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特表2024-510924効率的なプロテオミクス研究のための自己組織化（ＭＩＰＳＡ）によるタンパク質の分子インデックス化
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-12
(54)【発明の名称】効率的なプロテオミクス研究のための自己組織化（ＭＩＰＳＡ）によるタンパク質の分子インデックス化
(51)【国際特許分類】
C40B 40/08 20060101AFI20240305BHJP
C12N 15/10 20060101ALI20240305BHJP
C12Q 1/686 20180101ALI20240305BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240305BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240305BHJP
A61K 38/21 20060101ALI20240305BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240305BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240305BHJP
【ＦＩ】
C40B40/08 ZNA
C12N15/10 Z
C12Q1/686 Z
C12N15/63 Z
C07K19/00
A61K38/21
A61P31/14
A61K47/60
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023553019
(86)(22)【出願日】2022-03-01
(85)【翻訳文提出日】2023-10-30
(86)【国際出願番号】 US2022018386
(87)【国際公開番号】W WO2022187277
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】63/155,086
(32)【優先日】2021-03-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518056003
【氏名又は名称】ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100189131
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 拓郎
(74)【代理人】
【識別番号】100182486
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 正展
(74)【代理人】
【識別番号】100147289
【弁理士】
【氏名又は名称】佐伯 裕子
(72)【発明者】
【氏名】ラーマン， ハリー ビー．
(72)【発明者】
【氏名】クレドル， ジョエル
(72)【発明者】
【氏名】ガン， ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】サンカプリーチャ， プワナット
【テーマコード（参考）】
4B063
4C076
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA20
4B063QQ42
4B063QQ52
4B063QR08
4B063QR62
4B063QS05
4C076AA95
4C076CC35
4C076CC41
4C076EE23
4C076EE59
4C076FF70
4C084AA02
4C084BA44
4C084DA21
4C084DA23
4C084NA05
4C084NA12
4C084ZB33
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045EA50
4H045FA70
4H045FA71
(57)【要約】
本開示は、プロテオミクスの分野に関する。より具体的には、本開示は、自己組織化によるタンパク質の分子インデックス化のための組成物および方法を提供する。一態様では、本開示は、自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーを提供する。特定の実施形態では、各タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートは以下を含む（ａ）バーコードを含むｃＤＮＡであって、ポリペプチドタグに特異的に結合するリガンドとコンジュゲートしているｃＤＮＡ；および（ｂ）前記ポリペプチドタグおよび目的のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リガンドは前記ポリペプチドタグと共有結合する融合タンパク質。
【選択図】図１－１
【選択図】図１－１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下の工程を含む方法：（ａ）ベクターライブラリーをメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写する工程であって、前記ベクターライブラリーが複数のタンパク質をコードし、前記ベクターライブラリーの各ベクターが、５’から３’方向に構成される工程：
（ｉ）ポリメラーゼ転写開始部位；
（ｉｉ）バーコード；
（ｉｉｉ）逆転写プライマー結合部位；
（ｉｖ）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）；および
（ｖ）（１）ポリペプチドタグと（２）タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドタグがリガンドに特異的に結合する、ヌクレオチド配列；
（ｂ）前記ＲＢＳの上流に結合するプライマーを使用して前記ｍＲＮＡの５’末端を逆転写するステップであって、前記プライマーが、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグに特異的に結合する前記リガンドとコンジュゲートされ、前記リガンド、プライマーおよびバーコードを含む相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）が形成される、工程：
（ｃ）前記ｍＲＮＡを翻訳するステップであって、前記ｃＤＮＡの前記リガンドが、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグに結合する、工程：
【請求項2】
前記ベクターライブラリーに、工程（ａ）の前にニックを入れることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ベクターが、（ｖｉ）ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含み、前記ベクターライブラリーが、工程（ａ）の前に直鎖化される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ベクターの前記バーコードが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記バーコードが、ＰＣＲプライマーに対する結合部位を含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
前記ＲＢＳが内部リボソーム進入部位を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記ポリペプチドタグが、前記目的のタンパク質のＮ末端に融合される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記ポリペプチドタグが、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項9】
前記ポリペプチドタグがＨＡＬＯタグを含み、前記リガンドがＨＡＬＯリガンドを含む、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記ＨＡＬＯタグが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記ＨＡＬＯリガンドが【化1】
【請求項12】
前記ポリペプチドタグがＳＮＡＰタグを含み、前記リガンドがＳＮＡＰリガンドを含む、請求項１～１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記ＳＮＡＰタグが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ＳＮＡＰ－リガンドがベンジルグアニンまたはその誘導体を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
前記ポリペプチドタグがＣＬＩＰタグを含み、前記リガンドがＣＬＩＰリガンドを含む、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
前記ＣＬＩＰタグが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ＣＬＩＰリガンドがベンジルシトシンまたはその誘導体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーであって、各タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートが、（ａ）バーコードを含むｃＤＮＡであって、ポリペプチドタグに特異的に結合するリガンドとコンジュゲートしているｃＤＮＡ；および（ｂ）前記ポリペプチドタグおよび目的のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リガンドは前記ポリペプチドタグと共有結合する融合タンパク質；とを含む、ライブラリー。
【請求項19】
前記バーコードがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している、請求項１８に記載のライブラリー。
【請求項20】
前記バーコードがＰＣＲプライマーの結合部位を含む、請求項１８または１９に記載のライブラリー。
【請求項21】
前記ポリペプチドタグが、前記目的のタンパク質のＮ末端に融合される、請求項１８～２０のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項22】
前記ポリペプチドタグが、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む、請求項１８～２１のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項23】
前記ポリペプチドタグがＨＡＬＯタグを含み、前記リガンドがＨＡＬＯリガンドを含む、請求項１８～２２のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項24】
前記ＨＡＬＯタグが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２３に記載のライブラリー。
【請求項25】
前記ＨＡＬＯリガンドが【化2】
【請求項26】
前記ポリペプチドタグがＳＮＡＰタグを含み、前記リガンドがＳＮＡＰリガンドを含む、請求項１８から２５のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項27】
前記ＳＮＡＰタグが配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２６に記載のライブラリー。
【請求項28】
前記ＳＮＡＰリガンドがベンジルグアニンまたはその誘導体を含む、請求項２６記載のライブラリー。
【請求項29】
前記ポリペプチドタグがＣＬＩＰタグを含み、前記リガンドがＣＬＩＰリガンドを含む、請求項１８～２８のいずれか１項に記載のライブラリー。
【請求項30】
前記ＣＬＩＰタグが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項31】
前記ＣＬＩＰリガンドがベンジルシトシンまたはその誘導体を含む、請求項２９に記載のライブラリー。
【請求項32】
タンパク質－タンパク質相互作用を研究するための方法であって、目的のタンパク質を用いて、請求項１８～３１のいずれか１項に記載のライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含する、方法。
【請求項33】
タンパク質－小分子相互作用を研究するための方法であって、小分子を用いて、請求項１８～３１のいずれか１項に記載のライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含する、方法。
【請求項34】
生物学的サンプルから得られた抗体を用いて、請求項１８～３１のいずれか１項に記載のライブラリーの免疫沈降を行う工程を包含する、方法。
【請求項35】
第１の小分子の標的を同定する方法であって、（ａ）請求項１８～３１のいずれか１項に記載のライブラリーを、その標的に結合する第１の小分子とともにインキュベートする工程、および（ｂ）第２の小分子を用いて工程（ａ）のライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を含み、ここで、その標的に結合した第１の小分子は、第２の小分子の結合をブロックする、方法。
【請求項36】
（ａ）バーコードを含むｃＤＮＡであって、ポリペプチドタグに特異的に結合するリガンドとコンジュゲートしているｃＤＮＡと、（ｂ）ポリペプチドタグおよび目的のタンパク質を含む融合タンパク質であって、リガンドがポリペプチドタグに共有結合している融合タンパク質とを含む自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項37】
前記バーコードが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している、請求項３６に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項38】
前記バーコードがＰＣＲプライマーの結合部位を含む、請求項３６または３７に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項39】
前記ポリペプチドタグが、前記目的のタンパク質のＮ末端に融合される、請求項３６～３８のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項40】
前記ポリペプチドタグが、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む、請求項３６～３９のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項41】
前記ポリペプチドタグがＨＡＬＯタグを含み、前記リガンドがＨＡＬＯリガンドを含む、請求項３６～４０のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項42】
前記ＨＡＬＯタグが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４１に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項43】
前記ＨＡＬＯリガンドが【化3】
【請求項44】
前記ポリペプチドタグがＳＮＡＰタグを含み、前記リガンドがＳＮＡＰリガンドを含む、請求項３６～４３のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項45】
前記ＳＮＡＰタグが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４４に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項46】
前記ＳＮＡＰリガンドがベンジルグアニンまたはその誘導体を含む、請求項４４に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項47】
前記ポリペプチドタグがＣＬＩＰタグを含み、前記リガンドがＣＬＩＰリガンドを含む、請求項３６～４６のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項48】
前記ＣＬＩＰタグが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項49】
前記ＣＬＩＰリガンドがベンジルシトシンまたはその誘導体を含む、請求項４７に記載の自己組織化タンパク質－ＤＮＡ組成物。
【請求項50】
目的のタンパク質をコードする核酸配列をそれぞれ含む複数のベクターを含む自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーであって、前記複数のベクターがそれぞれ、５’から３’方向に沿って構成されている、自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー：（ａ）ポリメラーゼ転写開始部位；
（ｂ）バーコード；
（ｃ）逆転写プライマー結合部位；
（ｄ）ＲＢＳ；
（ｅ）（ｉ）ポリペプチドタグと（ｉｉ）目的のタンパク質とを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドタグがリガンドに特異的に結合する、ヌクレオチド配列；
【請求項51】
前記複数のベクターがそれぞれ、（ｆ）ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含む、請求項５０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項52】
前記バーコードが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している、請求項５０または５１に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項53】
前記バーコードが、ＰＣＲプライマーに対する結合部位を含む、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項54】
前記ＲＢＳが、内部リボソーム進入部位を含む、請求項５０～６のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項55】
前記ポリペプチドタグが、前記目的のタンパク質のＮ末端に融合される、請求項５０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項56】
前記ポリペプチドタグが、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む、請求項５０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項57】
前記ポリペプチドタグがＨＡＬＯタグを含み、前記リガンドがＨＡＬＯリガンドを含む、請求項５０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項58】
前記ＨＡＬＯタグが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５７に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項59】
前記ＨＡＬＯリガンドが【化4】
【請求項60】
前記ポリペプチドタグがＳＮＡＰタグを含み、前記リガンドがＳＮＡＰリガンドを含む、請求項５０～５９のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項61】
前記ＳＮＡＰタグが、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項62】
前記ＳＮＡＰリガンドがベンジルグアニンまたはその誘導体を含む、請求項６０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項63】
前記ポリペプチドタグがＣＬＩＰタグを含み、前記リガンドがＣＬＩＰリガンドを含む、請求項５０から６２のいずれか１項に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項64】
前記ＣＬＩＰタグが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６３に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項65】
前記ＣＬＩＰリガンドがベンジルシトシンまたはその誘導体を含む、請求項６３に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリー。
【請求項66】
５’から３’方向に沿って構成されるベクター：（ａ）ポリメラーゼ転写開始部位；
（ｂ）バーコード；
（ｃ）逆転写プライマー結合部位；
（ｄ）ＲＢＳ；
（ｅ）（ｉ）ポリペプチドタグと（ｉｉ）目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドタグがリガンドに特異的に結合する、ヌクレオチド配列；
【請求項67】
前記複数のベクターがそれぞれ、（ｆ）ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含む、請求項６６に記載のベクター。
【請求項68】
バーコードがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している、請求項６６または６７に記載のベクター。
【請求項69】
バーコードがＰＣＲプライマーの結合部位を含む、請求項６６～６８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項70】
前記ＲＢＳが内部リボソーム進入部位を含む、請求項６６～６９のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項71】
前記ポリペプチドタグが、前記目的のタンパク質のＮ末端に融合される、請求項６６～７０のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項72】
前記ポリペプチドタグが、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む、請求項６６～７１のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項73】
前記ポリペプチドタグがＨＡＬＯタグを含み、前記リガンドがＨＡＬＯリガンドを含む、請求項６６～７２のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項74】
前記ＨＡＬＯタグが、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７３に記載のベクター。
【請求項75】
前記ＨＡＬＯリガンドが【化5】
【請求項76】
前記ポリペプチドタグがＳＮＡＰタグを含み、前記リガンドがＳＮＡＰリガンドを含む、請求項６６～７５のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項77】
前記ＳＮＡＰタグが配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７６に記載のベクター。
【請求項78】
前記ＳＮＡＰリガンドがベンジルグアニンまたはその誘導体を含む、請求項７６に記載のベクター。
【請求項79】
前記ポリペプチドタグがＣＬＩＰタグを含み、前記リガンドがＣＬＩＰリガンドを含む、請求項６６～７８のいずれか１項に記載のベクター。
【請求項80】
前記ＣＬＩＰタグが、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項７９に記載のベクター。
【請求項81】
前記ＣＬＩＰリガンドがベンジルシトシンまたはその誘導体を含む、請求項７９に記載のベクター。
【請求項82】
以下の工程を含む方法：（ａ）請求項５０に記載の自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを含む、直鎖化またはニック化された複数のベクターを転写して、ｍＲＮＡを産生する工程；
（ｂ）前記リガンドにコンジュゲートされたプライマーを使用して、前記ｍＲＮＡの５’末端を逆転写して、前記バーコードを含むｃＤＮＡを生成する工程；および
（ｃ）前記ｍＲＮＡを翻訳する工程；
ここで、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグが、前記バーコードを含む前記ｃＤＮＡにコンジュゲートされた前記リガンドに共有結合する。
【請求項83】
重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者を治療するための方法であって、有効量のインターフェロン療法を前記患者に投与する工程を含み、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体が、前記患者から得られた生物学的サンプルにおいて検出される、方法。
【請求項84】
重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者を治療するための方法であって、以下を含む方法：（ａ）前記患者から得られた生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を検出する工程；および
（ｂ）有効量のインターフェロン療法で前記患者を治療する工程；
【請求項85】
患者から得られた生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を検出する工程を含む、インターフェロン療法が有益であるＣＯＶＩＤ－１９患者を同定する方法。
【請求項86】
前記インターフェロン療法が、インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）を含む、請求項８３～８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項87】
インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）がペグ化されている、請求項８６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照本出願は、２０２１年３月１日に出願された米国仮特許出願第６３／１５５，０８６号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
政府支援条項
政府の支援本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＧＭ１２７３５３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
政府支援条項
政府の支援本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＧＭ１２７３５３の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【0002】
分野
本開示は、プロテオミクスの分野に関する。より具体的には、本開示は、自己組織化によるタンパク質の分子インデックス化のための組成物および方法を提供する。
本開示は、プロテオミクスの分野に関する。より具体的には、本開示は、自己組織化によるタンパク質の分子インデックス化のための組成物および方法を提供する。
【0003】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本出願は、配列表を含む。配列表は、「Ｐ１６７２０＿０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。配列表は１０，１４８バイトのサイズであり、２０２１年３月１日に作成された。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、配列表を含む。配列表は、「Ｐ１６７２０＿０１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。配列表は１０，１４８バイトのサイズであり、２０２１年３月１日に作成された。これは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0004】
抗体結合特異性の不偏分析は、健常および疾患状態への重要な洞察を提供することができる。（１～４）ファージディスプレイはこれらおよび多くの他の用途に有用であるが、ほとんどのタンパク質－タンパク質、タンパク質－抗体およびタンパク質－小分子相互作用は、プログラム可能なファージディスプレイを用いて捕捉されないある程度の立体構造を必要とする。プロテオームスケールでの立体構造タンパク質相互作用のプロファイリングは、伝統的にタンパク質マイクロアレイ技術に依存してきた。しかしながら、タンパク質マイクロアレイは、高いアッセイ当たりのコスト、ならびにタンパク質のハイスループット発現および精製、固体支持体上へのタンパク質のスポッティング、アレイ化されたタンパク質の乾燥および再水和、ならびにスライド走査蛍光イメージングベースのリードアウトに関連するものを含む、無数の技術的アーチファクトに悩まされる傾向がある（５、６）タンパク質マイクロアレイ生産および貯蔵に対する代替的アプローチが開発されているが（例えば、核酸プログラム可能タンパク質アレイ、ＮＡＰＰＡ（７）またはＳＩＭＰＬＥＸ（８））、ロバストで、拡張性があり、費用対効果の高い技術が欠けている。
【0005】
完全長タンパク質のアレイベースのプロファイリングに関連する制限を克服するために、本発明者らは、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのリボソームディスプレイを利用する、翻訳オープンリーディングフレームのパラレル解析（ParalleL Analysis of Translated Open reading frames）（ＰＬＡＴＯ）と呼ばれる方法論を以前に確立した（９）。リボソームディスプレイは、終止コドンを欠くｍＲＮＡのインビトロ翻訳に依存し、それらがコードする新生タンパク質との複合体においてｍＲＮＡ分子の末端でリボソームを失速させる。ＰＬＡＴＯは、その有用性を制限するいくつかの重要な制限に悩まされている。理想的な代替法は、タンパク質を短い増幅可能なＤＮＡバーコードへ共有結合させることである。実際に個々に調製されたＤＮＡバーコード化抗体やタンパク質は、LiszczakとMuirによって最近レビューされたように、無数のアプリケーションで採用されている。（１０）１つの特に魅力的なタンパク質－ＤＮＡコンジュゲーション方法は、ハロゲン末端アルカン部分と不可逆的共有結合を形成する細菌酵素を利用したＨａｌｏタグシステムを含む。（１１）個々のＤＮＡ－バーコード化Ｈａｌｏタグ融合タンパク質は、従来のＥＬＩＳＡと比較して、自己抗体検出の感度およびダイナミックレンジを大幅に向上させることが示されている（１２）。個々のタンパク質バーコード化を全ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーにスケーリングすることは非常に価値があるが、高コストおよび低スループットのために困難を伴う。従って、自己組織化アプローチは、ライブラリー生成へのはるかに効率的な経路を提供し得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0006】
本開示は、少なくとも部分的に、ＰＬＡＴＯおよび他の全長タンパク質アレイ技術の主要な欠点を克服する、新規分子ディスプレイ技術であるMolecular Indexing of Proteins by Self Assembly（ＭＩＰＳＡ）の開発に基づく。特定の実施形態では、ＭＩＰＳＡは可溶性全長タンパク質のライブラリーを産生し、それらはそれぞれユニバーサルＰＣＲプライマー結合配列に隣接するＤＮＡバーコードへの共有結合を介して一意的に識別可能である（図１Ａ～１Ｃ）。バーコードは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の上流で、転写されたｍＲＮＡ配列の５’末端付近に導入される。インビトロで転写されたｍＲＮＡの５’末端の逆転写（ＲＴ）は、ｃＤＮＡバーコードを作製し、これは、いくつかの実施形態において、ハロアルカン標識ＲＴプライマーに連結される。Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質はＲＢＳの下流にコードされ、インビトロ翻訳の結果、ｃＤＮＡバーコードとＨａｌｏタグおよびその下流のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がコードするタンパク質産物が複合体内で共有結合をもたらす。得られた一意的にインデックス付けされた全長タンパク質のライブラリーは、不偏自己抗体プロファイリングなどの安価なプロテオーム全体の相互作用研究に使用することができる。以下に記載されるように、一実施形態において、本発明者らは、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の血漿中の既知および新規自己抗体を明らかにすることによって、プラットフォームの有用性を実証する。
【0007】
一態様では、本開示は、自己組織化によるタンパク質の分子インデキシング（ＭＩＰＳＡ）を介した効率的なプロテオミクス調査のための方法を提供する。一実施形態では、以下の工程を含む方法：（ａ）ベクターライブラリーをメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写する工程であって、前記ベクターライブラリーが複数のタンパク質をコードし、前記ベクターライブラリーの各ベクターが、５’から３’方向に構成される工程： （ｉ）ポリメラーゼ転写開始部位； （ｉｉ）バーコード； （ｉｉｉ）逆転写プライマー結合部位； （ｉｖ）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）； および（ｖ）（１）ポリペプチドタグと（２）タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドタグがリガンドに特異的に結合する、ヌクレオチド配列； （ｂ）前記ＲＢＳの上流に結合するプライマーを使用して前記ｍＲＮＡの５’末端を逆転写するステップであって、前記プライマーが、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグに特異的に結合する前記リガンドとコンジュゲートされ、前記リガンド、プライマーおよびバーコードを含む相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）が形成される、工程：および（ｃ）前記ｍＲＮＡを翻訳するステップであって、前記ｃＤＮＡの前記リガンドが、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグに結合する、工程。特定の実施形態では、前記ベクターライブラリーに、工程（ａ）の前にニックを入れる。他の特定の実施形態では、前記ベクターが、（ｖｉ）ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含み、前記ベクターライブラリーが、工程（ａ）の前に直鎖化される。
【0008】
別の態様において、本開示は、自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲート組成物を提供する。特定の実施形態において、本開示は、自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーを提供する。特定の実施形態では、各タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートは以下を含む（ａ）バーコードを含むｃＤＮＡであって、ポリペプチドタグに特異的に結合するリガンドとコンジュゲートしているｃＤＮＡ；および（ｂ）前記ポリペプチドタグおよび目的のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リガンドは前記ポリペプチドタグと共有結合する融合タンパク質。
【0009】
特定の実施形態において、ポリペプチドタグは、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドタグはＨＡＬＯタグを含み、リガンドはＨＡＬＯリガンドを含む。より具体的な実施形態では、ＨＡＬＯタグは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＨＡＬＯ－リガンドは以下のいずれか１つを含む：
【化1】
【0010】
別の実施形態では、ポリペプチドタグはＳＮＡＰタグを含み、リガンドはＳＮＡＰリガンドを含む。より具体的な実施形態では、ＳＮＡＰタグは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＳＮＡＰ－リガンドはベンジルグアニンまたはその誘導体を含む。
【0011】
さらなる実施形態では、ポリペプチドタグはＣＬＩＰタグを含み、リガンドはＣＬＩＰリガンドを含む。より具体的な実施形態では、ＣＬＩＰタグは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。他の態様において、ＣＬＩＰ－リガンドはベンジルシトシンまたはその誘導体を含む。
【0012】
本開示はまた、自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーを使用するための方法を提供する。１つの実施形態において、タンパク質－タンパク質相互作用を研究するための方法は、目的のタンパク質を用いてタンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含する。別の実施形態において、タンパク質－小分子相互作用を研究するための方法は、小分子を用いて、タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含する。さらに別の実施形態において、方法は、生物学的サンプルから得られた抗体を用いて、タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーの免疫沈降を行う工程を包含する。さらなる実施形態において、第１の小分子の標的を同定するための方法は、（ａ）タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーを、その標的に結合する第１の小分子とともにインキュベートする工程、および（ｂ）第２の小分子を用いて工程（ａ）のライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含し、ここで、その標的に結合した第１の小分子は、第２の小分子の結合をブロックする。より具体的な実施形態において、２つ以上の小分子が、ステップ（ｂ）のプルダウンアッセイにおいて使用される。
【0013】
さらに別の態様では、本開示は、ベクターおよび複数のベクターを含む自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを提供し、各ベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む。１つの実施形態において、ベクターは、５’から３’方向に沿って、（ａ）ポリメラーゼ転写開始部位；（ｂ）バーコード；（ｃ）逆転写プライマー結合部位；（ｄ）ＲＢＳ；ならびに（ｅ）（ｉ）ポリペプチドタグおよび（ｉｉ）目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリペプチドタグは、リガンドに特異的に結合する。
【0014】
特定の実施形態において、ベクターは、ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、（ｖｉｉ）終止コドンをさらに含む。
【0015】
特定の実施形態において、バーコードは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している。別の実施形態では、バーコードはＰＣＲプライマーの結合部位を含む。
【0016】
別の実施形態では、ＲＢＳは内部リボソーム進入部位を含む。特定の実施形態において、ポリペプチドタグは、目的のタンパク質のＮ末端に融合される。他の実施形態において、ポリペプチドタグは、目的のタンパク質のＣ末端に融合される。
【0017】
本開示はまた、自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを使用するための方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、（ａ）自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを含む直鎖化またはニック化された複数のベクターを転写して、ｍＲＮＡを産生する工程；（ｂ）リガンドにコンジュゲートされたプライマーを使用して、ｍＲＮＡの５’末端を逆転写して、バーコードを含むｃＤＮＡを産生する工程；および（ｃ）ｍＲＮＡを翻訳する工程を包含し、ここで、融合タンパク質のポリペプチドタグが、バーコードを含むｃＤＮＡにコンジュゲートされたリガンドに共有結合する。
【0018】
別の態様において、本開示は、ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための方法を提供する。一実施形態では、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者を治療するための方法は、有効量のインターフェロン療法を患者に投与する工程を含み、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体が患者から得られた生物学的サンプル中で検出される。別の実施形態において、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者を治療するための方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を検出する工程および、（ｂ）有効量のインターフェロン療法で患者を治療する工程とを含む。さらなる実施形態において、インターフェロン療法が有益であるＣＯＶＩＤ－１９患者を同定するための方法は、患者から得られた生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を検出する工程を包含する。特定の実施形態において、インターフェロン療法は、インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）を含む。特定の実施形態では、インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）はペグ化される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1A-1G】ＭＩＰＳＡ法を示す。図１Ａ：キー成分を強調した組換えｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡベクターの概略図：ユニーククローン識別子（ＵＣＩ、青色）、リボソーム結合サイト（ＲＢＳ、黄色）、Ｎ末端Ｈａｌｏタグ（紫色）、ＦＬＡＧエピトープ（橙色）、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ、緑色）、およびベクター直鎖化のためのＩ－ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位（黒色）。図１Ｂ：（図１Ａ）に示されるベクター鋳型からインビトロ転写された（ＩＶＴ）ＲＮＡを示す概略図。等温塩基バランス化ＵＣＩ配列：（ＳＷ）１８－ＡＧＧＧＡ－（ＳＷ）１８。図１Ｃ：（図１Ｂ）に示されるＲＮＡ－ｃＤＮＡの無細胞翻訳。Ｈａｌｏタグタンパク質は、翻訳中にcisでＨａｌｏリガンドとコンジュゲートしたＵＣＩ含有ｃＤＮＡと共有結合を形成する。図１Ｄ：翻訳に対する影響について試験したＲＴプライマー位置。図１Ｅ：（図１Ｄ）に示すＲＴプライマーの存在下での翻訳のα－ＦＬＡＧウェスタンブロット分析（ＮＣ、陰性対照、ＲＴプライマーなし）。図１Ｆ：－３２位からプライミングされたＵＣＩ－ｃＤＮＡを有するＲＮＡから翻訳されたＴＲＩＭ２１タンパク質のウェスタンブロット分析であり、Ｈａｌｏリガンドとコンジュゲートしていても（＋）していなくても（－）よい。シェーグレン症候群、ＳＳ；健常対照、ＨＣ。図１Ｇ：ＩＰ化したＴＲＩＭ２１ ＵＣＩのｑＰＣＲ分析。倍数差は、Ｈａｌｏリガンド（－）ＨＣ ＩＰとの比較による。
【図2A-2D】ｃｉｓ－対ｔｒａｎｓ－ＵＣＩコンジュゲーションを示す。図２Ａ：別個のＵＣＩバーコードを有するＴＲＩＭ２１またはＧＡＰＤＨをコードするＩＶＴ－ＲＮＡを、１：１の比で混合する前または後に翻訳した。ＵＣＩ特異的プライマーを使用したＩＰのｑＰＣＲ分析は、ＩＶＴ－ＲＮＡを翻訳後に混合した場合の、ＨＣ血漿を用いたＩＰに対する倍率変化として報告された。図２Ｂ：ＴＲＩＭ２１（黒色ＵＣＩ）およびＧＡＰＤＨ（灰色ＵＣＩ）をコードするＩＶＴ－ＲＮＡを、１００倍過剰のＧＡＰＤＨ（白色ＵＣＩ）のバックグラウンドに１：１で混合し、次いで、モックライブラリーとして翻訳した。ＩＰのシーケンシング分析は、１００×ＧＡＰＤＨのＨＣ ＩＰに対する倍率変化として報告される。図２Ｃ：スパイクインＴＲＩＭ２１を含有するｈＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリーであって、ＳＳ血漿を用いてＩＰ化され、８つのモックＩＰ（血漿投入なし）の平均と比較されたもの。ＴＲＩＭ２１ ＵＣＩは赤色で示されている。図２Ｄ：シーケンシングによって決定された、ＳＳ対ＨＣ ＩＰにおけるＴＲＩＭ２１ ＵＣＩの相対的倍数差。
【図3A-3D】ＵＣＩ－ＯＲＦ辞書の構築を示す。図３Ａ：（ｉ）タグメンテーションは、ＭＩＰＳＡベクターライブラリーにアダプターをランダムに挿入する。（ｉｉ）ＰＣＲ１フォワードプライマーおよびタグメンテーションにより挿入されたアダプターのリバースプライマーを利用して、ＤＮＡ断片を増幅し、ＯＲＦの５’末端を捕捉する約１．５ｋｂとなるようにサイズ選択する。（ｉｉｉ）これらの断片を、Ｐ５を含むＰＣＲ２フォワードプライマーおよびＰ７リバースプライマーを用いて増幅する。（ｉｖ）Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングを使用して、同じ断片からＵＣＩおよびＯＲＦを読み取り、辞書におけるそれらの会合を可能にする。図３Ｂ：ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ｈＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの各メンバーについて、単一特異性ＵＣＩの数を、ＯＲＦの長さに重ねて示す。図３Ｃ：それらの集計されたＵＣＩ関連リードカウントによるライブラリー中のＯＲＦ表現のヒストグラム。赤色の縦線は、ＵＣＩ関連リードカウントの中央値の＋／－１０倍を示す。図３Ｄ：シェーグレン症候群（ＳＳ）血漿を用いたｈＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリーのＩＰを、８つのモックＩＰの平均と比較する。各ＵＣＩについてのシーケンシングリードカウントをプロットする。２つのＧＡＰＤＨアイソフォーム（塗りつぶされた黒色）およびスパイクインされたＴＲＩＭ２１（赤色）に関連するＵＣＩが示されている。
【図4A-4C】重症ＣＯＶＩＤ－１９における自己抗体のＭＩＰＳＡ分析を示す。図４Ａ：健常対照、軽度～中等度のＣＯＶＩＤ－１９患者、または重症ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血漿中の自己反応性タンパク質の総数を示す箱ひげ図。＊は、平均を比較するための片側ｔ検定によるｐ＜０．０５を示す。図４Ｂ：少なくとも１つの重症ＣＯＶＩＤ－１９血漿中の少なくとも２つの反応性ＵＣＩによって表されるが、１つ以下の対照（健常または軽度～中等度のＣＯＶＩＤ－１９血漿）では表されない、全てのタンパク質の階層的クラスターマップ。図４Ｃ：ｈＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを使用した、１０人の封入体筋炎（ＩＢＭ）患者および１０人の健常対照（ＨＣ）における自己抗体のＭＩＰＳＡ分析。ＵＣＩ－ｑＰＣＲ倍率変化（１０個のＨＣの平均に対する）およびシーケンシングの倍率変化（モックＩＰに対する）の両方として測定された、ＩＰ化５’－ヌクレオチダーゼ、細胞質１Ａ（ＮＴ５Ｃ１Ａ）の倍率変化。
【図5A-5H】ＭＩＰＳＡが既知および新規の中和インターフェロン自己抗体を検出することを示す。図５Ａ～５Ｃ：３人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者についての反応性インターフェロンＵＣＩを強調する散布図。図５Ｄ：重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する５５人のうち５人において検出されたインターフェロン反応性の概要。ヒット倍数変化値（細胞の色）および反応性ＵＣＩの数（細胞中の数）が提供される。図５Ｅ～５Ｆ：図５Ｄに示される同じ患者の組換えインターフェロンアルファ２（ＩＦＮ－α２）またはインターフェロンラムダ３（ＩＦＮ－λ３）中和活性。Ａ５４９細胞とのインキュベーションの前に、血漿を１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ－α２または１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３とプレインキュベートした。インターフェロン刺激遺伝子ＭＸ１の倍率変化を、非刺激細胞に対するＲＴ－ｑＰＣＲによって計算した。ＧＡＰＤＨを正規化のためのハウスキーピング対照遺伝子として使用した。赤色のバーは、どのサンプルが各インターフェロンについて中和活性を有するとＭＩＰＳＡによって予測されるかを示す。図５Ｇ：図５Ｄの５人の患者におけるインターフェロン自己抗体のＰｈＩＰ－Ｓｅｑ分析（行および列の順序を維持）。ヒット倍数変化値（セルの色）および反応性ペプチドの数（セル中の数）が提供される。図５Ｈ：ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ反応性Ｉ型インターフェロン９０－ａａペプチドのＥｐｉｔｏｐｅｆｉｎｄｒ分析。
【図6A-6C】逆転写プライマーへのＨａｌｏリガンド結合を示す。図６Ａ：上部は、５’第一級アミンで修飾されたオリゴヌクレオチド逆転写（ＲＴ）プライマー配列である。下は、１つのエチレングリコール部分（Ｏ２）によって分離された、反応性スクシンイミジルエステル基を有するＨａｌｏリガンドである。スクシンイミジルエステルは、第一級アミンと反応して、ＲＴプライマーとＨａｌｏリガンドとの間にアミド結合を形成し、Ｈａｌｏリガンド結合ＲＴプライマーを生じる。図６Ｂ：Ｈａｌｏリガンド修飾を含まないＲＴプライマーのＨＰＬＣクロマトグラフィー。図６Ｃ：精製後のＨａｌｏリガンド修飾を有するＲＴプライマーのＨＰＬＣクロマトグラフィー。コンジュゲート生成物は、修飾によって付与された疎水性の増加のために後に溶出する。
【図7A-7C】ｃｉｓ対ｔｒａｎｓＵＣＩ－ＯＲＦ会合を示す。ＭＩＰＳＡ ＩＶＴ－ＲＮＡライブラリーの翻訳中のＵＣＩ－ＯＲＦコンジュゲーションのｃｉｓ図７Ａ対ｔｒａｎｓ図７Ｂの概略図。図７Ｃ：左パネル：正しいタンパク質－ＵＣＩ会合（例えば、青色ＵＣＩと青色タンパク質）からなる５０％ｃｉｓコンジュゲート（「Ｃ」）。中央パネル：非コンジュゲートタンパク質は、次いで、非コンジュゲートＵＣＩとｔｒａｎｓ（「Ｔ」）でランダムに会合する。右パネル：この２種実験における正確にＩＰ処理されたＵＣＩと不正確にＩＰ処理されたＵＣＩとの比は３：１（７５％：２５％）であり、実験観察と同様である（図２Ａ）。
【図8】ＴＲＩＭ２１およびＧＡＰＤＨの２重翻訳およびＩＰを示す。ＴＲＩＭ２１（Ｔ）およびＧＡＰＤＨ（Ｇ）ＩＶＴ－ＲＮＡ－ｃＤＮＡを別々にまたは一緒に翻訳し、次いで、健常対照（ＨＣ）またはシェーグレン症候群（ＳＳ）血漿を用いてＩＰを行った。分析は、Ｈａｌｏタグをタンパク質に連結する共通のＦＬＡＧエピトープタグを認識するＭ２抗体を用いたイムノブロッティングによって行った。
【図10A-10C】患者Ｐ２の自己抗体のＭＩＰＳＡ検出の再現性および線形性を示す。図１０Ａ：全ての一貫して反応性の単一特異性ＵＣＩについての１００ ＯＲＦ倍数変化の平均および標準偏差（３つの複製物全てにおいて倍数変化＞３）。エラーバーの右側の値は変動係数である。図１０Ｂ：Ｐ２血漿の３つの独立したＭＩＰＳＡ分析にわたる重複する反応性単一特異性ＵＣＩの数。面積はヒット数に比例する。図１０Ｃ：健常対照血漿のバックグラウンドに１０倍希釈したＰ２血漿と比較した、Ｐ２血漿についての平均ＯＲＦ倍率変化。ドットサイズは、各ＯＲＦに対応する反応性ＵＣＩの数を示す。
【図11A-11B】患者Ｐ２のインターフェロン自己抗体レベルの滴定に基づく推定値を示す。マウスモノクローナルブロッキング抗体を、細胞ベースのＩＦＮ中和アッセイにおいて異なる濃度で使用した：図１１Ａ：ＩＦＮ－α２および図１１Ｂ ＩＦＮ－λ３。中和曲線をあてはめ、患者Ｐ２の対応するインターフェロン自己抗体レベルを推定するために使用した。示された血漿希釈は、アッセイのダイナミックレンジ内にあるように選択された；示された希釈でのＰ２血漿の中和活性は、三連でアッセイされた。
【図12A-12C】連続希釈におけるインターフェロン抗体のＭＩＰＳＡ分析を示す。連続希釈したＰ２血漿中のＭＩＰＳＡによって検出されたインターフェロン反応性の概要（図１２Ａ）、ＩＦＮ－α２ ｍＡｂ（図１２Ｂ）、およびＩＦＮ－λ３ ｍＡｂ（図１２Ｃ）。ヒット倍数変化値（セル内の色）および反応性ＵＣＩの数（セル内中の数）を、図５Ｄと同様に提供する。
【図13】ＩＦＮ－λ３自己抗体は、ＩＦＮ－λ１を効率的に中和しない。患者Ｐ２の血漿のＩＦＮ－λ３中和活性を、そのＩＦＮ－λ１中和活性と比較した。ＩＦＮ－λ３の中和は、それぞれ１：１０および１：１００希釈で完全および部分的であった。ＩＦＮ－λ１の中和は部分的であり、それぞれ１：１０および１：１００希釈では検出されなかった（ＮＤ）。
【発明を実施するための形態】
【0020】
本開示は、本明細書に記載される特定の方法および構成要素などに限定されず、これらは変化し得ることが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明する目的で使用され、本開示の範囲を限定することを意図しないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の言及を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「タンパク質」への言及は、１つまたは複数のタンパク質への言及であり、当業者に公知のその等価物などを含む。
【0021】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。特定の方法、デバイス、および材料が記載されるが、本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施または試験において使用され得る。
【0022】
本明細書に引用される全ての刊行物は、全ての雑誌論文、書籍、マニュアル、公開された特許出願、および発行された特許を含めて、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において使用される特定の用語および語句の意味が提供される。定義は、本質的に限定的であることを意味せず、本開示の特定の態様のより明確な理解を提供するのに役立つ。
【0023】
本発明者らは、本明細書において、タンパク質マイクロアレイ、ＰＬＡＴＯ、および代替技術を超える重要な利点を提供する、全長タンパク質のための新規分子ディスプレイ技術を記載する。特定の実施形態において、ＭＩＰＳＡは、自己組織化を利用して、例えば、２５ｋＤａのＨａｌｏタグドメインを介して比較的短い（例えば、１５８ｎｔ）一本鎖バーコードに連結されたタンパク質のライブラリーを生成する。このコンパクトなバーコード化アプローチは、かさ高い連結カーゴ（例えば、酵母、ファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ）を有する代替的なディスプレイフォーマットに利用できない多数の用途を見出す可能性が高い。実際、最小ＤＮＡバーコードをタンパク質、特に抗体および抗原に個々にコンジュゲートすることは、ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ、（２５）ＬＩＢＲＡ－ｓｅｑ、（２６）および関連する方法論（２２、２７）を含むいくつかの状況において有用であることが既に証明されている。プロテオームスケールでは、ＭＩＰＳＡは、例えば、ハプテン修飾研究またはプロテアーゼ活性プロファイリングなどの翻訳後修飾の研究と同様に、タンパク質－抗体、タンパク質－タンパク質、およびタンパク質－小分子相互作用の不偏分析を可能にする。ＭＩＰＳＡの重要な利点は、その高いスループット、低いコスト、単純なシーケンシングライブラリー調製、およびタンパク質－ＤＮＡ複合体の安定（ディスプレイライブラリーの操作および保存の両方に重要である）を含む。重要なことは、ＭＩＰＳＡは、特殊な訓練または機器を必要とせず、ハイスループットシーケンシング機器または設備への単なるアクセスを必要とするだけでよいので、低複雑度の研究室によって直ちに採用され得ることである。
【0024】
ＭＩＰＳＡおよびＰｈＩＰ－Ｓｅｑの相補性。ディスプレイ技術は、互いに補完することが多いが、協調して日常的に使用することができない場合がある。ＭＩＰＳＡは、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑよりも、インビトロで十分に発現されたタンパク質上の立体構造エピトープに対する抗体を検出する可能性が高い。これは、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑを介して検出されなかった、以下に記載されるＭＩＰＳＡを介したインターフェロンα自己抗体のロバストな検出によって例証された。一方、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーに存在しないか、または細菌溶解物中で十分に発現され得ないかのいずれかであるタンパク質内に含まれるより少ない立体構造エピトープに対する抗体を検出する可能性がより高い。ＭＩＰＳＡおよびＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、これらの方法で互いに自然に相補するので、本発明者らは、ＭＩＰＳＡ ＵＣＩ増幅プライマーを、本発明者らがＰｈＩＰ－Ｓｅｑに使用したものと同じになるように設計した。ＭＩＰＳＡおよびＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、細菌ファージ溶解物中でも安定であるので、単一セットの増幅およびシーケンシングプライマーを使用して、単一反応で一緒に容易に実施することができる。したがって、これらの２つの表示モダリティの自然な互換性は、それらの相乗効果を活用することに対する障壁を低下させる。
【0025】
ＭＩＰＳＡシステムのバリエーション。ＭＩＰＳＡの重要な側面は、別のライブラリーメンバーのＵＣＩのｔｒａｎｓでの結合と比較して、タンパク質のその関連するＵＣＩへのｃｉｓでの結合を含む。ここで、本発明者らは、Ｈａｌｏタグ／Ｈａｌｏリガンド系を介した共有結合を利用したが、同様に機能し得る他のものも存在する。例えば、ＳＮＡＰタグ（ＤＮＡ修復タンパク質Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼの２０ｋＤａ変異体）は、ベンジルグアニン（ＢＧ）誘導体と共有結合を形成する（２８）ので、Ｈａｌｏリガンドの代わりにＢＧを用いてＲＴプライマーを標識することができる。ＳＮＡＰタグの変異誘導体であるＣＬＩＰタグは、Ｏ２－ベンジルシトシン（ＢＣ）誘導体に結合し、これもＭＩＰＳＡに適応させることができる（２９）。
【0026】
融合タグ成熟およびリガンド結合の速度は、ｃｉｓ対ｔｒａｎｓ結合の相対収率にとって重要である。Samelsonらの研究によると、Ｈａｌｏタグタンパク質の生産速度は、Ｈａｌｏタグの機能成熟速度の約４倍である（３０）。典型的なタンパクサイズがＯＲＦｅｏｍｅライブラリーにおいて１，０００アミノ酸未満であることを考慮すると、これらのデータは、ほとんどのタンパクが、Ｈａｌｏタグ成熟の前に、すなわちｃｉｓＨａｌｏリガンド結合が起こり得る前にリボソームから放出され、それによって望ましくないｔｒａｎｓバーコード化に有利に働くことを予測する。最適化実験の間に、本発明者らは、翻訳混合物から放出因子を排除することによってｃｉｓバーコード化の割合がわずかに改善されることを見出し、これは、リボソームをそれらのネイティブＯＲＦ終止コドン上で停止させる。すなわち、Ｈａｌｏタグ成熟は、ｃｉｓＨａｌｏリガンド結合プライマーに近接したままで継続する。制御されたリボソーム失速を促進するための代替的なアプローチはまた、終止コドン除去／抑制またはドミナントネガティブ終止因子の使用を含み得る。次いで、リボソーム放出は、鎖ターミネーターであるピューロマイシンの添加を介して達成され得る。
【0027】
ＵＣＩはｍＲＮＡの５’ＵＴＲ上に形成されるので、真核生物リボソームは５’キャップから開始Ｋｏｚａｋ配列まで走査することができないであろう。キャップ依存性翻訳が必要とされる場合、２つの代替的な方法が使用され得る。第１に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がＲＴプライマーとＫｏｚａｋ配列との間に配置される場合、現在の５’ＵＣＩ系が使用され得る。第２に、ＵＣＩをｍＲＮＡの３’末端に配置し、ＲＴがＯＲＦ中に伸長することを妨げることが可能である。無細胞翻訳にとどまらず、これらのアプローチのいずれかが開発された場合、ｍＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドを生きている細胞または組織にトランスフェクトし、そこでＵＣＩタンパク質形成をin situで行うことができる。
【0028】
ＯＲＦ関連ＵＣＩは、様々な方法で具体化することができる。特定の実施形態では、実施例の項に記載されるように、本発明者らは、約１０倍の表示でヒトＯＲＦｅｏｍｅにインデックスを確率的に割り当てた。このアプローチは、２つの主な利点を有し、第１は、合成オリゴヌクレオチドライブラリー（単一の縮重オリゴヌクレオチドプール）の低コストであり、第２は、各ＯＲＦに関連するＵＣＩのセットによって報告される証拠の複数の独立した部分である。ある特定の実施形態において、確率バーコードのライブラリーは、均一な融解温度の配列、したがって均一なＰＣＲ増幅効率を特徴とするように設計される。単純化のために、本発明者らは、固有分子識別子（ＵＭＩ）をプライマーに組み込まないことを選択したが、このアプローチは、ＭＩＰＳＡ ＵＭＩと互換性であり、定量化を潜在的に増強し得る。確率的インデックス付けの１つの欠点は、ＯＲＦドロップアウトの可能性、したがって、比較的高いＵＣＩ表現の必要性であり、これは、各ＵＣＩを定量化するために必要とされるシーケンシングの深さ、したがって、全体的なサンプルあたりのコストを増加させる。第２の欠点は、ＵＣＩ－ＯＲＦｅｏｍｅマッチング辞書を構築する必要があることである。ショートリードシーケンシングを用いて、本発明者らは、大部分が代替アイソフォームから構成されるライブラリーの画分を明確にすることができなかった。ショートリード技術の代わりに、またはショートリード技術に加えて、PacBioまたはOxford Nanopore Technologiesなどのロングリードシーケンシング技術を使用することは、ＵＣＩ－ＯＲＦマッチング中の不完全な曖昧性除去を克服することができる。確率的バーコード化とは対照的に、個々のＯＲＦ－ＵＣＩクローニングは可能であるが、費用がかかり面倒である。しかし、より小さいＵＣＩセットは、より低いアッセイあたりのシーケンシングコストという利点を提供する。本発明者らは、以前に、Long Adapter Single Stranded Oligonucleotide（ＬＡＳＳＯ）プローブを用いてＯＲＦｅｏｍｅをクローニングする方法を開発した（３１）。標的特異的インデックスを捕捉プローブライブラリーに組み込むことにより、ＬＡＳＳＯプローブライブラリーのコストを劇的に増加させることなく、一意的にインデックス付けされたＯＲＦが得られる。したがって、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのＬＡＳＳＯクローニングは、ＭＩＰＳＡベースの適用と相乗作用する可能性がある。
【0029】
ｑＰＣＲによるＭＩＰＳＡリードアウト。適切に設計されたＵＣＩの有用な特徴は、それらがｑＰＣＲリードアウトプローブとしても機能し得ることである。本発明者らが設計し、本明細書中で使用した縮重ＵＣＩ（図１Ｂ）もまた、１８ｎｔのＴｍ平衡フォワードおよびリバースプライマー結合部位を含む。したがって、ｑＰＣＲアッセイの低いコストおよび迅速なターンアラウンドタイムを、ＭＩＰＳＡと組み合わせて活用することができる。例えば、ＴＲＩＭ２１ ＩＰのようなアッセイ品質管理手段を組み込むことは、よりコストのかかるシーケンシングの実行の前に、サンプルのセットを認定するために使用され得る。トラブルシューティングおよび最適化は、同様に、ＮＧＳではなくｑＰＣＲをリードアウトとして使用することによって促進することができる。特異的ＵＣＩのｑＰＣＲ試験はまた、理論的には、シーケンシングと比較して増強された感度を提供する可能性があり、臨床設定における分析により適している可能性がある。
Ｉ．定義
Ｉ．定義
【0030】
本明細書中で使用される場合、用語「アミノ酸」は、アミン基、カルボン酸基、および各アミノ酸に特異的な側鎖を含む有機化合物をいい、これらはペプチドのモノマーサブユニットとして働く。アミノ酸には、２０種の標準アミノ酸、天然アミノ酸または標準アミノ酸、ならびに非標準アミノ酸が含まれる。標準的な天然アミノ酸としては、アラニン（Ａ又はＡｌａ）、システイン（Ｃ又はＣｙｓ）、アスパラギン酸（Ｄ又はＡｓｐ）、グルタミン酸（Ｅ又はＧｌｕ）、フェニルアラニン（Ｆ又はＰｈｅ）、グリシン（Ｇ又はＧｌｙ）、ヒスチジン（Ｈ又はＨｉｓ）、イソロイシン（Ｉ又はＩｌｅ）、リジン（Ｋ又はＬｙｓ）、ロイシン（Ｌ又はＬｅｕ）、メチオニン（Ｍ又はＭｅｔ）、アスパラギン（Ｎ又はＡｓｎ）、プロリン（Ｐ又はＰｒｏ）、グルタミン（Ｑ又はＧｌｎ）、アルギニン（Ｒ又はＡｒｇ）、セリン（Ｓ又はＳｅｒ）、スレオニン（Ｔ又はＴｈｒ）、バリン（Ｖ又はＶａｌ）、トリプトファン（Ｗ又はＴｒｐ）、およびチロシン（Ｙ又はＴｙｒ）が挙げられる。アミノ酸は、Ｌ－アミノ酸またはＤ－アミノ酸であってよい。非標準アミノ酸は、修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣物、非標準タンパク質構成アミノ酸、または天然に存在するかもしくは化学的に合成された非タンパク質構成アミノ酸であってよい。非標準アミノ酸の例としては、セレノシステイン、ピロリジン、およびＮ－ホルミルメチオニン、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、プロリンおよびピルビン酸誘導体、３－置換アラニン誘導体、グリシン誘導体、環置換フェニルアラニンおよびチロシン誘導体、直鎖状コアアミノ酸、Ｎ－メチルアミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。
【0031】
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」は、ペプチドおよびタンパク質を包含し、そしてペプチド結合によって連結された２つ以上のアミノ酸の鎖を含む分子をいう。いくつかの実施形態において、ポリペプチドは、２～５０個のアミノ酸を含み、例えば、２０～３０個を超えるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態において、ペプチドは、二次構造、領域構造、または高次構造を含まない。いくつかの実施形態において、タンパク質は、３０個以上のアミノ酸を含み、例えば、５０個を超えるアミノ酸を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質は、一次構造に加えて、二次構造、領域構造、または高次構造を含む。ポリペプチドのアミノ酸は、最も典型的にはＬ－アミノ酸であるが、Ｄ－アミノ酸、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸、アミノ酸類似体、アミノ酸模倣体、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。ポリペプチドは、天然に存在するか、合成的に産生されるか、または組換え的に発現され得る。ポリペプチドはまた、アミノ酸鎖を修飾するさらなる基、例えば、翻訳後修飾を介して付加される官能基を含んでもよい。ポリマーは、直鎖状または分枝状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然に、または介入によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分とのコンジュゲートなど任意の他の操作もしくは改変。
【0032】
本明細書中で使用される場合、用語「プロテオーム」は、任意の生物の標的、例えば、ゲノム、細胞、組織、または生物、によって特定の時間に発現されるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチド（これらのコンジュゲートまたは複合体を含む）のセット全体を含み得る。一態様では、それは、規定された条件下で、所与の時間に、所与のタイプの細胞または生物において発現されたタンパク質のセットである。プロテオミクスは、プロテオームの研究である。例えば、「細胞プロテオーム」は、ホルモン刺激への曝露などの特定の一連の環境条件下で特定の細胞型において見出されるタンパク質の集合を含み得る。生物の完全なプロテオームは、様々な細胞プロテオームの全てからのタンパク質の完全なセットを含み得る。プロテオームはまた、特定の細胞内生物学的系におけるタンパク質の収集を含み得る。例えば、ウイルス中の全てのタンパク質をウイルスプロテオームと呼ぶことができる。本明細書中で使用される場合、用語「プロテオーム」は、プロテオームのサブセットを含み、これには、キノーム；セクレトーム；レセプトソーム（例えば、ＧＰＣＲｏｍｅ）；免疫プロテオーム；ニュートリプロテオーム（ｎｕｔｒｉｐｒｏｔｅｏｍｅ）；翻訳後修飾（例えば、リン酸化、ユビキチン化、メチレーション、アセチレーション、グリコシレーション、酸化、脂質化、および／またはニトロシル化）によって定義されるプロテオームサブセット、例えば、ホスホプロテオーム（例えば、ホスホチロシン－プロテオーム、チロシン－キノーム、およびチロシン－ホスファトーム）、グリコプロテオームなど；組織もしくは臓器、発生ステージ、または生理的もしくは病理学的状態に関連するプロテオームサブセット；細胞プロセス、例えば、細胞サイクル、分化（もしくは脱分化）、細胞死、老化、細胞移動、形質転換、もしくは転移に関連するプロテオームサブセット；またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【0033】
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」という用語は、３’－５’ホスホジエステル結合によって連結されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含有する一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチド、ならびにポリヌクレオチド類似体を指す。核酸分子としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびｃＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。ポリヌクレオチド類似体は、天然のポリヌクレオチドにおいて見出される標準的なホスホジエステル結合以外の骨格、および必要に応じて、改変された糖部分または、リボースもしくはデオキシリボース以外の部分を有し得る。ポリヌクレオチド類似体は、標準的なポリヌクレオチド塩基に対するワトソン－クリック塩基対形成によって水素結合し得る塩基を含み、ここで、類似体骨格は、オリゴヌクレオチド類似体分子と標準的なポリヌクレオチド中の塩基との間の配列特異的様式でのこのような水素結合を可能にする様式で塩基を提示する。
【0034】
本明細書で使用される場合、「バーコード」という用語は、巨大分子、巨大分子のライブラリー中の各巨大分子などについての固有の識別子タグまたは起源情報を提供する、約２～約１０塩基（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００塩基）の核酸分子を指す。バーコードは、人工配列または天然に存在する配列であり得る。バーコードの概念は、任意の増幅の前に、各元の標的分子が固有のバーコード配列によって「タグ付けされる」というものである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡ配列は、各ファウンダー分子に固有のバーコードを割り当てるのに十分な順列を提供するのに十分な長さでなければならない。
【0035】
本明細書中で使用される場合、用語「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」または「ユニバーサルプライミング配列」は、ライブラリー増幅および／またはシーケンシング反応のために使用され得る核酸分子をいう。ユニバーサルプライミング部位は、ＰＣＲ増幅のためのプライミング部位（プライマー配列）、フローセル表面上の相補的オリゴヌクレオチドにアニールするフローセルアダプター配列、いくつかの次世代シーケンシングプラットフォームにおけるブリッジ増幅を可能にするシーケンシングプライミング部位、またはそれらの組み合わせを含み得るが、これらに限定されない。「フォワード」という用語は、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」との関連で使用される場合、「５’」または「センス」とも称され得る。「リバース」という用語は、「ユニバーサルプライミング部位」または「ユニバーサルプライマー」との関連で使用される場合、「３’」または「アンチセンス」とも称され得る。
【0036】
本明細書で使用される場合、「次世代シーケンシング」は、数百万から数十億の分子のシーケンシングを並行して可能にするハイスループットシーケンシング方法を指す。次世代シーケンシング法の例としては、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング、ポロニーシーケンシング、イオン半導体シーケンシング、およびパイロシーケンスが挙げられる。プライマーを固体基板に付着させ、相補配列を核酸分子に付着させることによって、核酸分子をプライマーを介して固体基板にハイブリダイズさせることができ、次いで、ポリメラーゼを用いて増幅することによって、固体基板上の別個の領域に複数のコピーを生成することができる（これらのグループ分けは、ポリメラーゼコロニーまたはポロニーと呼ばれることもある）。その結果、シーケンシングプロセスにおいて、特定の位置のヌクレオチドを複数回（例えば、数百回または数千回）シーケンシングすることができる。ハイスループット核酸シーケンシング技術の例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、ＢＧＩ、Ｑｉａｇｅｎ、Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ、およびＲｏｃｈｅによって提供されるプラットフォームが含まれ、パラレルビーズアレイ、合成によるシーケンシング、ライゲーションによるシーケンシング、キャピラリー電気泳動、電子マイクロチップ、「バイオチップ」、マイクロアレイ、パラレルマイクロチップ、および単一分子アレイなどのフォーマットが含まれる。
【0037】
用語「～に特異的に結合する」、「～に対して特異的な」および関連する文法上の変形は、リガンド／タグ、抗体／抗原、アプタマー／標的、酵素／基質、受容体／アゴニストおよびレクチン／炭水化物のような対になった種の間で起こる結合であって、共有結合もしくは非共有結合相互作用または共有結合および非共有結合相互作用の組み合わせによって媒介され得る結合を指す。２つの種の相互作用が非共有結合複合体を生成する場合、生じる結合は、典型的には静電結合、水素結合、または親油性相互作用の結果である。従って、特定の実施形態において、「特異的結合」は、例えば、抗体／抗原または酵素／基質相互作用の特徴を有する結合複合体を生成する２つの間の相互作用が存在する、対になった種の間で生じる。特に、特異的結合は、対の一方のメンバーが特定の種に結合し、結合メンバーの対応するメンバーが属する化合物ファミリー内の他の種には結合しないことを特徴とする。したがって、例えば、抗体は、典型的には単一のエピトープに結合し、タンパク質ファミリー内の他のエピトープには結合しない。ある実施形態では、抗原と抗体との特異的結合は、少なくとも１０－６Ｍの結合親和性を有する。他の実施形態では、抗原および抗体は、少なくとも１０－７Ｍ、１０－８Ｍ～１０－９Ｍ、１０－１０Ｍ、１０－１１Ｍ、または１０－１２Ｍの親和性で結合する。ある特定の実施形態では、この用語は、任意の非標的と比較して少なくとも５倍大きい親和性、例えば、少なくとも１０、２０、５０、または１００倍大きい親和性で標的（例えば、タンパク質）に結合する分子（例えば、アプタマー）を指す。特定の実施形態において、ポリペプチドタグは、そのリガンドに特異的に結合する。特定の実施形態では、ポリペプチドタグはリガンドに共有結合する。
【0038】
「生物学的サンプル」は、本明細書中で使用される場合、一般に、個体または被験体由来のサンプルである。生物学的サンプルの非限定的な例としては、血液、血清、血漿、または脳脊髄液が挙げられる。さらに、固形組織（例えば、脊髄または脳の生検）が使用され得る。
ＩＩ．ベクター、そのライブラリーおよびそれを使用する方法
ＩＩ．ベクター、そのライブラリーおよびそれを使用する方法
【0039】
本開示は、ベクターおよび複数のベクターを含む自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを提供する。特定の実施形態において、ベクターは、目的のタンパク質をコードする核酸配列を含む。１つの実施形態において、ベクターは、５’から３’方向に沿って、（ａ）ポリメラーゼ転写開始部位；（ｂ）バーコード；（ｃ）逆転写プライマー結合部位；（ｄ）ＲＢＳ；ならびに（ｅ）（ｉ）ポリペプチドタグおよび（ｉｉ）目的のタンパク質を含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、このポリペプチドタグは、リガンドに特異的に結合する。
【0040】
特定の実施形態において、ベクターは、ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含む。他の実施形態において、ベクターは、（ｖｉｉ）終止コドンをさらに含む。
【0041】
特定の実施形態において、バーコードは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プライマーの結合部位に隣接している。別の実施形態では、バーコードはＰＣＲプライマーの結合部位を含む。
【0042】
別の実施形態では、ＲＢＳは内部リボソーム進入部位を含む。
【0043】
ある特定の実施形態では、バーコードの集団内の各バーコードは異なる。他の実施形態では、バーコードの集団におけるバーコードの一部は異なり、例えば、バーコードの集団におけるバーコードの少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％が異なる。
【0044】
バーコードの母集団は、ランダムに生成されてもよいし、非ランダムに生成されてもよい。いくつかの実施形態において、バーコードは、ランダム化されたヌクレオチドを含有し、核酸に組み込まれる。例えば、１２塩基ランダム配列は、サンプル中の各標的分子について４１２または１６，７７７，２１６個のＵＭＩを提供する。
【0045】
特定の実施形態では、バーコードを使用して、多重化シーケンシングデータをコンピュータでデコンボリューションし、個々の高分子、サンプル、ライブラリーなどに由来する配列を同定することができる。
【0046】
本開示はまた、自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを使用するための方法を提供する。特定の実施形態において、方法は、（ａ）自己組織化タンパク質ディスプレイライブラリーを含む直鎖化またはニック化された複数のベクターを転写して、ｍＲＮＡを産生する工程；（ｂ）リガンドにコンジュゲートされたプライマーを使用して、ｍＲＮＡの５’末端を逆転写して、バーコードを含むｃＤＮＡを産生する工程；および（ｃ）ｍＲＮＡを翻訳する工程を包含し、ここで、融合タンパク質のポリペプチドタグが、バーコードを含むｃＤＮＡにコンジュゲートされたリガンドに共有結合する。
【0047】
より具体的な実施形態は、以下の工程を含む方法：（ａ）ベクターライブラリーをメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に転写する工程であって、前記ベクターライブラリーが複数のタンパク質をコードし、前記ベクターライブラリーの各ベクターが、５’から３’方向に構成される工程： （ｉ）ポリメラーゼ転写開始部位； （ｉｉ）バーコード； （ｉｉｉ）逆転写プライマー結合部位； （ｉｖ）リボソーム結合部位（ＲＢＳ）； および（ｖ）（１）ポリペプチドタグと（２）タンパク質とを含む融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、前記ポリペプチドタグがリガンドに特異的に結合する、ヌクレオチド配列； （ｂ）前記ＲＢＳの上流に結合するプライマーを使用して前記ｍＲＮＡの５’末端を逆転写するステップであって、前記プライマーが、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグに特異的に結合する前記リガンドとコンジュゲートされ、前記リガンド、プライマーおよびバーコードを含む相補的デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）が形成される、工程：および（ｃ）前記ｍＲＮＡを翻訳するステップであって、前記ｃＤＮＡの前記リガンドが、前記融合タンパク質の前記ポリペプチドタグに結合する、工程。特定の実施形態では、前記ベクターライブラリーに、工程（ａ）の前にニックを入れる。他の特定の実施形態では、前記ベクターが、（ｖｉ）ベクター直鎖化のためのエンドヌクレアーゼ部位をさらに含み、前記ベクターライブラリーが、工程（ａ）の前に直鎖化される。
ＩＩＩ．自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲート、そのライブラリーおよびそれを使用する方法
ＩＩＩ．自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲート、そのライブラリーおよびそれを使用する方法
【0048】
本開示はまた、自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲート組成物およびそれを含むライブラリーを提供する。特定の実施形態では、各タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートは以下を含む（ａ）バーコードを含むｃＤＮＡであって、ポリペプチドタグに特異的に結合するリガンドとコンジュゲートしているｃＤＮＡ；および（ｂ）前記ポリペプチドタグおよび目的のタンパク質を含む融合タンパク質であって、前記リガンドは前記ポリペプチドタグと共有結合する融合タンパク質。
【0049】
ある特定の実施形態では、目的のタンパク質の２つ以上のコピーが、タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリー中にタンパク質－ＤＮＡコンジュゲートとして存在することができ、目的のタンパク質の各コピーは、固有のバーコードを含むことができる。
【0050】
特定の実施形態において、ポリペプチドタグは、目的のタンパク質のＮ末端に融合される。他の実施形態において、ポリペプチドタグは、目的のタンパク質のＣ末端に融合される。
【0051】
特定の実施形態において、ポリペプチドタグは、ハロアルカンデハロゲナーゼまたはＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼを含む。特定の実施形態では、ポリペプチドタグはＨＡＬＯタグを含み、リガンドはＨＡＬＯリガンドを含む。より具体的な実施形態では、ＨＡＬＯタグは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、ＨＡＬＯ－リガンドは以下のいずれか１つを含む：
【化2】
【0052】
ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）タグおよびリガンドは、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から市販されており、製造者の指示に従って核酸とコンジュゲートされる。特定の実施形態では、ＨＡＬＯＴＡＧ（登録商標）リガンドをＤＮＡ配列（例えば、逆転写プライマー）にコンジュゲートするために、ＤＮＡ配列をアルキン基で修飾する。次いで、Ｃｕ触媒環化付加（「クリック」化学）を使用して、アジドハロリガンドをアルキン末端ＤＮＡ配列と反応させる。例えば、Duckworth et al. 46 ANGEW CHEM. INT. 8819-22 (2007)を参照のこと。
【0053】
あるいは、他のポリペプチドタグ－リガンド捕捉部分系を使用することができる。例えば、Ｏ６－アルキルグアニン－ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼは、ベンジルグアニン（ＢＧ）およびその誘導体と特異的かつ迅速に反応する。特定の実施形態において、ポリペプチドタグは、ＳＮＡＰ－ＴＡＧ（登録商標）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（Ｉｐｗｉｃｈ，ＭＡ））を含む。ＳＮＡＰ－ＴＡＧ（登録商標）は、ヒトＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼに由来する自己標識タンパク質である。ＳＮＡＰ－ＴＡＧ（登録商標）は、Ｏ６－ベンジルグアニン誘導体と共有結合的に反応する。一実施形態では、ポリペプチドタグは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。別の特定の実施形態では、ポリペプチドタグは、ＳＮＡＰ－ＴＡＧ（登録商標）の修飾バージョンであるＣＬＩＰ－ＴＡＧ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む。これはまた、ヒトＯ６－アルキルグアニン－ＤＮＡ－アルキルトランスフェラーゼ由来の自己標識タンパク質である。ベンジルグアニン誘導体の代わりに、ＣＬＩＰタグは、ベンジルシトシン誘導体と反応するように操作される。特定の実施形態では、ポリペプチドタグは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。Keppler et al. 1 NAT BIOTECHNOL. 86-99 (2003)；およびGautier et al. 15(2) CHEM. BIOL. 128-36 (2008)を参照のこと。
【0054】
本開示はまた、自己組織化タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーを使用するための方法を提供する。１つの実施形態において、タンパク質－タンパク質相互作用を研究するための方法は、目的のタンパク質を用いてタンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含する。別の実施形態において、タンパク質－小分子相互作用を研究するための方法は、小分子を用いて、タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含する。さらに別の実施形態において、方法は、生物学的サンプルから得られた抗体を用いて、タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーの免疫沈降を行う工程を包含する。さらなる実施形態において、第１の小分子の標的を同定するための方法は、（ａ）タンパク質－ＤＮＡコンジュゲートのライブラリーを、その標的に結合する第１の小分子とともにインキュベートする工程、および（ｂ）第２の小分子を用いて工程（ａ）のライブラリーのプルダウンアッセイを行う工程を包含し、ここで、その標的に結合した第１の小分子は、第２の小分子の結合をブロックする。より具体的な実施形態において、２つ以上の小分子が、ステップ（ｂ）のプルダウンアッセイにおいて使用される。
ＩＶ．ＣＯＶＩＤ－１９の処置
ＩＶ．ＣＯＶＩＤ－１９の処置
【0055】
本開示はまた、ＣＯＶＩＤ－１９を処置するための方法を提供する。一実施形態では、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者を治療するための方法は、有効量のインターフェロン療法を患者に投与する工程を含み、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体が患者から得られた生物学的サンプル中で検出される。別の実施形態において、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者を治療するための方法は、（ａ）患者から得られた生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を検出する工程および、（ｂ）有効量のインターフェロン療法で患者を治療する工程とを含む。さらなる実施形態において、インターフェロン療法が有益であるＣＯＶＩＤ－１９患者を同定するための方法は、患者から得られた生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を検出する工程を包含する。特定の実施形態において、インターフェロン療法は、インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）を含む。特定の実施形態では、インターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）またはインターフェロンベータ（ＩＦＮ－β）はペグ化される。さらなる実施形態において、インターフェロン療法は、インターフェロンω（ＩＦＮ－ω）を含む。
【0056】
用語「インターフェロン」、「ＩＦＮ」および「インターフェロン分子」は、本明細書中で交換可能に使用される。それらは、ＣＯＶＩＤ－１９の治療に使用することができる任意のインターフェロンまたはインターフェロン誘導体（例えば、ペグ化インターフェロン）を指す。
【0057】
インターフェロンは、ウイルス感染および他の抗原刺激に応答して真核細胞によって産生されるサイトカインのファミリーであり、広域スペクトルの抗ウイルス、抗増殖および免疫調節効果を示す。インターフェロンの組換え形態は、ウイルス感染（例えば、ＨＣＶ、ＨＢＶおよびＨＩＶ）、炎症性障害および疾患（例えば、多発性硬化症、関節炎、嚢胞性線維症）、ならびに腫瘍（例えば、肝臓癌、リンパ腫、骨髄腫など）などの様々な状態および疾患の治療に広く適用されている。
【0058】
インターフェロンは、それらが結合する細胞受容体に応じて、Ｉ型、ＩＩ型およびＩＩＩ型に分類される。Ｉ型インターフェロンは、２つの鎖（ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２）からなるＩＦＮ－アルファ（ＩＦＮ－α）受容体（ＩＦＮＡＲ）として知られる特異的細胞表面受容体複合体に結合する。ヒトに存在するＩ型インターフェロンは、インターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－α）、インターフェロン－ベータ（ＩＦＮ－β）およびインターフェロン－オメガ（ＩＦＮ－ω）である。
【0059】
ＩＩＩ型インターフェロンは、インターフェロン－ラムダ受容体（ＩＦＮＬＲ１またはＣＲＦ２－１２）およびインターロイキン１０受容体２（ＩＬ１０Ｒ２またはＣＲＦ２－４）からなる受容体複合体を介してシグナル伝達する。ヒトにおいて、ＩＩＩ型インターフェロンは、それぞれインターロイキン２９（ＩＬ－２９）、インターロイキン２８Ａ（ＩＬ－２８Ａ）およびインターロイキン２８Ｂ（ＩＬ－２８Ｂ）としても知られる、ＩＦＮ－λ１、ＩＦＮ－λ２およびＩＦＮ－λ３と呼ばれる３つのインターフェロンラムダ（ＩＦＮ－λ）タンパク質を含む。
【0060】
したがって、特定の実施形態では、インターフェロン療法は、ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－γ、ＩＦＮ－λ、それらの類似体およびそれらの誘導体のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態において、インターフェロン療法は、ＩＦＮ－λ、その類似体およびその誘導体を含む。他の実施形態において、インターフェロン療法は、ＩＦＮ－β、その類似体およびその誘導体を含む。
【0061】
本明細書中で使用される場合、用語「インターフェロン」、「ＩＦＮ」および「ＩＦＮ分子」は、より具体的には、インターフェロン（例えば、ヒトインターフェロン）（例えば、当該分野で公知のＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ω、ＩＦＮ－γおよびＩＦＮ－λ）の配列の全てまたは一部と実質的に同一である（例えば、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはさらに１００％同一である）アミノ酸を有するペプチドまたはタンパク質をいう。本開示における使用に適したインターフェロンとしては、ヒト細胞を使用して産生される天然ヒトインターフェロン、哺乳動物細胞から産生される組換えヒトインターフェロン、大腸菌産生組換えヒトインターフェロン、ヒトインターフェロンの合成バージョンおよびそれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切なインターフェロンとしては、全ての公知のヒトＩＦＮサブタイプ（例えば、全ての公知のＩＦＮ－βサブタイプ、または全ての公知のＩＦＮ－λサブタイプ）の配列のおおよその平均であるアミノ酸配列を有する合成インターフェロンの一種であるコンセンサスインターフェロンが挙げられる。
【0062】
用語「インターフェロン」、「ＩＦＮ」、および「ＩＦＮ分子」はまた、インターフェロン誘導体、すなわち、改変または形質転換されたインターフェロンの分子（上記のような）を含む。適切な形質転換は、インターフェロン分子に所望の特性を付与する任意の改変であり得る。望ましい特性の例としては、インビボ半減期の延長、治療有効性の改善、投与頻度の減少、溶解度／水溶性の増加、タンパク質分解に対する耐性の増加、制御放出の促進などが挙げられるが、これらに限定されない。上記のように、ペグ化インターフェロンが産生されており（例えば、ペグ化ＩＦＮ－λ）、肝炎を治療するために現在使用されている。ペグ化インターフェロンは、より長い半減期を示し、これは、薬物のより少ない頻度の投与を可能にする。インターフェロン分子をペグ化することは、インターフェロンをポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、不活性、非毒性および生分解性有機ポリマーに共有結合させることを含む。したがって、特定の実施形態において、インターフェロン療法はペグ化インターフェロンを含む。インターフェロンはまた、ヒトアルブミンとの融合タンパク質（例えば、アルブミン－ＩＦＮ－λ）として産生されている。アルブミン融合プラットフォームは、ヒトアルブミンの長い半減期を利用して、ＩＦＮの投与頻度を減少させることができる治療を提供する。したがって、特定の実施形態において、インターフェロン療法は、アルブミン－インターフェロン融合タンパク質を含む。
【0063】
本開示は、ＩＦＮ－λ３に対する自己抗体を検出するための方法を提供する。より具体的な実施形態において、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体が検出される。ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体の存在は、インターフェロン療法から利益を得るＣＯＶＩＤ－１９患者を同定するために使用され得る。特定の実施形態では、患者は重症ＣＯＶＩＤ－１０を有する。インターフェロン治療は、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体が患者から得られた生物学的サンプル中で検出されているＣＯＶＩＤ－１９患者に施すことができる。
【0064】
ＩＦＮ－λ３ポリペプチドは、生物学的サンプル中のＩＦＮ－λ３特異的自己抗体を検出するための免疫アッセイにおいて使用され得る。イムノアッセイにおいて使用されるＩＦＮλ－３ポリペプチドは、細胞溶解物（例えば、全細胞溶解物もしくは細胞画分）中に存在し得るか、または精製されたＩＦＮλ－３ポリペプチドもしくはその断片が、ＩＦＮλ－３特異的自己抗体によって認識される少なくとも１つの抗原部位が結合のために利用可能なままであるという条件で、使用され得る。サンプルの性質に依存して、免疫アッセイおよび免疫細胞化学的染色技術のいずれかまたは両方が使用され得る。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロット、およびラジオイムノアッセイは、生物学的サンプル中のＩＦＮλ－３特異的自己抗体の存在を検出するために、本明細書中に記載されるように使用され得る。
【0065】
ＩＦＮλ－３ポリペプチドまたはその断片は、ＩＦＮλ－３特異的自己抗体の検出のために、改変してまたは改変せずに使用され得る。ポリペプチドは、ポリペプチドを検出可能なシグナルを提供する第２の物質と共有結合または非共有結合させることによって標識することができる。多種多様な標識およびコンジュゲーション技術を使用することができる。使用され得る標識のいくつかの例としては、放射性同位体、酵素、基質、補因子、インヒビター、蛍光剤、化学発光剤、磁性粒子などが挙げられる。
【0066】
さらに詳述することなく、当業者は、前述の説明を用いて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。以下の実施例は例示に過ぎず、本開示の残りの部分を何ら限定するものではない。
【実施例】
【0067】
以下の実施例は、本明細書に記載および特許請求される化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作製および評価されるかの完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、純粋に例示的であることが意図され、本発明者らがそれらの開示とみなすものの範囲を限定することは意図されない。数（例えば、量、温度など）に関して正確さを確保するための努力がなされているが、いくつかの誤差および偏差が本明細書において考慮されるべきである。別段の指示がない限り、部は重量部であり、温度は摂氏度であるか、または周囲温度であり、圧力は大気圧またはその付近である。反応条件、例えば、成分濃度、所望の溶媒、溶媒混合物、温度、圧力、ならびに記載されたプロセスから得られる生成物純度および収率を最適化するために使用することができる他の反応範囲および条件の多数の変形形態および組合せが存在する。このようなプロセス条件を最適化するためには、合理的かつ日常的な実験のみが必要とされる。
【0068】
実施例１：効率的なプロテオミクス調査のための自己組織化によるタンパク質の分子インデックス化（ＭＩＰＳＡ）。
材料および方法
材料および方法
【0069】
ＭＩＰＳＡ宛先ベクター構築およびＵＣＩバーコードライブラリー構築。ＭＩＰＳＡベクターは、ｐＤＥＳＴ１５ベクターを骨格として用いて構築した。ＲＢＳ、Ｋｏｚａｋ配列、Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質、ＦＬＡＧタグ、およびａｔｔＲ１配列をコードするｇＢｌｏｃｋ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を親プラスミドにクローニングした。１５０ｂｐのポリ（Ａ）配列もａｔｔＲ２および終止コドンの後に付加した。４１ｎｔバーコードオリゴを、交互混合塩基（Ｓ：Ｇ／Ｃ；Ｗ：Ａ／Ｔ）を有するｇＢｌｏｃｋ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で生成して、以下の配列：（ＳＷ）１８－ＡＧＧＧＡ－（ＳＷ）１８を生成した。縮重バーコードに隣接する配列は、標準的なＰｈＩＰ－Ｓｅｑ ＰＣＲ１およびＰＣＲ２プライマー結合部位を組み込んだ（４３）。１８ｎｇの出発ＵＣＩライブラリーを使用して４０サイクルのＰＣＲを行い、ライブラリーを増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｐｘＩ制限部位を組み込んだ。次いで、ＭＩＰＳＡベクターおよび増幅されたＵＣＩライブラリーを制限酵素で一晩消化し、カラム精製し、１：５のベクター対インサート比で連結（ｌｉｇａｔｅ）した。連結されたＭＩＰＳＡベクターを使用して、エレクトロコンピテントＯｎｅ Ｓｈｏｔ ｃｃｄＢ ２ Ｔ１Ｒ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を形質転換した。６回の形質転換反応により約８００，０００個のコロニーを得て、ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩライブラリーを作製した。
【0070】
バーコード化ＭＩＰＳＡベクターへのヒトＯＲＦｅｏｍｅ組換え。１５０ｎｇのｐＥＮＴＲ－ｈＯＲＦｅｏｍｅ－（Ｌ１－Ｌ５）ベクターを、１５０ｎｇのｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡベクターおよび２μＬのＧａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と合わせて、総反応容量を１０ｕＬとした。反応物を２５℃で一晩インキュベートした。全反応物を５０μＬのＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＯｍｎｉＭＡＸ ２ Ｔ１Ｒケミカルコンピテント大腸菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。形質転換により約１２０，０００コロニーが得られ、これは各ヒトサブプールライブラリーの約１０倍である。コロニーを収集し、掻き取ることによってプールした後、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、バーコード化ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ－ｈｓＯＲＦｅｏｍｅプラスミドＭＩＰＳＡ（ヒトＯＲＦｅｏｍｅ ＤＮＡライブラリー）を精製した。
【0071】
ＲＴオリゴへのＨａｌｏリガンド結合およびＨＰＬＣ精製。１００μｇの５’アミン修飾オリゴ（表１）を、Ｇｕら（１４）に従って、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液中の７５μＬ（１７．８５μｇ／μＬ）のスクシンイミジルエステル（Ｏ２）Ｈａｌｏリガンド（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に室温で６時間インキュベートした。３Ｍ ＮａＣｌおよび氷冷エタノールを、それぞれ１０％（ｖ／ｖ）および２５０％（ｖ／ｖ）で標識反応物に添加し、－８０℃で一晩インキュベートした。反応物を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを氷冷７０％エタノール中で１回すすぎ、１０分間風乾した。
【0072】
Ｈａｌｏリガンド結合ＲＴプライマーを、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ－３００ ７ｕ、１００×４．６ｍｍカラム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、０－７０％ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＣＮ（アセトニトリルに対して１００ｍＭ酢酸トリメチルアミン）の２緩衝液勾配を使用して７０分間にわたってＨＰＬＣ精製した。標識オリゴに対応する画分を回収し、凍結乾燥した（図６）。オリゴを１μＭで再懸濁し、－８０℃で保存した。
【0073】
ＭＩＰＳＡ ＲＮＡライブラリー調製。ヒトＯＲＦｅｏｍｅライブラリー（４μｇ）を含有するｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡベクターを、Ｉ－ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で一晩直鎖化した。生成物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．ＫＧ）を用いてカラム精製した。４０μＬのＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を利用して、１μｇの精製した直鎖化産物を転写した。生成物を６０μＬの分子生物学グレードの水で希釈し、１μＬのＤＮＡｓｅＩを添加した。反応物を３７℃でさらに１５分間インキュベートした。次いで、５０μＬの１Ｍ ＬｉＣｌを溶液に添加し、－８０℃で一晩インキュベートした。遠心分離機を４℃に冷却し、ＲＮＡを最大速度で３０分間回転させた。上清を除去し、ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。サンプルを４℃でさらに１０分間スピンダウンし、７０％エタノールを除去した。ペレットを室温で１５分間乾燥させ、続いて１００μＬの水に再懸濁した。サンプルを保存するために、１μＬの４０Ｕ／μＬ ＲＮＡｓｅＯＵＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ ＣＡ）を添加した。
【0074】
ＭＩＰＳＡ ＲＮＡライブラリー逆転写および翻訳。ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写反応物を調製した。最初に、１μＬの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μＬのＲＮＡｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μＬ）、４．１７μＬのＲＮＡライブラリー（１．５μＭ）、および７．８３μＬのＨａｌｏリガンドコンジュゲートＲＴプライマー（１μＭ、表１）を、単一の１４μＬの反応液に合わせ、６５℃で５分間インキュベートし、続いて氷上で２分間インキュベートした。４μＬの５×ＲＴ緩衝液、１μＬの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μＬのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＲＴ酵素（２００Ｕ／μＬ）を氷上の１４μＬ反応物に添加し、４２℃で２０分間インキュベートした。単一の２０μＬ ＲＴ反応物に３６μＬのＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。ビーズを磁石で集め、７０％エタノールで５回洗浄した。ビーズを室温で１０分間風乾し、７μＬの５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５に再懸濁した。生成物（２μＬ）を分光光度法で分析して、ＲＮＡ収量を測定した。翻訳反応を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓΔＲｉｂｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して氷上で設定した（４４）。リボソームの最終濃度が０．３μＭになるように反応を改変した。４．５７μＬのＲＴ反応物を、４μＬの溶液Ａ、１．２μＬの因子混合物、および０．２３μＬのリボソーム（１３．３μＭ）に添加した。この反応物を３７℃で２時間インキュベートし、３５μＬの１×ＰＢＳで総容量４５μＬに希釈し、直ちに使用するか、または２５％グリセロールの添加後に－８０℃で保存した。ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓΔＲＦ１２３ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を利用する最適化実験において、溶液ＢをＮＥＢカスタムメイドのＦａｃｔｏｒ Ｍｉｘ（－ＲＦ１２３、－リボソーム）で置換した。３７℃で２時間のインキュベーション工程の後、ＲＮａｓｅ Ａを添加するか、または放出因子１、２、および３を添加し、反応を氷上で３０分間進行させた。
【0075】
ＭＩＰＳＡライブラリーを用いた免疫沈降。５μＬの血清を４５μＬの希釈ＭＩＰＳＡライブラリー（上記参照）と混合し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートする。各ＩＰについて、５μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｙｎａｂｅａｄｓおよび５μＬのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物を、１×ＰＢＳを用いてそれらの元の体積の２倍で３回洗浄した。次いで、ビーズを元の容量で１×ＰＢＳに再懸濁し、各ＩＰに添加した。結合を４℃で４時間進行させた。ビーズを磁石上に回収し、ビーズを１×ＰＢＳで３回洗浄し、洗浄の間にチューブまたはプレートを交換した。次いで、ビーズを回収し、Ｔ７－Ｐｅｐ ２ ＰＣＲ１ ＦフォワードプライマーおよびＴ７－Ｐｅｐｓ ＰＣＲ１ Ｒ＋ａｄ ｍｉｎリバースプライマー（表１）ならびにＨｅｒｃｕｌａｓｅ－ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含有する２０μＬのＰＣＲマスターミックスに再懸濁した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性ステップ、続いて９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３０サイクル、最後に７２℃で３分間の伸長。２マイクロリットルの増幅産物を、ＰｈＩＰ ＰＣＲ２ ＦフォワードプライマーおよびＡｄ ｍｉｎ ＢＣＸ Ｐ７リバースプライマーを用いた１０サイクルの２０μＬデュアルインデックスＰＣＲ反応へのインプットとして使用した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の最初の変性工程、続いて９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の１０サイクル、最後に７２℃で３分間の伸長。ｉ５／ｉ７インデックス付きライブラリーをプールし、カラム精製した。ライブラリーを、１×７５ｎｔプロトコルを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上でシーケンシングした。Ｐｌａｔｏ２＿ｉ５＿ＮｅｘｔＳｅｑ＿ＳＰおよびＳｔａｎｄａｒｄ＿ｉ７＿ＳＰプライマーを、ｉ５／ｉ７同定のために使用した（表１）。出力は、不整合を許容することなくｉ５およびｉ７を使用して多重分離された。
【0076】
ファージ免疫沈降シーケンシング。９０アミノ酸のヒトペプチドームライブラリーの設計およびクローニングは、以前に記載されている（２４）。ファージ免疫沈降およびシーケンシングを、本発明者らが公開したプロトコルに従って実施した（４５）。簡単に述べると、０．２μｌの各血漿を個々にヒトファージライブラリーと混合し、次いでプロテインＡおよびプロテインＧでコーティングした磁気ビーズを使用して免疫沈降させた。８つのモックＩＰのセットを各９６ウェルプレート上で実行した。アンプリコンを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００機器でシーケンシングした。
【0077】
ｑＰＣＲによるＭＩＰＳＡ実験の定量化のために、ＰＣＲ１産物を以下のように分析した。ＰＣＲ１反応の１／１０００希釈物４．６μＬを、５μＬのＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ Ｆａｓｔ ２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、０．２μＬの２μＭ参照色素および０．２μＬの１０μＭフォワードおよびリバースプライマーミックス（標的ＵＣＩに特異的）を含有する１０μＬのｑＰＣＲマスターミックスに再懸濁した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性ステップ、続いて９５℃で２０秒間、６０℃で３０秒間を３０サイクル、４５サイクル。サーモサイクリングの完了後、増幅産物を融解曲線分析に供した。ＭＩＰＳＡ免疫沈降実験のためのｑＰＣＲプライマーは以下の通りである。ＴＲＩＭ２１に対するＢＴ２＿ＦおよびＢＴ２＿Ｒ、ＧＡＰＤＨに対するＢＧ４＿ＦおよびＢＧ４＿Ｒ、ならびにＮＴ５Ｃ１Ａに対するＮＴ５Ｃ１Ａ＿ＦおよびＮＴ５Ｃ１Ａ＿Ｒ（表１）。
【0078】
血漿サンプル。全てのサンプルは、以下に記載されるように、対象がプロトコール適格性基準を満たした研究によって収集された。研究の全ては、研究参加者の権利およびプライバシーを保護し、元のサンプル収集およびその後の分析について、それぞれの直観審査委員会によって承認された。
【0079】
パンデミック前の血漿サンプル。全てのヒトサンプルは、２０１７年より前に、ＮＩＡＩＤ ＩＲＢ承認の手順に従って、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）、ワクチン研究センター（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＶＲＣ）／国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＡＩＤ）／ＮＩＨのプロトコル「VRC 000: Screening Subjects for HIV Vaccine Research Studies」（NCT00031304）の下で、収集した。
【0080】
非入院患者からのＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿（ＣＣＰ）。適格なＣＣＰドナーは、前述のように研究担当者から連絡を受けた（４６，４７）。全てのドナーは少なくとも１８歳であり、鼻咽頭スワブサンプル中のＲＮＡの検出によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の確定診断を有していた。基本的な人口統計学的情報（年齢、性別、ＣＯＶＩＤ－１９による入院）を各ドナーから得た；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最初の診断および診断の日付を、カルテ審査によって確認した。採取から１２時間以内にサンプルを血漿と末梢血単核細胞に分離し、血漿サンプルを直ちに－８０℃で凍結した。
【0081】
重症ＣＯＶＩＤ－１９血漿サンプル。研究コホートは、以下の条件を満たす入院患者を対照とした：１）ＣＯＶＩＤ－１９の確定診断；２）死亡または退院までの生存；および３）Johns Hopkins COVID-19 Remnant Specimen Biorepository（ジョンズ・ホプキンズ病院ＣＯＶＩＤ－１９患者の５９％および在院日数≧３日を有する患者の６６％を含む機会サンプル）中に残存検体を有する（４８）。患者の結果は、世界保健機関（ＷＨＯ）ＣＯＶＩＤ－１９疾患重篤度スケールによって定義された。この研究に含まれた重症ＣＯＶＩＤ－１９患者からのサンプルは、死亡した１７人の患者、人工呼吸後に回復した１３人の患者、回復するために酸素投与を必要とした２２人の患者、および補充酸素投与なしで回復した３人の患者から得られた。この研究は、ＪＨＵ施設内倫理委員会（ＩＲＢ００２４８３３２、ＩＲＢ００２７３５１６）によって承認され、すべての標本および臨床データが、Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational ResearchのCore for Clinical Research Data Acquisitionによって非特定化されたので、同意の権利放棄が認められ；研究チームは、同定可能な患者データへのアクセスを有さなかった。
【0082】
シェーグレン症候群および封入体筋炎（ＩＢＭ）血漿サンプル。シェーグレン症候群サンプルをプロトコルＮＡ＿０００１３２０１の下で収集した。全ての患者は＞１８歳であり、インフォームドコンセントを得た。ＩＢＭ患者サンプルをプロトコルＩＲＢ００２３５２５６の下で収集した。全ての患者がＥＮＭＣ ２０１１診断基準（４９）を満たし、インフォームドコンセントを得た。
【0083】
イムノブロット分析。５％β－ＭＥを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液を翻訳後サンプルに添加し、５分間煮沸し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ＰＶＤＦ膜に移した後、ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）および５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有する２０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．６）中、室温で＞１時間ブロッキングした。続いて、ブロットを一次抗体と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて二次抗体中で室温で４時間インキュベートした。
【0084】
ＵＣＩ－ＯＲＦ辞書の構築。Ｎｅｘｔｅｒａ ＸＴ ＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を１５０ｎｇの各ライブラリーのタグメント化に使用して、１．５ｋｂ付近を中心とする最適サイズ分布を得た。タグメント化ＭＩＰＳＡヒトＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを、Ｔ７－Ｐｅｐ２ ＰＣＲ１ ＦフォワードおよびＮｅｘｔｅｒａ Ｉｎｄｅｘ １ Ｒｅａｄプライマーと共にＨｅｒｃｕｌａｓｅ－ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して増幅した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性ステップ、続いて９５℃で２０秒間、５３．５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３０サイクル、最後に７２℃で３分間の伸長。ＰＣＲ反応を１％アガロースゲル上で実行し、続いて約１．５ｋｂの産物を切り出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ＆ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐカラム（Ｍａｃｋｅｒｙナゲル）を使用して精製した。次いで、精製した産物を、ＰｈＩＰ ＰＣＲ２ ＦフォワードプライマーおよびＰ７．２リバースプライマー（プライマー配列のリストについては表１を参照のこと）を用いてさらに１０サイクル増幅した。産物をゲル精製し、リード１についてＴ７－Ｐｅｐ２．２ ＳＰ ｓｕｂＡプライマーおよびリード２についてＭＩＳＥＱＰＬＡＴＯＲ２プライマーを使用してＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）上でシーケンシングした。リード１は、ＵＣＩを捕捉するために６０ｂｐ長であった。第１のインデックスリードＩ１は、ＯＲＦへの５０ｂｐリードで置換された。Ｉ２は、サンプル逆多重化のためのｉ５インデックスを識別するために使用された。
【0085】
ヒトＯＲＦｅｏｍｅ Ｖ８．１のＤＮＡ配列を最初の５０ｎｔに切断し、非ユニーク配列に対応するＯＲＦ名を連結した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑから読み取った５０ｎｔのＲ２（ＯＲＦ）の逆多重化出力を、Ｒｂｏｗｔｉｅ２パッケージ（５０）を使用して、以下のパラメーターを有する短縮型ヒトＯＲＦｅｏｍｅ Ｖ８．１ライブラリーにアライメントさせた：options = "-a --very-sensitive-local"。次いで、固有のＦＡＳＴＱ識別子を使用して、６０ｂｐのＲ１（ＵＣＩ）リードから対応する配列を抽出した。次いで、これらの配列を、３’アンカーＡＣＧＡＴＡを使用して短縮し、そしてアンカーを有さない配列を除去した。さらに、１８個未満のヌクレオチドを有する任意の短縮型Ｒ１配列を除去した。フィルタリング後に対応するＵＣＩを依然として有するＯＲＦ配列を、ＦＡＳＴＱ識別子を使用して保持した。次いで、同じＵＣＩを有するＯＲＦの名前を連結し、この最終辞書を使用して、ＯＲＦ名およびＵＣＩ配列を有するＦＡＳＴＡアラインメントファイルを生成した。
【0086】
ＭＩＰＳＡデータの情報分析。Ｉｌｌｕｍｉｎａ出力ＦＡＳＴＱファイルを、全てのＵＣＩ配列の後に定常ＡＣＧＡＴアンカー配列を使用して切り詰めた。次に、完全マッチアラインメントを使用して、ＵＣＩ－ＯＲＦルックアップディクショナリを介して短縮配列をそれらの連結されたＯＲＦにマッピングした。行が個々のＵＣＩに対応し、列がサンプルに対応するカウント行列が構築される。次に、本発明者らは、ｅｄｇｅＲソフトウェアパッケージ（５１）を使用し、これは、負の二項モデルを使用して、各サンプルにおいて検出されたシグナルを、血清なしで実施された陰性対照（「モック」）ＩＰのセットと比較し、倍率変化値および各サンプルにおける各ＵＣＩについての検定統計量を返し、倍率変化および有意性行列を作成した。有意に濃縮されたＵＣＩ（「ヒット」）は、少なくとも１５のリードカウント、０．００１未満のｐ値、および少なくとも３の倍数変化を必要とした。ヒット倍数変化行列は、「ヒット」について倍数変化値を報告し、ヒットではないＵＣＩについて「１」を報告する。
【0087】
タンパク質配列の類似性。ｈＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１ライブラリー中のタンパク質間の配列相同性を評価するために、ｂｌａｓｔｐアラインメントを用いて、各タンパク質配列を他のすべてのライブラリーメンバーと比較した（パラメーター：「-outfmt 6 -evalue 100 -max_hsps 1 -soft_masking false -word_size 7 -max_target_seqs 100000」）。
【0088】
ファージ免疫沈降シーケンシング（ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ）分析。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、以前に公開されたプロトコールに従って行った（４５）。簡潔には、０．２μｌの各血漿を、９０－ａａヒトファージライブラリーと個々に混合し、プロテインＡおよびプロテインＧでコーティングした磁気ビーズを使用して免疫沈降させた。６～８個のモック免疫沈降（血漿投入なし）のセットを各９６ウェルプレート上で実行した。磁気ビーズをＰＣＲマスターミックスに懸濁し、サーモサイクリングに供した。第２のＰＣＲ反応を、サンプルバーのために使用した。アンプリコンをプールし、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００機器でシーケンシングした。ヒトライブラリーを有するＰｈＩＰ－Ｓｅｑを使用して、健常なドナーからの血漿の収集物中の自己抗体を特徴付けた。重症ＣＯＶＩＤ－１９コホートとの公平な比較のために、本発明者らはまず、陽性個体の両方においてＩＦＮ－λ３反応性を検出するために必要とされたであろう最小シーケンシング深度を決定した。次いで、本発明者らは、この最小閾値より大きいシーケンシング深度を有する健常コホートからの４２３個のデータセットのみを考慮した。これらの４２３個体のいずれも、ＩＦＮ－λ３由来の任意のペプチドに対して反応性であることが見出されなかった。
【0089】
Ｉ／ＩＩＩ型インターフェロン中和アッセイ。ＩＦＮ－α２（カタログ番号１１１００－１）、ＩＦＮ－λ１（カタログ番号１５９８－ＩＬ－０２５）、およびＩＦＮ－λ３（カタログ番号５２５９－ＩＬ－０２５）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。２０μＬの患者の粗血清を、１００Ｕ／ｍＬのＩＦＮ－α２または１ｎｇ／ｍＬのＩＦＮ－λ３のいずれか、および２００μＬの総容量の完全ＤＭＥＭ溶媒と共に室温で１時間インキュベートした後、７．５×１０４ Ａ５４９細胞に添加した。４時間のインキュベーション後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、細胞ｍＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。６００ｎｇの抽出ｍＲＮＡをSuperScript III First-Strand Synthesis System（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、ｑＰＣＲ実行のためにQuantStudio 6 Flex System（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で１０倍に希釈した。ＰＣＲは２段階サイクリングプロトコールを実行し、９５℃で３分間のサイクル、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で３０秒間の４５サイクルからなる。ＭＸ１発現をインターフェロンによる細胞刺激の尺度として選択し、相対的ｍＲＮＡ発現をＧＡＰＤＨ発現によって正規化した。ｑＰＣＲプライマーＧＡＰＤＨおよびＭＸ１は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した（表１）。
表１ プライマーシーケンス
表１ プライマーシーケンス
【表1】
【0090】
結果
ＭＩＰＳＡシステムの開発。ＭＩＰＳＡゲートウェイデスティネーションベクターは、以下の重要な要素を含有する：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位、定常プライマー結合配列に隣接する等温ユニーククローン識別子（「ＵＣＩ」バーコード）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質（８９１ｎｔ）、ＯＲＦ挿入のための組換え配列、終止コドン、およびプラスミド直鎖化のためのホーミングエンドヌクレアーゼ部位。組換えＯＲＦ含有ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡプラスミドを図１Ａに示す。
ＭＩＰＳＡシステムの開発。ＭＩＰＳＡゲートウェイデスティネーションベクターは、以下の重要な要素を含有する：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位、定常プライマー結合配列に隣接する等温ユニーククローン識別子（「ＵＣＩ」バーコード）、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質（８９１ｎｔ）、ＯＲＦ挿入のための組換え配列、終止コドン、およびプラスミド直鎖化のためのホーミングエンドヌクレアーゼ部位。組換えＯＲＦ含有ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡプラスミドを図１Ａに示す。
【0091】
本発明者らは、最初に、転写開始部位とリボソーム結合性部位との間に位置する確率的等温ＵＣＩを含むｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡプラスミドのライブラリーを確立しようとした。融解温度（Ｔｍ）バランスのとれた配列：（ＳＷ）１８－ＡＧＧＧＡ－（ＳＷ）１８（式中、ＳはＣおよびＧの等量混合物を表し、ＷはＡおよびＴの等量混合物を表す）を含む縮重オリゴヌクレオチドプールを合成した（図１Ｂ）。本発明者らは、この安価な配列プールが、（ｉ）固有のＯＲＦ標識のために十分な複雑性（２３６～７×１０１０）を提供し、（ｉｉ）歪みなく増幅し、（ｉｉｉ）対象となる個々のＵＣＩの測定のためのＯＲＦ特異的フォワードおよびリバースｑＰＣＲプライマー結合部位として役立つと推論した。縮重オリゴヌクレオチドプールをＰＣＲによって増幅し、ＭＩＰＳＡデスティネーションベクターに制限クローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した（方法）。約８００，０００個の形質転換体を選択プレートから掻き取って、ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーを得た。ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および既知の自己抗原、tripartite motif containing-21（ＴＲＩＭ２１、一般にＲｏ５２として知られている）をコードするＯＲＦを別々にｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーに組み換え、以下の実験に使用した。単一のバーコード化ＧＡＰＤＨおよびＴＲＩＭ２１クローンを単離し、シーケンシングした。
【0092】
ＭＩＰＳＡの手順は、スクシンイミジルエステル（Ｏ２）－ハロアルカン（Ｈａｌｏリガンド）結合逆転写（ＲＴ）プライマーを使用する確率バーコードの逆転写を含む。結合されたＲＴプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉリボソームのアセンブリおよび翻訳の開始を妨害すべきではないが、Ｈａｌｏリガンド－Ｈａｌｏタグ－タンパク錯体のカップリングが翻訳のさらなるラウンドを妨害し得るように十分に近位であるべきである。本発明者らは、ＲＢＳの３’末端から－３０ヌクレオチド～＋７ヌクレオチド（５’から３’）の範囲の距離でアニーリングする一連のＲＴプライマーを試験した（図１Ｄ）。これらの様々な位置でプライマーで飽和されたｍＲＮＡからのタンパク質産物の収量に基づいて、本発明者らは、翻訳効率に干渉しなかったので－２０位を選択した（図１Ｅ）。対照的に、ＲＢＳの２０ヌクレオチド以内に位置するプライマーからのＲＴは、タンパク質翻訳を減少または消失させた。この結果は、最小１５ヌクレオチドのｍＲＮＡを保護することが示されている、アセンブルされた７０Ｓ大腸菌リボソームの推定フットプリントと一致する（１３）。
【0093】
次に、本発明者らは、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶの５’末端がＨａｌｏリガンドで標識されたプライマーからの逆転写能、およびＨａｌｏタグ－ＴＲＩＭ２１タンパクの翻訳反応におけるＨａｌｏリガンド結合プライマーとの共有結合形成能を評価した。Ｈａｌｏリガンドコンジュゲーションおよび精製は、Gu et al.に従った（Materials and Methods、図６）（１４）。非コンジュゲートＲＴプライマーまたはａＨａｌｏリガンドコンジュゲートＲＴプライマーのいずれかを、バーコード化Ｈａｌｏタグ－ＴＲＩＭ２１ ｍＲＮＡのＲＴのために使用した。次いで、翻訳産物を、健常ドナー由来の血清またはシェーグレン症候群（ＳＳ）を有するＴＲＩＭ２１（Ｒｏ５２）自己抗体陽性患者由来の血清を用いて免疫沈降（ＩＰｅｄ、ＩＰ化）した。ＳＳ血清は、ＲＴプライマー結合にかかわらず、ＴＲＩＭ２１タンパクを効率的にＩＰ化したが、Ｈａｌｏリガンド結合プライマーをＲＴ反応に使用した場合、ＴＲＩＭ２１ ｃＤＮＡ ＵＣＩのみをプルダウンした（図１Ｆ～Ｇ）。
【0094】
ｃｉｓ対ｔｒａｎｓＵＣＩバーコード化の評価。先の実験は、実際にＨａｌｏリガンドがＲＴプライミングを妨げないこと、およびＨａｌｏタグが翻訳反応の間にＨａｌｏリガンドと共有結合を形成することができることを示したが、ｃｉｓ（錯体内）およびｔｒａｎｓ（錯体間）のＨａｌｏタグ－ＵＣＩコンジュゲーションの量は解明されなかった。（図７）。ｃｉｓおよびｔｒａｎｓＨａｌｏタグ－ＵＣＩ－コンジュゲーションの量を測定するために。ＧＡＰＤＨおよびＴＲＩＭ２１ ｍＲＮＡを別々に逆転写し（Ｈａｌｏリガンドプライマーを使用）、次いで１：１で混合するか、またはインビトロ翻訳のために別々に保持した。予想された通り、混合物の翻訳は、個々の翻訳と比較してほぼ等量の各タンパク質を産生した（図８）。翻訳条件にかかわらず、ＳＳ血漿はＴＲＩＭ２１タンパク質を特異的にＩＰ化した（図８、ＩＰｅｄ画分）。しかしながら、本発明者らは、ＳＳ ＩＰは高レベルのＴＲＩＭ２１ ＵＣＩを含んでいたが、意図したように、ｍＲＮＡが翻訳前に混合された場合、ＨＣ血清によるものと比較して、より多くのＧＡＰＤＨ ＵＣＩがＳＳ血清によってプルダウンされたことに注目した。これは、実際にいくつかのｔｒａｎｓバーコード化が起こることを示す（図２Ａ）。本発明者らは、タンパク質の約５０％がｃｉｓバーコード化され、残りの５０％がｔｒａｎｓバーコード化されたタンパク質が両方のタンパク質によって等しく表されると推定する。したがって、この２コンパートメント系では、ＴＲＩＭ２１タンパク質の２５％がＧＡＰＤＨ－ＵＣＩにコンジュゲートしている。
【0095】
複雑なライブラリーの設定において、タンパク質の約５０％がｔｒａｎｓバーコード化される場合であっても、この望ましくない副産物は、ライブラリーの全てのメンバーにわたって一様に分布する。本発明者らは、第１のＧＡＰＤＨおよびＴＲＩＭ２１クローンの１：１混合物と組み合わせた１００倍過剰の第２のＧＡＰＤＨクローンから構成されるモデルＭＩＰＳＡライブラリーを使用してこれを試験した（図２Ｂ）。本発明者らはさらに、各ＵＣＩの絶対定量化のためにＰＣＲスパイクイン配列を利用するシーケンシングワークフローを開発した。最適化されたプロトコルを使用したＳＳ血清によるＩＰは、ＴＲＩＭ２１－ＵＣＩの特異的ＩＰをもたらし、ｔｒａｎｓ結合ＧＡＰＤＨ－ＵＣＩ ＩＰの検出は無視できる量であった（図２Ｂ）。絶対定量化のためにスパイクイン配列を使用し、ＴＲＩＭ２１タンパク質の１００％のプルダウンを仮定して、本発明者らは、約０．２％のｃｉｓカップリング効率を計算した（すなわち、投入ＴＲＩＭ２１ ＲＮＡ分子の０．２％が、意図されたＵＣＩカップリングＴＲＩＭ２１タンパク質に変換された）。
【0096】
確率的にバーコード化されたヒトＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリーを確立し、デコンボリューションする。配列が検証されたヒトＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１は、ｐＤＯＮＲ２２３中の１１，４３７個の遺伝子にマッピングされる１２，６８０個のクローンＯＲＦから構成される（１５）。ライブラリーの５つのサブプールを作製し、各々はおよそ約２，５００個の同様のサイズのＯＲＦから構成された。５つのサブプールの各々を別々にｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーに組み換え、形質転換して、約１０倍のＯＲＦカバレッジ（サブプール当たり約３０，０００クローン）を得た。各サブプールを、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ電気泳動、約２０個のコロニーのシーケンシング、およびスーパープールのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによって評価した。ＴＲＩＭ２１プラスミドを、スーパープールされたｈＯＲＦｅｏｍｅライブラリーに、典型的なライブラリーメンバーに匹敵する１：１０、０００でスパイクした。次いで、リードアウトとしてシーケンシングを使用して、ｈＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリーに対してＳＳ ＩＰ実験を行った。スパイクインされたＴＲＩＭ２１を含む、ライブラリー中の全てのバーコードからの読み取りを図２Ｃに示す。ＴＲＩＭ２１のＳＳ自己抗体依存的濃縮（１７倍）は、単純な系と同様であった（図２Ｄ）。以前に誘導されたカップリング効率を仮定して、本発明者らは、正確にｃｉｓカップリングしたＴＲＩＭ２１分子の約６×１０５分子（したがって、平均して各ライブラリーメンバー）がＩＰ反応に投入されたと推定している。
【0097】
次に、本発明者らは、タグメンテーションおよびシーケンシングを使用して、ＵＣＩ－ＯＲＦルックアップ辞書を作成するためのシステムを確立した（図３Ａ）。５’５０ｎｔのＯＲＦインサートのシーケンシングにより、１１，８８７個のユニークな５’５０ｎｔ配列のうち１１，３００個が検出された。検出された１５３，１６１のユニークなバーコードのうち、８２．９％（１２６，９７５）が単一のＯＲＦに関連することが見出された。各ＯＲＦは、０～１２３ＵＣＩの範囲の中央値９ＵＣＩと一意的に関連した（図３Ｂ）。各ＯＲＦに対応するリードを集約すると、表されたＯＲＦの９９％超が、中央値ＯＲＦ存在量の１０倍の差内に存在した（図３Ｃ）。総合すると、これらのデータは、本発明者らが１１，３００個の確率的にインデックス付けされたヒトＯＲＦの均一なライブラリーを確立し、下流の分析のための辞書を十分に定義したことを示した。図３Ｄは、図２Ｃの散布図を示すが、予想通りｙ＝ｘ対角線に沿って出現する４７個の辞書解読ＧＡＰＤＨ ＵＣＩ（ｈＯＲＦｅｏｍｅライブラリー中に存在する２つのＧＡＰＤＨアイソフォームに対応する）を有する。
【0098】
重症ＣＯＶＩＤ－１９に関連する自己抗体の不偏ＭＩＰＳＡ分析。いくつかの最近の報告は、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者における自己抗体反応性の上昇を記載している（１６～２０）。そこで、本発明者らは、５５人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の血漿中の自己反応性の偏りのない同定のために、ヒトＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを有するＭＩＰＳＡを使用した。比較のために、本発明者らは、ＭＩＰＳＡを使用して、１０人の健常なドナーおよび１０人の入院していないＣＯＶＩＤ－１９の回復期血漿ドナーからの血漿中の自己反応性を検出した（表２）。各サンプルを、血清を除く全ての反応成分を含有する８つの「モックＩＰ」のセットと比較した。このモックＩＰとの比較は、ライブラリーおよびバックグラウンド結合における偏りを説明する。重要なことに、抗体依存性反応性を検出するために使用されるインフォーマティックパイプラインは、モックＩＰ当たり５つの偽陽性ＵＣＩヒットの中央値（２～９の範囲）をもたらした。しかし、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血清を使用したＩＰは、平均１３２個の反応性ＵＣＩをもたらし、これは、対照の中の９３個の反応性ＵＣＩの平均よりも有意に高かった（ｐ＝０．０１８、ｔ検定）。ＵＣＩをそれらの対応するタンパク質に折り畳むことにより、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の間で平均８３個の反応性タンパク質が得られ、これは対照の間で平均６３個の反応性タンパク質よりも有意に高かった（図４Ａ、ｐ＝０．０１９、ｔ検定）。
表２ 研究対象
表２ 研究対象
【表2】
【0099】
本発明者らは次に、少なくとも２つの反応性ＵＣＩを有し、少なくとも１人の重症患者において反応性があり、１より多い対照（健常または軽度／中等度の回復期血漿中）において反応性でなかった重症ＣＯＶＩＤ－１９ ＩＰ中のタンパク質を調べた。１人の重症の患者および１人の対照において反応性であったタンパク質は除外した。これらの基準を満たした１１５個のタンパク質を図４Ｂのクラスター化ヒートマップに示す。５５人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうち５２人が、これらのタンパク質の少なくとも１つに対して反応性を示した。本発明者らは、複数の個体において同時に起こるタンパク質反応性に注目し、その大多数がタンパク質配列アラインメントによる相同性を欠いていた。
【0100】
１つの注目すべき自己反応性クラスター（図４Ｂ）は、５’－ヌクレオチダーゼ、細胞質基質１Ａ（ＮＴ５Ｃ１Ａ）を含み、これは、骨格筋において高度に発現され、封入体筋炎（ＩＢＭ）において最もよく特徴付けられた自己抗体標的である。ＮＴ５Ｃ１Ａに連鎖する複数のＵＣＩは、５５人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうちの３人（５．５％）において有意に増加した。ＮＴ５Ｃ１Ａ自己抗体は、ＩＢＭ患者の最大７０％において（１）、ＳＳ患者の約２０％において、および健常ドナーの最大約５％において報告されている（２１）。重症ＣＯＶＩＤ－１９コホートにおけるＮＴ５Ｃ１Ａ反応性の頻度は、必ずしも上昇していない。しかし、本発明者らは、ＭＩＰＳＡが、ＮＴ５Ｃ１Ａ反応性に基づいて、健常なドナーとＩＢＭ血漿とを確実に区別することができるかどうかを疑問に考えた。本発明者らは、１０人の健常ドナーおよび１０人のＩＢＭ患者からの血漿を試験し、後者はＰｈＩＰ－Ｓｅｑによって決定されたＮＴ５Ｃ１Ａ血清陽性に基づいて選択された（１）この独立したコホートにおける対照からの患者の明確な分離は、ＭＩＰＳＡが実際に、密接に相関するリードアウトであったｑＰＣＲまたはシーケンシングのいずれかを使用する臨床診断試験において有用性を有し得ることを示唆する（図４Ｃ）。
【0101】
重症ＣＯＶＩＤ－１９におけるＩ型およびＩＩＩ型インターフェロン中和自己抗体。Ｉ型インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）及びオメガ（ＩＦＮ－ω）を標的とする中和自己抗体は、重症ＣＯＶＩＤ－１９と関連付けられている（１７、２２、２３）。ＩＦＮ－α１６を除く全てのＩ型インターフェロンは、ヒトＭＩＰＳＡライブラリ及び辞書に表されている。しかし、ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α１７、およびＩＦＮ－α２１は、それらをコードするＯＲＦ配列の最初の５０ヌクレオチドをシーケンシングすることによって区別できない。このコホートにおける重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうちの２人（３．６％）は、劇的なＩＦＮ－α自己反応性を示した（１０個の別個のＩＦＮ－αＯＲＦにわたって４３個および４１個のＵＣＩ、ならびに５個および２個のＩＦＮ－ωＵＣＩ、図５Ａ～５Ｂ）。これらのタンパク質の広範な共反応性は、それらの配列相同性に起因する可能性が高い（図９）。少なくとも２つのＩＦＮ ＵＣＩが陽性であるとみなされることを必要とすることによって、本発明者らは、より低いレベルの反応性を有する３人のさらなる重症ＣＯＶＩＤ－１９患者を同定し、各々は２つの反応性ＩＦＮ－αＵＣＩのみを有した。興味深いことに、１つの血漿（Ｐ５）は、ＩＩＩ型インターフェロンＩＦＮ－λ３から５つのＵＣＩを沈降させたが、いずれのＩ型またはＩＩ型インターフェロンからもＵＣＩを沈降させなかった（図５Ｃ～５Ｄ）。健常または非入院ＣＯＶＩＤ－１９対照のいずれも、２つ以上のインターフェロンＵＣＩに対して陽性でなかった。
【0102】
Ａ５４９ヒト腺癌肺上皮細胞を１００Ｕ／ｍｌ ＩＦＮ－α２または１ｎｇ／ｍｌ ＩＦＮ－λ３とともに無血清培地中で４時間インキュベートすると、ＩＦＮ応答遺伝子ＭＸ１がそれぞれ約１，０００倍および約１００倍強く上方制御された。Ｐ１、Ｐ２またはＰ３の血漿とのＩＦＮ－α２のプレインキュベーションは、Ａ５４９インターフェロン応答を完全に消失させた（図５Ｅ）。ＭＩＰＳＡによる最も弱いＩＦＮ－α反応性を有する血漿（Ｐ４）は、サイトカインを部分的に中和した。ＨＣまたはＰ５血漿のいずれも、ＩＦＮ－αに対するＡ５４９細胞の応答に対していかなる効果も有しなかった。しかしながら、ＩＦＮ－λ３とＭＩＰＳＡ反応性血漿Ｐ２およびＰ５とのプレインキュベーションは、サイトカインを中和した（図５Ｆ）。他の血漿（ＨＣ、Ｐ１、Ｐ３またはＰ４）はいずれも、ＩＦＮ－λに対するＡ５４９細胞の応答に対していかなる効果も有しなかった。要約すると、この重症ＣＯＶＩＤ－１９コホートの抗体検査により、患者の５．５％に強く中和するＩＦＮ－α自己抗体が、患者の３．６％に強く中和するＩＦＮ－λ３自己抗体が同定され、１人の患者（１．８％）が両方の自己反応性を保有していた。
【0103】
本発明者らは、９０－ａａヒトペプチドームライブラリー（２４）を有するＰｈＩＰ－Ｓｅｑもまた、このコホートにおいてインターフェロン抗体を検出する可能性があると考えた。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、Ｐ１およびＰ２からの血漿中でＩＦＮ－α反応性を検出したが、その程度ははるかに低かった（図５Ｇ）。Ｐ３およびＰ４の血漿中のＭＩＰＳＡによって検出された２つのより弱いＩＦＮ－α反応性は、両方ともＰｈＩＰ－Ｓｅｑによって失われた。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、ＭＩＰＳＡによって陰性であった単一のさらなる弱いＩＦＮ－α反応性サンプルを同定した（図示せず）。ＩＩＩ型インターフェロン自己反応性（ＩＦＮ－λ３のみを対象とする）の検出は、２つの技術間で完全に一致した。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑデータを使用して、Ｉ型およびＩＩＩ型自己抗原における優性エピトープの位置を絞り込んだ（図５Ｈ～５Ｉ）。
【0104】
本発明者らは次に、一般集団におけるＩＦＮ－λ３自己反応性の罹患率、およびそれが重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の間で増加し得るかどうかについて考えた。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、４２３人の健常な対照の血漿をプロファイリングするために使用され、そのうちのいずれも、検出可能なＩＦＮ－λ３自己反応性を有することが見出されなかった。これらのデータは、ＩＦＮ－λ３自己反応性が重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する個体の間でより頻繁であり得ることを示唆する。これは、中和抗ＩＦＮλ自己抗体を記載する最初の報告であり、したがって、一部の患者において生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９に寄与する潜在的に新規な病原性機構を提案する。
【0105】
実施例２：タンパク質ディスプレイ技術によって同定された重症ＣＯＶＩＤ－１９における中和ＩＦＮＬ３自己抗体。
【0106】
ＭＩＰＳＡを使用した重症ＣＯＶＩＤ－１９患者において検出された自己抗体。自己免疫と重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患との間の関連性は、ますます認識されている。５５人の入院個体のコホートにおいて、本発明者らは、本発明者らが以前に封入体筋炎に関連していたものを含む、複数の確立された自己抗体を検出した（１）。次いで、本発明者らは、血清陽性ＩＢＭ患者および健常対照の別個のコホートにおいて、ＮＴ５Ｃ１Ａ自己抗体を検出するためのＭＩＰＳＡの能力を試験した。結果は、標準化された包括的な自己抗体試験のためのＭＩＰＳＡの臨床有用性を評価することにおける将来の努力を支持する。そのような試験は、シングルプレックスｑＰＣＲまたはバイアスのないシーケンシングのいずれかをリードアウトとして利用することができる。
【0107】
自己反応性のクラスターが複数の個体において観察されたが、それらが重症ＣＯＶＩＤ－１９において、たとえあったとしても、どのような機能を果たし得るかは明らかではない。より大規模な研究において、本発明者らは、同時に起こる反応性、または関連する生物学的機能を有するタンパク質に対する反応性のパターンが、重症ＣＯＶＩＤ－１９に関連する新たな自己免疫症候群を究極的に規定し得ると期待する。中和ＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－ω自己抗体は、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者において記載されており、病原性であると推定される（１７）。これらのおそらく既存の自己抗体は、一般集団において非常に稀にしか存在せず、細胞培養におけるウイルス複製の制限を遮断し、したがって疾患の解消を妨げる可能性が高い。この発見は、生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９肺炎の危険性がある個体のサブセットを同定する道を開いて、これらの自己抗体によって中和されないインターフェロンベータを利用する潜在的な治療手段を提案した。本研究において、ＭＩＰＳＡは、ＩＦＮ－αサイトカインの全ファミリーに対して広範な反応性を有する２人の個体を同定した。実際に、両方の個体に加えて、ＭＩＰＳＡによって検出されたより弱いＩＦＮ－α反応性を有する１つの個体からの血漿は、肺腺癌細胞培養モデルにおいて組換えＩＦＮ－α２を強く中和した。予期しないことに、ＩＦＮ－α反応性を有さないコホートにおける１人の個体は、５つのＩＦＮ－λ３ ＵＣＩをプルダウンした。第２のＩＦＮ－α自己反応性個体もまた、単一のＩＦＮ－λ３ ＵＣＩをプルダウンした。同じ自己反応性がまた、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑを用いて検出された。興味深いことに、ＭＩＰＳＡもＰｈＩＰ－Ｓｅｑも、それらの高度な配列相同性にもかかわらず、ＩＦＮ－λ２に対する反応性を検出しなかった（図９）。本発明者らは、これらの患者の血漿中のＩＦＮ－λ３中和能を試験し、組換えサイトカインに対する細胞応答のほぼ完全な消失を観察した（図５Ｆ）。これらのデータは、ＩＦＮ－λ３自己反応性が、重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患に寄与する新規の潜在的な病原性機構であることを提案する。
【0108】
ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ－λ、ＩＬ－２８／２９としても知られる）は、主にバリア部位で作用する強力な抗ウイルス活性を有するサイトカインである。ＩＦＮ－λに対するＩＦＮ－λＲ１／ＩＬ－１０ＲＢヘテロ二量体受容体は、肺上皮細胞上で発現され、ウイルス感染に対する自然応答にとって重要である。Ｍｏｒｄｓｔｅｉｎらは、マウスにおいて、ＩＦＮ－λが病原性を減少させ、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、およびサーズコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）の複製を抑制することを明らかにした（３２）。ＩＦＮ－λは、抗ウイルス細胞状態の誘導ではなく、免疫細胞との刺激的相互作用を介してインビボでその抗ウイルス活性の多くを発揮することが提案されている（３３）。重要なことは、ＩＦＮ－λは、初代ヒト気管支上皮細胞（３４）、初代ヒト気道上皮培養物（３５）、および初代ヒト腸上皮細胞（３６）におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を強く制限することである。これらの研究を総合すると、中和ＩＦＮ－λ自己抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を悪化させ得る多面的機構を示唆している。
【0109】
Ｃａｓａｎｏｖａらは、試験したＩ型ＩＦＮ自己抗体を有する１０１人の個体の中でＩＩＩ型ＩＦＮ中和抗体を検出しなかった（１７）。本発明者らの研究において、３人のＩＦＮ－α自己反応性個体のうちの１人（Ｐ２、２２歳男性）もまた、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を保有していた。この共反応性は非常に稀であり、したがってＣａｓａｎｏｖａコホートにおいて示されない可能性がある。あるいは、異なるアッセイ条件が異なる検出感度を示すことが可能である。Ｃａｓａｎｏｖａらは、Ａ５４９細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３と共に培養し、血漿中でプレインキュベートしなかったのに対し、本発明者らは、Ａ５４９細胞を血漿中で１時間プレインキュベートした後、１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３と共に培養した。ＳＴＡＴ３リン酸化のそれらのリードアウトはまた、ＭＸ１の上方制御と比較して異なる検出感度を提供し得る。重症ＣＯＶＩＤ－１９患者および対応対照におけるこれらの反応性の真の頻度を決定するためには、より大規模な研究が必要である。ここで、本発明者らは、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する５５人の個体のうち、それぞれ３人（５．５％）および２人（３．６％）においてＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－λ３自己抗体を中和することを報告する。ＩＦＮ－λ３自己抗体は、パンデミック前に収集された５４１人の健常対照のより大きなコホートにおいて、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑを介して検出されなかった。
【0110】
ＩＩＩ型インターフェロンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のための治療様式として提案されており（３５、３７～４１）、現在、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する罹患率および死亡率の低減における効力についてペグ化ＩＦＮ－λ１を試験するための３つの進行中の臨床試験がある（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ：ＮＣＴ０４３４３９７６、ＮＣＴ０４５３４６７３、ＮＣＴ０４３４４６００）。最近完了した１つの二重盲検プラセボ対照試験、ＮＣＴ０４３５４２５９は、外来患者設定における軽度から中等度のＣＯＶＩＤ－１９患者の間で、７日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１ｍＬ当たり２・４２ｌｏｇコピーの有意な減少を報告した（ｐ＝０・００４１）（４２）。将来の研究は、抗ＩＦＮ－λ３自己抗体が既存であるか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答して生じるかどうか、およびそれらがどのくらい頻繁にＩＦＮ－λ１も交差中和するかを決定する。しかし、ＩＦＮ－λ１およびＩＦＮ－λ３の配列アラインメント（約２９％の相同性、図９）に基づくと、交差中和はまれであると予想され、中和ＩＦＮ－λ３自己抗体を有する患者がペグ化ＩＦＮ－λ１治療が特に有益である可能性が生じる。
【0111】
結論
ＭＩＰＳＡは、別のアプローチよりも重要な利点を有する新しい自己組織化タンパクディスプレイ技術である。これは、ＰｈＩＰ－ＳｅｑおよびＭＩＰＳＡライブラリーのような相補的技術が、プログラム可能なファージディスプレイライブラリーを用いて同じ反応において簡便にスクリーニングされ得るという特性を有する。本明細書に提示されるＭＩＰＳＡプロトコルは、キャップ非依存的無細胞翻訳を必要とするが、将来の適応は、この制限を克服し得る。ＭＩＰＳＡベースの研究のための適用は、タンパク－タンパク、タンパク－抗体、およびタンパク－小分子相互作用研究を含み、翻訳後修飾の偏りのない分析を含む。ここで、本発明者らは、ＭＩＰＳＡを使用して、多くの他の潜在的に病原性の自己反応性の中で、中和ＩＦＮ－λ３自己抗体（これは、危険性のある個体のサブセットにおいて、生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９肺炎に寄与し得る）を発見した。
参考文献
1. H. B. Larman et al., Cytosolic 5’-nucleotidase 1A autoimmunity in sporadic inclusion body myositis. Annals of neurology 73, 408-418 (2013).
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17. P. Bastard et al., Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19. Science 370, (2020).
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19. L. Casciola-Rosen et al., IgM autoantibodies recognizing ACE2 are associated with severe COVID-19. medRxiv, (2020).
20. M. C. Woodruff, R. P. Ramonell, F. E. Lee, I. Sanz, Broadly-targeted autoreactivity is common in severe SARS-CoV-2 Infection. medRxiv, (2020).
21. T. E. Lloyd et al., Cytosolic 5’-Nucleotidase 1A As a Target of Circulating Autoantibodies in Autoimmune Diseases. Arthritis Care Res (Hoboken) 68, 66-71 (2016).
22. E. Y. Wang et al., Diverse Functional Autoantibodies in Patients with COVID-19. medRxiv, (2020).
23. S. Gupta, S. Nakabo, J. Chu, S. Hasni, M. J. Kaplan, Association between anti-interferon-alpha autoantibodies and COVID-19 in systemic lupus erythematosus. medRxiv, (2020).
24. G. J. Xu et al., Systematic autoantigen analysis identifies a distinct subtype of scleroderma with coincident cancer. Proc Natl Acad Sci U S A, (2016).
25. M. Stoeckius et al., Simultaneous epitope and transcriptome measurement in single cells. Nat Methods 14, 865-868 (2017).
26. I. Setliff et al., High-Throughput Mapping of B Cell Receptor Sequences to Antigen Specificity. Cell 179, 1636-1646 e1615 (2019).
27. S. K. Saka et al., Immuno-SABER enables highly multiplexed and amplified protein.
8. M. A. Jongsma, R. H. Litjens, Self-assembling protein arrays on DNA chips by auto-labeling fusion proteins with a single DNA address. Proteomics 6, 2650-2655 (2006).
29. A. Gautier et al., An engineered protein tag for multiprotein labeling in living cells. Chem Biol 15, 128-136 (2008).
30. A. J. Samelson et al., Kinetic and structural comparison of a protein’s cotranslational folding and refolding pathways. Sci Adv 4, eaas9098 (2018).
31. L. Tosi et al., Long-adapter single-strand oligonucleotide probes for the massively multiplexed cloning of kilobase genome regions. Nat Biomed Eng 1, (2017).
32. M. Mordstein et al., Lambda interferon renders epithelial cells of the respiratory and gastrointestinal tracts resistant to viral infections. J Virol 84, 5670-5677 (2010).
33. N. Ank et al., Lambda interferon (IFN-lambda), a type III IFN, is induced by viruses and IFNs and displays potent antiviral activity against select virus infections in vivo. J Virol 80, 4501-4509 (2006).
34. I. Busnadiego et al., Antiviral Activity of Type I, II, and III Interferons Counterbalances ACE2 Inducibility and Restricts SARS-CoV-2. mBio 11, (2020).
35. A. Vanderheiden et al., Type I and Type III Interferons Restrict SARS-CoV-2 Infection of Human Airway Epithelial Cultures. J Virol 94, (2020).
36. M. L. Stanifer et al., Critical Role of Type III Interferon in Controlling SARS-CoV-2 Infection in Human Intestinal Epithelial Cells. Cell Rep 32, 107863 (2020).
37. I. E. Galani et al., Untuned antiviral immunity in COVID-19 revealed by temporal type I/III interferon patterns and flu comparison. Nat Immunol 22, 32-40 (2021).
38. U. Felgenhauer et al., Inhibition of SARS-CoV-2 by type I and type III interferons. J Biol Chem 295, 13958-13964 (2020).
39. T. R. O’Brien et al., Weak Induction of Interferon Expression by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Supports Clinical Trials of Interferon-lambda to Treat Early Coronavirus Disease 2019. Clin Infect Dis 71, 1410-1412 (2020).
40. E. Andreakos, S. Tsiodras, COVID-19: lambda interferon against viral load and hyperinflammation. EMBO Mol Med 12, e12465 (2020).
41. L. Prokunina-Olsson et al., COVID-19 and emerging viral infections: The case for interferon lambda. J Exp Med 217, (2020).
42. J. J. Feld et al., Peginterferon lambda for the treatment of outpatients with COVID-19: a phase 2, placebo-controlled randomised trial. Lancet Respir Med, (2021).
43. D. Mohan et al., Publisher Correction: PhIP-Seq characterization of serum antibodies using oligonucleotide-encoded peptidomes. Nature protocols 14, 2596 (2019).
44. C. Tuckey, H. Asahara, Y. Zhou, S. Chong, Protein synthesis using a reconstituted cell-free system. Curr Protoc Mol Biol 108, 16 31 11-22 (2014).
45. D. Mohan et al., PhIP-Seq characterization of serum antibodies using oligonucleotide-encoded peptidomes. Nature protocols 13, 1958-1978 (2018).
46. S. L. Klein et al., Sex, age, and hospitalization drive antibody responses in a COVID-19 convalescent plasma donor population. J Clin Invest 130, 6141-6150 (2020).
47. R. A. Zyskind I, Zimmerman J, Naiditch H, Glatt AE, Pinter A, Theel ES, Joyner MJ, Hill DA, Lieberman MR, Bigajer E, Stok D, Frank E, Silverberg JI, SARS-CoV-2 Seroprevalence and Symptom Onset in Culturally-Linked Orthodox Jewish Communities Across Multiple Regions in the United States. JAMA Open Network In Press, (2021).
48. Correction: Patient Trajectories Among Persons Hospitalized for COVID-19. Ann Intern Med 174, 144 (2021).
49. M. R. Rose, E. I. W. Group, 188th ENMC International Workshop: Inclusion Body Myositis, 2-4 December 2011, Naarden, The Netherlands. Neuromuscul Disord 23, 1044-1055 (2013).
50. Z. Wei, W. Zhang, H. Fang, Y. Li, X. Wang, esATAC: an easy-to-use systematic pipeline for ATAC-seq data analysis. Bioinformatics 34, 2664-2665 (2018).
51. M. D. Robinson, D. J. McCarthy, G. K. Smyth, edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140 (2010).
このページの残りの部分は意図的に空白にしている。（訳注：原文においてはこのページの残りは空白であった）
ＭＩＰＳＡは、別のアプローチよりも重要な利点を有する新しい自己組織化タンパクディスプレイ技術である。これは、ＰｈＩＰ－ＳｅｑおよびＭＩＰＳＡライブラリーのような相補的技術が、プログラム可能なファージディスプレイライブラリーを用いて同じ反応において簡便にスクリーニングされ得るという特性を有する。本明細書に提示されるＭＩＰＳＡプロトコルは、キャップ非依存的無細胞翻訳を必要とするが、将来の適応は、この制限を克服し得る。ＭＩＰＳＡベースの研究のための適用は、タンパク－タンパク、タンパク－抗体、およびタンパク－小分子相互作用研究を含み、翻訳後修飾の偏りのない分析を含む。ここで、本発明者らは、ＭＩＰＳＡを使用して、多くの他の潜在的に病原性の自己反応性の中で、中和ＩＦＮ－λ３自己抗体（これは、危険性のある個体のサブセットにおいて、生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９肺炎に寄与し得る）を発見した。
参考文献
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17. P. Bastard et al., Autoantibodies against type I IFNs in patients with life-threatening COVID-19. Science 370, (2020).
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19. L. Casciola-Rosen et al., IgM autoantibodies recognizing ACE2 are associated with severe COVID-19. medRxiv, (2020).
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36. M. L. Stanifer et al., Critical Role of Type III Interferon in Controlling SARS-CoV-2 Infection in Human Intestinal Epithelial Cells. Cell Rep 32, 107863 (2020).
37. I. E. Galani et al., Untuned antiviral immunity in COVID-19 revealed by temporal type I/III interferon patterns and flu comparison. Nat Immunol 22, 32-40 (2021).
38. U. Felgenhauer et al., Inhibition of SARS-CoV-2 by type I and type III interferons. J Biol Chem 295, 13958-13964 (2020).
39. T. R. O’Brien et al., Weak Induction of Interferon Expression by Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Supports Clinical Trials of Interferon-lambda to Treat Early Coronavirus Disease 2019. Clin Infect Dis 71, 1410-1412 (2020).
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46. S. L. Klein et al., Sex, age, and hospitalization drive antibody responses in a COVID-19 convalescent plasma donor population. J Clin Invest 130, 6141-6150 (2020).
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49. M. R. Rose, E. I. W. Group, 188th ENMC International Workshop: Inclusion Body Myositis, 2-4 December 2011, Naarden, The Netherlands. Neuromuscul Disord 23, 1044-1055 (2013).
50. Z. Wei, W. Zhang, H. Fang, Y. Li, X. Wang, esATAC: an easy-to-use systematic pipeline for ATAC-seq data analysis. Bioinformatics 34, 2664-2665 (2018).
51. M. D. Robinson, D. J. McCarthy, G. K. Smyth, edgeR: a Bioconductor package for differential expression analysis of digital gene expression data. Bioinformatics 26, 139-140 (2010).
このページの残りの部分は意図的に空白にしている。（訳注：原文においてはこのページの残りは空白であった）
【0112】
実施例３：自己組織化によるタンパク質の分子インデックス化（ＭＩＰＳＡ）により、重症ＣＯＶＩＤ－１９における中和Ｉ型およびＩＩＩ型インターフェロン自己抗体を同定された。
【0113】
抗体結合特異性の不偏分析は、健常および疾患状態への重要な洞察を提供することができる。本発明者らおよび他の研究者らは、新規な自己抗体を同定し、抗ウイルス免疫を特徴付け、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体をプロファイリングするために、プログラム可能なファージディスプレイライブラリーを利用してきた１～４。ファージディスプレイは、これらおよび多くの他の用途に有用であるが、ほとんどのタンパク質－タンパク質、タンパク質－抗体およびタンパク質－小分子相互作用は、バクテリオファージディスプレイペプチドライブラリーによって捕捉されない程度の立体構造を必要とする。プロテオームスケールでの立体構造タンパク質相互作用のプロファイリングは、伝統的にタンパク質マイクロアレイ技術に依存してきた。しかしながら、タンパク質マイクロアレイは、高いアッセイ当たりのコスト、ならびにタンパク質のハイスループット発現および精製、固体支持体上へのタンパク質のスポッティング、アレイ化されたタンパク質の乾燥および再水和、ならびにスライド走査蛍光イメージングベースのリードアウトに関連するものを含む無数の技術的アーチファクトに悩まされる傾向がある５，６。タンパク質マイクロアレイ生産および保存に対する代替的なアプローチが開発されているが（例えば、核酸プログラム可能タンパク質アレイ、ＮＡＰＰＡ７、または単一分子ＰＣＲ関連インビトロ発現、ＳＩＭＰＬＥＸ８）、ロバストで、スケーラブルで、費用効果の高い代替法が欠けている。
【0114】
完全長タンパク質のアレイベースのプロファイリングに関連する制限を克服するために、本発明者らは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）ライブラリーのリボソームディスプレイを利用する、翻訳オープンリーディングフレームの並行分析（Ｐａｒａｌｌｅｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅｓ）（ＰＬＡＴＯ）と呼ばれる方法論を以前に確立した９。リボソームディスプレイは、終止コドンを欠くｍＲＮＡのインビトロ翻訳に依存し、それらがコードする新生タンパク質との複合体中のｍＲＮＡ分子の末端でリボソームを失速させる。ＰＬＡＴＯは、その採用を妨げてきたいくつかの重要な制限に悩まされている。理想的な代替法は、短い増幅可能なＤＮＡバーコードへのタンパク質の共有結合である。実際、個々に調製されたＤＮＡバーコード化抗体やタンパク質は、様々な用途で成功裏に使用されている１０。特に魅力的なタンパク質－ＤＮＡコンジュゲーション法のひとつに、ハロゲン末端アルカン部位と不可逆的な共有結合を形成する細菌酵素を利用したＨａｌｏタグシステムがある１１。個々のＤＮＡバーコード化Ｈａｌｏタグ融合タンパク質は、従来のＥＬＩＳＡと比較して、自己抗体検出の感度およびダイナミックレンジを大幅に増強することが示されている１２。個々のタンパク質バーコード化を全ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーにスケーリングすることは、非常に有用であるが、高コストおよび低スループットのために手に負えないものである。従って、自己組織化アプローチは、ライブラリー生成へのはるかに効率的な経路を提供し得る。
【0115】
ここで、新規な分子ディスプレイ技術であるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｂｙ Ｓｅｌｆ Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＭＩＰＳＡ）が記載され、これは、ＰＬＡＴＯおよび他の全長タンパク質アレイ技術の主要な欠点を克服する。ＭＩＰＳＡは可溶性完全長タンパク質のライブラリーを産生し、各々は増幅可能なバーコードへの共有結合を介して独自に同定可能である。バーコードは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）の上流に導入される。インビトロ転写されたＲＮＡ（ＩＶＴ－ＲＮＡ）の部分逆転写（ＲＴ）は、ハロアルカン標識ＲＴプライマーに連結されるｃＤＮＡバーコードを作製する。Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質は、インビトロ翻訳が、Ｈａｌｏタグおよびその下流のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）コードタンパク質産物へのｃＤＮＡバーコードの複合体内（「ｃｉｓ」）で共有結合をもたらすように、ＲＢＳの下流にコードされる。一意的にインデックス付けされた全長タンパク質の得られたライブラリーは、不偏自己抗体プロファイリングなどの安価なプロテオーム全体の相互作用研究に使用することができる。
【0116】
サーズコロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）感染によって引き起こされるコロナウイルス疾患２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、無症状の経過から生命を脅かす肺炎および死にまで及ぶ。自己免疫と重症ＣＯＶＩＤ－１９との間の因果関係は、複数の研究によって支持されている１３，１４。多種多様な自己抗体が実証されているが１５、中和Ｉ型インターフェロン自己抗体が特に重要な役目を果たしているようである１６，１７。ここでは、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の血漿中の新規自己抗体を探索することによって、ＭＩＰＳＡプラットフォームの有用性を調査する。
【0117】
方法
【0118】
ＭＩＰＳＡ宛先ベクター構築
【0119】
ＭＩＰＳＡベクターは、Ｇａｔｅｗａｙ ｐＤＥＳＴ１５ベクターを骨格として用いて構築した。ＲＢＳ、Ｋｏｚａｋ配列、Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質、およびＦＬＡＧタグ、続いてａｔｔＲ１配列をコードするｇＢｌｏｃｋ断片（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を親プラスミドにクローニングした。１５０ｂｐのポリ（Ａ）配列もａｔｔＲ２部位の後に付加した。２成分系を特徴付け、最適化するために使用したＴＲＩＭ２１およびＧＡＰＤＨ ＯＲＦ配列は、最終ＭＩＰＳＡ構築物中に保持された天然終止コドンを含んでいた。
【0120】
ＵＣＩバーコードライブラリ構築
【0121】
４１ｎｔのバーコードオリゴを、交互混合塩基（Ｓ：Ｇ／Ｃ；Ｗ：Ａ／Ｔ）を有するｇＢｌｏｃｋ Ｇｅｎｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内で生成して、以下の配列：（ＳＷ）１８－ＡＧＧＧＡ－（ＳＷ）１８を生成した。変性バーコードに隣接する配列には、標準的なＰｈＩＰ－Ｓｅｑ ＰＣＲ１およびＰＣＲ２プライマー結合部位が組み込まれた５１。１８ナノグラムの出発ＵＣＩライブラリーを使用して４０サイクルのＰＣＲを行い、ライブラリーを増幅し、ＢｇｌＩＩおよびＰｓｐｘＩ制限部位を組み込んだ。次いで、ＭＩＰＳＡベクターおよび増幅されたＵＣＩライブラリーを制限酵素で一晩消化し、カラム精製し、１：５のベクター対インサート比で連結した。連結されたＭＩＰＳＡベクターを使用して、エレクトロコンピテントＯｎｅ Ｓｈｏｔ ｃｃｄＢ ２ Ｔ１Ｒ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を形質転換した。６回の形質転換反応により、約８００，０００コロニーを得て、ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩライブラリーを作製した。
【0122】
ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーへのヒトＯＲＦｅｏｍｅ組換え
【0123】
ｈＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１からの１５０ｎｇの各ｐＥＮＴＲ－ｈＯＲＦｅｏｍｅサブプール（Ｌ１～Ｌ５）を、１５０ｎｇのｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩライブラリープラスミドおよび２μｌのＧａｔｅｗａｙ ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ ＩＩ ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と個別に合わせて、１０μｌの総反応容量とした。反応物を２５℃で一晩インキュベートした。全反応物を５０μｌのＯｎｅ Ｓｈｏｔ ＯｍｎｉＭＡＸ ２ Ｔ１Ｒケミカルコンピテント大腸菌（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に形質転換した。全体として、形質転換により約１２０，０００コロニーが得られ、これはｈＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１の複雑性の約１０倍である。コロニーを収集し、掻き取ることによってプールした後、Ｑｉａｇｅｎ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、バーコード化ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ－ｈＯＲＦｅｏｍｅプラスミドＭＩＰＳＡ（ヒトＯＲＦｅｏｍｅ ＤＮＡライブラリー）を精製した。ヒトｈＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１コレクションを、終止コドンなしでクローニングした；従って、提示されたタンパク質は、ポリＡテールの翻訳から生じるポリリジンＣ末端を含み得る。ＭＩＰＳＡデスティネーションベクターのより最近のバージョンは、組換えＯＲＦとインフレームで終止コドンを含む。
【0124】
ＲＴオリゴへのＨａｌｏリガンド結合およびＨＰＬＣ精製
【0125】
１００μｇの５’アミン修飾オリゴＨＬ－３２＿ａｄ（表１）を、Ｈａｌｏリガンドである７５μｌ（１７．８５μｇ／μｌ）のＨａｌｏタグ Ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ Ｅｓｔｅｒ（Ｏ２）（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）と共に、０．１Ｍホウ酸ナトリウム緩衝液中で、Ｇｕら１９に従って室温で６時間インキュベートした。３Ｍ ＮａＣｌおよび氷冷エタノールをそれぞれ１０％（ｖ／ｖ）および２５０％（ｖ／ｖ）で標識反応物に添加し、－８０℃で一晩インキュベートした。反応物を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離した。ペレットを氷冷７０％エタノールで１回すすぎ、１０分間風乾した。
【0126】
Ｈａｌｏリガンド結合ＲＴプライマーを、Ｂｒｏｗｎｌｅｅ Ａｑｕａｐｏｒｅ ＲＰ－３００ ７ｕ、１００×４．６ｍｍカラム（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、０－７０％ＣＨ３ＣＮ／ＭｅＣＮ（アセトニトリルに対して１００ｍＭ酢酸トリメチルアミン）の２緩衝液勾配を使用して７０分間にわたってＨＰＬＣ精製した。標識オリゴに対応する画分を回収し、凍結乾燥した（図１５Ａ～１５Ｃ）。オリゴを１μＭ（１５．４ｎｇ／μｌ）で再懸濁し、－８０℃で保存した。
【0127】
ＭＩＰＳＡライブラリーＩＶＴ－ＲＮＡ調製
【0128】
ヒトＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリープラスミド（４μｇ）をＩ－ＳｃｅＩ制限エンドヌクレアーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で一晩直鎖化した。生成物をＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ Ｇｅｌ ａｎｄ ＰＣＲ Ｃｌｅａｎ Ｕｐ ｋｉｔ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いてカラム精製した。ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して４０μｌのインビトロ転写反応を行い、１μｇの精製された直鎖化ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡプラスミドライブラリーを転写した。生成物を６０μｌの分子生物学グレードの水で希釈し、１μｌのＤＮＡｓｅＩを添加した。反応物を３７℃でさらに１５分間インキュベートした。次いで、５０μｌの１ Ｍ ＬｉＣｌを溶液に添加し、－８０℃で一晩インキュベートした。遠心分離機を４℃に冷却し、ＲＮＡを最大速度で３０分間回転させた。上清を除去し、ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄した。サンプルを４℃でさらに１０分間スピンダウンし、７０％エタノールを除去した。ペレットを室温で１５分間乾燥し、続いて１００μｌの水に再懸濁した。サンプルを保存するために、１μｌの４０Ｕ／μｌ ＲＮＡｓｅＯＵＴ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した。
【0129】
ＭＩＰＳＡライブラリーＩＶＴ－ＲＮＡ逆転写および翻訳
【0130】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ Ｆｉｒｓｔ－Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて逆転写反応物を調製した。最初に、１μｌの１０ｍＭ ｄＮＴＰ、１μｌのＲＮＡｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ）、４．１７μｌのＲＮＡライブラリー（１．５μＭ）、および７．８３μｌのＨａｌｏリガンドコンジュゲートＲＴプライマー（１μＭ、表１）を、単一の１４μｌ反応物中で合わせ、６５℃で５分間インキュベートし、続いて氷上で２分間インキュベートした。４マイクロリットルの５×ＲＴ緩衝液、１μｌの０．１Ｍ ＤＴＴ、および１μｌのＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶ ＲＴ酵素（２００Ｕ／μｌ）を、氷上の１４μｌの反応物に添加し、４２℃で２０分間インキュベートした。単一の２０μｌ ＲＴ反応物に３６μｌのＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を加え、室温で１０分間インキュベートした。ビーズを磁石で集め、７０％エタノールで５回洗浄した。ビーズを室温で１０分間風乾し、７μｌの５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．５に再懸濁した。生成物を分光光度法で分析して、ＲＮＡ収量を測定した。翻訳反応を、ＰＵＲＥｘｐｒｅｓｓΔＲｉｂｏｓｏｍｅ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）を使用して氷上でセットアップした５２。リボソームの最終濃度が０．３μＭになるように反応を改変した。各１０μｌの翻訳反応について、４．５７μｌのＲＴ反応を、４μｌの溶液Ａ、１．２μｌのＦａｃｔｏｒ Ｍｉｘ、および０．２３μｌのリボソーム（１３．３μＭ）に添加した。この反応物を３７℃で２時間インキュベートし、３５μｌの１×ＰＢＳで総容量４５μｌに希釈し、直ちに使用するか、または最終濃度２５％（ｖ／ｖ）までグリセロールを添加した後に－８０℃で保存した。
【0131】
翻訳されたＭＩＰＳＡ ｈＯＲＦｅｏｍｅライブラリーの免疫沈降。
【0132】
５μｌの血漿（ＰＢＳで１：１００に希釈）を、４５μｌの希釈ＭＩＰＳＡライブラリー翻訳反応物（上記参照）と混合し、穏やかに撹拌しながら４℃で一晩インキュベートする。各ＩＰについて、５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｄｙｎａｂｅａｄｓおよび５μｌのＰｒｏｔｅｉｎ Ｇ Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の混合物を、１×ＰＢＳを用いてそれらの元の体積の２倍で３回洗浄した。次いで、ビーズを元の容量で１×ＰＢＳに再懸濁し、各ＩＰに添加した。抗体捕捉を４℃で４時間進行させた。ビーズを磁石上に集め、１×ＰＢＳで３回洗浄し、洗浄の間にチューブまたはプレートを交換した。次いで、ビーズを回収し、Ｔ７－Ｐｅｐ２＿ＰＣＲ１＿ＦフォワードプライマーおよびＴ７－Ｐｅｐ２＿ＰＣＲ１＿Ｒ＋ａｄ＿ｍｉｎリバースプライマー（表１）ならびにＨｅｒｃｕｌａｓｅ－ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を含有する２０μｌのＰＣＲマスターミックスに再懸濁した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の最初の変性および酵素活性化工程、続いて９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の２０サイクル。最後の伸長工程を７２℃で３分間行った。２マイクロリットルのＰＣＲ１増幅産物を、それぞれ１０ｎｔバーコード（それぞれｉ５およびｉ７）を含有するＰｈＩＰ＿ＰＣＲ２＿ＦフォワードプライマーおよびＰｈＩＰ＿ＰＣＲ２＿Ｒリバースプライマーを用いた２０μｌのデュアルインデックスＰＣＲ反応へのインプットとして使用した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性ステップ、続いて９５℃で２０秒間、５８℃で３０秒間、および７２℃で３０秒間の２０サイクル。最終伸長工程を、７２℃で３分間行った。ｉ５／ｉ７インデックス化ライブラリーをプールし、カラム精製した（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎカラム、Ｔａｋａｒａ）。ライブラリーを、１×５０ｎｔ ＳＥまたは１×７５ｎｔ ＳＥプロトコルを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００上でシーケンシングした。ＭＩＰＳＡ＿ｉ５＿ＮｅｘｔＳｅｑ＿ＳＰおよびスタンダード＿ｉ７＿ＳＰプライマーをｉ５／ｉ７シーケンシングに使用した（表１）。出力は、不整合を許容することなくｉ５およびｉ７を使用して多重分離された。
【0133】
ｑＰＣＲによるＭＩＰＳＡ実験の定量化のために、ＰＣＲ１産物（上記）を以下のように分析した。ＰＣＲ１反応の１：１，０００希釈物４．６μｌを、５μｌのＢｒｉｌｌｉａｎｔ ＩＩＩ Ｕｌｔｒａ Ｆａｓｔ ２Ｘ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｍｉｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、０．２μｌの２μＭ参照色素および０．２μｌの１０μＭフォワードおよびリバースプライマーミックス（標的ＵＣＩに特異的）に添加した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性ステップ、続いて９５℃で２０秒間、６０℃で３０秒間を４５サイクル。サーモサイクリングの完了後、増幅産物を融解曲線分析に供した。ＭＩＰＳＡ免疫沈降実験のためのｑＰＣＲプライマーは、ＴＲＩＭ２１についてはＢＧ ２＿ＦおよびＢＧ ２＿Ｒ、ＧＡＰＤＨについてはＢＧ４＿ＦおよびＢＧ４＿Ｒ、ならびにＮＴ５Ｃ１ＡについてはＮＴ５Ｃ１Ａ＿ＦおよびＮＴ５Ｃ１Ａ＿Ｒであった（表１）。
【0134】
オリゴヌクレオチド
【0135】
表５にプローブ、プライマーおよびｇＲＮＡのリストを提供する。
【0136】
血漿サンプル
【0137】
全てのサンプルを、以下に記載されるように、プロトコル適格性基準を満たした対象から収集した。すべての試験は、試験参加者の権利およびプライバシーを保護し、元のサンプル収集およびその後の分析について、それぞれの施設内倫理委員会によって承認された。
【0138】
パンデミック前および健常対照血漿サンプル。全てのヒトサンプルは、２０１７年より前に、ＮＩＡＩＤ ＩＲＢ承認の手順に従って、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ、ＮＩＨ）、ワクチン研究センター（Ｖａｃｃｉｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ、ＶＲＣ）／国立アレルギー感染症研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ａｌｌｅｒｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、ＮＩＡＩＤ）／ＮＩＨのプロトコル「VRC 000: Screening Subjects for HIV Vaccine Research Studies」（NCT00031304）の下で、収集した。
【0139】
非入院患者からのＣＯＶＩＤ－１９回復期血漿（ＣＣＰ）。適格なＣＣＰドナーは、前述のように研究担当者から連絡を受けた５３。全てのドナーは少なくとも１８歳であり、鼻咽頭スワブサンプル中のＲＮＡの検出によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の確定診断を有していた。基本的な人口統計学的情報（年齢、性別、ＣＯＶＩＤ－１９による入院）を各ドナーから得た；ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の最初の診断および診断の日付を、カルテ審査によって確認した。
【0140】
重症ＣＯＶＩＤ－１９血漿サンプル。研究コホートは 、以下の条件を満たす入院患者を対照とした：１）ＣＯＶＩＤ－１９の確定診断；２）死亡または退院までの生存；および３）Johns Hopkins COVID-19 Remnant Specimen Biorepository（ジョンズ・ホプキンズ病院ＣＯＶＩＤ－１９患者の５９％および在院日数≧３日を有する患者の６６％を含む機会サンプル）中に残存検体を有する５４，５５。患者の結果は、世界保健機関（ＷＨＯ）ＣＯＶＩＤ－１９疾患重篤度スケールによって定義された。この研究に含まれた重症ＣＯＶＩＤ－１９ジョンズ・ホプキンズからのサンプルは、死亡した１７人の患者、人工呼吸後に回復した１３人の患者、回復のために酸素投与を必要とした２２人の患者、および補助酸素投与なしで回復した３人の患者から得られた。この研究は、ＪＨＵ施設内倫理委員会（ＩＲＢ００２４８３３２、ＩＲＢ００２７３５１６）によって承認され、すべての標本および臨床データが、Johns Hopkins Institute for Clinical and Translational ResearchのCore for Clinical Research Data Acquisitionによって非特定化されたので、同意の権利放棄が認められ；研究チームは、同定可能な患者データへのアクセスを有さなかった。
【0141】
シェーグレン症候群および封入体筋炎（ＩＢＭ）血漿サンプル。シェーグレン症候群サンプルをプロトコルＮＡ＿０００１３２０１の下で収集した。全ての患者は＞１８歳であり、インフォームドコンセントを得た。ＩＢＭ患者サンプルをプロトコルＩＲＢ００２３５２５６の下で収集した。全ての患者がＥＮＭＣ ２０１１診断基準５６を満たし、インフォームドコンセントを提供した。
【0142】
免疫ブロット分析
【0143】
５％β－ＭＥを含有するＬａｅｍｍｌｉ緩衝液をサンプルに添加し、５分間煮沸し、ＮｕＰＡＧＥ ４～１２％Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓポリアクリルアミドゲル（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）上で分析した。ＰＶＤＦ膜に移した後、ブロットを、０．１％Ｔｗｅｅｎ ２０（ＴＢＳＴ）および５％（ｗｔ／ｖｏｌ）脱脂粉乳を含有する２０ｍＭトリス緩衝生理食塩水（ｐＨ ７．６）中、室温で３０分間ブロッキングした。続いて、ブロットを、１：４，０００（ｖ／ｖ）の一次抗ＦＬＡＧ抗体（＃Ｆ３１６５、ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ）と共に４℃で一晩インキュベートし、続いて、１：２，０００（ｖ／ｖ）の抗マウスＩｇＧ、ＨＲＰ結合二次抗体（＃７０７６、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）中、室温で４時間インキュベートした。
【0144】
ＵＣＩ－ＯＲＦ辞書の構築。
【0145】
１５０ｎｇのｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ｈＯＲＦｅｏｍｅプラスミドライブラリーのタグメント化のためにＮｅｘｔｅｒａ ＸＴＤＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、約１．５ｋｂを中心とする最適なサイズ分布を得た。タグメント化ライブラリーを、Ｔ７－Ｐｅｐ２＿ＰＣＲ１＿ＦフォワードおよびＮｅｘｔｅｒａ Ｉｎｄｅｘ １ Ｒｅａｄプライマーと共にＨｅｒｃｕｌａｓｅ－ＩＩ（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用して増幅した。ＰＣＲサイクルは以下の通りであった：９５℃で２分間の初期変性ステップ、続いて９５℃で２０秒間、５３．５℃で３０秒間、７２℃で３０秒間の３０サイクル。最終伸長工程を、７２℃で３分間行った。ＰＣＲ反応を１％アガロースゲル上で行い、続いて約１．５ｋｂの産物を切り出し、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ＧｅｌおよびＰＣＲ Ｃｌｅａｎ－ｕｐカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を用いて精製した。次いで、精製した産物を、ＰｈＩＰ＿ＰＣＲ２＿ＦフォワードプライマーおよびＰ７．２リバースプライマー（プライマー配列のリストについては表１を参照のこと）を用いてさらに１０サイクル増幅した。産物をゲル精製し、リード１についてはＴ７－Ｐｅｐ２．２＿ＳＰ＿ｓｕｂＡプライマーを、リード２についてはＭＩＳＥＱ＿ＭＩＰＳＡ＿Ｒ２プライマーを使用してＭｉＳｅｑ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）でシーケンシングした。リード１は、ＵＣＩを捕捉するために６０ｂｐ長であった。第１のインデックスリードＩ１は、ＯＲＦへの５０ｂｐリードで置換した。Ｉ２は、サンプル逆多重化のためのｉ５インデックスを同定するために使用した。
【0146】
ｈＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１配列を最初の５０ｎｔに切断し、非ユニーク配列に対応するＯＲＦ名を「｜」デリミタで連結した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑから読み取られた５０ｎｔのＲ２（ＯＲＦ）の逆多重化された出力を、以下のパラメーターを有するＲｂｏｗｔｉｅ２パッケージを使用して、短縮型ヒトＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１ライブラリーにアライメントさせた：options = "-a --very-sensitive-local"（５７）。次いで、固有のＦＡＳＴＱ識別子を使用して、６０ｂｐのＲ１（ＵＣＩ）リードから対応する配列を抽出した。これらの配列を、３’アンカーＡＣＧＡＴＡを使用して短縮し、そしてアンカーを有さない配列を除去した。さらに、１８個未満のヌクレオチドを有する任意の短縮型Ｒ１配列を除去した。フィルタリング後に対応するＵＣＩを依然として有するＯＲＦ配列を、ＦＡＳＴＱ識別子を使用して保持した。同じＵＣＩを有するＯＲＦの名前を「＆」デリミタで連結し、この最終辞書を使用して、ＯＲＦ名およびＵＣＩ配列から構成されるＦＡＳＴＡアラインメントファイルを生成した。
【0147】
ＭＩＰＳＡシーケンシングデータのインフォーマティック分析
【0148】
Ｉｌｌｕｍｉｎａ出力ＦＡＳＴＱファイルを、全てのＵＣＩ配列の後に定常ＡＣＧＡＴアンカー配列を使用して切り詰めた。次に、完全マッチアラインメントを使用して、ＵＣＩ－ＯＲＦルックアップディクショナリを介して短縮配列をそれらの連結されたＯＲＦにマッピングした。行が個々のＵＣＩに対応し、列がサンプルに対応するリードカウント行列を構築した。ｅｄｇｅＲソフトウェアパッケージ５８を使用し、これは、負の二項モデルを使用して、各サンプルにおいて検出されたシグナルを、血漿なしで行われた陰性対照（「モック」）ＩＰのセットと比較して、最大尤度倍数変化推定値およびすべてのサンプルにおける各ＵＣＩについての検定統計量を返し、したがって、倍数変化および－ｌｏｇ１０（ｐ値）行列を作成した。反復ＩＰからのＥｄｇｅＲ出力データの比較によって、有意に濃縮されたＵＣＩ（「ヒット」）は、少なくとも１５のリードカウント、０．００１未満のｐ値、および少なくとも３の倍数変化を必要とするはずであることが確立された。ヒット倍数変化行列は、「ヒット」について倍数変化値を報告し、ヒットではないＵＣＩについて「１」を報告する。
【0149】
タンパク質配列類似性
【0150】
ｈＯＲＦｅｏｍｅ ｖ８．１ライブラリー中のタンパク質間の配列相同性を評価するために、ｂｌａｓｔｐアラインメントを用いて、各タンパク質配列を他のすべてのライブラリーメンバーと比較した（パラメーター：「-outfmt 6 -evalue 100 -max_hsps 1 -soft_masking false -word_size 7 -max_target_seqs 100000」）。ヒト９０－ａａファージディスプレイライブラリーにおける反応性ペプチド間の配列相同性を評価するために、ｅｐｉｔｏｐｅｆｉｎｄｒ５９ソフトウェアを使用した。
【0151】
ファージ免疫沈降シーケシング（ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ）分析Ｐ
【0152】
ｈＩＰ－Ｓｅｑは、以前に発表されたプロトコールに従って行われた51。簡潔には、０．２μｌの各血漿を個々に９０－ａａヒトファージライブラリーと混合し、プロテインＡおよびプロテインＧ被覆磁気ビーズを使用して免疫沈降させた。６～８個のモック免疫沈降（血漿投入なし）のセットを各９６ウェルプレート上で実行した。磁気ビーズをＰＣＲマスターミックスに再懸濁し、サーモサイクリングに供した。第２のＰＣＲ反応を、サンプルバーのために使用した。アンプリコンをプールし、１×５０ｎｔ ＳＥまたは１×７５ｎｔ ＳＥプロトコルを使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００機器でシーケンシングした。ヒトライブラリーを用いたＰｈＩＰ－Ｓｅｑを使用して、健常な対照からの血漿の収集物中の自己抗体を特徴付けた。重症ＣＯＶＩＤ－１９コホートとの公平な比較のために、陽性個体の両方においてＩＦＮ－λ３反応性を検出するために必要とされたであろう最小シーケンシング深度を最初に決定した。その場合にのみ、健常なコホートからの４２３個のデータセットを、この最小閾値よりも大きいシーケンシング深度で検討した。これらの４２３個体のいずれも、ＩＦＮ－λ３由来の任意のペプチドに対して反応性であることが見出されなかった。
【0153】
Ｉ／ＩＩＩ型インターフェロン中和アッセイ
【0154】
ＩＦＮ－α２（カタログ番号１１１００－１）、ＩＦＮ－λ１（カタログ番号１５９８－ＩＬ－０２５）およびＩＦＮ－λ３（カタログ番号５２５９－ＩＬ－０２５）は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓから購入した。２０マイクロリットルの血漿を、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ－α２または１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３のいずれか、および１８０μｌのＤＭＥＭと共に、２００μｌの総体積で室温で１時間インキュベートした後、４８ウェル組織培養プレート中の７．５×１０４ Ａ５４９細胞に添加した。４時間のインキュベーション後、細胞を１×ＰＢＳで洗浄し、細胞ｍＲＮＡを抽出し、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。６００ｎｇの抽出ｍＲＮＡをSuperScript III First-Strand Synthesis System（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、ｑＰＣＲ実行のためにQuantStudio 6 Flex System（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で１０倍に希釈した。ＰＣＲは２段階サイクリングプロトコールを実行し、９５℃で３分間のサイクル、続いて９５℃で１５秒間および６０℃で３０秒間の４５サイクルからなる。ＭＸ１発現をインターフェロンによる細胞刺激の尺度として選択し、相対的ｍＲＮＡ発現をＧＡＰＤＨ発現に対して正規化した。ＧＡＰＤＨおよびＭＸ１のｑＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した（表１）。抗ｈＩＦＮ－α２－ＩｇＧ（カタログ番号ｍａｂｇ－ｈｉｆｎａ－３）および抗ｈＩＬ－２８ｂ－ＩｇＧ（カタログ番号ｍａｂｇ－ｈｉｌ２８ｂ－３）はＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入した。ｍａｂｇ－ｈｉｆｎａ－３についての製造業者の注記：「この抗体は、ｈＩＦＮ－α１、ｈＩＦＮ－α２、ｈＩＦＮ－α５、ｈＩＦＮ－α８、ｈＩＦＮ－α１４、ｈＩＦＮ－α１６、ｈＩＦＮ－α１７およびｈＩＦＮ－α２１と反応する；ｈＩＦＮ－α４およびＩＦＮ－α１０とは非常に弱く反応する；ｈＩＦＮ－α６またはｈＩＦＮ－α７とは反応しない」。ｍａｂｇ－ｈｉｌ２８ｂ－３についての製造業者の注記：「ヒトＩＬ－２８ＡおよびヒトＩＬ－２８Ｂと反応します。」。
【0155】
結果
【0156】
ＭＩＰＳＡシステムの開発
【0157】
Ｅ．ｃｏｌｉ無細胞翻訳のためのＭＩＰＳＡゲートウェイデスティネーションベクターは、以下の重要な要素を含有する：Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ転写開始部位、等温ユニーククローン識別子（「ＵＣＩ」）バーコード配列、Ｅ．ｃｏｌｉリボソーム結合性部位（ＲＢＳ）、Ｎ末端Ｈａｌｏタグ融合タンパク質（８９１ｎｔ）、ＯＲＦ挿入のための組換え配列、およびプラスミド直鎖化のためのホーミングエンドヌクレアーゼ（Ｉ－ＳｃｅＩ）部位。組換えＯＲＦ含有ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡプラスミドを図１Ａに示す。
【0158】
転写開始部位とリボソーム結合性部位との間に位置する確率的等温ＵＣＩを含むｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡプラスミドのライブラリーを確立することが最初に求められた。融解温度（Ｔｍ）バランスのとれた配列：（ＳＷ）１８－ＡＧＧＧＡ－（ＳＷ）１８（式中、ＳはＣおよびＧの等量混合物を表し、ＷはＡおよびＴの等量混合物を表す）を含む縮重オリゴヌクレオチドプールを合成した（図１Ｂ）。配列のこの安価なプールは、（ｉ）固有のＯＲＦ標識のために十分な複雑性（２３６～７×１０１０）を提供し、（ｉｉ）歪みなく増幅し、（ｉｉｉ）対象の個々のＵＣＩの測定のためのＯＲＦ特異的フォワードおよびリバースｑＰＣＲプライマー結合部位として役立つと推論された。縮重オリゴヌクレオチドプールをＰＣＲによって増幅し、ＭＩＰＳＡデスティネーションベクターに制限クローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉに形質転換した（方法）。約８００，０００個の形質転換体を選択プレートから掻き取って、ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーを得た。ハウスキーピング遺伝子グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）および既知の自己抗原、トリパータイトモチーフ含有－２１（ＴＲＩＭ２１、一般にＲｏ５２として知られる）をコードするＯＲＦを、ｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーに別々に組み換えた。個々にバーコード化されたＧＡＰＤＨおよびＴＲＩＭ２１クローンを単離し、シーケンシングし、以下の実験に使用した。
【0159】
ＭＩＰＳＡの手順は、スクシンイミジルエステル（Ｏ２）－ハロアルカン（Ｈａｌｏリガンド）結合ＲＴプライマーを使用するＵＣＩのＲＴを含む（図６Ａ～６Ｃ）。結合されたＲＴプライマーは、Ｅ．ｃｏｌｉリボソームのアセンブリおよび翻訳の開始を妨害すべきではないが、Ｈａｌｏリガンド－Ｈａｌｏタグ－タンパク錯体のカップリングが翻訳のさらなるラウンドを妨害し得るように十分に近位であるべきである。リボソーム結合部位の３’末端に対して－４２ヌクレオチド～－７ヌクレオチドの範囲の距離でアニールする一連のＲＴプライマーを評価した（図１Ｄ）。これらの異なる位置においてプライマーで飽和されたｍＲＮＡからのタンパク質産物の収量に基づいて、翻訳効率を妨害しなかった－３２位を選択した（図１Ｅ）。対照的に、ＲＢＳの２０ヌクレオチド内に位置するプライマーからのＲＴは、最小１５ヌクレオチドのｍＲＮＡを保護することが示されているアセンブルされた７０Ｓ Ｅ．ｃｏｌｉリボソームの推定フットプリントと一致して、タンパク質翻訳を減少または消失させた１８。
【0160】
５’末端をＨａｌｏリガンドで標識したプライマーからＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ ＩＶがＲＴを行うことができるかどうか、およびＨａｌｏタグ－ＴＲＩＭ２１タンパク質が翻訳反応の間にＨａｌｏリガンド結合プライマーと共有結合を形成することができるかどうかを評価した。Ｈａｌｏリガンドコンジュゲーションおよび精製は、Ｇｕらに従った（Methods、図Ａ～１５Ｃ）１９。非コンジュゲートＲＴプライマーまたはＨａｌｏリガンドコンジュゲートＲＴプライマーのいずれかを、バーコード化Ｈａｌｏタグ－ＴＲＩＭ２１ ｍＲＮＡのＲＴのために使用した。次いで、翻訳産物を、プロテインＡおよびプロテインＧでコーティングされた磁気ビーズを使用して、健常なドナー由来の血漿またはシェーグレン症候群（ＳＳ）を有するＴＲＩＭ２１（Ｒｏ５２）自己抗体陽性患者由来の血漿で免疫捕捉（すなわち、免疫沈降、「ＩＰ化」）した。ＳＳ血漿は、ＲＴプライマー結合にかかわらず、ＴＲＩＭ２１タンパクを効率的にＩＰ化したが、Ｈａｌｏリガンド結合プライマーをＲＴ反応に使用した場合、ＴＲＩＭ２１ ＵＣＩのみをプルダウンした（図１０Ｆ～１０Ｇ）。
【0161】
ｃｉｓ対ｔｒａｎｓＵＣＩバーコード化のレベルの評価
【0162】
先の実験は、実際にＨａｌｏリガンドがＲＴプライミングを妨げないこと、およびＨａｌｏタグが翻訳反応の間にＨａｌｏリガンドと共有結合を形成することができることを示したが、ｃｉｓ（錯体内、望ましい）対ｔｒａｎｓ（錯体間、望ましくない）Ｈａｌｏタグ－ＵＣＩコンジュゲーションの量を解明しなかった（図１６Ａ～１６Ｃ）。ここで、「複合体内」は、タンパク質をコードする同じＲＮＡ分子と会合するＵＣＩへのコンジュゲーションとして定義される。ｃｉｓおよびｔｒａｎｓのＨａｌｏタグ－ＵＣＩコンジュゲーションの量を測定するために、ＧＡＰＤＨおよびＴＲＩＭ２１ ｍＲＮＡを別々に逆転写し（Ｈａｌｏリガンドコンジュゲートプライマーを使用して）、次いで、インビトロ翻訳のために１：１で混合するかまたは別々に維持した。予想通り、混合物の翻訳は、個々の翻訳と比較してほぼ等量の各タンパク質を産生した（図８）。翻訳条件にかかわらず、ＳＳ血漿はＴＲＩＭ２１タンパク質を特異的にＩＰ化した（図８、ＩＰｅｄ画分）。しかしながら、ＳＳ ＩＰは高レベルのＴＲＩＭ２１ ＵＣＩを含んでいる一方で、ｍＲＮＡが翻訳前に混合された場合、ＨＣ血漿によるものと比較して、より多くのＧＡＰＤＨ ＵＣＩがＳＳ血漿によってプルダウンされたことが注目された。これは、実際にいくらかの量のｔｒａｎｓバーコード化が生じることを示す（図１１Ａ）。本発明者らは、タンパク質の約５０％がｃｉｓ－バーコード化され、残りの５０％がｔｒａｎｓ－バーコード化されたタンパク質が両方のＵＣＩに等しくコンジュゲートしていると推定する。したがって、この二成分系では、ＴＲＩＭ２１タンパク質の２５％がＧＡＰＤＨ ＵＣＩにコンジュゲートしている（図１６Ａ～１６Ｃ）。
【0163】
複雑なライブラリーの設定において、各タンパク質の約５０％がｔｒａｎｓバーコード化される場合であっても、この副産物は、低レベルの無作為にサンプリングされたＵＣＩと関連するはずである。本発明者らは、１００倍過剰の第２のＧＡＰＤＨクローンから構成されるモックＭＩＰＳＡライブラリーを使用してこれを試験し、これを第１のＧＡＰＤＨおよびＴＲＩＭ２１クローンの１：１混合物と組み合わせた（図２Ｂ）。
【0164】
確率的にバーコード化されたヒトＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリーの確立およびデコンボリューション
【0165】
配列が検証されたヒトＯＲＦｅｏｍｅ（ｈＯＲＦｅｏｍｅ）ｖ８．１は、Ｇａｔｅｗａｙ Ｅｎｔｒｙプラスミド（ｐＤＯＮＲ２２３）中の１１，４３７個の遺伝子にマッピングされる１２，６８０個のクローンＯＲＦから構成される２０。ライブラリーの５つのサブプールを作製し、それぞれ、約２，５００個の同様のサイズのＯＲＦから構成された。５つのサブプールの各々を別々にｐＤＥＳＴ－ＭＩＰＳＡ ＵＣＩプラスミドライブラリーに組み換え、形質転換して、約１０倍のＯＲＦカバレッジ（サブプール当たり約２５，０００クローン）を得た。各サブプールを、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ電気泳動、約２０個のコロニーのシーケンシング、および合わせたスーパープールのＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングによって評価した。ＴＲＩＭ２１プラスミドをスーパープールしたｈＯＲＦｅｏｍｅライブラリーに、典型的なライブラリーメンバーである１：１０，０００でスパイクした。次いで、リードアウトとしてシーケンシングを使用して、ｈＯＲＦｅｏｍｅ ＭＩＰＳＡライブラリーに対してＳＳ ＩＰ実験を行った。スパイクインされたＴＲＩＭ２１を含むライブラリ内の全てのＵＣＩからのリードカウントは、図１１Ｃにおいて、８つのモックＩＰの平均に対するＳＳ ＩＰについて示されている。確かに、ＴＲＩＭ２１のＳＳ自己抗体依存的濃縮（１７倍）は、モデル系と同様であった（図１１Ｄ）。シーケンシングデータのための分析パイプラインの説明については、方法セクションにおけるＭＩＰＳＡシーケンシングデータのインフォーマティック分析を参照されたい。
【0166】
次に、タグメンテーションおよびシーケンシングを使用して、ＵＣＩ－ＯＲＦルックアップ辞書を作成するためのシステムを確立した（図３Ａ）。５’５０ｎｔのＯＲＦインサートのシーケンシングにより、１１，８８７個のユニークな５’５０ｎｔライブラリー配列のうち１１，０７６個が検出された。検出された１５３，１６１のＵＣＩのうち、８２．９％（１２６，９７５）が、単一のＯＲＦ（「単一特異性ＵＣＩ」と呼ばれる）に関連することが見出された。各ＯＲＦは、中央値９（０～１２３の範囲）の単一特異性ＵＣＩと一意的に関連していた（図３Ｂ）。重要なことに、一貫した挙動を有する単一特異性ＵＣＩのアンサンブルは、それらの関連するＯＲＦの反応性についてのさらなる強力な支持を提供することができる。ＵＣＩ数とＯＲＦサイズとの間の弱い逆相関が認められ、これは、プールされた組換え反応におけるより大きなＯＲＦ含有プラスミドのより低い効率の組換えを反映している可能性が最も高い。各ＯＲＦに対応するリードカウントの集計後、表示されたＯＲＦの９９％超が、ＯＲＦ存在量中央値の１０倍の差内に存在していた（図３Ｃ）。まとめると、これらのデータは、１１，０７６個の確率的にインデックス付けされたヒトＯＲＦの均一なライブラリーが確立され、下流の分析のためのルックアップ辞書を定義したことを示す。図３Ｄは、８個のモックｈＯＲＦｅｏｍｅの平均に対するＳＳ ＩＰのＵＣＩリードカウント、および予想通りｙ＝ｘ対角線に沿って現れる４７個のディクショナリデコードされたＧＡＰＤＨ単一特異性ＵＣＩ（ＩＰＳライブラリに存在する２つのＧＡＰＤＨアイソフォームに対応する）を示す。曖昧さを避けるために、１つより多いＯＲＦに関連する任意のＵＣＩをさらなる分析から除外した。
【0167】
重症ＣＯＶＩＤ－１９に関連する自己抗体の不偏ＭＩＰＳＡ分析
いくつかの最近の報告は、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者における自己抗体反応性の上昇が報告されている２１－２５。臨床メタデータの利用可能性が不完全であったため、ここでは入院のみに基づいて定義した５５名の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の血漿中の自己反応性を不偏同定するために、ヒトＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを用いてＭＩＰＳＡを用いた。比較のために、ＭＩＰＳＡを使用して、１０人の健常なドナーおよび入院していない１０人のＣＯＶＩＤ－１９の回復期血漿ドナーからの血漿中の自己反応性を検出した（表２）。ファージ免疫沈降シーケンシング（ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ）分析について以前に行ったように、各サンプルを、血漿を除く全ての反応成分を含有する８つの「モックＩＰ」のセットと比較し、同じプレート上で実行した。モックＩＰとの比較は、ライブラリーおよびバックグラウンド結合における偏りを説明する。抗体依存性反応性を検出するために使用されるインフォーマティックパイプライン（Methods）は、モックＩＰ当たり中央値５（２～９の範囲）の偽陽性ＵＣＩヒットをもたらした。しかし、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血漿を使用したＩＰは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の間で平均８３個の反応性タンパク質を生じ、これは、健常なパンデミック前の対照の間での平均６４個の反応性タンパク質よりも有意に多く、軽度から中等度のＣＯＶＩＤ－１９後に回復した個体の間での平均６２個の反応性タンパク質よりも有意に多かった（それぞれｐ＝０．０２およびｐ＝０．０５、片側ｔ検定；図４Ａ）。
いくつかの最近の報告は、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者における自己抗体反応性の上昇が報告されている２１－２５。臨床メタデータの利用可能性が不完全であったため、ここでは入院のみに基づいて定義した５５名の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の血漿中の自己反応性を不偏同定するために、ヒトＯＲＦｅｏｍｅライブラリーを用いてＭＩＰＳＡを用いた。比較のために、ＭＩＰＳＡを使用して、１０人の健常なドナーおよび入院していない１０人のＣＯＶＩＤ－１９の回復期血漿ドナーからの血漿中の自己反応性を検出した（表２）。ファージ免疫沈降シーケンシング（ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ）分析について以前に行ったように、各サンプルを、血漿を除く全ての反応成分を含有する８つの「モックＩＰ」のセットと比較し、同じプレート上で実行した。モックＩＰとの比較は、ライブラリーおよびバックグラウンド結合における偏りを説明する。抗体依存性反応性を検出するために使用されるインフォーマティックパイプライン（Methods）は、モックＩＰ当たり中央値５（２～９の範囲）の偽陽性ＵＣＩヒットをもたらした。しかし、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者からの血漿を使用したＩＰは、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の間で平均８３個の反応性タンパク質を生じ、これは、健常なパンデミック前の対照の間での平均６４個の反応性タンパク質よりも有意に多く、軽度から中等度のＣＯＶＩＤ－１９後に回復した個体の間での平均６２個の反応性タンパク質よりも有意に多かった（それぞれｐ＝０．０２およびｐ＝０．０５、片側ｔ検定；図４Ａ）。
【0168】
少なくとも２つの反応性ＵＣＩ（同じＩＰ内）を有し、少なくとも１人の重症患者において反応性であり、２人以上の対照（健常または軽度／中等度の回復期血漿中）において反応性でなかった重症ＣＯＶＩＤ－１９ ＩＰにおいてタンパク質を調べた。タンパク質は、１人の重症の患者および１人の対照において反応性であった場合には除外した。これらの基準を満たした１０３個のタンパク質を図４Ｂのクラスターマップに示す。５５人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうちの５１人が、これらのタンパク質の少なくとも１つに対して反応性を示した。複数の個体において同時に生じるタンパク質反応性が注目され、その大多数は、タンパク質配列アラインメントによる相同性を欠く。表４は、それらがヒト自己抗原データベースＡＡｇＡｔｌａｓ １．０．２６に従って以前に定義された自己抗原であるかどうかを含む、これらの反応性タンパク質に関する要約統計量を提供する。タンパク質は、少なくとも１人の重症患者において少なくとも２つの反応性ＵＣＩを有し、１より多い対照（健常または軽度／中等度の回復期血漿）において反応性でなかった場合に含まれた。タンパク質は、１人の重症の患者および１人の対照において反応性であった場合には含めなかった。各行は、アルファベット順にタンパク質によって編成された単一のＵＣＩに対応する（遺伝子記号は下線の左に提供される）。各カラムは個々のＣＯＶＩＤ－１９患者である。ＵＣＩリードカウントがモックＩＰに対して有意に濃縮されなかった場合、それは「１」として報告される。ＵＣＩリードカウントがモックＩＰに対して有意に濃縮された場合、倍数変化推定値（ＥｄｇｅＲから）が提供される。
【0169】
１つの注目すべき自己反応性クラスター（表４、クラスター＃５）は、５’－ヌクレオチダーゼ、細胞質基質１Ａ（ＮＴ５Ｃ１Ａ）を含み、これは、骨格筋において高度に発現され、封入体筋炎（ＩＢＭ）において最もよく特徴付けられた自己抗体標的である。ＮＴ５Ｃ１Ａに連鎖する複数のＵＣＩは、５５人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうちの３人（５．５％）において有意に増加した。ＮＴ５Ｃ１Ａ自己抗体は、ＩＢＭ患者１の最大７０％、シェーグレン症候群（ＳＳ）患者の約２０％、および健常ドナーの最大約５％において報告されている２７。したがって、重症ＣＯＶＩＤ－１９コホートにおけるＮＴ５Ｃ１Ａ反応性の罹患率は必ずしも上昇しない。しかし、本発明者らは、ＭＩＰＳＡが、ＮＴ５Ｃ１Ａ反応性に基づいて、健常なドナーとＩＢＭ血漿とを確実に区別することができるかどうか疑問に思った。１０人の健常ドナーおよび１０人のＩＢＭ患者からの血漿を使用し、後者は、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ１によって決定されたＮＴ５Ｃ１Ａ血清陽性に基づいて選択した。この独立コホートにおける対照からの患者の明確な分離は、ＭＩＰＳＡ特異的ｑＰＣＲまたはライブラリシーケンシングのいずれかを使用する臨床診断試験において、ＵＣＩが実際に有用性を有し得ることを示唆しており、これらは密接に相関するリードアウトであった（図４Ｃ）。
【0170】
重症ＣＯＶＩＤ－１９患者におけるＩ型およびＩＩＩ型インターフェロン中和自己抗体
【0171】
Ｉ型インターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）およびオメガ（ＩＦＮ－ω）を標的とする中和自己抗体は、重症ＣＯＶＩＤ－１９と関連付けられている１５，２２，２８。ＩＦＮ－α１６を除く全てのＩ型インターフェロンは、ヒトＭＩＰＳＡ ＯＲＦｅｏｍｅライブラリに表されており、ルックアップ辞書に注釈が付けられている。ＩＦＮ－α４、ＩＦＮ－α１７、およびＩＦＮ－α２１は、それらをコードするＯＲＦ配列の最初の５０ヌクレオチドによって区別できないので、単一のＯＲＦとして分析される。このコホートにおける重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうちの２人（Ｐ１およびＰ２）（３．６％）は、劇的なＩ型ＩＦＮ自己反応性を示した（４９および４６のＩ型インターフェロンＵＣＩ、多くのＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－ωに対応する１１の別個のＯＲＦにわたって。図５Ａおよび図５Ｂ）。これらのタンパク質の広範な共反応性は、それらの配列相同性に起因する可能性が高い（図９）。陽性と見なすために少なくとも２つの反応性ＩＦＮ ＵＣＩを必要とすることにより、検出可能なレベルのＩＦＮ－α反応性を有するさらに２つの重篤なＣＯＶＩＤ－１９血漿（Ｐ３およびＰ４）が同定され、それぞれ２つの反応性ＩＦＮ－α ＵＣＩのみであった。これら４つのＩＦＮ－α自己反応性患者のうち５０％が死亡したが、残りのコホートでは約３０％であった。興味深いことに、１つのさらなる血漿（Ｐ５）は、任意のＩ型またはＩＩ型インターフェロン由来のＵＣＩを沈降させなかったが、ＩＩＩ型インターフェロンＩＦＮ－λ３由来の５つのＵＣＩを沈降させた（図５Ｃ、５Ｄ）。この患者もＣＯＶＩＤ－１９で死亡した。重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の間でさらなるインターフェロン自己反応性は検出されなかった。健常または非入院ＣＯＶＩＤ－１９対照のいずれも、２つ以上のインターフェロンＵＣＩに対して陽性でなかった。
【0172】
Ｉ型およびＩＩＩ型インターフェロンの両方を中和するＰ２血漿を用いたＭＩＰＳＡの能力を評価した。ＭＩＰＳＡをＰ２血漿中で３回実施し、ヒットの一貫した検出および低い変動係数（平均ＣＶ＝２２％）の両方において、高レベルのアッセイ再現性を得た（図１９Ａ、１９Ｂ）。アッセイの線形性は、Ｐ２血漿を健常な血漿中に１０倍希釈し、次いで再びＭＩＳＰＡを行うことによって評価した。結果は、反応性間のシグナルの一貫した減少（反応性インターフェロンについて平均５．４倍）、およびいくつかのヒット、特に単一反応性ＵＣＩを有するＯＲＦの検出の喪失を実証する。
【0173】
Ａ５４９ヒト腺癌肺上皮細胞を１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮ－αまたは１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３とともに無血清培地中で４時間インキュベートすると、ＩＦＮ応答遺伝子ＭＸ１がそれぞれ約１，０００倍および約１００倍強く上方制御される。血漿Ｐ１、Ｐ２、またはＰ３とのＩＦＮ－α２のプレインキュベーションは、ＭＸ１上方制御を完全に無効にした（図５Ｅ）。ＭＩＰＳＡによる最も弱いＩＦＮ－α反応性を有する血漿Ｐ４は、サイトカインを部分的にしか中和しなかった。ＨＣまたはＰ５血漿のいずれも、ＩＦＮ－α２処置に対するＡ５４９細胞の応答に対していかなる効果も有さなかった。しかしながら、ＩＦＮ－λ３サイトカインのＭＩＰＳＡ陽性血漿、Ｐ２およびＰ５とのプレインキュベーションは、インターフェロン応答を除去した（図５Ｆ）。他の血漿（ＨＣ、Ｐ１、Ｐ３またはＰ４）はいずれも、ＩＦＮ－λ３に対するＡ５４９細胞の応答に対していかなる効果も有さなかった。ＩＦＮ－α２およびＩＦＮ－λ３モノクローナル抗体を使用した滴定曲線と比較すると、患者Ｐ２血漿を３回使用した連続滴定により、これらの自己抗体の循環レベルがそれぞれ～２０μｇ／ｍｌおよび～１００ｎｇ／ｍｌであることが示された（図１１Ａ、１１Ｂ）。連続希釈したＩＦＮ－α２ ｍＡｂのＭＩＰＳＡ分析は、広範なＩＦＮ－α交差認識を示したが、適切なＩ型またはＩＩＩ型インターフェロンに対するｍＡｂの相互排他的な結合を示した（図１２Ａ、１２Ｂ）。重要なこととして、本発明者らは、ＭＩＰＳＡ検出感度の損失が、ＩＦＮ－α２およびＩＦＮ－λ３の中和活性も失われる同等以上の血漿希釈に相当することに注目した。最後に、Ｐ２の自己抗体の力価は、ＩＦＮ－γ１中和よりもＩＦＮ－γ３中和に対して少なくとも１０倍の優先性を示した（図１３）。要約すると、この重症ＣＯＶＩＤ－１９コホートのＭＩＰＳＡベースの自己抗体プロファイリングは、患者の７．３％において強力に中和するＩＦＮ－α自己抗体が同定され、および患者の３．６％において強力に中和するＩＦＮ－λ３自己抗体を同定され、単一の患者（１．８％）は両方の自己反応性を保有していた。
【0174】
次いで、９０ ａａヒトペプチドームライブラリー２９を有するファージ免疫沈降シーケシング（ＰｈＩＰ－Ｓｅｑ）もまた、このコホートにおいてインターフェロン抗体を検出し得るかどうかを決定した。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、Ｐ１およびＰ２からの血漿中でＩＦＮ－α反応性を検出したが、その程度ははるかに低かった（図５Ｇ）。Ｐ３およびＰ４の血漿中のＭＩＰＳＡによって検出された２つのより弱いＩＦＮ－α反応性は、両方ともＰｈＩＰ－Ｓｅｑによって失われた。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、ＭＩＰＳＡによって陰性であった単一のさらなる弱いＩＦＮ－α反応性サンプルを同定した（図示せず）。両方の技術は、ＩＩＩ型インターフェロン自己反応性（ＩＦＮ－λ３のみを対象とする）を検出した。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑデータを使用して、これらのＩ型およびＩＩＩ型インターフェロン自己抗原における優性エピトープの位置を絞り込んだ（ＩＦＮ－αについては図５Ｈ；ＩＦＮ－λ３についてはアミノ酸位置４５～１３５）。
【0175】
一般集団における以前に報告されていないＩＦＮ－λ３自己反応性の罹患率、およびそれが重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する患者の間で増加し得るかどうかを評価した。ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、４２３人の健常な対照の血漿をプロファイリングするために以前に使用されており、そのいずれも、検出できるＩＦＮ－λ３自己反応性を有することが見出されなかった３０。これらのデータは、ＩＦＮ－λ３自己反応性が、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する個体の間でより頻繁である可能性が高いことを示唆する。これは、中和ＩＦＮ－λ３自己抗体を記載する最初の報告であり、したがって、患者のサブセットにおいて生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９に寄与する潜在的に新規な病原性機構を提供する。
【0176】
考察
【0177】
ここで、新規な分子ディスプレイ技術が、全長タンパク質について提示され、これは、タンパク質マイクロアレイ、ＰＬＡＴＯ、および代替技術を超える重要な利点を提供する。ＭＩＰＳＡは、自己組織化を利用して、２５ｋＤａのＨａｌｏタグドメインを介して比較的短い（１５８ｎｔ）一本鎖バーコードに連結されたタンパク質のライブラリーを産生する。このコンパクトなバーコード化アプローチは、かさ高い連結カーゴ（例えば、酵母、細菌、ウイルス、ファージ、リボソーム、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ）を有する代替ディスプレイフォーマットに利用できない多数の用途を有する可能性が高い。実際に、最小ＤＮＡバーコードをタンパク、特に抗体および抗原に個々にコンジュゲートすることは、ＣＩＴＥ－Ｓｅｑ３１、ＬＩＢＲＡ－ｓｅｑ３２、および関連する方法論を含むいくつかの設定において有用であることが既に証明されている３３。プロテオームスケールで、ＭＩＰＳＡは、タンパク質－抗体、タンパク質－タンパク質、およびタンパク質－小分子相互作用の偏りのない分析、ならびに例えばハプテン修飾研究３４またはプロテアーゼ活性プロファイリング３５などの翻訳後修飾の研究を可能にする。ＭＩＰＳＡの重要な利点には、その高いスループット、低いコスト、単純なシーケンシングライブラリー調製、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑとの固有の適合性、およびタンパク質－ＤＮＡ複合体の安定（ディスプレイライブラリーの操作および保存に重要）が含まれる。重要なことに、ＭＩＰＳＡは、専門の訓練または機器を必要とせず、ハイスループットシーケンシング機器または設備への単なるアクセスを必要とするので、標準的な分子生物学研究所によって直ちに採用され得る。
【0178】
ＭＩＰＳＡを使用して重症ＣＯＶＩＤ－１９患者において検出された自己抗体
【0179】
中和ＩＦＮ－α／ω自己抗体は、重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患を有する患者において記載されており、病原性であると推定されている２２。これらの既存の自己抗体は、一般集団において非常に稀にしか存在せず、細胞培養におけるウイルス複製の制限を遮断し、したがって、病気の消散を妨げる可能性が高い。この発見は、生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９のリスクがある個体のサブセットを同定する道を開いて、この患者集団におけるインターフェロンβの治療用途を提案した。この研究において、ＭＩＰＳＡは、ＩＦＮ－αサイトカインの全ファミリーに対して広範な反応性を有する２人の個体を同定した。実際、両方の個体に加えて、ＭＩＰＳＡによって検出されたより弱いＩＦＮ－α反応性を有する２人の個体からの血漿は、肺腺癌細胞培養モデルにおいて組換えＩＦＮ－α２を強く中和した。
【0180】
ＩＩＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ－λ、ＩＬ－２８／２９としても知られる）は、主にバリア部位で作用する強力な抗ウイルス活性を有するサイトカインである。ＩＦＮ－λに対するＩＦＮ－λＲ１／ＩＬ－１０ＲＢヘテロ二量体受容体は、肺上皮細胞上で発現され、ウイルス感染に対する自然応答にとって重要である。Ｍｏｒｄｓｔｅｉｎらは、マウスにおいて、ＩＦＮ－λが病原性を減少させ、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトメタニューモウイルス、およびサーズコロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）の複製を抑制することを明らかにした３６。ＩＦＮ－λは、抗ウイルス細胞状態の誘導を介するのではなく、免疫細胞との刺激相互作用を介してインビボでその抗ウイルス活性の多くを発揮することが提唱されている３７。しかしながら、ＩＦＮ－λは、初代ヒト気管支上皮細胞３８、初代ヒト気道上皮培養物３９、および初代ヒト腸上皮細胞４０において、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を強く制限することが見出されている。これらの研究を総合すると、中和ＩＦＮ－λ自己抗体がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染を悪化させ得る多面的機構を示唆している。
【0181】
５５人の重症ＣＯＶＩＤ－１９患者のうち、ＭＩＰＳＡは、ＩＦＮ－λ３反応性自己抗体を有する２人の個体を検出した。本発明者らは、これらの患者の血漿中のＩＦＮ－λ３中和能を試験し、組換えサイトカインに対する細胞応答のほぼ完全な消失を観察した（図５Ｆ）。これらのデータは、ＩＦＮ－λ３自己反応性が、重症ＣＯＶＩＤ－１９疾患に寄与する新規の潜在的な病原性機構であることを提案する。
【0182】
Ｃａｓａｎｏｖａらは、試験したＩ型ＩＦＮ自己抗体を有する１０１人の個体のうち、ＩＩＩ型ＩＦＮ中和抗体を全く検出しなかった２２。この研究において、４人のＩＦＮ－α自己反応性個体のうちの１人（Ｐ２、２２歳男性）もまた、ＩＦＮ－λ３を中和する自己抗体を有していた。この共反応性は非常に稀であり、したがってＣａｓａｎｏｖａコホートにおいて示されない可能性がある。あるいは、異なるアッセイ条件が異なる検出感度を示すことが可能である。Ｃａｓａｎｏｖａらは、Ａ５４９細胞を５０ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３と共に、血漿中でプレインキュベートせずに培養したが、ここでは、Ａ５４９細胞を、血漿中で１時間プレインキュベートした後、１ｎｇ／ｍｌのＩＦＮ－λ３と共に培養した。ＳＴＡＴ３リン酸化のそれらのリードアウトはまた、ＭＸ１発現の上方制御と比較して異なる検出感度を提供し得る。より大規模な研究は、重症ＣＯＶＩＤ－１９患者および対応する対照におけるこれらの反応性の真の頻度を決定するはずである。ここで、重症ＣＯＶＩＤ－１９を有する５５人の患者のコホートにおいて、それぞれ４人（７．３％）および２人（３．６％）の個体における強力に中和するＩＦＮ－αおよびＩＦＮ－λ３自己抗体の検出が報告されている。ＩＦＮ－λ３自己抗体は、パンデミック前に収集された４２３人の健常対照のより大きなコホートにおいて、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑを介して検出されなかった。
【0183】
外因的に投与されたＩＩＩ型インターフェロンは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療薬として提案されており３９，４１－４５、現在、ＣＯＶＩＤ－１９に関連する罹患率および死亡率の低減における効力についてペグ化ＩＦＮ－λ１を試験するための３つの進行中の臨床試験がある（ＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒｓ：ＮＣＴ０４３４３９７６、ＮＣＴ０４５３４６７３、ＮＣＴ０４３４４６００）。１つの最近完了した二重盲検プラセボ対照治験、ＮＣＴ０４３５４２５９は、外来患者設定における軽度から中等度のＣＯＶＩＤ－１９患者の間で、７日目にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の２．４２ｌｏｇコピー／ｍｌの有意な減少を報告した（ｐ＝０．００４１）４６。将来の研究は、抗ＩＦＮ－λ３自己抗体が既存であるか、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答して生じるかどうか、およびそれらがどのくらい頻繁にＩＦＮ－λ１を交差中和するかを決定する。Ｐ２からの中和データ（図１３）ならびにＩＦＮ－λ１およびＩＦＮ－λ３の配列アラインメント（約２９％相同性、図９）に基づいて、交差中和はまれであると予想され、中和ＩＦＮ－λ３自己抗体を有する患者がペグ化ＩＦＮ－λ１治療から利益を得る可能性を生じさせる。
【0184】
特徴付けられていない自己反応性のクラスターが複数の個体において観察されたが、それらが重症ＣＯＶＩＤ－１９において、たとえあったとしても、どのような機能を果たし得るかは明らかではない。より大規模な研究において、本発明者らは、同時に起こる反応性、または関連する生物学的機能を有するタンパク質に対する反応性のパターンが、重症ＣＯＶＩＤ－１９に関連する新たな自己免疫症候群を究極的に規定し得ることを予測する。
【0185】
ＭＩＰＳＡおよびＰｈＩＰ－Ｓｅｑの相補性
【0186】
ディスプレイ技術はしばしば互いに補完し合うが、通常の同時使用には適していない場合がある。ＭＩＰＳＡは、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑよりも、インビトロで十分に発現されたタンパク質上の立体構造エピトープに対する抗体を検出する可能性が高い。これは、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑを介してあまり敏感に検出されなかったＭＩＰＳＡを介したインターフェロンα自己抗体のロバストな検出によって例証された。一方、ＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーに存在しないか、または無細胞溶解物中で十分に発現され得ないかのいずれかであるタンパク質内に含まれるより少ない立体構造エピトープに対する抗体を検出する可能性がより高い。ＭＩＰＳＡおよびＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、これらの方法で互いに自然に相補するので、本発明者らは、ＭＩＰＳＡ ＵＣＩ増幅プライマーを、本発明者らがＰｈＩＰ－Ｓｅｑに使用したものと同じになるように設計した。ＭＩＰＳＡおよびＰｈＩＰ－Ｓｅｑは、ファージ調製物中でも安定であるので、単一セットの増幅およびシーケンシングプライマーを使用して、単一反応で一緒に容易に実施することができる。これらの２つの表示モダリティの互換性は、それらの相乗効果を活用する障壁を低下させる。
【0187】
ＭＩＰＳＡシステムのバリエーション
【0188】
ＭＩＰＳＡの重要な側面は、別のライブラリーメンバーのＵＣＩのｔｒａｎｓでの結合と比較して、タンパク質のその関連するＵＣＩへのｃｉｓでの結合を含む。ここでは、Ｈａｌｏタグ／Ｈａｌｏリガンドシステムを介して共有結合を利用したが、他のものも同様に機能し得る。例えば、ＳＮＡＰタグ－ｔａｇ（ＤＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｐｒｏｔｅｉｎ Ｏ６－ａｌｋｙｌｇｕａｎｉｎｅ－ＤＮＡ ａｌｋｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅの２０ｋＤａ突然変異体）は、ベンジルグアニン（ＢＧ）誘導体と共有結合を形成する４７。したがってＢＧを用いてＨａｌｏリガンドの代わりにＲＴプライマーを標識することができる。ＳＮＡＰタグの変異誘導体であるＣＬＩＰタグは、Ｏ２－ベンジルシトシン誘導体に結合し、これもＭＩＰＳＡに適合させることができる４８。
【0189】
Ｈａｌｏタグ成熟およびリガンド結合の速度は、ｃｉｓ対ｔｒａｎｓＵＣＩコンジュゲーションの相対収率に重要である。Samelsonらの研究によると、Ｈａｌｏタグタンパク質の生産速度は、Ｈａｌｏタグの機能成熟速度の約４倍である49。典型的なタンパク質サイズがＯＲＦｅｏｍｅライブラリーにおいて＜１，０００アミノ酸であることを考慮すると、これらのデータは、ほとんどのタンパクが、Ｈａｌｏタグ成熟の前に、したがってｃｉｓＨａｌｏリガンドコンジュゲーションが起こり得る前に、リボソームから放出されるはずであり、それによって望ましくないｔｒａｎｓバーコード化に有利に働くことを予測する。しかしながら、ここでは、約５０％のタンパク質－ＵＣＩコンジュゲートがｃｉｓで形成され、それによって、複合体ライブラリーの設定において優れたアッセイ性能を可能にすることが観察された。最適化実験の間、翻訳混合物から放出因子を排除することによって、ｃｉｓバーコード化の速度がわずかに改善されることが見出され、これは、リボソームをそれらの終止コドン上で失速させ、Ｈａｌｏタグ成熟がそのＵＣＩに近接して継続することを可能にする。制御されたリボソーム失速を促進するための代替のアプローチは、終止コドン除去／抑制またはドミナントネガティブ終止因子の使用を含み得る。次いで、リボソーム放出は、鎖ターミネーターであるピューロマイシンの添加を介して誘導され得る。
【0190】
ＵＣＩ ｃＤＮＡは、ＩＶＴ－ＲＮＡの５’ＵＴＲ上に形成されるので、真核生物リボソームは、５’キャップから開始Ｋｏｚａｋ配列まで走査することができない。したがって、本明細書に記載されるＭＩＰＳＡ系は、キャップ依存性真核無細胞翻訳系と不適合である。しかし、キャップ依存性翻訳が所望される場合、２つの代替的な方法が開発され得る。第１に、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）がＲＴプライマーとＫｏｚａｋ配列との間に配置される場合、現在の５’ＵＣＩ系が使用され得る。第２に、ＲＴがＯＲＦ内に伸長するのを防止するという条件で、代わりにＵＣＩをＲＮＡの３’末端に導入することができる。真核生物培養ＭＩＰＳＡの拡張において、ＲＮＡ－ｃＤＮＡハイブリッドは、生きている細胞または組織に潜在的にトランスフェクトされ得、ここで、ＵＣＩタンパク形成がin situで起こり得、多くのさらなる適用を可能にする。
【0191】
ＯＲＦ関連ＵＣＩは、様々な方法で具体化することができる。ここで、確率的に割り当てられたインデックスを、約１０倍の表示でヒトＯＲＦｅｏｍｅに割り当てた。このアプローチは、２つの主な利点を有する：第１に、単一の縮重オリゴヌクレオチドプールが低コストである；第２に、複数の独立した測定が、各ＯＲＦに関連するＵＣＩのアンサンブルによって報告される。ここでライブラリーは、均一なＧＣ含量、したがって均一なＰＣＲ増幅効率を有するＵＣＩを有するように設計された。簡単にするために、固有分子識別子（ＵＭＩ）をＲＴプライマーに組み込まないことを選択したが、このアプローチはＭＩＰＳＡ ＵＭＩと互換性であり、定量化を潜在的に増強し得る。確率的インデックス付けの１つの欠点は、ＯＲＦドロップアウトの可能性、したがって、比較的高いＵＣＩ表現の必要性であり、これは、各ＵＣＩを定量化するために必要とされるシーケンシングの深さ、したがって、全体的なサンプルあたりのコストを増加させる。第２の欠点は、ＵＣＩ－ＯＲＦｅｏｍｅマッチング辞書を構築する必要があることである。ショートリードシーケンシングを用いて、本発明者らは、大部分が代替アイソフォームから構成されるライブラリーの画分を明確にすることができなかった。ショートリードシーケンシング技術の代わりに、またはショートリードシーケンシング技術に加えて、PacBioまたはOxford Nanopore Technologiesなどのロングリードシーケンシング技術を使用することは、不完全な曖昧性除去を克服し得る。確率的バーコード化とは対照的に、個々のＵＣＩ－ＯＲＦクローニングは可能であるが、コストがかかり面倒である。しかし、より小さいＵＣＩセットは、より低いアッセイあたりのシーケンシングコストという利点を提供する。Long Adapter Single Stranded Oligonucleotide（ＬＡＳＳＯ）プローブを使用してＯＲＦｅｏｍｅｓをクローニングする方法論は、以前に開発された５０。ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのＬＡＳＳＯクローニングは、ＭＩＰＳＡベースのアプリケーションと自然に相乗効果を発揮する。
【0192】
ｑＰＣＲによるＭＩＰＳＡリードアウト
【0193】
適切に設計されたＵＣＩの有用な特徴は、それらがｑＰＣＲリードアウトプローブとしても機能し得ることである。ここで設計および使用された縮重ＵＣＩ（図１Ｂ）は、１８ｎｔ塩基バランスのフォワードおよびリバースプライマー結合部位を含む。したがって、ｑＰＣＲアッセイの低いコストおよび迅速なターンアラウンドタイムを、ＭＩＰＳＡと組み合わせて活用することができる。例えば、ＴＲＩＭ２１ ＩＰのようなアッセイ品質管理手段を組み込むことは、より費用のかかるシーケンシングの実行の前に、サンプルのセットを認定するために使用され得る。トラブルシューティングおよび最適化は、ＮＧＳのみに依存するのではなく、リードアウトとしてｑＰＣＲを使用することによって同様に促進することができる。特異的ＵＣＩのｑＰＣＲ試験はまた、理論的には、シーケンシングと比較して増強された感度を提供する可能性があり、臨床設定における分析により適している可能性がある。
【0194】
結論
【0195】
ＭＩＰＳＡは、別のアプローチに勝る重要な利点を有する自己組織化性タンパク質ディスプレイ技術である。それは、ＰｈＩＰ－ＳｅｑおよびＭＩＰＳＡ ＯＲＦｅｏｍｅライブラリーのような相補的技術が、ファージディスプレイライブラリーを用いた同じ反応において簡便にスクリーニングされ得るという特性を有する。本明細書に提示されるＭＩＰＳＡプロトコルは、キャップ非依存性の無細胞翻訳を必要とするが、将来の適応は、この制限を克服し得る。ＭＩＰＳＡベースの研究の用途には、タンパク－タンパク、タンパク－抗体、およびタンパク－小分子相互作用研究、ならびに翻訳後修飾の分析が含まれる。ここで、ＭＩＰＳＡを使用して、既知の自己抗体を検出し、中和ＩＦＮ－λ３自己抗体を発見したが、これは、多くの他の潜在的に病原性の自己反応性（表４）の中でも、危険性のある個体のサブセットにおいて、生命を脅かすＣＯＶＩＤ－１９に寄与し得る。
【0196】
表４：重症ＣＯＶＩＤ－１９患者において反応性のタンパク質（次のページに続く）。
Symbol、遺伝子記号；AAgAtlas、AAgAtlas 1.0にリストされたタンパク質。；#Severe、少なくとも１つのＵＣＩに反応性を示した重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の数；#Controls、少なくとも１つのＵＣＩに反応性を示した対照ドナー（健常または軽度～中等度ＣＯＶＩＤ－１９患者）の数；#Reactive_UCIs、所定のＯＲＦに関連する反応性ＵＣＩの数；hits_FCs、反応性を示した患者の間で観察されたＯＲＦごとの最大ヒット倍率変化の平均および範囲（最小～最大）；Cluster_ID、図４Ｂに定義された抗原クラスター。
Symbol、遺伝子記号；AAgAtlas、AAgAtlas 1.0にリストされたタンパク質。；#Severe、少なくとも１つのＵＣＩに反応性を示した重症ＣＯＶＩＤ－１９患者の数；#Controls、少なくとも１つのＵＣＩに反応性を示した対照ドナー（健常または軽度～中等度ＣＯＶＩＤ－１９患者）の数；#Reactive_UCIs、所定のＯＲＦに関連する反応性ＵＣＩの数；hits_FCs、反応性を示した患者の間で観察されたＯＲＦごとの最大ヒット倍率変化の平均および範囲（最小～最大）；Cluster_ID、図４Ｂに定義された抗原クラスター。
【表4-1】
【表4-2】
【0197】
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【表5-1】
【表5-2】
【表5-3】
【表5-4】
【表5-5】
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3-1】
【図3-2】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図5-3】
【図5-4】
【図5-5】
【図6】
【図7-1】
【図7-2】
【図8】
【図9】
【図10-1】
【図10-2】
【図10-3】
【図11】
【図12】
【図13】
【配列表】
【国際調査報告】