特表 2024-510838 Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-11

(54)【発明の名称】Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 1/20 20060101AFI20240304BHJP

   C12P 13/08 20060101ALI20240304BHJP

   C12P 13/06 20060101ALI20240304BHJP

   C12N 15/31 20060101ALN20240304BHJP

   C12N 1/21 20060101ALN20240304BHJP

【ＦＩ】

C12N1/20 A

C12P13/08 C

C12P13/06 C

C12N15/31 ZNA

C12N1/21

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558681

(86)(22)【出願日】2022-04-14

(85)【翻訳文提出日】2023-09-22

(86)【国際出願番号】 KR2022005385

(87)【国際公開番号】W WO2022225254

(87)【国際公開日】2022-10-27

(31)【優先権主張番号】10-2021-0051233

(32)【優先日】2021-04-20

(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】513178894

【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダン コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100136629

【弁理士】

【氏名又は名称】鎌田 光宜

(74)【代理人】

【識別番号】100080791

【弁理士】

【氏名又は名称】高島 一

(74)【代理人】

【識別番号】100125070

【弁理士】

【氏名又は名称】土井 京子

(74)【代理人】

【識別番号】100121212

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 弥栄子

(74)【代理人】

【識別番号】100174296

【弁理士】

【氏名又は名称】當麻 博文

(74)【代理人】

【識別番号】100137729

【弁理士】

【氏名又は名称】赤井 厚子

(74)【代理人】

【識別番号】100152308

【弁理士】

【氏名又は名称】中 正道

(74)【代理人】

【識別番号】100201558

【弁理士】

【氏名又は名称】亀井 恵二郎

(72)【発明者】

【氏名】チェ、ウソン

(72)【発明者】

【氏名】ジャン、ジェウォン

(72)【発明者】

【氏名】ベク、ミナ

(72)【発明者】

【氏名】イ、クワン ウ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE07

4B064AE10

4B064CA02

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA11

4B064DA20

4B065AA24X

4B065AC14

4B065BA02

4B065BA22

4B065CA17

4B065CA43

4B065CA44

4B065CA50

(57)【要約】

本出願は、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物。

【請求項2】

前記コリネバクテリウム属微生物は、Ｌ－アミノ酸を生産するものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。

【請求項3】

前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。

【請求項4】

前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－トレオニン及びＬ－イソロイシンから選択される少なくとも１つである、請求項２に記載のコリネバクテリウム属微生物。

【請求項5】

前記微生物は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されていない微生物に比べてＬ－アミノ酸生産能が向上したものである、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。

【請求項6】

請求項１～５のいずれか一項に記載のコリネバクテリウム属微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アミノ酸製造方法。

【請求項7】

前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項６に記載の製造方法。

【請求項8】

前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－トレオニン及びＬ－イソロイシンから選択される少なくとも１つである、請求項６に記載の製造方法。

【請求項9】

前記製造方法は、前記微生物又は培地からＬ－アミノ酸を回収するステップをさらに含む、請求項６に記載の製造方法。

【請求項10】

請求項１～５のいずれか一項に記載の微生物、それを培養した培地、又はそれらの組み合わせを含むＬ－アミノ酸生産用組成物。

【請求項11】

前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－トレオニン及びＬ－イソロイシンから選択される少なくとも１つである、請求項１０に記載のＬ－アミノ酸生産用組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本出願は、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いたＬ－アミノ酸の生産方法に関する。

【背景技術】

【0002】

Ｌ－アミノ酸は、動物飼料、医薬品及び化粧品産業などに用いられており、主にコリネバクテリウム属菌株やエシェリキア属菌株を用いた発酵により生産されている。Ｌ－アミノ酸の生産のために、高効率生産菌株、発酵工程技術開発などの様々な研究が行われている。

【0003】

具体的には、Ｌ－アミノ酸生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質に特異的なアプローチが主に用いられている（特許文献１）。

【先行技術文献】

【特許文献】

【0004】

【特許文献1】米国特許第８０４８６５０号明細書

【特許文献2】韓国登録特許第１０－２１２６９５１号公報

【特許文献3】米国特許第１０５９０４４６号明細書

【特許文献4】韓国登録特許第１０－１３３５７８９号公報

【特許文献5】韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報

【非特許文献】

【0005】

【非特許文献1】Pearson et al (1988) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85]: 2444

【非特許文献2】Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276-277

【非特許文献3】Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453

【非特許文献4】Devereux, J., et al, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)

【非特許文献5】Atschul, [S.] [F.,] [ET AL, J MOLEC BIOL 215]: 403 (1990)

【非特許文献6】Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego,1994

【非特許文献7】[CARILLO ETA/.](1988) SIAM J Applied Math 48: 1073

【非特許文献8】Smith and Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2:482

【非特許文献9】Schwartz and Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, National Biomedical Research Foundation, pp. 353-358 (1979)

【非特許文献10】Gribskov et al(1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745

【非特許文献11】J. Sambrook et al.,Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989

【非特許文献12】F.M. Ausubel et al.,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York, 9.50-9.51, 11.7-11.8

【非特許文献13】Nakashima N et al., Bacterial cellular engineering by genome editing and gene silencing. Int J Mol Sci. 2014;15(2):2773-2793

【非特許文献14】Sambrook et al. Molecular Cloning 2012

【非特許文献15】Weintraub, H. et al., Antisense-RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews - Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986

【非特許文献16】"Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)

【非特許文献17】Appl. Microbiol. Biotecenol.(1999) 52:541-545

【非特許文献18】Moore, S., Stein, W. H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0006】

本出願人は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－アミノ酸生産能が向上することを確認し、発明を完成するに至った。

【課題を解決するための手段】

【0007】

本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。

【0008】

また、本出願は、前記微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アミノ酸製造方法を提供することを目的とする。

【0009】

さらに、本出願は、前記微生物、それを培養した培地、又はそれらの組み合わせを含むＬ－アミノ酸製造用組成物を提供することを目的とする。

【0010】

さらに、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化させるステップを含む、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物の製造方法を提供することを目的とする。

【0011】

さらに、本出願は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－アミノ酸生産用途を提供することを目的とする。

【発明の効果】

【0012】

本出願の微生物を用いると、Ｌ－アミノ酸を高効率で生産することができる。

【発明を実施するための形態】

【0013】

以下、これらを具体的に説明する。なお、本出願で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本出願で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本出願に含まれる。また、以下の具体的な記述に本出願が限定されるものではない。

【0014】

また、当該技術分野における通常の知識を有する者であれば、通常の実験のみを用いて本出願に記載された本出願の特定の態様の多くの等価物を認識し、確認することができるであろう。さらに、その等価物も本出願に含まれることが意図されている。

【0015】

本出願の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属（the genus of Corynebacterium）微生物を提供する。

【0016】

本出願のタンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するものであってもよく、前記アミノ酸配列を含むものであってもよく、前記アミノ酸配列から実質的に構成される（essentially consisting of）ものであってもよい。

【0017】

本出願における「配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質」とは、ＡＢＣ－Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｅｒｍｅａｓｅ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ活性を有するタンパク質であって、ＮＣＢＩ ｎｕｍｂｅｒがＮＣｇｌ１９１７であるものを意味する。

【0018】

本出願において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質は、菌株の内在性タンパク質であるが、これに限定されるものではない。

【0019】

前記ＮＣｇｌ１９１７タンパク質のアミノ酸配列は、公知のデータベースである米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH GenBank）から得られる。例えば、前記ＮＣｇｌ１９１７のアミノ酸配列情報は、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ＷＰ＿００６２８４２１１などで確認されるが、これらに限定されるものではない。例えば、前記ＮＣｇｌ１９１７タンパク質は、コリネバクテリウム属由来のＡＢＣ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｐｅｒｍｅａｓｅ活性を有するタンパク質であるが、これに限定されるものではない。

【0020】

本出願において、前記ＮＣｇｌ１９１７タンパク質のアミノ酸配列は、配列番号１で表されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％又は９９．９％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列を含むものであってもよい。また、そのような相同性又は同一性を有し、本出願のタンパク質に相当する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質も本出願に含まれることは言うまでもない。

【0021】

例えば、アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端及び／又は内部に、本出願のタンパク質の機能を変更しない配列の付加もしくは欠失、自然に発生し得る突然変異、非表現突然変異（silent mutation）又は保存的置換を有するものが挙げられる。

【0022】

本出願における「保存的置換（conservative substitution）」とは、あるアミノ酸が類似した構造的及び／又は化学的性質を有する他のアミノ酸に置換されることを意味する。前記タンパク質は、少なくとも１つの生物学的活性を依然として有する状態で、例えば少なくとも１つの保存的置換を有する。このようなアミノ酸置換は、一般に残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（amphipathic nature）における類似性に基づいて発生し得る。例えば、電荷を帯びた側鎖（electrically charged amino acid）を有するアミノ酸のうち正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられ、負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、グルタミン酸及びアスパラギン酸が挙げられ、電荷を帯びていない側鎖（uncharged amino acid）を有するアミノ酸のうち非極性アミノ酸（nonpolar amino acid）としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン及びプロリンが挙げられ、極性（polar）又は親水性（hydrophilic）アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられ、前記アミノ酸のうち芳香族アミノ酸としては、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンが挙げられる。

【0023】

本出願における「相同性（homology）」又は「同一性（identity）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列又は塩基配列が類似する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば互換的に用いられる。

【0024】

保存されている（conserved）ポリヌクレオチド又はタンパク質の配列相同性又は同一性は標準配列アルゴリズムにより決定され、用いられるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に用いられてもよい。実質的には、相同性を有するか（homologous）又は同じ（identical）配列は、中程度又は高いストリンジェントな条件（stringent conditions）下において、一般に配列全部又は一部分とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーションには、ポリヌクレオチドにおいて一般のコドン又はコドン縮退を考慮したコドンを有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることは言うまでもない。

【0025】

任意の２つのポリヌクレオチド又はタンパク質配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、例えば非特許文献１のようなデフォルトパラメーターと「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの公知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, 非特許文献２）（バージョン５．０．０又はそれ以降のバージョン）で行われるように、ニードルマン＝ウンシュ（Needleman-Wunsch）アルゴリズム（非特許文献３）を用いて決定することができる（ＧＣＧプログラムパッケージ（非特許文献４）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（非特許文献５、６及び７）を含む）。例えば、国立生物工学情報センターのＢＬＡＳＴ又はＣｌｕｓｔａｌ Ｗを用いて相同性、類似性又は同一性を決定することができる。

【0026】

ポリヌクレオチド又はタンパク質の相同性、類似性又は同一性は、例えば非特許文献８に開示されているように、非特許文献３などのＧＡＰコンピュータプログラムを用いて、配列情報を比較することにより決定することができる。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列のうち短いものにおける記号の総数で、類似する配列記号（すなわち、ヌクレオチド又はアミノ酸）の数を割った値と定義している。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメーターは、（１）二進法比較マトリックス（同一性は１、非同一性は０の値をとる）及び非特許文献９に開示されているように、非特許文献１０の加重比較マトリックス（又はＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）と、（２）各ギャップに３．０のペナルティ、及び各ギャップの各記号に追加の０．１０ペナルティ（又はギャップオープンペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）と、（３）末端ギャップに無ペナルティとを含む。

【0027】

本出願において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドをＮｃｇｌ１９１７遺伝子ともいう。

【0028】

本出願における「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチド単量体（monomer）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（polymer）であって、所定の長さより長いＤＮＡ又はＲＮＡ鎖を意味する。具体的には、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド断片である。

【0029】

本出願のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列を含むものであってもよい。本出願の一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列を有するものであってもよく、配列番号２の配列を含むものであってもよい。また、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列からなるものであってもよく、配列番号２の配列から実質的に構成されるものであってもよい。

【0030】

本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退（degeneracy）により、又は本出願のタンパク質を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮して、本出願のタンパク質のアミノ酸配列が変化しない範囲でコード領域に様々な改変を行うことができる。

【0031】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び１００％未満の塩基配列を有するものであるか、前記塩基配列を含むものであるか、又は配列番号２の配列と相同性もしくは同一性が７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上及び１００％未満の塩基配列からなるものであるか、前記塩基配列から実質的に構成されるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0032】

また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば本出願のポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列であればいかなるものでもよい。前記「ストリンジェントな条件（stringent condition）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（非特許文献１１、１２参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性もしくは同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上もしくは９９％以上の相同性もしくは同一性を有するポリヌクレオチド同士をハイブリダイズし、それより相同性もしくは同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーション（southern hybridization）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回～３回洗浄する条件が挙げられる。

【0033】

ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本出願のポリヌクレオチドには、実質的に類似する核酸配列だけでなく、全配列に相補的な単離された核酸フラグメントが含まれてもよい。

【0034】

具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性又は同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検出することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節される。

【0035】

前記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーはポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当該技術分野で公知である（例えば、非特許文献１１）。

【0036】

本出願における「微生物（又は、菌株）」とは、野生型微生物や自然に又は人為的に遺伝的改変が行われた微生物が全て含まれるものであり、外部遺伝子が挿入されるか、内在性遺伝子の活性が強化又は不活性化されるなどの原因により、特定機序が弱化又は強化された微生物であって、目的とするポリペプチド、タンパク質又は産物の生産のために遺伝的改変（modification）が行われた微生物である。

【0037】

本出願の微生物は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された微生物であってもよく、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現が弱化された微生物であってもよく、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されるようにベクターにより遺伝的に改変された微生物（例えば、組換え微生物）であってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0038】

一例として、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性弱化は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド、又は配列番号２のポリヌクレオチドの発現弱化である。他の例として、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性弱化は、前記ポリヌクレオチド配列の改変、例えばヌクレオチドの挿入、欠失又は置換によるものである。しかし、これらに限定されるものではない。

【0039】

本出願の微生物は、Ｌ－アミノ酸生産能を有する微生物であってもよい。

【0040】

本出願の微生物は、自然にＬ－アミノ酸生産能を有する微生物であってもよく、Ｌ－アミノ酸生産能のない親株に、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されてＬ－アミノ酸生産能が付与された微生物であってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0041】

一例として、本出願の微生物は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されるようにベクターにより形質転換され、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された菌株又は微生物であってもよい。前記微生物は、本出願の目的上、天然の野生型微生物、又はＬ－アミノ酸を生産する微生物において、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化され、非改変微生物（例えば、天然の野生型微生物、又は配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が改変されていない微生物）に比べてＬ－アミノ酸生産能が向上した微生物であるが、これらに限定されるものではない。

【0042】

例えば、前記Ｌ－アミノ酸生産能が向上したか否かを比較する対象菌株である非改変微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ（特許文献２）、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ（特許文献３）又はＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献４）であるが、これらに限定されるものではない。

【0043】

一例として、前記生産能が向上した菌株は、変異前の親株又は非改変微生物のＬ－アミノ酸生産能に比べて、約１％以上、具体的には約１％以上、約２．５％以上、約５％以上、約６％以上、約７％以上、約８％以上、約９％以上、約１０％以上、約１０．５％以上、約１１％以上、約１１．５％以上、約１２％以上、約１２．５％以上、約１３％以上、約１３．５％以上、約１４％以上、約１４．５％以上、約１５％以上、約１５．５％以上、約１６％以上、約１６．５％以上、約１７％以上、約１７．５％以上、約１８％以上、約１８．５％以上、約１９％以上、約１９．５％以上、約２０％以上、約２０．５％以上、約２１％以上、約２１．５％以上、約２２％以上、約２２．５％以上、約２３％以上、約２３．５％以上、約２４％以上、約２４．５％以上、約２５％以上、約２５．５％以上、約２６％以上、約２６．５％以上、約２７％以上、約２７．５％以上、約２８％以上、約２８．５％以上、約２９％以上、約２９．５％以上、約３０％以上、約３０．５％以上、約３１％以上、約３１．５％以上、約３２％以上、約３２．５％以上、約３３％以上、約３３．５％以上、約３４％以上、約３４．５％以上、約３５％以上向上したものであるが、変異前の親株又は非改変微生物の生産能に比べて、＋値の増加量を有するものであればいかなるものでもよい。他の例として、前記生産能が向上した組換え菌株は、変異前の親株又は非改変微生物に比べて、Ｌ－アミノ酸生産能が約１．１倍以上、約１．１２倍以上、約１．１３倍以上、１．１５倍以上、１．１６倍以上、１．１７倍以上、１．１８倍以上、１．１９倍以上、１．２倍以上、１．２５倍以上、１．３倍以上又は１．３５倍以上向上したものであるが、これらに限定されるものではない。前記「約（about）」とは、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などが全て含まれる範囲であり、約という用語の後に続く数値と同等又は同程度の範囲の数値であればいかなるものでもよいが、これらに限定されるものではない。

【0044】

一例として、本出願のＬ－アミノ酸生産能が向上した微生物は、変異前の親株又は非改変微生物に比べて、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が１００％未満、例えば約９９．９％以下、約９９％以下、約９８％以下、約９７％以下、約９６％以下、約９５％以下、約９０％以下、約８０％以下、約７０％以下、約６０％以下、約５０％以下、約４０％以下、約３０％以下、約２０％以下、約１０％以下、約５％以下又は約０％になるものであるが、これらに限定されるものではない。

【0045】

本出願における「非改変微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株もしくは天然菌株自体、又は自然要因もしくは人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、前記非改変微生物とは、本明細書における配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化される前の微生物を意味する。前記「非改変微生物」は、「改変前の菌株」、「改変前の微生物」、「非変異菌株」、「非改変菌株」、「非変異微生物」又は「基準微生物」と混用される。

【0046】

本出願の他の例として、本出願のコリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であってもよい。

【0047】

本出願におけるタンパク質の「弱化」は、内在性活性に比べて活性が低下することや、活性がなくなることが全て含まれる概念である。前記弱化は、不活性化（inactivation）、欠乏（deficiency）、下方調節（down-regulation）、減少（decrease）、低下（reduce）、減衰（attenuation）などと混用される。

【0048】

前記弱化には、前記タンパク質をコードするポリヌクレオチドの変異などによりタンパク質自体の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性に比べて減少又は除去されること、それをコードするポリヌクレオチドの発現阻害やタンパク質への翻訳（translation）阻害などにより細胞内での全体的なタンパク質活性の程度及び／又は濃度（発現量）が天然菌株に比べて低下すること、前記ポリヌクレオチドの発現が全くないこと、及びポリヌクレオチドが発現したとしてもタンパク質の活性がないことの少なくとも１つが含まれる。前記「内在性活性」とは、自然要因又は人為的要因により遺伝的に変異して形質が変化する場合に、形質変化の前の親株、野生型又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用される。タンパク質の活性が内在性活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方調節、低下、減衰」するとは、形質変化の前の親株又は非改変微生物が本来有していた特定タンパク質の活性に比べて低下することを意味する。

【0049】

このようなタンパク質の活性の弱化は、これらに限定されるものではなく、当該分野で周知の様々な方法を適用することにより達成することができる（例えば、非特許文献１３、１４など）。

【0050】

具体的には、本出願のタンパク質の弱化は、１）タンパク質をコードする遺伝子の全部又は一部を欠失させること、２）タンパク質をコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（又は発現調節配列）を改変すること、３）タンパク質の活性が欠失又は弱化されるように前記タンパク質を構成するアミノ酸配列を改変すること（例えば、アミノ酸配列の１つ以上のアミノ酸を欠失／置換／付加すること）、４）タンパク質の活性が欠失又は弱化されるように前記タンパク質をコードする遺伝子配列を改変すること（例えば、タンパク質の活性が欠失又は弱化されるように改変されたタンパク質をコードするように前記タンパク質遺伝子の核酸塩基配列の１つ以上の核酸塩基を欠失／置換／付加すること）、５）タンパク質をコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変すること、６）タンパク質をコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入すること、７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにタンパク質をコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加すること、８）タンパク質をコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）、又は９）前記１）～８）から選択される２つ以上の組み合わせにより行われるが、特にこれらに限定されるものではない。

【0051】

例えば、前記１）タンパク質をコードする前記遺伝子の一部又は全部を欠失させることは、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド全体を欠失させること、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行われてもよい。

【0052】

また、前記２）発現調節領域（又は発現調節配列）を改変することは、欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節領域（又は発現調節配列）上の変異を発生させるか、より低い活性を有する配列に置換することにより行われてもよい。前記発現調節領域には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。

【0053】

また、前記３）タンパク質をコードする遺伝子転写産物の開始コドンもしくは５’ＵＴＲ領域をコードする塩基配列を改変することは、例えば内在性開始コドンに比べてタンパク質の発現率が低い他の開始コドンをコードする塩基配列に置換することにより行われるが、これに限定されるものではない。

【0054】

さらに、前記４）及び５）のアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列を改変することは、タンパク質の活性が弱化するように、前記タンパク質のアミノ酸配列又は前記タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を発生させるか、より低い活性を有するように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列、又は活性がなくなるように改良されたアミノ酸配列もしくはポリヌクレオチド配列に置換することにより行われるが、これらに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列に変異を導入して終止コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害又は弱化させることができる。ポリヌクレオチド配列を改変することの他の例として、ポリヌクレオチド配列にトランスポゾンを挿入することにより、前記ポリヌクレオチドの発現を弱化させることもでき、ポリヌクレオチド配列がコードするタンパク質の活性を弱化させることもできる。しかし、これらに限定されるものではない。

【0055】

前記６）タンパク質をコードする前記遺伝子転写産物に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入することは、例えば、非特許文献１５を参照することができる。

【0056】

前記７）リボソーム（ribosome）の付着を不可能にする２次構造物が形成されるようにタンパク質をコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することは、ｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、速度を低下させることにより行われてもよい。

【0057】

前記８）タンパク質をコードする遺伝子配列のＯＲＦ（open reading frame）の３’末端に逆転写するようにプロモーターを付加すること（Reverse transcription engineering, RTE）は、前記タンパク質をコードする遺伝子転写産物に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作成して活性を弱化させることにより行われてもよい。

【0058】

本出願における「ベクター」とは、好適な宿主内で標的ポリペプチドを発現させることができるように、好適な発現調節領域（又は発現調節配列）に作動可能に連結された前記標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ産物を意味する。前記発現調節領域には、転写を開始するプロモーター、その転写を調節するための任意のオペレーター配列、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、並びに転写及び翻訳の終結を調節する配列が含まれる。ベクターは、好適な宿主細胞に形質転換されると、宿主ゲノムに関係なく複製及び機能することができ、ゲノム自体に組み込まれる。

【0059】

本出願に用いられるベクターは、特に限定されるものではなく、当該技術分野で公知の任意のベクターが用いられる。通常用いられるベクターの例としては、天然状態又は組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージが挙げられる。例えば、ファージベクター又はコスミドベクターとしては、ｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、Ｃｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしては、ｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系、ｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。

【0060】

例えば、細胞内染色体導入用ベクターにより、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体に挿入することができる。前記ポリヌクレオチドの染色体への挿入は、当該技術分野で公知の任意の方法、例えば相同組換え（homologous recombination）により行うことができるが、これに限定されるものではない。前記染色体に導入されたか否かを確認するための選択マーカー（selection marker）をさらに含んでもよい。前記選択マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選択するためのもの、すなわち標的核酸分子が挿入されたか否かを確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性、表面ポリペプチドの発現などの選択可能表現型を付与するマーカーが用いられる。選択剤（selective agent）で処理した環境においては、選択マーカーを発現する細胞のみ生存するか、異なる表現形質を示すので、形質転換された細胞を選択することができる。

【0061】

本出願における「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞内又は微生物に導入することにより、宿主細胞内で前記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドを発現させることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現するものであれば、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、染色体外に位置するかに関係なく、いかなるものでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含むものである。前記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現するものであれば、いかなる形態で導入されるものでもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自ら発現する上で必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（expression cassette）の形態で宿主細胞に導入されるものでもよい。通常、前記発現カセットは、前記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーター（promoter）、転写終結シグナル、リボソーム結合部位及び翻訳終結シグナルを含む。前記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞において発現に必要な配列と作動可能に連結されたものであってもよいが、これに限定されるものではない。

【0062】

また、前記「作動可能に連結」されたものとは、標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介するプロモーター配列と前記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されたものを意味する。

【0063】

本出願の微生物において、ポリヌクレオチドの一部又は全部の改変は、（ａ）微生物中の染色体導入用ベクターを用いた相同組換え、もしくは遺伝子はさみ（engineered nuclease, e.g., CRISPR-Cas9）を用いたゲノム編集、並びに／又は（ｂ）紫外線や放射線などの光及び／もしくは化学物質処理により誘導することができるが、これらに限定されるものではない。前記遺伝子の一部又は全部の改変方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列が含まれるヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより遺伝子の一部又は全部の欠失が行われる。この導入されるヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。

【0064】

本出願の他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属組換え微生物を培地で培養するステップを含むＬ－アミノ酸製造方法を提供する。

【0065】

配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物などについては前述した通りである。

【0066】

前記コリネバクテリウム属微生物はコリネバクテリウム・グルタミカムであるが、これに限定されるものではなく、これについては前述した通りである。

【0067】

前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－トレオニン及びＬ－イソロイシンから選択される少なくとも１つのアミノ酸であるが、これらに限定されるものではない。

【0068】

本出願における「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適宜調節した環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当該技術分野で公知の好適な培地と培養条件で行うことができる。このような培養過程は、当業者であれば選択される菌株に応じて容易に調整して用いることができる。具体的には、前記培養は、回分、連続及び／又は流加培養であるが、これらに限定されるものではない。

【0069】

本出願における「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養するために必要な栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質や発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及び他の培養条件は、通常の微生物の培養に用いられる培地であればいかなるものでもよく、好適な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地中で好気性条件下にて温度、ｐＨなどを調節して本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養することができる。

【0070】

具体的には、コリネバクテリウム属微生物の培養培地は、非特許文献１６に開示されている。

【0071】

本出願における前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどの炭水化物、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などの有機酸、グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのアミノ酸などが挙げられる。また、デンプン加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米糠、キャッサバ、バガス、トウモロコシ浸漬液などの天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコースや殺菌した前処理糖蜜（すなわち、還元糖に変換した糖蜜）などの炭水化物を用いることができ、その他適量の炭素源であればいかなるものでも用いることができる。これらの炭素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0072】

前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどの無機窒素源と、グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類又はその分解生成物、脱脂大豆ケーキ又はその分解生成物などの有機窒素源とを用いることができる。これらの窒素源は、単独で用いることもでき、２種以上を組み合わせて用いることもできるが、これらに限定されるものではない。

【0073】

前記リン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム又はそれらに相当するナトリウム含有塩などが挙げられる。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどを用いることができ、それ以外に、アミノ酸、ビタミン及び／又は好適な前駆体などを用いることができる。これらの構成成分又は前駆体は、培地に回分式又は連続式で添加することができる。しかし、これらに限定されるものではない。

【0074】

また、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などの化合物を培地に好適な方法で添加し、培地のｐＨを調整してもよい。さらに、培養中に脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。さらに、培地の好気状態を維持するために、培地中に酸素又は酸素含有気体を注入してもよく、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体を注入しなくてもよく、窒素、水素又は二酸化炭素ガスを注入してもよいが、これらに限定されるものではない。

【0075】

本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃に維持し、約１０～１６０時間培養するが、これらに限定されるものではない。

【0076】

本出願の培養により作製されたＬ－アミノ酸は、培地中に分泌されるか、細胞内に残留する。

【0077】

本出願のＬ－アミノ酸製造方法は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を準備するステップ、前記微生物を培養するための培地を準備するステップ、又はそれらの組み合わせ（任意の順序，in any order）を、例えば前記培養するステップの前にさらに含んでもよい。

【0078】

本出願のＬ－アミノ酸生産方法は、前記培養に用いた培地（培養が行われた培地）又はコリネバクテリウム属微生物からＬ－アミノ酸を回収するステップをさらに含んでもよい。前記回収するステップは、前記培養するステップの後にさらに含んでもよい。

【0079】

前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば回分、連続、流加培養方法などに応じて、当該技術分野で公知の好適な方法を用いて目的とするＬ－アミノ酸を回収（collect）するものであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化、タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲル濾過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ又はそれらの組み合わせが用いられ、当該分野で公知の好適な方法を用いて培地又は微生物から目的とするＬ－アミノ酸を回収することができる。

【0080】

また、本出願のＬ－アミノ酸生産方法は、精製ステップをさらに含んでもよい。前記精製は、当該技術分野で公知の好適な方法により行うことができる。例えば、本出願のＬ－アミノ酸生産方法が回収ステップと精製ステップの両方を含む場合、前記回収ステップと前記精製ステップは、順序に関係なく連続的又は非連続的に行ってもよく、同時に又は１つのステップとして統合して行ってもよいが、これらに限定されるものではない。

【0081】

本出願のさらに他の態様は、本出願の配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物、それを培養した培地、又はそれらの組み合わせを含むＬ－アミノ酸製造用組成物を提供する。

【0082】

配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物培地、Ｌ－アミノ酸などについては前述した通りである。

【0083】

本出願の組成物は、アミノ酸生産用組成物に通常用いられる任意の好適な賦形剤をさらに含んでもよい。このような賦形剤としては、例えば保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤、等張化剤などが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0084】

本出願の組成物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物、培地、Ｌ－アミノ酸などについては前述した通りである。

【0085】

本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化させるステップを含む、Ｌ－アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物の製造方法を提供する。

【0086】

前記製造方法は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化させるように微生物を改変するステップを含んでもよい。

【0087】

タンパク質の活性弱化、Ｌ－アミノ酸、微生物などについては前述した通りである。

【0088】

本出願のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されたコリネバクテリウム属微生物のＬ－アミノ酸生産用途を提供する。

【0089】

配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、弱化、微生物、Ｌ－アミノ酸などについては前述した通りである。

【実施例】

【0090】

以下、実施例及び実験例を挙げて本出願をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例及び実験例は本出願を例示するものにすぎず、本出願がこれらの実施例及び実験例に限定されるものではない。

【実施例1】

【0091】

トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーの作製
Ｌ－トレオニン生産能が向上した菌株を得るために、次の方法でランダム突然変異ライブラリーを作製した。まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株（特許文献２）を親株とし、ＥＺ－Ｔｎ５^ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞ＴｎＰ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ^ＴＭ Ｋｉｔ（Epicentre）を用いて得たプラスミドを電気パルス法（非特許文献１７）で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含有する複合平板培地に塗抹して約２０，０００個のコロニーを確保した。
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１０ｇ，ペプトン１０ｇ，Ｂｅｅｆ ｅｘｔｒａｃｔ ５ｇ，酵母抽出物５ｇ，Ｂｒａｉｎ Ｈｅａｒｔ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ １８．５ｇ，ＮａＣｌ ２．５ｇ，尿素２ｇ，Ｓｏｒｂｉｔｉｏｌ ９１ｇ，寒天２０ｇ（蒸留水１リットル中）

【実施例2】

【0092】

トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーのスクリーニング
実施例１で確保した約２０，０００個のコロニーをそれぞれ３００ｕＬの次のカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有選択培地に接種し、９６ディープウェルプレート（96-deep well plate）にて３２℃、２００ｒｐｍで約２４時間培養した。
＜選択培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース１０ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ５．５ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ０．８ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ １６．４ｇ，ビオチン１００ｕｇ，チアミンＨＣＬ １０００ｕｇ，パントテン酸カルシウム２０００ｕｇ，ニコチンアミド２０００ｕｇ（蒸留水１リットル中）

【0093】

培養液中に生産されたＬ－トレオニンの生産量を分析するためにニンヒドリン法を用いた（非特許文献１８）。培養終了後に、培養上清１０ｕｌとニンヒドリン反応液１９０ｕｌを６５℃で３０分間反応させ、次いで分光光度計（spectrophotometer）にて波長５７０ｎｍで吸光度を測定し、対照群であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株と比較して高い吸光度を示す変異菌株として約６０種のコロニーを選択した。その他のコロニーは、対照群として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株と同等又は弱化された吸光度を示した。

【0094】

前述したように選択した約６０種の菌株を上記と同様に再び培養し、その後ニンヒドリン反応を繰り返し行い、最終的に親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株と比較してＬ－トレオニン生産能が向上した上位１０種の突然変異株を選択し、それぞれ１２５０２Ｐ－ｍ１、１２５０２Ｐ－ｍ２、１２５０２Ｐ－ｍ３、１２５０２Ｐ－ｍ４、１２５０２Ｐ－ｍ５、１２５０２Ｐ－ｍ６、１２５０２Ｐ－ｍ７、１２５０２Ｐ－ｍ８、１２５０２Ｐ－ｍ９、１２５０２Ｐ－ｍ１０と命名した。

【実施例3】

【0095】

選択したランダム突然変異株におけるＬ－トレオニン生産能の分析
実施例２で選択した１０種の突然変異株を対象に、再現性のあるＬ－トレオニン生産能向上を示す菌株を最終選択するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。次の方法で培養し、Ｌ－トレオニン生産量を測定した。まず、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有種培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有生産培地２４ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養結果を表１に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン０．１ｍｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース６３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２８ｇ，大豆タンパク質２０ｇ，糖蜜１４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．１ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１．８ｍｇ，チアミン塩酸塩９ｍｇ，パントテン酸カルシウム９ｍｇ，ＭｎＳＯ４ １８０ｍｇ，ＦｅＳＯ４ ２００ｍｇ，ＺｎＳＯ４ １ｍｇ，ＣｕＳＯ４ １ｍｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）

【0096】

【表1】

【0097】

選択した１０種の変異株のうち、Ｌ－トレオニン生産能が有意に向上した菌株として１２５０２Ｐ－ｍ６を最終選択した。

【実施例4】

【0098】

最終選択株におけるＬ－トレオニン生産能向上の原因解明
本実施例においては、実施例３で最終選択した突然変異株を対象に、トランスポゾンのランダムな挿入により欠損した遺伝子の同定を試みた。１２５０２Ｐ－ｍ６のＧｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡを抽出して切断し、その後連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有ＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換された２０種のコロニーを選択し、その後未知の遺伝子の一部を含むプラスミドを得て、ＥＺ－Ｔｎ５^ＴＭ＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ－２＞ＴｎＰ Ｔｒａｎｓｐｏｓｏｍｅ^ＴＭ Ｋｉｔのプライマー配列番号３及びプライマー配列番号４を用いて塩基配列を分析した。その結果、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Geneback）に報告されている塩基配列に基づいて、配列番号２（Ｎｃｇｌ１９１７）のヌクレオチド配列を含む遺伝子が不活性化され、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化されていることが確認された。

【0099】

【表2】

【実施例5】

【0100】

配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性弱化のための組換えベクター及び菌株の作製
コリネバクテリウム属菌株の染色体上において、実施例４で確認した配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させる組換えベクターを次の方法で作製した。まず、ＷＴ菌株から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型とし、Ｎｃｇｌ１９１７遺伝子の上流の２４９ｂｐ離れた位置の５’断片に制限酵素ＳｍａＩ認識部位を挿入した配列番号５及び６のプライマーを合成した。また、Ｎｃｇｌ１９１７遺伝子の下流の４１０ｂｐ離れた位置の３’断片に制限酵素ＳｍａＩ認識部位を挿入したプライマー配列番号７及び８を合成した（表３）。

【0101】

【表3】

【0102】

具体的には、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２の染色体ＤＮＡを鋳型とし、ＰＣＲ［非特許文献１１］を行った。こうすることにより、配列番号２のヌクレオチド配列でコードされるタンパク質をコードする部分の上流２４９ｂｐと下流４１０ｂｐのＤＮＡ断片を得た。ここで、ＰＣＲ条件は、９４℃で２分間の変性後、９４℃で１分間の変性、５６℃で１分間のアニーリング、７２℃で４０秒間の重合を３０サイクル行い、次いで７２℃で１０分間の重合反応を行うものとした。一方、制限酵素ＳｍａＩで処理し、その後６５℃で２０分間熱処理したｐＤＣＭ２ベクター（特許文献５）と前記ＰＣＲにより増幅した挿入ＤＮＡ断片をＩｎｆｕｓｉｏｎ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔにより連結し、次いで大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。上記菌株をカナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）含有ＬＢ固体培地に塗抹した。プライマー配列番号５及び８を用いたＰＣＲにより、標的遺伝子を挿入したベクターで形質転換されたコロニーを選択し、その後通常のプラスミド抽出法を用いてプラスミドを得た。前記プラスミドをｐＤＣＭ２－ΔＮｃｇｌ１９１７と命名した。トレオニンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株に、作製したベクターを電気パルス法で形質転換した。このように、ＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株においてＮｃｇｌ１９１７遺伝子が不活性化された菌株をＫＣＣＭ１２５０２Ｐ：：Δ１９１７と命名した。

【実施例6】

【0103】

コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ由来である、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された菌株のＬ－トレオニン生産能の評価
前述したように作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ：：Δ１９１７菌株のＬ－トレオニン生産能を分析するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。対照群としては、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐ菌株を用い、次の方法で培養してＬ－トレオニン生産量を測定した。種培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養結果を表４に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン０．１ｍｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース６３ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ ２８ｇ，大豆タンパク質２０ｇ，糖蜜１４ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １．１ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １．２ｇ，ビオチン１．８ｍｇ，チアミン塩酸塩９ｍｇ，パントテン酸カルシウム９ｍｇ，ＭｎＳＯ４ １８０ｍｇ，ＦｅＳＯ４ ２００ｍｇ，ＺｎＳＯ４ １ｍｇ，ＣｕＳＯ４ １ｍｇ，ＣａＣＯ３ ３０ｇ（蒸留水１リットル中）

【0104】

【表4】

【0105】

これらの結果から、Ｌ－トレオニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１２５０２Ｐから配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させると、親株に比べてＬ－トレオニン生産能が平均３５％向上することが確認された。

【0106】

よって、コリネバクテリウム属微生物において、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させることによりＬ－トレオニン生産能が向上することが確認された。

【0107】

これらの結果から、Ｌ－トレオニン生産菌株において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質を不活性化させるとＬ－トレオニン生産能を向上させるのに効果があることが確認されたので、菌株ＫＣＣＭ１２５０２Ｐ：：Δ１９１７をＣＡ０９－０９０７と命名し、２０２１年２月１日付けで韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に寄託番号ＫＣＣＭ１２９４６Ｐとして国際寄託した。

【実施例7】

【0108】

コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２２２Ｐ由来である、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された菌株の作製及びＬ－トレオニン生産能の評価
Ｌ－トレオニンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても上記と同等の効果があるか否かを確認するために、実施例５と同様に、Ｌ－トレオニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２２２Ｐ（特許文献３）を対象に、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１２２２Ｐ：：Δ１９１７と命名した。作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２２２Ｐ：：Δ１９１７菌株のＬ－トレオニン生産能を分析するために、実施例６と同様に培養した。対照群としては、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２２２Ｐ菌株を用いた。培養結果を表５に示す。

【0109】

【表5】

【0110】

これらの結果から、Ｌ－トレオニン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２２２Ｐを対象に、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させると、Ｌ－トレオニン生産能が平均１２％向上することが確認された。実施例５～７の結果から、コリネバクテリウム属微生物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化させることによりＬ－トレオニン生産能が向上することが確認された。

【実施例8】

【0111】

コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ由来である、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性が弱化された菌株の作製及びＬ－イソロイシン生産能の評価
Ｌ－イソロイシンを生産するコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても上記と同様にＬ－アミノ酸生産増加効果があるか否かを確認するために、実施例５と同様に、Ｌ－イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ（特許文献４）を対象に、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：Δ１９１７と命名した。作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ：：Δ１９１７菌株のＬ－イソロイシン生産能を分析するために、次の培地を用いたフラスコ培養を行った。対照群としては、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐ菌株を用い、次の方法で培養してＬ－イソロイシン生産量を測定した。まず、種培地２５ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含む２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養結果を表６に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ ４ｇ，Ｋ２ＨＰＯ４ ８ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ，ビオチン０．１ｍｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．２）＞
グルコース１００ｇ，酵母抽出物５ｇ，（ＮＨ４）２ＳＯ４ １６ｇ，ＫＨ２ＰＯ４ １ｇ，ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １ｇ，ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ １０ｍｇ，ビオチン２００μｇ（蒸留水１リットル中）

【0112】

【表6】

【0113】

これらの結果から、Ｌ－イソロイシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２４８Ｐを対象に、配列番号２のヌクレオチド配列を含む遺伝子を欠損させると、Ｌ－イソロイシン生産能が平均２７％向上することが確認された。よって、コリネバクテリウム属微生物において、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質の活性を弱化させることによりＬ－イソロイシン生産能が向上することが確認された。

【0114】

以上の説明から、本出願の属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、上記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。

【0115】

【配列表】

2024510838000001.app

【国際調査報告】