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特表2024-510876インドシアニングリーン及びフルオレセインナトリウムの固体組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-12
(54)【発明の名称】インドシアニングリーン及びフルオレセインナトリウムの固体組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 49/00 20060101AFI20240305BHJP
【ＦＩ】
A61K49/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548916
(86)(22)【出願日】2022-03-21
(85)【翻訳文提出日】2023-09-25
(86)【国際出願番号】 IB2022052553
(87)【国際公開番号】W WO2022200993
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】102021000006794
(32)【優先日】2021-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(31)【優先権主張番号】102021000006809
(32)【優先日】2021-03-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(31)【優先権主張番号】102021000026075
(32)【優先日】2021-10-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】IT
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523292832
【氏名又は名称】アイクロム エスアールエル
【氏名又は名称原語表記】ＩＣＲＯＭ ＳＲＬ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100225060
【弁理士】
【氏名又は名称】屋代 直樹
(72)【発明者】
【氏名】ピエルフランチェスコ モロジーニ
(72)【発明者】
【氏名】ダニエーレ デ ツァーニ
【テーマコード（参考）】
4C085
【Ｆターム（参考）】
4C085HH11
4C085JJ02
4C085JJ11
4C085KA27
4C085KB55
4C085KB56
4C085LL20
(57)【要約】
本発明は、式（ＩＡ）の化合物であるインドシアニングリーン及び式（ＩＢ）の化合物であるフルオレセインナトリウムの新規固体組成物、診断分野におけるその使用、並びにそのような組成物を含むキットに関する。
【化１】
【化１】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式（ＩＡ）のインドシアニングリーン及び式（ＩＢ）のフルオレセインナトリウムの固体組成物。【化1】
【請求項2】
インドシアニングリーンの量は、２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇであり、かつ、フルオレセインナトリウムの量は、０．１ｇ、０．２ｇ、０．４ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．２５ｇまたは１ｇである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ＵＳＰモノグラフに従った銀電極を用いた電位差測定法に基づいて、化合物（ＩＡ）の量に対して、０％≦ＮａＩ≦２．５％に等しい量のＮａＩを含む、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
インドシアニングリーンの量は５ｍｇであり、かつフルオレセインナトリウムの量は０．２ｇである、請求項１～３のそれぞれに記載の組成物。
【請求項5】
式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物によって形成された水溶液の凍結乾燥による、請求項１～３に記載の組成物の調製プロセス。
【請求項6】
前記水溶液は、凍結乾燥される前に精密濾過される、請求項５に記載のプロセス。
【請求項7】
眼科での画像診断に使用するための、請求項１～３に記載の組成物。
【請求項8】
請求項１～４に記載の固体組成物と、眼科での画像化に使用するための静脈注射液の生成に適した滅菌水のバイアルと、を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、下記式（ＩＡ）の化合物であるインドシアニングリーン及び下記式（ＩＢ）の化合物であるフルオレセインナトリウムの新規固体組成物、診断分野におけるその使用、並びにそのような組成物を含むキットに関する。
【化1】
【0002】
本発明は造影剤の分野に関し、特に眼科で使用される造影剤に関する。
【背景技術】
【0003】
フルオレセインは通常ナトリウム塩として投与され、室温では無臭の赤茶色の固体として存在し、２５４ｎｍ及び青色範囲（４６５～４９０ｎｍ）の紫外線によって励起されると、５２０～５３０ｎｍの範囲（非常に特徴的な黄緑色）の強い蛍光を発する。フルオレセインナトリウムは、５ｍｌまたは２ｍｌバイアルに入った滅菌水溶液で、ヨーロッパまたは米国では０．２５ｇ／ｍｌ、０．２ｇ／ｍｌ～０．１ｇ／ｍｌの様々な濃度で市販されている。
【0004】
このような技術は、その後の治療に対して診断及び有用な情報を提供し、網膜及び脈絡膜の血管新生の視覚化を可能にする。このテストにより、治療を受けていない（虚血）領域、及び網膜血管新生によって引き起こされた病変を強調表示することができる。薬剤の黄緑色の蛍光は、網膜及び虹彩の血管領域の境界を示す。フルオレセインは、静脈内投与から２４～３６時間以内に腎臓によって完全に除去される。
【0005】
さらに近年では、インドシアニングリーン血管造影法（ＩＣＧＡ）が開発された。この色素は１９５５年にコダック研究所（Kodak Research Laboratories）によって写真用に開発され、１９５６年にはすでに臨床使用が承認されていたが、血管造影で使用されるまでには１０年かかり、網膜血管造影で使用されるまでには１９７０年代までかかった。
【0006】
式（ＩＡ）のインドシアニングリーン（ＩＣＧ、１Ｈ－ベンズ［ｅ］インドール、２－［７－［１，３－ジヒドロ－１，１－ジメチル－３－（４－スルホブチル）－２Ｈ－ベンズ［ｅ］インドール－２－イリデン］－１，３，５－ヘプタトリエニル］－１，１－ジメチル－３－（４－スルホブチル)ヒドロキシド、分子内塩、ナトリウム塩、ＣＡＳ ＲＮ ３５９９－３２－４）は、５％以下のヨウ化ナトリウムの存在下で２５ｍｇまたは５０ｍｇのインドシアニングリーンを含有する、滅菌凍結乾燥粉末の形態で固体状態にて販売される。眼科血管造影のために投与できる量は、ボーラス注射として体重１ｋｇあたり０．１～０．３ｍｇを超えてはならない。再構成された注射用溶液１ｍｌが式５ｍｇのインドシアニングリーンを含むように、該化合物２５ｍｇ用量を注射用溶液として５ｍｌの水に溶解し、該化合物５０ｍｇ用量を１０ｍｌに溶解する。
【0007】
成人の１日の全投与量は体重１ｋｇあたり５ｍｇ未満に保たなければならない。インドシアニングリーンの最大吸収及び発光は両方とも赤外範囲付近にあり、最大吸収は８００ｎｍ、及び蛍光測定の最大発光は８３０ｎｍである。インドシアニングリーンは、水に溶解すると、たった数時間で検出できないほどの分解を示す。
【0008】
ヨウ化ナトリウムが存在すると重度のアナフィラキシー反応を引き起こし得るため、医師の監督下でのみ使用すべきである。
【0009】
注射用調剤の場合、２ｍｌの滅菌水に最大４０ｍｇのインドシアニングリーン色素を使用できる。色素の注入後、直ちに生理食塩水を５ｍｌボーラス注入しなれければならない。
【0010】
インドシアニングリーン分子は最も大きい（フルオレセインの３３２Ｄａと比較して、分子量７７５Ｄａ）ため、フルオレセインと比較して血漿中のタンパク質により強く結合し、代わりに赤外スペクトルで蛍光を発する。したがって、肝臓によって代謝される。
【0011】
当初、ＩＣＧ血管造影は赤外写真フィルムを使用して実行された。しかし、色素の蛍光特性が比較的弱いことに加えフィルムの感度が乏しかったため、この方法は放棄されるに至った。
【0012】
インドシアニングリーンは血漿タンパク質に強く結合しているため、フルオレセインと比較して代謝が遅くなり、画像化（imaging）に利用できる蛍光の量が減少する。ＩＣＧ血管造影用の画像を取得するためにデジタルビデオカメラが使用された。
【0013】
蛍光血管造影法（フルオレセインまたはインドシアニングリーンを使用）の別のアプローチは、走査型レーザー検眼鏡である。このツールは、近年のマーケティングのため、一般的な臨床業務の一部になった。走査型レーザー検眼鏡の利点としては、網膜を走査する励起光を使用できることを含み、それによって安全な照明レベルを使用しながらも、より強力な励起が可能になる（したがって、より強力な発光シグナルが得られる）。これが可能となるのは、スキャン範囲が網膜領域の各点をわずか０．１～０．７マイクロ秒間照射するためである。走査型レーザー検眼鏡を用いた血管造影では、実際のビデオにより１秒あたり２０～３０フォトグラムの速度で画像化できるため、静止画像化システムよりもアクセスしやすい時刻情報を提供する。
【0014】
ＩＣＧ血管造影は、網膜下血管新生、及びその他の疾患の特定の場合には有利であり得るが、その欠点の１つとしては、血管造影に長時間（４５分）を要すること、及びフルオレセインによる血管造影図を取得した後に２回目の血管造影図を取得する必要があることである。フルオレセイン血管造影図及びＩＣＧ血管造影図を取得するプロセスには長い時間がかかり、研究セットを完了するためには患者あたり２～３回の注射が必要となる。さらに、血管造影は様々な時間で実行されるため、蛍光の漏れ込み（fluorescence leakage）の変動が色素の特性の違いによるものなのか、または画像の品質によるものなのかを理解することが困難になる。
【0015】
これらの欠点を克服するために、１９９８年にＰＣベースの小型デジタル共焦点走査レーザー検眼鏡を使用して、フルオレセイン及びインドシアニングリーンを同時に投与する（W. R. Freeman et al., Arch. Ophysical., vol. 116, Apr. 1998, 455‐463）、同時血管造影が実行され、インドシアニングリーン及びフルオレセインの１回の静脈注射後に同時画像化が可能になった。臨床的には、インドシアニングリーン及びフルオレセインの１６９回にわたる同時注射において、重篤な副作用は観察されなかった。研究全体の実行に必要となる時間は、フルオレセインに関する初期研究、それを再検討し、それに続いてインドシアニングリーンに関する研究を実行する場合に比べて大幅に短縮された。
【0016】
現在、２つの色素を同時に注入し、注入後数秒で網膜及び脈絡膜レベルに到達する。蛍光血管撮影装置として知られる特別な機器を使用すると、色素の通過の全ステップを通して眼の奥を撮影することが可能であり、それによって、虚血領域、血管新生、光学ディスクまたは網膜血管からの色素の拡散領域（漏出）、炎症巣（inflammatory foci）などの変化の存在を特定することが可能となる。ＦＡＧ及びＩＣＧＡは日常的ではあるが侵襲的なテストであり、そのため、フルオレセインは注射後数時間で腎臓から除去され、患者が造影剤に対してアレルギーがないことを確認する必要があるため、テストを実行する前に腎機能の正常性を確認しなければならない。テストは通常、空腹時、または朝食もしくは非常に軽い食事の後に実施される。
【0017】
現今では、高解像度ＯＣＴ及び最新のＯＣＴ血管造影の登場により、この侵襲的なテストは多くの場合回避され得る。ただし、状況によっては依然としてそれ（侵襲的なテスト）が根本であり、患者への正しい診断及び治療像を達成するにはマルチモードのアプローチが必要である。眼科医は、どのテストが個々の患者に最も適しているかをケースバイケースで決定しなければならない。
【0018】
２つの色素の同時投与は、実際的には、沈殿物の存在しない当該２つの色素の混合物の滅菌溶液を得るために、バイアルの内容物であるフルオレセインナトリウム水溶液をインドシアニングリーン粉末に添加することによって行われる。フルオレセインナトリウムを含む溶液を１本のシリンジで取り出し、それをインドシアニングリーンの滅菌粉末に加え、沈殿物が生じずに溶液が形成されるのを待ってから、その後、同じシリンジまたは異なるシリンジを用いて再度最終的な溶液を取り出す必要があるため、この調製方法がいかに潜在的な問題を暗示しているのかは明らかである。
【0019】
別の問題としては、市販されているものとは異なる量の色素を投与する必要があり、そのため、別の患者には投与することができない混合物を廃棄しなければならないことである。インドシアニングリーンは高価であるため、この廃棄に費用がかかり得る。
【0020】
別の問題は、インドシアニングリーンは水溶液中において長期間安定ではなく、したがって混合物を保存できないことが原因である。
【発明の概要】
【0021】
本発明の目的は、２つの色素、式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物を同時に凍結乾燥することによって得られる、固体状態の新規組成物であって、前記式（ＩＡ）の化合物の量は２．５ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、２５ｍｇ、５０ｍｇまたは１００ｍｇであり、前記式（ＩＢ）の化合物の量は０．１ｇ、０．２ｇ、０．４ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．２５ｇまたは１ｇである、新規組成物である。混合物を水に溶解することによって得ることのできる濃度は、実験パートに記載されている。
【0022】
出願人は、驚くべきことに、式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の組成物が、凍結乾燥によって調製された場合、式（ＩＡ）の化合物を安定化するための先行技術で行われているようなＮａＩの添加がなくても、水溶性であり、かつ安定であることを見出した。本発明の組成物は、０％≦ＮａＩ≦２．５％、例えば０％、０．９％、２．５％の量でＮａＩを含有することができる。パーセンテージは、米国薬局方モノグラフによる銀電極を用いた電位差滴定に基づく式（ＩＡ）の化合物の量を指す。
【0023】
本発明の組成物はこれまでに記載されていなかったと思われ、前述の問題を克服することができ、画像診断（diagnostic imaging）に必要な用量を同時に調製することを可能にする。
【0024】
本発明で使用される式（ＩＢ）の化合物は市販されているものである。特に、本発明の式（ＩＡ）の化合物は市販されているものであってもよいが、同じ出願人により出願されたイタリア特許出願（ＩＴ１０２０２１０００００６７９４）（未公開）に記載されている通りに便宜的に調製される。前述の出願は、総不純物含量が０．５％以下、及び個々の不純物が０．１０％以下であり（純度は２５４ｎｍの波長における新しい分析法ＨＰＬＣによって測定される）、並びに、水溶性で、ＮａＩ含有量が２．５％以下である安定したＮａＩを含む関連組成物を有する、式（ＩＡ）のインドシアニングリーンを調製するための新しいプロセスに関する。
【0025】
当該プロセスは、以下のステップ：
（ａ）下記式（ＩＩ）の化合物１，１，２－トリメチル－１ｈ－ベンゾ［ｅ］インドールを、下記式（ＩＩＩ）の１，４－ブタンスルトンと、
適切な高沸点溶媒中において反応させ、既知の方法に従って、下記式（ＩＶ）の４－（１，１，２－トリメチル－１Ｈ－ベンゾ［ｅ］インドリル－３－イル）ブタン－１－スルホネートを提供することと、
（ｂ）上記式（ＩＶ）の化合物を、下記式（Ｖ）の化合物、ベンゼンアミン，Ｎ－［（２Ｅ，４Ｅ）－５－（フェニルアミノ）－２，４－ペンタジエン－１－イリデン］－，塩酸塩（１：１)（ＧＡＤとして知られる）と、
無水酢酸、酢酸ナトリウムの存在下で、双極性非プロトン性溶媒を使用して反応させ、中間体を単離することなく、上記式（ＩＡ）の最終化合物を提供することと、を含む、式（ＩＡ）の化合物の合成を想定している。
（ａ）下記式（ＩＩ）の化合物１，１，２－トリメチル－１ｈ－ベンゾ［ｅ］インドールを、下記式（ＩＩＩ）の１，４－ブタンスルトンと、
【化2】
【化3】
【化4】
【化5】
【0026】
ステップａ）もよく知られており、反応は、例えば以下の非プロトン性溶媒、すなわち、ヘキサン、シクロヘキサン、トルエン、キシレン、テトラヒドロフラン、アセトン、アセトニトリル、１，４－ジオキサン、ジエチルエーテル、ジクロロメタン、酢酸エチル、Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド、メチルｔｅｒｔ－ブチルエーテルなど、キシレン及びアセトンといった使用される高沸点溶媒に応じた温度で実行され得る。
【0027】
出願人は、約１３０℃の温度で溶媒としてキシレンを使用した。アニソールも使用でき、反応速度の点で良好な結果が得られ、１２５～１３０℃のキシレンでは通常２４時間必要であるところ、１４０～１５０℃で７～８時間で完全に転換した。式（ＩＶ）の中間体化合物は、アセトンを反応混合物に添加して沈殿させることによって単離され、ＵＳ２０１９／０３３７８９６に記載されているように再結晶化することなく湿潤状態でそのまま使用される。
【0028】
したがって、当該プロセスは、先行技術において既知の合成及び前述した合成で起こるように、いかなる中間体も単離することなく、また中間体（ＶＩ）もしくは中間体（ＶＩＩ）のいずれかを精製する必要もなく、ステップｂ）の直接的な実施、すなわち「ワンステップ」によって特徴付けられる。
【0029】
ステップｂ）は、すでに知られているように、溶媒（アセトニトリル）、無水酢酸及び酢酸ナトリウムの存在下で式（ＩＶ）の化合物と式（Ｖ）の化合物とを縮合させることによって実施する。反応は４０～５０℃の温度で実施し、式（ＩＡ）の粗製（crude）化合物を形成する。式（Ｖ）の化合物及び式（ＩＶ）の化合物を酢酸ナトリウム（４当量）の存在下でアセトニトリルに溶解する。次いで、無水酢酸（４当量）をＵＳ２０１９／０３３７８９６に公表されている温度よりも低い温度で添加し、同じ温度で１～３時間反応させる。この「ワンポット」ステップでアセトニトリルを使用することで、完全に反応させるための最小限の量で無水酢酸を使用することが可能となり、ゆえに無水酢酸を反応溶媒として使用しない。これにより、蒸留によるその除去がより容易になり、したがって式（ＩＡ）の粗製化合物の単離に使用される水／イソプロパノール混合物の使用がより安全になった。
【0030】
実際、その後の処理は、式（ＩＡ）の化合物の粗製固体を分離するためにイソプロパノールを使用して実行した。
【0031】
このようにして粗製形態で得られた式（ＩＡ）の化合物は、それ自体ですでに高いＨＰＬＣ純度レベル（＞９０％）を特徴とし、唯一存在する重要な不純物は不純物Ａである。化合物（ＩＡ）は、ＵＳ２０１９／０３３７８９６のメタノール／イソプロパノール混合物、もしくはアセトン、イソプロパノール、または他の引用文献において使用されたメタノールといった既知の方法によるのではなく、むしろイソプロパノール／Ｈ２Ｏ中での結晶化によって都合よく精製することができる。以下から選択される適切な比率、すなわち、式（ＩＡ）の粗製化合物についてリットル／ｋｇの体積表記で、イソプロパノール／水：５．９／３．４または７．４／３．４または９．９／３．４でのイソプロパノール／Ｈ２Ｏ混合物の使用については、これまでに言及した参考文献はない。
【0032】
イソプロパノール／Ｈ２Ｏを使用することにより、中間体（ＶＩ）が単離されていないという事実にもかかわらず、純度９９．５以上で式（ＩＡ）の化合物を提供するという利点を有する。
【0033】
本発明の式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の粉末形態の固体組成物は、組成物の無菌性及び空気、特に酸素との接触がないことを保証できる適切な容器に都合よく収容される。
【0034】
本発明のさらなる目的は、特に５ｍｇの式（ＩＡ）の化合物及び２００ｍｇの式（ＩＢ）の化合物を含む便利な「単回用量（single dose）」組成物である。このような組成物は、臨床現場において通常１回の注射に使用される適切な用量で注入される２つの成分の混合物を調製する必要がある場合に、専門家にとって特に有利である。
【0035】
本発明のさらなる目的は、本発明に係る組成物を含む容器と、注射用溶液を再構成するのに適した滅菌水のバイアルと、を含むキットである。
【0036】
本発明の目的はまた、組成物の無菌性、及び既知の分解を引き起し得る空気、特に酸素との非接触を保証する適切な容器に収容された式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の本発明の固体組成物を含むキットでもある。
【0037】
［実験パート］
［凍結乾燥条件］
すべての調製に使用した凍結乾燥条件は次のとおりである：
凍結乾燥機：Ｅｄｗａｒｄｓ ＭＩＮＩＦＡＳＴ ６８０
温度：凍結乾燥開始時 －４０℃；凍結乾燥終了時 ＋５℃
圧力（真空）：凍結乾燥開始時 ６．６＊１０２ｍｂａｒ、凍結乾燥終了時 ４．６＊１０－２ｍｂａｒ
凍結乾燥時間：７２時間
琥珀色のガラスバイアルに窒素を注入、及び蒸留終了時に密封。
［凍結乾燥条件］
すべての調製に使用した凍結乾燥条件は次のとおりである：
凍結乾燥機：Ｅｄｗａｒｄｓ ＭＩＮＩＦＡＳＴ ６８０
温度：凍結乾燥開始時 －４０℃；凍結乾燥終了時 ＋５℃
圧力（真空）：凍結乾燥開始時 ６．６＊１０２ｍｂａｒ、凍結乾燥終了時 ４．６＊１０－２ｍｂａｒ
凍結乾燥時間：７２時間
琥珀色のガラスバイアルに窒素を注入、及び蒸留終了時に密封。
【0038】
［式（ＩＡ）の化合物の純度を決定するために使用される分析方法］
・カラムＨＰＬＣ：ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ４．６ｘ２５０ｍｍ ５μｍ
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
・ステップＡ：ギ酸アンモニウム ４．０９ｇ／Ｌ、ｐＨ＝５．０（ギ酸を用いて）
・ステップＢ：アセトニトリル
・混合相： ７０：３０ Ａ：Ｂ
・流量：１．５ｍｌ／分
・注入量：１０μＬ
・分析時間：３０分
・カラムＨＰＬＣ：ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ４．６ｘ２５０ｍｍ ５μｍ
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
・ステップＡ：ギ酸アンモニウム ４．０９ｇ／Ｌ、ｐＨ＝５．０（ギ酸を用いて）
・ステップＢ：アセトニトリル
・混合相： ７０：３０ Ａ：Ｂ
・流量：１．５ｍｌ／分
・注入量：１０μＬ
・分析時間：３０分
【表1】
【0039】
［サンプルの調製（方法１）］
５０ｍｌフラスコ中で４０ｍｇを溶解し、混合相で正しい体積にする。
５分間超音波処理を施し、完全な可溶化を確認する。
サンプルは３０分を超えると安定しないため、直ちに注入。
５０ｍｌフラスコ中で４０ｍｇを溶解し、混合相で正しい体積にする。
５分間超音波処理を施し、完全な可溶化を確認する。
サンプルは３０分を超えると安定しないため、直ちに注入。
【0040】
［サンプルの調製（方法２）］
５０ｍｌフラスコ中で４０ｍｇを溶解し、メタノールで正しい体積にする。５分間超音波処理を施し、完全な可溶化を確認する。
すぐに注入。
サンプルは３０分を超えると安定しないため、直ちに注入。
５０ｍｌフラスコ中で４０ｍｇを溶解し、メタノールで正しい体積にする。５分間超音波処理を施し、完全な可溶化を確認する。
すぐに注入。
サンプルは３０分を超えると安定しないため、直ちに注入。
【0041】
メタノールの使用により、式（ＩＡ）の化合物をより良好に安定化することができ、［ＭＨ］＋：７５２．５、すなわち、生成物に関して「－１」を有する劣化不純物の形成を防止することができる。
１～１０分ごとに注入。
１～１０分ごとに注入。
【0042】
［実施例１］
［式（ＩＶ）の４‐（１，１，２‐トリメチル‐１Ｈ‐ベンゾ［ｅ］インドリル‐３‐イル）ブタン‐１‐スルホネートの調製］
キシレン９３ｍｌ中に３１．１ｇの式（ＩＩ）の化合物（０．１５ｍｏｌ、１当量、市販）、４０．５ｇの式（ＩＩＩ）の化合物（０．３０ｍｏｌ、２当量、市販）を、窒素流下で２Ｌ反応器に充填する。懸濁液を撹拌し、約１３０℃の温度まで２４時間加熱する。懸濁液を冷却し、アセトン（２００ｍｌ）を添加する。次いで、得られた固体を濾過し、真空中で乾燥させる。このようにして、４８．５ｇの所望の化合物が得られ、これは９４．５％の収率に相当する（ＨＰＬＣ純度：９７～９８％）。
［式（ＩＶ）の４‐（１，１，２‐トリメチル‐１Ｈ‐ベンゾ［ｅ］インドリル‐３‐イル）ブタン‐１‐スルホネートの調製］
【化6】
【0043】
あるいは、溶媒としてキシレンの代わりにアニソールを同量使用することもできる。同じプロトコールに従い、反応を１４０℃で実行すると、生成物の転換は６～８時間で完了する。得られる収率及び量はキシレン中での反応と同様である。
【0044】
［実施例２］
［式（ＩＡ）の化合物の調製（ワンポット合成）］
２０．０ｇの式（Ｖ）の化合物（０．０７ｍｏｌ、１当量、市販）、４８．５ｇの式（ＩＶ）の化合物（実施例１に記載の通りに調製、０．１４ｍｏｌ、２当量）、２３ｇの酢酸ナトリウム（０．２８ｍｏｌ、４当量）及び１８０ｍｌのアセトニトリルを、窒素流下で１Ｌ反応器に充填する。懸濁液を２０～２５℃で撹拌し、無水酢酸２８．８ｇ（０．２８ｍｏｌ、４当量）を５～１０分間で滴下する。懸濁液を４５～５０℃の温度まで加熱し、撹拌を約２時間続ける。反応混合物を、温度を４０～５０℃に保ちながら真空中で濃縮する。次いで、大気圧に戻し、１００ｍｌのイソプロパノールを添加して、温度を４０～５０℃に保ちながら、再び反応混合物を真空中で濃縮する。
［式（ＩＡ）の化合物の調製（ワンポット合成）］
【化7】
【0045】
その後、水（１８０ｍｌ）及びイソプロパノール（３２０ｍｌ）を加え、生成物を５０～５５℃で溶液にし、次いでイソプロパノール（１００ｍｌ）を添加し、混合物を２０～２５℃まで徐々に冷却する。濾過し、イソプロパノールで洗浄する。このようにして、所望の湿潤した化合物が得られる（重量損失による収量：４６．３ｇ、化合物（Ｖ）に対して８５．１％、ＨＰＬＣ純度８０～８５％）。
【0046】
［実施例３］
［式（ＩＡ）の化合物の精製（ＮａＩなし）］
イソプロパノールと共に４９ｇの湿潤したインドシアニングリーン（実施例２に記載のように調製、２４．４ｇ（乾燥）に等しい）、１３０ｍｌのイソプロパノール及び７７ｍｌの水を１リットルフラスコに充填する。５０～５５℃に加熱し、完全に溶解するまで撹拌する。溶液のｐＨを５％ＮａＯＨで７．５～８．５に校正し、４０～４５℃まで冷却する。
［式（ＩＡ）の化合物の精製（ＮａＩなし）］
イソプロパノールと共に４９ｇの湿潤したインドシアニングリーン（実施例２に記載のように調製、２４．４ｇ（乾燥）に等しい）、１３０ｍｌのイソプロパノール及び７７ｍｌの水を１リットルフラスコに充填する。５０～５５℃に加熱し、完全に溶解するまで撹拌する。溶液のｐＨを５％ＮａＯＨで７．５～８．５に校正し、４０～４５℃まで冷却する。
【0047】
４０～４５℃を維持しながらイソプロパノール（４８ｍｌ）を添加し、次いで２０～２５℃まで徐々に冷却し、撹拌を１．５時間続け、その後に濾過し、イソプロパノールで洗浄する（２×４８ｍｌ）。
粉末を真空中において６０℃で４０時間乾燥させる。
収量：２０ｇ（８２．９％）。
ＨＰＬＣ純度：９９．５％；不純物Ａ：０．４０％。
ヨウ化ナトリウム含有量：０％。
粉末を真空中において６０℃で４０時間乾燥させる。
収量：２０ｇ（８２．９％）。
ＨＰＬＣ純度：９９．５％；不純物Ａ：０．４０％。
ヨウ化ナトリウム含有量：０％。
【0048】
［実施例４］
［ＮａＩを用いた式（ＩＡ）の化合物の調製（Ｉ結晶化）］
９３．６ｇの式（ＩＡ）の粗製化合物（実施例２に記載の通りに調製された、理論的乾燥化合物４６．３ｇ）及びヨウ化ナトリウム（１．３９ｇ；３％ｗ／ｗ）を２５０ｍｌのイソプロパノール及び１４８ｍｌの水に懸濁する。懸濁液を５５～６０℃の温度まで加熱し、完全に溶解するまで撹拌する。２．５％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨを７．５～８．５に校正する。溶液を４５～５０℃の温度まで冷却し、１５～３０分後に９３ｍｌのイソプロパノールを添加する。２０～２５℃の温度に達するまでゆっくりと冷却し、３０分間撹拌を続ける。次いで、懸濁液を３５～４０℃にし、約１時間撹拌したら、約２時間で再び２０～２５℃まで冷却し、最後に２０～３０℃で濾過して、イソプロパノールで洗浄する。
［ＮａＩを用いた式（ＩＡ）の化合物の調製（Ｉ結晶化）］
９３．６ｇの式（ＩＡ）の粗製化合物（実施例２に記載の通りに調製された、理論的乾燥化合物４６．３ｇ）及びヨウ化ナトリウム（１．３９ｇ；３％ｗ／ｗ）を２５０ｍｌのイソプロパノール及び１４８ｍｌの水に懸濁する。懸濁液を５５～６０℃の温度まで加熱し、完全に溶解するまで撹拌する。２．５％ｗ／ｗ水酸化ナトリウム溶液を使用してｐＨを７．５～８．５に校正する。溶液を４５～５０℃の温度まで冷却し、１５～３０分後に９３ｍｌのイソプロパノールを添加する。２０～２５℃の温度に達するまでゆっくりと冷却し、３０分間撹拌を続ける。次いで、懸濁液を３５～４０℃にし、約１時間撹拌したら、約２時間で再び２０～２５℃まで冷却し、最後に２０～３０℃で濾過して、イソプロパノールで洗浄する。
【0049】
上記対象物を真空中において５０～８０℃で８～４８時間乾燥させ、３５．８９ｇの所望の生成物を収率７７．５％で得た（充填したそれぞれの粗製乾燥生成物に対して）。
ＨＰＬＣ純度：９９．６％；不純物Ａ：０．２８％
ヨウ化物（銀電極による電位差滴定）：１％。
ＨＰＬＣ純度：９９．６％；不純物Ａ：０．２８％
ヨウ化物（銀電極による電位差滴定）：１％。
【0050】
既知の不純物が０．１５％を超え、かつ未知の不純物が０．１％を超える場合、より少ないヨウ化ナトリウムの使用によって第２の結晶化を実施することが可能であり、ヨウ化ナトリウムをより少なくすることは最終生成物中のヨウ化ナトリウムの量を２．５％未満に保つために不可欠である（実施例６）。
【0051】
［実施例５］
［ＮａＩを用いた式（ＩＡ）の化合物の調製（ＩＩ結晶化）］
第１の結晶化から得られた式（ＩＡ）の湿潤した化合物（実施例４に記載の通りに調製）（６３．７％、重量損失ベースで対応する乾燥生成物３５．９ｇに等しい）、ヨウ化ナトリウム（０．５４ｇ；１．５％ ｗ／ｗ）、イソプロパノール（１９４ｍｌ）及び水（１１５ｍｌ）を１リットルの反応器に充填する。５５～６０℃まで加熱し完全に溶解させ、次いで溶液をボール紙上で濾過し、フィルターを水（７ｍｌ）で洗浄、次にイソプロパノール（１８ｍｌ）で洗浄する。濾液を５５～６０℃にし、必要に応じて希釈したＮａＯＨで７．５～８．５の範囲にｐＨを校正し、次いで４５～５０℃まで冷却し、約３０分後にイソプロパノール（５４ｍｌ）を添加する。
［ＮａＩを用いた式（ＩＡ）の化合物の調製（ＩＩ結晶化）］
第１の結晶化から得られた式（ＩＡ）の湿潤した化合物（実施例４に記載の通りに調製）（６３．７％、重量損失ベースで対応する乾燥生成物３５．９ｇに等しい）、ヨウ化ナトリウム（０．５４ｇ；１．５％ ｗ／ｗ）、イソプロパノール（１９４ｍｌ）及び水（１１５ｍｌ）を１リットルの反応器に充填する。５５～６０℃まで加熱し完全に溶解させ、次いで溶液をボール紙上で濾過し、フィルターを水（７ｍｌ）で洗浄、次にイソプロパノール（１８ｍｌ）で洗浄する。濾液を５５～６０℃にし、必要に応じて希釈したＮａＯＨで７．５～８．５の範囲にｐＨを校正し、次いで４５～５０℃まで冷却し、約３０分後にイソプロパノール（５４ｍｌ）を添加する。
【0052】
上記対象物を２０～２５℃までゆっくり冷却し、再び３５～４０℃まで約１時間加熱し、次いで約１時間で２０～２５℃に戻して、撹拌を３０分間続ける。懸濁液を濾過し、イソプロパノールで洗浄し、湿潤した生成物を得て、これを真空中において５０～８０℃で２４～４８時間乾燥させる。
収量：２６．９ｇ（７５％）。
このようにして得られた生成物の純度は、本発明のＨＰＬＣ法を用いて測定すると９９．５％以上である。
ＨＰＬＣ純度：９９．９２％
不純物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ：定量不可能（ＨＰＬＣ）。
最大未知不純物：０．０８４％（ＨＰＬＣ； ｒｒｔ：０．４５）。
ヨウ化ナトリウム（ＵＳＰモノグラフによる電位差滴定）：０．９％。
残留イソプロパノール：１５９７ｐｐｍ。
収量：２６．９ｇ（７５％）。
このようにして得られた生成物の純度は、本発明のＨＰＬＣ法を用いて測定すると９９．５％以上である。
ＨＰＬＣ純度：９９．９２％
不純物Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦ：定量不可能（ＨＰＬＣ）。
最大未知不純物：０．０８４％（ＨＰＬＣ； ｒｒｔ：０．４５）。
ヨウ化ナトリウム（ＵＳＰモノグラフによる電位差滴定）：０．９％。
残留イソプロパノール：１５９７ｐｐｍ。
【0053】
［実施例５］
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の乾燥凍結テスト］
初めに、０．９％のヨウ化ナトリウムを含有する５ｍｇ／ｍｌ水の濃度で実施例５に記載の通り調製した化合物（ＩＡ）の１０ｍｌ水溶液、ヨウ化ナトリウムを使用せずに調製した５ｍｇ／ｍｌ水の濃度で実施例３に記載の通り調製した式（ＩＡ）の化合物の１０ｍｌ水溶液、及び２００ｍｇ／ｍｌ水の濃度で市販の式（ＩＢ）の化合物の１０ｍｌ水溶液について乾燥凍結テストを実行した。
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の乾燥凍結テスト］
初めに、０．９％のヨウ化ナトリウムを含有する５ｍｇ／ｍｌ水の濃度で実施例５に記載の通り調製した化合物（ＩＡ）の１０ｍｌ水溶液、ヨウ化ナトリウムを使用せずに調製した５ｍｇ／ｍｌ水の濃度で実施例３に記載の通り調製した式（ＩＡ）の化合物の１０ｍｌ水溶液、及び２００ｍｇ／ｍｌ水の濃度で市販の式（ＩＢ）の化合物の１０ｍｌ水溶液について乾燥凍結テストを実行した。
【0054】
乾燥凍結は７２時間で完了し、３つの乾燥凍結生成物はすべて水溶性であった。
【0055】
特に、ヨウ化ナトリウムを使用せずに得られた式（ＩＡ）の化合物（銀電極を用いた電位差滴定によるヨウ化ナトリウム＝０％）は、結晶化後の単離された乾燥粉末としてそのまま使用した場合、５ｍｇ／ｍｌまたは２．５ｍｇ／ｍｌの臨床的利用濃度では２０～２５℃の水に溶解しない。
【0056】
驚くべきことに、その代わりとして同じ乾燥凍結粉末は、２．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、さらには１０ｍｇ／ｍｌの濃度でも溶解する。
【0057】
溶解度は、得られたすべての溶液を０．４５μｍの穴を備えたシリンジフィルターで濾過することによって評価し、また、５ｍｇ／ｍｌ濃度の凍結乾燥粉末については、ＮａＩの有無にかかわらず、０．２μｍの穴を備えたものを用いて評価し、濾過が流体的に行われ、フィルター上にも、溶液を取り出したバイアル中にも残留物が残っていないことを観察した。
【0058】
この分子はおそらくそれ自体は可溶性であるが、反応速度論的な理由により、妥当な時間スケールでは溶解しない。一方、乾燥凍結粉末は水と接触する相対表面積が大きいため、超音波処理をする必要さえなく、完全かつ即座に溶解する傾向がある。これらの結果を表１にまとめる。
【表2】
【0059】
驚くべきことに、２つの成分を同時に凍結乾燥して、適切な量を同じバイアルに投与できることも見いだされた。このようにして得られた凍結乾燥生成物は、低濃度のヨウ化ナトリウムでも水に可溶であるため、水溶液を再構成した後、注射による２つの色素の同時投与に適している。
【0060】
１３～１８の凍結乾燥製剤（表２）の可溶化も、ＮａＩの存在の有無に関係なく、即時的である。
【0061】
特に、式（ＩＡ）の化合物、式（ＩＢ）の化合物、及びヨウ化ナトリウム（式（ＩＡ）の化合物に対する重量％として表示）の量を含有する凍結乾燥生成物を調製することが可能であり、以下の表２に報告されている：
【表3】
【0062】
［実施例６］
［式（ＩＢ）の化合物の乾燥凍結生成物の調製］
式（ＩＢ）の化合物であるフルオレセインナトリウム（市販品、５．０ｇ）を水（２５ｍｌ）に溶解し、１分間超音波処理する。この溶液を用いて５つの異なる琥珀色のガラスバイアルに充填する（バイアルあたり約５ｍｌの溶液）。バイアルは、すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
［式（ＩＢ）の化合物の乾燥凍結生成物の調製］
式（ＩＢ）の化合物であるフルオレセインナトリウム（市販品、５．０ｇ）を水（２５ｍｌ）に溶解し、１分間超音波処理する。この溶液を用いて５つの異なる琥珀色のガラスバイアルに充填する（バイアルあたり約５ｍｌの溶液）。バイアルは、すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
【0063】
［実施例７］
［式（ＩＡ）の化合物の乾燥凍結生成物の調製］
式（ＩＡ）の化合物（実施例５または実施例３に従って調製、１２５ｍｇ）を水（２５ｍｌ）に溶解し、１分間超音波処理する。
［式（ＩＡ）の化合物の乾燥凍結生成物の調製］
式（ＩＡ）の化合物（実施例５または実施例３に従って調製、１２５ｍｇ）を水（２５ｍｌ）に溶解し、１分間超音波処理する。
【0064】
この溶液を用いて５つの異なる琥珀色のガラスバイアルに充填する（バイアルあたり約５ｍｌの溶液）。バイアルは、すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
【0065】
［実施例８］
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の固体組成物の調製］
ＮａＩ溶液の調製
１００ｍｌのメスフラスコに３０ｍｇのヨウ化ナトリウムを秤量し、ＨＰＬＣ用に水で定容する。５分間超音波処理する。
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の固体組成物の調製］
ＮａＩ溶液の調製
１００ｍｌのメスフラスコに３０ｍｇのヨウ化ナトリウムを秤量し、ＨＰＬＣ用に水で定容する。５分間超音波処理する。
【0066】
式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の混合物を調製するための一般的な方法。
混合物の各成分の正確な量を表２に示す。
２０ｍｌの琥珀色のガラスバイアル中で、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物を正確に秤量する。
前に調製した正しい量のヨウ化ナトリウム溶液を加える。
適切な量の水を加える。
バイアルを窒素下、２０～２５℃で約１分間超音波処理する。
すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
各溶液に対して、５つの複製品を調製した。
混合物の各成分の正確な量を表２に示す。
２０ｍｌの琥珀色のガラスバイアル中で、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物を正確に秤量する。
前に調製した正しい量のヨウ化ナトリウム溶液を加える。
適切な量の水を加える。
バイアルを窒素下、２０～２５℃で約１分間超音波処理する。
すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
各溶液に対して、５つの複製品を調製した。
【0067】
［実施例９］
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の混合物を調製するための一般的方法：製剤１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８］
混合物の各成分の正確な量を表２に示す。
１０ｍｌフラスコ中で、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物を正確に秤量する。
適切な量の水を加える。
バイアルを窒素下、２０～３０℃で約１分間超音波処理する。
必要に応じて、上記より得られた溶液全体を新しいバイアル内の０．２μｍシリンジフィルターで濾過する。
すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の混合物を調製するための一般的方法：製剤１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８］
混合物の各成分の正確な量を表２に示す。
１０ｍｌフラスコ中で、式（ＩＡ）または（ＩＢ）の化合物を正確に秤量する。
適切な量の水を加える。
バイアルを窒素下、２０～３０℃で約１分間超音波処理する。
必要に応じて、上記より得られた溶液全体を新しいバイアル内の０．２μｍシリンジフィルターで濾過する。
すでに説明した凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥する。
【0068】
［実施例１０］
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の固体組成物の安定性］
式（ＩＡ）の化合物（ヨウ化物含むまたは含まず）及び式（ＩＢ）の化合物をそのまま及び凍結乾燥後に以下の方法に従ってＨＰＬＣで分析した。分析により、そのような化合物が安定であることを実証した。
［式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の化合物の固体組成物の安定性］
式（ＩＡ）の化合物（ヨウ化物含むまたは含まず）及び式（ＩＢ）の化合物をそのまま及び凍結乾燥後に以下の方法に従ってＨＰＬＣで分析した。分析により、そのような化合物が安定であることを実証した。
【0069】
分析方法（ＨＰＬＣ）
・カラムＨＰＬＣ：ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ４．６ｘ２５０ｍｍ ５μｍ
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
・ステップＡ：ギ酸アンモニウム ４．０９ｇ／Ｌ、ｐＨ＝５．０（ギ酸を用いて）
・ステップＢ：アセトニトリル
・混合相： ７０：３０ Ａ：Ｂ
・流量：１．５ｍｌ／分
・注入量：１０μＬ
・分析時間：３０分
・カラムＨＰＬＣ：ＯＤＳ Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ４．６ｘ２５０ｍｍ ５μｍ
・カラム温度：４０℃
・検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
・ステップＡ：ギ酸アンモニウム ４．０９ｇ／Ｌ、ｐＨ＝５．０（ギ酸を用いて）
・ステップＢ：アセトニトリル
・混合相： ７０：３０ Ａ：Ｂ
・流量：１．５ｍｌ／分
・注入量：１０μＬ
・分析時間：３０分
【表4】
【0070】
製剤１３～１８及びその調製に用いた化合物を以下の分析方法により分析した。分析により、クロマトグラムにＩａ及びＩｂ以外のピークが存在しないという事実に基づいて評価され、そのまま注入されたＩＡの純度が＞９９．５％であること、及び凍結乾燥後の製剤が安定であること、が確認された。
【0071】
分析方法（ＨＰＬＣ）
・カラムＨＰＬＣ：Ｐｏｌａｒｉｓ３ Ｃ１８－Ａ １５０ｘ４．６ｍｍ
・カラム温度：２０℃
・検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
・ステップＡ：１０００ｍｌ中の酢酸アンモニウム２．３ｇを希酢酸またはアンモニアでｐＨ６．８±０．０５に調整
・ステップＢ：アセトニトリル
・希釈剤：メタノール
・流量：１．５ｍｌ／分
・注入量：１０μＬ
・分析時間：３４分
・オートサンプラー温度：５℃
・カラムＨＰＬＣ：Ｐｏｌａｒｉｓ３ Ｃ１８－Ａ １５０ｘ４．６ｍｍ
・カラム温度：２０℃
・検出器：ＵＶ２５４ｎｍ
・ステップＡ：１０００ｍｌ中の酢酸アンモニウム２．３ｇを希酢酸またはアンモニアでｐＨ６．８±０．０５に調整
・ステップＢ：アセトニトリル
・希釈剤：メタノール
・流量：１．５ｍｌ／分
・注入量：１０μＬ
・分析時間：３４分
・オートサンプラー温度：５℃
【表5】
【0072】
表２に記載の式（ＩＡ）及び（ＩＢ）の混合物を調製し、次いで適切に希釈し、ＨＰＬＣに注入して、Ｔ０でのプロファイルを評価した。
【0073】
同じ混合物を実験パートに記載したとおりに正確に再調製、乾燥凍結し、凍結乾燥後（７日後に）ＨＰＬＣで制御した。この７日間の間、サンプルは琥珀色のガラスバイアル内で、保護雰囲気下、室温で保管した。凍結乾燥生成物を、非凍結乾燥サンプルと同じ希釈率で水に溶解した。
【0074】
この分析から、凍結乾燥は、ヨウ化ナトリウムの有無に関わらず、式（ＩＡ）の化合物をそのままの状態でも、または式（ＩＢ）の化合物との混合物としてでも劣化させないことが明らかである。バイアルに保存された凍結乾燥粉末の安定性を、６か月後にＨＰＬＣを使用して評価した。凍結乾燥製品は、ヨウ化ナトリウムが存在しなくても安定している（製剤９）。
【0075】
再構成された溶液は、４～１０℃で少なくとも２４時間保存した場合には安定であった（製剤１、３、５及び７）。
【表6】
【表7】
【表8】
【表9】
【表10】
【表11】
【国際調査報告】