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特表2024-510800高コレステロール血症を治療するための組成物及び方法

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-11

(54)【発明の名称】高コレステロール血症を治療するための組成物及び方法

(51)【国際特許分類】

C12N 15/12 20060101AFI20240304BHJP

C12N 15/09 20060101ALI20240304BHJP

C12N 15/113 20100101ALI20240304BHJP

C12N 15/55 20060101ALI20240304BHJP

A61K 31/7105 20060101ALI20240304BHJP

A61K 48/00 20060101ALI20240304BHJP

A61K 31/711 20060101ALI20240304BHJP

A61K 35/407 20150101ALI20240304BHJP

A61K 35/28 20150101ALI20240304BHJP

A61P 3/06 20060101ALI20240304BHJP

C12N 5/10 20060101ALN20240304BHJP

A61K 38/46 20060101ALN20240304BHJP

【ＦＩ】

C12N15/12 ZNA

C12N15/09 110

C12N15/09 100

C12N15/113 Z

C12N15/55

A61K31/7105

A61K48/00

A61K31/711

A61K35/407

A61K35/28

A61P3/06

C12N5/10

A61K38/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558546

(86)(22)【出願日】2022-03-22

(85)【翻訳文提出日】2023-11-21

(86)【国際出願番号】 US2022021263

(87)【国際公開番号】W WO2022204087

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】63/304,170

(32)【優先日】2022-01-28

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/164,396

(32)【優先日】2021-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521476126

【氏名又は名称】エメンドバイオ・インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】110003708

【氏名又は名称】弁理士法人鈴榮特許綜合事務所

(72)【発明者】

【氏名】エマニュエル、ラフィ

(72)【発明者】

【氏名】ゴラン・メシア、ミハル

(72)【発明者】

【氏名】ディッケン、ジョセフ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084DC22

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZC33

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA03

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZC33

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB52

4C087BB65

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZC33

(57)【要約】

開示は、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子、並びにそれらの組成物、方法、及び使用を提供する。具体的には、本開示は、細胞内の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の内因性発現を増加させる方法であって、ＬＤＬＲ遺伝子の改変又はＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物の改変、少なくとも１つのヌクレアーゼ及びガイド配列部分を含むＲＮＡ分子を含む組成物の細胞への導入を含み、ＲＮＡ分子のガイド配列部分が、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む方法を提供する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

細胞内の低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の内因性発現を増加させる方法であって、前記ＬＤＬＲ遺伝子の改変又は前記ＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物の改変を含む、方法。

【請求項2】

前記ＬＤＬＲ遺伝子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）により改変される、又は前記ＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）により改変される、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＬＤＬＲ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）又は前記ＬＤＬＲ遺伝子がコードする前記転写産物の３’ＵＴＲが改変される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲが、前記３’ＵＴＲ又はその一部分の切除により改変される、請求項３に記載の方法。

【請求項5】

前記方法が、前記細胞への、
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列部分を含む、ＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子
を含む組成物の導入を含み、
前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記ＲＮＡ分子の複合体が、前記ＬＤＬＲ遺伝子の１つのアレルを二本鎖切断し、これにより、前記ＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記組成物が、対象の細胞又は培養中の細胞に導入される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記細胞が、肝臓細胞、肝実質細胞又は幹細胞である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子、及び前記ＲＮＡ分子又は前記ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子が、実質的に同時に又は異なる時点で前記細胞に導入される、請求項５～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記細胞内の前記ＬＤＬＲ遺伝子のｍｉＲＮＡ結合部位又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）が、挿入変異又は欠失変異を受ける、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記ＲＮＡ分子のガイド配列部分が、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ内の、終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流に位置する部位を標的とする、請求項５～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ＲＮＡ分子のガイド配列部分が、ＬＤＬＲアレル中のｍｉＲＮＡ結合部位を標的とする、請求項５～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記ＲＮＡ分子のガイド配列部分が、ｍｉＲ－８５結合部位又はｍｉＲ－１４８結合部位を標的とする、請求項５～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ＬＤＬＲ遺伝子の改変の結果、ｍｉＲシード配列が不活性化される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ｍｉＲシード配列が、ＵＧＧＵＧＣＵＡ又はＣＡＣＵＧＵＧである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記ｍｉＲシード配列が、ｍｉＲ－８５シード配列又はｍｉＲ－１４８シード配列である、請求項１３に記載の方法。

【請求項16】

前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記ＲＮＡ分子の複合体が、前記ＬＤＬＲ遺伝子の一対のアレルを二本鎖切断する、請求項５～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ＲＮＡ分子のガイド配列部分が、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む、請求項５～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記細胞に導入される前記組成物が、ガイド配列部分を含む、第２のＲＮＡ分子又は前記第２のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を更に含む、請求項５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分が、前記ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの、終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流に位置する部位を標的とする、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

前記第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分が、前記第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む、請求項１８又は１９に記載の方法。

【請求項21】

ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ又はその一部分が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第１のＲＮＡ分子によって形成される二本鎖切断、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記第２のＲＮＡ分子によって形成される二本鎖切断により切除される、請求項１８～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

内因性ＬＤＬＲのポリアデニル化シグナルは改変されない、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記第１のＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分が、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドミスマッチを有する、請求項５～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記ガイド配列部分が、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含み、前記連続するヌクレオチドは、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ガイド配列部分の、前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと前記ＲＮＡ分子の複合体に対する標的特異性が、前記ＬＤＬＲ遺伝子の変異したアレルに対して高い相補性を有するガイド配列部分よりも高い、請求項２３又は２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

細胞内の内因性ＬＤＬＲ遺伝子の発現の増加が、前記ＬＤＬＲ遺伝子を改変する前の細胞内のＬＤＬＲ転写産物又はＬＤＬＲタンパク質のレベルと比較して、ＬＤＬＲ転写産物又はＬＤＬＲタンパク質のレベルの、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％又は少なくとも６００％の増加として測定される、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

内因性ＬＤＬＲ遺伝子の発現の増加が、前記ＬＤＬＲ遺伝子を改変する前の細胞によるＬＤＬ－Ｃの取込みと比較して、前記細胞によるＬＤＬ－Ｃの取込みを、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％又は少なくとも５００％増加させる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項28】

配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド、若しくはＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている前記連続するヌクレオチドを含むＲＮＡ分子、又は前記ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む、組成物。

【請求項29】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子を更に含む、請求項２８に記載の組成物。

【請求項30】

ｔｒａｃｒＲＮＡ分子を更に含む、請求項２８又は２９に記載の組成物。

【請求項31】

ガイド配列部分を含む、第２のＲＮＡ分子又は前記第２のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を更に含む、請求項２８～３０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項32】

前記第２のＲＮＡのガイド配列部分が、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの、終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流に位置する部位を標的とする、請求項３１に記載の組成物。

【請求項33】

前記第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分が、前記第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド、又は前記第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む、請求項３１又は３２に記載の組成物。

【請求項34】

請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法により改変された細胞、又は請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物により改変された細胞。

【請求項35】

請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物を含む、細胞中のＬＤＬＲアレルを不活性化するための医薬であって、前記医薬が、前記組成物を前記細胞へ送達することにより投与される、医薬。

【請求項36】

請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項３４に記載の改変された細胞の、高コレステロール血症を治療する、寛解させる又は予防するための使用であって、前記組成物又は前記改変された細胞を、高コレステロール血症にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することを含む、使用。

【請求項37】

請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項３４に記載の改変された細胞を含む、高コレステロール血症を治療する、寛解させる又は予防するための医薬であって、前記医薬が、前記組成物又は前記改変された細胞を、高コレステロール血症にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することにより投与される、医薬。

【請求項38】

請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物及び前記組成物を細胞へ送達することについての使用説明書を含む、細胞内のＬＤＬＲ発現を増加させるためのキット。

【請求項39】

請求項２８～３３のいずれか一項に記載の組成物又は請求項３４に記載の改変された細胞、及び前記組成物又は前記改変された細胞を高コレステロール血症にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することについての使用説明書を含む、対象において高コレステロール血症を治療する又は予防するためのキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

この出願は、2022年1月28日に出願された米国仮出願第63/304,170号及び2021年3月22日に出願された同第63/164,396号の恩恵を主張し、それらの米国仮出願の内容は参照により本明細書に組み入れられる。

【0002】

この出願全体で、括弧に入れて参照したものを含む、さまざまな刊行物を参照する。この出願において全体として言及された全ての刊行物の開示は、この発明が属する技術分野及びこの発明と共に使用される技術分野における追加の特徴の説明を提供するために、参照によりこの出願に組み入れられる。

【0003】

配列表への言及
この出願は、「220321_91709-A-PCT_Sequence_Listing_AWG.txt」と名付けられたファイルに存在するヌクレオチド配列を参照により組み入れ、そのファイルは、サイズが2,288kbであり、MS-Windows（登録商標）とのシステム互換性を有するＩＢＭ－ＰＣ機フォーマットで2022年3月17日に作成され、この出願の一部として、2021年3月21日に出願されたテキストファイルに含まれている。

【背景技術】

【0004】

高コレステロール血症、又は高コレステロールは、高い血漿中コレステロールレベルの存在と定義される。家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、コレステロールの上昇及び心血管疾患の早期発症に至る低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）の変異を主な原因とする、遺伝性疾患である。

【0005】

低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は、血漿の主要なコレステロール運搬リポタンパク質である低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）と結合し、エンドサイトーシスによりこれを細胞中に輸送する。受容体－リガンド複合体は、内在化されるためにはまず、クラスリン被覆ピット中に密集しなければならない。ＬＤＬコレステロールのレベルの上昇は、冠動脈性心疾患の病態形成において中心的な役割を果たす。家族性高コレステロール血症を引き起こすＬＤＬＲ遺伝子における影響の大きな機能欠失変異によって実証されるように、ＬＤＬ受容体又はその制御における欠陥は、高レベルのＬＤＬ及び早発の心血管疾患をもたらす。

【0006】

生涯にわたる脂質低下薬物療法、例えばスタチン類又はエゼチミブが現在利用可能だが、これらは一部の患者には耐え難く、所望のＬＤＬ－Ｃレベルを得ることができないことが多い。より最近の治療的アプローチは、ＬＤＬＲのリソソーム分解を促進するタンパク質であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を一過的に阻害する、皮下注入されたモノクローナル抗体に基づいている。現在、塩基編集によるＰＣＳＫ９の恒久的な阻害が開発されつつあるが、ＦＨの病原性の根拠ですらない遺伝子のそのような非可逆的ノックダウンの持続的な結果については、未知のままである。

【発明の概要】

【0007】

高コレステロール又は高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療又は予防するための、内因性ＬＤＬＲ遺伝子の発現又はその転写産物の半減期を増加させるアプローチを開示する。本発明のいくつかの側面によれば、開示するアプローチは、高コレステロール又は高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療又は予防するために、ＬＤＬＲ遺伝子の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を標的とするものである。いずれかの作用機序に限定されるものではないが、本発明のいくつかの側面によれば、開示するアプローチは、ＬＤＬＲの発現を増強し、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の取込みを促進するために、ＬＤＬＲの転写及び／又は翻訳を制限する原因となる３’非翻訳領域（ＵＴＲ）を、ノックアウト、除去、短縮化又はブロックするためのものである。したがって、例えば、この明細書で説明する、好ましくは肝臓細胞（例．肝実質細胞）中の、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲにおける調節エレメント結合部位（例．ｍｉＲＮＡ結合部位）の両アレルの切除又はノックアウトを利用して、ＬＤＬＲ分子の半減期又は発現レベルを増加させ、これにより、高コレステロール血症を治療し、阻止し、予防し、及び／又は寛解させてもよい。いくつかの態様では、この明細書で説明するＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの少なくとも部分的な切除を利用して、転写産物の半減期又はＬＤＬＲ分子の発現を増加させ、これにより、高コレステロール血症を治療し、阻止し、予防し、及び／又は寛解させてもよい。

【0008】

いくつかの態様では、細胞中の内因性低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の発現を増加させる方法であって、ＬＤＬＲ遺伝子の改変又はＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物の改変を含む方法を提供する。いくつかの態様では、細胞中の内因性低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の発現を増加させる方法であって、ＬＤＬＲ遺伝子又はＬＤＬＲ転写産物の３’ＵＴＲの少なくとも一部分を、改変、ブロック又は除去することを含む方法を提供する。

【0009】

ある態様では、この方法は、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
１７～５０ヌクレオチドを有するガイド配列部分を含むＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子
を含む組成物の細胞への導入を含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子の複合体がＬＤＬＲ遺伝子の１つのアレルを二本鎖切断する。

【0010】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ又はその一部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第１のＲＮＡ分子によって形成される第１の二本鎖切断と、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及び第２のＲＮＡ分子によって形成される第２の二本鎖切断との組合せにより切除される。

【0011】

限定するものではない例として、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの一部分は、ＯＭＮＩ－５０ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（配列番号１０７４９）と配列番号７７０７で示す配列を含むガイド配列部分を含む第１のＲＮＡ分子とを含む第１のＣＲＩＳＰＲ複合体、及びＯＭＮＩ－５０ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（配列番号１０７４９）と配列番号９８４３で示す配列を含むガイド配列部分を含む第２のＲＮＡ分子とを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の複合的な活性により切除されてもよい。

【0012】

別の限定するものではない例において、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの一部分は、ＯＭＮＩ－７９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（配列番号１０７４４）と配列番号７８７１で示す配列を含むガイド配列部分を含む第１のＲＮＡ分子とを含む第１のＣＲＩＳＰＲ複合体、及びＯＭＮＩ－７９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（配列番号１０７４４）と配列番号９８４３で示す配列を含むガイド配列部分を含む第２のＲＮＡ分子とを含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の複合的な活性により切除されてもよい。

【0013】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子を提供する。

【0014】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を提供する。

【0015】

本発明のいくつかの態様では、例えば、細胞中のＬＤＬＲのｍｉＲＮＡ結合部位を不活性化することによる、細胞中のＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させる方法であって、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を細胞へ送達することを含む方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は肝臓細胞である。いくつかの態様では、細胞は肝実質細胞である。いくつかの態様では、細胞は幹細胞である。いくつかの態様では、細胞への送達は、in vivo、ex vivo又はin vitroで実施する。いくつかの態様では、細胞への送達は、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はナノ粒子の、肝臓へのin vivo送達によって実施する。いくつかの態様では、この方法はex vivoで実施され、細胞は、個々の患者から提供／外植される。いくつかの態様では、この方法は、不活性化されたｍｉＲＮＡ結合部位を含有する少なくとも１つの改変されたＬＤＬＲアレルを有する得られた細胞を、個々の患者に導入する工程を更に含む。

【0016】

本発明のいくつかの態様では、高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療及び／又は予防する方法であって、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を、高コレステロール血症にり患した又はり患するリスクがある対象の細胞へ送達することを含む方法を提供する。

【0017】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を細胞へ送達することを含む、細胞中のＬＤＬＲアレルのｍｉＲＮＡ結合部位を不活性化するための、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物の使用を提供する。

【0018】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を含む医薬を提供し、前記医薬は、組成物を細胞へ送達することにより投与される。

【0019】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物の、高コレステロール血症を治療する、寛解させる、又は予防するための使用を提供し、前記組成物は、高コレステロール血症にり患した又はり患するリスクがある対象の細胞へ送達される。

【0020】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを含む組成物を含む、高コレステロール血症を治療する、寛解させる、又は予防するための医薬を提供し、前記組成物は、高コレステロール血症にり患した又はり患するリスクがある対象の細胞へ送達することにより投与される。

【0021】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及び必要に応じてｔｒａｃｒＲＮＡ分子、並びに前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及び必要に応じてｔｒａｃｒＲＮＡを細胞へ送達することについての使用説明書を含む、細胞中のＬＤＬＲ発現を増加させるキットを提供する。

【0022】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡ分子、並びに前記ＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及び必要に応じてｔｒａｃｒＲＮＡを、高コレステロール血症を有する又は有するリスクがある対象の細胞へ送達することについての使用説明書を含む、対象において高コレステロール血症を治療又は予防するためのキットを提供する。

【0023】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した方法のいずれか１つにより改変された、又はこの明細書に記載した組成物のいずれか１つを使用して改変された細胞を提供する。

【図面の簡単な説明】

【0024】

【図1A】図１Ａ～１Ｈは、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除の機能の概念実証である。ＳｐＣａｓ９及び２つのシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を同時に使用して、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲを改変した。この標的化はＨｅｐＧ２細胞で行い、３’ＵＴＲのほぼ全体（ｇ１＋ｇ９）、ｍｉＲ８５結合領域（ｇ６＋ｇ７）、又はＦＨ患者でＬＤＬＲ発現を上方制御することが以前に示されている２．５キロベース領域のいずれかを切除した。

【図1B】切除された細胞はいずれも、ｍＲＮＡ（ｑＲＴ－ＰＣＲで測定した「Ｒｑ」値）の上方制御を示した。その効果は、３’ＵＴＲ全体が切除された細胞で特に顕著であった。

【図1C】切除された細胞はいずれも、総タンパク質（ウエスタンブロットで測定）の上方制御を示した。その効果は、３’ＵＴＲ全体が切除された細胞で特に顕著であった。

【図1D】切除された細胞はいずれも、膜タンパク質（フローサイトメトリー分析で測定）の上方制御を示した。その効果は、３’ＵＴＲ全体が切除された細胞で特に顕著であった。

【図1E】ガイドｇ１＋ｇ９で３’ＵＴＲを切除した細胞の蛍光ＬＤＬコレステロール取込みを、指定の時点にフローサイトメトリーで測定した。全ての時点で、コレステロール取込みの最大で２倍の上方制御が示された（ＬＤＬ－DyLight（商標）488－コレステロール取込み）。

【図1F】ｓｇＲＮＡのさまざまな組合せを用いて、３’ＵＴＲＬＤＬＲ切除実験を行った。

【図1G】ｓｇＲＮＡのさまざまな組合せを用いて、３’ＵＴＲＬＤＬＲ切除実験を行った。

【図1H】図１Ｆ及び図１Ｇに示したＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除実験の切断マップを、ＬＤＬＲの発現（Ｒｑ値）に対するｓｇＲＮＡの組合せ形成の効果と共に示す。ｄｄＰＣＲプローブ部位を含まない組合せはｄｄＰＣＲでは検出できない点に留意されたい。

【図2A】患者に由来するヘテロ接合ＬＤＬＲ変異体ＬＣＬ細胞：表面受容体の低下が、いずれの患者のものでも確認された（図２Ａ及び図２Ｂ）。図２Ａに、患者ＬＣＬ細胞株対ＷＴ細胞における、膜ＬＤＬＲのフローサイトメトリー分析を示す。

【図2B】図２Ｂに、ＷＴＬＣＬ細胞の値から、各細胞株の発現の割合（幾何平均）を計算した結果を示す。

【図2C】ＧＭ１４４８変異を有するＦＨ患者のＬＣＬ細胞は、Ｇｌｙ１９７の欠失［△Ｇ１９７］に対応する。

【図2D】ＧＭ１４６０変異は、コドン６４６におけるシステインからチロシンへの置換［Ｃ６４６Ｙ］に対応する。

【図3A】ヘテロ接合のＦＨ患者のＬＣＬ細胞におけるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除は、表面ＬＤＬＲの上方制御とコレステロールの取込みの増加をもたらす。特定のガイド（ｇ１及びｇ９）とＳｐＣａｓ９を使用して、ヘテロ接合のＦＨ患者に由来するＬＣＬ細胞株でＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲを切除した。切除後、ＬＤＬＲの発現とＬＤＬ－コレステロールの取込みについて細胞を分析した（以上、図３Ａ～図３Ｄ）。図３Ａに、ｄｄＰＣＲで測定したＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除の割合を示す。

【図3B】図３Ｂに、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したＬＤＬＲｍＲＮＡのレベルを示す。

【図3C】図３Ｃに、特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーで測定した、ＬＤＬＲ表面タンパク質発現のレベルを示す。

【図3D】図３Ｄに、４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーで測定した、ＬＤＬ－Dylight-488－コレステロールの取込みを示す。

【図4A】マウス肝臓細胞株Ｈｅｐａ１－６におけるＬＤＬＲの３’ＵＴＲの切除は、ヒト肝臓ＨｅｐＧ２細胞における結果と一致する。特定のガイド（ｇ１ｍ及びｇ６ｍ）とＳｐＣａｓ９を使用して、マウス肝細胞癌細胞株Ｈｅｐａ１－６でＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲを切除した。切除後、ＬＤＬＲの発現とＬＤＬ－コレステロールの取込みについて細胞を分析した（以上、図４Ａ～図４Ｃ）。図４Ａに、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したＬＤＬＲｍＲＮＡのレベルを示す。

【図4B】図４Ｂに、特異的な抗体を使用するフローサイトメトリーで測定した、ＬＤＬＲ表面タンパク質発現のレベルを示す。

【図4C】図４Ｃに、４時間のインキュベーション後にフローサイトメトリーで測定した、ＬＤＬ－Dylight-488－コレステロールの取込みを示す。

【図5A】３’ＵＴＲ領域での、ＯＭＮＩ－７９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ系ガイドのスクリーニング（図５Ａ～図５Ｃ）。図５Ａに、ＷＴＯＭＮＩ－７９又はＯＭＮＩ－７９Ｖ５５７０のいずれかを使用する、ＬＤＬＲの３’ＵＴＲの指定された領域を標的とするガイドの、ＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクションに基づくガイドのスクリーニングの結果を示す。いくつかのガイドは高いレベルの編集を示し、ＲＮＰ又はＲＮＡ組成物として更に評価される。

【図5B】図５Ｂに、ＯＭＮＩ－１０３によるＬＤＬＲの３’ＵＴＲの指定された領域を標的とするガイドの、ＨｅＬａ細胞におけるトランスフェクションに基づくガイドのスクリーニングの結果を示す。ＯＭＮＩ－１０３ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用した複数のガイド分子では活性が高い。

【図5C】図５Ｃは、ガイド分子のＬＤＬＲ標的部位の概略図である。

【図6A】ＨｅｐＧ２細胞における、ＣＲＩＳＰＲベースの編集によるＰＣＳＫ９のノックアウトと、そのＬＤＬＲ発現及びＬＤＬ取込みに対する効果（図６Ａ～図６Ｅ）。図６Ａの表題は、ＰＣＳＫ９編集である。特定のガイド分子によるＰＣＳＫ９の改変後に、ＨｅｐＧ２細胞における編集のレベルを測定した。

【図6B】図６Ｂの表題は、ＰＣＳＫ９ｑＲＴ－ＰＣＲである。ＰＣＳＫ９編集後のＨｅｐＧ２細胞におけるＰＣＳＫ９のｍＲＮＡレベル。

【図6C】図６Ｃの表題は、分泌されたＰＣＳＫ９である。野生型細胞と比較したＰＣＳＫ９編集細胞におけるＰＣＳＫ９の分泌を、ＥＬＩＳＡにより測定した。

【図6D】図６Ｄの表題は、ＬＤＬＲ発現である。野生型細胞及びＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除細胞と比較した、ＰＣＳＫ９改変細胞におけるＬＤＬＲの膜発現を測定した。図６Ｅ：ＬＤＬ－コレステロール取込み。これらの細胞にロバスタチンを１６時間添加した場合と添加しない場合の４８８－ＬＤＬコレステロールの取込みを、４時間測定した。

【図6E】図６Ｅの表題は、ＬＤＬ－コレステロール取込みである。これらの細胞にロバスタチンを１６時間添加した場合と添加しない場合の４８８－ＬＤＬコレステロールの取込みを、４時間測定した。

【図7A】ＬＤＬＲ発現の上方制御に必須であるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの領域を特定するために、ｓｇＲＮＡのＳｐＣａｓ９とのいくつかの異なる組合せを使用して、ヒト肝癌細胞株ＨｅｐＧ２で、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの一部分を切除した。切除後、ｍＲＮＡのレベルと表面膜におけるＬＤＬＲの発現レベルについて、細胞を分析した（以上、図７Ａ～図７Ｃ）。図７Ａは、各ｓｇＲＮＡの編集割合が、試験を行ったガイドの全てで９０％を超えたことを示す。

【図7B】図７Ｂは、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除のそれぞれについての、ｄｄＰＣＲで測定したＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除の割合（可能であれば４回測定）、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したＬＤＬＲｍＲＮＡのレベル（２回測定）、及びＬＤＬＲ特異的抗体を使用したフローサイトメトリーで測定したＬＤＬＲ膜タンパク質の発現レベルを示す（３回の実験）。

【図7C】図７Ａ及び図７Ｂに示したＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除実験の切断マップを、ＬＤＬＲの発現（Ｒｑ値）に対するｓｇＲＮＡ組合せ形成の効果と共に示す。

【図8A】ガイドｇ４６及びｇ７９とＯＭＮＩ－５０リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体による、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除。簡潔に説明すると、特定のガイドとＯＭＮＩ－５０ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して、ヒト細胞株ＨｅｐＧ２でＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲを切除した。切除後、ＬＤＬＲ発現レベルとＬＤＬ－コレステロール取込みについて、細胞を分析した（以上、図８Ａ～図８Ｄ）。図８Ａは、ｄｄＰＣＲ測定によるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除の割合を示す。

【図8B】図８Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したＬＤＬＲｍＲＮＡのレベルを示す。

【図8C】図８Ｃは、ＤＬＲ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーで測定した、ＬＤＬＲ膜タンパク質発現レベルを示す。

【図8D】図８Ｄは、ロバスタチンを添加した場合と添加しない場合で、４時間のインキュベーション後のフローサイトメトリーにより測定した、ＬＤＬ－Dylight-488－コレステロールの取込みを示す。

【図9A】ガイドｇ３８及びｇ７９とＯＭＮＩ－７９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体の導入、又はＯＭＮＩ－７９をコードするｍＲＮＡ並びにガイドｇ３８及びｇ７９を含むＲＮＡ組成物の導入による、ＨｅｐＧ２細胞におけるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除。簡潔に説明すると、特定のガイドとＯＭＮＩ－７９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを使用して、ＨｅｐＧ２でＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲを切除した。切除後、ＬＤＬＲ発現レベルとＬＤＬ－コレステロール取込みについて、細胞を分析した（以上、図９Ａ～図９Ｄ）。図９Ａは、ｄｄＰＣＲ測定によるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除の割合を示す。

【図9B】図９Ｂは、ｑＲＴ－ＰＣＲで測定したＬＤＬＲｍＲＮＡのレベルを示す。

【図9C】図９Ｃ：ＬＤＬＲ特異的抗体を用いたフローサイトメトリーで測定した、ＬＤＬＲ膜タンパク質発現レベルを示す。

【図9D】図９Ｄ：ロバスタチンを添加した場合と添加しない場合で、４時間のインキュベーション後のフローサイトメトリーにより測定した、ＬＤＬ－Dylight-488－コレステロールの取込みを示す。

【図10】本発明におけるＣＲＩＳＰＲベースのＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除ストラテジーの概略図である。

【発明を実施するための形態】

【0025】

詳細な説明
別段の定義がある場合を除き、この明細書で用いる全ての技術的及び／又は科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。この明細書に記載したものと類似した又は等価の方法及び材料は、本発明の態様の実施又は試験に用いることができるが、代表的な方法及び／又は材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含めて、この特許明細書が優先する。加えて、材料、方法及び実施例は例証となるのみであり、必ずしも限定することを意図するものではない。

【0026】

この明細書では、用語「１つの（a、an）」は、列挙された成分の「１つ以上」を指すことが理解される。単数形の使用は、具体的に別段の説明がある場合を除き、複数形を含むことは当業者に明らかである。したがって、用語「１つの（a、an）」及び「少なくとも１つの」は、この出願では同じ意味である。

【0027】

この教示をより良く理解することを目的として、かつ教示の範囲を決して限定することなく、別段の指示がある場合を除き、この明細書及び特許請求の範囲で用いられる、量、パーセンテージ又は割合を表す全ての数及び他の数値は、あらゆる場合において、用語「約」により修飾されていると理解される。したがって、反する指示がある場合を除き、明細書及び特許請求の範囲に示した数的パラメータは、得られるように求められる所望の性質に依存して変動し得る近似値である。最低でも、各数的パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の数を考慮しかつ通常の丸め技術を適用することによって解釈される。

【0028】

別段の説明がある場合を除き、形容詞、例えば、本発明の態様の特徴を示す状態又は関係を修飾する「実質的に」及び「約」は、その状態又は特性が、それが意図される適用についての態様の運用に受け入れられる許容範囲内までで定義されることを意味すると理解される。別段の指示がある場合を除き、この明細書及び特許請求の範囲における語「又は」は、排他的な「又は」というよりむしろ、包含的な「又は」であると見なされ、それが結合させる項目の少なくとも１つ又は任意の組合せを示す。

【0029】

本出願の説明及び特許請求の範囲において、動詞「含む（comprise）」、「含有する（include）」及び「有する（have）」、並びにそれらの活用形は、その動詞の目的語が、必ずしも、その動詞の主語の成分、要素又は部分の完全な列挙とは限らないことを示すために用いられる。この明細書では他の用語は、当技術分野におけるそれらの周知の意味により定義されることを意図される。

【0030】

本発明のいくつかの態様では、ＤＮＡヌクレアーゼを利用して、標的部位のＤＮＡを切断し、例えば、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）が挙げられるがこれには限定されない、細胞修復機構を誘導する。古典的なＮＨＥＪでは、二本鎖切断（ＤＳＢ）部位の２つの末端が、迅速ではあるものの不正確に連結される（すなわち、切断部位におけるわずかな挿入又は欠失というＤＮＡの変異が多く生じる）。

【0031】

この明細書では、用語「改変された細胞」は、標的配列とのハイブリダイゼーション、すなわち、オンターゲットハイブリダイゼーションの結果、ＲＮＡ分子及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの複合体が二本鎖切断する細胞を指す。

【0032】

この明細書では、用語「標的化配列」又は「標的化分子」は、特定の標的配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列、又はヌクレオチド配列を含む分子を指し、例えば、標的化配列は、標的となる配列と少なくとも部分的に相補的であるヌクレオチド配列を有する。標的化配列又は標的化分子は、単独で、又は他のＲＮＡ分子と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部であってもよく、標的化配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的化部分としての役割を果たす。標的化配列を有する分子がＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、単独で又は他の１つ以上のＲＮＡ分子（例．ｔｒａｃｒＲＮＡ分子）と組み合わせて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的を特定の標的配列とする能力がある。限定するものではない例として、ＣＲＩＳＰＲＲＮＡ分子のガイド配列部分又はシングルガイドＲＮＡ分子は、標的化分子としての役割を果たしてもよい。それぞれの実現可能性は、個別の態様である。標的化配列は、所望の配列を標的とするようにカスタムデザインできる。

【0033】

この明細書では、用語「標的とする」は、標的化分子の標的化配列を、標的化されるヌクレオチド配列を有する核酸へ優先的にハイブリダイズさせることを指す。用語「標的化する」は、可変性のハイブリダイゼーション効率を包含し、したがって、標的化されるヌクレオチド配列を有する核酸の優先的標的化があるが、オンターゲットハイブリダイゼーションに加えて、意図しないオフターゲットハイブリダイゼーションも生じる可能性があることは理解されている。ＲＮＡ分子が配列を標的とする場合、ＲＮＡ分子とＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ分子の複合体は、ヌクレアーゼ活性のためにその配列を標的とすることは理解されている。

【0034】

ＲＮＡ分子の「ガイド配列部分」は、特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を指し、例えば、ガイド配列部分は、ガイド配列部分に沿って標的化されるＤＮＡ配列と部分的に又は完全に相補的であるヌクレオチド配列を有する。いくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０、又は、およそ１７～５０、１７～４９、１７～４８、１７～４７、１７～４６、１７～４５、１７～４４、１７～４３、１７～４２、１７～４１、１７～４０、１７～３９、１７～３８、１７～３７、１７～３６、１７～３５、１７～３４、１７～３３、１７～３１、１７～３０、１７～２９、１７～２８、１７～２７、１７～２６、１７～２５、１７～２４、１７～２２、１７～２１、１８～２５、１８～２４、１８～２３、１８～２２、１８～２１、１９～２５、１９～２４、１９～２３、１９～２２、１９～２１、１９～２０、２０～２２、１８～２０、２０～２１、２１～２２若しくは１７～２０である。いくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは１７～５０である。いくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは１７～２５である。いくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは１７～２２である。いくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは１７～２０である。いくつかの態様では、ガイド配列部分の全長は、ガイド配列部分に沿って標的化されるＤＮＡ配列と完全に相補的である。ガイド配列部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成できるＲＮＡ分子の一部であってもよく、ガイド配列部分がＣＲＩＳＰＲ複合体のＤＮＡ標的化部分としての役割を果たす。ガイド配列部分を有するＤＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲ分子と同時に存在する場合、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的を特定の標的ＤＮＡ配列とする能力がある。それぞれの実現可能性は、個別の態様である。ＲＮＡ分子は、任意の所望の配列を標的とするようにカスタムデザインできる。したがって、「ガイド配列部分」を含む分子は一種の標的化分子である。いくつかの態様では、ガイド配列部分は、この明細書に記載したガイド配列部分、例えば、配列番号１～２０２４６のいずれかに示すガイド配列と同じ配列、又は１、２、３、４若しくは５ヌクレオチド以下の異なる配列を含む。それぞれの実現可能性は、個別の態様である。これらの態様の一部において、ガイド配列部分は、標的配列に対して完全に相補的であり、配列番号１～２０２４６のいずれかに示す配列と同じ配列を含む。この出願全体で、用語「ガイド分子」、「ＲＮＡガイド分子」、「ガイドＲＮＡ分子」及び「ｇＲＮＡ分子」は、ガイド配列部分を含む分子と同義である。

【0035】

この明細書では、用語「非区別的な」は、遺伝子の全てのアレルで共通する特定のＤＮＡ配列を標的とするＲＮＡ分子のガイド配列部分を指す。

【0036】

本発明のいくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドのガイド配列部分を含む。

【0037】

ＲＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子のガイド配列部分は、修飾ヌクレオチドを有してもよい。ヌクレオチド／ポリヌクレオチドへの代表的な修飾は、合成であってもよく、天然に存在するアデニン、シトシン、チミン、ウラシル又はグアニン塩基以外の塩基を含むヌクレオチドを有するポリヌクレオチドを包含してもよい。ポリヌクレオチドへの修飾には、合成で、天然に存在しないヌクレオシド、例えば、ロックド核酸を有するポリヌクレオチドが挙げられる。ＲＮＡの安定性を増加又は減少させるために、ポリヌクレオチドを修飾してもよい。修飾ポリヌクレオチドの例は、１－メチルプソイドウリジンを有するｍＲＮＡである。修飾ポリヌクレオチドとその用途の例は、参照によりこの明細書に組み入れられる米国特許第8,278,036号、国際公開第2015/006747号及びWeissman and Kariko (2015)を参照。

【0038】

この明細書では、配列番号で示す「連続するヌクレオチド」は、ヌクレオチドの介入を一切含まない、配列番号に示した順序での配列のヌクレオチドを指す。

【0039】

本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分は、１７～５０ヌクレオチド長であってもよく、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する２０～２２ヌクレオチドを含有してもよい。本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分は、２２ヌクレオチド長未満であってもよい。例えば、本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分は、１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチド長であってもよい。そのような態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す連続する１７～２２ヌクレオチドの配列における、それぞれ１７、１８、１９、２０又は２１ヌクレオチドからなってもよい。例えば、配列番号１０７３９に示す連続する１７ヌクレオチドの配列のガイド配列部分は、以下のヌクレオチド配列のいずれか１つからなってもよい（連続する配列から排除されたヌクレオチドには、取り消し線が引かれている）：

【0040】

【化1】

【0041】

本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチドの長さは、２０を超えてもよい。例えば、本発明のいくつかの態様では、ガイド配列部分のヌクレオチド長は、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０であってもよい。そのような態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す連続する２０、２１又は２２ヌクレオチドの配列を含有する１７～５０ヌクレオチド、及び、標的配列の３’末端、５’末端、又は両者に隣接するヌクレオチド（の配列）に完全に相補的なヌクレオチドを含む。

【0042】

本発明のいくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びガイド配列部分を含むＲＮＡ分子は、標的ＤＮＡ配列と結合して、標的ＤＮＡ配列を切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を形成する。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１は、追加のｔｒａｃｒＲＮＡ分子なしで、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＲＮＡ分子を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。あるいは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、Ｃａｓ９は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子とｔｒａｃｒＲＮＡ分子の間でＣＲＩＳＰＲ複合体を形成してもよい。特定の標的ＤＮＡ配列とハイブリダイズできるヌクレオチド配列を含むガイド配列部分と、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ結合に関与する配列部分、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列部分は、同じＲＮＡ分子中に存在できる。あるいは、ガイド配列部分は１つのＲＮＡ分子に存在し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ結合に関与する配列部分、例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ部分は、別のＲＮＡ分子に存在してもよい。ガイド配列部分（例．ＤＮＡ標的化ＲＮＡ配列）及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲタンパク質結合ＲＮＡ配列部分（例．ｔｒａｃｒＲＮＡ配列部分）を含む単一のＲＮＡ分子が、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体を形成し、ＤＮＡ標的化分子としての役割を果たすことができる。いくつかの態様では、ガイド配列部分を含むＤＮＡ標的化ＲＮＡ部分を含む第１のＲＮＡ分子と、ＣＲＩＳＰＲタンパク質結合ＲＮＡ配列を含む第２のＲＮＡ分子は、塩基対形成により相互作用して、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的をＤＮＡ標的部位とするＲＮＡ複合体を形成し、あるいは、融合してＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化し、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的をＤＮＡ標的部位とするＲＮＡ分子を形成する。

【0043】

本発明のいくつかの態様において、ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子の配列を更に含んでいてもよい。そのような態様は、ＲＮＡ分子のガイド部分とトランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の合成的融合体としてデザインされてもよい。（Jinek et al., 2012参照）。そのような態様では、ＲＮＡ分子はシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子である。本発明のいくつかの態様は、個々のｔｒａｃｒＲＮＡ分子及びガイド配列部分を含む個々のＲＮＡ分子を利用するＣＲＩＳＰＲ複合体も形成してもよい。そのような態様では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、塩基対形成を介してＲＮＡ分子とハイブリダイズしてもよく、この明細書に記載した発明のある特定の適用において有利である可能性がある。

【0044】

用語「ｔｒａｃｒメイト配列」は、塩基対形成を介してｔｒａｃｒＲＮＡとハイブリダイズし、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するように、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子に対して十分に相補的な配列を指す。（米国特許第8,906,616号参照）。本発明のいくつかの態様では、ＲＮＡ分子はｔｒａｃｒメイト配列を有する部分を更に含んでいてもよい。

【0045】

本発明では、「遺伝子」は、遺伝子産物をコードするＤＮＡ領域、及び、遺伝子産物の産生を制御する全てのＤＮＡ領域を含み、前記制御領域の配列は、コード配列及び／又は転写配列と隣接しているか、していないかを問わない。したがって、遺伝子には、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳制御配列、例えば、リボソーム結合部位及び配列内リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、並びに遺伝子座調節領域が挙げられるが、必ずしもそれらに限定されるものではない。

【0046】

「真核」細胞には、真菌細胞（例．酵母）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、及びヒト細胞が挙げられるが、それらに限定されるものではない。

【0047】

この明細書では、用語「ヌクレアーゼ」は、核酸のヌクレオチドサブユニット間のホスホジエステル結合を切断する能力がある酵素を指す。ヌクレアーゼは、天然物から単離してもよく、又は天然物に由来するものであってもよい。天然物は、生きている生物体であってもよい。あるいは、ヌクレアーゼは、ホスホジエステル結合切断活性を保持する、改変された又は合成されたタンパク質であってもよい。遺伝子改変は、ヌクレアーゼ、例えばＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いて実現できる。

【0048】

本発明のいくつかの態様では、細胞中の内因性低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）遺伝子の発現を増加させる方法であって、ＬＤＬＲ遺伝子の改変又はＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物の改変を含む方法を提供する。

【0049】

いくつかの態様では、細胞内の内因性ＬＤＬＲ遺伝子の発現の増加が、ＬＤＬＲ遺伝子を改変する前の細胞内のＬＤＬＲ転写産物又はＬＤＬＲタンパク質のレベルと比較して、ＬＤＬＲ転写産物又はＬＤＬＲタンパク質のレベルの、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％又は少なくとも６００％の増加として測定される。転写産物のレベル（例．ｑＲＴ－ＰＣＲ）及びタンパク質のレベル（例．抗体染色、フローサイトメトリー）を測定する方法は当技術分野において知られている。

【0050】

いくつかの態様では、内因性ＬＤＬＲ遺伝子の発現の増加は、ＬＤＬＲ遺伝子を改変する前の細胞によるＬＤＬ－Ｃの取込みと比較して、細胞によるＬＤＬ－Ｃの取込みを、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、又は少なくとも５００％増加させる。

【0051】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）若しくはジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）により改変される、又はＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物が、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）若しくはマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）により改変される。

【0052】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子又はＬＤＬＲ遺伝子がコードする転写産物の３’非翻訳領域（ＵＴＲ）が改変される。例えば、ＬＤＬＲ遺伝子の転写産物は、ｓｉＲＮＡ分子の転写産物への結合により改変されてもよい。転写産物のそのような改変は、転写産物の３’ＵＴＲへの接触をブロックするために実施されてもよい。

【0053】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲは、３’ＵＴＲ又はその一部分の切除により改変される。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの領域が切除される。いくつかの態様では、３’ＵＴＲの切除された領域の５’末端は、ＬＤＬＲ終止コドンの末端の少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０ヌクレオチド下流に位置し、３’ＵＴＲの切除された領域の３’末端は、内因性ＬＤＬＲポリアデニル化シグナルの少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０ヌクレオチド上流に位置する。各可能性は、別々の態様を表す。いくつかの態様では、３’ＵＴＲの切除された領域は、ＬＤＬＲ遺伝子の終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流にあり、ポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流にある。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除された領域は、ポリアデニル化シグナルの５００、４５０、４００、３００、２００ヌクレオチド（「塩基対（ｂｐ）」とも呼ばれる）上流からポリアデニル化シグナルの１００、９０、７０、８０、７０、６０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。各可能性は、別々の態様を表す。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除された領域は、ポリアデニル化シグナルの５００ヌクレオチド上流からポリアデニル化シグナルの６０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除された領域は、終止コドンの８００、９００、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００ヌクレオチド下流からポリアデニル化シグナルの２００、１００、９０、７０、６０、５０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。各可能性は、別々の態様を表す。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除された領域は、終止コドンの８００ヌクレオチド下流からポリアデニル化シグナルの６０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除された領域は、終止コドンの１００～３００ヌクレオチド下流からポリアデニル化シグナルの１７０～３０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除された領域は、終止コドンの１７５ヌクレオチド下流からポリアデニル化シグナルの７０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除された領域は、終止コドンの２３０ヌクレオチド下流からポリアデニル化シグナルの７０ヌクレオチド上流にわたる、少なくとも一領域の切除を含む。

【0054】

いくつかの態様では、この方法は、
少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子；及び
ガイド配列を含む、ＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子
を含む組成物の細胞への導入を含み、
ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子の複合体が、ＬＤＬＲ遺伝子の１つのアレルを二本鎖切断し、これにより、ＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させる。

【0055】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲの３’ＵＴＲに位置する、ＬＤＬＲ発現を抑止することに関与する１つ以上の部位、例えばｍｉＲＮＡ結合部位又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）は不活性化され、ＬＤＬＲの発現の増加をもたらす。

【0056】

いくつかの態様では、組成物は、対象の細胞又は培養中の細胞に導入される。

【0057】

いくつかの態様では、細胞は肝臓細胞である。いくつかの態様では、細胞は肝実質細胞である。いくつかの態様では、細胞は幹細胞である。

【0058】

いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びＲＮＡ分子又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子（例．ＤＮＡ分子）は、実質的に同時に又は異なる時点で細胞に導入される。

【0059】

いくつかの態様では、細胞内のＬＤＬＲ遺伝子のｍｉＲＮＡ結合部位又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）は、挿入変異又は欠失変異を受ける。いくつかの態様では、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）が、細胞における一方又は両方のＬＤＬＲアレルから完全に切除される。

【0060】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの、終止コドンの下流又はポリアデニル化シグナルの上流に位置する部位を標的とする。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの、終止コドンの末端の少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも１、２、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０ヌクレオチド上流に位置する部位を標的とする。各可能性は、別々の態様を表す。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの、終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流に位置する部位を標的とする。

【0061】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ＬＤＬＲアレル中のｍｉＲＮＡ結合部位を標的とする。

【0062】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ｍｉＲ－８５結合部位又はｍｉＲ－１４８結合部位を標的とする。

【0063】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ遺伝子のアレルの二本鎖切断の結果、ｍｉＲシード配列は不活性化される。

【0064】

いくつかの態様では、ｍｉＲシード配列は、ＵＧＧＵＧＣＵＡ又はＣＡＣＵＧＵＧである。

【0065】

いくつかの態様では、ｍｉＲシード配列は、ｍｉＲ－１８５又はｍｉＲ－１４８シード配列である。

【0066】

いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子の複合体は、ＬＤＬＲ遺伝子の一対のアレルを二本鎖切断する。

【0067】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子のガイド配列部分は、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。

【0068】

いくつかの態様では、細胞に導入される組成物は、ガイド配列部分を含む、第２のＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子（例．ＤＮＡ分子）を更に含む。

【0069】

いくつかの態様では、第２のＲＮＡのガイド配列部分は、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの、終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流に位置する部位を標的とする。

【0070】

いくつかの態様では、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。

【0071】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ又はその一部分は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第１のＲＮＡ分子によって形成される二本鎖切断、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと第２のＲＮＡ分子によって形成される二本鎖切断により切除される。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの配列の少なくとも一部分を含む配列が切除される。いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの配列を含む配列が切除される。

【0072】

【0073】

【0074】

したがって、特定のガイド配列部分を組み合わせて使用して、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの一部分を切除してもよい。以下の態様は、ＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させるために切除されてもよいＬＤＬＲ３’ＵＴＲの一部分の、いくつかの限定するものではない例を提供する。列挙された、示したゲノム位置は、gnomAD v3 database and UCSC Genome Browser assembly ID: hg38, Sequencing/Assembly provider ID: Genome Reference Consortium Human GRCh38.p12 (GCA_000001405.27). Assembly date: Dec. 2013 initial release; Dec. 2017 patch release 12に基づく。

【0075】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１４６３から１９：１１１３３２７９に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１１２０で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号２６５６で示される配列を含んでいてもよい。

【0076】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１４６３から１９：１１１３３７１３に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１１２０で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７９６で示される配列を含んでいてもよい。

【0077】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１４６３から１９：１１１３２１１４に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１１２０で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号４７７で示される配列を含んでいてもよい。

【0078】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１４６３から１９：１１１３２１１５に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１１２０で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１９１３で示される配列を含んでいてもよい。

【0079】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１５１６から１９：１１１３３７１３に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１８１で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７９６で示される配列を含んでいてもよい。

【0080】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１５５７から１９：１１１３１５６７に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号９０１で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１９２７で示される配列を含んでいてもよい。

【0081】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３３２７９から１９：１１１３３７１３に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号２６５６で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７９６で示される配列を含んでいてもよい。

【0082】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３３７１３から１９：１１１３２１１４に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７９６で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号４７７で示される配列を含んでいてもよい。

【0083】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３３７１３から１９：１１１３２１１５に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７９６で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号１９１３で示される配列を含んでいてもよい。

【0084】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１４６７から１９：１１１３３７１３に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７８７１で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号９８４３で示される配列を含んでいてもよい。

【0085】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除した部分は、ほぼ１９：１１１３１５１９から１９：１１１３３７１３に及ぶ。例えば、ＬＤＬＲ３’ＵＴＲからそのような部分を切除するために、第１のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号７７０７で示される配列を含んでいてもよく、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は配列番号９８４３で示される配列を含んでいてもよい。

【0086】

いくつかの態様では、内因性ＬＤＬＲのポリアデニル化シグナルは改変されない。

【0087】

いくつかの態様では、第１のＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドミスマッチを有する。

【0088】

いくつかの態様では、ガイド配列部分は、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含み、前記連続するヌクレオチドは、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている。

【0089】

いくつかの態様では、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個又は５個のヌクレオチドミスマッチを有するように改変されたガイド配列部分の、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼとＲＮＡ分子の複合体に対する標的特異性は、ＬＤＬＲ遺伝子の変異したアレルに対して高い相補性を有するガイド配列部分より高い。

【0090】

いくつかの態様では、細胞内の内因性ＬＤＬＲ遺伝子の発現の増加は、ＬＤＬＲ遺伝子を改変する前の細胞内のＬＤＬＲ転写産物又はＬＤＬＲタンパク質のレベルと比較して、ＬＤＬＲ転写産物又はＬＤＬＲタンパク質のレベルの、少なくとも１０％、少なくとも２５％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２００％、少なくとも２５０％、少なくとも３００％、少なくとも３５０％、少なくとも４００％、少なくとも４５０％、少なくとも５００％、少なくとも５５０％又は少なくとも６００％の増加として測定される。

【0091】

【0092】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド、若しくはＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている前記連続するヌクレオチドを含むＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を含む、組成物を提供する。

【0093】

いくつかの態様では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、又はＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードするヌクレオチド分子を更に含む。

【0094】

いくつかの態様では、組成物はｔｒａｃｒＲＮＡ分子を更に含む。

【0095】

いくつかの態様では、組成物は、ガイド配列部分を含む、第２のＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を更に含む。

【0096】

【0097】

いくつかの態様では、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、配列番号１～１０７３６のいずれか１つ、又は第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。

【0098】

【0099】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した態様のいずれか１つの組成物を含む、細胞中のＬＤＬＲアレルを不活性化する医薬を提供し、前記組成物は、細胞へ送達される。

【0100】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した態様のいずれか１つの組成物又はこの明細書に記載した改変された細胞の、高コレステロール血症を治療する、寛解させる、又は予防するための使用を提供し、前記組成物又は改変された細胞は、高コレステロール血症にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達される。

【0101】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した態様のいずれか１つの組成物又はこの明細書に記載した改変された細胞を含む、高コレステロール血症を治療する、寛解させる、又は予防するための医薬を提供し、前記医薬は、前記組成物又は改変された細胞を高コレステロール血症にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することにより投与される。

【0102】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した態様のいずれか１つの組成物及び組成物を細胞へ送達することについての使用説明書を含む、細胞内のＬＤＬＲ発現を増加させるキットを提供する。

【0103】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した態様のいずれか１つの組成物又はこの明細書に記載した改変された細胞、及び前記組成物又は改変された細胞を高コレステロール血症にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することについての使用説明書を含む、対象において高コレステロール血症を治療又は予防するためのキットを提供する。

【0104】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した組成物又は改変された細胞のいずれか１つの、高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療する、寛解させる、又は予防するための使用を提供し、前記組成物又は改変された細胞は、高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達される。

【0105】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した組成物又は改変された細胞のいずれか１つを含む、高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療する、寛解させる、又は予防する医薬を提供し、前記医薬は、前記組成物又は改変された細胞を高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することにより投与される。

【0106】

本発明のいくつかの態様では、細胞（例．肝臓細胞又は肝実質細胞）を改変して、対象における高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療する、寛解させる、又は予防することにおける使用のための、ＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡ分子は、ex vivo、in vitro、又はin vivoで細胞に送達してもよい。

【0107】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した組成物のいずれか１つ及び前記組成物を細胞へ送達することについての使用説明書を含む、細胞中のＬＤＬＲアレルのｍｉＲＮＡ結合部位及び／又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）を不活性化するキットを提供する。

【0108】

本発明のいくつかの態様では、この明細書に記載した組成物のいずれか１つの組成物及び組成物を高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）にり患している又はり患するリスクがある対象へ送達することについての使用説明書を含む、対象における高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療する、寛解させる、又は予防するためのキットを提供する。

【0109】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド、又はＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている前記連続するヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を含む、組成物を提供する。

【0110】

いくつかの態様では、組成物は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はその機能性誘導体を更に含む。

【0111】

いくつかの態様では、組成物はｔｒａｃｒＲＮＡ分子を更に含む。

【0112】

本発明のいくつかの態様では、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド、若しくはＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている前記連続するヌクレオチドのガイド配列部分を含むＲＮＡ分子、又はＲＮＡ分子をコードするヌクレオチド分子（例．ＤＮＡ分子）を含む、遺伝子編集組成物を提供する。いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合する配列を有する部分を更に含む。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと結合する配列はｔｒａｃｒＲＮＡ配列である。

【0113】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は、ｔｒａｃｒメイト配列を有する部分又はこれをコードする分子を更に含む。

【0114】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は１つ以上のリンカー部分を更に含んでいてもよい。

【0115】

本発明のいくつかの態様では、ＲＮＡ分子のヌクレオチド長は、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４５０、４００、３５０、３００、２９０、２８０、２７０、２６０、２５０、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９０、１８０、１７０、１６０、１５０、１４０、１３０、１２０、１１０、又は１００までであってもよい。それぞれの実現可能性は、個別の態様である。本発明のいくつかの態様では、ＲＮＡ分子のヌクレオチドの長さは、１７～３００、１００～３００、１５０～３００、１００～５００、１００～４００、２００～３００、１００～２００又は１５０～２５０であってもよい。それぞれの実現可能性は、個別の態様である。

【0116】

本発明のいくつかの態様では、組成物はｔｒａｃｒＲＮＡ分子を更に含む。

【0117】

いくつかの態様では、組成物は、第２のＲＮＡ分子又は第２のＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ分子を更に含む。

【0118】

【0119】

いくつかの態様では、第２のＲＮＡ分子のガイド配列部分は、第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド、又は第１のＲＮＡ分子に含まれる配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチド以外の、ＬＤＬＲの標的配列と完全に相補的な配列に対して、１個、２個、３個、４個若しくは５個のヌクレオチドミスマッチを有するように更に改変されている、配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含む。

【0120】

本開示の組成物及び方法は、高コレステロール血症を治療し、予防し、寛解させ又はその進行を遅くするために利用してもよい。

【0121】

本発明では、細胞中のＬＤＬＲの発現を増加させる又はＬＤＬＲの半減期を増加させるためのこれまでに説明したストラテジーのいずれか１つ又は組合せを使用してもよい。

【0122】

いくつかの態様では、この方法は、ＬＤＬＲ遺伝子の増加した発現により重症度が低下する疾患表現型である、高コレステロール血症のリスクがある対象を治療するために利用される。そのような態様では、この方法は、疾患表現型を改善し、寛解させ又は予防する。

【0123】

この明細書に記載した組成物の態様は、少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子を含み、対象又は細胞において同時に有効である。少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、ＲＮＡ分子及びｔｒａｃｒＲＮＡは、実質的に同時に送達してもよく、又は、異なる時点に送達できるが、効果は同時に生じる。例えば、これは、ＲＮＡ分子及び／又はｔｒａｃｒＲＮＡが対象又は細胞中に実質的に存在する前に、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを対象又は細胞へ送達することを含む。

【0124】

いくつかの態様では、ヒト細胞が、この明細書に記載した方法のいずれか１つにより改変される。いくつかの態様では、細胞は肝臓細胞である。いくつかの態様では、細胞は肝実質細胞である。いくつかの態様では、細胞は幹細胞である。

【0125】

ＬＤＬＲ編集ストラテジー
ＬＤＬＲ発現を増加させるために改変又は除去できるヒトＬＤＬＲ遺伝子の具体的な領域は、未だ決定されていない。これまでに、Knouffら(2001)は、マウスＬＤＬＲアレルを短縮化したヒトＬＤＬＲミニ遺伝子バリアントと置き換えるように改変したマウスヘテロ接合体の肝臓において、肝ＬＤＬＲｍＲＮＡレベルを中程度に増加させることを示している。さらに、Bjornssonら(2021)は、内因性ポリアデニル化シグナルを含むＬＤＬＲ３’ＵＴＲの遠位領域にわたってＬＤＬＲ遺伝子を越え、機能獲得効果をもたらすと思われる２．５ｋｂの欠失変異を有するいくつかのキャリアを含む、単一のファミリーを特定している。しかし、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを特定の部位へ標的化することによって、ヒトＬＤＬＲ３’ＵＴＲの特定の部分を標的とし、除去するストラテジーはこれまでに存在せず、並びにＬＤＬＲ発現及びコレステロールレベルに対するそのような変異の効果は、これまでに判明していない。

【0126】

本発明は、例えば、対象の細胞中の制御因子部位を除去若しくは不活性化させ、又は１つ以上のＬＤＬＲアレルの３’ＵＴＲの部分を切除することによって、ＬＤＬＲ遺伝子の発現を増加させ、これにより高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）を治療又は予防する方法を提供する。したがって、細胞中のＬＤＬＲアレル内の制御因子部位をノックアウト又は不活性化させる方法は、高コレステロール血症（例．家族性高コレステロール血症）の治療、予防又は寛解のために使用してもよい。いくつかの態様では、制御因子部位は、ｍｉＲＮＡ結合部位又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）である。

【0127】

ＬＤＬＲの編集ストラテジーには、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的をＬＤＬＲ３’ＵＴＲのマイクロＲＮＡ結合部位とするガイド配列部分を含むＲＮＡ分子を利用することが挙げられるが、これには限定されない。例えば、ガイド配列部分は、ｍｉＲ－１８５シード配列又はｍｉＲ－１４８シード配列を標的としてもよい。そのようなシード部位における編集は、ｍｉＲＮＡの３’ＵＴＲへの結合を防ぎ、これにより、ＬＤＬＲｍＲＮＡ及び／又はＬＤＬＲタンパク質のレベルを上方制御する。

【0128】

別のストラテジーは、それぞれがＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの標的をＬＤＬＲ３’ＵＴＲの配列とする独自のガイド配列部分を含む２つのＲＮＡ分子を利用することを含む。３’ＵＴＲの少なくとも一部分の両アレル切除を達成するために、２つの標的とされる配列の１つ目はＬＤＬＲ終止コドンの下流に位置していてもよく、２つ目はポリアデニル化シグナルの上流に位置していてもよい。そのような配列は、終止コドンの少なくとも３０ヌクレオチド下流又はポリアデニル化シグナルの少なくとも３０ヌクレオチド上流に位置していてもよい。このようにして、３’ＵＴＲの大半の両アレル切除が達成される。したがって、ＬＤＬＲの発現を負に制御するｍｉＲＮＡ結合部位又はＡＵリッチ領域（ＡＵＲ）制御部位は、無効化又は除去される。いくつかの態様では、これは、転写産物の安定性と翻訳効率に必須であるポリアデニル化シグナルを改変することなく、３’ＵＴＲを短縮化することで達成される。他の態様では、ポリアデニル化シグナルもまた少なくとも部分的に除去される。

【0129】

したがって、１つのストラテジーは、それぞれが３’ＵＴＲの配列を標的とする独自のガイド配列部分を含む２つのガイドＲＮＡ分子、及び少なくとも１つのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを利用して、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲ又はＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの少なくとも一部分を含む配列を切除することを含む。そのような配列は、ポリアデニル化シグナルの下流又は終止コドンの上流に位置していてもよい。少なくとも一部分の３’ＵＴＲ又は全ての３’ＵＴＲを含む両アレル切除を達成するために標的とすることができる配列の限定するものではない例として、１）終止コドンの上流に位置する第１の配列及びポリアデニル化シグナルの上流に位置する第２の配列；２）終止コドンの下流に位置する第１の配列及びポリアデニル化シグナルの下流に位置する第２の配列；並びに３）終止コドンの上流に位置する第１の配列及びポリアデニル化シグナルの下流に位置する第２の配列、が挙げられる。

【0130】

ガイド配列部分を含むＲＮＡ分子のいずれか１つは、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）分子又はＣＲＩＳＰＲＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）分子であってもよい。ｃｒＲＮＡ分子は、当技術分野において説明されているように、通常、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）分子と共に利用されて、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的とする。したがって、示したストラテジーのそれぞれは、１つ以上のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを、１つ以上のシングルガイドＲＮＡ分子並びに／若しくは１つ以上のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ分子、又はこれらの組合せと共に実施してもよい。組成物は、核酸ベクター、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）又はこれらの組合せのうちの１つ以上として、標的細胞に導入できる。

【0131】

ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ及びＰＡＭ認識
いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼは、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼから選択されるか、その機能性バリアントである。いくつかの態様では、配列特異的ヌクレアーゼはＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼである。そのような態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ（例．Ｃｐｆ１）をガイドするＲＮＡ配列は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼと結合し、及び／又は、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを細胞中の全てのＬＤＬＲアレルへ誘導する。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡを更に含まない。ＲＮＡ分子は、当技術分野において一般的に知られた方法により、ゲノム中の選択した標的と結合するように操作できることを、当業者は理解する。

【0132】

この明細書では、用語「ＰＡＭ」は、標的となるＤＮＡ配列の近傍に位置し、かつＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ複合体により認識される標的ＤＮＡのヌクレオチド配列を指す。ＰＡＭ配列は、ヌクレアーゼの種類によって異なっていてもよい。加えて、ほとんど全てのＰＡＭを標的にできるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼがある。本発明のいくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲシステムは、ガイド配列部分と、標的を認識するための追加の要件であるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡ部位のプロトスペーサーとの間で、ワトソン・クリック塩基対を形成することにより、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを標的ＤＮＡ部位へ誘導するガイド配列部分を有する１つ以上のＲＮＡ分子を利用する。その後、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、標的ＤＮＡ部位を切断し、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作り出す。限定するものではない例において、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｃｒＲＮＡのガイド配列部分と、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣の標的ＤＮＡ上のプロトスペーサーとの間で、ワトソン・クリック塩基対を形成することにより、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）を標的ＤＮＡへ誘導する成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を利用する。本発明の操作されたＲＮＡ分子が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）、例えば、利用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに関連する配列に対応するＰＡＭ、の隣の目的の標的ゲノムＤＮＡ配列と会合するように更にデザインされることを、当業者は理解する。そのＰＡＭは、例えば、限定するものではない例として、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Ｃａｓ９ＷＴ（ＳｐＣＡＳ９）ではＮＧＧ若しくはＮＡＧ（Ｎは任意の核酸塩基である）；黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（ＳａＣａｓ９）ではＮＮＧＲＲＴ；Jejuni Ｃａｓ９ＷＴではＮＮＮＶＲＹＭ；ＳｐＣａｓ９－ＶＱＲバリアントではＮＧＡＮ若しくはＮＧＮＧ；ＳｐＣａｓ９－ＶＲＥＲバリアントではＮＧＣＧ；ＳｐＣａｓ９－ＥＱＲバリアントではＮＧＡＧ；ＳｐＣａｓ９－ＮＲＲＨバリアントではＮＲＲＨ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）；ＳｐＣａｓ９－ＮＲＴＨバリアントではＮＲＴＨ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）；ＳｐＣａｓ９－ＮＲＣＨバリアントではＮＲＣＨ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＨはＡ、Ｃ、又はＴである）；ＳｐＣａｓ９のＳｐＧバリアントではＮＧ（Ｎは任意の核酸塩基である）；ＳｐＣａｓ９のＳｐＣａｓ９－ＮＧバリアントではＮＧ若しくはＮＡ（Ｎは任意の核酸塩基である）；ＳｐＣａｓ９のＳｐＲＹバリアントではＮＲ若しくはＮＲＮ若しくはＮＹＮ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧであり、ＹはＣ又はＴである）；ストレプトコッカス・カニス（Streptococcus canis）Ｃａｓ９バリアント（ＳｃＣａｓ９）ではＮＮＧ（Ｎは任意の核酸塩基である）；黄色ブドウ球菌のＳａＫＫＨ－Ｃａｓ９バリアント（ＳａＣａｓ９）ではＮＮＮＲＲＴ（Ｎは任意の核酸塩基であり、ＲはＡ又はＧである）；髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）（ＮｍＣａｓ９）ではＮＮＮＮＧＡＴＴ（Ｎは任意の核酸塩基である）；アリサイクロバチルス・アシドフィルス（Alicyclobacillus acidiphilus）Ｃａｓ１２ｂ（ＡａｃＣａｓ１２ｂ）ではＴＴＮ（Ｎは任意の核酸塩基である）；又はＣｐｆｌではＴＴＴＶ（ＶはＡ、Ｃ、又はＧである）である。本発明のＲＮＡ分子は、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと共に複合体を形成するようにそれぞれデザインされ、かつ前記ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼに対応する１つ以上の異なるＰＡＭ配列を利用して、目的のポリヌクレオチド配列を標的とするようにデザインされる。

【0133】

いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、事実上、二本鎖又は一本鎖のいずれかで、細胞のゲノムにおける所望の位置に、ＤＮＡ切断を引き起こすために用いてもよい。最も一般的に用いられるＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼはＣＲＩＳＰＲシステムに由来するが、他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼも、この明細書に記載したゲノム編集組成物及びゲノム編集方法における使用のために企図される。例えば、参照によりこの明細書に組み入れられる米国特許出願公開第2015/0211023号を参照。

【0134】

本発明の実施に使用できるＣＲＩＳＰＲシステムは非常にさまざまである。ＣＲＩＳＰＲシステムは、Ｉ型、ＩＩ型又はＩＩＩ型のシステムであってもよい。適切なＣＲＩＳＰＲタンパク質の限定するものではない例には、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ５ｅ（又はＣａｓＤ）、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａｌ、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓｌ０、ＣａｓｌＯｄ、ＣａｓＦ、ＣａｓＧ、ＣａｓＨ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ（又はＣａｓＡ）、Ｃｓｅ２（又はＣａｓＢ）、Ｃｓｅ３（又はＣａｓＥ）、Ｃｓｅ４（又はＣａｓＣ）、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘｌ０、Ｃｓｘｌ６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｚｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４及びＣｕｌ９６６が挙げられる。

【0135】

いくつかの態様では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムに由来したＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ（例．Ｃａｓ９）である。ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、ストレプトコッカス・サーモフィルス（Streptococcus thermophilus）、ストレプトコッカス種（Streptococcus sp.）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、トレポネーマ・デンティコラ（Treponema denticola）、ノカルディオプシス・ダッソンビレイ（Nocardiopsis dassonvillei）、ストレプトマイセス・プリスチナエスピラリス（Streptomyces pristinaespiralis）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）、ストレプトマイセス・ビリドクロモゲネス、ストレプトスポランジウム・ロゼウム（Streptosporangium roseum）、ストレプトスポランジウム・ロゼウム、アリサイクロバチルス・アシドカルダリウス（Alicyclobacillus acidocaldarius）、バチルス・シュードマイコイデス（Bacillus pseudomycoides）、バチルス・セレニティレデュセンス（Bacillus selenitireducens）、エキシグオバクテリウム・シビリクム（Exiguobacterium sibiricum）、ラクトバチルス・デルブレッキイ（Lactobacillus delbrueckii）、ラクトバチルス・サリバリウス（Lactobacillus salivarius）、ミクロシラ・マリナ（Microscilla marina）、バークホルデリアレス・バクテリウム（Burkholderiales bacterium）、ポラロモナス・ナフタレニボランス（Polaromonas naphthalenivorans）、ポラロモナス種（Polaromonas sp.）、クロコスファエラ・ワトソニー（Crocosphaera watsonii）、シアノセイス種（Cyanothece sp.）、ミクロキスティス・エルギノーサ（Microcystis aeruginosa）、シネココッカス種（Synechococcus sp.）、アセトハロビウム・アラビティカム（Acetohalobium arabaticum）、アンモニフェツクス・デゲンシイ（Ammonifex degensii）、カルディセルロシロプトル・ベスキー（Caldicellulosiruptor bescii）、キャンディダトゥス・デスルフォルディス（Candidatus Desulforudis）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）、クロストリジウム・ディフィシレ（Clostridium difficile）、フィネゴルディア・マグナ（Finegoldia magna）、ナトラネロビウス・サーモフィルス（Natranaerobius thermophilus）、ペロトマクルム・サーモプロピオニカム（Pelotomaculum thermopropionicum）、アシディチオバチルス・カルダス（Acidithiobacillus caldus）、アシディチオバチルス・フェロオキシダンス（Acidithiobacillus ferrooxidans）、アロクロマチウム・ビノスム（Allochromatium vinosum）、マリノバクター種（Marinobacter sp.）、ニトロソコッカス・ハロフィルス（Nitrosococcus halophilus）、ニトロソコッカス・ワッソニ（Nitrosococcus watsoni）、シュードアルテロモナス・ハロプランクティス（Pseudoalteromonas haloplanktis）、クテドノバクテル・ラセミファー（Ktedonobacter racemifer）、メタノハロビウム・エベスチガータム（Methanohalobium evestigatum）、アナベナ・バリアビリス（Anabaena variabilis）、ノジュラリア・スプミゲナ（Nodularia spumigena）、ノストック種（Nostoc sp.）、アルスロスピラ・マキシマ（Arthrospira maxima）、アルスロスピラ・プラテンシス（Arthrospira platensis）、アルスロスピラ種（Arthrospira sp.）、リングビア種（Lyngbya sp.）、ミクロコレウス・クソノプラステス（Microcoleus chthonoplastes）、オシラトリア種（Oscillatoria sp.）、ペトロトガ・モビリス（Petrotoga mobilis）、サーモシフォ・アフリカヌス（Thermosipho africanus）、アカリオクロリス・マリーナ（Acaryochloris marina）、又は既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼをコードする任意の種に由来してもよい。非培養性細菌によりコードされるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼも、本発明に関連して使用してもよい。（Burstein et al. Nature, 2017参照）。既知のＰＡＭ配列を有するＣＲＩＳＰＲタンパク質のバリアント、例えば、ＳｐＣａｓ９Ｄ１１３５Ｅバリアント、ＳｐＣａｓ９ＶＱＲバリアント、ＳｐＣａｓ９ＥＱＲバリアント又はＳｐＣａｓ９ＶＲＥＲバリアントも、本発明に関連して使用してもよい。

【0136】

したがって、Ｃａｓ９タンパク質若しくは改変されたＣａｓ９、若しくはＣａｓ９のホモログ若しくはオルソログといったＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、又は、Ｃｐｆ１とそのホモログ及びオルソログといった他のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを、本発明の組成物に使用してもよい。別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、例えば、国際公開第2020/223514号及び国際公開第2020/223553号（これらは参照によりこの明細書に組み入れられる）に記載のヌクレアーゼも使用してもよい。

【0137】

ある特定の態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼは、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能性誘導体」であってもよい。天然配列ポリペプチドの「機能性誘導体」は、天然配列ポリペプチドと質的に共通した生物学的性質を有する化合物である。「機能性誘導体」には、天然配列の断片、並びに天然配列ポリペプチド及びその断片の誘導体（ただし、それらは対応する天然配列ポリペプチドと共通の生物学的活性を有する）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。この明細書で企図される生物学的活性は、ＤＮＡ基質を加水分解して断片にする能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアントと、その共有結合性改変体及び融合体の両者を包含する。Ｃａｓポリペプチド又はその断片の適切な誘導体には、Ｃａｓタンパク質又はその断片の変異体、融合体、共有結合性改変体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。誘導体には、ＣＲＩＳＰＲニッカーゼ、触媒的に不活性なＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又は「死んだ」ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、及びＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ又はその誘導体と、塩基エディター又はレトロトランスポゾンといった他の酵素との融合体が挙げられるが、それらに限定されるものではない。例えば、Anzalone et al. (2019)及びＰＣＴ国際特許出願第PCT/US2020/037560号を参照。

【0138】

Ｃａｓタンパク質又はその断片、加えてＣａｓタンパク質又はその断片の誘導体を含むＣａｓタンパク質は、細胞から取得可能なものであってもよく、若しくは化学的に合成されるものであってもよく、又はこれらの方法の組合せにより得られるものであってもよい。細胞は、天然でＣａｓタンパク質を産生する細胞、又は、天然でＣａｓタンパク質を産生し、かつ、内因性Ｃａｓタンパク質をより高い発現レベルで産生するように、若しくは、内因性Ｃａｓと同じ若しくは異なるＣａｓをコードする外因的に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように、遺伝子操作された細胞であってもよい。場合によっては、細胞は、天然ではＣａｓタンパク質を産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。

【0139】

いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼはＣｐｆ１である。Ｃｐｆ１は、Ｔリッチなプロトスペーサー隣接モチーフを利用する単一のＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼである。Ｃｐｆ１は、ねじれ型ＤＮＡ二本鎖切断によってＤＮＡを切断する。アシダミノコッカス属（Acidaminococcus）及びラクノスピラ科（Lachnospiraceae）に由来する２つのＣｐｆ１酵素が、ヒト細胞において効率的にゲノム編集を行うことが示されている。（Zetsche et al., 2015参照）。

【0140】

したがって、Ｃａｓ９タンパク質若しくは改変されたＣａｓ９、若しくＣａｓ９のホモログ、オルソログ若しくはバリアントといったＩＩ型ＣＲＩＳＰＲシステムのＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼ、又は、Ｃｐｆ１及びそのホモログ、オルソログ若しくはバリアントといった他のＣＲＩＳＰＲシステムに属する他のＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼを、本発明で使用してもよい。

【0141】

いくつかの態様では、ガイド分子は、新しい性質又は向上した性質（例．分解に対する安定性、ハイブリダイゼーションエネルギー又はＲＮＡ誘導型ＤＮＡヌクレアーゼとの結合性）を付与する１つ以上の化学修飾を含む。適切な化学修飾には、修飾塩基、修飾糖、又は修飾されたヌクレオシド間結合が挙げられるが、それらに限定されるものではない。適切な化学修飾の限定するものではない例には、４－アセチルシチジン、５－（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’－Ｏ－メチルシチジン、５－カルボキシメチルアミノメチル－２－チオウリジン、５－カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’－Ｏ－メチルプソイドウリジン、β，Ｄ－ガラクトシルキューオシン、２’－Ｏ－メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、１－メチルアデノシン、１－メチルプソイドウリジン、１－メチルグアノシン、１－メチルイノシン、２，２－ジメチルグアノシン、２－メチルアデノシン、２－メチルグアノシン、３－メチルシチジン、５－メチルシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、７－メチルグアノシン、５－メチルアミノメチルウリジン、５－メトキシアミノメチル－２－チオウリジン、β，Ｄ－マンノシルキューオシン、５－メトキシカルボニルメチル－２－チオウリジン、５－メトキシカルボニルメチルウリジン、５－メトキシウリジン、２－メチルチオ－Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシル－２－メチルチオプリン－６－イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）Ｎ－メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン－５－オキシ酢酸－メチルエステル、ウリジン－５－オキシ酢酸、ワイブトキソシン、キューオシン、２－チオシチジン、５－メチル－２－チオウリジン、２－チオウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、Ｎ－（（９－β－Ｄ－リボフラノシルプリン－６－イル）－カルバモイル）スレオニン、２’－Ｏ－メチル－５－メチルウリジン、２’－Ｏ－メチルウリジン、ワイブトシン、「３－（３－アミノ－３－カルボキシ－プロピル）ウリジン、（ａｃｐ３）ｕ、２’－Ｏ－メチル（Ｍ）、３’－ホスホロチオエート（ＭＳ）、３’－チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン又は１－メチルプソイドウリジンが挙げられる。それぞれの実現可能性は本発明の個別の態様である。

【0142】

ＲＮＡ誘導型ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼによりＬＤＬＲアレルを標的とすることに加えて、標的細胞内のＬＤＬＲ発現を阻害する他の手段として、ギャップマー、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、カスタマイズされたＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼの使用、低分子阻害剤、及び標的細胞における遺伝子の発現を低減する又は取り除くための当技術分野において知られている他の方法が挙げられるが、それらに限定されない。例えば、米国特許第6,506,559号；同第7,560, 438号；同第8,420,391号；同第8,552,171号；同第7,056,704号；同第7,078,196号；同第8,362,231号；同第8,372,968号；同第9,045,754号及び国際公開第2004/067736号；同第2006/097853号；同第2003/087341号；同第2000/041566l号；同第2003/080809号；同第2010/079430号；同第2010/079430号；同第2011/072246号；同第2018/057989号；同第2017/164230号を参照、これらの内容全体は、参照により本明細書に組み入れられる。

【0143】

有利には、この明細書で提示したガイドＲＮＡ分子は、細胞におけるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと複合体化されたとき、他のガイドＲＮＡ分子と比べて改善された効率をもたらす。これらの特別にデザインされた配列は、他のヌクレオチド標的化に基づいた遺伝子編集又は遺伝子サイレンシング方法、例えば、ｓｉＲＮＡ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ又はジンクフィンガーヌクレアーゼのために、ＬＤＬＲ標的部位を特定することにも有用である可能性がある。

【0144】

細胞への送達
この明細書に記載した組成物のいずれか１つは、任意の適切な手段により標的細胞に送達してもよい。本発明のＲＮＡ分子組成物は、ＬＤＬＲアレルを含有し及び／又は発現する細胞（例．哺乳動物肝臓細胞、肝実質細胞、幹細胞）を標的としてもよい。例えば、ある態様では、ＲＮＡ分子は標的細胞におけるＬＤＬＲアレルを特異的に標的とし、標的細胞は、肝臓細胞、肝実質細胞又は幹細胞である。細胞への送達は、in vivo、ex vivo又はin vitroで実施してもよい。送達は、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はナノ粒子にパッケージングされた組成物の、対象の肝臓又は対象の肝臓細胞へのin vivo送達であってもよい。送達は、対象の細胞（例．対象から単離された肝臓細胞、肝実質細胞又は幹細胞）に対するex vivoであってもよい。さらに、この明細書に記載した核酸組成物は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、核酸ベクター、又はそれらの組合せのうちの１つ以上として細胞に送達してもよい。

【0145】

いくつかの態様では、この明細書に記載した組成物のin vivo送達方法には、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）又はナノ粒子による送達が挙げられる。いくつかの態様では、この明細書に記載した組成物のin vivo送達方法には、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、裸のＲＮＡ、又はナノ粒子、例えば、脂質ナノ粒子による送達が挙げられる。組成物は、ＲＮＡ組成物の形をとってもよい。組成物は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）組成物の形をとってもよい。したがって、送達は、対象、例えば、高コレステロール血症を患っている対象内の肝臓細胞へin vivoで行われる。

【0146】

いくつかの態様では、この明細書に記載した組成物のいずれか１つが、ex vivoで細胞に送達される。いくつかの態様では、細胞は幹細胞である。いくつかの態様では、細胞は肝臓細胞である。いくつかの態様では、細胞は肝実質細胞である。いくつかの態様では、細胞はｉＰＳ由来肝実質細胞である。組成物を公知のex vivo送達により細胞へ送達してもよく、その方法には、電気穿孔、ウイルス形質導入、ナノ粒子送達、リポソームなどが挙げられるが、それらに限定されるものではない。組成物は、ＲＮＰ組成物の形態であってもよい。送達方法の詳細は、このセクション全体に記載されている。

【0147】

いくつかの態様では、場合によっては、肝葉又は肝実質細胞が、例えば生検を行うことで、対象から得られる。得られた細胞は、この明細書に記載した組成物のex vivo送達により遺伝子改変してもよい。改変された細胞を、葉移植又は肝実質細胞移植により対象へ再導入してもよい。

【0148】

いくつかの態様では、ＲＮＡ分子は化学修飾を含む。適切な化学修飾の限定するものではない例には、2’-O-メチル（Ｍ）、2’-O-メチル-3’-ホスホロチオエート（ＭＳ）、又は2’-O-メチル-3’-チオＰＡＣＥ（ＭＳＰ）、プソイドウリジン及び1-メチルプソイドウリジンが挙げられる。それぞれの実現可能性は本発明の個別の態様である。

【0149】

適切なウイルスベクター系を用いて、核酸組成物、例えば、本発明のＲＮＡ分子の組成物を送達してもよい。核酸を導入し、組織を標的とするために、通常のウイルス及び非ウイルスに基づく遺伝子移入を行うことができる。ある特定の態様では、in vivo又はex vivo遺伝子治療のために核酸が投与される。非ウイルスベクター送達系には、裸の核酸、及び送達媒体（例．リポソーム又はポロキサマー）と複合体化した核酸が挙げられる。遺伝子治療の手順の総説は、Anderson (1992)；Nabel & Felgner (1993)；Mitani & Caskey (1993)；Dillon (1993)；Miller (1992)；Van Brunt (1988)；Vigne (1995)；Kremer & Perricaudet (1995)；Haddada et al. (1995)及びYu et al. (1994)を参照。

【0150】

核酸及び／若しくはタンパク質の非ウイルス性送達の方法には、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、微粒子銃、パーティクルガン加速、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、ポリカチオン若しくは脂質：核酸コンジュゲート、人工ビリオン、及び促進剤による核酸の取込みが挙げられ、又は、核酸及び／若しくはタンパク質は、細菌若しくはウイルス（例．アグロバクテリウム属（Agrobacterium）、リゾビウム種（Rhizobium sp.）ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、タバコモザイクウイルス（tobacco mosaic virus）、ジャガイモウイルスＸ（potato virus X）、カリフラワーモザイクウイルス（cauliflower mosaic virus）、及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス（cassava vein mosaic virus））により植物細胞へ送達できる（例えば、Chung et al., 2006を参照）。例えばSonitron 2000系（Rich-Mar）を用いるソノポレーションも、核酸の送達に用いることができる。タンパク質及び／又は核酸のカチオン性脂質媒介性送達も、in vivo、ex vivo又はin vitro送達として企図される。（Zuris et al. (2015)を参照；Coelho et al. (2013)；Judge et al. (2006)及びBasha et al. (2011)も参照）。

【0151】

トランスポゾンに基づく系（例．組換えスリーピングビューティトランスポゾン系又は組換えPiggyBacトランスポゾン系）のような非ウイルスベクターを、標的細胞に送達してもよく、標的細胞において、組成物の分子のポリヌクレオチド配列又は組成物の分子をコードするポリヌクレオチド配列の転位に利用してもよい。

【0152】

他の代表的な核酸送達系には、Amaxa Biosystems（Cologne, Germany）、Maxcyte, Inc.（Rockville, Md.）、BTX Molecular Delivery Systems（Holliston, Mass.）及びCopernicus Therapeutics Inc.が提供するもの（例えば米国特許第6,008,336号参照）が含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許第5,049,386号、米国特許第4,946,787号及び米国特許第4,897,355号で説明されており、リポフェクション試薬は市販されている（例．Transfectam（登録商標）、Lipofectin（登録商標）及びLipofectamine（登録商標）RNAiMAX）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質及び中性脂質には、国際公開第91/17424号及び国際公開第91/16024号に開示されているものが含まれる。細胞（ex vivo投与）又は標的組織（in vivo投与）への送達が可能である。

【0153】

免疫脂質複合体といった標的化リポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者によく知られている（例えば、Crystal, Science (1995)；Blaese et al., (1995)；Behr et al., (1994)；Remy et al. (1994)；Gao and Huang (1995)；Ahmad and Allen (1992)；米国特許第4,186,183号；同第4,217,344号；同第4,235,871号；同第4,261,975号；同第4,485,054号；同第4,501,728号；同第4,774,085号；同第4,837,028号及び同第4,946,787号を参照）。

【0154】

送達の別の方法には、送達する核酸をEnGeneIC送達媒体（ＥＤＶ）へパッケージングすることが含まれる。ＥＤＶは、抗体の一方のアームが標的組織に対する特異性を有し、他方がＥＤＶに対する特異性を有する二重特異性抗体を用いて、標的組織へ特異的に送達する。抗体は、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、ＥＤＶがエンドサイトーシスによって細胞内に運ばれる。細胞内に入った後に、内容物が放出される。（MacDiarmid et al., 2009参照）。

【0155】

ウイルスによる核酸の送達のためのＲＮＡ又はＤＮＡウイルス系の使用は、ウイルスの標的を体内の特定の細胞とし、ウイルスペイロードを核へ輸送する高度に進化した方法を活用する。ウイルスベクターは、患者へ直接投与でき（in vivo）、又は、in vitroで細胞を処理するために使用でき、改変された細胞を患者へ投与する（ex vivo）。核酸を送達する従来のウイルス系には、遺伝子移入のための、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニアウイルス及び単純ヘルペスウイルスのベクターが挙げられるが、それらに限定されるものではない。

【0156】

レトロウイルスのトロピズムは、外来エンベロープタンパク質を組み入れることにより変化させることができ、標的細胞の潜在的な標的集団を拡大する。レンチウイルスベクターは、分裂していない細胞に形質導入又は感染できるレトロウイルスベクターであり、通常、ウイルス力価が高い。レトロウイルスの遺伝子移入系の選択は標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、シス作用性末端反復配列で構成され、最大６～１０ｋｂの外来配列をパッケージングする能力がある。最小限のシス作用性ＬＴＲは、ベクターの複製及びパッケージングに十分であり、治療用遺伝子を標的細胞へ組み込み、導入遺伝子を永続的に発現させるために用いられる。広く用いられるレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）及びそれらの組合せに基づくものが挙げられる。（例えば、Buchschacher et al. (1992)；Johann et al. (1992)；Sommerfelt et al. (1990)；Wilson et al. (1989)；Miller et al. (1991)；国際公開第94/26877号を参照）。

【0157】

臨床試験における遺伝子移入のために、現在、少なくとも６つのウイルスベクターが利用でき、それらは、ヘルパー細胞株へ挿入された遺伝子による欠損ベクターの相補性を含むアプローチを利用して、形質導入剤を生成する。

【0158】

ｐＬＡＳＮ及びＭＦＧ－Ｓは、臨床試験で使用されたことがあるレトロウイルスベクターの例である（Dunbar et al., 1995；Kohn et al., 1995；Malech et al., 1997を参照）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子治療の治験で使用された初めての治療用ベクターであった（Blaese et al., 1995）。ＭＦＧ－Ｓパッケージングベクターの形質導入効率は、５０％以上であった（Ellem et al., (1997)；Dranoff et al., 1997）。

【0159】

パッケージング細胞は、宿主細胞に感染する能力があるウイルス粒子を形成するために用いられる。そのような細胞には、アデノウイルス、ＡＡＶをパッケージングする２９３細胞、及びレトロウイルスをパッケージングするＰｓｉ－２細胞又はＰＡ３１７細胞が挙げられる。遺伝子治療に用いられるウイルスベクターは、通常、核酸ベクターをウイルス粒子へパッケージングする産生細胞株により生成される。ベクターは、通常、パッケージング及び（該当する場合は）その後の宿主への組込みに必要とされる最小限のウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるタンパク質をコードする発現カセットで置換されている。欠損したウイルス機能は、パッケージング細胞株によりトランスで供給される。例えば、遺伝子治療に用いられるＡＡＶベクターは、通常、パッケージング及び宿主ゲノムへの組込みに必要とされるＡＡＶゲノム由来の末端逆位配列（ＩＴＲ）のみを有する。ウイルスＤＮＡは、細胞株においてパッケージングされ、その細胞株は、他のＡＡＶ遺伝子、つまり、ＩＴＲ配列を欠くが、ｒｅｐ及びｃａｐをコードするヘルパープラスミドを含有する。その細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染する。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製及びヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ＩＴＲ配列の欠損のため、ヘルパープラスミドは大量にはパッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがＡＡＶより感受性が高い熱処理によって軽減できる。さらに、バキュロウイルス系を用いて臨床スケールでＡＡＶを産生できる（米国特許第7,479,554号参照）。

【0160】

多くの遺伝子治療において、遺伝子治療ベクターは、特定の組織に対して高度の特異性で送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面のウイルス被覆タンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることによって、所定の細胞に対する特異性を有するように改変できる。そのリガンドは、目的の細胞に存在することが知られた受容体に対して親和性を有するように選択される。例えば、Hanら(1995)は、モロニーマウス白血病ウイルスが、ｇｐ７０と融合したヒトヘレグリンを発現するように改変でき、その組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現する特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、他のウイルス－標的細胞の組合せに拡張でき、その組合せでは、標的細胞は受容体を発現し、ウイルスは細胞表面受容体に対するリガンドを含む融合タンパク質を発現する。例えば、繊維状ファージは、事実上、選択されたいかなる細胞受容体に対しても特異的な結合親和性を有する抗体断片（例．ＦＡＢ又はＦｖ）を提示するように操作できる。この説明は、主にウイルスベクターに当てはまるが、同じ原理が非ウイルスベクターに適用できる。そのようなベクターは、特定の標的細胞による取込みを優先する特定の取込み配列を含むように操作できる。

【0161】

遺伝子治療ベクターは、個々の患者への投与により、例えば、全身投与（例．硝子体内、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下又は頭蓋内注入）又は局所適用により、in vivoで送達できる。

【0162】

あるいは、ベクターは、細胞、例えば、個々の患者から外植された細胞（例．リンパ球、骨髄穿刺、組織生検）又はユニバーサルドナー造血幹細胞へ、ex vivoで送達され、続いて、その細胞を患者へ、ベクターを組み入れている細胞の選択後に、再移植できる。限定するものではない代表的なex vivoアプローチは、培養のために患者から組織（例．末梢血、骨髄及び脾臓）を取り出し、培養細胞（例．造血幹細胞）に核酸を移入し、次いで、細胞を、患者の標的組織（例．骨髄及び脾臓）に移植することを含んでいてもよい。いくつかの態様では、幹細胞又は造血幹細胞は、生存率増強剤で更に処理してもよい。

【0163】

診断、研究のための、又は（例えばトランスフェクト細胞の宿主への再注入による）遺伝子治療のためのex vivoでの細胞トランスフェクションは、当業者によく知られている。好ましい態様において、対象から細胞が単離され、核酸組成物がトランスフェクトされ、対象（例．患者）へ再注入される。ex vivoトランスフェクションに適したさまざまな細胞型は、当業者によく知られている（例えば、Freshney, “Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Technique and Specialized Applications (6th edition, 2010)と、この文献の、患者から細胞を単離し、培養する方法の考察で引用されている文献を参照）。

【0164】

治療用核酸組成物を有するベクター（例．レトロウイルス、リポソーム）は、in vivoで細胞に形質導入するために、生物体へ直接投与することもできる。投与は、注射、注入、局所適用（例．点眼剤及びクリーム）及び電気穿孔を含むが、それらには限定されない、分子を血液又は組織細胞と最終的に接触するように導入するために通常使用される経路のいずれかによる。そのような核酸を投与する適切な方法が利用でき、当業者によく知られており、特定の組成物を投与する複数の経路が使用できるが、特定の経路が、別の経路より迅速かつ効果的な反応を提供できる場合が多い。いくつかの態様によれば、組成物はＩＶ注射で送達される。

【0165】

導入遺伝子の免疫細胞（例．Ｔ細胞）への導入に適したベクターには、非組込み型レンチウイルスベクターが挙げられる。例えば、米国特許出願公開第2009/0117617号を参照。

【0166】

薬学的に許容される担体は、部分的には、投与する組成物によって、加えて、組成物の投与に用いる方法によって、決まる。したがって、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1989の記載されているように、利用できる医薬組成物の幅広い種類の適切な製剤がある。

【0167】

ＬＤＬＲ遺伝子のアレルを特異的に標的とするＲＮＡガイド配列の例
ＬＤＬＲ遺伝子を標的とするように多数のガイド配列をデザインできるが、配列番号１～１０７３６で特定され、表１に記載したヌクレオチド配列を、この明細書で示した方法を効果的に実行するために、具体的に選択した。

【0168】

表１は、これまでに説明した態様での使用において、ＬＤＬＲアレルと会合するようにデザインされたガイド配列を示す。操作された各ガイド分子は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）（例．配列ＮＧＧ又はＮＡＧ（「Ｎ」は任意の核酸塩基である）に対応するＰＡＭ）の隣に位置する目的の標的ゲノムＤＮＡ配列と結合するように更にデザインされる。ガイド配列は、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと共に働くようにデザインされ、そのＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼには、例えば、ＳｐＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＧＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．１（ＰＡＭ配列：ＮＧＡＮ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＱＲ．２（ＰＡＭ配列：ＮＧＮＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＥＱＲ（ＰＡＭ配列：ＮＧＡＧ）、ＳｐＣａｓ９．ＶＲＥＲ（ＰＡＭ配列：ＮＧＣＧ）、ＳａＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＮＧＲＲＴ）、ＳｐＲＹ（ＰＡＭ配列：ＮＲＮ又はＮＹＮ）、ＮｍＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＮＮＮＧＡＴＴ）、Ｃｐｆ１（ＰＡＭ配列：ＴＴＴＶ）、又はＪｅＣａｓ９ＷＴ（ＰＡＭ配列：ＮＮＮＶＲＹＭ）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。本発明のＲＮＡ分子はそれぞれ、１つ以上の異なるＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼと共に複合体を形成するようにデザインされ、かつ使用するＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、それぞれの１つ以上の異なるＰＡＭ配列を利用して、目的のポリヌクレオチド配列を標的とするようにデザインされる。

【0169】

【表1】

【0170】

本発明のより完全な理解を促進するために、実施例を以下に示す。以下の実施例は、本発明を構築しかつ実施する代表的な様式を示す。しかしながら、本発明の範囲は、これらの実施例に開示した特定の態様に限定されず、これらの態様は例証のみを目的とする。

【実施例】

【0171】

実験の詳細
実施例１ＬＤＬＲ改変の全体的な分析
配列番号１～１０７３６のいずれか１つに示す配列の連続する１７～５０ヌクレオチドを含むガイド配列について、オンターゲット活性が高いものを、ヒト細胞においてＳｐＣａｓ９を用いてスクリーニングする。オンターゲット活性は、ＤＮＡキャピラリー電気泳動分析で測定する。

【0172】

実施例２ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ改変の概念実証
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）はＬＤＬ－Ｃの生涯にわたる上昇を特徴とし、８５～９０％の症例は、ＬＤＬＲ遺伝子の病原性変異によって引き起こされる（L. Jiang et al, 2015；A.K. Soutar and R.P. Naoumova, 2007）。

【0173】

この実施例のデータは、ＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲ領域の欠失（図１Ａ）が、ＬＤＬＲ遺伝子産物の発現をＲＮＡ及びタンパク質の両者で増加させたこと、及びin vitroでコレステロールの取込みを増加させること（図１Ｂ、図１Ｃ及び図１Ｄ）を示す。野生型ＨｅｐＧ２細胞及び３’ＵＴＲを切除したＨｅｐＧ２細胞における、蛍光標識したＬＤＬ－コレステロールの細胞取込みの動態を、フローサイトメトリーを使用して測定した。試験を行った全ての時点で、３’ＵＴＲ切除後にコレステロールの取込みが２倍に増加した（図１Ｅ）。図１Ｆ～１Ｈ、図７Ａ～７Ｃ、図８Ａ～８Ｄ及び図９Ａ～９Ｄも参照。

【0174】

ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除ストラテジーのex vivoにおける概念実証を、ＦＨ患者に由来するＬＣＬ細胞（これは、ＥＢＶで形質転換したリンパ芽球様Ｂ細胞株である）で確立した。この細胞は、疾患モデルとして使用する際に、いくつかの利点、例えば、誘導の容易さ、成長しやすさ及びゲノム安定性を有している。この細胞のＬＤＬＲの存在量及び機能も知られている（P.C. Chan et al. 1997）。

【0175】

ＦＨヘテロ接合性を示す２つの細胞株の特徴を明らかにした。第１の細胞株であるＧＭ１４４８は△Ｇ１９７変異を有し、ClinVarMinerによれば、これはリトアニアのアシュケナージユダヤ系集団における創始者変異であることが知られており、ＦＨに罹患している７１のアシュケナージユダヤ系家系の３５％で観察されている。機能性研究は、このバリアントがゴルジ体への不完全なタンパク質輸送を引き起こし、変異体タンパク質は、ホモ接合の個体の細胞でＬＤＬＲ活性が２％未満であることを示している。第２の細胞株であるＧＭ１４６０は、２０００Ｇ＞Ａ置換に起因するＣ６４６Ｙのミスセンス変異を有する。ClinVarMinerによれば、この変異はＬＤＬＲのプロセッシングを低下させ、ホモ接合の個体では成熟型へプロセッシングされた受容体はおよそ２０％である（図２Ａ～２Ｄ）。

【0176】

ＦＨ患者のＬＣＬ細胞でのＳｐＣａｓ９及び特定のガイドＲＮＡ分子によるＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除は、処理を行っていない細胞と比較して、ＬＤＬＲｍＲＮＡ、ＬＤＬＲ表面タンパク質、及びコレステロール取込みを上方制御した（図３Ａ～３Ｄ）。

【0177】

in vivoにおける概念実証としての動物モデルを選択するために、マウスＨｅｐａ１－６肝実質細胞における３’ＵＴＲ切除ストラテジーを検証した。マウス編集組成物を使用したマウスＬＤＬＲ遺伝子の３’ＵＴＲの切除は、表面ＬＤＬＲの上方制御及びコレステロール取込みの増加をもたらした（図４Ａ～４Ｃ）。

【0178】

別のＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼを用いる編集組成物も、ＬＤＬＲの編集における使用について検証した。ＬＤＬＲの３’ＵＴＲを変更するガイドＲＮＡ分子を、ＨｅＬａ細胞でＤＮＡトランスフェクション方法を使用して、（１）国際公開第2020/223513号（その内容は参照によりこの明細書に組み入れられる）に記載のＯＭＮＩ－５０ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、（２）国際公開第2021/248016号（その内容は参照によりこの明細書に組み入れられる）に記載のＯＭＮＩ－７９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、（３）ＯＭＮＩ－７９Ｖ５５７０と呼ばれるＯＭＮＩ－７９ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼの活性増強バリアント、及び（４）ＯＭＮＩ－１０３ＣＲＩＳＰＲヌクレアーゼ、を用いてスクリーニングした（図５Ａ～５Ｃ）。ＯＭＮＩ－７９Ｖ５５７０は、試験を行ったｓｇＲＮＡの大部分で、編集のレベルが改善することが判明した。試験を行った全てのヌクレアーゼにおいて、いくつかの高度に活性なガイドが特定された。

【0179】

【表2】

【0180】

【表3-1】

【0181】

【表3-2】

【0182】

【表3-3】

【0183】

実施例３結果の要約
ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集は、家族性高コレステロール血症においてＬＤＬＲの発現を増強し、ＬＤＬ－Ｃの取込みを促進する
家族性高コレステロール血症（ＦＨ）は、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ－Ｃ）の生涯にわたる上昇を特徴とする、広く見られる常染色体優性遺伝疾患で、アテローム性動脈硬化及び冠血管イベントが早期に発症する。遺伝学的に確認されたＦＨの約８５％～９０％が、ＬＤＬＲ遺伝子の病原性変異によって引き起こされ、そのハプロ不全はＬＤＬ－Ｃの取込みを低下させる。スタチン類やエゼチミブといった脂質低下薬を生涯使用できるが、患者は耐えられず、所望のＬＤＬ－Ｃレベルを得ることができないことが多い。最近の治療アプローチは、ＬＤＬＲのリソソーム分解を促進するタンパク質であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（ＰＣＳＫ９）を一過性で阻害する、皮下注入されたモノクローナル抗体に基づく。塩基編集によるＰＣＳＫ９の恒久的な阻害が現在開発中であるが、ＦＨの原因ではない遺伝子のこのような非可逆的ノックダウンの長期間の結果は、未だ判明していない。加えて、そのようなアプローチは単剤療法としては不十分であることが多く、スタチン療法との組合せで行われる。

【0184】

この開示は、ＬＤＬＲの発現を負に制御する部位を有するＬＤＬＲ３’ＵＴＲの少なくとも一部分の切除により、ＬＤＬＲの発現を上方制御する、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集ストラテジーを提示する。

【0185】

この編集ストラテジーを、ＨｅｐＧ２細胞株、ＦＨ患者に由来するリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）及びマウス肝細胞癌細胞株（Ｈｅｐａ１－６）で試験した。ＬＤＬＲ３’ＵＴＲの切除をｄｄＰＣＲで確認し、ＬＤＬＲｍＲＮＡレベルをｑＲＴ－ＰＣＲで定量した。特異的抗体を使用して、総ＬＤＬＲレベル及び膜結合ＬＤＬＲレベルを、それぞれ、ウエスタンブロット及びフローサイトメトリーで測定した。最後に、蛍光標識したＬＤＬ－Ｃの細胞取込みをフローサイトメトリーで測定することにより、コレステロール取込みに対するＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除の効果を評価した。

【0186】

ＨｅｐＧ２細胞での切除効率は約６０％であった。切除された細胞は、処理を行っていない細胞と比較して、ＬＤＬＲｍＲＮＡレベルの３～６倍の上方制御と、膜結合ＬＤＬＲの３倍の増加が示された。ＬＤＬＲ３’ＵＴＲ切除は、試験を行った全ての時点で、コレステロールの取込みが２倍に増加した。患者に由来するＬＣＬも類似の結果を示し、ＬＤＬ－Ｃ取込みの増加は３～４倍であった。マウス肝臓細胞株でも、ＬＤＬＲｍＲＮＡレベル及び膜タンパク質発現の増加と、それに続くＬＤＬ－Ｃ取込みの増強が観察され、in vivoのモデルマウスにおける編集ストラテジーの今後の評価を更に支持した。比較分析により、本ストラテジーは、コレステロール取込みの増加において、ＰＣＳＫ９ノックアウト及びスタチン類よりも優れていることが示された。

【0187】

これらの知見は、ＬＤＬＲｍＲＮＡの迅速なターンオーバーに関与する領域を短縮化して、ＬＤＬＲの発現を増強し、ＬＤＬ－Ｃの取込みを促進させるという、ＣＲＩＳＰＲベースの遺伝子編集ストラテジーを支持する。この独自のアプローチは、高コレステロール血症に関連するさまざまな障害に役に立つ可能性がある。

【0188】

参考文献
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【図1A】