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▶ ニューミルナ セラピューティクス エーピーエスの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-08
(54)【発明の名称】マイクロＲＮＡ－２７ｂ阻害剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/113 20100101AFI20240301BHJP
A61K 31/712 20060101ALI20240301BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240301BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240301BHJP
A61P 25/08 20060101ALI20240301BHJP
【ＦＩ】
C12N15/113 Z ZNA
A61K31/712
A61K48/00
A61P25/00
A61P25/08
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023557673
(86)(22)【出願日】2022-03-28
(85)【翻訳文提出日】2023-11-01
(86)【国際出願番号】 EP2022058142
(87)【国際公開番号】W WO2022200633
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】PA202170146
(32)【優先日】2021-03-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DK
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523355791
【氏名又は名称】ニューミルナ セラピューティクス エーピーエス
(74)【代理人】
【識別番号】100079108
【弁理士】
【氏名又は名称】稲葉 良幸
(74)【代理人】
【識別番号】100109346
【弁理士】
【氏名又は名称】大貫 敏史
(74)【代理人】
【識別番号】100117189
【弁理士】
【氏名又は名称】江口 昭彦
(74)【代理人】
【識別番号】100134120
【弁理士】
【氏名又は名称】内藤 和彦
(72)【発明者】
【氏名】カウッピネン，マルカス サカリ
(72)【発明者】
【氏名】ハンセン，スタイン ノーマン
(72)【発明者】
【氏名】クリットガード，ヘンリク ヴァルデマー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA13
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA06
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA06
(57)【要約】
【課題】
てんかんおよび他の神経傷害が脳損傷の発生を引き起こす可能性が高いプロセスを特異的に標的とする、治療または防止モダリティが必要とされている。
【解決手段】
本発明は、ｍｉＲ－２７ｂの活性を強力に阻害することが可能な、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのような化合物は、神経疾患を含めたＣＮＳまたはＰＮＳの疾患を治療するための医薬品として有用である。
【選択図】なし
てんかんおよび他の神経傷害が脳損傷の発生を引き起こす可能性が高いプロセスを特異的に標的とする、治療または防止モダリティが必要とされている。
【解決手段】
本発明は、ｍｉＲ－２７ｂの活性を強力に阻害することが可能な、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。そのような化合物は、神経疾患を含めたＣＮＳまたはＰＮＳの疾患を治療するための医薬品として有用である。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｍｉＲ－２７ｂと相補的な、１８～１９ヌクレオチド長の配列を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、７～１４、例えば１０～１３の親和性増強性ヌクレオチド類似体を有し、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーであり、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項2】
配列番号３と相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項3】
配列番号４を含む、請求項１または２に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項4】
１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、請求項１から３までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項5】
１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、前記ミックスマーのヌクレオシドの５０～７０％がＬＮＡである、例えば５２～６８％がＬＮＡ、例えば少なくとも５０％がＬＮＡ、例えば少なくとも５２％がＬＮＡである、請求項１から４までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項6】
各末端の２つの末端ヌクレオチドがＬＮＡである、請求項１から５までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項7】
ＬＮＡが、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、ＬＮＡシトシンが、５－メチルシトシンである、請求項１から６までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項8】
全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項9】
配列番号２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１のうちのいずれか１つである、請求項１から８までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項10】
（配列番号２２）５’ＡＧＡａｃＴＴａｉＣｃＡＣＴｇｔＧＡ３’（配列番号２０）５’ＡＧＡａｃＴＴａｇＣｃＡＣＴｇｔＧＡ３’
（配列番号１９）５’ＣＡｇａａＣＴｔａＧｃｃＡＣｔｇＴＧＡ３’
（配列番号１６）５’ＡＧａＡｃｔＴａｇＣｃａＣＴｇＴＧＡ３’
（配列番号１２）５’ＡＧａａＣＴｔＡＧｃＣａＣｔｇＴＧＡ３’
（配列番号８）５’ＡＧａＡｃｔＴＡｇｃＣａＣＴＧｔＧＡ３’
のうちのいずれか１つであり、大文字がＬＮＡであり、小文字がＤＮＡであり、大文字のＣがＬＮＡ５－メチルシトシンを示し、ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、「ｉ」がイノシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、請求項９に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項11】
ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーが、トリシクロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’環状エチル（ｃＥＴ）、ＵＮＡ、２’フルオロおよび立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）のいずれか１つであるヌクレオシドを１つまたは複数をさらに含む、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項12】
医薬としての使用のための、請求項１から１１までのいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項13】
使用が、ＣＮＳまたはＰＮＳのｍｉＲ－２７ｂ関連疾患を治療するためのものである、請求項１から１２に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物。
【請求項14】
使用が、神経性障害を治療するためのものである、請求項１から１３に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物。
【請求項15】
使用が、てんかんを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、請求項１から１４に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは組成物。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ヒトなどの哺乳動物におけるマイクロＲＮＡ－２７ｂ（ｍｉＲ－２７ｂ）の活性を阻害することが可能な新規の化合物および組成物に関する。具体的には、本発明は、てんかんおよび記憶障害を含めたＣＮＳ障害の治療に有用な、ヒトにおいてｉｎ ｖｉｖｏでｍｉＲ－２７ｂの活性をモジュレートすることが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物を提供する。
【背景技術】
【0002】
てんかんは、反復性の自発性発作を特徴とする重篤な慢性神経性障害であり、世界的に約５０００万人が影響を受けている。
【0003】
現在利用可能な抗てんかん薬では、一般には患者の３分の２で発作がコントロールされるが、基礎をなす病態生理にはおそらく効果がない。てんかん患者の残りの３分の１は、薬剤抵抗性であるか、または現在利用可能な薬物による重篤な副作用が生じている。
【0004】
薬物治療を受ける選択肢がない患者において発作を回避するための代替法は、ケトン食療法、脳外科手術、迷走神経または頭蓋内刺激である。
【0005】
症候性（後天性）てんかんの発達には、とりわけ、イオンチャネルおよび神経伝達物質受容体の発現の変更、シナプス再構築、炎症、グリオーシスならびにニューロン死が伴うと考えられている。しかし、細胞および分子機構に関する我々の理解は未だ不完全なままである。現在のところ、てんかんが引き起こされる可能性が高い脳損傷後の予防的治療（「抗てんかん」）は存在しない。同様に、てんかん重積状態（ＳＥ）に対する、または、脳損傷もしくはてんかんを引き起こす可能性が高い急性神経性傷害、例えば脳卒中、もしくは外傷を治療するための特定の神経保護治療は存在しない。
【0006】
最近のデータから、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）がてんかんを含めたいくつかの神経性障害の病態形成に極めて重要であることが示唆されている。ｍｉＲＮＡには、遺伝子発現の転写後調節を媒介する短い（約２２ｎｔ）内在性非コードＲＮＡのクラスが含まれる（Ambros, Nature, 2004 Sep 16; 431 (7006): 350-5；Bartel, 2009 Jan 23; 136 (2): 215-33）。
【0007】
成熟ｍｉＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの３’非翻訳領域（ＵＴＲ）に主に位置する部分的に相補的な標的部位にｍｉＲＩＳＣ複合体を方向づけることにより、ｍｉＲＩＳＣ複合体のガイド分子としての役割を果たし、ｍｉＲＩＳＣ複合体が標的部位に方向づけられた結果、標的の翻訳抑制および／またはｍＲＮＡ分解がもたらされる（van Rooij & Kauppinen EMBO Mol Med, 2014 Jul; 6 (7): 851-64）。ｍｉＲＮＡ標的認識をガイドする重要な決定因子は、ｍｉＲＮＡシード領域（成熟ｍｉＲＮＡのヌクレオチド２～７）と、標的ｍＲＮＡ３’ＵＴＲ内の完全に相補的なシードマッチ部位との塩基対合である（Bartel, 2009 Jan 23; 136 (2): 215-33）。ＭｉｃｒｏＲＮＡ－２７ｂ（ｍｉＲ－２７ｂ）は、Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路の活性を調節することによっていくつかの神経性の状態に関与することが示されている。ＭｉＲ－２７ｂアンタゴミルにより、ＩＣＨにより誘導されるＮｒｆ２／ＡＲＥ経路の活性化が促進され、そうでなければＩＣＨ後に見られる脂質過酸化、神経炎症、細胞死および神経学的欠損が低減した。ＰＣ１２細胞では、ｍｉＲ－２７ｂ阻害剤により、鉄誘導性酸化ストレス、炎症およびアポトーシスが減弱し、これらの効果はＮｒｆ２ノックダウンによって遮断された。これらの結果から、ｍｉＲ－２７ｂの阻害により、ＩＣＨにより誘導される脳損傷が緩和することが実証され、これは一部において、ｍｉＲ－２７ｂがＮｒｆ２／ＡＲＥ経路を調節することによって説明することができる。Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路の誘導は、てんかんの治療に有益であることが示されている。
【0008】
活性酸素種の産生および酸化ストレスの増大は、とりわけ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、フリードライヒ運動失調症、多発性硬化症、および脳卒中を含めた多数の神経変性状態の病態形成に関係づけられている。内在性抗酸化物質応答経路は、細胞保護酵素の発現を増大させることによって細胞を酸化ストレスから保護するものであり、転写因子である核因子赤血球系２関連因子２（ＮＲＦ２）によって調節される。抗酸化物質遺伝子の発現を調節することに加えて、ＮＲＦ２は、抗炎症効果を発揮し、また、ミトコンドリアの機能と生合成の両方をモジュレートすることも示されている。ミトコンドリア機能不全および神経炎症は多くの神経変性疾患の特色であり、これにより、神経変性疾患を治療するためのＮＲＦ２の有望な治療薬標的としての潜在性が強調される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0009】
要約すると、てんかんおよび他の神経傷害が脳損傷の発生を引き起こす可能性が高いプロセスを特異的に標的とし、上記の問題のいくつかを克服する、改善された治療または防止モダリティが依然として必要とされている。
【0010】
ｍｉＲ－２７ｂ活性の改変が有益である疾患の治療における使用のための、ｍｉＲ－２７ｂを標的とする強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド化合物が市場において必要とされている。本発明は、ｍｉＲ－２７ｂと相補的な、新規の非常に強力なアンチセンスオリゴヌクレオチド、有効投薬量のアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば配列番号５～２２のうちのいずれか１つを含む、医薬組成物を含めた組成物、および、ｍｉＲ２７ｂのモジュレーションが有益である疾患を治療するための、そのような組成物の使用を提供する。前記ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、および医薬組成物を含めたそのようなアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む組成物はｍｉＲ－２７ｂの強力な阻害剤であり、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで使用されると、Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路のアップレギュレーションを引き起こす。一部の実施形態では、化合物、医薬組成物などの組成物を使用して治療される疾患は、Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路のアップレギュレーションが有益である疾患である。一部の実施形態では、治療される疾患は、神経疾患などのＣＮＳの疾患である。
【課題を解決するための手段】
【0011】
ある態様によると、本発明は、１８～１９核酸塩基長の配列を含む、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド（配列番号１）であって、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーであり、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有せず、１～１８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【0012】
別の態様によると、本発明は、有効投薬量の本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｍｉＲ－２７ｂ阻害組成物に関する。
【0013】
別の態様によると、本発明は、有効投薬量の本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、ならびに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物に関する。
【0014】
別の態様によると、本発明は、本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドが唯一の活性医薬成分である、医薬組成物に関する。
【0015】
別の態様によると、本発明は、医薬としての使用のための、本発明によるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号５～２２のうちのいずれか１つの使用に関する。
【0016】
好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８を含む。
【0017】
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１２を含む。
【0018】
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６を含む。
【0019】
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１９を含む。
【0020】
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２０を含む。
【0021】
別の好ましい実施形態では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号２２を含む。
【0022】
別の態様によると、本発明は、本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明および／または実施形態による組成物を使用することによって本発明および／または実施形態による疾患を治療するための方法に関する。
【0023】
別の態様によると、本発明は、本発明および／または実施形態によるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明および／または実施形態による組成物を使用することによって本発明および／または実施形態による疾患を診断する方法に関する。
【0024】
上述の疾患の多くは十分には治療することができず、かつ／または、現在利用可能な治療は、重篤な副作用を引き起こすものであるので、本発明の化合物の必要性がある。
【発明を実施するための形態】
【0025】
本発明の実施形態の記載では、明瞭にするために特定の用語法に依拠する。しかし、本発明は、そのように選択された特定の用語に限定されるものではなく、特定の用語それぞれが、同様の目的を実現するために同様に機能する全ての技術的等価物を包含することが理解される。
【0026】
「治療有効量」または「有効量」または「有効用量」という用語は、治療剤を必要とする個体に対して所望の治療効果をもたらす治療剤の量を指す。有効量は、治療を受ける個体の健康および身体の状況、治療を受ける個体の分類群、組成物の製剤、投与方法、個体の医学的状態の評定、および他の関連性のある因子に応じて個体の間で変動し得る。
【0027】
「治療」という用語は、所与の疾患を部分的にまたは完全に治癒させる、またはその疾患の１つもしくは複数の症状もしくは特徴を低減させる、本明細書ではアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む治療用医薬のあらゆる投与を指す。
【0028】
「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、本発明による抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチドを含む化合物を指す。一部の実施形態では、化合物は、本発明のオリゴヌクレオチドとは別に他のエレメントを含み得る。そのような他のエレメントは、非限定的な例では、オリゴヌクレオチドとコンジュゲートしたまたは他のやり方で結合させた送達ビヒクルであり得る。
【0029】
「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸の対応する領域またはセグメントとのハイブリダイゼーションを可能にする核酸塩基配列を有する一本鎖オリゴヌクレオチドを意味する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、「ミックスマー」であることが好ましい。
【0030】
「ミックスマー」は、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドなどのヌクレオシド類似体が混在するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマー）であり、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡｓｅＨなどのＲＮＡｓｅを動員し得る複数のヌクレオシドを有する内部領域（例えば、少なくとも６または７つのＤＮＡヌクレオチドの領域など）を含まず、内部領域を構成するヌクレオシドは、外部ウイングを構成するヌクレオシドまたはヌクレオシドとは化学的に別個のものである。
【0031】
「ヌクレオシド類似体」は、例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid. Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213に記載されており、適切かつ好ましいヌクレオシド類似体の例は、これによって参照により組み込まれるＷＯ２００７０３１０９１に提示されている。
【0032】
「５－メチルシトシン」は、５’位に付着したメチル基で修飾されたシトシンを意味する。５－メチルシトシンは修飾核酸塩基である。
【0033】
「２’－Ｏ－メトキシエチル」（２’－ＭＯＥおよび２’－Ｏ（ＣＨ２）２－ＯＣＨ３とも称される）は、フラノース環の２’位におけるＯ－メトキシ－エチル修飾を指す。
【0034】
「２’－ＭＯＥヌクレオシド」（２’－Ｏ－メトキシエチルヌクレオシドとも称される）は、２’－ＭＯＥ修飾された糖部分を含むヌクレオシドを意味する。
【0035】
「ロックド核酸」または「ＬＮＡ」は、接近不可能なＲＮＡと称されることも多い、修飾ＲＮＡ核酸塩基である。ＬＮＡ核酸塩基のリボース部分が、２’酸素と４’炭素を接続する追加の架橋で修飾されている。ＬＮＡオリゴヌクレオチドでは、従来のＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドと比較して、その相補鎖に対する親和性の実質的な増大がもたらされる。一部の態様では、二環式ヌクレオシド類似体はＬＮＡヌクレオチドであり、したがって、これらの用語を互換的に使用することができ、そのような実施形態では、どちらも、リボース糖環のＣ２’とＣ４’の間にリンカー基（例えば、架橋など）が存在することを特徴とする。この状況で使用される場合、「ＬＮＡ単位」、「ＬＮＡ単量体」、「ＬＮＡ残基」、「ロックド核酸単位」、「ロックド核酸単量体」または「ロックド核酸残基」という用語は、二環式ヌクレオシド類似体を指す。ＬＮＡ単位は、とりわけ、ＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ０１／２５２４８、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ０３／００６４７５、ＷＯ２０１５０７１３８８、およびＷＯ０３／０９５４６７に記載されている。
【0036】
「ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡ」は好ましいＬＮＡバリアントである。
【0037】
「二環式核酸」または「ＢＮＡ」または「ＢＮＡヌクレオシド」は、ヌクレオシド糖単位の４’位と２’位の間に２つの炭素原子を接続する架橋を有し、それにより、二環式糖を形成した核酸単量体を意味する。そのような二環式糖の例としては、これだけに限定されないが、Ａ）ｐｔ－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡ，（Ｂ）Ｐ－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡ，（Ｃ）エチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＬＮＡ，（Ｄ）アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ）－２’）ＬＮＡおよび（Ｅ）オキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ）－Ｏ－２’）ＬＮＡが挙げられる。
【0038】
本明細書で使用される場合、ＬＮＡヌクレオチドとして、これだけに限定されないが、糖の４’位と２’位の間に少なくとも１つの架橋を有する化合物であって、架橋のそれぞれが独立に、２’酸素原子と４’炭素原子を接続する－［Ｃ（Ｒ～）（Ｒ２）］，，－、－Ｃ（Ｒ～）＝Ｃ（Ｒ２）－、－Ｃ（Ｒ～）＝Ｎ、－Ｃ（＝ＮＲＥＭ）－、－Ｃ（＝Ｏ）－、－Ｃ（＝Ｓ）－、－Ｏ－、－Ｓｉ（Ｒｉ）ｑ－、－Ｓ（＝Ｏ）－および－Ｎ（Ｒ＆）－（式中、ｘは０、１、または２であり、ｎは１、２、３、または４であり、各Ｒ＆およびＲ２は独立に、Ｈ、保護基、ヒドロキシル、Ｃ＞＞Ｃ＞＞アルキル、置換Ｃ＞＞（－ＣＨ２－）基である）から独立に選択される連結基を１つまたは２～４つ含み、メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡという用語が使用される、ヌクレオチドが挙げられる。
【0039】
さらに、この位置にエチレン架橋基を有する二環性糖部分の場合では、エチレンオキシ（４’－ＣＨ２ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡが使用される。メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＬＮＡの異性体であるｎ－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）も本明細書で使用されるＬＮＡの定義の範囲内に包含される。
【0040】
一部の実施形態では、ヌクレオシド単位は、ベータ－Ｄ－オキシ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌｏｘｙ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－アミノ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－アミノ－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－チオ－ＬＮＡ、アルファ－Ｌ－チオ－ＬＮＡ、５’－メチル－ＬＮＡ、ベータ－Ｄ－ＥＮＡおよびアルファ－Ｌ－ＥＮＡの一覧から選択されるＬＮＡ単位である。
【0041】
「ｃＥｔ」または「拘束エチル」は、４’炭素と２’炭素を接続する架橋を含む二環性糖部分を意味し、ここで、架橋は、式：４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’を有する。
【0042】
「拘束エチルヌクレオシド」（ｃＥｔヌクレオシドとも称される）は、４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’架橋を含む二環性糖部分を含むヌクレオシドを意味する。ｃＥｔおよびその特性のいくつかがPallan et al. Chem Commun (Camb). 2012, August 25; 48 (66): 8195-8197に記載されている。
【0043】
「トリシクロ（ｔｃ）－ＤＮＡ」は、ＤＮＡおよびＲＮＡに対する結合特性の増強を示す、立体配置が拘束されたＤＮＡ類似体のクラスに属する。構造および作製方法はRenneberg et al. Nucleic Acids Res. 2002 Jul 1; 30 (13): 2751-2757に見ることができる。
【0044】
本明細書で言及される「２’－フルオロ」は、糖環の２’位にフルオロ基を含むヌクレオシドである。２’－フッ素化ヌクレオチドは、Peng et al. J Fluor Chem. 2008 September; 129 (9): 743-766に記載されている。
【0045】
本明細書で言及される場合「２’－Ｏ－メチル」は、糖環の２’位に－ＯＣＨ３基を含む糖を含むヌクレオシドである。
【0046】
本明細書で言及される「立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）」およびそれらを合成するための方法は、これにより参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３０３６８６８に記載されている。ＣＲＮは、糖修飾されたヌクレオシドであり、ＬＮＡと同様に、リボースのＣ２’炭素とＣ４’炭素が化学架橋によって接続している。しかし、ＣＲＮでは、Ｃ２’－Ｃ４’架橋は、ＬＮＡ分子よりも炭素１つ長い。ＣＲＮではリボースの化学架橋によってリボースが固定位置にロックされ、それにより核酸塩基およびリン酸基の柔軟性が制限される。ＲＮＡに基づくまたはＤＮＡに基づくオリゴヌクレオチド内のＣＲＮ置換には、ハイブリダイゼーション親和性の増大およびヌクレアーゼ分解に対する抵抗性の増強という利点がある。
【0047】
本明細書で言及される「アンロックド核酸」または「ＵＮＡ」は、一般には、リボースのＣ２－Ｃ３のＣ－Ｃ結合が除去され、アンロックド「糖」残基が形成されたアンロックド核酸である（これにより参照により本明細書に組み込まれるFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039、およびSnead et al. Molecular Therapy-Nucleic Acids (2013) 2, e103；を参照されたい）。
【0048】
「標的領域」とは、１つまたは複数のアンチセンス化合物がターゲティングされる標的核酸の一部を意味する。
【0049】
「標的化送達」とは、本明細書で使用される場合、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、特定の組織もしくは細胞への効率的な送達が容易になるように製剤化されている、または、アンチセンスオリゴヌクレオチドが他のやり方で、例えば、標的化部分を含むように改変されている、もしくは、他のやり方で、特定の標的細胞への取り込みが容易になるように改変されている、送達を意味する。
【0050】
化合物
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ－２７ｂ（ｍｉＲ－２７ｂ）を標的とするように設計されたものである。
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、マイクロＲＮＡ－２７ｂ（ｍｉＲ－２７ｂ）を標的とするように設計されたものである。
【0051】
成熟配列５’ｕｕｃａｃａｇｕｇｇｃｕａａｇｕｕｃｕｇｃ３’（配列番号１）（ｍｉＲＢａｓｅ ａｃｃ番号ＭＩＭＡＴ００００４１９）を有するｍｉＲ－２７ｂの標的領域に対して特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドが設計されている。
【0052】
上記の「ｍｉＲＢａｓｅ」への言及はmiRBase release 22.1に従う。
【0053】
「ｍｉＲ－２７ｂ関連神経疾患」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患病態がｍｉＲ－２７ｂ活性のアップレギュレーションに関連付けられる、または疾患の治療のためにｍｉＲ－２７ｂ活性のダウンレギュレーションが有益になる疾患を意味する。
【0054】
一部の実施形態では、本発明は、５’ｕｃａｃａｇｕｇｇｃｕａａｇｕｕｃｕｇ３’（配列番号２）の一部または全体を標的とするように設計されたアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0055】
一部の実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも５’ｕｃａｃａｇｕｇｇｃｕａａｇｕｕｃｕ３’（配列番号３）を標的とするように設計されたものである。
【0056】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列５’ａｇａａｃｔｔａｇｃｃａｃｔｇｔｇａ３’（配列番号４）を含む。
【0057】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ａｇａａｃｔｔａｇｃｃａｃｔｇｔｇａ３’（配列番号４）を含む。
【0058】
一部の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ａｇａａｃｔｔａｇｃｃａｃｔｇｔｇａ３’（配列番号４）を含み、ミックスマーである。
【0059】
一部の実施形態では、ｍｉＲ－２７ｂを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列５’ａｇａａｃｔｔａｇｃｃａｃｔｇｔｇａ３’（配列番号４）を含み、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである。驚いたことに、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーであり、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドが、ｍｉＲ－２７ｂ活性をダウンレギュレートすることに関して特に強力であることが見いだされた。
【0060】
そのようなｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、５０～７０％のＬＮＡを含むＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーであり、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドを有さない場合に、それらの標的ｍｉＲ－２７ｂをダウンレギュレートすることに関して優れた効率を示す。
【0061】
一部の実施形態では、本発明は、１８～１９核酸塩基長の配列からなり、ミックスマーであり、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドの領域を含まず、７～１４の親和性増強性ヌクレオチド類似体を含む、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、１～１８のホスホロチオエートヌクレオチド間連結を含み、配列番号２～３のいずれかと相補的である、または、配列番号４を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【0062】
一部の実施形態では、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、５０～７０％のＬＮＡ、例えば５２～６８％のＬＮＡ、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ、例えば少なくとも５２％のＬＮＡを有するＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである。
【0063】
一部の実施形態では、上記の実施形態のいずれか１つによるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、各末端に２つの末端ＬＮＡヌクレオチドを有する。さらに、好ましい実施形態では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドに使用されるＬＮＡは、ベータ－Ｄ－オキシＬＮＡである。
【0064】
一部の好ましい実施形態では、全てのＬＮＡシトシンが５－メチルシトシンである、すなわち、配列表において、大文字のＣ全てがメチルＣである。
【0065】
ｉｎ ｖｉｖｏでの使用に関して、アンチセンスオリゴヌクレオチドの安定性には１つまたは複数のホスホロチオエート連結が有益である。一部の実施形態では、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合を含み、例えば、少なくとも１つの結合がホスホロチオエートである、または一部の場合では、オリゴヌクレオチドは完全なホスホロチオエート骨格を有する、すなわち、全てのヌクレオシド間連結がホスホロチオエート連結である。
【0066】
本発明者らは、一連のｍｉＲ－２７ｂと相補的な非常に強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定した。その全てが、上の実施形態で列挙した特色を有する。これらの化合物は表１に配列番号５～２２として列挙されている。これらの化合物の全てが好ましい。一部の実施形態では、配列番号８、１２、１６、１９、２０および２２のうちのいずれか１つを有する化合物が特に好ましい。
【0067】
表１に、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーであり、ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである配列番号５～２２を記載する。表１の全ての配列において、大文字のＣはメチルＣ（５－メチルシトシン）である。
【0068】
【表1】
【0069】
表１において、大文字はＬＮＡを示し、小文字はＤＮＡである。「ｉ」という文字はイノシンである。大文字のＣはＬＮＡ５－メチルシトシンである。全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である。
【0070】
一部の場合では、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーのＤＮＡヌクレオチドの１つまたは複数を、ＬＮＡ以外の親和性増強ヌクレオチドを含むように置き換えることにより、化合物に効力または他の特徴が付加される。
【0071】
一部の場合では、本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つまたは複数のＤＮＡヌクレオチドが、トリシクロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’環状エチル（ｃＥＴ）、ＵＮＡ、２’フルオロおよび立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）のうちのいずれか１つである１つまたは複数のヌクレオシドで置き換えられた、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである。
【0072】
組成物および使用
本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬としての使用のために十分に適する。さらに、本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｍｉＲ－２７阻害組成物が提供される。そのような組成物を、哺乳動物、例えばヒトにおいてＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導するために使用することができる。一部の好ましい実施形態では、医薬としての使用のためのｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、または阻害組成物に含まれるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５～２２のうちのいずれか１つである。
本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、医薬としての使用のために十分に適する。さらに、本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｍｉＲ－２７阻害組成物が提供される。そのような組成物を、哺乳動物、例えばヒトにおいてＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導するために使用することができる。一部の好ましい実施形態では、医薬としての使用のためのｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチド、または阻害組成物に含まれるｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号５～２２のうちのいずれか１つである。
【0073】
本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび組成物は、例えば、ｍｉＲ－２７ｂ活性の改変またはＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路の誘導が有益であるｍｉＲ－２７ｂ関連疾患を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためなど、医学的使用において大きな潜在性を示す。ＣＮＳまたはＰＮＳの疾患を含め、そのような疾患がいくつも同定されている。したがって、一部の実施形態では、本発明の抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチドは、ＣＮＳまたはＰＮＳのｍｉＲ－２７ｂ関連疾患を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである。
【0074】
一部の実施形態では、そのようなＣＮＳまたはＰＮＳ障害として、神経性障害、神経変性障害または神経発達障害が挙げられる。したがって、本発明の抗ｍｉＲ－２７ｂ化合物は、一部の実施形態では、神経性障害、神経変性障害、神経発達障害、遺伝障害および／または遺伝性神経発達障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである。
【0075】
Ｎｒｆ２／Ａｒｅ経路の誘導が、神経性障害、例えば、てんかん、または種々の状態のてんかんの治療に有益であることが示されている。一部の実施形態では、本発明の化合物は、てんかん、例えば、薬剤抵抗性てんかんまたはてんかんの発作またはてんかんの自発性発作または治療法抵抗性発作などの治療、緩和、先制治療または予防における使用のためのものである。一部の実施形態では、てんかんは焦点性てんかんであり、前記焦点性てんかんは、前頭葉、頭頂葉、後頭葉または側頭葉を焦点とするものであることが好ましい。一部の実施形態では、てんかんは全般てんかんであり、前記全般てんかんは、欠神、ミオクロニー発作、強直間代性発作、強直性発作、脱力発作、間代性発作および攣縮の中から選択されることが好ましい。一部の実施形態では、てんかんは、てんかん重積状態である。一部の実施形態では、てんかんは、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、徐波睡眠期持続性棘徐波を示すてんかん性脳症（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｉｋｅ－ａｎｄ－ｗａｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｌｏｗ ｓｌｅｅｐ）、ドラベ症候群、脳卒中後てんかん、てんかん性脳症、笑いてんかん、欠神、良性新生児発作、ジーボンス症候群、若年ミオクロニーてんかん、ランドウ・クレフナー症候群、レンノックス・ガストー症候群、内側側頭葉てんかん、ミオクロニー脱力発作を伴うてんかん、大田原症候群、パナイトポーラス症候群、ＰＣＤＨ１９症候群、中心側頭棘波をもつ良性小児てんかん、スタージ・ウェーバー症候群、症候性焦点性てんかん、一過性てんかん性健忘およびウエスト症候群の中から選択される。
【0076】
一部の実施形態では、配列番号５～２２のいずれかなどの本発明の化合物は、てんかんを、精神障害、認知障害、睡眠障害、心血管障害、呼吸器疾患、炎症性障害、精神障害、不安、疼痛、認知機能障害、うつ病、認知症、頭痛、片頭痛、心疾患、潰瘍、消化性潰瘍、関節炎および骨粗鬆症の中から選択される共存症と共に防止または予防または緩和または治療するためのものである。
【0077】
ｍｉＲ－２７ｂ阻害およびＮｒｆ２／ＡＲＥ経路の刺激による神経保護効果のエビデンスが存在し、したがって、有効投薬量の該化合物を含む本化合物および組成物は、海馬損傷などのニューロン損傷の防止または予防または先制治療または緩和または治療における使用のためのものである。
【0078】
一部の実施形態では、本発明の化合物および組成物は、酸化ストレス、炎症および／またはアポトーシスを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである。一部の場合では、化合物および組成物は、脳出血により誘導される脳損傷、虚血性脳卒中、出血性卒中または脳卒中を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するために使用するためのものである。
【0079】
一部の実施形態では、本発明による化合物は、自己免疫疾患、記憶障害、海馬硬化症、パーキンソン病、脱髄性疾患、多発性硬化症、脊髄損傷、急性脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症、運動失調、ベル麻痺、遺伝性神経疾患、シャルコー・マリー・トゥース、頭痛、ホートン頭痛、片頭痛、ピック病、進行性核上性麻痺、多系統変性、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、失語症、原発性進行性失語症またはその症状もしくは影響の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0080】
Ｎｒｆ２は、ＣＮＳにおいて遍在的に発現され、神経疾患の状態に関連する神経保護プロセスを活性化する。したがって、本発明の化合物は、ｍｉＲ－２７ｂを阻害し、その後、Ｎｒｆ２をアップレギュレートし、Ｎｒｆ２／ＡＲＥ経路を刺激することによって神経保護薬物として作用することが可能である。
【0081】
したがって、一部の実施形態では、本発明の化合物は、認知症、例えば、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症およびレビー小体認知症の中から選択される認知症の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0082】
一部の実施形態では、本発明による化合物は、疼痛、例えば、変形性関節症に付随する疼痛の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0083】
一部の実施形態では、本発明による化合物は、ｍｉＲ－２７ｂ活性のモジュレーションが有益である精神疾患、例えば、統合失調症、うつ病、双極性障害、注意欠陥多動性障害、自閉症、不安またはトゥレット症のいずれかの治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0084】
ｍｉＲ－２７ｂは、ある特定のがんの病態、例えば、血管新生プロセスに関与することが示されており、一部の実施形態では、本発明の化合物は、血管新生関連疾患の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0085】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、がん、例えば、非限定的な例として、中枢神経系のがん、神経膠腫、皮膚のがん、黒色腫、頭頸部がん、扁平上皮癌、好ましくは舌扁平上皮癌または口腔扁平上皮癌、血液のがん、好ましくは骨髄腫またはリンパ腫、より好ましくはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、甲状腺がん、甲状腺未分化がん、肝がん、肝細胞癌、胃がん、子宮頸がん、子宮体がん、血管腫、肺がん、膵がん、膀胱がん、前立腺がんおよび結腸直腸がん、例えば、結腸直腸がんの遊走および浸潤の群から選択されるがんのうちのいずれか１つの治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。一部の実施形態では、本発明の化合物は、がん転移の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0086】
プラダー・ウィリ症候群およびアンジェルマン症候群および関節炎の状態は、免疫炎症形質を有する。したがって、一部の実施形態では、本発明による化合物は、プラダー・ウィリ症候群またはアンジェルマン症候群、関節炎、変形性関節症の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0087】
ｍｉＲ－２７ｂは、ある特定の心臓の状態において過剰発現され、心不全の発生に関与する。一部の実施形態では、本発明の化合物は、これだけに限定されないが、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、術後心房細動、心不全および慢性心不全、脳内出血により誘導される脳損傷または脳卒中のうちのいずれか１つを含めた心血管障害の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0088】
ｍｉＲ－２７ｂ発現は、非アルコール性脂肪性肝疾患の発生を含めた肝臓の状態に関与することが示されている。本発明の化合物は、肝障害の治療、緩和、先制治療または予防における使用のためのものである。一部の実施形態では、肝障害は、非アルコール性脂肪肝、脂肪肝、脂肪肝線維症、肝線維症およびヘパトーマの中から選択される。
【0089】
肺サルコイドーシスは、患者のＰＢリンパ球においてｍｉＲ－２７ｂがアップレギュレートされていることを特徴とする。一部の実施形態では、本発明の化合物は、自己免疫疾患、肉芽腫性疾患、結合組織病またはサルコイドーシス、または肺障害の治療、緩和、好転、先制治療または予防のためのものである。一部の実施形態では、肺障害は、肺サルコイドーシスである。
【0090】
一部の実施形態では、本発明の化合物は、感染症の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。一部の実施形態では、治療、緩和、好転、先制治療または予防的治療される感染症は、敗血症、髄膜炎および脳炎のいずれかである。一部の実施形態では、本発明による化合物は、ヘルペスウイルス感染症、ヒトパピローマウイルス感染症、サイトメガロウイルス感染症、または単純ヘルペスウイルス感染症のいずれかを含めたウイルス感染症の治療、緩和、好転、先制治療または予防のためのものである。
【0091】
ＭｉＲ－２７ｂは、血管新生、および加齢黄斑変性症を含めた網膜疾患の発生に関係づけられることが示されている。一部の実施形態では、本発明の化合物は、網膜の障害、例えば、網膜症、糖尿病性網膜症および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の一覧からのいずれか１つの治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0092】
ｍｉＲ－２７ｂは、インスリン抵抗性の発生およびグルコース代謝に関与し、したがって、糖尿病などの代謝障害に対する治療の標的である。一部の実施形態では、本発明の化合物は、糖尿病または２型糖尿病などの代謝障害の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0093】
ｍｉＲ－２７ｂは、ＮＦ１を標的とすることによって神経線維腫症の発生に関与する。一部の実施形態では、本発明の化合物は、１型神経線維腫症を含めた神経線維腫症の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のためのものである。
【0094】
本発明の化合物は、ｍｉＲ－２７ｂの強力な阻害剤であり、有効投薬量で、上記の疾患の治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のための有益な医薬である。一部の場合では、他の活性医薬化合物と組み合わせることにより、より良好な効果、例えば、改善された効果、例えば、相加効果または相乗効果がもたらされる。
【0095】
一部の実施形態では、配列番号５～２２のうちのいずれか１つなどの本発明の抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチド化合物は、これだけに限定されないが、神経性障害および精神障害を含めた上記の疾患のうちのいずれか１つの治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のために、別の医薬化合物と組み合わせて使用するためのものである。一部の実施形態では、本発明のｍｉＲ－１３４と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、実施形態に記載の疾患に対する、例えば、神経障害および精神障害を治療するための１種または複数種の他の治療法と組み合わせて使用するためのものである。一部の実施形態では、配列番号５～２２のうちのいずれか１つなどの本発明の抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチド化合物は、上記の疾患のうちのいずれか１つの治療、緩和、好転、先制治療または予防における使用のために、ｍｉＲ－１３４阻害剤またはアデノシンキナーゼ阻害剤またはその両方と組み合わせて使用するためのものである。
【0096】
一部の実施形態では、本発明による化合物を使用する治療法は、哺乳動物、例えばヒトにおけるＮｒｆ２／ＡＲＥ経路を誘導するものである。一部の実施形態では、化合物、使用、治療、緩和、好転、先制治療または予防は、ヒトなどの哺乳動物におけるものである。
【0097】
一部の実施形態では、抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチド化合物を唯一の活性医薬成分として含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、抗ｍｉＲ－２７ｂ化合物および薬学的に許容される担体を含む。
【0098】
医薬品の投与は、活性成分が標的組織によって有効投薬量で利用可能になるように最適な様式で行うことが重要である。ｍｉＲ－２７ｂは、ＣＮＳ、ＰＮＳおよび末梢器官の疾患についての関連性のある標的である。したがって、抗ｍｉＲ－２７ｂ化合物を投与する方法は、治療される疾患に応じて選択されるべきである。以下の実施形態に記載されているものを含め、薬物の投与方法の多くの選択肢が利用可能である。一部の実施形態では、本発明の抗ｍｉＲ－２７ｂ化合物を含む組成物、例えば医薬組成物は、皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与、脳内投与、くも膜下腔内投与または経口投与または脳または脳脊髄液中への直接投与のいずれか１つによる投与用である、または前記組成物は、インプラントとして投与される。
【0099】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、ポンプとしての投与用であり、前記ポンプがミニ浸透圧ポンプであることが好ましい。
【0100】
一部の実施形態では、本発明の医薬組成物は、脳室内カテーテルによって容易になる脳室内投与用であり、前記カテーテルはリザーバーに取り付けられていることが好ましく、前記リザーバーはオンマイヤーリザーバーであることが好ましい。
【0101】
本発明による医薬組成物は、有効投薬量で投与するためのものであり、有効投薬量を、前記組成物を１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、６０日間、６１日間、６２日間、６３日間、６４日間、６５日間、６６日間、６７日間、６８日間、６９日間、７０日間、７１日間、７１日間、７２日間、７３日間、７４日間、７５日間、７６日間、７７日間、７８日間、７９日間、８０日間、８１日間、８２日間、８３日間、８４日間、８５日間、８６日間、８７日間、８８日間、８９日間、９０日間、９１日間、９２日間、９３日間、９４日間、９５日間、９６日間、９７日間、９８日間、９９日間、１００日間、１０１日間、１０２日間、１０３日間、１０４日間、１０５日間、１０６日間、１０７日間、１０８日間、１０９日間、１１０日間、１１１日間、１１２日間、１１３日間、１１４日間、１１５日間、１１６日間、１１７日間、１１８日間、１１９日間または好ましくは１２０日間の間隔で投与するその後の投与によって維持することができる。
【0102】
一部の実施形態では、本発明による医薬組成物を、１～２００日間、１０～１９０日間、２０～１８０日間、３０～１７０日間、４０～１６０日間、５０～１５０日間、６０～１４０日間、７０～１３０日間、８０～１２０日間、９０～１１０日間または好ましくは約１００日間の間隔で投与する。
【0103】
ｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記の疾患を治療する方法において有用である。一部の実施形態では、配列番号５～２２のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上に列挙されているＣＮＳまたはＰＮＳ疾患の治療を含めた、上で列挙されている疾患を治療する方法における使用のためのものである。
【0104】
抗ｍｉＲ－２７ｂ化合物は、一部の場合では、上記の疾患の治療、先制治療、好転、緩和または予防における使用のための組成物、医薬組成物に含められ、ここで、治療は、防止的治療、治癒的治療または疾患修飾治療のいずれか１つである。
【0105】
上記の疾患のいくつかでは、疾患にかかっていない人と比較してｍｉＲ－２７が過剰発現される。そのような場合には、本発明のｍｉＲ－２７ｂと相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、疾患を診断する方法における使用のためのものである。
【0106】
投薬量
「有効投薬量」という表現は、所望の効果が実現される薬物の用量を指す。本発明に関しては、所望の効果は、ｍｉＲ－２７ｂの活性の低下である。ｍｉＲ－２７ｂの活性の低下は、例えば、ｍｉＲ－２７ｂもしくはｍｉＲ－２７ｂ前駆体の分解をもたらすオリゴヌクレオチドを使用する場合にはｍｉＲ－２７ｂのレベルを測定することによって測定することができる、または、マイクロＲＮＡ－２７ｂ標的（例えば、ｍｉＲ－２７ｂ結合性部位を含み、発現がｍｉＲ－２７ｂによって調節されるｍＲＮＡ（ｍｉＲ－２７ｂ標的ｍＲＮＡ）など）の抑制解除を測定することによって測定することができる。一部の実施形態では、治療の有効性を、Ｎｒｆ２のアップレギュレーションを測定することによって測定する。したがって、ｍｉＲ－２７ｂ阻害を直接的に測定することもでき、ｍｉＲ－２７ｂ活性の二次的指標によって間接的に測定することもできる。
「有効投薬量」という表現は、所望の効果が実現される薬物の用量を指す。本発明に関しては、所望の効果は、ｍｉＲ－２７ｂの活性の低下である。ｍｉＲ－２７ｂの活性の低下は、例えば、ｍｉＲ－２７ｂもしくはｍｉＲ－２７ｂ前駆体の分解をもたらすオリゴヌクレオチドを使用する場合にはｍｉＲ－２７ｂのレベルを測定することによって測定することができる、または、マイクロＲＮＡ－２７ｂ標的（例えば、ｍｉＲ－２７ｂ結合性部位を含み、発現がｍｉＲ－２７ｂによって調節されるｍＲＮＡ（ｍｉＲ－２７ｂ標的ｍＲＮＡ）など）の抑制解除を測定することによって測定することができる。一部の実施形態では、治療の有効性を、Ｎｒｆ２のアップレギュレーションを測定することによって測定する。したがって、ｍｉＲ－２７ｂ阻害を直接的に測定することもでき、ｍｉＲ－２７ｂ活性の二次的指標によって間接的に測定することもできる。
【0107】
本発明の化合物は、有効投薬量で使用するためのものであり、組成物は、有効投薬量の本発明の化合物を含む。
【0108】
一部の実施形態では、各投薬時に投与される化合物の投薬量、例えば、単位用量は、０．０００１ｍｇ／ｋｇ～２５ｍｇ／ｋｇの範囲内に入る。
【0109】
一部の実施形態では、有効用量は、ｍｉＲ－１３４またはその活性を、継続的な投与間の期間にわたって意義のあるレベルまで、例えば、対象に対して治療的利益になるレベルまで、ダウンレギュレートするために十分な用量である。
【0110】
本発明の医薬組成物は、一部の実施形態では、最初の投薬量増量相をもたらすための投与用に作ることができ、疾患病態に応じて、最初の投薬量増量相の後に、対象における、例えば対象の標的組織における化合物の濃度を維持することを目的として、維持投薬量スキームを続けることができ、それが疾患の治療に有効になる。投薬の効果は、例えば、疾患の状態を示す疾患パラメータを観察することによって測定することもでき、標的組織に応じて、ｍｉＲ－２７ｂ標的ＲＮＡ活性などの種々の組織パラメータ、または、代替例では、血漿中の測定可能な病状依存的パラメータを観察することによっても測定可能であり得る。
【0111】
薬物送達
種々の送達系が公知であり、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。投与方法としては、これだけに限定されないが、皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳内投与、くも膜下腔内投与または経口投与または脳もしくは脳脊髄液中への直接投与が挙げられる。組成物を、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜組織（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与することができ、また、他の生物活性のある薬剤を伴って、または伴わずに投与することができる。投与は、全身性であっても局所的であってもよい。さらに、本発明の組成物を中枢神経系に脳室内およびくも膜下腔内投与を含めた任意の適切な経路によって投与することが望ましい場合がある。脳室内カテーテル、例えば、オンマイヤーリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより、脳室内注射を容易にすることができる。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を伴う製剤を使用することにより、経肺投与を使用することもできる。治療薬がＣＮＳまたはＰＮＳに送達されることが好ましい。
種々の送達系が公知であり、本発明の治療薬を投与するために使用することができる。投与方法としては、これだけに限定されないが、皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳内投与、くも膜下腔内投与または経口投与または脳もしくは脳脊髄液中への直接投与が挙げられる。組成物を、任意の都合のよい経路によって、例えば、注入またはボーラス注射によって、上皮もしくは皮膚粘膜組織（例えば、口腔粘膜、直腸および腸粘膜など）を通じた吸収によって投与することができ、また、他の生物活性のある薬剤を伴って、または伴わずに投与することができる。投与は、全身性であっても局所的であってもよい。さらに、本発明の組成物を中枢神経系に脳室内およびくも膜下腔内投与を含めた任意の適切な経路によって投与することが望ましい場合がある。脳室内カテーテル、例えば、オンマイヤーリザーバーなどのリザーバーに取り付けられた脳室内カテーテルにより、脳室内注射を容易にすることができる。例えば、吸入器またはネブライザー、およびエアロゾル化剤を伴う製剤を使用することにより、経肺投与を使用することもできる。治療薬がＣＮＳまたはＰＮＳに送達されることが好ましい。
【0112】
送達手段としては、吸入送達、シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによる直接筋肉内への筋肉内送達、シリンジまたはミニ浸透圧ポンプによって腹膜に直接投与する腹腔内投与、シリンジによって皮膚の下に直接投与する皮下投与、注射によってまたは浸透圧ポンプに取り付けられた小さなカテーテルを使用して脳室に直接投与する脳室内投与が挙げられる。さらに、筋肉内または脊髄に直接設置されるインプラントを調製することができる（例えば、小型のシリコンインプラント）。本発明の組成物を治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定するものではなく、局部適用によって、注射によって、カテーテルを用いて、坐薬を用いて、またはインプラントを用いて実現することができ、前記インプラントは、シラスティック膜などの膜または線維を含めた、多孔質、非多孔質、またはゼラチン質材料製であってよい。
【0113】
医薬組成物
本発明は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量の治療薬、および薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認される通り定義することができる。規制当局は、例えば、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）、連邦もしくは州政府であり得る、または動物、特にヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されているものであり得る。「治療有効量」という用語は、障害または疾患の発達または発生の臨床的に意義のある阻害、好転または逆転をもたらす治療薬の量と定義することができる。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油、動物、野菜または合成起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、好ましい担体は水であり得る。生理食塩水溶液ならびにブドウ糖水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望であれば、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝液も含有してよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、ピル、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとってよい。組成物を、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐薬として製剤化することができる。経口用製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を含めることができる。そのような組成物は、治療有効量の治療薬を、好ましくは精製された形態で、患者に適当に投与するための形態をもたらすために適した量の担体と共に含有してよい。製剤を投与形式に合わせることができる。静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液であってよい。必要であれば、組成物に、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めることもできる。成分は別々に供給することもでき、混合して単位剤形として、例えば、活性薬剤の数量が示されたアンプルまたはサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給することもできる。組成物を注入によって投与する場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入用ボトルに分配することができる。組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水、または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
本発明は、医薬組成物も提供する。そのような組成物は、治療有効量の治療薬、および薬学的に許容される担体を含み得る。「薬学的に許容される」という用語は、規制当局によって承認される通り定義することができる。規制当局は、例えば、欧州医薬品庁（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｇｅｎｃｙ）、連邦もしくは州政府であり得る、または動物、特にヒトにおける使用に関して米国薬局方もしくは他の一般に認められている薬局方に収載されているものであり得る。「治療有効量」という用語は、障害または疾患の発達または発生の臨床的に意義のある阻害、好転または逆転をもたらす治療薬の量と定義することができる。「担体」という用語は、治療薬がそれと共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指し得る。そのような医薬担体は、滅菌された液体、例えば、水、および石油、動物、野菜または合成起源のものを含めた油、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などであってよい。医薬組成物を静脈内投与する場合、好ましい担体は水であり得る。生理食塩水溶液ならびにブドウ糖水溶液およびグリセロール水溶液も、特に注射液のための液体担体として使用することができる。適切な医薬賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、イネ、穀粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望であれば、湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝液も含有してよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、ピル、カプセル剤、散剤、徐放性製剤などの形態をとってよい。組成物を、従来の結合剤およびトリグリセリドなどの担体を用いて坐薬として製剤化することができる。経口用製剤には、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を含めることができる。そのような組成物は、治療有効量の治療薬を、好ましくは精製された形態で、患者に適当に投与するための形態をもたらすために適した量の担体と共に含有してよい。製剤を投与形式に合わせることができる。静脈内投与用の組成物は、滅菌等張性水性緩衝液中の溶液であってよい。必要であれば、組成物に、可溶化剤および注射部位の疼痛を和らげるためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含めることもできる。成分は別々に供給することもでき、混合して単位剤形として、例えば、活性薬剤の数量が示されたアンプルまたはサシェなどの密封容器中の凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給することもできる。組成物を注入によって投与する場合、滅菌された医薬品グレードの水または生理食塩水を含有する注入用ボトルに分配することができる。組成物を注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、注射用滅菌水、または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【0114】
【図1】ホタルルシフェラーゼ（Firefly）に対して正規化したウミシイタケシグナルの抑制レベルを空ベクターに対するパーセントとして示すグラフである。ｎ、Ｎ＝２～３、４～６、平均値±ＳＥＭ。最も強力なアンチセンスオリゴヌクレオチドは配列番号８、１２、１６、１９および２０である。
【図2】ＰＣ－１２細胞において測定された５種のｍｉＲ－２７ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドの用量反応曲線およびＩＣ５０値を示すグラフである。用量反応曲線およびＩＣ５０値、ｎ、Ｎ＝１、２、両方の技術的反復実験が示されている、３パラメータ非線形曲線当てはめ。
【図3】Ｕ－８７ ｍｇ細胞におけるウミシイタケルシフェラーゼ活性の抑制解除によって測定された配列番号８、１２、１６、１９および２０のＩＣ５０値を示すグラフである。ｎ、Ｎ＝２、４～６、全ての生物学的反復実験が示されている。最小二乗回帰を使用し、３パラメータ応答に対するｌｏｇ（阻害剤）を用いてＩＣ５０曲線を当てはめ、効力を算出した。
【図4】抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチドをＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞にトランスフェクトした後のｍｉＲ－２７ｂの直接の標的ｍＲＮＡ（ｎｒｆ２）および下流の標的ｍＲＮＡ（ｈｍｏｘ１、ｎｑｏ１）の発現の増大を示すグラフである。ｎ、Ｎ＝３、６；平均値±ＳＥＭ、全ての技術的反復実験が示されている。ｑＰＣＲ結果の解析を、ΔΔＣｔ法を使用し、スクランブルされたオリゴヌクレオチドに対する正規化を使用して行った。（本実験で使用した配列番号２０に定義されるオリゴヌクレオチドを、１つのグアニンに対するイノシン置換を行って配列番号２２に対応するようにした。）
【図5】配列番号２０およびイノシン置換された配列番号２２の効力を示すグラフである。Ａは、０．２ｎＭ、１ｎＭおよび５ｎＭの抗ｍｉＲをＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞にトランスフェクトした後のウミシイタケルシフェラーゼ活性の抑制解除。ｎ、Ｎ＝１、２；平均値±ＳＥＭ。全ての技術的反復実験が示されている。Ｂは、配列番号２０および配列番号２２の用量反応曲線およびＩＣ５０値。配列番号２２は、配列番号２０に対して、１つのグアニンがイノシン置換されているが他の点では同一のものであった。用量反応曲線およびＩＣ５０値、ｎ、Ｎ＝１、３、平均、３パラメータ非線形曲線当てはめ。
【実施例】
【0115】
実施例１：細胞培養
アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍｉＲＮＡに対する効果のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングは、一般に、哺乳動物細胞株において行われる。
アンチセンスオリゴヌクレオチドのｍｉＲＮＡに対する効果のｉｎ ｖｉｔｒｏモデリングは、一般に、哺乳動物細胞株において行われる。
【0116】
接着性ラット褐色細胞腫細胞株ＰＣ－１２ Ａｄｈ（ＥＣＡＣＣ番号８８０２２４０１）をＡＴＣＣから購入し（ＡＴＣＣ ｃａｔ番号ＣＲＬ－１７２１．１（商標））、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ細胞培養フラスコ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号ＣＬＳ３２９０）中、２．５％熱失活ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｆ４１３５－５００ｍｌ）、１５％熱失活ウマ血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｈ１３８５－５００ｍｌおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｐ４３３３－１００ｍｌ）を補充したＨａｍ’ｓ Ｆ－１２Ｋ（Ｋａｉｇｈｎ’ｓ）培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号２１１２７０２２）で成長させた。細胞を、加湿５％ＣＯ２インキュベーター中、３７℃で保持し、週に２回継代した。
【0117】
実施例２：培養した細胞株におけるルシフェラーゼレポーターアッセイ
単純かつ非常に高感度の手法は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の３’ＵＴＲ内に単一の完全マッチｍｉＲＮＡ結合性部位を有するｍｉＲＮＡレポータープラスミドの構築を伴うものである。この方法は、培養した細胞において、ｍｉＲＮＡ阻害を検証するため、また異なる抗ｍｉＲ設計の効力を比較するために広範囲にわたって使用されている。
単純かつ非常に高感度の手法は、ルシフェラーゼなどのレポーター遺伝子の３’ＵＴＲ内に単一の完全マッチｍｉＲＮＡ結合性部位を有するｍｉＲＮＡレポータープラスミドの構築を伴うものである。この方法は、培養した細胞において、ｍｉＲＮＡ阻害を検証するため、また異なる抗ｍｉＲ設計の効力を比較するために広範囲にわたって使用されている。
【0118】
ヒトｍｉＲ－２７ｂに対する単一の完全マッチ標的部位に対応するアニーリングされたオリゴヌクレオチドを、デュアルルシフェラーゼｐｓｉＣＨＥＣＫ２プラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の３’ＵＴＲ内にクローニングすることにより、ｍｉＲ－２７ｂレポーターを生成した。
【0119】
ルシフェラーゼアッセイに関しては、トランスフェクションの前日に、ＰＣ－１２ ａｄｈ細胞を９６ウェルＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）ＣｅｌｌＢＩＮＤ（登録商標）Ｓｕｒｆａｃｅ細胞培養マイクロウェルプレート（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号ＣＬＳ３３３０）にウェル当たり細胞２５，０００個の密度で播種した。リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号１１６６８－０１９）をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）Ｉ Ｒｅｄｕｃｅｄ Ｓｅｒｕｍ Ｍｅｄｉｕｍ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｃａｔ番号５１９８５０２６）中、０．５μ／ウェルの最終濃度で使用して細胞へのトランスフェクションを行った。１７種のアンチセンスオリゴヌクレオチドのライブラリーに対するスクリーニングを、ルシフェラーゼレポータープラスミドを伴う各抗ｍｉＲ－２７ｂおよびｍｉＲ－２７ｂ模倣体を最終濃度０．２ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭで同時トランスフェクトすることにより、ルシフェラーゼレポーターアッセイを使用して行った。配列がスクランブルされたオリゴヌクレオチド、ｍｉＲＮＡマッチ部位を含有しないベクター、およびニセトランスフェクションを対照として含めた。全ての試料について技術的２連で実行した。４時間後、細胞をＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）培地で洗浄し、新鮮な完全細胞培養培地をウェルに添加した。
【0120】
トランスフェクションの２４時間後、Ｄｕａｌ－Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ ｃａｔ番号Ｅ２９２０）を使用し、製造者の指示に従ってルシフェラーゼアッセイを行った。試薬をプレート中で３０分インキュベートした後、発光量をプレートリーダー（ＶａｒｉｏＳｋａｎ Ｌｕｘ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で決定した。
【0121】
結果を、バックグラウンド発光を差し引き、次いで、ウミシイタケシグナルを構成的なホタルルシフェラーゼシグナルに対して正規化することによって分析した。次いで、２回の技術的２連の平均を空ベクターに対して正規化し、パーセンテージとして表した。結果をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）で可視化した。
【0122】
１７種全てのアンチセンスオリゴヌクレオチドについて、ホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化したウミシイタケルシフェラーゼ活性の抑制解除のレベルが図１に示されている。
【0123】
抗ｍｉＲ－２７ｂアンチセンスオリゴヌクレオチドの完全なライブラリーから、最も強力な５種の抗ｍｉＲ－２７ｂ分子をさらなる分析およびＩＣ５０決定のために選択した。
【0124】
実施例３：培養した細胞株における抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチドのＩＣ５０の決定
ｍｉＲ－２７ｂの阻害に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を決定するために、ＩＣ５０決定を行った。ルシフェラーゼアッセイを実施例２に記載の通り実施した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、Xu et al（Oncotarget. 2017 Sep 19; 8 (41): 70669-70684）によるｍｉＲ－２７ｂアンタゴミルと比較した。ＩＣ５０値を決定するために、細胞に、抗ｍｉＲ－２７ｂを８０ｎＭから２倍希釈で０．００４９ｎＭまでにわたる広範囲の濃度でトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でｌｏｇ（Ｍ）に対してプロットした。用量反応曲線を、３パラメータ非線形当てはめを使用して当てはめ、ＩＣ５０値をｎＭ単位で算出した。アンタゴミル対照化合物については、選択された濃度にわたって応答が低かったので、ＩＣ５０値を決定することができなかった。
ｍｉＲ－２７ｂの阻害に関するアンチセンスオリゴヌクレオチドの効力を決定するために、ＩＣ５０決定を行った。ルシフェラーゼアッセイを実施例２に記載の通り実施した。アンチセンスオリゴヌクレオチドを、Xu et al（Oncotarget. 2017 Sep 19; 8 (41): 70669-70684）によるｍｉＲ－２７ｂアンタゴミルと比較した。ＩＣ５０値を決定するために、細胞に、抗ｍｉＲ－２７ｂを８０ｎＭから２倍希釈で０．００４９ｎＭまでにわたる広範囲の濃度でトランスフェクトした。ウミシイタケルシフェラーゼ活性をホタルルシフェラーゼ活性に対して正規化し、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン９．０．２、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）でｌｏｇ（Ｍ）に対してプロットした。用量反応曲線を、３パラメータ非線形当てはめを使用して当てはめ、ＩＣ５０値をｎＭ単位で算出した。アンタゴミル対照化合物については、選択された濃度にわたって応答が低かったので、ＩＣ５０値を決定することができなかった。
【0125】
図２は、５種の抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチドの用量反応曲線およびＩＣ５０値を示す。
【0126】
実施例４：培養したＵ－８７ Ｍｇ細胞におけるＩＣ５０決定
Ｕ－８７ Ｍｇ細胞におけるＩＣ５０曲線を、リポフェクタミン２０００の量をウェル当たり０．４μＬとし、トランスフェクションを９６ウェルＣｏｓｔａｒ黒色プレート（ｃａｔ番号：３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）で行った以外は上の実施例に記載されているＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞の場合と同様に得た。
Ｕ－８７ Ｍｇ細胞におけるＩＣ５０曲線を、リポフェクタミン２０００の量をウェル当たり０．４μＬとし、トランスフェクションを９６ウェルＣｏｓｔａｒ黒色プレート（ｃａｔ番号：３６０３、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）で行った以外は上の実施例に記載されているＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞の場合と同様に得た。
【0127】
図３は、５種の選択された抗ｍｉＲ－２７ｂオリゴヌクレオチド（配列番号８、１２、１６、１９および２０）の用量反応曲線およびＩＣ５０値を示す。
【0128】
実施例５は、培養したＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞株におけるｍｉＲ－２７ｂ標的ｍＲＮＡの抑制解除を示す。
【0129】
ｍｉＲＮＡは、それらの標的ｍＲＮＡのレベルを負に調節するので、抗ｍｉＲオリゴヌクレオチドによるｍｉＲ－２７ｂ阻害の機能的影響を、その後に続く標的ｍＲＮＡのアップレギュレーションによって測定することができる。ｍｉＲ－２７ｂの主な標的は転写因子Ｎｒｆ２であり、これは、抗酸化物質のアップレギュレーションならびにＨｍｏｘ１およびＮｑｏ１などの因子の無毒化に関与する。これらの３種のマーカーのアップレギュレーションにより、単にＮｒｆ２レベルに対する機能的影響が示されるだけでなく、Ｎｒｆ２によって調節される下流の分子経路の活性化も示される。
【0130】
ＰＣ－１２ Ａｄｈ細胞へのトランスフェクションを、上記の実施例に記載されている通りであるが、細胞を１２ウェルＣｅｌｌＢｉｎｄプレート（ｃａｔ番号：ＣＬＳ３３３６、Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｗｏｒｌｄ、Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ、ＵＳＡ）にウェル当たり細胞３×１０５個の密度で播種したこと、ウェル当たり６μＬのリポフェクタミン２０００を使用したこと、ルシフェラーゼレポーターを使用しなかったことを例外として行った。直接顕微鏡によって検査することによってトランスフェクション効率を確認するために、ＦＡＭ標識されたオリゴヌクレオチドを別のウェルにトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、ｍｉＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ｃａｔ番号：２１７００４、Ｑｉａｇｅｎ、Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用し、製造者の指示に従ってＲＮＡ抽出を行った。さらなる分析を行うまでＲＮＡを－８０℃で保管した。Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＶ逆転写酵素（ｃａｔ番号：１８０９００１０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って逆転写を行った。これには、ｅｚＤＮａｓｅ（商標）（ｃａｔ番号：１１７６６０５１、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）によるｇＤＮＡの除去、およびランダムな六量体プライマー（ｃａｔ番号：ＳＯ１４２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）の使用が含まれた。ｑＰＣＲを、ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ６ Ｆｌｅｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって合成されたＴａｑＭａｎアッセイ（表２）およびＴａｑＭａｎ（商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ＩＩ、ＵＮＧなし（ｃａｔ番号：４４４００４０、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）を使用し、製造者の指示に従って行った。全てのｑＰＣＲアッセイを、エクソンにまたがる（ｅｘｏｎ－ｓｐａｎｎｉｎｇ）ように設計し、ｂｌａｓｔによってプライマーの特異性を確認し、プライマーの効率を５倍希釈系列を使用して決定した。Ｈｐｒｔ１をハウスキーピング遺伝子として使用した。全てのｑＰＣＲ結果をΔΔＣｔ法（Livak KJ, Schmittgen TD. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real-Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCT Method. Methods. 2001;25(4):402-408）を使用し、スクランブルされたオリゴヌクレオチドを正規化のために使用して解析した。
【0131】
【表2】
【0132】
図４の棒グラフは、抗ｍｉＲ（配列番号８、１２、１６、１９および２０）のｍｉＲ－２７ｂ標的遺伝子抑制解除（Ｎｒｆ２、Ｈｍｏｘ１およびＮｑｏ１）に対する効果を示す。本実験で使用した配列番号２０として定義されるオリゴヌクレオチドを、１つのグアニンに対するイノシン置換を行って配列番号２２に対応するようにした。
【0133】
実施例６は、配列番号２０および配列番号２２の効力の評定を示す
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを、細胞を、コラーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｃ８９１９）で前処理した透明底の白色９６ウェルプレート（ｃａｔ番号３６１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種したこと、ＩＣ５０実験について３回の技術的反復実験を使用したこと、およびバックグラウンド除去を行わなかったこと以外は実施例２および３に記載の通り行った。用量応答実験およびＩＣ５０実験の結果がそれぞれ図５ＡおよびＢに示されている。
トランスフェクションおよびルシフェラーゼアッセイを、細胞を、コラーゲン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ ｃａｔ番号Ｃ８９１９）で前処理した透明底の白色９６ウェルプレート（ｃａｔ番号３６１０、Ｃｏｒｎｉｎｇ）に播種したこと、ＩＣ５０実験について３回の技術的反復実験を使用したこと、およびバックグラウンド除去を行わなかったこと以外は実施例２および３に記載の通り行った。用量応答実験およびＩＣ５０実験の結果がそれぞれ図５ＡおよびＢに示されている。
【0134】
実施形態
１）１８～１９ヌクレオチド長の配列を含む、ｍｉＲ－２７ｂ（配列番号１または２）と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、７～１４、例えば１０～１３の親和性増強性ヌクレオチド類似体を有し、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーであり、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。
１）１８～１９ヌクレオチド長の配列を含む、ｍｉＲ－２７ｂ（配列番号１または２）と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、７～１４、例えば１０～１３の親和性増強性ヌクレオチド類似体を有し、３つを超える連続したＤＮＡヌクレオチドのひと続きを含有しないミックスマーであり、かつ、１～１８のホスホロチオエートヌクレオシド間連結を含む。
【0135】
２）配列番号３と相補的である、実施形態１によるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0136】
３）配列番号４を含む、実施形態１または２によるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0137】
４）１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、実施形態１から３までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0138】
５）１８または１９ヌクレオチド長であり、配列番号４を含み、５０～７０％のＬＮＡ、例えば５２～６８％のＬＮＡ、例えば少なくとも５０％のＬＮＡ、例えば少なくとも５２％のＬＮＡを有するＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーである、実施形態１から４までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0139】
６）各末端の２つの末端ヌクレオチドがＬＮＡである、実施形態１から５までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0140】
７）ＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡである、実施形態１から６までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0141】
８）全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態１から７までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0142】
９）配列番号５～２２のいずれか１つである、実施形態１から８までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0143】
１０）全てのＬＮＡがベータ－Ｄ－オキシＬＮＡであり、全てのＬＮＡシトシンが５－メチルシトシンであり、全てのヌクレオシド間結合がホスホロチオエート結合である、実施形態９によるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0144】
１１）ＬＮＡ／ＤＮＡミックスマーが、トリシクロ－ＤＮＡ、２’－フルオロ、２’－Ｏ－メチル、２’メトキシエチル（２’ＭＯＥ）、２’環状エチル（ｃＥＴ）、ＵＮＡ、２’フルオロおよび立体配置が制限されたヌクレオシド（ＣＲＮ）のいずれか１つであるヌクレオシドを１つまたは複数さらに含む、実施形態１から１０までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0145】
１２）医薬としての使用のための、実施形態１から１１までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【0146】
１３）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むｍｉＲ－２７ｂ阻害組成物。
【0147】
１４）哺乳動物、例えばヒトにおけるＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路の誘導における使用のための、実施形態１３による組成物。
【0148】
１５）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号５～２２のいずれか１つである、実施形態１２による医薬としての使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド、または実施形態１３または１４による組成物。
【0149】
１６）使用が、ｍｉＲ－２７ｂ活性の改変、またはＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路の誘導が有益であるｍｉＲ－２７ｂ関連疾患を治療する、緩和させる、先制治療する、または予防するためのものである、実施形態１２、１３、１４または１５のいずれかによる使用または組成物。
【0150】
１７）使用が、ＣＮＳまたはＰＮＳのｍｉＲ－２７ｂ関連疾患を治療する、緩和させる、先制治療する、または予防するためのものである、実施形態１２、１３、１４、１５または１６による使用または組成物。
【0151】
１８）神経性障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１７による使用。
【0152】
１９）神経変性障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１８による使用。
【0153】
２０）神経発達障害、遺伝障害、および／または遺伝性神経発達障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１９による使用。
【0154】
２１）てんかんを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１９までのいずれか１つによる使用。
【0155】
２２）薬剤抵抗性てんかんを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２１による使用。
【0156】
２３）てんかんの発作を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２１または２２による使用。
【0157】
２４）てんかんの自発性発作を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２１から２３までによる使用。
【0158】
２５）治療法抵抗性発作を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態２１から２４までによる使用。
【0159】
２６）前記てんかんが、焦点性てんかんであり、前記焦点性てんかんが、前頭葉、頭頂葉、後頭葉または側頭葉を焦点とするものであることが好ましい、実施形態２１から２５までによる使用。
【0160】
２７）前記てんかんが、全般てんかんであり、前記全般てんかんが、欠神、ミオクロニー発作、強直間代性発作、強直性発作、脱力発作、間代性発作および攣縮の中から選択されることが好ましい、実施形態２１から２５までによる使用。
【0161】
２８）前記てんかんが、てんかん重積状態である、実施形態２１から２７までによる使用。
【0162】
２９）前記てんかんが、常染色体優性夜間前頭葉てんかん、徐波睡眠期持続性棘徐波を示すてんかん性脳症（ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ｓｐｉｋｅ－ａｎｄ－ｗａｖｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｌｏｗ ｓｌｅｅｐ）、ドラベ症候群、脳卒中後てんかん、てんかん性脳症、笑いてんかん、欠神、良性新生児発作、ジーボンス症候群、若年ミオクロニーてんかん、ランドウ・クレフナー症候群、レンノックス・ガストー症候群、内側側頭葉てんかん、ミオクロニー脱力発作を伴うてんかん、大田原症候群、パナイトポーラス症候群、ＰＣＤＨ１９症候群、中心側頭棘波をもつ良性小児てんかん、スタージ・ウェーバー症候群、症候性焦点性てんかん、一過性てんかん性健忘およびウエスト症候群の中から選択される、実施形態２１から２８までによる使用。
【0163】
３０）前記てんかんが、精神障害、認知障害、睡眠障害、心血管障害、呼吸器疾患、炎症性障害、精神障害、不安、疼痛、認知機能障害、うつ病、認知症、頭痛、片頭痛、心疾患、潰瘍、消化性潰瘍、関節炎および骨粗鬆症の中から選択される共存症と共に存在する、実施形態２１から２９までによる使用。
【0164】
３１）ニューロン損傷を防止もしくは予防する、または緩和させるまたは治療するためのものである、実施形態１６から２９までによる使用。
【0165】
３２）海馬損傷を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態３１による使用。
【0166】
３３）酸化ストレス、炎症および／またはアポトーシスを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１７による使用。
【0167】
３４）脳出血により誘導される脳損傷、虚血性脳卒中、出血性卒中または脳卒中を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１７による使用。
【0168】
３５）自己免疫疾患、記憶障害、海馬硬化症、パーキンソン病、脱髄性疾患、多発性硬化症、脊髄損傷、急性脊髄損傷、筋萎縮性側索硬化症、進行性球麻痺、進行性筋萎縮症、原発性側索硬化症、運動失調、ベル麻痺、遺伝性神経疾患、シャルコー・マリー・トゥース、頭痛、ホートン頭痛、片頭痛、ピック病、進行性核上性麻痺、多系統変性、運動ニューロン疾患、ハンチントン病、プリオン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、大脳皮質基底核変性症、失語症、原発性進行性失語症またはその症状もしくは影響を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１７から２０までによる使用。
【0169】
３６）認知症を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１７から１９または３５までによる使用。
【0170】
３７）前記認知症が、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症およびレビー小体認知症の中から選択される、実施形態３６による使用。
【0171】
３８）疼痛、例えば、変形性関節症に付随する疼痛を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または実施形態１４から１９までのいずれかによる使用。
【0172】
３９）ｍｉＲ－２７ｂのモジュレーションが有益である精神疾患を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１９までのいずれかによる使用。
【0173】
４０）統合失調症、うつ病、双極性障害、注意欠陥多動性障害、自閉症、不安またはトゥレット症を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態３９による使用。
【0174】
４１）血管新生関連疾患を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１６までによる使用。
【0175】
４２）がんを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２から１６までまたは４１のいずれか１つによる使用。
【0176】
４３）前記がんが、神経系のがん、好ましくは神経膠腫である、実施形態４２による使用。
【0177】
４４）前記がんが、皮膚のがん、好ましくは黒色腫である、実施形態４２による使用。
【0178】
４５）前記がんが、頭頸部がんである、実施形態４２による使用。
【0179】
４６）前記がんが、扁平上皮癌、好ましくは舌扁平上皮癌または口腔扁平上皮癌である、実施形態４２による使用。
【0180】
４７）前記がんが、血液のがん、好ましくは骨髄腫またはリンパ腫、より好ましくはびまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫である、実施形態４２による使用。
【0181】
４８）前記がんが、乳がん、好ましくはトリプルネガティブ乳がんである、実施形態４２による使用。
【0182】
４９）前記がんが、甲状腺がん、好ましくは甲状腺未分化がんである、実施形態４２による使用。
【0183】
５０）前記がんが、肝がん、好ましくは肝細胞癌である、実施形態４２による使用。
【0184】
５１）前記がんが、胃がん、子宮頸がん、子宮体がん、血管腫、肺がん、膵がん、膀胱がん、前立腺がんおよび結腸直腸がん、例えば、結腸直腸がんの遊走および浸潤の群から選択される、実施形態４２による使用。
【0185】
５２）前記がんが、がん転移である、実施形態４２から５１までによる使用。
【0186】
５３）アンチセンスオリゴヌクレオチドが、プラダー・ウィリ症候群またはアンジェルマン症候群の治療における使用のためのものである、実施形態１２から１６までまたは２０のいずれか１つによる使用。
【0187】
５４）関節炎を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１６までのいずれか１つによる使用。
【0188】
５５）前記関節炎が、変形性関節症である、実施形態５４による使用。
【0189】
５６）心血管障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１７までのいずれか１つによる使用。
【0190】
５７）前記心血管障害が、アテローム性動脈硬化症、末梢動脈疾患、術後心房細動、心不全および慢性心不全、脳内出血により誘導される脳損傷または脳卒中の中から選択される、実施形態５６による使用。
【0191】
５８）肝障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１６までのいずれか１つによる使用。
【0192】
５９）前記肝障害が、非アルコール性脂肪肝、脂肪肝、脂肪肝線維症、肝線維症およびヘパトーマの中から選択される、実施形態５８による使用。
【0193】
６０）肺サルコイドーシスなどの肺障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１６までのいずれか１つによる使用。
【0194】
６１）自己免疫疾患、肉芽腫性疾患、結合組織病またはサルコイドーシスを治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１６までのいずれか１つによる使用。
【0195】
６２）感染症を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１７までのいずれか１つによる使用。
【0196】
６３）前記感染症が、敗血症、髄膜炎および脳炎の中から選択される、実施形態６２による使用。
【0197】
６４）前記感染症が、ヘルペスウイルス感染症である、実施形態６２による使用。
【0198】
６５）前記感染症が、ヒトパピローマウイルス感染症である、実施形態６２による使用。
【0199】
６６）前記ヘルペスウイルス感染症が、単純ヘルペスウイルス感染症およびサイトメガロウイルス感染症の間で選択される、実施形態６４による使用。
【0200】
６７）網膜の障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１７までのいずれか１つまたは４１による使用。
【0201】
６８）前記網膜の障害が、網膜症、糖尿病性網膜症および加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の中から選択される、実施形態６７による使用。
【0202】
６９）代謝障害を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１６までのいずれか１つによる使用。
【0203】
７０）前記代謝障害が、糖尿病、好ましくは２型糖尿病である、実施形態６９による使用。
【0204】
７１）遺伝障害、好ましくは神経線維腫症を治療する、緩和させる、先制治療するまたは予防するためのものである、実施形態１２または１４から１７までのいずれか１つによる使用。
【0205】
７２）アンチセンスオリゴヌクレオチドを別の治療法と組み合わせて使用する、実施形態１２から７１までのいずれか１つによる使用。
【0206】
７３）前記他の治療法が、抗ｍｉＲ－１３４アンチセンスオリゴヌクレオチドである、実施形態７２による使用。
【0207】
７４）前記他の治療法が、アデノシンキナーゼ阻害剤である、実施形態７２による使用。
【0208】
７５）前記他の治療法が、哺乳動物、例えばヒトにおいてＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導するものである、実施形態７２による使用。
【0209】
７６）前記治療法が、抗ｍｉＲ－１３４アンチセンスオリゴヌクレオチド、アデノシンキナーゼ阻害剤およびＮｒｆ－２／ＡＲＥ経路を誘導する治療法のうちの１つまたは複数である、実施形態７２による使用。
【0210】
７７）本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドが、唯一の活性医薬成分である、実施形態１２から７１までのいずれか１つによる使用。
【0211】
７８）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドおよび薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【0212】
７９）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む医薬組成物であって、前記抗ｍｉＲ２７ｂオリゴヌクレオチドが唯一の活性医薬成分である、医薬組成物。
【0213】
８０）実施形態１２から７７までのいずれか１つによる使用のためのものである、実施形態７８から８０までのいずれか１つによる医薬組成物。
【0214】
８１）皮下投与、静脈内投与、非経口投与、経鼻投与、経肺投与、直腸内投与、膣内投与、子宮内投与、尿道内投与、眼への投与、耳への投与、皮膚投与、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、硬膜外投与、脳室内投与（ｉｎｔｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、脳内投与、くも膜下腔内投与もしくは経口投与による投与用、もしくは脳もしくは脳脊髄液中への直接投与用である、または、インプラントとして投与される、実施形態７８から８０までによる医薬組成物。
【0215】
８２）前記組成物が、ポンプにより投与され、前記ポンプが、ミニ浸透圧ポンプであることが好ましい、実施形態７８から８１までによる医薬組成物。
【0216】
８３）脳室内カテーテルによって容易になる脳室内投与用であり、前記カテーテルがリザーバーに取り付けられていることが好ましく、前記リザーバーがオンマイヤーリザーバーであることが好ましい、実施形態７８から８２までによる医薬組成物。
【0217】
８４）１日、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、３１日間、３２日間、３３日間、３４日間、３５日間、３６日間、３７日間、３８日間、３９日間、４０日間、４１日間、４２日間、４３日間、４４日間、４５日間、４６日間、４７日間、４８日間、４９日間、５０日間、５１日間、５２日間、５３日間、５４日間、５５日間、５６日間、５７日間、５８日間、５９日間、６０日間、６１日間、６２日間、６３日間、６４日間、６５日間、６６日間、６７日間、６８日間、６９日間、７０日間、７１日間、７１日間、７２日間、７３日間、７４日間、７５日間、７６日間、７７日間、７８日間、７９日間、８０日間、８１日間、８２日間、８３日間、８４日間、８５日間、８６日間、８７日間、８８日間、８９日間、９０日間、９１日間、９２日間、９３日間、９４日間、９５日間、９６日間、９７日間、９８日間、９９日間、１００日間、１０１日間、１０２日間、１０３日間、１０４日間、１０５日間、１０６日間、１０７日間、１０８日間、１０９日間、１１０日間、１１１日間、１１２日間、１１３日間、１１４日間、１１５日間、１１６日間、１１７日間、１１８日間、１１９日間または好ましくは１２０日間の間隔で投与される、実施形態８１から８３までによる医薬組成物。
【0218】
８５）１～２００日間、１０～１９０日間、２０～１８０日間、３０～１７０日間、４０～１６０日間、５０～１５０日間、６０～１４０日間、７０～１３０日間、８０～１２０日間、９０～１１０日間または好ましくは約１００日間の間隔で投与される、実施形態８１から８３までによる医薬組成物。
【0219】
８６）実施形態１２から７７までのいずれか１つによる疾患を治療する方法における使用のための、実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施形態１３による組成物。
【0220】
８７）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施形態１３または１４による組成物を使用することによって実施形態１２から７７までのいずれか１つによる疾患を治療するための方法。
【0221】
８８）治療が、防止的治療、治癒的治療または疾患修飾治療のいずれか１つである、実施形態１２から７７までのいずれか１つによる使用、または実施形態７８から８５までのいずれか１つによる医薬組成物、または実施形態８６または８７による方法。
【0222】
８９）実施形態１から１２までのいずれか１つによるアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは実施形態１３による組成物を使用することによって実施形態１２から７７までのいずれか１つによる疾患を診断する方法。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】