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特表2024-510826様々なシヌクレイン病の治療のためのモノマーα－シヌクレインのＤ－エナンチオマーペプチドリガンドの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-11
(54)【発明の名称】様々なシヌクレイン病の治療のためのモノマーα－シヌクレインのＤ－エナンチオマーペプチドリガンドの使用
(51)【国際特許分類】
C07K 14/435 20060101AFI20240304BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240304BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240304BHJP
A61P 25/16 20060101ALI20240304BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240304BHJP
A61K 38/10 20060101ALI20240304BHJP
【ＦＩ】
C07K14/435
C07K7/08 ZNA
A61P43/00
A61P25/16
A61P25/00
A61K38/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558629
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2023-11-17
(86)【国際出願番号】 EP2022057456
(87)【国際公開番号】W WO2022200327
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】102021107061.9
(32)【優先日】2021-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】DE
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523361585
【氏名又は名称】プリアヴォイド ゲーエムベーハー
(74)【代理人】
【識別番号】100120891
【弁理士】
【氏名又は名称】林 一好
(74)【代理人】
【識別番号】100165157
【弁理士】
【氏名又は名称】芝 哲央
(74)【代理人】
【識別番号】100205659
【弁理士】
【氏名又は名称】齋藤 拓也
(74)【代理人】
【識別番号】100126000
【弁理士】
【氏名又は名称】岩池 満
(74)【代理人】
【識別番号】100185269
【弁理士】
【氏名又は名称】小菅 一弘
(72)【発明者】
【氏名】ヴィルボルド ディーター
(72)【発明者】
【氏名】モールルーダー ジャニーヌ
(72)【発明者】
【氏名】セヴェニッヒ マルク
(72)【発明者】
【氏名】アルテンドルフ ティム
(72)【発明者】
【氏名】サントゥール カロリーネ ビアンカ
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA02
4C084BA08
4C084BA18
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZC51
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA01
4H045BA17
4H045CA40
4H045EA21
4H045FA72
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA05
4H045GA15
4H045GA22
(57)【要約】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、及びシヌクレイン病の治療に使用するためのそのようなペプチドに関する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７、並びにそれらの相同体、断片及び一部分からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項2】
前記ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６若しくは配列番号７、又はそれらと少なくとも８０％の同一性を有する相同体からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
遊離Ｃ末端において、カルボキシル基の代わりに、酸アミド基（ＣＯＮＨ２基）若しくはＣＯＨ基、ＣＯＣｌ基、ＣＯＢｒ基、ＣＯＮＨ－アルキル基若しくはＣＯＮＨ－アルキルアミン基が存在するか、又は前記ペプチドは環化形態にあることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載のペプチド。
【請求項4】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６若しくは配列番号７を有する配列の２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又はこれより多いコピーを含有することを特徴とする請求項１から請求項３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項5】
前記ペプチドは実質的にＤ－アミノ酸からなることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項6】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする請求項１から請求項５のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項7】
別の物質に連結されていることを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項8】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の複数のペプチドが、互いに共有結合又は非共有結合により連結されていることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項9】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の複数のペプチドが、リンカーなしで互いに連結されている、すなわち、互いに直接連結されているか、又はリンカー基を使用して互いに連結されていることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項10】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の複数のペプチドが、線状又は分岐様式で互いに連結されていることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項11】
前記ペプチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のペプチドがプラットフォーム分子を使用して連結されているデンドリマーであることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項12】
５０μＭ未満のＫＤでα－シヌクレインペプチドに結合することを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項13】
α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／又はα－シヌクレインペプチド凝集体の形成を防止するための請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項14】
α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／又はα－シヌクレインペプチド凝集体の解毒のための請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載のペプチド。
【請求項15】
シヌクレイン病の治療に使用するための請求項１から請求項１４のいずれか１項に記載のペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７、それらの相同体、断片及び一部分からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド、並びにシヌクレイン病の治療に使用するためのそのようなペプチドに関する。
【背景技術】
【0002】
シヌクレイン病は、特定の細胞におけるタンパク質α－シヌクレインのミスフォールディング及び凝集に関連する、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）等の神経変性疾患の異種群を包含する。
【0003】
ＰＤ患者の罹患したニューロンにおいて見出される不溶性封入体は、α－シヌクレインのアミロイド形態を含有し、これは、アミロイド形成と疾患病態との間の因果関係を示唆する。様々なシヌクレイン病におけるα－シヌクレイン凝集体は、プリオンの様式で増殖して細胞から細胞に転移するα－シヌクレインの異なる立体構造状態に対応すると推定される。
【0004】
Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ａｎｄ Ｓｔｒｏｋｅ（米国国立神経疾患・脳卒中研究所）（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｉｎｄｓ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）からのデータによれば、ＰＤ、ＤＬＢ及びＭＳＡを治癒又は効果的に停止することができる物質は現在存在しない。それにもかかわらず、それぞれの症状を治療するために使用できる多くの活性成分が存在する。
【0005】
要約すると、因果関係に基づき大幅に寿命を延ばす療法は、現在、すべてではないにしてもほとんどのシヌクレイン病に対して利用可能ではなく、緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
それゆえ、本発明の目的は、既に存在している毒性α－シヌクレイン凝集体を天然の機能性α－シヌクレインモノマーに分解することができ、これにより様々なシヌクレイン病において治療的使用が可能になる新規化学物質を開発することであった。
【0007】
治療において使用されることになる化学物質又はその変異体は、可能な限り高い親和性及び特異性で天然の内因性α－シヌクレインタンパク質に結合し、これによりそれを安定化させることが意図される。結果として、誤って折り畳まれたα－シヌクレイン立体構造と天然に折り畳まれたα－シヌクレイン立体構造との間のバランスは、後者に有利にシフトする。従って、理想的な場合、すでに存在するα－シヌクレインオリゴマー及び原線維は、それらのモノマー成分に分解され、これにより排除されることが可能である。
【課題を解決するための手段】
【0008】
この目的は、請求項１に記載のペプチド、特に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７、並びにそれらの相同体、断片及び一部分からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドによって達成される。
【0009】
さらなる好ましい実施形態は、従属請求項において規定される。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】組換え完全長Ｌ－エナンチオマーα－ｓｙｎ及びＤ－エナンチオマー１６量体ペプチドを用いたチオフラビン－Ｔアッセイ。
【図2】ＳＶＤ－１及びα－ｓｙｎのＭＳＴ測定。
【図3】野生型α－シヌクレイン及びＳＶＤ－１の多サイクルＳＰＲ実験。
【図4】ＳＶＤ－１によるα－ｓｙｎオリゴマーの排除。
【図5】ＴｈＴアッセイにおけるα－ｓｙｎ凝集の準化学量論的阻害。
【図6】ＳＶＤ－１の存在下及び不存在下でのα－ｓｙｎ凝集試料の勾配遠心分離。
【図7】組換え完全長Ｌ－エナンチオマーα－ｓｙｎ及びＤ－エナンチオマーＳＶＤ－１ａを用いたチオフラビン－Ｔアッセイ。
【図8】野生型α－ｓｙｎ及びＳＶＤ－１ａ、ＳＶＤ－６ａ又はＳＶＤ－１０ａの単サイクルＳＰＲ実験。
【図9】ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄを用いたデノボＴｈＴアッセイ及び播種ＴｈＴアッセイ。
【図10】ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを用いたα－ｓｙｎのＭＳＴ測定。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中２５℃でのＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａと完全長α－ｓｙｎとの相互作用のＭＳＴ測定。
【図11】α－ｓｙｎ並びに固定化ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを用いた動態学的単サイクルアッセイ。
【図12】ＳＶＤ－１ａ（同位体標識されていない）との相互作用における１５Ｎ標識α－ｓｙｎのＮＭＲ分析。
【図13】漸増濃度のＳＶＤ－１ａとのインキュベーション後のモノマーα－ｓｙｎのサイズ排除クロマトグラフィー。
【図14】ＳＶＤ－１ａ及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＋５ｒとのモノマーα－ｓｙｎのチオフラビン－Ｔデノボ凝集。
【図15】ＴｈＴ、ＤＧＣ、ＣＤ及びＡＦＭを用いた、ＳＶＤ－１ａの存在下及び不存在下でのα－ｓｙｎのデノボ凝集分析。
【図16】ＳＶＤ－１ａ及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＋５ｒをシードとして用いたＴｈＴアッセイ。
【図17】ＳＶＤ－１ａは、ＰＦＦオリゴマーをα－ｓｙｎモノマーに分解する。
【図18】ＴｈＴアッセイ及びＣＤ分光法によるＳＶＤ－１ａの存在下及び不存在下での凝集アッセイの分析。
【図19】ＳＶＤ－１ａは、細胞における播種されたα－ｓｙｎの凝集を阻害する。
【図20】ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａは、ＰＦＦオリゴマーシードを用いたＭＴＴアッセイにおいて細胞生存率を増加させる。
【発明を実施するための形態】
【0011】
以下、「ｃｏｍｐｒｉｓｅ（含む）「は、「ｃｏｎｓｉｓｔ ｏｆ（からなる）」をも包含するものとする。
【0012】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７のペプチドは、最適化された鏡像ファージディスプレイ選択を用いて見出された。
【0013】
鏡像ファージディスプレイの方法は、本明細書に記載される特定のモノマーバインダの選択とともに、特定のオリゴマーバインダを見出すために、又はタンパク質ミスフォールディング疾患において形成する他の種に対するリガンドを見出すためにさえも、使用することができるということに留意されたい。
【0014】
鏡像ファージディスプレイでは、例えば、Ｍ１３ファージのｇｐ３タンパク質上に提示され、そのゲノム中にコードされるランダム化ペプチド配列の組換えライブラリが、天然に存在するＬ－エナンチオマー標的分子（例えば、α－シヌクレイン）の正確な鏡像（Ｄ－エナンチオマー）に対して選択される。遺伝子産物３としても知られるｇｐ３分子は、宿主細胞との接触に必要とされるファージカプシド中のタンパク質である。
【0015】
ペプチド配列は、有利には、Ｍ１３ファージのｇｐ３タンパク質のＮ末端に提示され、そのゲノム中にコードされる。
【0016】
選択されたファージのｐ３遺伝子のＤＮＡ配列は、ｇｐ３分子上の対応するペプチド配列についての遺伝情報を含むＤＮＡ配列に連結され、その結果、これを配列決定することができる。配列決定後、ゲノム配列をアミノ酸配列に翻訳し、生理学的なＬ－エナンチオマー形態の標的分子（例えばα－シヌクレイン）に結合するＤ－エナンチオマーペプチドとして合成することができる。表面上に異なるペプチドをｇｐ３との融合タンパク質として提示するすべてのファージは、以下、ファージライブラリと呼ばれる。対応するペプチドは、実験において選択される生体分子を表す。
【0017】
「バイオパニング」ラウンド（選択ラウンド）と呼ばれるものを、例えば３ラウンド実行することができる。このプロセスにおいて、ファージライブラリは、ベイトとも呼ばれる固定された標的分子と接触させられ、結合ファージは、同様に存在する数１００万個の他の非結合ファージから単離される。
【0018】
例として、α－シヌクレインのオリゴマー種又は原線維（フィブリル）種に優先的に結合するファージの数は、これらのまさにその種をベイトとして提供しないことによって減少する。これにより、α－シヌクレインオリゴマー及び原線維に対する親和性が増加したファージをファージプールから除去することができ、これは、例えば、α－シヌクレインモノマー特異的ファージが蓄積することを意味する。この方法は、もちろん、α－シヌクレインオリゴマーに結合するリガンド及びペプチドを特異的に決定するために同様に適合させることができる。
【0019】
本発明によると、プラスチック、ＢＳＡ又はストレプトアビジンに対する親和性を有するファージの何らかの蓄積を低減するために、好ましくはすべてのバイオパニングラウンドにおいて、異なる基材表面がさらに使用される。この場合、基材表面は、使用されるビオチン化基材（ストレプトアビジンで誘導体化されたポリスチレン又はポリプロピレンの表面）及び使用されるブロッキング剤又はクエンチング剤の組み合わせとして定義される。連続する選択ラウンドにおいて、選択圧は徐々に増加する。この目的のために、標的分子（例えば、モノマーα－シヌクレイン）の濃度は安定したままであるが、ファージインキュベーション後の洗浄工程の数は、α－シヌクレインモノマーに対して親和性を有するファージを除去しないように、第２の選択ラウンドから始めて増加される。
【0020】
さらに、標的分子が基材上に固定された後に、表面をブロック（遮断）するための他の薬剤（例えば、ＢＳＡ、ミルク粉末、ブロッキングなし）を使用することによって、異なる基材表面がファージディスプレイのあらゆる選択ラウンドにおいて選択される。
【0021】
例として、ラウンド１におけるＢＳＡブロックポリスチレン表面と、ラウンド２におけるミルク粉末ブロックポリプロピレン表面と、ラウンド３におけるＢＳＡブロックポリスチレン表面との間の切り替えがあってもよい。
【0022】
異なる基材表面間の切り替えは、表面に対する標的分子又はベイトの特異性を増加させる。さらに、これは、プラスチック表面、ＢＳＡ又はベイト分子以外の基材表面の他の成分に非特異的に結合するリガンドの減少をもたらす。
【0023】
実際のファージディスプレイ選択と並行して、例えば、主選択と同一であるが、ここではベイトを使用しないという顕著な違いを有する対照選択が行われてもよい。対照選択から得られた配列のデータ分析により、ベイトの不存在下でさえ選択中に蓄積し、それゆえすべてのその後の工程に無関係であるペプチドを特定することが可能になる。
【0024】
それゆえ、当該方法は、以下の、
ａ）基材表面上に固定化ベイトを提供する工程と、
ｂ）ベイトとして作用する固定化分子を、選択すべき分子のライブラリを含有する溶液と接触させる工程と、
ｃ）上記分子に取り囲まれた固定化ベイトを洗浄溶液と接触させる工程と、
ｄ）上記分子により取り囲まれた固定化ベイトを洗浄溶液と接触させた後にベイトに依然として結合した分子を分離し増殖（Ｖｅｒｍｅｈｒｕｎｇ）させる工程と、
ｅ）異なる基材を各反復に使用して、上記工程を反復する工程と、
ｆ）反復後にベイト上に残っている分子の配列を特定する工程と
を特徴とする。
ａ）基材表面上に固定化ベイトを提供する工程と、
ｂ）ベイトとして作用する固定化分子を、選択すべき分子のライブラリを含有する溶液と接触させる工程と、
ｃ）上記分子に取り囲まれた固定化ベイトを洗浄溶液と接触させる工程と、
ｄ）上記分子により取り囲まれた固定化ベイトを洗浄溶液と接触させた後にベイトに依然として結合した分子を分離し増殖（Ｖｅｒｍｅｈｒｕｎｇ）させる工程と、
ｅ）異なる基材を各反復に使用して、上記工程を反復する工程と、
ｆ）反復後にベイト上に残っている分子の配列を特定する工程と
を特徴とする。
【0025】
例えば、基材の種類を変更することによって、及び／又は試薬によって基材をブロックするか若しくはブロックしないことによって、異なる基材が使用される。
【0026】
ベイトとして、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ及び化学化合物からなる群からの分子が使用される。ベイトとして、特にモノマーα－シヌクレインが使用される。
【0027】
ベイトが固定化される表面として、例えば、微量滴定プレート、磁性粒子、アガロースビーズ又はセファロース（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズからなる群からの材料（成分）が使用される。
【0028】
それゆえ、ポイントａ）に係るベイトは、選択されるべき生体分子が結合する化合物である。従来技術から公知である方法によれば、その化合物は第１の表面に固定される。非限定的な例として、ベイトとして、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ又はＤＮＡ分子、特にα－シヌクレインモノマーを挙げてもよい。可能な表面として、例えば、微量滴定プレート、磁性粒子、アガロースビーズ又はセファロースビーズが使用されてもよい。その後、固定化ベイトを有する表面をクエンチすることができ、基材の官能基は、このプロセスにおいて不活性化される。さらに、基材上に残っている疎水性自由表面は、適切な薬剤でブロックすることができる。
【0029】
第２の工程ｂ）では、固定化ベイトは、分子、とりわけ生体分子のランダム化ライブラリと接触させられる。これらの生体分子は、ベイトへの結合について競合する。ランダム化ライブラリは、混合物中の非常に多数、例えば１０１２種の異なる分子、又は１０４種若しくはわずか１００種の異なる分子の混合物である。このようなライブラリは、例えば、それぞれの場合において、特定のビヒクルに結合し、しかもベイトに結合することができるペプチド、タンパク質、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｍＲＮＡからなることができる。ビヒクルとしては、例えば、ファージ、ポリソーム又は細菌表面が挙げられる。ライブラリは、人工的な構成成分若しくは天然から単離された構成成分、又は両方の混合物からなることができる。本発明の文脈では、人工的とは、例えば、オリゴヌクレオチド合成から生成される化合物を意味する。
【0030】
工程ｃ）では、生体分子によって取り囲まれた固定化ベイトを洗浄物質と接触させることができる。この目的のために、工程ｃ）において洗浄工程が実施され、緩衝液が固定化ベイトと接触させられるか、又は固定化ベイトをすすぐために使用される。これは、生体分子のライブラリを有する溶液が、好ましくは、類似又は同一であってもよい溶液で繰り返し置換されることを意味する。これは、固定化ベイトから他のライブラリ分子よりも速く解離しないライブラリ分子を除去する。結合するライブラリ分子の解離反応の速度は、主に個々の分子の異なる解離定数（特にｋｏｆｆ値）によって決定される。従って、統計学的には、小さいｋｏｆｆ値を有する分子は、固定化ベイトに最も長く結合したままであり、それゆえ、洗浄緩衝液によって洗い流される可能性が統計学的に低い。洗浄緩衝液を含む液体は、好ましくは水性であり、ｐＨ緩衝液を含有してもよい。特異性洗浄工程のための溶液の任意選択の成分は、塩、界面活性剤又は還元剤であってもよい。
【0031】
工程ｃ）における特異性洗浄工程の後、工程ｄ）において、結合した生体分子がベイトから分離され、増殖させられる。分離又は溶出は、例えば、ｐＨの変更、加熱又は他の変化、特に塩濃度の上昇によって行われてもよい。分離又は溶出された生体分子は、その後、公知の方法を用いて増殖される。この目的のために、例えば、工程ａ）～ｃ）の後に得られて溶出され、その表面に生体分子を担持するファージ粒子が、細胞に導入され、増殖させられることが可能である。
【0032】
工程ｅ）では、工程ａ）の後にベイトに供給される溶液中の選択された生体分子の濃度が高められる。好ましくは、工程ａ）～ｅ）を含む３～６回の選択ラウンドが実施される。しかしながら、１～１０回又は１～２０回の反復を実施することもできる。好ましくは工程ｃ）で実施される競合物質濃度の増加も、サイクル数の増加とともに改善された選択をもたらす。好ましくは工程ｃ）で実施される洗浄工程の増加は、サイクル数の増加とともに選択の改善をもたらす。
【0033】
特に関連する鏡像ファージディスプレイは、工程ａ）におけるＮ末端ビオチン化Ｄ－エナンチオマーα－シヌクレインモノマー、工程ｂ）における組換えファージライブラリ、及び工程ｃ）における緩衝液を、ベイトとしてのα－シヌクレインモノマーとともに提供する。分離工程としての溶出は、例えば、分離工程としてｐＨを低下させることによって行われ、ファージ増幅は工程ｄ）における増殖として行われる。
【0034】
このようにして、α－シヌクレインモノマーに特異的に結合する７種のＤ－エナンチオマーペプチドが開発された。
【0035】
配列番号１：
ＳＶＤ－１（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｋｍｐｔｈｅｔｙｗｑｅｈｉｗｈａ
ＳＶＤ－１（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｋｍｐｔｈｅｔｙｗｑｅｈｉｗｈａ
【0036】
配列番号２：
ＳＶＤ－６（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｙｄｗｋｑｐｍｓａｓｒｆｌａｐｗ
ＳＶＤ－６（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｙｄｗｋｑｐｍｓａｓｒｆｌａｐｗ
【0037】
配列番号３：
ＳＶＤ－１０（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｓｓｈｗｑｑｗｎｐｐｙｗｎｔｄｓ
ＳＶＤ－１０（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｓｓｈｗｑｑｗｎｐｐｙｗｎｔｄｓ
【0038】
配列番号４：
ＳＶＤ－１４（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｙｄｗｋｑｐｍｓａｓｒｆｌａｐｗｒ
ＳＶＤ－１４（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｙｄｗｋｑｐｍｓａｓｒｆｌａｐｗｒ
【0039】
配列番号５：
ＳＶＤ－１ａ（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｒｌｐｔｈｅｔｙｗｑｅｈｉｗｈａｒｒｒｒｒ
ＳＶＤ－１ａ（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｒｌｐｔｈｅｔｙｗｑｅｈｉｗｈａｒｒｒｒｒ
【0040】
配列番号６：
ＳＶＤ－６ａ（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｙｄｗｒｑｐｌｓａｓｒｆｌａｐｗｒｒｒｒｒ
ＳＶＤ－６ａ（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｙｄｗｒｑｐｌｓａｓｒｆｌａｐｗｒｒｒｒｒ
【0041】
配列番号７：
ＳＶＤ－１０ａ（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｓｓｈｗｑｑｗｎｐｐｙｗｎｔｄｓｒｒｒｒｒ
ＳＶＤ－１０ａ（遊離Ｎ末端、アミド化Ｃ末端）：
ｓｓｈｗｑｑｗｎｐｐｙｗｎｔｄｓｒｒｒｒｒ
【0042】
ＳＶＤ－１、ＳＶＤ－６、ＳＶＤ－１０、ＳＶＤ－１４、ＳＶＤ－１ａ、ＳＶＤ－６ａ又はＳＶＤ－１０ａの配列プロセシング（例えば配列変異）は、シヌクレイン病において治療的に使用することができる他の物質を開発する可能性をもたらす。
【0043】
本発明は、上記で開示された方法を用いて特定された可能性がある他のペプチドに関することもできる。
【0044】
配列番号１～７に係るペプチドは、α－シヌクレインモノマーへの特異的結合の結果としてシヌクレイン病に対する潜在的な医薬として使用することができる。
【0045】
本発明に係る目的は、配列番号１～７に係るアミノ酸配列の相同体、断片及び一部分を含有するペプチドによっても達成される。
【0046】
本明細書において、α－シヌクレインペプチド又はα－シヌクレインタンパク質は、好ましくはヒトのα－シヌクレインペプチド又はα－シヌクレインタンパク質を意味する。
【0047】
本発明の文脈では、相同配列又は「相同体」は、アミノ酸配列が上記モノマーの上述のアミノ酸配列の１つと少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００％の同一性を有することを意味する。このうち、８０％及び９０％が好ましい。本明細書において、用語「相同体」及び「相同性」は、「同一性」と同義に使用される。２つの核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、Ｓｍｉｔｈ，Ｔ．Ｆ．及びＷａｔｅｒｍａｎ，Ｍ．Ｓ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ． ２：４８２－４８９（１９８１））によるアルゴリズムに基づくＢＥＳＴＦＩＴプログラムを使用し、アミノ酸について、ギャップ生成ペナルティ（Ｇａｐ ｃｒｅａｔｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）：８及びギャップ伸長ペナルティ（Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ｐｅｎａｌｔｙ）：２、のパラメータ、核酸について、ギャップ生成ペナルティ：５０及びギャップ伸長ペナルティ：３、のパラメータを調整することにより比較によって計算される。好ましくは、２つの核酸配列又はポリペプチド配列の間の同一性は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ．Ｂ．及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ．Ｄ．（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ． ４８：４４３－４５３）によるアルゴリズムに基づくＧＡＰプログラムを使用し、アミノ酸について、ギャップ生成ペナルティ：８及びギャップ伸長ペナルティ：２、のパラメータ、核酸について、ギャップ生成ペナルティ：５０及びギャップ伸長ペナルティ：３、のパラメータを調整して、比較によって計算されるような、各場合において同じ配列長にわたる核酸配列／ポリペプチド配列の同一性によって定義される。
【0048】
本発明の文脈では、２つのアミノ酸配列は、それらが同じアミノ酸配列を有する場合、同一である。
【0049】
さらなる変形形態では、本発明に係るペプチドは、２個又は３個までのアミノ酸だけ記載された配列とは異なる配列を有する。
【0050】
さらには、上記配列を含む配列をペプチドとして用いることもできる。
【0051】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、遊離Ｃ末端において、カルボキシル基の代わりに、酸アミド基（ＣＯＮＨ２基）若しくはＣＯＨ基、ＣＯＣｌ基、ＣＯＢｒ基、ＣＯＮＨ－アルキル基若しくはＣＯＮＨ－アルキルアミン基が存在するか、又はペプチドは環化形態にあることを特徴とする。
【0052】
これは、特に有利には、Ｃ末端に負電荷を有さないペプチドを提供するという目的も達成する。これは、有利には、上記ペプチドが、遊離Ｃ末端にカルボキシル基を有するペプチドよりも高い親和性で標的分子に結合することができることを意味する。生理学的状態では、遊離の非修飾カルボキシル基を有するペプチドは、この末端に負電荷を有する。
【0053】
本発明の１つの実施形態では、本発明に係るペプチドは、生理学的状態、特に６～８、特に６．５～７．５のｐＨ、特にｐＨ６．０、ｐＨ６．１、ｐＨ６．２、ｐＨ６．３、ｐＨ６．４、ｐＨ６．５、ｐＨ６．６、ｐＨ６．７、ｐＨ６．８、ｐＨ６．９、ｐＨ７．０、ｐＨ７．１、ｐＨ７．２、ｐＨ７．３、ｐＨ７．４、ｐＨ７．５、ｐＨ７．６、ｐＨ７．７、ｐＨ７．８、ｐＨ７．９又はｐＨ８．０において、Ｃ末端が負電荷を有さず、代わりに中性であるか、又は１つ以上の正電荷を有するように修飾される。
【0054】
１つの実施形態では、当該ペプチドは、遊離Ｃ末端において、カルボキシル基の代わりに酸アミド基が存在することを特徴とする。それゆえ、カルボキシル基（－ＣＯＯＨ基）の代わりにＣ末端に酸アミド基（－ＣＯＮＨ２基）が配置される。
【0055】
従って、当該ペプチドは、特に有利には、遊離Ｃ末端でアミド化される。
【0056】
従って、当該ペプチドは、特に有利には、遊離Ｃ末端でアミド化され、遊離Ｎ末端では非修飾である。
【0057】
これは、特に有利には、標的分子に親和性で結合することができ、単純な様式で得ることができる過剰の負電荷のないペプチドを有するという目的も達成する。
【0058】
本開示のさらなる実施形態では、カルボキシル基の代わりに以下のさらなる基、ＣＯＨ、ＣＯＣｌ、ＣＯＢｒ、ＯＮＨ－アルキル基、ＣＯＮＨ－アルキルアミン基（正味正電荷）等が存在するが、これは、主請求項の技術的教示に従う限り、非限定的なリストである。
【0059】
それゆえ、本発明のさらなる好ましい実施形態では、Ｃ末端に負電荷を有さない本発明に従って修飾されたペプチドの結合親和性は、Ｃ末端に負電荷を有するがその点を除けば同一のアミノ酸配列を有する線状ペプチドと比較して、１％、２、３、４、５、６、７、８、９、特に１０％、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、特に１００％、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、特に２００％、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、特に３００％、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、特に４００％、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、さらに有利なことに５００％、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、特に有利には６００％、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、特に有利には７００％、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、同様に特に有利には８００％、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、同様に特に有利には９００％、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、又はさらには１０００％、又はさらには１００００％、又はさらには１０００００％若しくは１００００００％まで（いずれの中間値を採用することも可能である）増加する。
【0060】
これは、対応して低下したＫＤ値によって示される。α－シヌクレインモノマーに対する修飾ペプチドの結合親和性の尺度としてのＫＤ値は、遊離Ｃ末端に負電荷を有する線状結合ペプチドと比較して、１％、２、３、４、５、６、７、８、９、特に１０％、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、特に９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５％、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９～９９．９９又はさらには９９．９９９％（いずれの中間値を採用することも可能である）低下する。
【0061】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、このペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び／又は配列番号７を有する配列のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０個又はこれより多いコピーを含有することを特徴とする。
【0062】
当該ペプチドが配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び／又は配列番号７の１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個又はこれより多いペプチドを含有する変異体を想起することも可能である。
【0063】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６及び／又は配列番号７を有する配列のダイマーが特に好ましく、その両方のモノマーは、同じ配列番号を有するか又は異なる配列番号を有するペプチドである。
【0064】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、そのペプチドが実質的にＤ－アミノ酸からなることを特徴とする。
【0065】
本発明の文脈では、用語「実質的にＤ－エナンチオマーアミノ酸からなる」は、本発明に従って使用されるモノマーが、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、好ましくは７５％、８０％、特に好ましくは８５％、９０％、９５％、特に９６％、９７％、９８％、９９％、１００％まで、Ｄ－エナンチオマーアミノ酸から形成されることを意味する。
【0066】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、そのペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７からなる群から選択されるアミノ酸配列からなることを特徴とする。
【0067】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、そのペプチドが別の物質に連結されていることを特徴とする。
【0068】
本発明の文脈では、連結は、Ｒｏｅｍｐｐ Ｃｈｅｍｉｅ Ｌｅｘｉｋｏｎ、第９版、第１巻、６５０頁以降、Ｇｅｏｒｇ Ｔｈｉｅｍｅ Ｖｅｒｌａｇ、シュトゥットガルト（Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ）に定義される化学結合、好ましくは主原子価結合、特に共有結合である。
【0069】
上記物質は、ドイツ薬事法（Ｇｅｒｍａｎ Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ Ａｃｔ）第２条又は第４条（１９）、２０１２年９月版に従って定義される医薬品又は活性成分の変種である。あるいは、活性成分は、医薬活性物質として使用される治療活性物質である。好ましくは抗炎症剤が使用される。
【0070】
さらなる変形形態では、上記物質は、当該ペプチドの効果を増強する化合物である。
【0071】
さらなる代替形態において、上記物質は、当該ペプチドの溶解性及び／又は血液脳関門の通過を改善する化合物である。
【0072】
あるいは、本発明によれば、当該ペプチドは、上記の変形形態、実施形態及び／又は代替形態の少なくとも２つ以上の特徴の任意の所望の組み合わせを有する。
【0073】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の複数のペプチドが、互いに共有結合又は非共有結合で連結されていることを特徴とする。
【0074】
本発明の文脈では、ペプチドユニットの共有結合又は連結は、２つのペプチドが、その間にリンカー基が挿入されているか又は挿入されていない状態で、頭－頭、尾－尾、又は頭－尾でのいずれかで互いに線状に連結される場合に、存在する。
【0075】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の複数のペプチドが、リンカーなしで互いに連結されている、すなわち、互いに直接連結されているか、又はリンカー基を使用して互いに連結されていることを特徴とする。
【0076】
本発明の文脈では、ペプチドが、例えばビオチン及びストレプトアビジン、特にストレプトアビジンテトラマーを介して互いに連結されている場合、非共有結合による連結が存在する。
【0077】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６又は配列番号７の複数のペプチドが、線状又は分岐様式で互いに連結されていることを特徴とする。
【0078】
本発明の変形形態では、当該ペプチドは、特に上記のように、互いに線状に連結されていてもよい。別の変形形態において、上記ペプチドは、分岐様式で互いに連結されて、本発明に係るペプチドを与える。
【0079】
本発明によれば、分岐ペプチドは、上記モノマーが互いに共有結合又は非共有結合で連結されているデンドリマーであってもよい。
【0080】
あるいは、当該ペプチドは、プラットフォーム分子（例えば、ＰＥＧ又は糖）に連結され、従って、分岐ペプチドを形成することもできる。
【0081】
あるいは、これらの選択肢の組み合わせも可能である。
【0082】
本発明の１つの構成では、当該ペプチドの結合親和性は、解離定数（ＫＤ値）によって定義される。
【0083】
本発明の１つの有利な構成では、本発明に係るペプチドの解離定数（ＫＤ値）は、有利には低下する。これは、本発明に係るペプチドの改善された特性、例えば、より高い結合親和性及びより高い分解効率並びに／又は毒性のα－シヌクレインのオリゴマー若しくは凝集体の形成の防止に関連する。
【0084】
本発明の変形形態では、最大で５００μＭ、好ましくは２５０、１００、５０μＭ、特に好ましくは２５、１０、１μＭの解離定数（ＫＤ値）で、特に好ましくは最大で５００ｎＭ、２５０、１００、５０、特に好ましくは２５、１０、１ｎＭ、５００ｐＭ、１００、５０、２５、２０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、１ｐＭから１ｐＭ未満の範囲まで（任意の中間値を採用することが可能である）の解離定数（ＫＤ値）でα－シヌクレインモノマーに結合するペプチドが使用される。
【0085】
本発明に係るペプチドは、さらに好ましくは、それらが、５０μＭ未満のＫＤでα－シヌクレインペプチド、好ましくは折り畳まれていないα－シヌクレインペプチドに結合することを特徴とする。
【0086】
当該ペプチドは、例えば、化学合成又はペプチド合成によって生成することができる。
【0087】
α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／又はα－シヌクレインペプチド凝集体の形成を防止するための、先行する請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
【0088】
さらなる変形形態では、当該ペプチドは、α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／又はα－シヌクレインペプチド凝集体の形成を阻害又は防止するためのペプチドである。
【0089】
さらなる変形形態では、当該ペプチドは、α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／又はα－シヌクレインペプチド凝集体の解毒のためのペプチドである。
【0090】
本発明に係るペプチドは、α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／若しくはα－シヌクレインペプチド凝集体又はそれらから形成されるポリマー、例えば原線維を、好ましくはそれらに結合するのではなく、むしろα－シヌクレインモノマーに結合することによって、及び平衡をシフトさせることによって、α－シヌクレインオリゴマーの減少をもたらし、これによりそれらが毒性化合物に変換されるのを防止することによって、解毒する。従って、本発明の別の主題は、α－シヌクレインオリゴマー及び凝集体又はそれから形成される原線維の解毒の方法である。
【0091】
α－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／若しくはα－シヌクレインペプチド凝集体の形成の阻害又は防止、並びにα－シヌクレインペプチドオリゴマー及び／若しくはα－シヌクレインペプチド凝集体の解毒は、インビトロ又はインビボで行うことができる。
【0092】
本発明は、シヌクレイン病の治療に使用するための上記のペプチドにも関する。
【0093】
本発明は、特に、特定の細胞におけるタンパク質α－シヌクレインのミスフォールディング及び凝集に特に関連している、パーキンソン病（ＰＤ）、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）及び多系統萎縮症（ＭＳＡ）の治療に使用するための上記のペプチドにも関する。
【0094】
本発明は、特に、パーキンソン病（ＰＤ）の治療に使用するための上記のペプチドにも関する。
【0095】
以下で、非限定的な実施例を用いて本発明をより詳細に記載する。
【実施例】
【0096】
ペプチドＳＶＤ－１、ＳＶＤ－６、ＳＶＤ－１０及びＳＶＤ－１４、ＳＶＤ－１ａ、ＳＶＤ－６ａ、ＳＶＤ－１０ａを、より綿密に検討した。
【0097】
材料及び方法：
モノマーの野生型（ＷＴ）α－ｓｙｎ及びα－ｓｙｎ Ａ１４０Ｃの組換え発現及び洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ）：
モノマーの野生型（ＷＴ）α－ｓｙｎ及びα－ｓｙｎ Ａ１４０Ｃの組換え発現及び洗浄（ｃｌｅａｎｉｎｇ）：
【0098】
Ｎ末端アセチル化野生型α－ｓｙｎ（以下、α－ｓｙｎと呼ぶ）及びアセチル化α－ｓｙｎ－Ａ１４０Ｃを、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）由来のＮ末端アセチル化酵素とともにｐＴ７ベクター及びｐＮａｔＢベクター中にコドン最適化α－ｓｙｎを保有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）中で発現させた。発現は、１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ又は１５Ｎ飽和Ｍ９最少培地中で、１．２のＯＤ６００に到達し、続いて３７℃で４時間（ｈ）インキュベートした後に起こった。１ｌの発現物からのペレットを２５ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０に再懸濁し、９５～１００℃で２×１５分（ｍｉｎ）間沸騰させた。４℃で３０分間、２０，０００×ｇで遠心分離した後、上清を０．４５ｇ／ｍｌの硫酸アンモニウムの最終濃度で沈殿させた。このタンパク質を２０，０００×ｇで３０分間ペレット化し、５０ｍｌの２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０に再懸濁した。滅菌濾過後、この試料をＨｉＰｒｅｐ ＱＦＦ １６／１０（Ｃｙｔｉｖａ（サイティバ）、米国、ＣＶ＝２０ｍｌ）陰イオン交換カラムにロード（装填）した。勾配溶出は、目標濃度の８００ｍＭ ＮａＣｌで２０ＣＶにわたって行った。組換えα－ｓｙｎは、２８～３２ｍＳ／ｃｍの電気伝導率で溶出した。組換えα－ｓｙｎを含有する画分をプールし、上記のように硫酸アンモニウムで沈殿させた。ペレットを５ｍｌの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．４、５０ｍＭ ＮａＣｌに再懸濁し、ＨｉＬｏａｄ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ６０／７５ｐｇゲル濾過カラム（Ｃｙｔｉｖａ、米国、ＣＶ＝１２０ｍｌ）にロードした。発現は、５６００Ｍ－１ｃｍ－１の吸光係数を有するＡ２７５によって決定したところ、２０～３０ｍｇ／ｌを与えた。このタンパク質アリコートを液体窒素で凍結し、－８０℃で保存した。
【0099】
Ｄ－エナンチオマーペプチド：
Ｃ末端アミド化を有するＤ－エナンチオマーペプチドを、＞９５％の純度を有する凍結乾燥塩化物塩粉末としてＣＡＳＬＯ（キャスロ）（ＣＡＳＬＯ、デンマーク）から得た。上記ペプチド、例えばＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを、ＰＢＳを含む異なる緩衝液、ｐＨ７．４、条件下で試験し、３７℃で１時間のインキュベーション及び２０，８００×ｇの遠心分離の後のＵＶ－ｖｉｓ吸光度測定により、両方の化合物が少なくとも１ｍＭの開始濃度まで上清中に完全に残ったことが示された。
Ｃ末端アミド化を有するＤ－エナンチオマーペプチドを、＞９５％の純度を有する凍結乾燥塩化物塩粉末としてＣＡＳＬＯ（キャスロ）（ＣＡＳＬＯ、デンマーク）から得た。上記ペプチド、例えばＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを、ＰＢＳを含む異なる緩衝液、ｐＨ７．４、条件下で試験し、３７℃で１時間のインキュベーション及び２０，８００×ｇの遠心分離の後のＵＶ－ｖｉｓ吸光度測定により、両方の化合物が少なくとも１ｍＭの開始濃度まで上清中に完全に残ったことが示された。
【0100】
チオフラビンＴアッセイ：
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイは、α－ｓｙｎ細線維化（フィブリル化）を可視化するために慣例的に使用される。これは、染料ＴｈＴは原線維構造のアミロイド形成性交差βプリーツシート部分に結合することができるためである。組換えα－ｓｙｎを氷上で解凍し、２１，０００×ｇ及び４℃で３０分間遠心分離した。上清の濃度を測定した。凍結乾燥Ｄ－ペプチドを室温（ＲＴ）で１時間解凍し、５００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解した。２１，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、Ａ２８０における対応する吸光係数を用いて、ＵＶ－ｖｉｓによって上清の濃度を決定した。すべてのＴｈＴアッセイ実験は、明示的に特段の記載がない限り、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１５μＭ ＴｈＴ及び０．０５％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）を用いて３７℃で実施した。ＴｈＴ蛍光を、３ｍｍまでの中心以外の測定（ｏｒｂｉｔａｌ ａｖｅｒａｇｉｎｇ）で蛍光プレートリーダー（Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ又はＰｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ（ベーエムゲー・ラボバイオテック）、ドイツ）において、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍでのベースライン光学構成でモニターした。測定を開始する前に、１２０μｌの試料溶液を、透明な平らなベースを有する非結合性の９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング）、米国）に添加した。すべてのデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）凝集アッセイについて、ホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３．０ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ（ヒルゲンベルグ）、ドイツ）を各ウェルに添加した。接種した凝集アッセイについては、ビーズを使用せず、試料を静止条件下でインキュベートした。試料ウェルを取り囲むウェルは、熱分布を改善するために同体積の緩衝液で満たした。明示的に特段の記載がない限り、実験は５回の反復で行った（ｎ＝５）。
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）アッセイは、α－ｓｙｎ細線維化（フィブリル化）を可視化するために慣例的に使用される。これは、染料ＴｈＴは原線維構造のアミロイド形成性交差βプリーツシート部分に結合することができるためである。組換えα－ｓｙｎを氷上で解凍し、２１，０００×ｇ及び４℃で３０分間遠心分離した。上清の濃度を測定した。凍結乾燥Ｄ－ペプチドを室温（ＲＴ）で１時間解凍し、５００μｌのＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解した。２１，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、Ａ２８０における対応する吸光係数を用いて、ＵＶ－ｖｉｓによって上清の濃度を決定した。すべてのＴｈＴアッセイ実験は、明示的に特段の記載がない限り、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の１５μＭ ＴｈＴ及び０．０５％アジ化ナトリウム（ｗ／ｖ）を用いて３７℃で実施した。ＴｈＴ蛍光を、３ｍｍまでの中心以外の測定（ｏｒｂｉｔａｌ ａｖｅｒａｇｉｎｇ）で蛍光プレートリーダー（Ｃｌａｒｉｏｓｔａｒ又はＰｏｌａｒｓｔａｒ Ｏｐｔｉｍａ、ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ（ベーエムゲー・ラボバイオテック）、ドイツ）において、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍでのベースライン光学構成でモニターした。測定を開始する前に、１２０μｌの試料溶液を、透明な平らなベースを有する非結合性の９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ（コーニング）、米国）に添加した。すべてのデノボ（ｄｅ ｎｏｖｏ）凝集アッセイについて、ホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３．０ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ（ヒルゲンベルグ）、ドイツ）を各ウェルに添加した。接種した凝集アッセイについては、ビーズを使用せず、試料を静止条件下でインキュベートした。試料ウェルを取り囲むウェルは、熱分布を改善するために同体積の緩衝液で満たした。明示的に特段の記載がない限り、実験は５回の反復で行った（ｎ＝５）。
【0101】
ＴｈＴアッセイを異なる目的に使用した。第１に、デノボＴｈＴ凝集アッセイは、合成Ｄ－ペプチドによる凝集遅延についてのスクリーニングプラットフォームとして役立った。この場合、５０μＭの組換えα－ｓｙｎを３倍モル過剰の各Ｄ－ペプチドとともにインキュベートした。試料を各サイクルの前にオービタルシェイキング（軌道振盪）モードで３００ｒｐｍで３０秒（ｓ）間振盪した。水性緩衝液に不溶性であるペプチドを２．５μｌのＤＭＳＯ（０．５ｍｇペプチド）に溶解し、２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯの最終濃度に達するまでＰＢＳ、ｐＨ７．４と徐々に混合した。これらの試料については、２．５％（ｖ／ｖ）ＤＭＳＯを含むＰＢＳ、ｐＨ７．４中のα－ｓｙｎ単独の参照凝集も行った。各反復物の凝集曲線を、下記式を用いて対称ボルツマンシグモイドフィット（ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ２０２０、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（オリジンラボ）、米国）を用いて個々に調整した。
【数1】
【0102】
（Ａ１＝開始値、Ａ２＝終了値、ｘ０＝変曲点［ｓ］、ｄｘ＝時定数［１／ｓ］）。
【0103】
調整の変曲点は、凝集半減期ｔ１／２を決定し、遅延時間は、式ｔ１／２－２・ｄｔ１／２を使用して近似し、式中、ｄｔ１／２は、ｘ＝ｔ１／２での調整の勾配（単位：１／ｓ）として定義される。半減期及び遅延時間は、個々の調整の平均値として計算した。凝集遅延の濃度依存性を決定するために、５０μＭの組換えα－ｓｙｎに異なる濃度の上記化合物を適用した。遅延時間及びｔ１／２は、上述のように計算した。グラフ表示のために、調整した定常状態をすべての条件について１に正規化し、調整に基づいて平均誤差を計算した。時間シフトの有意性に関する統計的検定は、２つの無作為試料（無作為標本）についてウエルチ（Ｗｅｌｃｈ）のｔ検定を使用して実施し、ｐ＜０．０５を用いた（ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ２０２０、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ（オリジンラボ）、米国）。準化学量論的な物質濃度でのデノボＴｈＴアッセイのために、１０μＭ α－ｓｙｎを使用した。スクリーニング凝集アッセイとは対照的に、凝集時間を短縮するために、α－ｓｙｎ試料をオービタルシェイキングモードで３００ｒｐｍで連続的に振盪し、測定を５分ごとに行った。阻害剤及び同じ濃度の対応する対照ペプチドの存在下での遅延時間シフト及び定常状態減少に対するｔ１／２の有意性を比較することによって、上記のように統計的評価を行った。接種したＴｈＴアッセイについては、５０ｎＭのモノマー当量のＰＦＦオリゴマーを、異なる濃度の上記化合物とともに又はその不存在下で、３７℃の静止条件下で蛍光プレートリーダーにおいてインキュベートした。２０時間後、２０μＭのモノマーα－ｓｙｎを、播種を開始するために試料混合物に添加した。測定は５分毎に行った（ｎ＝３）。
【0104】
ＰＦＦオリゴマーの生成：
ＰＦＦオリゴマーを以下のように生成した。第１に、ホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３．０ｍＭ；Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）を含むＬｏＢｉｎｄ反応管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＧｍｂＨ（エッペンドルフ）、ドイツ）中で、２０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ０．０５％ ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中で、３００μＭの組換えα－ｓｙｎを３７℃で１週間インキュベートすることによって、不溶性ＰＦＦを生成した。この不溶性ＰＦＦを４℃で３０分間１００，０００×ｇの超遠心分離によって回収し、ペレットを２０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで数回洗浄した。モノマー当量濃度は、最初の遠心分離後の上清中のα－ｓｙｎ濃度を測定し、これを細線維化の開始濃度から差し引くことによって決定した。不溶性ＰＦＦを緩衝液に再懸濁し、液体Ｎ２で－８０℃で凍結させた。オリゴマーＰＦＦは、チップ超音波処理器（ＭＳ７２マイクロチップ、Ｓｏｎｏｐｏｌｕｓ、Ｂｒａｎｄｅｌｉｎ（ブランデリン）、ドイツ）を使用して、３００μＭのモノマー当量濃度を有する２００μｌの不溶性ＰＦＦを３×１５秒間（１秒の開始／終了）及び６０％振幅で激しく超音波処理することによって得た。不溶性ＰＦＦを、１００，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離することによって分離した。ＰＦＦオリゴマーを含む上清を分離し、分注（アリコート）し、液体Ｎ２で－８０℃で凍結した。
ＰＦＦオリゴマーを以下のように生成した。第１に、ホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３．０ｍＭ；Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）を含むＬｏＢｉｎｄ反応管（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＧｍｂＨ（エッペンドルフ）、ドイツ）中で、２０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ０．０５％ ＮａＣｌ（ｗ／ｖ）アジ化ナトリウム中で、３００μＭの組換えα－ｓｙｎを３７℃で１週間インキュベートすることによって、不溶性ＰＦＦを生成した。この不溶性ＰＦＦを４℃で３０分間１００，０００×ｇの超遠心分離によって回収し、ペレットを２０ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌで数回洗浄した。モノマー当量濃度は、最初の遠心分離後の上清中のα－ｓｙｎ濃度を測定し、これを細線維化の開始濃度から差し引くことによって決定した。不溶性ＰＦＦを緩衝液に再懸濁し、液体Ｎ２で－８０℃で凍結させた。オリゴマーＰＦＦは、チップ超音波処理器（ＭＳ７２マイクロチップ、Ｓｏｎｏｐｏｌｕｓ、Ｂｒａｎｄｅｌｉｎ（ブランデリン）、ドイツ）を使用して、３００μＭのモノマー当量濃度を有する２００μｌの不溶性ＰＦＦを３×１５秒間（１秒の開始／終了）及び６０％振幅で激しく超音波処理することによって得た。不溶性ＰＦＦを、１００，０００×ｇで１時間４℃で遠心分離することによって分離した。ＰＦＦオリゴマーを含む上清を分離し、分注（アリコート）し、液体Ｎ２で－８０℃で凍結した。
【0105】
蛍光標識：
システイン－マレイミドカップリングによってペプチドを蛍光標識した。ＳＶＤ－１＿Ｃｙｓ及びＳＶＤ１ａ＿Ｃｙｓを、５倍又は１０倍モル過剰のＴＣＥＰ及びＣＦ６３３－ＰＥＧ２－マレイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）、米国）でＣ末端で蛍光標識した。この標識反応を２５ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．０中で室温で２時間行った。標識したペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント） １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ及びＣ－１８ ＲＰ－ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ８／ＳＢ－Ｃ １８、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を用いて２５℃で精製した。移動相は、Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ、及びＢ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、からなっていた。蛍光標識したペプチド及びタンパク質を、３０分で５～４０％（ｖ／ｖ）Ｂの勾配で溶出した。蛍光標識生成物をフルオロフォアの吸収波長（ＣＦ６３３：６３３ｎｍ）を用いて分画し、続いてプールした試料を凍結乾燥し、適切な緩衝液に再溶解した。タンパク質濃度をＵＶ－ｖｉｓによって決定し、蛍光標識試料を－２０℃で保存した。
システイン－マレイミドカップリングによってペプチドを蛍光標識した。ＳＶＤ－１＿Ｃｙｓ及びＳＶＤ１ａ＿Ｃｙｓを、５倍又は１０倍モル過剰のＴＣＥＰ及びＣＦ６３３－ＰＥＧ２－マレイミド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（シグマ・アルドリッチ）、米国）でＣ末端で蛍光標識した。この標識反応を２５ｍＭ ＮａＰｉ、ｐＨ７．０中で室温で２時間行った。標識したペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ（アジレント） １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩ Ｓｙｓｔｅｍ及びＣ－１８ ＲＰ－ＨＰＬＣカラム（Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ８／ＳＢ－Ｃ １８、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を用いて２５℃で精製した。移動相は、Ａ：水＋０．１％ＴＦＡ、及びＢ：アセトニトリル＋０．１％ＴＦＡ、からなっていた。蛍光標識したペプチド及びタンパク質を、３０分で５～４０％（ｖ／ｖ）Ｂの勾配で溶出した。蛍光標識生成物をフルオロフォアの吸収波長（ＣＦ６３３：６３３ｎｍ）を用いて分画し、続いてプールした試料を凍結乾燥し、適切な緩衝液に再溶解した。タンパク質濃度をＵＶ－ｖｉｓによって決定し、蛍光標識試料を－２０℃で保存した。
【0106】
マイクロスケール熱泳動
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）の実験は、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（ナノテンパー・テクノロジーズ）、ドイツ）を用いて行った。蛍光標識ペプチドをＰＢＳ、ｐＨ７．４で１００ｎＭの最終濃度に希釈した。組換えα－ｓｙｎを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で、５０μＭ～３ｐＭの最終濃度の一連の連続希釈で希釈し、上記ペプチド溶液と均一に混合した。この試料を、ＳＶＤ１については標準表面積ガラスキャピラリーに、ＳＶＤ－１ａについてはプレミアム表面積キャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）にロードし、測定を２５℃で２０％ＬＥＤ出力及び６０％ＭＳＴ出力で行った。製造業者が推奨する標準パラメータを使用した（３０秒の加熱期間及び５秒の再平衡化期間の遅延時間）。データは、製造業者が供給するＮＴ分析ソフトウェア（バージョン１．５．４１）を使用して、熱泳動効果に関して評価した。
マイクロスケール熱泳動（ＭＳＴ）の実験は、Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ＮＴ．１１５装置（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ（ナノテンパー・テクノロジーズ）、ドイツ）を用いて行った。蛍光標識ペプチドをＰＢＳ、ｐＨ７．４で１００ｎＭの最終濃度に希釈した。組換えα－ｓｙｎを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で、５０μＭ～３ｐＭの最終濃度の一連の連続希釈で希釈し、上記ペプチド溶液と均一に混合した。この試料を、ＳＶＤ１については標準表面積ガラスキャピラリーに、ＳＶＤ－１ａについてはプレミアム表面積キャピラリー（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ＧｍｂＨ、ドイツ）にロードし、測定を２５℃で２０％ＬＥＤ出力及び６０％ＭＳＴ出力で行った。製造業者が推奨する標準パラメータを使用した（３０秒の加熱期間及び５秒の再平衡化期間の遅延時間）。データは、製造業者が供給するＮＴ分析ソフトウェア（バージョン１．５．４１）を使用して、熱泳動効果に関して評価した。
【0107】
表面プラズモン共鳴動態実験：
測定は、８Ｋ－Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｃｙｔｉｖａ、米国）を用いて行った。相互作用は、単サイクル動態実験を用いて測定した。すべてのアッセイにおいて、ペプチド化合物をリガンドとしてセンサー表面に固定化し、組換えα－ｓｙｎを分析物としてフローに注入した。ペプチド、特にＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを、第一級アミノ基を介してＣＭＤ２００Ｍカルボキシルデキストランマトリクスチップ（Ｘａｎｔｅｃ（キサンテック）、ドイツ）に固定化した。固定化は、１０ｍＭ ＮａＡｃ中、ＳＶＤ－１についてはｐＨ５．０、ＳＶＤ－１ａについてはｐＨ７．０で５０μｇ／ｍｌのペプチドを用いて、１０μｌ／分で７分間のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化後に、飽和シグナル（ＳＶＤ－１：４００ＲＵ、ＳＶＤ－１ａ：５００ＲＵ）に達するまで行った。ｐＨ８．３の１Ｍエタノールアミンを用いて表面クエンチングを行った。明示的に特段の記載がない限り、動態実験は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中３０μｌ／分の流量で実施した。表面は、３０μｌ／分での２Ｍ Ｇｕａ－ＨＣｌの３０秒注入を用いてサイクル間で再生した。データ評価は、評価ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｖ３．０（Ｃｙｔｉｖａ、米国）を用いて行った。
測定は、８Ｋ－Ｂｉａｃｏｒｅ装置（Ｃｙｔｉｖａ、米国）を用いて行った。相互作用は、単サイクル動態実験を用いて測定した。すべてのアッセイにおいて、ペプチド化合物をリガンドとしてセンサー表面に固定化し、組換えα－ｓｙｎを分析物としてフローに注入した。ペプチド、特にＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを、第一級アミノ基を介してＣＭＤ２００Ｍカルボキシルデキストランマトリクスチップ（Ｘａｎｔｅｃ（キサンテック）、ドイツ）に固定化した。固定化は、１０ｍＭ ＮａＡｃ中、ＳＶＤ－１についてはｐＨ５．０、ＳＶＤ－１ａについてはｐＨ７．０で５０μｇ／ｍｌのペプチドを用いて、１０μｌ／分で７分間のＥＤＣ／ＮＨＳ活性化後に、飽和シグナル（ＳＶＤ－１：４００ＲＵ、ＳＶＤ－１ａ：５００ＲＵ）に達するまで行った。ｐＨ８．３の１Ｍエタノールアミンを用いて表面クエンチングを行った。明示的に特段の記載がない限り、動態実験は、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中３０μｌ／分の流量で実施した。表面は、３０μｌ／分での２Ｍ Ｇｕａ－ＨＣｌの３０秒注入を用いてサイクル間で再生した。データ評価は、評価ソフトウェアＢｉａｃｏｒｅ ｉｎｓｉｇｈｔ ｖ３．０（Ｃｙｔｉｖａ、米国）を用いて行った。
【0108】
スピン標識ＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓ＿ＭＴＳＬの生成：
ニトロキシルラジカルでスピン標識したＳＶＤ－１ａの類似体は、（１－オキシル－２，２，５，５－テトラメチル－Δ３－ピロリン－３－メチル）メタンチオスルホネート（ＭＴＳＬ）（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（トロント・リサーチ・ケミカルズ）、米国）をＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓと反応させ、Ｃ末端Ｄ－システイン残基へのニトロキシルラジカルスピン標識ＭＴＳＬの共有結合をもたらすことによって生成した。ペプチドに対して５倍モル過剰のＭＴＳＬ、すなわち約４ｍｇのＭＴＳＬ（約１５μｍｏｌ）を９０μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、８１０μｌの２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ７．６と混合した。次いで、この溶液を約５ｍｇ（約３μｍｏｌ）の凍結乾燥ＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓに加えた。室温で１～２時間インキュベートした後、反応混合物を、接続されたＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ）を備えたＣ８カラム（Ｚｏｒｂａｘ－３００ ＳＢ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ）でのセミ分取用ＲＰ－ＨＰＬＣで使用した。スピン標識したペプチドＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓ＿ＭＴＳＬを、水性アセトニトリル（ＡＣＮ）勾配（４０分以内にＭｉｌｌｉ－Ｑ水中の８％ＡＣＮ、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から６０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡまで）を用いて、２５℃で４ｍｌ分－１のスループット速度及び２１４ｎｍでの検出で精製した。精製したスピン標識した試料を回収し、分注し、液体Ｎ２中で急速凍結し、真空下で凍結乾燥させた（ＬＴ－１０５、Ｍａｒｔｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ（マーティン・クライスト）、ドイツ）。この記載した方法は、９８％以上の純度を有するＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓ＿ＭＴＳＬの完全なスピン標識を可能にする。
ニトロキシルラジカルでスピン標識したＳＶＤ－１ａの類似体は、（１－オキシル－２，２，５，５－テトラメチル－Δ３－ピロリン－３－メチル）メタンチオスルホネート（ＭＴＳＬ）（Ｔｏｒｏｎｔｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（トロント・リサーチ・ケミカルズ）、米国）をＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓと反応させ、Ｃ末端Ｄ－システイン残基へのニトロキシルラジカルスピン標識ＭＴＳＬの共有結合をもたらすことによって生成した。ペプチドに対して５倍モル過剰のＭＴＳＬ、すなわち約４ｍｇのＭＴＳＬ（約１５μｍｏｌ）を９０μｌのＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、８１０μｌの２００ｍＭ ＨＥＰＥＳ／ＮａＯＨ緩衝液、ｐＨ７．６と混合した。次いで、この溶液を約５ｍｇ（約３μｍｏｌ）の凍結乾燥ＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓに加えた。室温で１～２時間インキュベートした後、反応混合物を、接続されたＨＰＬＣシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ）を備えたＣ８カラム（Ｚｏｒｂａｘ－３００ ＳＢ、Ａｇｉｌｅｎｔ、ドイツ）でのセミ分取用ＲＰ－ＨＰＬＣで使用した。スピン標識したペプチドＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓ＿ＭＴＳＬを、水性アセトニトリル（ＡＣＮ）勾配（４０分以内にＭｉｌｌｉ－Ｑ水中の８％ＡＣＮ、０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）から６０％ＡＣＮ、０．１％ＴＦＡまで）を用いて、２５℃で４ｍｌ分－１のスループット速度及び２１４ｎｍでの検出で精製した。精製したスピン標識した試料を回収し、分注し、液体Ｎ２中で急速凍結し、真空下で凍結乾燥させた（ＬＴ－１０５、Ｍａｒｔｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ（マーティン・クライスト）、ドイツ）。この記載した方法は、９８％以上の純度を有するＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓ＿ＭＴＳＬの完全なスピン標識を可能にする。
【0109】
ＮＭＲ分光法：
試料は、内部基準として５％Ｄ２Ｏを添加したＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で、２５μＭの完全長１５Ｎ標識アセチル－α－ｓｙｎの最終濃度で、等モル量のＳＶＤ－１ａ（同位体標識されず、従ってＮＭＲに不可視）の不在下（参照）及び存在下で作製した。２Ｄ－１Ｈ－１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ（ブルカー） ＡＶＡＮＣＥ ＮＥＯ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、米国）を用いて１２００ＭＨｚプロトンラーモア（Ｌａｒｍｏｒ）周波数で連続して（Ｒｕｅｃｋｅｎ ａｎ Ｒｕｅｃｋｅｎ）記録した。実験の温度は１０℃であった。スペクトル次元は１６．０２ｐｐｍ（１Ｈ）×３０ｐｐｍ（１５Ｎ）であり、１Ｈ次元で２０４８ポイント、１５Ｎ次元で２５６増分であり、１Ｈ次元で５３ｍｓ、１５Ｎ次元で３５ｍｓの記録時間を与えた。スキャン間で１秒の回復遅延を用いて３２スキャンを各増分について取得し、総試験期間はスペクトルあたり４．８時間となった。
試料は、内部基準として５％Ｄ２Ｏを添加したＰＢＳ緩衝液、ｐＨ７．４中で、２５μＭの完全長１５Ｎ標識アセチル－α－ｓｙｎの最終濃度で、等モル量のＳＶＤ－１ａ（同位体標識されず、従ってＮＭＲに不可視）の不在下（参照）及び存在下で作製した。２Ｄ－１Ｈ－１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルを、Ｂｒｕｋｅｒ（ブルカー） ＡＶＡＮＣＥ ＮＥＯ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ、米国）を用いて１２００ＭＨｚプロトンラーモア（Ｌａｒｍｏｒ）周波数で連続して（Ｒｕｅｃｋｅｎ ａｎ Ｒｕｅｃｋｅｎ）記録した。実験の温度は１０℃であった。スペクトル次元は１６．０２ｐｐｍ（１Ｈ）×３０ｐｐｍ（１５Ｎ）であり、１Ｈ次元で２０４８ポイント、１５Ｎ次元で２５６増分であり、１Ｈ次元で５３ｍｓ、１５Ｎ次元で３５ｍｓの記録時間を与えた。スキャン間で１秒の回復遅延を用いて３２スキャンを各増分について取得し、総試験期間はスペクトルあたり４．８時間となった。
【0110】
ＮＭＲ常磁性緩和促進（Ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）データを、１：１のα－ｓｙｎ：ＳＶＤ－１ａ比を与える、２５μＭの常磁性標識した（しかし同位体濃縮していない）ＳＶＤ－１ａ＿Ｃｙｓ＿ＭＴＳＬ（ＳＶＤ－１ａのＣ末端に共有結合したＭＴＳＬスピン標識を使用する）の存在下で２５μＭの完全長１５Ｎ標識アセチル－α－ｓｙｎを用いて取得した。強度（Ｉｐａｒａ）を、６００ＭＨｚ及び１０℃で取得した２Ｄ－１Ｈ－１５Ｎ－Ｂｅｓｔ－ＴＲＯＳＹ－ＮＭＲスペクトルから抽出した。測定では、増分毎にそれぞれ１２８回のスキャンを行い、総試験期間は１６時間となった。２０倍モル過剰のアスコルビン酸を同じ試料に添加し、その結果、スピン標識の常磁性効果がクエンチされ、反磁性参照試料が得られることによって参照データを得た。常磁性試料と同じ条件下で反磁性参照スペクトル及び強度（Ｉｄｉａ）を連続して記録した。
【0111】
ＮＭＲデータセットを、Ｂｒｕｋｅｒ ＴｏｐＳｐｉｎソフトウェア（バージョン４．１．１）を使用して処理し、ＣｃｐＮｍｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ｖ２．４．２）（５０）を使用して可視化した。参照スペクトル（ＳＶＤ１ａなし）と比較した、ＳＶＤ－１ａの存在下でのα－ｓｙｎ共鳴の化学シフトの変化を評価するために、ピーク位置を、ＣｃｐＮｍｒ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して抽出した。１Ｈ及び１５Ｎの次元における化学シフトの残基に特定の変化から、化学シフトの絶対変化を下記式に従って計算した。
【数2】
【0112】
ＰＲＥデータを分析するために、常磁性試料の共鳴強度及び反磁性参照試料のピーク強度を、ＣｃｐＮｍｒ Ａｎａｌｙｓｉｓを使用して抽出した。
【0113】
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＰＦＦオリゴマーの排除をＳＥＣ及びその後のＰＦＦオリゴマー及びモノマーのピークの検出によって評価した。ＰＦＦオリゴマーを、低保持エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）中で、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、ＳＶＤ－１ａとともに又はＳＶＤ－１ａを伴わずに、静止条件下で、３７℃で３日（ｄ）間インキュベートした。注入前に、試料を２分間２０，８００×ｇで遠心分離し、１００μｌの試料を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ ＳＥＣ－３ ３００Å、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）上に、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を１ｍｌ／分の流量で使用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を移動相として使用して注入した。タンパク質はＡ２１４で検出した。
ＰＦＦオリゴマーの排除をＳＥＣ及びその後のＰＦＦオリゴマー及びモノマーのピークの検出によって評価した。ＰＦＦオリゴマーを、低保持エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ、ドイツ）中で、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、ＳＶＤ－１ａとともに又はＳＶＤ－１ａを伴わずに、静止条件下で、３７℃で３日（ｄ）間インキュベートした。注入前に、試料を２分間２０，８００×ｇで遠心分離し、１００μｌの試料を、ＳＥＣ－ＨＰＬＣカラム（Ｂｉｏ ＳＥＣ－３ ３００Å、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）上に、Ａｇｉｌｅｎｔ １２６０ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ ＩＩシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を１ｍｌ／分の流量で使用し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４を移動相として使用して注入した。タンパク質はＡ２１４で検出した。
【0114】
動的光散乱（ＤＬＳ）
測定は、ＳｐｅｃｔｒｏＳｉｚｅ ３００ １３１（ＸｔａｌＣｏｎｃｅｐｔｓ（エクスタル・コンセプツ）、ドイツ）デバイス及び密封石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ Ｇｒｏｕｐ（ヘルマ・グループ）、ドイツ）中の１ｍｌの試料体積を使用して行った。試料を静止条件下、３７℃でインキュベートした。測定の前に、溶液からあらゆる可能性のある不純物を除去するために、すべての試料を４℃、２１，０００×ｇで３０分間遠心分離した。時間依存性ＤＬＳ測定のために３０秒毎にデータ点を記録した。拡散係数は、散乱強度の自己相関関数の減衰の分析から得て、ストークス－アインシュタイン（Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ）の式を使用して見かけの流体力学半径を決定するために使用した。
測定は、ＳｐｅｃｔｒｏＳｉｚｅ ３００ １３１（ＸｔａｌＣｏｎｃｅｐｔｓ（エクスタル・コンセプツ）、ドイツ）デバイス及び密封石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ Ｇｒｏｕｐ（ヘルマ・グループ）、ドイツ）中の１ｍｌの試料体積を使用して行った。試料を静止条件下、３７℃でインキュベートした。測定の前に、溶液からあらゆる可能性のある不純物を除去するために、すべての試料を４℃、２１，０００×ｇで３０分間遠心分離した。時間依存性ＤＬＳ測定のために３０秒毎にデータ点を記録した。拡散係数は、散乱強度の自己相関関数の減衰の分析から得て、ストークス－アインシュタイン（Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ）の式を使用して見かけの流体力学半径を決定するために使用した。
【0115】
原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）：
試料はα－ｓｙｎモノマー濃度が１μＭになるように希釈して作製した。５μｌを新たに劈開したマイカ（雲母）表面上でインキュベートし、乾燥させた。次いで、表面を２００μｌのｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、穏やかなＮ２流を用いて乾燥させた。測定は、Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ ３システム（ＪＰＫ ＢｉｏＡＦＭ（ジェイピーケー・バイオエーエフエム） － Ｂｒｕｋｅｒ Ｎａｎｏ ＧｍｂＨ（ブルカー・ナノ）、ドイツ）において、間欠接触モードで、２×２及び５×５μｍ、０．５～２Ｈｚのライン走査速度を用い、周囲条件下で、公称ばね定数２６Ｎ／ｍ、９±２ｎｍの平均先端半径、約３００ｋＨｚの共振周波数を持つシリコンカンチレバー及び先端（Ｏｌｙｍｐｕｓ（オリンパス） ＯＭＣＬ－ＡＣ１６０ＴＳ－Ｒ３）を用いて実施した。画像は、ＪＰＫデータ処理ソフトウェア（バージョンｓｐｍ－５．０．８４）を用いて処理した。図示の高さプロファイルについては、まず独立に、次いで限られたデータ範囲を使用して、各走査線から多項式調整を減算した。
試料はα－ｓｙｎモノマー濃度が１μＭになるように希釈して作製した。５μｌを新たに劈開したマイカ（雲母）表面上でインキュベートし、乾燥させた。次いで、表面を２００μｌのｄｄＨ２Ｏで３回洗浄し、穏やかなＮ２流を用いて乾燥させた。測定は、Ｎａｎｏｗｉｚａｒｄ ３システム（ＪＰＫ ＢｉｏＡＦＭ（ジェイピーケー・バイオエーエフエム） － Ｂｒｕｋｅｒ Ｎａｎｏ ＧｍｂＨ（ブルカー・ナノ）、ドイツ）において、間欠接触モードで、２×２及び５×５μｍ、０．５～２Ｈｚのライン走査速度を用い、周囲条件下で、公称ばね定数２６Ｎ／ｍ、９±２ｎｍの平均先端半径、約３００ｋＨｚの共振周波数を持つシリコンカンチレバー及び先端（Ｏｌｙｍｐｕｓ（オリンパス） ＯＭＣＬ－ＡＣ１６０ＴＳ－Ｒ３）を用いて実施した。画像は、ＪＰＫデータ処理ソフトウェア（バージョンｓｐｍ－５．０．８４）を用いて処理した。図示の高さプロファイルについては、まず独立に、次いで限られたデータ範囲を使用して、各走査線から多項式調整を減算した。
【0116】
円二色性（ＣＤ）分光法：
遠ＵＶ円二色性（ＣＤ）データは、Ｊａｓｃｏ Ｊ－１１００分光偏光計（Ｊａｓｃｏ（ジャスコ）、ドイツ）を使用して取得した。接種したアッセイからの試料複製物３５０μｌをプールし、１ｍｍの層厚を有する高精度石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ－Ｇｒｕｐｐｅ、ドイツ）に充填した。２０ｎｍ／分の走査速度、２６０ｎｍ～１９０ｎｍの遠ＵＶ波長で試料あたり５回の積算を採用した。ベースラインは、緩衝液の測定値だけを差し引くことによって補正した。
遠ＵＶ円二色性（ＣＤ）データは、Ｊａｓｃｏ Ｊ－１１００分光偏光計（Ｊａｓｃｏ（ジャスコ）、ドイツ）を使用して取得した。接種したアッセイからの試料複製物３５０μｌをプールし、１ｍｍの層厚を有する高精度石英キュベット（Ｈｅｌｌｍａ－Ｇｒｕｐｐｅ、ドイツ）に充填した。２０ｎｍ／分の走査速度、２６０ｎｍ～１９０ｎｍの遠ＵＶ波長で試料あたり５回の積算を採用した。ベースラインは、緩衝液の測定値だけを差し引くことによって補正した。
【0117】
α－シヌクレイン凝集の細胞アッセイ：
完全長Ａ５３Ｔ変異ヒトα－ｓｙｎをコードし、Ｃ末端でＹＦＰと融合した構築物を合成し、ｐＭＫ－ＲＱ発現ベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、米国）に導入した。α－ｓｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ構築物を、ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック）；タカラバイオ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、日本）中の制限部位ＮｈｅＩ（５’）及びＮｏｔＩ（３’）を使用してサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関））を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、５０単位／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）も添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）中で培養した。この細胞を５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で培養した。
完全長Ａ５３Ｔ変異ヒトα－ｓｙｎをコードし、Ｃ末端でＹＦＰと融合した構築物を合成し、ｐＭＫ－ＲＱ発現ベクター（ＧｅｎｅＡｒｔ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（サーモフィッシャーサイエンティフィック）、米国）に導入した。α－ｓｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ構築物を、ベクターｐＩＲＥＳｐｕｒｏ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（クロンテック）；タカラバイオ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ）、日本）中の制限部位ＮｈｅＩ（５’）及びＮｏｔＩ（３’）を使用してサブクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関））を、１０％ウシ胎仔血清（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）、５０単位／ｍｌペニシリン、及び５０μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）も添加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）中で培養した。この細胞を５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で培養した。
【0118】
ＤＭＥＭ中にプレーティングした細胞をＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（インビトロジェン）；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でトランスフェクトした。安定な細胞を、１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＤＭＥＭ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（メルクミリポア）、米国）中で選択した。モノクローナル細胞株は、ＭｏＦｌｏ ＸＤＰセルソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（ベックマン・コールター）、米国）を用いた９６ウェルプレートにおけるポリクローナル細胞集団の蛍光活性化セルソーティングによって作製した。クローン細胞株Ｂ５を最終的に２４のクローン細胞株から選択した。これを、αＳｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ細胞と命名する。
【0119】
ペプチドをＯｐｔｉＭＥＭ中１．５％Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００とともに室温で２時間インキュベートした。α－ｓｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ細胞を、０．１μｇ／ｍｌ Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）を用いてウェルあたり１０００細胞の密度で、ポリ－Ｄ－リシンコーティング（Ｇｒｅｉｎｅｒ（グライナー）、オーストリア）を有する３８４ウェルプレートにプレーティングし、予め調製したトランスフェクション混合物をウェル中の細胞に直接添加した。
【0120】
α－ｓｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ細胞へのα－ｓｙｎの細胞凝集の種を播く（播種する、ｓａｅｅｎ）ために、３０ｎＭの可溶性α－ｓｙｎ ＰＦＦオリゴマーをＯｐｔｉＭＥＭ中の１．５％Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅとともに室温で２時間インキュベートし、最初のトランスフェクションの３時間後に各ウェルに添加した。
【0121】
次いで、プレートを５％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７℃でインキュベートした。３日目に、ＩＮ Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６５００ＨＳシステム（Ｃｙｔｉｖａ、米国）において青色及び緑色蛍光チャネルを使用して細胞を画像化（イメージング）し、生細胞中の細胞内凝集体を特定するためのアルゴリズムを確立するために使用されていたＩＮ Ｃａｒｔａ Ｉｍａｇｅ Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア（Ｃｙｔｉｖａ、米国）によって分析した。各条件について４つのウェルを使用し、ゆがみを防止するために、ウェルあたり１６個の画像を記録し、完全自動化アルゴリズムによって分析した。統計分析は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びその後の多重比較のためのダネット（Ｄｕｎｎｅｔｔ）検定（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ（グラフパッド・ソフトウェア）、米国）を用いて行った。エラーバーは標準偏差を表す。
【0122】
細胞生存率アッセイ；ＣｅｌｌＧｌｏ試験：
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ（プロメガ）、ドイツ）を使用して、代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づいて、培養物中の生存細胞の数を決定した。
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ ＧｍｂＨ（プロメガ）、ドイツ）を使用して、代謝的に活性な細胞の指標である存在するＡＴＰの定量に基づいて、培養物中の生存細胞の数を決定した。
【0123】
細胞を３８４ウェルプレート中で３日間培養した後、３５μｌの培地をウェルから除去し、４０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ試薬を各ウェルに直接添加した。混合後、１０分後にＦｌｕｏｓｔａｒ（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を用いて発光を測定した。
【0124】
免疫蛍光細胞染色
３８４ウェルプレート上での３日間の細胞培養の後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）中で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した（それぞれ５分間続く）後、細胞をＰＢＳ中の０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で１０分間透過処理した。
３８４ウェルプレート上での３日間の細胞培養の後、細胞をＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％ホルムアルデヒド（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）中で１５分間固定した。ＰＢＳで３回洗浄した（それぞれ５分間続く）後、細胞をＰＢＳ中の０．２５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で１０分間透過処理した。
【0125】
さらにＰＢＳで５分間の洗浄を３回行った後、細胞を、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を含むＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）で３０分間ブロックした。この細胞を、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０を含むＰＢＳ中の１％ウシ血清アルブミン中８μｇ／ｍｌの濃度のＣＦ６３３（Ｂｉｏｔｉｕｍ（バイオティウム）、米国）蛍光標識抗体で、室温及び暗所で１～３時間染色した。抗α－ｓｙｎ抗体ｓｙｎ２１１（Ａｂｃａｍ（アブカム）、英国）を使用して、α－ｓｙｎ全体を検出した。
【0126】
抗凝集α－ｓｙｎ抗体５Ｇ４（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）を使用して、オリゴマーα－ｓｙｎ及び原線維α－ｓｙｎを検出した。組換え抗α－ｓｙｎ（ｐｈｏｓｐｈｏ Ｓ１２９）抗体ＥＰ１５３６Ｙ（Ａｂｃａｍ，英国）を使用して、セリン１２９でリン酸化されたα－ｓｙｎを検出した。それぞれ５分間続く、ＰＢＳ中でのその後の３回の洗浄の後、ＰＢＳ中の細胞を、ＩＮ－Ｃｅｌｌ Ａｎａｌｙｚｅｒ ６５００ＨＳシステム（Ｃｙｔｉｖａ、米国）を用いて４０×倍率で画像化した。
【0127】
細胞生存率アッセイ；ＭＴＴアッセイ：
ＳＶＤ－１、ＳＶＤ－１ａ又はＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（スクランブル）を添加することによってα－ｓｙｎ毒性からＰＣ１２細胞（Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ（ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ、ドイツ細胞バンク）、ドイツ）を救う可能性を、ＭＴＴ（３（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞生存率アッセイにおいて測定した。
ＳＶＤ－１、ＳＶＤ－１ａ又はＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ（スクランブル）を添加することによってα－ｓｙｎ毒性からＰＣ１２細胞（Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ（ライプニッツ研究所ＤＳＭＺ、ドイツ細胞バンク）、ドイツ）を救う可能性を、ＭＴＴ（３（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル）－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド）細胞生存率アッセイにおいて測定した。
【0128】
ＰＣ１２細胞（Ｌｅｉｂｎｉｚ－Ｉｎｓｔｉｔｕｔ ＤＳＭＺ、ドイツ）を、５％ウシ胎仔血清及び１０％ウマ血清を補充したＲＰＭＩ１６４０培地中、５％ＣＯ２を含む９５％に加湿した雰囲気中で、コラーゲンＡコーティング（Ｂｉｏｃｈｒｏｍ ＧｍｂＨ（バイオクロム）、ドイツ）組織培養フラスコで３７℃で培養した。１００μｌの体積のウェルあたり１０，０００個の細胞をコラーゲンＡコーティングした９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）に播種し、サーモサイクラー中、３７℃及び３００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。
【0129】
その後、３０ｎＭ α－ｓｙｎの最終濃度を、事前にインキュベーションをせずに、又は１５μＭ ＳＶＤ－１、ＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ若しくは０．５μＭ ＳＶＤ－１ａと事前にインキュベートした後のいずれかで、上記細胞に添加した。さらには、１５μＭのペプチド単独、細胞培地、ペプチドを含まない緩衝液及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００（細胞毒性化合物）を対照として使用した。５％ＣＯ２を含む９５％加湿雰囲気中で、３７℃で２４時間さらにインキュベートした後、Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｉ（ＭＴＴ）（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（ロシュ・アプライド・サイエンス）、スイス）を製造業者のプロトコルに従って使用して細胞の生存率を測定した。
【0130】
ＭＴＴ－ホルマザン生成物を、ＦｌｕｏｒｏＳｔａｒ Ｏｐｔｉｍａプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）において、６６０ｎｍでの吸光度を差し引くことによって補正した５７０ｎｍでの吸光度を測定することによって定量した。すべての結果を、培地中でのみ増殖させた未処理細胞に対して正規化した。有意性検定は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ（Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ）事後分析（ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ ２０２０、ＯｒｉｇｉｎＬａｂ、米国；ｎ＝４）によって行った。
【0131】
【0132】
図１：組換え完全長Ｌ－エナンチオマーα－ｓｙｎ及びＤ－エナンチオマー１６量体ペプチドを用いたチオフラビン－Ｔアッセイ。
【0133】
５０μＭのα－シヌクレイン（α－ｓｙｎ）を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で５０、１５０又は２５０μＭのＤ－ペプチドを伴って又は伴わずにインキュベートした。測定は、３７℃で２０分毎に３００ｒｐｍで３０秒間振盪しながら、非結合９６ウェルプレート中で行った。１つのホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３ｍｍ）を各ウェルに加えた。各条件の５つの複製物を、ボルツマンフィットに個別にフィッティングし、正規化し、平均を標準偏差（エラーバー）とともに計算した。Ｘ１／２及び遅延時間シフトは、ペプチドを含む試料と含まない試料との間の差を計算することによって決定した。時間シフトの有意性を、ウエルチのｔ検定を使用して２つの無作為試料が０．０５（有意：＊）であるか検定した。（Ａ）ＳＶＤ－１、（Ｂ）ＳＶＤ－６、（Ｃ）ＳＶＤ－１０、（Ｄ）ＳＶＤ－１４。
【0134】
図２：ＳＶＤ－１及びα－ｓｙｎのＭＳＴ測定。
【0135】
ＳＶＤ－１を１５９．５μＭ～１９ｎＭ及び３０ｎＭの１４０Ｃ－Ｃ２－Ａｌｅｘａ ６４７の濃度でインキュベートした。７０％のＬＥＤ出力；６０％ＭＳＴ出力。ＫＤは５５ｎＭと決定された。
【0136】
図３：野生型α－シヌクレイン及びＳＶＤ－１の多サイクルＳＰＲ実験。
【0137】
４００ＲＵのＳＶＤ－１を２Ｄ ＣＭＤセンサーチップ表面上に固定化した。野生型α－ｓｙｎを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中０．３９～１００ ０．１の濃度範囲で注入した。再生：２Ｍ Ｇｕａ－ＨＣｌ及び０．１％ＳＤＳ。ＫＤは、異種リガンド調整によって決定し、ＫＤ１は１２．５ｎＭであり、ＫＤ２は２．０μＭであった。
【0138】
図４：ＳＶＤ－１によるα－ｓｙｎオリゴマーの排除。
【0139】
５μＭのモノマー当量のオリゴマーを、ＳＶＤ－１を伴って又は伴わずに、９００ｒｐｍ及び３７℃で３日間インキュベートした。試料を２１，０００×ｇで遠心分離し、上清をＨＰＬＣ－ＳＥＣカラムにロードした。１５０及び２５０μＭのＳＶＤ－１濃度では、上清中のα－ｓｙｎオリゴマーを検出することはできなかった。
【0140】
図５：ＴｈＴアッセイにおけるα－ｓｙｎ凝集の準化学量論的阻害。
【0141】
２５μＭのモノマーα－ｓｙｎを２．５及び１２．５μＭ ＳＶＤ－１の準化学量論的な濃度のＳＶＤ－１とインキュベートした。測定は、３７℃で連続的に振盪しながら、非結合コーティングした９６ウェル中で行った。１ウェルあたり１つのホウケイ酸ビーズ（ｄ＝３ｍｍ）を加えた。各複製物を、ボルツマンシグモイドフィットを用いて調整し、平均値及び遅延時間を各条件について計算した。
【0142】
図６：ＳＶＤ－１の存在下及び不存在下でのα－ｓｙｎ凝集試料の勾配遠心分離。
【0143】
モノマーα－ｓｙｎを、高結合表面コーティングした９６ウェルプレート（ＣＯＲＮＩＮＧ（コーニング））中で、等モル濃度のＳＶＤ－１を伴って又は伴わずにインキュベートした。振盪なし、ガラスビーズなし、３７℃。９日後、三連の試料を合わせ、１００μｌをイオジキサノール勾配（５～５０％（ｗ／ｖ））に加えた。それぞれ１４０μｌの１５画分を、Ｚｏｒｂａｘ ３００ ＳＢ－Ｃ８カラムを使用するＲＰ－ＨＰＬＣによって分析し、α－ｓｙｎピークに積分した。ＳＶＤ－１の存在下では原線維形成（Ｆ６～Ｆ１２）は観察されなかった。
【0144】
図７：組換え完全長Ｌ－エナンチオマーα－ｓｙｎ及びＤ－エナンチオマーＳＶＤ－１ａを用いたチオフラビン－Ｔアッセイ。
【0145】
２０μＭのα－ｓｙｎを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、準化学量論的濃度のＳＶＤ－１ａを伴って又は伴わずにインキュベートした。測定は、４００ｒｐｍ及び３７℃で連続的に振盪しながら、非結合コーティングした９６ウェルプレート中で行った。１ウェルあたり１つのホウケイ酸ビーズ（ｄ＝３ｍｍ）を加えた。各条件について、５つの複製物の平均値及び標準誤差を計算した。
【0146】
図８：野生型α－ｓｙｎ及びＳＶＤ－１ａ、ＳＶＤ－６ａ又はＳＶＤ－１０ａの単サイクルＳＰＲ実験。
【0147】
各ペプチドをＣＭ５センサーチップ表面に固定化した。野生型α－ｓｙｎを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４、０．００５％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ－２０中３０～５００ｎＭの濃度範囲で注入した。再生は、２Ｍ Ｇｕａ－ＨＣｌで２×３０秒間、各サイクル後に行った。ＫＤは、１：１結合モデルフィットを用いて、以下のように決定した：ＳＶＤ－１ａ：１５．７ｎＭ；ＳＶＤ－６ａ：１４．０ｎＭ；ＳＶＤ－１０ａ：１２．３ｎＭ。
【0148】
図９：
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄを用いたデノボＴｈＴアッセイ及び播種ＴｈＴアッセイ。
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄを用いたデノボＴｈＴアッセイ及び播種ＴｈＴアッセイ。
【0149】
両アッセイは、ｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝系中で行った。ＴｈＴ蛍光の経過を、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍで９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）において測定した。ペプチド配列は、一文字アミノ酸コードとして灰色で示される。
【0150】
（Ａ）ＳＶＤ－１及びＳＶＤ １＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄを用いたデノボ凝集アッセイ。１０μＭのα－ｓｙｎモノマーを、５、１０及び２０μＭのペプチドとともに、１ウェルあたり１つのホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３．０ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）を添加し、測定間に３００ｒｐｍで連続的に振盪して、３７℃でインキュベートした。平均データ±ＳＤ（ｎ＝５）を報告する。
【0151】
（Ｂ）播種された凝集のために、５０ｎＭのモノマー当量のＰＦＦオリゴマーを、ペプチドを伴って又は伴わずに、静止条件下、３７℃で２０時間、シード（種）としてプレインキュベートした。その後ではじめて、播種を誘導するために２０μＭのα－ｓｙｎモノマーを添加した。平均データ±ＳＤ（ｎ＝３）を報告する。
【0152】
図１０：
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを用いたα－ｓｙｎのＭＳＴ測定。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中２５℃でのＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａと完全長α－ｓｙｎとの相互作用のＭＳＴ測定。
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを用いたα－ｓｙｎのＭＳＴ測定。ＰＢＳ、ｐＨ７．４中２５℃でのＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａと完全長α－ｓｙｎとの相互作用のＭＳＴ測定。
【0153】
α－ｓｙｎを５０μＭ～１ｐＭの連続希釈系列で希釈し、最終濃度１００ｎＭのフルオロフォア標識ペプチド（Ａｌｅｘａ ６４７ Ｃ２）と混合した。実験は個々の測定として行った。ＫＤは、ＳＶＤ－１については１７０ｎＭ±１００ｎＭであり、ＳＶＤ－１ａについては３９０ｎＭ±１５０ｎＭであると決定された。
【0154】
図１１：
α－ｓｙｎ並びに固定化ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを用いた動態学的単サイクルアッセイ。
α－ｓｙｎ並びに固定化ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを用いた動態学的単サイクルアッセイ。
【0155】
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａを、飽和までのアミノカップリングによってカルボキシルデキストランマトリクス（ＣＭＤ２００Ｍ、Ｘａｎｔｅｃ、ドイツ）上に固定化した。α－ｓｙｎを、３０～５００ｎＭの連続希釈で、ＰＢＳ７．４中、３０μｌ／分で１００秒間注入し、続いて６０分又は３０分の解離時間を設けた。実験は個々の測定として行った。相互作用動態は、動態学的１：１相互作用モデルを使用して調整した：ＳＶＤ－１：ＫＤ：８８０ｐＭ、Ｋｏｎ：６．５６×１０４Ｍ－１ｓ－１、Ｋｏｆｆ：５．７８ｓ－１×１０－５；ＳＶＤ－１ａ：ＫＤ：１００ｐＭ、Ｋｏｎ：３．１３×１０５Ｍ－１ｓ－１、Ｋｏｆｆ：３．１３×１０－５ｓ－１。
【0156】
図１２：
ＳＶＤ－１ａ（同位体標識されていない）との相互作用における１５Ｎ標識α－ｓｙｎのＮＭＲ分析。
ＳＶＤ－１ａ（同位体標識されていない）との相互作用における１５Ｎ標識α－ｓｙｎのＮＭＲ分析。
【0157】
（Ａ）等モル量のＳＶＤ－１ａの存在下（赤色）及び不存在下（黒色）における２５μＭ １５Ｎ－α－ｓｙｎの二次元１Ｈ－１５Ｎ－ＨＳＱＣスペクトルの重ね合わせ。
【0158】
（Ｂ）ＳＶＤ－１ａ（１３０Ｅ、１２９Ｓ、１２６Ｅ、１２２Ｎ、１１９Ｄ、６５Ｎ）の存在下（赤色）及び不存在下（黒色）の残基について小さな化学変化を示す（Ａ）に示されるスペクトルにおける多数の共鳴の拡大。比較のために、化学シフトの変化を示さない７７Ｖ共鳴を示す。
【0159】
（Ｃ）ＳＶＤ－１ａの不存在下と比較して、ＳＶＤ－１ａの存在下における１５Ｎ α－ｓｙｎのスペクトルにおける残基特異的絶対ＮＭＲ化学シフトの変化。観察された化学シフトの変化の分布の標準偏差σ及び２倍の標準偏差２σを破線で示す。
【0160】
（Ｄ）常磁性標識ＳＶＤ－１ａの存在下での１５Ｎ α－ｓｙｎのＮＭＲ ＰＲＥ強度比。これは、反磁性試料と比較した常磁性試料の二次元１Ｈ－１５Ｎ ＮＭＲスペクトルにおけるクロスピーク強度の残基特異的強度比Ｉｐａｒａ／Ｉｄｉａを示す。Ｉｐａｒａ／Ｉｄｉａ強度比が低いほど、常磁性標識ＳＶＤ－１ａは対象とするα－ｓｙｎ残基に近接している。１の強度は、相互作用の欠如を示す。データは、残りのＮ末端領域の残基に対する平均効果と比較して、α－ｓｙｎのＣ末端領域の残基とのＳＶＤ－１ａのいくらかより顕著な（一過性の）結合相互作用を示唆する。
【0161】
図１３：
漸増濃度のＳＶＤ－１ａとのインキュベーション後のモノマーα－ｓｙｎのサイズ排除クロマトグラフィー。
漸増濃度のＳＶＤ－１ａとのインキュベーション後のモノマーα－ｓｙｎのサイズ排除クロマトグラフィー。
【0162】
１０μＭのα－ｓｙｎモノマーを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中の０、５、１０、２０、４０及び８０μＭのＳＶＤ－１ａとともに、３７℃及び３００ｒｐｍで２時間インキュベートした。ＳＥＣは、Ｂｉｏ ＳＥＣ－３カラム（１５０Å、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）を用いて１ｍｌ／分で、移動相としてＰＢＳ、ｐＨ７．４を用いて行った。試料を２０，８００×ｇで５分間遠心分離した後、上清を注入した。タンパク質はＡ２１４で検出した。α－ｓｙｎモノマーは保持時間６．９１分後に溶出した。１０μＭのα－ｓｙｎ試料についてα－ｓｙｎモノマーのピーク面積を積分し、１００％に設定した。モノマーα－ｓｙｎの濃度は、漸増濃度のＳＶＤ－１ａの存在下で減少しなかった。ＳＶＤ－１ａ自体は、ＳＥＣの精製及び再生手順の間にのみ溶出され、これはおそらくその高い正味正電荷に起因する。
【0163】
図１４：
ＳＶＤ－１ａ及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＋５ｒとのモノマーα－ｓｙｎのチオフラビン－Ｔデノボ凝集。
ＳＶＤ－１ａ及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＋５ｒとのモノマーα－ｓｙｎのチオフラビン－Ｔデノボ凝集。
【0164】
実験は、ＰＢＳ緩衝系、ｐＨ７．４中で行った。ＴｈＴ蛍光の経過を、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍで９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）において測定した。１０μＭのα－ｓｙｎモノマーを、５、１０及び２０μＭのペプチドとともに、１ウェルあたり１つのホウケイ酸ガラスビーズ（ｄ＝３．０ｍｍ、Ｈｉｌｇｅｎｂｅｒｇ、ドイツ）を添加し、測定間に３００ｒｐｍでプレートを連続的に振盪して、３７℃でインキュベートした。データを平均±ＳＤ（ｎ＝５）として報告する。使用したペプチドのアミノ酸配列を灰色のテキストで示す。
【0165】
図１５：
ＴｈＴ、ＤＧＣ、ＣＤ及びＡＦＭを用いた、ＳＶＤ－１ａの存在下及び不存在下でのα－ｓｙｎのデノボ凝集分析。
ＴｈＴ、ＤＧＣ、ＣＤ及びＡＦＭを用いた、ＳＶＤ－１ａの存在下及び不存在下でのα－ｓｙｎのデノボ凝集分析。
【0166】
（Ａ）２０μＭのＳＶＤ－１ａを伴う又は伴わない１０μＭのα－ｓｙｎのデノボＴｈＴアッセイ。ＴｈＴ蛍光の経過を、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍで９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）において、測定間に３００ｒｐｍでプレートを連続的に振盪しながら測定した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝５）として報告する。
【0167】
（Ｂ）デノボ凝集体試料のＣＤ二次構造分析。試料を、いかなるＴｈＴも添加せずに（ｎ＝３）（Ａ）に記載のようにインキュベートし、続いてＣＤ分析のためにプールした。この試料の遠ＵＶ楕円率を、Ｊ－１１００ ＣＤ分光計（Ｊａｓｃｏ、ドイツ）において石英キュベット（ｌ＝１０ｍｍ）中で測定した。（Ａ）に加えて、２０μＭのＳＶＤ－１ａのみを含む試料を同じ条件下でインキュベートし、その後、α－ｓｙｎ及びＳＶＤ－１ａを含む試料の参照として使用した。これらの試料（α－ｓｙｎ＋ＳＶＤ－１ａ（インキュベーション後））について、ＳＶＤ－１ａ参照から差し引いたＣＤスペクトルを示す。
【0168】
（Ｃ）（Ａ）からの試料をインキュベーションの直後に単離し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中で希釈して、１μＭのα－ｓｙｎモノマー当量の最終濃度にした。５μｌの希釈試料をインキュベートし、新たに劈開したマイカ表面上で乾燥させ、その後ｄｄＨ２Ｏで洗浄し、穏やかなＮ２流を用いて乾燥させた。分析は、ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ ３システム（Ｊ－１１００、ＪＰＫ ＢｉｏＡＦＭ、米国）を用いて行い、複数の表面切片を記録した。（Ｃ）に示す切片は、すべての表面切片において特定した観察したタイプの代表である。
【0169】
図１６：
ＳＶＤ－１ａ及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＋５ｒをシードとして用いたＴｈＴアッセイ。
ＳＶＤ－１ａ及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ＋５ｒをシードとして用いたＴｈＴアッセイ。
【0170】
ＴｈＴ蛍光の経過を、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍで９６ウェルハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）において測定した。Ｄ－ペプチド配列は、一文字アミノ酸コードとして灰色で示す。５０ｎＭのモノマー当量のＰＦＦオリゴマーを、ペプチドを伴って又は伴わずに、３７℃で、静止条件下で、シードとして２０時間プレインキュベートした。その後ではじめて、播種を誘導しα－ｓｙｎモノマーとのインキュベーション時間を開始するために、２０μＭのα－ｓｙｎモノマーを添加した。平均データ±ＳＤ（ｎ＝３）を報告する。
【0171】
図１７：
ＳＶＤ－１ａは、ＰＦＦオリゴマーをα－ｓｙｎモノマーに分解する。
ＳＶＤ－１ａは、ＰＦＦオリゴマーをα－ｓｙｎモノマーに分解する。
【0172】
ＰＦＦオリゴマーを上記のように生成した。１００ｎＭのモノマー当量のＰＦＦオリゴマーを、４００ｎＭ及び１６００ｎＭ ＳＶＤ－１ａを伴って又は伴わずに、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、３７℃で３日間インキュベートした。
【0173】
（Ａ）ＨＰＬＣ－ＳＥＣ測定試料をＢｉｏ ＳＥＣ－３カラム（３００Å、Ａｇｉｌｅｎｔ、米国）に注入した。ＰＦＦオリゴマーは約５分後に溶出し、α－ｓｙｎモノマーは約８．６分後に検出された。
【0174】
（Ｂ）４００ｎＭ ＳＶＤ－１ａの存在下（赤色）及び不存在下（黒色）における１００ｎＭ ＰＦＦオリゴマーを用いた時間依存性ＤＬＳ測定。ＳｐｅｃｔｒｏＳｉｚｅ ３００ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ＸｔａｌＣｏｎｃｅｐｔｓ、ドイツ）において、１ｍｌの試料を、密封石英キュベット中で、３７℃で３０秒毎に２４時間、静止条件下で連続的に測定した。データは半径図として示され、各粒子の信号振幅はデータ点の直径によって表される。
【0175】
（Ｃ）ＡＦＭ分析のために、５μｌの（Ａ）に記載の試料を遠心分離前に取り出し、インキュベートし、新たに劈開したマイカ表面上で乾燥させ、続いてｄｄＨ２Ｏで洗浄し、穏やかなＮ２流を用いて乾燥させた。分析は、ＮａｎｏＷｉｚａｒｄ ３システム（Ｊ－１１００、ＪＰＫ ＢｉｏＡＦＭ、米国）を用いて行い、複数の表面切片を記録した。Ｃに示す切片は、すべての表面切片において特定した観察したタイプ及び粒子密度の代表である。
【0176】
図１８：
ＴｈＴアッセイ及びＣＤ分光法によるＳＶＤ－１ａの存在下及び不存在下での凝集アッセイの分析。
ＴｈＴアッセイ及びＣＤ分光法によるＳＶＤ－１ａの存在下及び不存在下での凝集アッセイの分析。
【0177】
５００ｎＭ α－ｓｙｎ ＰＦＦを、ＰＢＳ、ｐＨ７．４中、１５μＭ α－ｓｙｎモノマー及び／若しくは３０μＭ ＳＶＤ－１ａを伴って又は伴わずに、静止条件下、３７℃で２４時間インキュベートした。
【0178】
（Ａ）ＴｈＴ蛍光の経過を、Ｆｌｕｏｒｏｓｔａｒプレートリーダー（ＢＭＧ ｌａｂｔｅｃｈ、ドイツ）を使用して、λｅｘ＝４４８ｎｍ及びλｅｍ＝４８２ｎｍで９６ウェル非結合ハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）において測定した。データを平均±ＳＤ（ｎ＝３）として報告する。矢印は、ＣＤ分光法によって分析した時間点を示す。
【0179】
（Ｂ）（Ａ）に示す試料を、ＴｈＴを添加しない同じ条件下でインキュベートした。各条件についての３つの複製物（各１２０μｌ）をプールし、０時間（ｈ）、２時間、８時間及び２４時間の時間点でＣＤ分光法によって測定した。遠ＵＶ楕円率を、Ｊ－１１００ ＣＤ分光計（Ｊａｓｃｏ、ドイツ）において石英キュベット（ｌ＝１０ｍｍ）中で測定した。（ｄ）について示したデータは、対応する時間点について（ｃ）によって差し引からた。
【0180】
図１９：
ＳＶＤ－１ａは、細胞における播種されたα－ｓｙｎの凝集を阻害する。
ＳＶＤ－１ａは、細胞における播種されたα－ｓｙｎの凝集を阻害する。
【0181】
細胞におけるＳＶＤ－１ａの阻害効果を検証するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＹＦＰと融合した、家族性Ａ５３Ｔ変異を有するヒトα－ｓｙｎを安定的に発現するα－ｓｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ細胞系を使用し、凝集体の蛍光に基づく検出は、ＰＦＦオリゴマーを播種した後の細胞内におけるバックグラウンドに対する細胞内の強い蛍光スポットを明確に示すことを可能にした。ペプチドがＰＦＦオリゴマーの同化を妨害するのを防ぐために、ペプチドによる第１のトランスフェクション及びＰＦＦオリゴマーによる第２のトランスフェクションから開始する２段階トランスフェクションを行った。ＳＶＤ－１ａは、用量依存的にαＳｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ細胞におけるα－ｓｙｎ凝集を阻害したが、陰性対照由来のペプチド（ｋｇｖｇｎｌｅｙｑｌｗａｌｅｇｋ－ＮＨ２）は阻害しなかった（Ａ）。本発明者らの画像において凝集体を有する細胞の数を定量化し、実験的なゆがみを防止するために、画像分析のための完全自動化アルゴリズムを使用した。有意性は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びその後の多重比較のためのダネット検定を使用して計算した。１つのアスタリスクは０．０５未満のｐ値を表し、３つのアスタリスクは０．００１未満のｐ値を表す。エラーバーは標準偏差を表す。播種後３日目にα－ｓｙｎ凝集体を全く有さなかった播種されていない細胞（Ｂ～Ｅ）とは対照的に、可溶性α－ｓｙｎ－ＰＦＦオリゴマーの播種は、α－ｓｙｎに結合しない陰性対照由来のペプチド（２５μＭ）で処理した細胞の８５％において凝集をもたらした（Ｆ～Ｉ）。漸増濃度のＳＶＤ－１ａ、この場合２５μＭでの処理は、凝集物を有する細胞の数の濃度依存的減少をもたらした（Ｊ～Ｍ）。パネルＢ、Ｅ及びＨは、Ｈｏｅｃｈｓｔ ３３３４２で染色した核を示す。パネルＣ、Ｆ及びＩはαＳｙｎＡ５３Ｔ－ＹＦＰ蛍光を示す。パネルＤ、Ｇ及びＪは合成画像を示す。Ｌのスケールバーは１００μｍに相当し、パネルＢ～Ｄ、Ｆ～Ｈ及びＪ～Ｌに当てはまる。パネルＥ、Ｉ及びＭは、Ｄ、Ｈ及びＬの囲まれた部分の拡大を示す。Ｍのスケールバーは、パネルＥ、Ｉ及びＭに適用され、２５μＭに相当する。
【0182】
図２０：
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａは、ＰＦＦオリゴマーシードを用いたＭＴＴアッセイにおいて細胞生存率を増加させる。
ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１ａは、ＰＦＦオリゴマーシードを用いたＭＴＴアッセイにおいて細胞生存率を増加させる。
【0183】
ＳＶＤ－１、ＳＶＤ１ａ、ＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄを、３０ｎＭ ＰＦＦオリゴマーを伴って又は伴わずに、３７℃及び３００ｒｐｍで一晩インキュベートし、続いて、１５μＭ（ＳＶＤ－１及びＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄ）又は０．５μＭ（ＳＶＤ－１ａ）の最終濃度でＰＣ１２細胞とともにインキュベートした。３０ｎＭ ＰＦＦオリゴマーのみを伴う細胞の生存率は５０％に低下したが、細胞の８９又は８２％をＳＶＤ－１又はＳＶＤ－１ａの存在下で救うことができた。１５μＭの対照ペプチドＳＶＤ－１＿ｓｃｒａｍｂｌｅｄでも細胞生存率救済効果のわずかな増加が観察された。有意性検定は、一元配置ＡＮＯＶＡ及びボンフェローニ事後分析によって行った：＊ｐ≦０．５、＊＊＊ｐ≦０．０１。平均値を±ＳＤ（ｎ＝４）とともに記載する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【配列表】
【国際調査報告】