特表 2024-511096 がんを治療するための薬学的組み合わせ物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-12

(54)【発明の名称】がんを治療するための薬学的組み合わせ物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/74 20150101AFI20240305BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240305BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20240305BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240305BHJP

   C07K 14/195 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 38/17 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240305BHJP

   C12N 15/60 20060101ALN20240305BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240305BHJP

【ＦＩ】

A61K35/74 A

C12N1/21 ZNA

C07K19/00

C12N9/88

C07K16/28

C07K14/195

A61K38/17

A61K39/395 N

A61P35/00

A61P43/00 121

C12N15/13

C12N15/60

C12N15/62 Z

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558268

(86)(22)【出願日】2022-03-24

(85)【翻訳文提出日】2023-11-16

(86)【国際出願番号】 EP2022057752

(87)【国際公開番号】W WO2022200493

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】21164882.9

(32)【優先日】2021-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523157896

【氏名又は名称】ティースリー ファーマシューティカルズ アーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】110002077

【氏名又は名称】園田・小林弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】イッティ， シモン

(72)【発明者】

【氏名】カスペル， クリストフ

(72)【発明者】

【氏名】ソープ， ファルク

(72)【発明者】

【氏名】アムスタッツ， マーリーズ

(72)【発明者】

【氏名】デュヴァル， メロディ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C085

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA26X

4B065AA26Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C084AA02

4C084BA44

4C084DC50

4C084MA02

4C084NA05

4C084ZB022

4C084ZB032

4C084ZB092

4C084ZB261

4C084ZC751

4C085AA13

4C085AA14

4C085BB11

4C085DD62

4C085EE01

4C085GG01

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BC32

4C087CA09

4C087CA12

4C087MA02

4C087MA66

4C087NA05

4C087ZB02

4C087ZB03

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZC75

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

本発明は、組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む薬学的組み合わせ物、ならびに対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法におけるそれらの使用に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む薬学的組み合わせ物。

【請求項2】

異種タンパク質またはその断片が、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するタンパク質またはその断片である、請求項１に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項3】

異種タンパク質またはその断片が、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーまたはその断片、抗ウイルスシグナル伝達およびＩ型ＩＦＮ誘導に関与する他のＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質またはその断片、ならびにＳＴＩＮＧの刺激をもたらす、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素からなる群から選択されるＩ型ＩＦＮ応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質またはその断片である、請求項１に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項4】

異種タンパク質またはその断片が、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択されるＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質またはその断片である、請求項１に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項5】

ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＩＤＯ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）、ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭ、ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２、ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｃ（ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）；ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７、ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１、ＴＤＯ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項6】

ＩＣＭが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の阻害剤である、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項7】

ＩＣＭが、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ－４アンタゴニストである、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項8】

ＰＤ－１アンタゴニストが、アンタゴニストＰＤ－１抗体である、請求項７に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項9】

アンタゴニストＰＤ－１抗体が、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、レチファンリマブ、プロルゴリマブ（ＢＣＤ－１００）、セルプルリマブ（ＨＬＸ１０）、スパルタリズマブ、ＡＫ１０５、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、およびスゲマリマブからなる群から選択される、請求項８に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項10】

ＣＴＬＡ－４アンタゴニストが、アンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である、請求項７に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項11】

アンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体が、イピリムマブおよびトレメリムマブから選択される、請求項１０に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項12】

組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項13】

医薬としての使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項14】

対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法における使用のための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の薬学的組み合わせ物。

【請求項15】

第１の容器、第２の容器および添付文書を含む部材のキットであって、第１の容器が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株を含む少なくとも１用量の医薬を含み、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列はプロモーターに動作可能に連結されており、第２の容器が、免疫チェックポイント阻害剤（ＩＣＭ）を含む少なくとも１用量の医薬を含み、添付文書が、任意選択で、医薬を使用して対象のがんを治療するための指示を含む、キット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む薬学的組み合わせ物、ならびに対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法におけるそれらの使用に関する。

【背景技術】

【0002】

一般的に、増え続けるがん療法、および特に、組み合わせがん療法の数にもかかわらず、がんは、依然として、心血管疾患および感染性疾患／寄生虫病に次ぐ世界で３番目の一般的な死因であり；絶対数では、これは、任意の所与の年において７６０万人の死亡（全死亡のおよそ１３％）に相当する。ＷＨＯは、がん起因する死亡が、２０３０年までに１３１０万人に増加すると推定している。これらの統計は、がんが重要な健康状態のままであること、および新しい治療についての緊急の必要性が存在するという事実を示す。最近の手法において、免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）が、がんの治療のために使用されている。過去６年間では、４つの操作されたモノクローナル抗体免疫チェックポイント阻害剤の薬剤が、６つの形態のがんに対して５０超の世界市場において承認されている；ＰＤ－１に基づく療法で最大で４０～５０％の奏効率で、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）、ペムブロリズマブおよびニボルマブ（抗ＰＤ－１）、およびアテゾリズマブ（抗ＰＤ－Ｌ１）。しかしながら、現在のチェックポイント阻害剤単剤療法による治療は、より突然変異負荷が低いおよび／またはより免疫原性が低い腫瘍が、この形態の療法に対して本質的に耐性であることがあるので、すべてのがん型に有効というわけではない。非常に有効な免疫調節剤と一般に考えられているＣＰＩは、多くの腫瘍型において比較的低い奏効率を生じ（平均で＜２０％）；（Ｃａｒｒｅｔｅｒｏ－Ｇｏｎｚａｌｅｚら、２０１８）、ある特定のがんは、それらに全く応答しないように見える。したがって、チェックポイント阻害剤を使用する場合、単剤チェックポイント遮断から利益を受けない運命にある患者の割合を、長期間生存に変換する必要性が存在する。

【0003】

がんにおける併用療法についての論理的根拠は、通常、異なるメカニズムによって働く薬物を使用し、それによって、耐性がん細胞が発生する可能性を減少させることである。他方で、がんなどの所与の状態を治療するための２つ以上の薬物の投与は、一般に、薬物間の複雑なインビボ相互作用に起因して多くの潜在的な問題を生じる。任意の単一の薬物の効果は、その吸収、分布、および排泄に関連する。２つの薬物が身体に導入されると、それぞれの薬物は、他のものの吸収、分布、および排泄に影響を与え、そのため、他のものの効果を変更することができる。例えば、１つの薬物は、他の薬物の排泄の代謝経路に関与する酵素の産生を阻害、活性化または誘導し得る。したがって、２つの薬物が同じ状態を治療するために投与される場合、それぞれが、対象における他のものの治療活性を補完するか、それに対して効果を有さないか、またはそれに干渉するかどうかは予測不能である。２つの薬物間の相互作用は、それぞれの薬物の意図される治療活性に影響を与えることがあるだけでなく、相互作用は、毒性代謝産物のレベルを増加させることがある。相互作用は、それぞれの薬物の副作用を高めるか、または減らすこともある。そのため、疾患を治療するための２つの薬物の投与の際に、それぞれの薬物の副作用プロファイルにどのような悪化または改善のいずれかの変化が起こるかは予測不能である。加えて、２つの薬物間の相互作用の効果がいつ現れるかを正確に予測することは困難である。例えば、薬物間の代謝相互作用は、第２の薬物の最初の投与の際に、その２つが定常状態の濃度に達した後に、または薬物の一方の中止の際に明らかになり得る。したがって、２つ以上の薬物の併用療法の効果は、容易に予測することができない。

【発明の概要】

【0004】

ここに、異種タンパク質をコードする組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む組み合わせ物が、がんの予防、進行の遅延または治療のために有用であることが予想外に見出された。前記組み合わせ物による治療が相乗的な抗腫瘍効果を提供することが予想外に見出された。

【0005】

これらの予期外の知見を考慮して、本発明者らは、本発明を、その以下の態様で、ここに提供する。

【0006】

第１の態様において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む薬学的組み合わせ物を提供する。

【0007】

第２の態様において、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物を提供する。

【0008】

第３の態様において、本発明は、対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法における使用のための、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物を提供する。

【0009】

第４の態様において、本発明は、第１の容器、第２の容器および添付文書を含む部材のキットであって、第１の容器が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株を含む少なくとも１用量の医薬を含み、第２の容器が、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＩＣＭ）を含む少なくとも１用量の医薬を含み、添付文書が、任意選択で、医薬を使用するがんについて対象を治療するための指示を含む、キットを提供する。

【図面の簡単な説明】

【0010】

【図1】エルシニア・エンテロコリチカ（Yersinia enterocolitica）ｐＹＶ－ＭＲＳ４０病原性プラスミド、ｐＹＶ。一定の縮尺で描かれたＭＲＳ４０株のエルシニア属（Yersinia）病原性の７５’１１５ｂｐのプラスミド（ｐＹＶ）。選択されたＴ３ＳＳ機構、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質、複製開始点およびヒ素耐性（遺伝子ａｒｓＣ、Ｂ、ＲおよびＨによってコードされる）を示す：Ｉ．複製起点５３．．．２０３；ＩＩ．ＹｏｐＯ ７３７７．．．９５６６；ＩＩＩ．ＹｏｐＰ １０３１１．．．１１１７７；ＩＶ．ＹｏｐＱ １２９２０．．．１３４６８；Ｖ．ＹｏｐＴ １３９８９．．．１４９５７；ＶＩ．ｓｙｃＴ １４９５７．．．１５３４９；ＶＩＩ．ＹｏｐＭ １８９２６．．．２００２９；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＤ ２１２８３．．．２２２０３；ＩＸ．ＹｏｐＢ ２２２２２．．．２３４２７；Ｘ．ｓｙｃＤ ２３４０５．．．２３９１１；ＸＩ．ＹｏｐＨ ４７８８２．．．４９２８８；ＸＩＩ．ｓｙｃＨ ４９５１６．．．４９９４１；ＸＩＩＩ．ｓｙｃＥ ５１５５２．．．５１９４４；ＸＩＶ．ＹｏｐＥ ５２１３７．．．５２７９６；ＸＶ．ｙａｄＡ ６２２１５．．．６３６７８；ＸＶＩ．ａｒｓＣ ６７１６４．．．６７５８９；ＸＶＩＩ．ａｒｓＢ ６７６０２．．．６８８９１；ＸＶＩＩＩ．ａｒｓＲ ６８９３７．．．６９２５７；ＸＩＸ．ａｒｓＨ ６９３４３．．．７００４１

【図2】改変エルシニア・エンテロコリチカＭＲＳ４０病原性プラスミド、ｐＹＶ－Ｙ００４、一定の縮尺で描かれた７１’４０８ｂｐのｐＹＶ－Ｙ００４。選択されたＴ３ＳＳ機構、破壊されたＴ３ＳＳエフェクタータンパク質、複製開始点およびヒ素耐性遺伝子（遺伝子ａｒｓＣ、Ｂ、ＲおよびＨによってコードされる）を示す。Ｉ．複製起点５３．．．２０３；ＩＩ．破壊されたＹｏｐＯ ７４０９．．．８１１６；ＩＩＩ．破壊されたＹｏｐＰ ８５９７．．．８９４９；ＩＶ．ＹｏｐＱ １０６９２．．．１１２４０；Ｖ．破壊されたＹｏｐＴ １１７６１．．．１２３０１；ＶＩ．ｓｙｃＴ １２３０１．．．１２６９３；ＶＩＩ．破壊された（ｄｉｒｓｕｐｔｅｄ）ＹｏｐＭ １６２７０．．．１７３７５；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＤ １８６２９．．．１９５４９；ＩＸ．ＹｏｐＢ １９５６８．．．２０７７３；Ｘ．ｓｙｃＤ ２０７５１．．．２１２５７；ＸＩ．破壊されたＹｏｐＨ ４５２１３．．．４５５６３；ＸＩＩ．ｓｙｃＨ ４５７９１．．．４６２１６；ＸＩＩＩ．ｓｙｃＥ ４７８２７．．．４８２１９；ＸＩＶ．破壊されたＹｏｐＥ ４８４２６．．．４９０８９；ＸＶ．ｙａｄＡ ５８５０８．．．５９９７１；ＸＶＩ．ａｒｓＣ ６３４５７．．．６３８８２；ＸＶＩＩ．ａｒｓＢ ６３８９５．．．６５１８４；ＸＶＩＩＩ．ａｒｓＲ ６５２３０．．．６５５５０；ＸＩＸ．ａｒｓＨ ６５６３６．．．６６３３４

【図3】それぞれ、ｙｏｐＨおよびｙｏｐＥの内因性部位において内因性ｐＹＶプラスミドにおいてコードされるＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２をコードする、改変エルシニア・エンテロコリチカＭＲＳ４０病原性プラスミド、ｐＹＶ－Ｙ０５１。一定の縮尺で描かれた７３’０７３ｂｐのｐＹＶ－０５１。選択されたＴ３ＳＳ機構、破壊されたＴ３ＳＳエフェクタータンパク質、カーゴタンパク質（インフレームでｈＲｉｇＩ ＣＡＲＤ２ドメインを有するＹｏｐＥ_{１－１３８}およびインフレームでｈｃＧＡＳ_{１６１－５２２}を有するＹｏｐＥ_{１－１３８}（コドン変更））、複製開始点およびヒ素耐性遺伝子（遺伝子ａｒｓＣ、Ｂ、ＲおよびＨによってコードされる）を示す：Ｉ．複製起点５３．．．２０３；ＩＩ．破壊されたＹｏｐＯ ７４０９．．．８１１６；ＩＩＩ．破壊されたＹｏｐＰ ８５９７．．．８９４９；ＩＶ．ＹｏｐＱ １０６９２．．．１１２４０；Ｖ．破壊されたＹｏｐＴ １１７６１．．．１２３０１；ＶＩ．ｓｙｃＴ １２３０１．．．１２６９３；ＶＩＩ．破壊された（ｄｉｒｓｕｐｔｅｄ）ＹｏｐＭ １６２７０．．．１７３７５；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＤ １８６２９．．．１９５４９；ＩＸ．ＹｏｐＢ １９５６８．．．２０７７３；Ｘ．ｓｙｃＤ ２０７５１．．．２１２５７；ＸＩ．ＹｏｐＨ：：ＹｏｐＥ_{１－１３８}（コドン適応）－ｈｃＧＡＳ_{１６１－５２２}；４５２２８．．．４６７４２；ＸＩＩ．ｓｙｃＨ ４６９７０．．．４７３９５；ＸＩＩＩ．ｓｙｃＥ ４９００６．．．４９３９８；ＸＩＶ．ＹｏｐＥ：：ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ｈＲｉｇＩ（ＣＡＲＤ２）４９５９１．．．５０７５４；ＸＶ．ｙａｄＡ ６０１７３．．．６１６３６；ＸＶＩ．ａｒｓＣ ６５１２２．．．６５５４７；ＸＶＩＩ．ａｒｓＢ ６５５６０．．．６６８４９；ＸＶＩＩＩ．ａｒｓＲ ６６８９５．．．６７２１５；ＸＩＸ．ａｒｓＨ ６７３０１．．．６７９９９；

【図4】ベクターｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２の説明。ＹｏｐＥ_{１－１３８}との融合コンストラクトを作成するために使用されたクローニングプラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２（５’０８５ｂｐ（ｐｂ））のベクターマップ。シャペロンＳｙｃＥおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}融合物は、ネイティブＹ．エンテロコリチカプロモーター下である。Ｉ．ａｒａＢＡＤプロモーター領域４．．．２７９；ＩＩ．ＰＢＡＤ ２５０．．．２７７；ＩＩＩ．ＭＣＳ Ｉ ３１７．．．３３１；ＩＶ．ｓｙｃＥ ３３９．．．７３１；Ｖ．ＹｏｐＥ１－１３８ ９２４．．．１３３７；ＶＩ．ＭＣＳ ＩＩ １３３８．．．１３６１；ＶＩＩ．Ｍｙｃタグ１３６８．．．１３９７；ＶＩＩＩ．６×ｈｉｓタグ１４１３．．．１４３０；ＩＸ．停止１４３１．．．１４３３；Ｘ．ｒｒｎＢ １５３６．．．１６９３；ＸＩ．ｒｒｎＢ Ｔ２ １８３４．．．１８６１；ＸＩＩ．ＡｍｐＲ １９７２．．．２８３２；ＸＩＩＩ．ｐＢＲ３２２起点２９８１．．．３６０９；ＸＩＶ．ａｒａＣ ４１８１．．．５０５９；

【図5】ベクターｐＴ３Ｐ－４５４の説明。 コドン最適化ＹｏｐＥ_{１－１３８}との融合物Ｒｉｇ１－ＣＡＲＤ_２（マウス_{１－２４６}）をコードする中コピー数クローニングプラスミドｐＴ３Ｐ－４５４（５’８１８ｂｐ（ｐｂ））のベクターマップ。シャペロンＳｙｃＥおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}融合物は、ネイティブＹ．エンテロコリチカプロモーター下である。Ｉ．ａｒａＢＡＤプロモーター領域４．．．２７９；ＩＩ．ＰＢＡＤ ２５０．．．２７７；ＩＩＩ．ＭＣＳ Ｉ ３１７．．．３３１；ＩＶ．ＳｙｃＥ ３３９．．．７３１；Ｖ．ＹｏｐＥ１－１３８ ９２４．．．１３３７；ＶＩ．停止コドンで終結するＲｉｇ１－ＣＡＲＤドメイン １３４９．．．２０８７；ＶＩＩ．Ｍｙｃタグ２１０１．．．２１３０；ＶＩＩＩ．６×ｈｉｓタグ２１４６．．．２１６３；ＩＸ．第２の停止２１６４．．．２１６６；Ｘ．ｒｒｎＢ ２２６９．．．２４２６；ＸＩ．ｒｒｎＢ Ｔ２ ２５６７．．．２５９４；ＸＩＩ．アンピシリン耐性遺伝子２７０５．．．３５６５；ＸＩＩＩ．ｐＢＲ３２２起点３７１４．．．４３４２；ＸＩＶ．ａｒａＣ ４９１４．．．５７９２

【図6】ベクターｐＴ３Ｐ－４５３の説明。 コドン最適化ＹｏｐＥ_{１－１３８}との融合物Ｒｉｇ１－ＣＡＲＤ_２（マウス_{１－２４５}）をコードする中コピー数クローニングプラスミドｐＴ３Ｐ－４５３（５’８１５ｂｐ（ｐｂ））のベクターマップ。シャペロンＳｙｃＥおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}融合物は、ネイティブＹ．エンテロコリチカプロモーター下である。Ｉ．ａｒａＢＡＤプロモーター領域４．．．２７９；ＩＩ．ＰＢＡＤ ２５０．．．２７７；ＩＩＩ．ＭＣＳ Ｉ ３１７．．．３３１；ＩＶ．ＳｙｃＥ ３３９．．．７３１；Ｖ．ＹｏｐＥ１－１３８ ９２４．．．１３３７；ＶＩ．停止コドンで終結するヒトＲｉｇ１－ＣＡＲＤドメイン １３５０．．．２０８７；ＶＩＩ．Ｍｙｃタグ２０９８．．．２１２７；ＶＩＩＩ．６×ｈｉｓタグ２１４３．．．２１６０；ＩＸ．第２の停止２１６１．．．２１６３；Ｘ．ｒｒｎＢ ２２６６．．．２４２３；ＸＩ．ｒｒｎＢ Ｔ２ ２５６４．．．２５９１；ＸＩＩ．アンピシリン耐性遺伝子２７０２．．．３５６２；ＸＩＩＩ．ｐＢＲ３２２起点３７１１．．．４３３９；ＸＩＶ．ａｒａＣ ４９１１．．．５７８９

【図7】ベクターｐＴ３Ｐ－７１５の説明。ＹｏｐＥ_{１－１３８}との融合コンストラクトを作成するために使用された中コピー数クローニングプラスミドｐＴ３Ｐ－７１５（４’１４９ｂｐ）のベクターマップ。シャペロンＳｙｃＥおよびＹｏｐＥ１－１３８融合物は、ネイティブＹ．エンテロコリチカプロモーター下である。Ｉ．ａｒａＢＡＤプロモーター領域４．．．２７９；ＩＩ．ＰＢＡＤ ２５０．．．２７７；ＩＩＩ．ＭＣＳ Ｉ ３１７．．．３３１；ＩＶ．ｓｙｃＥ ３３９．．．７３１；Ｖ．ＹｏｐＥ１－１３８ ９２４．．．１３３７；ＶＩ．ＭＣＳ ＩＩ １３３８．．．１３６１；ＶＩＩ．Ｍｙｃタグ１３６８．．．１３９７；ＶＩＩＩ．６×ｈｉｓタグ１４１３．．．１４３０；ＩＸ．停止１４３１．．．１４３３；Ｘ．ｒｒｎＢ １５３６．．．１６９３；ＸＩ．ｒｒｎＢ Ｔ２ １８３４．．．１８６１；ＸＩＩ．クロラムフェニコール耐性遺伝子２１１０．．．２７６６；ＸＩＩＩ．ｐＢＲ３２２起点２９２４．．．３５５２；

【図8】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするベクターｐＴ３Ｐ－７５１の説明。ｙｏｐＥプロモーターの制御下の１つのオペロンにおけるＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２をコードする中コピー数ベクターｐＴ３Ｐ－７５１（６’４０７ｂｐ）のベクターマップ。Ｉ．ａｒａＢＡＤプロモーター領域４．．．２７９；ＩＩ．ＰＢＡＤ ２５０．．．２７７；ＩＩＩ．ＭＣＳ Ｉ ３１７．．．３３１；ＩＶ．ＳｙｃＥ ３３９．．．７３１；Ｖ．ＹｏｐＥ１－１３８ ９２４．．．１３３７；ＶＩ．停止コドンで終結するヒトＲｉｇ１－ＣＡＲＤドメイン １３５０．．．２０８７；ＶＩＩ．ｙｏｐＥ１－１３８（コドン変更）２１０１．．．２５１４；ＶＩＩＩ．停止コドンで終結するｈ＿ｃＧＡＳ１６１－５２２ ２５２７．．．３６１４；ＩＸ．Ｍｙｃタグ３６２６．．．３６５５；Ｘ．６×ｈｉｓタグ３６７１．．．３６８８；ＸＩ．第３の停止３６８９．．．３６９１；ＸＩＩ．ｒｒｎＢ ３７９４．．．３９５１；ＸＩＩＩ．ｒｒｎＢ Ｔ２ ４０９２．．．４１１９；ＸＩＶ．クロラムフェニコール耐性遺伝子４３６８．．．５０２４；ＸＶ．ｐＢＲ３２２起点５１８２．．．５８１０；

【図9】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍進行。ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ｍＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または対照として滅菌ＰＢＳを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３の体積（９２ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。平均腫瘍体積（群あたりｎ＝１５動物）を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。データは、それぞれの群が、最初のマウスの５０％未満の生存を含むまで表す。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図10】対照群のＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍進行。ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、滅菌ＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３の体積（９２ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図11】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療された、ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍進行。ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、滅菌ＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３の体積（９２ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図12】抗ＰＤ－１抗体で治療された、ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍進行。ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３の体積（９２ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図13】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴおよび抗ＰＤ－１抗体の組み合わせで治療された、ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍進行。ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３の体積（９２ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図14】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスの生存の確率。ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３の体積（９２ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。 数日（ＩＩ）にわたるそれぞれの群についての生存の確率（Ｉ、％）を表す。最初の治療の日を、０日目として定義する。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図15】ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植することによってチャレンジ／再チャレンジされた、ナイーブまたは以前に完全もしくは部分的腫瘍縮小を経験した野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスにおける腫瘍進行。最初のＥＭＴ６腫瘍が検出不能であったか（０ｍｍ^３）、または２５ｍｍより小さかった、ナイーブまたはすべての生存中マウスのいずれかの野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、反対側の脇腹にＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植することによってチャレンジ／再チャレンジした。反対側の脇腹の平均腫瘍体積（再チャレンジ腫瘍）を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義し、再チャレンジを６６日目（ＩＩＩ）に行った。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。群を、ＩＶ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ（Ｎ＝４）；Ｖ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１（Ｎ＝１）；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１（Ｎ＝７）；ＶＩＩ．ナイーブマウス（Ｎ＝１０）として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図16】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。データは、それぞれの群が、最初のマウスの５０％未満の生存を含むまで表す。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。平均腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図17】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＣＴＬＡ－４抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＣＴＬＡ－４抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。データは、それぞれの群が、最初のマウスの５０％未満の生存を含むまで表す。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。平均腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＣＴＬＡ－４；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＣＴＬＡ－４として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図18】対照群のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、滅菌ＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図19】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、滅菌ＰＢＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図20】抗ＰＤ－１抗体で治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図21】抗ＣＴＬＡ－４抗体で治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＣＴＬＡ－４抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図22】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴおよび抗ＰＤ－１抗体の組み合わせで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図23】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴおよび抗ＣＴＬＡ－４抗体の組み合わせで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＣＴＬＡ－４抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（７１ｍｍ^３＋／－２５の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。

【図24】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存の確率。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。数日（ＩＩ）にわたるそれぞれの群についての生存の確率（Ｉ、％）を表す。最初の治療の日を、０日目として定義する。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図25】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＣＴＬＡ－４抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存の確率。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＣＴＬＡ－４抗体（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。数日（ＩＩ）にわたるそれぞれの群についての生存の確率（Ｉ、％）を表す。最初の治療の日を、０日目として定義する。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、およびｄ１１において行った。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＣＴＬＡ－４；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＣＴＬＡ－４として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図26】対照群のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、対照ＩｇＧ（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、４０～１２０ｍｍ^３の体積（６６ｍｍ^３＋／－２２の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｖ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ９、ｄ１３、ｄ１６において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ６およびｄ９において行った。^＊ｄ１０において５頭のマウスを屠殺した。

【図27】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、対照ＩｇＧ（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、４０～１２０ｍｍ^３の体積（６６ｍｍ^３＋／－２２の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｖ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ９、ｄ１３、ｄ１６において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ６およびｄ９において行った。^＊ｄ１０において５頭のマウスを屠殺した。

【図28】抗ＰＤ－１抗体で治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳを静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、４０～１２０ｍｍ^３の体積（６６ｍｍ^３＋／－２２の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｖ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ９、ｄ１３、ｄ１６において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ６およびｄ９において行った。^＊ｄ１０において５頭のマウスを屠殺した。

【図29】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴおよび抗ＰＤ－１抗体の組み合わせで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける腫瘍進行。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、１×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。腫瘍が、４０～１２０ｍｍ^３の体積（６６ｍｍ^３＋／－２２の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１５）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｖ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ９、ｄ１３、ｄ１６およびｄ２０において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ６およびｄ９において行った。^＊ｄ１０において５頭のマウスを屠殺した。

【図30】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの生存の確率。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または１×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体または対照ＩｇＧ（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。数日（ＩＩ）にわたるそれぞれの群についての生存の確率（Ｉ、％）を表す。最初の治療の日を、０日目として定義する。ｉ．ｖ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ９、ｄ１３、ｄ１６およびｄ２０において行い、ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ６およびｄ９において行った。 群を、Ｖ．ＰＢＳ＋対照ＩｇＧ；ＶＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋対照ＩｇＧ；ＶＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＶＩＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。^＊群あたり５頭のマウスをｄ１０において屠殺し、そのため、これらの算出において考慮しなかった。

【図31】中コピー数ベクターにおいてコードされるＩ型ＩＦＮを誘導するタンパク質の送達。ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２またはマウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２の送達は、Ｂ１６Ｆ１メラニン形成細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達の誘導に至る。Ｂ１６Ｆ１ ＩＦＮレポーター細胞を、カーゴを送達しないか（ＩＩＩ）、または中コピー数ベクターＩＶ：ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２、Ｖ：ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２をコードする対照株のいずれかのＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで、感染させた。細胞に添加される細菌の用量設定を、それぞれの株について行い、感染多重度（ＭＯＩ）としてＩに示した。ＩＦＮ刺激を、多量体ＩＳＲＥによって増強されたＩＦＮ誘発性ＩＳＧ５４プロモーターで構成されるＩ－ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある分泌されたアルカリホスファターゼ（ＩＩ：ＯＤ_６５０）の活性に基づいて評価した。

【図32】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、ＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける平均腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でオペロンとしてコードされる）の両方においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１（ラットＩｇＧ２ａ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）、ならびに適切な場合、対照ＩｇＧ２ａアイソタイプおよび／または対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。平均腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ａ ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ８、およびｄ１２において行い、ＩｇＧ２ｂ治療（Ｖ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。データは、それぞれの群が、最初のマウスの６０％未満の生存を含むまで表す。 群を、群あたり１３頭の動物で、ＶＩ．ＰＢＳ＋対照ＩｇＧ２ａアイソタイプ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＶＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＶＩＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＩＸ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図33】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、ＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける平均腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でオペロンとしてコードされる）の両方においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－Ｌ１（ラットＩｇＧ２ｂ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）、または対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ、および適切な場合、対照ＩｇＧ２ａアイソタイプを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。データは、それぞれの群が、最初のマウスの６０％未満の生存を含むまで表す。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。平均腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ａ ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ８、およびｄ１２において行い、ＩｇＧ２ｂ治療（Ｖ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。 群を、群あたり１３頭の動物で、ＶＩ．ＰＢＳ＋対照ＩｇＧ２ａアイソタイプ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＶＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＶＩＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－Ｌ１；ＩＸ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－Ｌ１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図34】対照群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプ（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１３）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ａのｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ８、およびｄ１２において行い、ＩｇＧ２ｂのｉ．ｐ．治療（Ｖ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。

【図35】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でオペロンとしてコードされる）の両方においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、ＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１３）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ｂのｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。

【図36】抗ＰＤ－１抗体で治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１（ラットＩｇＧ２ａ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１３）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ａ抗ＰＤ－１のｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ８、およびｄ１２において行った。

【図37】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、ならびに抗ＰＤ－１抗体の組み合わせで治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でオペロンとしてコードされる）の両方においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１（ラットＩｇＧ２ａ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１３）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ａ抗ＰＤ－１のｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ８、およびｄ１２において行った。

【図38】抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳを腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－Ｌ１（ラットＩｇＧ２ｂ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１３）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ｂのｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。

【図39】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、ならびに抗ＰＤ－Ｌ１抗体の組み合わせで治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける腫瘍進行。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でオペロンとしてコードされる）の両方においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－Ｌ１（ラットＩｇＧ２ｂ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。個々の動物（ｎ＝１３）の腫瘍体積を、ｍｍ^３として示す（Ｉ）。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ｂのｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。

【図40】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、ならびに／または抗ＰＤ－１抗体で治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける最適な腫瘍成長阻害効果。腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％、Ｉ）は、治療された動物の腫瘍体積中央値対対照動物（滅菌ＰＢＳ／対照ＩｇＧアイソタイプの注射）の腫瘍体積中央値の比として定義される。最適な値は、達成された最大の腫瘍成長阻害を反映する最小Ｔ／Ｃ％比である。それぞれの考慮される最適な日（ＩＩＩ）における生きているマウスの数（ＩＩ）を示す。Ｔ／Ｃ％比を、以下の通り分類した：６０～１００％：抗腫瘍活性なし（ＩＶ）、３０～６０％：最低限の抗腫瘍活性（Ｖ）、１０～３０％：中程度の抗腫瘍活性（ＶＩ）、０～１０％：著しい抗腫瘍活性（ＶＩＩ）。 群を、ＶＩＩＩ．ＰＢＳ＋対照ＩｇＧ２ａアイソタイプ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＩＸ．ＹｏｐＥ１－１３８－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２およびＹｏｐＥ１－１３８－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；Ｘ．ＹｏｐＥ１－１３８－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２およびＹｏｐＥ１－１３８－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１、ＸＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図41】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、ならびに／または抗ＰＤ－Ｌ１抗体で治療された群のＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスにおける最適な腫瘍成長阻害効果。腫瘍成長阻害（Ｔ／Ｃ％、Ｉ）は、治療された動物の腫瘍体積中央値対対照動物（滅菌ＰＢＳ／対照ＩｇＧアイソタイプの注射）の腫瘍体積中央値の比として定義される。最適な値は、達成された最大の腫瘍成長阻害を反映する最小Ｔ／Ｃ％比である。それぞれの考慮される最適な日（ＩＩＩ）における生きているマウスの数（ＩＩ）を示す。Ｔ／Ｃ％比を、以下の通り分類した：６０～１００％：抗腫瘍活性なし（ＩＶ）、３０～６０％：最低限の抗腫瘍活性（Ｖ）、１０～３０％：中程度の抗腫瘍活性（ＶＩ）、０～１０％：著しい抗腫瘍活性（ＶＩＩ）。 群を、ＶＩＩＩ．ＰＢＳ＋対照ＩｇＧ２ａアイソタイプ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＩＸ．ＹｏｐＥ１－１３８－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２およびＹｏｐＥ１－１３８－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；Ｘ．ＹｏｐＥ１－１３８－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ２およびＹｏｐＥ１－１３８－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－Ｌ１、ＸＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－Ｌ１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図42】ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体、または両方の治療の組み合わせのいずれかで治療された、ＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスの生存の確率。ＣＴ２６結腸がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でオペロンとしてコードされる）の両方においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、ＩｇＧ２ｂ抗体、抗ＰＤ－Ｌ１またはＩｇＧ２ｂアイソタイプのいずれか、および適切な場合、対照ＩｇＧ２ａアイソタイプを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。 腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３の体積（５８ｍｍ^３＋／－１９の平均サイズ）に達したら、注射を開始した。生存の確率（Ｉ、％）を示す。最初の治療の日を、０日目として定義する。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日（ＩＩ：日）にわたって測定した。ｉ．ｔ．治療（ＩＩＩ）を、ｄ０、ｄ１、ｄ３、ｄ６、ｄ１０およびｄ１４において行い、ＩｇＧ２ａ ｉ．ｐ．治療（ＩＶ）を、ｄ０、ｄ４、ｄ８、およびｄ１２において行い、ＩｇＧ２ｂ治療（Ｖ）を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ８、ｄ１０、ｄ１２およびｄ１４において行った。群を、ＶＩ．ＰＢＳ＋対照ＩｇＧ２ａアイソタイプ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＶＩＩ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋対照ＩｇＧ２ｂアイソタイプ；ＶＩＩＩ．ＰＢＳ＋抗ＰＤ－Ｌ１；ＩＸ．ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－Ｌ１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）。

【図43】本出願において使用された株の一覧。

【発明を実施するための形態】

【0011】

上記で概説したように、本発明は、組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む薬学的組み合わせ物を提供し、これは、がんの予防、進行の遅延、または治療のために有用である。

【0012】

そのため、第１の態様において、本発明は、
ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む薬学的組み合わせ物を提供する。

【0013】

本明細書を解釈する目的のために、以下の定義が適用され、適切な場合はいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、逆もまた同様である。本明細書に使用される専門用語は、特定の実施形態を記載する目的のためだけであり、限定することを意図するものではないことが理解されるべきである。

【0014】

本発明の特定の態様、実施形態または例と併せて記載される、特徴、整数、特性、化合物は、それと不適合ではない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例に適用可能であることが理解されるべきである。本明細書（任意の添付の特許請求の範囲、要約書および図面を含む）に開示される特徴のすべて、および／またはそのように開示された任意の方法もしくはプロセスの工程のすべては、そのような特徴および／または工程の少なくとも一部が互いに排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされてもよい。本発明は、任意の前述の実施形態の詳細に制限されない。

【0015】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語、およびその変形形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、一般に、含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）、すなわち、「含むが、それらに限定されない」の意味で使用される、すなわち、１つまたは複数の特徴または構成要素の存在を許容することを言う。

【0016】

単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容が明確に他を示さない限り、複数の指示対象を含む。

【0017】

「約」という用語は、指定された値の値±１０％の範囲を指す。例えば、「約２００」という語句は、２００の±１０％、すなわち１８０～２２０を含む。

【0018】

「グラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、以下の細菌を含む：エロモナス・サルモニシダ（Aeromonas salmonicida）、エロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）、エロモナス・ベロニ（Aeromonas veronii）、アナエロミクソバクター・デハロゲナンス（Anaeromyxobacter dehalogenans）、気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）、ボルデテラ・パラペルタッシス（Bordetella parapertussis）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、ブラディリゾビウム・ジャポニカム（Bradyrhizobium japonicum）、バークホルデリア・セノセファシア（Burkholderia cenocepacia）、バークホルデリア・セパシア（Burkholderia cepacia）、バークホルデリア・マレイ（Burkholderia mallei）、バークホルデリア・シュードマレイ（Burkholderia pseudomallei）、クラミジア・ムリダルム（Chlamydia muridarum）、クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachmoatis）、クラミドフィラ・アボルタス（Chlamydophila abortus）、クラミドフィラ・ニューモニアエ（Chlamydophila pneumoniae）、クロモバクテリウム・ビオラセウム（Chromobacterium violaceum）、サイトロバクター・ロデンティウム（Citrobacter rodentium）、デスルホビブリオ・ブルガリス（Desulfovibrio vulgaris）、エドワージエラ・タルダ（Edwardsiella tarda）、エンドゾイコモナス・エリシコラ（Endozoicomonas elysicola）、エルウイニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）、エシェリキア・アルベルティイ（Escherichia albertii）、大腸菌（Escherichia coli）、ローソニア・イントラセルラリス（Lawsonia intracellularis）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ミクソコッカス・キサンタス（Myxococcus xanthus）、パントエア・アグロメランス（Pantoea agglomerans）、フォトバクテリウム・ダムセラエ（Photobacterium damselae）、フォトラブダス・ルミネッセンス（Photorhabdus luminescens）、フォトラブダス・テムペラテ（Photorabdus temperate）、シュードアルテロモナス・スポンギアエ（Pseudoalteromonas spongiae）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、シュードモナス・プレコグロシシダ（Pseudomonas plecoglossicida）、シュードモナス・シリンガエ（Pseudomonas syringae）、ラルストニア・ソラナセアラム（Ralstonia solanacearum）、根粒菌属種（Rhizobium sp）、サルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）および他のサルモネラ属種（Salmonella sp）、シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）および他のシゲラ属種（Shigella sp）、ソーダリス・グロスシニディウス（Sodalis glossinidius）、ビブリオ・アルギノリティカス（Vibrio alginolyticus）、ビブリオ・アズレウス（Vibrio azureus）、ビブリオ・キャンペリイ（Vibrio campellii）、ビブリオ・カリベンチクス（Vibrio caribbenthicus）、ビブリオ・ハーベイ（Vibrio harvey）、ビブリオ・パラヘモリティカス（Vibrio parahaemolyticus）、ビブリオ・タスマニエンシス（Vibrio tasmaniensis）、ビブリオ・ツビアシイ（Vibrio tubiashii）、キサントモナス・アキソノポディス（Xanthomonas axonopodis）、キサントモナス・キャンペストリス（Xanthomonas campestris）、キサントモナス・オリザエ（Xanthomonas oryzae）、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・ペスティス（Yersinia pestis）、エルシニア・シュードツベルクローシス（Yersinia pseudotuberculosis）。本発明の好ましいグラム陰性菌株は、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）およびシュードモナス科（Pseudomonadaceae）のファミリーによって構成されるグラム陰性菌株である。本発明のグラム陰性菌株は、通常、細菌Ｔ３ＳＳによる真核細胞への異種タンパク質のインビトロおよび／またはインビボ、好ましくは、インビボでの送達のために使用される。

【0019】

「組換えグラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、ベクターのようなポリヌクレオチドコンストラクトで遺伝子的に形質転換された組換えグラム陰性菌株を指す。本発明の組換えグラム陰性菌株は、形質転換、形質導入またはコンジュゲーションにより遺伝子改変され、好ましくは、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子による、形質転換、形質導入またはコンジュゲーションにより遺伝子改変された組換えグラム陰性菌株であり、ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結されている。そのような組換えグラム陰性菌株の病原性は、通常、分泌系機構の一部である１つまたは複数の細菌タンパク質によって輸送される病原性活性を有する細菌エフェクタータンパク質の欠失によって減弱される。そのようなエフェクタータンパク質は、分泌系機構によって宿主細胞に送達され、そこで、それらは、さまざまな宿主タンパク質および細胞機構に対してそれらの病原性活性を示す。さまざまな分泌系の種類によって輸送され、宿主の調節性分子の機能をモジュレートする生化学的活性の大きなレパートリーを示す、多くの異なるエフェクタータンパク質が公知である。本明細書で使用される組換えグラム陰性菌株の病原性は、グラム陰性菌株によって通常または時々産生されるシデロホアの欠如によってさらに減弱され得、その結果、株はシデロホアを産生せず、例えば、シデロホアの産生が欠損している。そのため、好ましい実施形態において、グラム陰性菌株によって通常または時々産生されるシデロホアを欠く組換えグラム陰性菌株が使用され、その結果、株は、シデロホアを産生せず、例えば、シデロホアの産生が欠損しており、より好ましくは、グラム陰性菌株によって通常または時々産生されるシデロホアを欠く、エルシニア属株、特に、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦまたはＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄが使用され、その結果、株は、シデロホアを産生せず、例えば、シデロホアの産生が欠損しており、特に、エルシニアバクチンの産生が欠損している。最も好ましくは、グラム陰性菌株によって通常または時々産生されるシデロホアを欠く、エルシニア属株、特に、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔが使用され、その結果、株は、シデロホアを産生せず、例えば、シデロホアの産生が欠損し、特に、エルシニアバクチンの産生が欠損している。エルシニアバクチンの産生が欠損しているＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔは、ＷＯ０２０７７２４９に記載されており、Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）での特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って２００１年９月２４日に寄託され、寄託番号ＬＭＧ Ｐ－２１０１３が付与された。組換えグラム陰性菌株は、好ましくは、シデロホアを産生せず、例えば、シデロホアの産生が欠損している。

【0020】

本明細書で互換的に使用される「シデロホア」、「鉄シデロホア」または「鉄キレート剤」という用語は、鉄に対して高い親和性を有する化合物、例えば、鉄に対して高い親和性を有する小化合物を指す。

【0021】

グラム陰性菌のシデロホアは、例えば、サルモネラ属（Salmonella）、大腸菌属（Escherichia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、シゲラ属（Shigella）、セラチア属（Serratia）によって合成されるエンテロバクチンおよびジヒドロキシベンゾイルセリン（しかし、すべての腸内細菌によって使用される）、シュードモナス属（Pseudomonas）によって合成されるピオベルジン、ビブリオ属（Vibrio）によって合成されるビブリオバクチン、アシネトバクター属（Acinetobacter）によって合成されるアシネトバクチンおよびアシネトフェリン、エルシニア属によって合成されるエルシニアバクチンおよびアエロバクチン、バークホルデリア属（Burkholderia）によって合成されるオルニバクチン、サルモネラ属によって合成されるサルモケリン、大腸菌属、シゲラ属、サルモネラ属およびエルシニア属によって合成されるアエロバクチン、ボルデテラ属（Bordetella）によって合成されるアルカリギン、ビブリオ属によって合成されるビスカベリンである。

【0022】

シデロホアには、ヒドロキサメート、カテコレート、および混合リガンドシデロホアが含まれる。これまでに、いくつかのシデロホアが、主に、鉄過剰症の治療を目的として、ヒトにおける使用について承認されている。好ましいシデロホアは、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢ、デスフェロキサミンＢ、ＤＦＯ－Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢまたはデスフェラールとしても公知）、デスフェリオキサミンＥ、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ、Ｄｅｓｉｒｏｘ、Ｄｅｆｒｉｊｅｔ、Ｄｅｓｉｆｅｒ）、およびデフェリプロン（Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘ）である。

【0023】

本明細書で使用される「成長に必須の内因性タンパク質」という用語は、それなしではグラム陰性菌株が成長することができな、組換えグラム陰性菌株のタンパク質を指す。成長に必須の内因性タンパク質は、例えば、アミノ酸産生に必須の酵素、ペプチドグリカン生合成に関与する酵素、ＬＰＳ生合成に関与する酵素、ヌクレオチド合成に関与する酵素、または翻訳開始因子である。

【0024】

本明細書で使用される「アミノ酸産生に必須の酵素」という用語は、組換えグラム陰性菌株のアミノ酸産生に関し、それなしではグラム陰性菌株が成長することができない、酵素を指す。アミノ酸産生に必須の酵素は、例えば、アスパラギン酸－ベータ－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、トリプトファニルｔＲＮＡシンテターゼ（ｔｒｐＳ）、またはセリンヒドロキシメチル（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｌｙ）トランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）、またはトランスケトラーゼ１（ｔｋｔＡ）、トランスケトラーゼ２（ｔｋｔＢ）、リブロースリン酸３－エピメラーゼ（ｒｐｅ）、リボース－５－リン酸イソメラーゼＡ（ｒｐｉＡ）、トランスアルドラーゼＡ（ｔａｌＡ）、トランスアルドラーゼＢ（ｔａｌＢ）、ホスホリボシルピロリン酸シンターゼ（ｐｒｓ）、ＡＴＰホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｉｓＧ）、ヒスチジン生合成二官能性タンパク質ＨｉｓＩＥ（ｈｉｓＩ）、１－（５－ホスホリボシル）－５－［（５－ホスホリボシルアミノ）メチリデンアミノ］イミダゾール－４－カルボキサミドイソメラーゼ（ｈｉｓＡ）、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼサブユニットＨｉｓＨ（ｈｉｓＨ）、イミダゾールグリセロールリン酸シンターゼサブユニットＨｉｓＦ（ｈｉｓＦ）、ヒスチジン生合成二官能性タンパク質ＨｉｓＢ（ｈｉｓＢ）、ヒスチジノールリン酸アミノトランスフェラーゼ（ｈｉｓＣ）、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ（ｈｉｓＤ）、３－デヒドロキナ酸シンターゼ（ａｒｏＢ）、３－デヒドロキナ酸デヒドラターゼ（ａｒｏＤ）、シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（ａｒｏＥ）、シキミ酸キナーゼ２（ａｒｏＬ）、シキミ酸キナーゼ１（ａｒｏＫ）、３－ホスホシキミ酸１－カルボキシビニルトランスフェラーゼ（ａｒｏＡ）、コリスミ酸シンターゼ（ａｒｏＣ）、Ｐ－タンパク質（ｐｈｅＡ）、Ｔタンパク質（ｔｙｒＡ）、芳香族アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｔｙｒＢ）、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＧ）、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＨ）、ホスホ－２－デヒドロ－３－デオキシヘプトン酸アルドラーゼ（ａｒｏＦ）、キナ酸／シキミ酸デヒドロゲナーゼ（ｙｄｉＢ）、ＡＴＰ依存性６－ホスホフルクトキナーゼアイソザイム１（ｐｆｋＡ）、ＡＴＰ依存性６－ホスホフルクトキナーゼアイソザイム２（ｐｆｋＢ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼクラス２（ｆｂａＡ）、フルクトース二リン酸アルドラーゼクラス１（ｆｂａＢ）、トリオースリン酸イソメラーゼ（ｔｐｉＡ）、ピルビン酸キナーゼＩ（ｐｙｋＦ）、ピルビン酸キナーゼＩＩ（ｐｙｋＡ）、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼＡ（ｇａｐＡ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ｐｇｋ）、２，３－ビスホスホグリセリン酸依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＡ）、２，３－ビスホスホグリセリン酸非依存性ホスホグリセリン酸ムターゼ（ｇｐｍＭ／ｙｉｂＯ）、おそらくホスホグリセリン酸ムターゼ（ｙｔｊＣ／ｇｐｍＢ）、エノラーゼ（ｅｎｏ）、Ｄ－３－ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ（ｓｅｒＡ）、ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ（ｓｅｒＣ）、ホスホセリンホスファターゼ（ｓｅｒＢ）、Ｌ－セリンデヒドラターゼ１（ｓｄａＡ）、Ｌ－セリンデヒドラターゼ２（ｓｄａＢ）、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ異化（ｔｄｃＢ）、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ生合成（ｉｌｖＡ）、Ｌ－セリンデヒドラターゼ（ｔｄｃＧ）、セリンアセチルトランスフェラーゼ（ｃｙｓＥ）、システインシンターゼＡ（ｃｙｓＫ）、システインシンターゼＢ（ｃｙｓＭ）、ベータ－シスタチオナーゼ（ｍａｌＹ）、シスタチオニンベータ－リアーゼ（ｍｅｔＣ）、５－メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸ホモシステインメチルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＥ）、メチオニンシンターゼ（ｍｅｔＨ）、Ｓ－アデノシルメチオニンシンターゼ（ｍｅｔＫ）、シスタチオニンガンマ－シンターゼ（ｍｅｔＢ）、ホモセリンＯ－スクシニルトランスフェラーゼ（ｍｅｔＡ）、５’－メチルチオアデノシン／Ｓ－アデノシルホモシステインヌクレオシダーゼ（ｍｔｎＮ）、Ｓ－リボシルホモシステインリアーゼ（ｌｕｘＳ）、シスタチオンベータリアーゼ、シスタチオンガンマリアーゼ、セリンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｇｌｙＡ）、グリシンヒドロキシメチルトランスフェラーゼ（ｉｔａＥ）、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ小サブユニット（ｌｅｕＤ）、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドラターゼ大サブユニット（ｌｅｕＣ）、３－イソプロピルリンゴ酸デヒドロゲナーゼ（ｌｅｕＢ）、Ｌ－スレオニンデヒドラターゼ生合成（ｉｌｖＡ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム３大サブユニット（ｉｌｖＩ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム３小サブユニット（ｉｌｖＨ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム１小サブユニット（ｉｌｖＮ）、アセト乳酸シンターゼアイソザイム２小サブユニット（ｉｌｖＭ）、ケトール酸レダクトイソメラーゼ（ＮＡＤＰ（＋））（ｉｌｖＣ）、ジヒドロキシ酸デヒドラターゼ（ｉｌｖＤ）、分岐鎖アミノ酸アミノトランスフェラーゼ（ｉｌｖＥ）、二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１（ｔｈｒＡ）、二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ２（ｍｅｔＬ）、２－イソプロピルリンゴ酸シンターゼ（ｌｅｕＡ）、グルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａＡ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ１（ｔｈｒＡ）、二官能性アスパルトキナーゼ／ホモセリンデヒドロゲナーゼ２（ｍｅｔＬ）、リジン感受性アスパルトキナーゼ３（ｌｙｓＣ）、アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）、２－ケト－３－デオキシガラクトン酸アルドラーゼ（ｙａｇＥ）、４－ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸シンターゼ（ｄａｐＡ）、４－ヒドロキシテトラヒドロジピコリン酸レダクターゼ（ｄａｐＢ）、２，３，４，５－テトラヒドロピリジン－２，６－ジカルボキシレートＮ－スクシニルトランスフェラーゼ（ｄａｐＤ）、スクシニル－ジアミノピメリン酸デスクシニラーゼ（ｄａｐＥ）、ジアミノピメリン酸エピメラーゼ（ｄａｐＦ）、推定リアーゼ（ｙｊｈＨ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、クエン酸シンターゼ（ｇｌｔＡ）、アコニット酸ヒドラターゼＢ（ａｃｎＢ）、アコニット酸ヒドラターゼＡ（ａｃｎＡ）、特性のない推定アコニット酸ヒドラターゼ（ｙｂｈＪ）、イソクエン酸デヒドロゲナーゼ（ｉｃｄ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｓｐＣ）、グルタミン酸－ピルビン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｌａＡ）、グルタミン酸シンターゼ［ＮＡＤＰＨ］大型鎖（ｇｌｔＢ）、グルタミン酸シンターゼ［ＮＡＤＰＨ］小型鎖（ｇｌｔＤ）、グルタミンシンテターゼ（ｇｌｎＡ）、アミノ酸アセチルトランスフェラーゼ（ａｒｇＡ）、アセチルグルタミン酸キナーゼ（ａｒｇＢ）、Ｎ－アセチル－ガンマ－グルタミルリン酸レダクターゼ（ａｒｇＣ）、アセチルオルニチン／スクシニルジアミノピメリン酸アミノトランスフェラーゼ（ａｒｇＤ）、アセチルオルニチンデアセチラーゼ（ａｒｇＥ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ鎖Ｆ（ａｒｇＦ）、オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ鎖Ｉ（ａｒｇｌ）、アルギニノコハク酸シンターゼ（ａｒｇＧ）、アルギニノコハク酸リアーゼ（ａｒｇＨ）、グルタミン酸５－キナーゼ（ｐｒｏＢ）、ガンマ－グルタミルリン酸レダクターゼ（ｐｒｏＡ）、ピロリン－５－カルボキシレートレダクターゼ（ｐｒｏＣ）、オルニチンシクロデアミナーゼ、ロイシン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｌｅｕＳ）、グルタミン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｇｌｎＳ）、セリン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｓｅｒＳ）、グリシン－ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｇｌｙＳ）、グリシン－ｔＲＮＡリガーゼアルファサブユニット（ｇｌｙＱ）、チロシン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｙｒＳ）、スレオニン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｈｒＳ）、フェニルアラニン－ｔＲＮＡリガーゼアルファサブユニット（ｐｈｅＳ）、フェニルアラニン－ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｐｈｅＴ）、アルギニン－ｔＲＮＡリガーゼ（ａｒｇＳ）、ヒスチジン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｈｉｓＳ）、バリン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｖａｌＳ）、アラニン－ｔＲＮＡリガーゼ（ａｌａＳ）、イソロイシン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｉｌｅＳ）、プロリン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｐｒｏＳ）、システイン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｃｙｓＳ）、アスパラギン－ｔＲＮＡリガーゼ（ａｓｎＳ）、アスパラギン酸ｔＲＮＡリガーゼ（ａｓｐＳ）、グルタミン酸－ｔＲＮＡリガーゼ（ｇｌｔＸ）、トリプトファン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｔｒｐＳ）、グリシン－ｔＲＮＡリガーゼベータサブユニット（ｇｌｙＳ）、メチオニン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｍｅｔＧ）、リジン－ｔＲＮＡリガーゼ（ｌｙｓＳ）である。アミノ酸産生に必須の好ましい酵素は、ｔｋｔＡ、ｒｐｅ、ｐｒｓ、ａｒｏＫ、ｔｙｒＢ、ａｒｏＨ、ｆｂａＡ、ｇａｐＡ、ｐｇｋ、ｅｎｏ、ｔｄｃＧ、ｃｙｓＥ、ｍｅｔＫ、ｇｌｙＡ、ａｓｄ、ｄａｐＡ／Ｂ／Ｄ／Ｅ／Ｆ、ａｒｇＣ、ｐｒｏＣ、ｌｅｕＳ、ｇｌｎＳ、ｓｅｒＳ、ｇｌｙＳ／Ｑ、ｔｙｒＳ、ｔｈｒＳ、ｐｈｅＳ／Ｔ、ａｒｇＳ、ｈｉｓＳ、ｖａｌＳ、ａｌａＳ、ｉｌｅＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｓｎＳ、ａｓｐＳ、ｇｌｔＸ、ｔｒｐＳ、ｇｌｙＳ、ｍｅｔＧ、ｌｙｓＳであり、ａｓｄ、ｇｌｙＡ、ｌｅｕＳ、ｇｌｎＳ、ｓｅｒＳ、ｇｌｙＳ／Ｑ、ｔｙｒＳ、ｔｈｒＳ、ｐｈｅＳ／Ｔ、ａｒｇＳ、ｈｉｓＳ、ｖａｌＳ、ａｌａＳ、ｉｌｅＳ、ｐｒｏＳ、ｃｙｓＳ、ａｓｎＳ、ａｓｐＳ、ｇｌｔＸ、ｔｒｐＳ、ｇｌｙＳ、ｍｅｔＧ、ｌｙｓＳがより好ましく、ａｓｄが最も好ましい。

【0025】

「成長に必須のアミノ酸を産生するのが欠損したグラム陰性菌株」および「栄養要求性突然変異体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、少なくとも１つの外因的に提供された必須アミノ酸またはその前駆体の非存在下で成長することができないグラム陰性菌株を指す。株が産生するのに欠損しているアミノ酸は、例えば、アスパラギン酸、メソ－２，６－ジアミノピメリン酸、芳香族アミノ酸またはロイシン－アルギニンである。そのような株は、例えば、アスパラギン酸－ベータ－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失（Δａｓｄ）によって作成することができる。そのような栄養要求性突然変異体は、外因性メソ－２，６－ジアミノピメリン酸の非存在下で成長することができない。突然変異、例えば、アスパラギン酸－ベータ－セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子の欠失は、本明細書において、本発明の成長に必須のアミノ酸を産生するのが欠損したグラム陰性菌株のために好ましい。

【0026】

「真核細胞表面または細胞外マトリックスに結合する接着タンパク質を産生するのが欠損したグラム陰性菌株」という用語は、対応する野生型株によって発現される接着タンパク質と比較して、少なくとも１つの接着タンパク質を発現しない突然変異型グラム陰性菌株を指す。接着タンパク質には、例えば、線毛（ｐｉｌｉ／ｆｉｍｂｒｉａｅ）または非線毛アドヘシンのような拡張ポリマー接着分子が含まれ得る。線毛アドヘシンには、１型線毛（ＦｉｍＨアドヘシンを有する大腸菌Ｆｉｍ線毛など）、Ｐ線毛（大腸菌由来のＰａｐＧアドヘシンを含むＰａｐ線毛など）、４型線毛（例えば、緑膿菌由来のピリンタンパク質として）、またはｃｕｒｌｉ（Ｓ．エンテリカ由来のＣｓｇＡアドヘシンを有するＣｓｇタンパク質）が含まれる。非線毛接着（ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）には、Ｙ．エンテロコリチカ由来のＹａｄＡ、ＢｐａＡ（Ｂ．シュードマレイ）、Ｈｉａ（インフルエンザ菌（H. influenzae））、ＢａｄＡ（Ｂ．ヘンセラエ（B. henselae））、NadA（髄膜炎菌（N. meningitidis））、またはＵｓｐＡｌ（Ｍ．カタラリス（M. catarrhalis））などの三量体自己輸送体アドヘシン、ならびにＡＩＤＡ－１（大腸菌）などの他の自動輸送体アドヘシン、ならびにＹ．エンテロコリチカまたはインチミン（大腸菌）由来のＩｎｖＡなどの他のアドヘシン／インバシン、またはＤｒファミリーまたはＡｆａファミリー（大腸菌）のメンバーが含まれる。ＹａｄＡおよびＩｎｖＡという用語は、本明細書で使用される場合、Ｙ．エンテロコリチカ由来のタンパク質を指す。自己輸送体ＹａｄＡ（ＳｋｕｒｎｉｋおよびＷｏｌｆ－Ｗａｔｚ、１９８９）はコラーゲンおよびフィブロネクチンの異なる形態に結合するが、インバシンＩｎｖＡ（Ｉｓｂｅｒｇら、１９８７）は真核細胞膜においてβ－インテグリンに結合する。グラム陰性菌株がＹエンテロコリチカ株である場合、株は、好ましくは、ＩｎｖＡおよび／またはＹａｄＡが欠損している。

【0027】

本明細書で使用される場合、「腸内細菌科のファミリー」は、土壌、水、植物、および動物において見られるグラム陰性の桿状の通性嫌気性細菌のファミリーを含み、これは、脊椎動物において病原体として頻繁に生じる。このファミリーの細菌は、類似する生理機能を共有し、個々のゲノムの機能的エレメントおよび遺伝子内での保存を実証している。オキシダーゼ陰性であるだけでなく、このファミリーのすべてのメンバーは、グルコース発酵体であり、ほとんどが硝酸塩還元体である。

【0028】

本発明の腸内細菌科細菌は、そのファミリー由来の任意の細菌であってもよく、具体的には、以下の属：大腸菌属、シゲラ属、エドワージエラ属（Edwardsiella）、サルモネラ属、サイトロバクター属（Citrobacter）、クレブシエラ属、エンテロバクター属（Enterobacter）、セラチア属、プロテウス属（Proteus）、エルウイニア属（Erwinia）、モーガネラ属（Morganella）、プロビデンシア属（Providencia）、またはエルシニア属の細菌を含むが、それらに限定されない。より具体的な実施形態において、細菌は、大腸菌、エシェリキア・ブラタエ（Escherichia blattae）、エシェリキア・ファグソニイ（Escherichia fergusonii）、エシェリキア・ヘルマニイ（Escherichia hermanii）、エシェリキア・ブネリス（Escherichia vuneris）、サルモネラ・エンテリカ、サルモネラ・ボンゴリ（Salmonella bongori）、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、シゲラ・フレックスネリ、シゲラ・ボイディイ（Shigella boydii）、シゲラ・ソンネイ（Shigella sonnei）、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）、エンテロバクター・ジェルゴビアエ（Enterobacter gergoviae）、エンデロバクター・サカザキイ（Enterobacter sakazakii）、エンテロバクター・クロアカエ（Enterobacter cloacae）、エンテロバクター・アグロメランス（Enterobacter agglomerans）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）、セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）、エルシニア・シュードツベルクローシス、ペスト菌、エルシニア・エンテロコリチカ、エルウイニア・アミロボーラ、プロテウス・ミラビリス（Proteus mirabilis）、プロテウス・ブルガリス（Proteus vulgaris）、プロテウス・ペンネリ（Proteus penneri）、プロテウス・ハウセリ（Proteus hauseri）、プロビデンシア・アルカリファシエンス（Providencia alcalifaciens）、またはモーガネラ・モーガニイ（Morganella morganii）種のものである。好ましくは、グラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、シゲラ属、シュードモナス属、クラミジア属（Chlamydia）、エルウイニア属、パンテア属（Pantoea）、ビブリオ属、バークホルデリア属、ラルストニア属（Ralstonia）、キサントモナス属（Xanthomonas）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、ソーダリス属（Sodalis）、サイトロバクター属、エドワージエラ属、リゾビア属（Rhizobiae）、エロモナス属（Aeromonas）、フォトラブダス属（Photorhabdus）、ボルデテラ属（Bordetella）およびデスルホビブリオ属（Desulfovibrio）からなる群から、より好ましくは、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、およびシュードモナス属からなる群から、最も好ましくは、エルシニア属およびサルモネラ属、特に、エルシニア属からなる群から選択される。

【0029】

「エルシニア属」という用語は、本明細書で使用される場合、エルシニア属のすべての種を含み、エルシニア・エンテロコリチカ、エルシニア・シュードツベルクローシスおよびペスト菌を含む。エルシニア・エンテロコリチカが好ましい。

【0030】

「サルモネラ属」という用語は、本明細書で使用される場合、サルモネラ属のすべての種を含み、サルモネラ・エンテリカおよびＳ．ボンゴリを含む。サルモネラ・エンテリカが好ましい。

【0031】

「プロモーター」は、本明細書で使用される場合、転写ユニットの発現を調節する核酸配列を指す。「プロモーター領域」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流（３’方向）のコード配列の転写を開始することができる調節領域である。プロモーター領域内に、転写開始部位（簡便には、ヌクレアーゼＳ１によるマッピングによって定義される）、ならびに推定－３５領域およびプリブノーボックスなどのＲＮＡポリメラーゼに結合する原因となるタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。「動作可能に連結された」という用語は、２つのヌクレオチド間、例えば、ＤＮＡ領域間の関係を記載する場合、それらが互いと機能的に関連し、同じ核酸断片上に位置することを単に意味する。プロモーターは、それが遺伝子の転写を制御する場合、およびそれが遺伝子と同じ核酸断片上に位置する場合、構造遺伝子に動作可能に連結されている。通常、プロモーターは、前記グラム陰性菌株において機能的であり、すなわち、プロモーターは、本発明の融合タンパク質を発現することができ、すなわち、プロモーターは、さらなるタンパク質のさらなる遺伝子操作または発現なしで、本発明の融合タンパク質を発現することができる。さらにまた、機能性プロモーターは、天然で、細菌Ｔ３ＳＳに対して対抗調節されてはならない。

【0032】

本明細書で使用される「染色体外遺伝エレメント」という用語は、病原性プラスミドなどの本発明のグラム陰性菌株が内因的に保有するか、またはグラム陰性菌株が形質転換され、染色体にもしくは内因性病原性プラスミドなどの内因的に保有される染色体以外の遺伝エレメントに、一過性にもしくは安定に組み込まれる外因性遺伝エレメントである、染色体以外の遺伝エレメントを指す。内因性病原性プラスミドは、好ましい本発明の染色体外遺伝エレメントである。そのような染色体外遺伝エレメントは、発現ベクター、相同組換えのためのＤＮＡ断片の組み込み、または染色体へのもしくは病原性プラスミドなどの内因的に保有される染色体以外の遺伝エレメントへの他の組み込みによって、あるいは染色体へのもしくは病原性プラスミドなどの内因的に保有される染色体以外の遺伝エレメントへのＲＮＡエレメントがガイドする部位特異的挿入、例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９および関連するガイドＲＮＡを介して、染色体へのもしくは病原性プラスミドなどの内因的に保有される染色体以外の遺伝エレメントへの相同組換えまたは他の組み込みのためのベクターのようなベクターの組み込みによって作成され得る。

【0033】

「ポリ核酸分子」および「ポリヌクレオチド分子」という用語は、本明細書で互換的に使用され、本明細書で同一の意味を有し、一本鎖または二本鎖のいずれかであり得るＤＮＡおよびＲＮＡ分子の両方を指し、これは、遺伝子産物に、部分的にもしくは完全に転写および翻訳され得るか（ＤＮＡ）、または部分的にもしくは完全に翻訳され得る（ＲＮＡ）。

【0034】

「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド酸配列」という用語は、本明細書で互換的に使用され、本明細書で同一の意味を有し、好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド酸配列」という用語は、好ましくは、「ポリヌクレオチド配列」という用語と同義で使用される。

【0035】

本明細書で使用される「オペロン」という用語は、単一のプロモーターの制御下で転写される２つ以上の遺伝子を指す。したがって、これらの遺伝子は、典型的には、一緒に転写され、１つのメッセージＲＮＡ（ｍｅｓｓｅｎｇｅ ＲＮＡ）を形成し、そこで、単一のｍＲＮＡは、２つ以上のタンパク質をコードする（多シストロン性ｍＲＮＡ）。プロモーターおよび２つ以上の遺伝子に加えて、転写を制御するオペレーターエレメントも存在していてもよい。

【0036】

本明細書で使用される「送達」という用語は、組換えグラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の輸送を指し、組換えグラム陰性菌株における異種タンパク質を発現する工程、そのような組換えグラム陰性菌株から発現するタンパク質を分泌する工程、およびそのような組換えグラム陰性菌株によって真核細胞のサイトゾルに分泌されたタンパク質を移動させる工程を含む。したがって、本明細書で互換的に使用される「送達シグナル」または「分泌シグナル」という用語は、グラム陰性菌株の分泌および転座系によって認識され得、グラム陰性菌株から真核細胞へのタンパク質の送達を指示する、ポリペプチド配列を指す。

【0037】

本明細書で使用される「細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル」という用語は、組換えグラム陰性菌株において機能的な細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルを指し、すなわち、これは、組換えグラム陰性菌株において発現する異種タンパク質が、ＩＩＩ型、ＩＶ型もしくはＶＩ型分泌系などの分泌系によってそのような組換えグラム陰性菌株から分泌されるのを可能にするか、またはＩＩＩ型、ＩＶ型もしくはＶＩ型分泌系などの分泌系によって真核細胞のサイトゾルにそのような組換えグラム陰性菌株によって移動されるのを可能にする。本明細書で使用される「細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナル」という用語はまた、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片、すなわち、送達シグナルのより短いバージョン、例えば、送達シグナルの、例えば、天然に存在する送達シグナルの最大で１０、好ましくは、最大で２０、より好ましくは、最大で５０、さらにより好ましくは、最大で１００、特に、最大で１４０のアミノ酸を含む送達シグナルを含む。そのため、例えば、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするＤＮＡ配列などのヌクレオチド配列は、全長送達シグナルまたはその（ｔｈｅｒｏｆ）断片をコードし得、ここで、断片は、通常、最大で３０、好ましくは、最大で６０、より好ましくは、最大で１５０、さらにより好ましくは、最大で３００、特に、最大で４２０核酸を含む。

【0038】

本明細書で使用される場合、タンパク質の「分泌」は、組換えグラム陰性菌株の細胞膜を横断して外側への異種タンパク質の輸送を指す。タンパク質の「移動」は、そのような真核細胞のサイトゾルへの、真核細胞の細胞膜を横断する組換えグラム陰性菌株からの異種タンパク質の輸送を指す。

【0039】

「分泌系機構の一部である細菌タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌の３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）および６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、好ましくは、Ｔ３ＳＳの必須構成要素を構成する細菌タンパク質を指す。そのようなタンパク質なしでは、分泌系のすべての他の構成要素および移動される細菌エフェクタータンパク質が依然としてコードされ、産生される場合でさえ、個々の分泌系は、タンパク質を宿主細胞に移動する際に非機能的である。

【0040】

「細菌エフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、宿主細胞への分泌系機構の一部である、分泌系によって、例えば、細菌タンパク質によって輸送される細菌タンパク質を指す。そのようなエフェクタータンパク質は、分泌系よって宿主細胞に送達され、そこで、例えば、さまざまな宿主タンパク質および細胞機構に対して病原性活性を示す。多くの異なるエフェクタータンパク質が公知であり、さまざまな分泌系の種類によって輸送され、宿主調節分子の機能をモジュレートする生化学的活性の大きなレパートリーを示す。分泌系には、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）および６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）が含まれる。一部のエフェクタータンパク質（シゲラ・フレックスネリＩｐａＣのような）は、同様に、分泌系機構の一部であり、タンパク質の移動を可能にする、細菌タンパク質のクラスに属する。本明細書で使用される組換えグラム陰性菌株は、通常、細菌の３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）および／または６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）、好ましくは、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）の必須構成要素を構成する細菌タンパク質を含む。本発明の組換えグラム陰性菌株の細菌エフェクタータンパク質は、通常、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質、細菌Ｔ４ＳＳエフェクタータンパク質または細菌Ｔ６ＳＳエフェクタータンパク質、好ましくは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質である。

【0041】

「細菌Ｔ３ＳＳの必須構成要素を構成する細菌タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、インジェクチソーム、例えば、注射針を天然に形成するか、またはそうでなければ、タンパク質を真核細胞に移動する際にその機能に必須である、タンパク質を指す。インジェクチソームを形成するか、またはそうでなければ、タンパク質を真核細胞に移動する際にその機能に必須である、タンパク質には、限定されるものではないが、ＳｃｔＣ、ＹｓｃＣ、ＭｘｉＤ、ＩｎｖＧ、ＳｓａＣ、ＥｓｃＣ、ＨｒｃＣ、ＨｒｃＣ（セクレチン）、ＳｃｔＤ、ＹｓｃＤ、ＭｘｉＧ、Ｐｒｇ、ＳｓａＤ、ＥｓｃＤ、ＨｒｐＱ、ＨｒｐＷ、ＦｌｉＧ（外側ＭＳ環タンパク質）、ＳｃｔＪ、ＹｓｃＪ、ＭｘｉＪ、ＰｒｇＫ、ＳｓａＪ、ＥｓｃＪ、ＨｒｃＪ、ＨｒｃＪ、ＦｌｉＦ（内側ＭＳ環タンパク質）、ＳｃｔＲ、ＹｓｃＲ、Ｓｐａ２４、ＳｐａＰ、ＳｐａＰ、ＳｓａＲ、ＥｓｃＲ、ＨｒｃＲ、ＨｒｃＲ、ＦｌｉＰ（マイナー排出装置タンパク質）、ＳｃｔＳ、ＹｓｃＳ、Ｓｐａ９（ＳｐａＱ）、ＳｐａＱ、ＳｓａＳ、ＥｓｃＳ、ＨｒｃＳ、ＨｒｃＳ、ＦｌｉＱ（マイナー排出装置タンパク質）、ＳｃｔＴ、ＹｓｃＴ、Ｓｐａ２９（ＳｐａＲ）、ＳｐａＲ、ＳｓａＴ、ＥｓｃＴ、ＨｒｃＴ、ＨｒｃＴ、ＦｌｉＲ（マイナー排出装置タンパク質）、ＳｃｔＵ、ＹｓｃＵ、Ｓｐａ４０、ＳｐａＳ、ＳｐａＳ、ＳｓａＵ、ＥｓｃＵ、ＨｒｃＵ、ＨｒｃＵ、ＦｌｈＢ（排出装置スイッチタンパク質）、ＳｃｔＶ、ＹｓｃＶ、ＭｘｉＡ、ＩｎｖＡ、ＳｓａＶ、ＥｓｃＶ、ＨｒｃＶ、ＨｒｃＶ、ＦｌｈＡ（メジャー排出装置タンパク質）、ＳｃｔＫ、ＹｓｃＫ、ＭｘｉＫ、ＯｒｇＡ、ＨｒｐＤ（アクセサリーサイトゾルタンパク質）、ＳｃｔＱ、ＹｓｃＱ、Ｓｐａ３３、ＳｐａＯ、ＳｐａＯ、ＳｓａＱ、ＥｓｃＱ、ＨｒｃＱＡ＋Ｂ、ＨｒｃＱ、ＦｌｉＭ＋ＦｌｉＮ（Ｃ環タンパク質）、ＳｃｔＬ、ＹｓｃＬ、ＭｘｉＮ、ＯｒｇＢ、ＳｓａＫ、ＥｓｃＬ、Ｏｒｆ５、ＨｒｐＥ、ＨｒｐＦ、ＦｌｉＨ（Ｓｔａｔｏｒ）、ＳｃｔＮ、ＹｓｃＮ、Ｓｐａ４７、ＳｐａＬ、ＩｎｖＣ、ＳｓａＮ、ＥｓｃＮ、ＨｒｃＮ、ＨｒｃＮ、ＦｌｉＩ（ＡＴＰアーゼ）、ＳｃｔＯ、ＹｓｃＯ、Ｓｐａ１３、ＳｐａＭ、ＩｎｖＩ、ＳｓａＯ、Ｏｒｆ１５、ＨｒｐＯ、ＨｒｐＤ、ＦｌｉＪ（Ｓｔａｌｋ）、ＳｃｔＦ、ＹｓｃＦ、ＭｘｉＨ、ＰｒｇＩ、ＳｓａＧ、ＥｓｃＦ、ＨｒｐＡ、ＨｒｐＹ（ニードルフィラメントタンパク質）、ＳｃｔＩ、ＹｓｃＩ、ＭｘｉＩ、ＰｒｇＪ、ＳｓａＩ、ＥｓｃＩ、ｒＯｒｆ８、ＨｒｐＢ、ＨｒｐＪ、（内側ロッドタンパク質）、ＳｃｔＰ、ＹｓｃＰ、Ｓｐａ３２、ＳｐａＮ、ＩｎｖＪ、ＳｓａＰ、ＥｓｃＰ、Ｏｒｆ１６、ＨｒｐＰ、ＨｐａＰ、ＦｌｉＫ（針の長さの調節因子）、ＬｃｒＶ、ＩｐａＤ、ＳｉｐＤ（親水性輸送体、ニードルチップタンパク質）、ＹｏｐＢ、ＩｐａＢ、ＳｉｐＢ、ＳｓｅＣ、ＥｓｐＤ、ＨｒｐＫ、ＰｏｐＦ１、ＰｏｐＦ２（疎水性輸送体、ポアタンパク質）、ＹｏｐＤ、ＩｐａＣ、ＳｉｐＣ、ＳｓｅＤ、ＥｓｐＢ（疎水性輸送体、ポアタンパク質）、ＹｓｃＷ、ＭｘｉＭ、ＩｎｖＨ（パイロチン）、ＳｃｔＷ、ＹｏｐＮ、ＭｘｉＣ、ＩｎｖＥ、ＳｓａＬ、ＳｅｐＬ、ＨｒｐＪ、ＨｐａＡ（ゲートキーパー）が含まれる。

【0042】

「Ｔ６ＳＳエフェクタータンパク質」または「細菌Ｔ６ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ６Ｓ系によって真核細胞または細菌のサイトゾルに天然で注入されるタンパク質、および例えば、真核細胞膜への輸送ポアを形成する可能性があるＴ６Ｓ系によって天然で分泌されるタンパク質を指す。「Ｔ４ＳＳエフェクタータンパク質」または「細菌Ｔ４ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ４Ｓ系によって真核細胞のサイトゾルに天然で注入されるタンパク質、および例えば、真核細胞膜への輸送ポアを形成する可能性があるＴ４Ｓ系によって天然で分泌されるタンパク質を指す。「Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」または「細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ３Ｓ系によって真核細胞のサイトゾルに天然で注入されるタンパク質、および例えば、真核細胞膜への輸送ポアを形成する可能性があるＴ３Ｓ系によって天然で分泌されるタンパク質（ポア形成輸送体（ｔｒａｎｌｏｃａｔｏｒｓ）（エルシニア属ＹｏｐＢおよびＹｏｐＤのような）およびｔｉｐタンパク質様エルシニア属ＬｃｒＶを含む）を指す。好ましくは、Ｔ３Ｓ系によって真核細胞のサイトゾルに天然で注入されるタンパク質が使用される。これらの病原性因子は、病原体に有利であるように、真核細胞を麻痺させるか、または再プログラムする。Ｔ３Ｓエフェクターは、生化学的活性の大きなレパートリーを示し、極めて重要な宿主調節分子の機能をモジュレートし、限定されるものではないが、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡを含む。

【0043】

「悪性固形腫瘍において蓄積している組換えグラム陰性菌株」または「悪性固形腫瘍において蓄積する組換えグラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、悪性固形腫瘍内で複製し、それによって、悪性固形腫瘍の内側でこの組換えグラム陰性菌株の細菌数を増加させる、組換えグラム陰性菌株を指す。驚くべきことに、対象への投与後の組換えグラム陰性菌株が、悪性固形腫瘍において特異的に、すなわち、悪性腫瘍が存在する臓器において特異的に蓄積し、ここで、悪性固形腫瘍が存在しない臓器における組換えグラム陰性菌株の細菌数は、低いか、または検出不能であることが見出された。エルシニア属のような細菌が細胞外に存在する場合において、細菌は、主に、腫瘍細胞間または腫瘍微小環境の細胞間に形成される細胞間の空間内に蓄積する。サルモネラ属のような細胞内で成長する細菌は、主に、腫瘍細胞または腫瘍微小環境の細胞に侵入し、そのような細胞の内側に存在するが、細胞外蓄積が依然として起こる可能性がある。悪性固形腫瘍の内側に蓄積した組換えグラム陰性菌株の細菌数は、例えば、腫瘍組織１グラムあたり１０^４～１０^９個細菌の範囲内であり得る。

【0044】

本明細書で使用される「がん」という用語は、異常な細胞が、制御なしで分裂し、近くの組織に侵入し得る疾患を指す。がん細胞はまた、血液およびリンパ系を通じて身体の他の部分に広がり得る。いくつかのがんの主な型がある。癌腫は、内臓を覆うまたは被覆する皮膚または組織において開始するがんである。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管、または他の結合組織もしくは支持組織において開始するがんである。白血病は、骨髄などの血液形成組織において開始するがんであり、多数の異常な血液細胞が、生じ、血液への侵入を引き起こす。リンパ腫および多発性骨髄腫は、免疫系の細胞において開始するがんである。中枢神経系がんは、脳および脊髄の組織において開始するがんである。本明細書で使用される「がん」という用語は、固形腫瘍、すなわち、例えば、肉腫、癌腫、およびリンパ腫などの悪性固形腫瘍、ならびに、例えば、白血病（血液のがん）などの非固形腫瘍を含む。固形腫瘍が好ましい。

【0045】

本明細書で使用される「固形腫瘍」または「固形腫瘍適応症」という用語は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない組織の異常な塊を指す。固形腫瘍は、良性（がんではない）、または悪性（がん）であり得る。好ましくは、悪性固形腫瘍は、本発明の方法により治療される。本明細書で使用される「悪性固形腫瘍」または「悪性固形腫瘍適応症」という用語は、通常、嚢胞または液体領域を含有しない組織の異常な塊を指す。異なる型の悪性固形腫瘍が、それらを形成する細胞型に対して命名されている。悪性固形腫瘍の例は、肉腫、癌腫、およびリンパ腫である。白血病（血液のがん）は、一般に、悪性固形腫瘍を形成しない（ＮＩＨの国立がん研究所による定義）。悪性固形腫瘍には、限定されるものではないが、肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺または肺などの異なる組織型に起因し得る異常な細胞の塊が含まれ、したがって、悪性の固形の肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺または肺の腫瘍が含まれる。本発明の方法により治療され得る好ましい悪性固形腫瘍は、皮膚、乳房、肝臓、膵臓、膀胱、前立腺および結腸に起因する悪性固形腫瘍であり、したがって、悪性の固形の皮膚、乳房、肝臓、膵臓、膀胱、前立腺および結腸の腫瘍が含まれる。同様に、本発明の方法に治療され得る好ましい悪性固形腫瘍は、肝臓がん、例えば、肝細胞癌に関連する悪性固形腫瘍である。

【0046】

「客観的奏効率」（ＯＲＲ）という用語は、本明細書で使用される場合、所定の量および最小期間で腫瘍サイズ低減を有する患者の割合を指す。奏功期間は、通常、初期応答の時から腫瘍の進行が確認されるまで測定される。一般に、ＦＤＡは、ＯＲＲを、部分寛解と完全寛解の合計として定義している。この方法で定義される場合、ＯＲＲは、薬物の抗腫瘍活性の直接測定であり、これは、シングルアーム研究において評価され得る。ＯＲＲは、完全寛解（ＣＲ）および部分寛解（ＰＲ）の合計を指す。ヒトに対するＯＲＲ、ＣＲおよびＰＲの定義は、ＲＥＣＩＳＴガイドライン（ＲＥＣＩＳＴ １．１；（Ｅｉｓｅｎｈａｕｅｒら、２００９））および免疫療法化合物の評価のために適応されたガイドライン（ｉＲＥＣＩＳＴ；（Ｓｅｙｍｏｕｒら、２０１７））において提供されている。

【0047】

腫瘍保持マウスによる前臨床研究において、腫瘍応答の定義は、ヒトに対するＲＥＣＩＳＴ定義と比較して、適応され：腫瘍縮小なしは、０日目のそれらの個々の体積と比較して３５％超の腫瘍体積の増加として定義され；安定疾患は、０日目と比較して、腫瘍体積の５０％の減少～３５％の増加の腫瘍体積の変化として定義され；部分縮小は、０日目と比較して、５０％～９５％の体積の腫瘍体積の減少として定義され；完全縮小または完全寛解は、０日目と比較して、腫瘍体積の＞９５％の減少として定義される。

【0048】

「完全寛解」および「完全縮小」という用語は、本明細書で互換的に使用され、同じ意味を有する。標的病変に関する「完全寛解」（ＣＲ）という用語は、すべての標的病変の消失を指す。任意の病理学的なリンパ節（標的または非標的にかかわらない）は、短軸の＜１０ｍｍまでの低減を有していなければならない。「完全寛解」（ＣＲ）という用語は、非標的病変に関して本明細書で使用される場合、すべての非標的病変の消失および腫瘍マーカーレベルの正常化を指す。すべてのリンパ節は、非病理学的なサイズでなければならない（＜１０ｍｍの短軸）。

【0049】

「部分寛解」（ＰＲ）という用語は、標的病変に関して本明細書で使用される場合、ベースラインの合計直径を参照として、標的病変の直径の合計の少なくとも３０％の減少を指す。

【0050】

「進行性疾患」（ＰＤ）という用語は、標的病変に関して本明細書で使用される場合、研究における最小合計（これは、研究において最小である場合のベースライン合計を含む）を参照として、標的病変の直径の合計の少なくとも２０％の増加を指す。２０％の相対的増加に加えて、合計は、少なくとも５ｍｍの絶対的増加も実証しなければならない。１つまたは複数の新しい病変の出現も、進行と考えられる。進行性疾患（ＰＤ）という用語は、非標的病変に関して本明細書で使用される場合、１つまたは複数の新しい病変の出現および／または既存の非標的病変の明解な進行を指す。明解な進行は、通常、標的病変の状態をしのぐものではないはずである。これは、単一の病変の増加ではなく、代表的な全体的な疾患状態の変化でなければならない。

【0051】

「安定疾患」（ＳＤ）という用語は、標的病変に関して本明細書で使用される場合、研究の間の最小の合計直径を参照して、ＰＲにふさわしい十分な収縮も、ＰＤにふさわしい十分な増加もないことを指す。

【0052】

「無増悪生存」（ＰＦＳ）という用語は、本明細書で使用される場合、治療の開始から進行または死亡のどちらか最初に起こった時までの期間に関する。

【0053】

「真核細胞に対して病原性である細菌エフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、分泌系によって宿主細胞に輸送され、そこで、それらがさまざまな宿主タンパク質および細胞機構に対するそれらの病原性活性を示す、細菌エフェクタータンパク質を指す。多くの異なるエフェクタータンパク質が公知であり、さまざまな分泌系の種類によって輸送され、宿主調節分子の機能をモジュレートする生化学的活性の大きなレパートリーを示す。分泌系には、３型分泌系（Ｔ３ＳＳ）、４型分泌系（Ｔ４ＳＳ）および６型分泌系（Ｔ６ＳＳ）が含まれる。重要なことには、真核細胞に対して病原性である一部のエフェクタータンパク質（シゲラ・フレックスネリＩｐａＣのような）は、同様に、分泌系機構の一部である細菌タンパク質のクラスに属する。真核細胞に対して病原性である細菌エフェクタータンパク質の場合において、同様に、分泌機構の機能に必須であり、そのようなタンパク質は、この定義から排除される。真核細胞に対して病原性であるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質は、Ｙ．エンテロコリチカＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、またはシゲラ・フレックスネリＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＩｐｇＢ１、またはサルモネラ・エンテリカＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、または緑膿菌ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、ＥｘｏＹ、または大腸菌Ｔｉｒ、Ｍａｐ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺのようなタンパク質を指す。真核細胞に対して病原性であるＴ４ＳＳエフェクタータンパク質は、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）ＬｉｄＡ、ＳｉｄＣ、ＳｉｄＧ、ＳｉｄＨ、ＳｄｈＡ、ＳｉｄＪ、ＳｄｊＡ、ＳｄｅＡ、ＳｄｅＡ、ＳｄｅＣ、ＬｅｐＡ、ＬｅｐＢ、ＷｉｐＡ、ＷｉｐＢ、ＹｌｆＡ、ＹｌｆＢ、ＶｉｐＡ、ＶｉｐＦ、ＶｉｐＤ、ＶｐｄＡ、ＶｐｄＢ、ＤｒｒＡ、ＬｅｇＬ３、ＬｅｇＬ５、ＬｅｇＬ７、ＬｅｇＬＣ４、ＬｅｇＬＣ８、ＬｅｇＣ５、ＬｅｇＧ２、Ｃｅｇ１０、Ｃｅｇ２３、Ｃｅｇ２９、またはバルトネラ・ヘンセラエ（Bartonella henselae）ＢｅｐＡ、ＢｅｐＢ、ＢｅｐＣ、ＢｅｐＤ、ＢｅｐＥ、ＢｅｐＦ ＢｅｐＧ、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）ＶｉｒＤ２、ＶｉｒＥ２、ＶｉｒＥ３、ＶｉｒＦ、またはＨ．ピロリ（H. pylori）ＣａｇＡ、または百日咳菌の百日咳毒素のようなタンパク質を指す。真核細胞に対して病原性であるＴ６ＳＳエフェクタータンパク質は、コレラ菌（Vibrio cholerae）ＶｇｒＧタンパク質（ＶｇｒＧ１のような）のようなタンパク質を指す。

【0054】

「真核細胞に対して病原性であるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質」または「真核細胞に対して病原性である細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｔ３Ｓ系によって真核細胞のサイトゾルに天然で注入されるタンパク質、および例えば、真核細胞に対する病原性因子である、真核細胞膜への輸送ポアを形成する可能性があるＴ３Ｓ系によって天然で分泌されるタンパク質、すなわち、病原体に有利であるように、真核細胞を麻痺させるか、または再プログラムするタンパク質を指す。エフェクターは、生化学的活性の大きなレパートリーを示し、極めて重要な宿主調節分子の機能、例えば、食作用およびアクチン細胞骨格、炎症シグナル伝達、アポトーシス、エンドサイトーシスまたは分泌経路などをモジュレートし（Ｃｏｒｎｅｌｉｓ、２００６；ＭｏｔａおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、２００５）、限定されるものではないが、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＢＳ３、ＡｖｒＢｓＴ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＡｖｒＲｐｔ２、ＡｖｒＸｖ３、ＣｉｇＲ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＨｏｐＡＢ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＩ１、ＨｏｐＭ１、ＨｏｐＮ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＨｏｐＵ１、ＨｓｖＢ、ＩｃｓＢ、ＩｐａＡ、ＩｐａＨ、ＩｐａＨ７．８、ＩｐａＨ９．８、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＢ２、ＩｐｇＤ、ＬｃｒＶ、Ｍａｐ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＯｓｐＦ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＰｉｐＢ、ＰｉｐＢ２、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＰｔｈＸｏ１、ＰｔｈＸｏ６、ＰｔｈＸｏ７、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｐｔＰ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｒｆＨ、ＳｒｆＪ、Ｓｓｅ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＴｃｃＰ２、Ｔｉｒ、ＶｉｒＡ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＶｏｐＦ、ＸｏｐＤ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＴ、ＹｐｋＡを含む。

【0055】

真核細胞に対して病原性であり、例えば、Ｙ．エンテロコリチカから欠失／突然変異され得るエルシニア属のＴ３ＳＳエフェクター遺伝子は、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ（ＹｏｐＪとも名付けられる）、およびＹｏｐＴである（Ｔｒｏｓｋｙら、２００８）。真核細胞に対して病原性である個々のエフェクター遺伝子は、シゲラ・フレックスネリ（例えば、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＩｐｇＢ１）、サルモネラ・エンテリカ（例えば、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ）、緑膿菌（例えば、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＥｘｏＵ、ＥｘｏＹ）または大腸菌（例えば、Ｔｉｒ、Ｍａｐ、ＥｓｐＦ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ）から欠失／突然変異され得る。これらの遺伝子の核酸配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋデータベース（ＮＣ＿００２１２０ ＧＩ：１０９５５５３６由来のｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＰ、ｙｏｐＭ、ｙｏｐＴ；ＡＦ３８６５２６．１ ＧＩ：１８４６２５１５由来のＳ．フレックスネリエフェクタータンパク質；ＮＣ＿０１６８１０．１ ＧＩ：３７８６９７９８３またはＦＱ３１２００３．１ ＧＩ：３０１１５６６３１由来のＳ．エンテリカエフェクター；ＡＥ００４０９１．２ ＧＩ：１１０２２７０５４またはＣＰ０００４３８．１ ＧＩ：１１５５８３７９６由来の緑膿菌エフェクター、およびＮＣ＿０１１６０１．１ ＧＩ：２１５４８５１６１由来の大腸菌エフェクタータンパク質）において、当業者に利用可能である。

【0056】

本発明の目的のために、遺伝子は、タンパク質から区別するために、小文字およびイタリック体の文字によって表される。遺伝子（小文字およびイタリック体の文字によって表される）が以下の細菌種名（大腸菌のような）である場合において、それらは、対応する細菌種における対応する遺伝子の突然変異を指す。例えば、ＹｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子によってコードされるエフェクタータンパク質を指す。Ｙ．エンテロコリチカｙｏｐＥは、ｙｏｐＥ遺伝子に突然変異を有するＹ．エンテロコリチカを表す。

【0057】

本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチド性」および「ペプチド性」という用語は、アルファ－アミノと隣接する残基のカルボキシ基との間のペプチド結合によって互いに接続された一連のアミノ酸残基を指定するために、互換的に使用される。少なくとも１０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも２０アミノ酸を含むアミノ酸配列を有するタンパク質が好ましい。

【0058】

本発明によれば、「異種タンパク質またはその断片」は、天然に存在するタンパク質またはその断片、そしてまた人工的に操作されたタンパク質またはその断片を含む。人工的に操作されたタンパク質またはその断片は、例えば、異種タンパク質のバリアントまたは機能的に活性な断片である。本発明の異種タンパク質に関する「バリアントまたはその機能的に活性な断片」とは、断片またはバリアント（アナログ、誘導体または突然変異体など）が、異種タンパク質と同じ生理的機能を示すことができることを意味する。そのようなバリアントは、天然に存在する対立遺伝子バリアントおよび天然に存在しないバリアントを含む。１つまたは複数のアミノ酸の付加、欠失、置換および誘導体化は、改変が断片またはバリアントの機能活性の喪失をもたらさない限り、企図される。好ましくは、機能的に活性な断片またはバリアントは、異種タンパク質の関連部分に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、さらにより好ましくは、少なくとも約９５％の配列同一性、最も好ましくは、少なくとも約９８％の配列同一性を有する。本明細書で使用される場合、「異種タンパク質またはその断片」という用語は、それが融合し得るＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片以外のタンパク質またはその断片を指す。特に、異種タンパク質またはその断片は、本明細書で使用される場合、プロテオーム、すなわち、本発明によって提供および使用される特定の組換えグラム陰性菌株の天然タンパク質相補体全体に属さない、例えば、プロテオーム、すなわち、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属またはシュードモナス属の特定の菌株の天然タンパク質相補体全体に属さない、タンパク質またはその断片を指す。「異種タンパク質またはその断片」は、本明細書で使用される場合、プロテオーム、すなわち、本発明のグラム陰性菌株の天然タンパク質相補体全体に属さないタンパク質またはその断片をコードする遺伝子またはコード配列が、遺伝子形質転換、形質導入またはコンジュゲーションによってグラム陰性菌株に導入されていることを意味することが理解される。異種タンパク質またはその断片は、グラム陰性菌株の染色体または染色体外遺伝エレメント上に位置し得る。異種タンパク質またはその断片をコードする遺伝子またはコード配列は、それが導入される宿主細胞とは異なる起源が起源である。通常、異種タンパク質またはその断片は、ヒト起源を含む動物起源のものである。好ましくは、異種タンパク質またはその断片は、ヒトタンパク質またはその断片である。より好ましくは、異種タンパク質またはその断片は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質、アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、小ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合コンストラクトおよびナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター、およびウイルスタンパク質、またはその断片からなる群から選択される。特に好ましくは、異種タンパク質またはその断片は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質、アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、アンキリンリピートタンパク質、レポータータンパク質、小ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合コンストラクト、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター、およびウイルスタンパク質、またはその断片からなる群から選択される。インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質、アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、およびアンキリンリピートタンパク質、またはその断片からなる群から選択される異種タンパク質またはその断片がさらにより特に好ましい。アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与する動物、好ましくはヒト異種タンパク質もしくはその断片、またはインターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するヒトタンパク質もしくはその断片のような、アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与するタンパク質もしくはその断片、またはインターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質もしくはその断片、特に、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質もしくはその断片が最も好ましい。インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質またはその断片は、好ましくは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質またはその断片、より好ましくは、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するヒトタンパク質またはその断片である。

【0059】

一部の実施形態において、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで互いに独立して融合された同一または２つの異なる異種タンパク質またはその断片をコードする２つのヌクレオチド配列を含む。

【0060】

一部の実施形態において、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで互いに独立して融合された同一または３つの異なる異種タンパク質またはその断片をコードする３つのヌクレオチド配列を含む。一部の実施形態において、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで互いに独立して融合された同一または４つの異なる異種タンパク質またはその断片をコードする４つのヌクレオチド配列を含む。

【0061】

組換えグラム陰性菌株によって発現される異種タンパク質は、通常、１～１５０ｋＤａ、好ましくは、１～１２０ｋＤａ、より好ましくは、１～１００ｋＤａ、最も好ましくは、１０～８０ｋＤａの分子量を有する。異種タンパク質の断片は、通常、１０～１５００アミノ酸、好ましくは、１０～８００アミノ酸、より好ましくは、１００～８００アミノ酸、特に、１００～５００アミノ酸を含有する。本明細書で定義される異種タンパク質の断片は、通常、それが由来する異種タンパク質と同じ機能的性質を有する。

【0062】

一部の実施形態において、異種タンパク質の断片は、異種タンパク質のドメインを含む。したがって、一部の実施形態において、本発明のグラム陰性菌株は、異種タンパク質のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。好ましくは、本発明のグラム陰性菌株は、異種タンパク質の１つまたは２つのドメイン、より好ましくは、異種タンパク質の２つのドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0063】

一部の実施形態において、本発明のグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された、異種タンパク質の反復ドメイン、または異なる異種タンパク質の２つ以上のドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0064】

「タンパク質の同じ機能クラスに属する異種タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、同じ機能を有する異種タンパク質、例えば、特定の酵素活性を有する異種タンパク質、例えば、細胞周期調節などの同じ経路において作用するか、または例えば細菌エフェクタータンパク質の同じクラスに属している共通の特定の特徴を共有する異種タンパク質を指す。タンパク質の機能クラスは、例えば、アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子として作用するタンパク質、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、小ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合コンストラクトおよびナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター、および真核細胞に対する病原性を確立する生物学的プロセスにおいて一緒に作用するウイルスタンパク質である。

【0065】

本発明によれば、「異種タンパク質のドメイン」は、天然に存在するタンパク質のドメインを含み、人工的に操作されたタンパク質のドメインも含む。本明細書で使用される場合、「異種タンパク質のドメイン」という用語は、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質のドメイン以外の異種タンパク質のドメイン、またはそれが融合して融合タンパク質を達成し得るそのＮ末端断片を含むドメイン以外のドメインを指す。特に、異種タンパク質のドメインは、本明細書で使用される場合、プロテオーム、すなわち、本発明によって提供および使用される特定の組換えグラム陰性菌株の天然タンパク質相補体全体に属さない、例えば、プロテオーム、すなわち、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属またはシュードモナス属の特定の菌株の天然タンパク質相補体全体に属さない、異種タンパク質のドメインを指す。通常、異種タンパク質のドメインは、ヒト起源を含む動物起源のものである。好ましくは、異種タンパク質のドメインは、ヒトタンパク質のドメインである。より好ましくは、異種タンパク質のドメインは、アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、小ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合コンストラクトおよびナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター、およびウイルスタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のドメインである。特に好ましくは、異種タンパク質のドメインは、アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、アンキリンリピートタンパク質、レポータータンパク質、小ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合コンストラクト、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター、およびウイルスタンパク質からなる群から選択されるタンパク質のドメインである。アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、およびアンキリンリピートタンパク質からなる群から選択される異種タンパク質のドメインがさらにより特に好ましい。インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与する動物タンパク質のようなインターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するタンパク質のドメイン、好ましくは、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するヒト異種タンパク質のドメイン、特に、１型インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するヒト異種タンパク質のドメインが最も好ましい。

【0066】

組換えグラム陰性菌株によって発現される異種タンパク質のドメインは、通常、１～５０ｋＤａ、好ましくは、１～３０ｋＤａ、より好ましくは、１～２０ｋＤａ、最も好ましくは、１～１５ｋＤａの分子量を有する。

【0067】

本発明によれば、「ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質」は、哺乳動物細胞中に存在する場合に、例えば、本発明の組換えグラム陰性菌株によって哺乳動物細胞に移動した場合に、発現または発現の変更、好ましくは、哺乳動物細胞によるＩＦＮの増加をもたらすシグナル伝達事象またはシグナル伝達カスケードを引き起こすか、またはそれに参加する、異種タンパク質である。ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質には、限定されるものではないが、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＢＫ１、ＩＫＫイプシロン、ＩＲＦ３、ＴＲＥＸ１、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ９ａ、ＤＤＸ３、ＬＣ３、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ－ＰＫ、ＲＩＧ１（ＤＤＸ５８）、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＩＰＳ－１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡ、Ｔｒｉｍ２５、Ｔｒｉｍ３２、Ｔｒｉｍ５６、Ｒｉｐｌｅｔ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＡＮＫ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＰＫＲ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＤＡＩ、ＩＦＩ１６、ＩＦＩＸ、ＭＲＥ１１、ＤＤＸ４１、ＬＳｍ１４Ａ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ１５、Ｋｕ７０、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＴＹＫ２、ＪＡＫ１、ＩＳＧＦ３、ＩＬ１０Ｒ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ４、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳのようなサイクリックジヌクレオチド生成酵素（サイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼ）、またはその断片が含まれる。

【0068】

本発明によれば、「Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質」は、哺乳動物細胞中に存在する場合に、例えば、本発明の組換えグラム陰性菌株によって哺乳動物細胞に移動した場合に、発現または発現の変更、好ましくは、哺乳動物細胞によるＩ型ＩＦＮの発現の増加をもたらすシグナル伝達事象またはシグナル伝達カスケードを引き起こすか、またはそれに参加する、異種タンパク質である。Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質には、限定されるものではないが、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＢＫ１、ＩＫＫｅｐｓｉｌｏｎ、ＩＲＦ３、ＴＲＥＸ１、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ９ａ、ＤＤＸ３、ＬＣ３、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ－ＰＫ、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＩＰＳ－１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡ、Ｔｒｉｍ２５、Ｔｒｉｍ３２、Ｔｒｉｍ５６、Ｒｉｐｌｅｔ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＡＮＫ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＰＫＲ、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＤＡＩ、ＩＦＩ１６、ＩＦＩＸ、ＭＲＥ１１、ＤＤＸ４１、ＬＳｍ１４Ａ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ９、ＤＨＸ３６、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ１５、Ｋｕ７０、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳのようなサイクリックジヌクレオチド生成酵素（サイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼ）、またはその断片が含まれる。

【0069】

Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する好ましいタンパク質は、ＳＴＩＮＧ、ＴＲＩＦ、ＴＢＫ１、ＩＫＫイプシロン、ＩＲＦ３、ＴＲＥＸ１、ＶＰＳ３４、ＡＴＧ９ａ、ＤＤＸ３、ＬＣ３、ＤＤＸ４１、ＩＦＩ１６、ＭＲＥ１１、ＤＮＡ－ＰＫ、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＩＰＳ－１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡ、Ｔｒｉｍ２５、Ｔｒｉｍ３２、Ｔｒｉｍ５６、Ｒｉｐｌｅｔ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ５、ＴＡＮＫ、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＲＦ９、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＰＫＲ、ＬＳｍ１４Ａ、ＬＲＲＦＩＰ１、ＤＨＸ２９、ＤＨＸ１５、ならびにＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳからなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素、またはその断片からなる群から選択される。

【0070】

Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するより好ましいタンパク質は、ｃＧＡＳ（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４のような）、ＲＩＧ１（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｏ９５７８６のような）、ＭＤＡ５（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９ＢＹＸ４のような）、ＩＰＳ－１／ＭＡＶＳ（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ７Ｚ４３４のような）、ＩＲＦ３（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ１４６５３のような）、ＩＲＦ７（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９２９８５のような）、ＩＲＦ９（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ００９７８のような）、ならびにＷｓｐＲ（緑膿菌タンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９ＨＸＴ９のような）、ＤｎｃＶ（コレラ菌タンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ９ＫＶＧ７のような）、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様（Ｂ．セレウス（B. cereus）タンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８１２Ｌ９のような）、ＣｄａＡ（Ｌ．モノサイトゲネス（L. monocytogenes）タンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｙ５Ｅ４のような）、ＣｄａＳ（枯草菌（B. subtilis）タンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｏ３１８５４または構成的に活性なＬ４４Ｆ突然変異のような）およびｃＧＡＳ（ヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４のような）からなる群から選択されるサイクリックジヌクレオチド生成酵素、例えば、サイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼ、またはこれらのタンパク質の断片からなる群から選択される。

【0071】

ＩＰＳ－１／ＭＡＶＳ／Ｃａｒｄｉｆ／ＶＩＳＡは、Ｎ末端ＣＡＲＤドメインを含有し、ヒト配列に対する「Ｑ７Ｚ４３４」およびマウス配列に対する「Ｑ８ＶＣＦ０」のＵｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）識別子を有する、真核生物ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質を指す。「ＩＰＳ－１／ＭＡＶＳ」、「ＭＡＶＳ／ＩＰＳ－１」および「ＭＡＶＳ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、Ｎ末端ＣＡＲＤドメインを含有し、ヒト配列に対する「Ｑ７Ｚ４３４」およびマウス配列に対する「Ｑ８ＶＣＦ０」のＵｎｉｐｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）識別子を含有する、真核生物ミトコンドリア抗ウイルスシグナル伝達タンパク質を指す。

【0072】

一部の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、ＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質またはその断片、ならびにサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼ、またはその断片などのサイクリックジヌクレオチド生成酵素からなる群から選択される。ＣＡＲＤドメインを含有するＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、例えば、通常２つのＣＡＲＤドメインを含有するＲＩＧ１、通常２つのＣＡＲＤドメインを含有するＭＤＡ５、および通常１つのＣＡＲＤドメインを含有するＭＡＶＳである。

【0073】

ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質の断片は、通常、２５～１０００アミノ酸、好ましくは、５０～６００アミノ酸、より好ましくは、１００～５００アミノ酸、さらにより好ましくは、１００～３６２アミノ酸を含有する。一部の実施形態において、ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質の断片は、通常、２５～１０００アミノ酸、好ましくは、５０～６００アミノ酸、より好ましくは、１００～５００アミノ酸、さらにより好ましくは、１００～３６２アミノ酸、特に、１００～２４６アミノ酸を含有するＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質の断片を含むか、あるいはＮ末端アミノ酸のアミノ酸１～アミノ酸１６０を含有するアミノ酸配列の欠失、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｉｄｓ）１～５９またはＮ末端アミノ酸（ａｍｉｎｏ ａｉｄｓ）１～１６０を含有するアミノ酸配列の欠失を有するＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質の断片を含み、ここで、ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質の断片は、通常、２５～１０００アミノ酸、好ましくは、５０～６００アミノ酸、より好ましくは、１００～５００アミノ酸、さらにより好ましくは、１００～３６２アミノ酸を含有する。

【0074】

ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質の断片は、通常、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～５００のいずれかのアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～４００のいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～３００のいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～２９４のいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～２４６のいずれかのアミノ酸配列を含有する。

【0075】

一部の実施形態において、ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質の断片は、ＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質、好ましくは、ヒトＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質の、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２９４以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４６以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２３１以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２２９以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１８以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１００以下を含むアミノ酸配列、および少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１０１以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特に、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７を含むアミノ酸配列、および少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１００以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、最も特に、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５以下を含むアミノ酸配列を含むアミノ酸配列を含有する。

【0076】

一部の好ましい実施形態において、異種タンパク質は、ＩＦＮ応答もしくはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質の断片であるか、またはＩＦＮ応答もしくはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質の断片を含む。通常、ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質の断片は、少なくとも１つのＣＡＲＤドメインを含む。これらの実施形態において、異種タンパク質は、特に、ＩＦＮ応答またはＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２９４のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４６のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２３１のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２９のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１０１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、より特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列、およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１００のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するか、またはそれからなる。

【0077】

これらの実施形態において、異種タンパク質は、より特に、ＲＩＧ－１のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４６のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２９のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１８のアミノ酸配列、およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列、特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列、最も特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはＭＡＶＳのＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１００のアミノ酸配列、およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１０１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはＭＤＡ５のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２９４のアミノ酸配列およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２３１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、さらにより特に、ＲＩＧ－１のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列、またはＭＡＶＳのＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１００のアミノ酸配列から選択されるアミノ酸配列、またはＭＤＡ５のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２９４のアミノ酸配列およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２３１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有するか、またはそれからなる。

【0078】

ヒトＲＩＧ－１のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、およびマウスＲＩＧ－１のＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４６のアミノ酸配列が最も好ましい。ヒトＲＩＧ－１の１～２４５断片およびマウスＲＩＧ－１の１～２４６断片は、互いに、７３％の配列同一性（および８５％の配列類似性）に相当し、それらは、機能的に同等であり、すなわち、両方の断片は、マウス細胞およびヒト細胞において同等の活性を示す。

【0079】

一部の好ましい実施形態において、異種タンパク質は、サイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素の断片である。サイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素の断片は、サイクリックジヌクレオチド生成酵素、好ましくは、ヒトｃＧＡＳの、通常、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～６００のいずれかのアミノ酸配列、好ましくは、アミノ酸５０～アミノ酸１００～５５０のいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、アミノ酸６０～アミノ酸１００～５３０のいずれかのアミノ酸配列、特に、アミノ酸６０～アミノ酸５３０のアミノ酸配列、より特に、アミノ酸１４６～アミノ酸５０７のアミノ酸配列、またはアミノ酸１６１～アミノ酸５２２のアミノ酸配列、最も特に、アミノ酸１６１～アミノ酸５２２のアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態において、ｃＧＡＳの断片は、特に、少なくともアミノ酸６０～アミノ酸４２２以下を含むアミノ酸配列、少なくともアミノ酸１４６～アミノ酸５０７以下を含むアミノ酸配列、および少なくともアミノ酸１６１～アミノ酸５２２以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。一部の実施形態において、ｃＧＡＳの断片は、より特に、アミノ酸６０～アミノ酸４２２のアミノ酸配列、アミノ酸１４６～アミノ酸５０７のアミノ酸配列、およびアミノ酸１６１～アミノ酸５２２のアミノ酸配列、最も好ましくは、アミノ酸１６１～アミノ酸５２２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。

【0080】

より好ましい実施形態において、異種タンパク質またはその断片は、ＣＡＲＤドメインを含むＲＩＧ１、ＭＤＡ５、およびＭＡＶＳ、またはその断片からなる群から選択されるＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質であり、ここで、断片は、少なくとも１つのＣＡＲＤドメイン、ならびにｃＧＡＳおよびその断片、特に、ＣＡＲＤドメインを含むＲＩＧ１およびその断片からなる群から選択される、少なくとも１つのＣＡＲＤドメイン、ならびにｃＧＡＳおよびその断片を含み、断片は、少なくとも１つのＣＡＲＤドメイン、ＣＡＲＤドメインを含むＭＡＶＳおよびその断片を含み、断片は、少なくとも１つのＣＡＲＤドメイン、ならびにｃＧＡＳおよびその断片を含む。上記に概説されるこれらのタンパク質の断片が特に好ましい。このより好ましい実施形態において、ＣＡＲＤドメインを含むＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳは、天然に存在するＣＡＲＤドメイン、および任意選択で、例えば、ＲＩＧ－１またはその断片、好ましくは、１～５００、より好ましくは、１～２５０を含有する断片の場合において、天然に存在するヘリカーゼドメインを含む天然に存在するＣＡＲＤドメイン後にさらにＣ末端アミノ酸を含み、ここで、天然に存在するヘリカーゼドメインまたはその断片は、機能的ではなく、すなわち、ＣＡＲＤドメインに結合しないか、またはＭＡＶＳもしくはその断片、好ましくは、１～５００、より好ましくは、１～２５０、さらにより好ましくは１～１５０アミノ酸を含有する断片の場合において、任意選択で下流のＣ末端配列を含む。これらの実施形態において、ｃＧＡＳおよびその断片は、通常、天然に存在するシンターゼドメイン（ＮＴアーゼコアおよびＣ末端ドメイン；（Ｋｒａｎｚｕｓｃｈら、２０１３）およびヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４に記載されるヒトｃＧＡＳのアミノ酸１６０～５２２）を含み、好ましくは、ｃＧＡＳおよびその断片は、天然に存在するシンターゼドメインを含むが、部分または完全Ｎ末端ドメインの欠失、好ましくは、完全Ｎ末端ヘリックス伸長（Ｎ末端ヘリックス伸長；（Ｋｒａｎｚｕｓｃｈら、２０１３）およびヒトタンパク質に対するＵｎｉｐｒｏｔ．Ｑ８Ｎ８８４に記載されるヒトｃＧＡＳのアミノ酸１～１６０）の欠失を有する。部分または完全Ｎ末端ドメインの欠失は、好ましくは、アミノ酸１～１６０の欠失である。

【0081】

好ましい実施形態において、異種タンパク質またはその断片は、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリー（ＲＩＧ１およびＭＤＡ５のような）またはその断片、抗ウイルスシグナル伝達およびＩ型ＩＦＮ誘導に関与する他のＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質（ＭＡＶＳのような）またはその断片、ならびにＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素からなる群から選択されるＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質である。ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素は、ＳＴＩＮＧの刺激をもたらす。

【0082】

一部の実施形態において、異種タンパク質またはその断片は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択される、より好ましくは、ＲＩＧ１、ＭＡＶＳ、ＭＤＡ５、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様、およびｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択される、最も好ましくは、ＲＩＧ１またはその断片およびｃＧＡＳまたはその断片からなる群から選択される、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質である。

【0083】

より好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択され、さらにより好ましくは、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、およびｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択され、特に、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳおよびｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択される。上記に記載されるこれらのタンパク質の断片が特に好ましい。

【0084】

このより好ましい実施形態において、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳの断片は、通常、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～５００のいずれかのアミノ酸配列、好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～４００のいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～３００のいずれかのアミノ酸配列を含有する。

【0085】

このより好ましい実施形態において、ＲＩＧ１の断片は、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４６以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２２９以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１８以下を含むアミノ酸配列、および少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７以下を含むアミノ酸配列、特に、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し；ＭＤＡ５の断片は、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２９４以下を含むアミノ酸配列、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２３１以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し、ＭＡＶＳの断片は、少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１００以下を含むアミノ酸配列および少なくともＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１０１以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。

【0086】

このより好ましい実施形態において、ＲＩＧ１の断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４６のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２９のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１８のアミノ酸配列、およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列、さらにより特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２２８のアミノ酸配列、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２１７のアミノ酸配列、最も特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２４５のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し；ＭＤＡ５の断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸２９４のアミノ酸配列およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸２３１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有し；ＭＡＶＳの断片は、より特に、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００のアミノ酸配列およびＮ末端アミノ酸１～アミノ酸１０１のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。

【0087】

このより好ましい実施形態において、ｃＧＡＳの断片は、ヒトｃＧＡＳの、通常、Ｎ末端アミノ酸１～アミノ酸１００～６００のいずれかのアミノ酸配列、好ましくは、アミノ酸５０～アミノ酸１００～５５０のいずれかのアミノ酸配列、より好ましくは、アミノ酸６０～アミノ酸１００～５３０のいずれかのアミノ酸配列、特に、アミノ酸６０～アミノ酸５３０のアミノ酸配列、アミノ酸１４６～アミノ酸５０７のアミノ酸配列、またはアミノ酸１６１～アミノ酸５３０のアミノ酸配列、より特に、アミノ酸６０～アミノ酸５３０のアミノ酸配列、またはアミノ酸１６１～アミノ酸５３０のアミノ酸配列を含有する。

【0088】

このより好ましい実施形態において、ｃＧＡＳの断片は、特に、少なくともアミノ酸６０～アミノ酸４２２以下を含むアミノ酸配列、少なくともアミノ酸１４６～アミノ酸５０７以下を含むアミノ酸配列、および少なくともアミノ酸１６１～アミノ酸５２２以下を含むアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。

【0089】

このより好ましい実施形態において、ｃＧＡＳの断片は、より特に、アミノ酸６０～アミノ酸４２２のアミノ酸配列、アミノ酸１４６～アミノ酸５０７のアミノ酸配列、アミノ酸１６１～アミノ酸５２２のアミノ酸配列、最も特に、アミノ酸１６１～アミノ酸５２２のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含有する。

【0090】

さらにより好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質は、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２４５}（配列番号１）、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２２８}（配列番号２）、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２１７}（配列番号３）、マウスＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２４６}（配列番号４）、マウスＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２２９}（配列番号５）、マウスＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２１８}（配列番号６）、ヒトＭＡＶＳ ＣＡＲＤドメイン_{１－１００}（配列番号７）、マウスＭＡＶＳ ＣＡＲＤドメイン_{１－１０１}（配列番号８）、Ｎ．ベクテンシス（N. vectensis）ｃＧＡＳ（配列番号９）、ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（配列番号１０）、マウスｃＧＡＳ_{１４６－５０７}（配列番号１１）、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ_{６０－４２２}（配列番号１２）、マウスＭＤＡ５_{１－２９４}（配列番号１３）、マウスＭＤＡ５_{１－２３１}（配列番号１４）、ヒトＭＤＡ５_{１－２９４}（配列番号１５）、およびヒトＭＤＡ５_{１－２３１}（配列番号１６）からなる群から選択される。

【0091】

特に好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質は、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２４５}、（配列番号１）、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２２８}（配列番号２）、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２１７}（配列番号３）、ヒトＭＡＶＳ ＣＡＲＤドメイン_{１－１００}（配列番号７）、およびヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（配列番号１０）からなる群から選択される。

【0092】

より特に好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質は、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２４５}（配列番号１）、マウスＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２４６}（配列番号４）、マウスＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２２９}（配列番号５）、マウスＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２１８}（配列番号６）、およびヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（配列番号１０）からなる群から選択され、最も特に、ヒトＲＩＧ１ ＣＡＲＤドメイン_{１－２４５}（配列番号１）およびヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（配列番号１０）からなる群から選択される。

【0093】

ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーは、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５およびＬＧＰ２からなる群から選択されるタンパク質を含む。好ましいＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、ＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質ＲＩＧ１およびＭＤＡ５、特に、ＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質ＲＩＧ１である。他の好ましいＩ型ＩＦＮ誘導に関与するＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質は、ＭＡＶＳからなる群から選択されるタンパク質を含む。

【0094】

一部の好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＭＤＡ５のＣＡＲＤドメイン、および／またはＭＡＶＳのＣＡＲＤドメイン、ならびにＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳおよびｃＧＡＳ、ならびにその断片を含むタンパク質の群から選択され、好ましくは、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＭＤＡ５のＣＡＲＤドメインおよび／またはＭＡＶＳのＣＡＲＤドメイン、ならびにＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、およびｃＧＡＳ、またはその断片から構成されるタンパク質の群から選択される。

【0095】

一部の好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＭＤＡ５のＣＡＲＤドメイン、ＭＡＶＳのＣＡＲＤドメイン、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳからなる群から選択され、より好ましくは、ＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様、およびｃＧＡＳからなる群から選択される。

【0096】

一部の好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、１つまたは複数（例えば、２つ、３つまたは４つ）のＣＡＲＤドメインを含み、好ましくは、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、および／またはＭＡＶＳの、好ましくは、ＲＩＧ１および／またはＭＡＶＳの、１つまたは複数（例えば、２つ、３つまたは４つ）の、ＣＡＲＤドメインを含む。より好ましい実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、ＲＩＧ１の両方のＣＡＲＤドメイン、ＭＤＡ５の両方のＣＡＲＤドメイン、ならびに／またはＭＡＶＳおよびｃＧＡＳのＣＡＲＤドメイン、またはその断片、特に、ＲＩＧ１およびｃＧＡＳの両方のＣＡＲＤドメイン、またはその断片、より特に、ＲＩＧ１の両方のＣＡＲＤドメインを含む。

【0097】

一部の実施形態において、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与する異種タンパク質は、酵素機能なしのＩ型ＩＦＮ応答を誘導するタンパク質、および酵素機能ありのＩ型ＩＦＮ応答を誘導するタンパク質からなる群から選択される。本発明に包含される酵素機能なしのＩ型ＩＦＮ応答を誘導するタンパク質は、通常、少なくとも１つのＣＡＲＤドメイン、好ましくは、２つのＣＡＲＤドメインを含む。ＣＡＲＤドメインは、通常、６～７つのアルファ－ヘリックスの束、好ましくは、疎水性コアおよび荷電残基から構成される外側面を有する６～７つの逆平行アルファ－ヘリックスの配列から構成される。本発明に包含される酵素機能ありのＩ型ＩＦＮ応答を誘導するタンパク質は、通常、ＳＴＩＮＧの刺激をもたらすサイクリックジヌクレオチド生成酵素（サイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼ）またはそのドメイン、好ましくは、ジ－アデニル酸シクラーゼ（ＤＡＣ）、ジ－グアニル酸シクラーゼ（ＤＧＣ）もしくはＧＭＰ－ＡＭＰシクラーゼ（ＧＡＣ）、またはそのドメインを含む。

【0098】

本発明によれば、「アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質」には、限定されるものではないが、Ｂａｄ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂｍｔ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ－ｘＬ、Ａｐａｆ１、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ１０、ＤＦＦＡ、ＤＦＦＢ、ＲＯＣＫ１、ＡＰＰ、ＣＡＤ、ＩＣＡＤ、ＣＡＤ、ＥｎｄｏＧ、ＡＩＦ、ＨｔｒＡ２、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ａｒｔｓ、ＡＴＭ、ＡＴＲ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ－１（Ｓ）、ＩＡＰファミリー、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、１４－３－３タンパク質、ＰＫＡ、ＰＫＣ、ＰＩ３Ｋ、Ｅｒｋ１／２、ｐ９０ＲＳＫ、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＤＤ、ＦＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＭＫＫ７、ＪＮＫ、ＦＬＩＰ、ＦＫＨＲ、ＧＳＫ３、ＣＤＫ、ならびにＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））、およびＣｉｐ１／Ｗａｆ１／Ｋｉｐ１－２ファミリー（ｐ２１（Ｃｉｐ１／Ｗａｆ１）、ｐ２７（Ｋｉｐ１）、ｐ５７（Ｋｉｐ２）のようなそれらの阻害剤が含まれる。好ましくは、Ｂａｄ、Ｂｍｔ、Ｂｃｌ２、Ｂａｋ、Ｂａｘ、Ｐｕｍａ、Ｎｏｘａ、Ｂｉｍ、Ｂｃｌ－ｘＬ、カスパーゼ９、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、Ｂｏｋ／Ｍｔｄ、Ｂｍｆ、Ｍｃｌ－１（Ｓ）、ＬＣ８、ＰＰ２Ｂ、ＴＲＡＤＤ、Ｄａｘｘ、カスパーゼ８、カスパーゼ２、ＲＩＰ、ＲＡＩＤＤ、ＦＫＨＲ、ＣＤＫ、およびＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のようなそれらの阻害剤、最も好ましくは、ＢＩＭ、Ｂｉｄ、切断型Ｂｉｄ、ＦＡＤＤ、カスパーゼ３（およびそのサブユニット）、Ｂａｘ、Ｂａｄ、Ａｋｔ、ＣＤＫ、ならびにＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のようなそれらの阻害剤が使用される（ＢｒｅｎｎｅｒおよびＭａｋ、２００９；ＣｈａｌａｈおよびＫｈｏｓｒａｖｉ－Ｆａｒ、２００８；ＦｕｃｈｓおよびＳｔｅｌｌｅｒ、２０１１）。加えて、アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質には、ＤＩＶＡ、Ｂｃｌ－Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、Ｅｇｌ－１、Ｂｃｌ－Ｇｓ、チトクロムＣ、ベクリン、ＣＥＤ－１３、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ－Ｂ、Ｂｃｌ－Ｗ、Ｃｅｄ－９、Ａ１、ＮＲ１３、Ｂｆｌ－１、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ８が含まれる。

【0099】

アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与するタンパク質は、アポトーシス促進性タンパク質、抗アポトーシス性タンパク質、アポトーシス予防経路の阻害剤、および生存促進性シグナル伝達または経路の阻害剤からなる群から選択される。アポトーシス促進性タンパク質は、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ－Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ－Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ－１およびＣＥＤ－１３、チトクロムＣ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、およびＣＤＫ、ならびにＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のようなそれらの阻害剤からなる群から選択されるか、またはＢａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ－Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ－１、Ａｐａｆ１、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ－Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ－１およびＣＥＤ－１３、チトクロムＣ、ＦＡＤＤ、およびカスパーゼファミリーからなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ－Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ｅｇｌ－１、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ－Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ－１およびＣＥＤ－１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリー、ＣＤＫ、ならびにＩＮＫ４ファミリー（ｐ１６（Ｉｎｋ４ａ）、ｐ１５（Ｉｎｋ４ｂ）、ｐ１８（Ｉｎｋ４ｃ）、ｐ１９（Ｉｎｋ４ｄ））のようなそれらの阻害剤が好ましい。Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｄｉｖａ、Ｂｃｌ－Ｘｓ、Ｎｂｋ／Ｂｉｋ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｍ、Ｂａｄ、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、Ｂｏｋ、Ａｐａｆ１、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｃｌ－Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ－１およびＣＥＤ－１３、Ｓｍａｃ／Ｄｉａｂｌｏ、ＦＡＤＤ、カスパーゼファミリーが同様に好ましい。

【0100】

抗アポトーシス性タンパク質は、Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ、Ｂｃｌ－Ｂ、Ｂｃｌ－Ｗ、Ｍｃｌ－１、Ｃｅｄ－９、Ａ１、ＮＲ１３、ＩＡＰファミリーおよびＢｆｌ－１からなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂｃｌ－２、Ｂｃｌ－Ｘｌ、Ｂｃｌ－Ｂ、Ｂｃｌ－Ｗ、Ｍｃｌ－１、Ｃｅｄ－９、Ａ１、ＮＲ１３およびＢｆｌ－１が好ましい。

【0101】

アポトーシス予防経路の阻害剤は、Ｂａｄ、ＮｏｘａおよびＣｄｃ２５Ａからなる群から選択されるタンパク質を含む。ＢａｄおよびＮｏｘａが好ましい。

【0102】

生存促進性シグナル伝達または経路の阻害剤は、ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２Ａ、ＰＨＬＰＰ、ＪＮＫ、ｐ３８からなる群から選択されるタンパク質を含む。ＰＴＥＮ、ＲＯＣＫ、ＰＰ２ＡおよびＰＨＬＰＰが好ましい。

【0103】

一部の実施形態において、アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与する異種タンパク質は、ＢＨ３のみのタンパク質、カスパーゼ、およびアポトーシスのデスレセプター制御の細胞内シグナル伝達タンパク質、またはその断片からなる群から選択される。ＢＨ３のみのタンパク質が好ましい。ＢＨ３のみのタンパク質は、Ｂａｄ、ＢＩＭ、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、Ｐｕｍａ、Ｂｉｋ／Ｎｂｋ、Ｂｏｄ、Ｈｒｋ／Ｄｐ５、ＢＮＩＰ１、ＢＮＩＰ３、Ｂｍｆ、Ｎｏｘａ、Ｍｃｌ－１、Ｂｃｌ－Ｇｓ、ベクリン１、Ｅｇｌ－１ならびにＣＥＤ－１３からなる群から選択されるタンパク質を含む。Ｂａｄ、ＢＩＭ、ＢｉｄおよびｔＢｉｄ、特に、ｔＢｉｄが好ましい。

【0104】

カスパーゼは、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０からなる群から選択されるタンパク質を含む。カスパーゼ３、カスパーゼ８およびカスパーゼ９が好ましい。

【0105】

アポトーシスのデスレセプター制御の細胞内シグナル伝達タンパク質は、ＦＡＤＤ、ＴＲＡＤＤ、ＡＳＣ、ＢＡＰ３１、ＧＵＬＰ１／ＣＥＤ－６、ＣＩＤＥＡ、ＭＦＧ－Ｅ８、ＣＩＤＥＣ、ＲＩＰＫ１／ＲＩＰ１、ＣＲＡＤＤ、ＲＩＰＫ３／ＲＩＰ３、Ｃｒｋ、ＳＨＢ、ＣｒｋＬ、ＤＡＸＸ、１４－３－３ファミリー、ＦＬＩＰ、ＤＦＦ４０および４５、ＰＥＡ－１５、ＳＯＤＤからなる群から選択されるタンパク質を含む。ＦＡＤＤおよびＴＲＡＤＤが好ましい。

【0106】

一部の実施形態において、アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与する２つの異種タンパク質は、グラム陰性菌株に含まれ、ここで、一方のタンパク質は、アポトーシス促進性タンパク質であり、他方のタンパク質は、アポトーシス予防経路の阻害剤であるか、または一方のタンパク質は、アポトーシス促進性タンパク質であり、他方のタンパク質は、生存促進性シグナル伝達または経路の阻害剤である。

【0107】

本発明に包含されるアポトーシス促進性タンパク質は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスに囲まれた疎水性ヘリックスを有し、通常、ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３またはＢＨ４ドメインの少なくとも１つを含み、好ましくは、少なくとも１つのＢＨ３ドメインを含む。通常、本発明に包含されるアポトーシス促進性タンパク質は、酵素活性を有さない。

【0108】

本発明に包含される抗アポトーシス性タンパク質は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスに囲まれた疎水性ヘリックスを有し、異なるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３およびＢＨ４ドメインの組み合わせ、好ましくは、異なるＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３およびＢＨ４ドメインの組み合わせを含み、ここで、ＢＨ１およびＢＨ２ドメインが存在し、より好ましくは、ＢＨ４－ＢＨ３－ＢＨ１－ＢＨ２、ＢＨ１－ＢＨ２、ＢＨ４－ＢＨ１－ＢＨ２またはＢＨ３－ＢＨ１－ＢＨ２（Ｎ末端からＣ末端）である。加えて、少なくとも１つのＢＩＲドメインを含有するタンパク質も包含される。

【0109】

本発明に包含されるアポトーシス予防経路の阻害剤は、通常、アルファヘリックス構造、好ましくは、両親媒性ヘリックスに囲まれた疎水性ヘリックスを有し、通常、１つのＢＨ３ドメインを含む。

【0110】

ＢＨ１、ＢＨ２、ＢＨ３またはＢＨ４ドメインは、それぞれ、通常、約５～約５０アミノ酸長である。したがって、一部の実施形態において、アポトーシスまたはアポトーシス調節に関与する異種タンパク質は、約５～約２００、好ましくは、約５～約１５０、より好ましくは、約５～約１００、最も好ましくは、約５～約５０、特に、約５～約２５アミノ酸長であるアポトーシスまたはアポトーシス調節に関与する異種タンパク質からなる群から選択される。

【0111】

特に好ましい異種タンパク質は、アポトーシス誘導因子ｔＢＩＤのＢＨ３ドメイン、より特に、配列番号１７～２０、好ましくは、配列番号１７または配列番号１８からなる群から選択される配列を含むＢＨ３ドメインである。

【0112】

アポトーシス調節因子ＢＡＸのＢＨ３ドメイン、より特に、配列番号２１～２４、好ましくは、配列番号２１または配列番号２２からなる群から選択される配列を含むＢＡＸドメインが同様に好ましい。ヒトおよびマウス配列は、配列番号で与えられるが、すべての他の種のｔＢＩＤおよびＢＡＸ ＢＨ３ドメインが、同様に含まれる。

【0113】

別の特に好ましい異種タンパク質は、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質のドメインを含有する異種タンパク質、より特に、ｉ）配列番号１～６からなる群から選択される配列を含むＲＩＧ１のＣＡＲＤドメイン、ｉｉ）配列番号１３～１６、好ましくは、配列番号１５または１６からなる群から選択される配列を含むＭＤＡ５のＣＡＲＤドメイン、およびｉｉｉ）配列番号７または８、好ましくは、配列番号７からなる群から選択される配列を含むＭＡＶＳのＣＡＲＤドメインからなる群から選択されるＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質のドメインを含有する異種タンパク質である。別の特に好ましい異種タンパク質は、全長ｃＧＡＳ、例えば、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ（配列番号９）、ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（配列番号１０）、Ｎ．ベクテンシスｃＧＡＳ_{６０－４２２}（配列番号１２）またはマウスｃＧＡＳ_{１４６－５０７}（配列番号１１）である。最も特に好ましい異種タンパク質は、ヒトＲＩＧ１（配列番号１～３）のＣＡＲＤドメイン、特に、ヒトＲＩＧ１（配列番号１）およびヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（配列番号１０）のＣＡＲＤドメインを含有する異種タンパク質である。

【0114】

一部の実施形態において、異種タンパク質は、プロドラッグ変換酵素である。これらの実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、プロドラッグ変換酵素を発現し、好ましくは、発現および分泌する。本明細書で称されるプロドラッグ変換酵素は、非毒性プロドラッグを毒性薬物に変換する酵素、好ましくは、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンキナーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、カルボキシルエステラーゼ、ニトロレダクターゼ、カルボキシペプチダーゼおよびベータ－グルクロニダーゼからなる（ｃｏｎｓｉｔｉｎｇ ｏｆ）群から選択される酵素、より好ましくは、シトシンデアミナーゼ、プリンヌクレオシドホスホリラーゼ、チミジンキナーゼおよびベータ－ガラクトシダーゼからなる（ｃｏｎｓｉｔｉｎｇ ｏｆ）群から選択される酵素を含む。

【0115】

「プロテアーゼ切断部位」という用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸配列内、例えば、タンパク質または融合タンパク質のアミノ酸配列内の特異的なアミノ酸モチーフを指し、これは、アミノ酸モチーフを認識する特異的なプロテアーゼによって切断される。概説について、（Ｗａｕｇｈ、２０１１）を参照されたい。プロテアーゼ切断部位の例は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ ３Ｃ）、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼおよびトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフである。

【0116】

以下のアミノ酸モチーフは、個々のプロテアーゼによって認識される：
－ Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ａｓｐ－Ｌｙｓ：エンテロキナーゼ（軽鎖）／エンテロペプチダーゼ（配列番号３７）
－ Ｌｅｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ／Ｇｌｙ－Ｐｒｏ：ＰｒｅＳｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ／ヒトライノウイルスプロテアーゼ（ＨＲＶ ３Ｃ）（配列番号３８）
－ Ｇｌｕ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｔｙｒ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－ＳｅｒおよびＴＥＶプロテアーゼ（タバコエッチウイルス）によって認識されるＧｌｕ－Ｘ－Ｘ－Ｔｙｒ－Ｘ－Ｇｌｎ－Ｇｌｙ／Ｓｅｒ（ここで、Ｘは任意のアミノ酸である）に基づく改変モチーフ（配列番号３９）および（配列番号４０）
－ Ｇｌｕ－Ｔｈｒ－Ｖａｌ－Ａｒｇ－Ｐｈｅ－Ｇｌｎ－Ｓｅｒ：ＴＶＭＶプロテアーゼ（配列番号４１）
－ Ｉｌｅ－（ＧｌｕまたはＡｓｐ）－Ｇｌｙ－Ａｒｇ：第Ｘａ因子プロテアーゼ（配列番号４２）
－ Ｌｅｕ－Ｖａｌ－Ｐｒｏ－Ａｒｇ／Ｇｌｙ－Ｓｅｒ：トロンビン（配列番号４３）。

【0117】

プロテアーゼ切断部位に包含されるものは、本明細書で使用される場合、ユビキチンである。したがって、一部の好ましい実施形態において、ユビキチンは、プロテアーゼ切断部位として使用され、すなわち、ヌクレオチド配列は、プロテアーゼ切断部位としてユビキチンをコードし、これは、Ｎ末端部位で特異的ユビキチンプロセシングプロテアーゼによって切断され得、例えば、融合タンパク質が送達されている細胞において内因性に（ｅｎｄｏｇｅｎｅｏｕｓｌｙ）、Ｎ末端部位で脱ユビキチン化酵素と呼ばれる特異的ユビキチンプロセシングプロテアーゼによって切断され得る。ユビキチンは、内因性ユビキチン特異的Ｃ末端プロテアーゼ（脱ユビキチン化酵素、ＤＵＢ）の群によってそのＣ末端でプロセシングされる。ＤＵＢによるユビキチンの切断は、ユビキチンのまさにＣ末端（Ｇ７６後）で起こるはずである。

【0118】

「突然変異」という用語は、本明細書において一般的な用語として使用され、単一の塩基対および複数の塩基対の両方の変更を含む。そのような突然変異には、置換、フレームシフト突然変異、欠失、挿入およびトランケーションが含まれ得る。

【0119】

「核局在化シグナル」という用語は、本明細書で使用される場合、真核細胞の核への移入のためのタンパク質をマークするアミノ酸配列を指し、好ましくは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原由来ＮＬＳ（ＰＰＫＫＫＲＫＶ）（配列番号４４）などのウイルス核局在化シグナルを含む。

【0120】

「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、ＡｃｌＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳｓｐＩ、ＭｌｕＣＩ、Ｔｓｐ５０９Ｉ、ＰｃｉＩ、ＡｇｅＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｆｕＡＩ、ＳｅｘＡＩ、ＭｌｕＩ、ＢｃｅＡＩ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＡｆｌＩＩＩ、ＳｐｅＩ、ＢｓｒＩ、ＢｍｒＩ、ＢｇｌＩＩ、ＡｆｅＩ、ＡｌｕＩ、ＳｔｕＩ、ＳｃａＩ、ＣｌａＩ、ＢｓｐＤＩ、ＰＩ－ＳｃｅＩ、ＮｓｉＩ、ＡｓｅＩ、ＳｗａＩ、ＣｓｐＣＩ、ＭｆｅＩ、ＢｓｓＳＩ、ＢｍｇＢＩ、ＰｍｌＩ、ＤｒａＩＩＩ、ＡｌｅＩ、ＥｃｏＰ１５Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＡｌｗＮＩ、ＢｔｓＩＭｕｔＩ、ＴｓｐＲＩ、ＮｄｅＩ、ＮｌａＩＩＩ、ＣｖｉＡＩＩ、ＦａｔＩ、ＭｓｌＩ、ＦｓｐＥＩ、ＸｃｍＩ、ＢｓｔＸＩ、ＰｆｌＭＩ、ＢｃｃＩ、ＮｃｏＩ、ＢｓｅＹＩ、ＦａｕＩ、ＳｍａＩ、ＸｍａＩ、ＴｓｐＭＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＬｐｎＰＩ、ＡｃｉＩ、ＳａｃＩＩ、ＢｓｒＢＩ、ＭｓｐＩ、ＨｐａＩＩ、ＳｃｒＦＩ、ＢｓｓＫＩ、ＳｔｙＤ４Ｉ、ＢｓａＪＩ、ＢｓｌＩ、ＢｔｇＩ、ＮｃｉＩ、ＡｖｒＩＩ、ＭｎｌＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｎｂ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、ＳｂｆＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｂｓｕ３６Ｉ、ＥｃｏＮＩ、ＨｐｙＡＶ、ＢｓｔＮＩ、ＰｓｐＧＩ、ＳｔｙＩ、ＢｃｇＩ、ＰｖｕＩ、ＢｓｔＵＩ、ＥａｇＩ、ＲｓｒＩＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｍＢＩ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｐＪＩ、ＳｇｒＡＩ、ＢｆａＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＸｈｏＩ、ＥａｒＩ、ＡｃｕＩ、ＰｓｔＩ、ＢｐｍＩ、ＤｄｅＩ、ＳｆｃＩ、ＡｆｌＩＩ、ＢｐｕＥＩ、ＳｍｌＩ、ＡｖａＩ、ＢｓｏＢＩ、ＭｂｏＩＩ、ＢｂｓＩ、ＸｍｎＩ、ＢｓｍＩ、Ｎｂ．ＢｓｍＩ、ＥｃｏＲＩ、ＨｇａＩ、ＡａｔＩＩ、ＺｒａＩ、Ｔｔｈ１１１Ｉ ＰｆｌＦＩ、ＰｓｈＡＩ、ＡｈｄＩ、ＤｒｄＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、ＳａｃＩ、ＢｓｅＲＩ、ＰｌｅＩ、Ｎｔ．ＢｓｔＮＢＩ、ＭｌｙＩ、ＨｉｎｆＩ、ＥｃｏＲＶ、ＭｂｏＩ、Ｓａｕ３ＡＩ、ＤｐｎＩＩ ＢｆｕＣＩ、ＤｐｎＩ、ＢｓａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＢｓｒＤＩ、Ｎｂ．ＢｓｒＤＩ、ＢｂｖＩ、ＢｔｓＩ、Ｎｂ．ＢｔｓＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＳｆａＮＩ、ＳｐｈＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＮａｅＩ、ＮｇｏＭＩＶ、ＢｇｌＩ、ＡｓｉＳＩ、ＢｔｇＺＩ、ＨｉｎＰ１Ｉ、ＨｈａＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＮｏｔＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＭｗｏＩ、ＮｈｅＩ、ＢｍｔＩ、ＳａｐＩ、ＢｓｐＱＩ、Ｎｔ．ＢｓｐＱＩ、ＢｌｐＩ、ＴｓｅＩ、ＡｐｅＫＩ、Ｂｓｐ１２８６Ｉ、ＡｌｗＩ、Ｎｔ．ＡｌｗＩ、ＢａｍＨＩ、ＦｏｋＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＰｈｏＩ、ＦｓｅＩ、ＳｆｉＩ、ＮａｒＩ、ＫａｓＩ、ＳｆｏＩ、ＰｌｕＴＩ、ＡｓｃＩ、ＥｃｉＩ、ＢｓｍＦＩ、ＡｐａＩ、ＰｓｐＯＭＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＮｌａＩＶ、ＫｐｎＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＢｓａＩ、ＨｐｈＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｖａＩＩ、ＢａｎＩ、ＢａｅＧＩ、ＢｓａＨＩ、ＢａｎＩＩ、ＲｓａＩ、ＣｖｉＱＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ、ＢｃｉＶＩ、ＳａｌＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｃｏＤＩ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｇＩ、ＡｃｃＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｔｓｐ４５Ｉ、ＨｐａＩ、ＰｍｅＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＢｓｉＨＫＡＩ、ＡｐｏＩ、ＮｓｐＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｔＹＩ、ＨａｅＩＩ、ＣｖｉＫＩ－１、ＥｃｏＯ１０９Ｉ、ＰｐｕＭＩ、Ｉ－ＣｅｕＩ、ＳｎａＢＩ、Ｉ－ＳｃｅＩ、ＢｓｐＨＩ、ＢｓｐＥＩ、ＭｍｅＩ、ＴａｑαＩ、ＮｒｕＩ、Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、ＸｂａＩ、ＢｃｌＩ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＦｓｐＩ、ＰＩ－ＰｓｐＩ、ＭｓｃＩ、ＢｓｒＧＩ、ＭｓｅＩ、ＰａｃＩ、ＰｓｉＩ、ＢｓｔＢＩ、ＤｒａＩ、ＰｓｐＸＩ、ＢｓａＷＩ、ＢｓａＡＩ、ＥａｅＩ、好ましくは、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩなどの制限エンドヌクレアーゼによる切断のためのいくつかの制限酵素認識部位を含有する短いＤＮＡ配列を指す。「多重クローニング部位」という用語は、本明細書で使用される場合、例えばＧａｔｅｗａｙクローニング戦略において、またはギブソンアセンブリーまたはｔｏｐｏクローニングなどの方法のための、組換え事象のために使用される短いＤＮＡ配列をさらに指す。

【0121】

「野生型株」または「野生型のグラム陰性菌株」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在するバリアント、またはベクターの使用を可能にする遺伝子改変、例えば、制限エンドヌクレアーゼまたは抗生物質耐性遺伝子における欠失突然変異を含有する天然に存在するバリアントを指す。これらの株は、染色体ＤＮＡ、および一部の場合において（例えば、Ｙ．エンテロコリチカ、Ｓ．フレックスネリ）、未改変病原性プラスミドを含有する。

【0122】

「エルシニア属野生型株」という用語は、本明細書で使用される場合、天然に存在するバリアント（Ｙ．エンテロコリチカＥ４０のような）、またはベクターの使用を可能にする遺伝子改変、例えば、制限エンドヌクレアーゼまたは抗生物質耐性遺伝子における欠失突然変異を含有する天然に存在するバリアント（Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０、Ｙ．エンテロコリチカＥ４０のアンピシリン感受性誘導体のような）を指す。これらの株は、染色体ＤＮＡ、および未改変病原性プラスミド（ｐＹＶと呼ばれる）を含有する。

【0123】

Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカ（Y. enterocolitica subspecies palearctica）は、低病原性Ｙ．エンテロコリチカ株を指し、これは、亜種エンテロコリチカのより高い病原性株と対照的である（Ｈｏｗａｒｄら、２００６；Ｔｈｏｍｓｏｎら、２００６）。Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカは、Ｙ．エンテロコリチカ亜種エンテロコリチカと比較して、高病原性アイランド（ＨＰＩ）を欠く。このＨＰＩは、エルシニアバクチンと呼ばれる鉄シデロホアをコードする（Ｐｅｌｌｕｄａｔら、２００２）。Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカにおけるエルシニアバクチンの欠如は、この亜種をより病原性が低い状態にし、例えば、肝臓または脾臓における持続的感染のための全身的にアクセス可能な鉄の誘導に依存する（Ｐｅｌｌｕｄａｔら、２００２）。鉄は、例えば、患者における鉄過剰症を治療するために使用される鉄キレート剤であるデフェロキサミンによる事前治療によって、個体において細菌にアクセス可能になり得る（Ｍｕｌｄｅｒら、１９８９）。

【0124】

「免疫チェックポイント」または「免疫チェックポイント分子」という用語は、本明細書で使用される場合、同族ＨＬＡ／抗原－Ｔ細胞受容体活性化または免疫系の他の活性化によって引き起こされる免疫応答を弱めるまたは促進するための陰性または陽性の刺激を指す。免疫チェックポイント分子は、典型的には、免疫経路に関与し、例えば、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞機能を調節する。免疫チェックポイント分子の多くは、免疫グロブリンスーパーファミリー、より具体的には、Ｂ７－ＣＤ２８ファミリーに、または腫瘍壊死因子／腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦ／ＴＮＦＲ）スーパーファミリーに属し、特異的リガンドの結合によって、細胞質ドメインに動員されるシグナル伝達分子を活性化する（Ｓｕｚｕｋｉら、２０１６）。

【0125】

免疫チェックポイントの例には、限定されるものではないが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）のようなＰＤ－１経路の免疫チェックポイント；ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）のようなＣＴＬＡ－４経路の免疫チェックポイント；ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）のようなＯＸ４０経路の免疫チェックポイント；ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、ＣＤ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）のような４１ＢＢ経路の免疫チェックポイント；ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）のようなＩＣＯＳ経路の免疫チェックポイント；ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩのようなＬＡＧ－３経路の免疫チェックポイント；ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－ＬのようなＴＩＭ－３経路の免疫チェックポイント；Ｂ７．１（Ｃｄ８０）、Ｂ７．２（ＣＤ８６）およびＣＤ２８のようなＣＤ２８経路の免疫チェックポイント；ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、ＭＨＣ－Ｉ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）；Ａ２ａＲのようなＫＩＲファンミリー受容体経路の免疫チェックポイント；ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）のようなＣＤ２７経路の免疫チェックポイント；ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＨＶＥＭ（Ｃｏｇｄｉｌｌら、２０１７；Ｐａｒｄｏｌｌ、２０１２）のようなＢＴＬＡ経路の免疫チェックポイント；ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）のようなＴＩＧＩＴ経路の免疫チェックポイント；ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＧＩＴＲＬのようなＧＩＴＲ経路の免疫チェックポイント；、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）；、ＴＩＭ－１；ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５またはＰＤ－１Ｈ）；ＣＥＡＣＡＭ１（Ｃｏｇｄｉｌｌら、２０１７；Ｇｒａｙ－ＯｗｅｎおよびＢｌｕｍｂｅｒｇ、２００６；ＨｏｌｄｅｒおよびＧｒａｎｔ、２０２０；Ｗａｌｄｍａｎら、２０２０）のようなＣＤ４０経路の免疫チェックポイント；ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２のようなＩＣＡＭ経路の免疫チェックポイント；ＣＤ１６０、ＨＶＥＭのようなＣＤ１６０経路の免疫チェックポイント；ＬＦＡ－１、ＬＦＡ－３のようなＬＦＡ経路の免疫チェックポイント；ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２（Ｃｏｇｄｉｌｌら、２０１７）のようなＣＤ２２６経路の免疫チェックポイント；ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＬＩＬＲＢ１～ＬＩＬＲＢ５（ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、およびＣＤ８５Ｃ、またはＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８；またＬＩＬＲＢ１～４＝ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３）（Ｋａｎｇら、２０１６）のようなＬＩＬＲＢ経路の免疫チェックポイント；ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７（Ｓｅｉｆｆｅｒｔら、２００１）のようなＳＩＲＰ経路の免疫チェックポイント；ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１（ｄｅ Ｓｔｒｅｅｌら、２０２０）のようなＧＡＲＰ経路の免疫チェックポイント；ＴＮＦＲ、ＴＮＦα；ＤｃＲ３（ＦａｓＲ）；ＤＲ３；ＴＬ１Ａ（Ｂｏｄｍｅｒら、２００２；Ｍｅｙｌａｎら、２０１１）；ＩＤＯ（Ｌｉｕら、２０１０）；ＴＤＯ（Ｐｌａｔｔｅｎら、２０１４）のようなＴＮＦＲ経路の免疫チェックポイント、Ｂ７－Ｈ６、Ｎｋｐ３０（Ｏｂｉｅｄａｔら、２０２０）のようなＢ７－Ｈ６経路の免疫チェックポイント；ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ（Ｓｈｅｕら、２００５）のようなＣＤ９４経路の免疫チェックポイント；ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ（Ｚｈｕら、２０１４）；ＴＩＭ－４（ＣｈｅｎｇおよびＲｕａｎ、２０１５）のようなＣＳＦ１Ｒ経路の免疫チェックポイント；２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）としてのＳＬＡＭ（Ａｇｒｅｓｔａら、２０１８；ＭｃＡｒｄｅｌら、２０１６）；ＣＤ１２２（Ｍａｔｈｅｗｓら、２０１８）；ＰＳ（ホスファチジルセリン）（ＤａｙｏｕｂおよびＢｒｅｋｋｅｎ、２０２０）のようなＳＬＡＭ経路の免疫チェックポイント；ＣＤ３０、ＣＤ３０Ｌ／ＴＮＦＳＦ８（Ｏｆｌａｚｏｇｌｕら、２００９）；ＬＩＧＨＴ／ＣＤ２５８（Ｓｋｅａｔｅら、２０２０）；ＣＤ６９（Ｍｉｔａら、２０１８）；ガレクチン１（Ｉｔｏら、２０１２）；ＬＡＩＲ－１（ＣＤ３０５）（Ｓｌｅｄｚｉｎｓｋａら、２０１５）のようなＣＤ３０経路の免疫チェックポイントが含まれる。括弧内の用語は、便宜上示される対応するタンパク質の同義語を指す。例として、ＣＤ１５４は、ＣＤ４０Ｌの同義語であり、したがって、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）として示される。同義語のリストは結論付けられておらず、さらなる同義語が、免疫チェックポイントの多くに存在する。

【0126】

「免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）」という用語は、本明細書で使用される場合、免疫チェックポイントをモジュレートする分子、すなわち、抗体としてのタンパク質を指す。免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）は、免疫チェックポイントに干渉し、１つまたは複数の免疫チェックポイント分子の機能をモジュレートする。ＩＣＭに関連する「モジュレーション」または「モジュレートする」は、本明細書において、ＩＣＭが、全体的にまたは部分的に、１つまたは複数の免疫チェックポイント分子の機能を、低減する、阻害する、干渉する、活性化する、刺激する、増加させる、強化するまたは支持することを意味する。したがって、免疫チェックポイントモジュレーターは、「免疫チェックポイント阻害剤」（「チェックポイント阻害剤」または「阻害剤」とも称される）または「免疫チェックポイント活性化剤」（「チェックポイント活性化剤」または「活性化剤」とも称される）であってもよい。

【0127】

ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１またはＣＴＬＡ４などの免疫チェックポイントに干渉することを可能にする免疫チェックポイントモジュレーターの例は、対応するネガティブフィードバックループのネガティブフィードバックを予防または低減する、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体などの免疫チェックポイント阻害剤（ＣＰＩ）である。この手法のための印象的な原理の証明は、転移性黒色腫を有する患者におけるモノクローナル抗体イピリムマブによるＣＴＬＡ－４遮断の第ＩＩＩ相臨床研究の２０１０年の報告に付随し、これは、治療された患者の増強された生存を実証した（Ｈｏｄｉ、２０１０）。

【0128】

免疫チェックポイントモジュレーターは、典型的には、（ｉ）自己免疫寛容、ならびに／または（ｉｉ）免疫応答の広さおよび／もしくは期間をモジュレートすることができる。好ましくは、本発明により使用される免疫チェックポイントモジュレーターは、１つまたは複数のヒトチェックポイント分子の機能をモジュレートし、したがって、「ヒトチェックポイントモジュレーター」である。したがって、チェックポイントモジュレーターによってモジュレートされる（例えば、全体的にまたは部分的に、低減される、阻害される、干渉される、活性化される、刺激される、増加される、強化されるまたは支持される）免疫チェックポイントの機能は、典型的には、Ｔ細胞活性化、Ｔ細胞増殖および／またはＴ細胞機能の調節である。

【0129】

好ましくは、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）のようなＰＤ－１経路の免疫チェックポイント；ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）のようなＣＴＬＡ－４経路の免疫チェックポイント；ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩのようなＬＡＧ－３経路の免疫チェックポイント；ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）；Ｇａｌ９（ガレクチン９）；ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）のようなＴＩＭ－３経路の免疫チェックポイント；ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）；ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）；ＩＤＯのようなＴＩＧＩＴ経路の免疫チェックポイント；ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）のようなＯＸ４０経路の免疫チェックポイント；ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）のような４１ＢＢ経路の免疫チェックポイント；ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）のようなＩＣＯＳ経路の免疫チェックポイント；ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、ＭＨＣ－Ｉ；Ａ２ａＲのようなＫＩＲファミリー受容体経路の免疫チェックポイント；ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）のようなＣＤ２７経路の免疫チェックポイント；ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭのようなＢＴＬＡ経路の免疫チェックポイント；ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬのようなＧＩＴＲ経路の免疫チェックポイント；ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）；ＴＩＭ－１；ＣＥＡＣＡＭ１のようなＣＤ４０経路の免疫チェックポイント；ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２のようなＩＣＡＭ経路の免疫チェックポイント；ＣＤ１６０、ＨＶＥＭのようなＣＤ１６０経路の免疫チェックポイント；ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２のようなＣＤ２２６経路の免疫チェックポイント；ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＬＩＬＲＢ１～ＬＩＬＲＢ５（ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、およびＣＤ８５Ｃ、またはＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８；またＬＩＬＲＢ１～４＝ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３）のようなＬＩＬＲＢ経路の免疫チェックポイント；ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７のようなＳＩＲＰ経路の免疫チェックポイント；ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１；ＴＤＯのようなＧＡＲＰ経路の免疫チェックポイント；ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－ＥのようなＣＤ９４経路の免疫チェックポイント；ＣＳＦ１、ＣＳＦ１ＲのようなＣＳＦ１Ｒ経路の免疫チェックポイント；２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）としてのＳＬＡＭのようなＳＬＡＭ経路の免疫チェックポイントからなる群から選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントポイント（ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｐｏｉｎｔ）分子の活性化剤または阻害剤である。

【0130】

より好ましくは、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）のようなＰＤ－１経路の免疫チェックポイント；ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）のようなＣＴＬＡ－４経路の免疫チェックポイント；ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩのようなＬＡＧ－３経路の免疫チェックポイント；ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９、ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）のようなＴＩＭ－３経路の免疫チェックポイント；ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＩＧ）；ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）；およびＩＤＯのようなＴＩＧＩＴ経路の免疫チェックポイントからなる群から選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である。

【0131】

最も好ましくは、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）のようなＰＤ－１経路の免疫チェックポイント；およびＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）のようなＣＴＬＡ－４経路の免疫チェックポイントからなる群から選択される１つまたは複数の免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である。

【0132】

「免疫チェックポイント阻害剤」（本明細書において「チェックポイント阻害剤」または「阻害剤」とも称される）は、全体的にまたは部分的に、１つまたは複数のチェックポイント分子の機能を低減し、阻害し、干渉し、または負の影響を及ぼす。

【0133】

「免疫チェックポイント活性化剤」（本明細書において「チェックポイント活性化剤」または「活性化剤」とも称される）は、全体的にまたは部分的に、１つまたは複数のチェックポイント分子の機能を活性化し、刺激し、増加させ、強化し、支持し、またはそれに正の影響を及ぼす。

【0134】

「ＰＤ－１アンタゴニスト」または「ＰＤ－１阻害剤」という用語は、本明細書で互換的に使用され、全体的にまたは部分的に、ＰＤ１、ＰＤＬ１および／またはＰＤＬ２の機能を低減し、阻害し、干渉し、または負にモジュレートする、分子、例えば、抗体を指す。

【0135】

「ＣＴＬＡ－４アンタゴニスト」または「ＣＴＬＡ－４阻害剤」という用語は、本明細書で互換的に使用され、全体的にまたは部分的に、ＣＴＬＡ－４の機能を低減し、阻害し、干渉し、または負にモジュレートする、分子、例えば、抗体を指す。

【0136】

「プログラム死－１」、「プログラム細胞死タンパク質１」または「ＰＤ－１」という用語は、本明細書で互換的に使用され、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫阻害受容体を指す。ＰＤ－１は、インビボで、以前に活性化されたＴ細胞において主に発現され、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２の２つのリガンドに結合する。「ＰＤ－１」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ－１（ｈＰＤ－１）、ｈＰＤ－１のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ－１と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログを含む。同じく、「ＰＤ－Ｌ１」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ－Ｌ１（ｈＰＤ－Ｌ１）、ｈＰＤ－Ｌ１のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ１と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログを含み、「ＰＤ－Ｌ２」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトＰＤ－Ｌ２（ｈＰＤ－Ｌ２）、ｈＰＤ－Ｌ２のバリアント、アイソフォームおよび種ホモログ、ならびにｈＰＤ－Ｌ２と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログを含む。完全ｈＰＤ－１配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６４８６３またはＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ１５１１６で見出され得る。完全ヒトＰＤ－Ｌ１タンパク質配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＮＺＱ７で見出され得、完全ヒトＰＤ－Ｌ２配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ番号Ｑ９ＢＱ５１で見出され得る。

【0137】

「細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原－４」、「ＣＴＬＡ－４」、「ＣＴＬＡ４」、「ＣＴＬＡ－４抗原」および「ＣＤ１５２」（例えば、（ＭｕｒａｔａおよびＤａｌａｋａｓ、１９９９）を参照されたい）という用語は、互換的に使用され、ヒトＣＴＬＡ－４のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、およびＣＴＬＡ－４と少なくとも１つの共通のエピトープを有するアナログ（例えば、（Ｂａｌｚａｎｏ、１９９２）を参照されたい）を含む。完全ＣＴＬＡ－４核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｌ１５００６またはＵｎｉｐｒｏｔ番号Ｐ１６４１０で見出され得る。

【0138】

「ヒト抗体」（ＨｕＭＡｂ）または「完全ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有するＡｂを指す。さらにまた、Ａｂが定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒトＡｂは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロのランダムもしくは部位特異的突然変異誘発によって、またはインビボの体細胞突然変異によって導入される突然変異）を含み得る。しかしながら、「ヒト抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、ＣＤＲ配列がマウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来し、ヒトフレームワーク配列にグラフトされているＡｂを含むことを意図しない。「ヒト」Ａｂおよび「完全ヒト」Ａｂという用語は、同義語として使用される（ａｎｄ ａｒｅ ｕｓｅｄ）。

【0139】

「ヒト化抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、非ヒトＡｂのＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべてが、ヒト免疫グロブリンに由来する対応するアミノ酸で置き換えられているＡｂを指す。Ａｂのヒト化形態の一実施形態において、ＣＤＲドメイン外のアミノ酸の一部、ほとんどまたはすべては、ヒト免疫グロブリン由来のアミノ酸で置き換えられているが、１つまたは複数のＣＤＲ領域内の一部、ほとんどまたはすべてのアミノ酸は、変化していない。アミノ酸の小さな付加、欠失、挿入、置換または改変は、それらが、Ａｂが特定の抗原に結合する能力を無効化しない限り、許容される。「ヒト化」Ａｂは、元のＡｂのものと類似の抗原特異性を保持する。

【0140】

「キメラ抗体」という用語は、本明細書で使用される場合、可変領域が１つの種に由来し、定常領域が別の種に由来するＡｂ、例えば、可変領域がマウスＡｂに由来し、定常領域がヒトＡｂに由来するＡｂを指す。

【0141】

「薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体」という用語は、本明細書で使用される場合、合理的な利益／リスク比に見合う、過度の有害な副作用（毒性、刺激、およびアレルギー応答など）なく、ヒトおよび／または動物での使用に好適である、希釈剤、添加物または担体を指す。「希釈剤」は、固体組成物を作り上げる活性薬剤のバルク体積に添加される剤である。結果として、固体組成物のサイズは増加し、それを取り扱うのを容易にする。希釈剤は、固形組成物あたりの薬物の用量が低く、固形組成物がそうでなければ小さすぎる場合に好都合である。「添加物」は、結合剤、潤滑剤、流動促進剤、コーティング添加剤、またはその組み合わせであり得る。したがって、添加物は、複数の目的を果たすことが意図される。「担体」は、本化合物を対象に送達するための、溶媒、懸濁化剤またはビヒクルであり得る。

【0142】

「個体」、「対象」または「患者」は、本明細書で使用される場合、脊椎動物である。ある特定の実施形態において、脊椎動物は、哺乳動物である。哺乳動物には、限定されるものではないが、霊長類（ヒトおよび非ヒト霊長類を含む）、およびげっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が含まれる。好ましい実施形態において、対象は、ヒトである。

【0143】

そのため、第１の態様において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む薬学的組み合わせ物を提供する。

【0144】

組換えグラム陰性菌株
一実施形態において、本発明の組換えグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であり、ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結されており、異種タンパク質またはその断片は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質、アポトーシスもしくはアポトーシス調節に関与するタンパク質、細胞周期調節因子、アンキリンリピートタンパク質、細胞シグナル伝達タンパク質、レポータータンパク質、転写因子、プロテアーゼ、小ＧＴＰアーゼ、ＧＰＣＲ関連タンパク質、ナノボディ融合コンストラクトおよびナノボディ、細菌Ｔ３ＳＳエフェクター、細菌Ｔ４ＳＳエフェクター、およびウイルスタンパク質、またはその断片からなる群から選択される。

【0145】

一実施形態において、本発明の組換えグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であり、ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結されており、異種タンパク質またはその断片は、インターフェロン（ＩＦＮ）応答の誘導または調節に関与するタンパク質、またはその断片である。

【0146】

一実施形態において、本発明の組換えグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であり、ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列は、プロモーターに動作可能に連結されており、異種タンパク質またはその断片は、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質またはその断片である。

【0147】

好ましくは、異種タンパク質またはその断片は、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーまたはその断片、抗ウイルスシグナル伝達およびＩ型ＩＦＮ誘導に関与する他のＣＡＲＤドメインを含有するタンパク質またはその断片、ならびにＳＴＩＮＧの刺激をもたらす、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素からなる群から選択されるＩ型ＩＦＮ応答の誘導または調節に関与するタンパク質、またはその断片である。

【0148】

より好ましくは、異種タンパク質またはその断片は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＬＧＰ２、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択される、より好ましくは、ＲＩＧ１、ＭＡＶＳ、ＭＤＡ５、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡ様、およびｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択される、最も好ましくは、ＲＩＧ１またはその断片およびｃＧＡＳまたはその断片、特に、そのＣＡＲＤドメインを含むＲＩＧ１の断片、より特に、そのＣＡＲＤドメインを含むＲＩＧ１の断片、さらより特に、２つのＣＡＲＤドメインを含む、ＲＩＧ１、好ましくは、ヒトＲＩＧ１の断片、最も特に、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される、好ましくは、配列番号１に示される２つのＣＡＲＤドメインを含むヒトＲＩＧ１の断片、ならびに／あるいはｃＧＡＳまたはその断片、例えば、上記に記載されるその断片、特に、配列番号１０に示されるヒトｃＧＡＳまたはその断片からなる群から選択される、Ｉ型ＩＦＮ応答の誘導もしくは調節に関与するタンパク質またはその断片である。

【0149】

本発明のグラム陰性菌株に含まれるポリヌクレオチド分子は、発現ベクターのようなベクターであり得る。ポリヌクレオチド分子を含むベクターは、低、中または高コピー数プラスミドであり得る。低コピー数プラスミドは、通常、１～１５コピー／細菌細胞、好ましくは、１～１０コピー／細菌細胞を有する。中コピー数プラスミドは、通常、５～２００コピー／細菌細胞、好ましくは、１０～１５０コピー／細菌細胞を有する。高コピー数プラスミドは、通常、１００～１’０００コピー／細菌細胞、好ましくは、１５０～７００コピー／細菌細胞を有する。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド分子を含むベクターは、中コピー数プラスミドである。好ましい実施形態において、ベクターは、５～２００コピー／細菌細胞を有する中コピー数プラスミドであり、すなわち、プラスミドの５～２００コピーが、単一の細菌細胞中に存在し、好ましくは、１０～１５０コピー／細菌細胞、すなわち、プラスミドの１０～１５０コピーが、単一細菌細胞中に存在する。

【0150】

一実施形態において、ポリヌクレオチド分子を含むベクターは、挿入断片なしで、１～１５ｋＤａ、好ましくは、２～１０ｋＤａ、より好ましくは、３～７ｋＤａのサイズを有するプラスミドである。

【0151】

一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、組換え病原性弱毒化グラム陰性菌株である。

【0152】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属およびシュードモナス属からなる群から選択される。一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、エルシニア属およびサルモネラ属からなる群から選択される。好ましくは、組換えグラム陰性菌株は、エルシニア属株、より好ましくは、エルシニア・エンテロコリチカ株である。エルシニア・エンテロコリチカＥ４０（Ｏ：９、バイオタイプ２）（ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９４）、または（Ｓａｒｋｅｒ、１９９８）に記載されるＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０（Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０とも名付けられる）のようなそのアンピシリン感受性誘導体が最も好ましい。Ｙ．エンテロコリチカＥ４０およびその誘導体の（Ｓａｒｋｅｒら、１９９８）に記載されるＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０は、Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＥ４０およびその誘導体の（Ｈｏｗａｒｄら、２００６；Ｎｅｕｂａｕｅｒら、２０００；Ｐｅｌｌｕｄａｔら、２００２）に記載されるＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０と同一である。また好ましくは、組換えグラム陰性菌株は、サルモネラ属株、より好ましくは、サルモネラ・エンテリカ株である。Ｐｕｂｌｉｃ ｈｅａｌｔｈ Ｅｎｇｌａｎｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＮＣＴＣ １３３４７）に記載されるサルモネラ・エンテリカ血液型亜型ティフィムリウム（Salmonella enterica Serovar Typhimurium）ＳＬ１３４４が最も好ましい。

【0153】

本発明の一部の実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、シデロホアを産生しない、例えば、シデロホアの産生が欠損している、好ましくは、シデロホアを産生しない、例えば、任意のシデロホアの産生が欠損している、株である。そのような株は、例えば、エルシニアバクチンを産生せず、好ましい（Ｈｏｗａｒｄら、２００６；Ｎｅｕｂａｕｅｒら、２０００；Ｐｅｌｌｕｄａｔら、２００２；Ｓａｒｋｅｒら、１９９８）に記載されるＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０である。

【0154】

本発明の一実施形態において、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌エフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片、好ましくは、真核細胞に対して病原性である細菌エフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片を含む。

【0155】

本発明の一実施形態において、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片を含む細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質であり、ここで、Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、シャペロン結合部位を含み得る。シャペロン結合部位を含むＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、本発明において、送達シグナルとして特に有用である。好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＳｓｐＨ１、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＸｏｐＤ、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＡｖｒＢＳ３、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、およびＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。より好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＹｏｐＥ、ＥｘｏＳ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、そのうち、最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ、特に、ＹｏｐＥまたはそのＮ末端断片からなる群から選択される。

【0156】

同様に好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＤ、ＳｏｐＡ、ＳｏｐＢ、ＳｏｐＤ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＳｉｐＣ、ＳｉｆＡ、ＳｉｆＢ、ＳｓｅＪ、Ｓｓｅ、ＳｒｆＨ、ＹｏｐＪ、ＡｖｒＡ、ＡｖｒＢｓＴ、ＹｏｐＨ、ＹｐｋＡ、Ｔｉｒ、ＥｓｐＦ、ＴｃｃＰ２、ＩｐｇＢ２、ＯｓｐＦ、Ｍａｐ、ＯｓｐＧ、ＯｓｐＩ、ＩｐａＨ、ＶｏｐＦ、ＥｘｏＳ、ＥｘｏＴ、ＨｏｐＡＢ２、ＡｖｒＲｐｔ２、ＨｏｐＡＯ１、ＨｏｐＵ１、ＧＡＬＡファミリーのタンパク質、ＡｖｒＢｓ２、ＡｖｒＤ１、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴ、ＥｓｐＧ、ＥｓｐＨ、ＥｓｐＺ、ＩｐａＡ、ＩｐａＢ、ＩｐａＣ、ＶｉｒＡ、ＩｃｓＢ、ＯｓｐＣ１、ＯｓｐＥ２、ＩｐａＨ９．８、ＩｐａＨ７．８、ＡｖｒＢ、ＡｖｒＤ、ＡｖｒＰｐｈＢ、ＡｖｒＰｐｈＣ、ＡｖｒＰｐｈＥＰｔｏ、ＡｖｒＰｐｉＢＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏ、ＡｖｒＰｔｏＢ、ＶｉｒＰｐｈＡ、ＡｖｒＲｐｍ１、ＨｏｐＰｔｏＤ２、ＨｏｐＰｔｏＥ、ＨｏｐＰｔｏＦ、ＨｏｐＰｔｏＮ、ＰｏｐＢ、ＰｏｐＰ２、ＡｖｒＢｓ３、ＸｏｐＤ、およびＡｖｒＸｖ３からなる群から選択される。同様により好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、ＳｏｐＥ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＳｏｐＢ、ＩｐｇＢ１、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＪ、ＹｏｐＨ、ＥｓｐＦ、ＯｓｐＦ、ＥｘｏＳ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＴからなる群から選択され、そのうち、同様に最も好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、ＩｐｇＢ１、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＢ、ＳｐｔＰ、ＳｔｅＡ、ＳｉｆＢ、ＯｓｐＦ、ＩｐｇＤ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＥ、およびＹｏｐＴ、特に、ＳｏｐＥ、ＳｔｅＡ、もしくはＹｏｐＥまたはそのＮ末端断片、より特に、ＳｔｅＡもしくはＹｏｐＥまたはそのＮ末端断片、最も特に、ＹｏｐＥまたはそのＮ末端断片からなる群から選択される。

【0157】

一部の実施形態において、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌エフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片を含むヌクレオチド配列によってコードされ、ここで、そのＮ末端断片は、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質の少なくとも最初の１０アミノ酸、好ましくは、少なくとも最初の２０アミノ酸、より好ましくは、少なくとも最初の１００アミノ酸を含む。

【0158】

一部の実施形態において、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクターまたはそのＮ末端断片を含むヌクレオチド配列によってコードされ、ここで、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、シャペロン結合部位を含む。

【0159】

シャペロン結合部位を含む好ましいＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片は、シャペロン結合部位およびＴ３ＳＳエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片の以下の組み合わせを含む：ＳｙｃＥ－ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ－ＳｏｐＥ、ＳｉｃＰ－ＳｐｔＰ、ＳｙｃＴ－ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ－ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ－ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ－ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ－ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ－ＥｓｐＦ、ＳｙｃＤ－ＹｏｐＢ、ＳｙｃＤ－ＹｏｐＤ。ＳｙｃＥ－ＹｏｐＥ、ＩｎｖＢ－ＳｏｐＥ、ＳｙｃＴ－ＹｏｐＴ、ＳｙｃＯ－ＹｏｐＯ、ＳｙｃＮ／ＹｓｃＢ－ＹｏｐＮ、ＳｙｃＨ－ＹｏｐＨ、ＳｐｃＳ－ＥｘｏＳ、ＣｅｓＦ－ＥｓｐＦがより好ましい。ＳｙｃＥシャペロン結合部位を含むＹｏｐＥまたはそのＮ末端断片、例えば本明細書においてＹｏｐＥ_{１－１３８}と指定され、配列番号２５に示されるＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の１３８アミノ酸を含有するＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片、あるいはＩｎｖＢシャペロン結合部位を含むＳｏｐＥエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片、例えば（ｓ ａｓ ｕｃｈ）本明細書においてそれぞれＳｏｐＥ_１－８１またはＳｏｐＥ_{１－１０５}と指定され、配列番号２６および２７に示されるＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の８１または１０５アミノ酸を含有するＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片が最も好ましい。

【0160】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、エルシニア属株であり、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質またはそのＮ末端部分、好ましくは、Ｙ．エンテロコリチカＹｏｐＥエフェクタータンパク質またはそのＮ末端部分を含む。好ましくは、ＳｙｃＥ結合部位は、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部分内に含まれる。これに関して、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片は、Ｎ末端の１２、１６、１８、５２、５３、８０または１３８アミノ酸を含み得る（Ｆｅｌｄｍａｎら、２００２；Ｉｔｔｉｇら、２０１５；ＲａｍａｍｕｒｔｈｉおよびＳｃｈｎｅｅｗｉｎｄ、２００５；Ｗｏｌｋｅら、２０１１）。例えば、ＦｏｒｓｂｅｒｇおよびＷｏｌｆ－Ｗａｔｚ（ＦｏｒｓｂｅｒｇおよびＷｏｌｆ－Ｗａｔｚ、１９９０）に記載され、本明細書においてＹｏｐＥ_{１－１３８}と指定され、配列番号２５に示される、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端の１３８アミノ酸を含有するＹｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端断片が最も好ましい。

【0161】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、サルモネラ属株であり、ヌクレオチド配列（ａｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）によってコードされる細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＳｏｐＥもしくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質またはそのＮ末端部分、好ましくは、サルモネラ・エンテリカＳｏｐＥもしくはＳｔｅＡエフェクタータンパク質またはそのＮ末端部分を含む。好ましくは、シャペロン結合部位は、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質のＮ末端部分内に含まれる。これに関して、ＳｏｐＥエフェクタータンパク質タンパク質（ｐｒｏｔｅｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ末端断片は、Ｎ末端の８１または１０５アミノ酸を含み得る。例えば、配列番号２７に記載される、エフェクタータンパク質のＮ末端の１０５アミノ酸を含有するＳｏｐＥエフェクタータンパク質の全長ＳｔｅＡ（配列番号２８）およびそのＮ末端断片が最も好ましい。

【0162】

当業者は、タンパク質を送達することができるエフェクタータンパク質のポリペプチド配列を特定するための方法に精通している。例えば、そのような方法の１つは、Ｓｏｒｙら（ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９４）によって記載されている。簡潔には、例えば、Ｙｏｐタンパク質のさまざまな部分由来のポリペプチド配列を、百日咳菌シクロリシンのカルモジュリン活性化アデニル酸シクラーゼドメイン（またはＣｙａ）などのレポーター酵素にインフレームで融合することができる。Ｙｏｐ－Ｃｙａハイブリッドタンパク質の真核細胞のサイトゾルへの送達は、ｃＡＭＰの蓄積をもたらす感染した真核細胞におけるシクラーゼ活性の出現によって示される。そのような手法を用いることによって、当業者は、所望により、タンパク質を送達することができる最小配列要件、すなわち、最も短い長さの連続するアミノ酸配列を決定することができ、例えば、（ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９４）を参照されたい。したがって、本発明の好ましい送達シグナルは、タンパク質を送達することができるＴ３ＳＳエフェクタータンパク質のアミノ酸の少なくとも最小配列からなる。

【0163】

一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が欠損しており、より好ましくは、真核細胞に対して病原性である少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が欠損しており、さらにより好ましくは、少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生が欠損しており、最も好ましくは、真核細胞に対して病原性である少なくとも１つのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質の産生が欠損している。一部の実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、真核細胞に対して病原性である、少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは、少なくとも３つ、さらにより好ましくは、少なくとも４つ、特に、少なくとも５つ、より特に、少なくとも６つ、最も特に、すべての細菌エフェクタータンパク質の産生が欠損している。一部の実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、真核細胞に対して病原性である、少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つ、より好ましくは、少なくとも３つ、さらにより好ましくは、少なくとも４つ、特に、少なくとも５つ、より特に、少なくとも６つ、最も特に、すべての機能的細菌エフェクタータンパク質の産生が欠損しており、その結果、得られる組換えグラム陰性菌株は、非病原性弱毒化グラム陰性菌野生型株と比較して、すなわち、細菌エフェクタータンパク質を正常に産生するか、またはその結果得られる組換えグラム陰性菌株が真核細胞に対して病原性である任意の機能的細菌エフェクタータンパク質をもはや産生しないグラム陰性菌野生型株と比較して、細菌エフェクタータンパク質の産生が少ないか、またはより少ない程度に細菌エフェクタータンパク質を産生する。

【0164】

本発明によれば、そのような突然変異型グラム陰性菌株、すなわち、少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が欠損している、例えば、真核細胞、例えば、そのような突然変異型エルシニア属株に対して病原性である少なくとも１つの細菌エフェクタータンパク質の産生が欠損しているそのような組換えグラム陰性菌株は、少なくとも１つの突然変異を少なくとも１つのエフェクターコード遺伝子に導入することによって作成することができる。好ましくは、そのようなエフェクターコード遺伝子には、エルシニア属株が関連する限り、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＰ／ＹｏｐＪおよびＹｏｐＴが含まれる。好ましくは、そのようなエフェクターコード遺伝子には、サルモネラ属株が関連する限り、ＡｖｒＡ、ＣｉｇＲ、ＧｏｇＢ、ＧｔｇＡ、ＧｔｇＥ、ＰｉｐＢ、ＳｉｆＢ、ＳｉｐＡ／ＳｓｐＡ、ＳｉｐＢ、ＳｉｐＣ／ＳｓｐＣ、ＳｉｐＤ／ＳｓｐＤ、ＳｌｒＰ、ＳｏｐＢ／ＳｉｇＤ、ＳｏｐＡ、ＳｐｉＣ／ＳｓａＢ、ＳｓｅＢ、ＳｓｅＣ、ＳｓｅＤ、ＳｓｅＦ、ＳｓｅＧ、ＳｓｅＩ／ＳｒｆＨ、ＳｏｐＤ、ＳｏｐＥ、ＳｏｐＥ２、ＳｓｐＨ１、ＳｓｐＨ２、ＰｉｐＢ２、ＳｉｆＡ、ＳｏｐＤ２、ＳｓｅＪ、ＳｓｅＫ１、ＳｓｅＫ２、ＳｓｅＫ３、ＳｓｅＬ、ＳｔｅＣ、ＳｔｅＡ、ＳｔｅＢ、ＳｔｅＤ、ＳｔｅＥ、ＳｐｖＢ、ＳｐｖＣ、ＳｐｖＤ、ＳｒｆＪ、ＳｐｔＰが含まれる。最も好ましくは、すべてのエフェクターコード遺伝子が欠失している。当業者は、これらのＴ３ＳＳエフェクター遺伝子において突然変異を作成するために、任意のいくつかの標準的な技法を用い得る。Ｓａｍｂｒｏｏｋらは、一般に、そのような技法を記載している。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（Ｓａｍｂｒｏｏｋ、２００１）を参照されたい。

【0165】

本発明に従って、そのようなエフェクター遺伝子の発現が無効化されるように、突然変異を、エフェクターコード遺伝子のプロモーター領域に作成することができる。コードされるエフェクタータンパク質の触媒活性が無効化されるように、突然変異を、エフェクターコード遺伝子のコード化領域に作成することもできる。エフェクタータンパク質の「触媒活性」は、通常、エフェクタータンパク質の抗標的細胞機能、すなわち、毒性を指す。そのような活性は、エフェクタータンパク質の触媒ドメイン中の触媒モチーフによって支配される。エフェクタータンパク質の触媒ドメインおよび／または触媒モチーフを特定するための手法は、当業者に周知である。例えば、（ＡｌｔｏおよびＤｉｘｏｎ、２００８；Ａｌｔｏら、２００６）を参照されたい。

【0166】

したがって、本発明の１つの好ましい突然変異は、触媒ドメイン全体の欠失である。別の好ましい突然変異は、触媒ドメインがそのような「フレームシフトした」遺伝子から発現されるタンパク質産物中に存在しないような、エフェクターコード遺伝子におけるフレームシフト突然変異である。最も好ましい突然変異は、エフェクタータンパク質のコード化領域全体の欠失を有する突然変異である。所与のエフェクタータンパク質の触媒活性の破壊をもたらすエフェクタータンパク質の触媒モチーフにおいて作成される小さな欠失または塩基対置換などの他の突然変異も本発明によって企図される。

【0167】

機能的細菌エフェクタータンパク質の遺伝子において作成される突然変異は、いくつかの方法によって特定の株に導入され得る。そのような方法の１つは、対立遺伝子交換を介して突然変異配列を株に導入することができる「自殺」ベクターに突然変異遺伝子をクローニングすることを含む。そのような「自殺」ベクターの例は、（Ｋａｎｉｇａら、１９９１）によって記載されている。

【0168】

この方法において、複数の遺伝子に作成された突然変異は、グラム陰性菌株に成功裏に導入されて、多突然変異型、例えば、六重突然変異型組換え株を生じ得る。これらの突然変異配列が導入される順序は重要ではない。一部の状況下で、エフェクター遺伝子のすべてではなく一部のみを突然変異させることが望ましいことがある。したがって、本発明は、六重突然変異型エルシニア属、例えば、二重突然変異型、三重突然変異型、四重突然変異型および五重突然変異型株以外の多突然変異型エルシニア属をさらに企図する。タンパク質を送達する目的のために、本突然変異型株の分泌および転座系は、無傷である必要がある。

【0169】

好ましい本発明の組換えグラム陰性菌株は、エフェクターコード遺伝子（ｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＰ、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＭ、ｙｏｐＴである）のすべてが、得られるエルシニア属が任意の機能的エフェクタータンパク質をもはや産生しないように突然変異されている、六重突然変異型エルシニア属株である。そのような六重突然変異型エルシニア属株は、Ｙ．エンテロコリチカについて、ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔと指定される。例として、そのような六重突然変異体は、好ましいＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔを生じさせるＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０株（本明細書において、Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，ＴまたはＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，ＴまたはＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨＯＰＥＭＴまたはＹ．エンテロコリチカΔＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，ＴまたはＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴまたはＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨＯＰＥＭＴまたはＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，ＴまたはＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔＨＯＰＥＭＴまたはＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨＯＰＥＭＴまたはＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ ΔＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ、またはＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカＭＲＳ４０ ΔＨＯＰＥＭＴとも名付けられる）から作成され得る。エルシニアバクチンの産生が欠損しているＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔは、ＷＯ０２０７７２４９に記載されており、Ｂｅｌｇｉａｎ Ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅｄ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＢＣＣＭ）での特許手続きを目的とした微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約に従って２００１年９月２４日に寄託され、寄託番号ＬＭＧ Ｐ－２１０１３が付与された。

【0170】

Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ（Ｙ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦとも名付けられる）などの内因性ＡｒａＣ型ＤＮＡ結合タンパク質（ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ）をコードする遺伝子の上流のヘアピンＩの欠失などのＲＮＡヘアピン構造またはその部分を除去する内因性病原性プラスミドｐＹＶ上に欠失を含むＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔが同様に好ましい。Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄ（本明細書でＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄとも名付けられる）などのプロモーター（ｐＹＶ－ａｓｄ）に動作可能に連結されたａｓｄをコードする遺伝子を含むヌクレオチド配列を含むａｓｄおよび内因性病原性プラスミドｐＹＶをコードする染色体遺伝子の欠失を含むＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔが同様に好ましい。上記に記載される両方の改変を含むＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ ｐＹＶ－ａｓｄ（本明細書でＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ ｐＹＶ－ａｓｄとも名付けられる）が特に好ましい。特に好ましい株は、シデロホアの産生が欠損している、好ましくは、シデロホアを産生しない、例えば、すべてのＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカ株についての場合のように、任意のシデロホアの産生が欠損している、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ（Ｙ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦとも名付けられる）、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄ（本明細書でＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄとも名付けられる）またはＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ ｐＹＶ－ａｓｄ（本明細書でＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ ｐＹＶ－ａｓｄとも名付けられる）である。したがって、同様に特に好ましい株は、Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ（Ｙ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦとも名付けられる）、本明細書でＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄとも名付けられるＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ｐＹＶ－ａｓｄ）、またはＹ．エンテロコリチカ亜種パレアークティカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ ｐＹＶ－ａｓｄ（本明細書でＹ．エンテロコリチカΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔ Δａｓｄ ΔＨａｉｒｐｉｎＩ－ｖｉｒＦ ｐＹＶ－ａｓｄとも名付けられる）である。

【0171】

ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔと指定される六重突然変異型エルシニア・エンテロコリチカ株が最も好ましい。

【0172】

グラム陰性菌株を形質転換するために本発明により使用され得るベクターのようなポリ核酸コンストラクトは、当業者に公知であるように、使用されるグラム陰性菌株に依存し得る。本発明により使用され得るポリ核酸コンストラクトは、発現ベクター（内因性病原性プラスミドの合成またはそうでなければ作成された改変バージョンを含む）、染色体または病原性プラスミド挿入のためのベクター、および例えば、染色体または病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片などのヌクレオチド配列を含む。例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属またはシュードモナス属株において有用である発現ベクターは、例えば、ｐＵＣ、ｐＢａｄ、ｐＡＣＹＣ、ｐＵＣＰ２０およびｐＥＴプラスミドである。例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属またはシュードモナス属株において有用である染色体または病原性プラスミド挿入のためのベクターは、例えば、ｐＫＮＧ１０１である。染色体または病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片は、例えば、ラムダ－レッド遺伝子操作として、例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属またはシュードモナス属株において使用される方法を指す。染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのベクター、または染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片は、本発明のヌクレオチド配列に挿入され得、その結果、例えば、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、組換えグラム陰性菌株の内因性プロモーターに動作可能に連結される。したがって、染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのベクター、または染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片が使用される場合、内因性プロモーターは、内因性細菌ＤＮＡ（染色体またはプラスミドＤＮＡ）においてコードされ得、個々のヌクレオチド配列のみが、染色体もしくは病原性プラスミド挿入のための操作されたベクター、または染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのＤＮＡ断片によって提供される。あるいは、染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのベクター、または例えば、染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのヌクレオチド配列などのポリ核酸コンストラクトが使用される場合、内因性プロモーターおよび細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、内因性細菌ＤＮＡ（染色体またはプラスミドＤＮＡ）においてコードされ得、例えば、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列などのポリ核酸コンストラクトのみが、染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのベクターによって、または例えば、染色体もしくは病原性プラスミド挿入のためのヌクレオチド配列などのポリ核酸コンストラクトによって提供される。したがって、プロモーターは、組換えグラム陰性菌株の形質転換のために使用されるベクターに含まれることは必ずしも必要ではなく、すなわち、本発明の組換えグラム陰性菌株は、プロモーターを含まないベクターで形質転換されてもよい。

【0173】

エルシニア属のための、好ましいベクター、例えば、好ましい発現ベクターは、ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿１、ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２およびｐＴ３Ｐ－７１５、ｐＴ３Ｐ－７１６およびｐＴ３Ｐ－７１７からなる群から選択される。ｐＢａｄ＿Ｓｉ２は、精製ｐＹＶ４０由来のＹｏｐＥおよびＳｙｃＥのための内因性プロモーターを含有するＳｙｃＥ－ＹｏｐＥ_{１－１３８}断片を、ｐＢａｄ－ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングすることによって構築された。追加の改変には、消化、クレノウ断片処理および再ライゲーションによるｐＢａｄ－ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去が含まれる。さらに、次の切断部位が、ＹｏｐＥ_{１－１３８}の３’末端に追加された：ＸｂａＩ－ＸｈｏＩ－ＢｓｔＢＩ－（ＨｉｎｄＩＩＩ）。ｐＢａｄ＿Ｓｉ１は、ｐＢａｄ＿Ｓｉ２と同等であるが、アラビノース誘導性プロモーター下でＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ部位においてｐＥＧＦＰ－Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から増幅されたＥＧＦＰをコードする。Ｔ３ＳＳシグナル配列への融合物として異種タンパク質をコードする内因性エルシニア属病原性プラスミドｐＹＶの改変バージョンの使用が同様に好ましい。

【0174】

サルモネラ属のための、好ましいベクター、例えば、好ましい発現ベクターは、ｐＴ３Ｐ＿２６７、ｐＴ３Ｐ＿２６８およびｐＴ３Ｐ＿２６９からなる群から選択される。対応する内因性プロモーターおよび全長ＳｔｅＡ配列（ｐＴ３Ｐ＿２６７）、ＳｏｐＥ_１－８１断片（ｐＴ３Ｐ＿２６８）またはＳｏｐＥ_{１－１０５}断片（ｐＴ３Ｐ＿２６９）を含有するプラスミドｐＴ３Ｐ＿２６７、ｐＴ３Ｐ＿２６８およびｐＴ３Ｐ＿２６９を、Ｓ．エンテリカＳＬ１３４４ゲノムＤＮＡから増幅し、ｐＢａｄ－ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位にクローニングした。

【0175】

ｐＴ３Ｐ－７１５は、ｐＳｉ＿２と類似の特性を有する完全合成プラスミド（デノボ合成（ｓｎｙｔｈｅｓｉｚｅｄ）ベクター）であるが、対応するＡｒａＣコード化領域は、欠失しており、アンピシリン耐性遺伝子（プラス７０ｂｐ上流）は、２００ｂｐ上流領域で、クロラムフェニコール（ｃｈｌｏｒａｍｐｅｎｉｃｏｌ）耐性遺伝子によって置き換えられている。明確にするために、ｐＴ３Ｐ－７１５は、ｐＹＶ４０由来のＹｏｐＥおよびＳｙｃＥのための内因性プロモーターを含有するＳｙｃＥ－ＹｏｐＥ_{１－１３８}断片を含み、ここで、次の切断部位が、ＹｏｐＥ１－１３８の３’末端に追加された：ＸｂａＩ－ＸｈｏＩ－ＢｓｔＢＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ。これは、ｐＢＲ３２２複製開始点、および転位可能な遺伝エレメントＴｎ９（ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ、１９７９）からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（触媒）を特徴とする。

【0176】

ｐＢａｄ＿Ｓｉ２およびｐＴ３Ｐ－７１５は、ｐＢＲ３２２（ｐＭＢ１）複製開始点（配列番号２９）を有する中コピー数プラスミドである。

【0177】

誘導体ｐＴ３Ｐ－７１６は、ｐＢＲ３２２複製開始点（配列番号２９）における点突然変異に基づく高コピー数プラスミドであり、これは、次いで、ＣｏｌＥ１複製開始点（配列番号３０）をもたらす。異種カーゴタンパク質の発現および送達のための高コピー数プラスミドは、ｐＴ３Ｐ－７１６に基づく。

【0178】

誘導体ｐＴ３Ｐ－７１７は、ｐＴ３Ｐ－７１５におけるｐＢＲ３２２複製開始点に基づくが、追加してｒｏｐ（「プライマーの抑制性因子」のための）遺伝子（配列番号３１）を含む、低コピー数プラスミドである。異種カーゴタンパク質の発現および送達のための低コピー数プラスミドは、ｐＴ３Ｐ－７１７に基づく。

【0179】

本発明のポリヌクレオチド分子は、３’末端配列（停止コドンおよびポリＡ配列を含む）などの他の配列エレメント、またはポリヌクレオチド分子を受け取る形質転換体の選択を可能にする薬物耐性を付与する遺伝子、または形質転換体の選択を可能にする他のエレメントを含んでいてもよい。

【0180】

本発明のポリヌクレオチド分子は、いくつかの公知の方法によって、組換えグラム陰性菌株に形質転換され得る。本発明の目的のために、ポリヌクレオチド分子を導入するための形質転換の方法には、限定されるものではないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム媒介形質転換、コンジュゲーション、またはその組み合わせが含まれる。例えば、ベクター上に位置する、例えば、ポリヌクレオチド分子は、標準的なエレクトロポレーション手順によって、第１の菌株に形質転換され得る。その後、例えば、ベクター上に位置する、そのようなポリヌクレオチド分子は、「可動化」とも呼ばれるプロセスであるコンジュゲーションによって、第１の菌株から所望の株に移入され得る。形質転換体（すなわち、ベクターを取り込んでいるグラム陰性菌株）は、例えば、抗生物質を用いて選択され得る。これらの技法は、当技術分野において周知である。例えば、（ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９４）を参照されたい。

【0181】

本発明に従って、本発明の組換えグラム陰性菌株の細菌エフェクタータンパク質に動作可能に連結されたプロモーターは、個々の株または適合する菌株のＴ３ＳＳエフェクタータンパク質のネイティブプロモーター、あるいは個々のまたは適合する菌株の別のネイティブプロモーター、または例えば、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属もしくはシュードモナス属株において有用である発現ベクターにおいて使用されるプロモーター、例えば、ｐＵＣおよびｐＢａｄであり得る。そのようなプロモーターは、Ｔ７プロモーター、Ｐｌａｃプロモーター、またはアラビノース誘導性Ａｒａ－ｂａｄプロモーターである。

【0182】

組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、エルシニア属ビルロン遺伝子由来であり得る。「エルシニア属ビルロン遺伝子」は、エルシニア属ｐＹＶプラスミド上の遺伝子を指し、その発現は、温度によって、および標的細胞との接触によっての両方で制御される。そのような遺伝子には、分泌機構のエレメントをコードする遺伝子（Ｙｓｃ遺伝子）、輸送体をコードする遺伝子（ＹｏｐＢ、ＹｏｐＤ、およびＬｃｒＶ）、制御エレメントをコードする遺伝子（ＹｏｐＮ、ＴｙｅＡおよびＬｃｒＧ）、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子（ＳｙｃＤ、ＳｙｃＥ、ＳｙｃＨ、ＳｙｃＮ、ＳｙｃＯおよびＳｙｃＴ）、ならびにエフェクター（ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴおよびＹｏｐＰ／ＹｏｐＪ）だけでなく、ＶｉｒＦおよびＹａｄＡのようなタンパク質がコードされる他のｐＹＶをコードする遺伝子が含まれる。

【0183】

本発明の好ましい実施形態において、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能的エフェクターコード遺伝子のネイティブプロモーターである。組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合、プロモーターは、ＹｏｐＥ、ＹｏｐＨ、ＹｏｐＯ／ＹｐｋＡ、ＹｏｐＭおよびＹｏｐＰ／ＹｏｐＪのいずれか１つから選択される。より好ましくは、プロモーターは、ＹｏｐＥおよび／またはＹｏｐＨ由来である。それぞれ、ＹｏｐＥおよびＹｏｐＨプロモーターが最も好ましい。

【0184】

組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、ＳｐｉＩもしくはＳｐｉＩＩ病原性アイランド由来、または他の場所でコードされるエフェクタータンパク質由来であり得る。そのような遺伝子には、分泌機構のエレメントをコードする遺伝子、輸送体をコードする遺伝子、制御エレメントをコードする遺伝子、Ｔ３ＳＳエフェクターシャペロンをコードする遺伝子、およびエフェクターだけでなく、ＳＰＩ－１またはＳＰＩ－２によってコードされる他のタンパク質をコードする遺伝子が含まれる。本発明の好ましい実施形態において、プロモーターは、Ｔ３ＳＳ機能的エフェクターコード遺伝子のネイティブプロモーターである。組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合、プロモーターは、エフェクタータンパク質のいずれか１つから選択される。より好ましくは、プロモーターは、ＳｏｐＥ、ＩｎｖＢまたはＳｔｅＡ由来である。

【0185】

一部の実施形態において、プロモーターは、例えば、ＩＰＴＧ誘導性プロモーター、光誘導性プロモーターおよびアラビノース誘導性プロモーターのような人工誘導性プロモーターである。

【0186】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、プロテアーゼ切断部位をコードするヌクレオチド配列を含む。プロテアーゼ切断部位は、通常、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列と送達シグナルをコードするヌクレオチド配列との間で細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子上に位置する。機能的および一般に利用可能な切断部位の作成は、移動後の送達シグナルの切り落としを可能にする。送達シグナルが、正しい局在化および／または標的細胞内の移動したタンパク質の機能に干渉し得るので、送達シグナルと目的のタンパク質との間のプロテアーゼ切断部位の導入は、ほとんどのネイティブタンパク質の真核細胞への送達を提供する。好ましくは、プロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼおよびトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼまたはその触媒ドメインによって切断されるアミノ酸モチーフ、より好ましくは、ＴＥＶプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフである。同様に好ましいプロテアーゼ切断部位は、エンテロキナーゼ（軽鎖）、エンテロペプチダーゼ、ｐｒｅｓｃｉｓｓｉｏｎプロテアーゼ、ヒトライノウイルスプロテアーゼ３Ｃ、ＴＥＶプロテアーゼ、ＴＶＭＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子プロテアーゼ、脱ユビキチン化酵素と呼ばれるユビキチンプロセシングプロテアーゼ、およびトロンビンからなる群から選択されるプロテアーゼまたはその触媒ドメインによって切断されるアミノ酸モチーフである。ＴＥＶプロテアーゼによって、またはユビキチンプロセシングプロテアーゼによって切断されるアミノ酸モチーフが最も好ましい。

【0187】

したがって、本発明のさらなる実施形態において、異種タンパク質は、プロテアーゼによって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルから切断される。切断の好ましい方法は、以下の方法である：
ａ）プロテアーゼは、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルおよび異種タンパク質としてプロテアーゼを含む融合タンパク質を発現する本明細書に記載される組換えグラム陰性菌株によって、真核細胞に移動される；または
ｂ）プロテアーゼは、真核細胞において、構成的にまたは一過性に発現される。

【0188】

通常、所望のタンパク質を真核細胞に送達するために使用される組換えグラム陰性菌株、およびプロテアーゼを真核細胞に移動させる組換えグラム陰性菌株は異なる。

【0189】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、標識化分子または標識化分子のための受容部位をコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。標識化分子または標識化分子のための受容部位をコードするさらなるヌクレオチド配列は、通常、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に融合される。好ましい標識化分子または標識化分子のための受容部位は、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、クマリン、クマリンリガーゼ受容部位、レゾルフィン、レゾルフィン（ｒｅｓｕｒｏｆｉｎ）リガーゼ受容部位、ＦｌＡｓＨ／ＲｅＡｓＨ色素（ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）との使用におけるテトラ－システインモチーフからなる群から選択される。レゾルフィンおよびレゾルフィン（ｒｅｓｕｒｏｆｉｎ）リガーゼ受容部位、またはＥＧＦＰが最も好ましい。標識化分子または標識化分子のための受容部位の使用は、標識化分子の目的の異種タンパク質への付着をもたらし、これは、次いで、それ自体が真核細胞に送達され、例えば、生細胞顕微鏡法によって、タンパク質の追跡を可能にする。

【0190】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、ペプチドタグをコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。ペプチドタグをコードするさらなるヌクレオチド配列は、通常、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に融合される。好ましいペプチドタグは、Ｍｙｃタグ、Ｈｉｓタグ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグもしくはＶ５タグ、またはこれらの群のうち２つ以上のタグの組み合わせからなる群から選択される。Ｍｙｃタグ、Ｆｌａｇタグ、Ｈｉｓタグ、ならびに組み合わされたＭｙｃタグおよびＨｉｓタグが最も好ましい。ペプチドタグの使用は、例えば、抗タグ抗体を使用する免疫蛍光またはウエスタンブロット法によって、タグ化タンパク質のトレーサビリティをもたらす。さらに、ペプチドタグの使用は、培養上清への分泌後または真核細胞への移動後のいずれかで、両方の場合において、対応するタグに適した精製方法（例えば、Ｈｉｓタグを用いる使用における金属－キレート親和性精製、またはＦｌａｇタグを用いる使用における抗Ｆｌａｇ抗体に基づく精製）を使用して、所望のタンパク質の親和性精製を可能する。

【0191】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるヌクレオチド配列を含む。核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードするさらなるヌクレオチド配列は、通常、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端または３’末端に融合され、ここで、前記さらなるヌクレオチド配列は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）をコードする。好ましいＮＬＳは、ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳおよびその誘導体（Ｙｏｎｅｄａら、１９９２）、および他のウイルスＮＬＳからなる群から選択される。ＳＶ４０大型Ｔ抗原ＮＬＳおよびその誘導体が最も好ましい。

【0192】

本発明の一実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、多重クローニング部位を含む。多重クローニング部位は、通常、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端、および／または異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端もしくは３’末端に位置する。１つまたは２つ以上の多重クローニング部位が、ベクターに含まれ得る。好ましい多重クローニング部位は、ＸｈｏＩ、ＸｂａＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＢａｍＨＩ、ＮｈｅＩ、ＳａｃＩ、ＳａｌＩ、ＢｓｔＢＩからなる制限酵素の群から選択される。ＸｂａＩ、ＸｈｏＩ、ＢｓｔＢＩおよびＨｉｎｄＩＩＩが最も好ましい。

【0193】

本発明の組換えグラム陰性菌株によって発現されるタンパク質は、「融合タンパク質」または「ハイブリッドタンパク質」とも称され、すなわち、送達シグナルおよび異種タンパク質の融合タンパク質またはハイブリッドである。融合タンパク質は、例えば、送達シグナルおよび２つ以上の異なる異種タンパク質を含むこともできる。一部の実施形態において、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルおよび異種タンパク質をそれぞれ含む少なくとも２つの融合タンパク質は、組換えグラム陰性菌株によって発現され、本発明の方法によって、真核細胞、例えば、がん細胞に移動される。

【0194】

組換えグラム陰性菌株は、当技術分野において公知の方法（例えば、ＦＤＡ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｍａｎｕａｌ（ＢＡＭ）、第８章：Ｙｅｒｓｉｎｉａ ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ）に従って、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質が発現するように、培養することができる。好ましくは、組換えグラム陰性菌株は、例えば、２８℃で、脳心臓インフュージョンブロス中で培養することができる。Ｔ３ＳＳ、および例えば、ＹｏｐＥ／ＳｙｃＥプロモーター依存性遺伝子の発現の誘導のために、細菌を、３７℃で成長させることができる。

【0195】

当業者は、いくつかのアッセイを使用して、組換えグラム陰性菌によって、融合タンパク質のような異種タンパク質の送達が成功するかどうかを決定することもできる。例えば、融合タンパク質は、融合されたタグ（Ｍｙｃタグのような）を認識する抗体を使用して、免疫蛍光を介して検出され得る。決定は、送達されるタンパク質の酵素活性、例えば、（ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９４）によって記載されるアッセイに基づくこともできる。

【0196】

好ましい実施形態において、本発明の組換えグラム陰性菌株は、
ｉ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む第１のポリヌクレオチド分子であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、第１のポリヌクレオチド分子；
ｉｉ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む第２のポリヌクレオチド分子であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、第２のポリヌクレオチド分子；
ｉｉｉ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む第３のポリヌクレオチド分子であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、第３のポリヌクレオチド分子；および
ｉｖ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含む第４のヌクレオチド分子であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、第４のヌクレオチド分子
を含む組換えグラム陰性菌株であって、
前記第１および前記第２のポリヌクレオチド分子が、前記グラム陰性菌株に含まれるベクター上に位置し、前記第３および前記第４のポリヌクレオチド分子が、前記グラム陰性菌株の染色体または前記グラム陰性菌株に含まれる染色体外遺伝エレメント上に位置し、ただし、染色体外遺伝エレメントが、前記第１および前記第２のポリヌクレオチド分子が位置するベクターではない、
組換えグラム陰性菌株である。

【0197】

一実施形態において、第３および第４のポリヌクレオチド分子は、内因性病原性プラスミド上に位置し、好ましくは、細菌エフェクタータンパク質のネイティブ部位、例えば、病原性因子のネイティブ部位、好ましくは、組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合において、ＹｏｐＥおよび／もしくはＹｏｐＨのネイティブ部位または別のＹｏｐ（ＹｏｐＯ、ＹｏｐＰ、ＹｏｐＭ、ＹｏｐＴ）のネイティブ部位、好ましくは、それぞれ、ＹｏｐＥおよびＹｏｐＨのネイティブ部位、あるいは組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合において、ＳｐｉＩ、ＳｐｉＩＩ内でコードされるか、または他の場所でコードされるエフェクタータンパク質のネイティブ部位、好ましくは、ＳｐｉＩまたはＳｐｉＩＩ内でコードされるエフェクタータンパク質のネイティブ部位、より好ましくは、ＳｏｐＥまたはＳｔｅＡのネイティブ部位で、内因性病原性プラスミド上に位置する。

【0198】

一実施形態において、第１のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列および第３のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、同じ異種タンパク質またはその断片をコードする。

【0199】

さらなる実施形態において、第２のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列および第４のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、同じ異種タンパク質またはその断片をコードする。

【0200】

好ましい実施形態において、第１のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列および第３のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、同じ異種タンパク質またはその断片をコードし、
第２のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列および第４のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、同じ異種タンパク質またはその断片をコードし、ここで、第１および第３のポリヌクレオチド分子によってコードされる異種タンパク質またはその断片は、第２および第４のポリヌクレオチド分子によってコードされる異種タンパク質またはその断片と異なる。

【0201】

より好ましい実施形態において、互いに独立して、第１および第３のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質またはその断片は、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーまたはその断片、他のＣＡＲＤドメインを含有する抗ウイルスシグナル伝達およびＩ型ＩＦＮ誘導に関与するタンパク質またはその断片、ならびにＳＴＩＮＧの刺激をもたらす、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳまたは上記に記載されるその断片からなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素からなる群から選択される。さらにより好ましくは、互いに独立して、第１および第３のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ならびにｃＧＡＳ、または上記に記載されるその断片からなる群から選択される。特に、第１および第３のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質は、ｃＧＡＳまたはその断片、例えば、上記に記載されるその断片、より特に、配列番号１０に示されるヒトｃＧＡＳまたはその断片である。

【0202】

より好ましい実施形態において、互いに独立して、第２および第４のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質またはその断片は、ＲＩＧ－Ｉ様受容体（ＲＬＲ）ファミリーまたはその断片、他のＣＡＲＤドメインを含有する抗ウイルスシグナル伝達およびＩ型ＩＦＮ誘導に関与するタンパク質またはその断片、ならびにＳＴＩＮＧの刺激をもたらす、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ＣｄａＳならびにｃＧＡＳ、または上記に記載されるその断片からなる群から選択されるサイクリック－ジ－ＡＭＰシクラーゼ、サイクリック－ジ－ＧＭＰシクラーゼおよびサイクリック－ジ－ＧＡＭＰシクラーゼなどのサイクリックジヌクレオチド生成酵素からなる群から選択される。さらにより好ましくは、互いに独立して、第２および第４のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ＣｄａＡ、ならびにｃＧＡＳ、またはその断片からなる群から選択される。特に、互いに独立して、第２および第４のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質は、ＲＩＧ１、ＭＤＡ５、ＭＡＶＳ、ＷｓｐＲ、ＤｎｃＶ、ＤｉｓＡおよびＤｉｓＡ様、ならびにＣｄａＡ、またはその断片からなる群から選択される。より特に、第２および第４のポリヌクレオチド分子のヌクレオチド配列によってコードされる異種タンパク質は、ＲＩＧ１または上記に記載されるその断片、より特に、ＣＡＲＤドメインを含むＲＩＧ１の断片、さらにより特に、ＲＩＧ１の断片、好ましくは、２つのＣＡＲＤドメインを含むヒトＲＩＧ１、最も特に、配列番号１、配列番号２または配列番号３に示される、好ましくは、配列番号１に示される２つのＣＡＲＤドメインを含むヒトＲＩＧ１の断片である。

【0203】

一部の実施形態において、第１、第２、第３および第４のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、同じ送達シグナルである。好ましい実施形態において、第１、第２、第３および第４のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の送達シグナル、好ましくは、細菌Ｔ３ＳＳエフェクタータンパク質由来の同じ送達シグナルである。より好ましい実施形態において、第１、第２、第３および第４のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルは、ＹｏｐＥエフェクタータンパク質またはそのＮ末端断片を含む。

【0204】

一実施形態において、第１のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および第２のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、それぞれ、同じプロモーターに動作可能に連結されている。「それぞれ、同じプロモーターに動作可能に連結される」という用語は、これに関して、１つのプロモーター（同じプロモーター）が、第１および第２のポリヌクレオチド分子の異種タンパク質の発現を駆動することを意味する。好ましい実施形態において、第１のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および第２のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、同じｙｏｐＥプロモーターにそれぞれ動作可能に連結されている。

【0205】

さらなる実施形態において、第３のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および第４のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターに動作可能に連結されている。好ましい実施形態において、第３のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、ＹｏｐＥプロモーターに動作可能に連結され、第４のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、ＹｏｐＨプロモーターに動作可能に連結されている。

【0206】

さらなる好ましい実施形態において、第１のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および第２のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、同じプロモーターに動作可能に連結され、第３のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列、および第４のポリヌクレオチド分子の細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列は、２つの異なるプロモーターに動作可能に連結されている。

【0207】

前記第１および第２のポリヌクレオチド分子を含むベクターは、低、中または高コピー数プラスミドであり得る。低コピー数プラスミドは、通常、１～１５コピー／細菌細胞、好ましくは、１～１０コピー／細菌細胞を有する。中コピー数プラスミドは、通常、５～２００コピー／細菌細胞、好ましくは、１０～１５０コピー／細菌細胞を有する。高コピー数プラスミドは、通常、１００～１’０００コピー／細菌細胞、好ましくは、１５０～７００コピー／細菌細胞を有する。

【0208】

好ましい実施形態において、前記第１および第２のポリヌクレオチド分子を含むベクターは、中コピー数プラスミドである。好ましい実施形態において、ベクターは、５～２００コピー／細菌細胞を有する中コピー数プラスミドであり、すなわち、プラスミドの５～２００コピーが、単一の細菌細胞中に存在し、好ましくは、１０～１５０コピー／細菌細胞、すなわち、プラスミドの１０～１５０コピーが、単一の細菌細胞中に存在する。

【0209】

一実施形態において、前記第１および第２のポリヌクレオチド分子を含むベクターは、挿入断片なしで、１～１５ｋＤａ、好ましくは、２～１０ｋＤａ、より好ましくは、３～７ｋＤａのサイズを有するプラスミドである。

【0210】

一実施形態において、染色体外遺伝エレメントは、内因性病原性プラスミド、好ましくは、ＩＩＩ型分泌系のタンパク質を天然に（天然で）コードする内因性病原性プラスミドである。好ましい実施形態において、染色体外遺伝エレメントは、内因性病原性プラスミドｐＹＶである。

【0211】

本発明の組換えグラム陰性菌株は、以下によって、得ることができる。
１）グラム陰性菌株を、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるか、または細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片をコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるヌクレオチド配列を含む、ポリヌクレオチド分子、好ましくは、ＤＮＡポリヌクレオチド分子で形質転換すること、ここで、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルは、グラム陰性菌株の染色体上または内因性病原性プラスミド上でコードされる。好ましくは、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルのヌクレオチド配列と相同または同一であるヌクレオチド配列は、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端上に位置する。異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルの３’末端の染色体または内因性病原性プラスミドのヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列によって、その３’末端上で隣接し得る。その３’末端上の相同タンパク質に隣接するこのヌクレオチド配列は、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルの３’末端の染色体上または内因性病原性プラスミド上の１０ｋｂｐ以内にあるヌクレオチド配列に相同であり得る。その３’末端上の相同タンパク質に隣接するこのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列と相同であり得、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルと、染色体上または内因性病原性プラスミド上の同じオペロン内にあり得る。形質転換は、通常、染色体または病原性プラスミドによってコードされる細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端で、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、組換えグラム陰性菌株の内因性病原性プラスミドまたは染色体上、好ましくは、内因性病原性プラスミド上に挿入されるように行われ、ここで、送達シグナルに融合された異種タンパク質が発現および分泌される；
２）工程１）の後（またはそれと並行して）、組換え菌株を、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるか、または細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片をコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるヌクレオチド配列を含む、さらなるポリヌクレオチド分子、好ましくは、ＤＮＡポリヌクレオチド分子で形質転換することができ、ここで、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルは、グラム陰性菌株の染色体上または内因性病原性プラスミド上でコードされる。ヌクレオチド配列は、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルのヌクレオチド配列と相同または同一であり得、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列の５’末端上に位置し得る。異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルの３’末端の染色体または内因性病原性プラスミドのヌクレオチド配列に相同なヌクレオチド配列によって、その３’末端上で隣接し得る。その３’末端上の相同タンパク質に隣接するこのヌクレオチド配列は、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルの３’末端の染色体上または内因性病原性プラスミド上の１０ｋｂｐ以内にあるヌクレオチド配列に相同であり得る。その３’末端上の相同タンパク質に隣接するこのヌクレオチド配列は、ヌクレオチド配列と相同であり得、細菌エフェクタータンパク質またはその断片からの送達シグナルと、染色体上または内因性病原性プラスミド上の同じオペロン内にあり得る。形質転換は、通常、染色体または内因性病原性プラスミドによってコードされる細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの３’末端で、異種タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、組換えグラム陰性菌株の内因性病原性プラスミドまたは染色体上、好ましくは、内因性病原性プラスミド上に挿入されるように行われ、ここで、送達シグナルに融合された異種タンパク質が、発現および分泌される；ならびに／あるいは
３）組換え菌株は、異種タンパク質、および細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるか、または細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片をコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるヌクレオチド配列をコードする、１つ（２つのベクターの場合において）または２つ（１つのベクターの場合において）のヌクレオチド配列を含む発現ベクターのような１つまたは２つのポリヌクレオチドコンストラクトで遺伝子的に形質転換することができる。

【0212】

１）および２）で得られた組換え菌株が、工程３）において、異種タンパク質、および細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるか、または細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルの断片をコードするヌクレオチド配列と相同もしくは同一であるヌクレオチド配列をそれぞれコードする、２つのヌクレオチド配列を含む１つのベクターで形質転換される場合において、これらの２つの配列は、融合されて、オペロンを形成することができる。

【0213】

工程１）～３）の順序は、交換することができ、または工程は、組み合わされてもよく、または個々の工程のみが行われてもよい。組換えグラム陰性菌株がエルシニア属株である場合において、内因性病原性プラスミドは、ｐＹＶ（エルシニア属病原性のプラスミド）である。組換えグラム陰性菌株がサルモネラ属株である場合において、挿入のための内因性位置は、エフェクタータンパク質が、他の場所でコードされる位置のＳｐｉＩまたはＳｐｉＩＩ（サルモネラ属病原性アイランドについて）と呼ばれる遺伝子クラスターの１つ、あるいはサルモネラ属病原性プラスミド（ＳＶＰ）の１つである。

【0214】

免疫チェックポイントモジュレーター
一実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＩＤＯ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）、ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭ、ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２、ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｃ（ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）；ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７、ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１、ＴＤＯ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である。括弧内の用語は、便宜上示される対応するタンパク質の同義語を指す。例として、ＣＤ１５４は、ＣＤ４０Ｌの同義語であり、したがって、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）として示される。同義語のリストは結論付けられておらず、さらなる同義語が、免疫チェックポイントの多くに存在する。

【0215】

好ましい実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９、ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＩＧ）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である。

【0216】

より好ましい実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの活性化剤または阻害剤、特に、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの活性化剤または阻害剤である。

【0217】

さらにより好ましい実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの阻害剤、特に、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの阻害剤である。

【0218】

特に好ましい実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ－４アンタゴニストである。好ましくは、ＰＤ－１アンタゴニストは、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体またはアンタゴニストＰＤＬ－２抗体、より好ましくは、アンタゴニストＰＤ－１抗体またはアンタゴニストＰＤＬ－１抗体である。好ましくは、ＣＴＬＡ－４アンタゴニストは、アンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である。特に、免疫チェックポイントモジュレーターは、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－２抗体およびアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体からなる群から選択され、より特に、免疫チェックポイントモジュレーターは、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体および／またはアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体であり、さらにより特に、免疫チェックポイントモジュレーターは、アンタゴニストＰＤ－１抗体および／またはアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である。

【0219】

より特に好ましい実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、セミプリマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、レチファンリマブ、プロルゴリマブ（ＢＣＤ－１００）、セルプルリマブ（ＨＬＸ１０）、スパルタリズマブ、ＡＫ１０５、アベルマブ、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、およびスゲマリマブからなる群から選択されるアンタゴニストＰＤ－１抗体、ならびに／またはイピリムマブおよびトレメリムマブからなる群から選択されるアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である。

【0220】

一実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、抗体である。好ましい実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、キメラ抗体、ヒト化抗体および完全ヒト抗体、より好ましくは、ヒト化抗体または完全ヒト抗体からなる群から選択される抗体である。

【0221】

一実施形態において、免疫チェックポイントモジュレーターは、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－２抗体またはアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体であり、ここで、抗体は、キメラ抗体、ヒト化抗体または完全ヒト抗体、好ましくは、ヒト化抗体または完全ヒト抗体である。

【0222】

組み合わせ物
本発明による薬学的組み合わせ物は、例えば、同時の、別々のまたは逐次的な使用のための、組み合わせ調製物または薬学的組成物である。

【0223】

「組み合わせ調製物」という用語は、本明細書で使用される場合、特に、前記組換えグラム陰性菌株および前記免疫チェックポイントモジュレーターが、独立して、別々の形態で、または区別された量の活性成分との異なる固定された組み合わせの使用によってのいずれかで投薬され得るという意味で、「部材のキット」を定義する。組み合わせ調製物において投与される組換えグラム陰性菌株の量の免疫チェックポイントモジュレーターの量に対する比は、例えば、治療される患者の下位集団の必要性または単一の患者の必要性に対処するために変更することができ、この必要性は、患者の年齢、性別、体重などに起因して異なり得る。組み合わせ調製物（部材のキット）の個々の部材は、同時にまたは逐次的に投与することができ、すなわち、部材のキットの任意の部材について、例えば、異なる時点および等しいまたは異なる時間間隔で、経時的に調整することができる。

【0224】

「薬学的組成物」という用語は、個々の投与量の所定の組み合わせを有する、単一投与形態中で組み合わされた組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーターを含む固定用量組み合わせ物（ＦＤＣ）を指す。

【0225】

薬学的組み合わせ物は、アドオン療法としてさらに使用されてもよい。本明細書で使用される場合、「アドオン」または「アドオン療法」は、療法における使用のための試薬の集合体を意味し、療法を受けている対象は、第１の治療レジメンに加えて１つまたは複数の異なる試薬の第２の治療レジメンを開始する前に、１つまたは複数の試薬の第１の治療レジメンを開始し、その結果、療法において使用される試薬のすべては、同じ時に開始しない。例えば、すでにグラム陰性菌株療法を受けている患者に免疫チェックポイントモジュレーター療法を追加する。

【0226】

好ましい実施形態において、本発明による薬学的組み合わせ物は、組み合わせ調製物である。

【0227】

投与される組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーターの量は、例えば、投与される特定の組換えグラム陰性菌株、投与の経路、治療される状態、治療される標的領域、および治療される対象または宿主を含む、症例の周囲の特定の状況に従って、特定の化合物、疾患状態およびその重症度などの要因に応じて変わるであろう。

【0228】

一実施形態において、本発明は、組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む薬学的組み合わせ物であって、前記組換えグラム陰性菌株および前記免疫チェックポイントモジュレーターが、治療的有効量で存在する、薬学的組み合わせ物を提供する。

【0229】

「有効量」または「治療的有効量」という表現は、本明細書で使用される場合、本発明の組み合わせ物を受けている対象において以下の効果の１つまたは複数を呼び起こすことができる量を指す：（ｉ）腫瘍成長の阻害または停止、腫瘍成長率を低減することまたは完全な成長の停止を引き起こすことを含む；（ｉｉ）完全な腫瘍縮小；（ｉｉｉ）腫瘍サイズの低減；（ｉｖ）腫瘍数の低減；（ｖ）抹消器官への腫瘍細胞浸潤の転移の阻害（すなわち、低減、減速または完全な停止）；（ｖｉ）抗腫瘍免疫応答の増強、これは、腫瘍の縮小または排除をもたらし得るが、必ずしもそうでなくてもよい；（ｖｉｉ）がんに関連する１つまたは複数の症状のある程度の軽減；（ｖｉｉｉ）組み合わせ物を受けている対象の無増悪生存（ＰＦＳ）および／または；全生存（ＯＳ）の増加。

【0230】

治療的有効量の決定は、特に、本明細書に提供される詳述される開示を考慮すると、十分に当業者の能力内である。一部の実施形態において、治療的有効量は、（ｉ）がん細胞の数を低減し得る；（ｉｉ）腫瘍サイズを低減し得る；（ｉｉｉ）末梢器官へのがん細胞浸潤を、ある程度、阻害し得、妨害し得、遅らせ得、好ましくは、停止させ得る；（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し得る（例えば、ある程度遅らせ得、好ましくは、停止させ得る）；（ｖ）腫瘍成長を阻害し得る；（ｖｉ）腫瘍の出現および／もしくは再発を遅延させ得る；ならびに／または（ｖｉｉ）がんに関連する症状の１つもしくは複数を、ある程度、軽減し得る。さまざまな実施形態において、量は、がんの症状の１つまたは複数を、回復させ、和らげ、少なくし、および／または遅延させるのに十分である。

【0231】

別の好ましい実施形態において、本発明は、組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む薬学的組み合わせ物であって、前記組換えグラム陰性菌株および前記免疫チェックポイントモジュレーターが、相加的治療効果を生じる量で存在する、薬学的組み合わせ物を提供する。

【0232】

本明細書で使用される場合、「相加的」という用語は、本発明の薬学的組み合わせ物により達成される効果が、抗がん剤、すなわち、単剤療法としての組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーターの使用から生じる効果のおよそ合計であることを意味する。

【0233】

別の好ましい実施形態において、本発明は、組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）を含む薬学的組み合わせ物であって、前記組換えグラム陰性菌株および前記免疫チェックポイントモジュレーターが、相乗的治療効果を生じる量で存在する、薬学的組み合わせ物を提供する。

【0234】

本明細書で使用される場合、「相乗的」という用語は、本発明の薬学的組み合わせ物により達成される効果が、抗がん剤、すなわち、単剤療法としての組換えグラム陰性菌株および免疫チェックポイントモジュレーターの使用から生じる効果の合計よりも大きいことを意味する。有利には、そのような相乗作用は、同じ用量でより高い有効性を提供し、療法に対するより長い奏功期間をもたらし得る。

【0235】

一実施形態において、本発明は、免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）および組換えグラム陰性菌株を含む薬学的組み合わせ物であって、組合せ物中の前記免疫チェックポイントモジュレーターの量が、約１～約１０００ｍｇである、薬学的組み合わせ物を提供する。

【0236】

好ましい実施形態において、本発明は、免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）および組換えグラム陰性菌株を含む薬学的組み合わせ物であって、組合せ物中の抗アポトーシス性タンパク質の前記阻害剤の量が、約１０^５～約１０^１０個細菌である、薬学的組み合わせ物を提供する。

【0237】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属、大腸菌属、サルモネラ属、およびシュードモナス属からなる群から選択され；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＩＤＯ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）、ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭ、ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２、ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｃ（ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）；ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７、ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１、ＴＤＯ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0238】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属およびサルモネラ属からなる群から選択され；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９、ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＩＧ）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0239】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＩＤＯ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）、ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭ、ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２、ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｃ（ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）；ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７、ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１、ＴＤＯ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0240】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９、ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＩＧ）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0241】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり；
ＩＣＭが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント、特に、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0242】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ－４アンタゴニストである；
組み合わせ物を提供する。

【0243】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア属株であり；
ＩＣＭが、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体および／またはアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である；
組み合わせ物を提供する。

【0244】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア・エンテロコリチカであり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＩＤＯ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）、ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭ、ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２、ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｃ（ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）；ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７、ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１、ＴＤＯ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0245】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア・エンテロコリチカであり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９、ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＩＧ）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0246】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア・エンテロコリチカであり；
ＩＣＭが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント、特に、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0247】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア・エンテロコリチカであり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ－４アンタゴニストである；
組み合わせ物を提供する。

【0248】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア・エンテロコリチカであり；
ＩＣＭが、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体および／またはアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である；
組み合わせ物を提供する。

【0249】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔであり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９（ガレクチン９）、ＴＩＭ３－Ｌ、Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）、Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＬ２）、ＰＶＲＩＧ、ＰＶＲＬ３（ＣＤ１１３）、ＰＶＲＬ１（ＣＤ１１１）、ＤＮＡＭ－１（ＣＤ２２６）、ＫＩＲ２ＤＬ５（ＣＤ１５８ｆ）、ＴＡＣＴＩＬＥ（ＣＤ９６）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）、ＩＤＯ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）、ＣＤ１３７（４１ＢＢ）、Ｃｄ１３７Ｌ（４１ＢＢ－Ｌ）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＩＣＯＳＬ（Ｂ７－Ｈ２またはＣＤ２７５またはＢ７ＲＰ１）、ＫＩＲ、ＫＩＲＤＳ（ＫＩＲ２ＤＳおよびＫＩＲ３ＤＳ）、ＫＩＲＤＬ（ＫＩＲ２ＤＬおよびＫＩＲ３ＤＬ）、Ａ２ａＲ、ＣＤ２７、ＣＤ７０（ＣＤ２７Ｌ）、ＢＴＬＡ、ＨＶＥＭ、ＧＩＴＲ、ＧＩＴＲＬ、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）、ＴＩＭ－１、ＣＥＡＣＡＭ１、ＩＣＡＭ、ＬＦＡ－１、ＣＤ２、ＣＤ１６０、ＨＶＥＭ、ＣＤ２２６、Ｃｄ１１２、ＰＩＲ－Ｂ（ｇｐ４９Ｂ）、ＣＤ８５Ｊ、ＣＤ８５Ｄ、ＣＤ８５Ａ、ＣＤ８５Ｋ、ＣＤ８５Ｃ（ＬＩＲ１、ＬＩＲ２、ＬＩＲ３、ＬＩＲ５、およびＬＩＲ８）；ＩＬＴ２、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ３、ＳＩＲＰアルファ、ＣＤ４７、ＧＡＲＰ、ＴＧＦベータ１、ＴＤＯ、ＣＤ９４、ＮＫＧ２Ａ、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＳＦ１、ＣＳＦ１Ｒ、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＣＤ２２９（ＳＬＡＭＦ３）、およびＣＤ４８（ＳＬＡＭＦ２）からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0250】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔであり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１、Ｂ７－Ｈ１（ＰＤＬ１またはＣＤ２７４）、Ｂ７－ＤＣ（ＰＤ－Ｌ２またはＣＤ２７３）、ＣＴＬＡ－４（ＣＤ１５２）、ＣＤ８０（Ｂ７－１）、ＣＤ８６（Ｂ７－２）、ＬＡＧ－３（ＣＤ２２３）、ＭＨＣ－Ｉ、ＭＨＣ－ＩＩ、ＴＩＭ－３（ＨＡＶｃｒ－２）、Ｇａｌ９、ＴＩＭ３－Ｌ；Ｂ７－Ｈ３（ＣＤ２７６）；Ｂ７－Ｈ４（ＶＴＣＮ１）、ＴＩＧＩＴ、ＰＶＲ（ＣＤ１５５）、ネクチン－２（ＣＤ１１２またはＰＶＲＩＧ）、ＶＩＳＴＡ（Ｂ７－Ｈ５）およびＩＤＯからなる群から選択される免疫チェックポイントポイント分子の活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0251】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、エルシニア・エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔであり；
ＩＣＭが、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２からなる群から選択される免疫チェックポイントポイント、特に、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１およびＰＤ－Ｌ１からなる群から選択される免疫チェックポイントポイントの活性化剤または阻害剤である；
組み合わせ物を提供する。

【0252】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔであり；
ＩＣＭが、ＰＤ－１アンタゴニストまたはＣＴＬＡ－４アンタゴニストである；
組み合わせ物を提供する。

【0253】

一実施形態において、本発明は、
（ａ）細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株；
（ｂ）免疫チェックポイントモジュレーター（ＩＣＭ）；および任意選択で、
（ｃ）１つまたは複数の薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体
を含む組み合わせ物であって；
組換えグラム陰性菌株が、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔｙｏｐＨ，Ｏ，Ｐ，Ｅ，Ｍ，Ｔであり；
ＩＣＭが、アンタゴニストＰＤ－１抗体、アンタゴニストＰＤＬ－１抗体および／またはアンタゴニストＣＴＬＡ－４抗体である；
組み合わせ物を提供する。

【0254】

製剤、投与様式および投薬
製剤および投与の経路は、個々の対象、対象における治療される状態の特質、および一般に主治医の判断に合わされ得る。

【0255】

本発明の薬学的組み合わせ物、すなわち、薬学的組成物または組み合わせ調製物は、単回用量または複数回用量のいずれかで、直腸、頬側、鼻腔内、経粘膜、経皮、動脈内注射によって、点滴によって、静脈内（点滴または注射）、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、経口、および腫瘍内注射を含む局所的を含む類似の有用性を有する薬剤の許容される投与様式のいずれかによって投与され得る。

【0256】

本発明に従って本明細書に記載される対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法における使用のための薬学的組み合わせ物は、好ましくは、注射、例えば、静脈内、筋肉内、くも膜下腔内、腫瘍内または腹腔内注射または注入に好適であり、より好ましくは、静脈内もしくは腫瘍内注射または点滴に好適であり、通常、治療的有効量の活性成分、および１つまたは複数の好適な薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体を含む。

【0257】

したがって、好ましい実施形態において、薬学的組み合わせ物は、対象に、静脈内または腫瘍内に投与され、すなわち、免疫チェックポイントモジュレーターおよび組換え病原性弱毒化グラム陰性菌株は、対象に、静脈内または腫瘍内に、特に、静脈内点滴によって投与される。

【0258】

対象への免疫チェックポイントモジュレーターの投与様式は、静脈内、腫瘍内、皮下、筋肉内または腹腔内投与からなる群から選択され得る。本発明は、任意の特定の適用様式に限定されることを意図しないが、免疫チェックポイントモジュレーターの静脈内または腹腔内投与が好ましい。

【0259】

免疫チェックポイントモジュレーターが注射または点滴による投与のために組み込まれ得る形態は、水性もしくは油性懸濁液、またはゴマ油、コーン油、綿実油、もしくは落花生油とのエマルジョン、ならびにエリキシル剤、マンニトール、デキストロース、スクロース、または滅菌水溶液、および類似の薬学的ビヒクルを含む。生理食塩水の水溶液はまた、慣例的に、注射または点滴のために使用され得、好ましくは、生理学的に適合するバッファー、例えば、ハンクス液、リンゲル液、Ｌ－ヒスチジンバッファー、クエン酸ナトリウムまたは生理的食塩水バッファーは、水溶液として使用される。エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコール、（氷）酢酸、ペンテト酸など（およびその好適な混合物）、シクロデキストリン誘導体、ポリソルベートおよび植物油も用いられ得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合において必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。注射溶液は、必要な量の本開示による化合物を、必要により、上記に列挙されるさまざまな他の成分とともに、適切な溶媒に組み込むことによって調製される。一般に、分散液は、さまざまな滅菌された活性成分を、基礎分散媒および上記に列挙されたものから必要な他の成分を含有する無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。注射溶液の調製用の粉末の場合において、好ましい調製の方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を与える真空乾燥および凍結乾燥技法である。しかしながら、実際に投与される化合物の量は、通常、治療される状態を含む関連する状況、選択された投与の経路、投与される実際の化合物およびその相対的活性、個々の患者の年齢、体重および応答、患者の症状の重症度などを考慮して、医師によって決定されることが理解される。

【0260】

組換えグラム陰性菌の対象への投与様式は、静脈内、腫瘍内、腹腔内および経口的投与からなる群から選択され得る。本発明は、任意の特定の適用様式に限定されることを意図しないが、細菌の静脈内または腫瘍内投与が好ましい。

【0261】

免疫チェックポイントモジュレーターおよび組換え病原性弱毒化グラム陰性菌株を含む別々の形態の薬学的組成物または組み合わせ調製物は、従来の混合、溶解、造粒、コーティング錠作製、粉末化、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造され得る。別々の形態の薬学的組成物または組み合わせ調製物は、１つまたは複数の生理的に許容される担体、希釈剤、添加物、または薬学的に使用され得る調製物への活性成分の処理を容易にする補助剤を使用して、従来の方法で製剤化され得る。適当な製剤は、選択された投与方法に依存する。

【0262】

個々の用量における活性成分の単位含有量は、そのような量が複数の投与単位の投与によって達成され得るので、それ自身が治療的有効量を構成する必要はない。本発明による組成物は、例えば、活性成分の治療的有効量の約１０％～約１００％を含有し得る。

【0263】

本発明による薬学的組み合わせ物が組み合わせ調製物である場合、前記組換えグラム陰性菌株は、好ましくは、前記免疫チェックポイントモジュレーターと同じ投与形態で投与されない。

【0264】

例示的な治療レジメンは、１日１回、１日２回、１日３回、２日ごと、１週間に２回、１週間に１回、１週間おきに１回、３週間ごとに１回、１か月に１回、または６週間ごと１回の投与を伴う。本発明の組み合わせ物は、通常、複数の機会に投与される。単回投与間の間隔は、例えば、１日未満、毎日、２日ごと、１週間に２回、毎週、隔週、３週間ごとに１回、１か月ごとに１回（ｒ ｏｎｃｅ）、または６週間ごとに１回であり得る。本発明の組み合わせ物は、継続的な中断なしの治療として与えられてもよい。本発明の組み合わせ物はまた、対象が、休薬期間または非治療期間によって中断される治療のサイクルを受けるレジメンで与えられてもよい。したがって、本発明の組み合わせ物は、１週間もしくはその一部、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間の継続的な期間にわたって上記の選択された間隔に従って投与され、次いで、１週間もしくはその一部、２週間、３週間、４週間、５週間、または６週間の期間にわたって停止されてもよい。治療間隔および非治療間隔の組み合わせは、サイクルと呼ばれる。サイクルは、１回または複数回繰り返されてもよい。２回以上の異なるサイクルを、治療を１回または複数回繰り返すために、組み合わせて使用してもよい。間隔はまた、患者における前記組換えグラム陰性菌株および／または前記免疫チェックポイントモジュレーターの血液（または腫瘍）レベルを測定することによって示される通りに不規則であり得る。一実施形態において、本発明による薬学的組み合わせ物は、１日１回投与される。例示的な治療レジメンにおいて、組換えグラム陰性菌株は、１日あたり約１０^５～約１０^１０個細菌を投与することができ、免疫チェックポイントモジュレーターは、１日あたり１～１０００ｍｇを投与することができる。

【0265】

本明細書に記載される組換えグラム陰性菌株の投与の投薬レジメンは、当業者に公知であるように、達成される特定の目標、治療される対象の年齢および健康状態、治療の期間、併用療法の特質および用いられる特定の細菌により変わる。組換えグラム陰性菌株は、通常、１～２０日ごと、好ましくは、１～１０日ごと、より好ましくは、１～７日ごとの単回用量からなる投薬レジメンに従って対象に投与される。投与の期間は、通常、約２０～約６０日、好ましくは、約３０～４０日である。あるいは、投与の期間は、通常、約８～約３２週間、好ましくは、約８～約２４週間、より好ましくは、約１２～約１６週間である。

【0266】

本発明は、本明細書に記載される組換えグラム陰性菌株を含み、任意選択で、好適な薬学的に許容される希釈剤、添加物または担体を含む、薬学的組み合わせ物も提供する。

【0267】

組換えグラム陰性菌は、好適な薬学的に許容される担体との薬学的組成物として対象を治療するのに十分である量で、便利で有効な投与のために調合され得る。例えば、７０ｋｇの人間に対して、投与される組換えグラム陰性菌または薬学的組成物の単位投与形態は、例えば、投与形態あたり約１０^５～約１０^１０個細菌、好ましくは、投与形態あたり約１０^６～約１０^９個細菌、より好ましくは、投与形態あたり約１０^７～約１０^９個細菌、最も好ましくは、投与形態あたり約１０^８個細菌；または１ｍｌあたり約１０^５～約１０^１０個細菌、好ましくは、１ｍｌあたり約１０^６～約１０^９個細菌、より好ましくは、１ｍｌあたり約１０^７～約１０^９個細菌、最も好ましくは、１ｍｌあたり約１０^８個細菌の量の組み換えグラム陰性菌を含有し得る。

【0268】

本明細書で互換的に使用される「対象を治療するのに十分である量」または「有効量」とは、健全な医学的判断の範囲内で、治療される状態を有意にポジティブに修正するのに十分な高さであるが、重篤な副作用を回避するのに十分な低さ（合理的な利益／リスク比で）である、１つまたは複数の細菌の量であることを意味する。細菌の有効量は、達成される特定の目標、治療される対象の年齢および健康状態、治療の期間、併用療法の特質および用いられる特定の細菌により変わる。細菌の有効量は、したがって、所望の効果を提供する最小限の量である。通常、約１０^５～約１０^１０個細菌、例えば、約１０^５～約１０^１０個細菌／体表面積ｍ^２、好ましくは、約１０^６～約１０^９個細菌、例えば、約１０^６～約１０^９個細菌／体表面積ｍ^２、より好ましくは、約１０^７～約１０^８個細菌、例えば、約１０^７～約１０^８個細菌／体表面積ｍ^２、最も好ましくは、１０^８個細菌、例えば、１０^８個細菌／体表面積ｍ^２の量が、対象に投与される。

【0269】

がん、例えば、悪性固形腫瘍を治療するために、対象、例えば、ヒトに投与するための組換えグラム陰性菌株の単回用量は、通常、約１０^４～約１０^１０個細菌、例えば、約１０^４個細菌／体表面積ｍ^２～約１０^１０個細菌／体表面積ｍ^２、好ましくは、約１０^５～約１０^９個細菌、例えば、約１０^５～約１０^９個細菌／体表面積ｍ^２、より好ましくは、約１０^６～約１０^８個細菌、例えば、約１０^６～約１０^８個細菌／体表面積ｍ^２、さらにより好ましくは、約１０^７～約１０^８個細菌、例えば、約１０^７～約１０^８個細菌／体表面積ｍ^２、最も好ましくは、１０^８個細菌、例えば、約１０^８個細菌／体表面積ｍ^２の総組換えグラム陰性菌株である。

【0270】

薬学的担体としての機能を果たし得る物質の例は、例えば、糖類、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；デンプンおよびその誘導体、例えば、コーンスターチおよびジャガイモデンプン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；粉末化トラガカント；麦芽；ゼラチン；タルク；ステアリン酸；ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；炭酸カルシウム；植物油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびカカオ油；ポリオール、例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ポリソルベート、マニトール（ｍａｎｉｔｏｌ）、およびポリエチレングリコール；寒天；アルギン酸；パイロジェンフリーの水；等張食塩水；クランベリー抽出物およびリン酸バッファー溶液；スキムミルク粉末；ならびに薬学的製剤において使用される他の非毒性適合性物質、例えば、ビタミンＣ、エストロゲンおよびエキナシアである。湿潤剤、および潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ならびに着色剤、香味剤、潤滑剤、添加物、錠剤化剤、安定剤、抗酸化剤および防腐剤も存在し得る。

【0271】

免疫チェックポイントモジュレーターの単回用量は、０．０１ｍｇ／ｋｇ～１００ｍｇ／体重ｋｇの範囲の投与量（ｄｏｓｅａｇｅ）、好ましくは、１～２０ｍｇ／体重ｋｇの投与量を含み、ここで、人間の典型的な体重は、７０ｋｇである。

【0272】

投与の経路に応じて、細菌を含む活性成分は、酵素、酸、および前記生物体を不活性化し得る他の天然条件の作用から前記生物体を保護する材料でコーティングする必要があってもよい。非経口投与以外によって細菌を投与するために、それらは、不活性化を予防する材料によってコーティングされ、またはそれとともに投与されなければならない。例えば、細菌は、酵素阻害剤とともに、またはリポソーム中で共投与され得る。酵素阻害剤には、膵トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＦＰ）およびトラジロールが含まれる。リポソームには、水中油中水型Ｐ４０エマルジョン、ならびに細菌、例えば、ラクトバチルス属（Lactobacillus）またはそれらの副産物を宿主対象の内部標的に輸送する従来のおよび特異的に設計されたリポソームが含まれる。１種の細菌は、単独で、または第２の異なる細菌と併用して投与されてもよい。任意の数の異なる細菌が併用されてもよい。「併用」とは、一緒に、実質的に同時に、または逐次的にを意味する。組成物はまた、錠剤、丸剤またはカプセル剤、例えば、本発明の細菌を含む凍結乾燥カプセル剤、またはＤＭＳＯもしくはグリセロールを含有する本発明の細菌の凍結溶液としてなどの形態で投与されてもよい。適用の別の好ましい形態は、本発明の細菌の凍結乾燥カプセル剤の調製物を含む。適用のまた別の好ましい形態は、本発明の細菌の加熱乾燥カプセル剤の調製物を含む。組成物は、凍結乾燥ケーキとして製剤化および調製されてもよく、これは、液体形態（懸濁液または溶液）として、投与前に好適なバッファー中で再構成される。

【0273】

投与される組換えグラム陰性菌は、注射によって投与することができる。注射使用に好適な形態は、モノセプティック懸濁液、およびモノセプティック注射用懸濁液の即時調製のためのモノセプティック粉末を含む。すべての場合において、形態は、モノセプティックでなければならず、容易に注射できる程度に流動性でなければならない。これは、製造および保管の条件下で安定でなければならない。担体は、例えば、水、糖類、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液状ポリエチレングリコールなど）、その好適な混合物、および植物油を含有する、溶媒または分散媒であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散液の場合において必要な粒子サイズの維持によって維持することができる。多くの場合において、等張剤、または生理学的に適合するバッファー、例えば、糖類、塩化ナトリウムまたはＬ－ヒスチジンバッファーを含むことが好ましい。注射用組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物における使用によってもたらすことができる。

【0274】

本発明の一部の実施形態において、組換えグラム陰性菌株は、対象に、シデロホアと共投与される。これらの実施形態が好ましい。共投与され得るシデロホアは、ヒドロキサメート、カテコレート、および混合リガンドシデロホアを含むシデロホアである。好ましいシデロホアは、デフェロキサミン（デスフェリオキサミンＢ、デスフェロキサミンＢ、ＤＦＯ－Ｂ、ＤＦＯＡ、ＤＦＢまたはデスフェラールとしても公知）、デスフェリオキサミンＥ、デフェラシロクス（Ｅｘｊａｄｅ、Ｄｅｓｉｒｏｘ、Ｄｅｆｒｉｊｅｔ、Ｄｅｓｉｆｅｒ）、およびデフェリプロン（Ｆｅｒｒｉｐｒｏｘ）であり、デフェロキサミンがより好ましい。デフェロキサミンは、放線菌門（Actinobacteria）ストレプトマイセス・ピロサス（Streptomyces pilosus）によって産生される細菌シデロホアであり、例えば、Ｎｏｖａｒｔｉｓ Ｐｈａｒｍａ Ｓｃｈｗｅｉｚ ＡＧ（スイス）から市販されている。

【0275】

シデロホアとの共投与は、組換えグラム陰性菌株の投与の前、それと同時に、またはその後であり得る。好ましくは、シデロホアは、組換えグラム陰性菌株の投与の前に投与され、より好ましくは、組換えグラム陰性菌株の対象への投与の約２４時間前、好ましくは、約６時間前、より好ましくは、３時間前の時間、特に、１時間前に投与される。特定の実施形態において、対象は、細菌の成長を可能にするために、組換えグラム陰性菌株による感染の１時間前にデスフェロキサミンで事前治療される。通常、シデロホアは、約０．５×１０^－５Ｍｏｌ～約１×１０^－３Ｍｏｌ、より好ましくは、約１×１０^－５Ｍｏｌ～約５×１０^－４Ｍｏｌ、好ましくは、約１×１０^－４Ｍｏｌ～約４×１０^－４Ｍｏｌの単回用量で共投与される。通常、デスフェロキサミンは、対象あたり約２０ｍｇ～約５００ｍｇ、好ましくは、約５０ｍｇ～約２００ｍｇの単回用量で共投与され、より好ましくは、１００ｍｇのデスフェロキサミンの単回用量が共投与される。

【0276】

一実施形態において、がん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の細胞は、２つの組換えグラム陰性菌株と接触し、ここで、第１の組換えグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルおよび第１の異種タンパク質を含む第１の融合タンパク質を発現し、第２の組換えグラム陰性菌株は、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルおよび第２の異種タンパク質を含む第２の融合タンパク質を発現し、その結果、第１および第２の融合タンパク質は、悪性固形腫瘍の細胞または腫瘍微小環境の細胞に移動される。この実施形態は、例えば、２つの異なるハイブリッドタンパク質を単一細胞に送達する有効な方法として、２つの菌株とのがん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の細胞の共感染を提供した。

【0277】

がんを治療するための本発明の組み合わせ物の使用
第２の態様によれば、本発明は、医薬としての使用のための、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物を提供する。

【0278】

第３の態様によれば、本発明は、対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法における使用のための、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物を提供する。

【0279】

対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物の使用も提供される。

【0280】

対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物の使用も提供される。

【0281】

対象におけるがんの予防、進行の遅延または治療のための方法であって、本明細書に記載される治療的有効量の薬学的組み合わせ物を前記対象に投与することを含む、方法も提供される。

【0282】

「治療／治療すること」という用語は、本明細書で使用される場合、（１）状況、障害もしくは状態に苦しんでいるか、またはそれに罹りやすくあり得るが、まだ状況、障害または状態の臨床症状または無症候性症状を経験または示していない、動物、特に、哺乳動物、特に、ヒトにおいて、発生している状況、障害または状態の臨床症状の出現を遅延させること；（２）状況、障害または状態を阻害すること（例えば、その少なくとも１つの臨床症状または無症候性症状の、疾患、または維持治療の場合においてその再発の発生を停止すること、低減することもしくは遅延させること）；および／あるいは（３）状態を軽減すること（すなわち、状況、障害もしくは状態、またはその臨床症状もしくは無症候性症状の少なくとも１つの縮小を引き起こすこと）を含む。治療される患者に対する利益は、統計学的に有意である、または患者もしくは医師が少なくとも感じられる。しかしながら、医薬が患者に投与されて、疾患が治療される場合、治療成績は、常に有効な治療でなくてもよいことが認識されるであろう。

【0283】

本明細書で使用される場合、「進行の遅延」は、がんの症状もしくはがんに関連するマークの出現までの時間を増加させること、またはがんの症状の重症度の増加を遅らせることを意味する。さらに、「進行の遅延」は、本明細書で使用される場合、疾患の進行の反転または阻害を含む。対象における疾患の進行または疾患の合併症の「阻害」は、対象における疾患の進行および／または疾患の合併症を予防することまたは低減することを意味する。

【0284】

予防的治療は、予防治療を含む。予防的適用において、本発明の薬学的組み合わせ物は、がんを有していると疑われるか、またはそれを発生するリスクがある対象に投与される。治療的適用において、薬学的組み合わせ物は、疾患の症状を治癒または少なくとも部分的に停止するのに十分な量で、がんをすでに患っている患者などの対象に投与される。この使用のために有効な量は、疾患の重症度および過程、以前の療法、対象の健康状況および薬物に対する応答、ならびに治療する医師の判断に依存する。

【0285】

対象の状態が改善しない場合において、本発明の薬学的組み合わせ物は、対象の疾患または状態の症状を回復させる、またはそうでなければ制御もしくは制限するために、対象の生涯を通じてを含む長期間にわたって、長期的に投与されてもよい。

【0286】

対象の状況が改善する場合において、薬学的組み合わせ物は、継続的に投与されてもよく；あるいは、投与される薬物の用量は、一時的に低減されてもよく、またはある一定の期間、一時的に止められてもよい（すなわち、「休薬期間」）。患者の状態の改善が起こったら、本発明の薬学的組み合わせ物の維持用量が、必要により、投与される。その後、投与の投与量もしくは頻度、またはその両方は、症状の関数として、改善された疾患が維持されるレベルに、任意選択で低減される。

【0287】

一実施形態において、がんは、肉腫、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫、中枢神経系がん、および悪性固形腫瘍からなる群から選択され、これには、限定されるものではないが、肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺または肺などの異なる組織型に起因し得る異常な細胞の塊が含まれ、したがって、悪性の固形の肝臓、結腸、結腸直腸、皮膚、乳房、膵臓、子宮頸部、子宮体、膀胱、胆嚢、腎臓、喉頭、唇、口腔、食道、卵巣、前立腺、胃、精巣、甲状腺または肺の腫瘍が含まれる。好ましくは、がんは、固形腫瘍、好ましくは、悪性固形腫瘍である。より好ましくは、がんは、乳がん、黒色腫および結腸がん（結腸癌）からなる群から選択される。

【0288】

一実施形態において、固形腫瘍は、対象における悪性固形腫瘍であり、ここで、組換えグラム陰性菌株は、悪性固形腫瘍中に蓄積する。したがって、一実施形態において、固形腫瘍は、対象における悪性固形腫瘍であり、ここで、組換えグラム陰性菌株は、悪性固形腫瘍中に蓄積し、方法は、前記組換えグラム陰性菌株を対象に投与することを含み、組換えグラム陰性菌株は、対象を治療するのに十分である量で投与される。

【0289】

グラム陰性菌株の異種タンパク質は、組換えグラム陰性菌株の対象への投与の時に、がん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の細胞に、送達され得る、すなわち、移動され得るか、または後の時、例えば、組換えグラム陰性菌株ががん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の部位に達したか、および／もしくはがん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の部位に達し、上記に記載されるように複製された後、がん細胞、例えば、悪性固形腫瘍の細胞もしくは腫瘍微小環境の細胞に、送達され得る、すなわち、移動され得る。送達の時間は、例えば、組換えグラム陰性菌株の異種タンパク質を発現させるために使用されるプロモーターによって、調節することができる。第１の場合において、構成的プロモーター、またはより好ましくは、細菌エフェクタータンパク質の内因性プロモーターが、異種タンパク質を駆動してもよい。遅延したタンパク質送達の場合において、アラビノース誘導性プロモーターとして、人工誘導性プロモーターが、異種タンパク質を駆動してもよい。この場合において、アラビノース（または対応する誘導性プロモーターの誘導因子）は、細菌が所望の部位に達し、蓄積されたら、対象に投与される。アラビノースは、次いで、送達されるタンパク質の細菌発現を誘導する。

【0290】

一実施形態において、がんを治療する方法は、
ｉ）本明細書に記載される組換えグラム陰性菌株を培養すること；
ｉｉ）ｉ）の前記組換えグラム陰性菌株を対象に投与すること、ここで、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルおよび異種タンパク質を含む融合タンパク質が、組換えグラム陰性菌株によって発現され、がん細胞または腫瘍微小環境の細胞に移動される；ならびに任意選択で、
ｉｉｉ）異種タンパク質が、がん細胞の内側で細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルから切断されるように、融合タンパク質を切断すること；
を含み、組換えグラム陰性菌株は、対象を治療するのに十分な量で投与される。

【0291】

組換えグラム陰性菌株およびＩＣＭは、同時に、またはいずれかの順序で、逐次的に投与されてもよい。そのため、組換えグラム陰性菌株は、例えば、ＩＣＭの前、それと同時的に、またはその後に投与されてもよく、または逆もまた同様である。前の投与は、本明細書で使用される場合、他方の化合物（例えば、グラム陰性菌株）による治療の開始前の、一方の化合物（例えば、ＩＣＭ）による前の治療の開始を指す。その後の投与は、本明細書で使用される場合、他方の化合物（例えば、グラム陰性菌株）による治療の開始後の、一方の化合物（例えば、ＩＣＭ）による治療のその後の開始を指す。同時的投与は、本明細書で使用される場合、すなわち、投与の同じ日における、両方の化合物（ＩＣＭおよびグラム陰性菌株）による治療の同時の開始を指す。

【0292】

部材のキット
本発明は、好ましくは、ヒトにおける、がん、例えば、悪性固形腫瘍などを治療するためのキットも提供する。そのようなキットは、一般に、本明細書に記載される薬学的組み合わせ物、およびキットを使用するための指示を含む。一部の実施形態において、キットは、担体、包装、または１つまたは複数の容器、例えば、バイアル、管などを受け入れる区分化された容器を含み、容器のそれぞれは、本明細書に記載される方法において使用される別々の要素の１つを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、注射器、および試験管が含まれる。他の実施形態において、容器は、ガラスまたはプラスチックなどの各種の材料から形成される。さらなる実施形態において、キットは、前に示した医薬を含むバンドル容器を含む。

【0293】

したがって、一実施形態において、本発明は、第１の容器、第２の容器および添付文書を含む部材のキットであって、第１の容器が、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列の３’末端にインフレームで融合された異種タンパク質またはその断片をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド分子を含む組換えグラム陰性菌株であって、細菌エフェクタータンパク質からの送達シグナルをコードするヌクレオチド配列が、プロモーターに動作可能に連結されている、組換えグラム陰性菌株を含む少なくとも１用量の医薬を含み、第２の容器が、免疫チェックポイント阻害剤（ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）（ＩＣＭ）を含む少なくとも１用量の医薬を含み、添付文書が、任意選択で、医薬を使用するがんについて対象を治療するための指示を含む、キットを提供する。

【実施例】

【0294】

本実施例は、本発明を制限することなく、本発明を説明することを意図する。

【0295】

実施例１：
Ａ）材料および方法
菌株および成長条件。本研究において使用した株を図４３にリストする。プラスミド精製およびクローニングのために使用される大腸菌Ｔｏｐ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、およびコンジュゲーションのために使用される大腸菌Ｓｍ１０ λ ｐｉｒ（Ｓｉｍｏｎら、１９８３）、ならびにｐＫＮＧ１０１を増やすために使用される大腸菌ＢＷ１９６１０（Ｍｅｔｃａｌｆら、１９９４）を、ＬＢ寒天プレート上およびＬＢブロス中で、３７℃で常套的に成長させた。アンピシリンを、２００μｇ／ｍｌ（エルシニア属）または１００μｇ／ｍｌ（大腸菌）の濃度で使用した。ストレプトマイシンを、自殺ベクターに対して選択するために、１００μｇ／ｍｌの濃度で使用した。クロラムフェニコールを、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用した。Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０（Ｏ：９、バイオタイプ２）（Ｓａｒｋｅｒら、１９９８）は、Ｙ．エンテロコリチカＥ４０のアンピシリン感受性誘導体である（ＳｏｒｙおよびＣｏｒｎｅｌｉｓ、１９９４）。すべてのＹ．エンテロコリチカ株を、室温で、脳心臓インフュージョン（ＢＨＩ；Ｄｉｆｃｏ）において常套的に成長させた。すべてのＹ．エンテロコリチカ株に、ナリジクス酸を添加した（３５μｇ／ｍｌ）。Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０およびＥ４０は両方とも、図１に示される、ｐＹＶ－ＭＲＳ４０またはｐＹＶ－Ｅ４０と称される同一のｐＹＶプラスミド（Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０およびＥ４０株の病原性プラスミド）を含む。密接に関連するＹ．エンテロコリチカのｐＹＶプラスミドＷ２２７０３、ｐＹＶｅ２２７の完全配列は、Ｇｅｎｂａｎｋでアクセス可能である（ＡＦ１０２９９０．１）。すべてのＴ３ＳＳエフェクタータンパク質（ｙｏｐＨ、ｙｏｐＯ、ｙｏｐＰ、ｙｏｐＥ、ｙｏｐＭ、ｙｏｐＴ）の破壊によりｐＹＶ－ＭＲＳ４０から誘導されたｐＹＶプラスミドは、ｐＹＶ－Ｙ００４と指定し、ｐＹＶ－Ｙ００４を持つ対応するＹ．エンテロコリチカＭＲＳ４０株は、例えば、図４３に示されるように、Ｙ．エンテロコリチカＭＲＳ４０ ΔＨＯＰＥＭＴと指定する。ｐＹＶ－Ｙ００４は、図２に記載し、表す。ｐＹＶ－Ｙ００４におけるネイティブｙｏｐＥの場所にｙｏｐＥ_{１－１３８}を有する融合物におけるヒトＲｉｇ－Ｉ ＣＡＲＤ２ドメインの挿入は、ｐＹＶ－Ｙ０２１をもたらし、ｐＹＶ０２１におけるｙｏｐＨの場所にヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}を有する融合物におけるＹｏｐＥ_{１－１３８}（コドン適応）の追加挿入は、ｐＹＶ－Ｙ０５１をもたらした。ｐＹＶ－Ｙ０５１を、図３に記載し、表す。

【0296】

Ｙ．エンテロコリチカの遺伝子操作。Ｙ．エンテロコリチカの遺伝子操作は、記載されている（Ｄｉｅｐｏｌｄら、２０１０；Ｉｒｉａｒｔｅら、１９９５）。簡潔には、ｐＹＶプラスミドにおけるまたは染色体上の遺伝子の改変または欠失のための突然変異剤を、鋳型として精製ｐＹＶ４０プラスミドまたはゲノムＤＮＡを使用して、２－断片重複ＰＣＲによって構築し、個々の遺伝子の欠失部分または改変部分の両側に２００～２５０ｂｐのフランキング配列をもたらした。あるいは、個々の遺伝子の欠失部分または改変部分の両側に２００～２５０ｂｐのフランキング配列を有する完全合成ＤＡＮ断片（デノボ合成された）を使用した。得られた断片を、大腸菌ＢＷ１９６１０（Ｍｅｔｃａｌｆら、１９９４）においてｐＫＮＧ１０１（Ｋａｎｉｇａら、１９９１）にクローニングした。配列が検証されたプラスミドを、大腸菌Ｓｍ１０ λ ｐｉｒに形質転換し、そこからプラスミドを、対応するＹ．エンテロコリチカ株に移動させた。組み込まれたベクターを持つ突然変異体を、選択圧なしで、いくつかの世代にわたって増やした。次いで、スクロースを使用して、ベクターを失ったクローンについて選択した。最後に、突然変異体を、コロニーＰＣＲによって特定した。特異的な突然変異剤（ｐＴ３Ｐ－４５６およびｐＴ３Ｐ－７１４）を、表ＩＩＩにリストする。

【0297】

プラスミドの構築。プラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２およびｐＴ３Ｔ－７１５を、ＹｏｐＥのＮ末端１３８アミノ酸（配列番号２５）を有する融合タンパク質のクローニングのために使用した。ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２（図４）を、精製ｐＹＶ４０由来のＹｏｐＥおよびＳｙｃＥに対する内因性プロモーターを含有するＳｙｃＥ－ＹｏｐＥ_{１－１３８}断片のｐＢａｄ－ＭｙｃＨｉｓＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＫｐｎＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位へのクローニングによって構築した。追加の改変には、消化、クレノウ断片処理および再ライゲーションによるｐＢａｄ－ＭｙｃＨｉｓＡのＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ断片の除去が含まれる。さらに、次の切断部位が、ＹｏｐＥ_{１－１３８}の３’末端に追加された：ＸｂａＩ－ＸｈｏＩ－ＢｓｔＢＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ（ＭＣＳを作出する、配列番号３６を参照されたい）。これは、ｐＢＲ３２２複製開始点（配列番号２９）を特徴とする。

【0298】

ベクターｐＴ３Ｐ－４５４（図５）およびｐＴ３Ｐ－４５３（図６）は、下記に記載するように、ＹｏｐＥ １－１３８ ＯＲＦとのインフレームで、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位における制限／ライゲーション技法を使用して、マウスまたはヒトＲｉｇ１－ＣＡＲＤ２ドメインをクローニングすることによって（それぞれ）、ｐＢＡＤ＿ＳＩ＿２から誘導される。

【0299】

ｐＴ３Ｐ－７１５（図７）は、ｐＢＡＤ＿Ｓｉ＿２と類似の特性を有する完全合成プラスミド（デノボ合成ベクター）であるが、対応するＡｒａＣコード化領域は、欠失しており、アンピシリン耐性遺伝子（プラス７０ｂｐ上流）は、２００ｂｐ上流領域で、クロラムフェニコール耐性遺伝子によって置き換えられている。明確にするために、ｐＴ３Ｐ－７１５は、ｐＹＶ４０由来のＹｏｐＥおよびＳｙｃＥのための内因性プロモーターを含有するＳｙｃＥ－ＹｏｐＥ１－１３８断片を含み、ここで、次の切断部位が、ＹｏｐＥ１－１３８の３’末端に追加された：ＸｂａＩ－ＸｈｏＩ－ＢｓｔＢＩ－ＨｉｎｄＩＩＩ。これは、ｐＢＲ３２２複製開始点、および転位可能な遺伝エレメントＴｎ９（ＡｌｔｏｎおよびＶａｐｎｅｋ、１９７９）からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（触媒）を特徴とする。ｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２およびｐＴ３Ｐ－７１５は、ｐＢＲ３２２（ｐＭＢ１）複製開始点（配列番号２９）を有する中コピー数プラスミドである。

【0300】

ベクターｐＴ３Ｐ－７５１（図８）は、下記に記載されるように、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ部位における制限／ライゲーション技法を使用して、１つのオペロンとして、ヒトＲｉｇ１－ＣＡＲＤ２ドメインとの融合物におけるＹｏｐＥ_{１－１３８}、続いてヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}との融合物におけるＹｏｐＥ_{１－１３８}（コドン適応）をクローニングすることによって、ｐＴ３Ｐ－７１５から誘導される。

【0301】

送達のための異種タンパク質－ＲＩＧ－Ｉ。ＲＩＧ－Ｉ（ＤＤＸ５８とも呼ばれる；マウスタンパク質についてＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ６Ｑ８９９およびヒトタンパク質についてＵｎｉｐｒｏｔ Ｏ９５７８６）は、短い二本鎖ＲＮＡについての細胞質センサーおよび自然免疫系の主要なパターン認識受容体である。ＲＩＧ－Ｉは、ＲＮＡヘリカーゼドメイン、Ｃ末端ドメインおよびＮ末端ドメインからなり、これは、２つのＣＡＲＤドメインから構成される（ＢｒｉｓｓｅおよびＬｙ、２０１９）。ＲＩＧ－Ｉ経路のＲＮＡ非依存性構成的活性化をもたらす、ＲＩＧ－Ｉ単独（タンパク質の残部なし；ヒトＲＩＧ－Ｉ_{１－２４５}；マウスＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）のＮ末端ＣＡＲＤドメインから主に構成されるように、送達のための異種タンパク質を選択した。細菌により送達されるＲＩＧＩ－ＣＡＲＤドメインは、接近しやすく、ＭＡＶＳおよびＴＢＫ１活性化をもたらす。これに、活性化されたＩＲＦ３およびＩＲＦ７の核移行が続き、これは、ＩＦＮａおよびｂなどのＩＳＲＥ調節されたコード配列の転写をもたらす。

【0302】

同様に、ＭＡＶＳまたはＭＤＡ５の１つまたは複数のＣＡＲＤドメインを、細菌による送達の際にアゴニスト非依存的に機能するように選択した。

【0303】

送達のための異種タンパク質－ｃＧＡＳ。サイクリックＧＭＰ－ＡＭＰシンターゼ（ｃＧＡＳ；ヒトタンパク質についてＵｎｉｐｒｏｔ Ｑ８Ｎ８８４）は、ＤＮＡについての細胞質センサーである。ｃＧＡＳは、ＡＴＰおよびグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）からのサイクリックＧＭＰ－ＡＭＰ（ｃＧＡＭＰ）の形成を触媒するヌクレオチジルトランスフェラーゼであり、ｃＧＡＳ－ＳＴＩＮＧ ＤＮＡセンシング経路の一部である。これは、触媒ポケットの反対側に２つの主要なｄｓＤＮＡ結合部位を有し、サイトゾルＤＮＡに結合することによって活性化される。ＤＮＡへの結合後、ｃＧＡＳは、ｃＧＡＭＰ合成を触媒し、次いで、これは、小胞体に位置する膜貫通タンパク質１７３（ＴＭＥＭ１７３）／ＳＴＩＮＧに結合し、活性化するセカンドメッセンジャーとして機能する。次いで、ＳＴＩＮＧは、プロテインキナーゼＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）およびＴＢＫ１を活性化し、次に、転写因子ＮＦ－κＢおよびＩＲＦ３を活性化して、インターフェロンおよび他のサイトカインを誘導する。セカンドメッセンジャーｃＧＡＭＰはまた、いくつかの方法で他の細胞を通過し、それによって、細胞の周囲にサイトゾルＤＮＡの危険シグナルを伝える。Ｎ末端でトランケートされたｃＧＡＳ（ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}のような）は、Ｎ末端ＤＮＡ結合ドメインを欠くが、触媒活性を保持している。このトランケートされたｃＧＡＳの真核細胞への送達は、ＳＴＩＮＧ経路の活性化をもたらす、ｃＧＡＳの酵素活性に起因して、細胞内ｃＧＡＭＰ産生に至る。ＲＩＧ－Ｉ経路で見られるように、ＳＴＩＮＧ経路の活性化は、最終的に、Ｉ型ＩＦＮの産生をもたらす。

【0304】

マウスおよびヒト遺伝子をデノボ合成し、これは、Ｙ．エンテロコリチカに適合するコドン使用を可能にし（図４３）、ＹｏｐＥ_{１－１３８}との融合物として、両方とも中コピー数ベクターであるプラスミドｐＢａｄ＿Ｓｉ＿２またはｐＴ３Ｐ－７１５にクローニングした（下記の表ＩＩを参照されたい）。ライゲーションされたプラスミドを、大腸菌Ｔｏｐ１０においてクローニングした。配列決定されたプラスミドを、標準的な大腸菌エレクトロポレーションに関する設定を使用して、所望のＹ．エンテロコリチカ株にエレクトロポレーションした。

【0305】

【0306】

【0307】

【0308】

動物へのｉ．ｔ．／ｉ．ｖ．注射のための細菌調製物
Ｙ．エンテロコリチカ凍結ストック（ＯＤ_６００＝８まで成長させ、－８０℃で保たれた細菌の７％のＤＭＳＯストック）を、適切な抗生物質が補充された新鮮なＢＨＩで、０．１のＯＤ_６００に希釈し、３７℃の水浴シェーカーにおけるさらに２時間の温度シフト前に、室温で２／３時間成長させた。最後に、細菌を、遠心分離（６０００ｒｃｆ、３０秒）によって収集し、ＰＢＳ（滅菌、エンドトキシン不含）で２回洗浄し、滅菌ＰＢＳに再懸濁させた。細菌懸濁液の濃度を、ＯＤ_６００に基づいて適応させ、懸濁液を、下記の指示に従って、マウスに注射した。マウスに投与される接種材料を、希釈プレーティングによって検証した。

【0309】

ＥＭＴ－６腫瘍同種移植マウスモデルおよびｉ．ｔ．／ｉ．ｐ．治療における有効性
動物の収容および実験手順は、フランスおよび欧州の規制、ならびに米国学術研究会議の実験動物のケアと使用に関する指針に従って実施した。動物を使用するすべての手順（手術、麻酔、および適用される場合安楽死を含む）は、フランス当局（ＣＮＲＥＥＡ）によって承認された。５～７週齢のＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ（ＥＭＴ－６モデル）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓに発注し、特定病原体除去（ＳＰＦ）環境中で保った。収容の少なくとも５～１４日後、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、２００ｕｌのＥＭＴ－６細胞（１×１０^６個細胞）を、マウスの脇腹に皮下同種移植した。実験全体を通して、マウスを、行動および外見についてスコア付けし、体重を測定した。

【0310】

腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３（平均サイズ９２ｍｍ^３＋／－１９）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、１ｍｇ／ｍＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）の濃度にＰＢＳに希釈された抗ＰＤ－１抗体（クローン：ＲＭＰ１－１４、カタログ：ＢＥ０１４６、アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）を、ｉ．ｐ．注射により投与した。対照として、マウスに、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳのみを注射した。同じ日に、マウスを、腫瘍への直接注射（ｉ．ｔ．）によって、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（７．５×１０^７個細菌）に感染させた。マウスに投与される接種材料を、希釈プレーティングによって検証した。対照として、マウスに、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳのみを注射した。最初の治療の日を、０日目として定義する。治療を、上記に記載されたようにして、さらに繰り返した：ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴまたはＰＢＳ対照のｉ．ｔ．投与を、０、１、５、６、１０、１１日目に行い；抗ＰＤ－１抗体（クローン：ＲＰＭ１－１４、アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）またはＰＢＳ対照のｉ．ｐ．投与を、０、４、７、１１日目に行った。最後の細菌治療の２４時間前に、マウスに、８ｍｇ／ｍｌのデスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を、ｉ．ｐ．注射により投与した。腫瘍の進行を、ノギスを用いる腫瘍の長さおよび幅の測定によって監視した。腫瘍体積を、０．５×長さ（ｌｅｎｇｈｔ）×幅^２として決定した。１５００ｍｍ^３を超える腫瘍体積を、人道的なエンドポイントと定義した。感染後のそれぞれの日に、マウスを、ガス麻酔（イソフルラン）の過剰摂取とそれに続く頸椎脱臼または失血によって屠殺した。

【0311】

再チャレンジアッセイのために、６６日目に、１×１０^６個のＥＭＴ６細胞を、最初のＥＭＴ６腫瘍が検出不能（０ｍｍ^３）または２５ｍｍ未満のいずれかであったすべての生存マウスの反対側の脇腹に２００μＬのＲＰＭＩ１６４０中、皮下注射した。ナイーブマウスにも、腫瘍成長についての対照としての役割を果たすために、同じ方法で移植した。腫瘍の進行を、上記に記載されたようにして監視した。

【0312】

Ｂ１６Ｆ１０腫瘍同種移植マウスモデルおよびｉ．ｔ．／ｉ．ｐ．治療における有効性
動物の収容および実験手順は、フランスおよび欧州の規制、ならびにＮＲＣの実験動物のケアと使用に関する指針に従って実現した。動物を使用するすべての手順は、フランス当局（ＣＮＲＥＥＡ）によって同意された。７週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ１６Ｆ１０モデル）マウスを、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓに発注し、特定病原体除去（ＳＰＦ）環境中で保った。収容の少なくとも５～１４日後、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、２００ｕｌのＢ１６Ｆ１０（１×１０^６個細胞）を、マウスの脇腹に皮下同種移植した。実験全体を通して、マウスを、行動および外見についてスコア付けし、体重を測定した。

【0313】

腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３（平均サイズ７１ｍｍ^３＋／－２５）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、１ｍｇ／ｍＬ（１０ｍｇ／ｋｇ）の濃度に滅菌ＰＢＳに希釈された抗ＰＤ－１抗体（クローン：ＲＭＰ１－１４、カタログ：ＢＥ０１４６、アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）または抗ＣＴＬＡ－４抗体（クローン：９Ｈ１０、カタログ：ＢＥ０１３１、アイソタイプ：ハムスターＩｇＧ１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ）を、ｉ．ｐ．注射により投与した。対照として、マウスに、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳのみを注射した。同じ日に、マウスを、腫瘍への直接注射（ｉ．ｔ．）によって、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（７．５×１０^７個細菌）に感染させた。マウスに投与される接種材料を、希釈プレーティングによって検証した。対照として、マウスに、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳのみを注射した。最初の治療の日を、０日目として定義する。治療を、上記に記載されたようにして、さらに繰り返した：ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴまたはＰＢＳ対照のｉ．ｔ．投与を、０、１、２、３、６、９日目に行い；抗ＰＤ－１抗体または抗ＣＴＬＡ－４抗体またはＰＢＳ対照のｉ．ｐ．投与を、０、４、７、１１日目に行った。最後の細菌治療の２４時間前に、マウスに、８ｍｇ／ｍｌのデスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を、ｉ．ｐ．注射により投与した。腫瘍の進行を、ノギスを用いる腫瘍の長さおよび幅の測定によって監視した。腫瘍体積を、０．５×長さ×幅^２として決定した。１５００ｍｍ^３を超える腫瘍体積を、人道的なエンドポイントと定義した。感染後のそれぞれの日に、マウスを、ガス麻酔の過剰摂取（イソフルラン）とそれに続く頸椎脱臼または失血によって屠殺した。

【0314】

Ｂ１６Ｆ１０腫瘍同種移植マウスモデルおよびｉ．ｖ．／ｉ．ｐ．治療における有効性
この研究に記載されるすべての動物実験は、地方倫理委員会（ＣＥＬＥＡＧ、Ｃｏｍｉｔｅ ｄ’ｅｔｈｉｑｕｅ Ｌｏｃａｌ ｐｏｕｒ ｌ’ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｎｉｍａｌｅ Ｇｅｎｅｖｏｉｓ）によって審査および承認された。８週齢のＣ５７ＢＬ／６Ｊ（Ｂ１６Ｆ１０モデル）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｓに発注した。収容の少なくとも５日後、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、１００ｕｌのＢ１６Ｆ１０細胞（５×１０^５個細胞）を、マウスの脇腹に皮下同種移植した。実験全体を通して、マウスを、行動および外見についてスコア付けし、体重を測定した。

【0315】

腫瘍が、４０～１２０ｍｍ^３（平均サイズ６６ｍｍ^３＋／－２２）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、デスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を、ｉ．ｐ．注射により投与し、これは、０日目に相当する。同じ日に、マウスを、０、２、４、６、９、１３、１６、２０日目に、尾静脈への注射によって、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（１×１０^７個細菌）に感染させた。マウスに投与される接種材料を、希釈プレーティングによって検証した。対照として、マウスに、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳのみを注射した。抗ＰＤ－１抗体またはアイソタイプ対照抗体を、０、４、６および９日目に、１０ｍｇ／ｋｇの用量でｉ．ｐ．投与した。加えて、すべてのマウスは、６、１３、２０日目に、１０ｍＬ／ｋｇの用量のデスフェラールのｉ．ｐ．注射を受けた。腫瘍の進行を、手動のノギスを用いる腫瘍の長さおよび幅の測定によって監視した。腫瘍体積を、０．５×長さ×幅^２として決定した。１５００ｍｍ^３を超える腫瘍体積を、人道的なエンドポイントと定義した。感染後のそれぞれの日に、マウスを屠殺した。

【0316】

ＣＴ２６腫瘍同種移植マウスモデルおよびｉ．ｔ．／ｉ．ｐ．治療における有効性
動物の収容および実験手順は、フランスおよび欧州の規制、ならびに米国学術研究会議の実験動物のケアと使用に関する指針に従って実施した。動物を使用するすべての手順（手術、麻酔、および適用される場合安楽死を含む）は、フランス当局（ＣＮＲＥＥＡ）によって承認された。５～６週齢のＢＡＬＢ／ｃ（ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪ）マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓに発注し、特定病原体除去（ＳＰＦ）環境中で保った。収容の少なくとも５～１４日後、マウスを、イソフルランを使用して麻酔し、２００ｕｌのＣＴ２６細胞（１×１０^６個細胞）を、マウスの脇腹に皮下同種移植した。実験全体を通して、マウスを、行動および外見についてスコア付けし、体重を測定した。

【0317】

腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３（平均サイズ５８ｍｍ^３＋／－１９）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、抗ＰＤ－１抗体（参照：ＢＥ０１４６、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＲＭＰ１－１４；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ）またはそのそれぞれの対照：ラットＩｇＧ２ａアイソタイプ（参照：ＢＥ００８９、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：２Ａ３）；および／または抗ＰＤ－Ｌ１（参照：ＢＰ０１０１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：１０Ｆ．０Ｇ２；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ｂ）またはそのそれぞれの対照：ラットＩｇＧ２ｂアイソタイプ（参照：ＢＥ００９０、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＬＴＦ－２）を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ｉ．ｐ．注射により投与した。同じ日に、少なくとも４時間後、マウスを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）投与によって、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（７．５×１０^７個細菌）に感染させた。マウスに投与される接種材料を、希釈プレーティングによって検証した。対照として、マウスに、滅菌エンドトキシン不含ＰＢＳのみを注射した。最初の治療の日を、０日目として定義する。治療を、上記に記載されたようにして、さらに繰り返した：ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（７．５×１０^７個細菌）または滅菌ＰＢＳ対照のｉ．ｔ．投与を、０、１、３、６、１０、１４日目に行い；１０ｍｇ／ｋｇのラットＩｇＧ２ｂ抗体（抗ＰＤ－Ｌ１または対照アイソタイプ）のｉ．ｐ．注射を、０、２、４、６、８、１０、１２、１４日目に行い；および／または１０ｍｇ／ｋｇのラットＩｇＧ２ａ抗体（抗ＰＤ－１または対照アイソタイプ）のｉ．ｐ．注射を、０、４、８および１２日目に行った。０、７および１４日目に、細菌または滅菌ＰＢＳ対照の注射の約１時間前に、マウスに、８ｍｇ／ｍｌのデスフェラール溶液（１０ｍｌ／ｋｇ）を、ｉ．ｐ．注射により投与した。腫瘍の進行を、ノギスを用いる腫瘍の長さおよび幅の測定によって監視した。腫瘍体積を、０．５×長さ×幅^２として決定した。１５００ｍｍ^３を超える腫瘍体積を、人道的なエンドポイントと定義した。感染後のそれぞれの日に、マウスを、ガス麻酔（イソフルラン）の過剰摂取とそれに続く頸椎脱臼または失血によって屠殺した。

【0318】

インビトロアッセイのための細胞培養、細菌調製および感染。Ｂ１６ Ｂｌｕｅ ＩＳＧ細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎから購入）を、１０％のＦＣＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されたＲＰＭＩ １６４０中で培養した。Ｙ．エンテロコリチカ凍結ストック（ＯＤ_６００＝８まで成長させ、－８０℃で保たれた細菌の７％のＤＭＳＯストック）を、新鮮なＢＨＩで、０．１のＯＤ６００に希釈し、３７℃の水浴シェーカー（１５０ｒｐｍ）におけるさらに１時間の温度シフト前に、オービタルシェーカー（１５０ｒｐｍ）において、室温で２時間成長させた。最後に、細菌を、遠心分離（６００ｒｃｆ、６０秒）によって収集し、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび２ｍＭのＬ－グルタミンが補充されたＤＭＥＭで１回洗浄し、同じ培地に再懸濁させた。細菌懸濁液の濃度を、ＯＤ_６００に基づいて調整した。９６ウェルプレートに播種された細胞を、示されたＭＯＩで感染させ、プレートを、５００ｇで１分間遠心分離し、示された期間、３７℃／５％のＣＯ_２に置いた。

【0319】

直接Ｉ型インターフェロン活性化アッセイ。多量体ＩＳＲＥによって増強されるＩＦＮ誘導性ＩＳＧ５４プロモーターから構成されるＩ－ＩＳＧ５４プロモーターの制御下で分泌型胚性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を安定に発現するマウスＢ１６Ｆ１黒色腫細胞を、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ（Ｂ１６－Ｂｌｕｅ ＩＳＧ）から購入した。成長条件およびＩ型ＩＦＮアッセイを、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎによって提供されたプロトコールから適応させた。簡潔には、ウェルあたり１５０マイクロリットルの試験培地（ＲＰＭＩ＋２ｍＭのＬ－グルタミン＋１０％のＦＣＳ）中の１５’０００個のＢ１６－Ｂｌｕｅ ＩＳＧ細胞を、平底９６ウェルプレート（ＮＵＮＣまたはＣｏｒｎｉｎｇ）に播種した。翌日、細胞を、所望の感染多重度（ＭＯＩ）のウェルあたり１５ミリリットルを添加し、それに続いて短時間の遠心分離（５００ｇ、６０秒、室温）によって、評価される菌株に感染させた。インキュベーション（３７℃および５％のＣＯ_２）の２時間後、インキュベーター（３７℃および５％のＣＯ_２）において、２時間、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）およびストレプトマイシン（１００ｕｇ／ｍｌ）を含有する試験培地に添加することによって、細菌を死滅させた。次いで、上清を除去し、細胞を、滅菌ＰＢＳで洗浄し、ペニシリン／ストレプトマイシンを含有する１００ｕＬの新鮮な試験培地を添加した。インキュベーションを１６時間継続した。ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）の推奨に従ったＳＥＡＰの検出：２０μｌの細胞懸濁液を、１８０μｌの検出試薬（ＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ^ＴＭ、ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）とともにインキュベートした。プレートを３７℃でインキュベートし、ＳＥＡＰ活性を、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して、６５０ｎｍでＯＤを読み取ることによって測定した。

【0320】

Ｂ）結果
抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤（ｉ．ｐ．）とｍＲｉｇ１－ＣＡＲＤ_２をコードするエルシニア・エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（ｉ．ｔ．）治療の組み合わせは、ＥＭＴ－６（乳がんモデル）細胞を同種移植されたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける完全腫瘍縮小を促進する。
ＥＭＴ－６乳がん細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／ｃマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵ（コロニー形成単位）の中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（クローン：ＲＰＭ１－１４、アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。群を、ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）、（１５マウス／群）。腫瘍が、６０～１３０ｍｍ^３（平均サイズ９２ｍｍ^３＋／－１９）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、治療を開始した（最初の治療の日を０日目として定義する）。ｉ．ｔ．治療を、ｄ０、ｄ１、ｄ５、ｄ６、ｄ１０およびｄ１１に行い、ｉ．ｐ．治療を、ｄ０、ｄ４、ｄ７およびｄ１１に行った。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日にわたって測定した。

【0321】

治療の際に、抗ＰＤ－１およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの組み合わせで治療された群の平均腫瘍サイズは、それぞれの治療単独と比較した場合に、有意により顕著な腫瘍成長の低減を示した（図９）。また、対照群（ＰＢＳ／ＰＢＳ）は、腫瘍縮小を示さなかったが（図１０）、抗ＰＤ－１ ＣＰＩ単独の投与は、１つの完全縮小に至り（図１２）；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独による治療は、４つの完全縮小に至り（図１１）；抗ＰＤ－１ ＣＰＩおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの共投与は、７つの完全縮小をもたらした（図１３）。

【0322】

また、カプラン－マイヤー生存プロット（図１４）は、対照群（ＰＢＳ／ＰＢＳ）のマウスが、最初の治療の６６日後まで生存しなかったことを示す。抗ＰＤ－１単独で治療されたマウスの群において、７％が研究の最後に生存していた。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独で治療されたマウスの群において、２７％が研究の最後に生存していた。抗ＰＤ－１と組み合わせてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療されたマウスの群において、４７％が研究の最後に生存していた。

【0323】

最初のＥＭＴ６腫瘍が検出不能（０ｍｍ^３）または２５ｍｍ^３未満のいずれかであったマウスに、次いで、反対側の脇腹へのＥＭＴ－６腫瘍細胞注射により２回目のチャレンジを行った。これは、６６日目に行った。再チャレンジ後に腫瘍を発生したマウスはなかったが、最初の時にＥＭＴ－６細胞を注射されたナイーブマウスは、すべて、腫瘍が発生した（図１５）。

【0324】

また、中程度であるが、一過性の体重減少が、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴのｉ．ｔ．投与により起こった。複数回のｉ．ｔ．用量は、進行性の体重減少に至らなかった。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴへの抗ＰＤ－１ ＣＰＩの追加は、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独と比較して、体重減少を増加させなかった。

【0325】

これらの知見は、乳がんモデルにおいて、Ｉ型ＩＦＮを誘導するタンパク質を抗ＰＤ－１ ＣＰＩと組み合わせて送達するＴ３ＳＳ系を用いる細菌が、単独で与えられるいずれかの治療と比較して、治療成績（平均腫瘍体積、完全縮小の数、生存の確率）を有意に改善し、したがって、驚くべき相乗的抗腫瘍活性を提供したことを強調する。

【0326】

抗ＰＤ－１または抗ＣＴＬＡ－４チェックポイント阻害剤（ｉ．ｐ．）とｍＲｉｇ１－ＣＡＲＤ_２をコードするエルシニア・エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（ｉ．ｔ．）治療の組み合わせは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を同種移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける完全腫瘍縮小を促進する。
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（クローン：ＲＰＭ１－１４、アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または抗ＣＴＬＡ－４抗体（クローン：９Ｈ１０、アイソタイプ：ハムスターＩｇＧ１、Ｂｉｏｘｃｅｌｌ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）または対照として滅菌ＰＢＳを、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。群を、ＰＢＳ＋ＰＢＳ；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＰＢＳ；ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１；ＰＢＳ＋抗ＣＴＬＡ－４；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＣＴＬＡ－４として分配した（ｉ．ｔ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）、（群あたり１５頭のマウス）。

【0327】

腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３（平均サイズ７１ｍｍ^３＋／－２５）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、治療を開始した（最初の治療の日を０日目として定義する）。ｉ．ｔ．治療を、ｄ０、ｄ１、ｄ２、ｄ３、ｄ６およびｄ９に行い、ｉ．ｐ．治療を、ｄ０、ｄ４、ｄ７、ｄ１１に行った。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日にわたって測定した。

【0328】

治療の際に、抗ＰＤ－１およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴならびに抗ＣＴＬＡ－４およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの組み合わせで治療された群の平均腫瘍サイズは、それぞれの治療単独と比較した場合に、より顕著な腫瘍成長の低減を示した（図１６および図１７）。また、対照群（ＰＢＳ／ＰＢＳ）は、腫瘍縮小を示さず（図１８）、同じく、抗ＰＤ－１単独（図２０）および抗ＣＴＬＡ－４単独（図２１）の投与も、完全腫瘍縮小を示さなかった。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独の注射は、３つの完全縮小に至り（図１９）；抗ＰＤ－１ ＣＰＩおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの共投与は、４つの完全縮小をもたらし（図２２）；抗ＣＴＬＡ－４ ＣＰＩおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの共投与は、４つの完全縮小をもたらした（図２３）。

【0329】

また、カプラン－マイヤー生存プロット（図２４および２５）は、対照群（ＰＢＳ／ＰＢＳ）のマウス、ならびに抗ＰＤ－１単独および抗ＣＴＬＡ－４単独のマウスが、それぞれ、研究の最後（最初の治療の７１日後）まで生存しなかったことを示す。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独で治療されたマウスの群において、２０％が研究の最後に生存していた。抗ＰＤ－１と組み合わせてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ、または抗ＣＴＬＡ－４と組み合わせてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴのいずれかで治療されたマウスの両方の群において、２７％が研究の最後に生存していた。また、中程度であるが、一過性の体重減少が、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴのｉ．ｔ．投与により起こった。複数回のｉ．ｔ．用量は、進行性の体重減少に至らなかった。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴへの抗ＰＤ－１ ＣＰＩまたは抗ＣＴＬＡ－４の追加は、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独と比較して、体重減少を増加させなかった。

【0330】

これらの知見は、黒色腫モデルにおいて、Ｉ型ＩＦＮを誘導するタンパク質を抗ＰＤ－１ ＣＰＩまたは抗ＣＴＬＡ－４ ＣＰＩと組み合わせて送達するＴ３ＳＳ系を用いる細菌が、単独で与えられるいずれかの治療と比較して、治療成績（完全縮小の数、平均腫瘍体積、生存の確率）を有意に改善し、したがって、驚くべき相乗的抗腫瘍活性を提供したことを強調する。

【0331】

抗ＰＤ－１チェックポイント阻害剤（ｉ．ｐ．）とｍＲｉｇ１－ＣＡＲＤ_２をコードするエルシニア・エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（ｉ．ｖ．）治療の組み合わせは、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞を同種移植されたＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスにおける完全腫瘍縮小を促進する。
Ｂ１６Ｆ１０黒色腫細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに、滅菌ＰＢＳ、または１×１０^７ＣＦＵの中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）においてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、静脈内（ｉ．ｖ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体またはＩｇＧアイソタイプ対照（注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。群を、ＰＢＳ＋ＩｇＧアイソタイプ対照；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＩｇＧ対照；ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１として分配した（ｉ．ｖ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）、１５マウス／群。

【0332】

腫瘍が、４０～１２０ｍｍ^３（平均サイズ６６ｍｍ^３＋／－２２）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、治療を開始した（最初の治療の日を０日目として定義する）。ｉ．ｖ．治療を、ｄ０、ｄ２、ｄ４、ｄ６、ｄ９、ｄ１３、ｄ１６およびｄ２０に行い、ｉ．ｐ．治療を、ｄ０、ｄ４、ｄ６、ｄ９に行った。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日にわたって測定した。

【0333】

治療の際に、対照群（ＰＢＳ／対照ＩｇＧ）は、腫瘍縮小を示さなかった（図２６）。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独または抗ＰＤ－１単独の投与は、完全腫瘍縮小に至らなかった（図２７および２８）。しかしながら、抗ＰＤ－１ ＣＰＩおよびＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの共投与は、１つの完全縮小をもたらした（図２９）。

【0334】

また、カプラン－マイヤー生存プロット（図３０）は、対照群（ＰＢＳ／対照ＩｇＧ）のマウス、ならびにＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独および抗ＰＤ－１単独で治療されたマウスが、研究の最後（最初の治療の２３日後）まで生存しなかったことを示す。抗ＰＤ－１と組み合わせてＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療されたマウスの群において、２０％が研究の最後に生存していた。また、中程度であるが、一過性の体重減少が、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴのｉ．ｖ．投与により起こった。複数回のｉ．ｔ．用量は、進行性の体重減少に至らなかった。体重減少は、ＰＢＳのおよび対照ＩｇＧの複数回ｉ．ｖ．用量で観察されなかった。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴへの抗ＰＤ－１ ＣＰＩの追加は、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独と比較して、体重減少を増加させなかった。

【0335】

これらの知見は、黒色腫モデルにおいて、Ｉ型ＩＦＮを誘導するタンパク質を抗ＰＤ－１ ＣＰＩと組み合わせて送達するＴ３ＳＳ系を用いる細菌が、単独で与えられるいずれかの治療と比較して、治療成績（完全縮小の数、生存の確率）を有意に改善し、したがって、驚くべき相乗的抗腫瘍活性を提供したことを強調する。

【0336】

Ｔ３ＳＳを介したヒトおよびマウスＲｉｇ１－ＣＡＲＤ_２の送達は、Ｂ１６Ｆ１黒色腫レポーター細胞株において、同様のレベルのＩ型ＩＦＮを誘導する
ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２またはマウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２の送達は、Ｂ１６Ｆ１メラニン形成細胞におけるＩ型ＩＦＮシグナル伝達の誘導に至る。Ｂ１６Ｆ１ ＩＦＮレポーター細胞を、Ｙ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、カーゴを送達しないか、または中コピー数ベクターにおいてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２もしくはＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２をコードする対照株のいずれかで、感染させた。細胞に添加される細菌の用量設定を、それぞれの株について行い、感染多重度（ＭＯＩ）として示した。ＩＦＮ刺激を、多量体ＩＳＲＥによって増強されたＩＦＮ誘発性ＩＳＧ５４プロモーターで構成され、ＯＤ_６５０測定によって評価される、Ｉ－ＩＳＧ５４プロモーターの制御下にある分泌されたアルカリホスファターゼの活性に基づいて評価した。結果は、ヒトバージョン（ヒトＲＩＧ－Ｉアミノ酸１～２４５）およびマウスバージョンのＲｉｇ１－ＣＡＲＤ_２ドメイン（マウスＲＩＧ－Ｉアミノ酸１～２４６）の送達が、マウス細胞において類似のレベルのＩ型ＩＦＮの誘導を引き起こした（ｔｒｉｇｅｒｒｅｄ）ことを示す（図３１）。ヒト細胞株において行われた類似の実験は、Ｒｉｇ１－ＣＡＲＤ_２ドメインのヒトバージョンおよびマウスバージョンの送達が、ヒト細胞においても類似のレベルのＩ型ＩＦＮの誘導を引き起こした。

【0337】

抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１チェックポイント阻害剤（ｉ．ｐ．）とエルシニア・エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ ｈＲｉｇ１－ＣＡＲＤ_２およびｈ－ｃＧＡＳ_{１６１－５２２}（ｉ．ｔ．）治療の組み合わせは、ＣＴ２６結腸癌細胞を同種移植されたＢａｌｂ／Ｃマウスにおける完全腫瘍縮小を促進する。
ＣＴ２６結腸癌細胞をｓ．ｃ．同種移植された野生型Ｂａｌｂ／Ｃマウスに、滅菌ＰＢＳ、または７．５×１０^７ＣＦＵのｐＹＶプラスミドおよび中コピー数ベクター（そこでは、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}は、ｙｏｐＥプロモーターの制御下でコードされる）において両方のＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ（ｃＧＡＳ_{１６１－５２２}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴを、腫瘍内（ｉ．ｔ．）注射した。組み合わせにおいて、マウスに、抗ＰＤ－１抗体（ＢＥ０１４６、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＲＭＰ１－１４；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ａ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）、または抗ＰＤ－Ｌ１抗体（ＢＰ０１０１、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：１０Ｆ．０Ｇ２；アイソタイプ：ラットＩｇＧ２ｂ、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）、またはそれらのそれぞれの対照アイソタイプ（ＩｇＧ２ａ対照アイソタイプ：ＢＥ００８９、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：２Ａ３、およびＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプ：ＢＥ００９０、ＢｉｏＸｃｅｌｌ；クローン：ＬＴＦ－２、注射あたり１０ｍｇ／ｋｇ）を、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。

【0338】

腫瘍が、３０～１２０ｍｍ^３（平均サイズ５８ｍｍ^３＋／－１９）の体積に達したら、マウスを、群に無作為化し、治療を開始した（最初の治療の日を０日目として定義する）。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（７．５×１０７個細菌）または滅菌ＰＢＳ対照のｉ．ｔ．投与を、０、１、３、６、１０、１４日目に行い；１０ｍｇ／ｋｇのラットＩｇＧ２ｂ抗体（抗ＰＤ－Ｌ１または対照アイソタイプ）のｉ．ｐ．注射を、０、２、４、６、８、１０、１２、１４日目に行い、ならびに／あるいは１０ｍｇ／ｋｇのラットＩｇＧ２ａ抗体（抗ＰＤ－１または対照アイソタイプ）のｉ．ｐ．注射を、０、４、８および１２日目に行った。腫瘍体積を、ノギスを用いて以下の日にわたって測定した。

【0339】

群を、ＰＢＳ＋ＩｇＧ２ａ＋ＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプ；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋ＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプ；ＰＢＳ＋抗ＰＤ－１；ＰＢＳ＋抗ＰＤ－Ｌ１；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－１；ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ＋抗ＰＤ－Ｌ１として分配した（ｉ．ｖ．治療＋ｉ．ｐ．治療として示す）（群あたり１３頭のマウス）。

【0340】

治療の際に、抗ＰＤ－１ならびにＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの組み合わせと、抗ＰＤ－Ｌ１ならびにＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの組み合わせで治療された群の平均腫瘍サイズは、それぞれの治療単独と比較した場合に、より顕著な腫瘍成長の低減を示した（図３２および３３）。また、対照群（ＰＢＳ／ＩｇＧ２ａ＋ＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプ、図３４）、抗ＰＤ－１単独で治療された群（図３６）および抗ＰＤ－Ｌ１単独で治療された群（図３８）は、研究の最後（または屠殺の日）に、腫瘍縮小を示さず、それぞれの群のすべてのマウスは、０日目のそれらの個々の体積と比較して、３５％超増加した腫瘍体積を保持していた。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴによる治療は、部分縮小として分類される１つの腫瘍に至った（０日目と比較して、腫瘍体積の５０％～９５％の減少、図３５）。抗ＰＤ－１ ＣＰＩとＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの併用治療は、１つの完全縮小をもたらし（図３７）；抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＰＩとＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴの併用治療は、１つの完全縮小、および部分縮小として分類される１つの腫瘍をもたらした（図３９）。また、異なる治療の最適な腫瘍成長阻害効果を、図４０および図４１に表す。腫瘍成長阻害（治療群／対照群比、Ｔ／Ｃ、％）は、治療された群の腫瘍体積中央値対対照群（ＰＢＳおよび対照アイソタイプを注射）の動物の腫瘍体積中央値の比として定義される。最適な値は、達成された最大の腫瘍成長阻害を反映する最小Ｔ／Ｃ％比である（ｎ≧４動物を用いる）。Ｔ／Ｃ％比を、以下の通り分類した：０～１０％：著しい抗腫瘍活性、１０～３０％：中程度の抗腫瘍活性、３０～６０％：最低限の抗腫瘍活性、６０～１００％：抗腫瘍活性なし。この分類は、内部データに基づく文献（Ｊｏｈｎｓｏｎら、２００１）が出典であった。また、カプラン－マイヤー生存プロット（図４２）は、対照群（ＰＢＳ／ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ対照アイソタイプ）のマウスが、４３日目まで生存しなかったことを示す。抗ＰＤ－Ｌ１単独で治療されたマウスの群において、マウスは、４３日目まで生存しなかった。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独で治療されたマウスの群において、８％が４３日目まで生存した。抗ＰＤ－Ｌ１と組み合わせてＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴで治療されたマウスの群において、２３％が４３日目まで生存した。

【0341】

さらにまた、中程度であるが、一過性の体重減少が、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴによりｉ．ｔ．治療された群において起こった。複数回のｉ．ｔ．用量は、進行性の体重減少に至らず、全体的な体重減少は、軽度および一過性であり、マウスは治療期間後に回復し始めた。ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴへの抗ＰＤ－１ ＣＰＩまたは抗ＰＤ－Ｌ１の追加は、ＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ単独と比較して、体重減少を増加させなかった。

【0342】

これらの知見は、マウスＣＴ２６癌腫のがんモデルにおいて、Ｉ型ＩＦＮを誘導するタンパク質を抗ＰＤ－１または抗ＰＤ－Ｌ１ ＣＰＩと組み合わせて送達するＴ３ＳＳ系を用いる細菌が、単独で与えられるいずれかの治療と比較して、治療成績（完全または部分縮小の数、平均腫瘍体積、生存の確率）を有意に改善し、したがって、驚くべき相乗的抗腫瘍活性を提供したことを強調する。

【0343】

要約すれば、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１または抗ＣＴＬＡ－４ ＣＰＩのｉ．ｐ．注射と一緒のＹｏｐＥ_{１－１３８}－マウスＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２（ＲＩＧ－Ｉ_{１－２４６}）をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（ｉ．ｔ．またはｉ．ｖ．）またはＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトＲＩＧ－Ｉ ＣＡＲＤ_２およびＹｏｐＥ_{１－１３８}－ヒトｃＧＡＳ_{１６１－５２２}をコードするＹ．エンテロコリチカΔＨＯＰＥＭＴ（ｉ．ｔ．）の併用的治療を、固形腫瘍の異なる動物モデルにおける腫瘍進行に対するその影響、ならびに生存の確率および相対体重発展について、固形腫瘍の異なるマウスがんモデルにおいて評価した。結果は、単独で与えられたいずれかの治療と比較して、有意に改善された治療成績を示し、全体的に驚くべき相乗的抗腫瘍活性を示した。また、我々は、Ｒｉｇ１－ＣＡＲＤ_２のヒトおよびマウスバージョンが、類似のレベルのＩ型ＩＦＮを誘導し、したがって機能的等価体であることを示した。

【0344】

参考文献

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【配列表】

2024511096000001.app

【国際調査報告】