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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-12
(54)【発明の名称】金属回収のための新しいシュードモナス菌株
(51)【国際特許分類】
C12N 15/31 20060101AFI20240305BHJP
C12N 1/20 20060101ALI20240305BHJP
【ＦＩ】
C12N15/31 ZNA
C12N1/20 A
C12N1/20 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023552284
(86)(22)【出願日】2022-02-23
(85)【翻訳文提出日】2023-09-20
(86)【国際出願番号】 EP2022054554
(87)【国際公開番号】W WO2022184525
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】21159994.9
(32)【優先日】2021-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522322778
【氏名又は名称】ブレイン バイオテック アーゲー
(74)【代理人】
【識別番号】110003018
【氏名又は名称】弁理士法人プロテクトスタンス
(72)【発明者】
【氏名】ガボール エステル
(72)【発明者】
【氏名】シュルツェ レナーテ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA41X
4B065BA22
4B065BC01
4B065CA60
(57)【要約】
【課題】 金属、特に貴金属、特に白金族金属を優先的に結合・分離できる微生物が求められている。
【解決手段】 本発明は、シュードモナス属BR87641として同定されたシュードモナス属の１種あり、寄託番号 DSM 33684を有するキャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンス（Candidatus Pseudomonas pretiosorbens）に関する。
【選択図】図１
【解決手段】 本発明は、シュードモナス属BR87641として同定されたシュードモナス属の１種あり、寄託番号 DSM 33684を有するキャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンス（Candidatus Pseudomonas pretiosorbens）に関する。
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
SEQ ID No.2と少なくとも９４％の同一性を有する、金属の回収が可能な単離されたシュードモナス細菌。
【請求項2】
単離されたシュードモナス細菌が、SEQ ID No.2に対して少なくとも９６％の同一性を有する、請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌。
【請求項3】
請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌であって、該単離されたシュードモナス細菌がSEQ ID No.2と少なくとも９８％の同一性を有する、単離されたシュードモナス細菌。
【請求項4】
単離されたシュードモナス細菌が、シュードモナス属の１種であり、Pseudomonas sp.BR8764として同定され、キャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンス（Candidatus Pseudomonas pretiosorbens）と命名され、寄託番号DSM 33684を有する、請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌。
【請求項5】
前記シュードモナス属細菌が、液体物質から白金族金属、金属および／または貴金属を回収することができる、請求項1から請求項４の１項に記載の単離されたシュードモナス属細菌。
【請求項6】
金属回収のための請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌の使用。
【請求項7】
貴金属および／または白金族金属の金属回収のための、請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌の使用。
【請求項8】
液体物質流からの金属回収のための請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌の使用。
【請求項9】
液体物質流が、鉱山排水、共同または工業廃水、プロセス流、例えば金属精錬またはリサイクルプロセスからのプロセス流、およびバイオリーチングプロセスからの上澄み液から選択される、請求項８による単離されたシュードモナス細菌の使用。
【請求項10】
白金族金属が、パラジウム、白金、ルテニウム、ロジウム、オスミウム、イリジウム、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６から請求項９の少なくとも１項に記載の使用。
【請求項11】
単離されたシュードモナス細菌が、シュードモナス属の１種であり、シュードモナス属BR8764と同定され、キャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンス（Candidatus Pseudomonas pretiosorbens）と命名され、寄託番号DSM 33684を有する、請求項６から請求項１０の少なくとも１項に記載の使用。
【請求項12】
（ａ）金属回収、特に貴金属および／または白金族金属の金属回収を促進するのに有効な量の、請求項１に記載の単離されたシュードモナス細菌；（ｂ）少なくとも1種の液体物質；
を含む組成物。
【請求項13】
少なくとも１つの液体物質（ｂ）が、二次資源から選択され、ここで二次資源が、鉱山排水、共同または工業廃水、プロセス流、例えば金属精製またはリサイクルプロセスからの廃水、ならびにバイオリーチングプロセスからの上澄みから選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項14】
白金族金属が、ルテニウム、ロジウム、パラジウム、オスミウム、イリジウム、白金およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１２または請求項１３に記載の組成物。
【請求項15】
SEQ ID No.2と少なくとも９４％の同一性を有する単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
本発明は、金属の回収が可能な単離されたシュードモナス（Pseudomonas）細菌、すなわち、キャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンス（Candidatus Pseudomonas pretiosorbens）と命名されるシュードモナス属の新種、金属回収のためのその使用、新種および単離された核酸を含む組成物に関する。
【0002】
多くの生きた微生物だけでなく、生きていない不活性化細胞も金属イオンやナノ粒子と結合する能力を持っている。金属結合は、細胞表面への吸着を介して起こることもあれば、バイオ収着（biosorption ）またはバイオ吸着（ bioadsorption）と呼ばれることが多い金属の活発な細胞内蓄積を介して起こることもある。非活性化、不活性化した細胞の場合、金属イオンやナノ粒子の結合は専ら表面吸着を介して起こると考えられている。バイオマスの一般的な特徴としてのバイオ収着能力は、細胞表面に存在する炭水化物、脂質、タンパク質によるキレート基（例えばカルボキシル基、アミド基、ヒドロキシル基、リン酸基、チオール基など）の存在に起因する。バイオマスには、細胞乾燥重量の５０％までの量の金属が蓄積され得ると記載されている(Vieira and Volesky, 2000)。特許文献１には、３００～５００℃の温度で熱不活性化した金属結合微生物から調製したマトリックスを用いて、水溶液から金属イオンを除去するプロセスを記載している。しかしながら、有機表面構造による特異的な結合メカニズムは、この手順によって回避される。
【0003】
特許文献２には、微生物によって生成されたリン酸イオンと金属をポリリン酸塩に反応させることによって、ランタンやイットリウムなどの希土類元素を含む金属を蓄積させることが記載されている。アセトバクター属の微生物が金属-ポリリン酸塩を蓄積することで、金属が沈殿・枯渇しやすくなり、金属汚染水の浄化が可能になる。特許文献３には、細菌、培地および粉砕した鉱石の混合物を使用して、鉱石からガリウムおよびゲルマニウムを浸出するためのバイオマイニング手順が記載されている。しかし、バイオマスを大規模に生産できる微生物を用いて、液体廃棄物から相当量の白金族金属を回収することができるプロセスは、これまで記述されていない。
【0004】
非特許文献１は、Saccharomyces cerevisiaeとAspergillus terreusとのバイオマスを用いた溶液からのスカンジウムとイットリウムのバイオ収着について記述している。特許文献４及び特許文献５ は、クプリアヴィドゥス・メタッリデュランス、枯草菌およびシュードモナス・プチダを微生物として用いて、固体原料から金属、特に金を回収する方法を記載している。しかし、金属、特に貴金属、特に白金族金属を優先的に結合・分離できる微生物が求められている。さらに、バイオマスを大規模に生産できる非病原性の頑健な微生物が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許公開１９９１／５０５５４０２
【特許文献2】欧州特許０６７３３５０Ｂ１
【特許文献3】国際公開 １９９１／００３４２４
【特許文献4】国際公開 ２０１８／０８０３２６Ａ１
【特許文献5】国際公開 ２０１８／０８４７２３Ａ1
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Karavaiko et al., Biotechnology Letters, 18 (1996) 1291-1296
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
この目的は、本発明の請求項１によって解決される。この請求項１は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対して少なくとも９４％の同一性を有する、金属を回収することができる単離されたシュードモナス細菌に関する。
【0008】
驚くべきことに、本発明者らは、本発明による単離されたシュードモナス細菌が、例えば以下のような多くの有利な特性を有することを見出した。
（a） 鉱山排水、生活排水または工業排水、プロセスストリーム、また例えば金属精製またはリサイクルプロセスからのプロセスストリーム、ならびにバイオリーチングプロセスからの上澄み液などの多様な液体物質流から貴金属および／または白金族金属を回収することができること。
（b） ｐＨ＜１の酸性浸出液、中性溶液以上からｐＨ＞１３のアルカリ浸出液に至るまで、非常に広いｐＨ範囲で貴金属および／または白金族金属の回収および濃縮をもたらす表面構造を有すること。
（c） 生細胞、不活性化細胞、および固定化された生細胞および／または不活性化細胞を用いて貴金属および／または白金族金属を回収すること。
（d） 有害元素や化合物、熱、ｐＨなどの外部条件に対して高い耐性を有すること。
（e） 高細胞密度で培養可能なリスクグループ１の生物であること。
（a） 鉱山排水、生活排水または工業排水、プロセスストリーム、また例えば金属精製またはリサイクルプロセスからのプロセスストリーム、ならびにバイオリーチングプロセスからの上澄み液などの多様な液体物質流から貴金属および／または白金族金属を回収することができること。
（b） ｐＨ＜１の酸性浸出液、中性溶液以上からｐＨ＞１３のアルカリ浸出液に至るまで、非常に広いｐＨ範囲で貴金属および／または白金族金属の回収および濃縮をもたらす表面構造を有すること。
（c） 生細胞、不活性化細胞、および固定化された生細胞および／または不活性化細胞を用いて貴金属および／または白金族金属を回収すること。
（d） 有害元素や化合物、熱、ｐＨなどの外部条件に対して高い耐性を有すること。
（e） 高細胞密度で培養可能なリスクグループ１の生物であること。
【0009】
本発明による好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２に対して少なくとも９６％の同一性を有する。本発明によるより好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ２に対して少なくとも９８％の同一性を有する。
【0010】
本発明による最も好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、シュードモナス属の種であり、Pseudomonas sp.BR8764として同定され、キャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンスと命名され、寄託番号ＤＳＭ ３３６８４を有する。
【0011】
本明細書で使用する場合、（Pseudomonas sp.BR8764に関して）用語「種」、「菌株」、および「シュードモナス・プレティオソルベンス（Pseudomonas pretiosorbens）」は、用語がすべて、Pseudomonas sp.BR8764として同定されたキャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンス（寄託番号ＤＳＭ ３３６８４を有する）に関連するので、同義的に使用され得る。
【0012】
本発明による白金族金属は、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）（軽白金族金属）、およびオスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）（重白金族金属）並びにそれらの混合物として定義される。
【0013】
本発明による貴金属は、白金族金属、さらに金および銀ならびにそれらの混合物から選択されるものとして定義される
【0014】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかにそうでないことが指示されない限り、複数の参照を含む。例えば、用語「化合物」または「少なくとも１つの化合物」は、それらの混合物を含む複数の化合物を含む場合がある。したがって、例えば、「液体物質」への言及は、複数の液体物質も含む。「核酸」という用語の使用は、実際問題として、その核酸分子の多数のコピーを任意に含む。
【0015】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、値を決定するために採用される方法に固有の誤差の変動、または値の間に存在する変動を値が含むことを示す。
【0016】
本明細書で使用する用語「バイオ収着」または「バイオ収着に基づくプロセス」は、材料からの金属の回収および濃縮を意味する。本発明による好ましい実施形態では、材料からの白金族金属および／または貴金属からの回収が行われる。さらに好ましい実施形態では、液体物質からの白金族金属および／または貴金属からの回収である。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】16SrRNA遺伝子の部分配列に基づき、フィルターpju6q4wa（arb-programを用いた大腸菌の位置100から1427まで、Ludwig et al.,2004）を用いてJukes-Cantor補正法により算出した距離行列である。ツリーデンドログラムは近傍結合法で作成した。
【図2】ハウスキーピング遺伝子rpoB（プログラムarb、フィルターSAI_AJ7174 912 nt、Ludwig et al, 2004）の部分遺伝子配列（912 nt）の配列類似度（パーセンテージで表示）を示す。
【図3】ハウスキーピング遺伝子rpoD（プログラムarb、フィルターcFM25190 560 nt Ludwig et al, 2004）の部分遺伝子配列（560 nt）の配列類似性（パーセンテージで表示）を示す。
【図4】BLASTアルゴリズムに基づく平均ヌクレオチド同一性（ANIb）を示す。ANIb分析（同一性パーセント）は、プログラムPYANI（Pritchard et al.（2016））を用いて行った。
【図5】製造者の指示に従った、API 20 NE（BIOMERIEUX社製）およびBIOLOG PM1およびPM2Aプレート（BIOLOG社製）に基づく炭素利用試験である、非ファスト化性、非腸炎性グラム陰性桿菌の同定のための標準化システムを用いた、 Pseudomonas sp.BR8764の生理学的形質の分析を示す。結果は、関連菌株の選択結果と比較した。
【図6】SEQ ID No.1であるPseudomonas sp. BR8764の16S rRNA遺伝子配列を示す。
【0018】
バイオ収着：
既に上述したように、本発明による単離されたシュードモナス細菌は、金属、特に貴金属、より具体的には白金族金属を、バイオ収着によって液体物質から回収することができる。
既に上述したように、本発明による単離されたシュードモナス細菌は、金属、特に貴金属、より具体的には白金族金属を、バイオ収着によって液体物質から回収することができる。
【0019】
「液体物質」という用語は、水、非水溶媒、有機溶媒、またはそれらの混合物をベースとする、金属イオン、金属錯体、または金属ナノ粒子の溶液を意味する。水をベースとする液体物質とは、例えば、鉱山排水、生活排水または工業排水、自然水域および帯水層、ならびに酸性およびアルカリ性のバイオリーチング溶液である。濃縮または希釈された非水性溶媒または有機溶媒またはそれらの混合物をベースとする液体物質は、通常、鉱業、金属精錬および金属リサイクル産業で使用される化学プロセスに由来する。本発明による好ましい実施形態では、液体物質は水性である。
【0020】
シュードモナス（Pseudomonas）sp.BR8764：
本発明の好ましい実施形態によれば、Pseudomonas sp.BR8764が新規な生物として提供される。この生物は、液体物質から金属、特に貴金属、より具体的には白金族金属を回収するために使用することができる。驚くべきことに、この生物は、鉛、クロム、カドミウムのような高レベルの有害金属を含む物質からも標的金属をバイオ収着できる。このことから、この生物のバイオマスは、液体物質から金属、特に貴金属、より具体的には白金族金属をバイオ収着または金属回収できるだけでなく、有毒元素や化合物、熱、極端なｐＨ条件などの外部条件に対して高い耐性を持つという結論が得られる。
本発明の好ましい実施形態によれば、Pseudomonas sp.BR8764が新規な生物として提供される。この生物は、液体物質から金属、特に貴金属、より具体的には白金族金属を回収するために使用することができる。驚くべきことに、この生物は、鉛、クロム、カドミウムのような高レベルの有害金属を含む物質からも標的金属をバイオ収着できる。このことから、この生物のバイオマスは、液体物質から金属、特に貴金属、より具体的には白金族金属をバイオ収着または金属回収できるだけでなく、有毒元素や化合物、熱、極端なｐＨ条件などの外部条件に対して高い耐性を持つという結論が得られる。
【0021】
Pseudomonas sp. BR8764はシュードモナス属の新規種であることが判明した。Pseudomonas sp. BR8764のシュードモナス属の新規種への分類は、表現型（API、BIOLOG）および遺伝子型のデータによって支持された。ゲノムデータは、ハウスキーピング遺伝子rpoB、rpoD、gyrBの部分配列の系統解析と、スキャフォールドゲノムを用いたBLASTアルゴリズムに基づく平均塩基同一性（ANI）の算出に使用した。図４に示すように、ANIb類似度は９１％以下であった。これらの結果から、 Pseudomonas sp. BR8764はシュードモナス属の新種であることがさらに明らかになった。Pseudomonas sp. BR8764のスキャフォールドゲノムと少なくとも９４％のANIを共有するシュードモナス株は、シュードモナスの新グループの一部とみなされる（Goris et al., 2007）。
【0022】
Pseudomonas sp. BR8764の生理学は、API（Biomerieux API 20 NE）およびBIOLOG（BIOLOG PM1、PM2A）分析によって示されるように、これまでに知られているシュードモナス種とは異なることが見出された。
【0023】
生物学的材料の寄託：
単離され同定された種Pseudomonas sp.BR8764は、ブダペスト条約の規定に基づき、２０２０年１１月５日にライプニッツ研究所ＤＳＭＺ－ドイツ微生物・細胞培養コレクションに寄託された。
アクセッション番号ＤＳＭ ３３６８４。
単離され同定された種Pseudomonas sp.BR8764は、ブダペスト条約の規定に基づき、２０２０年１１月５日にライプニッツ研究所ＤＳＭＺ－ドイツ微生物・細胞培養コレクションに寄託された。
アクセッション番号ＤＳＭ ３３６８４。
【0024】
本発明による好ましい実施形態において、本発明による単離されたシュードモナス細菌、好ましくは新種のPseudomonas sp. BR8764は、リスクグループ１に属する。 リスクグループ」という用語は、微生物の分類のために多くの国で使用されている分類システムである。リスクグループへの所属は、例えば以下の要因によって決まる。- 微生物の病原性
- 感染様式と宿主範囲
- 効果的な予防措置の有無（ワクチンなど）
- 効果的な治療法の有無（抗生物質など）
リスクグループ１属するすべての微生物は、健康な成人(NIH Guidelines in Recombinant DNA, 2002年4月参照)の疾患と関連していない。
- 感染様式と宿主範囲
- 効果的な予防措置の有無（ワクチンなど）
- 効果的な治療法の有無（抗生物質など）
リスクグループ１属するすべての微生物は、健康な成人(NIH Guidelines in Recombinant DNA, 2002年4月参照)の疾患と関連していない。
【0025】
本発明による実施形態において、 Pseudomonas sp. BR8764のリボソームDNAは、SEQ ID No．1である。
【0026】
使用：
本発明による実施形態の一つにおいて、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対して少なくとも９４％の同一性を有する単離されたシュードモナス細菌は、液体物質流からの金属、特に貴金属、具体的には白金族金属の回収のために使用される。
本発明による実施形態の一つにおいて、ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．２に対して少なくとも９４％の同一性を有する単離されたシュードモナス細菌は、液体物質流からの金属、特に貴金属、具体的には白金族金属の回収のために使用される。
【0027】
好ましくは、液体物体流は鉱山排水、生活排水または工業排水、プロセスストリーム、また例えば金属精製またはリサイクルプロセス、およびバイオリーチングプロセスからの上澄み液から選択される。
【0028】
すでに上述したように、白金族金属は、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ））（軽白金族金属）、およびオスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）（重白金族金属）並びにそれらの混合物として定義される。
【0029】
本発明による好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No 2に対して少なくとも９６％の同一性を有する。本発明によるより好ましい実施態様において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No 2に対して少なくとも９８％の同一性を有する。
【0030】
さらに好ましいのは、液体物質流からの金属、特に貴金属、特に白金族金属の回収のための Pseudomonas sp.BR8764の使用である。
【0031】
好ましい実施形態の一つにおいて、本発明によるシュードモナス細菌は、遊離バイオマスの形態で使用することができる。バイオマスは、生細胞または不活性化細胞または架橋細胞からなり得る。別の好ましい実施形態において、シュードモナス細菌は、以下に記載されるように、販売された担体材料内または表面上に細胞を含む組成物、または架橋細胞として使用することができる。
【0032】
組成物：
本発明によるさらなる実施形態は、以下を含む組成物に関する。
（ａ）金属回収、特に貴金属および／または白金族金属の金属回収を促進するのに有効な量の、SEQ ID No 2に対して少なくとも94％の同一性を有する単離されたシュードモナス細菌。
（ｂ）少なくとも１種の液体物質。
本発明によるさらなる実施形態は、以下を含む組成物に関する。
（ａ）金属回収、特に貴金属および／または白金族金属の金属回収を促進するのに有効な量の、SEQ ID No 2に対して少なくとも94％の同一性を有する単離されたシュードモナス細菌。
（ｂ）少なくとも１種の液体物質。
【0033】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの液体物質（ｂ）は、二次資源から選択され、ここで、二次資源は、鉱山排水、生活排水または工業廃水、プロセスストリーム、例えば金属精錬またはリサイクルプロセスからの廃水、ならびにバイオリーチングプロセスからの上澄み液から選択される。
【0034】
すでに上述したように、白金族金属は、ルテニウム（Ｒｕ）、ロジウム（Ｒｈ）、パラジウム（Ｐｄ）（軽白金族金属）、およびオスミウム（Ｏｓ）、イリジウム（Ｉｒ）、白金（Ｐｔ）（重白金族金属）並びにそれらの混合物として定義される。
【0035】
本発明による好ましい実施形態において、本発明によるシュードモナス細菌は、７０℃を超える温度で熱不活性化される。別の実施形態において、b）において使用されるポリマーは、例えばアルギン酸塩、ポリビニルアルコール-アルギン酸塩、ゲルライト、ケイ酸塩またはゾルゲルマトリックスである。本発明による好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No.2に対して少なくとも９６％の同一性を有する。本発明によるより好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No 2に対して少なくとも９８％の同一性を有する。好ましくは、シュードモナス細菌は、 Pseudomonas sp. BR8764から選択される。
【0036】
さらに好ましいのは、以下を含む組成物である。
（ａ）金属、特に白金族金属等の回収を可能にするのに有効な量の、SEQ ID No2に対して少なくとも９４％の同一性を有するシュードモナス細菌の生細胞または不活性化細胞の調製物であって、前記シュードモナス細菌の調製物が有機もしくは無機ポリマーまたは固体材料に包埋されており、有機もしくは無機ポリマーまたは該固体材料が前記シュードモナス細菌の調製物のための担体として機能する、調製物；および
（ｂ）少なくとも１つの液体物質。
（ａ）金属、特に白金族金属等の回収を可能にするのに有効な量の、SEQ ID No2に対して少なくとも９４％の同一性を有するシュードモナス細菌の生細胞または不活性化細胞の調製物であって、前記シュードモナス細菌の調製物が有機もしくは無機ポリマーまたは固体材料に包埋されており、有機もしくは無機ポリマーまたは該固体材料が前記シュードモナス細菌の調製物のための担体として機能する、調製物；および
（ｂ）少なくとも１つの液体物質。
【0037】
固体担体に適した材料は、ベントナイトのようなセラミック材料、またはポリウレタンフォームおよびパリ石膏、石膏またはナイロンのような材料である。
【0038】
本発明のさらなる実施形態において、シュードモナス細菌の生細胞または不活性化細胞の調製物は、例えば、グルタルアルデヒドもしくはポリエチレンイミン、またはシュウ酸およびポリエチレンイミンで架橋される。
【0039】
本発明による好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No ２に対して少なくとも９６％の同一性を有する。本発明によるより好ましい実施態様において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No ２に対して少なくとも９８％の同一性を有する。好ましくは、シュードモナス細菌は、 Pseudomonas sp. BR8764から選択される。
【0040】
方法：
本発明による一実施形態は、SEQ ID No 2と少なくとも９４％の同一性を有するシュードモナス細菌を用いて液体物質から金属を回収する方法に関する。本発明による好ましい実施形態において、この方法は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる
（ａ）シュードモナス細菌のバイオマスを液体物質と共にインキュベートする工程、
（ｂ）バイオマスと金属欠乏液体物質の分離する工程、
（ｃ）バイオマスからの金属の回収する工程。
この工程において、金属は、例えば、可燃性バイオマスの溶出または焼却によってバイオマスから放出される。
本発明による一実施形態は、SEQ ID No 2と少なくとも９４％の同一性を有するシュードモナス細菌を用いて液体物質から金属を回収する方法に関する。本発明による好ましい実施形態において、この方法は、以下の工程を含むか、または以下の工程からなる
（ａ）シュードモナス細菌のバイオマスを液体物質と共にインキュベートする工程、
（ｂ）バイオマスと金属欠乏液体物質の分離する工程、
（ｃ）バイオマスからの金属の回収する工程。
この工程において、金属は、例えば、可燃性バイオマスの溶出または焼却によってバイオマスから放出される。
【0041】
工程（ａ）では、金属イオン、錯体またはナノ粒子がバイオマスに結合する。工程（ｂ）では、金属イオン、錯体またはナノ粒子を濃縮し、液体物質から分離する。この工程は、例えば、遠心分離または沈降などの標準的な固液分離法によって実現することができる。
【0042】
本発明による好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No 2に対して少なくとも９６％の同一性を有する。本発明によるより好ましい実施形態において、単離されたシュードモナス細菌は、SEQ ID No 2に対して少なくとも９８％の同一性を有する。好ましくは、シュードモナス細菌は、 Pseudomonas sp. BR8764から選択される。
【0043】
単離された核酸：
本発明によるさらなる実施形態は、SEQ ID No.2に対して少なくとも９４％の同一性を有する単離された核酸に関する。
本発明によるさらなる実施形態は、SEQ ID No.2に対して少なくとも９４％の同一性を有する単離された核酸に関する。
【0044】
本発明による好ましい実施態様において、単離された核酸は、SEQ ID No.2に対して少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有する。本発明による別の好ましい実施形態において、単離された核酸は、SEQ ID No.2に対して１００％の同一性を有する。
すなわち、単離された核酸はSEQ ID No.２である。
すなわち、単離された核酸はSEQ ID No.２である。
【0045】
本明細書で使用される場合、核酸に関連して使用される場合の「同一性」という用語は、２つ以上のヌクレオチド配列間の類似性の程度を表す。２つの配列間の「配列同一性」のパーセンテージは、２つの配列の最適なアラインメントのための参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して、比較ウインドウ内の配列の部分が付加または欠失（ギャップ）を含み得るように、比較ウインドウにわたって最適にアラインメントされた２つの配列を比較することによって決定され得る。パーセンテージは、両配列において同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して一致した位置の数を得、一致した位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。参照配列と比較してすべての位置で同一である配列は、参照配列と同一であると言われ、逆もまた同様である。２つ以上の配列のアラインメントは、任意の適切なコンピュータプログラムを用いて実行することができる。例えば、配列アラインメントを実行するために広く使用され、受け入れられているコンピュータプログラムは、CLUSTALW vl .6（Tompson, et al. Acids Res., 22: 4673-4680）である。
【0046】
SEQ ID No.2は人工配列を表す。この人工配列はナノポア配列決定されており、Pseudomonas sp. BR8764のゲノム配列を表す。さらに、ナノポア配列は、イルミナ技術でさらに研磨された。ナノポア配列は、バイオポリマー、具体的にはＤＮＡまたはＲＮＡの形態のポリヌクレオチドの配列決定に用いられる第３世代のアプローチである。ナノポアシークエンシングを使用することで、ＰＣＲ増幅やサンプルの化学標識の必要なく、ＤＮＡまたはＲＮＡの１分子をシーケンスすることができる。ＤＮＡ／ＲＮＡはナノメートルサイズの孔を通って輸送される。ＤＮＡ／ＲＮＡがこの孔を通過する際、孔にかかる電圧が変化する。電圧の変化は４つの核酸塩基のそれぞれに特異的で、これにより塩基配列を認識することができる。ナノポア自体は、高分子膜に埋め込まれた組み換えタンパク質で構成されている。
【実施例】
【0047】
実施例１：Pseudomonas sp.BR8764の単離
Pseudomonas sp. BR8764単離のための環境サンプルは、２０１２年２月２８日にドイツ、ハスラッハのGrube Segen Gottesで採取された。したがって、この菌株には名古屋議定書の制限はない。この菌株は少量の環境サンプルを約５００μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＴＳＢ寒天プレートにプレーティングするという手順で単離された。培養温度は１０℃で、出現した微生物コロニーをＬＢ寒天培地プレートに移し、新鮮なＬＢ寒天培地プレート上で「クリーンストリーク」によって精製した。小規模培養は、ＬＢ培地（Bacto Tryptone #211705（BD）1%（w/v）、Bacto Yeast Extract #212750（BD）0.5%（w/v）、NaCl #141659.1221（Applichem）0.5%（w/v）など）を用いて２８℃で行った。
Pseudomonas sp. BR8764単離のための環境サンプルは、２０１２年２月２８日にドイツ、ハスラッハのGrube Segen Gottesで採取された。したがって、この菌株には名古屋議定書の制限はない。この菌株は少量の環境サンプルを約５００μｌの０．９％ＮａＣｌ溶液に懸濁し、ＴＳＢ寒天プレートにプレーティングするという手順で単離された。培養温度は１０℃で、出現した微生物コロニーをＬＢ寒天培地プレートに移し、新鮮なＬＢ寒天培地プレート上で「クリーンストリーク」によって精製した。小規模培養は、ＬＢ培地（Bacto Tryptone #211705（BD）1%（w/v）、Bacto Yeast Extract #212750（BD）0.5%（w/v）、NaCl #141659.1221（Applichem）0.5%（w/v）など）を用いて２８℃で行った。
【0048】
実施例２：Pseudomonas sp. BR8764の系統学的解析およびシュードモナス属の新規キャンディダスの定義
まず、Pseudomonas sp.BR8764菌株のシュードモナス属への帰属を、プログラムarb（Ludwig et al., 2004）を用いて部分的な16S rRNA遺伝子配列（図1）の16S rRNA遺伝子解析を行うことにより示した。Pseudomonas sp. BR8764の16S rDNA配列を図６およびSEQ ID No.1に示す。Pseudomonas sp. BR8764の系統関係をさらに調べるために、ハウスキーピング遺伝子rpoBおよびrpoDを解析した。プライマーLAPSおよびLAPS27は、部分的なrpoB遺伝子（Tayeb et al.）を増幅するために使用した。 rpoDの部分配列の増幅には、PsEG30F/PsEG790Rプライマーを使用した（Mulet et al.）。 図２に示すように、最大類似度はrpoBの場合で約９８％であった。さらに近縁型株との関係を調べるために、rpoDの部分配列の類似性を解析した。図３に示すように、近縁型株との最大類似度は、rpoBの部分配列が９７％または９８％前後の類似度を示すすべての型株配列を含めて、９３％前後またはそれ以下であった。すべてのrpoD配列の類似度が低いことから、Pseudomonas sp. BR8764は新種の可能性がある。系統関係をさらに調べるために、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション実験の代替法である平均塩基同一性（ＡＮＩ）分析（例えばRichter and Rossello-Mora, 2009）が選択された。提案された種レベルの境界は、約９４％のＡＮＩに設定された（例：Richter and Rossello-Mora, 2009）。図４に示すように、ANIb類似度は９１％以下である。これらの結果は、Pseudomonas sp. BR8764がシュードモナス属の新種であることをさらに強調している。Pseudomonas sp. BR8764のスキャフォールドゲノムと少なくとも９４％のＡＮＩを共有するシュードモナス菌株は、シュードモナスの新グループの一部とみなされる（Goris et al. 2007）。
Pseudomonas sp.BR8764の生理学的形質を解析するために、API 20 NE（BIOMERIEUX）を用いた非固定性非腸炎グラム陰性桿菌の標準的同定システムと、BIOLOG PM1およびPM2Aプレート（BIOLOG）を用いた炭素利用試験を、製造元の指示に従って実施した。結果は、関連菌株の生理学的試験の文献から選択した結果と比較した。関連菌株は、上記の系統的配列解析結果に基づいて選択した（図１～図４）。解析の結果、Pseudomonas sp. BR8764 の生理機能は、API および BIOLOG アッセイで示されたように、これまでに知られている シュードモナス 属とは異なることが明らかになった（図５） Pseudomonas sp. BR8764は、２０℃、２８℃、３０℃で増殖するが、３７℃では増殖しない。
これらのデータから、Pseudomonas sp. BR8764は、キャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンスと呼ばれるシュードモナス属の新種に分類できることがさらに明確になった。
分離・同定された菌株は、２０２０年１１月５日にライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物・細胞培養コレクション）に提出された。この菌株のアクセッション番号はDSM 33684である。
まず、Pseudomonas sp.BR8764菌株のシュードモナス属への帰属を、プログラムarb（Ludwig et al., 2004）を用いて部分的な16S rRNA遺伝子配列（図1）の16S rRNA遺伝子解析を行うことにより示した。Pseudomonas sp. BR8764の16S rDNA配列を図６およびSEQ ID No.1に示す。Pseudomonas sp. BR8764の系統関係をさらに調べるために、ハウスキーピング遺伝子rpoBおよびrpoDを解析した。プライマーLAPSおよびLAPS27は、部分的なrpoB遺伝子（Tayeb et al.）を増幅するために使用した。 rpoDの部分配列の増幅には、PsEG30F/PsEG790Rプライマーを使用した（Mulet et al.）。 図２に示すように、最大類似度はrpoBの場合で約９８％であった。さらに近縁型株との関係を調べるために、rpoDの部分配列の類似性を解析した。図３に示すように、近縁型株との最大類似度は、rpoBの部分配列が９７％または９８％前後の類似度を示すすべての型株配列を含めて、９３％前後またはそれ以下であった。すべてのrpoD配列の類似度が低いことから、Pseudomonas sp. BR8764は新種の可能性がある。系統関係をさらに調べるために、ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリダイゼーション実験の代替法である平均塩基同一性（ＡＮＩ）分析（例えばRichter and Rossello-Mora, 2009）が選択された。提案された種レベルの境界は、約９４％のＡＮＩに設定された（例：Richter and Rossello-Mora, 2009）。図４に示すように、ANIb類似度は９１％以下である。これらの結果は、Pseudomonas sp. BR8764がシュードモナス属の新種であることをさらに強調している。Pseudomonas sp. BR8764のスキャフォールドゲノムと少なくとも９４％のＡＮＩを共有するシュードモナス菌株は、シュードモナスの新グループの一部とみなされる（Goris et al. 2007）。
Pseudomonas sp.BR8764の生理学的形質を解析するために、API 20 NE（BIOMERIEUX）を用いた非固定性非腸炎グラム陰性桿菌の標準的同定システムと、BIOLOG PM1およびPM2Aプレート（BIOLOG）を用いた炭素利用試験を、製造元の指示に従って実施した。結果は、関連菌株の生理学的試験の文献から選択した結果と比較した。関連菌株は、上記の系統的配列解析結果に基づいて選択した（図１～図４）。解析の結果、Pseudomonas sp. BR8764 の生理機能は、API および BIOLOG アッセイで示されたように、これまでに知られている シュードモナス 属とは異なることが明らかになった（図５） Pseudomonas sp. BR8764は、２０℃、２８℃、３０℃で増殖するが、３７℃では増殖しない。
これらのデータから、Pseudomonas sp. BR8764は、キャンディダス・シュードモナス・プレティオソルベンスと呼ばれるシュードモナス属の新種に分類できることがさらに明確になった。
分離・同定された菌株は、２０２０年１１月５日にライプニッツ研究所ＤＳＭＺ（ドイツ微生物・細胞培養コレクション）に提出された。この菌株のアクセッション番号はDSM 33684である。
【0049】
実施例3：Pseudomonas sp. BR8764を用いた貴金属の回収と濃縮
まず、Pseudomonas sp. BR8764をLＢ寒天培地で２８℃、２日間培養した。その後、ＬＢ寒天培地から細胞を５００μｌのＬＢ培地に懸濁した。５０μｌを、１１あたり５ｇのグリセロールを含む１０ｍＬのリーゼンベルグ培地（下記参照）に移した。シェーカーで一晩培養した後、前培養の４１７μｌを、最終ＯＤが０．０５になるように５０ｍＬの同培地への接種に使用した。
７．６７時間後の培養の光学濃度は３．２であった。作業細胞バンク凍結培養のために、９００μｌの浮遊培養液をチューブに充填し、９００μｌの３０％グリセロール溶液と混合し、－８０℃で凍結した。５００ｍＬの三角フラスコに５０ｍＬのリーゼンベルグ培地を入れ、１つの作業細胞培養物を接種した。シェーカー付きバイオリアクターで一晩培養した後、ＯＤ ０．１になるように前培養液を接種した。Pseudomonas sp. BR8764を、約１．８Ｌの培地を満たした２Ｌバイオリアクター（Sartorius社製、Biostat B）で１６時間バッチ発酵させた。リーゼンベルク培地は、２６ｍＭ KH2PO4 (AppliChem, #A3620), ３０ｍＭ (NH4)2HPO4 (AppliChem (#A2291)), ９ｍＭ C■*HNo_2088■O■*H■O (AppliChem (#A4212)) で調製した。次に、５ｍＭ MgSO4*7H2O（AppliChem, #A4101）をオートクレーブした後、1mlの微量元素溶液（50mM FeSO4 *7H2O, 10mM MnSO4*1H2O, 10mM ZnSO4*7H2O, 2mM CoSO4*7H2O、2mM CuSO4*5H2O, 2mM NiSO4*6H2O, 2mM Na2MoO4*2H2O, 2mM Na2SeO3, 2mM H3BO3）および１リットルあたり１５ｇのグリセロール（Sigma-Aldrich, W252506-25KG-K）を添加した。５ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを６．８に調整した。バイオマスを採取し、0.9%NaCl溶液で洗浄した後、ペレットを-80℃で凍結乾燥し、乾物（DM）とした。
試験溶液を生成するために、ESI-Elemental Scientific (www.icpms.de)から市販されているICP標準溶液を、試験溶液１の場合は１０ ［％］ＨＣｌで、試験溶液２の場合は７．５ ［％］ＨＮＯ３で約１００ｐｐｍに希釈した。以下の標準物質を使用した： PdCl2 (10% v/v HCl, 1000ppm), CGPD1-125ML; Pt (10% v/v HCl, 1000ppm), CGPT1-125ML; RhCl3 (15% v/v HCl, 1000ppm) CGRH1-125ML； IrCl3 (10% v/v HCl, 1000ppm) CGIR1-125ML; Al (3% v/v HNO3, 1000ppm) CGAL1-125ML; Fe (2% v/v HNO3, 1000ppm) CGFE1-125ML。試験溶液中の元素組成を分析するために、イオン結合プラズマ質量分析（ICP-MS）を適用した。試験溶液１および試験溶液２の元素組成は、表１に示すとおりであった。
まず、Pseudomonas sp. BR8764をLＢ寒天培地で２８℃、２日間培養した。その後、ＬＢ寒天培地から細胞を５００μｌのＬＢ培地に懸濁した。５０μｌを、１１あたり５ｇのグリセロールを含む１０ｍＬのリーゼンベルグ培地（下記参照）に移した。シェーカーで一晩培養した後、前培養の４１７μｌを、最終ＯＤが０．０５になるように５０ｍＬの同培地への接種に使用した。
７．６７時間後の培養の光学濃度は３．２であった。作業細胞バンク凍結培養のために、９００μｌの浮遊培養液をチューブに充填し、９００μｌの３０％グリセロール溶液と混合し、－８０℃で凍結した。５００ｍＬの三角フラスコに５０ｍＬのリーゼンベルグ培地を入れ、１つの作業細胞培養物を接種した。シェーカー付きバイオリアクターで一晩培養した後、ＯＤ ０．１になるように前培養液を接種した。Pseudomonas sp. BR8764を、約１．８Ｌの培地を満たした２Ｌバイオリアクター（Sartorius社製、Biostat B）で１６時間バッチ発酵させた。リーゼンベルク培地は、２６ｍＭ KH2PO4 (AppliChem, #A3620), ３０ｍＭ (NH4)2HPO4 (AppliChem (#A2291)), ９ｍＭ C■*HNo_2088■O■*H■O (AppliChem (#A4212)) で調製した。次に、５ｍＭ MgSO4*7H2O（AppliChem, #A4101）をオートクレーブした後、1mlの微量元素溶液（50mM FeSO4 *7H2O, 10mM MnSO4*1H2O, 10mM ZnSO4*7H2O, 2mM CoSO4*7H2O、2mM CuSO4*5H2O, 2mM NiSO4*6H2O, 2mM Na2MoO4*2H2O, 2mM Na2SeO3, 2mM H3BO3）および１リットルあたり１５ｇのグリセロール（Sigma-Aldrich, W252506-25KG-K）を添加した。５ＭのＮａＯＨ溶液を用いてｐＨを６．８に調整した。バイオマスを採取し、0.9%NaCl溶液で洗浄した後、ペレットを-80℃で凍結乾燥し、乾物（DM）とした。
試験溶液を生成するために、ESI-Elemental Scientific (www.icpms.de)から市販されているICP標準溶液を、試験溶液１の場合は１０ ［％］ＨＣｌで、試験溶液２の場合は７．５ ［％］ＨＮＯ３で約１００ｐｐｍに希釈した。以下の標準物質を使用した： PdCl2 (10% v/v HCl, 1000ppm), CGPD1-125ML; Pt (10% v/v HCl, 1000ppm), CGPT1-125ML; RhCl3 (15% v/v HCl, 1000ppm) CGRH1-125ML； IrCl3 (10% v/v HCl, 1000ppm) CGIR1-125ML; Al (3% v/v HNO3, 1000ppm) CGAL1-125ML; Fe (2% v/v HNO3, 1000ppm) CGFE1-125ML。試験溶液中の元素組成を分析するために、イオン結合プラズマ質量分析（ICP-MS）を適用した。試験溶液１および試験溶液２の元素組成は、表１に示すとおりであった。
【0050】
表１
試験溶液１および試験溶液２の組成
バイオ収着実験のセットアップは以下の通りである。上記のように調製したバイオマスの乾燥物（ＤＭ）を２ｍＬ試験管に入れた。次に、１．５ｍＬの試験溶液を加え、オーバーヘッドシェーカーを用いて混合し、室温で３時間インキュベートした。その後、１３３００ｒｐｍで１０分間遠心した。上清をＩＣＰ－ＭＳで元素組成を分析するために採取した。バイオマスへの金属結合は、試験溶液中の値から上清のＩＣＰ－ＭＳ－元素値を差し引くことで計算した。回収率は、表２に示すように、結合量［％］で表した。
試験溶液１および試験溶液２の組成
【表1】
【0051】
表２
Pseudomonas sp. BR8764の乾燥物に対する貴金属の生物吸着
Pseudomonas sp. BR8764の乾燥物に対する貴金属の生物吸着
【表2】
【0052】
表２に示すように、Pseudomonas sp. BR8764の乾燥物を用いると、塩酸または硝酸酸性浸出液で９０％以上のパラジウム回収率が示された。白金の回収率は約８０％であった。ＨＣｌ－酸性浸出液では、ロジウムまたはイリジウムの 回収率が最大約３０％であった。HNO3-酸浸出液では、ロジウムまたはイリジウムの回収率はさらに高かった。最大約４０％の回収率が確認された。しかし、アルミニウムや鉄も回収されたが、パラジウムの優先的な生物吸着が観察された。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【国際調査報告】