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特表2024-510734神経変性疾患に対する治療プロトコルの有効性を評価する方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-11
(54)【発明の名称】神経変性疾患に対する治療プロトコルの有効性を評価する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/37 20060101AFI20240304BHJP
G01N 33/68 20060101ALI20240304BHJP
G01N 27/62 20210101ALI20240304BHJP
C07K 7/00 20060101ALN20240304BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/37 ZNA
G01N33/68
G01N27/62 V
C07K7/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023555183
(86)(22)【出願日】2022-03-08
(85)【翻訳文提出日】2023-11-06
(86)【国際出願番号】 EP2022055919
(87)【国際公開番号】W WO2022189442
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】2103219.8
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523341602
【氏名又は名称】イーエム サイエンティフィック リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000109
【氏名又は名称】弁理士法人特許事務所サイクス
(72)【発明者】
【氏名】シルカ エルネスタス
(72)【発明者】
【氏名】クライヤー アダム
(72)【発明者】
【氏名】フットゥネン アンリ
【テーマコード（参考）】
2G041
2G045
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
2G041CA01
2G041DA04
2G041DA05
2G041DA09
2G041EA04
2G041FA10
2G041FA12
2G041FA22
2G041GA03
2G041GA09
2G041HA01
2G041LA08
2G045AA25
2G045CA25
2G045CA26
2G045CB01
2G045CB03
2G045CB07
2G045CB11
2G045DA36
2G045FA33
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ79
4B063QR16
4B063QS12
4B063QS17
4H045AA10
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045CA40
4H045EA50
4H045FA16
(57)【要約】
本発明は、対象における神経変性疾患の治療効果を評価する方法であって、前記タンパク質分解ペプチドの存在を、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して質量分析を使用してアッセイする方法に関する。本発明はまた、神経変性疾患を有する対象を層別化する方法、神経変性疾患の診断方法、神経変性疾患を有する対象の治療方法、および対象における神経変性疾患の第一選択治療の有効性を評価するためのキットに関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
対象の神経変性疾患に対する治療法の有効性を評価する方法であって、該方法は（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程
を含む、方法。
【請求項2】
神経変性疾患を有する対象を層別化する方法であって、該方法が、（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、ならびに
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象を層別化する工程
を含む、方法。
【請求項3】
神経変性疾患の診断方法であって、該方法が、（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、ならびに
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象の神経変性疾患を診断する工程
を含む、方法。
【請求項4】
神経変性疾患を有する対象の治療方法であって、該方法が、（ａ）（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程；
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象の神経変性疾患を診断する工程、ならびに
（ｃ）神経変性疾患の治療のために、対象に医薬組成物を投与する工程
を含む、方法。
【請求項5】
対象の神経変性疾患の第二選択治療のための方法であって、該方法が（ａ）対象の神経変性疾患に対する第一選択治療法の有効性を評価する工程であって、該方法が：
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製すること；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイすることを含む工程、ならびに
（ｂ）神経変性疾患の第二選択治療のための医薬組成物で対象を治療する工程
を含む、方法。
【請求項6】
プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
プロテアーゼがトリプシンである、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項8】
対象の神経変性疾患に対する第一選択治療の有効性を評価するためのキットであって、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在について質量分析によって試料を分析するための複数の試料調製媒体であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなる、試料調製媒体を含むキット。
【請求項9】
試料調製培地がプロテアーゼを含み、任意選択で、プロテアーゼがセリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼである、請求項８に記載のキット。
【請求項10】
プロテアーゼがトリプシンである、請求項９に記載のキット。
【請求項11】
神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、バッテン病、または伝達性海綿状脳症（例えば、スクレイピー、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）またはクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（異所性、変異型、家族性、散発性のＣＪＤを含む）、ライソゾーム神経変性疾患（ゴーシェ病など）からなる群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項12】
神経変性疾患がパーキンソン病である、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項13】
試料が、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液（血清、全血（静脈血または末梢血）、血漿、尿、涙、唾液、間質液、リンパ液または組織試料からなる群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項14】
試料が脳脊髄液（ＣＳＦ）である、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項15】
少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドが、以下からなる群より選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット：ＶＮＶＤＥＶＧＧＥＡＬＧＲ（配列番号１）
ＡＦＡＬＷＳＡＶＴＰＬＴＦＴＲ（配列番号２）
ＱＬＳＬＰＥＴＧＥＬＤＳＡＴＬＫ（配列番号３）
ＬＶＭＧＩＰＴＦＧＲ（配列番号４）
ＴＬＬＳＶＧＧＷＮＦＧＳＱＲ（配列番号５）
ＦＳＮＴＤＹＡＶＧＹＭＬＲ（配列番号６）
ＡＬＮＳＩＩＤＶＹＨＫ（配列番号７）
ＧＮＦＨＡＶＹＲ（配列番号８）
ＶＩＥＨＩＭＥＤＬＤＴＮＡＤＫ（配列番号９）
ＬＴＷＡＳＨＥＫ（配列番号１０）
ＹＹＡＦＤＬＩＡＱＲ（配列番号１１）
ＶＤＡＶＦＱＱＥＨＦＦＨＶＦＳＧＰＲ（配列番号１２）
ＶＬＬＤＧＶＱＮＰＲ（配列番号１３）
ＮＴＬＩＩＹＬＤＫ（配列番号１４）
ＡＳＨＥＥＶＥＧＬＶＥＫ（配列番号１５）
ＳＱＬＶＹＱＳＲ（配列番号１６）
ＩＹＴＳＰＴＷＳＡＦＶＴＤＳＳＷＳＡＲ（配列番号１７）
ＦＳＴＶＡＧＥＳＧＳＡＤＴＶＲ（配列番号１８）
ＧＡＧＡＦＧＹＦＥＶＴＨＤＩＴＫ（配列番号１９）
ＡＧＬＡＡＳＬＡＧＰＨＳＩＶＧＲ（配列番号２０）
ＡＶＶＶＨＡＧＥＤＤＬＧＲ（配列番号２１）
ＥＩＬＤＡＦＤＫ（配列番号２２）
ＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）
ＶＥＰＬＤＦＧＧＴＱＫ（配列番号２４）
ＶＬＤＩＩＡＴＩＮＫ（配列番号２５）
ＬＳＰＥＤＹＴＬＫ（配列番号２６）
ＶＳＴＬＰＡＩＴＬＫ（配列番号２７）
ＷＧＬＡＷＶＳＳＱＦＹＮＫ（配列番号２８）
ＴＳＮＮＳＴＭＱＶＳＦＶＣＱＲ（配列番号２９）
ＥＬＡＬＥＥＥＲ（配列番号３０）
ＥＮＴＳＤＰＳＬＶＩＡＦＧＲ（配列番号３１）
ＴＶＥＳＩＴＤＩＲ（配列番号３２）
ＡＬＱＡＴＶＧＮＳＹＫ（配列番号３３）
ＤＤＩＬＰＭＤＬＧＴＦＹＲ（配列番号３４）
ＴＶＱＶＩＶＱＡＲ（配列番号３５）
ＬＬＧＨＬＡＳＨＧＡＬＲ（配列番号３６）
ＱＤＴＬＰＥＡＧＲ（配列番号３７）
ＳＬＱＬＡＳＷＰＮＲ（配列番号３８）
ＱＩＤＬＶＤＮＹＦＶＫ（配列番号３９）
ＬＦＣＥＴＣＤＲ（配列番号４０）
ＬＡＶＱＦＴＮＲ（配列番号４１）
ＡＳＴＬＱＬＧＳＰＲ（配列番号４２）
ＧＶＩＦＹＬＲ（配列番号４３）
ＥＬＷＦＳＤＤＰＮＶＴＫ（配列番号４４）
ＹＱＳＡＬＬＰＨＫ（配列番号４５）
ＥＮＩＴＩＶＤＩＳＲ（配列番号４６）
ＹＥＥＥＶＬＳＲ（配列番号４７）
ＩＤＳＬＭＤＥＩＳＦＬＫ（配列番号４８）
ＶＬＥＡＥＬＬＶＬＲ（配列番号４９）
ＦＴＶＬＴＥＳＡＡＫ（配列番号５０）
ＹＰＧＰＱＡＥＧＤＳＥＧＬＳＱＧＬＶＤＲ（配列番号５１）
ＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）
ＦＩＰＬＩＰＩＰＥＲ（配列番号５３）
ＩＶＥＳＹＱＩＲ（配列番号５４）
ＳＤＬＹＩＧＧＶＡＫ（配列番号５５）
ＩＴＴＱＩＴＡＧＡＲ（配列番号５６）
ＴＴＶＶＡＡＡＡＦＬＤＡＦＱＫ（配列番号５７）
ＳＬＴＭＤＰＨＫ（配列番号５８）
ＹＬＹＧＳＤＱＬＶＶＲ（配列番号５９）
ＩＬＱＡＬＤＬＰＡＫ（配列番号６０）
ＫＰＶＥＨＷＨＱＬＶＥＶＳＲ（配列番号６１）
ＧＰＴＰＴＰＤＫ（配列番号６２）
ＨＰＣ（カルバミドメチル）ＴＬＧＰＦＩＨＡＴＮＡＬＨＶＲ（配列番号６３）
ＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲ（配列番号６４）
ＧＥＶＱＡＭＬＧＱＳＴＥＥＬＲ（配列番号６５）
ＬＧＰＬＶＥＱＧＲ（配列番号６６）
ＩＰＴＴＦＥＮＧＲ（配列番号６７）
ＶＬＮＱＥＬＲ（配列番号６８）
ＶＴＴＶＡＳＨＴＳＤＳＤＶＰＳＧＶＴＥＶＶＶＫ（配列番号６９）
ＡＳＳＩＩＤＥＬＦＱＤＲ（配列番号７０）
ＮＶＶＬＱＴＬＥＧＨＬＲ（配列番号７１）
ＥＧＨＬＲＳＩＬＧＴＬＴＶＥＱＩＹＱＤＲＤＱＦＡＫ（配列番号７２）
ＴＡＥＡＱＬＡＹＥＬＱＧＡＲ（配列番号７３）
ＧＰＦＰＱＥＬＶＲ（配列番号７４）
ＤＶＨＥＧＱＰＬＬＮＶＫ（配列番号７５）
ＥＶＶＳＰＱＥＦＫ（配列番号７６）
ＡＬＬＱＶＴＩＳＬＳＫ（配列番号７７）
ＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）
ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶ（配列番号７９）
ＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡ（配列番号８０）
ＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫ（配列番号８１）
ＷＹＦＤＶＴＥＧＫ（配列番号８２）
ＤＤＴＰＭＴＬＰＫ （配列番号８３）
ＨＧＹＥＮＰＴＹＲ（配列番号８４）
ＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）
ＡＷＴＶＥＱＬＲ（配列番号８６）
ＳＥＥＴＬＤＥＧＰＰＫ（配列番号８７）
ＥＳＷＥＭＮＳＥＥＫ（配列番号８８）
ＡＬＥＬＤＳＮＮＥＫ（配列番号８９）
ＬＳＥＬＩＱＰＬＰＬＥＲ（配列番号９０）
ＹＴＮＷＩＱＫ（配列番号９１）
ＭＹＡＴＩＹＥＬＫ（配列番号９２）
ＶＰＬＱＱＮＦＱＤＮＱＦＱＧＫ（配列番号９３）
ＭＤＳＴＡＮＥＶＥＡＶＫ（配列番号９４）
ＡＬＡＰＥＹＡＫ（配列番号９５）
ＶＴＶＮＹＰＰＴＩＴＥＳＫ（配列番号９６）
ＳＧＩＩＦＡＧＨＤＫ（配列番号９７）
ＭＹＹＳＡＶＥＰＴＫ（配列番号９８）
ＩＹＨＳＨＩＤＡＰＫ（配列番号９９）
ＤＳＡＨＧＦＬＫ（配列番号１００）
ＤＧＡＧＤＶＡＦＶＫ（配列番号１０１）
ＬＧＤＴＰＧＶＳＹＳＤＩＡＡＲ（配列番号１０２）
ＡＬＬＬＶＧＤＶＡＱＡＡＤＶＡＩＥＨＲ（配列番号１０３）
ＴＶＤＮＦＶＡＬＡＴＧＥＫ（配列番号１０４）
ＶＹＦＤＬＲ（配列番号１０５）
ＦＬＮＬＴＥＮＤＩＱＫ（配列番号１０６）
ＬＰＡＰＳＩＤＲ（配列番号１０７）
ＧＫＥＤＦＬＳＶＳＤＩＩＤＹＦＲ（配列番号１０８）
ＶＴＦＬＧＬＱＨＷＶＰＥＬＡＲ（配列番号１０９）
ＬＡＳＨＥＹＬＫ（配列番号１１０）
ＡＦＱＶＷＳＤＶＴＰＬＲ（配列番号１１１）
ＦＦＧＬＰＱＴＧＤＬＤＱＮＴＩＥＴＭＲ（配列番号１１２）
ＬＴＬＬＡＰＬＮＳＶＦＫ（配列番号１１３）
ＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４）
ＬＰＥＰＡＴＬＧＦＳＡＲ（配列番号１１５）
ＮＰＬＦＤＨＡＡＬＳＡＰＬＰＡＰＳＳＰＰＡＬＰ（配列番号１１６）
ＳＥＦＶＶＰＤＬＥＬＰＳＷＬＴＴＧＮＹＲ（配列番号１１７）および
ＥＧＴＹＳＬＰＫ（配列番号１１８）。
【請求項16】
少なくとも１つのタンパク質は、クロモグラニン－Ａ、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、プロサポシンおよびアポリポタンパク質Ｅからなる群から選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット。
【請求項17】
少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドが、以下からなる群より選択される、先行する請求項のいずれかに記載の方法またはキット：ＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）
ＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）
ＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）
ＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４）
ＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）および
ＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲ（配列番号６４）。
【請求項18】
少なくとも１つのタンパク質が、以下からなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法またはキット：マトリックスメタロプロテアーゼ－９
キチナーゼ－３様タンパク質１
タンパク質Ｓ１００－Ａ８
タンパク質Ｓ１００－Ａ９
好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）
補体Ｃ３
ガレクチン－３結合タンパク質
カタラーゼ
細胞外スーパーオキシドジスムターゼ
プロサポシン
β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ
カテプシンＤ
ベクリン－１
ライソゾーム関連膜糖タンパク質１
オートファジータンパク質１３
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＲＮＦ２６
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ３３
ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア
アポトーシス誘導因子１、ミトコンドリア
膜貫通タンパク質１２６Ａ
ニューロフィラメントライトポリペプチド
クロモグラニンＡ
コンタクチン－１
ニューレキシン－１β
シナプトタグミン－３
アポリポタンパク質Ｅ
アポリポタンパク質Ｄ
クラスタリン
フロチリン－２
カドヘリン－２
神経細胞接着分子２
アミロイドβ前駆体タンパク質
アミロイド様タンパク質１
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４
カリクレイン－６
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）
辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）
セルロプラスミン
セロトランスフェリン
液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）
ラクタドヘリン
７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ
トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３
神経増殖分化制御タンパク質１および
ガングリオシドＧＭ２活性化因子。
【請求項19】
少なくとも１つのタンパク質が、請求項１８に記載のタンパク質の４８種すべてである、請求項１８に記載の方法またはキット。
【請求項20】
少なくとも１つのタンパク質が、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリアおよびコンタクチン－１からなる群より選択される、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法またはキット。
【請求項21】
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３のタンパク質分解ペプチドがＬＦＣＥＴＣＤＲ（配列番号４０）であり、高速キナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリアのタンパク質分解ペプチドがＬＡＶＱＦＴＮＲ（配列番号４１）であり；および／またはコンタクチン－１のタンパク質分解ペプチドがＩＶＥＳＹＱＩＲ（配列番号５４）である、請求項２０に記載の方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、多重標的プロテオミクスに基づくアッセイを用いて、神経変性疾患の治療プロトコルの有効性を評価する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
神経変性疾患は、末梢神経系または中枢神経系（ＣＮＳ）の機能と構造の進行性の変性を特徴とする、異質な疾患群である。当該疾患の有病率は多くの国で増加しているため、その効果的な治療はますます重要になっている。当該疾患の治療経過を研究する１つのルートは、患者からの生物学的試料で容易に得られるバイオマーカーを調べることである(Heywoodら、Molecular Neurodegeneration、10、64（2015))。
【0003】
現在、神経変性疾患における限られた数のタンパク質バイオマーカーの測定には、ＥＬＩＳＡ、ＳＩＭＯＡ、その他の免疫測定法がしばしば用いられている。探索プロテオミクスは、複数のタンパク質を同時に測定するために使われることもあるが、これらの技術プラットフォームにはいずれも大きな限界がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
克服すべき技術的な課題は主に２つある。第一に、神経変性疾患に関連する複数のバイオマーカーを測定する包括的なバイオマーカーパネルの欠如である。第二に、これら複数のバイオマーカーを正確かつ再現性のある方法で、単一の検査で測定する技術プラットフォームの構築である。既存の分析技術プラットフォームは、精度、再現性、多重化能力に欠けている。
【0005】
導入（ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ）のスピードも問題である。新しい抗体の作製には、抗体が利用可能になった後のイムノアッセイを構築するのに必要な時間に加えて、６カ月から９カ月かかる可能性がある。ターゲット・プロテオミクス・アッセイは３～４ヶ月で構築可能で、これはほとんどの臨床試験で許容できるリードタイムである。
【0006】
Ｈｅｙｗｏｏｄらによる以前の研究（２０１５）は、パーキンソン病における標的プロテオミクスが、同疾患のバイオマーカーの同定に有用であることを示した。しかし、この論文では、パーキンソン病の治療プロトコルの有効性を評価するためのバイオマーカーを同定するという概念については述べられていない。
【0007】
本発明は、多重標的プロテオミクスアッセイを用いて神経変性疾患の治療プロトコルの有効性を評価する方法を提供する。好適には、バイオマーカーは脳脊髄液（ＣＳＦ）から得られる。したがって、本発明によって提供される検査は、パーキンソン病などの神経変性疾患に対して現在開発中の新しい治療法の治療効果をモニターすることができる。
【発明を実施するための形態】
【0008】
本発明の第一の態様によれば、対象の神経変性疾患の治療の有効性を評価する方法が提供され、当該方法は以下を含む：
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程。
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程。
【0009】
神経変性疾患の治療は、薬学的活性物質を含む医薬組成物の投与を含むことができる。医薬組成物の投与は、処方された治療コースまたは臨床試験の一部であってもよい。医薬組成物は、処方された治療コースまたは臨床試験プロトコルに従って、１日１回、１日２回、週１回、または他の頻度で投与することができる。臨床試験の期間は、１ヶ月、２ヶ月、６ヶ月、１２ヶ月のいずれかでありえる。
【0010】
治療の有効性は、神経変性疾患に対する一般的に適切な方法による治療の有効性の指標とすることができる。有効性は、対象を治療するために使用される医薬組成物の１つ以上の臨床症状または１つ以上の副作用の有無で表すことができる。したがって、治療の有効性は、表１に示すように、タンパク質を含む試料中のタンパク質バイオマーカー濃度の変化とも相関しうる。本明細書で定義される関連バイオマーカー濃度の変化は、バイオマーカーのベースライン値または対照値と比較したバイオマーカー濃度の増加または減少である可能性がある。
【0011】
絶対的なペプチド濃度は、試料中の一組のタンパク質間で比較することができる。試料は、治療開始（すなわち、第０週（「第ゼロ週」）の時点）から異なる時間間隔で採取することができる。その後の試料は、約２０週目および／または４５週目に患者から採取することができる。異なる時点で得られた試料の結果は、ベースラインに対して正規化することができ、結果はベースラインからの相対的変化として表すことができる。例えば、薬物処置群においてベースラインから１．５倍のペプチド濃度増加または０．６７倍の濃度減少がある一方、プラセボ群では対応するペプチド変化がないか、または少ないことは、本発明の方法による評価中の薬物を含む医薬組成物の薬物処置有効性を示すと考えられる。
【0012】
その後の試料は、およそ約２週目、４週目、６週目、８週目、１０週目、１２週目、１４週目、１６週目、１８週目、２０週目、２２週目、２４週目、２６週目、２８週目もしくは３０週目、および／または３５週目、４０週目、４５週目、５０週目、５５週目もしくは６０週目に患者から採取することができる。
【0013】
その後の試料は、およそ約１、２、３、４、５、６ヶ月目および／または７、８、９、１０、１１、１２ヶ月目に患者から採取することができる。その後、約６ヵ月間隔で患者から試料を採取することができる。その後の試料は、約６ヵ月目および／または１２ヵ月目に患者から採取することができる。
【0014】
薬物処置群においてベースラインから少なくとも１．５倍のペプチド濃度の増加および／または少なくとも０．６７倍の濃度の減少がある一方、プラセボ群では対応するペプチドの変化がないか、または少ないことは、本発明の方法に従って評価中の薬物を含む医薬組成物の薬物処置有効性を示すと考えられる。
【0015】
薬物処置群において少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．６倍、少なくとも１．７倍、少なくとも１．８倍、少なくとも１．９倍または少なくとも２．０倍のペプチド濃度増加、および／または少なくとも０．９倍、少なくとも０．８倍、少なくとも０．７倍、少なくとも０．６倍、少なくとも０．６７倍、少なくとも０．５倍、少なくとも０．４倍、少なくとも０．３倍、少なくとも０．２倍、または少なくとも０．１倍のペプチド濃度減少がある一方、プラセボ群では対応するペプチド変化がないか、または少ないことは、本発明の方法に従って評価中の薬物を含む医薬組成物の薬物処置有効性を示すと考えられる。
【0016】
神経変性疾患は、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、バッテン病、または伝達性海綿状脳症（例えば、スクレイピー、牛海綿状脳症（ＢＳＥ）またはクロイツフェルト・ヤコブ病（ＣＪＤ）、（異所性、変異型、家族性、散発性のＣＪＤを含む）、ライソゾーム神経変性疾患（ゴーシェ病など）からなる群から選択され得る。神経変性疾患はパーキンソン病であり得る。
【0017】
本明細書に記載されているように、本発明の方法は、アルツハイマー病などの他の神経変性疾患、および神経変性要素を有する他の疾患、例えば希少疾患／先天性代謝異常／ライソゾーム貯蔵病などの広範な神経変性疾患に適用することができる。本発明の方法による検査は、炎症性疾患、例えば腎疾患におけるシスタチンＣなどにも適用できる。
【0018】
試料は、脳脊髄液（ＣＳＦ）、血液（血清、全血（静脈血または末梢血）、血漿、尿、涙、唾液、間質液、リンパ液または組織試料である。試料は脳脊髄液（ＣＳＦ）であり得る。試料は、腰椎穿刺による髄液の採取、静脈からの直接採取による静脈血の採取、あるいは指刺式採血装置やブラッドスポットカード、血漿スポットカードによる採取を含む、任意の適切な手段によって採取することができる。
【0019】
同じタンパク質を別の技術プラットフォームで測定することもできる。ＥＬＩＳＡ、ＳＩＭＯＡ、Ｏｌｉｎｋ、ウェスタンブロット、または他のイムノアッセイプラットフォームを使用して、同じタンパク質セットを測定することができる。アプタマー（特定の標的分子に結合するオリゴヌクレオチドまたはペプチド分子）は、同様のアッセイにおいて抗体の代わりに使用することができる。
【0020】
この検査には、さまざまな種類の試料を使用することができる。現在のところ、この検査は清澄な髄液試料で検証されているが、様々な試料添加物（抗凝固剤）を使用した血清、血漿などの異なる生体液試料が適している可能性がある。これには、Ｋ２およびＫ３ ＥＤＴＡ血漿チューブ、ヘパリン、シュウ酸カリウム／フッ化ナトリウム処理血漿チューブなどが含まれる。
【0021】
プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、エラスターゼ、またはスブチリシン）、システインプロテアーゼ（例えば、パパイン、カスパーゼ－１、アデナイン、ピログルタミン酸ペプチダーゼＩ、ソルターゼＡ）、Ｃ型肝炎ウイルスペプチダーゼ２、シンドビスウイルス型ｎｓＰ２ペプチダーゼ、ジペプチジルペプチダーゼＶＩ、ＤｅＳＩ－１ペプチダーゼ、ＴＥＶプロテアーゼ、アミドホスホリボジルトランスフェラーゼ前駆体、γ－グルタミルヒドロラーゼ、ヘッジホッグタンパク質、ｄｍｐＡアミノペプチダーゼ）、スレオニンプロテアーゼ（例えばオルニチンアセチルトランスフェラーゼなど）、アスパラギン酸プロテアーゼ（ペプシン、カテプシンＤ、カテプシンＥ、ナプシンＡ、ネペンテシン、プレセニリン、レニン（キモシン）など）、グルタミン酸プロテアーゼ（例えば、スキタリドグルタミン酸ペプチダーゼ（エクオリシン）、アスペルギログルタミン酸ペプチダーゼ）、メタロプロテアーゼ（例えば、ＡＤＡＭまたはマトリックスメタロプロテアーゼ）、またはアスパラギンペプチドリアーゼであり得る。プロテアーゼはトリプシンであり得る。
【0022】
したがって、タンパク質分解ペプチドとは、タンパク質配列中のアミノ酸間のペプチド結合を切断するプロテアーゼの作用によって生成された、タンパク質由来のペプチド配列のことである。したがって、このようなタンパク質分解ペプチドは、多数のアミノ酸から形成されるオリゴペプチドである。タンパク質分解ペプチドは、長さ５～３０アミノ酸残基、好適には長さ６～２０アミノ酸、長さ７～２５アミノ酸、または長さ５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９もしくは３０アミノ酸のいずれかであってもよい。
【0023】
タンパク質に対するプロテアーゼ・トリプシンの作用によって調製されるタンパク質分解ペプチドは、トリプシンペプチドなどと呼ばれることがある。
【0024】
タンパク質分解ペプチドは、好適には表１に示すような配列を有する。
【0025】
本発明の方法は、そのタンパク質分解ペプチドに関して、表１の最大５０のタンパク質すべての存在についてアッセイすることを含み得る。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、表１に示されるように、少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５または５０種のタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイすることを含み得る。
【0026】
したがって、本発明の方法は、表１に示した５０種のタンパク質のうち、最大１１８種のタンパク質分解ペプチドを測定することを含む。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、表１の少なくとも５～１０、５～１５、５～２０、５～２５、５～３０、５～３５、５～４０、５～４５または５～５０種のタンパク質分解ペプチドについてアッセイすることを含み得る。好ましくは、アッセイされるタンパク質分解ペプチドの数は、表１に示すように、少なくとも５種、少なくとも１５種、少なくとも２０種または少なくとも２５種のタンパク質分解ペプチドである。アッセイされるタンパク質分解ペプチドの数は、表１に示すように、４８種のタンパク質分解ペプチドとすることができる。表１に示す４８種のタンパク質分解ペプチドをアッセイする場合、タンパク質分解ペプチドは、タンパク質ＭＴＳＳ １（Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ＹＧＬ－１）およびリンパ球細胞質タンパク質２を除き、表１の各タンパク質の１種のタンパク質分解ペプチドであってもよい。
【0027】
１つ以上のタンパク質および／またはタンパク質分解ペプチドをアッセイする場合、本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質群から選択される少なくとも２つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドのパネルの存在についてアッセイすることを含むといえる。好ましくは、本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、少なくとも４８種のタンパク質のタンパク質分解ペプチドのパネルの存在についてアッセイすることを含み得、ここで、４８種のタンパク質は、以下の通りである：
マトリックスメタロプロテアーゼ－９
キチナーゼ－３様タンパク質１
タンパク質Ｓ１００－Ａ８
タンパク質Ｓ１００－Ａ９
好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）
補体Ｃ３
ガレクチン－３結合タンパク質
カタラーゼ
細胞外スーパーオキシドジスムターゼ
プロサポシン
β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ
カテプシンＤ
ベクリン－１
ライソゾーム関連膜糖タンパク質１
オートファジータンパク質１３
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＲＮＦ２６
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ３３
ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア
アポトーシス誘導因子１、ミトコンドリア
膜貫通タンパク質１２６Ａ
ニューロフィラメントライトポリペプチド
クロモグラニンＡ
コンタクチン－１
ニューレキシン－１β
シナプトタグミン－３
アポリポタンパク質Ｅ
アポリポタンパク質Ｄ
クラスタリン
フロチリン－２
カドヘリン－２
神経細胞接着分子２
アミロイドβ前駆体タンパク質
アミロイド様タンパク質１
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４
カリクレイン－６
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）
辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）
セルロプラスミン
セロトランスフェリン
液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）
ラクタドヘリン
７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ
トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３
神経増殖分化制御タンパク質１および
ガングリオシドＧＭ２活性化因子。
マトリックスメタロプロテアーゼ－９
キチナーゼ－３様タンパク質１
タンパク質Ｓ１００－Ａ８
タンパク質Ｓ１００－Ａ９
好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）
補体Ｃ３
ガレクチン－３結合タンパク質
カタラーゼ
細胞外スーパーオキシドジスムターゼ
プロサポシン
β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ
カテプシンＤ
ベクリン－１
ライソゾーム関連膜糖タンパク質１
オートファジータンパク質１３
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＲＮＦ２６
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ３３
ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア
アポトーシス誘導因子１、ミトコンドリア
膜貫通タンパク質１２６Ａ
ニューロフィラメントライトポリペプチド
クロモグラニンＡ
コンタクチン－１
ニューレキシン－１β
シナプトタグミン－３
アポリポタンパク質Ｅ
アポリポタンパク質Ｄ
クラスタリン
フロチリン－２
カドヘリン－２
神経細胞接着分子２
アミロイドβ前駆体タンパク質
アミロイド様タンパク質１
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４
カリクレイン－６
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）
辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）
セルロプラスミン
セロトランスフェリン
液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）
ラクタドヘリン
７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ
トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３
神経増殖分化制御タンパク質１および
ガングリオシドＧＭ２活性化因子。
【0028】
表１は、薬物治療後のパーキンソン病患者において差次的に発現する５０種のタンパク質と、対応する１１８種のタンパク質分解ペプチド配列、および対応する重同位体標識ペプチド内部標準配列を示したものである。表１は、対応するタンパク質分解ペプチド配列および対応する重同位体標識ペプチド内部標準配列とともに、任意の適切な分析対照タンパク質としてヘモグロビンサブユニットβも示している。
【0029】
本発明の方法に従って任意のタンパク質の発現を分析するためには、内部標準配列は必要としない場合がある。例えば、重同位体標識内部標準物質を使用せずに、酵母エノラーゼのような単一のタンパク質内部標準物質をバイオマーカー検査全体に使用することができる。内部標準物質を持たないペプチドの定量には、同様の保持時間を持つ他の重同位体標識内部標準物質を用いることができる。例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｃｏｌｌｅｇｅ Ｄｕｂｌｉｎの前立腺がん検査など、内部標準物質をまったく使用しない標的プロテオミクス法の例がある。
【0030】
一実施態様において、本発明の方法は、好適には、以下のタンパク質および対応するタンパク質分解ペプチド群中の６種のタンパク質分解ペプチドについてアッセイすることを含み得る：
【0031】
少なくとも１つのタンパク質は、クロモグラニン－Ａ、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、プロサポシンおよびアポリポタンパク質Ｅからなる群から選択され得る。少なくとも１つのタンパク質は、クロモグラニン－Ａ、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３およびプロサポシンからなる群から選択され得る。
【0032】
少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドは、以下からなる群から選択され得る：
ＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）
ＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）
ＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）
ＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４）
ＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）および
ＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲ（配列番号６４）。
ＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）
ＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）
ＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）
ＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４）
ＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）および
ＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲ（配列番号６４）。
【0033】
少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドは、以下からなる群から選択され得る：
ＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）
ＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）
ＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）
ＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４） および
ＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）。
ＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）
ＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）
ＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）
ＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４） および
ＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）。
【0034】
一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質はクロモグラニンＡであり、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドはＳＧＥＬＥＱＥＥＥＲ（配列番号５２）である。
【0035】
一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質はアミロイドβ前駆タンパク質であり、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドはＱＱＬＶＥＴＨＭＡＲ（配列番号７８）である。
【0036】
一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質はアミロイド様タンパク質１であり、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドはＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（配列番号８５）である。内部標準物質はＱＭＹＰＥＬＱＩＡＲ（Ｕ－１３Ｃ６，１５Ｎ４）ＶＥＱＡＴ（配列番号１６２）であってもよい。
【0037】
一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質はトランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３であり、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドはＧＤＥＬＡＤＳＡＬＥＩＦＫ（配列番号１１４）である。
【0038】
一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質はプロサポシンであり、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドはＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（配列番号２３）である。内部標準物質はＱＥＩＬＡＡＬＥＫ（Ｕ－１３Ｃ６，１５Ｎ２）ＧＣＳＦＬ（配列番号１３２）であってもよい。
【0039】
一実施形態では、少なくとも１つのタンパク質はアポリポタンパク質Ｅであり、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドはＡＡＴＶＧＳＬＡＧＱＰＬＱＥＲ（配列番号６４）である。内部標準はＡＡＴＶＧＳＡＧＱＰＬＱＥＲ（Ｕ－１３Ｃ６，１５Ｎ４）ＡＱＡＷＧ（配列番号１５１）でもよい。
【0040】
本発明の方法では、質量分析を用いてペプチド、例えば表１に示す配列を有するタンパク質分解ペプチドの濃度を同定する。試料中のタンパク質分解ペプチドを分析するための質量分析（ＭＳ）システムにおいて、タンパク質分解ペプチドはＭＳシステムに注入され、そこでタンパク質分解ペプチドはまずインタクトなペプチドとして検出され、その後ペプチドフラグメントと呼ばれる小さな断片に断片化される。本発明の方法は、表１に示すように、最大５０種のタンパク質のうち、最大１１８種のタンパク質分解ペプチドの検出を提供する。ペプチドの濃度は、既知の参照タンパク質分解ペプチドに対する濃度の検量線を参照して、神経変性疾患に対する治療の有効性を評価するため、および／または神経変性疾患を有する被験体を層別化するために使用することができる。
【0041】
したがって、試料中のタンパク質分解ペプチドの濃度は、神経変性疾患の治療効果の評価、および／または神経変性疾患を有する対象の層別化に関連する。一般に、対照からのタンパク質分解ペプチド濃度の差（増加または減少のいずれか）は、神経変性疾患に対する治療の有効性、および／または神経変性疾患を有する対象の層別化を示す。
【0042】
対照はベースライン対照であってもよい。対照はプラセボ群であってもよい。タンパク質分解ペプチドの濃度は、対照に対して正規化することができる。濃度は、ベースラインからの倍数変化など、対照に対する相対的な倍数変化として表すことができる。
【0043】
本発明の方法は、本明細書でタンパク質分解ペプチドがアップレギュレートされるかダウンレギュレートされるかをさらに説明することができる。例えば臨床試験において、異なる患者群間でバイオマーカーレベルが異なる可能性がある；すなわち、他の群（対照群やプラセボ群など）と比較して増加または減少する可能性がある。バイオマーカーの組み合わせは、バイオマーカー濃度に基づき、主成分分析（ＰＣＡ）またはフォールド変化差を使用して患者群を分けるために使用することができる。Ｆｏｌｄ変化差は、例えば図６と図７に示されるように、閾値またはカットオフポイントを用いて患者群を分けるために用いることができる。
【0044】
参照ペプチドは、試料中の表１のペプチドの濃度を検出および定量する本発明の方法において使用する前に、質量分析計を事前に設定するために使用することができる。参照ペプチドはまた、信頼性の高い結果を保証するために、検査した試料の各バッチでキャリブレーションラインを構築することを可能にする。重同位体標識ペプチドは、各試料の分析ばらつきをコントロールするための内部標準物質として使用することができ、また検量線を提供することもできる。
【0045】
本発明によれば、分析物の濃度を測定するために質量分析プラットフォームが使用される。この検査では、ＭＲＭモードで動作するトリプル四重極質量分析プラットフォームが望ましいが、この検査を中心に設計するために、他の質量分析プラットフォームや他のデータ収集モードを使用することもできる。一例として、高分解能質量分析プラットフォーム（Ｓｃｉｅｘ ６６００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｏｒｂｉｔｒａｐ、Ｗａｔｅｒｓ ＱＴＯＦ型装置など）では、「擬似」ＭＲＭまたはＰＲＭモードを測定に使用することができる。トリプル四重極装置はより堅牢で、より再現性の高いデータを提供するため、他のプラットフォームでは検査のすべての面で同じ性能に達しない可能性がある。
【0046】
また、質量分析プラットフォームと結合できるクロマトグラフィーシステムも各種ある。この検査は「標準フロー」（ｍｌ／分）の液体クロマトグラフィーシステムを使用するように設計されているが、μｌ／分またはｎｌ／分の範囲の低フローシステムを使用することもできる。
【0047】
質量分析前のペプチドイオン化インターフェース／方法も異なる可能性がある。この検査は、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）を使用するように設計されているが、ペプチドは、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）、脱離エレクトロスプレーイオン化（ＤＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、またはその他のイオン化法を使用してイオン化することがでる。
【0048】
同じターゲット・プロテオミクス・プラットフォーム上で異なる内部標準物質を使用することができる。この検査は、正確な測定のために重同位体標識内部標準物質を使用するように設計されているが、異なる標識または非標識のペプチドまたはタンパク質内部標準物質を使用することも可能であり、その場合、重同位体標識標準物質の性能を満たすことも、満たさないこともある。
【0049】
この方法は、試料中で測定されたタンパク質分解ペプチドの相対濃度を決定することを含んでいてもよい。試料中で測定されたペプチドの相対濃度は、対応する標識及び／又は非標識参照タンパク質分解ペプチドに対するタンパク質分解ペプチドの相対濃度を指す場合がある。
【0050】
本明細書に記載された検査はすべて、同じ技術プラットフォームを用いて、生物学的試料中のタンパク質、例えばＣＳＦタンパク質を測定する別の検査と多重化することができる。したがって、本発明の検査は、より大きな検査の一部である可能性がある。他の治療効果検査が出現した場合、本発明の検査はそのような他の検査を補強するために使用され、全体的な性能を高めることができる。
【0051】
ペプチド配列の元となるタンパク質は、本明細書に記載した表１に示されている。本発明の方法は、多重アッセイであってもよい。
【0052】
本明細書で規定するように、表１に示したものとは異なるペプチドセットも、同じ標的プロテオミクス・プラットフォームを用い、異なるプロテアーゼを用いて、表１に示したものと同じタンパク質から測定することができる。本明細書に記載した本発明の実施例は、本発明の方法の一実施形態を示すが、同じ５０種のタンパク質セットから異なるペプチドを用いてもよい。これには、この検査と同じプロテアーゼ（トリプシン）や異なるプロテアーゼ（ＬｙｓＣ、ＧｌｕＣなど）を用いて生成されたペプチドも含まれる。
【0053】
典型的には、本発明の方法によるペプチドの質量分析法は、時間多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作されるトリプル四重極装置を用いた液体クロマトグラフィー標的質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）である。
【0054】
したがって、本発明の方法は、標的プロテオミクスの使用を含む。この技術は、与えられた試料から特定の、あらかじめ選択されたタンパク質またはタンパク質分解ペプチドを定量することを含み、タンパク質の選択を導くためには、疾患生物学に関する既存の理解が必要である。したがって、この技術は、疾患生物学に関する既存の知識や仮説なしに、試料中のすべてのタンパク質やタンパク質分解ペプチドに関する情報を収集しようとする探索プロテオミクスとは異なる。探索プロテオミクスでは、目的のタンパク質やペプチドごとに内部標準物質やキャリブレーションラインを使用することはできない。探索プロテオミクスはまた、標的プロテオミクスにおけるＭＲＭやＰＲＭとは異なる装置操作モード、例えばＳＷＡＴＨやＨＤＭＳＥなどを用いて実施される。データ処理では、絶対濃度を提供できない場合、シグナルの正規化と定量化にも異なるアプローチを用いる。探索プロテオミクス・プラットフォームには、標的プロテオミクス・プラットフォームの頑健性と再現性が欠けている。標的プロテオミクスと探索プロテオミクスは、探索プロテオミクスのプラットフォームを利用する科学者チームが、標的プロテオミクスに関する特別な知識と経験がなければ、一般的に標的プロテオミクスバイオマーカー検査を開発することができないという点で、異なるものである。これは、最初のコンセプト、試料調製、データ収集、処理から臨床現場での最終的な検査実施に至るまで、プロセスの各段階において、上記のような違いがあるためである。
【0055】
本発明の方法は、タンパク質分解参照ペプチドを使用して実施されるが、同じ標的プロテオミクス・プラットフォーム上で任意の適切な内部標準ペプチドを使用するように構成することもできる。本発明の方法は、正確な測定のために、重同位体標識内部標準物質とともに好適に用いることができる。重同位体標識タンパク質分解ペプチドとしての内部標準の例を、そこに記載されたタンパク質分解ペプチドに関して表１に示す。内部標準物質は、本発明の方法の工程（ｉ）で試料中のタンパク質のタンパク質分解消化が起こる前に試料に添加することができる。あるいは、本発明の方法の工程（ｉ）で試料中のタンパク質のタンパク質分解消化が起こった後に、内部標準物質を試料に添加してもよい。質量分析計は、前記内部標準物質を用いて予め設定することができる。好適な重同位体標識は、13Ｃ、15Ｎ、および／または2Ｈである。
【0056】
一実施形態では、本発明の方法は、パーキンソン病の治療レジメの有効性を評価するために使用することができる。この検査では、表１に示すように、５０種のＣＳＦタンパク質から生じる１１８種のペプチドの濃度を測定する。本明細書に記載されたいくつかのタンパク質は、これまでパーキンソン病との関連はなく、パーキンソン病（ＰＤ）における薬物治療効果のバイオマーカーとして報告されていなかった。このタンパク質セットは、パーキンソン病病態の生化学的側面をすべてカバーし、以下のようなアッセイを含んでいる：炎症；酸化ストレス；オートファジー／ライソゾーム；ユビキチン・プロテアソーム・システム（ＵＰＳ）；ミトコンドリア；軸索／神経変性；シナプス変性；リポタンパク質代謝；エクソソームの放出促進；内皮機能障害；アミロイド処理およびＰＤに関連する他のタンパク質。この検査には、対照としてヘモグロビンも含まれ、髄液が血液で汚染されていないかどうかを監視する。
【0057】
本発明の方法は、コンピュータによって実行される工程を含み、コンピュータによって制御される装置を含むことができる。工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、タンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程は、コンピュータによって制御される装置によって実施することができる。
【0058】
本発明はまた、対象における神経変性疾患の治療の有効性を評価するためのコンピュータ実装方法を提供し、この方法は、対象から得られた試料中の少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルを表す試料データをコンピュータに受信させること、試料中の少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルをベースライン対照と比較するためのソフトウェアをコンピュータ上で実行することを含み、少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルとベースライン対照との間の差は、神経変性疾患に対する治療の有効性を示し、比較に基づいて神経変性疾患に対する治療の有効性を表す有効性データを出力する。
【0059】
また、本発明は、コンピュータによって実行されると、コンピュータに本発明のコンピュータ実施方法を実行させる命令を含むコンピュータプログラムも提供する。
【0060】
試料中の少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルをベースライン対照と比較する工程は、最初に試料中の少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドを表すデータを受信したコンピュータとは異なるコンピュータで実施されてもよいことが理解されよう。
【0061】
また、本発明は、神経変性疾患の治療効果を評価するためのコンピュータ装置であって、コンピュータを内蔵する第１の装置と、第２のコンピュータと、第１の装置と第２のコンピュータとの間でデータを伝送するための通信路とを備えるコンピュータ装置を提供する；ここで、第１の装置は、対象から得られた試料中の少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルを表す試料データを受信し、通信チャネルを介して試料データを第２のコンピュータに送信するように配置され、第２のコンピュータは、神経変性疾患に対する治療の有効性を決定するために、試料中の少なくとも少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルをベースライン対照と比較するソフトウェアを実行するように配置され、ここで、少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルとベースライン対照との間の差は、神経変性疾患に対する治療の有効性を示し、比較に基づいて神経変性疾患に対する治療の有効性を表す有効性データを出力する。
【0062】
第二のコンピュータは、通信路を介して第一の装置に、あるいは第三のコンピュータに効能データを送信するように配置されることがある。
【0063】
いくつかの実施形態において、第１の装置は、試料中の少なくとも１つのタンパク質分解ペプチドのレベルを測定するための質量分析装置または機器を組み込むことができる。
【0064】
この検査は、既存の規制基準に適合する唯一の質量分析プラットフォーム上に構築されており、継続的な臨床検査に適している。ユニークなことに、この検査では１１８種のペプチドを可能な限り堅牢な方法で同時に測定することができる。測定されるすべてのペプチドには専用の検量線と内部標準物質があり、絶対濃度を提供し、分析シグナルの変動を補正する。ＣＳＦ試料調製プロトコルも、この特定のタンパク質群を検出するために実験的に最適化されている。
【0065】
この検査は、新しく発見された分子を含めることができるタンパク質セットの迅速な反復を可能にする。これはまた、このアッセイを特定の治療法、患者集団、神経変性疾患（サブ）タイプに合わせて調整することを可能にする。
【0066】
本発明は、パーキンソン病などの神経変性疾患に対して開発中の新規治療法の治療効果を評価するための、世界初の包括的標的プロテオミクスバイオマーカー検査を提供する。
【0067】
本発明が提供するこの検査システムは、標準化された「アッセイキット」形式で商品化することが可能であり、これにより、試料を集中検査施設に送るだけでなく、顧客が自身の検査室に設置するエンド・ツー・エンドのソリューションを提供することができる。
【0068】
本発明の方法は、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患の治療のために、開発中の新規治療法または既存の／再利用された治療法の治療効果を評価するための生体液検査として使用することができる。このような用途には、臨床、前臨床開発、ファーマコビジランスにおける治療が含まれる。
【0069】
図６は、４８種のバイオマーカーの濃度変化を示す。これは、３つの患者グループ（プラセボ、中用量処置群、高用量処置群）のバイオマーカーシグネチャーが異なることを示している：すなわち、プラセボ群ではほとんどのバイオマーカーが経時的に減少するのに対し、両薬物処置群ではほとんどのバイオマーカーが経時的に増加する。したがって、この４８種のバイオマーカーパネルから任意の数のバイオマーカーを用いれば、プラセボ対照無作為化臨床試験における薬物治療後の分子レベルの変化を検出することが可能であり、薬物治療効果を評価するツールとして本発明が応用できることを示している。
【0070】
本発明の方法は、神経変性疾患、例えばパーキンソン病患者集団を、治療に対する応答に応じて層別化するための生体液検査として使用することができる。このような方法は、コンパニオン診断や補完的診断検査、あるいは臨床試験や前臨床試験、あるいは治療法承認後の医療現場で使用される精密医療のためのツールとなるだろう。
【0071】
本発明の第二の態様によれば、神経変性疾患を有する対象を層別化する方法が提供され、この方法は以下を含む：
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／コンタクチン参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、並びに、
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象を層別化する工程。
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／コンタクチン参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、並びに、
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象を層別化する工程。
【0072】
薬物治療後の患者群を層別化するために、薬物治療を受けた患者群内のバイオマーカー（すなわちペプチド）の軌跡を比較することができる。バイオマーカーシグナルが増加した（すなわち、アッセイされるバイオマーカータンパク質の濃度が増加した）すべての患者を第一のサブグループに層別化することができる一方、バイオマーカーシグナルが減少した、またはバイオマーカーシグナルが有意に変化しなかった（すなわち、アッセイされるバイオマーカータンパク質の濃度が減少した、または濃度に変化がなかった）すべての患者を第二のサブグループに分類することができる。濃度の変化（増加または減少のいずれか）は、ベースライン対照値に対するものであってもよいし、一定期間（例えば２０週間または４５週間）にわたって測定されたものであってもよい。
【0073】
試料中で測定されたペプチドの相対濃度は、対応する標識及び／又は非標識参照タンパク質分解ペプチドに対するペプチドの相対濃度を指す場合がある。
【0074】
試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って対象を層別化することは、試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って対象を２つ以上の群に分離することを含み得る。対象を層別化及び／又はグループ分けするために使用される相対濃度は、ベースライン、薬物投与後第２０週目及び／又は４５週目など、任意の適切な時点とすることができる。対象の層別化および／またはグループ分けには、任意の適切な閾値を用いることができる。例えば、対象を２群に層別化し、層別化されたすべての対象のペプチドの平均相対濃度より高いか低いペプチドの相対濃度を有することに基づくことができる。平均値は、平均値、中央値、最頻値のいずれかであり得る。あるいは、対象を、ペプチドの相対濃度が閾値を上回るか下回るかに基づいて、２つのグループに層別化することもできる。閾値はあらかじめ決定してもよい。閾値は、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４または０．１５のような任意の適切な値とすることができる。
【0075】
図７は、パーキンソン病と診断され、臨床開発中の新規パーキンソン病治療薬を投与された５人の患者における４８種のバイオマーカーの経時的な濃度変化を示す。図は、６ヵ月後と１２ヵ月後のバイオマーカー濃度のベースラインからの倍数変化を示。患者２と４（治療後にほとんどのバイオマーカーが減少）は、患者３と５（治療後にバイオマーカーが増加）とは異なる反応を示す。パーキンソン病は臨床的にも分子レベルでも不均一な疾患であり、したがって薬物治療に対する患者の反応も異なるというのが、パーキンソン病分野における現在の専門家のコンセンサスである。さらに、この特異的な薬剤は、そのマルチモーダルな作用機序の結果、パーキンソン病患者によって異なる応答を引き起こすことが期待される。したがって、この図に示されたバイオマーカー結果は、本発明がこれらの異なる患者群を同定するための実用的なツール（例えば、ＣＳＦバイオマーカー検査）を提供し、したがって患者層別化に応用できることを示している。
【0076】
本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ファストキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリアおよびコンタクチン－１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイすることを含み得る。Ｅ３ユビキチンプロテインリガーゼ ＴＲＩＭ３３のタンパク質分解ペプチドはＬＦＣＥＴＣＤＲ（配列番号４０）であってもよい。ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリアのタンパク質分解ペプチドはＬＡＶＱＦＴＮＲ（配列番号４１）であってもよい。コンタクチン－１のタンパク質分解ペプチドは ＩＶＥＳＹＱＩＲ（配列番号５４）であってもよい。
【0077】
本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物コンタクチンのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイすることを含み得、タンパク質がＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３であり、タンパク質分解ペプチドがＬＦＣＥＴＣＤＲ（配列番号４０）であり得る。
【0078】
本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイすることを含み得、タンパク質がＦａｓｔキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリアであり、タンパク質分解ペプチドがＬＡＶＱＦＴＮＲ（配列番号４１）であり得る。
【0079】
本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイすることを含み得、タンパク質がコンタクチン－１であり、タンパク質分解ペプチドがＩＶＥＳＹＱＩＲ（配列番号５４）であり得る。
【0080】
本発明の方法は、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患に対する開発中の新規治療法または既存の治療法の安全性を評価するのに役立つ生体液検査として使用することができる。これには臨床開発中または前臨床開発中の治療法も含まれる。
【0081】
本発明の方法は、異なる病因（異なる遺伝子変異、散発性、早期発症、異なる毒素、他の疾患例えばゴーシェ病などの結果）の結果として、神経変性疾患、例えばパーキンソン病の重症度や他の側面を比較するための生体液検査として使用することができる。
【0082】
本発明の方法は、集団のどのサブグループがより軽度またはより重篤なパーキンソン病を発症するかを決定するための集団研究のための生体液検査として使用することができる。これには年齢、さまざまな地域、食事、合併症などが含まれる。
【0083】
本発明の方法は、開発中の新規治療薬の作用機序を解明するための生体液検査として使用することができる。本発明の方法は、試験開発段階での交差検証を含む、神経変性疾患、例えばパーキンソン病に対する将来の試験のための参照方法／ベンチマークとしての生体液検査として使用することができる。
【0084】
本明細書に記載されたこの検査の一部は、将来、神経変性疾患、例えばパーキンソン病の診断検査に使用される可能性がある。本明細書に記載された本検査の一部は、臨床現場において、病期／重症度に応じてパーキンソン病患者集団を層別化するために使用される可能性がある。本明細書に記載された本検査の一部は、例えばパーキンソン病などの神経変性疾患や、より重篤な病型／病期を発症する個人のリスクを決定する予後／予測ツールとして使用される可能性がある。
【0085】
本発明の第３の態様によれば、神経変性疾患の診断方法が提供され、該方法は以下を含む：
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、並びに
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象の神経変性疾患を診断する、工程。
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、並びに
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象の神経変性疾患を診断する、工程。
【0086】
本発明の第４の態様によれば、神経変性疾患を有する対象の治療のための方法が提供され、該方法は以下を含む：
（ａ）（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程；
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象の神経変性疾患を診断する工程、並びに
（ｃ）神経変性疾患の治療のために、対象に医薬組成物を投与する工程。
（ａ）（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程；
（ｂ）試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、対象の神経変性疾患を診断する工程、並びに
（ｃ）神経変性疾患の治療のために、対象に医薬組成物を投与する工程。
【0087】
パーキンソン病の治療に適した医薬組成物としては、ブロモクリプチン、カベルゴリン、ラザベミド、レボドパ、ペルゴリド、プラミペキソール、ラサギリン、ロピニロール、ロチゴチンおよびセレギリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0088】
アルツハイマー病の治療に適した医薬組成物には、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣＩ）またはＮＭＤＡ受容体活性阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。コリンエステラーゼ阻害剤（ＣＩ）の例としては、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＮＭＤＡ受容体活性阻害剤の例としては、メマンチンがある。
【0089】
本発明の第５の態様によれば、対象の神経変性疾患の第二選択治療のための方法が提供され、該方法は以下を含む：
（ａ）対象の神経変性疾患に対する第一選択治療の有効性を評価する工程であって、該方法は以下を含む：
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、並びに
（ｂ）神経変性疾患の第二選択治療のために、対象に医薬組成物を投与する工程。
（ａ）対象の神経変性疾患に対する第一選択治療の有効性を評価する工程であって、該方法は以下を含む：
（ｉ）試料をプロテアーゼとインキュベートして、試料中のタンパク質のタンパク質分解消化物を形成することにより、アッセイ用の対象からの生物学的試料を調製する工程；および
（ｉｉ）工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイする工程であって、前記群は、マトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなり、
ここで、前記タンパク質分解ペプチドの存在は、対応する標識および／または非標識参照タンパク質分解ペプチドを参照して、質量分析を使用してアッセイされる、工程、並びに
（ｂ）神経変性疾患の第二選択治療のために、対象に医薬組成物を投与する工程。
【0090】
神経変性疾患の第一選択治療は、処方された適切な治療方針であればどのようなものでもよい。第一選択法の治療と第二選択法の治療は、対象に投与される医薬組成物、剤形および／または投与レジメンの点で同じであっても異なっていてもよい。
【0091】
パーキンソン病の治療に適した医薬組成物としては、ブロモクリプチン、カベルゴリン、ラザベミド、レボドパ、ペルゴリド、プラミペキソール、ラサギリン、ロピニロール、ロチゴチンおよびセレギリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【0092】
アルツハイマー病の治療に適した医薬組成物には、コリンエステラーゼ阻害剤（ＣＩ）またはＮＭＤＡ受容体活性阻害剤が含まれるが、これらに限定されるものではない。コリンエステラーゼ阻害剤（ＣＩ）の例としては、タクリン、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンなどが挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＮＭＤＡ受容体活性阻害剤の例としては、メマンチンがある。
【0093】
上記に加えて、本発明はアッセイキット形式で商品化することができる。このようなキットには、標準化された消耗品一式が含まれ、顧客の研究室での検査実施方法に関する説明書とともに顧客サイトに出荷される。また、検査方法を詳しく説明した指示書（標準操作手順書）を消耗品なしで別売することもできる。
【0094】
本発明の第６の態様によれば、対象の神経変性疾患に対する第一選択治療の有効性を評価するためのキットであって、以下を含むキットが提供される：
表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在について質量分析によって試料を分析するための複数の試料調製媒体であって、前記群はマトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなる、複数の試料調製媒体。。
表１に示すタンパク質の群から選択される少なくとも１つのタンパク質のタンパク質分解ペプチドの存在について質量分析によって試料を分析するための複数の試料調製媒体であって、前記群はマトリックスメタロプロテアーゼ－９、キチナーゼ－３様タンパク質１、タンパク質Ｓ１００－Ａ８、タンパク質Ｓ１００－Ａ９、好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）、補体Ｃ３、ガレクチン－３結合タンパク質、カタラーゼ、細胞外スーパーオキシドジスムターゼ、プロサポシン、β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ、カテプシンＤ、ベクリン－１、ライソゾーム関連膜糖タンパク質１、オートファジータンパク質１３、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＲＮＦ２６、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼＴＲＩＭ３３、ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア、アポトーシス誘導因子１ミトコンドリア、膜貫通タンパク質１２６Ａ、ニューロフィラメントライトポリペプチド、クロモグラニンＡ、コンタクチン－１、ニューレキシン－１－β、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）、シナプトタグミン－３、アポリポタンパク質Ｅ、アポリポタンパク質Ｄ、クラスタリン、フロチリン－２、カドヘリン－２、神経細胞接着分子２、アミロイドβ前駆体タンパク質、アミロイド様タンパク質１、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４、カリクレイン－６、好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン、タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）、辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）、セルロプラスミン、セロトランスフェリン、液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）、ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）、リンパ球細胞質タンパク質２、ラクタドヘリン、７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ、トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３、神経増殖分化制御タンパク質１、ガングリオシドＧＭ２活性化因子からなる、複数の試料調製媒体。。
【0095】
試料調製培地は、プロテアーゼを含んでいてもよい。プロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼまたはメタロプロテアーゼである。プロテアーゼはトリプシンであり得る。あるいは、試料調製用培地は、プロテアーゼとの使用に適している場合もある。
【0096】
試料調製培地は、緩衝液を含んでもよい。緩衝液は、プロテアーゼとの使用に適している場合もある。ペプチドの消化は、試料調製培地中で行われることがある。プロテアーゼに適した緩衝剤を当業者に知られている。
【0097】
試料調製培地は、同位体標識ペプチド内部標準物質などのペプチド内部標準物質を含んでもよい。
【0098】
本発明は、神経変性のための最初の包括的標的プロテオミクスバイオマーカーパネルを提供する。パーキンソン病病態のあらゆる側面を、単一の強固なアッセイでカバーする。各分析物には検量線と専用の内部標準物質があるため、パネル内のすべての分子が可能な限り正確な方法で測定される。このパネルは各分析物の絶対濃度を提供し、継続的な臨床検査に適している。全体として、この検査は根本的に豊かで信頼性の高いバイオマーカーデータを提供する。
【0099】
本発明の第２およびそれ以降の態様の好ましい特徴は、第１の態様に関して準用される。
【0100】
次に、本発明を以下の実施例を参照して説明するが、これらの実施例は例示の目的のみに存在するものであり、本発明を限定するものとして解釈されるものではない。
以下の図面も参照されたい：
以下の図面も参照されたい：
【図面の簡単な説明】
【0101】
【図1】図１は、パーキンソン病患者におけるクロモグラニンＡのタンパク質発現の差の結果を示す。バーは中央値、エラーバーは四分位範囲（ＩＱＲ）、ドットは個々の試料を表す。Ｗ０：ベースライン、Ｗ２０：薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５：薬物／プラセボ投与４５週後の患者。
【図2】図２は、パーキンソン病患者におけるアミロイドベータ前駆体タンパク質の発現差の結果を示している。バーは中央値、エラーバーは四分位範囲（ＩＱＲ）、ドットは個々の試料を表す。Ｗ０：ベースライン、Ｗ２０：薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５：薬物／プラセボ投与４５週後の患者。
【図3】図３は、パーキンソン病患者におけるアミロイド様タンパク質１のタンパク質発現の差の結果を示す。バーは中央値、エラーバーは四分位範囲（ＩＱＲ）、ドットは個々の試料を表す。Ｗ０：ベースライン、Ｗ２０：薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５：薬物／プラセボ投与４５週後の患者。
【図4】図４は、パーキンソン病患者におけるトランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３のタンパク質発現差の結果を示す。バーは中央値、エラーバーは四分位範囲（ＩＱＲ）、ドットは個々の試料を表す。Ｗ０：ベースライン、Ｗ２０：薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５：薬物／プラセボ投与４５週後の患者。
【図5】図５は、パーキンソン病患者におけるプロサポシンのタンパク質発現差の結果を示す。バーは中央値、エラーバーは四分位範囲（ＩＱＲ）、ドットは個々の試料を表す。Ｗ０：ベースライン、Ｗ２０：薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５：薬物／プラセボ投与４５週後の患者。
【図6】図６は、バイオマーカー試験における全タンパク質の差次的タンパク質発現のまとめを示す。前方のハッチングはベースラインと比較しての変化倍率の増加、後方のハッチングはベースラインと比較しての変化倍率の減少を表す。Ｗ０－ベースライン、Ｗ２０－薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５－薬物／プラセボ投与４５週後の患者。ＦＣ－倍数変化。
【図7】図７は、薬物治療を受けた患者群内の全タンパク質について、差次的なタンパク質発現のまとめを示したものである。異なるバイオマーカーの軌跡は、患者によって治療に対する反応が異なることを示しており、このバイオマーカー検査は患者の層別化に用いられ得る。前方のハッチングはベースラインと比較しての変化倍率の増加、後方のハッチングはベースラインと比較しての変化倍率の減少を表す。Ｗ０－ベースライン、Ｗ２０－薬物／プラセボ投与２０週後の患者、Ｗ４５－薬物／プラセボ投与４５週後の患者。ＦＣ－倍数変化、ＭＯ－月数。
【図8】図８は、薬物治療を受けたパーキンソン病患者におけるＥ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ３３のタンパク質発現の差の結果を示す。異なるバイオマーカーの軌跡は、患者によって治療に対する反応が異なることを示しており、このバイオマーカー検査は患者の層別化に用いられ得る。ドットは個々の試料を表す。Ｗ０－ベースライン、Ｗ２０－薬物治療２０週後の患者、Ｗ４５－薬物治療４５週後の患者。
【0102】
図６および図７に示されたタンパク質バイオマーカー名は、表１の５０種のタンパク質のうち４８種に対応する「バイオマーカー１」から「バイオマーカー４８」と呼ばれる。表１に含まれるが図６および図７では省略された２つのタンパク質は、タンパク質ＭＴＳＳ １（転移抑制因子ＹＧＬ－１）とリンパ球細胞質タンパク質２である。
【0103】
本方法は、任意の１つ以上のタンパク質分解ペプチドの増加および／または減少を検出することを含み得、図６および／または図７は対応するバイオマーカーについての増加および／または減少を示す。増加および／または減少は、図６（例えば第２０週目または４５週目）および／または図７（例えば６ヶ月目または１２ヶ月目）に増加および／または減少が示される任意の時点で得られた試料において検出され得る。図６を参照すると、バイオマーカーは、第２０週目および／または４５週目にプラセボで減少するバイオマーカーであってもよい。図６を参照すると、バイオマーカーは、第２０週目及び／又は４５週目に１つ以上の薬剤投与群で増加するバイオマーカーであってもよい。 図６を参照すると、バイオマーカーは、第２０週目及び／又は４５週目にプラセボで減少し、第２０週目及び／又は４５週目に１つ以上の薬物治療群で増加するバイオマーカーであってもよい。例えば、バイオマーカーは、第２０週目にプラセボ群で減少し、第２０週目に両薬剤投与群で増加するバイオマーカー２３とすることができる。例えば、バイオマーカーは、第２０週目にプラセボ群で減少し、第２０週目に両薬剤投与群で増加するバイオマーカー３３とすることができる。例えば、バイオマーカーは、第２０週目にプラセボ群で減少し、第２０週目に中用量薬剤投与群で増加するバイオマーカー３とすることができる。例えば、バイオマーカーは、第２０週目と４５週目にプラセボで減少し、２０週目に中用量薬剤投与群で増加し、第２０週目と４５週目に高用量薬剤投与群で増加するバイオマーカー４１とすることができる。増減は、図６のいずれのバイオマーカーについても、プラセボに対する相対的な倍数変化とすることができる。バイオマーカーは、図７が任意の時点、例えば６ヵ月時点及び／又は１２ヵ月時点における任意の２人の患者間の差を示す任意のバイオマーカーであり得る。例えば、バイオマーカーは、６ヵ月後および１２ヵ月後に患者３ヵ月で増加し、３ヵ月後および６ヵ月後に患者２および４で減少するバイオマーカー４８とすることができる。したがって、バイオマーカー４８は、試料中で測定されたペプチドの相対濃度に従って、治療応答別に患者を層別化するために使用され得るバイオマーカーの一例である。バイオマーカーは、以下のタンパク質の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８種のいずれかであってもよい：
マトリックスメタロプロテアーゼ－９
キチナーゼ－３様タンパク質１
タンパク質Ｓ１００－Ａ８
タンパク質Ｓ１００－Ａ９
好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）
補体Ｃ３
ガレクチン－３結合タンパク質
カタラーゼ
細胞外スーパーオキシドジスムターゼ
プロサポシン
β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ
カテプシンＤ
ベクリン－１
ライソゾーム関連膜糖タンパク質１
オートファジータンパク質１３
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＲＮＦ２６
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ３３
ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア
アポトーシス誘導因子１、ミトコンドリア
膜貫通タンパク質１２６Ａ
ニューロフィラメントライトポリペプチド
クロモグラニンＡ
コンタクチン－１
ニューレキシン－１β
シナプトタグミン－３
アポリポタンパク質Ｅ
アポリポタンパク質Ｄ
クラスタリン
フロチリン－２
カドヘリン－２
神経細胞接着分子２
アミロイドβ前駆体タンパク質
アミロイド様タンパク質１
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４
カリクレイン－６
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）
辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）
セルロプラスミン
セロトランスフェリン
液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）
ラクタドヘリン
７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ
トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３
神経増殖分化制御タンパク質１および
ガングリオシドＧＭ２活性化因子。
マトリックスメタロプロテアーゼ－９
キチナーゼ－３様タンパク質１
タンパク質Ｓ１００－Ａ８
タンパク質Ｓ１００－Ａ９
好中球コラゲナーゼ（ＭＭＰ８）
補体Ｃ３
ガレクチン－３結合タンパク質
カタラーゼ
細胞外スーパーオキシドジスムターゼ
プロサポシン
β－ヘキソサミニダーゼサブユニットβ
カテプシンＤ
ベクリン－１
ライソゾーム関連膜糖タンパク質１
オートファジータンパク質１３
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＲＮＦ２６
Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼ ＴＲＩＭ３３
ＦＡＳＴキナーゼドメイン含有タンパク質５、ミトコンドリア
アポトーシス誘導因子１、ミトコンドリア
膜貫通タンパク質１２６Ａ
ニューロフィラメントライトポリペプチド
クロモグラニンＡ
コンタクチン－１
ニューレキシン－１β
シナプトタグミン－３
アポリポタンパク質Ｅ
アポリポタンパク質Ｄ
クラスタリン
フロチリン－２
カドヘリン－２
神経細胞接着分子２
アミロイドβ前駆体タンパク質
アミロイド様タンパク質１
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ３
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素ＦＫＢＰ４
カリクレイン－６
好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン
タンパク質ジスルフィド異性化酵素Ａ１（ＰＤＩＡ１）
辺縁系関連膜タンパク質（フラグメント）
セルロプラスミン
セロトランスフェリン
液胞タンパク質選別関連タンパク質１６ホモログ（ｈＶＰＳ１６）
ペプチジルプロリルシストランス異性化酵素（ＰＰＩａｓｅ；ＨＥＬ－Ｓ－３９）
ラクタドヘリン
７２ｋＤａ ＩＶ型コラゲナーゼ
トランスフォーミング増殖因子β誘導タンパク質ＩＧ－Ｈ３
神経増殖分化制御タンパク質１および
ガングリオシドＧＭ２活性化因子。
【0104】
従って、本発明の方法またはキットにおいて使用される少なくとも１つのタンパク質は、上記の４８種のタンパク質のうちの任意の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７または４８種であり得る。好ましくは、少なくとも１つのタンパク質は、上記のタンパク質の４８種すべてであってもよい。従って、本方法は、工程（ｉ）のタンパク質のタンパク質分解消化物を、上記のタンパク質の全４８種のタンパク質分解ペプチドの存在についてアッセイすることを含み得る。
【0105】
本発明のさらなる利点は以下の通りである：
●単一の検査でパーキンソン病分子病態のあらゆる側面をカバーする高度に多重化されたバイオマーカーアッセイを開発することが可能であることを示している。表１は、これらの疾患プロセス、選択されたタンパク質、および対応するトリプシンペプチドの詳細である。本発明者らは、これがパーキンソン病／神経変性のための世界初の包括的標的プロテオミクスバイオマーカーパネルであると考える。
●この検査を患者集団の層別化や薬物治療効果の評価に適用することが可能であることを示している（図６と７）。
●表１及び表２並びに本明細書を参照することにより、当該当業者であれば実施可能であろう、特定の分析装置における本バイオマーカー検査の設定方法を示す。表２は、このバイオマーカー検査をセットアップするために直接コピーできる詳細なレベルまで、具体的な機器の設定を開示している。
●これまでパーキンソン病と関連しなかったタンパク質を明らかにし、これらのタンパク質がパーキンソン病の患者集団を層別化し、薬物治療効果を評価する方法の一部であることを明らかにした。
●この包括的なバイオマーカーパネルを特定の分析装置で確立することが可能であり、他の分析技術と比較して、パネル内のすべての分子についてより正確で頑健な分析測定が可能であること、およびこのアッセイが臨床の場で既存の規制基準に照らして検証可能であることを示す。
●全体として、このバイオマーカー検査は、この分野の他の技術と比較して、基本的に豊かで信頼性の高いバイオマーカーデータを提供する。
●単一の検査でパーキンソン病分子病態のあらゆる側面をカバーする高度に多重化されたバイオマーカーアッセイを開発することが可能であることを示している。表１は、これらの疾患プロセス、選択されたタンパク質、および対応するトリプシンペプチドの詳細である。本発明者らは、これがパーキンソン病／神経変性のための世界初の包括的標的プロテオミクスバイオマーカーパネルであると考える。
●この検査を患者集団の層別化や薬物治療効果の評価に適用することが可能であることを示している（図６と７）。
●表１及び表２並びに本明細書を参照することにより、当該当業者であれば実施可能であろう、特定の分析装置における本バイオマーカー検査の設定方法を示す。表２は、このバイオマーカー検査をセットアップするために直接コピーできる詳細なレベルまで、具体的な機器の設定を開示している。
●これまでパーキンソン病と関連しなかったタンパク質を明らかにし、これらのタンパク質がパーキンソン病の患者集団を層別化し、薬物治療効果を評価する方法の一部であることを明らかにした。
●この包括的なバイオマーカーパネルを特定の分析装置で確立することが可能であり、他の分析技術と比較して、パネル内のすべての分子についてより正確で頑健な分析測定が可能であること、およびこのアッセイが臨床の場で既存の規制基準に照らして検証可能であることを示す。
●全体として、このバイオマーカー検査は、この分野の他の技術と比較して、基本的に豊かで信頼性の高いバイオマーカーデータを提供する。
【実施例】
【0106】
実施例１
臨床試験中のパーキンソン病（ＰＤ）患者ＣＳＦ試料のプロテオーム解析
試料収集
ＣＳＦ試料は、臨床試験でパーキンソン病 患者から腰椎穿刺により、ベースライン時、プラセボまたは開発中のＰＤ治療薬投与２０週後、４５週後に採取された。
臨床試験中のパーキンソン病（ＰＤ）患者ＣＳＦ試料のプロテオーム解析
試料収集
ＣＳＦ試料は、臨床試験でパーキンソン病 患者から腰椎穿刺により、ベースライン時、プラセボまたは開発中のＰＤ治療薬投与２０週後、４５週後に採取された。
【0107】
試料の準備
等量のＣＳＦを凍結乾燥し、タンパク質消化の前に同位体標識ペプチド内部標準物質を加えた。ＣＳＦタンパク質は、トリプシンを用いて酵素的にペプチドに消化し、事前に還元とアルキル化を行った。消化後、試料はＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入する前に、Ｃ１８ベースの固相抽出マイクロプレートを用いて精製した。
等量のＣＳＦを凍結乾燥し、タンパク質消化の前に同位体標識ペプチド内部標準物質を加えた。ＣＳＦタンパク質は、トリプシンを用いて酵素的にペプチドに消化し、事前に還元とアルキル化を行った。消化後、試料はＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入する前に、Ｃ１８ベースの固相抽出マイクロプレートを用いて精製した。
【0108】
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのセットアップ
トリプシンペプチドは、次に液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析システム（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で定量され、時限多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で操作された。定量にはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＳＱ Ａｌｔｉｓトリプル四重極質量分析計を使用した。各タンパク質バイオマーカーについて、表１に示す対応する内部標準物質と、アッセイバッファーおよびＣＳＦ中のペプチドキャリブレーションラインを用いて、少なくとも２つのユニークなトリプシンペプチドを定量した。表２および表３に詳述するように、各ペプチドの確実な同定には最低２つのトランジションが用いられた。各患者試料をＫｉｎｅｔｅｘ逆相Ｃ１８ベースの液体クロマトグラフィーカラムに注入し、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で水とアセトニトリルのグラジエントでペプチドを分離した。試料は盲検化され、無作為の順序となっている。クロマトグラムはＸｃａｌｉｂｕｒ ｖ４．１ソフトウェアを用いて分析し、絶対濃度は表１に示すペプチドで作成した標準曲線から求めた。各ペプチドの標準曲線は、定量と性能標準化のためにランの開始時と終了時に分析された。
トリプシンペプチドは、次に液体クロマトグラフィー－タンデム質量分析システム（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）で定量され、時限多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）で操作された。定量にはＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＴＳＱ Ａｌｔｉｓトリプル四重極質量分析計を使用した。各タンパク質バイオマーカーについて、表１に示す対応する内部標準物質と、アッセイバッファーおよびＣＳＦ中のペプチドキャリブレーションラインを用いて、少なくとも２つのユニークなトリプシンペプチドを定量した。表２および表３に詳述するように、各ペプチドの確実な同定には最低２つのトランジションが用いられた。各患者試料をＫｉｎｅｔｅｘ逆相Ｃ１８ベースの液体クロマトグラフィーカラムに注入し、０．５ｍｌ／ｍｉｎの流速で水とアセトニトリルのグラジエントでペプチドを分離した。試料は盲検化され、無作為の順序となっている。クロマトグラムはＸｃａｌｉｂｕｒ ｖ４．１ソフトウェアを用いて分析し、絶対濃度は表１に示すペプチドで作成した標準曲線から求めた。各ペプチドの標準曲線は、定量と性能標準化のためにランの開始時と終了時に分析された。
【0109】
統計分析／結果の解釈
アッセイバッファーの検量線データセットに線形回帰モデルを当てはめ、絶対ペプチド濃度を求めた。検量線は対数軸（ｌｏｇ－ｌｏｇ）の散布図にプロットされ、１／ｘ2の重み付けが適用された。定量下限、日内変動係数、日間変動係数（％ＣＶ）も各ペプチドについて複数の濃度で設定した。次に、絶対ペプチド濃度を試料セット全体で比較した。第４５週と第２０週の結果はベースラインに対して正規化し、ベースラインからの倍数変化で表した。薬物処置群ではベースラインから１．５倍のペプチド濃度増加または０．６７倍の濃度減少がみられ、プラセボ群では対応するペプチド変化がないか、または少ないことが、薬物治療の有効性を示すと考えられた。
アッセイバッファーの検量線データセットに線形回帰モデルを当てはめ、絶対ペプチド濃度を求めた。検量線は対数軸（ｌｏｇ－ｌｏｇ）の散布図にプロットされ、１／ｘ2の重み付けが適用された。定量下限、日内変動係数、日間変動係数（％ＣＶ）も各ペプチドについて複数の濃度で設定した。次に、絶対ペプチド濃度を試料セット全体で比較した。第４５週と第２０週の結果はベースラインに対して正規化し、ベースラインからの倍数変化で表した。薬物処置群ではベースラインから１．５倍のペプチド濃度増加または０．６７倍の濃度減少がみられ、プラセボ群では対応するペプチド変化がないか、または少ないことが、薬物治療の有効性を示すと考えられた。
【0110】
実施例２：患者の層別化
薬物治療後の患者群を層別化するために、薬物治療を受けた患者群内のバイオマーカー（すなわちペプチド）の軌跡を比較した。バイオマーカーシグナルが増加した患者はすべてサブグループ１に層別化され、バイオマーカーシグナルが減少した患者またはバイオマーカーシグナルが有意に変化しなかった患者はすべてサブグループ２に分類された。
薬物治療後の患者群を層別化するために、薬物治療を受けた患者群内のバイオマーカー（すなわちペプチド）の軌跡を比較した。バイオマーカーシグナルが増加した患者はすべてサブグループ１に層別化され、バイオマーカーシグナルが減少した患者またはバイオマーカーシグナルが有意に変化しなかった患者はすべてサブグループ２に分類された。
【0111】
本出願では、以下の表も参照している：
表１は、パーキンソン病患者において差次的に発現する５０種のタンパク質と、対応する１１８種のタンパク質分解ペプチド配列、および対応する重同位体標識ペプチド内部標準配列を示している。
表１は、パーキンソン病患者において差次的に発現する５０種のタンパク質と、対応する１１８種のタンパク質分解ペプチド配列、および対応する重同位体標識ペプチド内部標準配列を示している。
【表1】
【0112】
表２は、表１に示したネイティブペプチドをモニターするために、実験的に最適化されたターゲットＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件を示している。表２のデータは、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のトリプル四重極ＬＣ－ＭＳ／ＭＳプラットフォームＴＳＱ Ａｌｔｉｓに基づいているが、他社製のプラットフォームにも同様に適用できる。表２では、以下の略語を使用している：ＲＦ－無線周波数。
【表2】
【0113】
表３は、表１に示した重同位体標識ペプチド内部標準物質をモニターするために、実験的に最適化したターゲットＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件を示している。これはＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社のトリプル四重極ＬＣ－ＭＳ／ＭＳプラットフォームＴＳＱ Ａｌｔｉｓに基づいている。表３では、以下の略語を使用している：ＲＦ－無線周波数。
【表3】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】