆｌ（ＫＰ）マウスにおける血管成長パターンを確定した。それぞれ肺実質及び内皮を染色するポドプラニン及びエンドムチンタンパク質発現の二重免疫蛍光分析は、ＫＰマウスが非血管新生性肺胞及び間質性腫瘍成長パターンを示すことを実証した。肺胞成長パターンは、肺胞内での腫瘍細胞成長を伴い、圧縮された間質腔及び血管をもたらすのに対して、間質性成長パターンは、肺胞内ではなく間質腔内での腫瘍細胞成長を特徴とする（図１Ａ）。さらなる結果では、間質性成長パターンを有する腫瘍の存在は、アデノウイルスＣｒｅ投与の６３～８４日後に増加し、間質性成長パターンと腫瘍進行の相関を示した。ポドプラニン及び内皮細胞マーカーＣＤ３１の二重免疫染色により、ヒト非小細胞肺がん試料における間質性成長の類似のパターンが明らかになり（図１Ｂ）、ＮＳＣＬＣ研究に対するＫＰマウスモデルの適合性が強調された。血管新生性血管成長ではなく腫瘍血管コ－オプションへの偏りが観察されたことと一致して、本発明者らは、抗ＶＥＧＦＲ２（ＤＣ１０１（Ｒｏｃｋｗｅｌｌ，Ｐ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｄｉｆｆｅｒ．，３：９１－１０９，１９９５））抗体による腫瘍負荷ＫＰマウスの処置が、肺腫瘍病巣の数、全体的な腫瘍量又は１視野当たりの微小血管の数に有意な効果を及ぼさないことを見出した（図１Ｃ）。合わせると、これらのデータは、ＫＰ肺腫瘍の新血管新生がヒト非小細胞肺がんの新血管新生と同様であること、及びこれらが抗ＶＥＧＦＲ２抗体を使用した抗血管新生処置に対して応答しないことを示唆した。
【0123】
例２－２９Ｐ処置はＮＳＣＬＣ成長パターンを改変し、血管密度を増加させる
ＮＳＣＬＣ成長に対する２９Ｐ処置の効果を調べるために、腫瘍を負荷されたＫＰマウスを２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）で処置し、処置が開始された後４週間の実験終了点で腫瘍量及び腫瘍血管を評価した処理の開始点及び終了点は、この実験モデルを用いた以前の刊行物に従って選択された（２２～２４）。組織学的分析は、２９Ｐ処置が病巣の数又は腫瘍量に影響を及ぼさない（図２Ａ、図９Ｂ）が、間質性腫瘍成長パターンを有する病巣の百分率及び１視野当たりの腫瘍血管の総数の両方を増加させること（図２Ｂ）を示した。さらなる免疫蛍光分析により、血管密度は、肺胞成長パターンを有する病巣では２９Ｐ処置によって変化しないが、間質性腫瘍成長パターンを有する病巣では有意に増加されることが明らかになった（図２Ｃ）。腫瘍進行（図９Ｃ、Ｄ）又は血管成熟の指標であるαＳＭＡ陽性血管の百分率のいずれに対しても効果は観察されなかった（図９Ｅ）。さらに、インビトロでの２９Ｐによる処理は、インビボで与えられた用量と同等の低用量（０．２ｎＭ～２００ｎＭ）でＫＰ腫瘍細胞生存に対して有意な効果を及ぼさなかった（補足図９Ｆ）。機能レベルでは、２９Ｐ処置はまた、（１）灌流された血管の百分率の増加（図２Ｄ）、（２）ヘキスト色素の漏出によって検出される血管透過性に対する明らかな影響の不存在（図２Ｅ）、（３）Ｇｌｕｔ１染色によって評価される腫瘍低酸素の減少されたレベル（図２Ｆ）並びに（４）組織学的に評価されたＣＤ３＋細胞の数の増加及び、フローサイトメトリーによってＫＰ腫瘍においてＣＤ３＋であったＣＤ４５＋細胞浸潤の百分率の増加（図２Ｇ）ももたらした。
ＮＳＣＬＣ成長に対する２９Ｐ処置の効果を調べるために、腫瘍を負荷されたＫＰマウスを２９Ｐ（２５０μｇ／ｋｇ）で処置し、処置が開始された後４週間の実験終了点で腫瘍量及び腫瘍血管を評価した処理の開始点及び終了点は、この実験モデルを用いた以前の刊行物に従って選択された（２２～２４）。組織学的分析は、２９Ｐ処置が病巣の数又は腫瘍量に影響を及ぼさない（図２Ａ、図９Ｂ）が、間質性腫瘍成長パターンを有する病巣の百分率及び１視野当たりの腫瘍血管の総数の両方を増加させること（図２Ｂ）を示した。さらなる免疫蛍光分析により、血管密度は、肺胞成長パターンを有する病巣では２９Ｐ処置によって変化しないが、間質性腫瘍成長パターンを有する病巣では有意に増加されることが明らかになった（図２Ｃ）。腫瘍進行（図９Ｃ、Ｄ）又は血管成熟の指標であるαＳＭＡ陽性血管の百分率のいずれに対しても効果は観察されなかった（図９Ｅ）。さらに、インビトロでの２９Ｐによる処理は、インビボで与えられた用量と同等の低用量（０．２ｎＭ～２００ｎＭ）でＫＰ腫瘍細胞生存に対して有意な効果を及ぼさなかった（補足図９Ｆ）。機能レベルでは、２９Ｐ処置はまた、（１）灌流された血管の百分率の増加（図２Ｄ）、（２）ヘキスト色素の漏出によって検出される血管透過性に対する明らかな影響の不存在（図２Ｅ）、（３）Ｇｌｕｔ１染色によって評価される腫瘍低酸素の減少されたレベル（図２Ｆ）並びに（４）組織学的に評価されたＣＤ３＋細胞の数の増加及び、フローサイトメトリーによってＫＰ腫瘍においてＣＤ３＋であったＣＤ４５＋細胞浸潤の百分率の増加（図２Ｇ）ももたらした。
【0124】
まとめると、これらのデータは、２９Ｐ処置が、血管新生性成長ではなく血管コ－オプションを示す間質性成長パターンを示す腫瘍病変の数を特異的に増加させることによって腫瘍新血管新生を改変することを実証した。２９Ｐによる処置はまた、これらの腫瘍における血管密度を増加させ、これは血管灌流の増加、低酸素の低下及びＣＤ３＋細胞浸潤の増加に対応した。
【0125】
例３－２９Ｐ処置はＫＰマウスにおけるＮＳＣＬＣの免疫チェックポイント遮断及びシスプラチン処置を増強する
シスプラチンなどの白金をベースとした療法は、第一選択化学療法の一部であり、ＮＳＣＬＣ処置のための免疫療法と組み合わせても使用される（２５）。低酸素及び抗腫瘍免疫浸潤物の非存在は有効な免疫療法の主要な障害であり、２９Ｐ処置はこれらを改善したので、本発明者らは、２９Ｐ処置を化学療法剤／免疫療法剤と組み合わせることはそれらの有効性を増加させると仮定した。実際、本発明者らは、免疫療法（抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４抗体）、Ｃｉｓ６（シスプラチン６ｍｇ／ｋｇ）及び２９Ｐの多重組み合わせで処置されたＫＰマウスは、Ｃｉｓ６／２９Ｐ又はＣｉｓ６／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかで処置されたＫＰマウスと比較して、有意に低下した病巣数及び有意により低い腫瘍量を有することを見出した（図３Ａ）。重要なことに、同じ多重組み合わせ処置であるが、より低用量のシスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ、Ｃｉｓ３）を使用することも、Ｃｉｓ３／２９Ｐ又はＣｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４で処置されたマウスと比較して、マウスの生存率を有意に増加させながら、腫瘍量及び病巣数を低下させた（図３Ｂ及びＣ）。シスプラチンの用量を６から３ｍｇ／ｋｇに低下させると、シスプラチンの毒性副作用の問題が克服された。例えば、Ｃｉｓ６／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４による組み合わせ処置は、動物の体重を低下させ、リンパ球減少症を誘発し、腎機能障害を示す高いクレアチニンレベルを引き起こしたが、Ｃｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４及び２９Ｐによる処置は、体重、リンパ球数及びクレアチニンレベルをプラセボ又は単剤２９Ｐで処置されたマウスの体重、リンパ球数及びクレアチニンレベルに回復させた（図３Ｄ）。
シスプラチンなどの白金をベースとした療法は、第一選択化学療法の一部であり、ＮＳＣＬＣ処置のための免疫療法と組み合わせても使用される（２５）。低酸素及び抗腫瘍免疫浸潤物の非存在は有効な免疫療法の主要な障害であり、２９Ｐ処置はこれらを改善したので、本発明者らは、２９Ｐ処置を化学療法剤／免疫療法剤と組み合わせることはそれらの有効性を増加させると仮定した。実際、本発明者らは、免疫療法（抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４抗体）、Ｃｉｓ６（シスプラチン６ｍｇ／ｋｇ）及び２９Ｐの多重組み合わせで処置されたＫＰマウスは、Ｃｉｓ６／２９Ｐ又はＣｉｓ６／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体のいずれかで処置されたＫＰマウスと比較して、有意に低下した病巣数及び有意により低い腫瘍量を有することを見出した（図３Ａ）。重要なことに、同じ多重組み合わせ処置であるが、より低用量のシスプラチン（３ｍｇ／ｋｇ、Ｃｉｓ３）を使用することも、Ｃｉｓ３／２９Ｐ又はＣｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４で処置されたマウスと比較して、マウスの生存率を有意に増加させながら、腫瘍量及び病巣数を低下させた（図３Ｂ及びＣ）。シスプラチンの用量を６から３ｍｇ／ｋｇに低下させると、シスプラチンの毒性副作用の問題が克服された。例えば、Ｃｉｓ６／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４による組み合わせ処置は、動物の体重を低下させ、リンパ球減少症を誘発し、腎機能障害を示す高いクレアチニンレベルを引き起こしたが、Ｃｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４及び２９Ｐによる処置は、体重、リンパ球数及びクレアチニンレベルをプラセボ又は単剤２９Ｐで処置されたマウスの体重、リンパ球数及びクレアチニンレベルに回復させた（図３Ｄ）。
【0126】
２９Ｐが腫瘍をシスプラチン及び／又は抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体処置に対して増感させたかどうかを調べるために、本発明者らは、２９Ｐをシスプラチン又は単一免疫療法のいずれかと別々に組み合わせた。抗ＰＤ－１＋抗ＣＴＬＡ－４抗体による処置は腫瘍成長を低下させなかったが、以前に記載されているように（２３）、抗ＰＤ－１及び抗ＣＴＬＡ－４抗体と組み合わせた２９Ｐの投与は腫瘍病巣の数及び腫瘍量を低下させた（図３Ｅ）。２９Ｐ処置はまた、抗ＰＤ－１＋抗ＣＴＬＡ－４と一緒の２９Ｐよりも控え目な効果であるが、抗ＰＤ－１単独療法に対して腫瘍を増感させるのに十分であった（図１０Ａ）。２９Ｐの有用性をよりよく実証するために、本発明者らは、Ｃｉｓ６、Ｃｉｓ３及びＣｉｓ３／２９Ｐのいずれかで処置されたＫＰマウスにおける抗腫瘍有効性及び有害な副作用を比較した。結果は、Ｃｉｓ６処置が明確な抗腫瘍効果を有するが、マウスはより高いレベルの体重減少副作用を被ることを示している。しかしながら、Ｃｉｓ３／２９Ｐは、Ｃｉｓ６で得られるレベルと同様のレベルに抗腫瘍効果を改善するが、明らかな有害な体重減少副作用はない（図３Ｆ）。これは、２９Ｐがシスプラチンと組み合わせて腫瘍細胞の生存に直接影響を及ぼし得るかという疑問を提起した。これに対処するために、本発明者らは、インビトロ実験を行い、ヒト肺腺がん（Ａ５４９）又はマウス肺腺がん（ＫＰ）細胞のいずれかを、単独での又は２９Ｐと組み合わせた漸増濃度のシスプラチンで処理した。ＭＴＳ細胞生存アッセイを使用して、本発明者らは、シスプラチン細胞毒性が２９Ｐ添加に非依存的であることを見出し、２９Ｐがシスプラチンの抗腫瘍効果を直接変化させないことを示唆した（図１０Ｂ）。合わせると、これらのデータは、２９Ｐによるインビボ処置が、副作用を軽減させながら、免疫療法と組み合わせたシスプラチンの有効性を改善し、ＮＳＣＬＣにおける免疫療法の治療効果を増加させる可能性のある機会を提供することを確立した。
【0127】
例４－２９Ｐによる処置は免疫抑制性腫瘍を免疫許容性腫瘍に切り替える
次に、本発明者らは、組み合わせ処置において見られた増強された治療効果の基礎を成す機序をさらに調査したいと考えた。２９Ｐ単独の効果と同様に、Ｃｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体と２９Ｐとの４重の組み合わせ、又は抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４免疫療法と２９Ｐとの３重の組み合わせで処置されたＫＰマウス中の腫瘍は、間質性成長パターンを有する腫瘍の百分率の増加を示した（図４Ａ）。この処置はまた、プラセボ又は抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体単独のいずれかで処置されたマウスと比較して、血管密度を増大させ、腫瘍低酸素を低下させた（図４Ｂ）。
次に、本発明者らは、組み合わせ処置において見られた増強された治療効果の基礎を成す機序をさらに調査したいと考えた。２９Ｐ単独の効果と同様に、Ｃｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体と２９Ｐとの４重の組み合わせ、又は抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４免疫療法と２９Ｐとの３重の組み合わせで処置されたＫＰマウス中の腫瘍は、間質性成長パターンを有する腫瘍の百分率の増加を示した（図４Ａ）。この処置はまた、プラセボ又は抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体単独のいずれかで処置されたマウスと比較して、血管密度を増大させ、腫瘍低酸素を低下させた（図４Ｂ）。
【0128】
他方、本発明者らは、抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４で処置されたマウス又はアイソタイプで処置されたマウスと比較して、抗ＰＤ－Ｌ１／抗ＣＴＬＡ－４及び２９Ｐの組み合わせで処置されたＫＰ腫瘍中でＰＤ－Ｌ１タンパク質の増加したレベルを観察した（図４Ｃ）。
【0129】
免疫排除した「非炎症型（ｃｏｌｄ）」腫瘍を、炎症を起こした「炎症型（ｈｏｔ）」腫瘍に切り替える、腫瘍中の浸潤Ｔ細胞の数を増強する戦略は、免疫療法がその可能性を実現するために必要であると広く考えられているので、現在のがん研究における主要な目標である（２）。面白いことに、本発明者らは、２９Ｐで処置されたＫＰマウスにおける間質性成長パターン、血管密度の増強及び低酸素の低下に対する効果が、Ｃｉｓ３のみとの組み合わせ又はＣｉｓ３／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体との組み合わせにおいて、ＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤の増加と相関することを見出した（図５Ａ）。Ｃｉｓ３の非存在下において、ＫＰマウスの２９Ｐ／抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体での組み合わせ処置もＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞腫瘍浸潤を増強し、免疫排除した腫瘍を、炎症を起こした腫瘍に切り替えた（図５Ｂ）。ポドプラニン、エンドムチン及びＣＤ３について三重免疫蛍光染色を行って、本発明者らは、ＣＤ３＋細胞浸潤が間質性成長パターンを有する病巣において有意に増強されることを示し（図１１Ａ）、２９Ｐによって誘導される増強された新血管新生が「非炎症型」腫瘍を「炎症型」腫瘍に切り替えることに関連することを示唆する。
【0130】
フローサイトメトリーによるＫＰ腫瘍負荷肺細胞懸濁液全体の検査により、シスプラチン処置は、腫瘍関連マクロファージの低下にもかかわらず、Ｔ細胞（ＣＤ４＋及びＣＤ８＋）及び骨髄細胞（Ｇｒ１＋、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞、単球）数を増加させることが特定された。低用量シスプラチン（Ｃｉｓ３）及び２９Ｐによる組み合わせ処置は、ＣＤ３＋細胞数、特に制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を低下させたのに対して、ＣＤ８＋細胞数の低下は観察されず、Ｔｒｅｇｓ：ＣＤ８＋細胞の比率が低いことを示した。さらに、活性化されたＣＤ８＋細胞（ＣＤ８＋ＣＤ４４＋ＣＤ６２－）の数は、組み合わされたＣｉｓ３／２９Ｐ処置後に増加した（図５Ｃ）。Ｃｉｓ３／２９Ｐ処置後のマウスでは、樹状細胞及びナチュラルキラー細胞の数は、Ｃｉｓ６単独と比較して影響を受けなかったが、Ｇｒ１＋好中球及び単球は減少した（図５Ｃ）。
【0131】
全体として、２９ＰでのＫＰマウスの処置は、シスプラチン処置によって誘導された阻害性免疫細胞を枯渇させ、ＣＤ８＋細胞の比較的より高い活性化をもたらし、免疫許容性の「炎症型」腫瘍微小環境を生成した。
【0132】
例６－２９Ｐ処置後の増強された免疫療法有効性はＶＥＧＦＲ２によって媒介される血管新生に依存する
本発明者らはまた、間質性成長パターンを有する腫瘍における２９Ｐ処置後の増加された血管数の分子的基礎を調査した。本発明者らの以前の研究は、低用量ＲＧＤ模倣物質による処置がＶＥＧＦＲ２によって媒介される血管新生を増強することを示した（２６）。本例で、本発明者らは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤ＤＣ１０１と組み合わせた２９Ｐによる処置が、腫瘍病巣の数、腫瘍量及び血管密度の低下をもたらしたことを示す。この効果は、間質性成長パターンを有する腫瘍では非常に明白であったが、肺胞成長パターンを有する腫瘍では本質的に存在しなかった。このデータは、肺胞成長パターンを有する腫瘍が２９Ｐによる血管調節に対して抵抗性であること、及び２９Ｐの効果がＶＥＧＦＲ２依存性であることを示唆している（図６Ａ）。
本発明者らはまた、間質性成長パターンを有する腫瘍における２９Ｐ処置後の増加された血管数の分子的基礎を調査した。本発明者らの以前の研究は、低用量ＲＧＤ模倣物質による処置がＶＥＧＦＲ２によって媒介される血管新生を増強することを示した（２６）。本例で、本発明者らは、ＶＥＧＦＲ２阻害剤ＤＣ１０１と組み合わせた２９Ｐによる処置が、腫瘍病巣の数、腫瘍量及び血管密度の低下をもたらしたことを示す。この効果は、間質性成長パターンを有する腫瘍では非常に明白であったが、肺胞成長パターンを有する腫瘍では本質的に存在しなかった。このデータは、肺胞成長パターンを有する腫瘍が２９Ｐによる血管調節に対して抵抗性であること、及び２９Ｐの効果がＶＥＧＦＲ２依存性であることを示唆している（図６Ａ）。
【0133】
ＲＮＡ－ｓｅｑ分析により、２９Ｐでインビトロ処理された内皮細胞が、ＤＮＡ複製及び細胞周期転写物の上方制御（Ｒｅａｃｔｏｍｅ ＤＮＡ Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ Ｍｉｔｏｔｉｃ ａｎｄ Ｒｅａｃｔｏｍｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔを参照）並びに細胞外マトリックス形成に関連する転写物の下方制御（Ｎａｂａ Ｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｓｏｍｅ、Ｎａｂａ Ｂａｓｅｍｅｎｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ、ＫＥＧＧ Ｆｏｃａｌ Ａｄｈｅｓｉｏｎを参照）を示したことが特定され、これらは全て血管新生の増強に関与するプロセスである。インビボにおいて、ピクロシリウスレッド分析により、２９Ｐ処理後のコラーゲン組織化の低下が同定され、インビトロでのＥＣＭ転写物シグネチャーの低下を連想させる。さらに、２９Ｐ処理は、インビボで、増殖する内皮細胞のレベルも有意に増強した（図６Ｂ）。２９Ｐ処置後、Ｋｉ６７陽性内皮細胞の数は、肺胞パターンを有するものと比較して、間質性成長パターンを有する腫瘍において有意により高かった（図６Ｃ）。簡潔には、２９Ｐは、間質性成長パターンを有する腫瘍において優先的にＶＥＧＦＲ２依存性血管新生を誘導し、肺胞成長パターンを有する腫瘍においては誘導しない。
【0134】
例７－２９Ｐ処置は、インビボで、ＫＰ腫瘍において抗腫瘍免疫効果を誘導する
本発明者らはまた、インビボでの２９Ｐ処置によってどのような他の分子変化が誘導されるかを調査した。以前の研究は、ＣＸＣＬ９及びＩＮＦ－γ関連遺伝子がＮＳＣＬＣにおける抗腫瘍免疫応答の予測因子であることを示している（２７）。さらに、ＩＦＮ－γ関連ｍＲＮＡプロファイルは、メラノーマなどのいくつかのがんにおけるＰＤ－１遮断に対する臨床応答を予測することができる（２８）。ＣＸＣＬ９は、腫瘍内へのＴ細胞浸潤を促進する走化性ケモカインであり、ＩＦＮ－γによって誘導される（２９）。
本発明者らはまた、インビボでの２９Ｐ処置によってどのような他の分子変化が誘導されるかを調査した。以前の研究は、ＣＸＣＬ９及びＩＮＦ－γ関連遺伝子がＮＳＣＬＣにおける抗腫瘍免疫応答の予測因子であることを示している（２７）。さらに、ＩＦＮ－γ関連ｍＲＮＡプロファイルは、メラノーマなどのいくつかのがんにおけるＰＤ－１遮断に対する臨床応答を予測することができる（２８）。ＣＸＣＬ９は、腫瘍内へのＴ細胞浸潤を促進する走化性ケモカインであり、ＩＦＮ－γによって誘導される（２９）。
【0135】
プラセボ対照と比較して、２９Ｐで処置されたマウス由来の、ＫＰ腫瘍を有する肺は、免疫応答に関与するＲＮＡ転写物シグネチャーの上方制御を示した。２９Ｐ処置は、ＣＸＣＬ１３及びその受容体ＣＸＣＲ５を含む免疫原性サイトカイン及びそれらの受容体、並びにＴ細胞遊走に関与するケモカイン：ＣＣＬ５、ＣＸＣＬ９、ＣＣＬ１０及びそれらの受容体ＣＸＣＲ３（ＣＸＣＬ１３の受容体でもある）などのサイトカイン－サイトカイン受容体相互作用に関連する経路を含む経路を濃縮した。インターフェロン－γシグナル伝達経路などの他の細胞傷害性経路も、２９Ｐ処置後に有意に上方制御された。興味深いことに、ＩＬ１８（インターフェロン誘導因子としても知られる）もまた、２９Ｐ処置後に上方制御される。これらのデータを裏付けるように、インビトロで２９Ｐで処理された内皮細胞は、インターフェロン（ＩＦＮ－Ｉ、ＩＦＮ－γ）経路成分（Ｉｆｒ５、Ｉｆｉｔ２、Ｇｂｐ２、Ｍｘ１、Ｒｎａｓｅｌ、Ｓｔａｔ２、Ｘａｆ１、Ｉｆｉｔｍ３、Ｏａｓ３、Ｉｆｉ３５、ｌｓｇ１５、Ｏａｓ２、Ｐｓｍｂ８、Ｉｒｆ１、Ｉｆｉｔ１、Ｉｆｉｔ３、Ｓｔａｔ１、ｌｓｇ２０、Ｕｓｐ１８）の上方制御も示した。２９Ｐ処理は、血管壁における白血球遊出及び細胞表面受容体についてのリアクトーム（ｒｅａｃｔｏｍｅ）の有意な濃縮も誘導した。合わせると、これらのデータは、２９Ｐが増強された抗腫瘍免疫応答と相関する分子的変化を誘導し、本発明者らが本研究で記載した抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４処置の増強された有効性についての可能性のある説明を提供することを示唆している。
【0136】
重要なことに、２９Ｐ処置されたマウスの腫瘍を有する肺由来の上方制御されたＲＮＡシグネチャーと免疫応答性ヒトがん由来の上方制御された転写物シグネチャーとの比較（３０）により、全てＴ細胞浸潤の主要なメディエーターであるＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ８及びＣＣＬ５が一般に上方制御されることが特定され、免疫療法を増強する上での２９Ｐ処置の臨床的妥当性を示唆する。
【0137】
例８－２９Ｐによって誘導される腫瘍の増感は、Ｔ細胞、ＩＬ－１８、ＩＦＮ－γ及びＣＸＣＬ９依存性である
本発明者らは、増加したＣＤ８＋細胞並びにＩＬ－１８、ＩＮＦγ及びＣＸＣＬ９レベルが、２９Ｐ処置によって誘導される免疫療法の増強された有効性において鍵となる機能的関連性を有すると仮定した。これを調査するために、本発明者らは、本発明者らの既存の治療レジメンと組み合わせてこれらの成分のそれぞれを枯渇させる一連の実験を行った。抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体と２９Ｐの三重の組み合わせで処置されたＫＰマウスへの抗ＣＤ８α抗体の投与によるＣＤ８＋細胞枯渇は処置効果を失わせ、マウスは、プラセボ処置群と同様に、病巣数、腫瘍面積又は腫瘍量の低下を示さなかった（図７Ａ）。同様に、Ｃｉｓ６と２９Ｐの組み合わせ処置は、抗ＣＤ８α抗体を使用してＣＤ８＋細胞集団を除去すると、もはや、ＫＰ腫瘍病巣の数、腫瘍面積又は腫瘍量の低下をもたらさなかった（図７Ｂ）。したがって、腫瘍成長の制御においてシスプラチンと２９Ｐの組み合わせで観察された効果は、より高いレベルの活性化されたＣＤ８＋細胞を有する免疫許容性腫瘍微小環境の促進を原因とする可能性が高い。
本発明者らは、増加したＣＤ８＋細胞並びにＩＬ－１８、ＩＮＦγ及びＣＸＣＬ９レベルが、２９Ｐ処置によって誘導される免疫療法の増強された有効性において鍵となる機能的関連性を有すると仮定した。これを調査するために、本発明者らは、本発明者らの既存の治療レジメンと組み合わせてこれらの成分のそれぞれを枯渇させる一連の実験を行った。抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体と２９Ｐの三重の組み合わせで処置されたＫＰマウスへの抗ＣＤ８α抗体の投与によるＣＤ８＋細胞枯渇は処置効果を失わせ、マウスは、プラセボ処置群と同様に、病巣数、腫瘍面積又は腫瘍量の低下を示さなかった（図７Ａ）。同様に、Ｃｉｓ６と２９Ｐの組み合わせ処置は、抗ＣＤ８α抗体を使用してＣＤ８＋細胞集団を除去すると、もはや、ＫＰ腫瘍病巣の数、腫瘍面積又は腫瘍量の低下をもたらさなかった（図７Ｂ）。したがって、腫瘍成長の制御においてシスプラチンと２９Ｐの組み合わせで観察された効果は、より高いレベルの活性化されたＣＤ８＋細胞を有する免疫許容性腫瘍微小環境の促進を原因とする可能性が高い。
【0138】
ＩＦＮ－、ＩＬ－１８及びＣＸＣＬ９が免疫療法の抗腫瘍効果の決定的に重要なメディエーターであるという本発明者らのＲＮＡ配列決定データ分析をさらに裏付けるように、本発明者らが、抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４抗体及び２９Ｐ並びにＩＦＮ－γ又はＣＸＣＬ９を機能的に阻害する抗体の三重の組み合わせでＫＰ腫瘍負荷マウスを処置すると、動物はもはや免疫療法に応答せず、腫瘍量又は病巣の数の低下を示さなかった。三重処置に加えた抗ＩＬ－１８抗体による処置はなお病巣数の有意な低下をもたらしたが、全体的な腫瘍量はプラセボと比較して変化しなかった（図７Ｃ～Ｅ）。本発明者らは、中和抗体を使用してＣＸＣＬ９を除去すると、２９Ｐによって誘導される、Ｔ細胞浸潤に対する効果が損なわれることを実証する。抗ＰＤ－１／抗ＣＴＬＡ－４、２９Ｐ及び抗ＣＸＣＬ９の組み合わせで処置された腫瘍は、ＣＤ８＋が異なる肺腫瘍病変の周辺に留まる免疫排除表現型を示し、２９Ｐ処置後の腫瘍のコアへのＣＤ８＋の遊走におけるＣＸＣＬ９の重要な機能を示している（図７Ｃ）。総合すると、これらのデータは、２９Ｐによる処置が、２９Ｐ処置によって調節される免疫療法の増加した有効性に機能的に関連するＩＬ－１８、ＩＦＮ－γ及びＣＸＣＬ９のレベルを増加させるという強力な証拠を提供する。
【0139】
考察
ＰＤＬ１又はＣＴＬＡ－４抗体を含む、肺がんにおける免疫療法を使用する臨床試験は、これが極めて有望な第一選択であり、腫瘍細胞においてＰＤ－Ｌ１の高い発現を有する患者において良好な結果をもたらすことを示している（Ｒｅｃｋら）。しかしながら、これは、診断された全患者の３０％未満に当てはまるに過ぎない。大部分の患者にとって、腫瘍微小環境の不均一性、特に浸潤する細胞傷害性Ｔ細胞の程度は、免疫療法に対する応答性の鍵となる決定因子である（３１）。
ＰＤＬ１又はＣＴＬＡ－４抗体を含む、肺がんにおける免疫療法を使用する臨床試験は、これが極めて有望な第一選択であり、腫瘍細胞においてＰＤ－Ｌ１の高い発現を有する患者において良好な結果をもたらすことを示している（Ｒｅｃｋら）。しかしながら、これは、診断された全患者の３０％未満に当てはまるに過ぎない。大部分の患者にとって、腫瘍微小環境の不均一性、特に浸潤する細胞傷害性Ｔ細胞の程度は、免疫療法に対する応答性の鍵となる決定因子である（３１）。
【0140】
本研究において、本発明者らは、血管促進戦略が免疫療法に対するこの固有の抵抗性を克服することができるかどうか、及びＮＳＣＬＣ腫瘍を処置に対してより感受性にすることを可能にするかどうかを調査した。これを調査するために、本発明者らは、ヒト疾患及び現在の治療に対して応答しない患者の集団の両方を密接に再現する、ゴールドスタンダードである遺伝子操作されたＫＰマウスモデルを使用した。ＮＳＣＬＣ患者における抗血管新生療法の使用は、なお議論されている。本発明者らが実証したように、ＫＰ腫瘍は大部分が血管新生性ではなく、代わりに血管コ－オプションモードで成長する。これらの腫瘍はまた、抗血管新生療法に対しても応答せず、これは、多くの患者が臨床においてＶＥＧＦＲ２阻害剤及び類似の薬物に対して応答しなかった理由を説明し得る。
【0141】
本発明者らは、ＫＰ腫瘍の大部分及び患者試料中にも見られる非血管新生性血管コ－オプション成長パターン（間質性及び肺胞）の静止状態の腫瘍脈管構造を調節した。ＲＧＤを模倣するヘキサペプチド２９Ｐを使用したこの戦略は、間質性パターンで成長するＫＰ腫瘍における新血管新生性の、ＶＥＧＦＲ２依存性機構で血管密度を増加させた。これらの腫瘍において促進された微細血管網は、より高い血管灌流をもたらし、低酸素の低下ももたらした。腫瘍塊の内側の低酸素ゾーンはＴ細胞を欠くが、低酸素の喪失はＴ細胞排除を逆転させることが以前に記載されている（４）。２９Ｐを使用して、本発明者らは、ＫＰ腫瘍内へのＴ細胞浸潤を促進し、それによって以前は免疫学的に「非炎症型」のＫＰ腫瘍を免疫チェックポイント遮断に対して増感させることができた。
【0142】
本研究では、本発明者らは、非血管新生性腫瘍中の腫瘍脈管構造を調節し、したがって静止状態の血管を標的とした。血管を流用する腫瘍は抗血管新生療法に対して抵抗性であるので、血管コ－オプションは抗血管新生に対する抵抗性の機序であると考えられている（１２）。本発明者らは、本研究において、血管新生促進アプローチが静止状態及び非血管新生性の腫瘍を標的とするのに有用であることを実証した。本発明者らは、２９Ｐを使用して、間質性成長パターンを有する腫瘍において新血管新生を促進することを実証し、間質性成長パターンでは抗ＶＥＧＦＲ２処置に対して増感されるようになるが、肺胞成長パターンでは増感されるようにならない。２９Ｐ処置後の増加した血管密度は、腫瘍低酸素の減少及び増加したＣＤ８＋細胞浸潤と相関し、したがって全て免疫療法の有効性の増強と相関する。
【0143】
並行して、ＲＮＡｓｅｑ分析を使用した本発明者らの結果は、機能的にも検証された、サイトカイン産生及びそれらの受容体に基づく機構を実証し、ＣＸＣＬ９－ＩＬ－１８－ＩＦＮシグナル伝達軸を中心に据える。Ｔ細胞遊走に関与するＣＸＣＬ９、及びＣＤ８＋細胞の細胞傷害能力に関連するＩＦＮ－γ、又はＩＦＮ経路は全て、２９Ｐによる処理後に内皮細胞において上方制御されることが見出された。これらのＲＮＡシグネチャーは、ヒトがん患者試料における治療に対する応答と相関し、ここでは、これらのＲＮＡシグネチャーは、化学療法及び免疫療法処置を２９Ｐと組み合わせた場合の治療に対する応答を予測した。
【0144】
したがって、本発明者らは、非血管新生性腫瘍を標的とするための新しい概念の原理の証明を提供し、この血管調節が免疫療法及び化学療法の有効性を高めるためにどのように有益であり得るかを提供した。本発明者らは、このアプローチが、非血管新生性肺転移又は肝臓若しくは脳への転移などの他の免疫学的に「非炎症型」及び非血管新生性の腫瘍に機能的に影響を及ぼし、様々ながんに対する処置の有効性を高める方法を提供すると考える。
【0145】
参考文献
【配列表フリーテキスト】
【0146】
配列表１ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表４ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表５ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表６ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表７ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表８ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表９ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１０ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１１ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１２ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表１４ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１５ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表１６ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表１７ ＜２２３＞合成ペプチド
配列表１８ ＜２２３＞合成ペプチド
配列表１９ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
配列表２０ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表２１ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞ヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表２２ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表２３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表２４ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２５ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２６ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２７ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２８ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２９ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３０ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３１ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３２ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３４ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３５ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３６ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３７ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３８ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表３９ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表４０ ＜２２３＞環状ペプチド
配列表４１ ＜２２３＞環状ペプチド
配列表４２ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
配列表４３ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表４４ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞ヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表４５ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表４６ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表４ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表５ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表６ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表７ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表８ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表９ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１０ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１１ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１２ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表１４ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表１５ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表１６ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表１７ ＜２２３＞合成ペプチド
配列表１８ ＜２２３＞合成ペプチド
配列表１９ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
配列表２０ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表２１ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞ヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表２２ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表２３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表２４ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２５ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２６ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２７ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２８ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表２９ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３０ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３１ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３２ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３３ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３４ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３５ ＜２２３＞合成ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３６ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３７ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表３８ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表３９ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表４０ ＜２２３＞環状ペプチド
配列表４１ ＜２２３＞環状ペプチド
配列表４２ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
配列表４３ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎメチル化
配列表４４ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞ヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
＜２２３＞メチルエステル（ＯＭｅ）部分
＜２２３＞Ｎ－メチル化
配列表４５ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
配列表４６ ＜２２３＞環状ペプチド
＜２２３＞Ｄ－アミノ酸
＜２２３＞Ｎ－メチル化
＜２２３＞２つのヘキシルオキシカルボニル（Ｈｏｃ）部分
【図1A】
【図1B】
【図1C】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図2D-G】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図4A】
【図4B-1】
【図4B-2】
【図5A-1】
【図5A-2】
【図5B-1】
【図5B-2】
【図5C-1】
【図5C-2】
【図6A-1】
【図6A-2】
【図6B】
【図6C】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D-1】
【図7D-2】
【図7E】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図9E】
【図9F】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【配列表】
【国際調査報告】