ホーム > 特許ランキング > キングス カレッジ ロンドン
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-511059ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、およびＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドを含む組成物ならびにその使用方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-12
(54)【発明の名称】ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、およびＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドを含む組成物ならびにその使用方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240305BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240305BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240305BHJP
C12N 15/867 20060101ALI20240305BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240305BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240305BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12
C12N5/10 ZNA
C12N15/62 Z
C12N15/867 Z
A61K35/17
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】有
(21)【出願番号】P 2023557437
(86)(22)【出願日】2022-03-23
(85)【翻訳文提出日】2023-11-16
(86)【国際出願番号】 EP2022057653
(87)【国際公開番号】W WO2022200442
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/164,959
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/288,593
(32)【優先日】2021-12-11
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＬＵＲＯＮＩＣ
２．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】500545366
【氏名又は名称】キングス カレッジ ロンドン
【住所又は居所原語表記】Ｓｔｒａｎｄ， Ｌｏｎｄｏｎ ＷＣ２Ｒ ２ＬＳ Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ
(74)【代理人】
【識別番号】100113376
【弁理士】
【氏名又は名称】南条 雅裕
(74)【代理人】
【識別番号】100179394
【弁理士】
【氏名又は名称】瀬田 あや子
(74)【代理人】
【識別番号】100185384
【弁理士】
【氏名又は名称】伊波 興一朗
(74)【代理人】
【識別番号】100137811
【弁理士】
【氏名又は名称】原 秀貢人
(72)【発明者】
【氏名】マー ジョン
(72)【発明者】
【氏名】デイビース デイビッド マーク
(72)【発明者】
【氏名】ラーコム－ヤング ダニエル
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA92X
4B065AA92Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB37
4C087BB65
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZB26
(57)【要約】
ＮＫＧ２ＤポリペプチドおよびＣＸＣＲ２ポリペプチド、ならびに、任意選択で、ＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドおよびＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む、免疫応答性細胞が提供される。また、そのような免疫応答性細胞を作製および使用する方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと；（ｂ）（ｉ）ＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその機能的変異体および（ｉｉ）ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドと；
（ｃ）ＣＸＣＲ２ポリペプチドと
を含む免疫応答性細胞。
【請求項2】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、前記ＤＡＰ１０ポリペプチド、前記ＤＡＰ１２ポリペプチド、および前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドのそれぞれが哺乳動物ポリペプチドである、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項3】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、前記ＤＡＰ１０ポリペプチド、前記ＤＡＰ１２ポリペプチド、および前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドのそれぞれがヒトポリペプチドである、請求項２に記載の免疫応答性細胞。
【請求項4】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１４の配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項5】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチドが、前記配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的変異体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項6】
前記機能的変異体が、配列番号１４のアミノ酸のうちの少なくとも１つを付加、欠失、または置換させる１つまたは複数の点突然変異を有する、請求項５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項7】
前記機能的変異体が、前記配列番号１４のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの切断バージョンである、請求項５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項8】
前記機能的変異体がキメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドである、請求項５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項9】
前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ、
［式中、
Ａは任意選択のＮ末端配列であり；
ＢはＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその機能的変異体であり；
Ｃは任意選択のリンカー配列であり；
ＤはＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその機能的変異体であり；
Ｅは任意選択のＣ末端配列である］
を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項10】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドが、配列番号１のＤＡＰ１０ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＤＡＰ１０の機能的変異体である、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項11】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドが、前記配列番号１のＤＡＰ１０ポリペプチドのアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を有する、配列番号１の機能的変異体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項12】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドが、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの切断バージョンであるＤＡＰ１０ポリペプチドの機能的変異体である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項13】
前記ＤＡＰ１０の切断バージョンが、配列番号１のアミノ酸１９～９３、１９～６９、１～７１、１９～７１、１９～４８、４９～６９、４９～９３、または７０～９３を含む、またはそれからなる、請求項１２に記載の免疫応答性細胞。
【請求項14】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドが、配列番号１～８のうちの任意の１つを含む、またはそれからなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項15】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドが、配列番号９のＤＡＰ１２ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＤＡＰ１２の機能的変異体である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項16】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドが、前記配列番号９のＤＡＰ１２ポリペプチドのアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を有する、配列番号９の機能的変異体である、請求項１～１５のいずれかに記載の免疫応答性細胞。
【請求項17】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドが、前記配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドの切断バージョンであるＤＡＰ１２ポリペプチドの機能的変異体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項18】
前記ＤＡＰ１２の切断バージョンが、配列番号９のアミノ酸２２～１１３、６２～１１３、２２～６１、または４１～６１を含む、またはそれからなる、請求項１７に記載の免疫応答性細胞。
【請求項19】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドが、配列番号９～１３のうちの任意の１つを含む、またはそれからなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項20】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドおよび前記ＤＡＰ１２ポリペプチドがリンカーによって結合されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項21】
前記リンカーが、配列番号１８～４６のうちの任意のものに列挙されているアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項２０に記載の免疫応答性細胞。
【請求項22】
前記リンカーが、配列番号３３または３８～４４のうちの任意のものに列挙されているアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項２０または請求項２１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項23】
前記融合ポリペプチドがＮ末端配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項24】
前記融合ポリペプチドがＣ末端配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項25】
前記Ｎ末端またはＣ末端配列が、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、ＡｖｉＴａｇ（商標）、アプタマータグ、ｍｙｃタグ、ＣＤ８αリーダー配列、４－１ＢＢエンドドメイン、Ｖ５タグ、またはＣＤ２７エンドドメインのうちの１つまたは複数を含む、請求項２３または請求項２４に記載の免疫応答性細胞。
【請求項26】
前記Ｎ末端またはＣ末端配列が、ＣＤ８αリーダー配列、４－１ＢＢエンドドメイン、またはＣＤ２７エンドドメインのうちの１つまたは複数を含む、請求項２５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項27】
前記融合ポリペプチドが、配列番号６０～６３のうちの任意の１つの配列を含む、またはそれからなる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項28】
前記融合ポリペプチドが：（ａ）配列番号８４を含まない；ならびに／または
（ｂ）抗ＥｐＣＡＭペプチドを含まない；ならびに／または
（ｃ）配列番号８５を含まない；ならびに／または
（ｄ）配列番号８６を含まない；ならびに／または
（ｅ）配列番号８５および配列番号８６の両方は含まない、
請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項29】
前記融合ポリペプチドが、そのＣ末端でヒトＤＡＰ１２ポリペプチドのエンドドメインと融合した完全長ヒトＤＡＰ１０を含む、またはそれからなり、前記エンドドメインが、ヒトＤＡＰ１２のアミノ酸６２～１１３によってコードされている、請求項１～２８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項30】
前記融合ポリペプチドが配列番号６０の配列を有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項31】
前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号８７の配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項32】
前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドが配列番号８７のアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項33】
前記免疫応答性細胞がＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項34】
前記免疫応答性細胞がαβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、またはそれらの任意の組合せである、請求項３３に記載の免疫応答性細胞。
【請求項35】
前記核酸分子がＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＣＸＣＲ２ポリペプチド、ならびに任意選択でＤＮＡＸ活性化（ＤＡＰ１０）ポリペプチド、ＤＮＡＸ活性化（ＤＡＰ１２）ポリペプチド、および／または融合ポリペプチドをコードしている、核酸分子。
【請求項36】
前記融合ポリペプチドが、（ｉ）ＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその機能的変異体および（ｉｉ）ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項37】
前記核酸分子が前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、前記融合ポリペプチド、および前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドをコードしているキメラポリヌクレオチドである、請求項３５または請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項38】
前記核酸分子が５’から３’に、（ｉ）ヒトＤＡＰ１２のエンドドメインとインフレームのヒトＤＡＰ１０、（ｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位、（ｉｉｉ）第１のリンカー、（ｉｖ）第１のリボソームスキップペプチド、（ｖ）ヒトＮＫＧ２Ｄ、（ｖｉ）第２のプロテアーゼ切断部位、（ｖｉｉｉ）第２のリンカー、（ｖｉｉｉ）第２のリボソームスキップペプチド、および（ｉｘ）ヒトＣＸＣＲ２をコードしている、請求項３７に記載の核酸分子。
【請求項39】
前記核酸分子が配列番号８８のヌクレオチド配列を含む、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項40】
前記核酸が配列番号９１のヌクレオチド配列を有する、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項41】
請求項３５～４０のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項42】
前記ベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項43】
前記ベクターがＳＦＧレトロウイルスベクターである、請求項４２に記載のベクター。
【請求項44】
（ａ）Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を、請求項３５～４０のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項４１～４３のいずれか一項に記載のベクターで形質導入するステップと、（ｂ）前記形質導入した細胞がＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチド、およびＣＸＣＲ２ポリペプチドを発現し、前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチドおよび前記ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドが前記細胞膜中で会合するように、前記Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を培養するステップと
を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を作製する方法。
【請求項45】
対象に、治療上有効な量の請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与するステップを含む、癌を有する対象を処置する方法。
【請求項46】
前記免疫応答性細胞を、前記対象の自家であるＴまたはＮＫ細胞から製造する、請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記癌が固形腫瘍癌である、請求項４５または請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記固形腫瘍癌が、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、結腸癌、腎臓癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、またはそれらの任意の組合せである、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記固形腫瘍癌が卵巣癌である、請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
癌の処置または予防において使用するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項51】
（ａ）ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインまたはその変異体およびネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインまたはその変異体を含む、キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドと；（ｂ）ＣＸＣＲ２ポリペプチドと
を含む免疫応答性細胞。
【請求項52】
前記ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインが、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７に記載の配列を有する、請求項５１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項53】
前記ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインが、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、または配列番号１０１に記載の配列を有する、請求項５１または請求項５２に記載の免疫応答性細胞。
【請求項54】
前記キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドが前記ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの変異体を含み、前記変異体が、配列番号９５、９６、または９７のうちの任意のものと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項５１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項55】
前記キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドが前記ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインの変異体を含み、前記変異体が、配列番号９８、９９、１００、または１０１のうちの任意のものと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項５１～５２または請求項５４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項56】
前記細胞が少なくとも１つのＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその変異体をさらに含む、請求項５１～５５のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項57】
前記細胞が少なくとも１つのＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその変異体をさらに含む、請求項５１～５６のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項58】
前記細胞が配列番号１０２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項５７に記載の免疫応答性細胞。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
１．背景
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作Ｔ細胞を使用した免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍および多発性骨髄腫の管理を変化させる力があることが証明されている。しかし、この技術の固形腫瘍免疫療法への応用は、腫瘍選択的標的の欠如によって妨げられている。ほとんどの腫瘍抗原は細胞内にあり、したがってＣＡＲ Ｔ細胞によって容易に認識することができない。その結果、現在開発中の固形腫瘍に向けられたＣＡＲのほとんどは、腫瘍細胞中において上方制御されているが、正常組織中ではより低いレベルで見つかる標的と結合する。
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）操作Ｔ細胞を使用した免疫療法は、Ｂ細胞悪性腫瘍および多発性骨髄腫の管理を変化させる力があることが証明されている。しかし、この技術の固形腫瘍免疫療法への応用は、腫瘍選択的標的の欠如によって妨げられている。ほとんどの腫瘍抗原は細胞内にあり、したがってＣＡＲ Ｔ細胞によって容易に認識することができない。その結果、現在開発中の固形腫瘍に向けられたＣＡＲのほとんどは、腫瘍細胞中において上方制御されているが、正常組織中ではより低いレベルで見つかる標的と結合する。
【0002】
高い度合の腫瘍選択性を示す数少ない標的群のうちの１つが、ＮＫＧ２Ｄリガンドである。人において、これらは、事実上すべての腫瘍細胞種において異常に発現される、８つのストレス誘導性タンパク質（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＵＬＢＰ１－６）の群を含む。さらに、ＮＫＧ２Ｄリガンドは、内皮、制御性Ｔ細胞、および骨髄由来サプレッサー細胞などの、腫瘍関連の間質要素においても見つかる（Ｐａｒｉｈａｒ，Ｒ．ら、２０１９、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｓ．、７（３）：３６３～３７５、ＳｃｈｍｉｅｄｅｌおよびＭａｎｄｅｌｂｏｉｍ、２０１８、Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（９）２０４０）。ＮＫＧ２Ｄを遺伝的に欠くマウスは、上皮およびリンパ球性悪性腫瘍のどちらについても免疫監視の障害を実証した。ＮＫＧ２Ｄリガンドが安全な治療標的であるという証拠は、これらが健康な組織中に見つからないという事実によって支持される。自己ＮＫＧ２Ｄ標的ＣＡＲを使用した臨床治験では、顕著な安全性の問題が全く明らかとならなかった（ｈｔｔｐｓ：／／ｐｕｂｍｅｄ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／３０３９６９０８／を参照）。
【0003】
ＮＫＧ２Ｄ受容体は、ナチュラルキラー（ＮＫ）および一部のＴ細胞集団によって天然に発現される。それぞれのＮＫＧ２Ｄホモ二量体は、形質膜内の相補的な荷電アミノ酸を介して２つのホモ二量体ＤＡＰ１０アダプター分子と会合する。この相互作用は、細胞表面発現およびＮＫＧ２Ｄの機能に必要である。ＤＡＰ１０は、ホスファチジルイノシトール３－キナーゼを介した共刺激を提供するその能力においてＣＤ２８と似ているが、重要なことに、これは、制御性Ｔ細胞の望まない動員を促進するｐ５６ｌｃｋ結合モチーフを欠く（Ｋｏｆｌｅｒら、２０１１、Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．、１９：７６０～７６７）。ＤＡＰ１０共刺激の効力は、内部移行の後にシグナル伝達し続けるその能力が根底にある。しかし、ＤＡＰ１０は免疫受容体チロシンに基づく活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を欠くため、ＮＫＧ２Ｄとの結合は完全なＴ細胞活性化をもたらさない。
【0004】
ＩＴＡＭ依存性シグナル１と共に共刺激（シグナル２としても知られる）を提供するために様々な方法を使用する、様々なＣＡＲが開発されており、これは、完全なＴ細胞活性化を誘発するためにはどちらのシグナルタイプも必要であるためである。最初のＮＫＧ２Ｄ標的化ＣＡＲはＳｅｎｔｍａｎらによって開発され、ＮＫＧ２ＤとＣＤ３ζとの融合からなる（Ｚｈａｎｇら、２００５、Ｂｌｏｏｄ、１０６：１５４４～１５５１）。これは、名目上は第一世代ＣＡＲであるが、Ｔ細胞中の内在性ＤＡＰ１０と会合し、これはシグナル１および２がどちらも提供されることを意味する。このＣＡＲは、Ｃｅｌｙａｄ ＯｎｃｏｌｏｇｙによってＣｙａｄ－０１として現在臨床開発中である。より最近では、Ｃｈａｎｇら（２０１３、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、７３：１７７７～１７８６）は、同一のＣＡＲと共に外因性ＤＡＰ１０を同時発現するＮＫ細胞を操作した。４－１ＢＢ（Ｓｏｎｇら、２０１３、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．、２４：２９５～３０５）またはＣＤ２８（Ｌｅｈｎｅｒら、２０１２、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、７：ｅ３１２１０）のどちらかを取り込んで、ＤＡＰ１０によって提供されるものの代わりに共刺激の代替形態を提供する、２つのさらなるＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲも記載されている。これらのＣＡＲはすべて、サイトカイン産生を伴ったＴ細胞媒介性腫瘍細胞死滅を可能にした一方で、Ｃｈａｎｇらによって記載されているＣＡＲは、一過性のｉｎ ｖｉｖｏ抗腫瘍活性も実証した。
【0005】
ＣＸＣＲ２受容体のリガンドとしては、（Ｇｌｕ－Ｌｅｕ－Ａｒｇ）ＥＬＲモチーフを含有するシステイン－Ｘ－システイン（ＣＸＣ）ファミリーのケモカイン、すなわちＣＸＣＬ１～３およびＣＸＣＬ５～８が挙げられる。腫瘍内におけるこれらのケモカインの産生は、悪性細胞だけでなく、線維芽細胞およびマクロファージなどの間質要素によっても行われる（Ｔｈｕｗａｊｉｔら、２０１８、Ｍｅｄ Ｒｅｓ Ｒｅｖ．、３８：１２３５～５４、Ｔｈｏｎｇｃｈｏｔら、２０２１、Ｉｎｔ Ｊ Ｏｎｃｏｌ．、５８：１４）。さらに、腫瘍細胞は、これらの因子を産生するように間質細胞を教育することができ、それによって疾患進行および細胞毒性化学療法に対する耐性を可能にする（Ｌｅ Ｎａｏｕｒ、２０２０、Ｊ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１２：２０２～１５）。
【0006】
ＣＸＣファミリーの最もよく研究されているメンバーはＣＸＣＬ８であり、インターロイキン（ＩＬ）－８としても知られる。循環ＣＸＣＬ８のレベルは、卵巣腫瘍（Ｚｈａｎｇら、２０１９、Ｏｎｃｏｌ Ｌｅｔｔ．、１７：２３６５～９）、悪性中皮腫（Ｊｕｄｇｅら、２０１６、Ａｎｎ Ｓｕｒｇ Ｏｎｃｏｌ．、２３：１４９６～５００）、膵癌（Ｈｏｕら、２０１８、Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｅｄ．、７：５０２、乳癌（Ｍｉｌｏｖａｎｏｖｉｃら、２０１９、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ、１１８：９３～９８、Ａｕｔｅｎｓｈｌｙｕｓら、２０２１、３５：２０５８７３８４２１１０３４０８９）、食道癌（Ｈｕａｎｇら、Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｍａｒｋ．、２９：１３９～１４９）、および頭頸部癌（Ｒｅｚａｅｉら、２０１９、３９：７２７～７３９）を含めた特定の癌を有する患者において上昇している。ＣＸＣＬ８に加えて、ＣＸＣＲ２リガンドＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ３、およびＣＸＣＬ５の高レベル産生もいくつかの癌において記載されている。
【発明の概要】
【0007】
２．要約
第１の態様では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＣＸＣＲ２ポリペプチド、およびＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその機能的変異体とＤＮＡＸ活性化１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその機能的変異体とを含む融合ポリペプチドを含む免疫応答性細胞を、本明細書中に記載する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２ポリペプチドはそれぞれ哺乳動物ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２ポリペプチドはそれぞれヒトポリペプチドである。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドの配列は、配列番号１４の配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２ＤポリペプチドはヒトＮＫＧ２Ｄポリペプチドの機能的変異体であり、配列番号１４のアミノ酸のうちの少なくとも１つを付加、欠失、または置換させる１つまたは複数の突然変異を有する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドの機能的変異体は、配列番号１４の配列を有するポリペプチドの切断バージョンである。一部の実施形態では、機能的変異体はキメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドである。一部の実施形態では、機能的変異体はヒト－ネズミキメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドである。
第１の態様では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＣＸＣＲ２ポリペプチド、およびＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその機能的変異体とＤＮＡＸ活性化１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその機能的変異体とを含む融合ポリペプチドを含む免疫応答性細胞を、本明細書中に記載する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２ポリペプチドはそれぞれ哺乳動物ポリペプチドである。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、ＤＡＰ１０、およびＤＡＰ１２ポリペプチドはそれぞれヒトポリペプチドである。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドの配列は、配列番号１４の配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２ＤポリペプチドはヒトＮＫＧ２Ｄポリペプチドの機能的変異体であり、配列番号１４のアミノ酸のうちの少なくとも１つを付加、欠失、または置換させる１つまたは複数の突然変異を有する。一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドの機能的変異体は、配列番号１４の配列を有するポリペプチドの切断バージョンである。一部の実施形態では、機能的変異体はキメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドである。一部の実施形態では、機能的変異体はヒト－ネズミキメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドである。
【0008】
一部の実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドは、配列番号１のＤＡＰ１０ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＤＡＰ１０の機能的変異体である。一部の実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる１つまたは複数の点突然変異を有する、ＤＡＰ１０の機能的変異体である。一部の実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの切断バージョンであるＤＡＰ１０の機能的変異体である。一部の実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドは、配列番号１～８のうちの任意の１つの配列を含む、またはそれからなる。
【0009】
一部の実施形態では、ＤＡＰ１２ポリペプチドは、配列番号９のＤＡＰ１２ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ＤＡＰ１２の機能的変異体である。一部の実施形態では、ＤＡＰ１２ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる１つまたは複数の点突然変異を有する、ＤＡＰ１２の機能的変異体である。一部の実施形態では、ＤＡＰ１２ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドの切断バージョンであるＤＡＰ１２の機能的変異体である。一部の実施形態では、ＤＡＰ１２ポリペプチドは、配列番号９～１３のうちの任意の１つの配列を含む、またはそれからなる。
【0010】
一部の実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドおよびＤＡＰ１２ポリペプチドはリンカーによって結合されている。一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１８～４６のうちの任意の１つのアミノ酸配列を含む、またはそれからなる。
【0011】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＮ末端配列を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドはＣ末端配列を含む。一部の実施形態では、Ｎ末端またはＣ末端配列は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、ＡｖｉＴａｇ（商標）、アプタマータグ、ｍｙｃタグ、ＣＤ８αリーダー配列、４－１ＢＢエンドドメイン、Ｖ５タグ、またはＣＤ２７エンドドメインのうちの１つまたは複数を含む。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、配列番号６０～６３のうちの任意の１つの配列を含む、またはそれからなる。
【0012】
一部の実施形態では、ＣＸＣＲ２ポリペプチドは、配列番号８７と少なくとも約８５％の配列同一性を有する配列を有する。特定の実施形態では、ＣＸＣＲ２ポリペプチドは配列番号８７の配列を有する。
【0013】
一部の実施形態では、本開示の免疫応答性細胞は、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。一部の実施形態では、免疫応答性細胞は、αβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、またはその任意の組合せである。
【0014】
第２の態様では、キメラＮＫＧ２ＤポリペプチドおよびＣＸＣＲ２ポリペプチドを含む免疫応答性細胞を本明細書中に記載する。一部の実施形態では、キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインまたはその変異体およびネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインまたはその変異体を含む。特定の実施形態では、ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインは、配列番号９５～９７のうちの任意の１つに記載の配列を有する。一部の実施形態では、キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、配列番号９５～９７のうちの任意の１つの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの変異体を含む。一部の実施形態では、ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインは配列番号９８～１０１のうちの任意の１つに記載の配列を有する。一部の実施形態では、キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、配列番号９８～１０１のうちの任意の１つの配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインの変異体を含む。一部の実施形態では、免疫応答性細胞は、少なくとも１つのＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその変異体をさらに含む。一部の実施形態では、免疫応答性細胞は、少なくとも１つのＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその変異体をさらに含む。好ましい実施形態では、細胞は、配列番号１０２と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。
【0015】
また、ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＣＸＣＲ２ポリペプチド、ならびに、任意選択で、ＤＮＡＸ活性化（ＤＡＰ１０）ポリペプチド、ＤＮＡＸ活性化（ＤＡＰ１２）ポリペプチド、および／または融合ポリペプチドをコードしている核酸分子も、本明細書中に記載する。
【0016】
また、（ｉ）本明細書中に記載のように、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を核酸分子またはベクターで形質導入するステップと、（ｉｉ）形質導入した細胞が、ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＣＸＣＲ２ポリペプチド、および任意選択でＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドを発現するように、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を培養するステップとを含む、免疫応答性細胞を作製する方法も、本明細書中に記載する。好ましい実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドは細胞膜と会合する。
【0017】
また、対象に、治療上有効な量の本明細書中に記載の免疫応答性細胞を投与することを含む、癌を有する対象を処置する方法も、本明細書中に記載する。一部の実施形態では、免疫応答性細胞は、対象の自家であるＴまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞から製造する。一部の実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。一部の実施形態では、固形腫瘍癌は、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、結腸癌、腎臓癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、またはその任意の組合せである。
【0018】
３．図面の簡単な説明
本発明のこれらおよび他の特長、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面に関連して、より良好に理解されるであろう。図は以下の通りである。
本発明のこれらおよび他の特長、態様、および利点は、以下の説明および添付の図面に関連して、より良好に理解されるであろう。図は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1】図１は、作製した構築体のそれぞれの構造を実証する模式図である。Ｎ１０１２は、外因性ヒトＮＫＧ２Ｄタンパク質と本発明による融合外因性ＤＡＰ１０／１２ホモ二量体とを含む複合体を含む。Ｎ１０１２は配列番号６４を含み、これは表２中に記載されている。１０１２＿１０＿Ｎは、ＤＡＰ１０と同時発現させたＮＫＧ２ＤならびにＤＡＰ１０細胞外および膜貫通ドメインのＦＬＡＧでタグ付けした融合物が、ＤＡＰ１２エンドドメインと融合したものを含む。ＮＫＧ２Ｄ複合体は、細胞中に既に存在する内在性ＤＡＰ１０と相互作用する外因性ヒトＮＫＧ２Ｄタンパク質を含み、比較目的でのみ提供される。
【図2】図２は、Ｎ１０１２（図１に模式的に示す）またはＮＫＧ２Ｄ単独のどちらかを発現するレトロウイルスプラスミドを用いた形質移入の３日後の、２９３Ｔ細胞における、細胞表面および細胞内（ＩＣＳ）の両方におけるＮＫＧ２Ｄの発現を示し、非形質導入（ＵＴ）２９３Ｔ細胞との比較を行う図である。
【図3A-3B】図３Ａ～３Ｂは、活性化未分画ヒトＴ細胞を、ＮＫＧ２Ｄ単独またはＮ１０１２をコードしているレトロウイルスベクターを用いて形質導入した後の、Ｔ細胞のＣＤ４＋部分組における細胞表面ＮＫＧ２Ｄ発現の形質導入の百分率（図３Ａ）および蛍光強度の中央値（ＭＦＩ－図３Ｂ）を示す図である。ＵＴ Ｔ細胞における発現およびＭＦＩも比較のために示す。
【図4】図４は、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、またはＮＫＧ２Ｄを欠く対照ＣＡＲを発現するように形質導入した活性化未分画Ｔ細胞のＣＤ４＋およびＣＤ８＋部分組における、細胞表面ＮＫＧ２Ｄの代表的な発現パターンを示す図である。ＵＴ Ｔ細胞内におけるＮＫＧ２Ｄ発現を比較として提供する。
【図5】図５は、Ｎ１０１２＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に様々なＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、１１個の異なる腫瘍細胞系の生存度を示す図である。腫瘍細胞生存度を７２時間後にＭＴＴアッセイを使用して評価し、Ｔ細胞同時培養の非存在下で観察されたものの百分率として表す。
【図6A-6B】図６Ａ～６Ｂは、８個の異なる腫瘍細胞系と共に１：１のＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養中に、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、およびＵＴ Ｔ細胞によって分泌されたサイトカイン（ＩＦＮ－γ（図６Ａ）およびＩＬ－２（図６Ｂ）のレベルを示す図である。同時培養上清を７２時間後に取り出し、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によってサイトカインの存在について評価した。
【図7A-7F】図７Ａ～７Ｆは、Ｎ１０１２＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に様々なＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、腫瘍および／または膵臓星状ＰＳ１の生存度を示す図である。図７Ａは、Ｎ１０１２＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に様々なＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、膵臓星状ＰＳ１細胞の生存度を示す。１：１のＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で加えた場合、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、１：１の比で一緒に成長させたＰＳ１およびＢｘＰＣ３細胞の両方からなる単層の強力な溶解も実証した（図７Ｂ）。これは、ＮＫＧ２Ｄ＋またはＵＴ Ｔ細胞のどちらかの添加の際に観察された有効性の欠如と対照的である。どちらの事例でも、標的細胞生存度を４８時間後にＭＴＴアッセイによって評価し、Ｔ細胞同時培養の非存在下で観察されたものの百分率として表す。Ｎ１０１２＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に１：１のＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、腫瘍細胞および間質細胞単層の生存度を、図７Ｃ（ＢｘＰＣ３＿ＬＴ＋ＰＳ１）および図７Ｄ（ＰａＴＵ＋ＰＳ１）に示す。腫瘍および間質細胞のどちらの強力な溶解もＮ１０１２＋ Ｔ細胞で観察された一方で、標的細胞生存度の最小限の低下が、ＮＫＧ２ＤまたはＵＴ Ｔ細胞のどちらかと共に同時培養した場合に観察された（図７Ｃ～７Ｄ）。Ｎ１０１２＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に１：１のＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、腫瘍細胞単独の生存度を図７Ｃ（ＢｘＰＣ３＿ＬＴ）および図７Ｄ（ＰａＴＵ＿ＧＦＰ）に示す。Ｎ１０１２＋、Ａ２０２８ｚ＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に１：１のＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、腫瘍細胞および間質細胞単層の生存度を、図７Ｅおよび図７Ｆに示す（５回までの再刺激の後）。Ｎ１０１２＋、Ａ２０２８ｚ＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞と共に１：１のＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、腫瘍細胞単独の生存度も、図７Ｅ（ＢｘＰＣ３＿ＬＴ）に示す。Ａ２０２８ｚは、腫瘍細胞を死滅させるがＰＳ１間質細胞を死滅させない、ａｖｂ６インテグリンに対して標的化されたＣＡＲである（Ｗｈｉｌｄｉｎｇら、２０１７、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ．、２５：２４２７）。図７Ｇおよび７Ｈは、上述の同時培養中にＮ１０１２＋、Ａ２０２８ｚ＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、およびＵＴ Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮ－γのレベルを示す。腫瘍単独から分泌されたＩＦＮ－γのレベルを陰性対照として決定した。図７Ｉおよび７Ｊは、Ｎ１０１２＋、ＮＫＧ２Ｄ＋、またはＵＴ Ｔ細胞との同時培養の後に、ＧＦＰ発現ＰａＴＵ腫瘍細胞をｍＣｈｅｒｒｙ発現ＰＳ１細胞と混合した（１：１の比でそれぞれ３または８日間）腫瘍球状体の生存度を示す。ｎ．ｄ．－検出されず。図７Ｋは、腫瘍球状体との同時培養中にＮ１０１２＋、ＵＴ Ｔ細胞、および腫瘍単独によって７２時間後に分泌されたＩＦＮ－γのレベルを示す。
【図8A-8D】図８Ａ～８Ｄは、ＵＴ Ｔ細胞またはＮＫＧ２Ｄ単独を発現するものと比較した場合に、Ｎ１０１２を発現するＴ細胞の、複数ラウンドの繰り返し刺激（「再刺激」）を受ける能力を示す図である。Ｎ１０１２を発現するＴ細胞は、複数サイクルの刺激を通じて、Ｊｕ７７中皮腫Ｊｕ７７細胞およびＨＮ３＿ＬＵＣ頭頸部扁平細胞癌（ＨＮＳＣＣ）細胞のどちらの溶解も媒介する（図８Ａ）。中皮腫（Ｊｕ７７、Ｒｅｎ）、ＨＮＳＣＣ（ＨＮ３＿ＬＵＣ）、または膵癌（ＢｘＰＣ３＿ＬＴ）細胞と同時培養した場合の、成功した再刺激サイクルの合計数を図８Ｂに示す。Ｊｕ７７またはＨＮ３＿ＬＵＣ腫瘍細胞による繰り返し刺激の際のＴ細胞の増殖を図８Ｃに示す。Ｊｕ７７、Ｒｅｎ、またはＨＮ３＿ＬＵＣ腫瘍細胞を共に培養した１日目と比較した、最大のＴ細胞拡大の倍数を図８Ｄに示す。対照的に、ＵＴ Ｔ細胞またはＮＫＧ２Ｄ単独を発現するものは、最小限の標的細胞溶解または増殖を実証した。
【図9A-9B】図９Ａ～９Ｂは、腫瘍保有マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏ評価のための、ＣＡＲ Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入による操作を示す図である。図９Ａは、Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄのどちらかを用いた形質導入の後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの細胞表面発現を示す図である。比較は、Ｄａｖｉｅｓら、２０１２、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、１８：５６５～５７６によって記載されているように、パン－ＥｒｂＢ標的化ＣＡＲ、Ｔ４を発現する同じドナーからのＴ細胞を用いて行った。ＴＭＹと呼ばれる、Ｔ４内に含有される４αβドメインを欠き、わずかに改変されたＣＤ２８ヒンジ（ＭＹＰＰＰＹ配列が１０個のアミノ酸の直鎖状ｍｙｃタグ配列で置き換えられている）を有する、第２のパン－ＥｒｂＢ標的化ＣＡＲも使用した。図９Ｂは、マウスへの養子移入の後の、示した腫瘍細胞系に対する残留Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性機能を示す。
【図10A-10E】図１０Ａ～１０Ｅは、１０×１０６個の示したＣＡＲ Ｔ細胞を用いた腹腔内処置の前および後の生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認した、ＮＳＧマウスにおけるｆｆＬＵＣでタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腹腔内（ｉ．ｐ．）成長を示す図である。Ｎ１０１２の場合、この用量（「高」と示す）を使用したか、またはより低い用量を投与した（「低」－４×１０６個の細胞）。それぞれのマウス群からのプールしたＢＬＩの発光を図１０Ａに示す。個々のマウスからの連続的な生物発光を図１０Ｂに示す。マウスの重量を図１０Ｃに示す。８８日目の腹腔内ｆｆＬＵＣ ＢｘＰＣ３腫瘍再負荷の後の、個々のマウスからの連続的な生物発光を図１０Ｄに示す。１４５日間の後に終了した実験の生存曲線を図１０Ｅに示す。
【図11A-11B】図１１Ａ～１１Ｂは、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認した、示したＴ細胞またはＰＢＳを用いた処置の前および後の、ＮＳＧマウスにおけるｆｆＬＵＣでタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腹腔内成長を実証する別の実験の結果を示す図である。処置群あたりのＢＬＩ平均全光束（光子数／秒）を図１１Ａに示し、個々のマウスあたりのＢＬＩ全光束（光子数／秒）を図１１Ｂに示す。４１日目（Ｔ細胞注入の２９日後）に無腫瘍であったマウスを、ｆｆＬＵＣでタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞を用いて腹腔内で再負荷した（点線として示す）。
【図12A-12B】図１２Ａ～１２Ｂは、生物発光イメージング（ＢＬＩ）によって確認した、示したＴ細胞またはＰＢＳを用いた処置の前および後の、ＮＳＧマウスにおけるｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６悪性中皮腫細胞のｉｎ ｖｉｖｏでの腹腔内成長を示す図である。処置群あたりのＢＬＩ平均全光束（光子数／秒）を図１２Ａに示し、個々のマウスあたりのＢＬＩ全光束（光子数／秒）を図１２Ｂに示す。Ｔ細胞の持続および機能の維持を確認するために、すべての無腫瘍マウスに、追加の１×１０６個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６細胞を、初回腫瘍接種の９１日後に、腹腔内で接種した。腫瘍負荷のタイミングは、Ｎ１０１２グラフ中の２つ目の点線として示す。
【図13】図１３は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞中で発現させた場合に、ＮＫＧ２Ｄ、Ｎ１０１２、およびＣｙａｄ－０１ＣＡＲのレプリカの細胞表面発現の形質導入の百分率（左パネル）および蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）（右パネル）を示す図である。
【図14A-14B】図１４Ａ～１４Ｂは、ＢｘＰＣ３－ＬＴ（図１４Ａ）、Ｒｅｎ、またはＪｕ７７細胞（図１４Ｂ）と共に同時培養した場合に、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の再刺激（図１４Ａ）および最大の拡大の倍数（図１４Ｂ）を、ＮＫＧ２Ｄ Ｔ細胞またはＣｙａｄ－０１のレプリカを発現するものと比較した図である。
【図15A】図１５Ａは、Ｎ１０１２、Ｃｙａｄ－０１レプリカ、または非形質導入Ｔ細胞と共に、３または８日間のどちらかの間、同時培養した後の、腫瘍球状体の生存度を示す図である。腫瘍球状体は、Ｔ細胞添加の前に３日間の間、１：１の比で同時培養したＧＦＰ発現ＰａＴＵ腫瘍細胞およびｍＣｈｅｒｒｙ発現ＰＳ１細胞からなっていた。添加したＴ細胞の数は、２：１：１の最終的なＴ細胞：ＧＦＰ ＰａＴＵ：ｍＣｈｅｒｒｙ ＰＳ１の比を反映していた。図１５Ｂは、腫瘍球状体との同時培養中の、Ｔ細胞の増殖のレベルを示す。
【図16A-16C】図１６Ａ～１６Ｃは、ＣＡＲ構築体Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、およびＮＫＧ２Ｄ（図１６Ａ）、ならびにＣＹＡＤ－０１＿１０（図１６Ｂ）を示す模式図である。ＣＹＡＤ－０１＿１０では、Ｃｙａｄ－０１のレプリカを追加のＤＡＰ１０と共に同時発現させた。図１６Ｃは、活性化未分画ヒトＴ細胞を、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１＿１０、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、またはＮＫＧ２Ｄをコードしているレトロウイルスベクターを用いて形質導入した後の、Ｔ細胞のＣＤ４＋部分組における細胞表面ＮＫＧ２Ｄ発現の形質導入の百分率（左パネル）および蛍光強度の中央値（ＭＦＩ）（右パネル）を示す。非形質導入Ｔ細胞の結果を比較のために示す。
【図17】図１７は、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１＿１０、および非形質導入Ｔ細胞と共に様々なＣＡＲ Ｔ細胞：標的の比で同時培養した後の、２つの卵巣癌細胞系、倉持＿ＬＴ（左）およびＯｖｓａｈｏ＿ＬＴ（右）の生存度を示す図である。データを２人の独立したドナーについて示す。腫瘍細胞生存度は７２時間後にＭＴＴアッセイによって評価し、Ｔ細胞の非存在下で培養した生細胞の百分率として表す。
【図18】図１８は、Ｃｙａｄ－０１のレプリカまたはＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞と比較した、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の、繰り返しラウンドの刺激の後に持続および増殖する改善された能力を示す図である。
【図19A-19B】図１９Ａ～１９Ｂは、Ｒｅｎ腫瘍細胞単層に対する１６回の再刺激サイクル（図１９Ａ）および２３回の再刺激サイクル（図１９Ｂ）の後の、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋集団からのＮ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞におけるほぼ完全なシフトを示すフローサイトメトリープロットである。
【図22】図２２は、音響力勾配（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｆｏｒｃｅ ｒａｍｐ）を適用した際の、Ｌｏ６８＿ＣＤ１９細胞（左パネル）およびＳＫＯＶ－３細胞（右パネル）についての示したＣＡＲ Ｔ細胞の結合力プロットを示す図である。
【図23A-23B】図２３Ａ～２３Ｂは、４個の異なる腫瘍細胞系と共に同時培養した場合に、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、および非形質導入Ｔ細胞によって分泌されたサイトカインＩＦＮ－γ（図２３Ａ）およびＩＬ－２（図２３Ｂ）のレベルを示す図である。上清を同時培養細胞から取り出し、ＥＬＩＳＡによってサイトカインの存在について評価した。
【図24】図２４は、１２日間にわたる刺激していないＮ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の拡大がＮＫＧ２Ｄおよび非形質導入Ｔ細胞の拡大を上回る一方で、ＣＹＡＤ－０１レプリカおよびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して実質的により乏しい拡大を実証することを示す図である。
【図25】図２５は、ＰＢＳまたはＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入）で処置したマウスにおける、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）発現Ｏｖｓａｈｏ腫瘍異種移植片からの生物発光を示す図である。Ｔ細胞を６日後に腹腔内で、および７日後に静脈内（ｉ．ｖ．）で投与した（垂直方向の点線によって示す）。腫瘍の発生は全光束（光子数／秒）として測定する。
【図26】図２６は、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞で処置したｆｆＬｕｃ Ｏｖｓａｈｏ異種移植片含有マウスにおける抗腫瘍活性を実証する生物発光イメージングの結果（左および中央パネル）、ならびにＮ１０１２ Ｔ細胞と比較した、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の腫瘍部位への改善された輸送（右パネル）を示す図である。腫瘍の発生は、ホタルルシフェラーゼ発現によって全光束（光子数／秒）として測定する。Ｔ細胞輸送は、再度全光束（光子数／秒）として定量するウミシイタケルシフェラーゼの発現によってモニタリングする。
【図27】図２７は、腫瘍接種の７日後にＰＢＳまたはＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１＿１０、または対照ＮＫＧ２Ｄ構築体）で処置したマウスにおける、ｆｆＬｕｃ発現ＳＫＯＶ－３腫瘍異種移植片の発生を示す図である。腫瘍の発生は、ホタルルシフェラーゼ発現によって全光束（光子数／秒）として測定する。
【図28】図２８は、ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、またはレポーター対照「ウミシイタケルシフェラーゼ」）で処置したＳＫＯＶ－３異種移植片含有マウスにおける、腫瘍成長（左パネル）およびＴ細胞輸送（右パネル）の評価の結果を示す図である。
【図29】図２９は、腹腔内ＳＫＯＶ－３腫瘍異種移植片を有するＮＳＧマウスへの静脈内投与の後の、示したウミシイタケルシフェラーゼ発現ＣＡＲ Ｔ細胞の生物発光イメージングの結果を示す図である。様々な時点における、ｒＬｕｃ Ｎ１０１２、ｒＬｕｃ Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、またはｒＬｕｃ単独を発現するＴ細胞のイメージングを示す。
【図30】図３０は、ＰＢＳまたはＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、Ｎ１０１２、またはＮＫＧ２Ｄ）の投与の後の、マウスにおける皮下（ｓ．ｃ．）ＣＦＰａｃ－１膵臓腫瘍異種移植片の発生を示す図である。
【図32】図３２は、腫瘍接種の２８日後に、ＰＢＳ、高用量（１０×１０６個）のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入）、または低用量（４×１０６個）のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２もしくはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２）で処置したマウスにおける、皮下ＣＦＰａｃ－１膵臓腫瘍異種移植片の経時的な発生を示す図である。
【図33】図３３は、腫瘍接種の１４日後にＰＢＳまたは１０×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＹＡＤ－０１レプリカ、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、もしくは非形質導入）を投与した後のマウスにおける、皮下ＢｘＰＣ３膵臓腫瘍異種移植片の発生を示す図である。
【図34】図３４は、ＰＢＳまたは１０×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（ＣＹＡＤ－０１レプリカ、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、もしくは非形質導入）で処置した皮下ＢｘＰＣ３腫瘍異種移植片含有マウスの生存曲線を示す図である。
【図35】図３５は、腫瘍移植の１１１日後にＰＢＳまたは１０×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、Ｎ１０１２、ＣＹＡＤ－０１＿１０、もしくは非形質導入）を投与した後のマウス（ＰＤＸ ＰＤ＿００８）における、皮下中皮腫患者由来異種移植片腫瘍の発生を示す図である。
【図36】図３６は、中皮腫患者由来異種移植片腫瘍含有ＮＳＧマウスへの投与の後の、ｆｆＬｕｃ／ｄｓＴｏｍａｔｏ（ＬＴ）発現ＣＡＲ Ｔ細胞の生物発光イメージングの結果を示す図である。マウスは、Ｔ細胞投与後の様々な時点で、１０×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＬＴ、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ＬＴ、またはＬＴ）を用いて処置した。
【図37】図３７は、腫瘍接種の７日後にＰＢＳまたは１０×１０６個のＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１＿１０、もしくは対照ＮＫＧ２Ｄ）のいずれかを用いて腹腔内で処置した、腹腔内ＳＫＯＶ－３腫瘍を保有するＮＳＧマウスのカプラン－マイヤー生存曲線を示す図である。
【図38】図３８は、ＮＳＧＰＢＳまたはＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入）で処置したマウスにおける、腹腔内ｆｆＬｕｃ Ｏｖｓａｈｏ腫瘍異種移植片の発生を示す図である。５×１０６個のＴ細胞を腫瘍接種の６日後に腹腔内で投与し、さらなる用量の５×１０６個のＴ細胞を翌日に静脈内で投与した。初回腫瘍接種の５６日後に、マウスを、ｆｆＬｕｃ Ｏｖｓａｈｏ細胞を用いて再負荷した。
【図39】図３９は、ＰＢＳまたはＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、もしくは非形質導入）で処置したＮＳＧマウスにおける、腹腔内ｆｆＬｕｃ倉持腫瘍異種移植片の発生を示す図である。５×１０６個のＴ細胞を腫瘍接種の１７日後に腹腔内で投与し、さらなる用量の５×１０６個のＴ細胞を翌日に静脈内で投与した。無腫瘍のマウスは、初回腫瘍接種の８６日後にｆｆＬｕｃ倉持細胞を用いて再負荷した。
【図40】図４０は、図３９に記載するように、腫瘍接種の１７および１８日後に、ＰＢＳまたはＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、もしくは非形質導入）で処置した、腹腔内ｆｆＬｕｃ倉持腫瘍を保有するマウスのカプラン－マイヤー生存曲線を示す図である。
【図41】図４１は、ＰＢＳまたはＣＡＲ－Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、もしくは非形質導入）で処置したＮＳＧマウスにおける、腹腔内ｆｆＬｕｃ倉持腫瘍異種移植片の発生を示す図である。５×１０６個のＴ細胞を腫瘍接種の１７日後に腹腔内で投与し、さらなる用量の５×１０６個のＴ細胞を翌日に静脈内で投与した。無腫瘍のマウスは、初回腫瘍接種の８６日後にｆｆＬｕｃ倉持細胞を用いて再負荷した。
【図42】図４２は、ｒＬｕｃで標識したＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ｒＬｕｃ、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃ）で処置した倉持腫瘍異種移植片含有ＮＳＧマウスの生物発光イメージングの結果を示す図である。Ｔ細胞浸潤は、セレンテラジン投与の後に、４日間にわたって生物発光イメージングによって評価した。
【0020】
【発明を実施するための形態】
【0021】
４．詳細な説明
４．１．定義
特許請求の範囲および明細書中で使用した用語は、別段に指定しない限りは以下に記載するように定義される。
４．１．定義
特許請求の範囲および明細書中で使用した用語は、別段に指定しない限りは以下に記載するように定義される。
【0022】
本明細書中で使用する用語「哺乳動物」とは、ヒトおよび非ヒトをどちらも含み、それだけには限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ネズミ、ウシ、ウマ、およびブタが挙げられる。
【0023】
用語「ネズミ」とは、ネズミ亜科（Ｍｕｒｉｎａｅ）のげっ歯動物をいう。用語「ネズミ」はラットおよびマウスを含む。
【0024】
用語「キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチド」とは、２つ以上の異なる生物からのドメインから形成されるＮＫＧ２Ｄ受容体をいう。キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、その開示がその全体で本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２０２１／２３４１６３号中により詳細に記載されている。
【0025】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列のコンテキストにおいて、用語パーセント「同一性」とは、以下に記載の配列比較アルゴリズムのうちの１つ（たとえば、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮもしくは当業者が利用可能な他のアルゴリズム）を使用して測定して、または目視検査によって、最大一致について比較およびアラインメントした場合に、指定した百分率の同じヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列または部分配列をいう。適用に応じて、パーセント「同一性」は、比較する配列の領域にわたって、たとえば機能的ドメインにわたって存在することができる、または、比較する２つの配列の完全長にわたって存在することができる。
【0026】
配列比較のためには、典型的には１つの配列が参照配列の役を務め、試験配列をそれに対して比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験および参照配列をコンピュータに入力し、必要な場合は部分配列の座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。その後、指定したプログラムパラメータに基づいて、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を計算する。
【0027】
本発明の目的のために、パーセント同一性および配列類似度はＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して行い、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３～４１０ （１９９０）に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公的に利用可能である。
【0028】
本明細書中で使用する用語「対象」とは、任意の動物を広くいい、それだけには限定されないが、ヒトおよび非ヒト動物（たとえば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽、魚、甲殻類など）が挙げられる。
【0029】
本明細書中で使用する用語「有効量」とは、有益または所望の結果をもたらすために十分な、組成物（たとえば合成ペプチド）の量をいう。有効量は、１つまたは複数の投与、施用、または投薬量で投与することができ、特定の配合物または投与経路に限定されることを意図しない。
【0030】
用語「治療上有効な量」とは、疾患の症状を寛解させるために有効な量である。予防は治療とみなすことができるため、治療上有効な量は「予防上有効な量」であることができる。
【0031】
本明細書中で使用する用語「投与」および「投与すること」とは、薬物、プロドラッグ、もしくは他の薬剤、または治療処置（たとえばペプチド）を、対象、またはｉｎ ｖｉｖｏ、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、もしくはｅｘ ｖｉｖｏの細胞、組織、および臓器に与える行為をいう。人体への例示的な投与経路は、脳または脊髄のくも膜下の空間を通じて（くも膜下腔内）、目（眼）、口（経口）、皮膚（局所または経皮）、鼻（経鼻）、肺（吸入剤）、口腔粘膜（頬または舌）、耳、直腸、経膣、注射によって（たとえば、静脈内、皮下、腫瘍内、腹腔内等）などであることができる。
【0032】
本明細書中で使用する用語「処置」とは、有益または意図する臨床結果を得るための手法を意味する。有益または意図する臨床結果としては、症状の緩和、疾患の重篤度の低下、疾患もしくは状態の根底原因の阻害、疾患の非進行性状態での安定化、疾患の進行の遅延、および／または病状の改善もしくは緩和を挙げることができる。
【0033】
本明細書中で使用する用語「医薬組成物」とは、組成物を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏでの治療的または診断的使用に特に適したものにする、活性成分と不活性または活性の担体との組合せをいう。
【0034】
本明細書中で使用する用語「薬学的に許容される」または「薬理学的に許容される」とは、対照に投与した場合に、有害な反応、たとえば、毒性、アレルギー性、または免疫学的の反応を実質的に生じない組成物をいう。
【0035】
本明細書中で使用する単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」ならびにこれらの単語の変形、たとえば「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」とは、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）がそれだけには限定されないこと」を意味し、他の構成要素、整数、またはステップを排除しない。さらに、内容によりそうでないことを要する場合以外は、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞を使用する場合、内容によりそうでないことを要する場合以外は、本明細書は、複数のものおよび単一のものを企図するとして理解されるべきである。
【0036】
本明細書および添付の特許請求の範囲中で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、内容により明らかにそうでないと指示されない限りは、複数形の指示対象を含むことに注意しなければならない。
【0037】
４．２．ＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、ならびに任意選択でＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、またはＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドを含む、免疫応答性細胞
本開示の免疫応答性細胞は、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと、ＣＸＣＲ２ポリペプチドと、任意選択で、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドもしくはその機能的変異体、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドもしくはその機能的変異体、ならびに／またはＤＡＰ１０ポリペプチドもしくはその機能的変異体およびＤＡＰ１２ポリペプチドもしくはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドとを含む。
本開示の免疫応答性細胞は、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと、ＣＸＣＲ２ポリペプチドと、任意選択で、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドもしくはその機能的変異体、ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドもしくはその機能的変異体、ならびに／またはＤＡＰ１０ポリペプチドもしくはその機能的変異体およびＤＡＰ１２ポリペプチドもしくはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドとを含む。
【0038】
４．２．１．ＤＡＰ１０ポリペプチドおよびその機能的変異体
ＤＡＰ１０ポリペプチドは、特定の生物および特定の細胞種において内在的に発現され得る。一実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその変異体は内在性である。あるいは、ＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその変異体は外因性であり得る。
ＤＡＰ１０ポリペプチドは、特定の生物および特定の細胞種において内在的に発現され得る。一実施形態では、ＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその変異体は内在性である。あるいは、ＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその変異体は外因性であり得る。
【0039】
本開示のＤＡＰ１０ポリペプチドは、哺乳動物、たとえばヒトであり得る。野生型ヒトＤＡＰ１０は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｑ９ＵＢＫ５（配列番号１）を有するアミノ酸配列によってコードされている。これは９３個のアミノ酸のポリペプチドである。最初の１８個のアミノ酸はシグナル／リーダー配列、アミノ酸１９～４８は細胞外ドメイン、アミノ酸４９～６９は膜貫通ドメイン、およびアミノ酸７０～９３は細胞質／細胞内ドメインであるとみなされている。
【0040】
一実施形態では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用するＤＡＰ１０ポリペプチドは、配列番号１のＤＡＰ１０ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用するＤＡＰ１０ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。
【0041】
別の実施形態では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用する機能的変異体ＤＡＰ１０ポリペプチドは、ＤＡＰ１０のアミノ酸（野生型ヒトＤＡＰ１０のもの（配列番号１）など）のアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を含み得る。
【0042】
ＤＡＰ１０ポリペプチドの切断バージョンも、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用し得る。たとえば、配列番号１のアミノ酸１９～９３のみを含む（すなわちアミノ酸１～１８、シグナル／リーダー配列を欠く）ＤＡＰ１０の切断バージョンを、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用し得る。そのような配列は本明細書中で配列番号２と呼ぶ。他の切断バージョンは、配列番号１のアミノ酸１９～６９を含んでよく、そのような配列はＤＡＰ１０の細胞外および膜貫通ドメインのみを含み、本明細書中で配列番号３と呼ぶ。本発明において使用するＤＡＰ１０のさらなる切断バージョンは、配列番号１のアミノ酸１～７１（すなわち、シグナル／リーダー配列、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質／細胞内ドメインからの２個のアミノ酸）を含んでよく、本明細書中で配列番号４と呼ぶ。本発明において使用するＤＡＰ１０のさらなる切断バージョンは、配列番号１のアミノ酸１９～７１（すなわち、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞質／細胞内ドメインからの２個のアミノ酸）を含んでよく、本明細書中で配列番号５と呼ぶ。本発明において使用するＤＡＰ１０のさらなる切断バージョンは、配列番号１のアミノ酸７０～９３（すなわち細胞内ドメイン）を含んでよく、本明細書中で配列番号６と呼ぶ。本発明において使用するＤＡＰ１０のさらなる切断バージョンは、配列番号１のアミノ酸４９～９３（すなわち、膜貫通および細胞質／細胞内ドメイン）を含んでよく、本明細書中で配列番号７と呼ぶ。本発明において使用するＤＡＰ１０のさらなる切断バージョンは、配列番号１のアミノ酸４９～６９（すなわち膜貫通ドメイン）を含んでよく、本明細書中で配列番号８と呼ぶ。
【0043】
ＤＡＰ１０ポリペプチドの他の突然変異バージョンまたは切断バージョンも、本開示における使用に適している。一部の実施形態では、本開示におけるＤＡＰ１０ポリペプチドの機能的変異体として使用する突然変異バージョンまたは切断バージョンは、配列番号１に示す野生型ポリペプチドの活性を保持する。
【0044】
一実施形態では、本開示のＤＡＰ１０ポリペプチドの機能的変異体は、配列番号１に示す野生型ポリペプチドの活性の少なくとも１０％（たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く）を保持する。一実施形態では、活性は、ＤＡＰ１０のチロシンリン酸化の評価、ならびに／またはホスファチジルイノシトール３－キナーゼのｐ８５サブユニットおよび下流の抗アポトーシスキナーゼＡＫＴの動員および活性化によって、測定し得る。
【0045】
当業者には理解されるように、ＤＡＰ１０は典型的にはホモ二量体として存在する。したがって、一実施形態では、免疫応答性細胞は、本開示による２つのＤＡＰ１０ポリペプチドを含むＤＡＰ１０ホモ二量体を含む。一実施形態では、免疫応答性細胞はＤＡＰ１０ヘテロ二量体を含み、ＤＡＰ１０ヘテロ二量体のそれぞれのペプチドは、本開示の異なるＤＡＰ１０ポリペプチドを含む。
【0046】
４．２．２．ＤＡＰ１２ポリペプチドおよびその機能的変異体
ＤＡＰ１２ポリペプチドは、特定の生物および特定の細胞種において内在的に発現され得る。一実施形態では、ＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその変異体は内在性である。あるいは、ＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその変異体は外因性であり得る。
ＤＡＰ１２ポリペプチドは、特定の生物および特定の細胞種において内在的に発現され得る。一実施形態では、ＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその変異体は内在性である。あるいは、ＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその変異体は外因性であり得る。
【0047】
本開示のＤＡＰ１２ポリペプチドは、哺乳動物、たとえばヒトであり得る。野生型ヒトＤＡＰ１２は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｏ４３９１４（配列番号９）を有するアミノ酸配列によってコードされている。最初の２１個のアミノ酸はシグナル／リーダー配列、アミノ酸２２～４０は細胞外ドメイン、アミノ酸４１～６１は膜貫通ドメイン、およびアミノ酸６２～１１３は細胞質／細胞内ドメインであるとみなされている。
【0048】
一実施形態では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用するＤＡＰ１２ポリペプチドは、配列番号９のＤＡＰ１２ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用するＤＡＰ１２ポリペプチドは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【0049】
別の実施形態では、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用する機能的変異体ＤＡＰ１２ポリペプチドは、ＤＡＰ１２のアミノ酸（野生型ヒトＤＡＰ１２のもの（配列番号９）など）のアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を含み得る。
【0050】
ＤＡＰ１２ポリペプチドの切断バージョンも、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用し得る。たとえば、配列番号９のアミノ酸２２～１１３のみを含む（すなわちアミノ酸１～２１、シグナル／リーダー配列を欠く）ＤＡＰ１２の切断バージョンを、本開示の融合ポリペプチドにおいて使用し得る。そのような配列は本明細書中で配列番号１０と呼ぶ。他の切断バージョンは、配列番号９のアミノ酸６２～１１３を含んでよく、そのような配列はＤＡＰ１２の細胞質／細胞内ドメインのみを含み、本明細書中で配列番号１１と呼ぶ。他の切断バージョンは、配列番号９のアミノ酸４１～６１（すなわち膜貫通ドメイン）を含んでよく、本明細書中で配列番号１２と呼ぶ。別の切断バージョンは、配列番号９のアミノ酸２２～６１（すなわち細胞外および膜貫通ドメイン）を含んでよく、本明細書中で配列番号１３と呼ぶ。
【0051】
ＤＡＰ１２ポリペプチドの他の突然変異バージョンまたは切断バージョンも、本開示における使用に適している。一部の実施形態では、本開示におけるＤＡＰ１２ポリペプチドの機能的変異体として使用する突然変異バージョンまたは切断バージョンは、配列番号９に示す野生型ポリペプチドの活性を保持する。
【0052】
一実施形態では、本開示のＤＡＰ１２ポリペプチドの機能的変異体は、配列番号９に示す野生型ポリペプチドの活性の少なくとも１０％（たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く）を保持する。一実施形態では、活性は、ＭＴＴや、ＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌の測定などの、機能アッセイを使用して、測定し得る。
【0053】
ＤＡＰ１２は典型的にはホモ二量体として存在することが、当業者には理解されるであろう。したがって、一実施形態では、免疫応答性細胞は、本開示による２つのＤＡＰ１２ポリペプチドを含むＤＡＰ１２ホモ二量体を含む。一実施形態では、免疫応答性細胞はＤＡＰ１２ヘテロ二量体を含み、ＤＡＰ１２ヘテロ二量体のそれぞれのペプチドは、本開示の異なるＤＡＰ１２ポリペプチドを含む。
【0054】
４．２．３．ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドと会合するポリペプチド
本発明の融合ポリペプチドは他のポリペプチドと会合し得る。そのような会合は、相補的な荷電アミノ酸によって提供されるものなどの、静電力が原因であり得る。
本発明の融合ポリペプチドは他のポリペプチドと会合し得る。そのような会合は、相補的な荷電アミノ酸によって提供されるものなどの、静電力が原因であり得る。
【0055】
本発明の融合ポリペプチドと会合し得るそのようなポリペプチドの一例は、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドである（Ｗｕら、２０００、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１９２（７）：１０５９～１０６７およびＲｏｓｅｎら、２００４、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１７３（４）：２４７０～２４７８）。
【0056】
一実施形態では、そのようなポリペプチドは、本開示の融合ポリペプチドをコードしている遺伝子と共に、連続的なキメラ構築体の一部として、遺伝学的にコードされていてよい。その後、融合ポリペプチドおよび他のポリペプチドは、翻訳中に（たとえばリボソームスキップペプチドを使用して）または翻訳後切断によって（たとえばフューリン切断部位を使用して）分離され得る。したがって、融合ポリペプチドおよび他のポリペプチドは、任意選択のリンカーによって結合され得る。そのようなリンカーは、切断を容易にするために切断部位を含み得る。
【0057】
４．２．３．１．ＮＫＧ２Ｄポリペプチドおよびその機能的変異体
本開示のＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、哺乳動物、たとえばヒトであり得る。野生型ヒトＮＫＧ２Ｄは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２６７１８（配列番号１４）を有するアミノ酸配列によってコードされている。ポリペプチドは、細胞質ドメイン（アミノ酸１～５１）、膜貫通ドメイン（アミノ酸５２～７２）、および細胞外ドメイン（アミノ酸７３～２１６）を含むとみなされている。
本開示のＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、哺乳動物、たとえばヒトであり得る。野生型ヒトＮＫＧ２Ｄは、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２６７１８（配列番号１４）を有するアミノ酸配列によってコードされている。ポリペプチドは、細胞質ドメイン（アミノ酸１～５１）、膜貫通ドメイン（アミノ酸５２～７２）、および細胞外ドメイン（アミノ酸７３～２１６）を含むとみなされている。
【0058】
一実施形態では、本開示において使用するＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、配列番号１４のＮＫＧ２Ｄポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、本開示において使用するＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、配列番号１４のアミノ酸配列を含む。
【0059】
別の実施形態では、本開示において使用する機能的変異体ＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、ＮＫＧ２Ｄのアミノ酸（野生型ヒトＮＫＧ２Ｄのもの（配列番号１４）など）のアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を含み得る。
【0060】
ＮＫＧ２Ｄポリペプチドの切断バージョンも、本開示のポリペプチドにおいて使用し得る。たとえば、配列番号１４のアミノ酸７３～２１６（すなわち細胞外ドメイン）のみを含む、ＮＫＧ２Ｄの切断バージョンを本開示において使用し得る。そのような配列は本明細書中で配列番号１５と呼ぶ。他の切断バージョンは、配列番号１４のアミノ酸８２～２１６を含んでよく、そのような配列はＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメインの一部を含み、本明細書中で配列番号１６と呼ぶ。さらなる切断バージョンは、配列番号１４のアミノ酸５２～２１６（すなわち、膜貫通および細胞外ドメイン）を含み、本明細書中で配列番号１７と呼ぶ。
【0061】
ＮＫＧ２Ｄポリペプチドの他の突然変異バージョンまたは切断バージョンも、本開示における使用に適している。もちろん、本開示におけるＮＫＧ２Ｄポリペプチドの機能的変異体として使用する任意のそのような突然変異バージョンまたは切断バージョンは、好ましくは、配列番号１４に示す野生型ポリペプチドの活性を保持するべきである。
【0062】
一実施形態では、本開示のＮＫＧ２Ｄポリペプチドの機能的変異体は、配列番号１４に示す野生型ポリペプチドの活性の少なくとも１０％（たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く）を保持する。一実施形態では、活性は、ＮＫＧ２Ｄリガンドとの継続的な結合を確認するためのフローサイトメトリーを使用して、ならびに標的細胞溶解、サイトカイン分泌、および共刺激を確認することを目的とした様々な細胞培養アッセイ（ＭＴＴおよびＥＬＩＳＡなど）を通じて、測定し得る。
【0063】
一部の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドはキメラポリペプチドである。特定の実施形態では、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドはヒト－ネズミキメラポリペプチドである。一実施形態では、キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端に、ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインまたはその変異体およびヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインまたはその変異体を含む。キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドは、その開示がその全体で本明細書中に参考として組み込まれているＷＯ２０２１／２３４１６３号中により詳細に記載されている。
【0064】
４．２．３．２．ＣＸＣＲ２ポリペプチドおよびその機能的変異体
本開示のＣＸＣＲ２ポリペプチドは、哺乳動物、たとえばヒトであり得る。野生型ヒトＣＸＣＲ２は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２５０２５（配列番号８７）を有するアミノ酸配列によってコードされている。
本開示のＣＸＣＲ２ポリペプチドは、哺乳動物、たとえばヒトであり得る。野生型ヒトＣＸＣＲ２は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：Ｐ２５０２５（配列番号８７）を有するアミノ酸配列によってコードされている。
【0065】
一実施形態では、本開示のＣＸＣＲ２ポリペプチドは、配列番号８７のＣＸＣＲ２ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。一実施形態では、本開示のＣＸＣＲ２ポリペプチドは配列番号８７のアミノ酸配列を有する。
【0066】
一実施形態では、本開示のＣＸＣＲ２ポリペプチドは、配列番号８７のＣＸＣＲ２ポリペプチドの機能的変異体である。一実施形態では、機能的変異体ＣＸＣＲ２ポリペプチドは、ＣＸＣＲ２のアミノ酸（たとえば配列番号８７）に付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を含む。
【0067】
一実施形態では、本開示の機能的変異体ＣＸＣＲ２ポリペプチドは、野生型ヒトＣＸＣＲ２（配列番号８７）の活性の少なくとも１０％（たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高く）を保持する。一実施形態では、ポリペプチドの活性は、ＣＸＣＲ２とリガンド（たとえばＩＬ－８）との結合を確認するためのフローサイトメトリーを使用して測定する。一実施形態では、ポリペプチドの活性は、当技術分野で知られている細胞培養アッセイを通じて測定する。
【0068】
４．２．４．リンカー
本明細書中に記載のＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドのＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２部分は、連続的なポリペプチド鎖中で互いに直接結合していることができるか、または、適切なリンカーを通じて互いに間接的に結合していてよい。リンカーはペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは融合ポリペプチドにおいて一般的に使用されており、リンカーを選択または設計する方法は周知である。（たとえば、Ｃｈｅｎ Ｘら、２０１３、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、６５（１０）：１３５７０１３６９およびＷｒｉｇｇｅｒｓ Ｗら、２００５、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、８０：７３６～７４６を参照）。リンカーは、上述のキメラ構築体において本開示の融合ポリペプチドを別のポリペプチド（ＮＫＧ２Ｄポリペプチドなど）と結合させるためにも使用し得る。
本明細書中に記載のＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドのＤＡＰ１０およびＤＡＰ１２部分は、連続的なポリペプチド鎖中で互いに直接結合していることができるか、または、適切なリンカーを通じて互いに間接的に結合していてよい。リンカーはペプチドリンカーであり得る。ペプチドリンカーは融合ポリペプチドにおいて一般的に使用されており、リンカーを選択または設計する方法は周知である。（たとえば、Ｃｈｅｎ Ｘら、２０１３、Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．、６５（１０）：１３５７０１３６９およびＷｒｉｇｇｅｒｓ Ｗら、２００５、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、８０：７３６～７４６を参照）。リンカーは、上述のキメラ構築体において本開示の融合ポリペプチドを別のポリペプチド（ＮＫＧ２Ｄポリペプチドなど）と結合させるためにも使用し得る。
【0069】
ペプチドリンカーは、一般にｉ）柔軟なリンカー、ｉｉ）ヘリックス形成リンカー、およびｉｉｉ）切断可能なリンカーとして分類され、それぞれの種類の例は当技術分野で知られている。一例では、柔軟なリンカーが本明細書中に記載の融合ポリペプチド中に含められる。柔軟なリンカーは、グリシンおよびアラニンなどの立体障害のないアミノ酸を大多数含有し得る。親水性アミノ酸Ｓｅｒも柔軟なリンカー中で慣習的に使用される。柔軟なリンカーの例としては、それだけには限定されないが、ポリグリシン（たとえば（Ｇｌｙ）４および（Ｇｌｙ）５）、ポリアラニン ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）、ならびにポリ（Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）（たとえば（Ｇｌｙｎ－Ｓｅｒｎ）ｎまたは（Ｓｅｒｎ－Ｇｌｙｎ）ｎ［式中、それぞれのｎは独立して１以上の整数である］）が挙げられる。
【0070】
ペプチドリンカーは、適切な長さのものであることができる。ペプチドリンカー配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５個、またはそれより多くのアミノ酸残基の長さであり得る。たとえば、ペプチドリンカーは、約５～約５０個のアミノ酸の長さ、約１０～約４０個のアミノ酸の長さ、約１５～約３０個のアミノ酸の長さ、または約１５～約２０個のアミノ酸の長さであることができる。ペプチドリンカーの長さの変動は、活性を保持または増強させる場合があり、活性研究において優れた有効性を生じる。ペプチドリンカー配列は、天然に存在するもしくは存在しないアミノ酸、または天然に存在するおよび存在しないアミノ酸の両方の混合物から構成され得る。
【0071】
一部の態様では、アミノ酸グリシンおよびセリンがリンカー配列内のアミノ酸を構成する。特定の態様では、リンカー領域は、グリシンリピートの組（ＧＳＧ３）ｎ（配列番号１８）［式中、ｎは１以上の正の整数（たとえば１から約２０）である］を含む。より詳細には、リンカー配列はＧＳＧＧＧ（配列番号１９）であり得る。リンカー配列はＧＳＧＧ（配列番号２０）であり得る。特定の他の態様では、リンカー領域の配向は、グリシンリピートの組（ＳｅｒＧｌｙ３）ｎ（配列番号２１）［式中、ｎは１以上の正の整数（たとえば１から約２０）である］を含む。
【0072】
他の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）およびセリン（Ｓ）をランダムまたは繰り返しのパターンで含有し得る。たとえば、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号２２）［式中、ｎは１～２０の範囲の整数、たとえば１～４である］であることができる。具体的な例では、ｎは４であり、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２３）である。別の特定の例では、ｎは３であり、リンカーはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号２４）である。
【0073】
他の実施形態では、リンカーは、グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）、およびプロリン（Ｐ）をランダムまたは繰り返しのパターンで含有し得る。たとえば、リンカーは（ＧＰＰＧＳ）ｎ［式中、ｎは１～２０の範囲の整数、たとえば１～４である］であることができる。具体的な例では、ｎは１であり、リンカーはＧＰＰＧＳ（配列番号２５）である。
【0074】
一般に、リンカーは、ヒトなどの患者に投与した場合に免疫原性ではない。したがって、リンカーは、低い免疫原性を有するように、または低い免疫原性を有すると考えられるように選択し得る。
【0075】
本明細書中に記載のリンカーは例示的であり、所望する場合は、リンカーはＧｌｕおよびＬｙｓなどの他のアミノ酸を含むことができる。所望する場合は、ペプチドリンカーは、複数リピートの、たとえば、（Ｇ３Ｓ）（配列番号２６）、（Ｇ４Ｓ）（配列番号２７）、（ＧＹＳ）（配列番号２８）、および／または（ＧｌｙＳｅｒ）（配列番号２９）を含み得る。特定の態様では、ペプチドリンカーは、複数リピートの、たとえば、（ＳＧ４）（配列番号３０）、（ＳＧ３）（配列番号３１）、（ＳＧ２）（配列番号３２）、（ＳＧ）２（配列番号３３）、または（ＳｅｒＧｌｙ）（配列番号３４）を含み得る。
【0076】
他の態様では、ペプチドリンカーは、（Ｇ３Ｓ）＋（Ｇ４Ｓ）＋（ＧｌｙＳｅｒ）（配列番号２６＋配列番号２７＋配列番号２９）などの、リピートアミノ酸配列単位の組合せおよび多重を含み得る。他の態様では、ＳｅｒをＡｌａで置き換えることができ、たとえば（Ｇ４Ａ）（配列番号３５）または（Ｇ３Ａ）（配列番号３６）である。さらに他の態様では、リンカーはモチーフ（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは１以上の正の整数、たとえば１から約２０である］（配列番号３７）を含む。特定の態様では、ペプチドリンカーは切断可能なリンカーも含み得る。
【0077】
リンカーは、フューリン切断部位（ＲＲＫＲ）（配列番号３８）、Ｐ２Ａリボソームスキップペプチド（ＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号３９）、および／またはＴ２Ａリボソームスキップペプチド（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号４０）などの、さらなるドメインおよび／または特長を含み得る。これらのドメインを含むリンカーの例としては、ＳＧＳＧ＋１つのＰ２Ａリボソームスキップペプチド（ＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号４１）、ＳＧＳＧ＋１つのＴ２Ａリボソームスキップペプチド（ＳＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号４２）、ならびにフューリン切断部位も含むバージョン、すなわち、フューリン切断部位＋ＳＧＳＧ＋１つのＰ２Ａリボソームスキップペプチド（ＲＲＫＲＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号４３）およびフューリン切断部位＋ＳＧＳＧ＋１つのＴ２Ａリボソームスキップペプチド（ＲＲＫＲＳＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）（配列番号４４）が挙げられる。本発明において使用し得る代替リボソームスキップペプチドとしては、Ｆ２Ａ（ＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）（配列番号４５）およびＥ２Ａ（ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ）（配列番号４６）が挙げられる。
【0078】
４．２．５．Ｎ末端配列およびＣ末端配列
様々な配列を、本開示の融合ポリペプチドのＮもしくはＣ末端、または本明細書中に開示するＮＫＧ２Ｄポリペプチドに付着させ得る。これらは、シグナルペプチド、精製タグ／配列、もしくは半減期延長部分などの機能的なものであり得るか、または単純にスペーサー配列を含み得る。あるいは、これらはＴ細胞刺激機能などの機能を含み得る。
様々な配列を、本開示の融合ポリペプチドのＮもしくはＣ末端、または本明細書中に開示するＮＫＧ２Ｄポリペプチドに付着させ得る。これらは、シグナルペプチド、精製タグ／配列、もしくは半減期延長部分などの機能的なものであり得るか、または単純にスペーサー配列を含み得る。あるいは、これらはＴ細胞刺激機能などの機能を含み得る。
【0079】
４．２．５．１．精製タグおよびマーカー
精製を支援するために、様々なタグまたはマーカーを本開示の融合ポリペプチドのＮまたはＣ末端に付着させ得る。任意の親和性タグを本開示の融合ポリペプチドと組み合わせて、精製を支援し得る。そのような親和性タグの例は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、アプタマータグ、Ｖ５タグ、ＡｖｉＴａｇＴＭ、ｍｙｃエピトープタグ、またはこれらのタグの任意の組合せである。一実施形態では、親和性タグは、Ｈｉｓタグ（通常は５～１０個のヒスチジン残基を含む）、たとえば６Ｈｉｓタグ（すなわちＨＨＨＨＨＨ）（配列番号４７）である。別の実施形態では、親和性タグはＦＬＡＧタグ（すなわちＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号４８）である。別の実施形態では、親和性タグはＡｖｉＴａｇ（商標）（すなわちＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号４９）である。別の実施形態では、親和性タグはＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号５０）または（ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ）（配列番号５１）である。別の実施形態では、親和性タグは、９ｅ１０抗体によって認識されるｍｙｃエピトープタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号５２）である。本開示において使用するための様々な他のタグが当技術分野で周知である。
精製を支援するために、様々なタグまたはマーカーを本開示の融合ポリペプチドのＮまたはＣ末端に付着させ得る。任意の親和性タグを本開示の融合ポリペプチドと組み合わせて、精製を支援し得る。そのような親和性タグの例は、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、アプタマータグ、Ｖ５タグ、ＡｖｉＴａｇＴＭ、ｍｙｃエピトープタグ、またはこれらのタグの任意の組合せである。一実施形態では、親和性タグは、Ｈｉｓタグ（通常は５～１０個のヒスチジン残基を含む）、たとえば６Ｈｉｓタグ（すなわちＨＨＨＨＨＨ）（配列番号４７）である。別の実施形態では、親和性タグはＦＬＡＧタグ（すなわちＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号４８）である。別の実施形態では、親和性タグはＡｖｉＴａｇ（商標）（すなわちＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）（配列番号４９）である。別の実施形態では、親和性タグはＶ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）（配列番号５０）または（ＩＰＮＰＬＬＧＬＤ）（配列番号５１）である。別の実施形態では、親和性タグは、９ｅ１０抗体によって認識されるｍｙｃエピトープタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）（配列番号５２）である。本開示において使用するための様々な他のタグが当技術分野で周知である。
【0080】
Ｎ末端に１つもしくは複数のタグを含む、Ｃ末端に１つもしくは複数のタグを含む、またはＮ末端およびＣ末端のそれぞれに１つもしくは複数のタグを含むかのいずれかである、そのような親和性タグの組合せも使用し得る。そのような組合せの例としては、Ｈｉｓタグ（Ｈ）をＡｖｉＴａｇ（Ａ）と組み合わせたもの、またはＨｉｓタグ（Ｈ）をＡｖｉＴａｇ（Ａ）およびＦＬＡＧタグ（Ｆ）の両方と組み合わせたものが挙げられる。タグはどちらの配向であってもよく、したがって、ＡｖｉＴａｇ／Ｈｉｓタグは配向Ｎ－ＡＨ－ＣまたはＮ－ＨＡ－Ｃを有してよい一方で、Ａｖｉ／Ｈｉｓ／ＦＬＡＧタグは配向Ｎ－ＡＨＦ－Ｃ、Ｎ－ＦＨＡ－Ｃなどを有してよい。
【0081】
一実施形態では、本開示による融合ポリペプチドは、配列「ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＧＨＨＨＨＨＨＤＹＫＤＤＤＤＫ」（配列番号５３）を有する「ＡＨＦ」タグを含む。別の実施形態では、本開示による融合ポリペプチドは、配列「ＤＹＫＤＤＤＤＫＨＨＨＨＨＨＧＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ」（配列番号５４）を有する「ＦＨＡ」タグを含む。
【0082】
ＣＤ８αリーダー配列（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０１７３２のアミノ酸１～２１、またはアミノ酸１～１８を含む短縮された誘導体）は、一般的に使用されているＴ細胞配列であり、本明細書中で配列番号５５と呼ぶ。
【0083】
４．２．５．２．共刺激配列
様々なＴ細胞共刺激活性化配列が、ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作するための以前の研究から知られている。これらも本開示の融合ポリペプチドに付加し得る。
様々なＴ細胞共刺激活性化配列が、ＣＡＲ－Ｔ細胞を操作するための以前の研究から知られている。これらも本開示の融合ポリペプチドに付加し得る。
【0084】
４－１ＢＢエンドドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｑ０７０１１のアミノ酸２１４～２５５）も、ＮまたはＣ末端配列として使用し得る。４－１ＢＢエンドドメインは本明細書中で配列番号５６と呼ぶ。４－１ＢＢエンドドメインは共刺激ドメインとして作用し得る。
【0085】
ＣＤ２７エンドドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ２６８４２のアミノ酸２１３～２６０）も、ＮまたはＣ末端配列として使用し得る。ＣＤ２７エンドドメインは本明細書中で配列番号５７と呼ぶ。ＣＤ２７エンドドメインは共刺激ドメインとして作用し得る。
【0086】
ヒトＩｇＧ１ヒンジ（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０ＤＯＸ５のアミノ酸２１８～２２９または２１８～２３２）も、ＮまたはＣ末端配列として使用し得る。ヒトＩｇＧ１ヒンジは配列番号５８または配列番号１０４と呼ぶ。
【0087】
切断されたＣＤ８αヒンジ（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１７３２のアミノ酸１３８～１８２）も、ＮまたはＣ末端配列として使用し得る。切断されたＣＤ８ａヒンジは配列番号５９と呼ぶ。
【0088】
４．２．６．例示的な構築体
本開示は、表１中の以下の例示的な融合ポリペプチド構築体を提供する。
本開示は、表１中の以下の例示的な融合ポリペプチド構築体を提供する。
【表1】
【0089】
さらに、上述のように、本開示の融合ポリペプチドは、翻訳関連または翻訳後の切断のために、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドとの単一のキメラ構築体として発現され得る。そのような構築体では、発現の後、翻訳されたポリペプチドは切断されて別々のポリペプチドが作製され、その後、これらが自己会合してＣＡＲを形成する。一実施形態では、本開示の融合ポリペプチドはＮＫＧ２Ｄポリペプチドから切断される。そのような構築体の例を表２に示す。
【表2】
【0090】
４．２．７．本開示のＮＫＧ２Ｄ、ＣＸＣＲ２、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、およびＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドをコードしている核酸分子
本開示の別の態様は、本開示の１つまたは複数のポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。これは、ＤＮＡまたはＲＮＡとしてであり得る。本明細書中で具体的に限定しない限りは、この用語は、参照核酸と類似の特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例としては、それだけには限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホン酸メチル、キラル－メチルリン含有物（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ）、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別段に指定しない限りは、特定の核酸配列は、保存的に改変されたその変異体（たとえば縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に示した配列も暗に包含する。具体的には、以下に詳述するように、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置き換えた配列を作製することによって、達成し得る（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１、Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５～２６０８、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１～９８）。
本開示の別の態様は、本開示の１つまたは複数のポリペプチドをコードしている核酸分子に関する。これは、ＤＮＡまたはＲＮＡとしてであり得る。本明細書中で具体的に限定しない限りは、この用語は、参照核酸と類似の特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。そのような類似体の例としては、それだけには限定されないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、ホスホン酸メチル、キラル－メチルリン含有物（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｔｅ）、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が挙げられる。別段に指定しない限りは、特定の核酸配列は、保存的に改変されたその変異体（たとえば縮重コドン置換）および相補的配列、ならびに明確に示した配列も暗に包含する。具体的には、以下に詳述するように、縮重コドン置換は、１つまたは複数の選択された（またはすべての）コドンの３番目の位置を混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置き換えた配列を作製することによって、達成し得る（Ｂａｔｚｅｒら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．、１９：５０８１、Ｏｈｔｓｕｋａら、１９８５、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６０：２６０５～２６０８、およびＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、１９９４、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ、８：９１～９８）。
【0091】
したがって、本開示は、配列番号６０～６９、８７、９０、および１０２のうちの任意の１つまたは複数のポリペプチド配列をコードしているヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。
【0092】
本開示は、配列番号６０～６９、８７、９０、および１０２のうちの任意のものをコードしている核酸と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸をさらに提供する。配列同一性は、典型的には参照配列の完全長に沿って測定する。
【0093】
本開示は、配列番号７０～７９、８８、９１、および１０３のうちの任意の１つと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸をさらに提供する。
【0094】
本開示は、配列番号７０～７９、８８、９１、および１０３のうちの任意の１つのヌクレオチド配列を含む核酸も提供する。本開示は、配列番号７０～７９、９１、および１０３のうちの任意の１つのヌクレオチド配列からなる核酸も提供する。
【0095】
ポリヌクレオチド配列は、ｄｅ ｎｏｖｏ固相ＤＮＡ合成によって、または既存配列（たとえば以下の実施例中に記載の配列）のＰＣＲ突然変異誘発によって、生成することができる。核酸の直接化学合成は、当技術分野で知られている方法、たとえば、Ｎａｒａｎｇら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：９０のリン酸トリエステル方法；Ｂｒｏｗｎら、１９７９、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６８：１０９のリン酸ジエステル方法；Ｂｅａｕｃａｇｅら、１９８１、Ｔｅｔｒａ．Ｌｅｔｔ．、２２：１８５９のジエチルホスホルアミダイト方法；および米国特許第４，４５８，０６６号の固体支持体方法によって達成することができる。ＰＣＲによって突然変異をポリヌクレオチド配列に導入することは、たとえば、ＰＣＲ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ： Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｈ．Ａ．Ｅｒｌｉｃｈ （編）、Ｆｒｅｅｍａｎ Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ，Ｎ．Ｙ．、１９９２；ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｉｎｎｉｓら（編）、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ、１９９０；Ｍａｔｔｉｌａら、１９９１、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１９：９６７；およびＥｃｋｅｒｔら、１９９１、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、１：１７中に記載されているように行うことができる。
【0096】
４．２．８．ベクター
本開示は、本開示の１つまたは複数の核酸分子を含むベクターも提供する。
本開示は、本開示の１つまたは複数の核酸分子を含むベクターも提供する。
【0097】
宿主細胞中での発現には、本開示の１つまたは複数のポリペプチドをコードしている核酸が適切なベクター中に存在することができ、適切な宿主内への導入の後、配列を発現させて、コードされているポリペプチドを、当技術分野で知られている標準のクローニングおよび発現技法に従って生成することができる（たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．、Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．、およびＭａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、１９８９に記載）。開示は、本開示による核酸配列を含むそのようなベクターにも関する。
【0098】
様々な発現ベクターを用いて、本開示のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを発現させることができる。ウイルスに基づくベクターおよび非ウイルス発現ベクターをどちらも使用して、哺乳動物宿主細胞などの宿主細胞中でポリペプチドを産生させることができる。非ウイルスベクターおよびシステムとしては、プラスミド、エピソームベクター、典型的にはタンパク質またはＲＮＡを発現させるための発現カセットを有するもの、およびヒト人工染色体が挙げられる（たとえばＨａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７、Ｎａｔ Ｇｅｎｅｔ．、１５：３４５を参照）。たとえば、哺乳動物（たとえばヒト）細胞における本開示のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの発現に有用な非ウイルスベクターとしては、ｐＴｈｉｏＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ、ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｉｓ、ｐＥＢＶＨｉｓ Ａ、Ｂ、およびＣ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）、ＭＰＳ Ｖベクター、ならびに他のタンパク質を発現させるために当技術分野で知られている数々の他のベクターが挙げられる。有用なウイルスベクターとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ＳＶ４０に基づくベクター、パピローマウイルス、ＨＢＰエプスタイン・バーウイルス、ワクシニアウイルスベクター、およびセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）に基づくベクターが挙げられる。Ｂｒｅｎｔら、上記、Ｓｍｉｔｈ、１９９５、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４９：８０７；およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄら、１９９２、Ｃｅｌｌ、６８：１４３を参照されたい。特に、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、またはアデノ随伴ウイルスベクターが、Ｔ細胞における発現に一般的に使用される。そのようなベクターの例としては、ＳＦＧレトロウイルス発現ベクターが挙げられる（Ｒｉｖｉｅｒｅら、１９９５、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）、９２：６７３３～６７３７を参照）。一実施形態では、レンチウイルスベクターを使用し、これには自己不活性化レンチウイルスベクター（いわゆるＳＩＮベクター）が挙げられる。
【0099】
発現ベクターの選択は、ベクターをその中で発現させることを意図する宿主細胞に依存する。哺乳動物宿主細胞のための発現ベクターは、複製起点、プロモーター、およびエンハンサーなどの発現制御配列（たとえばＱｕｅｅｎら、１９８６、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、８９：４９～６８を参照）、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネーター配列などの必要なプロセッシング情報部位を含むことができる。これらの発現ベクターは通常、哺乳動物遺伝子または哺乳動物ウイルスに由来するプロモーターを含有する。適切なプロモーターは、構成的、細胞種特異的、段階特異的、および／または変調可能もしくは調節可能であり得る。有用なプロモーターとしては、それだけには限定されないが、メタロチオネインプロモーター、構成的アデノウイルス主要後期プロモーター、デキサメタゾン誘導性ＭＭＴＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＭＲＰ ｐｏｌＩＩＩプロモーター、構成的ＭＰＳ Ｖプロモーター、テトラサイクリン誘導性ＣＭＶプロモーター（ヒト前初期ＣＭＶプロモーターなど）、構成的ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１アルファプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、および当技術分野で知られているプロモーター－エンハンサーの組合せが挙げられる。
【0100】
形質転換させた生物の培養物は、集団を、その発現産物が宿主細胞によってより良好に耐容されるコード配列についてバイアスをかけずに、非誘導性条件下で拡大することができる。プロモーターに加えて、他の調節要素も、本開示のポリペプチドの効率的な発現に必要であり得るまたは所望され得る。これらの要素は、典型的には。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接リボソーム結合部位または他の配列を含む。さらに、発現の効率は、使用中の細胞系に適切なエンハンサーを含めることによって増強させ得る（たとえば、Ｓｃｈａｒｆら、１９９４、Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｐｒｏｂｌ．Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒ．、２０：１２５；およびＢｉｔｔｎｅｒら、１９８７、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、１５３：５１６を参照）。たとえば、ＳＶ４０エンハンサーまたはＣＭＶエンハンサーを使用して、哺乳動物宿主細胞中における発現を増加させ得る。
【0101】
本開示は、配列番号６０～６９、８７、９０、および１０２のうちの任意のものをコードしている核酸と少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む核酸を含む、クローニングまたは発現ベクターを提供する。さらに、本開示は、配列番号６０～６９、８７、９０、および１０２のうちの１つまたは複数をコードしている核酸を含む、クローニングまたは発現ベクターを提供する。本開示は、配列番号７０～７９、８８、９１、および１０３のうちの任意の１つの核酸配列を含む、クローニングまたは発現ベクターを提供する。
【0102】
４．２．９．宿主細胞
本開示のポリペプチド、本開示の核酸、本開示のベクター、またはそのいずれかもしくは両方の組合せを含む宿主細胞を提供する。そのような細胞は、一般に、本開示によるポリペプチドの発現に利用される。
本開示のポリペプチド、本開示の核酸、本開示のベクター、またはそのいずれかもしくは両方の組合せを含む宿主細胞を提供する。そのような細胞は、一般に、本開示によるポリペプチドの発現に利用される。
【0103】
核酸またはベクターは、標準の技法によって宿主細胞内に形質移入し得る。
【0104】
用語「形質移入」の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核または真核宿主細胞内に導入するために一般的に使用されている多種多様な技法、たとえば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、ＤＥＡＥ－デキストラン形質移入などを包含することを意図する。
【0105】
あるいは、核酸またはベクターは、形質導入によって宿主細胞内に送達し得る。たとえば、上記開示したウイルスベクターを核酸またはベクターの送達に使用し得る。
【0106】
本開示のポリペプチドを、原核または真核のどちらかの宿主細胞中で発現させることが可能である。代表的な宿主細胞としては、多数の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株、ＣＨＯ、ＣＨＯ－Ｋ１、およびＨＥＫ２９３などの哺乳動物細胞系；Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ならびに出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞は、ＮＫ細胞（初代ＮＫ細胞もしくはＮＫ細胞系のどちらか）またはＴ細胞（初代Ｔ細胞もしくはＴ細胞系のどちらか）などの免疫応答性細胞である。他の種類の宿主細胞としては、マクロファージ、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、好中球、および不変ＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞が挙げられる。Ｔ細胞はＣＤ４＋またはＣＤ８＋ Ｔ細胞であり得る。一実施形態では、宿主細胞はヒト細胞である。一実施形態では、宿主細胞はヒトＴ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞は初代ヒトＴ細胞である。使用し得る細胞系としては、ＮＫ細胞系ＮＫ－９２が挙げられる。
【0107】
本開示のポリペプチドを発現させるための哺乳動物宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（たとえばＲ．Ｊ．ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．Ａ．Ｓｈａｒｐ、１９８２、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、１５９：６０１～６２１に記載されたＤＨ ＦＲ選択マーカーと共に使用する、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、１９８０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、７７：４２１６～４２２０に記載されたｄｈｆｒ－ ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、およびＳＰ２細胞が挙げられる。一実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ Ｋ１ＰＤ細胞である。別の実施形態では、宿主細胞はＮＳＯ１細胞である。特に、ＮＳＯ骨髄腫細胞との使用では、別の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２号、ＷＯ８９／０１０３６号、およびＥＰ３３８，８４１号中に示されているＧＳ遺伝子発現系である。ポリペプチドをコードしている組換え発現ベクターを哺乳動物宿主細胞内に導入する場合、ポリペプチドは、宿主細胞中におけるポリペプチドの発現、または宿主細胞を成長させている培養培地内へのポリペプチドの分泌を可能にするために十分な期間の間、宿主細胞を培養することによって、生成し得る。ポリペプチドは、標準のタンパク質精製方法を使用して培養培地から回収することができる。
【0108】
４．３．本開示の免疫応答性細胞を生成する方法
本開示は、本開示のポリペプチドを含む免疫応答性細胞を生成する方法も提供する。そのような方法は、細胞を、本開示のポリペプチドをコードしている核酸またはベクターで形質導入するステップを含み得る。この方法は、ポリペプチドが発現され、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと会合してＣＡＲを形成するように、細胞を培養するステップをさらに含み得る。
本開示は、本開示のポリペプチドを含む免疫応答性細胞を生成する方法も提供する。そのような方法は、細胞を、本開示のポリペプチドをコードしている核酸またはベクターで形質導入するステップを含み得る。この方法は、ポリペプチドが発現され、ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと会合してＣＡＲを形成するように、細胞を培養するステップをさらに含み得る。
【0109】
一実施形態では、本開示は、（ｉ）本開示の核酸分子またはベクターを免疫応答性細胞内に形質導入するステップと、（ｉｉ）形質導入した細胞がＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチド、およびＣＸＣＲ２ポリペプチドを発現し、ＮＫＧ２ＤポリペプチドおよびＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドが細胞膜中で会合するように、免疫応答性細胞を培養するステップとを含む、免疫応答性細胞を調製する方法を提供する。
【0110】
さらなる実施形態では、本開示は、（ｉ）Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を患者から得るステップと、（ｉｉ）本開示の核酸またはベクターをＴ細胞および／またはＮＫ細胞内に形質導入するステップと、（ｉｉｉ）形質導入した細胞がＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチド、およびＣＸＣＲ２ポリペプチドを発現し、ＮＫＧ２ＤポリペプチドおよびＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドが細胞膜中で会合するように、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を培養するステップとを含む方法を提供する。
【0111】
免疫応答性細胞を培養するための様々な方法が当技術分野で周知である。たとえば、Ｐａｒｅｎｔｅ－Ｐｅｒｅｉｒａ ＡＣら、２０１４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１（２）：ｅ７、Ｇｈａｓｓｅｍｉ Ｓら、２０１８、Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｓ、６（９）：１１００～１１０９、およびＤｅｎｍａｎ ＣＪら、２０１２、ＰＬｏＳ Ｏｎｅ、７（１）： ｅ３０２６４を参照されたい。
【0112】
４．４．医薬組成物
本開示は、本明細書中に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または宿主細胞を含む医薬組成物も提供する。そのような医薬組成物は、薬学的にまたは生理的に許容される希釈剤および／または担体を含むことができる。担体は一般に、意図する投与様式に適切であるように選択し、たとえば、組成物のｐＨ、容積モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための薬剤を挙げることができる。典型的には、これらの担体としては、塩類溶液および／または緩衝媒体を含めた、水性溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液が挙げられる。
本開示は、本明細書中に記載のポリペプチド、核酸、ベクター、または宿主細胞を含む医薬組成物も提供する。そのような医薬組成物は、薬学的にまたは生理的に許容される希釈剤および／または担体を含むことができる。担体は一般に、意図する投与様式に適切であるように選択し、たとえば、組成物のｐＨ、容積モル浸透圧濃度、粘度、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着、または浸透を改変、維持、または保存するための薬剤を挙げることができる。典型的には、これらの担体としては、塩類溶液および／または緩衝媒体を含めた、水性溶液またはアルコール／水溶液、乳濁液、または懸濁液が挙げられる。
【0113】
医薬組成物中に含めるための適切な薬剤としては、それだけには限定されないが、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリシンなど）、抗微生物剤、抗酸化剤（アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、または亜硫酸水素ナトリウムなど）、緩衝剤（ボレート、バイカーボネート、トリス－ＨＣｌ、シトレート、ホスフェート、または他の有機酸など）、充填剤（マンニトールまたはグリシンなど）、キレート化剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）、錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ－シクロデキストリン、またはヒドロキシプロピル－ベータ－シクロデキストリンなど）、充填剤、単糖、二糖、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）、タンパク質（無血清（ｆｒｅｅ ｓｅｒｕｍ）アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）、着色剤、香味料および希釈剤、乳化剤、親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）、低分子量ポリペプチド、塩形成対イオン（ナトリウムなど）、保存料（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、または過酸化水素など）、溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、またはポリエチレングリコールなど）、糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）、懸濁剤、界面活性剤または湿潤剤（ｐｌｕｒｏｎｉｃ、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート２０もしくはポリソルベート８０などのポリソルベート、Ｔｒｉｔｏｎ、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサパル（ｔｙｌｏｘａｐａｌ）など）、安定性増強剤（スクロースまたはソルビトールなど）、等張性増強剤（塩化ナトリウムもしくはカリウム等のハロゲン化アルカリ金属、またはマンニトールソルビトールなど）、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤、および／あるいは薬学的アジュバントが挙げられる。
【0114】
非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロース、塩化ナトリウム、および乳酸リンゲル液が挙げられる。カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、およびアルギネートなどの、適切な生理的に許容されるシックナーを含め得る。静脈内ビヒクルとしては、リンゲルデキストロースに基づいたものなどの、流体および栄養素の補充液ならびに電解質補充液が挙げられる。一部の事例では、組成物の等張性を調節するための薬剤、たとえば、糖、ポリアルコール、たとえばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを、医薬組成物中に含め得る。たとえば、多くの場合、組成物が実質的に等張であることが望ましい。抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスなどの保存料および他の添加剤も存在し得る。正確な配合物は投与経路に依存する。薬学的配合物のための追加の関連する原理、方法、および構成要素は周知である（たとえばＡｌｌｅｎ，Ｌｏｙｄ Ｖ．編、（２０１２） Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２２版を参照）。
【0115】
本開示の医薬組成物は、当技術分野で知られている様々な方法のうちの１つまたは複数を使用して、１つまたは複数の投与経路によって投与することができる。当業者には理解されるように、投与の経路および／または様式は所望の結果に応じて変動する。本開示の医薬組成物の投与経路としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、皮下、脊髄、または他の非経口投与経路、たとえば注射または注入によるものが挙げられる。本明細書中で使用する語句「非経口投与」とは、経腸および局所投与以外の投与様式、通常は注射によるものを意味し、それだけには限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、関節内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内の注射および注入が挙げられる。一実施形態では、医薬組成物は腫瘍内に投与する。非経口投与が企図される場合、医薬組成物は通常、無菌的な、発熱物質を含まない、非経口的に許容される組成物の形態である。非経口注射のための特に適切なビヒクルは、正しく保存された無菌的な等張溶液である。医薬組成物は、凍結乾燥ケークなどの凍結乾燥物の形態であることができる。
【0116】
あるいは、本明細書中に記載の医薬組成物は、局所、表皮、または粘膜の投与経路、たとえば、鼻腔内、経口、経膣、直腸、舌下、または局所などの、非経口でない経路によって投与することができる。
【0117】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は皮下投与のためのものである。ポリペプチド治療剤（たとえば、抗体、融合ポリペプチドなど）の皮下投与のための適切な配合物構成要素および方法は、当技術分野で知られており、たとえば、ＵＳ２０１１／００４４９７７号、ＵＳ８４６５７３９号、およびＵＳ８４７６２３９号を参照されたい。典型的には、皮下投与のための医薬組成物は、適切な安定化剤（たとえば、メチオニンなどのアミノ酸、およびまたはスクロースなどの糖類）、緩衝剤、ならびに等張化剤を含有する。
【0118】
典型的には、細胞治療では、宿主細胞を含む組成物は、静脈内注入によって患者に投与する。
【0119】
本開示の薬学的に有用な組成物の投与は、好ましくは「治療上有効な量」または「予防上有効な量」（場合に応じて、予防は治療とみなすことができるが）のものであり、これは、個体において利益を示すために十分なものである。投与する実際の量、ならびに投与の速度および時間経過は、処置しているタンパク質凝集疾患の性質および重篤度に依存する。処置の処方、たとえば投薬量の決定などは、一般的従事者および他の医師の責任の範囲内にあり、典型的には、処置する障害、個々の患者の状態、送達部位、投与方法、および従事者に知られている他の要因を考慮に入れる。上記言及した技法およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．（編）、１９８０中に見つけることができる。
【0120】
組成物は処置する状態に応じて、単独でまたは他の処置と組み合わせて、同時にまたは順次のどちらかで投与することができる。
【0121】
４．５．処置方法
一部の実施形態では、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、および／または医薬組成物は、疾患もしくは障害の処置、予防、および／または疾患症状の発症の遅延のために使用する。この方法は、治療上有効な量の本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、および／または医薬組成物を投与することを含む。
一部の実施形態では、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、および／または医薬組成物は、疾患もしくは障害の処置、予防、および／または疾患症状の発症の遅延のために使用する。この方法は、治療上有効な量の本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、細胞、および／または医薬組成物を投与することを含む。
【0122】
本開示は、治療においてまたは医薬品として使用するための、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を提供する。本開示は、病理学的障害の処置または予防において使用するための、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物をさらに提供する。本開示は、癌の処置または予防において使用するための、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を提供する。また、癌の処置または予防において使用するための、本開示の免疫応答性細胞も提供される。本開示は、病理学的障害を処置するための医薬品の製造における、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の使用も提供する。また、病理学的障害の処置または予防における、本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物の使用も提供される。本開示は、治療上有効な量の本開示のポリペプチド、核酸、ベクター、宿主細胞、または医薬組成物を患者に投与することを含む、病理学的障害を患っている患者を処置する方法をさらに提供する。
【0123】
本明細書中で使用する用語「疾患」および「病理学的障害」は癌を含み、それだけには限定されないが、固形腫瘍癌、軟組織腫瘍、転移性病変、および血液癌が挙げられる。たとえば、癌は、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、結腸癌、腎臓癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭部もしくは頸部の癌、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、輸卵管癌腫、子宮内膜癌腫、子宮頸部癌腫、膣癌腫、外陰部癌腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道癌、小腸癌、内分泌系癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ球性白血病を含めた慢性もしくは急性白血病、小児期固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱癌、腎臓もしくは輸尿管の癌、腎盂癌腫、中枢神経系（ＣＮＳ）新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮癌、扁平細胞癌、Ｔ細胞リンパ腫、脊髄形成異常症候群（ＭＤＳ）、慢性骨髄性白血病－慢性期（ＣＭＬＣＰ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、末梢性Ｔ細胞リンパ腫（ＰＴＣＬ）、肝細胞癌（ＨＣＣ）、胃腸間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、扁平細胞頭頸部癌（ＳＣＣＨＮ）、アスベストによって誘導されるものを含めた環境誘導癌、および前記癌の組合せであることができる。特に、癌は、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ ｐｏｓ）乳癌および／または転移性形態の乳癌などの乳癌であることができる。
【0124】
一実施形態では、癌は固形腫瘍癌である。一実施形態では、病理学的障害の処置は、腫瘍関連間質細胞などの非腫瘍細胞の標的化を含む。そのような腫瘍関連間質細胞の種類の例としては、膵臓間質細胞が挙げられる。標的化し得る他の種類の非腫瘍細胞としては、マクロファージ、制御性Ｔ細胞、および骨髄由来サプレッサー細胞が挙げられる。
【0125】
一実施形態では、患者は化学療法剤で事前に処置されている。
【0126】
一実施形態では、宿主細胞の患者への投与は、未処置の腫瘍と比較した場合に、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、またはさらには１００％の腫瘍の大きさの減少をもたらす。
【0127】
特許（ｐａｔｅｎｔ）に投与する宿主細胞の量は、投与経路、処置する癌、患者の重量、および／または患者の年齢を考慮に入れるべきである。一般に、約１×１０６～約１×１０１１個の細胞を患者に投与する。一実施形態では、約１×１０７～約１×１０１０個の細胞、または約１×１０８～約１×１０９個の細胞を患者に投与する。
【0128】
４．６．キット
別の態様では、システムのための本明細書中に記載の構成要素または実施形態をキット中で提供する。たとえば、プラスミド、ならびに哺乳動物細胞、関連する緩衝剤、培地、始動剤、または細胞培養およびビリオン生成に関連する他の構成要素のうちの任意のものを、任意選択の構成要素を凍結し、キットとしてパッケージングし、単独でまたは他の薬剤のうちの任意のものの別々の容器、および任意選択の使用説明書と共に、提供することができる。一部の実施形態では、キットは、培養容器、バイアル、チューブなどを含み得る。
別の態様では、システムのための本明細書中に記載の構成要素または実施形態をキット中で提供する。たとえば、プラスミド、ならびに哺乳動物細胞、関連する緩衝剤、培地、始動剤、または細胞培養およびビリオン生成に関連する他の構成要素のうちの任意のものを、任意選択の構成要素を凍結し、キットとしてパッケージングし、単独でまたは他の薬剤のうちの任意のものの別々の容器、および任意選択の使用説明書と共に、提供することができる。一部の実施形態では、キットは、培養容器、バイアル、チューブなどを含み得る。
【0129】
４．７．実施例
以下に本発明を実施するための具体的な実施形態の例を示す。例は例示目的のみで提供し、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。使用した数値（たとえば、量、温度など）に関して正確さを保証する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差がもちろん許容されるべきである。
以下に本発明を実施するための具体的な実施形態の例を示す。例は例示目的のみで提供し、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。使用した数値（たとえば、量、温度など）に関して正確さを保証する努力がなされているが、ある程度の実験誤差および偏差がもちろん許容されるべきである。
【0130】
本発明の実施では、別段に指定しない限りは、当技術分野の技術範囲内にある、タンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技法、および薬理学の慣用方法を用いる。そのような技法は文献中に完全に説明されている。
【0131】
４．７．１．方法
Ｔ細胞単離およびレトロウイルス形質導入
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健康なボランティアからの血液試料から、密度媒介性遠心分離を通じて単離した。Ｔ細胞を、植物性赤血球凝集素を用いて７２時間活性化させ、最後の２４時間の間は１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を加えた。１×１０６個の活性化ＰＢＭＣを、３ｍＬのレトロウイルス上清で事前に処理した、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングしたプレート上に蒔いた。続いて、それぞれのウェルを３ｍＬの新鮮なウイルス上清および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で処理した。レトロウイルス形質導入を、安定テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）偽型２９３ＴＶｅｃ安定パッケージング細胞によって生成させたウイルス粒子を用いて行った。それ以降、Ｔ細胞に、ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％の正常ヒトＡＢ血清中に１００ＩＵ／ｍＬを供給し、新鮮な培地およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を週に３回提供した。
Ｔ細胞単離およびレトロウイルス形質導入
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を、健康なボランティアからの血液試料から、密度媒介性遠心分離を通じて単離した。Ｔ細胞を、植物性赤血球凝集素を用いて７２時間活性化させ、最後の２４時間の間は１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を加えた。１×１０６個の活性化ＰＢＭＣを、３ｍＬのレトロウイルス上清で事前に処理した、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングしたプレート上に蒔いた。続いて、それぞれのウェルを３ｍＬの新鮮なウイルス上清および１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２で処理した。レトロウイルス形質導入を、安定テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）偽型２９３ＴＶｅｃ安定パッケージング細胞によって生成させたウイルス粒子を用いて行った。それ以降、Ｔ細胞に、ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％の正常ヒトＡＢ血清中に１００ＩＵ／ｍＬを供給し、新鮮な培地およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を週に３回提供した。
【0132】
フローサイトメトリー
示した場合は適切なアイソタイプ対照との比較を行って、Ｔ細胞形質導入および２９３Ｔ細胞の形質移入をフローサイトメトリーによって比較した。ＮＫＧ２Ｄに基づく構築体の発現を評価するために、細胞を、マウス抗ヒトＣＤ４－ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ、およびマウス抗ヒトＣＤ８－ＡＰＣを用いて染色し、適切に補正した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞における高いレベルの内在性ＮＫＧ２Ｄ発現が原因で、形質導入効率は、非形質導入ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現に対して比較した。ｐａｎＥｒｂＢに特異的なＴ４およびＴＭＹ ＣＡＲの発現は、ビオチン標識したヤギ抗ヒトＥＧＦ、次いでＰＥとコンジュゲートさせたストレプトアビジンを使用して評価した。形質導入効率は、同じ試薬を使用して染色したＮ１０１２＋ Ｔ細胞との比較によって計算した。使用の前に、非形質導入Ｔ細胞の必須割合をスパイクすることによって、構築体間で形質導入効率を正規化した。これにより、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の合計数および全体的なＴ細胞濃度についてすべての条件が同一であったことが保証された。
示した場合は適切なアイソタイプ対照との比較を行って、Ｔ細胞形質導入および２９３Ｔ細胞の形質移入をフローサイトメトリーによって比較した。ＮＫＧ２Ｄに基づく構築体の発現を評価するために、細胞を、マウス抗ヒトＣＤ４－ＦＩＴＣ、マウス抗ヒトＮＫＧ２Ｄ－ＰＥ、およびマウス抗ヒトＣＤ８－ＡＰＣを用いて染色し、適切に補正した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞における高いレベルの内在性ＮＫＧ２Ｄ発現が原因で、形質導入効率は、非形質導入ＣＤ４＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ発現に対して比較した。ｐａｎＥｒｂＢに特異的なＴ４およびＴＭＹ ＣＡＲの発現は、ビオチン標識したヤギ抗ヒトＥＧＦ、次いでＰＥとコンジュゲートさせたストレプトアビジンを使用して評価した。形質導入効率は、同じ試薬を使用して染色したＮ１０１２＋ Ｔ細胞との比較によって計算した。使用の前に、非形質導入Ｔ細胞の必須割合をスパイクすることによって、構築体間で形質導入効率を正規化した。これにより、ＣＡＲ＋ Ｔ細胞の合計数および全体的なＴ細胞濃度についてすべての条件が同一であったことが保証された。
【0133】
細胞内染色を行うために、形質移入した２９３Ｔ細胞を４％のホルムアルデヒド中に１０分間、室温で固定した後、透過処理溶液（ＰＢＳ＋０．５％のＢＳＡ＋０．１％のサポニン）で２回洗浄した。続いて、細胞を、５００ｎｇのＰＥとコンジュゲートさせた抗ヒトＮＫＧ２Ｄ、または適切なアイソタイプ対照を用いて、１００ｕＬの透過処理溶液の存在下で染色した。フローサイトメトリーによる分析の前に、細胞を透過処理溶液で２回、さらに洗浄した。
【0134】
複数ラウンドの刺激の後のＴ細胞分化を評価するために、Ｔ細胞を腫瘍細胞同時培養から取り出し、ＦＩＴＣとコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ４５ＲＯ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）とコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ６２Ｌ、ＰＥとコンジュゲートさせた抗ヒトＣＣＲ７、ＦＩＴＣとコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ４、ＡＰＣＣｙ７とコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ８α、およびフィコエリスリンシアニン７（ＰＥＣｙ７）とコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ２７抗体を用いて染色した。２ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーによって評価した。染色効率は、適切なアイソタイプおよび蛍光マイナス１（ＦＭＯ）対照を用いて染色したＴ細胞を使用して評価した。
【0135】
用量応答アッセイ
１×１０４個の腫瘍細胞を９６ウェルプレートの１ウェル（１００μＬ）あたり蒔き、３７℃および５％のＣＯ２で終夜インキュベートした。２４時間後、Ｔ細胞を、１：１～１：６４の範囲のｌｏｇ２ ＣＡＲ Ｔ細胞：腫瘍細胞の比で加えた。７２時間後、Ｔ細胞を取り出し、１００μＬのＭＴＴ溶液（５００μｇ／ｍＬ）を加えた後、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、生じたホルマザン結晶をＤＭＳＯ（１００μＬ／ウェル）中に溶かし、吸光度を５６０ｎｍで測定した。腫瘍細胞生存度は以下のように計算した：（Ｔ細胞を用いた単層の吸光度／Ｔ細胞を用いない単層の吸光度）＊１００。
１×１０４個の腫瘍細胞を９６ウェルプレートの１ウェル（１００μＬ）あたり蒔き、３７℃および５％のＣＯ２で終夜インキュベートした。２４時間後、Ｔ細胞を、１：１～１：６４の範囲のｌｏｇ２ ＣＡＲ Ｔ細胞：腫瘍細胞の比で加えた。７２時間後、Ｔ細胞を取り出し、１００μＬのＭＴＴ溶液（５００μｇ／ｍＬ）を加えた後、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、生じたホルマザン結晶をＤＭＳＯ（１００μＬ／ウェル）中に溶かし、吸光度を５６０ｎｍで測定した。腫瘍細胞生存度は以下のように計算した：（Ｔ細胞を用いた単層の吸光度／Ｔ細胞を用いない単層の吸光度）＊１００。
【0136】
再刺激アッセイ
１×１０５個の腫瘍細胞を２４ウェルプレートの３つ組ウェル中に蒔き、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、１×１０５個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞を含有する１ｍＬを１ウェルあたりに加えた。７２時間後、Ｔ細胞を穏やかに取り出し、ウェルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去した後、１ｍＬのＭＴＴ（５００μｇ／ｍＬの最終濃度）をそれぞれのウェルに加え、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。吸光度を適切なウェル中、５６０ｎｍで測定し、「用量応答」セクションに詳述したように腫瘍細胞生存度を計算した。腫瘍細胞生存度が５０％未満として測定された場合に、再刺激は成功したとみなされた。
１×１０５個の腫瘍細胞を２４ウェルプレートの３つ組ウェル中に蒔き、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、１×１０５個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞を含有する１ｍＬを１ウェルあたりに加えた。７２時間後、Ｔ細胞を穏やかに取り出し、ウェルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去した後、１ｍＬのＭＴＴ（５００μｇ／ｍＬの最終濃度）をそれぞれのウェルに加え、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。吸光度を適切なウェル中、５６０ｎｍで測定し、「用量応答」セクションに詳述したように腫瘍細胞生存度を計算した。腫瘍細胞生存度が５０％未満として測定された場合に、再刺激は成功したとみなされた。
【0137】
プレートから取り出したＴ細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを３．２ｍＬのＲ５培地に再懸濁させ、１ｍＬを新鮮な腫瘍単層（２４ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０５個の腫瘍細胞）のそれぞれのウェルに３つ組で加えた。総Ｔ細胞数は、残った２００μＬの小アリコートのトリパンブルー排除によって評価した。
【0138】
結合力
標的細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の結合力は、漸増するレベルの音響力で標的細胞と結合したＴ細胞の百分率を測定することによって評価した。ＣＤ１９で操作したＬＯ６８またはＳＫＯＶ－３腫瘍細胞を、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングしたｚ－Ｍｏｖｉマイクロ流体チップ（Ｌｕｍｉｃｋｓ、オランダＡｍｓｔｅｒｄａｍ）中に播種し、１６時間培養した。翌日、流動選別したＣＡＲ－Ｔ細胞をチップに連続的に流し、標的細胞と共に５分間インキュベートした後、３分間の直線力勾配を開始した。力勾配中、ｚ－Ｍｏｖｉ装置（Ｌｕｍｉｃｋｓ）により、プラットフォーム内に組み込んだ明視野顕微鏡を使用してイメージの時系列を捕らえた。剥離した細胞を音響節（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｏｄｅ）に向かって浮揚させ、これにより、そのＸＹ位置に基づいた細胞の追跡が可能となる。Ｚ位置の変化は回折パターンの変化をもたらし、これが、基質に接着した細胞と音響節中に浮遊する細胞との区別を可能にした。この情報を使用して、細胞剥離事象を特定の破裂力と相関させた。細胞剥離は（ｚ－Ｍｏｖｉ Ｔｒａｃｋｉｎｇ＿ｖ１．６．０）を使用して獲得し、実験後の画像解析は細胞追跡（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇ）オフライン分析＿ｖ２．１を使用して行った。
標的細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞の結合力は、漸増するレベルの音響力で標的細胞と結合したＴ細胞の百分率を測定することによって評価した。ＣＤ１９で操作したＬＯ６８またはＳＫＯＶ－３腫瘍細胞を、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングしたｚ－Ｍｏｖｉマイクロ流体チップ（Ｌｕｍｉｃｋｓ、オランダＡｍｓｔｅｒｄａｍ）中に播種し、１６時間培養した。翌日、流動選別したＣＡＲ－Ｔ細胞をチップに連続的に流し、標的細胞と共に５分間インキュベートした後、３分間の直線力勾配を開始した。力勾配中、ｚ－Ｍｏｖｉ装置（Ｌｕｍｉｃｋｓ）により、プラットフォーム内に組み込んだ明視野顕微鏡を使用してイメージの時系列を捕らえた。剥離した細胞を音響節（ａｃｏｕｓｔｉｃ ｎｏｄｅ）に向かって浮揚させ、これにより、そのＸＹ位置に基づいた細胞の追跡が可能となる。Ｚ位置の変化は回折パターンの変化をもたらし、これが、基質に接着した細胞と音響節中に浮遊する細胞との区別を可能にした。この情報を使用して、細胞剥離事象を特定の破裂力と相関させた。細胞剥離は（ｚ－Ｍｏｖｉ Ｔｒａｃｋｉｎｇ＿ｖ１．６．０）を使用して獲得し、実験後の画像解析は細胞追跡（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇ）オフライン分析＿ｖ２．１を使用して行った。
【0139】
ＥＬＩＳＡ
Ｔ細胞によるＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の分泌は、同時培養の開始の２４時後に取り出した上清アリコートにおいて、それぞれＤｕｏ－ｓｅｔおよびＲｅａｄｙ－Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｏ ＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。
Ｔ細胞によるＩＦＮ－γおよびＩＬ－２の分泌は、同時培養の開始の２４時後に取り出した上清アリコートにおいて、それぞれＤｕｏ－ｓｅｔおよびＲｅａｄｙ－Ｓｔｅａｄｙ－Ｇｏ ＥＬＩＳＡキットを使用して評価した。
【0140】
腫瘍球状体の作製
腫瘍球状体を作製するために、超低親和性９６ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０３個の腫瘍細胞および１×１０３個のＰＳ１星細胞を加え、７２時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。球状体の作製は、標準の光学顕微鏡の可視化によって確認した。
腫瘍球状体を作製するために、超低親和性９６ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０３個の腫瘍細胞および１×１０３個のＰＳ１星細胞を加え、７２時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。球状体の作製は、標準の光学顕微鏡の可視化によって確認した。
【0141】
Ｉｎ ｖｉｖｏ研究
生物発光イメージング
１×１０５個のホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬＵＣ）でタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞を、ＮＳＧマウスの腹腔内腔内に注射した。腫瘍接種の１２日後、マウス（ｎ＝５匹／群）を、腹腔内で、ＰＢＳ、４×１０６個の（Ｎ１０１２＋（Ｎ１０１２（低））、Ｔ４＋、もしくはＴＭＹ＋ＣＡＲ Ｔ細胞）、または１×１０７個の（Ｎ１０１２（高）もしくはＮＫＧ２Ｄ）ＣＡＲ＋ Ｔ細胞のいずれかを用いて処置した。あるいは、ＮＳＧマウスに、１×１０６個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６悪性中皮腫細胞を腹腔内で接種した。腫瘍接種の８日後、マウスをＰＢＳまたは４×１０６個のＮ１０１２＋ Ｔ細胞のどちらかで処置した。対照として、１つのマウス群を、４×１０６個の、ＮＫＧ２Ｄを単独で発現するＴ細胞で処置した。
生物発光イメージング
１×１０５個のホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬＵＣ）でタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞を、ＮＳＧマウスの腹腔内腔内に注射した。腫瘍接種の１２日後、マウス（ｎ＝５匹／群）を、腹腔内で、ＰＢＳ、４×１０６個の（Ｎ１０１２＋（Ｎ１０１２（低））、Ｔ４＋、もしくはＴＭＹ＋ＣＡＲ Ｔ細胞）、または１×１０７個の（Ｎ１０１２（高）もしくはＮＫＧ２Ｄ）ＣＡＲ＋ Ｔ細胞のいずれかを用いて処置した。あるいは、ＮＳＧマウスに、１×１０６個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６悪性中皮腫細胞を腹腔内で接種した。腫瘍接種の８日後、マウスをＰＢＳまたは４×１０６個のＮ１０１２＋ Ｔ細胞のどちらかで処置した。対照として、１つのマウス群を、４×１０６個の、ＮＫＧ２Ｄを単独で発現するＴ細胞で処置した。
【0142】
他の研究では、ＮＳＧマウスに、１×１０５個のｆｆＬｕｃ発現Ｏｖｓａｈｏまたは５×１０５個のｆｆＬｕｃ発現ＳＫＯＶ－３細胞を腹腔内で接種した。Ｏｖａｓｈｏ細胞を接種したマウスを、ＰＢＳまたは５×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入）のいずれかを用いて、腹腔内注射（腫瘍接種の６日後）または静脈内注射（接種の７日後）を介して処置した。ＳＫＯＶ－３細胞を接種したマウスを、静脈内で、ＰＢＳまたは１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、もしくはＣＹＡＤ－０１＿１０）のいずれかを用いて、腫瘍接種の１４日後に処置した。
【0143】
Ｔ細胞輸送を評価するために、Ｔ細胞を、ＣＡＲ構築体（Ｎ１０１２またはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２）と、レポーター構築体、すなわち、ウミシイタケルシフェラーゼ（ｒＬｕｃ）単独、またはｒＬｕｃおよびＧＦＰをどちらもコードしている二重レポーターのどちらかとを発現するように二重形質導入した。Ｏｖａｓｈｏ細胞を接種したマウスを、５×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ウミシイタケルシフェラーゼまたはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ウミシイタケルシフェラーゼ）を用いて、腫瘍接種の７日後に静脈内注射によって処置した。ＳＫＯＶ－３細胞を接種したマウスを、１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃまたはＮ１０１２＿ｒＬｕｃ）を用いて、腫瘍接種の１４日後に静脈内注射によって処置した。倉持細胞を接種したマウスを、２×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃまたはＮ１０１２＿ｒＬｕｃ）を用いて、腫瘍接種の１８日後に静脈内注射によって処置した。Ｔ細胞追跡をモニタリングするために、ウミシイタケルシフェラーゼの基質であるセレンテラジンをマウスに静脈内投与した。
【0144】
腫瘍成長をＢＬＩによってモニタリングし、すべてのデータを処置あたりの全光束（光子数／秒）または平均全光束（光子数／秒）として提示する。不健康の徴候についてマウスをしっかりとモニタリングし、週に３回秤量した。
【0145】
腫瘍体積
１×１０５個のＣＦＰａｃ－１またはＢｘＰＣ３細胞を５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１のＰＢＳ）中でＮＳＧマウスの左脇腹内に皮下注射した。ＣＦＰａｃ－１細胞を用いた接種の２９日後またはＢｘＰＣ３細胞を用いた接種の１４日後、マウスを、ＰＢＳまたは１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、非形質導入（ＵＴ））のいずれかを用いて静脈内で処置した。
１×１０５個のＣＦＰａｃ－１またはＢｘＰＣ３細胞を５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１のＰＢＳ）中でＮＳＧマウスの左脇腹内に皮下注射した。ＣＦＰａｃ－１細胞を用いた接種の２９日後またはＢｘＰＣ３細胞を用いた接種の１４日後、マウスを、ＰＢＳまたは１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、非形質導入（ＵＴ））のいずれかを用いて静脈内で処置した。
【0146】
腫瘍成長をカリパス測定によって毎週測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）として表した。
【0147】
免疫組織化学
１×１０５個のＣＦＰａｃ－１細胞を５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１のＰＢＳ）中でＮＳＧマウスの左脇腹内に皮下注射した。接種の２９日後、マウスを、ＰＢＳまたは１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞）のいずれかを用いて静脈内で処置した。Ｔ細胞注射の３日後、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、およびＮＫＧ２Ｄ Ｔ細胞処置群のそれぞれからの３匹のマウスを屠殺し、腫瘍を免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために収集した。手短に述べると、組織をホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、切片化し、スライド上に載せ、標準方法を使用して抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。
１×１０５個のＣＦＰａｃ－１細胞を５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１のＰＢＳ）中でＮＳＧマウスの左脇腹内に皮下注射した。接種の２９日後、マウスを、ＰＢＳまたは１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞）のいずれかを用いて静脈内で処置した。Ｔ細胞注射の３日後、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、およびＮＫＧ２Ｄ Ｔ細胞処置群のそれぞれからの３匹のマウスを屠殺し、腫瘍を免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために収集した。手短に述べると、組織をホルマリン中に固定し、パラフィン中に包埋し、切片化し、スライド上に載せ、標準方法を使用して抗ヒトＣＤ３抗体（Ａｂｃａｍ）で染色した。
【0148】
４．７．２．実施例１：２９３Ｔ細胞におけるＮＫＧ２ＤおよびＤＡＰ１０／１２融合タンパク質の発現
２９３Ｔ細胞を、ＤＡＰ１０／１２融合タンパク質Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄ発現カセットのどちらかを含有するＳＦＧレトロウイルスプラスミド主鎖を用いて形質移入した。Ｎ１０１２（配列番号６４）は、外因性ヒトＮＫＧ２Ｄタンパク質と本発明による融合外因性ＤＡＰ１０／１２ホモ二量体とを含む複合体を含む。Ｎ１０１２プラスミドは、配列番号６４をコードしている配列番号７４を含む。ＮＫＧ２Ｄの表面発現は、７２時間後にフローサイトメトリーによって評価した。ＮＫＧ２Ｄ発現は、Ｎ１０１２プラスミドを用いて形質移入した２９３Ｔ細胞の表面で容易に検出された一方で、対照ＮＫＧ２Ｄをコードしているプラスミドを用いて形質移入したものの表面では、ＮＫＧ２Ｄ発現は検出されなかった（図２、上パネル）。ＮＫＧ２Ｄ表面発現がＤＡＰ１０の発現に依存することを考慮すると、ＮＫＧ２Ｄ表面発現の欠如は、ＮＫＧ２Ｄプラスミド内でのＤＡＰ１０の同時発現の非存在によって説明される可能性がある。ＮＫＧ２Ｄを形質移入した２９３Ｔ細胞中における表面ＮＫＧ２Ｄ発現の欠如が、形質移入不良が原因でないことを確認するために、ＮＫＧ２Ｄの存在についての細胞内染色を行った。決定的に、ＮＫＧ２Ｄの細胞内発現が、Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄプラスミドのどちらかを用いて形質移入した２９３Ｔ細胞中で観察された（図２、下パネル）。このことは、両方の構築体からのＮＫＧ２Ｄの発現の成功を実証し、また、ＮＫＧ２Ｄの表面発現を達成するためにはＤＡＰ１０の同時発現が必要であることも裏付けている。
２９３Ｔ細胞を、ＤＡＰ１０／１２融合タンパク質Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄ発現カセットのどちらかを含有するＳＦＧレトロウイルスプラスミド主鎖を用いて形質移入した。Ｎ１０１２（配列番号６４）は、外因性ヒトＮＫＧ２Ｄタンパク質と本発明による融合外因性ＤＡＰ１０／１２ホモ二量体とを含む複合体を含む。Ｎ１０１２プラスミドは、配列番号６４をコードしている配列番号７４を含む。ＮＫＧ２Ｄの表面発現は、７２時間後にフローサイトメトリーによって評価した。ＮＫＧ２Ｄ発現は、Ｎ１０１２プラスミドを用いて形質移入した２９３Ｔ細胞の表面で容易に検出された一方で、対照ＮＫＧ２Ｄをコードしているプラスミドを用いて形質移入したものの表面では、ＮＫＧ２Ｄ発現は検出されなかった（図２、上パネル）。ＮＫＧ２Ｄ表面発現がＤＡＰ１０の発現に依存することを考慮すると、ＮＫＧ２Ｄ表面発現の欠如は、ＮＫＧ２Ｄプラスミド内でのＤＡＰ１０の同時発現の非存在によって説明される可能性がある。ＮＫＧ２Ｄを形質移入した２９３Ｔ細胞中における表面ＮＫＧ２Ｄ発現の欠如が、形質移入不良が原因でないことを確認するために、ＮＫＧ２Ｄの存在についての細胞内染色を行った。決定的に、ＮＫＧ２Ｄの細胞内発現が、Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄプラスミドのどちらかを用いて形質移入した２９３Ｔ細胞中で観察された（図２、下パネル）。このことは、両方の構築体からのＮＫＧ２Ｄの発現の成功を実証し、また、ＮＫＧ２Ｄの表面発現を達成するためにはＤＡＰ１０の同時発現が必要であることも裏付けている。
【0149】
４．７．３．実施例２：初代ヒトＴ細胞におけるＮ１０１２およびＮＫＧ２Ｄの発現
初代ヒトＴ細胞を、抗ヒトＣＤ３および抗ヒトＣＤ２８抗体でコーティングした常磁性ビーズを用いて活性化した。活性化の４８時間後、Ｔ細胞を、Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄを発現するようにレトロウイルス形質導入によって操作した。ＮＫＧ２Ｄの表面発現をフローサイトメトリーによって評価し、ＣＤ４およびＣＤ８発現について同時染色した。ＮＫＧ２Ｄの発現の百分率（図３Ａ）および蛍光強度の中央値（ＭＦＩ、図３Ｂ）を非形質導入Ｔ細胞に対して比較した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの内在性発現が原因で、データはＣＤ４＋ Ｔ細胞に対してゲーティングされている。示したように、ＵＴ Ｔ細胞、または対照ＣＡＲを発現するＴ細胞のどちらとも対照的に、ＮＫＧ２ＤおよびＮ１０１２構築体はどちらも、初代ヒトＴ細胞の表面において高レベルで再現可能に発現されている（図４）。
初代ヒトＴ細胞を、抗ヒトＣＤ３および抗ヒトＣＤ２８抗体でコーティングした常磁性ビーズを用いて活性化した。活性化の４８時間後、Ｔ細胞を、Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄを発現するようにレトロウイルス形質導入によって操作した。ＮＫＧ２Ｄの表面発現をフローサイトメトリーによって評価し、ＣＤ４およびＣＤ８発現について同時染色した。ＮＫＧ２Ｄの発現の百分率（図３Ａ）および蛍光強度の中央値（ＭＦＩ、図３Ｂ）を非形質導入Ｔ細胞に対して比較した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞におけるＮＫＧ２Ｄの内在性発現が原因で、データはＣＤ４＋ Ｔ細胞に対してゲーティングされている。示したように、ＵＴ Ｔ細胞、または対照ＣＡＲを発現するＴ細胞のどちらとも対照的に、ＮＫＧ２ＤおよびＮ１０１２構築体はどちらも、初代ヒトＴ細胞の表面において高レベルで再現可能に発現されている（図４）。
【0150】
４．７．４．実施例３：Ｎ１０１２ Ｔ細胞による標的細胞の破壊および認識の評価
細胞溶解能力を評価するために、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞を、５個の異なる腫瘍種（中皮腫、卵巣癌、頭頸部扁平細胞癌、膵癌、および乳癌）を表す１１個の異なるヒト腫瘍細胞系と共に、または腫瘍関連間質細胞（ＰＳ１）と共に、様々なＥ：Ｔ比で同時培養した。７２時間後、Ｔ細胞を取り出し、ＭＴＴアッセイを行って、腫瘍細胞生存度を評価した。標的細胞をＵＴ Ｔ細胞またはＮＫＧ２Ｄを発現するもののどちらかと同時培養した場合は、腫瘍生存度の最小限の低下が観察された一方で、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、低いＥ：Ｔ比においてさえも、すべての標的細胞系の強力な溶解を実証した（図５ならびに７Ａおよび７Ｂ）。ＥＬＩＳＡによる同時培養上清の分析により、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞によるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の両方の実質的な分泌が実証されたが、ＵＴ Ｔ細胞または対照ＮＫＧ２Ｄ構築体を発現するもののどちらによる分泌も実証されなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。これらのデータは、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、腫瘍関連間質細胞を含めた幅広い種類の腫瘍種を認識および溶解する能力を実証している。
細胞溶解能力を評価するために、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞を、５個の異なる腫瘍種（中皮腫、卵巣癌、頭頸部扁平細胞癌、膵癌、および乳癌）を表す１１個の異なるヒト腫瘍細胞系と共に、または腫瘍関連間質細胞（ＰＳ１）と共に、様々なＥ：Ｔ比で同時培養した。７２時間後、Ｔ細胞を取り出し、ＭＴＴアッセイを行って、腫瘍細胞生存度を評価した。標的細胞をＵＴ Ｔ細胞またはＮＫＧ２Ｄを発現するもののどちらかと同時培養した場合は、腫瘍生存度の最小限の低下が観察された一方で、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、低いＥ：Ｔ比においてさえも、すべての標的細胞系の強力な溶解を実証した（図５ならびに７Ａおよび７Ｂ）。ＥＬＩＳＡによる同時培養上清の分析により、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞によるインターフェロン－γ（ＩＦＮ－γ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の両方の実質的な分泌が実証されたが、ＵＴ Ｔ細胞または対照ＮＫＧ２Ｄ構築体を発現するもののどちらによる分泌も実証されなかった（図６Ａおよび６Ｂ）。これらのデータは、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、腫瘍関連間質細胞を含めた幅広い種類の腫瘍種を認識および溶解する能力を実証している。
【0151】
４．７．５．実施例５：Ｎ１０１２ Ｔ細胞による腫瘍球状体破壊の例示
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、３Ｄ系内における標的細胞溶解を媒介する能力を評価するために、これらを腫瘍球状体と共に同時培養した。球状体の作製の後、１ウェルあたり６×１０３個のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｖｉｏｌｅｔで標識したＴ細胞を加えた。腫瘍細胞および星状細胞の生存度を、３および８日後に、蛍光顕微鏡観察を使用して、それぞれＧＦＰおよびＲＦＰを測定することによって評価した。ＧＦＰおよびＲＦＰシグナルの定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して行い、Ｔ細胞の非存在下で成長させた球状体からの蛍光の読取りの百分率として表した。Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞では球状体の強力な溶解が観察されたが、これは、ＮＫＧ２ＤまたはＵＴ Ｔ細胞のどちらでも観察されなかった（図７Ｉ～７Ｊ）。さらに、Ｎ１０１２＋Ｔ細胞のみがＩＦＮ－γの分泌を実証した（図７Ｋ）。
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、３Ｄ系内における標的細胞溶解を媒介する能力を評価するために、これらを腫瘍球状体と共に同時培養した。球状体の作製の後、１ウェルあたり６×１０３個のＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｖｉｏｌｅｔで標識したＴ細胞を加えた。腫瘍細胞および星状細胞の生存度を、３および８日後に、蛍光顕微鏡観察を使用して、それぞれＧＦＰおよびＲＦＰを測定することによって評価した。ＧＦＰおよびＲＦＰシグナルの定量は、Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して行い、Ｔ細胞の非存在下で成長させた球状体からの蛍光の読取りの百分率として表した。Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞では球状体の強力な溶解が観察されたが、これは、ＮＫＧ２ＤまたはＵＴ Ｔ細胞のどちらでも観察されなかった（図７Ｉ～７Ｊ）。さらに、Ｎ１０１２＋Ｔ細胞のみがＩＦＮ－γの分泌を実証した（図７Ｋ）。
【0152】
球状体の生存度およびＴ細胞の増殖を、フローサイトメトリーを使用して代替評価した。これを達成するために、Ｔ細胞添加の３または８日後のどちらかに球状体をプレートから取り出し、フローサイトメトリーチューブ内に入れ、同じＣＡＲ Ｔ細胞で処理した５個までの球状体を同じチューブに加えた。球状体の脱凝集は、Ａｃｃｕｔａｓｅ溶液およびピペットチップを介した激しい再懸濁液を使用して達成した。生じた単個細胞懸濁液をＲＰＭＩ１６４０培地＋５％の正常ヒトＡＢ血清で洗浄し、続いて計数用ビーズを含有するＰＢＳ中に再懸濁させた。チューブ１本あたり等数の計数用ビーズが得られ、生じた腫瘍細胞の数（ＧＦＰおよびＲＦＰ蛍光によって評価）ならびにＴ細胞の数（ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ Ｖｉｏｌｅｔ蛍光によって評価）を決定した。データは、Ｔ細胞の非存在下で成長させた球状体中に存在するＧＦＰおよびＲＦＰ細胞の合計の百分率として示す（図１５）。
【0153】
４．７．６．実施例６：Ｎ１０１２ Ｔ細胞による連続的な標的認識の例示
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、標的細胞の連続的な溶解（「再刺激」）を行う能力を評価するために、これらを新鮮な単層と共に、週に２回、単層破壊が観察されなくなるまで同時培養した。ＵＴまたはＮＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞は最小限の標的細胞破壊を媒介し、増殖の証拠を示さなかった一方で、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、複数ラウンドの再刺激を通じて強力な溶解を媒介した（図８Ａ～８Ｂ）。また、標的細胞破壊は、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の実質的な増殖および最大の拡大の倍数とも関連していた（図８Ｃ～８Ｄ）。
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、標的細胞の連続的な溶解（「再刺激」）を行う能力を評価するために、これらを新鮮な単層と共に、週に２回、単層破壊が観察されなくなるまで同時培養した。ＵＴまたはＮＫＧ２Ｄ＋ Ｔ細胞は最小限の標的細胞破壊を媒介し、増殖の証拠を示さなかった一方で、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、複数ラウンドの再刺激を通じて強力な溶解を媒介した（図８Ａ～８Ｂ）。また、標的細胞破壊は、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の実質的な増殖および最大の拡大の倍数とも関連していた（図８Ｃ～８Ｄ）。
【0154】
ＣＹＡＤ－０１レプリカＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲおよび対照Ｔ細胞と比較した場合、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、ＢｘＰＣ３＿ＬＴ細胞に対する有意により多くのラウンドの再刺激を受けた（図１４Ａ）。さらに、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、ＣＹＡＤ－０１ Ｔ細胞または対照よりも実質的に高い増殖も実証した（図１４Ｂ）。
【0155】
４．７．７．実施例７：膵癌のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＮ１０１２ Ｔ細胞の有効性
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を標的とする能力を決定するために、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、またはパン－ＥｒｂＢ標的化ＣＡＲの２つの異なる反復（Ｔ４およびＴＭＹ）を発現するＴ細胞を作製した。初代ヒトＴ細胞内における様々な構築体の発現（図９Ａ）およびＴ細胞細胞の有効性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、３つの腫瘍細胞系に対して、７２時間の１：１の比での同時培養の後に実証した（図９Ｂ）。ｉｎ ｖｉｖｏでの機能を評価するために、腹腔内のホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬＵＣ）でタグ付けしたＢｘＰＣ３腫瘍異種移植片を、１２日間、ＮＳＧマウスにおいて確立させた。腫瘍保有マウスを、腹腔内で、ＰＢＳ、４×１０６個の（Ｎ１０１２（低）、Ｔ４、もしくはＴＭＹ）Ｔ細胞、または１×１０７個の（Ｎ１０１２（高）またはＮＫＧ２Ｄ）形質導入したＴ細胞のいずれかを用いて処置した。腫瘍成長を毎週、生物発光イメージングによって測定し、マウスを週に３回秤量した。データは、処置群あたりの平均全光束（光子数／秒）（図１０Ａ）、または個々のマウスあたりの全光束（光子数／秒）（図１０Ｂ）の両方として表す。ＮＫＧ２Ｄ＋、Ｔ４＋、またはＴＭＹ＋ Ｔ細胞を受けたマウスにおける腫瘍量は、ＰＢＳを受けたものと同一であり、有効性の欠如を示唆している。対照的に、腫瘍は、Ｎ１０１２（低）またはＮ１０１２（高）のいずれかで処置したそれぞれ２匹／５匹のマウスおよび４匹／５匹のマウスで完全に根絶されていた。これらのマウスは、Ｔ細胞投与の７６日後に無腫瘍のままであった。体重変化の百分率の測定によって評価した場合に、毒性の証拠は観察されなかった（図１０Ｃ）。
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍細胞を標的とする能力を決定するために、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、またはパン－ＥｒｂＢ標的化ＣＡＲの２つの異なる反復（Ｔ４およびＴＭＹ）を発現するＴ細胞を作製した。初代ヒトＴ細胞内における様々な構築体の発現（図９Ａ）およびＴ細胞細胞の有効性を、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、３つの腫瘍細胞系に対して、７２時間の１：１の比での同時培養の後に実証した（図９Ｂ）。ｉｎ ｖｉｖｏでの機能を評価するために、腹腔内のホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬＵＣ）でタグ付けしたＢｘＰＣ３腫瘍異種移植片を、１２日間、ＮＳＧマウスにおいて確立させた。腫瘍保有マウスを、腹腔内で、ＰＢＳ、４×１０６個の（Ｎ１０１２（低）、Ｔ４、もしくはＴＭＹ）Ｔ細胞、または１×１０７個の（Ｎ１０１２（高）またはＮＫＧ２Ｄ）形質導入したＴ細胞のいずれかを用いて処置した。腫瘍成長を毎週、生物発光イメージングによって測定し、マウスを週に３回秤量した。データは、処置群あたりの平均全光束（光子数／秒）（図１０Ａ）、または個々のマウスあたりの全光束（光子数／秒）（図１０Ｂ）の両方として表す。ＮＫＧ２Ｄ＋、Ｔ４＋、またはＴＭＹ＋ Ｔ細胞を受けたマウスにおける腫瘍量は、ＰＢＳを受けたものと同一であり、有効性の欠如を示唆している。対照的に、腫瘍は、Ｎ１０１２（低）またはＮ１０１２（高）のいずれかで処置したそれぞれ２匹／５匹のマウスおよび４匹／５匹のマウスで完全に根絶されていた。これらのマウスは、Ｔ細胞投与の７６日後に無腫瘍のままであった。体重変化の百分率の測定によって評価した場合に、毒性の証拠は観察されなかった（図１０Ｃ）。
【0156】
Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞がＮＳＧマウス内に移植されて免疫記憶を提供することができるかどうかを決定するために、腫瘍を完全に拒絶したマウスに、腹膜腔内で、初回腫瘍接種の８８日後（Ｔ細胞注入の７６日後）に、１×１０５個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞の第２の接種を与えた。ＢＬＩによって腫瘍再負荷の２４時間後にルミネセンスの増加が観察された一方で、続いて４匹／５匹のマウスが腫瘍の大きさの実質的な低下を示し、したがってＮ１０１２＋ Ｔ細胞の再活性化を示した（図１０Ｄ）。実験は１４５日間の後に終了し、生存曲線を作成し、これはＮ１０１２ Ｔ細胞の強力な抗腫瘍有効性を実証していた（図１０Ｅ）。
【0157】
ｉｎ ｖｉｖｏの膵癌モデルに対するＮ１０１２＋ Ｔ細胞の有効性をさらに確認するために、繰り返し実験を行った。１×１０７個のＣＡＲ＋または対照非形質導入Ｔ細胞を、ＮＳＧマウス内に、１×１０５個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞を用いた接種の１２日後に腹腔内注射した。腫瘍成長を毎週、生物発光イメージングによってモニタリングし、データを処置群あたりの平均全光束（光子数／秒）（図１１Ａ）および個々のマウスあたりの全光束（光子数／秒）（図１１Ｂ）の両方として表す。有意かつ持続的な腫瘍回帰が、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて再度観察された。実際、腫瘍は、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞で処置した５匹／６匹のマウスにおいて完全に根絶されていた。対照的に、ＵＴ Ｔ細胞で処置したマウスにおける腫瘍成長の動力学は、ＰＢＳを受けているものと同一であった。これらのデータは、腫瘍の根絶がＮ１０１２＋に特異的であったことを裏付けている。
【0158】
記憶Ｔ細胞の潜在的な形成を調査するために、４１日目（Ｔ細胞注入の２９日後）に無腫瘍であったマウスを、１×１０５個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＢｘＰＣ３細胞の新鮮なボーラスを用いて腹腔内で再負荷した。マウスを４２日目にイメージングして腫瘍の獲得を確認した。続くイメージングにより、５匹／５匹の再負荷したマウスで腫瘍量が検出未満まで低下されることが実証され、３匹／５匹のマウスは長期的腫瘍制御を実証した（図１１Ｂ）。これらのデータは、Ｎ１０１２ ＣＡＲ Ｔ細胞が、標的の再出現に応答して再活性化することができる、記憶集団を形成することができることを示唆している。
【0159】
４．７．８．実施例８：悪性中皮腫のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＮ１０１２ Ｔ細胞の有効性
別のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＮ１０１２の有効性を確認するために、ＮＳＧマウスに、腹腔内注射を介して、１×１０６個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６悪性中皮腫細胞を接種した。腫瘍細胞接種の８日後、マウスをＰＢＳまたは４×１０６個のＮ１０１２＋ Ｔ細胞のいずれかで処置した。対照として、１つのマウス群を、４×１０６個の、ＮＫＧ２Ｄを単独で発現するＴ細胞で処置した。腫瘍成長を毎週、生物発光イメージングによってモニタリングし、データを処置あたりの平均全光束（光子数／秒）（図１２Ａ）および個々のマウスあたりの全光束（光子数／秒）（図１２Ｂ）として表す。ＰＢＳを受けたマウスでは一貫した腫瘍成長が観察された一方で、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞を受けたマウスでは１００％の腫瘍の根絶が観察された。
別のｉｎ ｖｉｖｏモデルにおけるＮ１０１２の有効性を確認するために、ＮＳＧマウスに、腹腔内注射を介して、１×１０６個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６悪性中皮腫細胞を接種した。腫瘍細胞接種の８日後、マウスをＰＢＳまたは４×１０６個のＮ１０１２＋ Ｔ細胞のいずれかで処置した。対照として、１つのマウス群を、４×１０６個の、ＮＫＧ２Ｄを単独で発現するＴ細胞で処置した。腫瘍成長を毎週、生物発光イメージングによってモニタリングし、データを処置あたりの平均全光束（光子数／秒）（図１２Ａ）および個々のマウスあたりの全光束（光子数／秒）（図１２Ｂ）として表す。ＰＢＳを受けたマウスでは一貫した腫瘍成長が観察された一方で、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞を受けたマウスでは１００％の腫瘍の根絶が観察された。
【0160】
Ｔ細胞の持続および機能の維持を確認するために、すべての無腫瘍マウスに、追加の１×１０６個のｆｆＬＵＣでタグ付けしたＨ２２６細胞を、初回腫瘍接種の９１日後に、腹腔内で接種した。腫瘍の獲得がすべてのマウスにおいて２４時間に生物発光イメージングによって確認された。すべての再負荷したマウスが腫瘍を拒絶し、これは、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞の持続の継続およびこれらのＴ細胞の長期的腫瘍制御を媒介する能力を裏付けている。
【0161】
４．７．９．実施例９：Ｎ１０１２ Ｔ細胞とＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞との比較
Ｎ１０１２ Ｔ細胞の再刺激および増殖の潜在性をＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞と比較した。以前に記述したように、ＣＹＡＤ－０１ＣＡＲはＮＫＧ２ＤとＣＤ３ζとの融合からなり、最初にＳｅｎｔｍａｎらによって記載されたマウスＣＡＲのヒトバージョンを表す（Ｚｈａｎｇら、２００５、Ｂｌｏｏｄ、１０６：１５４４～１５５１）。これは、名目上は第一世代ＣＡＲであるが、Ｔ細胞中の内在性ＤＡＰ１０と会合し、これはシグナル１および２がどちらも提供されることを意味する。ＣＹＡＤ－０１ＣＡＲはＣｅｌｙａｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって現在臨床開発中であり、このＣＡＲのレプリカは、比較目的でのみこれらの実施例中に提供する。
Ｎ１０１２ Ｔ細胞の再刺激および増殖の潜在性をＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞と比較した。以前に記述したように、ＣＹＡＤ－０１ＣＡＲはＮＫＧ２ＤとＣＤ３ζとの融合からなり、最初にＳｅｎｔｍａｎらによって記載されたマウスＣＡＲのヒトバージョンを表す（Ｚｈａｎｇら、２００５、Ｂｌｏｏｄ、１０６：１５４４～１５５１）。これは、名目上は第一世代ＣＡＲであるが、Ｔ細胞中の内在性ＤＡＰ１０と会合し、これはシグナル１および２がどちらも提供されることを意味する。ＣＹＡＤ－０１ＣＡＲはＣｅｌｙａｄ Ｏｎｃｏｌｏｇｙによって現在臨床開発中であり、このＣＡＲのレプリカは、比較目的でのみこれらの実施例中に提供する。
【0162】
フローサイトメトリーによって評価した場合に、ＣＹＡＤ－０１レプリカの表面発現が初代ヒトＴ細胞において確認された（図１３）。
【0163】
手短に述べると、Ｎ１０１２またはＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞を、新鮮な単層と共に、週に２回、単層破壊が観察されなくなるまで同時培養した。これを達成するために、１×１０５個の腫瘍細胞を２４ウェルプレートの３つ組ウェル中に蒔き、２４時間、３７℃および５％のＣＯ２でインキュベートした。２４時間後、１ウェルあたり１×１０５個のＣＡＲ＋ Ｔ細胞を、１×１０５個のＣＡＲ＋／ｍＬの最終濃度で加えた。７２時間後、Ｔ細胞を穏やかに取り出し、ウェルを１ｍＬのＰＢＳで洗浄した。ＰＢＳを除去した後、１ｍＬのＭＴＴ（５００μｇ／ｍＬの最終濃度）をそれぞれのウェルに加え、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。プレートを読み取り、上記に詳述したように腫瘍細胞生存度を計算した。腫瘍細胞生存度が５０％未満として測定された場合に、再刺激は成功したとみなされた。
【0164】
標的細胞認識に応答したＴ細胞増殖を調査するために、プレートから取り出したＴ細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを３．２ｍＬのＲ５培地に再懸濁させ、１ｍＬを新鮮な腫瘍単層のそれぞれのウェルに３つ組で加えた。総Ｔ細胞数は、残った２００μＬの小アリコートのトリパンブルー排除によって評価した。
【0165】
ＣＹＡＤ－０１レプリカ、ＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲおよび対照Ｔ細胞と比較した場合、Ｎ１０１２＋ Ｔ細胞は、ＢｘＰＣ３＿ＬＴ細胞に対する有意により多くのラウンドの再刺激を受けた（図１４Ａ）。さらに、Ｎ１０１２ Ｔ細胞は、ＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞または対照よりも実質的に高い、平均の拡大の倍数も実証した（図１４Ｂ）。
【0166】
腫瘍球状体と共に同時培養した場合、球状体生存度の有意な低下がＮ１０１２＋ Ｔ細胞で観察されたが、これは、ＵＴ対照Ｔ細胞でも、機能的ＣＹＡＤ－０１レプリカＣＡＲを発現するものでも観察されなかった（図１５Ａ）。Ｎ１０１２ Ｔ細胞は、ＵＴまたはＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞のいずれと比較しても、有意な増殖も実証した（図１５Ｂ）。
【0167】
４．７．１０．実施例１０：Ｎ１０１２ Ｔ細胞およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の作製
ＣＡＲ構築体（たとえば、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１＿１０）を発現するＴ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、Ｔ細胞を活性化させ、Ｔ細胞を、ＣＡＲをコードしている核酸を含有するウイルスで形質導入することによって、作製した（図１６Ａ～１６Ｂ）。
ＣＡＲ構築体（たとえば、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１＿１０）を発現するＴ細胞は、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、Ｔ細胞を活性化させ、Ｔ細胞を、ＣＡＲをコードしている核酸を含有するウイルスで形質導入することによって、作製した（図１６Ａ～１６Ｂ）。
【0168】
手短に述べると、ウイルスを作製するために、１．６５×１０６個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０ｃｍ２の組織培養皿中、１０％のＦＢＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミンを含有する１０ｍＬのＩＭＤＭ培地（Ｉ１０培地）中で播種し、２４時間、３７℃、５％のＣＯ２でインキュベートした。翌日、表３中のプロトコルに従って、形質移入混合物をそれぞれのＣＡＲ構築体について作製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、以下のプラスミドを用いて別々に形質移入した：Ｎ１０１２（ＤＡＰ１０／１２融合タンパク質およびヒトＮＫＧ２Ｄ受容体をコード（配列番号７４））、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２（ＤＡＰ１０／１２融合タンパク質、ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体、およびＣＸＣＲ２をコード（配列番号９１））、ＣＹＡＤ－０１レプリカ（ＣＤ３ζと融合したＮＫＧ２Ｄ受容体をコード（配列番号９３））、ならびにＣＹＡＤ－０１＿１０（ＣＹＡＤ－０１レプリカおよびＤＡＰ１０をコード（配列番号９４）。
【表3】
【0169】
１５分間のインキュベーションの完了の後、ミックスＢをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に滴下し、穏やかに回旋させた。その後、細胞をインキュベーター内に戻した。上清を形質移入の４８時間後に収集し、事前に冷却した５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ内に収集し、４℃で保存した。
【0170】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に１０ｍＬの新鮮なＩ１０培地を供給し、インキュベーター内に戻した。さらに２４時間後、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞から上清の２回目の収集を行い、形質移入の４８時間後に収集した上清と合せた。合わせた上清を事前にラベル付けしたチューブ内に分注し、急速凍結し、－８０℃で保存した。
【0171】
ＰＢＭＣを、標準のＦｉｃｏｌｌ Ｐａｑｕｅ媒介性密度遠心分離を使用して単離した。３×１０６個の細胞／ｍＬの濃度でＲＰＭＩ＋５％の正常ヒトＡＢ血清および２ｍＭのＬ－グルタミン（「Ｒ５」培地）中に再懸濁させた後、Ｔ細胞を、抗ヒトＣＤ３および抗ヒトＣＤ２８抗体でコーティングした常磁性ビーズ（１：２の細胞：ビーズの比）または５ｕｇ／ｍＬの濃度の植物性赤血球凝集素（ＰＨＡ）を使用して活性化した。活性化の４８時間後、１×１０６個のＴ細胞を、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎでコーティングした、非組織培養物で処理したプレート上に蒔き、一過的に形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞から収集した３ｍＬのウイルス上清と混合した。Ｔ細胞に、ＲＰＭＩ１６４０培地＋５％の正常ヒトＡＢ血清中の１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ－２を供給し、新鮮な培地およびＩＬ－２（１００ＩＵ／ｍＬ）を週に３回提供した。
【0172】
Ｔ細胞上におけるＮ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１、およびＣＹＡＤ－０１＿１０ ＣＡＲの表面発現をフローサイトメトリーによって評価した。手短に述べると、Ｔ細胞を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）とコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ４、フィコエリスリン（ＰＥ）とコンジュゲートさせた抗ヒトＮＫＧ２Ｄ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ＿６４７（ＡＦ＿６４７）とコンジュゲートさせた抗ヒトＣＸＣＲ２、およびアロフィコシアニンシアニン７（ＡＰＣＣｙ７）とコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ８α抗体を用いて、氷上で３０分間染色した。バックグラウンドＣＸＣＲ２発現の対照として、１本のチューブを、ＦＩＴＣとコンジュゲートさせたＣＤ４、ＰＥとコンジュゲートさせたＮＫＧ２Ｄ、ＡＰＣＣｙ７とコンジュゲートさせたＣＤ８α、およびＡＦ＿６４７とコンジュゲートさせたアイソタイプ抗体を用いて染色した。２ｍＬの氷冷ＰＢＳで洗浄した後、細胞を０．５ｍＬの氷冷ＰＢＳに再懸濁させ、フローサイトメトリーによって評価した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞中におけるＮＫＧ２Ｄの内在性発現が原因で、遺伝子移入効率はＣＤ４＋Ｔ細胞内で計算し、非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞において見られるものと比較した。図１６Ｃに示す結果は、高レベルの遺伝子移入がすべての構築体で達成されるが（図１６Ｃ、左パネル）、Ｎ１０１２が、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２を含めた他のＣＡＲと比較して有意により高い表面発現を有する（図１６Ｃ、右パネル）ことを実証している。
【0173】
４．７．１１．実施例１１：ヒト卵巣癌細胞に対するＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の有効性の評価
細胞毒性（ＭＴＴ）アッセイを行って、卵巣癌細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍有効性を評価した。手短に述べると、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）－倉持およびＯｖｓａｈｏ－に代表的な２つの上皮卵巣癌細胞系を、ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、またはＣＹＡＤ－０１＿１０）と共に、１：１～１：６４の範囲のｌｏｇ２エフェクター：標的の比で、別々に同時培養した。腫瘍細胞生存度は、Ｔ細胞添加の４８時間後に、上述のようにＭＴＴアッセイを行うことによって評価した。腫瘍細胞生存度は、Ｔ細胞の非存在下で成長させた腫瘍細胞の百分率として表した（図１７）。結果は、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、およびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞が、どちらの腫瘍細胞系においても強力な細胞毒性を実証したことを示す（図１７）。対照的に、非形質導入Ｔ細胞は無視できる腫瘍細胞死しか媒介しなかった。
細胞毒性（ＭＴＴ）アッセイを行って、卵巣癌細胞に対するＣＡＲ Ｔ細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏの抗腫瘍有効性を評価した。手短に述べると、高悪性度漿液性卵巣癌（ＨＧＳＯＣ）－倉持およびＯｖｓａｈｏ－に代表的な２つの上皮卵巣癌細胞系を、ＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、またはＣＹＡＤ－０１＿１０）と共に、１：１～１：６４の範囲のｌｏｇ２エフェクター：標的の比で、別々に同時培養した。腫瘍細胞生存度は、Ｔ細胞添加の４８時間後に、上述のようにＭＴＴアッセイを行うことによって評価した。腫瘍細胞生存度は、Ｔ細胞の非存在下で成長させた腫瘍細胞の百分率として表した（図１７）。結果は、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、およびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞が、どちらの腫瘍細胞系においても強力な細胞毒性を実証したことを示す（図１７）。対照的に、非形質導入Ｔ細胞は無視できる腫瘍細胞死しか媒介しなかった。
【0174】
４．７．１２．実施例１２：Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞は優れた増殖を実証する
再刺激アッセイを行って、複数ラウンドの標的細胞溶解を受けるＣＡＲ Ｔ細胞の能力を評価した。手短に述べると、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｒｅｎ中皮腫腫瘍細胞と共に、１：１のエフェクター比で同時培養した。７２時間後、Ｔ細胞を穏やかに取り出し、それぞれのウェルを１ｍＬのＰＢＳで穏やかに洗浄した。ＰＢＳを除去した後、１ウェルあたり０．５ｍＬのＭＴＴ溶液を加え、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、生じたホルマザン結晶をＤＭＳＯ（０．５ｍＬ／ウェル）中に溶かし、吸光度を５６０ｎｍで測定した。腫瘍細胞生存度は以下のように計算した：（Ｔ細胞を用いた単層の吸光度／Ｔ細胞を用いない単層の吸光度）＊１００。単層から取り出したＴ細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを３．２ｍＬのＲ５培地に再懸濁させ、１ｍＬを新鮮な腫瘍単層のそれぞれのウェルに３つ組で加えた。Ｔ細胞が４０％を超える標的細胞溶解を媒介することができなくなるまで、アッセイを週に２回繰り返した。標的細胞認識に応答したＴ細胞増殖を調査するために、Ｔ細胞数は、残った２００μＬの小アリコートのトリパンブルー排除によって評価した。拡大の倍数は以下のように計算した（再刺激中に達成された最高総Ｔ細胞数／播種した初期Ｔ細胞数）。
再刺激アッセイを行って、複数ラウンドの標的細胞溶解を受けるＣＡＲ Ｔ細胞の能力を評価した。手短に述べると、ＣＡＲ－Ｔ細胞を、Ｒｅｎ中皮腫腫瘍細胞と共に、１：１のエフェクター比で同時培養した。７２時間後、Ｔ細胞を穏やかに取り出し、それぞれのウェルを１ｍＬのＰＢＳで穏やかに洗浄した。ＰＢＳを除去した後、１ウェルあたり０．５ｍＬのＭＴＴ溶液を加え、プレートを３７℃および５％のＣＯ２でおよそ１時間インキュベートした。ＭＴＴ溶液を除去した後、生じたホルマザン結晶をＤＭＳＯ（０．５ｍＬ／ウェル）中に溶かし、吸光度を５６０ｎｍで測定した。腫瘍細胞生存度は以下のように計算した：（Ｔ細胞を用いた単層の吸光度／Ｔ細胞を用いない単層の吸光度）＊１００。単層から取り出したＴ細胞を４００×ｇで５分間遠心分離し、上清を除去した。ペレットを３．２ｍＬのＲ５培地に再懸濁させ、１ｍＬを新鮮な腫瘍単層のそれぞれのウェルに３つ組で加えた。Ｔ細胞が４０％を超える標的細胞溶解を媒介することができなくなるまで、アッセイを週に２回繰り返した。標的細胞認識に応答したＴ細胞増殖を調査するために、Ｔ細胞数は、残った２００μＬの小アリコートのトリパンブルー排除によって評価した。拡大の倍数は以下のように計算した（再刺激中に達成された最高総Ｔ細胞数／播種した初期Ｔ細胞数）。
【0175】
図１８に示す結果は、ＣＹＡＤ－０１レプリカおよびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞と比較した、再刺激アッセイ中のＮ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の有意に改善された増殖および持続を実証している。非形質導入Ｔ細胞またはＮＫＧ２Ｄを発現するＴ細胞の拡大は観察されなかった一方で、すべてのＣＡＲ＋ Ｔ細胞が最初に播種した数から増殖した。Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の拡大のレベルは、ＣＹＡＤ－０１レプリカまたはＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞のいずれで観察されたものよりも実質的に大きかった。さらに、ＣＹＡＤ－０１レプリカおよびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞の数は、追加のラウンドの刺激の際に迅速に減少した一方で、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞はどちらも頑強な増殖を実証した。実際、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞は、最初に播種した細胞数と比較して、Ｔ細胞数のそれぞれ５９．７倍および５８．１倍の最大拡大を実証した。Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞はどちらも、増殖の突発、次いでＴ細胞数の収縮を実証し、その後、これに追加のラウンドの増殖が続くことが明らかであった（図１８）。この増殖および収縮のパターンは、内在性免疫応答のそれを反映している。
【0176】
４．７．１３．実施例１３：Ｔ細胞刺激後のＴ細胞分化、ＣＤ４：ＣＤ８の比、および共刺激分子の発現の評価
Ｔ細胞の小アリコートを、継続中の再刺激アッセイから、刺激１６および刺激２３の後に取り出し、Ｔ細胞を、ＦＩＴＣとコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ４およびＡＰＣＣｙ７とコンジュゲートさせたＣＤ８α抗体を用いて染色した。Ｔ細胞を、ＣＤ２７について、ＰＥＣｙ７とコンジュゲートさせた抗体を使用して別々に染色した。Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって評価した。どちらの時点でも、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞は、ＣＤ８＋部分組に向かうほぼ完全なシフトを実証し、非常にわずかなＣＤ４＋細胞しか検出されなかった（図１９Ａ～１９Ｂ）。ＣＤ８＋へのシフトは、刺激１６よりも刺激２３の後により顕著であった（図１９Ｂを図１９Ａと比較）。決定的に、Ｎ１０１２ Ｔ細胞は、２８ラウンドの再刺激の後でさえも主要な共刺激分子であるＣＤ２７の発現を保持していた（図２０、右パネル）。結果は、Ｎ１０１２ Ｔ細胞が、２８ラウンドの刺激の後に一部の記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）を維持することも実証している（図２０、左パネル）。
Ｔ細胞の小アリコートを、継続中の再刺激アッセイから、刺激１６および刺激２３の後に取り出し、Ｔ細胞を、ＦＩＴＣとコンジュゲートさせた抗ヒトＣＤ４およびＡＰＣＣｙ７とコンジュゲートさせたＣＤ８α抗体を用いて染色した。Ｔ細胞を、ＣＤ２７について、ＰＥＣｙ７とコンジュゲートさせた抗体を使用して別々に染色した。Ｔ細胞をフローサイトメトリーによって評価した。どちらの時点でも、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞は、ＣＤ８＋部分組に向かうほぼ完全なシフトを実証し、非常にわずかなＣＤ４＋細胞しか検出されなかった（図１９Ａ～１９Ｂ）。ＣＤ８＋へのシフトは、刺激１６よりも刺激２３の後により顕著であった（図１９Ｂを図１９Ａと比較）。決定的に、Ｎ１０１２ Ｔ細胞は、２８ラウンドの再刺激の後でさえも主要な共刺激分子であるＣＤ２７の発現を保持していた（図２０、右パネル）。結果は、Ｎ１０１２ Ｔ細胞が、２８ラウンドの刺激の後に一部の記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）を維持することも実証している（図２０、左パネル）。
【0177】
Ｎ１０１２ Ｔ細胞はさらに、中央記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ＋）およびエフェクター記憶Ｔ細胞（ＣＤ４５ＲＯ＋ ＣＤ６２Ｌ－）の間を循環すると考えられた。高い再刺激ラウンド数においてさえも、終末消耗（ＣＤ４５ＲＯ－ ＣＤ６２Ｌ－）の証拠は最小限しか観察されなかった（図２１）。
【0178】
４．７．１４．実施例１４：ＣＡＲ Ｔ細胞の結合力の評価
ＮＫＧ２Ｄ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞に対する結合力を評価するために、漸増レベルの音響力で標的細胞と結合したＴ細胞の百分率を測定した。手短に述べると、ＣＤ１９で操作したＬＯ６８またはＳＫＯＶ－３腫瘍細胞（どちらもＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する）を、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングしたｚ－Ｍｏｖｉマイクロ流体チップ（Ｌｕｍｉｃｋｓ、オランダＡｍｓｔｅｒｄａｍ）中に播種し、１６時間培養した。翌日、流動選別したＣＡＲ－Ｔ細胞をチップに連続的に流し、標的細胞と共に５分間インキュベートした後、３分間の直線力勾配を開始した。力勾配中、ｚ－Ｍｏｖｉ装置（Ｌｕｍｉｃｋｓ）により、プラットフォーム内に組み込んだ明視野顕微鏡を使用してイメージの時系列を捕らえた。剥離した細胞を音響節に向かって浮揚させ、これにより、そのＸＹ位置に基づいた細胞の追跡が可能となる。Ｚ位置の変化は回折パターンの変化をもたらし、これが、基質に接着した細胞と音響節中に浮遊する細胞との区別を可能にした。この情報を使用して、細胞剥離事象を特定の破裂力と相関させた。細胞剥離は（ｚ－Ｍｏｖｉ Ｔｒａｃｋｉｎｇ＿ｖ１．６．０）を使用して獲得し、実験後の画像解析は細胞追跡（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇ）オフライン分析＿ｖ２．１を使用して行った。
ＮＫＧ２Ｄ標的化ＣＡＲ Ｔ細胞の標的細胞に対する結合力を評価するために、漸増レベルの音響力で標的細胞と結合したＴ細胞の百分率を測定した。手短に述べると、ＣＤ１９で操作したＬＯ６８またはＳＫＯＶ－３腫瘍細胞（どちらもＮＫＧ２Ｄリガンドを発現する）を、ポリ－Ｌ－リシンでコーティングしたｚ－Ｍｏｖｉマイクロ流体チップ（Ｌｕｍｉｃｋｓ、オランダＡｍｓｔｅｒｄａｍ）中に播種し、１６時間培養した。翌日、流動選別したＣＡＲ－Ｔ細胞をチップに連続的に流し、標的細胞と共に５分間インキュベートした後、３分間の直線力勾配を開始した。力勾配中、ｚ－Ｍｏｖｉ装置（Ｌｕｍｉｃｋｓ）により、プラットフォーム内に組み込んだ明視野顕微鏡を使用してイメージの時系列を捕らえた。剥離した細胞を音響節に向かって浮揚させ、これにより、そのＸＹ位置に基づいた細胞の追跡が可能となる。Ｚ位置の変化は回折パターンの変化をもたらし、これが、基質に接着した細胞と音響節中に浮遊する細胞との区別を可能にした。この情報を使用して、細胞剥離事象を特定の破裂力と相関させた。細胞剥離は（ｚ－Ｍｏｖｉ Ｔｒａｃｋｉｎｇ＿ｖ１．６．０）を使用して獲得し、実験後の画像解析は細胞追跡（Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｋｉｎｇ）オフライン分析＿ｖ２．１を使用して行った。
【0179】
図２２に示す結果は、ＣＡＲ Ｔ細胞の結合力がＣＡＲの細胞表面発現のレベルを反映すると考えられることを実証している（図１６Ｃ）。Ｎ１０１２ ＣＡＲ Ｔ細胞は、Ｌｏ６８－１９およびＳＫＯＶ３細胞のどちらに対しても、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、およびＣＹＡＤ－０１＿１０ ＣＡＲ Ｔ細胞よりも高い結合力を示した（図２２）。すべてのＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ Ｔ細胞が、Ｌｏ６８＿１９細胞に対してＣＤ１９に特異的なＴ細胞よりも低い結合力を実証し（ＦＭＣ６３）、これは、ＦＭＣ６３と比較した、ＮＫＧ２Ｄのそのリガンドに対するより低い親和性を反映している。
【0180】
４．７．１５．実施例１５：Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞からのサイトカイン分泌の評価
ＣＡＲ Ｔ細胞によるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の分泌を、ＥＬＩＳＡによって、様々な腫瘍細胞系との同時培養の後に評価した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、卵巣癌（倉持、Ｏｖｓａｈｏ）および膵癌（ＣＦＰａｃ－１）に由来する細胞と共に、２４時間、別々に同時培養した。続いて、上清を取り出し、以前に記載したようにＥＬＩＳＡによって評価した。
ＣＡＲ Ｔ細胞によるインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）およびインターロイキン－２（ＩＬ－２）の分泌を、ＥＬＩＳＡによって、様々な腫瘍細胞系との同時培養の後に評価した。ＣＡＲ Ｔ細胞を、卵巣癌（倉持、Ｏｖｓａｈｏ）および膵癌（ＣＦＰａｃ－１）に由来する細胞と共に、２４時間、別々に同時培養した。続いて、上清を取り出し、以前に記載したようにＥＬＩＳＡによって評価した。
【0181】
【0182】
４．７．１６．実施例１６：刺激していないＮ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞は、ＣＹＡＤ－０１レプリカまたはＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞と比較して、ｅｘ ｖｉｖｏで改善された拡大を実証する
Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、およびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞の拡大、ひいてはスケールアップの潜在性を評価するために、実験を行った。手短に述べると、Ｔ細胞を以前に記載したように形質導入し、４８～７２時間毎に、１００％の体積の、１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２を添加したＲ５培地を供給した。細胞の拡大は、１２日間の培養期間の終わりの時点でのＴ細胞の合計数／形質導入したＴ細胞の初期数として計算した。
Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、およびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞の拡大、ひいてはスケールアップの潜在性を評価するために、実験を行った。手短に述べると、Ｔ細胞を以前に記載したように形質導入し、４８～７２時間毎に、１００％の体積の、１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２を添加したＲ５培地を供給した。細胞の拡大は、１２日間の培養期間の終わりの時点でのＴ細胞の合計数／形質導入したＴ細胞の初期数として計算した。
【0183】
結果は、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞がどちらも、非形質導入Ｔ細胞をわずかに上回る拡大レベルを実証することを示す（図２４）。対照的に、ＣＹＡＤ－０１レプリカおよびＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞は、対照Ｔ細胞と比較して実質的により乏しい拡大を実証する（図２４）。
【0184】
４．７．１７．実施例１７：卵巣癌のマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性の評価
卵巣腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）発現Ｏｖｓａｈｏ卵巣腫瘍異種移植片、ｆｆＬｕｃ発現ＳＫＯＶ－３卵巣腫瘍異種移植片、またはｆｆＬｕｃ発現倉持腫瘍異種移植片を保有するマウス内に注射した。Ｏｖｓａｈｏ腫瘍細胞は低レベルのＩＬ－８を発現し、ＳＫＯＶ－３腫瘍細胞は中等度のレベルのＩＬ－８を発現する。続いて、腫瘍成長を生物発光イメージングによってモニタリングした。
卵巣腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼ（ｆｆＬｕｃ）発現Ｏｖｓａｈｏ卵巣腫瘍異種移植片、ｆｆＬｕｃ発現ＳＫＯＶ－３卵巣腫瘍異種移植片、またはｆｆＬｕｃ発現倉持腫瘍異種移植片を保有するマウス内に注射した。Ｏｖｓａｈｏ腫瘍細胞は低レベルのＩＬ－８を発現し、ＳＫＯＶ－３腫瘍細胞は中等度のレベルのＩＬ－８を発現する。続いて、腫瘍成長を生物発光イメージングによってモニタリングした。
【0185】
手短に述べると、１×１０５個のｆｆＬｕｃ発現Ｏｖｓａｈｏもしくは倉持または５×１０５個のｆｆＬｕｃ発現ＳＫＯＶ－３細胞を、ＮＳＧマウスの腹腔内腔内に注射した。Ｏｖａｓｈｏ細胞を接種したマウスを、腹腔内注射（腫瘍接種の６日後）または静脈内注射（接種の７日後）を介して投与したＰＢＳ［ｎ＝５匹］または５×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２［ｎ＝７匹］、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２［ｎ＝７匹］、ＣＹＡＤ－０１レプリカ［ｎ＝４匹］、もしくは非形質導入Ｔ細胞）のいずれかを用いて処置した。ＳＫＯＶ－３細胞を接種したマウスを、静脈内で、ＰＢＳ［ｎ＝５匹］または１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２［ｎ＝１１匹］、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２［ｎ＝１１匹］、もしくはＣＹＡＤ－０１＿１０［ｎ＝８匹］）のいずれかを用いて、腫瘍接種の１４日後に処置した。接種後の１７日目に、倉持細胞を接種したマウスを、腹腔内注射を介して、ＰＢＳあるいは２×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２もしくはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２）または非形質導入Ｔ細胞を用いて処置した。１８日目に、倉持細胞を接種したマウスを、静脈内注射を介して、ＰＢＳあるいは２×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２もしくはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２）または非形質導入Ｔ細胞を用いて処置した。
【0186】
結果は、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、およびＣＹＡＤ＿０１レプリカＴ細胞で処置したマウスにおけるＯｖｓａｈｏ細胞腫瘍に対する初期抗腫瘍効果を示す（図２５および図３８）。Ｏｖａｓｈｏ異種移植マウスを、腫瘍を用いて、初回腫瘍接種の５６日後に、１×１０５個のｆｆＬｕｃ発現Ｏｖｓａｈｏ細胞の腹腔内注射によって再負荷した。腫瘍再負荷の後、Ｎ１０１２またはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて腫瘍成長は観察されなかった（図３８）。比較すると、ＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞で処置したマウスは、腫瘍再負荷の後に腫瘍成長の著しい増加を示した（図３８）。結果は、ＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞と比較したＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２およびＮ１０１２ Ｔ細胞の優れた抗卵巣腫瘍活性を実証している。
【0187】
【0188】
Ｎ１０１２またはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞を用いた処置も、倉持異種移植マウスにおいて抗腫瘍活性を実証した（図３９および図４１）。腫瘍を拒絶した、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２で処置したマウスを、腫瘍を用いて、８６日目に、１×１０５個のｆｆＬｕｃ発現倉持細胞の腹腔内注射によって再負荷した。腫瘍成長は、再負荷したマウスの一部において阻害され、マウスにおいて保持された抗腫瘍活性を実証している（図３９および図４１）。図４０および４３は、それぞれ図３９および図４１中に詳述した実験において処置した倉持異種移植片保有マウスのカプラン－マイヤー生存曲線である。単一実験において使用したＴ細胞は同じドナーからのものであった。図４１中に詳述した実験において使用したＴ細胞は、図３９中に詳述した実験において使用したＴ細胞とは異なるドナーからのものであった。
【0189】
Ｔ細胞輸送を評価するために、Ｔ細胞を、ＣＡＲ構築体（Ｎ１０１２またはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２）およびレポーター構築体（ｒＬｕｃ単独またはＧＦＰと同時発現されるｒＬｕｃ））を発現するように二重形質導入した。
【0190】
以前に記載したようにＯｖａｓｈｏ細胞を接種したマウスを、５×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＳＷ［ｎ＝３匹］またはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰ［ｎ＝３匹］）を用いて、腫瘍接種の７日後に静脈内注射によって処置した。生物発光イメージングの結果（図２６、右パネル）は、Ｔ細胞注射の１～３日後に、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰ Ｔ細胞が、Ｎ１０１２＿ＳＷ Ｔ細胞よりも効率的に腹膜に輸送された一方で、２つの処置群において同等の抗腫瘍活性が観察されたことを示す（図２６、左および中央パネル）。Ｏｖｓａｈｏ細胞がＩＬ－８を中等度から低いレベルで発現することを考慮すると、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰ Ｔ細胞の輸送の増加は、ＩＬ－８以外のＣＸＣＲ２リガンドが原因であり得る。
【0191】
以前に記載したようにＳＫＯＶ－３細胞を接種したマウスを、１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰまたはＮ１０１２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰ）を用いて、腫瘍接種の１４日後に静脈内注射によって処置した。図２８および図２９に示す結果は、Ｔ細胞投与の最初の４日後において、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞がＮ１０１２ Ｔ細胞よりも効率的に輸送されたことを実証している（図２８、右パネルおよび図２９）。図２８（左パネル）に示す結果は、Ｎ１０１２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰおよびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ｒＬｕｃ／ＧＦＰ Ｔ細胞で処置したマウスが、Ｔ細胞投与の６０日を超えた後に抗腫瘍活性を維持することをさらに実証している。
【0192】
以前に記載したように倉持細胞を接種したマウスを、腫瘍接種の１８日後に、Ｎ１０１２またはＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２のどちらかおよび二重レポーターｒＬｕｃ／ＧＦＰで同時形質導入した２×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞を用いて、処置した。図４２に示す結果は、Ｔ細胞投与の最初の４日後において、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞がＮ１０１２ Ｔ細胞よりも効率的に腹膜腔内に輸送されたことを実証している。
【0193】
４．７．１８．実施例１８：膵癌のマウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性の評価
膵臓腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＦＰａｃ－１またはＢｘＰＣ３腫瘍細胞のどちらかを保有するマウス内に注射した。
膵臓腫瘍に対するｉｎ ｖｉｖｏでのＣＡＲ Ｔ細胞の有効性を評価するために、ＣＡＲ Ｔ細胞を、ＣＦＰａｃ－１またはＢｘＰＣ３腫瘍細胞のどちらかを保有するマウス内に注射した。
【0194】
手短に述べると、１×１０５個のＣＦＰａｃ－１またはＢｘＰＣ３細胞を５０μｌのＭａｔｒｉｇｅｌ（１：１のＰＢＳ）中でＮＳＧマウスの左脇腹内に皮下注射した。ＣＦＰａｃ－１細胞を用いた接種の２９日後またはＢｘＰＣ３細胞を用いた接種の１４日後、マウスを、ＰＢＳまたは１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、Ｎ１０１２、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＹＡＤ－０１レプリカ、もしくは非形質導入（ＵＴ）Ｔ細胞）のいずれかを用いて静脈内で処置した。Ｔ細胞注射の３日後、Ｎ１０１２、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２、およびＵＴ Ｔ細胞処置群のそれぞれからの３匹のマウスを屠殺し、腫瘍を免疫組織化学（ＩＨＣ）分析のために収集した。腫瘍成長をカリパス測定によって毎週測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）として表した。
【0195】
結果は、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞で処置したＣＦＰａｃ－１異種移植マウスにおける腫瘍が、Ｔ細胞投与の後に完全に根絶されており、腫瘍再発は観察されなかったことを示す（図３０）。対照的に、Ｎ１０１２およびＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞で処置したＣＦＰａｃ－１異種移植マウスにおける腫瘍成長は、Ｔ細胞投与の後に最初に阻害され、抗腫瘍活性の喪失および腫瘍再発が続いた（図３０）。ＩＨＣ分析により、Ｎ１０１２またはＮＫＧ２Ｄ Ｔ細胞と比較して、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞のＣＦＰａｃ－１腫瘍内への改善された浸潤が示された（図３１）。
【0196】
Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞で処置したＢｘＰＣ３異種移植マウスは、Ｎ１０１２またはＣＹＡＤ－０１レプリカＴ細胞で処置したマウスと比較して、改善された腫瘍阻害（図３３）および生存（図３４）を示し、これは、ＣＸＣＲ２の存在が、ＣＡＲ Ｔ細胞のＩＬ－８産生ＢｘＰＣ３腫瘍への回遊を改善させることを示唆している。
【0197】
高および低用量のＣＡＲ Ｔ細胞の処置を比較するために、さらなる研究を行った。手短に述べると、１×１０５個のＣＦＰａｃ－１細胞をＮＳＧマウスの腹腔内腔内に注射した。腫瘍接種の２８日後、マウスを、ＰＢＳ［ｎ＝５匹］、高用量の１０×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２［ｎ＝７匹］、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２［ｎ＝７匹］、ＣＹＡＤ－０１レプリカ［ｎ＝５匹］）、または低用量の４×１０６個のＣＡＲ Ｔ細胞（Ｎ１０１２［ｎ＝６匹］、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２［ｎ＝７匹］）のいずれかで処置した。図３２に示す結果は、低用量のＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞を用いた処置の有効性が、高用量のＮ１０１２ Ｔ細胞を用いた処置の後を追うことを実証している。
【0198】
４．７．１９．実施例１９：中皮腫患者由来異種移植片（ＰＤＸ）腫瘍モデルにおけるＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞の抗腫瘍有効性の評価
中皮腫患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウス腫瘍モデルを作製して、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の、中皮腫のｉｎ ｖｉｖｏ処置の有効性を評価した。中皮腫ＰＤＸモデルを確立するために、初代患者中皮腫腫瘍断片（２×２ｍｍ）を、ＮＳＧマウスの左脇腹内に、１５Ｇのトロカール移植針を使用して、皮下移植した。腫瘍を６カ月の期間にわたって成長させ、新しいコホートへと３回継代させた。４継代目に、雄ＮＳＧマウスの実験コホートにＰＤＸ材料を左脇腹内に移植した。腫瘍移植後の１１１日目に、マウスにＰＢＳ［ｎ＝８匹］または１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（非形質導入（ＵＴ）、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２［ｎ＝８匹］、Ｎ１０１２［ｎ＝９匹］、もしくはＣＹＡＤ－０１＿１０［ｎ＝５匹］）のいずれかを静脈内投与した。生物発光イメージングによってＴ細胞を追跡するために、マウスの部分群を、ルシフェラーゼおよびＴＤトマト（ＬＴ）を用いて、ＣＡＲを用いたまたは用いずに形質導入したＴ細胞で処置した（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ＬＴ［ｎ＝３匹］、Ｎ１０１２＿ＬＴ、またはＬＴ単独［ｎ＝３匹］）。腫瘍成長をカリパス測定によって毎週測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）として表した。
中皮腫患者由来異種移植片（ＰＤＸ）マウス腫瘍モデルを作製して、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ ＣＡＲ Ｔ細胞の、中皮腫のｉｎ ｖｉｖｏ処置の有効性を評価した。中皮腫ＰＤＸモデルを確立するために、初代患者中皮腫腫瘍断片（２×２ｍｍ）を、ＮＳＧマウスの左脇腹内に、１５Ｇのトロカール移植針を使用して、皮下移植した。腫瘍を６カ月の期間にわたって成長させ、新しいコホートへと３回継代させた。４継代目に、雄ＮＳＧマウスの実験コホートにＰＤＸ材料を左脇腹内に移植した。腫瘍移植後の１１１日目に、マウスにＰＢＳ［ｎ＝８匹］または１×１０７個のＣＡＲ Ｔ細胞（非形質導入（ＵＴ）、Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２［ｎ＝８匹］、Ｎ１０１２［ｎ＝９匹］、もしくはＣＹＡＤ－０１＿１０［ｎ＝５匹］）のいずれかを静脈内投与した。生物発光イメージングによってＴ細胞を追跡するために、マウスの部分群を、ルシフェラーゼおよびＴＤトマト（ＬＴ）を用いて、ＣＡＲを用いたまたは用いずに形質導入したＴ細胞で処置した（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２＿ＬＴ［ｎ＝３匹］、Ｎ１０１２＿ＬＴ、またはＬＴ単独［ｎ＝３匹］）。腫瘍成長をカリパス測定によって毎週測定し、腫瘍体積（ｍｍ３）として表した。
【0199】
図３５および図４４の結果は、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞で処置したマウスにおいて抗腫瘍活性が観察されたことを示す。対照的に、ＣＹＡＤ－０１＿１０ Ｔ細胞で処置したマウスは処置に対して良好に反応しなかった。図３６はＴ細胞の生物発光イメージングを示し、Ｎ１０１２およびＮ１０１２＿ＣＸＣＲ２ Ｔ細胞は中皮腫ＰＤＸマウス中の腫瘍部位に局在化した一方で、ＬＴレポーターのみ（ＣＡＲなし）で形質導入したＴ細胞は腫瘍に局在化しなかったことを実証している。実験におけるマウスのカプラン－マイヤー生存曲線を図４５に示す。
【0200】
５．均等物および参考としての組込み
本明細書中に引用するすべての参考文献は、それぞれの個々の出版物、データベースエントリー（たとえばＧｅｎｂａｎｋ配列もしくはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が、すべての目的のためにその全体で参考として組み込まれていると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参考として組み込まれている。この参考としての組込みの記述は、そのそれぞれが米国特許法施行規則（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．５７条（ｂ）（２）項に従って明確に同定されるありとあらゆる個々の出版物、データベースエントリー（たとえばＧｅｎｂａｎｋ 配列もしくはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許に、そのような引用が専用の参考としての組込みの記述に直接隣接していない場合でさえも、米国特許法施行規則第１．５７条（ｂ）（１）項に従って関連することを、出願人らによって意図する。存在する場合、本明細書内への専用の参考としての組込みの記述の包含は、いかなる様式でも、この全体的な参考としての組込みの記述を弱めない。本明細書中卯の参考文献の引用は、参考文献が関連する従来技術であるという承認として意図せず、また、これらの出版物または文書の内容または日付に関するいかなる承認をも構成しない。
本明細書中に引用するすべての参考文献は、それぞれの個々の出版物、データベースエントリー（たとえばＧｅｎｂａｎｋ配列もしくはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許が、すべての目的のためにその全体で参考として組み込まれていると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参考として組み込まれている。この参考としての組込みの記述は、そのそれぞれが米国特許法施行規則（３７ Ｃ．Ｆ．Ｒ．）第１．５７条（ｂ）（２）項に従って明確に同定されるありとあらゆる個々の出版物、データベースエントリー（たとえばＧｅｎｂａｎｋ 配列もしくはＧｅｎｅＩＤエントリー）、特許出願、または特許に、そのような引用が専用の参考としての組込みの記述に直接隣接していない場合でさえも、米国特許法施行規則第１．５７条（ｂ）（１）項に従って関連することを、出願人らによって意図する。存在する場合、本明細書内への専用の参考としての組込みの記述の包含は、いかなる様式でも、この全体的な参考としての組込みの記述を弱めない。本明細書中卯の参考文献の引用は、参考文献が関連する従来技術であるという承認として意図せず、また、これらの出版物または文書の内容または日付に関するいかなる承認をも構成しない。
【0201】
好ましい実施形態および様々な代替実施形態を参照して本発明を具体的に示し、記載したが、関連分野の技術者には、本発明の精神および範囲から逸脱せずに、形態および詳細の様々な変化をその中に行うことができることが理解されよう。
【0202】
６．配列
配列番号１（ヒトＤＡＰ１０の完全配列）
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG
配列番号２（ＤＡＰ１０のアミノ酸１９～９３－リーダー配列を欠く）
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP
AQEDGKVYIN MPGRG
配列番号３（ＤＡＰ１０のアミノ酸１９～６９－細胞外／膜貫通ドメイン）
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
配列番号４（ＤＡＰ１０のアミノ酸１～７１）
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
SLLIVGAVFL C
配列番号５（ＤＡＰ１０のアミノ酸１９～７１）
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLC
配列番号６（ＤＡＰ１０のアミノ酸７０～９３－細胞内ドメイン）
LCARPRRSPA QEDGKVYINM PGRG
配列番号７（ＤＡＰ１０のアミノ酸４９～９３－膜貫通および細胞内ドメイン）
LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP AQEDGKVYIN MPGRG
配列番号８（ＤＡＰ１０のアミノ酸４９～６９－膜貫通ドメイン）
LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
配列番号９（ヒトＤＡＰ１２の完全配列）
mgglepcsrl lllplllavs glrpvqaqaq sdcscstvsp gvlagivmgd lvltvliala
vyflgrlvpr grgaaeaatr kqritetesp yqelqgqrsd vysdlntqrp yyk
配列番号１０（ＤＡＰ１２のアミノ酸２２～１１３－リーダー配列を欠く）
LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV YFLGRLVPRG RGAAEAATRK
QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
配列番号１１（ＤＡＰ１２のアミノ酸６２～１１３－細胞質／細胞内ドメイン）
YFLGRLVPRG RGAAEAATRK QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
配列番号１２（ＤＡＰ１２のアミノ酸４１～６１－膜貫通ドメイン）
gvlagivmgd lvltvliala v
配列番号１３（ＤＡＰ１２のアミノ酸２２～６１－細胞外および膜貫通ドメイン）
lrpvqaqaqs dcscstvspg vlagivmgdl vltvlialav
配列番号１４（ヒトＮＫＧ２Ｄの完全配列）
MGWIRGRRSR HSWEMSEFHN YNLDLKKSDF STRWQKQRCP VVKSKCRENA SPFFFCCFIA
VAMGIRFIIM VAIWSAVFLN SLFNQEVQIP LTESYCGPCP KNWICYKNNC YQFFDESKNW
YESQASCMSQ NASLLKVYSK EDQDLLKLVK SYHWMGLVHI PTNGSWQWED GSILSPNLLT
IIEMQKGDCA LYASSFKGYI ENCSTPNTYI CMQRTV
配列番号１５（ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸７３～２１６－細胞外ドメイン）
IWSAVFLNSL FNQEVQIPLT ESYCGPCPKN WICYKNNCYQ FFDESKNWYE SQASCMSQNA
SLLKVYSKED QDLLKLVKSY HWMGLVHIPT NGSWQWEDGS ILSPNLLTII EMQKGDCALY
ASSFKGYIEN CSTPNTYICM QRTV
配列番号１６（ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸８２～２１６－細胞外ドメイン）
LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE
DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE
NCSTPNTYIC MQRTV
配列番号１７（ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸５２～２１６－膜貫通および細胞外ドメイン）
PFFFCCFIAV AMGIRFIIMV AIWSAVFLNS LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE NCSTPNTYIC MQRTV
配列番号１８（リンカー）
GSG
配列番号１９（リンカー）
GSGGG
配列番号２０（リンカー）
GSGG
配列番号２１（リンカー）
SGGG
配列番号２２（リンカー）
GGGGS
配列番号２３（リンカー）
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２４（リンカー）
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２５（リンカー）
GPPGS
配列番号２６（リンカー）
GGGS
配列番号２７（リンカー）
GGGGS
配列番号２８（リンカー）
GYS
配列番号２９（リンカー）
GS
配列番号３０（リンカー）
SGGGG
配列番号３１（リンカー）
SGGG
配列番号３２（リンカー）
SGG
配列番号３３（リンカー）
SGSG
配列番号３４（リンカー）
SG
配列番号３５（リンカー）
GGGGA
配列番号３６（リンカー）
GGGA
配列番号３７（リンカー）
EAAAK
配列番号３８（フューリン切断部位）
RRKR
配列番号３９（Ｐ２Ａスキップペプチド）
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号４０（Ｔ２Ａスキップペプチド）
EGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号４１（ＳＧＳＧ＋Ｐ２Ａ）
SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号４２（ＳＧＳＧ＋Ｔ２Ａ）
SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号４３（フューリン＋ＳＧＳＧ＋Ｐ２Ａ）
RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号４４（フューリン＋ＳＧＳＧ＋Ｔ２Ａ）
RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号４５（Ｆ２Ａスキップペプチド）
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
配列番号４６（Ｅ２Ａスキップペプチド）
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
配列番号４７（Ｈｉｓタグ）
HHHHHH
配列番号４８（ＦＬＡＧタグ）
DYKDDDDK
配列番号４９（Ａｖｉタグ）
GLNDIFEAQKIEWHE
配列番号５０（Ｖ５タグ）
GKPIPNPLLGLDST
配列番号５１（Ｖ５タグ）
IPNPLLGLD
配列番号５２（Ｍｙｃタグ）
EQKLISEEDL
配列番号５３（ＡＨＦタグ）
glndifeaqkiewhegghhhhhhdykddddk
配列番号５４（ＦＨＡタグ）
dykddddkhhhhhhggglndifeaqkiewhe
配列番号５５（ＣＤ８αリーダー配列）
MALPVTALLL PLALLLHAAR P
配列番号５６（４－１ＢＢエンドドメイン）
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL
配列番号５７（ＣＤ２７エンドドメイン）
QRRKYRSNKG ESPVEPAEPC HYSCPREEEG STIPIQEDYR KPEPACSP
配列番号５８（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０ＤＯＸ５のヒトＩｇＧ１ヒンジ－アミノ酸２１８～２２９）
EPKSCDKTHT CP
配列番号５９（切断されたＣＤ８αヒンジ）
TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD
配列番号６０
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６１
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６２
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEPKSCDKTHTCPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６３
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６４（構築体１／Ｎ１０１２）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号６５（構築体３）
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号６６（構築体８）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号６７（構築体９）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号６８（構築体１０）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
配列番号６９（構築体１１）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
配列番号７０（配列番号６０のポリペプチドをコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７１（配列番号６１のポリペプチドをコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７２（配列番号６２のポリペプチドをコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACACACACATGCCCTCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７３（配列番号６３のポリペプチドをコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGACCACAACACCTGCTCCTAGACCTCCCACCCCTGCTCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCTGCTGGCGGCGCTGTGCATACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７４（配列番号６４のポリペプチド／構築体１／Ｎ１０１２をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
配列番号７５（配列番号６５のポリペプチド／構築体３をコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGCGGAGAAAGCGCtccGGCTCCGGCGAGGGCcgcGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTtccggaTGTGGATCCCTTTCTTTGcctttgCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGaagcgctccGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
配列番号７６（配列番号６６のポリペプチド／構築体８をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTGCTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG
配列番号７７（配列番号６７のポリペプチド／構築体９をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACcTatggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgctagacccgattataaggacgacgacgacaagCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG
配列番号７８（配列番号６８のポリペプチド／構築体１０をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTGCTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC
配列番号７９（配列番号６９のポリペプチド／構築体１１をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACcTatggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgctagacccgattataaggacgacgacgacaagCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC
配列番号８０（Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド）
NAVPNLRGDLQVLAQKVART
配列番号８１（ＣＤ１２４シグナルペプチド）
MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGN
配列番号８２（ＣＤ２８のアミノ酸１１４～２２０）
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号８３（ＣＤ２４７のアミノ酸５２～１６４）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号８４（ＷＯ２０１９／１８２４２５号の配列番号１）
MGWSCIILFLVATATGVHSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTDYSMHWVNQAP
GKGLKWMGWINTETGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARTAV
YWGQGTTLTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGSL
SWLQQKPDGTIKRLIYAASTLNSGVPKRFSGRRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYSS
YPWSFGGGTKLEIKEPKSPDKTHTCPPCPSHTQPLGVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVV
VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSL
SLGKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGGRLVPRG
RGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRVKFSRSADAPAYQQGQN
QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号８５（ＷＯ２０１９／１８２４２５号の配列番号９）
ARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG
配列番号８６（ＷＯ２０１９／１８２４２５号の配列番号１１）
GRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号８７（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２中で発現されたヒトＣＸＣＲ２ポリペプチドの配列）
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
配列番号８８（配列番号８７のポリペプチドをコードしている核酸配列）
atggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggcgaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgccccttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgtttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggccgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgacactgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaaggtggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctccgtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggtgaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgtttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaataccgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccctgctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggccagaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctgccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatgcgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcactcctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaagatcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttccttcgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactg
配列番号８９（ＳＦＧ Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２の核酸配列）
gatccggattagtccaatttgttaaagacaggatatcagtggtccaggctctagttttgactcaacaatatcaccagctgaagcctatagagtacgagccatagataaaataaaagattttatttagtctccagaaaaaggggggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggggcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcacatgcagcatgtatcaaaattaatttggttttttttcttaagtatttacattaaatggccatagtacttaaagttacattggcttccttgaaataaacatggagtattcagaatgtgtcataaatatttctaattttaagatagtatctccattggctttctactttttcttttatttttttttgtcctctgtcttccatttgttgttgttgttgtttgtttgtttgtttgttggttggttggttaatttttttttaaagatcctacactatagttcaagctagactattagctactctgtaacccagggtgaccttgaagtcatgggtagcctgctgttttagccttcccacatctaagattacaggtatgagctatcatttttggtatattgattgattgattgattgatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttgtgtgtgtgattgtgtatatgtgtgtatggttgtgtgtgattgtgtgtatgtatgtttgtgtgtgattgtgtgtgtgtgattgtgcatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttatgtgtatgattgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttgtgtatatatatttatggtagtgagaggcaacgctccggctcaggtgtcaggttggtttttgagacagagtctttcacttagcttggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctttgctcttaggagtttcctaatacatcccaaactcaaatatataaagcatttgacttgttctatgccctagggggcggggggaagctaagccagctttttttaacatttaaaatgttaattccattttaaatgcacagatgtttttatttcataagggtttcaatgtgcatgaatgctgcaatattcctgttaccaaagctagtataaataaaaatagataaacgtggaaattacttagagtttctgtcattaacgtttccttcctcagttgacaacataaatgcgctgctgagaagccagtttgcatctgtcaggatcaatttcccattatgccagtcatattaattactagtcaattagttgatttttatttttgacatatacatgtgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagaaaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcatttgggggctcgtccgggatcgggagacccctgcccagggaccaccgacccaccaccgggaggtaagctggccagcaacttatctgtgtctgtccgattgtctagtgtctatgactgattttatgcgcctgcgtcggtactagttagctaactagctctgtatctggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccggccgcaaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtcctaaaatcccgatcgtttaggactctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgaaaatatgggcccgggctagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgcccccatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctgacatgacaagagttactaacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctacttagtccagcacgaagtctggagacctctggcggcagcctaccaagaacaactggaccgaccggtggtacctcacccttaccgagtcggcgacacagtgtgggtccgccgacaccagactaagaacctagaacctcgctggaaaggaccttacacagtcctgctgaccacccccaccgccctcaaagtagacggcatcgcagcttggatacacgccgcccacgtgaaggctgccgaccccgggggtggaccatcctctagactgccatgatccacctgggccacatcctgttcctgctgctgctgcccgtggccgctgcccagaccacccctggcgagcggagcagcctgcctgccttctaccctggcaccagcggcagctgcagcggctgcggcagcctgagcctgcccctgctggccggcctggtggccgccgacgccgtggccagcctgctgatcgtgggcgccgtgttcctgtgcgccaggcccaggcggagccctgcccaggaggacggcaaggtgtacatcaacatgcccggccggggctacttcctgggcaggctggtgcccaggggcaggggcgctgccgaggctgccacccggaagcagcggatcaccgagaccgagagcccctaccaggagctgcagggccagcggagcgacgtgtacagcgacctgaacacccagaggccctactacaagaggcggaaaaggtctgggagtggggctaccaatttctctctcctcaagcaagccggagacgttgaggaaaaccctggacccatgggctggatccggggacggaggagccggcacagctgggagatgagcgagttccacaactacaacctggacctgaagaagagcgacttcagcacccggtggcagaagcagcggtgccccgtggtgaagagcaagtgccgggagaacgccagccccttcttcttctgctgcttcatcgccgtggctatgggcatccggttcatcatcatggtggccatctggagcgccgtgttcctgaacagcctgttcaaccaggaggtgcagatccccctgaccgagagctactgcggcccctgccccaagaactggatctgctacaagaacaactgctaccagttcttcgacgagagcaagaactggtacgagagccaggccagctgcatgagccagaacgccagcctgctgaaggtgtacagcaaggaggaccaggacctgctgaagctggtgaagagctaccactggatgggcctggtgcacatccccaccaacggcagctggcagtgggaggacggcagcatcctgagccccaacctgctgaccatcatcgagatgcagaagggcgactgcgccctgtacgccagcagcttcaagggctacatcgagaactgcagcacccccaacacctacatctgcatgcagcggacagtgcggagaaagagatccggatctggagagggaagaggaagcctgctgacctgcggcgacgtggaggagaacccaggacccatggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggcgaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgccccttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgtttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggccgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgacactgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaaggtggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctccgtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggtgaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgtttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaataccgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccctgctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggccagaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctgccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatgcgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcactcctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaagatcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttccttcgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactgtgacagccactcgag
配列番号９０（配列番号８９によってコードされているタンパク質（（ｉ）完全長ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２の細胞内ドメインの融合、（ｉｉ）フューリン切断部位（ＲＲＫＲ）、（ｉｉｉ）ＳＧＳＧリンカー、（ｉｖ）Ｐ２Ａスキップ配列、（ｖ）ＮＫＧ２Ｄ、（ｖｉ）フューリン切断部位（ＲＲＫＲ）、（ｖｉｉ）ＳＧＳＧリンカー、（ｖｉｉｉ）Ｔ２Ａスキップ配列、（ｉｘ）ＣＸＣＲ２を含む）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
配列番号９１（配列番号９０のポリペプチドをコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAG
ACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAG
CCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCA
GGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTG
GTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCT
GCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTG
GGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGG
AGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTG
GCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCG
TGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTG
CAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTT
CGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGG
AGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAG
TGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAG
CAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACAGTGCGGAGAAAGAGAT
CCGGATCTGGAGAGGGAAGAGGAAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGACCCATGGAGGATTTCAAT
ATGGAGAGCGACTCCTTCGAGGATTTTTGGAAGGGCGAGGACCTGTCTAACTACAGCTATAGCTCCACACTGCCCCCTTT
TCTGCTGGATGCCGCCCCTTGTGAGCCAGAGTCCCTGGAGATCAACAAGTACTTCGTGGTCATCATCTATGCCCTGGTGT
TTCTGCTGTCTCTGCTGGGCAATAGCCTGGTCATGCTGGTCATCCTGTACTCCAGGGTGGGCCGCTCTGTGACCGACGTG
TATCTGCTGAATCTGGCCCTGGCCGATCTGCTGTTCGCACTGACACTGCCAATCTGGGCAGCAAGCAAGGTGAACGGCTG
GATCTTCGGCACCTTTCTGTGCAAGGTGGTGTCTCTGCTGAAGGAGGTGAACTTCTACAGCGGCATCCTGCTGCTGGCCT
GTATCTCCGTGGACCGGTATCTGGCCATCGTGCACGCCACCAGGACACTGACCCAGAAGCGGTACCTGGTGAAGTTCATC
TGCCTGAGCATCTGGGGACTGTCCCTGCTGCTGGCCCTGCCTGTGCTGCTGTTTAGGCGCACAGTGTACTCTAGCAACGT
GTCTCCAGCCTGTTATGAGGATATGGGCAACAATACCGCCAATTGGAGGATGCTGCTGCGCATCCTGCCACAGAGCTTCG
GCTTTATCGTGCCCCTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGCTTTACACTGCGGACCCTGTTCAAGGCCCACATGGGCCAG
AAGCACCGGGCCATGAGAGTGATCTTCGCCGTGGTGCTGATCTTTCTGCTGTGCTGGCTGCCCTATAACCTGGTGCTGCT
GGCCGACACACTGATGCGGACCCAGGTCATCCAGGAGACATGCGAGCGGAGAAACCACATCGACAGAGCCCTGGATGCCA
CCGAGATCCTGGGCATCCTGCACTCCTGTCTGAATCCTCTGATCTATGCCTTCATCGGCCAGAAGTTTAGGCACGGCCTG
CTGAAGATCCTGGCCATCCACGGCCTGATCTCCAAGGACTCTCTGCCCAAGGATAGCCGCCCTTCCTTCGTGGGCTCCTC
TAGCGGCCACACCTCTACCACACTGTGACAGCCACTCGAG
配列番号９２（Ｃｙａｄ－０１ＣＡＲのレプリカ（ＣＤ３ζの細胞内ドメインと融合したＮＫＧ２Ｄ）のアミノ酸配列
MRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９３（配列番号９２のポリペプチドをコードしている核酸配列）
ATGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCcGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCATTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa
配列番号９４（配列番号９２および配列番号１のＣＹＡＤ－０１＿１０－ポリペプチドをコードしている核酸配列）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCcGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGgacacctacgatgcaTTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa
配列番号９５（ヒト細胞外ＮＫＧ２Ｄドメイン）
LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９６（ヒト細胞外ＮＫＧ２Ｄドメイン）
IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９７（配列番号９５マイナス８個の最もＮ末端側のアミノ酸）
PLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９８（マウスＮＫＧ２ＤのＴＭドメイン、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：０５４７０９）
VVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAI
配列番号９９（マウスＮＫＧ２ＤのＴＭドメイン）
KISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPV
配列番号１００（ラットＮＫＧ２Ｄ）
MSKCHNYDLKPAKWDTSQEHQKQRSALPTSRPGENGIIRRRSSIEELKISPLFVVRVLVA
AMTIRFTVITLTWLAVFITLLCNKEVSVSSREGYCGPCPNDWICHRNNCYQFFNENKAWN
QSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQSPANGSWQWEDGSSLSPNELTL
VKTPSGTCAVYGSSFKAYTEDCSNPNTYICMKRAV
配列番号１０１（ラットＮＫＧ２ＤのＴＭドメイン、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：０７０２１５のアミノ酸５２～７４）
LFVVRVLVAAMTIRFTVITLTWL
配列番号１０２（Ｎ５ポリペプチド）
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPVLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号１０３（配列番号１０２のポリペプチドをコードしている核酸）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCTGAGACCCGTGCAGGCCCAGGCCCAGAGCGACTGCAGCTGCAGCACCGTGAGCCCCGGCGTGCTGGCCGGCATCGTGATGGGCGACCTGGTGCTGACCGTGCTCATCGCCCTTGCCGTGTACTTCCTGGGCAGACTGGTCCCCAGGGGCAGAGGAGCTGCCGAGGCCGCTACCAGAAAGCAGAGGATCACCGAGACAGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGAGATCCGACGTGTACAGCGACCTCAACACCCAGAGACCCTATTACAAGAGGCGGAAGCGCTCCGGCTCCGGCGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTTCCGGATGTGGATCCCTTTCTTTGCCTTTGCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCTGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAGCGCTCCGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCCATGAAAATATCTCCAATGTTCGTTGTTCGAGTCCTTGCTATAGCCTTGGCAATTCGATTCACCCTTAACACATTGATGTGGCTTGCCATTTTCAAAGAGACGTTTCAGCCAGTACTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCAAAAAATTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
配列番号１０４（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０ＤＯＸ５のヒトＩｇＧ１ヒンジ－アミノ酸２１８～２３２）
EPK SCDKTHTCPP CP
配列番号１０５（ＣＹＡＤ－０１＿１０（ＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ζ＋リボソームスキップペプチド＋ＤＡＰ１０）のアミノ酸配列）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号１（ヒトＤＡＰ１０の完全配列）
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
SLLIVGAVFL CARPRRSPAQ EDGKVYINMP GRG
配列番号２（ＤＡＰ１０のアミノ酸１９～９３－リーダー配列を欠く）
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP
AQEDGKVYIN MPGRG
配列番号３（ＤＡＰ１０のアミノ酸１９～６９－細胞外／膜貫通ドメイン）
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
配列番号４（ＤＡＰ１０のアミノ酸１～７１）
MIHLGHILFL LLLPVAAAQT TPGERSSLPA FYPGTSGSCS GCGSLSLPLL AGLVAADAVA
SLLIVGAVFL C
配列番号５（ＤＡＰ１０のアミノ酸１９～７１）
QTTPGERSSL PAFYPGTSGS CSGCGSLSLP LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLC
配列番号６（ＤＡＰ１０のアミノ酸７０～９３－細胞内ドメイン）
LCARPRRSPA QEDGKVYINM PGRG
配列番号７（ＤＡＰ１０のアミノ酸４９～９３－膜貫通および細胞内ドメイン）
LLAGLVAADA VASLLIVGAV FLCARPRRSP AQEDGKVYIN MPGRG
配列番号８（ＤＡＰ１０のアミノ酸４９～６９－膜貫通ドメイン）
LLAGLVAADA VASLLIVGAV F
配列番号９（ヒトＤＡＰ１２の完全配列）
mgglepcsrl lllplllavs glrpvqaqaq sdcscstvsp gvlagivmgd lvltvliala
vyflgrlvpr grgaaeaatr kqritetesp yqelqgqrsd vysdlntqrp yyk
配列番号１０（ＤＡＰ１２のアミノ酸２２～１１３－リーダー配列を欠く）
LRPVQAQAQS DCSCSTVSPG VLAGIVMGDL VLTVLIALAV YFLGRLVPRG RGAAEAATRK
QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
配列番号１１（ＤＡＰ１２のアミノ酸６２～１１３－細胞質／細胞内ドメイン）
YFLGRLVPRG RGAAEAATRK QRITETESPY QELQGQRSDV YSDLNTQRPY YK
配列番号１２（ＤＡＰ１２のアミノ酸４１～６１－膜貫通ドメイン）
gvlagivmgd lvltvliala v
配列番号１３（ＤＡＰ１２のアミノ酸２２～６１－細胞外および膜貫通ドメイン）
lrpvqaqaqs dcscstvspg vlagivmgdl vltvlialav
配列番号１４（ヒトＮＫＧ２Ｄの完全配列）
MGWIRGRRSR HSWEMSEFHN YNLDLKKSDF STRWQKQRCP VVKSKCRENA SPFFFCCFIA
VAMGIRFIIM VAIWSAVFLN SLFNQEVQIP LTESYCGPCP KNWICYKNNC YQFFDESKNW
YESQASCMSQ NASLLKVYSK EDQDLLKLVK SYHWMGLVHI PTNGSWQWED GSILSPNLLT
IIEMQKGDCA LYASSFKGYI ENCSTPNTYI CMQRTV
配列番号１５（ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸７３～２１６－細胞外ドメイン）
IWSAVFLNSL FNQEVQIPLT ESYCGPCPKN WICYKNNCYQ FFDESKNWYE SQASCMSQNA
SLLKVYSKED QDLLKLVKSY HWMGLVHIPT NGSWQWEDGS ILSPNLLTII EMQKGDCALY
ASSFKGYIEN CSTPNTYICM QRTV
配列番号１６（ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸８２～２１６－細胞外ドメイン）
LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE
DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE
NCSTPNTYIC MQRTV
配列番号１７（ヒトＮＫＧ２Ｄのアミノ酸５２～２１６－膜貫通および細胞外ドメイン）
PFFFCCFIAV AMGIRFIIMV AIWSAVFLNS LFNQEVQIPL TESYCGPCPK NWICYKNNCY QFFDESKNWY ESQASCMSQN ASLLKVYSKE DQDLLKLVKS YHWMGLVHIP TNGSWQWEDG SILSPNLLTI IEMQKGDCAL YASSFKGYIE NCSTPNTYIC MQRTV
配列番号１８（リンカー）
GSG
配列番号１９（リンカー）
GSGGG
配列番号２０（リンカー）
GSGG
配列番号２１（リンカー）
SGGG
配列番号２２（リンカー）
GGGGS
配列番号２３（リンカー）
GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２４（リンカー）
GGGGSGGGGSGGGGS
配列番号２５（リンカー）
GPPGS
配列番号２６（リンカー）
GGGS
配列番号２７（リンカー）
GGGGS
配列番号２８（リンカー）
GYS
配列番号２９（リンカー）
GS
配列番号３０（リンカー）
SGGGG
配列番号３１（リンカー）
SGGG
配列番号３２（リンカー）
SGG
配列番号３３（リンカー）
SGSG
配列番号３４（リンカー）
SG
配列番号３５（リンカー）
GGGGA
配列番号３６（リンカー）
GGGA
配列番号３７（リンカー）
EAAAK
配列番号３８（フューリン切断部位）
RRKR
配列番号３９（Ｐ２Ａスキップペプチド）
ATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号４０（Ｔ２Ａスキップペプチド）
EGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号４１（ＳＧＳＧ＋Ｐ２Ａ）
SGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号４２（ＳＧＳＧ＋Ｔ２Ａ）
SGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号４３（フューリン＋ＳＧＳＧ＋Ｐ２Ａ）
RRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGP
配列番号４４（フューリン＋ＳＧＳＧ＋Ｔ２Ａ）
RRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGP
配列番号４５（Ｆ２Ａスキップペプチド）
VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP
配列番号４６（Ｅ２Ａスキップペプチド）
QCTNYALLKLAGDVESNPGP
配列番号４７（Ｈｉｓタグ）
HHHHHH
配列番号４８（ＦＬＡＧタグ）
DYKDDDDK
配列番号４９（Ａｖｉタグ）
GLNDIFEAQKIEWHE
配列番号５０（Ｖ５タグ）
GKPIPNPLLGLDST
配列番号５１（Ｖ５タグ）
IPNPLLGLD
配列番号５２（Ｍｙｃタグ）
EQKLISEEDL
配列番号５３（ＡＨＦタグ）
glndifeaqkiewhegghhhhhhdykddddk
配列番号５４（ＦＨＡタグ）
dykddddkhhhhhhggglndifeaqkiewhe
配列番号５５（ＣＤ８αリーダー配列）
MALPVTALLL PLALLLHAAR P
配列番号５６（４－１ＢＢエンドドメイン）
KRGRKKLLYI FKQPFMRPVQ TTQEEDGCSC RFPEEEEGGC EL
配列番号５７（ＣＤ２７エンドドメイン）
QRRKYRSNKG ESPVEPAEPC HYSCPREEEG STIPIQEDYR KPEPACSP
配列番号５８（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０ＤＯＸ５のヒトＩｇＧ１ヒンジ－アミノ酸２１８～２２９）
EPKSCDKTHT CP
配列番号５９（切断されたＣＤ８αヒンジ）
TTTPAPRPPT PAPTIASQPL SLRPEACRPA AGGAVHTRGL DFACD
配列番号６０
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６１
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６２
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKEPKSCDKTHTCPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６３
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号６４（構築体１／Ｎ１０１２）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号６５（構築体３）
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号６６（構築体８）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号６７（構築体９）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
配列番号６８（構築体１０）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
配列番号６９（構築体１１）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCQRRKYRSNKGESPVEPAEPCHYSCPREEEGSTIPIQEDYRKPEPACSP
配列番号７０（配列番号６０のポリペプチドをコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７１（配列番号６１のポリペプチドをコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７２（配列番号６２のポリペプチドをコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGGAGCCCAAGAGCTGCGACAAGACACACACATGCCCTCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７３（配列番号６３のポリペプチドをコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGACCACAACACCTGCTCCTAGACCTCCCACCCCTGCTCCCACCATCGCCAGCCAGCCCCTGAGCCTGAGACCCGAGGCCTGCAGACCCGCTGCTGGCGGCGCTGTGCATACCAGAGGCCTGGATTTCGCCTGCGACCTTctggccggCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAG
配列番号７４（配列番号６４のポリペプチド／構築体１／Ｎ１０１２をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
配列番号７５（配列番号６５のポリペプチド／構築体３をコード）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCtGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGCGGAGAAAGCGCtccGGCTCCGGCGAGGGCcgcGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTtccggaTGTGGATCCCTTTCTTTGcctttgCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGaagcgctccGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
配列番号７６（配列番号６６のポリペプチド／構築体８をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTGCTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG
配列番号７７（配列番号６７のポリペプチド／構築体９をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACcTatggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgctagacccgattataaggacgacgacgacaagCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTAAGAGAGGCAGAAAGAAGCTGCTGTACATCTTCAAGCAGCCCTTCATGAGACCCGTGCAGACCACCCAGGAGGAGGACGGCTGCAGCTGCAGATTCCCCGAGGAGGAGGAGGGCGGCTGCGAGCTG
配列番号７８（配列番号６８のポリペプチド／構築体１０をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACccATGATTCATCTCGGACATATTCTCTTTCTCTTGCTCTTGCCTGTCGCTGCCGCTCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC
配列番号７９（配列番号６９のポリペプチド／構築体１１をコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTGGTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGGAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGAGAAGAAAGAGAAGCGGCAGCGGCGAGGGCAGAGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGACcTatggctctgcctgtgacagctctgctgctgcctctggctctgctgctgcacgccgctagacccgattataaggacgacgacgacaagCAAACAACTCCCGGAGAAAGATCTTCTCTCCCCGCTTTTTATCCCGGAACATCTGGATCTTGTTCTGGATGTGGATCTTTGTCTCTCCCTCTCCTCGCTGGACTCGTCGCAGCTGATGCTGTCGCTTCTCTCTTGATTGTCGGAGCTGTCTTTTTGTGTCAGAGGCGGAAGTACCGGAGCAACAAGGGCGAGAGCCCCGTGGAGCCTGCCGAGCCCTGCCACTACAGCTGTCCCCGGGAGGAGGAGGGCAGCACCATCCCCATCCAGGAGGACTACCGGAAGCCCGAGCCTGCCTGCAGCCCC
配列番号８０（Ａ２０ＦＭＤＶ２ペプチド）
NAVPNLRGDLQVLAQKVART
配列番号８１（ＣＤ１２４シグナルペプチド）
MGWLCSGLLFPVSCLVLLQVASSGN
配列番号８２（ＣＤ２８のアミノ酸１１４～２２０）
IEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRS
配列番号８３（ＣＤ２４７のアミノ酸５２～１６４）
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号８４（ＷＯ２０１９／１８２４２５号の配列番号１）
MGWSCIILFLVATATGVHSQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKTSGYTFTDYSMHWVNQAP
GKGLKWMGWINTETGEPTYTDDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARTAV
YWGQGTTLTVSSGSTSGSGKPGSGEGSDIQMTQSPSSLSASLGERVSLTCRASQEISGSL
SWLQQKPDGTIKRLIYAASTLNSGVPKRFSGRRSGSDYSLTISSLESEDFVDYYCLQYSS
YPWSFGGGTKLEIKEPKSPDKTHTCPPCPSHTQPLGVFLFPPKPKDQLMISRTPEVTCVV
VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV
SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVLHEALHNHYTQKSLSL
SLGKFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGGRLVPRG
RGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRVKFSRSADAPAYQQGQN
QLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPQRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMK
GERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
配列番号８５（ＷＯ２０１９／１８２４２５号の配列番号９）
ARPRRSPAQEDGKVYINMPGRG
配列番号８６（ＷＯ２０１９／１８２４２５号の配列番号１１）
GRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYK
配列番号８７（Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２中で発現されたヒトＣＸＣＲ２ポリペプチドの配列）
MEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
配列番号８８（配列番号８７のポリペプチドをコードしている核酸配列）
atggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggcgaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgccccttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgtttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggccgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgacactgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaaggtggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctccgtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggtgaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgtttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaataccgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccctgctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggccagaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctgccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatgcgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcactcctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaagatcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttccttcgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactg
配列番号８９（ＳＦＧ Ｎ１０１２＿ＣＸＣＲ２の核酸配列）
gatccggattagtccaatttgttaaagacaggatatcagtggtccaggctctagttttgactcaacaatatcaccagctgaagcctatagagtacgagccatagataaaataaaagattttatttagtctccagaaaaaggggggaatgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagagaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggggcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcacatgcagcatgtatcaaaattaatttggttttttttcttaagtatttacattaaatggccatagtacttaaagttacattggcttccttgaaataaacatggagtattcagaatgtgtcataaatatttctaattttaagatagtatctccattggctttctactttttcttttatttttttttgtcctctgtcttccatttgttgttgttgttgtttgtttgtttgtttgttggttggttggttaatttttttttaaagatcctacactatagttcaagctagactattagctactctgtaacccagggtgaccttgaagtcatgggtagcctgctgttttagccttcccacatctaagattacaggtatgagctatcatttttggtatattgattgattgattgattgatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttgtgtgtgtgattgtgtatatgtgtgtatggttgtgtgtgattgtgtgtatgtatgtttgtgtgtgattgtgtgtgtgtgattgtgcatgtgtgtgtgtgtgattgtgtttatgtgtatgattgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgtgttgtgtatatatatttatggtagtgagaggcaacgctccggctcaggtgtcaggttggtttttgagacagagtctttcacttagcttggaattcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcgttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaagaggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgagacgaaagggcctcgtgatacgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgtagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggcaccccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggataacaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagctttgctcttaggagtttcctaatacatcccaaactcaaatatataaagcatttgacttgttctatgccctagggggcggggggaagctaagccagctttttttaacatttaaaatgttaattccattttaaatgcacagatgtttttatttcataagggtttcaatgtgcatgaatgctgcaatattcctgttaccaaagctagtataaataaaaatagataaacgtggaaattacttagagtttctgtcattaacgtttccttcctcagttgacaacataaatgcgctgctgagaagccagtttgcatctgtcaggatcaatttcccattatgccagtcatattaattactagtcaattagttgatttttatttttgacatatacatgtgaaagaccccacctgtaggtttggcaagctagcttaagtaacgccattttgcaaggcatggaaaaatacataactgagaatagaaaagttcagatcaaggtcaggaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggaacagctgaatatgggccaaacaggatatctgtggtaagcagttcctgccccggctcagggccaagaacagatggtccccagatgcggtccagccctcagcagtttctagagaaccatcagatgtttccagggtgccccaaggacctgaaatgaccctgtgccttatttgaactaaccaatcagttcgcttctcgcttctgttcgcgcgcttctgctccccgagctcaataaaagagcccacaacccctcactcggcgcgccagtcctccgattgactgagtcgcccgggtacccgtgtatccaataaaccctcttgcagttgcatccgacttgtggtctcgctgttccttgggagggtctcctctgagtgattgactacccgtcagcgggggtctttcatttgggggctcgtccgggatcgggagacccctgcccagggaccaccgacccaccaccgggaggtaagctggccagcaacttatctgtgtctgtccgattgtctagtgtctatgactgattttatgcgcctgcgtcggtactagttagctaactagctctgtatctggcggacccgtggtggaactgacgagttcggaacacccggccgcaaccctgggagacgtcccagggacttcgggggccgtttttgtggcccgacctgagtcctaaaatcccgatcgtttaggactctttggtgcaccccccttagaggagggatatgtggttctggtaggagacgagaacctaaaacagttcccgcctccgtctgaatttttgctttcggtttgggaccgaagccgcgccgcgcgtcttgtctgctgcagcatcgttctgtgttgtctctgtctgactgtgtttctgtatttgtctgaaaatatgggcccgggctagactgttaccactcccttaagtttgaccttaggtcactggaaagatgtcgagcggatcgctcacaaccagtcggtagatgtcaagaagagacgttgggttaccttctgctctgcagaatggccaacctttaacgtcggatggccgcgagacggcacctttaaccgagacctcatcacccaggttaagatcaaggtcttttcacctggcccgcatggacacccagaccaggtcccctacatcgtgacctgggaagccttggcttttgacccccctccctgggtcaagccctttgtacaccctaagcctccgcctcctcttcctccatccgccccgtctctcccccttgaacctcctcgttcgaccccgcctcgatcctccctttatccagccctcactccttctctaggcgcccccatatggccatatgagatcttatatggggcacccccgccccttgtaaacttccctgaccctgacatgacaagagttactaacagcccctctctccaagctcacttacaggctctctacttagtccagcacgaagtctggagacctctggcggcagcctaccaagaacaactggaccgaccggtggtacctcacccttaccgagtcggcgacacagtgtgggtccgccgacaccagactaagaacctagaacctcgctggaaaggaccttacacagtcctgctgaccacccccaccgccctcaaagtagacggcatcgcagcttggatacacgccgcccacgtgaaggctgccgaccccgggggtggaccatcctctagactgccatgatccacctgggccacatcctgttcctgctgctgctgcccgtggccgctgcccagaccacccctggcgagcggagcagcctgcctgccttctaccctggcaccagcggcagctgcagcggctgcggcagcctgagcctgcccctgctggccggcctggtggccgccgacgccgtggccagcctgctgatcgtgggcgccgtgttcctgtgcgccaggcccaggcggagccctgcccaggaggacggcaaggtgtacatcaacatgcccggccggggctacttcctgggcaggctggtgcccaggggcaggggcgctgccgaggctgccacccggaagcagcggatcaccgagaccgagagcccctaccaggagctgcagggccagcggagcgacgtgtacagcgacctgaacacccagaggccctactacaagaggcggaaaaggtctgggagtggggctaccaatttctctctcctcaagcaagccggagacgttgaggaaaaccctggacccatgggctggatccggggacggaggagccggcacagctgggagatgagcgagttccacaactacaacctggacctgaagaagagcgacttcagcacccggtggcagaagcagcggtgccccgtggtgaagagcaagtgccgggagaacgccagccccttcttcttctgctgcttcatcgccgtggctatgggcatccggttcatcatcatggtggccatctggagcgccgtgttcctgaacagcctgttcaaccaggaggtgcagatccccctgaccgagagctactgcggcccctgccccaagaactggatctgctacaagaacaactgctaccagttcttcgacgagagcaagaactggtacgagagccaggccagctgcatgagccagaacgccagcctgctgaaggtgtacagcaaggaggaccaggacctgctgaagctggtgaagagctaccactggatgggcctggtgcacatccccaccaacggcagctggcagtgggaggacggcagcatcctgagccccaacctgctgaccatcatcgagatgcagaagggcgactgcgccctgtacgccagcagcttcaagggctacatcgagaactgcagcacccccaacacctacatctgcatgcagcggacagtgcggagaaagagatccggatctggagagggaagaggaagcctgctgacctgcggcgacgtggaggagaacccaggacccatggaggatttcaatatggagagcgactccttcgaggatttttggaagggcgaggacctgtctaactacagctatagctccacactgcccccttttctgctggatgccgccccttgtgagccagagtccctggagatcaacaagtacttcgtggtcatcatctatgccctggtgtttctgctgtctctgctgggcaatagcctggtcatgctggtcatcctgtactccagggtgggccgctctgtgaccgacgtgtatctgctgaatctggccctggccgatctgctgttcgcactgacactgccaatctgggcagcaagcaaggtgaacggctggatcttcggcacctttctgtgcaaggtggtgtctctgctgaaggaggtgaacttctacagcggcatcctgctgctggcctgtatctccgtggaccggtatctggccatcgtgcacgccaccaggacactgacccagaagcggtacctggtgaagttcatctgcctgagcatctggggactgtccctgctgctggccctgcctgtgctgctgtttaggcgcacagtgtactctagcaacgtgtctccagcctgttatgaggatatgggcaacaataccgccaattggaggatgctgctgcgcatcctgccacagagcttcggctttatcgtgcccctgctgatcatgctgttctgctacggctttacactgcggaccctgttcaaggcccacatgggccagaagcaccgggccatgagagtgatcttcgccgtggtgctgatctttctgctgtgctggctgccctataacctggtgctgctggccgacacactgatgcggacccaggtcatccaggagacatgcgagcggagaaaccacatcgacagagccctggatgccaccgagatcctgggcatcctgcactcctgtctgaatcctctgatctatgccttcatcggccagaagtttaggcacggcctgctgaagatcctggccatccacggcctgatctccaaggactctctgcccaaggatagccgcccttccttcgtgggctcctctagcggccacacctctaccacactgtgacagccactcgag
配列番号９０（配列番号８９によってコードされているタンパク質（（ｉ）完全長ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２の細胞内ドメインの融合、（ｉｉ）フューリン切断部位（ＲＲＫＲ）、（ｉｉｉ）ＳＧＳＧリンカー、（ｉｖ）Ｐ２Ａスキップ配列、（ｖ）ＮＫＧ２Ｄ、（ｖｉ）フューリン切断部位（ＲＲＫＲ）、（ｖｉｉ）ＳＧＳＧリンカー、（ｖｉｉｉ）Ｔ２Ａスキップ配列、（ｉｘ）ＣＸＣＲ２を含む）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTVRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMEDFNMESDSFEDFWKGEDLSNYSYSSTLPPFLLDAAPCEPESLEINKYFVVIIYALVFLLSLLGNSLVMLVILYSRVGRSVTDVYLLNLALADLLFALTLPIWAASKVNGWIFGTFLCKVVSLLKEVNFYSGILLLACISVDRYLAIVHATRTLTQKRYLVKFICLSIWGLSLLLALPVLLFRRTVYSSNVSPACYEDMGNNTANWRMLLRILPQSFGFIVPLLIMLFCYGFTLRTLFKAHMGQKHRAMRVIFAVVLIFLLCWLPYNLVLLADTLMRTQVIQETCERRNHIDRALDATEILGILHSCLNPLIYAFIGQKFRHGLLKILAIHGLISKDSLPKDSRPSFVGSSSGHTSTTL
配列番号９１（配列番号９０のポリペプチドをコード）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAG
ACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAG
CCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCA
GGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCTACTTCCTGGGCAGGCTG
GTGCCCAGGGGCAGGGGCGCTGCCGAGGCTGCCACCCGGAAGCAGCGGATCACCGAGACCGAGAGCCCCTACCAGGAGCT
GCAGGGCCAGCGGAGCGACGTGTACAGCGACCTGAACACCCAGAGGCCCTACTACAAGAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTG
GGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGGGCTGGATCCGGGGACGG
AGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTG
GCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCG
TGGCtATGGGCATCCGGTTCATCATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTG
CAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTT
CGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGG
AGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAG
TGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAG
CAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACAGTGCGGAGAAAGAGAT
CCGGATCTGGAGAGGGAAGAGGAAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCAGGACCCATGGAGGATTTCAAT
ATGGAGAGCGACTCCTTCGAGGATTTTTGGAAGGGCGAGGACCTGTCTAACTACAGCTATAGCTCCACACTGCCCCCTTT
TCTGCTGGATGCCGCCCCTTGTGAGCCAGAGTCCCTGGAGATCAACAAGTACTTCGTGGTCATCATCTATGCCCTGGTGT
TTCTGCTGTCTCTGCTGGGCAATAGCCTGGTCATGCTGGTCATCCTGTACTCCAGGGTGGGCCGCTCTGTGACCGACGTG
TATCTGCTGAATCTGGCCCTGGCCGATCTGCTGTTCGCACTGACACTGCCAATCTGGGCAGCAAGCAAGGTGAACGGCTG
GATCTTCGGCACCTTTCTGTGCAAGGTGGTGTCTCTGCTGAAGGAGGTGAACTTCTACAGCGGCATCCTGCTGCTGGCCT
GTATCTCCGTGGACCGGTATCTGGCCATCGTGCACGCCACCAGGACACTGACCCAGAAGCGGTACCTGGTGAAGTTCATC
TGCCTGAGCATCTGGGGACTGTCCCTGCTGCTGGCCCTGCCTGTGCTGCTGTTTAGGCGCACAGTGTACTCTAGCAACGT
GTCTCCAGCCTGTTATGAGGATATGGGCAACAATACCGCCAATTGGAGGATGCTGCTGCGCATCCTGCCACAGAGCTTCG
GCTTTATCGTGCCCCTGCTGATCATGCTGTTCTGCTACGGCTTTACACTGCGGACCCTGTTCAAGGCCCACATGGGCCAG
AAGCACCGGGCCATGAGAGTGATCTTCGCCGTGGTGCTGATCTTTCTGCTGTGCTGGCTGCCCTATAACCTGGTGCTGCT
GGCCGACACACTGATGCGGACCCAGGTCATCCAGGAGACATGCGAGCGGAGAAACCACATCGACAGAGCCCTGGATGCCA
CCGAGATCCTGGGCATCCTGCACTCCTGTCTGAATCCTCTGATCTATGCCTTCATCGGCCAGAAGTTTAGGCACGGCCTG
CTGAAGATCCTGGCCATCCACGGCCTGATCTCCAAGGACTCTCTGCCCAAGGATAGCCGCCCTTCCTTCGTGGGCTCCTC
TAGCGGCCACACCTCTACCACACTGTGACAGCCACTCGAG
配列番号９２（Ｃｙａｄ－０１ＣＡＲのレプリカ（ＣＤ３ζの細胞内ドメインと融合したＮＫＧ２Ｄ）のアミノ酸配列
MRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９３（配列番号９２のポリペプチドをコードしている核酸配列）
ATGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCcGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGATGCATTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa
配列番号９４（配列番号９２および配列番号１のＣＹＡＤ－０１＿１０－ポリペプチドをコードしている核酸配列）
ATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAGACCACCCCTGGCGAGCGGAGCAGCCTGCCTGCCTTCTACCCTGGCACCAGCGGCAGCTGCAGCGGCTGCGGCAGCCTGAGCCTGCCCCTGCTGGCCGGCCTGGTGGCCGCCGACGCCGTGGCCAGCCTGCTGATCGTGGGCGCCGTGTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCtGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAAAGGTCTGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGaCCcATGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCcGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGgacacctacgatgcaTTGCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCATGGGCTGGATCCGCGGCCGCAGGAGCCGGCACAGCTGGGAGATGAGCGAGTTCCACAACTACAACCTGGACCTGAAGAAGAGCGACTTCAGCACCCGGTGGCAGAAGCAGCGGTGCCCCGTGGTGAAGAGCAAGTGCCGGGAGAACGCCAGCCCCTTCTTCTTCTGCTGCTTCATCGCCGTGGCtATGGGCATCCGGTTTATAATCATGGTGGCCATCTGGAGCGCCGTGTTCCTGAACAGCCTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCCAAGAACTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTGtaa
配列番号９５（ヒト細胞外ＮＫＧ２Ｄドメイン）
LFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９６（ヒト細胞外ＮＫＧ２Ｄドメイン）
IWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９７（配列番号９５マイナス８個の最もＮ末端側のアミノ酸）
PLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号９８（マウスＮＫＧ２ＤのＴＭドメイン、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：０５４７０９）
VVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAI
配列番号９９（マウスＮＫＧ２ＤのＴＭドメイン）
KISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPV
配列番号１００（ラットＮＫＧ２Ｄ）
MSKCHNYDLKPAKWDTSQEHQKQRSALPTSRPGENGIIRRRSSIEELKISPLFVVRVLVA
AMTIRFTVITLTWLAVFITLLCNKEVSVSSREGYCGPCPNDWICHRNNCYQFFNENKAWN
QSQASCLSQNSSLLKIYSKEEQDFLKLVKSYHWMGLVQSPANGSWQWEDGSSLSPNELTL
VKTPSGTCAVYGSSFKAYTEDCSNPNTYICMKRAV
配列番号１０１（ラットＮＫＧ２ＤのＴＭドメイン、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号：０７０２１５のアミノ酸５２～７４）
LFVVRVLVAAMTIRFTVITLTWL
配列番号１０２（Ｎ５ポリペプチド）
MALPVTALLLPLALLLHAARPDYKDDDDKLRPVQAQAQSDCSCSTVSPGVLAGIVMGDLVLTVLIALAVYFLGRLVPRGRGAAEAATRKQRITETESPYQELQGQRSDVYSDLNTQRPYYKRRKRSGSGEGRGSLLTCGDVEENPGPMIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMKISPMFVVRVLAIALAIRFTLNTLMWLAIFKETFQPVLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
配列番号１０３（配列番号１０２のポリペプチドをコードしている核酸）
ATGGCTCTGCCTGTGACAGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCTAGACCCGATTATAAGGACGACGACGACAAGCTGAGACCCGTGCAGGCCCAGGCCCAGAGCGACTGCAGCTGCAGCACCGTGAGCCCCGGCGTGCTGGCCGGCATCGTGATGGGCGACCTGGTGCTGACCGTGCTCATCGCCCTTGCCGTGTACTTCCTGGGCAGACTGGTCCCCAGGGGCAGAGGAGCTGCCGAGGCCGCTACCAGAAAGCAGAGGATCACCGAGACAGAGAGCCCCTACCAGGAGCTGCAGGGCCAGAGATCCGACGTGTACAGCGACCTCAACACCCAGAGACCCTATTACAAGAGGCGGAAGCGCTCCGGCTCCGGCGAGGGCCGCGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAAGAGAACCCCGGACCCATGATCCACCTGGGCCACATCCTGTTCCTGCTGCTGCTGCCCGTGGCCGCTGCCCAAACAACACCCGGCGAGAGATCCTCCTTGCCCGCTTTCTATCCCGGAACATCCGGAAGCTGTTCCGGATGTGGATCCCTTTCTTTGCCTTTGCTTGCTGGATTGGTCGCAGCTGACGCTGTCGCTTCCCTCCTTATTGTCGGAGCTGTCTTCCTGTGCGCCAGGCCCAGGCGGAGCCCTGCCCAGGAGGACGGCAAGGTGTACATCAACATGCCCGGCCGGGGCAGGCGGAAGCGCTCCGGGAGTGGGGCTACCAATTTCTCTCTCCTCAAGCAAGCCGGAGACGTTGAGGAAAACCCTGGACCCATGAAAATATCTCCAATGTTCGTTGTTCGAGTCCTTGCTATAGCCTTGGCAATTCGATTCACCCTTAACACATTGATGTGGCTTGCCATTTTCAAAGAGACGTTTCAGCCAGTACTGTTCAACCAGGAGGTGCAGATCCCCCTGACCGAGAGCTACTGCGGCCCCTGCCCAAAAAATTGGATCTGCTACAAGAACAACTGCTACCAGTTCTTCGACGAGAGCAAGAACTGGTACGAGAGCCAGGCCAGCTGCATGAGCCAGAACGCCAGCCTGCTGAAGGTGTACAGCAAGGAGGACCAGGACCTGCTGAAGCTGGTGAAGAGCTACCACTGGATGGGCCTGGTGCACATCCCCACCAACGGCAGCTGGCAGTGGGAGGACGGCAGCATCCTGAGCCCCAACCTGCTGACCATCATCGAGATGCAGAAGGGCGACTGCGCCCTGTACGCCAGCAGCTTCAAGGGCTACATCGAGAACTGCAGCACCCCCAACACCTACATCTGCATGCAGCGGACCGTG
配列番号１０４（ＵｎｉＰｒｏｔ：Ｐ０ＤＯＸ５のヒトＩｇＧ１ヒンジ－アミノ酸２１８～２３２）
EPK SCDKTHTCPP CP
配列番号１０５（ＣＹＡＤ－０１＿１０（ＮＫＧ２Ｄ－ＣＤ３ζ＋リボソームスキップペプチド＋ＤＡＰ１０）のアミノ酸配列）
MIHLGHILFLLLLPVAAAQTTPGERSSLPAFYPGTSGSCSGCGSLSLPLLAGLVAADAVASLLIVGAVFLCARPRRSPAQEDGKVYINMPGRGRRKRSGSGATNFSLLKQAGDVEENPGPMRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRMGWIRGRRSRHSWEMSEFHNYNLDLKKSDFSTRWQKQRCPVVKSKCRENASPFFFCCFIAVAMGIRFIIMVAIWSAVFLNSLFNQEVQIPLTESYCGPCPKNWICYKNNCYQFFDESKNWYESQASCMSQNASLLKVYSKEDQDLLKLVKSYHWMGLVHIPTNGSWQWEDGSILSPNLLTIIEMQKGDCALYASSFKGYIENCSTPNTYICMQRTV
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5-1】
【図5-2】
【図6A-1】
【図6A-2】
【図6B-1】
【図6B-2】
【図7-1】
【図7-2】
【図7-3】
【図7-4】
【図7-5】
【図7-6】
【図8A】
【図8B-1】
【図8B-2】
【図8C】
【図8D-1】
【図8D-2】
【図9A-1】
【図9A-2】
【図9B】
【図10A】
【図10B】
【図10C】
【図10D】
【図10E】
【図11A】
【図11B】
【図12A】
【図12B】
【図13】
【図14】
【図15A】
【図15B】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図17】
【図18】
【図19A】
【図19B】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23A】
【図23B】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【図31】
【図32】
【図33】
【図34】
【図35】
【図36】
【図37】
【図38】
【図39】
【図40】
【図41】
【図42】
【図43】
【図44】
【図45】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと；（ｂ）（ｉ）ＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその機能的変異体および（ｉｉ）ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドと；
（ｃ）ＣＸＣＲ２ポリペプチドと
を含む免疫応答性細胞。
【請求項2】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、前記ＤＡＰ１０ポリペプチド、前記ＤＡＰ１２ポリペプチド、およびＣ前記ＸＣＲ２ポリペプチドのそれぞれが哺乳動物ポリペプチドである、請求項１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項3】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチド、前記ＤＡＰ１０ポリペプチド、前記ＤＡＰ１２ポリペプチド、および前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドのそれぞれがヒトポリペプチドである、請求項２に記載の免疫応答性細胞。
【請求項4】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号１４の配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項5】
前記ＮＫＧ２Ｄポリペプチドが、前記配列番号１４のアミノ酸配列を有するポリペプチドの機能的変異体である、請求項１～４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項6】
前記機能的変異体が、配列番号１４のアミノ酸のうちの少なくとも１つを付加、欠失、または置換させる１つまたは複数の点突然変異を有する、請求項５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項7】
前記機能的変異体が、前記配列番号１４のアミノ酸配列を有する前記ポリペプチドの切断バージョンである、請求項５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項8】
前記機能的変異体がキメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドである、請求項５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項9】
前記融合ポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端に、以下の式：Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｅ、
［式中、
Ａは任意選択のＮ末端配列であり；
ＢはＤＡＰ１０ポリペプチドまたはその機能的変異体であり；
Ｃは任意選択のリンカー配列であり；
ＤはＤＡＰ１２ポリペプチドまたはその機能的変異体であり；
Ｅは任意選択のＣ末端配列である］
を有する、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項10】
配列番号１のＤＡＰ１０ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ＤＡＰ１０ポリペプチドの機能的変異体を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項11】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドの機能的変異体が、前記配列番号１のＤＡＰ１０ポリペプチドのアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を有する、配列番号１の機能的変異体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項12】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドの機能的変異体が、前記配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドの切断バージョンである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項13】
前記ＤＡＰ１０の切断バージョンが、配列番号１のアミノ酸１９～９３、１９～６９、１～７１、１９～７１、１９～４８、４９～６９、４９～９３、または７０～９３を含む、またはそれからなる、請求項１２に記載の免疫応答性細胞。
【請求項14】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドまたは前記その機能的変異体が、配列番号１～８のうちの任意の１つを含む、またはそれからなる、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項15】
配列番号９のＤＡＰ１２ポリペプチドと少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、前記ＤＡＰ１２ポリペプチドの機能的変異体を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項16】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドの機能的変異体が、前記配列番号９のＤＡＰ１２ポリペプチドのアミノ酸のうちの任意のものを付加、欠失、または置換させる、１つまたは複数（すなわち、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多く）の点突然変異を有する、配列番号９の機能的変異体である、請求項１～１５のいずれかに記載の免疫応答性細胞。
【請求項17】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドの機能的変異体が、前記配列番号９のアミノ酸配列を有するポリペプチドの切断バージョンである、請求項１～１６のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項18】
前記ＤＡＰ１２の切断バージョンが、配列番号９のアミノ酸２２～１１３、６２～１１３、２２～６１、または４１～６１を含む、またはそれからなる、請求項１７に記載の免疫応答性細胞。
【請求項19】
前記ＤＡＰ１２ポリペプチドまたは前記その機能的変異体が、配列番号９～１３のうちの任意の１つを含む、またはそれからなる、請求項１～１４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項20】
前記ＤＡＰ１０ポリペプチドまたは前記その機能的変異体と前記ＤＡＰ１２ポリペプチドまたは前記その機能的変異体とがリンカーによって結合されている、請求項１～１９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項21】
前記リンカーが、配列番号１８～４６のうちの任意のものに列挙されているアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項２０に記載の免疫応答性細胞。
【請求項22】
前記リンカーが、配列番号３３または３８～４４のうちの任意のものに列挙されているアミノ酸配列を含む、またはそれからなる、請求項２０または請求項２１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項23】
前記融合ポリペプチドがＮ末端配列を含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項24】
前記融合ポリペプチドがＣ末端配列を含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項25】
前記Ｎ末端またはＣ末端配列が、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、Ａｒｇタグ、Ｔ７タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｓタグ、ＡｖｉＴａｇ（商標）、アプタマータグ、ｍｙｃタグ、ＣＤ８αリーダー配列、４－１ＢＢエンドドメイン、Ｖ５タグ、またはＣＤ２７エンドドメインのうちの１つまたは複数を含む、請求項２３または請求項２４に記載の免疫応答性細胞。
【請求項26】
前記Ｎ末端またはＣ末端配列が、ＣＤ８αリーダー配列、４－１ＢＢエンドドメイン、またはＣＤ２７エンドドメインのうちの１つまたは複数を含む、請求項２５に記載の免疫応答性細胞。
【請求項27】
前記融合ポリペプチドが、配列番号６０～６３のうちの任意の１つの配列を含む、またはそれからなる、請求項１～２６のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項28】
前記融合ポリペプチドが：（ａ）配列番号８４を含まない；ならびに／または
（ｂ）抗ＥｐＣＡＭペプチドを含まない；ならびに／または
（ｃ）配列番号８５を含まない；ならびに／または
（ｄ）配列番号８６を含まない；ならびに／または
（ｅ）配列番号８５および配列番号８６の両方は含まない
、請求項１～８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項29】
前記融合ポリペプチドが、そのＣ末端でヒトＤＡＰ１２ポリペプチドのエンドドメインと融合した完全長ヒトＤＡＰ１０を含む、またはそれからなり、前記エンドドメインが、ヒトＤＡＰ１２のアミノ酸６２～１１３によってコードされている、請求項１～２８のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項30】
前記融合ポリペプチドが配列番号６０の配列を有する、請求項１～２９のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項31】
前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号８７の配列と少なくとも約８５％の配列同一性を有する、請求項１～３０のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項32】
前記ＣＸＣＲ２ポリペプチドが配列番号８７のアミノ酸配列を有する、請求項３１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項33】
前記免疫応答性細胞がＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である、請求項１～３２のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項34】
前記免疫応答性細胞がαβ Ｔ細胞、γδ Ｔ細胞、ＣＤ４＋ Ｔ細胞、ＣＤ８＋ Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、またはその任意の組合せである、請求項３３に記載の免疫応答性細胞。
【請求項35】
（ａ）ＮＫＧ２Ｄポリペプチドと；（ｂ）（ｉ）ＤＮＡＸ活性化１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその機能的変異体および（ｉｉ）ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその機能的変異体を含む融合ポリペプチドと；
（ｃ）ＣＸＣＲ２ポリペプチドと
をコードしている核酸分子。
【請求項36】
前記核酸分子がキメラポリヌクレオチドである、請求項３５に記載の核酸分子。
【請求項37】
前記核酸分子が５’から３’に、（ｉ）前記ヒトＤＡＰ１２のエンドドメインとインフレームのヒトＤＡＰ１０、（ｉｉ）第１のプロテアーゼ切断部位、（ｉｉｉ）第１のリンカー、（ｉｖ）第１のリボソームスキップペプチド、（ｖ）ヒトＮＫＧ２Ｄ、（ｖｉ）第２のプロテアーゼ切断部位、（ｖｉｉｉ）第２のリンカー、（ｖｉｉｉ）第２のリボソームスキップペプチド、および（ｉｘ）ヒトＣＸＣＲ２をコードしている、請求項３６に記載の核酸分子。
【請求項38】
前記核酸分子が配列番号８８のヌクレオチド配列を含む、請求項３５～３７のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項39】
前記核酸が配列番号９１のヌクレオチド配列を有する、請求項３５～３８のいずれか一項に記載の核酸分子。
【請求項40】
請求項３５～３９のいずれか一項に記載の核酸配列を含むベクター。
【請求項41】
前記ベクターがレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項４０に記載のベクター。
【請求項42】
前記ベクターがＳＦＧレトロウイルスベクターである、請求項４１に記載のベクター。
【請求項43】
（ａ）Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を、請求項３５～３９のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項４０～４２のいずれか一項に記載のベクターで形質導入するステップと、（ｂ）前記形質導入した細胞がＮＫＧ２Ｄポリペプチド、ＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチド、およびＣＸＣＲ２ポリペプチドを発現し、前記ＮＫＧ２ＤポリペプチドおよびＤＡＰ１０／ＤＡＰ１２融合ポリペプチドが前記細胞膜中で会合するように、前記Ｔ細胞またはナチュラルキラー細胞を培養するステップと
を含む、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を作製する方法。
【請求項44】
対象に、治療上有効な量の請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞を投与するステップを含む、癌を有する対象を処置する方法。
【請求項45】
前記免疫応答性細胞を、前記対象の自家であるＴまたはＮＫ細胞から製造する、請求項４４に記載の方法。
【請求項46】
前記癌が固形腫瘍癌である、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【請求項47】
前記固形腫瘍癌が、肝臓癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、リンパ系癌、結腸癌、腎臓癌、骨癌、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚もしくは眼内悪性黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部癌、胃癌、精巣癌、子宮癌、甲状腺癌、食道癌、小腸癌、またはそれらの任意の組合せである、請求項４６に記載の方法。
【請求項48】
前記固形腫瘍癌が卵巣癌である、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
癌の処置または予防において使用するための、請求項１～３４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項50】
（ａ）ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインまたはその変異体およびネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインまたはその変異体を含む、キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドと；（ｂ）ＣＸＣＲ２ポリペプチドと；
（ｃ）少なくとも１つのＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ポリペプチドまたはその変異体および少なくとも１つのＤＮＡＸ活性化タンパク質１０（ＤＡＰ１０）ポリペプチドまたはその変異体と
を含む免疫応答性細胞。
【請求項51】
前記ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインが、配列番号９５、配列番号９６、または配列番号９７に記載の配列を有する、請求項５０に記載の免疫応答性細胞。
【請求項52】
前記ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインが、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、または配列番号１０１に記載の配列を有する、請求項５０または請求項５１に記載の免疫応答性細胞。
【請求項53】
前記キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドが前記ヒトＮＫＧ２Ｄ細胞外ドメインの変異体を含み、前記変異体が、配列番号９５、９６、または９７のうちの任意のものと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項５０に記載の免疫応答性細胞。
【請求項54】
前記キメラＮＫＧ２Ｄポリペプチドが前記ネズミＮＫＧ２Ｄ膜貫通ドメインの変異体を含み、前記変異体が、配列番号９８、９９、１００、または１０１のうちの任意のものと少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項５０～５１または請求項５３のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。
【請求項55】
前記細胞が配列番号１０２に記載の配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドを含む、請求項５０～５４のいずれか一項に記載の免疫応答性細胞。【国際調査報告】