特表 2024-510947 三量体ポリペプチドおよびがん治療におけるその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-12

(54)【発明の名称】三量体ポリペプチドおよびがん治療におけるその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/62 20060101AFI20240305BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240305BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240305BHJP

   C07K 14/78 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 38/16 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240305BHJP

【ＦＩ】

C12N15/62 Z

C07K16/28 ZNA

C07K19/00

C07K14/78

C12N15/13

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12N15/12

A61P35/00

A61K38/16

A61K45/00

A61K39/395 U

A61K48/00

A61K35/12

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023554071

(86)(22)【出願日】2022-03-07

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 EP2022055707

(87)【国際公開番号】W WO2022184937

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】21382188.7

(32)【優先日】2021-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523337421

【氏名又は名称】レアダルティス、ソシエダッド リミターダ

【氏名又は名称原語表記】ＬＥＡＤＡＲＴＩＳ， Ｓ．Ｌ．

(74)【代理人】

【識別番号】100094640

【弁理士】

【氏名又は名称】紺野 昭男

(74)【代理人】

【識別番号】100103447

【弁理士】

【氏名又は名称】井波 実

(74)【代理人】

【識別番号】100111730

【弁理士】

【氏名又は名称】伊藤 武泰

(74)【代理人】

【識別番号】100180873

【弁理士】

【氏名又は名称】田村 慶政

(72)【発明者】

【氏名】アルバレス バジナ、ルイス

(72)【発明者】

【氏名】コンプテ グラウ、マルタ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA91Y

4B065AA93X

4B065AA93Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BD14

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA07

4C084AA13

4C084BA01

4C084BA08

4C084BA22

4C084CA53

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC412

4C084ZC752

4C085AA14

4C085BB01

4C085CC23

4C085EE03

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087CA04

4C087CA12

4C087MA02

4C087NA14

4C087ZB26

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

4H045GA26

(57)【要約】

本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、各単量体ポリペプチドが、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、ホモ三量体化ドメイン、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域を含む、三量体ポリペプチド複合体に関する。本発明はまた、がんの治療における使用のための、上記三量体ポリペプチド複合体に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体ポリペプチドが、
ａ）Ｖ_ＨドメインがＶ_Ｌドメインに対してＮ末端側にある、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、
ｂ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^ＸＶ）およびそれらの機能的に等価な改変体からなる群から選択される、ホモ三量体化ドメイン、および
ｃ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
を含む、
三量体ポリペプチド複合体。

【請求項2】

３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体ポリペプチドが、
ａ）ＣＤＲが配列番号１または配列番号４２、配列番号２または配列番号４３、配列番号３または配列番号４４、配列番号４または配列番号４５、配列番号５または配列番号４６、および配列番号６で表される配列、またはそれらの機能的に等価な改変体を含む、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、
ｂ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^ＸＶ）およびそれらの機能的に等価な改変体からなる群から選択される、ホモ三量体化ドメイン、および
ｃ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
を含む、
三量体ポリペプチド複合体。

【請求項3】

前記抗４－１ＢＢ特異的アゴニストｓｃＦｖが、ヒト化されているか、またはヒト化ＶＬドメインおよび／または部分ヒト化ＶＨドメインを提示する、請求項１または２に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項4】

前記抗４－１ＢＢアゴニストｓｃＦｖが、配列番号１９で表される配列を含む、請求項３に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項5】

前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域が、前記ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する、請求項１から４のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。

【請求項6】

前記腫瘍関連抗原が、ＥＧＦＲである、請求項１から５のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項7】

ＥＧＦＲに特異的に結合可能なポリペプチド領域が、抗体である、請求項６に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項8】

抗ＥＧＦＲ抗体が、ヒト化抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）である、請求項７に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項9】

前記ヒト化抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）が、配列番号２８で表される配列を含む、請求項８に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項10】

前記抗４－１ＢＢアゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、前記ホモ三量体化ドメインおよび／または前記腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域が、直接連結されているか、またはスペーサーを介して連結されている、請求項１から９のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド複合体。

【請求項11】

前記スペーサーが、１～１８残基を有するフレキシブルリンカーである、請求項１０に記載の三量体ポリペプチド。

【請求項12】

前記単量体の少なくとも１つが、前記三量体ポリペプチドの検出および／または精製に適したタグをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド。

【請求項13】

前記単量体ポリペプチドが、配列番号 または配列番号で表される配列を含む、請求項１または２に記載の三量体ポリペプチド。

【請求項14】

請求項１から１３のいずれかに記載の三量体ポリペプチドの一部を形成する少なくとも１つの単量体ポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。

【請求項15】

配列番号または配列番号で表される配列を含む、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１４または１５のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項17】

請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項18】

請求項１から１３のいずれかに記載の三量体ポリペプチド、請求項１４または１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載のベクター、または請求項１７に記載の宿主細胞と、免疫チェックポイントブロッカーとを含む、組み合わせ物。

【請求項19】

前記免疫チェックポイントブロッカーが、ＰＤ－Ｌ１阻害剤である、請求項１８に記載の組み合わせ物。

【請求項20】

前記ＰＤ－Ｌ１阻害剤が、ＰＤ－Ｌ１抗体である、請求項１９に記載の組み合わせ物。

【請求項21】

前記ＰＤ－Ｌ１抗体が、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される、請求項２０に記載の組み合わせ物。

【請求項22】

前記免疫チェックポイントブロッカーが、ＰＤ－１阻害剤である、請求項１８に記載の組み合わせ物。

【請求項23】

前記ＰＤ－１阻害剤が、ペムブロリズマブまたはニボルマブである、請求項２２に記載の組み合わせ物。

【請求項24】

請求項１～１３のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド、請求項１４または１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、または請求項１８～２３のいずれか一項に記載の組み合わせ物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。

【請求項25】

がんの治療における使用のための、請求項１～１３のいずれか一項に記載の三量体ポリペプチド、請求項１４または１５のいずれかに記載のポリヌクレオチド、請求項１６に記載のベクター、請求項１７に記載の宿主細胞、請求項１８～２３のいずれか一項に記載の組み合わせ物、または請求項２４に記載の医薬組成物。

【請求項26】

前記がんがＥＧＦＲ陽性である、請求項２５に記載の使用のための三量体ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組み合わせ物、または医薬組成物。

【請求項27】

前記がんが、結腸直腸がん、乳がん、膵臓がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がんおよび肺がんからなる群から選択される、請求項２６に記載の使用のための三量体ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組み合わせ物、または医薬組成物。

【請求項28】

前記乳がんがトリプルネガティブ乳がんであり、前記肺がんが小細胞肺がんである、請求項２７に記載の使用のための三量体ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組み合わせ物、または医薬組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、がん治療学の分野に関し、より具体的には、コラーゲンホモ三量体化ドメインによって形成される三量体ポリペプチド複合体である治療薬に関する。

【背景技術】

【0002】

モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いた免疫応答の調節は、がん免疫療法に対する最も有望なアプローチの１つである。おそらく最もよく知られているのは、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）阻害経路のｍＡｂ媒介遮断であり、これにより、Ｔ細胞におけるＰＤ－１媒介免疫抑制シグナル伝達を阻止し、アネルギー性腫瘍浸潤Ｔ細胞にエフェクター機能を回復させることができる。ＰＤ－１／ＰＤ－リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）軸遮断は、幅広いがんにおいて長期にわたる持続性応答を示しているが、その有効性は、患者の１０～３０％に限られている。別の免疫療法アプローチは、アゴニストｍＡｂによる４－１ＢＢなどの共刺激受容体の刺激に関する。ＣＤ１３７としても知られる４－１ＢＢは、ＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリーのメンバーであり、さまざまな白血球サブセット上に誘導され得る。４－１ＢＢは、４つの細胞外システインリッチドメイン（ＣＲＤ）および１つの細胞内シグナル伝達ドメインを有するＩ型単回膜貫通型受容体である。Ｔ細胞上では、４－１ＢＢは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化後に発現される。その天然リガンド［４－１ＢＢ－リガンド（４－１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ９］またはアゴニストｍＡｂと結合すると、Ｔ細胞の増殖およびエフェクター機能を増強し、Ｔ細胞枯渇を阻止し、プログラム細胞死から保護し、記憶細胞分化を促進し、これにより腫瘍特異的Ｔ細胞の持続性がサポートされ得る。抗４－１ＢＢアゴニストｍＡｂは、前臨床がんモデルで検討され、さまざまな低免疫原性腫瘍の排除を促進することが示されている。しかしながら、腫瘍外毒性が、完全長抗ヒト４－１ＢＢの臨床開発に対する大きな障害となっている。抗ｈｕ４－１ＢＢヒトＩｇＧ４ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３）は、用量依存性の肝毒性を引き起こし、２例の死亡に関与した。その後の研究で、より低用量であれば肝毒性は軽減されるが、その代償として有効性が低下することが明らかになった（Ｓｅｇａｌ ＮＨ．ら、２０１７）。抗ｈｕ４－１ＢＢヒトＩｇＧ２ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６）は、ウレルマブと比較して安全性プロファイルが改善されているが、４－１ＢＢアゴニストとしての効力も低い（Ｃｈｅｓｔｅｒ Ｃ．ら、２０１８）。

【0003】

４－１ＢＢ共刺激に関連する抗腫瘍活性を保持しながら、Ｆｃ－ＦｃγＲ相互作用に関連する腫瘍外毒性を回避するための新たな戦略が、積極的に模索されている。これらのアプローチは、４－１ＢＢ共刺激を、腫瘍微小環境および流入領域リンパ節に限定することを目的としている。ＥＧＦＲ（上皮増殖因子受容体）（Ｃｏｍｐｔｅ Ｍ．ら、２０１８）またはＣＥＡ（癌胎児抗原）（Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ Ｋ．ら、２０１９）などの腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）およびマウス４－１ＢＢをアゴニスト様式で標的とする、Ｆｃフリー腫瘍特異的トリマーボディが最近報告されている。両トリマーボディとも、インビトロでは強力な共刺激分子であり、ＥＧＦＲ標的化４－１ＢＢアゴニストトリマーボディは、免疫適格マウスにおいて、腫瘍浸透性の増強および強力な抗腫瘍活性を示した一方で、ＩｇＧベースの４－１ＢＢアゴニストに関連する全身性サイトカイン産生およびＴ細胞媒介性肝毒性を緩和した（Ｃｏｍｐｔｅ Ｍ．ら、２０１８）。さらに最近、肝臓特異的ヒトＥＧＦＲトランスジェニック免疫適格マウスにおいて、抗４－１ＢＢアゴニストＩｇＧの全身投与は、非特異的な免疫刺激および肝毒性を引き起こしたが、ＦｃフリーＥＧＦＲ特異的４－１ＢＢアゴニストトリマーボディで治療したマウスでは、そのような免疫関連の有害作用は観察されなかったことが開示された（Ｃｏｍｐｔｅ Ｍ．ら、２０２０）。

【0004】

したがって、腫瘍標的化治療のために、重篤な副作用を伴わずに効果的な免疫刺激を可能にする新たな戦略が、当技術分野で必要とされている。

【発明の概要】

【0005】

第１の態様において、本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体ポリペプチドが、
ａ）ＶＨドメインがＶＬドメインに対してＮ末端側にある、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、
ｂ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびそれらの機能的に等価な改変体からなる群から選択される、ホモ三量体化ドメイン、および
ｃ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
を含む、
三量体ポリペプチド複合体に関する。

【0006】

第２の態様において、本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体であって、
各単量体ポリペプチドが、
ａ）ＣＤＲが配列番号１または配列番号４２、配列番号２または配列番号４３、配列番号３または配列番号４４、配列番号４または配列番号４５、配列番号５または配列番号４６および配列番号６で表される配列、またはそれらの機能的に等価な改変体を含む、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、
ｂ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびその機能的に等価な改変体からなる群から選択される、ホモ三量体化ドメイン、および
ｃ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
を含む、
三量体ポリペプチド複合体に関する。

【0007】

第３の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチドの一部を形成する少なくとも１つの単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

【0008】

第４の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

【0009】

第５の態様において、本発明は、本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。

【0010】

第６の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞と、免疫チェックポイントブロッカーとを含む、組み合わせ物に関する。

【0011】

第７の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、または本発明による組み合わせ物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。

【0012】

第８の態様において、本発明は、がんの治療における使用のための、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、本発明による組み合わせ物、または本発明による医薬組成物に関する。

【図面の簡単な説明】

【0013】

【図1】ヒト化Ｆｃフリー腫瘍標的化４－１ＢＢアゴニストトリマーボディ（４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ）の設計および特性評価。（ａ）ＳＡＸＳにより決定された、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの遺伝子配置およびドメイン構造、および溶液中の配置を示す模式図。（ｂ）ＳＡＸＳエンベロープ内での４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲに対応するモデルの剛体フィッティング（薄灰色で着色されている）。各鎖はブルー、マゼンタおよびシアンで着色されている。（ｃ）４－１ＢＢＮおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディ（１および５ｎＭ濃度）と固定化ｈｕ４－１ＢＢとの間の相互作用（上パネル）、および抗ｈｕＥＧＦＲ ＡＴＴＡＣＫおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディ（１および５ｎＭ濃度）と固定化ｈｕＥＧＦＲとの間の相互作用（下パネル）を示す、ＢＬＩから得られた実験に基づくセンサーグラム（黒線）および計算に基づくセンサーグラム（赤線）。計算曲線に用いた動態速度定数を表Ｖに示す。（ｄ）溶液中の固定化ｈｕ４－１ＢＢとｈｕＥＧＦＲの両方への同時結合は、４－１ＢＢＬ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（緑）では示されたが、４－１ＢＢ^Ｎ（黒）では示されなかった；５ｎＭのいずれかのトリマーボディをまず固定化ｈｕ４－１ＢＢに結合させ、その後、バイオセンサーを１０ｎＭのｈｕＥＧＦＲに移動させた。

【図2】４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、ｈｕＥＧＦＲ発現細胞およびシグナル１の存在下で、インビトロでのＴ細胞共刺激を有意に増強する。ＣＨＯ細胞およびＣＨＯ^{ｈｕＦｃγＲＩＩｂ}細胞におけるｈｕＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）発現のフローサイトメトリー分析（ａ）、ならびに３Ｔ３細胞および３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞におけるｈｕＥＧＦＲ発現のフローサイトメトリー分析（ｂ）。ＰＥコンジュゲート化アイソタイプ対照ｍＡｂと共にインキュベートされた細胞を、灰色で塗りつぶしたヒストグラムで示す。蛍光強度（横軸）を相対細胞数（縦軸）に対してプロットした。数字は平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。Ｊｕｒｋａｔｈｕ４－１ＢＢ細胞を、１０倍漸増濃度の４－１ＢＢ ＩｇＧ、ウレルマブ、４－１ＢＢＮまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ抗体の存在下で、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ^{ｈｕＦｃγＲＩＩｂ}細胞（ｃ）および３Ｔ３細胞または３Ｔ３ｈｕＥＧＦＲ細胞（ｄ）と共培養し、３７℃で６時間後に発光を測定した。データは、未刺激のＪｕｒｋａｔ^{ｈｕ４－１ＢＢ}細胞から得られた値に対する誘導倍率として示した。代表的な用量－濃度曲線を示し、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。有意性は、独立スチューデントｔ検定により決定した。健常ドナーから単離したＰＢＭＣ（ｅ）およびＴ細胞（ｆ）（１．５×１０^５／ウェル）を、照射された３Ｔ３細胞または３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞と、５：１のＥ：Ｔ比で共培養した。抗ｈｕＣＤ３ ｍＡｂ（０．０５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、抗ｈｕ４－１ＢＢアゴニスト抗体（４－１ＢＢＩｇＧまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ）および対照を１０倍連続希釈で添加し、７２時間後のＩＦＮγ分泌を分析した（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。有意性は、独立スチューデントｔ検定により決定した。（ｇ）３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞におけるｈｕＥＧＦＲ発現（上パネル）またはｈｕＰＤ－Ｌ１発現（下パネル）のフローサイトメトリー分析。ＰＥコンジュゲート化アイソタイプ対照ｍＡｂと共にインキュベートした細胞を、灰色で塗りつぶしたヒストグラムで示す。（ｈ）照射されたＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１－細胞（３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}）またはＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１＋細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）（３×１０^４細胞／ウェル）を、抗ＰＤ－Ｌ１単独または４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲとの組み合わせの存在下で、抗ｈｕＣＤ３ ｍＡｂ（０．０５μｇ／ｍｌ）で活性化されたｈｕＰＢＭＣと、５：１のＥ：Ｔ比で共培養した。無細胞上清を、７２時間後にＩＦＮγについてＥＬＩＳＡにより測定した。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示す。有意性は、独立スチューデントｔ検定により算出した。３つの独立した実験のうち、１つの代表的な実験を示した（ａおよびｃ）。初代細胞を用いた場合、少なくとも３人の異なるドナーを試験した。

【図3】４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、ヒト化マウスモデルにおいて、有意な腫瘍成長抑制を示した。（ａ）^８９Ｚｒ－４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲのｉ．ｖ．投与後の血漿中％ＩＤ／ｍｌ対時間で表した薬物動態プロファイル。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝２～６）で示す。（ｂ）Ｒａｇ２^－／－ＩＬ２Ｒγ^ｎｕｌｌマウスに、ＨＴ２９腫瘍細胞をｓ．ｃ．播種し、新鮮単離ｈｕＰＢＭＣをｉ．ｐ．播種し、腫瘍が直径約０．４ｃｍに達した時点で、平均腫瘍サイズおよびＳＤが同程度の群（ｎ＝７～８／群）に無作為に割り付け、ＰＢＳ、ＣＥＡ^Ｎまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディ（４ｍｇ／ｋｇ）の５回のｉ．ｐ．注射で、または４－１ＢＢ ＩｇＧ（４ｍｇ／ｋｇ）の３回のｉ．ｐ．注射で処置した。ｃ）各群のマウスの平均腫瘍体積増加を表す。データは平均値±ＳＤで示す。有意性は、多重比較検定のためのボンフェローニ補正で調整した一元配置分散分析により決定した。（ｄ）ＮＳＣＬＣ ＰＤＸ ＴＰ１０３におけるＩＨＣによるｈｕＥＧＦＲ発現の分析。（ｅ）ＮＳＧマウスに、予め増幅されたＴＰ１０３の小断片をｓ．ｃ．播種し、腫瘍が直径約０．５ｃｍに達した時点で、平均腫瘍サイズおよびＳＤが同程度の群（ｎ＝６～７／群）に無作為に割り付け、新鮮単離ｈｕＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射した。マウスを、ＰＢＳまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲで処置した。（ｆ）各群のマウスの平均腫瘍体積増加を表す。データは平均値±ＳＤで示す。有意性は、独立スチューデントｔ検定により決定した。いずれのインビボアッセイにおいても、毒性をモニターするためにマウスの体重を週１回測定し、苦痛の徴候および／または１０～１５％の体重減少があれば、マウスを安楽死させた。ＰＢＳ処置マウスおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ処置マウス由来の組織切片におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋細胞（ｇ）またはＦｏｘＰ３＋細胞（ｈ）のパーセンテージ（平均値±ＳＤ、ｎ＝４～５）。有意性は、独立スチューデントｔ検定により算出した。（ｉ）ＣＤ４およびＣＤ８の代表的なＩＨＣ染色を示す。腫瘍は、（ｃ）に示した実験から終了時に採取した。（ｊ）ＰＢＳ、４－１ＢＢ ＩｇＧ、および４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲで処置したマウスの肝臓の代表的な組織切片のＨ＆Ｅ染色。スケールバーを示す。（ｋ）４週目に、マウスのヒトＩＦＮγ血清レベルを調べた（平均値±ＳＤ、ｎ＝４）。有意性は、独立スチューデントｔ検定により算出した。

【図4】４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲと完全長ＰＤ－Ｌ１遮断抗体との併用は、ヒト化ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ ＴＮＢＣ異種移植モデルにおいて、腫瘍縮小を誘導する。（ａ）ＮＳＧマウスに、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１腫瘍細胞をｓ．ｃ．播種し、新鮮単離ｈｕＰＢＭＣをｉ．ｐ．注射し、腫瘍が直径約０．２ｃｍに達した時点で各群に無作為に割り付け（ｎ＝５～６／群）、ＰＢＳで、または４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲまたはアテゾリズマブを単独でまたは併用して処置した。（ｂ）各群のマウスの平均腫瘍体積増加を表す。データは平均値±ＳＤで示す。マウスの体重は週１回測定し、苦痛の徴候および／または１０～１５％の体重減少が認められた時点で、マウスを安楽死させた。有意性は、多重比較検定のためのボンフェローニ補正で調整した一元配置分散分析により決定した。（ｂ）に示した実験から終了時に採取した腫瘍切片のサイトケラチン（ＣＫ）＋細胞のパーセンテージ（ｃ）および腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のＣＤ４／ＣＤ８比（ｄ）。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝４～６）で示す。有意性は、独立スチューデントｔ検定により算出した。（ｅ）サイトケラチン、ＣＤ４およびＣＤ８について、Ｈ＆Ｅ染色および免疫組織化学的染色を行った試料の代表的な低倍率画像を示す。併用療法群では、ＴＮＢＣ細胞の部分的または完全な免疫介在性根絶（ＩＭＥ）が認められた２つの代表的な標本を示す。

【図5】抗ｈｕ４－１ＢＢ ＩｇＧのタンパク質構造（ａ）、および抗ｈｕ４－１ＢＢトリマーボディの遺伝子配置（ｂ）およびタンパク質構造（ｃ）を示す模式図。ＳＡＰ３．２８抗体由来の可変領域は緑色で、マウス定常ドメインは薄灰色で表す。ｓｃＦｖベースのＮ末端トリマーボディ（４－１ＢＢ^Ｎ）遺伝子構築物は、ヒトＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}ドメイン（水色のボックス）にフレキシブルリンカー（濃灰色のボックス）を介して接続されたＳＡＰ３．２８ ｓｃＦｖ遺伝子（ＶＨ－リンカー－ＶＬ）を含む。精製および免疫検出のためにＦＬＡＧ－ｓｔｒｅｐタグ（薄橙色のボックス）を付加した。矢印は転写の方向を示す。

【図6】４－１ＢＢ ＩｇＧおよびウレルマブの結合アッセイ。プラスチック固定化ｈｕ４－１ＢＢに対する４－１ＢＢ ＩｇＧ（ａ）およびウレルマブ（ｂ）の抗原力価測定ＥＬＩＳＡ。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。漸増濃度の４－１ＢＢ ＩｇＧまたはウレルマブの存在下で固定化ｈｕ４－１ＢＢＬに結合する可溶性ｈｕ４－１ＢＢの競合ＥＬＩＳＡ（ｃ）。ｈｕ４－１ＢＢ結合のパーセンテージは、（競合する抗４－１ＢＢ抗体存在下でのＡｂｓ_{４５０ｎｍ}÷可溶性ｈｕ４－１ＢＢ単独でのＡｂｓ_{４５０ｎｍ}）×１００で表す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示す。それぞれ飽和濃度のウレルマブ（ｄ）または４－１ＢＢ ＩｇＧ（ｅ）の存在下での固定化ｈｕ４－１ＢＢに対する可溶性４－１ＢＢ ＩｇＧ（ｄ）またはウレルマブ（ｅ）の競合ＥＬＩＳＡ。表示データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で示す。

【図7】４－１ＢＢＮおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの構造的特性評価。（ａ）精製４－１ＢＢＮおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。４－１ＢＢ^Ｎ（ｂ）および４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（ｃ）のＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析。黒線は、ＵＶ吸光度（左軸）、赤線は、測定されたモル質量（右軸）に対応する。（ｄ）４－１ＢＢＮ（黒線）および４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（赤線）の円偏光二色性スペクトル。（ｅ）それぞれ２１０ｎｍおよび２１３ｎｍでの円偏光二色性楕円率の変化により測定した、４－１ＢＢＮ（黒線）および４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（赤線）の熱変性。

【図8】４－１ＢＢＮトリマーボディの溶液中での配置のＳＡＸＳによる分析。第一原理的に決定された４－１ＢＢ^ＮのＳＡＸＳエンベロープの剛体オーバーレイ。作成されたモデル（各鎖はブルー、マゼンタおよびシアンで着色されている）は、エンベロープ（薄灰色で着色されている）にフィットする。

【図9】実験上および理論上のＳＡＸＳ散乱。６ｍｇｍｌ^－１濃度での実験上の散乱曲線（ドット）およびモデルから計算された理論上の散乱（滑らかな曲線）。図は、４－１ＢＢ^Ｎ（ａ）および４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（ｂ）の正規化二体間距離分布関数Ｐ（ｒ）を示す。データはわかりやすくするために垂直方向にオフセットされている。ａ．ｕ．は任意単位。

【図10】４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの種特異性。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲは、プラスチックに固定化された精製マウス（ｍｏ）ＥＧＦＲ、カニクイザル（ｃｙ）ＥＧＦＲおよびｈｕＥＧＦＲ（ａ）に、ならびにｃｙ４－１ＢＢおよびｈｕ４－１ＢＢに、そしてｍｏ４－１ＢＢ（ｂ）にははるかに低い程度に、濃度依存的に結合した。データは１つの代表的な実験の平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。

【図11】細胞表面に発現したｈｕ４－１ＢＢおよびｈｕＥＧＦＲに対する４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの結合。４－１ＢＢ ＩｇＧを対照として用いた。Ｙ軸は細胞数を示し、Ｘ軸は蛍光強度を表し、対数目盛で表した。３つの独立した実験のうち、１つの代表的な実験を示す。

【図12】ＥＧＦＲ媒介シグナル伝達に対する４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの効果。（ａ）Ａ４３１細胞増殖の阻害。細胞を、指示用量の４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ、４－１ＢＢ ＩｇＧ、セツキシマブ（陽性対照）またはリツキシマブ（陰性対照）で処理した。処理７２時間後に、生存細胞を３連で測定し、未処理の対照に対してプロットした。結果は平均値±ＳＤ（ｎ＝３）で表す。有意性は、独立スチューデントｔ検定により評価した。（ｂ）ＥＧＦＲリン酸化の阻害。細胞を、ＥＧＦまたはビヒクルでの１０分間刺激の４時間前に、１００ｎＭの各抗体と共にプレインキュベートした。ＥＧＦＲのリン酸化状態は、ウェスタンブロッティングにより評価した。

【図13】対照抗体の共刺激活性。Ｊｕｒｋａｔｈｕ４－１ＢＢレポーター細胞を、１０倍漸増濃度のマウスＩｇＧ１アイソタイプ（ｍｏＩｇＧ１）、ヒトＩｇＧ４アイソタイプ（ｈｕＩｇＧ４）または抗ＣＥＡ ｓｃＦｖベースのトリマーボディ（ＣＥＡＮ）の存在下で、３Ｔ３または３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞（ａ）およびＣＨＯまたはＣＨＯ^{ｈｕＦｃγＲＩＩｂ}細胞（ｂ）と共培養し、３７℃で６時間後に発光を測定した。データは、未刺激のＪｕｒｋａｔ^{ｈｕ４－１ＢＢ}細胞から得られた値に対する誘導倍率として示す。３つの独立した実験のうち、１つの代表的な実験を示す（平均値±ＳＤ、ｎ＝３）。有意性は、独立スチューデントｔ検定により算出した。

【図14】ヒト初代細胞における共刺激試験。ヒトＰＢＭＣ（１．５×１０^５／ウェル）（ａ）または単離Ｔ細胞（１．５×１０^５／ウェル）（ｂ）を、照射された３Ｔ３細胞または３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞と、５：１のＥ：Ｔ比で共培養した。抗ｈｕＣＤ３ ｍＡｂ（０．０５μｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下で、ｍｏＩＧ１アイソタイプまたはＣＥＡＮトリマーボディを１０倍連続希釈で添加し、７２時間後にＩＦＮ－γ分泌を分析した。３つの独立した実験のうち、１つの代表的な実験を示す。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝３）である。有意性は、独立スチューデントｔ検定により算出した。

【図15】４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの血清安定性。プラスチック固定化ｈｕ４－１ＢＢ（ａ）またはｈｕＥＧＦＲ（ｂ）に対するＥＬＩＳＡを、ヒト血清中３７℃で異なる時間インキュベートした後に行った。各時点での平均値±ＳＤ（ｎ＝３）を示す。

【図16】ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミン（Ｄｆ）とのコンジュゲーション後の４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの構造的および機能的特性評価。（ａ）非コンジュゲート化４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲおよびｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミンとのコンジュゲーション後（Ｄｆ－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ）の還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥ。（ｂ）プラスチック固定化ｈｕ４－１ＢＢおよびｈｕＥＧＦＲに対するＥＬＩＳＡによる４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲおよびＤｆ－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの機能的特性評価。データは平均値±ＳＤ（ｎ＝２）で表す。

【図17】ＰＢＳまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディで処置したＥＧＦＲ＋ＮＳＣＬＣ ＰＤＸを有するｈｕＰＢＭＣ駆動型ヒト化ＮＳＧマウスにおけるＣＤ３＋およびＦｏｘＰ３＋ＴＩＬ免疫染色の代表的な画像。腫瘍は、図３Ｃに示した実験から終了時に採取した。

【発明を実施するための形態】

【0014】

本発明者らは、幅広いヒト腫瘍に対して抗腫瘍活性を示すとともに、免疫チェックポイントブロッカーとの相乗効果を示す、腫瘍特異的４－１ＢＢアゴニストトリマーボディを開発した。このアプローチは、Ｆｃ媒介有害反応を回避しながら、ほとんどのがん患者において応答を惹起する方法を提供し得る。

【0015】

さらに、本発明者らは、腫瘍特異的４－１ＢＢ－アゴニストトリマーボディのアゴニスト特性も研究した。一般に、抗４－１ＢＢ－アゴニストｍＡｂは、強アゴニストまたは弱アゴニストのいずれかに分類することができる。強アゴニスト（例えば、ウレルマブ）は、ＦｃγＲ媒介架橋なしにシグナル伝達活性化を誘導することができるが、弱アゴニスト（例えば、ウトミルマブ）は、４－ｌＢＢシグナル伝達を有意に誘導するためにＦｃγＲ媒介架橋を必要とする（Ｑｉら，Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ．，２０１９；１０：２１４１）。ＳＡＰ３．２８抗体由来の二価（ＩｇＧ）抗ｈｕ４－１ＢＢ抗体（国際特許出願ＷＯ２０１７０７７０８５）は、４－１ＢＢシグナル伝達を誘導するためにＦｃγＲＩＩｂの存在に依存しており、したがって、弱アゴニストとして分類することができる。本発明者らは、ｈｕ４－１ＢＢレポーティング細胞株を用いて、本発明による腫瘍特異的４－１ＢＢアゴニストトリマーボディが、追加の架橋なしに４－１ＢＢシグナル伝達活性を示すことを観察した。４－１ＢＢに特異的な二量体抗体を本発明のように三量体抗体に改変することによって、ＦｃγＲＩＩｂ発現細胞により架橋された抗体によって達成される活性を有意に上回るアゴニスト活性の増大がもたらされるという示唆は、当技術分野において存在しなかったので、これは明らかに予想外であった。

【0016】

従って、第１の態様において、本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体（本発明の第１のＴＰＣ）であって、
各単量体ポリペプチドが、
ａ）ＶＨドメインがＶＬドメインに対してＮ末端側にある、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、
ｂ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥＸＶ）およびそれらの機能的に等価な改変体からなる群から選択される、ホモ三量体化ドメイン、および
ｃ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
を含む、
三量体ポリペプチド複合体に関する。

【0017】

別の態様において、本発明は、３つの単量体ポリペプチドを含む三量体ポリペプチド複合体（第２のＴＰＣ）であって、
各単量体ポリペプチドが、
ａ）ＣＤＲが配列番号１または配列番号４２、配列番号２または配列番号４３、配列番号３または配列番号４４、配列番号４または配列番号４５、配列番号５または配列番号４６および配列番号６で表される配列、またはそれらの機能的に等価な改変体を含む、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、
ｂ）ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^ＸＶ）およびそれらの機能的に等価な改変体からなる群から選択される、ホモ三量体化ドメイン、および
ｃ）腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
を含む、
三量体ポリペプチド複合体に関する。

【0018】

本明細書で使用される場合、「三量体ポリペプチド複合体」または「ＴＰＣ」という用語は、非共有結合的に結合した３つの単量体ポリペプチドの複合体を指す。各単量体ポリペプチドは、互いに同一であっても異なっていてもよい。好ましい実施形態において、ＴＰＣはホモ三量体であり、これは複合体の３つの単量体またはサブユニットが同一であることを意味する。別の好ましい実施形態において、ＴＰＣはヘテロ三量体であり、これは複合体の３つの単量体またはサブユニットの少なくとも１つが他の２つと異なることを意味する。より好ましい実施形態において、ＴＰＣはホモ三量体である。

【0019】

抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）
本明細書で使用される場合、「抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）」という用語は、４－１ＢＢに特異的に結合し、その刺激を誘導することができる単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）を指す。

【0020】

ＣＤ１３７またはＴＮＦＲＳ９としても知られる「４－１ＢＢ」は、本明細書で使用される場合、活性化誘導共刺激分子に関する。４－１ＢＢには、確認されたリガンドが１つしかなく［４－１ＢＢ－リガンド（４－１ＢＢＬ）、ＴＮＦＳＦ９］、これは、マクロファージ、活性化Ｂ細胞、および樹状細胞に発現する。４－１ＢＢがそのリガンドまたはアゴニスト抗体と結合すると、Ｔ細胞増殖、サイトカイン産生、および細胞溶解エフェクター機能を促進し、リンパ球をプログラム細胞死から保護する。さらに、ＮＫ細胞上の４－１ＢＢの結合により、サイトカイン放出（ＩＦＮγを含む）および抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）が増強される。

【0021】

本明細書で使用される場合、「単鎖可変フラグメント」という用語は、適切なペプチドリンカーにより結合された可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含み、遺伝的に融合された単鎖分子として形成された、遺伝子工学によって改変された分子を指す。上記フラグメントは、例えば、重鎖相補性決定領域（ＨＣＤＲ）１、２および３、軽鎖相補性決定領域（ＬＣＤＲ）１、２および３、重鎖可変領域（ＶＨ）、または軽鎖可変領域（ＶＬ）などの、重鎖および／または軽鎖抗原結合部位を保持する免疫グロブリン分子の一部である。抗体フラグメントには、周知のＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｄおよびＦｖフラグメントのほか、１つのＶＨドメインまたは１つのＶＬドメインからなるシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）が含まれる。ＶＨドメインとＶＬドメインは合成リンカーを介して連結され得、ＶＨ／ＶＬドメインが分子内で対合するか、またはＶＨドメインとＶＬドメインが別々の単鎖抗体構築物によって発現される場合には分子間で対合して、一価の抗原結合部位を形成する、さまざまなタイプの単鎖抗体設計が形成され得る。

【0022】

「特異的結合」または「特異的に結合する」または「結合する」とは、他の抗原よりも高い親和性で４－１ＢＢまたは４－１ＢＢ内のエピトープに結合する分子を指す。典型的には、アゴニストは、結合の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）が約１×１０^－８Ｍ以下、例えば約１×１０^－９Ｍ以下、約１×１０^－１０Ｍ以下、約１×１０^－１１Ｍ以下、または約１×１０^－１２Ｍ以下である場合に、典型的には、非特異的抗原（例えば、ＢＳＡ、カゼイン）への結合のＫ_Ｄよりも少なくとも１００倍小さいＫ_Ｄで、「特異的に結合する」。Ｋ_Ｄは、標準手順を用いて測定され得る。しかしながら、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントは、他の関連抗原、例えばヒトまたはサル、例えばＭａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（カニクイザル、ｃｙｎｏ）、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ（チンパンジー、ｃｈｉｍｐ）またはＣａｌｌｉｔｈｒｉｘ ｊａｃｃｈｕｓ（コモンマーモセット、マーモセット）などの他の種由来の同じ抗原（ホモログ）に対して交差反応性を有し得る。単一特異性抗体が１つの抗原または１つのエピトープにのみ特異的に結合するのに対し、二重特異性抗体は２つの異なる抗原または２つの異なるエピトープに特異的に結合する。

【0023】

本発明のＴＰＣの一部を形成する抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントは、４－１ＢＢの天然リガンドによって誘導される、抗体が結合する４－１ＢＢの少なくとも１つの生物活性を誘導する能力を有する。例示的なアゴニスト活性としては、ＮＦ－κＢ、ＡＫＴ、ｐ３８ＭＡＰＫ、およびＥＲＫ経路を活性化するためのＴＲＡＦ１およびＴＲＡＦ２を介したシグナル伝達誘導が挙げられ、これはサバイビン、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－ＸＬ、およびＢｆｌ－１をコードする生存遺伝子の発現を誘導し、アポトーシス促進性Ｂｉｍの発現を減少させる。４－１ＢＢは、Ｔ細胞の増殖、エフェクター機能の獲得、生存、およびＴ細胞記憶の発達に関与している。抗４－１ＢＢ抗体がアゴニストであるか否かを決定するための適切なアッセイは、実施例２に示されており、ＥＧＦＲを標的とする抗体がＴ細胞共刺激を増強する能力を決定することからなる。

【0024】

当業者であれば、単鎖抗体フラグメントが４－１ＢＢ特異的であるか否かを、当技術分野で公知のいくつかのアッセイによって知ることができる。当業者であれば、抗４－１ＢＢ特異的単鎖抗体フラグメントがアゴニストであるか否かを、当技術分野で公知のいくつかのアッセイによって知ることができる。

【0025】

好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６で表される配列を含むＣＤＲ配列またはそれらの機能的に等価な改変体によって定義される。

【0026】

「機能的に等価な改変体」という用語は、本明細書に開示されるＣＤＲの機能的に等価な改変体に適用可能な等価であるように、本発明のホモ三量体化ドメインに関連して以下に定義される。

【0027】

好ましい実施形態において、ＣＤＲは、配列番号１または配列番号４２、配列番号２または配列番号４３、配列番号３または配列番号４４、配列番号４または配列番号４５、配列番号５または配列番号４６、および／または配列番号６の配列と、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0028】

「相補性決定領域（ＣＤＲ）」とは、抗体における「抗原結合部位」である。ＣＤＲは、種々の用語を用いて定義され得る：（ｉ）相補性決定領域（ＣＤＲ）は、ＶＨ内に３つ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３）およびＶＬ内に３つ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３）存在し、配列多様性に基づく（Ｗｕら（１９７０）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １３２：２１１－５０）（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）。（ｉｉ）「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」は、ＶＨ内に３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）およびＶＬ内に３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）存在し、ＣｈｏｔｈｉａとＬｅｓｋ（Ｃｈｏｔｈｉａら（１９８７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－１７）によって定義されたとおり、構造において超可変性である抗体可変ドメインの領域を指す。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）データベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ＿ｉｍｇｔ＿ｏｒｇ）は、抗原結合部位の標準的な付番および定義を提供している。ＣＤＲ、ＨＶ、およびＩＭＧＴの記述間の対応は、（Ｌｅｆｒａｎｃら（２００３）Ｄｅｖ Ｃｏｍｐ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２７：５５－７７）に記載されている。本明細書で使用される「ＣＤＲ」、「ＨＣＤＲ１」、「ＨＣＤＲ２」、「ＨＣＤＲ３」、「ＬＣＤＲ１」、「ＬＣＤＲ２」および「ＬＣＤＲ３」という用語には、本明細書に特に明記されていない限り、上記のＫａｂａｔ、ＣｈｏｔｈｉａまたはＩＭＧＴのいずれかの方法によって定義されたＣＤＲが含まれる。

【0029】

本発明の抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）は、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４の配列を示すフレームワーク領域（ＦＲ）またはそれらの機能的に等価な改変体によって代替的に定義される。

【0030】

好ましい実施形態において、ＦＲには、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および／または配列番号１４の配列と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列が含まれる。

【0031】

本明細書で使用される「フレームワーク領域」は、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場として機能する、ＶＬまたはＶＨのいずれかの可変ドメインの一部に関する。本質的には、ＣＤＲのない可変ドメインである。

【0032】

好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニストｓｃＦｖは、ヒト化されているか、またはヒト化ＶＬドメインおよび／または部分ヒト化ＶＨドメインを提示（ｄｉｓｐｌａｙ）する。特定の実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニストｓｃＦｖは、配列番号１９で表される配列を含む。

【0033】

「ヒト化された抗体、単鎖抗体フラグメント、またはＶＬ、ＶＨドメイン」とは、抗原結合部位が非ヒト種由来であり、可変領域フレームワークがヒト免疫グロブリン配列由来である、抗体、単鎖抗体フラグメント、またはＶＬまたはＶＨドメインを指す。ヒト化抗体は、フレームワークが発現ヒト免疫グロブリンまたはヒト免疫グロブリン生殖系列遺伝子配列の正確なコピーではない場合があるため、フレームワークに置換を含む場合がある。

【0034】

本発明によれば、抗体または単鎖抗体フラグメントは、ヒト個体における免疫原性を低減するために「ヒト化」することができる。ヒト化抗体は、モノクローナル抗体療法の安全性および有効性を向上させる。ヒト化の一般的な方法の一つは、任意の適切な動物（例えば、マウス、ラット、ハムスター）においてモノクローナル抗体を産生させ、その定常領域をヒト定常領域に置き換えるものであり、この方法で操作された抗体は「キメラ」と呼ばれる。別の一般的な方法は、非ヒトＶ－ＦＲをヒトＶ－ＦＲに置き換える「ＣＤＲ移植」である。ＣＤＲ移植法では、ＣＤＲ領域を除くすべての残基がヒト由来である。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体はヒト化されている。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体はキメラである。特定の実施形態において、本明細書に記載の抗体はＣＤＲ移植されている。ヒト化は、抗体の全体的な親和性を低下させるか、ほとんど影響しない場合もあれば、ヒト化後にその標的に対する親和性を向上させる場合もある。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を１０％高める。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を２５％高める。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を３５％高める。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を５０％高める。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を６０％高める。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を７５％高める。特定の実施形態において、ヒト化は、抗体に対する親和性を１００％高める。親和性は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて適切に測定される。

【0035】

ホモ三量体化ドメイン
本明細書で使用される場合、用語「ホモ三量体化ドメイン」とは、単量体間の非共有結合的三量体化を担う領域を指す。本発明のＴＰＣのホモ三量体化ドメインは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}）、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメイン（ＴＩＥ^ＸＶ）およびそれらの機能的に等価な改変体からなる群から選択される。

【0036】

本明細書に開示される場合、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸＶ型コラーゲンの単量体は、三量体化特性が、天然コラーゲン分子の三量体化特性と比較して維持されている限り、互いに同一であっても異なっていてもよい。特定の実施形態において、単量体の少なくとも１つは、他の２つとは異なる。好ましい実施形態において、３つの単量体は互いに同一であり、好ましくは、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸＶ型コラーゲンの３つの単量体である。

【0037】

一実施形態において、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメインは、配列番号１５からなるかまたは配列番号１５を含む。別の実施形態において、ＸＶ型コラーゲンホモ三量体化ドメインは、配列番号１６からなるかまたは配列番号１６を含む。別の実施形態において、ＸＶＩＩＩ型コラーゲンホモ三量体化ドメインは、配列番号１７からなるかまたは配列番号１７を含む。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、配列番号１８を含むヒト化ホモ三量体化ドメインＸＶＩＩＩ型コラーゲンである。

【0038】

本明細書中で使用される「それらの機能的に等価な改変体」とは、天然に存在するＸＶＩＩＩ型コラーゲンまたはＸＶ型コラーゲンのＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶの機能的に等価な改変体、すなわち、天然のＸＶＩＩＩ型コラーゲン分子またはＸＶ型コラーゲン分子と比較して、三量体化特性に実質的な程度にまで悪影響を及ぼすことなく、アミノ酸配列に改変を加えた改変体を包含することを意図する。上記改変には、１個以上のアミノ酸の他のアミノ酸への保存的（または非保存的）置換、１個以上のアミノ酸の挿入および／または欠失が含まれるが、天然のＸＶＩＩＩ型コラーゲンタンパク質またはＸＶ型コラーゲンタンパク質の三量体化特性は、実質的に維持される、すなわち、改変体は、生理的条件下で、同じ配列を有する他のペプチドと三量体を形成する能力（素質）を維持するものとする。

【0039】

好ましくは、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶの改変体は、（ｉ）１つ以上のアミノ酸残基が、保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基（好ましくは保存アミノ酸残基）で置換され、このような置換アミノ酸が、遺伝コードによってコードされていてもいなくてもよい、ポリペプチド、（ｉｉ）１つ以上の修飾アミノ酸残基、例えば置換基結合によって修飾された残基が存在する、ポリペプチド、（ｉｉｉ）類似ｍＲＮＡの選択的プロセシングによって生じるポリペプチド、および／または（ｉｖ）ポリペプチドフラグメントである。フラグメントには、元の配列のタンパク質分解切断（多部位タンパク質分解を含む）によって生成されたポリペプチドが含まれる。改変体は、翻訳後に修飾されたものであっても化学的に修飾されたものであってもよい。このような改変体は、当業者には明らかなはずである。

【0040】

当業者であれば、本発明のポリペプチドをコードする２つのヌクレオチド配列の対応する配列同一性を決定するために、コドン縮重、保存的アミノ酸置換、およびリーディングフレームの位置決定を考慮することによって、ヌクレオチド配列の同一性の値を適切に調整し得ることを認識するであろう。

【0041】

本発明の文脈において、「保存的アミノ酸変化」および「保存的アミノ酸置換」は、本発明において同義語として用いられる。「保存的アミノ酸置換」とは、類似の側鎖を有する残基の交換可能性を指し、タンパク質の機能を変化させないサイレント変化をもたらす、天然アミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸の、類似の側鎖を有する別のアミノ酸（複数可）での置換を意味する。天然アミノ酸配列内のアミノ酸の保存置換基は、天然に存在するアミノ酸が属する群の他のメンバーから選択され得る。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンが挙げられ；脂肪族－ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群としては、セリンおよびスレオニンが挙げられ；アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群としては、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられ；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群としては、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが挙げられ；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群としては、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられ；芳香族側鎖を有するアミノ酸の群としては、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンが挙げられ；塩基性側鎖を有するアミノ酸の群としては、リジン、アルギニン、およびヒスチジンが挙げられ；そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群としては、システインおよびメチオニンが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、好ましい保存的アミノ酸置換は、バリン－ロイシン、バリン－イソロイシン、フェニルアラニン－チロシン、リジン－アルギニン、アラニン－バリン、アスパラギン酸－グルタミン酸、およびアスパラギン－グルタミンである。従って、本発明は、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶの機能的に等価な改変体であって、１つ以上の保存的アミノ酸置換の結果として得られる配列を有する、１つ以上のアミノ酸が異なるアミノ酸配列を有する改変体を指す。置換が、非修飾配列の機能と比較してその機能を変化させない修飾ポリペプチドにおけるサイレント変化をもたらすように、ポリペプチド配列中の１つ以上のアミノ酸を、類似の電荷および極性を有する少なくとも１つの他のアミノ酸で置換することができることは、当技術分野において周知である。
本発明は、上記のさらに提供されたポリペプチド配列が、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶと同一または類似または同等の機能を有する限り、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶによって与えられる配列と比較して、保存置換または非保存置換のいずれかの結果として、および／または配列の挿入または欠失のいずれかの結果として、１つ以上のアミノ酸が異なる任意のポリペプチド配列を指す。

【0042】

「コドン縮重」とは、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列に影響を与えることなくヌクレオチド配列の変動を可能にする、遺伝コードにおける相違を意味する。当業者であれば、所与のアミノ酸残基を特定するためにヌクレオチドコドンを使用する際に、特定の宿主細胞によって示されるコドンバイアスを十分承知している。したがって、宿主細胞における遺伝子の異所性発現のためには、そのコドン使用頻度がコドン使用頻度表に記載の宿主細胞のコドン使用頻度に近くなるように遺伝子を設計または合成することが望ましい。

【0043】

２つ以上のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列の文脈における「同一性」、「同一」または「同一性パーセント」という用語は、いかなる保存的アミノ酸置換も配列同一性の一部とみなさずに、最大一致となるように比較およびアライメント（必要であればギャップを導入して）を行った場合に、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチド残基の指定のパーセンテージを有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを使用して、または目視検査によって測定され得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアライメントを得るために使用することができるさまざまなアルゴリズムおよびソフトウェアが、当技術分野において公知である。

【0044】

配列同一性のパーセンテージは、２つの最適にアライメントされた配列を、比較ウィンドウにわたって比較することにより決定され得る。アライメントされた配列は、ポリヌクレオチド配列であってもポリペプチド配列であってもよい。２つの配列の最適なアライメントのために、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列の一部は、参照配列（挿入または欠失を含まない）と比較して、挿入または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。配列同一性のパーセンテージは、比較される両方の配列中に同一のヌクレオチド残基または同一のアミノ酸残基が出現する位置の数を決定して、マッチした位置の数を求め、次いで、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを求めることによって算出される。２つのポリペプチド配列間または２つのポリヌクレオチド配列間の配列同一性は、例えば、対比較のためのデフォルトパラメータのセット（アミノ酸配列比較用：ギャップ生成ペナルティ＝８、ギャップ伸長ペナルティ＝２；ヌクレオチド配列比較用：ギャップ生成ペナルティ＝５０；ギャップ伸長ペナルティ＝３）を使用して、ＮｅｅｄｌｅｍａｎとＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３，１９７０）の方法に基づくＧｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．製のＷＩＳＣＯＮＳＩＮ ＰＡＣＫＡＧＥバージョン１０．０－ＵＮＩＸにおけるギャッププログラムを使用することによって、あるいはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス（ＨｅｎｉｋｏｆｆとＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１０９１５－１０９１９，１９９２）および対比較のためのデフォルトパラメータのセット（ギャップ生成コスト＝１１、ギャップ伸長コスト＝１）を使用して、ＢＬＡＳＴ２．２．１ソフトウェアスイート中のＴＢＬＡＳＴＮプログラムを使用することによって決定され得る。

【0045】

ポリペプチド間の配列同一性のパーセンテージおよびそれらの対応する機能は、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＳｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎを含む、例えば、クエリ配列をタンパク質データベースと比較するために利用可能なさまざまな相同性に基づく検索アルゴリズムを使用して、決定され得る。ＢＬＡＳＴＸおよびＢＬＡＳＴＰアルゴリズムは、タンパク質の機能情報を提供するために使用され得る。機能割り当ての信頼性を評価するために、多くの値が調べられる。有用な測定値としては、「Ｅ値」（「ｈｉｔ＿ｐ」とも表記される）、「同一性パーセント」、「クエリカバレッジパーセント」、および「ヒットカバレッジパーセント」が挙げられる。ＢＬＡＳＴでは、Ｅ値（すなわち期待値）は、データベース検索において偶然に生じると予想される、生のアライメントスコア（Ｓ）と同等以上のスコアを有する異なるアライメントの数を表す。したがって、Ｅ値が低いほど、より有意なマッチとなる。データベースのサイズは、Ｅ値計算における要素であるため、ＧｅｎＢａｎｋなどの公開データベースに対してＢＬＡＳＴ検索を行うことで得られるＥ値は、一般に、いかなるクエリ／エントリのマッチについても、時間の経過とともに増加している。したがって、ポリペプチド機能予測の信頼性に関する基準を設定する際に、「高い」ＢＬＡＳＴＸマッチは、トップＢＬＡＳＴＸヒットのＥ値が１Ｅ－３０未満であるとみなされ；中程度のＢＬＡＳＴＸは、Ｅ値が１Ｅ－３０～１Ｅ－８であるとみなされ；そして低いＢＬＡＳＴＸは、Ｅ値が１Ｅ－８より高いとみなされる。同一性パーセントとは、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによってアライメントされた配列部分の長手方向に沿って存在する、完全にマッチしたアミノ酸残基のパーセンテージを指す。ポリペプチド機能予測の信頼性に関する基準を設定する際に、「高い」ＢＬＡＳＴマッチは、トップＢＬＡＳＴヒットに対して少なくとも７０％の同一性パーセントを有するとみなされ；中程度の同一性パーセントの値は、３５％～７０％であるとみなされ；低い同一性パーセントは、３５％未満であるとみなされる。タンパク質の機能割り当てにおいて特に興味深いのは、Ｅ値、同一性パーセント、クエリカバレッジおよびヒットカバレッジの組み合わせの使用である。クエリカバレッジとは、ＢＬＡＳＴアライメントで表示されるクエリ配列のパーセントを意味し、ヒットカバレッジとは、ＢＬＡＳＴアライメントで表示されるデータベースエントリのパーセントを意味する。本発明によって機能的に包含されるポリペプチドを定義する目的で、ポリペプチドの機能は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７または配列番号１８などのタンパク質ホモログの機能から推定され、本発明のポリペプチドは、（１）ｈｉｔ＿ｐ＜１ｅ－３０または同一性％＞３５％かつクエリカバレッジ＞５０％かつヒットカバレッジ＞５０％、あるいは（２）ｈｉｔ＿ｐ＜１ｅ－８かつクエリカバレッジ＞７０％かつヒットカバレッジ＞７０％のいずれかとなるポリペプチドである。

【0046】

ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}の機能的に等価な改変体には、配列番号１５の配列と、配列番号１７の配列と、または配列番号１８の配列と、少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列も含まれる。

【0047】

ＴＩＥ^ＸＶの機能的に等価な改変体には、配列番号１６の配列と少なくとも５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列も含まれる。

【0048】

機能的に等価な改変体が三量体を形成する能力は、当業者に公知の従来の方法によって決定され得る。例えば、簡単な例として、機能的に等価な改変体が三量体を形成する能力は、標準的なクロマトグラフィー技術を用いて決定され得る。したがって、評価対象の改変体を適切な三量体化条件下に置き、最終的に形成される複合体（三量体）が変化しないように、非変性条件下で複合体を標準的なクロマトグラフィーアッセイにかける。改変体が適切に三量体化すると、複合体の分子サイズは改変体１分子の分子サイズよりも３倍重くなる。複合体の分子サイズは、分析遠心分離、質量分析、サイズ排除クロマトグラフィー、沈降速度などの標準的な方法を用いて明らかにすることができる。

【0049】

ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶは、任意の被験体、好ましくは、マウス、ラット、サル、ヒトなどの哺乳類に由来し得る。好ましい実施形態において、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}はヒトに由来する。別の好ましい実施形態において、ＴＩＥ^ＸＶはヒトに由来する。別の好ましい実施形態において、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}は、マウスＸＶＩＩＩ型コラーゲンに由来する。別の好ましい実施形態において、ＴＩＥ^ＸＶは、マウスＸＶ型コラーゲンに由来する。より好ましい実施形態において、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}は、マウスＸＶＩＩＩ型コラーゲンの小さなホモ三量体化ドメインである。

【0050】

ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶは、他の三量体ポリペプチド複合体（ＴＰＣ）の中でも、機能的に活性な単一特異性および二重特異性の三価Ｎ末端ＴＰＣ、三価Ｃ末端ＴＰＣ、単一特異性および二重特異性の三価Ｎ／Ｃ末端ＴＰＣ；ならびに単一特異性および二重特異性の六価単鎖Ｎ／Ｃ末端ＴＰＣを作製するために使用され得る。さらに、リガンド結合ドメインとしてのシングルドメイン（Ｖ_ＨＨ）抗体を有するか、または成長因子（例えば、ＶＥＧＦ）を有する、機能的に活性な単一特異性Ｃ末端ＴＰＣの作製にも使用され得る。したがって、特異性と価数の異なる組み合わせを有する、単一特異性または多重特異性（例えば、二重、三重、四重特異性など）の多価（例えば、三価、四価、五価または六価）の組換え分子が容易に作製され得る。特定の実施形態において、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶは、単一特異性ＴＣＰを作製するために使用される。好ましい実施形態において、ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}および／またはＴＩＥ^ＸＶは、単一特異性または二重特異性ＴＣＰを作製するために使用される。

【0051】

腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域
本発明によるＴＰＣは、単一特異性であり得る、すなわち、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域を含むが、腫瘍細胞の表面に存在する腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な１つ以上のポリペプチド領域も含み得る。この結果、４－１ＢＢに結合してアゴニスト作用を発揮する領域および腫瘍関連抗原に結合するポリペプチド領域を含む、二重特異性抗体が得られる。腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域を含む、ＴＰＣ内の単量体の数は、１つ、２つまたは３つのいずれでもよいことが理解されよう。好ましい実施形態において、単量体ポリペプチドの１つは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域を含む。別の好ましい実施形態において、単量体ポリペプチドのうちの２つは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域を含む。別の好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域を含む。

【0052】

「特異的結合」という用語は、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントのアゴニストに関して上記で詳細に定義されており、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に等しく適用される。典型的には、抗体はおよそ１０^－７Ｍ未満、例えばおよそ１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ未満あるいはさらに低い親和性（ＫＤ）で結合する。用語「Ｋ_Ｄ」または「Ｋｄ」は、特定の抗体－抗原相互作用の解離平衡定数を指す。典型的には、本発明の抗体は、例えばＢＩＡＣＯＲＥ装置の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術を使用して決定されるように、およそ１０^－７Ｍ未満、例えばおよそ１０^－８Ｍ未満、１０^－９Ｍ未満または１０^－１０Ｍ未満あるいはさらに低い解離平衡定数（Ｋ_Ｄ）で抗原に結合する。

【0053】

本明細書で使用される場合、「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」という用語は、患者のがんの状態または種類を、適切な免疫療法製品またはレジメンと適合させることができる、任意の抗原を意味する。ＴＡＡは、がん細胞自体が発現している場合もあれば、腫瘍に関連する新生血管または他の間質など、腫瘍の非がん性成分と関連している場合もある。腫瘍細胞によって発現され、免疫エフェクター機構の標的として機能することが可能な腫瘍抗原の中には、タンパク質、一般的には糖タンパク質、ペプチド、炭水化物、および糖脂質が含まれる。腫瘍関連抗原の非限定的な例としては、ＡＦＰ（アルファ（α）－フェトタンパク質）、ＡＩＭ－２（黒色腫には存在しないインターフェロン誘導性タンパク質２）、ＡＲＴ－４（Ｔ細胞によって認識される腺癌抗原４）、ＢＡＧＥ（Ｂ抗原）、ＢＣＭＡ、ＣＡＭＥＬ（黒色腫上のＣＴＬ認識抗原）、Ｃ１６ａ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ３、ＣＤ４０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＶＥＧＦ、ＩＬ－６、ＭＵＣ－１、エンドグリン、ＤＬＬ、Ｂ７－Ｈ３、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＤＡＭ（分化抗原黒色腫）、Ｅｐ－ＣＡＭ（上皮細胞接着分子）、ＥｒＢ３、ＦＡＰ、ｇｐＡ３３、Ｈｅｒ２、ＩＧＦ－１Ｒ、ＣＤ－５、ＦＡＰ、ＭＡＧＥ（黒色腫抗原）、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ（Ｔ細胞によって認識される黒色腫抗原－１／黒色腫抗原Ａ）、ＭＣ１Ｒ（メラノコルチン１受容体）、ＭＥＴ、ＭＵＣ－１、ＮＹ－ＥＳＯ－１（ニューヨーク食道扁平上皮癌１（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ｅｓｏｐｈａｇｅｏｕｓ １））、ＯＡ１（眼白子症１型タンパク質）、Ｐ－カシェリン、ＰＤ－Ｌ１、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、ＳＡＲＴ－１、－２、－３（扁平上皮抗原拒絶腫瘍１、２、３）、サバイビン－２Ｂ（イントロン２保持サバイビング（ｓｕｒｖｉｖｉｎｇ））、ＴＲＰ（チロシナーゼ関連タンパク質）が挙げられる。抗原は、腫瘍細胞の表面で発現されてもよく、または分泌されてもよい。好ましい実施形態において、抗原は細胞表面抗原である。潜在的な腫瘍抗原に対する患者の血清抗体の存在は、当業者であれば、例えばＳＥＲＥＸ（組換え発現クローニングによる抗原の血清学的同定）を用いて判定することができ、ＳＥＲＥＸでは、腫瘍細胞由来のｃＤＮＡライブラリーと血清を反応させることにより、標的抗原が同定される。

【0054】

一実施形態において、ＴＡＡはＥＧＦＲである。

【0055】

別の実施形態において、ＴＡＡはＣＥＡである。

【0056】

一実施形態において、ＴＡＡに特異的に結合可能な領域は、上記ＴＡＡに対するアゴニスト能を有さない。

【0057】

一実施形態において、ＴＡＡに特異的に結合可能な領域は、抗体であり、より好ましくは、「単鎖抗体、ナノボディまたは「非免疫グロブリン剤」である。この用語は、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントの文脈において上記で定義されており、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域にも同様に適用可能である。

【0058】

好ましい実施形態において、ＴＡＡに特異的に結合可能なポリペプチド領域は、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端またはＣ末端に位置する。好ましい実施形態において、ＴＡＡは、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する。

【0059】

好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントに特異的に結合可能な分子が、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端に位置する場合には、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な分子は、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する。別の好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域が、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に位置する場合には、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントは、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端に位置する。

【0060】

好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）である。本明細書で使用される場合、用語「上皮成長因子受容体」または「ＥＧＦＲ」は、細胞外タンパク質リガンドの上皮成長因子ファミリー（ＥＧＦファミリー）のメンバーに対する受容体である、膜貫通タンパク質である。これは、シグナル伝達経路ならびに細胞の成長および生存を調節し、ＥＧＦ分子に対する親和性を示す、チロシンキナーゼを指す。受容体のＥｒｂＢファミリーは、４つの密接に関連するサブタイプ：ＥｒｂＢ１（上皮成長因子受容体［ＥＧＦＲ］）、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）、ならびにそれらの改変体（例えば、Ｈｕｍｐｈｒｅｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９０，８７：４２０７－４２１１）のような欠失変異体ＥＧＦＲ）からなる。ＥＧＦＲに結合することが可能な分子の非限定的な例としては、天然リガンドの上皮成長因子（ＥＧＦ）、ベタセルリン（ＢＴＣ）、ヘパリン結合ＥＧＦ様成長因子（ＨＢ－ＥＧＦ）、アンフィレギュリン（ＡＲ）、エピレギュリン（ＥＰＲ）、トランスフォーミング増殖因子－α（ＴＧＦ－α）、およびエピジェン（ＥＰＧ）が挙げられる。一実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合可能な分子は、アゴニスト能を有さない。好ましい実施形態において、ＥＧＦＲはヒトである。

【0061】

好ましい実施形態において、ＥＧＦＲに特異的に結合可能なポリペプチド領域は、抗体である。

【0062】

「抗体」は、広義の意味であり、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を含むモノクローナル抗体、抗体フラグメント、二重特異性また多重特異性抗体、二量体、三量体または多量体抗体、単鎖抗体、シングルドメイン抗体、抗体ミメティック、および必要な特異性の抗原結合部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾構造を含む、免疫グロブリン分子を含む。「全長抗体分子」は、ジスルフィド結合によって相互接続されている２つの重鎖（ＨＣ）および２つの軽鎖（ＬＣ）、ならびにそれらの多量体（例えば、ＩｇＭ）で構成される。各重鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）および重鎖定常領域（ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインで構成される）で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ＶＬ）および軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成される。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）が散在している、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシル末端へ以下の順序で配列された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲセグメントで構成される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３およびＦＲ４。免疫グロブリンは、重鎖定常領域のアミノ酸配列によって、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの５つの主要クラスに割り当てられ得る。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４にさらに細分類される。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、それらの定常領域のアミノ酸配列に基づいて、２つの明確に異なる型、すなわちカッパ（κ）およびラムダ（λ）のいずれかに割り当てられ得る。

【0063】

好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ｓｃＦｖ、ナノボディまたは抗体ミメティックである。

【0064】

本明細書で使用される場合、「単鎖抗体」という用語は、遺伝的に融合された単鎖分子として形成された、適切なペプチドリンカーによって結合された可変軽鎖領域および可変重鎖領域を含む、遺伝子工学によって改変された分子を指す。

【0065】

本明細書で使用される場合、「ナノボディ」という用語は、単一の単量体の可変抗体ドメインからなる抗体フラグメントである、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）を指す。抗体全体と同様に、特異的抗原に選択的に結合することが可能である。

【0066】

本明細書で使用される場合、「抗体ミメティック」という用語は、抗体と同様に、抗原に特異的に結合することができるが、必ずしも抗体と構造的に関連していない、任意の化合物を指す。「ミメティック」の化合物には、機能活性に必要な化合物の化学構造が、その化合物の立体構造を模倣する他の化学構造で置き換えられた化合物が含まれる。ミメティックの例としては、ペプチド主鎖が１つ以上のベンゾジアゼピン分子で置換されたペプチド性化合物（例えば、Ｊａｍｅｓ，Ｇ．Ｌ．ら（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：１９３７－１９４２を参照）、または、鎖伸長またはヘテロ原子組み込みを含む、天然のペプチド主鎖のアミド結合アイソスターおよび／または修飾を用いてペプチド二次構造を模倣するオリゴマーが挙げられ；その例としては、アザペプチド、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、β－ペプチド、γ－ペプチド、オリゴ（フェニレンエチニレン）、ビニル性スルホノペプチド、ポリ－Ｎ－置換グリシン（ペプトイド）などが挙げられる。ペプチドミメティック化合物を調製するための方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃ．Ａ．Ｒａｍｓｄｅｎ Ｇｄ．，１７．２章，Ｆ．Ｃｈｏｐｌｉｎ Ｐｅｒｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９２）に詳述されている。

【0067】

別の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ抗体は、ナノボディである。

【0068】

別の好ましい実施形態において、ＥＧＦＲ抗体は、抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）である。より好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）ヌクレオチド配列は、配列番号２０で表される配列を含む。別の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ（ＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１（配列番号２５）、ＣＤＲ２（配列番号２６）、ＣＤＲ３（配列番号２７）である。別の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）ＦＲ配列は、ＦＲ１（配列番号２１）、ＦＲ２（配列番号２２）、ＦＲ３（配列番号２３）、ＦＲ４（配列番号２４）である。

【0069】

別の好ましい実施形態において、ＥＧＦＲ抗体は、ヒト化抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）である。より好ましい実施形態において、ヒト化抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）は、配列番号２８で表される配列を含む。別の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）ＣＤＲ配列は、ＣＤＲ１（配列番号３３）、ＣＤＲ２（配列番号３４）、ＣＤＲ３（配列番号３５）である。別の好ましい実施形態において、抗ＥＧＦＲ（ｈｕＥＧＦＲ）シングルドメイン抗体（ＶＨＨ）ＦＲ配列は、ＦＲ１（配列番号２９）、ＦＲ２（配列番号３０）、ＦＲ３（配列番号３１）、ＦＲ４（配列番号３２）である。

【0070】

別の好ましい実施形態において、腫瘍関連抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）である。本明細書で使用される場合、ＣＥＡＣＡＭ１、ＢＧＰ１、ＢＧＰＩ、ＣＤ６６ａ、ＢＧＰとしても知られる「癌胎児性抗原」または「ＣＥＡ」という用語は、癌胎児性抗原関連細胞接着分子１を指す。上記タンパク質をコードするヒト遺伝子は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースにアクセッション番号ＥＮＳＧ００００００７９３８５で示されている。

【0071】

ホモ三量体化ドメイン、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントおよび腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域の間のリンカー領域。
本発明によるＴＰＣを形成する単量体ポリペプチドの異なるエレメントは、互いに直接連結されていてもよく、アミノ酸スペーサーまたはリンカーを介して接続されていてもよい。

【0072】

一実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、ホモ三量体化ドメイン、および／または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、直接接続されている。別の実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ホモ三量体化ドメインは、直接接続されている。別の好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、直接接続されている。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインと、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、直接接続されている。別の好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ホモ三量化ドメインと、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、直接接続されている。

【0073】

別の実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）、ホモ三量体化ドメイン、および／または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、アミノ酸リンカーまたはスペーサーによって接続されている。別の実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、ホモ三量体化ドメインは、アミノ酸リンカーまたはスペーサーによって接続されている。別の好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）と、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、アミノ酸リンカーまたはスペーサーによって接続されている。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインと、腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域は、アミノ酸リンカーまたはスペーサーによって接続されている。

【0074】

別の実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）のアゴニストは、アミノ酸リンカーを介してホモ三量化ドメインに接続され、ホモ三量化ドメインは、アミノ酸スペーサーによって腫瘍関連抗原に特異的に結合可能なポリペプチド領域に接続されている。

【0075】

本明細書に開示される場合、スペーサーは、適切な長さおよび特徴のペプチドを接続または連結する挿入物である。一般に、上記スペーサーは、上記ドメイン間のヒンジ領域として機能し、個々のドメインの三次元形態を維持しつつ、それらが互いに独立して動くことを可能にする。この意味で、好ましいスペーサーは、この動きを可能にする構造的延性または柔軟性を特徴とするヒンジ領域であろう。スペーサーの長さは変えることができ、典型的には、スペーサーのアミノ酸数は、１００個以下のアミノ酸、好ましくは５０個以下のアミノ酸、より好ましくは４０個以下のアミノ酸、さらにより好ましくは３０個以下のアミノ酸、さらにいっそう好ましくは２０個以下のアミノ酸である。

【0076】

あるいは、適切なスペーサーは、マウスＩｇＧ３の上部ヒンジ領域の１０アミノ酸残基の配列に基づくことができ、これは、コイルドコイルによる二量体化抗体の生成に使用されており（Ｐａｃｋ Ｐ．およびＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．，１９９２，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３１：１５７９－１５８４）、本発明によるスペーサーペプチドとして有用であり得る。これはまた、ヒトＩｇＧ３または他のヒトＩｇサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４、ＩｇＭおよびＩｇＡ）の上部ヒンジ領域の対応する配列であり得る。ヒトＩｇの配列は、ヒトにおいて免疫原性であるとは予想されない。本発明に使用することができる追加のスペーサーとしては、アミノ酸配列ＧＡＰ、ＡＡＡのペプチドが挙げられる。

【0077】

特定の実施形態において、上記スペーサーは、構造的柔軟性を有するペプチド（すなわち、柔軟な連結ペプチドまたは「フレキシブルリンカー」）であり、グリシン、セリン、アラニンおよびトレオニンからなる群から選択される２つ以上のアミノ酸を含む。別の特定の実施形態において、スペーサーは、アミノ酸残基、特に、ＧｌｙおよびＳｅｒの繰り返し、またはアミノ酸残基の任意の他の適切な繰り返しを含むペプチドである。実際上は、いかなるフレキシブルリンカーでも、本発明によるスペーサーとして使用することができる。

【0078】

好ましい実施形態において、スペーサーは、フレキシブルリンカーである。より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１～１８残基の間である。さらにより好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、５残基、１５残基、１７残基、または１８残基であり、好ましくは１５残基である。

【0079】

より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、少なくとも３残基、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基、少なくとも１１残基、少なくとも１２残基、少なくとも１３残基、少なくとも１４残基、少なくとも１５残基、少なくとも１６残基、少なくとも１７残基、または少なくとも１８残基である。さらにより好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１５残基長である。

【0080】

好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント、または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域のいずれかに、直接連結されている。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント、および腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に、直接連結されている。好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント、またはフレキシブルリンカーを介して腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域のいずれかに、直接連結されている。別の好ましい実施形態において、ホモ三量体化ドメインは、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメント、およびフレキシブルリンカーを介して腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域に、直接連結されている。

【0081】

より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、少なくとも１残基、少なくとも２残基、少なくとも３残基、少なくとも４残基、少なくとも５残基、少なくとも６残基、少なくとも７残基、少なくとも８残基、少なくとも９残基、少なくとも１０残基、少なくとも１１残基、少なくとも１２残基、少なくとも１３残基、少なくとも１４残基、少なくとも１５残基、少なくとも１６残基、少なくとも１７残基、または少なくとも１８残基である。より好ましい実施形態において、フレキシブルリンカーは、１７および／または１８残基長である。さらにより好ましい実施形態において、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントは、１８残基長のリンカーを介してホモ三量体化ドメインに連結されており、かつ／または腫瘍関連抗原に特異的に結合可能な領域は、１６残基長のリンカーを介してホモ三量体化ドメインに連結されている。

【0082】

好ましい実施形態において、１８残基長のリンカーは、配列番号４７である。別の好ましい実施形態において、１６残基長のリンカーは、配列番号３６である。

【0083】

好ましい実施形態において、ＴＰＣの少なくとも１つの単量体は、三量体ポリペプチドの検出および／または精製に適したタグをさらに含む。タグの非限定的な例としては、タグペプチドなどのアフィニティー精製タグが挙げられ；上記タグの例示的で非限定的な例としては、ポリヒスチジン［ポリ（Ｈｉｓ）］配列、得られた融合タンパク質を免疫親和性クロマトグラフィーによって精製するために使用され得る抗体によって認識可能なペプチド配列、例えば、熱ウイルスのヘマグルチニンに由来するエピトープ、ｃ－ｍｙｃタグ、Ｓｔｒｅｐタグなどが挙げられる。別の好ましい実施形態において、ＴＰＣの複数の単量体は、三量体ポリペプチドの検出および／または精製に適したタグをさらに含む。

【0084】

特定の実施形態において、３つの単量体ポリペプチドのそれぞれが、１つのアフィニティー精製タグを含み、上記タグが互いに異なる場合（例えば、アフィニティー精製タグ「ａ」、「ｂ」および「ｃ」であって、タグ「ａ」は物質Ａに結合することによって認識され、タグ「ｂ」は物質Ｂに結合することによって認識され、タグ「ｃ」は物質Ｃに結合することによって認識される）、対応する物質（Ａ、ＢおよびＣ）に対して親和性を示す本発明のそのようなＴＰＣのみを選択的に回収できるように設計された３工程のアフィニティー精製手順に供される。上記アフィニティー精製タグは、直列で直接融合させることもでき、あるいは、切断可能リンカー、すなわち、酵素的または化学的手段によって特異的に切断可能なアミノ酸配列を含むペプチドセグメント（すなわち、認識／切断部位）を介して単量体ポリペプチドに融合させることもできる。特定の実施形態において、上記切断可能リンカーは、エンテロキナーゼ、Ａｒｇ Ｃエンドプロテアーゼ、Ｇｌｕ Ｃエンドプロテアーゼ、Ｌｙｓ Ｃエンドプロテアーゼ、第Ｘａ因子などのプロテアーゼによって切断可能なアミノ酸配列を含み、あるいは、別の特定の実施形態において、上記切断可能リンカーは、例えば、メチオニン残基を切断する臭化シアンなどの化学試薬、または任意の他の適切な化学試薬によって切断可能なアミノ酸配列を含む。切断可能リンカーは、その後にアフィニティー精製タグの除去が望ましい場合に有用である。

【0085】

好ましい実施形態において、３つの単量体ポリペプチドは、同一のアフィニティー精製タグを含む。タグは、単量体の任意の位置、特に、ホモ三量体化ドメインに対してＣ末端またはＮ末端に配置され得る。より好ましい実施形態において、タグは、抗４－１ＢＢ特異的アゴニスト単鎖抗体フラグメントのＮ末端にある。より好ましい実施形態において、タグは、Ｈｉｓ６－ｍｙｃタグまたはｓｔｒｅｐ－Ｆｌａｇタグである。より好ましい実施形態において、タグは、配列番号３７のｆｌａｐタグ、および／または配列番号３８のＳｔｒｅｐＩＩタグである。

【0086】

別の好ましい実施形態において、単量体は、三量体ポリペプチドの循環半減期を増加させる部分をさらに含む。本発明によれば、「半減期」は、体内の化合物の濃度または量が、所与の濃度または量の半分に減少するのに必要な期間である。半減期は「開始点」として選択された濃度または量とは全く無関係であるため、所与の濃度または量は、観察時間中に観察された最大値である必要はなく、投与開始時に存在する濃度または量である必要もない。

【0087】

治療的投薬にとって最適ではない半減期プロファイルを増加させるための非限定的な戦略は、当業者に公知であり、これらとしては、薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質と、天然に存在する半減期の長いタンパク質またはタンパク質ドメインとの遺伝子融合（例えば、Ｆｃ融合、トランスフェリン融合、またはアルブミン融合）；薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質と、不活性なポリペプチド、例えば、ＸＴＥＮ（組換えＰＥＧまたは「ｒＰＥＧ」としても公知）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ；ＨＡＰ化）、プロリン－アラニン－セリンポリマー（ＰＡＳ；ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ；ＥＬＰ化）との遺伝子融合；薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質と、繰り返し化学部分、例えば、ＰＥＧ（ＰＥＧ化）またはヒアルロン酸との化学的コンジュゲーションによって流体力学的半径を増加させること；ポリシアリル化により、薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質を融合する負電荷を著しく増加させること；あるいは、ヒトＧＧ βサブユニットなどの天然タンパク質の半減期を延長することが知られている、負に荷電し、高度にシアリル化されたペプチド（例えば、カルボキシ末端ペプチド［ＣＴＰ；絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）β鎖のもの］）を目的の分子と融合させること；生物活性タンパク質に、ペプチドまたはタンパク質結合ドメインを付着させることで、ＨＳＡ、ヒトＩｇＧ、またはトランスフェリンなどの通常長い半減期のタンパク質と非共有結合的に結合させること；ペプチドまたは低分子と、ヒトＩｇＧ、Ｆｃ部分、またはＨＳＡなどの半減期の長いタンパク質との化学的コンジュゲーションが挙げられる。

【0088】

好ましい実施形態において、半減期は、ＴＰＣ循環半減期を増加させる任意の部分を含まない三量体ポリペプチドと比較して、少なくとも１％、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも１００％増加され得る。

【0089】

ＴＰＣの循環半減期を増加させる役割を果たす部分は、ＴＰＣの単量体のうちの１つ、ＴＰＣの単量体のうちの２つ、または３つのＴＰＣ単量体に存在し得る。さらに、ＴＰＣの循環半減期を増加させる役割を果たす部分は、単量体のＮ末端、単量体のＣ末端、ホモ三量体化ドメインに対してＮ末端、またはホモ三量体化ドメインに対してＣ末端に存在し得る。

【0090】

別の好ましい実施形態において、三量体ポリペプチドの循環半減期を増加させる部分は、アルブミンフラグメントまたはアルブミン結合部分である。

【0091】

「結合部分」という用語は、異なるエピトープまたは抗原結合ドメインとは独立して、抗原またはエピトープに特異的に結合するドメインを指す。結合部分は、ドメイン抗体（ｄＡｂ）であってもよく、または非免疫グロブリンタンパク質スキャフォールド、例えば、ＣＴＬＡ－４、リポカリン、ＳｐＡ、アドネクチン、アフィボディ、アビマー、ＧｒｏＥｌ、トランスフェリン、ＧｒｏＥＳおよびフィブロネクチンからなる群から選択されるスキャフォールドの誘導体であるドメインであってもよく、これは、天然リガンド以外のリガンドに結合する。好ましい実施形態において、上記部分は、血清アルブミンに結合する。

【0092】

前述のすべての用語および実施形態は、本開示にも同様に適用可能である。

【0093】

ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
別の態様において、本発明は、本発明の三量体ポリペプチドの一部を形成する少なくとも１つの単量体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。

【0094】

本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基を有する一本鎖または二本鎖ポリマーを指す。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド塩基を有する。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基を有する。より好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、本発明による三量体ポリペプチドの一部を形成する単量体ポリペプチドの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つをコードする。

【0095】

好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコードする配列に対して５’位にあり、かつ上記配列と同じオープンリーディングフレーム内にある、シグナル配列をコードする配列をさらに含む。本明細書で使用される場合、「シグナル配列」または「シグナルペプチド」という用語は、細胞内で合成されたタンパク質を分泌経路に向かわせる、比較的短い長さの、一般には５～３０アミノ酸残基のペプチドを指す。シグナルペプチドは、通常、二次アルファヘリックス構造をとる一連の疎水性アミノ酸を含む。加えて、多くのペプチドは、タンパク質がその輸送に適したトポロジーをとるのに寄与し得る、正電荷を帯びた一連のアミノ酸を含む。シグナルペプチドは、そのカルボキシル末端に、ペプチダーゼによって認識されるモチーフを有する傾向があり、ペプチダーゼはシグナルペプチドを加水分解して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成させる能力がある。シグナルペプチドは、目的のタンパク質が適切な位置に到達すると、切断され得る。任意のシグナルペプチドが、本発明で使用され得る。好ましい実施形態において、シグナル配列は、オンコスタチンＭのシグナル配列である。

【0096】

別の態様において、本発明は、本発明によるポリヌクレオチドを含むベクターに関する。

【0097】

本明細書で使用される場合、「ベクター」または「発現ベクター」という用語は、細胞、好ましくは、真核細胞において、少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現するために使用される複製ＤＮＡ構築物を指す。発現ベクターの選択は、宿主の選択に依存する。多種多様な発現宿主／ベクターの組み合わせを用いることができる。真核生物宿主に有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスおよびサイトメガロウイルスに由来する発現制御配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に有用な発現ベクターとしては、公知の細菌プラスミド、例えばｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３．１、ｐＣＭＶ３、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体を含めた大腸菌由来のプラスミド、より広い宿主範囲のプラスミド、例えばＭ１３および繊維状一本鎖ＤＮＡファージなどが挙げられる。これらのベクターは、形質転換プロトコル中に外来ＤＮＡが組み込まれたクローンを最初に選択するために使用される選択可能マーカーを発現するための追加の独立したカセットを含んでもよい。発現ベクターは、好ましくは複製起点を含む。発現ベクターは、１つ以上の多重クローニング部位を含むこともできる。

【0098】

発現ベクターはまた、細菌におけるベクター増幅に必要な、原核生物における複製起点を含んでもよい。さらに、発現ベクターは、細菌に対する選択遺伝子、例えば、抗生物質、例えば、アンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどに対する耐性を付与するタンパク質をコードする遺伝子を含むこともできる。発現ベクターはまた、１つ以上の多重クローニング部位を含むこともできる。多重クローニング部位は、１つ以上のユニークな制限部位を含むポリヌクレオチド配列である。制限部位の非限定的な例としては、ＥｃｏＲＩ、ＳａｃＩ、ＫｐｎＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＰｓｔＩ、ＳｐｈＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＡｖａＩ、またはそれらの任意の組み合わせが挙げられる。

【0099】

本発明のベクターで発現されるポリヌクレオチド（１つまたは複数）、および本発明の発現ベクターの調製に必要なＲＮＡまたはＤＮＡ構築物は、一般的な実験マニュアル、例えば、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ」（Ｊｏｓｅｐｈ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｄａｖｉｄ Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌ編，２００１，第３版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）または「Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．Ｅ．Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｄ．Ｍｏｏｒｅ，Ｊ．Ａ．Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｇ．ＳｅｉｄｍａｎおよびＫ．Ｓｔｒｕｈｌ編，第２巻，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ニューヨーク，Ｎ．Ｙ．，２００６年９月更新）に記載されている従来の分子生物学的方法によって得ることができる。

【0100】

別の態様において、本発明は、本発明によるベクターを含む宿主細胞に関する。

【0101】

「宿主細胞」という用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的子孫も指すように使用される。突然変異または環境的影響のいずれかにより、後代においてある種の改変が生じ得るため、そのような子孫は、実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでもなお本明細書で使用される用語の範囲に含まれる。宿主細胞は、任意の原核細胞（例えば、大腸菌）または真核細胞（例えば、酵母、昆虫または植物細胞）であり得、これは、本発明の核酸を適切な発現ベクターに挿入すること、そのベクターを用いて適切な宿主細胞を形質転換すること、およびその宿主細胞を、本発明のＴＰＣを構成する単量体ポリペプチドのポリペプチド部分の発現を可能にする条件下で培養することを含めた、従来の遺伝子工学的手法によって調製され得る。本発明の核酸は、誘導プロモーターまたは構成的プロモーターであり得る適切なプロモーターの制御下に置かれ得る。発現系に応じて、ポリペプチドは、宿主細胞の細胞外相、ペリプラズム、または細胞質から回収され得る。

【0102】

適切なベクター系および宿主細胞は、当業者に利用可能な膨大な文献および資料によって証明されるように、当技術分野において周知である。本発明はまた、ベクターの構築および宿主細胞における本発明の核酸の使用に関するものでもあるので、以下に、そのような使用に関連する一般的な考察および本発明のこの態様を実施する際の特定の考慮事項を提供する。

【0103】

一般に、本発明の核酸の最初のクローニング、および本発明のベクターの構築には、原核動物が好ましい。例えば、下記のより具体的な開示において言及される特定の株に加えて、大腸菌Ｋ１２株２９４（ＡＴＣＣ番号３１４４６）、大腸菌Ｂ、および大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ番号３１５３７）などの株を、例として挙げてもよい。当然ながら、これらの例は、限定的なものではなく、例示的なものであることを意図している。

【0104】

原核生物は、効率的な精製およびタンパク質のリフォールディング戦略が利用可能なことから、発現にも利用され得る。前述の株、ならびに大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ－、λ－、原栄養株、ＡＴＣＣ番号２７３３２５）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）などの桿菌、またはネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）もしくはセラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ ｍａｒｃｅｓａｎｓ）などの他の腸内細菌、および種々のシュードモナス種が使用され得る。

【0105】

一般に、宿主細胞と適合性のある種に由来するレプリコンおよび制御配列を含むプラスミドベクターが、これらの宿主に関連して使用される。ベクターは通常、複製部位、および形質転換細胞において表現型選択を提供し得るマーキング配列を有する。例えば、大腸菌は、典型的には、大腸菌種由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を用いて形質転換される。ｐＢＲ３２２プラスミドは、アンピシリン耐性およびテトラサイクリン耐性の遺伝子を含んでおり、従って、形質転換細胞を同定するための容易な手段を提供する。ｐＢＲ３２２プラスミド、または他の微生物プラスミドまたはファージはまた、発現のために微生物が使用できるプロモーターを含むか、または含むように改変されなければならない。

【0106】

組換えＤＮＡ構築において最も一般的に使用されるこれらのプロモーターとしては、Ｂ－ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系、およびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系が挙げられる。これらは最も一般的に使用されているが、他の微生物プロモーターも発見され、利用されており、それらのヌクレオチド配列に関する詳細が公開されているので、当業者であれば、それらをプラスミドベクターと機能的にライゲートすることが可能である。原核生物に由来するある種の遺伝子は、それら自体のプロモーター配列から大腸菌において効率的に発現する場合があり、人工的な手段で別のプロモーターを付加する必要がない。

【0107】

原核生物に加えて、酵母培養物などの真核微生物を使用してもよい。真核微生物の中では、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｓｅ）または一般的なパン酵母が、最も一般的に使用されるが、他の多くの株も一般的に利用可能である。サッカロミセスにおける発現には、例えばプラスミドＹＲｐ７が一般的に使用される。このプラスミドは、既にｔｒｐ１遺伝子を含んでおり、トリプトファン中で増殖する能力が欠如した酵母の突然変異株、例えばＡＴＣＣ番号４４０７６またはＰＥＰ４－１に対する選択マーカーを提供する。酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファン非存在下での増殖によって形質転換体を検出するための有効な環境を提供する。

【0108】

酵母ベクターにおける適切なプロモーティング配列としては、３－ホスホグリセリン酸キナーゼまたは他の解糖系酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグルコキナーゼなどのためのプロモーターが挙げられる。適切な発現プラスミドを構築する際には、これらの遺伝子に関連する終止配列も、発現ベクター内の発現させたい配列の３’側にライゲートさせて、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を提供する。

【0109】

増殖条件によって転写が制御されるという付加的な利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ－２、イソチトクロムＣ、酸性ホスファターゼ、窒素代謝に関連する分解酵素、および前述のグリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ならびにマルトースおよびラクトースの利用を担う酵素のためのプロモーター領域である。酵母適合性のプロモーター、複製起点および終止配列を含む任意のプラスミドベクターが適している。

【0110】

微生物に加えて、多細胞生物に由来する細胞の培養物も、宿主として使用され得る。原則としては、脊椎動物培養物由来かまたは無脊椎動物培養物由来かに関わらず、任意のこのような細胞培養が実行可能である。しかしながら、脊椎動物細胞への関心が最も高く、培養（組織培養）における脊椎動物の増殖は、近年、日常的な手順となっている。このような有用な宿主細胞株の例は、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ならびにＷ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ－７、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ）２９３、およびＭＤＣＫ細胞株である。加えて、バキュロウイルス－昆虫細胞発現系は、組換えタンパク質および抗体を産生させるために広く使用される。

【0111】

このような細胞のための発現ベクターは、通常、（必要に応じて）複製起点、発現させる遺伝子の前方に位置するプロモーターを、任意の必要なリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列と共に含む。

【0112】

哺乳動物細胞における使用のために、発現ベクターにおける制御機能は、しばしば、ウイルス性材料によって提供され、例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、および最も頻繁にはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）に由来する。ＳＶ４０ウイルスの初期および後期プロモーターは、両方とも、ＳＶ４０ウイルスの複製起点も含むフラグメントとしてウイルスから容易に得られるので、特に有用である。ＨｉｎｄＩＩＩ部位からウイルスの複製起点に位置するＢｇｌＩ部位に向かって伸長するおよそ２５０ｂｐの配列が含まれていれば、より小さいか、またはより大きいＳＶ４０フラグメントも使用され得る。さらに、所望の遺伝子配列に通常関連するプロモーターまたは制御配列を利用することも可能であり、しばしば望ましいが、そのような制御配列が宿主細胞系に適合することが条件である。

【0113】

複製起点は、例えば、ＳＶ４０または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデノなど）に由来し得る、外来起源を含むベクターの構築によって提供されてもよく、または宿主細胞の染色体複製機構によって提供されてもよい。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれる場合は、後者で十分であることが多い。

【0114】

本発明のＴＰＣを構成する単量体ポリペプチドの作製に際して、例えば、ポリペプチドに非タンパク質性機能を導入することによって、材料を適切なリフォールディング条件に付すことによって（例えば、ＷＯ９４／１８２２７号に示唆されている一般に適用可能な戦略を用いることによって）、または単量体の望ましくないペプチド部分（例えば、最終生成物中で望ましくない発現増強ペプチドフラグメント）を切断することによって、ポリペプチドをさらに処理する必要がある場合がある。

【0115】

上記の議論の観点から、本発明の上記ＴＰＣ、または本発明のＴＰＣを構成する上記単量体ポリペプチドを組換え的に作製する方法もまた、宿主細胞または細胞株において本発明の核酸を有し、かつ／または複製することが可能なベクターであるので、本発明の一部である。本発明によれば、発現ベクターは、例えば、ウイルス、プラスミド、コスミド、ミニ染色体、またはファージであり得る。

【0116】

本発明の別の態様は、本発明の核酸を有し、かつ複製可能な、上記に記載の方法において有用な形質転換細胞（すなわち、本発明の宿主細胞）であり、宿主細胞は、細菌、酵母、または原生動物などの微生物であってもよく、あるいは真菌、昆虫細胞、植物細胞、または哺乳動物細胞などの多細胞生物に由来する細胞であってもよい。細胞はまた、トランスフェクトされていてもよい。

【0117】

本発明のさらに別の態様は、本発明のＴＰＣを構成する単量体ポリペプチドまたはそのポリペプチド部分を産生する安定な細胞株に関し、好ましくは、この細胞株は、本発明の核酸を有し、かつ発現する。特に興味深いのは、哺乳動物細胞株ＨＥＫおよびＣＨＯに由来する細胞である。

【0118】

前述のすべての用語および実施形態は、本発明のこの態様にも同様に適用可能である。

【0119】

治療上の組み合わせ
別の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞と、免疫チェックポイントブロッカーとを含む、組み合わせ物に関する。

【0120】

「組み合わせ物」とは、組成物中での、「タンクミックス」などの単一活性化合物の別個の製剤から構成される組み合わせ混合物中での、および連続的に、すなわち数時間または数日などの適度に短い期間で１つずつ適用されるか、または同時投与で適用される場合の単一有効成分の組み合わせ使用での、本発明の三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞と、免疫チェックポイントブロッカーとのさまざまな組み合わせを意味する。

【0121】

本発明の三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞と、免疫チェックポイントブロッカーとの組み合わせ物は、その同時投与、個別投与、または連続投与のために処方され得る。このことは、２つの化合物の組み合わせが、
－ 同じ医薬製剤の一部であり、２つの化合物が常に同時に投与される組み合わせとして
－ 同時投与、連続投与、または個別投与の可能性をもたらす物質の１つをそれぞれ含む２つのユニットの組み合わせとして
投与され得ることを意味する。

【0122】

特定の実施態様において、本発明の三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞は、免疫チェックポイントブロッカーとは独立して（すなわち、２つのユニットで）、しかし同時に投与される。

【0123】

別の特定の実施態様において、本発明の三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞が最初に投与され、次いで、免疫チェックポイントブロッカーが別個にまたは連続して投与される。

【0124】

さらに別の特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーが最初に投与され、次いで、本発明の三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、または本発明による宿主細胞が、別個にまたは連続して、定義されたとおりに投与される。

【0125】

さらに、化合物は、同一または異なる剤形で、あるいは同一または異なる投与経路によって投与される（例えば、一方の化合物は局所投与され得、他方の化合物は経口投与され得る）。好適には、両方の化合物は経口投与される。

【0126】

本明細書で使用される「免疫チェックポイントブロッカー」または「免疫チェックポイント阻害剤」は、免疫応答の過程でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の抗原認識を制御するための一種のシグナルであるチェックポイントと呼ばれるタンパク質を阻害する分子群に関する。免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、自己免疫を阻止し、二次的な組織損傷を最小限に抑えるために免疫応答の持続期間および程度を制御するのに極めて重要な、免疫系の抑制性制御因子である。これらの免疫チェックポイントは、腫瘍細胞上または腫瘍微小環境内の非形質転換細胞上でしばしば過剰発現され、免疫系が効果的な抗腫瘍反応を開始する能力を損なわせる。これらの分子は、適応免疫応答を下方調節または阻害する「ブレーキ」として効果的に機能し得る。従って、これらの分子は、がん細胞が患者の免疫系を回避することを阻止するのに有用な薬剤である。抗腫瘍免疫破壊の主要な機構の一つは、「Ｔ細胞枯渇」として知られ、これは、抗原への慢性的な曝露によって、抑制性受容体の上方制御が引き起こされることに起因する。これらの抑制性受容体は、制御不能な免疫反応を阻止するための免疫チェックポイントとして機能している。

【0127】

ＰＤ－１、および共抑制性受容体、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ－４）、ＢおよびＴリンパ球減衰因子（ＢＴＬＡ；ＣＤ２７２）、Ｔ細胞免疫グロブリンおよびムチンドメイン－３（Ｔｉｍ－３）、リンパ球活性化遺伝子－３（Ｌａｇ－３；ＣＤ２２３）などは、しばしばチェックポイント制御因子と呼ばれる。これらは、細胞外情報が、細胞周期の進行およびその他の細胞内シグナル伝達プロセスを進めるべきか否かを決定できるようにする、分子「ゲートキーパー」として機能する。

【0128】

免疫チェックポイントの阻害は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質レベルでの阻害によって行われ得る。いくつかの実施形態において、阻害性核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ）を用いて、阻害性分子の発現を阻害することができる。他の実施形態において、免疫チェックポイントの阻害剤は、阻害性分子に結合するポリペプチド、例えば、可溶性リガンド、または／抗体もしくはその抗原結合フラグメントである。

【0129】

ある態様において、チェックポイント阻害剤は、生物学的治療薬または小分子である。好ましい実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、抗体である。別の態様において、チェックポイント阻害剤は、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、完全ヒト抗体、融合タンパク質、またはそれらの組み合わせ物である。

【0130】

「抗体」という用語は、本発明のこの態様にも同様に適用可能なものとして、以前に定義されている。

【0131】

さらなる態様において、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬｌ、ＰＤＬ２、ＰＤｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ－７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせから選択されるチェックポイントタンパク質を阻害する。さらなる態様において、チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬｌ、ＰＤＬ２、ＰＤｌ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０、ＣＧＥＮ－１５０４９、ＣＨＫ１、ＣＨＫ２、Ａ２ａＲ、Ｂ－７ファミリーリガンド、またはそれらの組み合わせから選択されるチェックポイントタンパク質のリガンドと相互作用する。Ｂ７ファミリーリガンドとしては、Ｂ７－１、Ｂ７－２、Ｂ７－ＤＣ、Ｂ７－Ｈ１、Ｂ７－Ｈ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、Ｂ７－Ｈ５、Ｂ７－Ｈ６およびＢ７－Ｈ７が挙げられるが、これらに限定されない。免疫チェックポイントブロッカーには、ＣＴＬＡ－４、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＰＤ１、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ３、ＧＡＬ９、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＫＩＲ、２Ｂ４、ＣＤ１６０およびＣＧＥＮ－１５０４９の１つ以上に結合し、その活性を遮断または阻害する、抗体、またはその抗原結合フラグメント、その他の結合タンパク質、生物学的治療薬、または小分子が含まれる。例示的な免疫チェックポイント阻害剤としては、トレメリムマブ（ＣＴＬＡ－４遮断抗体）、抗ＯＸ４０、ＰＤ－Ｌｌモノクローナル抗体（抗Ｂ７－Ｈｌ；ＭＥＤＩ４７３６）、ＭＫ－３４７５（ＰＤ－１ブロッカー）、ニボルマブ（抗ＰＤｌ抗体）、ＣＴ－０１１（抗ＰＤｌ抗体）、ＢＹ５５モノクローナル抗体、ＡＭＰ２２４（抗ＰＤＬｌ抗体）、ＢＭＳ－９３６５５９（抗ＰＤＬｌ抗体）、ＭＰＬＤＬ３２８０Ａ（抗ＰＤＬｌ抗体）、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（抗ＰＤＬｌ抗体）、およびイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤）が挙げられる。チェックポイントタンパク質のリガンドとしては、ＰＤ－Ｌｌ、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＤ２８、ＣＤ８６およびＴＩＭ－３が挙げられるが、これらに限定されない。

【0132】

特定の実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＰＤ－１アンタゴニスト、ＰＤ－Ｌ１アンタゴニスト、およびＣＴＬＡ－４アンタゴニストから選択される。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、イピリムマブ（ヤーボイ（登録商標））、およびペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（抗ＰＤ－１抗体、オプジーボ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ペムブロリズマブ（抗ＰＤ－１抗体、キイトルーダ（登録商標）、Ｍｅｒｃｋ）；イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４抗体、ヤーボイ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；デュルバルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体、イミフィンジ（登録商標）、ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；アベルマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体）およびアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１抗体、テセントリク（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）から選択される。

【0133】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ランブロリズマブ（ＭＫ－３４７５）、ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８）、ピディリズマブ（ＣＴ－０１１）、ＡＭＰ－２２４、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ４７３６、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＭＳ－９３６５５９、イピリムマブ、リルマブ（ｌｉｒｌｕｍａｂ）、ＩＰＨ２１０１、ペムブロリズマブ（Ｋｅｙｔｒｕｄａ（登録商標））、およびトレメリムマブからなる群から選択される。

【0134】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、抗ＰＤ－１抗体であるＲＥＧＮ２８１０（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ）；ＰＤ－１に結合する抗体であり、ＣＴ－０１１としても知られるピディリズマブ（ＣｕｒｅＴｅｃｈ）；完全ヒトＩｇＧ１抗ＰＤ－Ｌ１抗体であり、ＭＳＢ００１０７１８Ｃとしても知られるアベルマブ（バベンチオ（登録商標）、Ｐｆｉｚｅｒ／Ｍｅｒｃｋ ＫＧａＡ）である。

【0135】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン含有タンパク質－３（ＴＩＭ－３）の阻害剤である。本発明で使用され得るＴＩＭ－３阻害剤としては、ＴＳＲ－０２２、ＬＹ３３２１３６７およびＭＢＧ４５３が挙げられる。

【0136】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、特定のＴ細胞およびＮＫ細胞上の免疫受容体である、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（すなわち、ＴＩＧＩＴ）の阻害剤である。本発明で使用され得るＴＩＧＩＴ阻害剤としては、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体であるＢＭＳ－９８６２０７（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）（ＮＣＴ０２９１３３１３）；ＯＭＰ－３１３Ｍ３２（Ｏｎｃｏｍｅｄ）；および抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体（ＮＣＴ０３１１９４２８）が挙げられる。

【0137】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）の阻害剤である。本発明で使用され得るＬＡＧ－３阻害剤としては、ＢＭＳ－９８６０１６およびＲＥＧＮ３７６７およびＩＭＰ３２１が挙げられる。

【0138】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＯＸ４０アゴニストが挙げられる。現在臨床試験中のＯＸ４０アゴニストとしては、ＰＦ－０４５１８６００／ＰＦ－８６００（Ｐｆｉｚｅｒ）；ＧＳＫ３１７４９９８（Ｍｅｒｃｋ）；ＭＥＤＩ０５６２（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）；ＭＥＤＩ６４６９；およびＢＭＳ－９８６１７８（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。

【0139】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＣＤ１３７（４－１ＢＢとも呼ばれる）アゴニストが挙げられる。ＣＤ１３７アゴニストの非例示的で非限定的な例としては、ウトミルマブ（ＰＦ－０５０８２５６６、Ｐｆｉｚｅｒ）およびウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）が挙げられる。

【0140】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＣＤ２７アゴニストが挙げられる。ＣＤ２７アゴニストとしては、バリルマブ（ｖａｒｌｉｌｕｍａｂ）（ＣＤＸ－１１２７、Ｃｅｌｌｄｅｘ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

【0141】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、グルココルチコイド誘導性腫瘍壊死因子受容体（ＧＩＴＲ）アゴニストが挙げられる。現在臨床試験中のＧＩＴＲアゴニストとしては、ＴＲＸ５１８（Ｌｅａｐ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；ＧＷＮ３２３；ＩＮＣＡＧＮ０１８７６（Ｉｎｃｙｔｅ／Ａｇｅｎｕｓ）、ＭＫ－４１６６（Ｍｅｒｃｋ）、およびＭＥＤＩ１８７３（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ／ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ）が挙げられる。

【0142】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、誘導性Ｔ細胞共刺激因子（ＩＣＯＳ、ＣＤ２７８としても知られる）アゴニストが挙げられる。ＩＣＯＳアゴニストの例示的で非限定的な例としては、ＭＥＤＩ－５７０（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）；ＧＳＫ３３５９６０９（Ｍｅｒｃｋ）；およびＪＴＸ－２０１１（Ｊｏｕｎｃｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）が挙げられる。

【0143】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、キラーＩｇＧ様受容体（ＫＩＲ）阻害剤が挙げられる。ＫＩＲの例示的で非限定的な例としては、リリルマブ（ＩＰＨ２１０２／ＢＭＳ－９８６０１５、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ／Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）；ＩＰＨ２１０１（１－７Ｆ９、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）；およびＩＰＨ４１０２（Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）が挙げられる。

【0144】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＣＤ４７とシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰａ）との相互作用を阻害するＣＤ４７阻害剤が挙げられる。ＣＤ４７／ＳＩＲＰａ阻害剤の例示的で非限定的な例としては、ＡＬＸ－１４８（Ａｌｅｘｏ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＴＴＩ－６２１（ＳＩＲＰａ－Ｆｃ、Ｔｒｉｌｌｉｕｍ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ；ＣＣ－９０００２（Ｃｅｌｇｅｎｅ）；およびＨｕ５Ｆ９－Ｇ４（Ｆｏｒｔｙ Ｓｅｖｅｎ，Ｉｎｃ．）が挙げられる。

【0145】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＣＤ７３阻害剤が挙げられる。ＣＤ７３阻害剤の例示的で非限定的な例としては、ＭＥＤＩ９４４７（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ；およびＢＭＳ－９８６１７９）が挙げられる。

【0146】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、インターフェロン遺伝子刺激因子タンパク質（ＳＴＩＮＧ、膜貫通タンパク質１７３、またはＴＭＥＭ１７３としても知られる）のアゴニストが挙げられる。ＳＴＩＮＧのアゴニストの例示的で非限定的な例としては、ＭＫ－１４５４（Ｍｅｒｃｋ）；およびＡＤＵ－Ｓ１００が挙げられる。

【0147】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＣＳＦ１Ｒ阻害剤が挙げられる。ＣＳＦ１Ｒ阻害剤としては、ペキシダルチニブ（ＰＬＸ３３９７、Ｐｌｅｘｘｉｋｏｎ；およびＩＭＣ－ＣＳ４（ＬＹ３０２２８５５，Ｌｉｌｌｙ）が挙げられる。

【0148】

本発明で使用され得る免疫チェックポイントブロッカーとしては、ＮＫＧ２Ａ受容体阻害剤が挙げられる。ＮＫＧ２Ａ受容体阻害剤の例示的で非限定的な例としては、モナリズマブ（ＩＰＨ２２０１、Ｉｎｎａｔｅ Ｐｈａｒｍａ）が挙げられる。

【0149】

好ましい実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＰＤ－Ｌ１阻害剤である。

【0150】

本明細書で使用される「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、ＣＤ２７４、ＰＤＣＤ１Ｌ１、Ｂ７－Ｈ、Ｂ７－Ｈ１、ＰＤＣＤ１ＬＧ１、ＰＤＬ１、Ｂ７Ｈ１としても知られ、プログラム死リガンド１を指す。上記タンパク質をコードするヒト遺伝子は、Ｅｎｓｅｍｂｌデータベースにアクセッション番号ＥＮＳＧ０００００１２０２１７で示されている。

【0151】

ＰＤ－Ｌ１に結合する小分子は、ＷＯ２０１５０３４８２０号に開示されている。これらの化合物は、オルト置換ビフェニル部分構造を含む三環芳香族構造からなる。これらの化合物の生物学的活性は、ホモジニアス時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）結合アッセイによって確立された。このような化合物の代表例は、ＢＭＳ－８およびＢＭＳ－２０２である。

【0152】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０、ＭＰＯＬ３２８０Ａ、ＭＥＯＩ－４７３６、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃ、またはＭＯＸ－１１０５から選択される抗ＰＤ－ＬＩ結合アンタゴニストである。ＭＯＸ－１１０５は、ＢＭＳ－９３６５５９としても知られ、Ｗ０２００７／００５８７４号に記載されている抗ＰＤ－ＬＩ抗体である。抗体ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０は、ＷＯ２０１０／０７７６３４号に記載されている抗ＰＤ－ＬＩである。

【0153】

好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１阻害剤は、ＰＤ－Ｌ１抗体である。

【0154】

より好ましい実施形態において、ＰＤ－Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ、アベルマブおよびデュルバルマブからなる群から選択される。

【0155】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＰＤ－Ｌ１に結合するヒトＦｅ最適化ＩｇＧ１モノクローナル抗体であるＭＤＰＬ３２８０Ａ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ １ Ｒｏｃｈｅ）である。ＭＯＰＬ３２８０ＡおよびＰＤ－Ｌ１に対する他のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第７，９４３，７４３号および米国特許公開第２０１２００３９９０６号に開示されている。本発明の組み合わせ物のための免疫チェックポイントブロッカーとして有用な他の抗ＰＤ－Ｌ１結合剤としては、ＹＷ２４３．５５．Ｓ７０（Ｗ０２０１０／０７７６３４号を参照）、ＭＤＸ－１１０５（８ＭＳ－９３６５５９とも呼ばれる）、およびＷ０２００７／００５８７４号に開示された抗ＰＤ－Ｌ１結合剤が挙げられる。

【0156】

別の好ましい実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＰＤ－１阻害剤である。いくつかの実施形態において、抗ＰＤＬ１抗体は、ＭＳＢ００１０７１８Ｃである。ＭＳＢ００１０７１８Ｃ（Ａ０９－２４６－２とも呼ばれる；ＭｅｒｃｋＳｅｒｏｎｏ）は、ＰＤ－Ｌ１に結合するモノクローナル抗体である。

【0157】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＰＤ－１に対する抗体である。ＰＤ－１は、プログラム細胞死１受容体（ＰＤ－１）に結合して、その受容体が抑制性リガンドＰＤＬ－１に結合するのを阻止し、宿主の抗腫瘍免疫応答を抑制する腫瘍の能力を無効にする。

【0158】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＭＤＸ－１１０６、Ｍｅｒｃｋ３４７５またはＣＴ－０１１から選択される抗ＰＤ－１抗体である。いくつかの実施形態において、免疫調節薬は、ＡＭＰ－２２４などのＰＤ－１阻害剤である。

【0159】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ＰＤ１に結合するヒト化ＩｇＧ１ｋモノクローナル抗体であるピディリズマブ（ＣＴ－０１１；Ｃｕｒｅ Ｔｅｃｈ）である。ピディリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、Ｗ０２００９／１０１６１１号に開示されている。

【0160】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、ニボルマブ（ＣＡＳ登録番号：９４６４１４－９４－４）である。ニボルマブの代替名には、ＭＯＸ－１１０６、ＭＯＸ－１１０６－０４、ＯＮ０－４５３８、またはＢＭＳ－９３６５５８が含まれる。ニボルマブは、ＰＤ－１を特異的に遮断する完全ヒトＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ニボルマブ（クローン５Ｃ４）およびＰＤ－１に特異的に結合する他のヒトモノクローナル抗体は、ＵＳ８，００８，４４９号、ＥＰ２１６１３３６号およびＷ０２００６／１２１１６８号に開示されている。

【0161】

いくつかの実施形態において、免疫チェックポイントブロッカーは、抗ＰＤ－１抗体であるペムブロリズマブである。ペムブロリズマブ（ラムブロリズマブ、ＭＫ－３４７５、ＭＫ０３４７５、ＳＣＨ－９００４７５またはＫＥＹＴＲＵＯＡ（登録商標）とも呼ばれる；Ｍｅｒｃｋ）は、ＰＤ－１に結合するヒト化ＩｇＧ４モノクローナル抗体である。ペムブロリズマブおよび他のヒト化抗ＰＤ－１抗体は、Ｈａｍｉｄ，Ｏ．ら（２０１３）Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ３６９（２）：１３４－４４、ＵＳ８，３５４，５０９号、Ｗ０２００９／１１４３３５号、およびＷ０２０１３／０７９１７４号に開示されている。

【0162】

本明細書に開示される組み合わせ物の免疫チェックポイントブロッカーとして有用な他の抗ＰＤ１抗体としては、ＡＭＰ５１４（Ａｍｐｌｉｍｍｕｎｅ）、およびＵＳ８，６０９，０８９号、ＵＳ２０１００２８３３０号、および／またはＵＳ２０１２０１１４６４９号に開示される抗ＰＤ１抗体が挙げられる。

【0163】

本発明の組み合わせ物の別の好ましい実施形態において、ＰＤ－１阻害剤は、ペムブロリズマブまたはニボルマブである

【0164】

医薬組成物
別の態様において、本発明は、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、または本発明による組み合わせ物と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物に関する。

【0165】

本発明によるＴＰＣ、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、または本発明による組み合わせ物は、被験体へのその投与に適したビヒクルを含む医薬組成物の一部とすることができ、そのような場合、ＴＰＣ、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組み合わせ物は、その目的に適した医薬剤形で被験体に投与され、少なくとも１つの薬学的に許容されるビヒクルを含むことになる。したがって、特定の実施形態において、ＴＰＣ、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組み合わせ物は、有効成分としてのＴＰＣ、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組み合わせ物に加えて、少なくとも１つのビヒクル、好ましくは薬学的に許容されるビヒクルを含む医薬組成物の一部となる。「ビヒクル」という用語には、一般に、有効成分と共に投与される任意の希釈剤または賦形剤が含まれる。好ましくは、上記ビヒクルは、被験体へのその投与のための薬学的に許容されるビヒクルであり、すなわち、規制機関、例えば、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）などによって承認されたビヒクル（例えば、賦形剤）であるか、または動物、より具体的にはヒトにおける使用のために一般に認められた薬局方（例えば、欧州薬局方、米国薬局方など）に含まれる。

【0166】

ＴＰＣ、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、またはそれらの組み合わせ物は、投与のために、任意の適切な媒体中に溶解され得る。有効成分が溶解、懸濁され得るか、または有効成分とエマルジョンを形成し得る媒体の非限定的な実例としては、水、エタノール、水－エタノール混合物または水－プロピレングリコール混合物など、石油由来の油、動物油、植物油、または合成油を含めた油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油など、有機溶媒、例えば、アセトン、メチルアルコール、エチルアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセリン、ジエチルエステル、クロロホルム、ベンゼン、トルエン、キシレン、エチルベンゼン、ペンタン、ヘキサン、シクロヘキサン、テトラヒドロフラン、四塩化炭素、クロロホルム、塩化メチレン、トリクロロエチレン、パークロロエチレン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などが挙げられる。

【0167】

同様に、使用直前に、経口または非経口投与用の液体形態調製物に変換されることが意図される、医薬組成物の固体形態調製物も含まれる。このタイプの液体形態としては、溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。有効成分のさまざまな医薬剤形、使用されるビヒクル、およびその製造方法に関する概説は、例えば、Ｔｒａｔａｄｏ ｄｅ Ｆａｒｍａｃｉａ Ｇａｌｅｎｉｃａ，Ｃ．Ｆａｕｌｉ ｉ Ｔｒｉｌｌｏ，Ｌｕｚａｎ ５，Ｓ．Ａ．ｄｅ Ｅｄｉｃｉｏｎｅｓ，１９９３およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ編）、第２０版、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ ＰＡ，ＵＳＡ（２０００）に記載されている。

【0168】

非限定的な様式において、ＴＰＣ、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、または組み合わせ物のための投与経路としては、とりわけ、経口経路、胃腸経路、鼻腔内経路、または舌下経路などの非侵襲的な薬理学的投与経路、および非経口経路などの侵襲的な投与経路が挙げられる。特定の実施形態において、ＴＰＣは、非経口経路（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、髄腔内など）により、医薬剤形で投与される。「非経口経路による投与」は、注射によって目的の化合物を投与することからなる投与経路と理解されるため、注射器および針の使用を必要とする。非経口穿刺には、注射針が到達する組織によって、筋肉内（化合物が筋肉組織内に注射される）、静脈内（化合物が静脈内に注射される）、皮下（皮膚の下に注射される）、および皮内（皮膚の層間に注射される）という異なるタイプがある。髄腔内経路は、血液脳関門を十分に通過しない薬物を中枢神経系に投与するために用いられ、それによって、薬物が脊髄を取り囲む空間（髄腔内空間）に投与される。好ましい実施形態において、投与は、皮内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、静脈内投与、皮下投与、または髄腔内投与である。

【0169】

医学的使用
別の態様において、本発明は、がんの治療における使用のための、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、本発明による組み合わせ物、または医薬組成物に関する。

【0170】

あるいは、本発明は、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、組み合わせ物、または本発明による医薬組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、がんを治療するための方法に関する。

【0171】

あるいは、本発明は、がんの治療のための医薬の調製のための、本発明による三量体ポリペプチド、本発明によるポリヌクレオチド、本発明によるベクター、本発明による宿主細胞、組み合わせ物、または本発明による医薬組成物に関する。

【0172】

本明細書中で使用される場合、「治療」という用語は、罹患しているがんに対する感受性を終結させる、改善する、または低減することを目的とする任意のタイプの療法を指す。したがって、「治療」、「治療する」、およびこれらに相当する用語は、薬理学的または生理学的に所望の効果を得ることを指し、ヒトを含む哺乳動物におけるがんの任意の治療を対象とする。その効果は、障害および／またはそれに起因する有害作用の完全なまたは部分的な予防を提供するという点で、予防的であり得る。言い換えれば、「治療」には、（１）疾患を阻止すること、例えばその発症を止めること、（２）障害または少なくともそれに関連する症状を中断または終息させ、患者がもはや疾患またはその症状に苦しむことがないようにすること、例えば、失われた機能、欠如した機能、または欠陥のある機能を回復または修復することによって疾患またはその症状を退行させること、または非効率的なプロセスを刺激すること、あるいは（３）疾患またはそれに関連する症状を軽減、緩和、または改善することが含まれ、ここで、軽減とは、例えば、炎症、疼痛、呼吸困難、または自力で動くことができないなどのパラメータまたは症状の大きさを少なくとも低減させることを指す広い意味で使用される。

【0173】

本明細書に開示されるように、「がん」および「腫瘍」という用語は、未制御の細胞増殖を特徴とする哺乳動物における生理学的状態に関する。がんの例としては、副腎、骨、脳、乳房、気管支、結腸および／または直腸、胆嚢、消化管、頭頸部、腎臓、喉頭、肝臓、肺、神経組織、膵臓、前立腺、副甲状腺、皮膚、胃、および甲状腺のがんが挙げられるが、これらに限定されない。がんの他の例としては、腺がん、腺腫、基底細胞がん、子宮頸部異形成および上皮内がん、ユーイング肉腫、類表皮がん、巨細胞腫、多形神経膠芽腫（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ｍｕｌｔｉｆｏｒｍａ）、毛様細胞腫瘍、腸管神経節腫、過形成角膜神経腫瘍、膵島細胞がん、カポジ肉腫、平滑筋腫、白血病、リンパ腫、悪性カルチノイド、悪性黒色腫、悪性高カルシウム血症、マルファン症候群様体質腫瘍（ｍａｒｆａｎｏｉｄ ｈａｂｉｔｕｓ ｔｕｍｏｒ）、髄様がん、転移性皮膚がん、粘膜神経腫、骨髄異形成症候群（ｍｙｅｌｏｄｉｓｐｌａｓｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、骨髄腫、菌状息肉腫、神経芽細胞腫、骨肉腫、骨原性肉腫およびその他の肉腫、卵巣腫瘍、褐色細胞腫、真性多血症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｒｍｉａ ｖｅｒａ）、原発性脳腫瘍、小細胞肺腫瘍、潰瘍性および乳頭状の両方のタイプの扁平上皮がん、セミノーマ、軟部肉腫、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、腎細胞腫瘍または腎細胞がん、細網肉腫（ｖｅｔｉｃｕｌｕｍ ｃｅｌｌ ｓａｒｃｏｍａ）、およびウィルム腫瘍が挙げられる。がんの例としては、星状細胞腫、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、神経膠腫または神経膠芽腫、腎細胞がん（ＲＣＣ）、肝細胞がん（ＨＣＣ）、および膵神経内分泌がんも挙げられる。

【0174】

本発明による三量体ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、組み合わせ物、または医薬組成物は、限定されるものではないが、乳腺腫瘍、心臓腫瘍、肺腫瘍、小腸腫瘍、結腸腫瘍、脾臓腫瘍、腎臓腫瘍、膀胱腫瘍、頭部腫瘍、頸部腫瘍、卵巣腫瘍、前立腺腫瘍、脳腫瘍、膵臓腫瘍、皮膚腫瘍、骨腫瘍、骨髄腫瘍、血腫、胸腺腫瘍、子宮腫瘍、精巣腫瘍および肝臓腫瘍などの任意のがんまたは腫瘍の治療に有用である。

【0175】

さまざまな実施形態において、治療される患者のがんは、転移性がんであるか、あるいは第一、第二、または第三選択治療に対して難治性の難治性および／または再発性がんである。別の実施形態において、治療は、第一、第二、または第三選択治療である。本明細書で使用される場合、「第一選択」または「第二選択」または「第三選択」という語句は、患者が受ける治療の順序を指す。第一選択治療レジメンは、最初に行われる治療であり、第二選択治療または第三選択治療は、それぞれ、第一選択療法後または第二選択治療後に行われる。したがって、第一選択治療は、ある疾患または状態に対する最初の治療である。がん患者の場合、一次治療は、手術、化学療法、放射線療法、またはこれらの併用療法となり得る。第一選択治療は、当業者には一次療法または一次治療とも呼ばれる。典型的には、患者が第一選択療法に対して良好な臨床応答を示さなかったか、亜臨床応答しか示さなかったか、または第一選択治療が中止されたという理由で、次の化学療法レジメンが患者に施される。この文脈では、「化学療法」は、古典的な細胞毒性化学療法だけでなく、分子標的療法および免疫療法も包含するその最も広い意味で使用される。

【0176】

好ましい実施形態において、がんは、ＥＧＦＲ陽性である。

【0177】

別の好ましい実施態様において、がんは、免疫チェックポイントも陽性であり、その阻害剤が、上記がんの治療に使用される本発明の組み合わせ物に含まれている。免疫チェックポイントの例示的で非限定的な例は、先に記載されており、本発明のこの態様にも同様に適用可能である。より詳細には、がんは、ＰＤ－Ｌ１陽性である。

【0178】

「陽性」という用語は、ＥＧＦＲを指すために本明細書で使用される場合、腫瘍またはがん中のＥＧＦＲの「量」または「レベル」が、非陽性腫瘍または正常細胞において観察されるものよりも高いことを示す。発現レベルは、当業者に公知の、また本明細書にも開示されている方法によって、測定され得る。「発現のレベル」または「発現レベル」という用語は、一般に、生体試料中のバイオマーカーの量を指す。「発現」とは、一般に、情報（例えば、遺伝子がコードする情報および／またはエピジェネティックな情報）が、細胞内に存在しかつ機能する構造体へと変換されるプロセスを指す。したがって、本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドへの転写、ポリペプチドへの翻訳、またはさらにはポリヌクレオチド修飾および／またはポリペプチド修飾（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾）を指す場合もある。転写されたポリヌクレオチド、翻訳されたポリペプチド、またはポリヌクレオチド修飾体および／またはポリペプチド修飾体（例えば、ポリペプチドの翻訳後修飾体）のフラグメントもまた、それらが選択的スプライシングよって生成された転写物または分解された転写物が起源であるか、または、ポリペプチドの翻訳後プロセシング（例えば、タンパク質分解による）が起源であるかに関わらず、発現されたと見なされるべきである。「発現遺伝子」には、ｍＲＮＡとしてポリヌクレオチドに転写され、その後にポリペプチドに翻訳されるもの、およびＲＮＡに転写されるが、ポリペプチドに翻訳されないもの（例えば、トランスファーＲＮＡおよびリボソームＲＮＡ）も含まれる。

【0179】

「発現の増加」、「発現レベルの増加」、「レベルの増加」、「発現の上昇」、「発現レベルの上昇」または「レベルの上昇」は、例えば、疾患または障害（例えば、がん）を有さない単一または複数の個体、内部対照（例えば、ハウスキーピングバイオマーカー）、または患者の群／集団に由来する試料中のバイオマーカーの発現レベルの中央値などの対照と比較して、個体におけるバイオマーカーの発現の増加またはレベルの増加を指すために、互換的に使用される。

【0180】

より好ましい実施形態において、がんは、結腸直腸がん、乳がん、膵臓がん、甲状腺がん、前立腺がん、卵巣がん、頭頸部がんまたは肺がんである。別のより好ましい実施形態において、乳がんはトリプルネガティブ乳がんであり、肺がんは小細胞肺がんである。

【0181】

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＊＊＊

【0182】

本発明を以下の実施例により説明するが、これらは単に例示であって本発明の範囲を限定するものではないとみなされるべきである。

【実施例】

【0183】

材料および方法
マウス
マウスＮＯＤ．Ｃｇ－Ｐｒｋｄｃ^ＳＣＩＤＩＬ２ｒｇ^{ｔｍ１Ｗｊｌ}／ＳｚＪ（ＮＳＧ）雌性マウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒから提供され、Ｈｓｄ：胸腺欠損Ｎｕｄｅ－Ｆｏｘｎ１ｎｕ雌性マウスは、Ｅｎｖｉｇｏ ＲＭＳ ＳＰＡＩＮ Ｓ．Ｌ．から提供され、１２９Ｓ４－Ｒａｇ２ｔｍ１．１Ｆｌｖ Ｉｌ２ｒｇｔｍ１．１Ｆｌｖ／Ｊ（Ｒａｇ２－／－ＩＬ２Ｒγ欠損）雌性マウスは、ＣＩＭＡの動物施設で飼育した。動物は、１２時間明期／１２時間暗期の１日サイクルで、特定の病原体を含まない条件下で飼育し、滅菌水および餌を自由摂取させた。すべての動物実験手順は、ＲＤ１２０１／２００５の下でスペインの法律で施行されている欧州連合指令８６／６０９／ＥＥＣおよび勧告２００７／５２６／ＥＣに準拠した。動物実験プロトコルは、参加機関（ＩＤＩＰＨＩＳＡ、ｉｍａｓ１２、ＣＩＥＭＡＴおよびＣＩＭＡ）の各動物実験倫理委員会により承認され、国際医学団体協議会（ＣＩＯＭＳ）により制定された「動物を用いた生物医学研究のための国際指導原則」に記載されたガイドラインを厳守して実施された。実験研究プロトコルは、さらに地方自治体の承認を得ている（ＰＲＯＥＸ０９４／１５、１０８／１５、０７６／１９および１６６／１９）。

【0184】

抗体および細胞株
実験に使用した市販の抗体を表Ｉに記載する。

【0185】

【表1-1】

【0186】

【表1-2】

【0187】

【表1-3】

【0188】

組換え的に作製された抗体を表ＩＩに記載する。

【0189】

【表2】

【0190】

ＨＥＫ２９３（ＣＲＬ－１５７３）細胞、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＨＴＢ－２６）細胞、Ａ４３１（ＣＲＬ－１５５５）細胞、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＣＲＬ－１６５８）細胞およびＣＨＯ－Ｋ１（ＣＣＬ－６１）細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、ＤＭＥＭ完全培地（ＤＣＭ）と呼ばれる、２ｍＭのＬ－グルタミン、１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）熱不活性化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、および抗生物質（１００ユニット／ｍＬペニシリン、１００ｍｇ／ｍＬストレプトマイシン）（すべてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｌｏｎｚａ）中で、湿度、５％ＣＯ２中、３７℃で培養した。ｈｕＥＧＦＲを発現するＮＩＨ／３Ｔ３細胞（３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}）（Ｅｓｔｒａｄａ Ｃ．ら、１９９２）は、Ａ．Ｖｉｌｌａｌｏｂｏ博士（ＩＩＢｍ、マドリッド、スペイン）の好意により提供された。ｈｕ４－１ＢＢ発現ＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２３９^{ｈｕ４－１ＢＢ}）は、発現ベクターｐＣＭＶ３－Ｆｌａｇ－ＴＮＦＲＳＦ９（ＳｉｎｏＢｉｏｌｏｇｉｃａｌ）を用いたトランスフェクションにより作製し、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＤＣＭ中で選択した。ヒトＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２）を発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、Ｐｒｏｍｅｇａ（＃ＪＡ２２５１）から入手した。細胞株は、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ Ｐｌｕｓ（商標）プライマーセット（Ｂｉｏｔｏｏｌｓ Ｂ＆Ｍ Ｌａｂｓ）を用いたＰＣＲにより、マイコプラズマ汚染がないことを日常的にスクリーニングした。

【0191】

発現ベクターの構築
ＳＡＰ３．２８ｓｃＦｖベースのＮ末端トリマーボディを作製するために、ＦＬＡＧ－ｓｔｒｅｐＩＩ－ＳＡＰ３．２８ＨＬ（ＶＨ－リンカー－ＶＬ）ｓｃＦｖをコードするＤＮＡフラグメントをＧｅｎｅａｒｔ ＡＧが合成し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩとして、発現ベクターｐＣＲ３．１－ＭＦＥ２３Ｎ（Ｃｕｅｓｔａ ＡＭ．ら、２００９）にサブクローニングし、ｐＣＲ３．１－ＦＬＡＧ－ｓｔｒｅｐＩＩ－ＳＡＰ３．２８ＨＬ－Ｎ－ｍｙｃ／Ｈｉｓを得た。Ｃ末端のｍｙｃ／Ｈｉｓタグ配列は、Ｆｗ－ＣＭＶおよびＳｔｏｐ－ＸｂａＩ－Ｒｅｖプライマー（表ＩＩＩ）を用いて、プラスミドからＰＣＲによって除去した。

【0192】

【表3】

【0193】

Ｆｌａｇ－ｓｔｒｅｐＩＩ－ＳＡＰ３．２８ＨＬ ｓｃＦｖ遺伝子を、ヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲン由来のホモ三量体化（ＴＩＥ^{ＸＶＩＩＩ}）ドメインおよび抗ヒトＥＧＦＲシングルドメイン抗体（ＶＨＨ；ＥＧａ１）（Ｓｃｈｍｉｔｚ ＫＲら、２０１３）を含むベクターにＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩとしてサブクローニングし、二重特異性トリマーボディ発現ベクターｐＣＲ３．１－ＦＬＡＧ－ｓｔｒｅｐＩＩ－ＳＡＰ３．２８ＨＬ－Ｎ１８／Ｃ１８ＥＧａ１を得た。すべての配列を、プライマーＦｗＣＭＶおよびＲｖＢＧＨを用いて検証した（表ＩＩＩ）。

【0194】

組換え抗体の発現および精製
ＨＥＫ２９３細胞を、リン酸カルシウム沈殿法によって、適切な発現ベクターを用いてトランスフェクトし、５００μｇ／ｍＬのＧ４１８を含むＤＣＭ中で選択して、安定な細胞株２９３－ＳＡＰ３．２８Ｎおよび２９３－ＳＡＰ３．２８^Ｎ／ＣＥＧａ１を作製した。条件培地を回収し、ＡＫＴＡ Ｐｒｉｍｅ ｐｌｕｓシステム（Ｃｙｔｉｖａ）を用いたＳｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）精製システム（ＩＢＡ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて精製した。精製抗体を、ＰＢＳ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）に対して４℃で一晩透析し、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、４℃で保存した。精製抗体を、Ｐｉｅｒｃｅ’ｓリムルスアメボサイト溶解物（ＬＡＬ）発色エンドトキシン定量キットにより、製造業者の仕様書（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に従って、エンドトキシンレベルをテストした。精製抗体ストックのエンドトキシンレベルは、ＬＡＬテストにより０．２５ＥＵ／ｍｌ未満であった。

【0195】

ウエスタンブロット法
タンパク質試料を、１０～２０％トリス－グリシンゲル上で、還元条件下で分離し、ニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に転写し、抗ＦＬＡＧまたは抗Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ ｍＡｂを用いて探索し、続いて、ＤｙＬｉｇｈｔ８００コンジュゲート化ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧと共にインキュベートした。タンパク質バンドの可視化および定量分析を、Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）赤外イメージングシステム（ＬＩ－ＣＯＲ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行った。

【0196】

ＥＬＩＳＡ
マウス（ｍｏ－）、カニクイザル（ｃｙ－）およびｈｕ４－１ＢＢ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃９３７－４Ｂ、＃９３２４－４Ｂ、＃８３８－４Ｂ）（５μｇ／ｍｌ）、または、ｍｏ－、ｃｙ－およびｈｕＥＧＦＲ－ヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、＃１２８０－ＥＲ、＃１０３６６－ＥＲ、＃３４４－ＥＲ）（５μｇ／ｍｌ）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート（ＮＵＮＣ Ｂｒａｎｄ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）上に４℃で一晩固定化した。２００μｌのＰＢＳ＋５％ＢＳＡ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）で洗浄およびブロッキングした後、１００μｌの精製タンパク質溶液を添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ－２０で３回洗浄し、１００μｌの抗ＦＬＡＧまたは抗Ｓｔｒｅｐ－ｔａｇＩＩ ｍＡｂを添加し、室温で１時間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、１００μｌのＨＲＰコンジュゲート化ＧＡＭ ＩｇＧ（ＧＡＭ－ＨＲＰ）を各ウェルに添加した。その後、プレートを洗浄し、ＯＰＤ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させた。組換えＨｉｓタグ付きｈｕ４－１ＢＢ（Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１００１４－Ｈ０８Ｈ）（３μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩固定化し、ウェルを洗浄およびブロッキングし、抗ｈｕ４－１ＢＢ抗体を１０倍連続希釈にて３連で添加し、平衡結合曲線を得た。１時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、それぞれＨＲＰコンジュゲート化ヤギ抗ヒトＩｇＧ（ＧＡＨ－ＨＲＰ）（１：１０００）またはＧＡＭ－ＨＲＰ（１：１０００）と共にインキュベートした。プレートをＴＭＢ（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を用いて発色させ、４５０～５７０ｎｍで吸光度を測定した。競合ＥＬＩＳＡでは、ウェルをｈｕ４－１ＢＢＬヒトＩｇＧ１ Ｆｃキメラ（Ａｂｃａｍ、＃ａｂ２１７５６７）（５μｇ／ｍＬ）で、４℃で一晩コートした。プレートを洗浄し、前述のようにブロッキングした。組換えＨｉｓタグ付きｈｕ４－１ＢＢ（１μｇ／ｍＬ）を、漸増濃度（０～１０μｇ／ｍＬ）のウレルマブまたは４－１ＢＢ ＩｇＧ（ＳＡＰ３．２８ ＩｇＧ）と共に３０分間プレインキュベートした後、その混合物を、ｈｕ４－１ＢＢＬでコートしたウェルに３連で移し、１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、Ｔｅｔｒａ－Ｈｉｓ ｍＡｂ（αＨｉｓ４）と共に、次いでＧＡＭ－ＨＲＰ（１：１０００）と共に、１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、ＴＭＢを用いて発色させた。両方の抗ｈｕ４－１ＢＢ ｍＡｂのエピトープ結合をさらに評価するために、Ｈｉｓタグ付きｈｕ４－１ＢＢを、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＥＬＩＳＡプレート上に４℃で一晩固定化した（３μｇ／ｍＬ）。上記のように洗浄およびブロッキングを行った後、ウレルマブまたは４－１ＢＢ Ｉｇを、飽和となるようにあらかじめ決定した濃度である１０μｇ／ｍＬで１時間、３連で添加した。ウェルを洗浄した後、前の工程で使用しなかったもう一方の抗体を、１μｇ／ｍＬでウェルに添加した。１時間後、プレートを洗浄し、１００μｌのＧＡＭ－ＨＲＰまたはＧＡＨ－ＨＲＰ（１：０００）を各ウェルに添加した。その後、プレートを洗浄し、ＴＭＢを用いて発色させた。

【0197】

質量分析
２μｌのタンパク質試料を、ＺｉｐＴｉｐ（登録商標）Ｃ４マイクロカラム（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて脱塩し、０．５μｌのＳＡ（シナピン酸、［７０：３０］アセトニトリル：トリフルオロ酢酸０．１％中１０ｍｇ／ｍｌ）マトリックスを用いてＧｒｏｕｎｄＳｔｅｅｌ ｍａｓｓｉｖｅ ３８４ ｔａｒｇｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）上に溶出した。Ａｕｔｏｆｌｅｘ ＩＩＩ ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＴＯＦ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を、リニアモードで、以下の設定で使用した：５０００－４００００Ｔｈウィンドウ、リニアポジティブモード、イオン源１：２０ｋＶ、イオン源２：１８．５ｋＶ、レンズ：９ｋＶ、１２０ナノ秒のパルスイオン抽出、最大１０００Ｍｒまでの高ゲーティングイオン抑制。質量較正を、タンパク質１標準較正混合物（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を用いて外部で行った。データ取得、ピークのピーキングおよびその後のスペクトル分析を、Ｆｌｅｘ Ｃｏｎｔｒｏｌ ３．０およびＦｌｅｘ Ａｎａｌｙｓｉｓ ３．０ソフトウェア（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）を使用して行った。

【0198】

サイズ排除クロマトグラフィー－多角度レーザー光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）
静的光散乱測定は、ＤＡＷＮ－ＨＥＬＥＯＳ光散乱検出器およびＯｐｔｉｌａｂ ｒＥＸ示差屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）にインラインで接続されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ １０／３００ ＧＬカラム（Ｃｙｔｉｖａ）を使用して２５℃で行った。カラムの排除体積は８．６ｍＬであり、いずれの注入においても吸光度は観察されなかった（凝集タンパク質は観察されなかった）。カラムを、ランニング緩衝液（ＰＢＳ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１μｍでろ過）を用いて平衡化し、ＳＥＣ－ＭＡＬＳシステムを、同じ緩衝液中１ｇ／ＬのＢＳＡの試料を用いて較正した。次いで、ランニング緩衝液中１．１ｇ／Ｌの２種類のトリマーボディのそれぞれ１００μＬの試料を、０．５ｍＬ／分の流速でカラムに注入した。データの取得および分析は、ＡＳＴＲＡソフトウェア（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を用いて行った。報告されたモル質量は、クロマトグラフィーピークの中央に相当する。同一または類似の条件下での１ｇ／ＬのＢＳＡ試料における多数の測定値に基づき、モル質量の実験誤差はおよそ５％であると推定している。

【0199】

円偏光二色性
円偏光二色性測定は、Ｊａｓｃｏ Ｊ－８１０分光偏光計（ＪＡＳＣＯ）を用いて行った。スペクトルを、ＰＢＳ＋１５０ｍＭのＮａＣｌ中０．１ｇ／Ｌのタンパク質試料について、０．２ｃｍ光路長の石英キュベットを用いて２５℃で記録した。５～９５℃の熱変性曲線を、同じタンパク質試料およびキュベットについて、１℃／分の速度で温度を上昇させ、２１０ｎｍ（４－１ＢＢ^Ｎ）または２１３ｎｍ（４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ）での楕円率の変化を測定することによって記録した。

【0200】

小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）
ＳＡＸＳ実験を、Ｄｉａｍｏｎｄ Ｌｉｇｈｔ Ｓｏｕｒｃｅ（ジドコット）のビームラインＢ２１で行った。タンパク質を濃縮し、データ収集前に４℃で調製した。３ｍｇ／ｍｌおよび６ｍｇ／ｍｌの濃度の４－１ＢＢＮおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの試料４０μｌを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）＋１５０ｍＭのＮａＣｌで構成されるランニング緩衝液を使用して、インラインのＡｇｉｌｅｎｔ １２００ ＨＰＬＣシステムを介してＳｈｏｄｅｘ Ｋｗ－４０３カラムに４℃で送達した。連続的に溶出する試料を、Ｘ線波長１Å、および試料から検出器（Ｐｉｌａｔｕｓ ２Ｍ）までの距離３．９ｍを使用して、１０秒の取得ブロック中で３００秒間露光した。データは、０．０３２＜ｑ＜３．６９５Å－１の運動量移動範囲をカバーした。試料の溶出直前に記録されたフレームを、タンパク質散乱プロファイルから減算した。Ｓｃａｔｔｅｒソフトウェアパッケージ（ｗｗｗ．ｂｉｏｉｓｉｓ．ｎｅｔ）を使用して、データ、緩衝液の減算、スケーリング、統合、および試料の放射線損傷の可能性のチェックを分析した。３ｍｇ／ｍＬの４－１ＢＢＮに対応するデータセットは、凝集のためそれ以上分析できなかった。Ｒｇ値を、非常に小さな角度ｑ＜１．３／Ｒｇと仮定するＧｕｉｎｉｅｒ近似を用いて計算した。最大粒子分布Ｄｍａｘおよび距離分布を、ＧＮＯＭによる散乱パターンから計算し、形状の推定を、ＤＡＭＭＩＦ／ＤＡＭＭＩＮを用いて行い、これらのプログラムはすべて、ＡＴＳＡＳパッケージに含まれていた（Ｐｅｔｏｕｋｈｏｖ ＭＶ．ら，２０１２）。インタラクティブで作成されたＰＤＢに基づくモデルを、プログラムＲａｐｔｏｒＸを用いて得たテンプレートに基づいて、２つの抗体について作成した。このモデルの実空間の散乱プロファイルを、プログラムＦｏＸＳを用いて計算した。

【0201】

バイオレイヤー干渉法を用いた動態研究
適切な抗体と固定化抗原との間の相互作用を、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システム（Ｆｏｒｔｅｂｉｏ）でバイオレイヤー干渉法を用いて調べた。精製した抗原、ｈｕ４－１ＢＢおよびｈｕＥＧＦＲ（Ｒ＆Ｄ）を、標準的なアミン反応性化学を用いてＡＲ２Ｇバイオセンサー上に固定化した。簡単には、バイオセンサーをＥＤＣおよびｓ－ＮＨＳで活性化した後、ｐＨ５．０の１０ｍＭ酢酸緩衝液中５μｇ／ｍＬの抗原溶液中で３０分間インキュベートし、その後エタノールアミンでクエンチした。すべての結合研究は、動態緩衝液（ＰＢＳ＋０．１％ＢＳＡ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いて行った。４－１ＢＢ^Ｎおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲとｈｕ４－１ＢＢとの相互作用を調べるために、１ｎＭおよび５ｎＭの抗体をｈｕ４－１ＢＢ固定化バイオセンサーと２時間インキュベートし、その後、解離を動態緩衝液中で２時間測定した。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲおよびＡＴＴＡＣＫ抗体とｈｕＥＧＦＲ固定化バイオセンサーとの相互作用には、同じ抗体濃度および時間長を用いた。溶液中の固定化ｈｕ４－１ＢＢおよびｈｕＥＧＦＲに対する４－１ＢＢ^Ｎおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲのタンデム結合は、５ｎＭのいずれかの抗体、または動態緩衝液のみを、２連のｈｕ４－１ＢＢ固定化バイオセンサーに１時間結合させ、続いて１時間解離させることによって調べた。次いで、２連のバイオセンサーの一方を、動態緩衝液中１０ｎＭのｈｕＥＧＦＲに導入し、もう一方は動態緩衝液中で維持した。１時間の二次結合の後、二次解離を１時間測定した。

【0202】

インビトロ４－１ＢＢ依存性ＮＦ－κＢ活性化アッセイ
活性化核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）の４－１ＢＢ依存性活性化アッセイは、製造業者の使用説明書に従って、ｔｈａｗ－ａｎｄ－ｕｓｅ（Ｔ＆Ｕ）ＧｌｏＲｅｓｐｏｎｓｅ（商標）ＮＦκＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ，＃ＪＡ２３５１）を用いて行った。全般的なアッセイを行うために、１×１０５のＪｕｒｋａｔ細胞／ウェルを、白壁９６ウェルプレート（Ｍｅｒｃｋ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）中のＡｓｓａｙ Ｂｕｆｆｅｒ（ＲＰＭＩ＋１％ＦＣＳ）中に播種した。抗４－１ＢＢアゴニストおよびコントロール抗体を１０倍連続希釈で添加した。ヒトＥＧＦＲ陰性細胞（３Ｔ３）またはＥＧＦＲ陽性細胞（３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}）、およびＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ）またはヒトＦｃγＲＩＩｂを発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（ＣＨＯ^{ｈｕＦｃγＲＩＩｂ}）（２×１０^４細胞／ウェル）を添加し、Ｊｕｒｋａｔ^{４－１ＢＢ}細胞を３７℃で６時間刺激した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、Ｔｅｃａｎ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｆ２００プレート読み取りルミノメーター（Ｔｅｃａｎ Ｔｒａｄｉｎｇ ＡＧ）を用いてルシフェラーゼ活性を評価した。実験は３連で行い、データを非刺激細胞から得られた値に対するｘ倍の誘導として報告した（平均値±ＳＤ）。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍフィッティングソフトウェア６．０１を用いて分析し、プロットした。

【0203】

ＥＧＦＲを介した細胞増殖およびシグナル伝達の阻害
Ａ４３１細胞を９６ウェルプレート中のＤＣＭ中に播種した。２４時間後、培地を、等モル濃度（０．１９～５０ｎＭ）のセツキシマブ、リツキシマブ、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲまたは４－１ＢＢ ＩｇＧを含むＤＭＥＭ＋１％ＦＣＳに交換し、７２時間インキュベートした。生存率は、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｇ７５７０）を用いて評価した。実験は３連で行った。ＥＧＦＲシグナル伝達の研究では、Ａ４３１細胞をＤＭＥＭ１％ＦＣＳ中で一晩飢餓状態にした後、０．１μＭのセツキシマブ、リツキシマブ、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲまたは４－１ＢＢ ＩｇＧの存在下、無血清ＤＭＥＭ中で４時間インキュベートし、続いて２５ｎｇ／ｍＬのヒトＥＧＦ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ、＃１３０－０９７－７４９）と１０分間インキュベートした。試料を、１２％トリス－グリシンゲル上で、還元条件下で分離し、ニトロセルロース膜に転写し、ブロッキングし、ウサギ抗ヒト蛍光体－ＥＧＦＲ（Ｔｙｒ１０６８）ｍＡｂとインキュベートした後、ＩＲＤｙｅ８００－ロバ抗ウサギ抗体とインキュベートした。同時に、ローディング対照として抗β－アクチンマウスｍＡｂを添加し、続いてＩＲＤｙｅ７００－ロバ抗マウスＩｇＧを添加した。タンパク質バンドの可視化および定量分析は、Ｏｄｙｓｓｅｙシステムを用いて行った。

【0204】

ヒトＰＢＭＣおよびＴ細胞の単離
健常ドナー由来の細胞は、アフェレーシス手順（Ｎｅｒｏｎ Ｓ．ら、２００７）後に回収された小型白血球除去チャンバー（ＬＲＳチャンバー）から単離した。ＬＲＳチャンバー内容物を滅菌チューブ内に流し、最大５０ｍｌまでのＰＢＳでリンスし、Ｆｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（Ｃｙｔｉｖａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いた密度勾配遠心（２０００ｒｐｍ、室温で２０分）によってｈｕＰＢＭＣを単離した。ＡＣＫ溶解緩衝液（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加して残留赤血球（ＲＢＣ）を除去し、ｈｕＰＢＭＣを洗浄し、計数し、所望の最終濃度に再懸濁した。ヒトＴ細胞は、Ｐａｎ Ｔ細胞単離キット（ヒト）（Ｍｉｌｔｅｎｙ Ｂｉｏｔｅｃｈ、＃１３０－０９６－５３５）を用いて、製造業者の使用説明書に従って精製した。細胞を洗浄し、計数し、所望の最終濃度に再懸濁した。

【0205】

ヒトＰＢＭＣおよびＴ細胞活性化アッセイ
ヒトＰＢＭＣまたは単離Ｔ細胞（１．５×１０^５細胞／ウェル）を、１０％ＦＣＳおよび５０μＭのβ－メルカプトエタノール（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充したＲＰＭＩ中で平底９６ウェルプレートに３連で播種し、４５Ｇｙ照射された標的細胞（３Ｔ３または３Ｔ３^{ｈＥＧＦＲ}）と、エフェクター／標的比５：１で共培養した。抗ｈｕ４－１ＢＢアゴニスト抗体および対照は、０．０５μｇ／ｍｌの抗ｈｕＣＤ３（ＯＫＴ３）ｍＡｂの存在下で、１０倍連続希釈で添加した。７２時間後、無細胞上清を、サイトカイン分泌についてＥＬＩＳＡにより分析した。照射されたＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１細胞（３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}）またはＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１＋細胞（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）（３×１０^４細胞／ウェル）を、抗ＰＤ－Ｌ１（アテゾリズマブ）単独（１０μｇ／ｍｌ）または４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（１μｇ／ｍｌ）との組み合わせの存在下で、０．０５μｇ／ｍｌの抗ｈｕＣＤ３で活性化されたｈｕＰＢＭＣ（１．５×１０^５細胞／ウェル）と共に播種した。無細胞上清を、７２時間後にＩＦＮγについてＥＬＩＳＡ（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、＃８５１５６０００５）により測定した。

【0206】

フローサイトメトリー
ｈｕ４－１ＢＢを発現している細胞（２．５×１０^５細胞／ウェル）を、精製抗体（３μｇ／ｍｌ）と氷上で１時間インキュベートし、洗浄後、抗ＦＬＡＧ ｍＡｂと氷上で３０分間インキュベートし、ＰＥコンジュゲート化Ｆ（ａｂ’）２ ＧＡＭ ＩｇＧ抗体で検出した。Ｍ．Ｇｌｅｎｎｉｅ（サウサンプトン大学、英国）の好意により提供された精製抗ｈｕ４－１ＢＢ ＩｇＧ１ ｍＡｂ（クローンＳＡＰ３．２８）を、対照として用いた。ヒトＦｃγＲＩＩｂの発現を調べるために、細胞を、抗ｈｕＣＤ３２ ｍＡｂおよびＰＥ－ＧＡＭ－Ｆ（ａｂ’）２とインキュベートした。ｈｕＥＧＦＲおよびｈｕＰＤ－Ｌ１の細胞表面発現は、３Ｔ３、３Ｔ３^{ｈＥＧＦＲ}およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞について、ＰＥコンジュゲート化抗ｈｕＥＧＦＲおよびＡＰＣコンジュゲート化抗ｈｕＰＤ－Ｌ１ ｍＡｂとインキュベートした後に分析した。試料は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ Ａｎａｌｙｚｅｒ １０フローサイトメーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＧｍｂＨ）で分析した。試料ごとに最低２０，０００件のイベントを取得し、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ Ｖ３ソフトウェア（Ｄｅ Ｎｏｖｏ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，グレンデール，カリフォルニア州，ＵＳＡ）を用いてデータを評価した。

【0207】

血清安定性
精製された４－１ＢＢ^Ｎおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲを、６０％ヒト血清中、３７℃で４日間インキュベートした。試料は、実験終了まで、様々な時点で－８０℃で凍結し、ｈｕ４－１ＢＢおよびｈｕＥＧＦＲへの結合活性をＥＬＩＳＡにより分析した（上記の通り）。結合活性の減衰パーセンテージに対応する時間を計算するために、０時間での試料の結合活性を１００％とした。

【0208】

４－１ＢＢ ^Ｎ／Ｃ ＥＧＦＲのコンジュゲーションおよび ^８９ Ｚｒ標識
４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（１ｍｇ）を、ｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミン（Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ）と、以前に報告された方法（Ｖｏｓｊａｎ ＭＪ．ら、２０１０）を用いてコンジュゲート化した。ジルコニウム－８９（^８９Ｚｒ）（Ｔ_１／２＝７８．４時間、β^＋＝２２．６％；１Ｍシュウ酸中約２．７ＧＢｑ／ｍｌで市販）は、Ｃｙｃｌｏｔｒｏｎ ＶＵから入手した。８９Ｚｒを用いたＤｆ－４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの放射性標識を、以前に記載された従来の方法を用いて達成し、ＰＤ－１０カラム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で精製した（Ｖｏｓｊａｎ ＭＪ．ら、２０１０）。放射性標識収率（ＲＣＹ）は、使用された全放射能のうちそれぞれの収集画分で回収された放射能％として決定し、経過時間に対する減衰に関して測定値を補正した。８９Ｚｒ放射能の決定は、最近報告された換算係数（またはダイヤル設定係数）（Ｇａｒｃｉａ－Ｔｏｒａｎｏ Ｅ．ら、２０１９）を用いて、線量校正器ＶＤＣ－４０５（Ｖｅｅｎｓｔｒａ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して行った。放射化学的純度（ＲＱＰ）は、全放射能のうち所望の放射性医薬品形態中に存在する放射性核種の放射能の％として定義され、インスタント薄層クロマトグラフィー（ＩＴＬＣ）により分析した。実験は３連で行った。

【0209】

薬物動態研究
６週齢の雌性無胸腺ヌードマウスに、ＰＢＳ中２４２．３５ｋＢｑ（１４μｇ）の^８９Ｚｒ標識４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲをｉ．ｖ．注射（尾静脈）した。薬物動態研究では、血液試料をヘパリン処理チューブに採取し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿中の放射能濃度は、１ｍＬあたりの注入量パーセント（％ＩＤ／ｍＬ）として算出し、注入後の時間に対してプロットした。放射能の血漿中濃度対時間は、非線形回帰を用いたコンパートメント法により解析した（Ｂｒｏｗｎ ＡＭ．ら、２００１）。薬物動態パラメータの初期推定値は、アドインプログラムＰＫＳｏｌｖｅｒ（Ｚｈａｎｇ Ｙ．ら、２０１０）による曲線ストリッピング法を用いて計算した。赤池情報量規準（ＡＩＣ）を用いて、最適コンパートメントモデルを決定した。血液クリアランス（Ｃｌ_血液）は、以下の関係を用いて血漿クリアランス（Ｃｌ_血漿）から推定した：Ｃｌ_血液＝Ｃｌ_血漿／ＢＰ（式中、ＢＰは血液対血漿比である）。

【0210】

ヒト化大腸がん細胞株由来異種移植（ＣＤＬＸ）モデル
ＨＴ２９細胞（１×１０^６個）を、６週齢のＲａｇ２_－／－ＩＬ２Ｒγ欠損雌性マウスの背側腔にｓ．ｃ．移植し、続いて新鮮ｈｕＰＢＭＣ（１×１０^７細胞／マウス）をｉ．ｐ．注入した。腫瘍成長を、週３回のノギス測定によってモニターし、腫瘍が直径約０．４ｃｍに達した時点で、マウスを治療のために無作為に割り付けた（ｎ＝７～８／群）。測定は、治療割り付けを盲検化された研究者が、無作為の順序で行った。３日ごとに５回のＣＥＡ^Ｎまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディ（４ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射、または１週間ごとに３回の４－１ＢＢ ＩｇＧ（４ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射を行って、マウスを治療した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（２×１０^６個）をＰＢＳに再懸濁し、マトリゲル（３０％）と混合した。細胞を、６週齢のＮＳＧ雌性マウスの右脇腹背側にｓ．ｃ．移植し、続いて新鮮単離ｈｕＰＢＭＣ（１×１０^７細胞／マウス）をｉ．ｐ．注射した。腫瘍成長は、週３回のノギス測定でモニターした。担がんマウス（直径０．２ｃｍ）を無作為に４群に分け（ｎ＝５～６／群）、研究者は治療割り付けを盲検化された。３日ごとに５回の４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディ（４ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射、または１週間ごとに３回のＰＤ－Ｌ１ ＩｇＧ（４ｍｇ／ｋｇ）のｉ．ｐ．注射を、単独または併用して行い、マウスを治療した。毒性をモニターするために、マウスの体重を週２回測定した。苦痛の徴候および／または１０～１５％の体重減少が認められた時点で、マウスを安楽死させた。

【0211】

ヒト化患者由来異種移植（ＰＤＸ）モデル
この研究では、予め増幅された肺ＰＤＸ ＴＰ１０３を、組織型、遺伝的背景（ＥＧＦＲおよびＴＰ５３変異）、およびｈｕＥＧＦＲ細胞表面発現に従って選択した（Ｑｕｉｎｔａｎａｌ－Ｖｉｌｌａｌｏｎｇａ Ａ．ら、２０１９）。腫瘍を約５０ｍｍ^３の断片に切断し、麻酔下の６週齢のＮＳＧ雌性マウスの背側腔に小さな切開からｓ．ｃ．移植した。腫瘍成長を、３～４日ごとのノギス測定によってモニターし、腫瘍が直径約０．５ｃｍに達した時点で、マウスを平均腫瘍サイズおよびＳＤが同程度の群（ｎ＝６～７／群）に無作為に割り付け、健常ドナー由来の新鮮単離ｈｕＰＢＭＣ（１×１０^７細胞／マウス）をｉ．ｐ．注入した。３日ごとに４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ（４ｍｇ／ｋｇ）を５回ｉ．ｐ．注射して、マウスを治療した。毒性をモニターするために、マウスの体重を週１回測定した。体重減少が１０～１５％以上になった場合、腫瘍サイズが任意寸法で直径１．０ｃｍに達した場合、腫瘍が潰瘍化した場合、またはマウスに苦痛の徴候が認められた場合、マウスを安楽死させた。

【0212】

免疫組織化学的検査
免疫組織化学染色は、ホルマリン固定、パラフィン包埋した試料の４μｍ厚切片で行った。スライドを、Ｂｏｎｄ（商標）自動化システム（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、製造業者の使用説明書に従って、表Ｉに記載したマウスｍＡｂと共にインキュベートした。核は、ハリスヘマトキシリンで対比染色した。

【0213】

統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアのバージョン６．０を用いて行った。通常、インビトロ実験は３連で行い、値を、少なくとも３つの別々の実験のうちの１つからの平均値±ＳＤとして示している。有意差（Ｐ値）は、正規分布を仮定した両側独立Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定を適用して判別した。Ｐ値は、各実験の対応する図に示した。ＥＣ５０は、非線形回帰曲線（対数アゴニスト対正規化応答－可変応答）を用いて算出した。平均腫瘍体積は、散布図を用いて平均値±ＳＤとして各群について示した。治療群間の差異を評価するため、多重比較検定のためのボンフェローニ補正により調整した一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）によってＰ値を決定した。

【0214】

実施例１．４－１ＢＢアゴニストヒト化トリマーボディの作製および特性評価
抗ｈｕ４－１ＢＢトリマーボディは、ｈｕ４－１ＢＢ ＣＲＤ－１に結合する抗ｈｕ４－１ＢＢアゴニストＳＡＰ３．２８ ｍＡｂ（図５ａ）（ＷＯ／２０１７／０７７０８５）に由来するｓｃＦｖコード遺伝子を用いて作製した。ＳＡＰ３．２８ ＩｇＧ（以下、４－１ＢＢ ＩｇＧと呼ぶ）は、ヒト化ＶＬドメイン、および抗原結合を保持するためにマウスＦＲ３領域を保存する部分ヒト化ＶＨドメイン、およびマウスＩｇＧ１のＦｃ領域を提示する、キメラ分子である（ＷＯ／２０１７／０７７０８５）。ＣＲＤ－１のＮ末端を認識するウレルマブ（Ｃｈｉｎ ＳＭ．ら、２０１８）と同様に、４－１ＢＢ ＩｇＧは、ｈｕ４－１ＢＢ受容体／ｈｕ４－１ＢＢＬ相互作用を遮断しない（図６ａ～ｃ）。さらに、本発明者らは、４－１ＢＢ ＩｇＧとウレルマブのエピトープがオーバーラップしていないことを示した（図６ｄおよびｅ）。本発明者らは、ＳＡＰ３．２８ ｓｃＦｖをヒトＸＶＩＩＩ型コラーゲン由来のホモ三量体化（ＴＩＥＸＶＩＩＩ）ドメインにフレキシブルリンカーを用いて融合させることによって、ＳＡＰ３．２８ ｓｃＦｖベースの抗ｈｕ４－１ＢＢ Ｎ末端トリマーボディ（４－１ＢＢＮ）を設計し（図５ｂおよびｃ）、抗ＥＧＦＲ ＥＧａ１ Ｖ_ＨＨ抗体（Ｓｃｈｍｉｔｚ ＫＲ．ら、前掲書２０１３）を４－１ＢＢＮのＣ末端に融合させて４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲと呼ばれる構築物を作製することによって、二重特異性トリマーボディを設計した（図１ａ）。両トリマーボディとも、安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞由来の条件培地から、Ｓｔｒｅｐ－Ｔａｃｔｉｎアフィニティークロマトグラフィーによって、純度９５％を超えるタンパク質収率（それぞれ３．５ｍｇ／Ｌおよび４．５ｍｇ／Ｌ）で精製された（図７ａ）。質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを使用、図示せず）により、精製抗体中にシグナル配列が存在しないことを確認した。４－１ＢＢ^Ｎおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの両方に対するＳＥＣ－ＭＡＬＳ実験から、それぞれモル質量が１１１ｋＤａおよび１６０ｋＤａの主要なピークが得られ（図７ｂおよびｃ）、これらは三量体分子と一致している。モル質量が２１７ｋＤａおよび３４０ｋＤａのより小さな体積の微小ピークは、他のトリマーボディで以前に観察されたように（Ｃｏｍｐｔｅ Ｍ．ら、２０１８）、三量体の二量体の存在を示している。円偏光二色性測定は、顕著なｂシート構造および協同的な熱変性（Ｔｍ＝約６０℃；図７ｄおよびｅ）を示している。小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を用いて、両トリマーボディの三次元構造を調べた。４－１ＢＢ^Ｎトリマーボディは、平坦な分布を示し、中央に明確なＴＩＥＸＶＩＩＩコアがあり、ｓｃＦｖｓが車輪のスポークのように同一平面上に部分的に伸長している（図８および９；表ＩＶ）。

【0215】

【表4】

【0216】

【表5】

【0217】

４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、４－１ＢＢＮと同じ平面構造を維持し、それに加えて、小さなサイズのＥＧＦＲ ＶＨＨドメインが４－１ＢＢ ｓｃＦｖｓの間に散在しており、６枚刃の手裏剣に似ている（図１ｂ；図９；表ＩＶ）。バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）を用いて、ｈｕ４－１ＢＢに結合する４－１ＢＢＮおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ、ならびにｈｕＥＧＦＲに結合する４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲおよび抗ＥＧＦＲ ＡＴＴＡＣＫ抗体（Ｈａｒｗｏｏｄ ＳＬ．ら、２０１７）の会合および解離速度を測定した（図１ｃ）。

【0218】

二重特異性ＡＴＴＡＣＫ抗体は、３つのＥＧＦＲ結合ＶＨＨ抗体と１つのＣＤ３結合ｓｃＦｖを組み合わせたタンデムトリマーボディフォーマット（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｃｉｅｎｆｕｅｇｏｓ Ａ．ら、２０１６）を進化させたものである（Ｈａｒｗｏｏｄ ＳＬら、前掲、２０１７）。すべての相互作用は、高い親和性（低いピコモルＫＤ値）であり、バイオセンサー表面に提示された抗原に対するトリマーボディの機能的三価性を示していた（表Ｖ）。これらの三価抗体によるｈｕＥＧＦＲ結合の動態は、以前の研究（Ｃｏｍｐｔｅ Ｍ．ら、前掲、Ｈａｒｗｏｏｄ ＳＬら、前掲）と一致している。補足実験では、４－１ＢＢ^Ｎおよび４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲを、まずバイオセンサー表面に固定化されたｈｕ４－１ＢＢにロードし、次いで、そのバイオセンサーを、ｈｕＥＧＦＲを含む緩衝液中に移動させた。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲは、４－１ＢＢ^Ｎとは異なり、固定化ｈｕ４－１ＢＢに結合したまま可溶性ｈｕＥＧＦＲに結合することが可能であり、その二価性および両方の抗原に同時に結合する能力をさらに確認した（図１ｄ）。さらに、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲは、マウス（ｍｏ－）、カニクイザル（ｃｙ－）およびｈｕＥＧＦＲに結合し（図１０ａ）、ｃｙ４－１ＢＢおよびｈｕ４－１ＢＢにも結合したが、ｍｏ４－１ＢＢへの結合ははるかに低かった（図１０ｂ）。細胞状況でのｈｕ４－１ＢＢおよびｈｕＥＧＦＲを検出する能力を、フローサイトメトリーで分析した。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、野生型ＨＥＫ２９３（ＥＧＦＲ＋）細胞、細胞表面にｈｕ４－１ＢＢを発現するようにトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞（ＨＥＫ２９３ｈｕ４－１ＢＢ）、およびｈｕＥＧＦＲを発現しているマウス３Ｔ３細胞（３Ｔ３ｈｕＥＧＦＲ）に結合したが、野生型３Ｔ３細胞には結合しなかった（図１１）。一方、４－１ＢＢ ＩｇＧは、ＨＥＫ２９３ｈｕ４－１ＢＢ細胞にのみ結合した（図１１）。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの多価結合をさらに評価するために、本発明者らは、Ａ４３１細胞における増殖およびＥＧＦＲリン酸化を阻害するその能力を研究した（Ｓｃｈｍｉｔｚ ＫＲ．ら、前掲）。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲおよびＥＧＦ競合的阻害剤であるセツキシマブ（Ｌｉ Ｓ．ら、２００５）の両方とも、抗ヒトＣＤ２０リツキシマブおよび親４－１ＢＢ ＩｇＧとは異なり、用量依存的にＡ４３１の増殖を阻害し（高用量の両抗体では、等モル用量の対照抗体と比較して、それぞれＰ＝０．００３およびＰ＝０．０００５）（図１２ａ）、ＥＧＦＲリン酸化も阻害した（図１２ｂ）。

【0219】

実施例２．ＦｃフリーＥＧＦＲ標的化４－１ＢＢアゴニストヒト化トリマーボディは、ＥＧＦＲ発現細胞の存在下でＴ細胞共刺激を有意に増強する
３種のＳＡＰ３．２８由来抗体およびウレルマブのアゴニスト活性を、細胞表面にｈｕ４－１ＢＢ、およびＮＦ－κＢ応答エレメントで駆動されるルシフェラーゼレポーターを構成的に発現するＮＦ－κＢ－ｌｕｃ２／４－１ＢＢ Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＪｕｒｋａｔＮＦ－κＢ）を用いて評価した。Ｊｕｒｋａｔ^{ＮＦ－κＢ}レポーター細胞を、ｈｕＦｃγＲＩＩｂ（ＣＨＯ^{ｈｕＦｃγＲＩＩｂ}）またはｈｕＥＧＦＲ（３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}）を安定に発現している標的細胞、および陰性対照として非トランスフェクトＣＨＯ細胞または３Ｔ３細胞と共培養し；細胞表面のｈｕＦｃγＲＩＩｂおよびｈｕＥＧＦＲの発現を、フローサイトメトリーにより実証した（図２ａおよびｂ）。次いで、二価（４－１ＢＢ ＩｇＧまたはウレルマブ）または三価（４－１ＢＢ^Ｎまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ）の抗ｈｕ４－１ＢＢ抗体の滴定物を共培養細胞に添加した。標的細胞表面にＦｃまたはＥＧＦＲを介した抗体架橋が存在しない場合（すなわち、非トランスフェクトＣＨＯ細胞または３Ｔ３細胞との共培養の場合）、４－１ＢＢ ＩｇＧは、試験したすべての濃度で、未処理のＪｕｒｋａｔ ＮＦ－κＢ細胞に対してほとんどまたは全く誘導を示さず、抗ｈｕ４－１ＢＢトリマーボディは両方とも約１０倍の誘導を示し、ウレルマブは約２０倍の誘導を示した（図２ｃおよびｄ）。ＦｃγＲＩＩｂを介した架橋が存在する場合（すなわち、ＣＨＯｈｕＦｃγＲＩＩｂを標的細胞として用いた場合）、４－１ＢＢ ＩｇＧは、２６倍の誘導（Ｐ＝０．０００８）でＮＦ－κＢの用量依存的な活性化を誘導し、ウレルマブの誘導はさらに４０倍（Ｐ＝０．００３）に増加した（図２ｃ）。トリマーボディはどちらも、ＦｃγＲＩＩｂを介した誘導の増加は示さなかった（図２ｃ）。トリマーボディを介した４－１ＢＢシグナル伝達は、標的細胞がｈｕＥＧＦＲを発現すると有意に増強され（Ｐ＝０．０００８）、ＮＦ－κＢルシフェラーゼレポーター活性が４０倍増加した（図２ｄ）。４－１ＢＢ ＩｇＧ、ウレルマブ、および４－１ＢＢＮによる誘導は、ｈｕＥＧＦＲの発現に影響されなかった（図２ｄ）。陰性対照抗体のｍｏＩｇＧ１、ｈｕＩｇＧ４、およびＣＥＡを認識するトリマーボディであるＣＥＡＮは、活性化を示さなかった（図１３ａおよびｂ）。次に、本発明者らは、健常ドナー由来のｈｕＰＢＭＣまたはＴ細胞を用いて、照射された３Ｔ３または３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞と共培養した場合のＩＦＮγ分泌に対する抗ｈｕ４－１ＢＢ抗体の効果を、最適以下の用量の抗ｈｕＣＤ３ ｍＡｂが存在する場合と存在しない場合の両方で調べた。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、ｈｕＰＢＭＣまたはＴ細胞をＥＧＦＲ＋細胞と共培養した場合にのみ、ＩＦＮγ分泌に対して用量依存的な活性化効果を示し；ＥＧＦＲ－細胞では、誘導は観察されなかった（図２ｅおよびｆ）。これらの条件下では、４－１ＢＢ ＩｇＧおよびＣＥＡＮの効果は最小限であり、ＥＧＦＲ発現とは無関係であった（図２ｅ；図１４）。これらのデータは、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲが、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介した最初のシグナル伝達（シグナル１）を必要とする、強力なＥＧＦＲ依存性Ｔ細胞共刺激およびＩＦＮγ分泌を誘導することを示している。その後、ｈｕＰＢＭＣを、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲおよびＰＤ－Ｌ１遮断抗体アテゾリズマブの存在下で、照射されたＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１－（３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}）細胞またはＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１＋（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１）細胞と共培養した（図２ｇ）。最適以下の用量の抗ｈｕＣＤ３ ｍＡｂと併用すると、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、ＩＦＮγ分泌を有意に増強した（Ｐ＝０．０００７ ３Ｔ３^{ｈｕＥＧＦＲ}細胞；Ｐ＝０．０００２ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞）（図２ｈ）。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ存在下でｈｕＰＢＭＣをＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞と共培養した場合、アテゾリズマブの添加により、ＩＦＮγレベルが有意に増加した（Ｐ＝０．０２）（図２ｈ）。

【0220】

実施例３．８９Ｚｒ標識４－１ＢＢ ^Ｎ／Ｃ ＥＧＦＲトリマーボディの薬物動態
４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、ヒト血清中３７℃で４日後、その最初の結合活性をほぼ１００％保持した（図１５ａおよびｂ）。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディをｐ－ＳＣＮ－Ｂｎ－デフェロキサミン（Ｄｆ）でキレート化しても、ＳＤＳ－ＰＡＧＥの遊走パターンは変化せず、結合活性も低下しなかった（図１６ａおよびｂ）。放射性標識後の精製［^８９Ｚｒ］Ｚｒ－Ｄｆ－４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲのＲＣＹ（放射性標識収率）およびＲＱＰ（放射化学的純度）は、それぞれ４０％および９５％であった。ＡＩＣ値は、［^８９Ｚｒ］Ｚｒ－Ｄｆ－４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの１コンパートメントおよび２コンパートメントについて、それぞれ１０．９７および－２２．６６であったたため、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの体内動態は、２コンパートメントモデルによってよりよく説明された（表ＶＩ）。

【0221】

【表6】

【0222】

静脈内投与後の［_８９Ｚｒ］Ｚｒ－Ｄｆ－４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの排出は二相性であり、半減期は急速な分布相で７．３時間、緩やかな分布相で６６．８時間であった（図３ａ）。定常状態での分布容積は６６．５ｍＬ（２．６３Ｌ／Ｋｇ）、血漿クリアランスは０．９７ｍＬ／時間（３７．６ｍＬ／Ｋｇ／時間）であった。血液対血漿比が０．６２であったことから、得られた血液クリアランス値は、心拍出量（マウスでは２１．７Ｌ／Ｋｇ／時間）と比較して非常に低く（０．０６２Ｌ／Ｋｇ／時間）、これは一般に、低用量レジメンで用いる薬剤を開発する上で望ましい値である（Ｔｏｕｔａｉｎ ＰＬ．ら、２００４）。

【0223】

実施例４．ＦｃフリーＥＧＦＲ標的化４－１ＢＢアゴニストヒト化トリマーボディの抗腫瘍活性
本発明者らは、ｈｕＰＢＭＣ駆動ヒト化イムノアバター（ｉｍｍｕｎｏａｖａｔａｒ）マウスモデルにおいて、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの抗腫瘍活性について試験した。Ｒａｇ２^－／－ＩＬ２Ｒγ^ｎｕｌｌマウスにｈｕＰＢＭＣを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、次いでヒトＨＴ－２９ ＣＲＣ細胞を皮下（ｓ．ｃ．）接種した（図３ｂ）。移植されたヒトＴ細胞は活性化され、異種移植対宿主病（ｘＧＶＨＤ）と呼ばれるプロセスである病原性異種反応性を生じるが（Ｎｅｒｖｉ Ｂ．ら、２００７）、移植されたヒトＴ細胞は治療薬による調節が可能であり、免疫調節戦略を試験するための貴重なモデルである（Ｃａｒｒｏｌｌ ＲＧ．ら，２００８、Ｍｕｔｉｓ Ｔ．ら，２００６、Ｓａｎｍａｍｅｄ ＭＦ．ら，２０１５）。腫瘍が直径約０．４ｃｍに達したマウスを、図３ｂに示すように、３／４日間隔で５回のトリマーボディ（ＣＥＡ^Ｎまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ）のｉ．ｐ．注射、または週３回の等モル用量の４－１ＢＢ ＩｇＧで治療した。用量および治療スケジュールは、ＣＲＣの免疫適格モデルにおいて抗ｍｏ４－１ＢＢアゴニストを用いて実施されたもの（Ｃｏｍｐｔｅ Ｍ．ら、前掲）と同様に設計した。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ治療群は、未治療群（Ｐ＝０．０１）およびＣＥＡＮ治療群（Ｐ＝０．００４）と比較して、有意に遅い腫瘍成長を示した（図３ｃ）。特に、ヒト化４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディは、４－１ＢＢ ＩｇＧに匹敵する抗腫瘍活性をインビボで示した（図３ｃ）。

【0224】

次に発明者らは、ＥＧＦＲ＋ＮＳＣＬＣ ＰＤＸを有するｈｕＰＢＭＣ駆動ヒト化ＮＳＧマウスモデル（ＴＰ１０３、図３ｄおよびｅ）においても抗腫瘍効果が生じるか否かを明らかにしようとした。図３ｆに示すように、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ治療マウスは、対照群と比較して腫瘍成長が抑制された。腫瘍成長制御の改善は、ＴＩＬ浸潤パターンの有意な変化を伴った。両群とも、腫瘍細胞巣を取り囲み関与しているＣＤ３＋Ｔリンパ球のびまん性浸潤が認められた（図１７）。ＰＢＳ処置マウスでは、ＣＤ４＋Ｔ細胞が多く、ＣＤ４／ＣＤ８比は２．８であった（図３ｇ～ｉ）。４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ治療群では、ＣＤ８＋Ｔ細胞数の有意な増加（Ｐ＝０．０４）が認められ、同時にＦｏｘｐ３＋細胞数の減少（Ｐ＝０．０１）も認められた（図３ｇ～ｉ；図１７）。

【0225】

本発明者らは、４－１ＢＢ ＩｇＧまたは４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディ（６ｍｇ／ｋｇ）を週１回３週間投与し、１週間後に安楽死させた、ｈｕＰＢＭＣ駆動ヒト化ＮＳＧマウスにおける毒性プロファイルを比較した。肝臓の組織学的研究により、４－１ＢＢ ＩｇＧ治療がｘＧＶＨＤを悪化させることが明らかになった。各治療群の代表的なマウスにおける肝浸潤の詳細を図３ｊに示すが、ＩｇＧベースの４－１ＢＢアゴニストで治療した群では広範囲の血管周囲単核細胞浸潤を示している。次に本発明者らは、屠殺時に採取した血清試料中のヒトＩＦＮγ濃度を調べた。４－１ＢＢ ＩｇＧ治療は、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ治療よりもＩＦＮγレベルを有意に増加させたが（Ｐ＝０．００１）、そのレベルはＰＢＳ処置マウスと同程度であった（図３ｋ）。

【0226】

実施例５．４－１ＢＢ ^Ｎ／Ｃ ＥＧＦＲとアテゾリズマブの併用は腫瘍退縮を誘導する
４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲとＰＤ－Ｌ１ブロッカーアテゾリズマブの併用による治療の可能性を、ヒトＥＧＦＲ＋ＰＤ－Ｌ１＋ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（図２ｇ）ＴＮＢＣ異種移植片を有するｈｕＰＢＭＣ駆動ヒト化ＮＳＧマウスにおいて検討した（図４ａ）。アテゾリズマブ単剤療法は、腫瘍成長を約６０％抑制することができ、一方、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ単剤療法は、腫瘍成長を約９０％抑制した（図４ｂ）。アテゾリズマブと４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲの併用は、腫瘍成長のさらなる抑制をもたらした（図４ｂ）。ＰＢＳ処置群では、サイトケラチン（ＣＫ）を強く発現し、密なリンパ球浸潤を伴う（図４ｃおよびｄ）腫瘍性多形細胞の大きな巣が観察された。重要なことは、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ単剤療法群（Ｐ＝０．０４）および併用療法群（Ｐ＝０．０００２）では、アテゾリズマブ単剤療法群よりも、ＣＫ＋細胞のパーセンテージが有意に低かったことである（図４ｃ）。併用療法では、６匹中５匹のマウスでＣＫ＋細胞のパーセンテージが最大でも３０％であり、１匹のマウスではＴＮＢＣ細胞が完全に根絶された（図４ｅ）。この腫瘍量の減少は、４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ治療群におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の割合の有意な増加と関連していた（Ｐ＝０．０３およびＰ＝０．０４）（図４ｄおよびｅ）。

【0227】

実施例６．Ｃｏｍｐｔｅら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０７１９５－ｗ）に開示された１Ｄ８抗４－１ＢＢ ＳｃＦｖを含む４－１ＢＢ ^Ｎ／Ｃ ＥＧＦＲ抗４－１ＢＢトリマーボディに対するＳＡＰ３．２８抗４－１ＢＢ ＳｃＦｖを含む４－１ＢＢ ^Ｎ／Ｃ ＥＧＦＲトリマーボディの薬物動態特性の改善
１Ｄ８^Ｎ／ＣＥＧａ１の薬物動態研究を、１Ｄ８^Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディを１ｍｇ／ｋｇで単回静脈内（ｉ．ｖ．）注射した雌性ＣＤ－１マウス（ｎ＝２４）および免疫適格Ｂａｌｂ／Ｃ雌性マウス（ｎ＝２４）において実施した。各群３匹のマウスから、５分、１５分、３０分、１時間、３時間、６時間、２４時間、および４８時間に血液試料を採取した。遠心分離後に血清を採取し、－２０℃で保存した。血清の抗体濃度を、プラスチック固定化ｍ４－１ＢＢ（３μｇ／ｍｌ）に対するＥＬＩＳＡによって分析した。洗浄およびブロッキング後、異なる時点の血清を添加し、室温で１時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）コンジュゲート化抗ＦＬＡＧ ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ）（Ｍ２；カタログ番号ａｂ４９７６３、Ａｂｃａｍ）（１：１０００希釈）を添加した。洗浄後、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（ＯＰＤ）を用いてプレートを発色させた。薬物動態パラメータは、Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて算出した。

【0228】

ＣＤ－１マウスでは、１Ｄ８^Ｎ／ＣＥＧａ１の循環半減期は１６．１時間であった（表２）。１Ｄ８^Ｎ／ＣＥＧａ１の血清中半減期は、マウスの遺伝的背景の影響を受けず、ＢＡＬＢ／ｃマウスでも同様の薬物動態プロファイルが観察された（表３）。

【0229】

【表7】

【0230】

【表8】

【0231】

ＳＡＰ３．２８^Ｎ／ＣＥＧａ１の薬物動態研究を、ＰＢＳ中２４２．３５ｋＢｑ（１４μｇ）（０．５６ｍｇ／ｋｇ）の^８９Ｚｒ標識ＳＡＰ３．２８^Ｎ／ＣＥＧａ１トリマーボディをｉ．ｖ．注射（尾静脈）した６週齢の雌性無胸腺ヌードマウスにおいて実施した。薬物動態研究のために、血液試料をヘパリン処理チューブに採取し、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して血漿を得た。血漿中の放射能濃度は、１ｍＬあたりの注入量パーセント（％ＩＤ／ｍＬ）として算出し、注入後の時間に対してプロットした。放射能の血漿中濃度対時間は、非線形回帰を用いたコンパートメント法により解析した。薬物動態パラメータの初期推定値は、アドインプログラムＰＫＳｏｌｖｅｒによる曲線ストリッピング法を用いて計算した。赤池情報量規準（ＡＩＣ）を用いて、最適コンパートメントモデルを決定した。血液クリアランス（Ｃｌ血液）は、以下の関係を用いて血漿クリアランス（Ｃｌ血漿）から推定した：Ｃｌ血液＝Ｃｌ血漿／ＢＰ（式中、ＢＰは血液対血漿比である）。

【0232】

静脈内投与後の［^８９Ｚｒ］Ｚｒ－Ｄｆ－ＳＡＰ３．２８^Ｎ／ＣＥＧａ１の排出は二相性であり、半減期は急速な分布相で７．３時間、緩やかな分布相で６６．８時間であった（表４）。定常状態での分布容積は６６．５ｍＬ（２．６３Ｌ／ｋｇ）、血漿クリアランスは０．９７ｍＬ／時間（３７．６ｍＬ／ｋｇ／時間）であった。血液対血漿比が０．６２であったことから、得られた血液クリアランス値は、心拍出量（マウスでは２１．７Ｌ／ｋｇ／時間）と比較して非常に低かった（０．０６２Ｌ／ｋｇ／時）。

【0233】

【表9】

【0234】

上記の比較データに示されるように、ＳＡＰ３．２８抗４－１ＢＢ ＳｃＦｖの存在を特徴とする本発明による４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲトリマーボディの半減時間は、Ｃｏｍｐｔｅら（Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，２０１８，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１４６７－０１８－０７１９５－ｗ）に開示された１Ｄ８抗４－１ＢＢ ＳｃＦｖを含む４－１ＢＢ^Ｎ／ＣＥＧＦＲ抗４－１ＢＢトリマーボディの半減時間よりもはるかに長い。これら２つの抗体の半減期の差は、急速な分配相では約７倍、緩やかな分配相では約４倍である。この差は、両抗体の特性評価に使用された薬物動態アッセイの方法論的な違いのみに起因するものとは考えられないほど顕著である。本発明による抗体のより長い半減期は、明らかに予想外のものであり、高い半減期値は、低用量レジメンで投与される予定の薬剤にとって望ましい特性であるため、先行技術の抗体よりも有利である。

【図1ab】

【図1cd】

【図2ab】

【図2cd】

【図2efg】

【図2h】

【図3ab】

【図3cde】

【図3fgh】

【図3ij】

【図3k】

【図4ab】

【図4cd】

【図4e】

【図5】

【図6ab】

【図6cd】

【図6e】

【図7abc】

【図7de】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【配列表】

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【国際調査報告】