特表 2024-511131 ＤＮＡ改変酵素とその活性な断片およびバリアント、ならびに利用の方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-12

(54)【発明の名称】ＤＮＡ改変酵素とその活性な断片およびバリアント、ならびに利用の方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/55 20060101AFI20240305BHJP

   C12N 9/78 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240305BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/113 20100101ALI20240305BHJP

   C12P 21/02 20060101ALI20240305BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 35/12 20150101ALI20240305BHJP

   A61P 3/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240305BHJP

【ＦＩ】

C12N15/55

C12N9/78 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C07K19/00

C12N15/62 Z

C12N15/113 Z

C12P21/02 C

C12N15/09 110

C12N15/09 100

A61K35/12

A61P3/00

A61P43/00 105

A61K48/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558569

(86)(22)【出願日】2022-03-22

(85)【翻訳文提出日】2023-11-07

(86)【国際出願番号】 US2022021271

(87)【国際公開番号】W WO2022204093

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】63/164,273

(32)【優先日】2021-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521282169

【氏名又は名称】ライフエディット セラピューティクス，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100225598

【弁理士】

【氏名又は名称】桐島 拓也

(72)【発明者】

【氏名】タイソン ディー．ボーウェン

(72)【発明者】

【氏名】アレグザンドラ ブリナー クローリー

(72)【発明者】

【氏名】テッド ディー．エリッチ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG01

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA87X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC20

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA31

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA14

4C084NA20

4C084ZB211

4C084ZB212

4C084ZC211

4C084ZC212

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA03

4C087BB65

4C087NA14

4C087NA20

4C087ZB21

4C087ZC21

4H045AA10

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA11

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

標的を絞った核酸編集のためデアミナーゼを含む組成物と方法が提供される。組成物は、デアミナーゼポリペプチドを含む。ＤＮＡ結合ポリペプチドと本発明の融合タンパク質を含むも提供される。この融合タンパク質は、場合によりガイドＲＮＡとの複合体になったデアミナーゼに融合したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを含む。組成物は、前記デアミナーゼまたは前記融合タンパク質をコードする核酸分子も含む。前記デアミナーゼまたは前記融合タンパク質をコードする核酸分子を含むベクターと宿主細胞も提供される。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
デアミナーゼ活性を持つポリペプチド。

【請求項2】

配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のポリペプチド。

【請求項3】

デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、
ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる核酸分子。

【請求項4】

前記デアミナーゼが、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項5】

前記デアミナーゼが、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれか１つと１００％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項6】

前記デアミナーゼポリペプチドが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致するアミノ酸配列を持つ、請求項３に記載の核酸分子。

【請求項7】

前記ポリペプチドに機能可能に連結された異種プロモータをさらに含む、請求項３～６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項8】

請求項３～７のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項9】

請求項３～７のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項８に記載のベクターを含む細胞。

【請求項10】

医薬として許容可能な基剤を含むとともに、請求項１または２に記載のポリペプチド、請求項３～７のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項８に記載のベクター、または請求項９に記載の細胞を含む医薬組成物。

【請求項11】

デアミナーゼを作製する方法であって、前記デアミナーゼが発現する条件下で請求項９に記載の細胞を培養することを含む方法。

【請求項12】

デアミナーゼを作製する方法であって、請求項３～７のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項８に記載のベクターを細胞の中に導入し、前記デアミナーゼが発現する条件下で前記細胞を培養することを含む方法。

【請求項13】

前記デアミナーゼを精製することをさらに含む、請求項１１または１２に記載の方法。

【請求項14】

ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むとともに、
ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つデアミナーゼ
を含む融合タンパク質。

【請求項15】

前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項16】

前記デアミナーゼがシトシンデアミナーゼである、請求項１４または１５に記載の融合タンパク質。

【請求項17】

前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項18】

前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項19】

前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項１８に記載の融合タンパク質。

【請求項20】

前記ＲＧＮが、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項21】

前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項１９または２０に記載の融合タンパク質。

【請求項22】

前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、請求項２１に記載の融合タンパク質。

【請求項23】

前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、請求項１９または２０に記載の融合タンパク質。

【請求項24】

前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項25】

前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項26】

前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項27】

前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項１９に記載の融合タンパク質。

【請求項28】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項２１に記載の融合タンパク質。

【請求項29】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つを持つアミノ酸配列を持つ、請求項２１に記載の融合タンパク質。

【請求項30】

少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、請求項１４～２９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項31】

ウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、請求項１４～３０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。

【請求項32】

前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、請求項３１に記載の融合タンパク質。

【請求項33】

配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項１４に記載の融合タンパク質。

【請求項34】

ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、
ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。

【請求項35】

前記デアミナーゼが、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、請求項３４に記載の核酸分子。

【請求項36】

前記デアミナーゼのヌクレオチド配列が、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、請求項３４に記載の核酸分子。

【請求項37】

前記デアミナーゼのヌクレオチド配列が、配列番号２、４、６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードする、請求項３４に記載の核酸分子。

【請求項38】

前記デアミナーゼがシトシンデアミナーゼである、請求項３４～３７のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項39】

前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項40】

前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、請求項３４～３８のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項41】

前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、請求項４０に記載の核酸分子。

【請求項42】

前記ＲＧＮが、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項４１に記載の核酸分子。

【請求項43】

前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項４１または４２に記載の核酸分子。

【請求項44】

前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、請求項４３に記載の核酸分子。

【請求項45】

前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、請求項４１または４２に記載の核酸分子。

【請求項46】

前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項４１に記載の核酸分子。

【請求項47】

前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項４１に記載の核酸分子。

【請求項48】

前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項４１に記載の核酸分子。

【請求項49】

前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項４１に記載の核酸分子。

【請求項50】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項４３に記載の核酸分子。

【請求項51】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つを持つアミノ酸配列を持つ、請求項４３に記載の核酸分子。

【請求項52】

前記融合タンパク質をコードする前記ポリペプチドがその５´末端でプロモータに機能可能に連結されている、請求項３４～５１のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項53】

前記融合タンパク質をコードする前記ポリペプチドがその３´末端でターミネータに機能可能に連結されている、請求項３４～５２のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項54】

前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項３４～５３のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項55】

前記融合タンパク質が、真核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている、請求項３４～５４のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項56】

前記融合タンパク質が、原核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている、請求項３４～５５のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項57】

前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、請求項３４～５６のいずれか１項に記載の核酸分子。

【請求項58】

前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、請求項５７に記載の核酸分子。

【請求項59】

前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、請求項３４に記載の核酸分子。

【請求項60】

請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子を含むベクター。

【請求項61】

標的配列にハイブリダイズすることのできるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む、請求項６０に記載のベクター。

【請求項62】

請求項１４～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を含む細胞。

【請求項63】

ガイドＲＮＡをさらに含む、請求項６２に記載の細胞。

【請求項64】

請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む細胞。

【請求項65】

請求項６０または６１に記載のベクターを含む細胞。

【請求項66】

医薬として許容可能な基剤を含むとともに、請求項１４～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項６０または６１に記載のベクター、または請求項６２～６５のいずれか１項に記載の細胞を含む医薬組成物。

【請求項67】

融合タンパク質を作製する方法であって、前記融合タンパク質が発現する条件下で請求項６２～６５のいずれか１項に記載の細胞を培養することを含む方法。

【請求項68】

融合タンパク質を作製する方法であって、請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子、または請求項６０または６１に記載のベクターを細胞の中に導入し、前記融合タンパク質が発現する条件下で前記細胞を培養することを含む方法。

【請求項69】

前記融合タンパク質を精製することをさらに含む、請求項６７または６８に記載の方法。

【請求項70】

ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を作製する方法であって、細胞の中に、請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子を導入するとともに、ガイドＲＮＡをコードする発現カセットを含む核酸分子、または請求項６０または６１に記載のベクターを導入し、前記融合タンパク質と前記ｇＲＮＡが発現してＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で前記細胞を培養することを含む方法。

【請求項71】

前記ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することをさらに含む、請求項７０に記載の方法。

【請求項72】

標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する系であって、
ａ）融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ただし前記融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、前記デアミナーゼは、
ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）と；
ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡ、または前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列
を含み、
前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記融合タンパク質と複合体を形成し、前記融合タンパク質が前記標的ＤＮＡ配列に結合して前記標的ＤＮＡ分子を改変することを可能にする系。

【請求項73】

前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項７２に記載の系。

【請求項74】

前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つがプロモータに機能可能に連結されている、請求項７２または７３に記載の系。

【請求項75】

前記標的ＤＮＡ配列が、前記ＲＧＮによって認識されるプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項７２～７４のいずれか１項に記載の系。

【請求項76】

前記標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、請求項７２～７５のいずれか１項に記載の系。

【請求項77】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項78】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項79】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項80】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項81】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項82】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項83】

前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、請求項８２に記載の系。

【請求項84】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項８２または８３に記載の系。

【請求項85】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである、請求項８２または８３に記載の系。

【請求項86】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、請求項７２～７６のいずれか１項に記載の系。

【請求項87】

前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項７２～８６のいずれか１項に記載の系。

【請求項88】

前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、請求項７２～８７のいずれか１項に記載の系。

【請求項89】

前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、請求項８８に記載の系。

【請求項90】

前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、請求項７２に記載の系。

【請求項91】

前記融合タンパク質が、真核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている、請求項７２～９０のいずれか１項に記載の系。

【請求項92】

前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が１つのベクター上に位置する、請求項７２～９１のいずれか１項に記載の系。

【請求項93】

請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系の前記少なくとも１つのガイドＲＮＡと前記融合タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体。

【請求項94】

請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系または請求項９３に記載のリボ核タンパク質複合体を含む細胞。

【請求項95】

医薬として許容可能な基剤を含むとともに、請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系、請求項９３に記載のリボ核タンパク質複合体、または請求項９４に記載の細胞を含む医薬組成物。

【請求項96】

標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって、請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系または請求項９３に記載のリボ核タンパク質複合体を、前記標的ＤＮＡ分子に、または前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞に送達することを含む方法。

【請求項97】

前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｎ変異を含む（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項99】

前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を含む、請求項９７に記載の方法。

【請求項100】

標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって、
ａ）ＲＧＮ－デアミナーゼ複合体の組み立てを、前記ＲＧＮ－デアミナーゼ複合体が形成されるのに適した条件下で、
ｉ）前記標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡと；
ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）と少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質（ただし前記デアミナーゼは、
Ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ＩＩ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）をインビトロで組み合わせることによって実施した後；
ｂ）前記標的ＤＮＡ分子、または前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、前記インビトロで組み立てられたＲＧＮ－デアミナーゼ複合体と接触させることを含み、
前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることにより、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ分子に結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の改変を起こさせる方法。

【請求項101】

前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１００に記載の方法。

【請求項102】

前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｎ変異を含む（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）、請求項１００または１０１に記載の方法。

【請求項103】

前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項104】

前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を含む、請求項１０２に記載の方法。

【請求項105】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項108】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項109】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項110】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、請求項１１０に記載の方法。

【請求項112】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１１０または１１１に記載の方法。

【請求項113】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである、請求項１１０または１１１に記載の方法。

【請求項114】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、請求項１００～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項115】

前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項１００～１１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項116】

前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、請求項１００～１１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項117】

前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、請求項１１６に記載の方法。

【請求項118】

前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、請求項１００に記載の方法。

【請求項119】

前記標的ＤＮＡ配列が、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、請求項１００～１１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項120】

前記標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、請求項１００～１１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項121】

前記改変されたＤＮＡ分子を含む細胞を選択することをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。

【請求項122】

請求項１２１に記載の方法に従う改変された標的ＤＮＡ配列を含む細胞。

【請求項123】

請求項１２２に記載の細胞と、医薬として許容可能な基剤を含む医薬組成物。

【請求項124】

遺伝性疾患に関する原因変異の修正がなされた遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
ａ）融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ただし前記融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、前記デアミナーゼは、
ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）と；
ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
を前記細胞に導入することを含み、
そのことによって前記融合タンパク質とｇＲＮＡが前記原因変異のゲノム遺伝子座に向かい、前記ゲノム配列を改変して前記原因変異を除去する方法。

【請求項125】

前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１２４に記載の方法。

【請求項126】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、請求項１２４または１２５に記載の方法。

【請求項127】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項128】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項129】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項130】

前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、請求項１２９に記載の方法。

【請求項131】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、請求項１２９または１３０に記載の方法。

【請求項132】

前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである、請求項１２９または１３０に記載の方法。

【請求項133】

前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、請求項１２４～１２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項134】

前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項１２４～１３３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項135】

前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、請求項１２４～１３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項136】

前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、請求項１３５に記載の方法。

【請求項137】

前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、請求項１２４に記載の方法。

【請求項138】

前記ゲノム改変が、前記標的ＤＮＡ配列内で少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を導入することを含む、請求項１２４～１３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項139】

前記ゲノム改変が、前記標的ＤＮＡ配列内で少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を導入することを含む、請求項１２４～１３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項140】

前記細胞が動物細胞である、請求項１２４～１３９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項141】

前記原因変異の修正がナンセンス変異の修正を含む、請求項１２４～１４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項142】

前記遺伝性疾患が表２３に掲載されている疾患である、請求項１２４～１４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項143】

疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１４～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項６０または６１に記載のベクター、または請求項６２～６５、９４、および１２２のいずれか１項に記載の細胞、請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系、請求項９３に記載のリボ核タンパク質複合体、または請求項６６、９５、および１２３のいずれか１項に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【請求項144】

前記疾患が原因変異と関係しており、前記医薬組成物が前記原因変異を修正する、請求項１４３に記載の方法。

【請求項145】

前記疾患が表２３に掲載されている疾患である、請求項１４３または１４４に記載の方法。

【請求項146】

対象における疾患を治療するための、請求項１４～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項６０または６１に記載のベクター、または請求項６２～６５、９４、および１２２のいずれか１項に記載の細胞、請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系、請求項９３に記載のリボ核タンパク質複合体の利用。

【請求項147】

前記疾患が原因変異と関係しており、前記医薬組成物が前記原因変異を修正する、請求項１４６に記載の利用。

【請求項148】

前記疾患が表２３に掲載されている疾患である、請求項１４６または１４７に記載の利用。

【請求項149】

疾患の治療に有用な薬を製造するための、請求項１４～３３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、請求項３４～５９のいずれか１項に記載の核酸分子、請求項６０または６１に記載のベクター、または請求項６２～６５、９４、および１２２のいずれか１項に記載の細胞、請求項７２～９２のいずれか１項に記載の系、請求項９３に記載のリボ核タンパク質複合体の利用。

【請求項150】

前記疾患が原因変異と関係しており、前記薬の有効量が前記原因変異を修正する、請求項１４９に記載の利用。

【請求項151】

前記疾患が表２３に掲載されている疾患である、請求項１４９または１５０に記載の利用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連する出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月２２日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第６３／１６４，２７３号の優先権を主張するものであり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0002】

配列リストに関する宣言
本出願に付随する配列リストは紙のコピーの代わりにＡＳＣＩＩ形式で提供され、参照によって本明細書に組み込まれている。Ｌ１０３４３８＿１２４０ＷＯ＿０１３４＿１＿ＳＬ．ｔｘｔと名づけたこのＡＳＣＩＩコピーはサイズが１，３１０，１１３バイトであり、２０２２年３月２２に作成され、ＥＦＳ－Ｗｅｂを通じて電子的に提出されている。

【0003】

本発明は、分子生物学と遺伝子編集の分野に関する。

【背景技術】

【0004】

標的を絞ったゲノム編集または標的を絞ったゲノム改変が、急速に基礎研究と応用研究のための重要なツールになりつつある。初期の方法は、ヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮなど）を操作することを含んでいたため、それぞれの特定の標的配列に対して特異的な操作されたプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合ドメインを持つキメラヌクレアーゼを作製する必要があった。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）（クラスター化されて規則的な間隔で配置された短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）－関連（Ｃａｓ）細菌系のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質など）は、ヌクレアーゼを特定の標的配列に特異的にハイブリダイズするガイドＲＮＡとの複合体にすることにより、特定の配列を標的にすることが可能になる。標的特異的ガイドＲＮＡの作製は、各標的配列のためのキメラヌクレアーゼの作製よりもコストがかからず、より効率的である。このようなＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを用いて配列特異的二本鎖切断を導入することによりゲノムを編集することが可能であり、この二本鎖切断は、エラーを起こしやすい非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じて修復されるため、変異が特定のゲノム位置に導入される。あるいは相同組み換え修復を通じて異種ＤＮＡをそのゲノム部位に導入することができる。

【0005】

それに加え、ＲＧＮは、標的を絞ったＤＮＡ編集のアプローチに有用である。標的を絞った核酸配列編集（例えば標的を絞った切断）によりゲノムＤＮＡに特定の改変を導入できるため、遺伝子機能と遺伝子発現を研究するための非常に精細なアプローチが可能になる。ＲＧＮを用いると、標的を絞った塩基編集にＲＧＮのＲＮＡ誘導型活性をＤＮＡ改変酵素（デアミナーゼなど）と組み合わせて用いるキメラタンパク質を作製することもできる。標的を絞った編集を利用し、ヒトにおける遺伝性疾患を標的とすること、または作物のゲノムに農業で有益な変異を導入することができる。ゲノム編集ツールの開発により、遺伝子編集に基づく哺乳類治療法と農業バイオテクノロジーへの新たなアプローチが提供される。

【発明の概要】

【0006】

標的ＤＮＡ分子を改変する組成物と方法が提供される。組成物は興味ある標的ＤＮＡ分子の改変に利用される。提供される組成物はデアミナーゼポリペプチドを含む。核酸分子結合ポリペプチド（例えばＤＮＡ結合ポリペプチド）とデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質と、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質とリボ核酸を含むリボ核タンパク質複合体も提供される。提供される組成物は、デアミナーゼポリペプチドまたは融合タンパク質をコードする核酸分子、およびその核酸分子を含むベクターと宿主細胞も含む。本明細書に開示されている方法は、興味ある標的ＤＮＡ分子の中の興味ある標的配列に結合し、興味ある標的ＤＮＡ分子を改変することに関する。

【0007】

第１の側面では、本開示により、ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み；デアミナーゼ活性を持つポリペプチドが提供される。

【0008】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、前記ポリペプチドは単離されている。

【0009】

別の１つの側面では、本開示により、デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；およびｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる核酸分子が提供される。

【0010】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれか１つと１００％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致するアミノ酸配列を持つ。

【0011】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記核酸分子は、前記ポリペプチドに機能可能に連結された異種プロモータをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記核酸分子は単離されている。

【0012】

別の１つの側面では、本開示により、上記の核酸分子を含むベクターが提供される。

【0013】

別の１つの側面では、本開示により、上記の核酸分子またはベクターを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は昆虫細胞または鳥類細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は菌類細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は植物細胞である。

【0014】

別の１つの側面では、本開示により、上記の植物細胞を含む植物または種子が提供される。

【0015】

別の１つの側面では、本開示により、医薬として許容可能な基剤を含むとともに、実施形態１１のポリペプチド、核酸分子、ベクター、または上記の細胞を含む医薬組成物が提供される。いくつかの実施形態では、医薬として許容可能な前記基剤は、前記ポリペプチドまたは前記核酸分子にとって異種である。いくつかの実施形態では、医薬として許容可能な前記基剤は天然ではない。

【0016】

別の１つの側面では、本開示により、デアミナーゼを作製する方法として、前記デアミナーゼが発現する条件下で上記の細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0017】

別の１つの側面では、本開示により、デアミナーゼを作製する方法として、上記の核酸分子またはベクターを細胞の中に導入し、前記デアミナーゼが発現する条件下で前記細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0018】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記方法は前記デアミナーゼを精製することをさらに含む。

【0019】

別の１つの側面では、本開示により、ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むとともに、ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。

【0020】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性は低下しているか阻害されている。

【0021】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは不活性なＲｕｖＣドメインを持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0022】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つを持つアミノ酸配列を持つ。

【0023】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0024】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰは、配列番号８１として示されている配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列は、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0025】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0026】

別の１つの側面では、本開示により、ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；およびｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる核酸分子が提供される。

【0027】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼのヌクレオチド配列は、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼのヌクレオチド配列は、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼのヌクレオチド配列は、配列番号２、４、６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードする。

【0028】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼはシトシンデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性は低下しているか阻害されている。

【0029】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは不活性なＲｕｖＣドメインを持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0030】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0031】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つを持つアミノ酸配列を持つ。

【0032】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質をコードする前記ポリペプチドはその５´末端でプロモータに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質をコードする前記ポリペプチドはその３´末端でターミネータに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は１つ以上の核局在化シグナルを含む。

【0033】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は真核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は原核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている。

【0034】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰは、配列番号８１として示されている配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列は、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0035】

別の１つの側面では、本開示により、上記の核酸分子を含むベクターが提供される。いくつかの実施形態では、前記ベクターは、標的配列にハイブリダイズすることのできるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは単一ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは二重ガイドＲＮＡである。

【0036】

別の１つの側面では、本開示により、上記の融合タンパク質を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは単一ガイドＲＮＡである。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは二重ガイドＲＮＡである。

【0037】

別の１つの側面では、本開示により、上記の核酸分子またはベクターを含む細胞が提供される。

【0038】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記細胞は原核細胞である。上記の側面のいくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は昆虫細胞または鳥類細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は菌類細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は植物細胞である。

【0039】

別の１つの側面では、本開示により、上記の細胞を含む植物または種子が提供される。

【0040】

別の１つの側面では、本開示により、医薬として許容可能な基剤を含むとともに、上記の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、または細胞を含む医薬組成物が提供される。

【0041】

別の１つの側面では、本開示により、融合タンパク質を作製する方法でとして、前記融合タンパク質が発現する条件下で上記の細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0042】

別の１つの側面では、本開示により、融合タンパク質を作製する方法として、上記の核酸分子またはベクターを細胞の中に導入し、前記融合タンパク質が発現する条件下で前記細胞を培養することを含む方法が提供される。

【0043】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記方法は前記融合タンパク質を精製することをさらに含む。

【0044】

別の１つの側面では、本開示により、ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を作製する方法として、細胞の中に、上記の核酸分子を導入するとともに、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする発現カセットを含む核酸分子、または上記のベクターを導入し、前記融合タンパク質と前記ｇＲＮＡが発現してＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で前記細胞を培養することを含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することをさらに含む。

【0045】

別の１つの側面では、本開示により、標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する系として、ａ）融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ただし前記融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、前記デアミナーゼは、ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）と；ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡ、または前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含み；前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記融合タンパク質と複合体を形成し、前記融合タンパク質が前記標的ＤＮＡ配列に結合して前記標的ＤＮＡ分子を改変することを可能にする系が提供される。

【0046】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つはプロモータに機能可能に連結されている。

【0047】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ配列は真核細胞の標的ＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ配列は、前記ＲＧＮによって認識されるプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する。

【0048】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ分子は細胞内にある。いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は原核細胞である。

【0049】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、ＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0050】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは不活性なＲｕｖＣドメインを持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0051】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は１つ以上の核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0052】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰは配列番号８１として示されている配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列は、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0053】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は真核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている。いくつかの実施形態では、前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は１つのベクター上に位置する。

【0054】

別の１つの側面では、本開示により、上記の系の前記少なくとも１つのガイドＲＮＡと前記融合タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体が提供される。

【0055】

別の１つの側面では、本開示により、上記の系またはリボ核タンパク質複合体を含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は昆虫細胞または鳥類細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は菌類細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は植物細胞である。

【0056】

別の１つの側面では、本開示により、上記の植物細胞を含む植物または種子が提供される。

【0057】

別の１つの側面では、本開示により、医薬として許容可能な基剤を含むとともに、上記の系、リボ核タンパク質複合体、または細胞を含む医薬組成物が提供される。

【0058】

別の１つの側面では、本開示により、標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法として、上記の系またはリボ核タンパク質複合体を、前記標的ＤＮＡ分子、または前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞に送達することを含む方法が提供される。

【0059】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記改変された標的ＤＮＡ分子は、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｎ変異を含む（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）。いくつかの実施形態では、前記改変された標的ＤＮＡ分子は、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記改変された標的ＤＮＡ分子は、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を含む。

【0060】

別の１つの側面では、本開示により、標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法として、ａ）ＲＧＮ－デアミナーゼ複合体の組み立てを、前記ＲＧＮ－デアミナーゼ複合体が形成されるのに適した条件下で、ｉ）前記標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡと；ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）と少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質（ただし前記デアミナーゼは、Ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ＩＩ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）をインビトロで組み合わせることによって実施した後；ｂ）前記標的ＤＮＡ分子、または前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、前記インビトロで組み立てられたＲＧＮ－デアミナーゼ複合体と接触させることを含み、前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることにより、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ分子に結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の改変を起こさせる方法が提供される。

【0061】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。

【0062】

いくつかの実施形態では、前記改変された標的ＤＮＡ分子は、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｎ変異を含む（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）。いくつかの実施形態では、前記改変された標的ＤＮＡ分子は、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む。いくつかの実施形態では、前記改変された標的ＤＮＡ分子は、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を含む。

【0063】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0064】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは不活性なＲｕｖＣドメインを持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0065】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は１つ以上の核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0066】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰは配列番号８１として示されている配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列は、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0067】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ配列は真核細胞の標的ＤＮＡ配列である。いくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ配列は、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する。

【0068】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記標的ＤＮＡ分子は細胞内にある。いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は植物細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は原核細胞である。

【0069】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記方法は、前記改変されたＤＮＡ分子を含む細胞を選択することをさらに含む。

【0070】

別の１つの側面では、本開示により、上記の方法に従う改変された標的ＤＮＡを含む細胞が提供される。いくつかの実施形態では、前記細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では前記真核細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記哺乳類細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、前記ヒト細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記幹細胞は人工多能性幹細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は原核細胞である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は植物細胞である。

【0071】

別の１つの側面では、本開示により、上記の細胞を含む植物または種子が提供される。

【0072】

別の１つの側面では、本開示により、上記の細胞と、医薬として許容可能な基剤を含む医薬組成物が提供される。

【0073】

別の１つの側面では、本開示により、遺伝性疾患に関する原因変異の修正がなされた遺伝子改変細胞を作製する方法として、ａ）融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ただし前記融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、前記デアミナーゼは、ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）と；ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを前記細胞に導入することを含み、そのことによって前記融合タンパク質とｇＲＮＡが前記原因変異のゲノム遺伝子座に向かい、前記ゲノム配列を改変して前記原因変異を除去する方法が提供される。

【0074】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、前記細胞の中で活性なプロモータに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記細胞の中で活性なプロモータに機能可能に連結されている。

【0075】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはＩＩ型またはＶ型のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。

【0076】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮは、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ。

【0077】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは不活性なＲｕｖＣドメインを持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質の前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0078】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は１つ以上の核局在化シグナルを含む。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記デアミナーゼは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記リンカー配列は、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0079】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質はウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰは配列番号８１として示されている配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列は、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ。

【0080】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変は、前記標的ＤＮＡ配列内で少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を導入することを含む。いくつかの実施形態では、前記ゲノム改変は、前記標的ＤＮＡ配列内で少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を導入することを含む。

【0081】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記細胞は動物細胞である。いくつかの実施形態では、前記動物細胞は哺乳類細胞である。いくつかの実施形態では、前記細胞は、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、またはヒトに由来する。

【0082】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記原因変異の修正はナンセンス変異の修正を含む。いくつかの実施形態では、前記遺伝性疾患は表２３に掲載されている疾患である。いくつかの実施形態では、前記ｇＲＮＡは、配列番号１２２～１４４のいずれか１つを標的とするスペーサ配列、またはその相補体をさらに含む。

【0083】

別の１つの側面では、本開示により、ａ）ＤＮＡ結合ポリペプチドとシトシンデアミナーゼを含む融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードする核酸分子と；ｂ）第２のシトシンデアミナーゼ、または前記第２のデアミナーゼをコードする核酸分子（ただし前記第２のデアミナーゼは、ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）を含む組成物が提供される。

【0084】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第２のシトシンデアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第２のシトシンデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。

【0085】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。

【0086】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性は低下しているか阻害されている。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである。

【0087】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0088】

別の１つの側面では、本開示により、融合タンパク質をコードする核酸分子と第２のシトシンデアミナーゼをコードする核酸分子を含むベクター（ただし前記融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチドと第１のシトシンデアミナーゼを含み、前記第２のシトシンデアミナーゼは、ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）が提供される。

【0089】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第２のシトシンデアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第２のシトシンデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。

【0090】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ。

【0091】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性は低下しているか阻害されている。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである。

【0092】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0093】

別の１つの側面では、本開示により、上記のベクターを含む細胞が提供される。

【0094】

別の１つの側面では、本開示により、ａ）ＤＮＡ結合ポリペプチドと第１のシトシンデアミナーゼを含む融合タンパク質；または前記融合タンパク質をコードする核酸分子と；ｂ）第２のシトシンデアミナーゼ、または前記第２のデアミナーゼをコードする核酸分子（ただし前記第２のデアミナーゼは、ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）を含む細胞が提供される。

【0095】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第２のシトシンデアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第２のシトシンデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。

【0096】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記第１のシトシンデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性は低下しているか阻害されている。いくつかの実施形態では、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである。

【0097】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはＲＧＮニッカーゼである。いくつかの実施形態では、前記ＲＧＮはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。

【0098】

別の１つの側面では、本開示により、医薬として許容可能な基剤を含むとともに、上記の組成物、ベクター、または細胞を含む医薬組成物が提供される。

【0099】

別の１つの側面では、本開示により、疾患を治療する方法として、それを必要とする対象に、上記の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、系、リボ核タンパク質複合体、組成物、または医薬組成物を投与することを含む方法が提供される。

【0100】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記疾患は原因変異と関係しており、前記医薬組成物が前記原因変異を修正する。いくつかの実施形態では、前記疾患は表２３に掲載されている疾患である。

【0101】

別の１つの側面では、本開示により、対象における疾患を治療するための、上記の融合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、系、リボ核タンパク質複合体、または組成物の利用が提供される。

【0102】

上記の側面のいくつかの実施形態では、前記疾患は原因変異に関係しており、前記治療は前記原因変異を修正することを含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は表２３に掲載されている疾患である。

【0103】

別の１つの側面では、本開示により、疾患の治療に有用な薬を製造するための、融合タンパク質、核酸分子、ベクター、細胞、系、リボ核タンパク質複合体、または組成物の利用が提供される。いくつかの実施形態では、前記疾患は原因変異と関係しており、前記薬の有効量が前記原因変異を修正する。いくつかの実施形態では、前記疾患は表２３に掲載されている疾患である。

【発明を実施するための形態】

【0104】

本発明が関係する分野の当業者は、本明細書に記載されている本発明の改変およびそれ以外の実施形態として、これまでの記述に示されている教示の利益を持つものを思いつくであろう。したがってこれらの発明は、開示されている具体的な実施形態に限定されることはなく、改変と他の実施形態は添付の請求項の範囲に含まれることを理解すべきである。特殊な用語を本明細書で使用するが、それらは一般的かつ説明的な意味で用いられているのであり、制限する目的ではない。

【0105】

Ｉ．概要

【0106】

本開示により、シトシンデアミナーゼと、核酸分子結合ポリペプチド（ＤＮＡ結合ポリペプチドなど）とデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。ある実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ランダム化されたバックグラウンド配列に結合するよりも大きな頻度で標的配列に結合するという意味で配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか、それに由来する。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡとも呼ばれる）に結合するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ（例えばＣａｓ９）ポリペプチドなど）であり、それが今度は鎖のハイブリダイゼーションを通じて標的核酸配列に結合する。

【0107】

本明細書に開示されているデアミナーゼポリペプチドは核酸塩基（例えばシトシンなど）を脱アミノ化することができる。デアミナーゼによる核酸塩基の脱アミノ化はそれぞれの残基の位置での点変異につながる可能性があり、それを本明細書では「核酸編集」または「塩基編集」と呼ぶ。したがってＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドとデアミナーゼを含む融合タンパク質を用い、標的を絞った核酸配列編集が可能になる。

【0108】

このような融合タンパク質は、例えば遺伝子が改変された細胞を作製するためインビトロで標的を絞ってＤＮＡを編集するのに有用である。遺伝子が改変されたこれら細胞として、植物細胞または動物細胞が可能である。このような融合タンパク質は、例えば生体外で哺乳類細胞内の遺伝子異常を修正するため標的を絞った変異を導入する（例えば対象から得られた細胞内の遺伝子異常を修正し、その後その細胞を同じ対象または別の対象に再導入する）ことと；哺乳類対象内の疾患関連遺伝子に標的を絞った変異を導入（例えば遺伝子異常の修正または脱活性化変異を導入）することにも有用である可能性がある。このような融合タンパク質は、植物細胞の中に標的を絞った変異を導入する（例えば有益な、または農業で価値のある形質またはアレルを導入する）のにも有用である可能性がある。

【0109】

「タンパク質」、「ペプチド」、および「ポリペプチド」という用語は本明細書では交換可能に使用され、ペプチド（アミド）結合によって互いに連結されたアミノ酸残基のポリマーを意味する。これらの用語は、任意のサイズ、構造、または機能のタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドを意味する。典型的には、タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは少なくとも３個のアミノ酸の長さになろう。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、個別のタンパク質、または一群のタンパク質を意味することができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドの中のアミノ酸の１つ以上を例えば化学物質（例えば複合体化、機能化、または他の修飾などのための炭水化物基、ヒドロキシル基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカー）の付加によって改変することができる。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは単一分子であること、または多分子複合体であることも可能である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドとして、天然のタンパク質またはペプチドの単なる断片が可能である。タンパク質、ペプチド、またはポリペプチドは、天然、組み換え、または合成、またはこれらの任意の組み合わせが可能である。

【0110】

本明細書に提示されているどのタンパク質も本分野で知られている任意の方法によって作製することができる。例えば本明細書に提示されているタンパク質は、組み換えタンパク質の発現と精製によって作製することができ、ペプチドリンカーを含む融合タンパク質に特に適している。組み換えタンパク質の発現と精製のための方法は周知であり、Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（４ｔｈ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州（２０１２））（その内容全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている方法を含む。

【0111】

ＩＩ．デアミナーゼ

【0112】

「デアミナーゼ」という用語は、脱アミノ化反応の触媒となる酵素を意味する。本発明のデアミナーゼは核酸塩基デアミナーゼであり、「デアミナーゼ」と「核酸塩基デアミナーゼ」という用語は本明細書では交換可能に使用される。デアミナーゼとして、天然のデアミナーゼ酵素、またはその活性な断片またはバリアントが可能である。デアミナーゼは一本鎖核酸（ｓｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡなど）または二本鎖核酸（ｄｓＤＮＡまたはｄｓＲＮＡなど）に対して活性である可能性がある。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはｓｓＤＮＡを脱アミノ化することだけが可能でｄｓＤＮＡには作用しない。

【0113】

本開示の方法と組成物は、シトシン、シチジン、またはデオキシシチジンを加水分解で脱アミノ化してウラシルにする触媒となるシトシンデアミナーゼを含む。シトシンデアミナーゼはＤＮＡまたはＲＮＡに作用する可能性があり、典型的には一本鎖核酸分子に作用する。さらなる実施形態では、シトシンデアミナーゼはアポリポタンパク質Ｂ ｍＲＮＡ編集複合体（ＡＰＯＢＥＣ）ファミリーのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはＡＰＯＢＥＣｌファミリーのデアミナーゼである。いくつかの実施形態では、シトシンデアミナーゼは、活性化誘導型シチジンデアミナーゼ（ＡＩＤ）である。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはＡＣＦ１／ＡＳＥデアミナーゼである。追加の適切なデアミナーゼ酵素は、本開示に基づくと当業者には明らかであろう。ＤＮＡ結合ポリペプチドとシトシンデアミナーゼを含む融合タンパク質を本明細書では「Ｃ塩基エディタ」、「シトシン塩基エディタ」、または「ＣＢＥ」と呼ぶ。ＣＢＥはシトシンをウラシルに変換することができ、ウラシルをその後ＤＮＡの複製または修復を通じてチミジンに変換することができる。いくつかの実施形態では、ＣＢＥはシトシンからグアニンに、またはシトシンからアデニンに変換する。作用のいかなる理論または機構にも囚われないと、シトシン塩基エディタによるシトシンからグアニンまたはアデニンへの変換は、シトシンが脱アミノ化によってウラシルになり、その後ウラシル残基が塩基除去修復されている間にウラシルＤＮＡグリコシラーゼの活性によってなされると考えられる。

【0114】

いくつかの実施形態では、本開示のシトシンデアミナーゼはアデニンデアミナーゼと組み合わせて使用される。いくつかの実施形態では、アデニンデアミナーゼは、ＡＤＡＴファミリーのデアミナーゼ、またはそのバリアントである。アデニン、アデノシン、またはデオキシアデノシンの脱アミノ化によってイノシンが生じ、それがグアニンとしてポリメラーゼによって処理される。現在のところ、ＤＮＡの中のアデニンを脱アミノ化する天然のアデニンデアミナーゼは知られていない。いくつかの方法を利用して、ｔＲＮＡに作用するアデニンデアミナーゼ（ＡＤＡＴ）タンパク質を進化させ、哺乳類細胞の中のＤＮＡ分子に対して活性であるようにされた（Ｇａｕｄｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ， ２０１７；Ｋｏｂｌａｎ， Ｌ． Ｗ． ｅｔ ａｌ， ２０１８， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３６， ８４３－８４６；Ｒｉｃｈｔｅｒ， Ｍ． Ｆ． ｅｔ ａｌ， ２０２０， Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ， ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５８７－０２０－０５６２－８（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている））。そのような１つの方法は細菌選択アッセイを利用しており、そこではＡ：Ｔ＞Ｇ：Ｃ変換を通じて抗生剤耐性を活性化させる能力を持つ細胞だけが生き延びることができる。いくつかの実施形態では、本開示のシトシンデアミナーゼを含む本開示の組成物と方法はさらに、２０２０年９月１１日に出願されたアメリカ合衆国仮特許出願第６３／０７７，０８９号と２０２１年２月８日に出願された第６３／１４６，８４０号、および２０２１年９月１０日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４９８５３号（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に示されているアデニンデアミナーゼを含む。

【0115】

本発明は、細菌から同定されたシトシンデアミナーゼポリペプチドと、細菌デアミナーゼのトランケーションを通じて生成したシトシンデアミナーゼに関する。シトシンデアミナーゼは本明細書に開示されており、配列番号２、４、および６～１２として示されている。本発明のデアミナーゼを用いてＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を編集することができる。いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼを用いてｓｓＤＮＡ分子またはｓｓＲＮＡ分子を編集することができる。本明細書に記載されているシトシンデアミナーゼは、単独のデアミナーゼとして、または融合タンパク質の中の成分として有用である。ＤＮＡを標的にするポリペプチドとシトシンデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質を本明細書では「Ｃに基づくエディタ」、「シトシン塩基エディタ」、または「ＣＢＥ」と呼び、標的を絞った核酸配列編集に用いることができる。

【0116】

「塩基エディタ」は、ＤＮＡターゲティングポリペプチド（ＲＧＮなど）とデアミナーゼを含む融合タンパク質である。シトシン塩基エディタ（ＣＢＥ）は、ＤＮＡを標的とするタンパク質（ＲＧＮなど）とシトシンデアミナーゼを含む。ＣＢＥはＤＮＡ標的分子上でシトシンを脱アミノ化してウラシルにすることを通じて機能する。ウラシルはその後、ＤＮＡの複製または修復を通じてチミンに変換される。いくつかの実施形態では、本開示のシトシンデアミナーゼ、またはその活性なバリアントまたは断片は、Ｃ＞Ｎ変異をＤＮＡ分子に導入する（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）。いくつかの実施形態では、本開示のシトシンデアミナーゼ、またはそれを含む融合タンパク質は、Ｃ＞Ｔ変異をＤＮＡ分子に導入する。いくつかの実施形態では、本開示のシトシンデアミナーゼ、またはそれを含む融合タンパク質は、Ｃ＞Ｇ変異をＤＮＡ分子に導入する。

【0117】

デアミナーゼがＤＮＡ結合ポリペプチドとの融合を通じて核酸分子の特定の領域に向けられた実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドが結合する標的配列の中、またはその標的配列に隣接するシトシンの変異率は、本分野で知られている任意の方法（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、またはＤＮＡシークエンシングが含まれる）を利用して測定することができる。

【0118】

標的ＤＮＡ分子の中に望むＣ＞Ｎ（ただしＮは、Ａ、Ｔ、またはＧ）変異（Ｃ＞ＴまたはＣ＞Ｇ変異など）を導入する効率を大きくするため、本開示のデアミナーゼ、またはデアミナーゼ活性を保持するその活性なバリアントまたは断片を、デアミナーゼ－ＤＮＡ結合ポリペプチド融合体の一部として細胞の中に導入すること、および／またはＤＮＡ結合ポリペプチド－デアミナーゼ融合体と同時に発現させることができる。本開示のデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれか、またはデアミナーゼ活性を保持しているそのバリアントまたは断片のアミノ酸配列を持つ。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ。特別な実施形態では、デアミナーゼは、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む。ある実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む。

【0119】

ＩＩＩ．核酸分子結合ポリペプチド

【0120】

本開示のいくつかの側面により、核酸分子結合ポリペプチドとデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質が提供される。ＲＮＡ分子への結合と標的を絞ったＲＮＡ分子編集が本発明によって考慮されるが、いくつかの実施形態では、融合タンパク質の核酸分子結合ポリペプチドはＤＮＡ結合ポリペプチドである。このような融合タンパク質は、インビトロ、生体外、または生体内での標的を絞ったＤＮＡ編集に有用である。これら融合タンパク質は哺乳類細胞の中で活性であり、標的を絞ったＤＮＡ分子編集に有用である。

【0121】

「融合タンパク質」という用語は、本明細書では、少なくとも２つの異なるタンパク質からのタンパク質ドメインを含むハイブリッドポリペプチドを意味する。融合タンパク質は２つ以上の異なるドメイン（例えばＤＮＡ結合ドメインとデアミナーゼ）を含むことができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、核酸（例えばＲＮＡ）との複合体であるか、核酸と会合している。

【0122】

いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質はＤＮＡ結合ポリペプチドを含む。本明細書では、「ＤＮＡ結合ポリペプチド」という用語は、ＤＮＡに結合することのできる任意のポリペプチドを意味する。ある実施形態では、本開示の融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド部分が二本鎖ＤＮＡに結合する。特別な実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは配列特異的にＤＮＡに結合する。本明細書では、「配列特異的な」または「配列特異的に」という用語は、特定のヌクレオチド配列との選択的相互作用を意味する。

【0123】

２つのポリヌクレオチド配列が実質的に相補的であると見なせるのは、それら２つの配列が厳しい条件下で互いにハイブリダイズするときである。同様に、ＤＮＡ結合ポリペプチドが特定の標的配列に配列特異的に結合すると見なされるのは、そのＤＮＡ結合ポリペプチドがその配列に厳しい条件で結合する場合である。「厳しい条件」または「厳しいハイブリダイゼーション条件」とは、それら２つのポリヌクレオチド配列が他の配列よりも大きな程度（例えばバックグラウンドの少なくとも２倍）の検出可能性で互いに結合する（またはポリペプチドがその特定の標的配列に結合する）条件を意味する。厳しい条件は配列に依存しており、環境が異なれば異なるであろう。典型的には、厳しい条件は、塩の濃度が、ｐＨ７．０～８．３で約１．５Ｍ未満のＮａイオン、典型的には約０．０１～１．０ＭのＮａイオン（または他の塩）、かつ温度が短い配列（例えば１０～５０個のヌクレオチド）では少なくとも約３０℃、長い配列（例えば５０個超のヌクレオチド）では少なくとも約６０℃である条件である。厳しい条件は、脱安定剤（ホルムアミドなど）の添加によって実現することもできる。厳しさの低い代表的な条件には、３０～３５％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）の緩衝溶液を用いた３７℃でのハイブリダイゼーションと、５０～５５℃の１×～２×ＳＳＣ（２０×ＳＳＣ＝３．０ＭのＮａＣｌ／０．３Ｍのクエン酸三ナトリウム）の中での洗浄が含まれる。中程度の厳しさの代表的な条件には、４０～４５％のホルムアミド、１．０ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの中での３７℃でのハイブリダイゼーションと、５５～６０℃の０．５×～１×ＳＳＣの中での洗浄が含まれる。厳しさの程度が高い代表的な条件には、５０％のホルムアミド、１ＭのＮａＣｌ、１％ＳＤＳの中での３７℃でのハイブリダイゼーションと、６０～６５℃の０．１×ＳＳＣの中での洗浄が含まれる。場合により、洗浄用バッファは、約０．１％～約１％のＳＤＳを含むことができる。ハイブリダイゼーションの時間は一般に約２４時間未満であり、通常は約４～約１２時間である。洗浄時間は、少なくとも平衡に到達するのに十分な長さの時間になろう。

【0124】

Ｔｍは、相補的な標的配列の５０％が、完全に一致した配列に（規定されたイオン強度とｐＨのもとで）ハイブリダイズする温度である。ＤＮＡ－ＤＮＡハイブリッドに関しては、Ｔｍは、Ｍｅｉｎｋｏｔｈ ａｎｄ Ｗａｈｌ （１９８４） Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． １３８：２６７－２８４の式から大まかに知ることができ、Ｔｍ＝８１．５℃＋１６．６ （ｌｏｇＭ）＋０．４１（％ＧＣ）－０．６１（％ｆｏｒｍ）－５００／Ｌとなる（ただしＭは１価カチオンのモル数であり、％ＧＣは、ＤＮＡの中のグアノシンヌクレオチドとシトシンヌクレオチドの割合であり、％ｆｏｒｍは、ハイブリダイゼーション溶液に含まれるホルムアミドの割合であり、Ｌは、塩基対の中のハイブリッドの長さである）。一般に、厳しい条件は、規定されたイオン強度とｐＨにおける具体的な配列とその相補的配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃低くなるように選択される。しかし極めて厳しい条件は、融点（Ｔｍ）よりも１、２、３、または４℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ；中程度に厳しい条件は、融点（Ｔｍ）よりも６、７、８、９、または１０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができ；厳しさが低い条件は、融点（Ｔｍ）よりも１１、１２、１３、１４、１５、または２０℃低い温度でのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄を利用することができる。当業者は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄溶液の厳しさの変動が、上記の式、ハイブリダイゼーション用と洗浄用の組成物、および望むＴｍを利用して本質的に記述されることを理解しているであろう。核酸のハイブリダイゼーションに関する包括的なガイドは、Ｔｉｊｓｓｅｎ （１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐａｒｔ Ｉ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、ニューヨーク）；およびＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９９５） Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ－Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、ニューヨーク） に見いだされる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｄ ｅｄ．， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、プレインヴュー、ニューヨーク州）を参照されたい。

【0125】

ある実施形態では、配列特異的ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ＲＧＤＢＰ）である。本明細書では、「ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド」と「ＲＧＤＢＰ」という用語は、関連するＲＮＡ分子と標的ＤＮＡ配列のハイブリダイゼーションを通じてＤＮＡに結合することのできるポリペプチドを意味する。

【0126】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドはヌクレアーゼ（配列特異的ヌクレアーゼなど）である。本明細書では、「ヌクレアーゼ」という用語は、核酸分子の中のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断する触媒となる酵素を意味する。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは核酸分子内のヌクレオチド間のホスホジエステル結合を切断することのできるエンドヌクレアーゼであるのに対し、ある実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、核酸分子のいずれかの末端（５´または３´）の位置でヌクレオチドを切断することのできるエキソヌクレアーゼである。いくつかの実施形態では、配列特異的ヌクレアーゼの選択は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬ－エフェクタＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質（ＴＡＬＥＮ）、およびＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）、またはヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されたそのバリアントからなる群からなされる。

【0127】

本明細書では、「メガヌクレアーゼ」または「ホーミングエンドヌクレアーゼ」という用語は、長さが１２～４０ｂｐの二本鎖ＤＮＡ内の認識部位に結合するエンドヌクレアーゼを意味する。メガヌクレアーゼの非限定的な例は、保存されたアミノ酸モチーフＬＡＧＬＩＤＡＤＧ（配列番号８５）を含むＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリーに属するものである。「メガヌクレアーゼ」という用語は、二量体または一本鎖のメガヌクレアーゼを意味することができる。

【0128】

本明細書では、「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」または「ＺＦＮ」という用語は、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質を意味する。

【0129】

本明細書では、「ＴＡＬ－エフェクタＤＮＡ結合ドメイン－ヌクレアーゼ融合タンパク質」または「ＴＡＬＥＮ」という用語は、ＴＡＬエフェクタＤＮＡ結合ドメインとヌクレアーゼドメインを含むキメラタンパク質を意味する。

【0130】

ある実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドは、二本鎖ＤＮＡ分子内に一本鎖領域を生成させることのできるものである。一本鎖領域の一例は、Ｒループの中に含まれる一本鎖ループであり、Ｒループは、相補的な鎖が一本鎖のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子にハイブリダイズすることから生じる二本鎖ＤＮＡ分子の中に形成される一本鎖ＤＮＡの領域を含む三本鎖核酸構造である。Ｒループの一本鎖領域の中にあるかＲループの一本鎖領域に隣接するシトシンは、一本鎖核酸（例えばｓｓＤＮＡ）に対する活性を持つシトシンデアミナーゼによって脱アミノ化することができる。これら実施形態のいくつかでは、二本鎖ＤＮＡ分子内にＲループを生じさせることのできるＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはＲＧＮヌクレアーゼである。本明細書では、「ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」または「ＲＧＮ」という用語は、ヌクレアーゼ活性を持つＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを意味する。ＲＧＮは「ＲＮＡ誘導型」と見なされる。なぜならガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成してＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的配列に結合させ、いくつかの実施形態では、標的配列に一本鎖または二本鎖の切断を導入するからである。

【0131】

ある実施形態では、ＲＧＮは、ニッカーゼＲＧＮ、またはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである。「ＲＧＮポリペプチド」という用語は、標的ヌクレオチド配列の一本鎖だけを切断するＲＧＮポリペプチドを包含し、それを本明細書ではニッカーゼと呼ぶ。このようなＲＧＮは単一機能のヌクレアーゼドメインを持つ。ＲＧＮニッカーゼとして、天然のニッカーゼが可能であるか、ＲＧＮタンパク質のうちで、１つ以上のヌクレアーゼドメイン内の変異した二本鎖核酸分子の両方の鎖を自然に切断するため、これら変異したドメインのヌクレアーゼ活性が低下するか消失し、ニッカーゼになるものが可能である。

【0132】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮはＲＧＮが核酸二本鎖の塩基編集されていない標的鎖（ＰＡＭを含んでいてｇＲＮＡと塩基対を形成する鎖）だけを切断できるようにする変異（例えばＤ１０Ａ変異（ただしアミノ酸の番号は、配列番号９９として示されている化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列に基づく）を含む。Ｄ１０Ａ変異または同等な変異を含むニッカーゼはＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを不活性にしており、標的となる鎖を切断する。Ｄ１０ニッカーゼはＤＮＡの非標的鎖、すなわち塩基編集が望ましい鎖を切断することができない。これら実施形態では、ＲＧＮが標的鎖にニックを入れる一方で、それと相補的な非標的鎖はデアミナーゼによって改変される。細胞ＤＮＡ修復機構は、ニックが入れられた標的鎖を、改変された非標的鎖を鋳型として用いて修復することにより、変異をＤＮＡに導入することができる。

【0133】

そこでいくつかの実施形態では、ニッカーゼは不活性なＲｕｖＣドメインを含む。ＲｕｖＣドメインはＲＮアーゼＨフォールド構造を持つ（例えばＮｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｃｅｌｌ １５６（５）： ９３５－９４９参照（その全体が参照によって組み込まれている））。ＲＧＮのＲｕｖＣドメインは、直線状アミノ酸配列の中に２つ以上の非隣接領域を含む分割ＲｕｖＣドメインであることがしばしばある。例えば化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＲｕｖＣドメインは、配列番号９９のアミノ酸残基１～５９、７１８～７６９、および９０９～１０９８を含む。ＲｕｖＣドメインの中にあってそのヌクレアーゼ活性を不活性化する変異の非限定的な一例は、分割ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの中の最初のアスパラギン酸残基を変異させるＤ１０Ａ変異である。本出願には、記載されているＲＧＮのＤ１０ニッカーゼバリアントまたは相同ニッカーゼバリアントでＲｕｖＣドメインが不活性化されているものがいくつか開示されている。（それぞれ配列番号７５と８８として示されている）ｎＡＰＧ０７４３３．１とｎＡＰＧ０８２９０．１は、それぞれ配列番号４４と８７として示されているＡＰＧ０７４３３．１とＡＰＧ０８２９０．１のニッカーゼバリアントであり、ＷＯ２０１９／２３５６６（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている。（それぞれ配列番号９７と９８として示されている）ｎＡＰＧ０７４３３．１－ｄｅｌとｎＡＰＧ０８２９０．１－ｄｅｌは、それぞれＡＰＧ０７４３３．１とＡＰＧ０８２９０．１の欠失変異体であり、２０２０年９月１１日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第６３／０７７，０８９号と２０２１年２月８日に出願された第６３／１４６，８４０号、および２０２１年９月１０日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２１／０４９８５３号に記載されている。（配列番号８９として示されている）ｎＡＰＧ００９６９と（配列番号９０として示されている）ｎＡＰＧ０９７４８は、それぞれＡＰＧ００９６９とＡＰＧ０９７４８のニッカーゼバリアントであり、ＷＯ２０２０／１３９７８３（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている。（配列番号９１として示されている）ｎＡＰＧ０６６４６と（配列番号９２として示されている）ｎＡＰＧ０９８８２は、それぞれＡＰＧ０６６４６とＡＰＧ０９８８２のニッカーゼバリアントであり、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０２１／０３０３４４号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている。ｎＡＰＧ０３８５０、ｎＡＰＧ０７５５３、ｎＡＰＧ０５５８８６、およびｎＡＰＧ０１６０４はそれぞれ配列番号９３～９６として示されていて、ＡＰＧ０３８５０、ＡＰＧ０７５５３、ＡＰＧ０５５８８６、およびＡＰＧ０１６０４のニッカーゼバリアントであり、係属中のアメリカ合衆国仮出願第６３／０１４，９７０号と第６３／０７７，２１１号、およびＰＣＴ公開第ＷＯ２０２１／２１７０２号（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている。

【0134】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のニッカーゼＲＧＮは変異（例えばＨ８４０Ａ変異（ただしアミノ酸番号は、配列番号９９として示されている化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列に基づく））を含み、その変異が、ＲＧＮが核酸二本鎖の塩基編集された非標的鎖（ＰＡＭを含まず、ｇＲＮＡと塩基対を形成しない鎖）だけを切断できるようにする。これら実施形態のいくつかでは、ニッカーゼは不活性なＨＮＨヌクレアーゼドメインを含む。ＲＧＮのＨＮＨヌクレアーゼドメインはββα－金属フォールドを持つ（例えばＮｉｓｈｉｍａｓｕ ｅｔ ａｌ． ２０１４参照）。化膿レンサ球菌Ｃａｓ９のＨＮＨヌクレアーゼドメインは例えば配列番号９９のアミノ酸残基７７５～９０８を含む。ヌクレアーゼ活性を不活性化させるＨＮＨドメイン内の変異の非限定的な一例は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインの最初のヒスチジンを変異させるＨ８４０Ａ変異である。不活性化されたＨＮＨドメインを持つデアミナーゼは非標的鎖に作用する。

【0135】

ＲＧＮのＲｕｖＣドメインおよび／またはＨＮＨドメインを不活性にする方法は本分野で知られており、一般に、分割ＲｕｖＣドメイン内の最初のアスパラギン酸、および／またはＨＮＨドメインの最初のヒスチジンを変異させることを含む。典型的には、アスパラギン酸残基またはヒスチジン残基が変異してアラニンになる。ＲｕｖＣドメイン内にあって変異させることでこのドメインのヌクレアーゼ活性を不活性にすることのできる他のアミノ酸残基には、Ｇｌｕ７６２、Ｈｉｓ９８３、およびＡｓｐ９８６（典型的にはアラニンへ）が含まれる（ただしアミノ酸の番号は、配列番号９９として示されている化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列に基づく）。ＨＮＨドメインの中で変異させることが可能な他のアミノ酸残基には、Ｄ８３９とＮ８６３（典型的にはアラニンへ）が含まれる（ただしアミノ酸の番号は、配列番号９９として示されている化膿レンサ球菌Ｃａｓ９配列に基づく）。

【0136】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＲＧＮはヌクレアーゼデッドである。本明細書では、変異してヌクレアーゼ不活性または「デッド」になったＲＧＮタンパク質は、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド、またはヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ、またはヌクレアーゼ－デッドＲＧＮと呼ぶことができる。ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮを生成させる方法は本分野で知られており、一般に、ＲＧＮのヌクレアーゼドメインのヌクレアーゼドメインだけ、またはすべてを変異させてヌクレアーゼドメイン不活性にすることを含む。ＲＧＮが単一のヌクレアーゼドメイン（例えばＲｕｖＣドメイン）だけを含む実施形態では、ヌクレアーゼ不活性なバリアントはＲｕｖＣドメイン内に少なくとも１つの変異を持ち、その結果としてＲｕｖＣヌクレアーゼドメインが不活性化するであろう。ＲＧＮが２つ以上のヌクレアーゼドメイン（ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインなど）を含む実施形態では、ＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインのそれぞれの中の少なくとも１つの変異が両方のヌクレアーゼドメインを不活性にする。

【0137】

適切な１つの代表的なヌクレアーゼ不活性なＲＧＮは、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ Ｃａｓ９変異体である（例えばＱｉ ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． ２０１３； １５２（５）： １１７３－８３参照（その全内容が参照によって本明細書に組み込まれている）。それに加え、他の既知のＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の適切なヌクレアーゼ不活性バリアントを明確にすることができる（例えばアメリカ合衆国特許出願公開第２０１９／０３６７９４９号（その全内容は参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されているＲＧＮ ＡＰＧ０８２９０．１またはＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１、または配列番号８３として示されているｄＡＰＧ０９２９８のヌクレアーゼ不活性バリアント）。

【0138】

他の追加の適切な代表的ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮバリアントの非限定的な例に含まれるのは、Ｄ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０ＡとＤ１０Ａ／Ｄ８３９Ａ／Ｈ８４０Ａ／Ｎ８６３Ａという変異体ドメインである（例えばＭａｌｉ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ． ２０１３； ３１（９）： ８３３－８３８参照（その全内容が参照によって本明細書に組み込まれている））。

【0139】

変異してニッカーゼまたは不活性なヌクレアーゼになる追加の適切なＲＧＮタンパク質は、本開示と本分野の知識に基づき当業者には明らかであろう（例えばＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／２３６５６６号に開示されているＲＧＮなど（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている））ゆえ、本開示の範囲に含まれる。

【0140】

いくつかの実施形態では、ニッカーゼ活性を保持するＲＧＮニッカーゼは、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％一致するアミノ酸配列を含む。

【0141】

アミノ酸配列に変異を導入するための本分野で知られている任意の方法（ＰＣＲを媒介とした突然変異誘発や部位特異的突然変異誘発など）を利用してニッカーゼまたはヌクレアーゼ－デッドＲＧＮを作製することができる。例えばアメリカ合衆国出願公開第２０１４／００６８７９７号とアメリカ合衆国特許第９，７９０，４９０号参照；それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている。

【0142】

ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）によりゲノム内の単一部位を標的とした操作が可能になるため、治療と研究の用途のための遺伝子ターゲティングの文脈で有用である。ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、哺乳類を含む多彩な生物において、非相同末端結合または相同組み換えを促進することによるゲノム操作に使用されてきた。ＲＧＮに含まれるのは、クラスター化されて規則的な間隔で配置された短い回文反復（ＣＲＩＳＰＲ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ系の一部としてのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）によって標的配列に向けられるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはその活性なバリアントまたは断片である。

【0143】

本開示のいくつかの側面により、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼポリペプチド（特にシトシンデアミナーゼポリペプチド）を含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）である。さらなる実施形態では、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼは、天然のＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはその活性なバリアントまたは断片である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ系はクラス１または２の系に分類される。クラス２の系は単一のエフェクタヌクレアーゼを含み、ＩＩ型、Ｖ型、およびＶＩ型を含む。クラス１と２の系は複数の型（Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型、ＩＶ型、Ｖ型、ＶＩ型）に分類され、いくつかの型はさらに亜型（例えばＩＩ－Ａ型、ＩＩ－Ｂ型、ＩＩ－Ｃ型、Ｖ－Ｖ型－Ｂ型）に分類される。

【0144】

ある実施形態では、ＲＧＮは、天然のＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはその活性なバリアントまたは断片である。本明細書では、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質」、または「ＩＩ型ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」という用語は、トランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を必要とするＲＧＮを意味し、それぞれが二本鎖ＤＮＡ分子の単一の鎖の切断に責任がある２つのヌクレアーゼドメイン（すなわちＲｕｖＣとＨＮＨ）を含む。いくつかの実施形態では、本発明により、化膿レンサ球菌Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）またはＳｐＣａｓ９ニッカーゼ（その配列はそれぞれ配列番号９９と１００として示されており、アメリカ合衆国特許第１０，０００，７７２号と第８，６９７，３５９号（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている）などのＣａｓ９タンパク質に融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、本発明により、ストレプトコッカス・サーモフィラスＣａｓ９（ＳｔＣａｓ９）またはＳｔＣａｓ９ニッカーゼ（その配列はそれぞれ配列番号１０１と１０２として示されており、アメリカ合衆国特許第１０，１１３，１６７号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されている）に融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、本発明により、ストレプトコッカス・アウレウスＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）またはＳａＣａｓ９ニッカーゼ（その配列はそれぞれ配列番号１０３と１０４として示されており、アメリカ合衆国特許第９，７５２，１３２号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されている）に融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。

【0145】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはその活性なバリアントまたは断片である。本明細書では、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質」、または「Ｖ型ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ」という用語は、ｄｓＤＮＡを切断するＲＧＮを意味し、単一のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインまたは１つの分割ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨドメインを欠く（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ ２０１５， Ｃｅｌｌ ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１５．０９．０３８；Ｓｈｍａｋｏｖ ｅｔ ａｌ ２０１７， Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｒｍｉｃｒｏ．２０１６．１８４；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ ２０１８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ７２７１；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．ａａｖ４２９４）。いくつかの実施形態では、本開示の融合タンパク質はＣａｓ１２（例えばＣａｓ１２ａ）を含む。Ｃａｓ１２ａはＣｐｆ１とも呼ばれ、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としないが、他のＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質（Ｃａｓ１２ｂなど）はｔｒａｃｒＲＮＡを必要とすることに注意されたい。大半のＶ型エフェクタは、しばしばＰＡＭを必要とせずにｓｓＤＮＡ（一本鎖ＤＮＡ）も標的とすることができる（Ｚｅｔｓｃｈｅ ｅｔ ａｌ ２０１５；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ ２０１８；Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ ｅｔ ａｌ ２０１８）。「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」と「Ｖ型ＲＧＮ」という用語は、分割ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含む独自のＲＧＮ（２０１９年１２月３０日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第６２／９５５，０１４号と２０２０年７月２９日に出願された第６３／０５８，１６９号、および２０２０年１２月２８日に出願されたＰＣＴ国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０６７１３８号（それぞれの内容全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されているものなど）を包含する。いくつかの実施形態では、本発明により、フランシセラ・ノビシダＣａｓ１２ａ（ＦｎＣａｓ１２ａ）（その配列は配列番号１０５として示されていて、アメリカ合衆国特許第９，７９０，４９０号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されている）、またはアメリカ合衆国特許第９，７９０，４９０号に開示されているＦｎＣａｓ１２ａのヌクレアーゼ不活性化変異体のいずれかに融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。

【0146】

いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質は、天然のＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはその活性なバリアントまたは断片である。本明細書では、「ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質」、「ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質」、または「ＶＩ型ＲＧＮ」という用語は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要とせず、ＲＮＡを切断する２つのＨＥＰＮドメインを含むＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓエフェクタタンパク質を意味する。いくつかの実施形態では、本発明により、Ｃａｓ１３に融合された本開示のデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。

【0147】

特別な実施形態では、本開示の融合タンパク質は、表１に掲載されているＲＧＮ、またはニッカーゼ、またはそのヌクレアーゼ－デッドバリアントを含む。表１の各ＲＧＮとともに使用できるガイドＲＮＡ配列（ｃｒＲＮＡ反復とｔｒａｃｒＲＮＡ配列）のほか、コンセンサスＰＡＭ配列も提供される。ある実施形態では、融合タンパク質は、表１に掲載されているＲＧＮの活性なバリアント（核酸分子にＲＮＡ誘導型で結合できるもの）で、表１に掲載されているアミノ酸配列のいずれか１つと８０％と９９％の間、またはそれよりも多く（約８０％以上、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれよりも多くが含まれるが、それに限定されない）一致する配列を持つものを含む。特別な実施形態では、融合タンパク質は、表１に開示されているＲＧＮアミノ酸配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも多く一致する配列を持つＲＧＮを含む。他の実施形態では、融合タンパク質は、表１に掲載されているＲＧＮの断片（１～１５個という少数のアミノ酸残基、例えば１～１０個（６～１０個など）という少数、５個という少数、４個という少数、３個という少数、２個という少数、または１個という少数のアミノ酸残基だけ異なるもの）を含む。特別な実施形態では、ＲＧＮは、Ｎ末端またはＣ末端のトランケーションを含んでおり、それは、ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、またはそれよりも多くのアミノ酸の欠失を少なくとも含む。いくつかの実施形態では、ＲＧＮは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、またはそれよりも多くのアミノ酸の欠失を少なくとも含む内部欠失を含む。

【0148】

【表1-1】

【表1-2】

【0149】

「ガイドＲＮＡ」という用語は、標的ヌクレオチド配列と十分な相補性を有するためにこの標的配列とハイブリダイズし、関連するＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的ヌクレオチド配列に配列特異的に結合させるヌクレオチド配列を意味する。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ ＲＧＮについては、それぞれのガイドＲＮＡは、ＲＧＮに結合してガイドＲＧＮを特定の標的ヌクレオチド配列に結合させることができ、ＲＧＮがニッカーゼ活性またはヌクレアーゼ活性を持つ場合には、標的ヌクレオチド配列を切断することもできる１つ以上のＲＮＡ分子（一般に１または２個）である。ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）と、いくつかの実施形態ではトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡの一部はＤＮＡヌクレオチドを含む。ある実施形態では、ガイドＲＮＡは人工的な非天然のヌクレオチド類似体を含む、または１つ以上のヌクレオチドが化学的に修飾されている。

【0150】

ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡはスペーサ配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列を含む。「スペーサ配列」は、興味ある標的ヌクレオチド配列に直接ハイブリダイズするヌクレオチド配列である。スペーサ配列を操作し、興味ある標的ヌクレオチド配列と完全に、または部分的に相補的であるようにする。さまざまな実施形態では、スペーサ配列は、約８～約３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含むことができる。例えばスペーサ配列として、長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドが可能である。いくつかの実施形態では、スペーサ配列は、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサ配列は長さが約１０～約２６個のヌクレオチド、または長さが約１２～約３０個のヌクレオチドである。特別な実施形態では、スペーサ配列は長さが約３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサ配列は長さが３０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、スペーサ配列とそれに対応する標的配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントにしたとき、５０％と９９％の間、またはそれよりも大きく（約５０％以上、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれよりも大きい値が含まれるが、それに限定されない）である。特別な実施形態では、スペーサ配列とそれに対応する標的配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントにしたとき、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きい値である。特別な実施形態では、スペーサ配列は二次構造が自由であり、それは、本分野で知られている適切な任意のポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムを用いて予測することができる。アルゴリズムの非限定的な例に含まれるのは、ｍＦｏｌｄ（例えばＺｕｋｅｒ ａｎｄ Ｓｔｉｅｇｌｅｒ （１９８１） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ９：１３３－１４８参照）と、ＲＮＡｆｏｌｄ（例えばＧｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３－２４参照）である。

【0151】

ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、それ自身で、またはハイブリダイズしたｔｒａｃｒＲＮＡと協働してある構造を形成するヌクレオチド配列を含んでおり、それがＲＧＮ分子によって認識される。さまざまな実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、約８～約３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含む。特別な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ反復配列は、８～３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含む。例えばＣＲＩＳＰＲ反復配列として、長さが約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドが可能である。特別な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列は、長さが８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とそれに対応するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントにしたとき、５０％と９９％の間、またはそれよりも大きく（約５０％以上、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれよりも大きい値が含まれるが、それに限定されない）である。特別な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とそれに対応するｔｒａｃｒＲＮＡ配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントにしたとき、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きい値である。

【0152】

いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡはｔｒａｃｒＲＮＡ分子をさらに含む。トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡまたはｔｒａｃｒＲＮＡ分子は、ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列にハイブリダイズするのに十分な相補性を持つ領域（それを本明細書では抗反復領域と呼ぶ）を含むヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ分子はさらに、二次構造（例えばステム－ループ）を持つ領域を含むか、それに対応するｃｒＲＮＡにハイブリダイズしたときに二次構造を形成する。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡのうちでＣＲＩＳＰＲ反復構造と完全に、または部分的に相補的な領域は、この分子の５´末端に位置し、ｔｒａｃｒＲＮＡの３´末端は二次構造を含む。二次構造のこの領域は一般にいくつかのヘアピン構造を含み、その中には抗反復領域に隣接して見られるネクサスヘアピンが含まれる。ｔｒａｃｒＲＮＡの３´末端には末端ヘアピンが存在することがしばしばある。それは構造と数がさまざまである可能性があるが、ＧＣリッチでＲｈｏとは独立な転写ターミネータヘアピンと、それに続く３’末端のＵのストリングをしばしば含む。例えばＢｒｉｎｅｒ ｅｔ ａｌ． （２０１４） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ ５６：３３３－３３９、Ｂｒｉｎｅｒ ａｎｄ Ｂａｒｒａｎｇｏｕ （２０１６） Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｒｏｔｏｃ； ｄｏｉ： １０．１１０１／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９０９０２、およびアメリカ合衆国出願公開第２０１７／０２７５６４８号（それぞれの全体が参照によって本明細書に組み込まれている）を参照されたい。

【0153】

さまざまな実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡのうちでＣＲＩＳＰＲ反復配列と完全に、または部分的に相補的な抗反復配列は、約６～約３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドを含む。例えばｔｒａｃｒＲＮＡ抗反復配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列の間で塩基対を形成する領域として、長さが約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドが可能である。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ抗反復配列とＣＲＩＳＰＲ反復配列の間で塩基対を形成する領域は、長さが６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個、またはそれよりも多いヌクレオチドである。特別な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列と完全に、または部分的に相補的なｔｒａｃｒＲＮＡの抗反復配列は長さが約１０個のヌクレオチドである。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡのうちでＣＲＩＳＰＲ反復配列と完全に、または部分的に相補的な抗反復配列は、長さが１０個のヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とそれに対応するｒａｃｒＲＮＡ抗反復配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントにしたとき、５０％と９９％の間、またはそれよりも大きい（約５０％以上、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれよりも大きな値が含まれるが、それに限定されない）。特別な実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ反復配列とそれに対応するｔｒａｃｒＲＮＡ抗反復配列の間の相補性の程度は、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適なアラインメントにしたとき、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれよりも大きい値である。

【0154】

さまざまな実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ全体は、約６０個のヌクレオチド～約２１０個超のヌクレオチドを含む。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡ全体は、６０個のヌクレオチド～２１０個超のヌクレオチドを含む。例えばｔｒａｃｒＲＮＡとして、長さが約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１０５、約１１０、約１１５、約１２０、約１２５、約１３０、約１３５、約１４０、約１５０、約１６０、約１７０、約１８０、約１９０、約２００、約２１０個、またはそれよりも多いヌクレオチドが可能である。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０個、またはそれよりも多いヌクレオチドである。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが約１００～約２００個のヌクレオチドである（長さが約９５、約９６、約９７、約９８、約９９、約１００、約１０５、約１０６、約１０７、約１０８、約１０９、および約１００個のヌクレオチドが含まれる）。特別な実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡは、長さが１００～１１０個のヌクレオチド（長さが９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、および１１０個のヌクレオチドが含まれる）である。

【0155】

ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼと複合体を形成し、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを標的配列に結合させる。ガイドＲＮＡがＲＧＮと複合体を形成する場合には、その結合したＲＧＮは標的配列の位置に一本鎖または二本鎖の切断を導入する。標的配列が切断された後、この切断を修復することができるため、修復プロセスの間に標的配列のＤＮＡ配列が改変される。本明細書で提供されるのは、デアミナーゼに連結されたＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ヌクレアーゼ不活性またはニッカーゼのいずれか）の変異体バリアントを用いて宿主細胞のＤＮＡの中の標的配列を改変する方法である。ヌクレアーゼ活性が不活性にされるか顕著に低下したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼの変異体バリアントはＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと呼ぶことができる。というのもこのポリペプチドは標的配列に結合できるが、必ずしも標的配列を切断しないからである。二本鎖核酸分子の単一の鎖だけを切断することのできるＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを本明細書ではニッカーゼと呼ぶ。

【0156】

ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが結合した標的ヌクレオチド配列は、ＲＧＤＢＰと会合したガイドＲＮＡとハイブリダイズする。ＲＧＤＢＰがヌクレアーゼ活性（ニッカーゼとしての活性が含まれる）を持つ（すなわちＲＧＮである）場合には、標的配列をその後切断することができる。

【0157】

ガイドＲＮＡとして、単一ガイドＲＮＡまたは二重ガイドＲＮＡ系が可能である。単一ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの単一の分子上にｃｒＲＮＡと場合によりｔｒａｃｒＲＮＡを含むのに対し、二重ガイドＲＮＡ系は、２つの別々のＲＮＡ分子上に存在していてｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列の少なくとも一部とｔｒａｃｒＲＮＡの少なくとも一部（ｃｒＲＮＡのＣＲＩＳＰＲ反復配列と完全に、または部分的に相補的なものが可能である）を通じて互いにハイブリダイズされたｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ガイドＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである実施形態のいくつかでは、ｃｒＲＮＡと場合によるｔｒａｃｒＲＮＡはリンカーヌクレオチド配列によって分離される。

【0158】

一般に、リンカーヌクレオチド配列は、リンカーヌクレオチド配列のヌクレオチドの中に二次構造が形成されることを避けるため、またはリンカーヌクレオチド配列のヌクレオチドを含む二次構造が形成されることを避けるため、相補的な塩基を含まない配列である。いくつかの実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間のリンカーヌクレオチド配列は、長さが少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２個、またはそれよりも多いヌクレオチドである。特別な実施形態では、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの間のリンカーヌクレオチド配列は、長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２個、またはそれよりも多いヌクレオチドである。特別な実施形態では、単一ガイドＲＮＡのリンカーヌクレオチド配列は、長さが少なくとも４個のヌクレオチドである。特別な実施形態では、単一ガイドＲＮＡのリンカーヌクレオチド配列は、長さが４個のヌクレオチドである。

【0159】

ある実施形態では、ガイドＲＮＡは、標的細胞、オルガネラ、または胚の中にＲＮＡ分子として導入することができる。ガイドＲＮＡはインビトロで転写すること、または化学的に合成することができる。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、細胞、オルガネラ、または胚の中に導入される。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列はプロモータ（例えばＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータ）に機能可能に連結される。プロモータとして、天然プロモータ、またはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列にとって異種のプロモータが可能である。いくつかの実施形態では、プロモータは、２０２１年６月１１日に出願されたアメリカ合衆国仮出願第６３／２０９，６６０号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されているプロモータ（配列番号３４８～３５７が含まれる）のいずれか１つ、またはその活性なバリアントまたは断片（配列番号３４８～３５７のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも多く一致する配列を持つプロモータが含まれる）から選択される。

【0160】

さまざまな実施形態では、ガイドＲＮＡはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチドに結合しており、本明細書に記載されているように、標的細胞、オルガネラ、または胚の中にリボ核タンパク質複合体として導入することができる。

【0161】

ガイドＲＮＡは、会合したＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼを、標的ヌクレオチド配列へのガイドＲＮＡのハイブリダイゼーションを通じて興味ある特定の標的ヌクレオチド配列に向かわせる。標的ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両者の組み合わせを含むことができ、一本鎖または二本鎖が可能である。標的ヌクレオチド配列として、ゲノムＤＮＡ（すなわち染色体ＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、またはＲＮＡ分子（例えばメッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、小さな干渉性ＲＮＡ）が可能である。標的ヌクレオチド配列は、インビトロで、または細胞内でＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼに結合すること（そしていくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドによって切断すること）ができる。ＲＧＤＢＰが標的とする染色体配列として、核、プラスチド、またはミトコンドリアの染色体配列が可能である。いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列は標的ゲノムの中に１つだけである。

【0162】

いくつかの実施形態では、標的ヌクレオチド配列はプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接している。ＰＡＭは一般に、標的ヌクレオチド配列から約１～約１０個のヌクレオチド以内の位置にあり、その中には、標的ヌクレオチド配列からヌクレオチド約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個が含まれる。特別な実施形態では、ＰＡＭは標的ヌクレオチド配列から１～１０個のヌクレオチド以内の位置にあり、その中には、標的ヌクレオチド配列からヌクレオチド約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０個が含まれる。特に断わらない限り、ＰＡＭは一般に、標的ヌクレオチド配列にその５´末端または３´末端の位置で隣接している。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは標的配列の３´である。一般に、ＰＡＭは約２～６個のヌクレオチドからなるコンセンサス配列だが、特別な実施形態では、長さが１、２、３、４、５、６、７、８、９個、またはより多いヌクレオチドである。

【0163】

ＰＡＭは、所与のＲＧＤＢＰまたはＲＧＮがどの配列を標的にできるかを制限する。というのもＲＧＤＢＰまたはＲＧＮのＰＡＭは標的ヌクレオチド配列の近位である必要があるからである。ＲＧＮは、それに対応するＰＡＭ配列を認識すると、特定の切断部位で標的ヌクレオチド配列を切断することができる。本明細書では、切断部位は、標的ヌクレオチド配列内の２個の特定のヌクレオチドで構成されており、その間でヌクレオチド配列がＲＧＮによって切断される。切断部位は、ＰＡＭから５´方向または３´方向に向かって１番目と２番目、２番目と３番目、３番目と４番目、４番目と５番目、５番目と６番目、７番目と８番目、または８番目と９番目のヌクレオチドを含むことができる。ＲＧＮは標的ヌクレオチド配列を切断して粘着末端にすることができるため、いくつかの実施形態では、切断部位は、ポリヌクレオチドのプラス（＋）鎖上のＰＡＭからのそれらヌクレオチド２個の距離と、ポリヌクレオチドのマイナス（－）鎖上のＰＡＭからのそれらヌクレオチド２個の距離に基づいて規定される。

【0164】

ＲＧＤＢＰとＲＧＮを使用し、融合されたポリペプチド、ポリヌクレオチド、または小分子ペイロードを特定のゲノム位置に送達することができる。

【0165】

ＤＮＡ結合ポリペプチドがメガヌクレアーゼを含む実施形態では、標的配列は、４つの塩基対によって分離された一対の逆転９塩基対「半部位」を含むことができる。一本鎖メガヌクレアーゼの場合には、タンパク質のＮ末端ドメインが第１の半部位に接触し、タンパク質のＣ末端ドメインが第２の半部位に接触する。メガヌクレアーゼによる切断で４塩基対の３´オーバーハングが生じる。ＤＮＡ結合ポリペプチドがコンパクトなＴＡＬＥＮを含む実施形態では、認識配列は、Ｉ－ＴｅｖＩドメインによって認識される第１のＣＮＮＮＧＮ配列を含み、その後に長さが４～１６塩基対の非特異的スペーサ、その後にＴＡＬ－エフェクタドメインによって認識される長さが１６～２２ｂｐの第２の配列（この配列は典型的には５´Ｔ塩基を持つ）が続く。ＤＮＡ結合ポリペプチドがジンクフィンガーを含む実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは典型的には２～１０塩基対によって分離された一対の９塩基対「半部位」を含む１８－ｂｐ認識配列を認識し、ヌクレアーゼによる切断で、平滑末端、または長さがさまざまな（しばしば４塩基対の）５´オーバーハングが生じる。

【0166】

ＩＶ．融合タンパク質

【0167】

いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばヌクレアーゼ不活性なＲＧＮまたはニッカーゼＲＧＮ）は本発明のデアミナーゼに機能可能に連結される。いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼに融合したＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばヌクレアーゼ不活性なＲＧＮまたはニッカーゼＲＧＮ）を核酸分子（すなわち標的核酸分子）の特定の位置（いくつかの実施形態では、特定のゲノム遺伝子座）に向かわせて望む配列の発現を変化させることができる。いくつかの実施形態では、標的配列に融合タンパク質が結合すると核酸塩基が脱アミノ化され、その結果として１つの核酸塩基が別の核酸塩基に変換される。いくつかの実施形態では、標的配列にこの融合タンパク質が結合すると標的配列に隣接した核酸塩基が脱アミノ化される。標的配列に隣接していて本開示の組成物と方法を用いて脱アミノ化されて変異する核酸塩基として、標的核酸分子内の（ｇＲＮＡが結合した）標的配列の５´末端または３´末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基対が可能である。本開示のいくつかの側面により、（ｉ）ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばヌクレアーゼ不活性なＲＧＮポリペプチドまたはニッカーゼＲＧＮポリペプチド）；（ｉｉ）デアミナーゼポリペプチド；および場合により（ｉｉｉ）第２のデアミナーゼを含む融合タンパク質が提供される。第２のデアミナーゼは、第１のデアミナーゼと同じでもよいし、異なるデアミナーゼでもよい。いくつかの実施形態では、第１と第２のデアミナーゼの両方が本発明のシトシンデアミナーゼである。

【0168】

本開示により、さまざまな構成の融合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼポリペプチドはＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＧＮポリペプチド）のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼポリペプチドはＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＧＮポリペプチド）のＣ末端に融合される。

【0169】

いくつかの実施形態では、デアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド）はペプチドリンカーを介して互いに融合される。デアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド）の間のリンカーは融合タンパク質の編集ウインドウを決めることができ、そのことによってデアミナーゼ特異性を増大させ、オフ－ターゲット変異を減らす。特定の用途のためのデアミナーゼ活性に最適な長さと硬さを実現するため、（ＧＧＧＧＳ）_ｎと（Ｇ）_ｎの形態の非常に可撓性のあるリンカーから（ＥＡＡＡＫ）_ｎと（ＸＰ）_ｎの形態のより堅固なリンカーまでの範囲のさまざまな長さと可撓性のリンカーを使用することができる。「リンカー」という用語は、本明細書では、２つの分子または部分（例えばヌクレアーゼの結合ドメインと切断ドメイン）を連結する化学基または分子を意味する。いくつかの実施形態では、リンカーがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとデアミナーゼを接合する。いくつかの実施形態では、リンカーは、デッドまたは不活性なＲＧＮとデアミナーゼを接合する。さらなる実施形態では、リンカーは２つのデアミナーゼを接合する。いくつかの実施形態では、リンカーはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼとＵＳＰを接合する。いくつかの実施形態では、リンカーはデアミナーゼとＵＳＰを接合する。ある実施形態では、リンカーはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼデアミナーゼ融合体をＵＳＰと接合する。典型的にはリンカーは、２つの基、分子、または他の部分の間に位置するか、それら２つに隣接し、共有結合によってそれぞれに接続されているため、それら２つを接続する。いくつかの実施形態では、リンカーは１個のアミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは、長さが３～１００個のアミノ酸、例えば長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００個のアミノ酸である。より長いリンカーまたはより短いリンカーも考慮される。いくつかの実施形態では、より短いリンカーは、融合タンパク質またはそのコード配列の全体的なサイズまたは長さを小さくするのに好ましい。

【0170】

いくつかの実施形態では、リンカーは、（ＧＧＧＧＳ）_ｎ、（Ｇ）_ｎ （ＥＡＡＡＫ）_ｎ、または（ＸＰ）_ｎというモチーフを含むか、これらの任意の組み合わせを含む（ただしｎは、独立に、１と３０の間の整数である）。いくつかの実施形態では、ｎは、独立に、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０であり、２つ以上のリンカー、または２つ以上のリンカーモチーフが存在する場合には、その任意の組み合わせである。追加の適切なリンカーのモチーフとリンカーの構成は当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、適切なリンカーのモチーフと構成に含まれるのは、Ｃｈｅｎら、２０１３年（Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ． ６５（１０）：１３５７－６９（その全内容が参照によって本明細書に組み込まれている））に記載されているものである。追加の適切なリンカー配列は当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を含む。

【0171】

いくつかの場合には、細胞ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）がシトシンの脱アミノ化から生じるＵ：Ｇヘテロ二本鎖ＤＮＡを認識することで、ＤＮＡからウラシルを除去して脱塩基部位を残す触媒となることができ、そのことにより塩基－除去修復を開始させ、主要な一般的な結果としてＵ：Ｇ対をＣ：Ｇ対に戻すが、Ｃ＞Ｇ変異またはＣ＞Ａ変異のほか、ｉｎｄｅｌ（挿入または欠失）形成も起こることが知られている。シトシン塩基エディタによって生じたウラシルをシトシンに戻すウラシルＤＮＡグリコシラーゼによる塩基除去修復を阻止するか減らすため、いくつかの実施形態では、シトシン塩基エディタ融合タンパク質はウラシル安定化ポリペプチド（ＵＳＰ）（ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）またはＵＳＰ２など）をさらに含む。

【0172】

本明細書では、「ウラシル安定化タンパク質」、「ウラシル安定化ポリペプチド」、および「ＵＳＰ」という用語は、ウラシル安定化活性を持つポリペプチドを意味する。本明細書では、「ウラシル安定化活性」という用語は、ある分子（例えばポリペプチド）が、シトシンデアミナーゼによる核酸分子の中の少なくとも１つのシチジン、デオキシシチジン、またはシトシンからチミジン、デオキシチミジン、またはチミンへの変異率を、その分子（例えばウラシル安定化ポリペプチド）の不在下でのシトシンデアミナーゼによる変異率と比べて大きくする能力を意味する。作用の理論または機構に囚われないと、ＵＳＰは、複製が起こって望むＣ＞Ｔ変異の導入が可能になるのに十分な時間にわたり、シチジン、デオキシシチジン、またはシトシンという塩基の脱アミノ化を通じて生成した一本鎖ＤＮＡの中のウラシルの存在を維持することによって機能することができると考えられる。ウラシル安定化活性は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ、塩基除去修復経路、またはミスマッチ修復機構の阻害を通じて起こる可能性がある。

【0173】

本開示のシトシンデアミナーゼと、本開示のシトシンデアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質に融合させることのできるＵＳＰの非限定的な例に含まれるのは、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害剤（ＵＧＩ）（その一例が配列番号８６として示されている）と、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０２１／２１７００２号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に開示されているＵＳＰのいずれか１つ（配列番号８１として示されているＵＳＰ２が含まれる）である。

【0174】

いくつかの実施形態では、デアミナーゼ－ＤＢＤ融合タンパク質は、野生型ＵＳＰであるＵＳＰ、またはその活性な断片またはバリアントを含む。例えばいくつかの実施形態では、デアミナーゼ－ＤＢＤ融合タンパク質は、配列番号８１または８６を含むＵＳＰ、またはその活性な断片またはバリアントを含む。いくつかの実施形態では、ＵＳＰ断片は、配列番号８１または８６として示されているアミノ酸配列の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくとも９９．５％を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、デアミナーゼ－ＤＢＤ融合タンパク質は、配列番号８１または８６として示されているＵＳＰと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも多く一致する配列を持つＵＳＰを含む。

【0175】

追加の適切なＵＳＰ配列は当業者に知られており、その中に含まれるのは、例えばＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．， １９８９． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６４： １１６３－１１７１；Ｌｕｎｄｑｕｉｓｔ ｅｔ ａｌ．， １９９７． Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７２： ２１４０８－２１４１９；Ｒａｖｉｓｈａｎｋａｒ ｅｔ ａｌ．， １９９８． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２６：４８８０－４８８７；およびＰｕｔｎａｍ ｅｔ ａｌ．， １９９９． Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２８７：３３１－３４６（１９９９）（それぞれの全内容が参照によって本明細書に組み込まれている）に公開されているものである。

【0176】

いくつかの実施形態では、リンカーがデアミナーゼ－ＤＢＤ融合タンパク質をＵＳＰと接合する。いくつかの実施形態では、リンカーがデアミナーゼとＵＳＰを接合する。いくつかの実施形態では、ＵＳＰをデアミナーゼまたはデアミナーゼ－ＤＢＤ融合タンパク質に接合するリンカーは、１個のアミノ酸または複数のアミノ酸（例えばペプチドまたはタンパク質）である。いくつかの実施形態では、リンカーは、有機分子、基、ポリマー、または化学部分である。いくつかの実施形態では、リンカーは、長さが３～１００個のアミノ酸、例えば長さが３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３０～３５、３５～４０、４０～４５、４５～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１５０、または１５０～２００個のアミノ酸である。より長いリンカーまたはより短いリンカーも考慮される。いくつかの実施形態では、より短いリンカーは、融合タンパク質またはそのコード配列の全体的なサイズまたは長さを小さくするのに好ましい。特別な実施形態では、ＵＳＰをデアミナーゼまたはデアミナーゼ－ＤＢＤ融合タンパク質に接合するリンカーは、配列番号１２０として示されている配列を含む。

【0177】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される代表的な融合タンパク質の一般的なアーキテクチャは、構造として、［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＤＢＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［ＤＢＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＤＢＰ］－［ＣＯＯＨ］；または［ＮＨ_２］－［ＤＢＰ］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］を含む（ただしＤＢＰはＤＮＡ結合ポリペプチドであり、ＵＳＰはウラシル安定化ポリペプチドであり、ＮＨ_２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は３つ以上のデアミナーゼポリペプチドを含む。

【0178】

ある実施形態では、本明細書で提供される代表的な融合タンパク質の一般的なアーキテクチャは、構造として、［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；または［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；または［ＮＨ_２］－［ＲＧＮ］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］を含む（ただしＲＧＮはＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼであり、ＵＳＰはウラシル安定化ポリペプチドであり、ＮＨ_２は融合タンパク質のＮ末端であり、ＣＯＯＨは融合タンパク質のＣ末端である）。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は３つ以上のデアミナーゼポリペプチドを含む。

【0179】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、構造として、［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［ＣＯＯＨ］；または［ＮＨ_２］－［ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］を含む。「ヌクレアーゼ不活性なＲＧＮ」は任意のＲＧＮを表わすと理解すべきであり、その中には変異してヌクレアーゼ不活性になったあらゆるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は３つ以上のデアミナーゼポリペプチドを含む。

【0180】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、構造として、［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；または［ＮＨ_２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］；［ＮＨ_２］－［デアミナーゼ］－［ＵＳＰ］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＣＯＯＨ］；または［ＮＨ_２］－［ＲＧＮニッカーゼ］－［ＵＳＰ］－［デアミナーゼ］－［ＣＯＯＨ］を含む。「ＲＧＮニッカーゼ」は、変異してニッカーゼとして活性になったあらゆるＲＧＮ（あらゆるＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質が含まれる）を表わすと理解すべきである。

【0181】

いくつかの実施形態では、上記の一般的なアーキテクチャの中で使用されている「－」は、オプションのリンカー配列が存在することを示す。いくつかの実施形態では、本明細書に提示されている融合タンパク質はリンカー配列を含まない。いくつかの実施形態では、オプションのリンカー配列の少なくとも１つが存在する。

【0182】

存在していてもよい他の代表的な特徴は、局在化配列（核局在化配列、細胞質局在化配列、輸送配列（核輸送配列など）、または他の局在化配列など）のほか、融合タンパク質の溶解、精製、または検出に有用な配列タグである。本明細書で提供され、非限定的な例に含まれるのが、ビオチンカルボキシラーゼ担体タンパク質（ＢＣＣＰ）タグ、ｍｙｃタグ、カルモジュリンタグ、ＦＬＡＧタグ（例えば３ＸＦＬＡＧタグ）、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、ポリヒスチジンタグ（ヒスチジンタグまたはＨｉｓタグとも呼ばれる）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）タグ、ｎｕｓタグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）タグ、チオレドキシンタグ、Ｓタグ、Ｓｏｆｔａｇｓ（例えばＳｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３）、ストレプタグ、ビオチンリガーゼタグ、ＦｌＡｓＨ（登録商標）タグ、Ｖ５タグ、およびＳＢＰタグである適切な局在化シグナル配列とタンパク質タグの配列。追加の適切な配列は当業者には明らかであろう。

【0183】

ある実施形態では、本開示の融合タンパク質は、細胞への融合タンパク質の取り込みを容易にする少なくとも１つの細胞侵入ドメインを含む。細胞侵入ドメインは本分野で知られており、一般に、正に帯電したアミノ酸残基のストレッチ（すなわちポリカチオン性細胞侵入ドメイン）、極性アミノ酸残基と非極性アミノ酸残基が交互になったストレッチ（すなわち両親媒性細胞侵入ドメイン）、または疎水性アミノ酸残基のストレッチ（すなわち疎水性細胞侵入ドメイン）を含む（例えばＭｉｌｌｅｔｔｉ Ｆ． （２０１２） Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ Ｔｏｄａｙ １７：８５０－８６０参照）。細胞侵入ドメインの非限定的な一例は、ヒト免疫不全ウイルス１からのトランス活性化転写アクチベータ（ＴＡＴ）である。

【0184】

いくつかの実施形態では、本明細書に提示されているデアミナーゼまたは融合タンパク質は、核局在化配列（ＮＬＳ）をさらに含む。核局在化シグナル、プラスチド局在化シグナル、ミトコンドリア局在化シグナル、二重ターゲティング局在化シグナル、および／または細胞侵入ドメインは、アミノ末端（Ｎ末端）、カルボキシル末端（Ｃ末端）、または融合タンパク質の内部位置に位置させることができる。

【0185】

いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質またはデアミナーゼのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質またはデアミナーゼのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のデアミナーゼのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のデアミナーゼのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＧＮポリペプチド）のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＧＮポリペプチド）のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のデアミナーゼポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは融合タンパク質のデアミナーゼポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは１つ以上のリンカー（非限定的な例として配列番号１４８が含まれる）を介して融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳはリンカーなしで融合タンパク質に融合される。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは、本明細書に提示されているか本明細書で参照されているＮＬＳ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＮＬＳは配列番号７６または配列番号８０に示されているアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質またはデアミナーゼはそのＮ末端に配列番号７６を含み、そのＣ末端に配列番号８０を含む。

【0186】

いくつかの実施形態では、本明細書に提示されている融合タンパク質はデアミナーゼの完全長配列（例えば配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つ）を含む。しかしいくつかの実施形態では、本明細書に提示されている融合タンパク質はデアミナーゼの完全長配列を含まず、その断片だけを含む。例えばいくつかの実施形態では、本明細書に提示されている融合タンパク質はＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合）ドメインとデアミナーゼドメインをさらに含む。

【0187】

いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質はＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、そのデアミナーゼは、配列番号２、４、および６～１２のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％一致するアミノ酸配列を持つ。このような融合タンパク質の例は本明細書の実施例のセクションに記載されている。

【0188】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質は１つのデアミナーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、直接に、またはペプチドリンカーを介して機能可能に連結された少なくとも２つのデアミナーゼポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は１つのデアミナーゼポリペプチドを含み、第２のデアミナーゼポリペプチドが融合タンパク質と同時に発現する。

【0189】

本明細書では、デアミナーゼと、ＲＧＤＢＰと、単一のガイドまたは二重ガイドＲＮＡとしてのガイドＲＮＡ（まとめてｇＲＮＡとも呼ぶ）を含む融合タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体も提供される。

【0190】

Ｖ．デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするヌクレオチド

【0191】

本開示により、本開示のデアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９）が提供される。本開示により、デアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮ）を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドがさらに提供される。本開示により、デアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドがさらに提供される。このようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとして、ＲＧＮまたはＲＧＮバリアントが可能である。タンパク質バリアントとして、ヌクレアーゼ－不活性、またはニッカーゼが可能である。ＲＧＮとして、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓタンパク質、またはその活性なバリアントまたは断片が可能である。配列番号７４と７５は、それぞれＲＧＮとニッカーゼＲＧＮバリアントの非限定的な例である。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓヌクレアーゼの例は本分野で周知であり、同様の対応する変異が変異体バリアントを創出することができ、それはニッカーゼ、またはヌクレアーゼ不活性でもある。

【0192】

本発明の一実施形態により、ＲＧＤＢＰと本明細書に記載されているデアミナーゼ（配列番号２、４、および６～１２、またはそのバリアント）を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの実施形態では、第２のポリヌクレオチドは、興味あるヌクレオチド配列を標的にするため、ＲＧＤＢＰが必要とするガイドＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、ガイドＲＮＡと融合タンパク質は同じポリヌクレオチドによってコードされる。

【0193】

「ポリヌクレオチド」という用語の使用は、ＤＮＡを含むポリヌクレオチドに本開示を限定する意図はないが、そのようなＤＮＡポリヌクレオチドが考慮される。当業者は、ポリヌクレオチドに、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）（例えばｍＲＮＡ）と、リボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの組み合わせを含めることが可能であることを認識しているであろう。このようなデオキシリボヌクレオチドとリボヌクレオチドには天然分子と合成類似体の両方が含まれる。本明細書に開示されているポリヌクレオチドにはあらゆる形態の配列も包含され、その非限定的な例に含まれるのは、一本鎖形態、二本鎖形態、ステムとループ構造、環状形態（例えば環状ＲＮＡを含む）などである。

【0194】

本発明の一実施形態は、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％一致する配列を含む核酸分子であり、その核酸分子はシトシンデアミナーゼ活性を持つデアミナーゼをコードしている。核酸分子は異種のプロモータまたはターミネータをさらに含むことができる。核酸分子は融合タンパク質をコードすることができ、その中のコードされたデアミナーゼは、ＤＮＡ結合ポリペプチドに、場合により第２のデアミナーゼに、そして場合によりＵＳＰに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸分子は融合タンパク質をコードし、その中のコードされたデアミナーゼは、ＲＧＮに、場合により第２のデアミナーゼに、そして場合によりＵＳＰに機能可能に連結されている。

【0195】

いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含む核酸分子は、興味ある生物の中で発現させるためにコドンが最適化されている。「コドンが最適化された」コード配列は、特定の宿主細胞の好ましいコドンの使用頻度または転写条件を模倣するように設計されたコドン使用頻度を持つ配列をコードするポリヌクレオチドである。核酸レベルで１個以上のコドンが変化しているが翻訳されるアミノ酸配列は変化していない結果として、その特定の宿主細胞または生物における発現が増加する。核酸分子の全体または一部についてコドンを最適化することができる。広い範囲の生物について、好ましい情報を提供するコドン表とそれ以外の参考文献を本分野で入手することができる（植物が好むコドンの利用に関しては、例えばＣａｍｐｂｅｌｌ ａｎｄ Ｇｏｗｒｉ （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ． ９２：１－１１を参照されたい）。本分野では、植物が好む遺伝子を合成するための方法を利用することができる。例えばアメリカ合衆国特許第５，３８０，８３１号と第５，４３６，３９１号、およびＭｕｒｒａｙ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：４７７－４９８を参照されたい（参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0196】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているデアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを発現カセットに入れて提供し、インビトロで発現させるか、興味ある細胞、オルガネラ、胚、または生物の中で発現させる。カセットは、デアミナーゼをコードするポリヌクレオチドに、および／またはデアミナーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド、および場合により第２のデアミナーゼを含む融合タンパク質に、および／またはポリヌクレオチドの発現を可能にする本明細書に提示のｇＲＮＡに機能可能に連結された５´調節配列と３´調節配列を含むことができる。カセットは、その生物に入れて同時形質転換するための少なくとも１つの追加の遺伝子または遺伝子エレメントを追加して含むことができる。追加の遺伝子またはエレメントが含まれている場合には、これらの要素は機能可能に連結されている。「機能可能に連結された」という表現は、２つ以上のエレメントの間の機能的連結を意味することが想定されている。例えばプロモータと興味あるコード領域（例えばデアミナーゼ、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド、および／またはｇＲＮＡをコードする領域）の間の機能可能な連結は、興味あるコード領域の発現を可能にする機能可能な連結である。機能可能に連結されたエレメントは連続していても不連続でもよい。機能可能に連結されたは、２つのタンパク質コード領域の接合を意味するのに使用されるときには、それらコード領域が同じリーディングフレーム内にあることが想定されている。いくつかの実施形態では、追加の遺伝子またはエレメントは複数の発現カセット上に提供される。例えば本開示のデアミナーゼをコードするヌクレオチド配列は、単独で、または融合タンパク質の一要素として、１つの発現カセット上に存在することができる一方で、ｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は別の発現カセット上に存在することができる。別の一例は、第１の発現カセット上の本開示のデアミナーゼだけをコードするヌクレオチド配列、デアミナーゼを含む融合タンパク質をコードする第２の発現カセット、および第３の発現カセット上のｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を持つことができる。調節領域の転写調節下にあるポリヌクレオチドを挿入するため複数の制限部位および／または組み換え部位を持つような発現カセットが提供される。選択マーカー遺伝子を含む発現カセットも存在することができる。

【0197】

発現カセットは、転写の５´→３´方向に向かって、興味ある生物の中で機能する転写（といくつかの実施形態では翻訳）の開始領域（すなわちプロモータ）、興味あるデアミナーゼをコードするポリヌクレオチド、および転写（といくつかの実施形態では翻訳）の終止領域（すなわち終止領域）を含む。本発明のプロモータは、宿主細胞の中でコード配列の発現を命令または駆動することができる。これら調節領域（例えばプロモータ、転写調節領域、および転写終止領域）は、宿主細胞にとって、または互いに、内在性または異種であることが可能である。本明細書では、配列に関する「異種の」は、外来種に由来する配列であるか、同じ種に由来する場合には、人為的な介入によって組成および／またはゲノム遺伝子座の中の天然の形態から実質的に改変されている配列である。本明細書では、キメラ遺伝子は、コード配列として、このコード配列にとって異種の転写開始領域に機能可能に連結されたコード配列を含む。

【0198】

便利な終止領域（例えばオクトピンシンターゼ終止領域とノパリンシンターゼ終止領域）をＡ．ツメファシエンスのＴｉプラスミドから入手することができる。Ｇｕｅｒｉｎｅａｕ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２６２：１４１－１４４；Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ （１９９１） Ｃｅｌｌ ６４：６７１－６７４；Ｓａｎｆａｃｏｎ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． ５：１４１－１４９；Ｍｏｇｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１２６１－１２７２；Ｍｕｎｒｏｅ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｇｅｎｅ ９１：１５１－１５８；Ｂａｌｌａｓ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １７：７８９１－７９０３；およびＪｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ． （１９８７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １５：９６２７－９６３９も参照されたい。

【0199】

追加の調節シグナルの非限定的な例に含まれるのは、転写開始部位、オペレータ、アクチベータ、エンハンサ、他の調節エレメント、リボソーム結合部位、開始コドン、終止シグナルなどである。例えばアメリカ合衆国特許第５，０３９，５２３号と第４，８５３，３３１号；ＥＰＯ０４８０７６２Ａ２；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， ｅｄ． Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州）（今後は「Ｓａｍｂｒｏｏｋ １１」と呼ぶ）；Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ． （１９８０） Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ （Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州と、これらの中で引用されている参考文献を参照されたい。

【0200】

発現カセットを用意する際には、さまざまなＤＮＡ断片を操作し、適切な向きと、必要に応じて適切なリーディングフレームにされたＤＮＡ配列が提供されるようにする。この目的に向け、アダプタまたはリンカーを用いてＤＮＡ断片を接合すること、または便利な制限部位の提供、余分なＤＮＡの除去、制限部位の除去などのための他の操作を含めることができる。この目的で、インビトロの突然変異誘発、プライマーの修復、制限、アニーリング、再置換（例えば転位（トランジション）と転換（トランスバージョン））を含めることができる。

【0201】

本発明を実施するのに多数のプロモータを使用することができる。プロモータは、望む結果に基づいて選択することができる。核酸を、構成的プロモータ、誘導性プロモータ、増殖段階特異的プロモータ、細胞タイプ特異的プロモータ、組織選択的プロモータ、組織特異的プロモータ、または他のプロモータと組み合わせ、興味ある生物の中で発現させることができる。例えばＷＯ９９／４３８３８と、アメリカ合衆国特許第８，５７５，４２５号；第７，７９０，８４６号；第８，１４７，８５６号；第８，５８６８３２号；第７，７７２，３６９号；第７，５３４，９３９号；第６，０７２，０５０号；第５，６５９，０２６号；第５，６０８，１４９号；第５，６０８，１４４号；第５，６０４，１２１号；第５，５６９，５９７号；第５，４６６，７８５号；第５，３９９，６８０号；第５，２６８，４６３号；第５，６０８，１４２号；および第６，１７７，６１１号（これらは参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されているプロモータを参照されたい。

【0202】

植物の中で発現させるため、構成的プロモータには、ＣａＭＶ ３５Ｓプロモータ（Ｏｄｅｌｌ ｅｔ ａｌ． （１９８５） Ｎａｔｕｒｅ ３１３：８１０－８１２）；イネのアクチン（ＭｃＥｌｒｏｙ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ２：１６３－１７１）；ユビキチン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８９） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １２：６１９－６３２と、Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． １８：６７５－６８９）；ｐＥＭＵ（Ｌａｓｔ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｔｈｅｏｒ． Ａｐｐｌ． Ｇｅｎｅｔ． ８１：５８１－５８８）；およびＭＡＳ （Ｖｅｌｔｅｎ ｅｔ ａｌ． （１９８４） ＥＭＢＯ Ｊ． ３：２７２３－２７３０）も含まれる。

【0203】

誘導性プロモータの例は、低酸素ストレスまたは低温ストレスによって誘導可能なＡｄｈ１プロモータ、熱ストレスによって誘導可能なＨｓｐ７０プロモータ、光によって誘導可能なＰＰＤＫプロモータとペプカルボキシラーゼプロモータである。化学的に誘導可能なプロモータも有用であり、それは例えば、薬害軽減剤によって誘導されるＩｎ２－２プロモータ（アメリカ合衆国特許第５，３６４，７８０号）、オーキシンによって誘導され、タペート組織特異的だがカルスの中でも活性なＡｘｉｇ１プロモータ（ＰＣＴ ＵＳ０１／２２１６９）、ステロイド反応性プロモータ（例えばエストロゲンによって誘導されるＥＲＥプロモータと、Ｓｃｈｅｎａ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８：１０４２１－１０４２５とＭｃＮｅｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｐｌａｎｔ Ｊ． １４（２）：２４７－２５７の中のグルココルチコイド誘導性プロモータを参照されたい）、およびテトラサイクリン誘導性プロモータとテトラサイクリン抑制性プロモータ（例えばＧａｔｚ ｅｔ ａｌ． （１９９１） Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔ． ２２７：２２９－２３７と、アメリカ合衆国特許第５，８１４，６１８号および第５，７８９，１５６号を参照されたい）である（これらは参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0204】

いくつかの実施形態では、特定の組織内で発現コンストラクトを発現させることを目的として組織特異的または組織選択的なプロモータを用いることができる。ある実施形態では、組織特異的または組織選択的なプロモータは、植物組織の中で活性である。植物の中で発生制御下にあるプロモータの例に含まれるのは、所定の組織（例えば葉、根、果実、種子、または花）の中で選択的に転写を開始するプロモータである。「組織特異的」プロモータは、所定の組織の中でだけ転写を開始するプロモータである。組織特異的発現は、遺伝子の構成的発現とは異なり、遺伝子調節の相互作用のレベルがいくつかあることの結果である。そのため、相同な植物種、または近縁の植物種からのプロモータを選択的に用いて特定の組織内で導入遺伝子の効果的かつ信頼性の高い発現を実現することができる。いくつかの実施形態では、発現は、組織選択的プロモータを含む。「組織選択的」プロモータは、選択的に転写を開始するが、必ずしも全面的に所定の組織の中で、または所定の組織の中だけで転写を開始するのではないプロモータである。

【0205】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているデアミナーゼをコードする核酸分子は、細胞タイプ特異的プロモータを含む。「細胞タイプ特異的」プロモータは、１つ以上の器官内のいくつかのタイプの細胞の中での発現を主に駆動するプロモータである。植物の中で機能する細胞タイプ特異的プロモータが主に活性であることのできる植物細胞のいくつかの例に含まれるのは、例えばＢＥＴＬ細胞、根、葉の中の維管束細胞、茎細胞、および幹細胞である。核酸分子は、細胞タイプ選択的プロモータも含むことができる。「細胞タイプ選択的」プロモータは、たいていは１つ以上の器官内のいくつかのタイプの細胞の中で発現を主に駆動するが、必ずしも全面的に所定の組織の中で、または所定の組織の中だけで発現を駆動するのではないプロモータである。植物の中で機能する細胞タイプ選択的プロモータが選択的に活性であることのできる植物細胞のいくつかの例に含まれるのは、例えばＢＥＬＴ細胞、根、葉の中の維管束細胞、茎細胞、および幹細胞である。

【0206】

いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードする核酸配列は、例えばインビトロでのｍＲＮＡ合成のため、ファージＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモータ配列に機能可能に連結される。このような実施形態では、インビトロで転写されたＲＮＡを精製し、本明細書に記載されている方法で使用することができる。例えばプロモータ配列として、Ｔ７プロモータ配列、Ｔ３プロモータ配列、またはＳＰ６プロモータ配列や、Ｔ７プロモータ配列、Ｔ３プロモータ配列、またはＳＰ６プロモータ配列のバリエーションが可能である。このような実施形態では、発現したタンパク質および／またはＲＮＡを精製し、本明細書に記載されているゲノム改変の方法で使用することができる。

【0207】

ある実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０ポリＡシグナルと、植物の中で機能する他のシグナル）および／または少なくとも１つの転写終止配列に連結される。いくつかの実施形態では、デアミナーゼまたは融合タンパク質をコードする配列は、本明細書の別の箇所に記載されているように、少なくとも１つの核局在化シグナル、少なくとも１つの細胞侵入ドメイン、および／またはタンパク質を特定の細胞内位置に移動させることのできる少なくとも１つのシグナルペプチドをコードする配列に連結される。

【0208】

いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、１つのベクター、または複数のベクターの中に存在する。「ベクター」は、核酸を宿主細胞の中に移す、送達する、または導入するためのポリヌクレオチド組成物を意味する。適切なベクターに含まれるのは、プラスミドベクター、ファージミド、コスミド、人工／ミニ－染色体、トランスポゾン、およびウイルスベクター（例えばレンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、追加の発現制御配列（例えばエンハンサ配列、コザック配列、ポリアデニル化配列、転写終止配列）、選択マーカー配列（例えば抗生剤耐性遺伝子）、複製起点などを含む。追加情報は、“Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ” Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、２００３、または“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ” Ｓａｍｂｒｏｏｋ ＆ Ｒｕｓｓｅｌｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州、３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， ２００１に見いだすことができる。

【0209】

いくつかの実施形態では、ベクターは、形質転換された細胞を選択するための選択マーカー遺伝子を含む。選択マーカー遺伝子は、形質転換された細胞または組織を選択するために使用される。マーカー遺伝子に含まれるのは、抗生剤耐性をコードする遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼＩＩ（ＮＥＯ）とハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）をコードする遺伝子など）のほか、除草化合物（グルホシネートアンモニウム、ブロモキシニル、イミダゾリノン、および２，４－ジクロロフェノキシ酢酸塩（２，４－Ｄ）など）に対する耐性を与える遺伝子である。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ＲＧＮなど）を含む融合タンパク質をコードする配列を含む発現カセットまたはベクターは、ｇＲＮＡをコードする配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、ｇＲＮＡをコードする配列は、興味ある生物または宿主細胞の中でｇＲＮＡを発現させるための少なくとも１つの転写制御配列に機能可能に連結される。例えばｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ（Ｐｏｌ ＩＩＩ）によって認識されるプロモータ配列に機能可能に連結させることができる。適切なＰｏｌ ＩＩＩプロモータの非限定的な例に含まれるのは、哺乳類のＵ６プロモータ、Ｕ３プロモータ、Ｈ１プロモータ、および７ＳＬ ＲＮＡプロモータと、イネのＵ６プロモータおよびＵ３プロモータである。

【0211】

示されているように、デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む発現コンストラクトを用いて興味ある生物を形質転換することができる。形質転換の方法は、ヌクレオチドコンストラクトを興味ある生物の中に導入することを含む。「導入する」とは、ヌクレオチドコンストラクトを宿主細胞の中に導入し、このコンストラクトが宿主細胞の内部にアクセスできるようにすることを意味する。本発明の方法は、ヌクレオチドコンストラクトを宿主生物の中に導入する特別な方法を必要とせず、ヌクレオチドコンストラクトが宿主生物の少なくとも１個の細胞の内部にアクセスできるだけでよい。いくつかの実施形態では、デアミナーゼまたは融合タンパク質をコードするｍＲＮＡが宿主細胞に導入される。融合タンパク質がＲＧＤＢＰを含むいくつかの実施形態では、融合タンパク質をコードするｍＲＮＡが細胞に導入されて、ｇＲＮＡがその細胞に導入される。宿主細胞として真核細胞または原核細胞が可能である。特別な実施形態では、真核細胞は、植物細胞、哺乳類細胞、または昆虫細胞である。ヌクレオチドコンストラクトを植物と他の宿主細胞に導入する方法は本分野で知られており、その非限定的な例に含まれるのは、安定に形質転換する方法、一過性に形質転換する方法、およびウイルスを媒介とする方法である。

【0212】

これらの方法により、形質転換された生物（例えば植物であり、その中には植物体全体のほか、植物の器官（例えば葉、幹、根など）、種子、植物細胞、むかご、およびこれらの胚と子孫が含まれる）が得られる。植物細胞は、分化していること、または未分化であることが可能である（例えばカルス、懸濁培養細胞、プロトプラスト、葉細胞、根細胞、師管細胞、花粉）。

【0213】

「トランスジェニック生物」または「形質転換された生物」または「安定に形質転換された」生物または細胞または組織は、本発明のデアミナーゼをコードするポリヌクレオチドが組み込まれているか一体化している生物を意味する。他の外来性または内在性の核酸配列またはＤＮＡ断片も宿主細胞の中に組み込めることが知られている。アグロバクテリウムを媒介とした形質転換とバイオリスティックを媒介とした形質転換は、植物細胞を形質転換するのに相変わらず利用されている２つの主要なアプローチである。しかし宿主細胞の形質転換は、感染、トランスフェクション、微量注入、電気穿孔、マイクロプロジェクション、バイオリスティックまたは粒子衝突、電気穿孔、シリカ／炭素繊維、超音波を媒介とすること、ＰＥＧを媒介とすること、リン酸カルシウム共沈降、ポリカチオンＤＭＳＯ技術、ＤＥＡＥデキストラン手続き、およびウイルスを媒介とすること、リポソームを媒介とすることなどによって実現できる。ウイルスを媒介としてデアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを導入することに含まれるのは、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスを媒介とした導入および発現のほか、カリモウイルス（例えばカリフラワーモザイクウイルス）、ジェミニウイルス（例えばマメ黄斑モザイクウイルス、またはトウモロコシ条斑ウイルス）、およびＲＮＡ植物ウイルス（例えばタバコモザイクウイルス）の利用である。

【0214】

形質転換のプロトコルのほか、ポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列を植物の中に導入するプロトコルは、形質転換の標的にされる宿主細胞のタイプ（例えば単子葉植物の細胞または双子葉植物の細胞）によって異なる可能性がある。形質転換の方法は本分野で知られており、その中に含まれるのは、アメリカ合衆国特許第８，５７５，４２５号；第７，６９２，０６８号；第８，８０２，９３４号；第７，５４１，５１７号（これらのそれぞれは参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている方法である。Ｒａｋｏｃｚｙ－Ｔｒｏｊａｎｏｗｓｋａ， Ｍ． （２００２） Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ． ７：８４９－８５８；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：５；Ｒｉｖｅｒａ ｅｔ ａｌ． （２０１２） Ｐｈｙｓｉｃｓ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９：３０８－３４５；Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ． （２００８） Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ４：１－１２；Ｂａｔｅｓ， Ｇ．Ｗ． （１９９９） Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １１１：３５９－３６６；Ｂｉｎｎｓ ａｎｄ Ｔｈｏｍａｓｈｏｗ （１９８８） Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ４２：５７５－６０６；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ， Ｐ． （１９９２） Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌ ２：２７５－２８１；Ｃｈｒｉｓｔｏｕ， Ｐ． （１９９５） Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ ８５：１３－２７；Ｔｚｆｉｒａ ｅｔ ａｌ． （２００４） ＴＲＥＮＤＳ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：３７５－３８３；Ｙａｏ ｅｔ ａｌ． （２００６） Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｂｏｔａｎｙ ５７：３７３７－３７４６；Ｚｕｐａｎ ａｎｄ Ｚａｍｂｒｙｓｋｉ （１９９５） Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １０７： １０４１－１０４７；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ． （２００５） Ｐｌａｎｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １：５も参照されたい；

【0215】

形質転換により、細胞の中に核酸を安定に、または一過性に組み込むことができる。「安定な形質転換」は、宿主細胞の中に導入されたヌクレオチドコンストラクトがその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、その子孫によって遺伝させることができることを意味する。「一過性の形質転換」は、ポリヌクレオチドが宿主細胞の中に導入されるがこの宿主細胞のゲノムには組み込まれないことを意味する。

【0216】

葉緑体を形質転換する方法は本分野で知られている。例えばＳｖａｂ ｅｔ ａｌ． （１９９０） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７：８５２６－８５３０；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ （１９９３） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：９１３－９１７；Ｓｖａｂ ａｎｄ Ｍａｌｉｇａ （１９９３） ＥＭＢＯ Ｊ． １２：６０１－６０６を参照されたい。この方法は、選択マーカーを含有するＤＮＡを粒子銃で送達することに頼っており、相同組み換えを通じてそのＤＮＡをプラスチドのゲノムに向かわせる。それに加え、プラスチドの形質転換は、プラスチドが運ぶサイレントな導入遺伝子を、核がコードするプラスチド誘導型ＲＮＡポリメラーゼの組織選択的発現によって交差活性化することによって実現できる。このような系は、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ． （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：７３０１－７３０５に報告されている。

【0217】

形質転換された細胞は従来のやり方に従ってトランスジェニック生物（植物など）の中に入れて増殖させることができる。例えばＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４を参照されたい。次いでこれらの植物を成長させ、同じ形質転換された株、または異なる株を用いて受粉させ、得られたハイブリッドの中からデアミナーゼまたは融合タンパク質ポリヌクレオチドを持つものを同定する。２世代以上増殖させてそのデアミナーゼまたは融合タンパク質ポリヌクレオチドが安定に維持されて遺伝することを確認した後、種子を回収してそのデアミナーゼまたは融合タンパク質ポリヌクレオチドの存在を確認することができる。このようにして、本発明により、本発明のヌクレオチドコンストラクト（例えば本発明の発現カセット）がゲノムの中に安定に組み込まれた形質転換種子（「トランスジェニック種子」とも呼ばれる）が提供される。

【0218】

いくつかの実施形態では、形質転換された細胞は生物の中に導入される。これらの細胞はその生物に由来してもよく、その場合には、細胞は生体外アプローチで形質転換される。

【0219】

本明細書に提示されている配列を用いて任意の植物種（その非限定的な例に、単子葉植物と双子葉植物が含まれる）を形質転換することができる。興味ある植物の非限定的な例に含まれるのは、コーン（トウモロコシ）、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、木綿、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびナタネ、アブラナ属の種、アルファルファ、ライムギ、雑穀、ベニバナ、ピーナツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴ、オリーブ、パパイヤ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、アーモンド、エンバク、野菜、装飾植物、および針葉樹である。

【0220】

野菜の非限定的な例に含まれるのは、トマト、レタス、グリーンピース、ライマメ、エンドウマメ、およびキュウリ属のメンバー（キュウリ、カンタループ、およびマスクメロンなど）である。装飾植物の非限定的な例に含まれるのは、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクである。本発明の植物は、作物（例えばトウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、木綿、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）であることが好ましい。

【0221】

本明細書では、植物という用語に含まれるのは、植物細胞、植物プロトプラスト、植物を再生させることのできる植物細胞組織培養物、植物カルス、植物の集団、および植物内で完全であるか植物の一部（胚、花粉、胚珠、種子、葉、花、枝、果実、仁、穂、穂軸、殻、茎、根、根冠、葯など）である植物細胞である。穀粒は、農作物栽培者が増殖または生殖以外の目的で生産した成熟した種子を意味する。再生した植物の子孫、バリアント、および変異体も本発明の範囲に含まれるが、これらの部分が、導入されたポリヌクレオチドを含んでいることが条件である。さらに、本明細書に開示されている配列を保持している加工された植物製品または副生成物（例えば大豆粕）も提供される。

【0222】

いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて任意の真核生物種を形質転換する。真核生物種の非限定的な例に含まれるのは、動物（例えば哺乳類、昆虫、魚類、鳥類、および爬虫類）、菌類、アメーバ、藻類、および酵母である。いくつかの実施形態では、デアミナーゼ、融合タンパク質、および／またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを用いて任意の原核生物種を形質転換する。原核生物種の非限定的な例に含まれるのは、古細菌と細菌（例えばバシラス属の種、クレブシエラ属の種、ストレプトマイセス属の種、リゾビウム属の種、大腸菌属の種、シュードモナス属の種、サルモネラ属の種、赤痢菌属の種、ビブリオ属の種、エルシニア属の種、マイコプラズマ属の種、アグロバクテリウム属の種、およびラクトバシラス属の種）である。

【0223】

いくつかの実施形態では、ウイルスと非ウイルスに基づく従来からの遺伝子導入法を利用して核酸を哺乳類の細胞または標的組織に導入する。このような方法を利用して、本発明のデアミナーゼまたは融合タンパク質をコードする核酸と、場合によりｇＲＮＡを培養物または宿主生物の中の細胞に投与することができる。非ウイルスベクター送達系に含まれるのは、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば本明細書に記載されているベクターの転写産物）、裸の核酸、および送達ビヒクル（リポソームなど）との複合体にされた核酸である。ウイルスベクター送達系に含まれるのはＤＮＡウイルスとＲＮＡウイルスであり、これらのウイルスは細胞に送達された後にエピソーマルゲノムまたは組み込まれたゲノムを持つ。非限定的な例に含まれるのは、カリモウイルス（例えばカリフラワーモザイクウイルス）、ジェミニウイルス（例えばマメ黄斑モザイクウイルス、またはトウモロコシ条斑ウイルス）、およびＲＮＡ植物ウイルス（例えばタバコモザイクウイルス）を用いたベクターである。遺伝子療法の手続きの総説に関しては、Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６： ８０８－ ８１３ （１９９２）；Ｎａｂｅｌ ＆ Ｆｅｉｇｎｅｒ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：２１１－２１７ （１９９３）；Ｍｉｔａｎｉ ＆ Ｃａｓｋｅｙ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６２－１６６ （１９９３）；Ｄｉｌｌｏｎ， ＴＩＢＴＥＣＨ １１：１６７－１７５ （１９９３）；Ｍｉｌｌｅｒ， Ｎａｔｕｒｅ ３５７：４５５－４６０ （１９９２）；Ｖａｎ Ｂｒｕｎｔ， Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６（１０）： １１４９－１１５４ （１９８８）；Ｖｉｇｎｅ， Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ ８：３５－３６ （１９９５）；Ｋｒｅｍｅｒ ＆ Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ， Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ ５１（１）：３１－４４ （１９９５）； Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｄｏｅｒｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｏｈｍ （ｅｄｓ） （１９９５）の中のＨａｄｄａｄａ ｅｔ ａｌ．；およびＹｕ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：１３－２６ （１９９４） を参照されたい。

【0224】

核酸の非ウイルス送達法に含まれるのは、リポフェクション、アグロバクテリウムを媒介とした形質転換、ヌクレオフェクション、微量注入、バイオリスティック、ウイロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸の複合体、裸のＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強式取り込みである。リポフェクションは、例えばアメリカ合衆国特許第５，０４９，３８６号、第４，９４６，７８７号；および第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬が市販されている（例えばＴｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）とＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性脂質と中性脂質に含まれるのは、ＦｅｉｇｎｅｒによるＷＯ９１／１７４２４；ＷＯ９１／１６０２４の脂質である。送達は、細胞（例えばインビトロまたは生体外の投与）または標的組織（例えば生体内投与）に対してなすことができる。脂質：核酸複合体の調製は、標的とされるリポソーム（イムノ脂質複合体など）の調製を含め、当業者に周知である（例えばＣｒｙｓｔａｌ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７０： ４０４－４１０ （１９９５）；Ｂｌａｅｓｅ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ． ２：２９１－２９７ （１９９５）；Ｂｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：３８２－３８９ （１９９４）；Ｒｅｍｙ ｅｔ ａｌ．， Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ． ５：６４７－６５４ （１９９４）；Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．， Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７１０－７２２ （１９９５）；Ａｈｍａｄ ｅｔ ａｌ．， Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ５２：４８１７－４８２０ （１９９２）；アメリカ合衆国特許第４，１８６，１８３号、第４，２１７，３４４号、第４，２３５，８７１号、第４，２６１，９７５号、第４，４８５，０５４号、第４，５０１，７２８号、第４，７７４，０８５号、第４，８３７，０２８号、および第４，９４６，７８７号を参照されたい）。

【0225】

核酸の送達にＲＮＡウイルスまたはＤＮＡウイルスに基づく系を用いるというのは、ウイルスを体内の特定の細胞に向かわせてウイルスのペイロードを核に輸送するための高度に進化した方法を利用することである。ウイルスベクターは患者に直接投与することができる（生体内）。あるいはウイルスベクターを用いてインビトロで細胞を処理し、この改変された細胞を場合によっては患者に投与することができる（生体外）。ウイルスに基づく従来の系には、遺伝子を輸送するためのレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、および単純ヘルペスウイルスベクターを含めることができよう。宿主のゲノムへの組み込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスによる遺伝子輸送法を用いることによって可能になり、その結果として挿入された導入遺伝子がしばしば長期にわたって発現する。それに加え、大きな遺伝子導入効率が、異なる多くのタイプの細胞と標的組織で観察されてきた。

【0226】

レトロウイルスの指向性は、外来のエンベロープタンパク質を組み込み、標的細胞の潜在的な標的集団を増殖させることによって変えることができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に遺伝子導入または感染することのできるレトロウイルスベクターであり、典型的には高いウイルス力価を生み出す。したがってレトロウイルス遺伝子輸送系の選択は、標的組織に依存すると考えられる。レトロウイルスベクターは、シス作用性の長い末端反復からなり、６～１０ｋｂまでの外来配列をパッケージする能力を持つ。ベクターの複製とパッケージングには最小のシス作用性ＬＴＲで十分であり、このベクターを用いて治療遺伝子を標的細胞の中に組み込み、導入遺伝子を恒久的に発現させる。広く使用されているレトロウイルスベクターに含まれるのは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、ギボン白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に基づくベクターと、これらの組み合わせである（例えばＢｕｃｈｓｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：２７３１－２７３９ （１９９２）；Ｊｏｈａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６６：１６３５－１６４０ （１９９２）；Ｓｏｍｍｎｅｒｆｅｌｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌ． １７６：５８－５９ （１９９０）；Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：２３７４－２３７８ （１９８９）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６５：２２２０－２２２４ （１９９１）；ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００を参照されたい）。

【0227】

一過性発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づく系を用いることができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くのタイプの細胞で非常に高い遺伝子導入効率が可能であり、細胞分裂を必要としない。このようなベクターを用いて高力価と高い発現レベルが得られている。このベクターは、比較的簡単な系の中で大量に作製することができる。例えば核酸とペプチドをインビトロで作製するため、そして生体内と生体外の遺伝子治療手続きのため、アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターを用いて細胞に標的核酸を導入することもできる（例えばＷｅｓｔ ｅｔ ａｌ．， Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １６０：３８－４７ （１９８７）；アメリカ合衆国特許第４，７９７，３６８号；ＷＯ９３／２４６４１；Ｋａｔｉｎ， Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：７９３－８０１ （１９９４）；Ｍｕｚｙｃｚｋａ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｉｎｖｅｓｔ． ９４：１３５１ （１９９４）を参照されたい）。組み換えＡＡＶベクターの構築は多数の刊行物に記載されており、そうした刊行物に含まれるのは、アメリカ合衆国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ５：３２５１－３２６０ （１９８５）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ， ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ． Ｃｅｌｌ． Ｂｉｏｌ． ４： ２０７２－２０８１ （１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ＆ Ｍｕｚｙｃｚｋａ， ＰＮＡＳ ８１：６４６６－６４７０ （１９８４）；およびＳａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． ６３：０３８２２－３８２８ （１９８９）である。典型的にはパッケージング細胞を用い、宿主細胞に感染することのできるウイルス粒子を形成する。このような細胞に含まれるのは、２９３細胞（アデノウイルスをパッケージする）と、ψＪ２細胞またはＰＡ３１７細胞（レトロウイルスをパッケージする）である。

【0228】

遺伝子療法で用いられるウイルスベクターは、通常は、核酸ベクターをウイルス粒子の中にパッケージする細胞系を生成させることによって作製する。ベクターは、典型には、パッケージングとその後の宿主への組み込みに必要な最小ウイルス配列を含有しており、他のウイルス配列は、発現させるポリヌクレオチドのための発現カセットによって置き換えられる。失われるウイルス機能は、典型的には、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば遺伝子療法で用いられるＡＡＶベクターは、典型的には、パッケージングと宿主ゲノムへの組み込みに必要なＡＡＶゲノムからのＩＴＲ配列だけを有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子（すなわちｒｅｐとｃａｐ）をコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有している細胞系の中にパッケージされる。

【0229】

細胞系には、ヘルパーとしてアデノウイルスを感染させることもできる。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製と、ヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列が欠けているため大量にはパッケージされない。アデノウイルスでの汚染は、例えばアデノウイルスのほうがＡＡＶよりも感受性である熱処理によって減らすことができる。核酸を細胞に送達する追加の方法が当業者に知られている。例えばアメリカ合衆国特許出願公開第２００３／００８７８１７号を参照されたい（参照によって本明細書に組み込まれている）。

【0230】

理想的には、本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質のコード配列と、その融合タンパク質を標的とする対応するガイドＲＮＡをすべて、単一のＡＡＶベクターにパッケージすることができる。ＡＡＶベクターの一般に受け入れられているサイズ制限は４．７ ｋｂだが、パッキング効率が低下する犠牲を払ってより大きなサイズを考慮することができる。融合タンパク質とそれに対応するガイドＲＮＡの両方のための発現カセットをＡＡＶベクターに確実にフィットさせることができるようにするため、ＲＧＮの新しい活性な欠失バリアント（配列番号９７、９８、１０６、および１０７として示されているものなど）、またはデアミナーゼの活性な欠失バリアント（配列番号２、４、および６として示されている本明細書に記載のものなど）を用いることができる。アミノ酸配列、したがってＲＧＮおよび／または融合タンパク質のデアミナーゼのコード配列を短くすることに加え、ＲＧＮとデアミナーゼを連結するペプチドリンカーも短くすることができる。ＵＳＰ（存在する場合）と、そのＵＳＰとＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質を接続するリンカーを短くすることができる。最後に、遺伝子エレメント（プロモータ、エンハンサ、および／またはターミネータなど）も欠失分析を通じて操作し、それぞれが機能するのに必要な最小サイズを求めることができる。本発明は、ＡＡＶベクター送達を通じたインビトロでの標的を絞った塩基編集のために前記融合タンパク質を用いる方法も教示する。

【0231】

いくつかの実施形態では、宿主細胞は本明細書に記載されている１つ以上のベクターを用いて一過性または非一過性にトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、細胞は、対象で自然に起こるようにトランスフェクトされる。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は対象から採取される。

【0232】

いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は真核細胞である。いくつかの実施形態では、真核細胞は動物細胞（例えば哺乳類、昆虫、魚類、鳥類、および爬虫類）である。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞はヒト細胞である。いくつかの実施形態では、トランスフェクトされる細胞は、造血系起源の細胞である免疫細胞（すなわち自然免疫系または適応免疫系の細胞）などであり、その非限定的な例に含まれるのは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞である。

【0233】

いくつかの実施形態では、細胞は、対象から採取された細胞に由来する（細胞系など）。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は原核細胞である。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系は真核細胞である。さらなる実施形態では、細胞または細胞系は、昆虫、鳥類、植物、または菌類の種に由来する。いくつかの実施形態では、細胞または細胞系として、哺乳類（例えばヒト、サル、マウス、ウシ、ブタ、ヤギ、ハムスター、ラット、ネコ、またはイヌなど）が可能である。組織培養のための多彩な細胞系が本分野で知られている。細胞系の非限定的な例に含まれるのは、Ｃ８１６１、ＣＣＲＦ－ＣＥＭ、ＭＯＬＴ、ｍＩＭＣＤ－３、ＮＨＤＦ、ＨｅＬａＳ３、Ｈｕｈｌ、Ｈｕｈ４、Ｈｕｈ７、ＨＵＶＥＣ、ＨＡＳＭＣ、ＨＥＫｎ、ＨＥＫａ、ＭｉａＰａＣｅｌｌ、Ｐａｎｅｌ、ＰＣ－３、ＴＦｌ、ＣＴＬＬ－２、ＣＩＲ、Ｒａｔ６、ＣＶＩ、ＲＰＴＥ、ＡｌＯ、Ｔ２４、１８２、Ａ３７５、ＡＲＨ－７７、Ｃａｌｕｌ、ＳＷ４８０、ＳＷ６２０、ＳＫＯＶ３、ＳＫ－ＵＴ、ＣａＣｏ２、Ｐ３８８Ｄｌ、ＳＥＭ－Ｋ２、ＷＥＨＩ－２３１、ＨＢ５６、ＴＩＢ５５、ｌｕｒｋａｔ、１４５．０１、ＬＲＭＢ、Ｂｃｌ－１、ＢＣ－３、ＩＣ２１、ＤＬＤ２、Ｒａｗ２６４．７、ＮＲＫ、ＮＲＫ－５２Ｅ、ＭＲＣ５、ＭＥＦ、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨｅＬａ Ｂ、ＨｅＬａ Ｔ４。ＣＯＳ、ＣＯＳ－１、ＣＯＳ－６、ＣＯＳ－Ｍ６Ａ、ＢＳ－Ｃ－１サル腎臓上皮、ＢＡＬＢ／３Ｔ３マウス胚線維芽細胞、３Ｔ３ Ｓｗｉｓｓ、３Ｔ３－Ｌｌ、１３２－ｄ５ヒト胎児線維芽細胞；１０．１マウス線維芽細胞、２９３－Ｔ、３Ｔ３、７２１、９Ｌ、Ａ２７８０、Ａ２７８０ＡＤＲ、Ａ２７８０ｃｉｓ、Ａ１７２、Ａ２０、Ａ２５３、Ａ４３１、Ａ－５４９、ＡＬＣ、Ｂ１６、Ｂ３５、ＢＣＰ－Ｉ細胞、ＢＥＡＳ－２Ｂ、ｂＥｎｄ．３、ＢＨＫ－２１、ＢＲ ２９３、ＢｘＰＣ３、Ｃ３Ｈ－１０Ｔｌ／２、Ｃ６／３６、Ｃａｌ－２７、ＣＨＯ、ＣＨＯ－７、ＣＨＯ－ＩＲ、ＣＨＯ－Ｋｌ、ＣＨＯ－Ｋ２、ＣＨＯ－Ｔ、ＣＨＯ Ｄｈｆｒ－／－、ＣＯＲ－Ｌ２３、ＣＯＲ－Ｌ２３／ＣＰＲ、ＣＯＲ－Ｌ２３５０１０、ＣＯＲＬ２３／Ｒ２３、ＣＯＳ－７、ＣＯＶ－４３４、ＣＭＬ Ｔｌ、ＣＭＴ、ＣＴ２６、Ｄ１７、ＤＨ８２、ＤＵ１４５、ＤｕＣａＰ、ＥＬ４、ＥＭ２、ＥＭ３、ＥＭＴ６／ＡＲ１、ＥＭＴ６／ＡＲ１０．０、ＦＭ３、Ｈ１２９９、Ｈ６９、ＨＢ５４、ＨＢ５５、ＨＣＡ２、ＨＥＫ－２９３、ＨｅＬａ、Ｈｅｐａｌｃｌｃ７、ＨＬ－６０、ＨＭＥＣ、ＨＴ－２９、ｌｕｒｋａｔ、ｌＹ細胞、Ｋ５６２細胞、Ｋｕ８１２、ＫＣＬ２２、ＫＧｌ、ＫＹＯｌ、ＬＮＣａｐ、Ｍａ－Ｍｅｌ １－４８、ＭＣ－３８、ＭＣＦ－７、ＭＣＦ－ｌ０Ａ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、ＭＤＡ－ＭＢ－４６８、ＭＤＡ－ＭＢ－４３５、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＤＣＫＩＩ、ＭＯＲ／０．２Ｒ、ＭＯＮＯ－ＭＡＣ ６、ＭＴＤ－ｌＡ、ＭｙＥｎｄ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＣＰＲ、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ１０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ２０、ＮＣＩ－Ｈ６９／ＬＸ４、ＮＩＨ－３Ｔ３、ＮＡＬＭ－１、ＮＷ－１４５、ＯＰＣＮ／ＯＰＣＴ細胞系、Ｐｅｅｒ、ＰＮＴ－ｌＡ／ＰＮＴ ２、ＲｅｎＣａ、ＲＩＮ－５Ｆ、ＲＭＡ／ＲＭＡＳ、Ｓａｏｓ－２脂肪、Ｓｆ－９、ＳｋＢｒ３、Ｔ２、Ｔ－４７Ｄ、Ｔ８４、ＴＨＰｌ細胞系、Ｕ３７３、Ｕ８７、Ｕ９３７、ＶＣａＰ、Ｖｅｒｏ細胞、ＷＭ３９、ＷＴ－４９、Ｘ６３、ＹＡＣ－１、ＹＡＲ、およびこれらのトランスジェニックな変種である。当業者に知られている多彩な供給源からの細胞系を利用することができる（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（マナサス、ヴァージニア州）を参照されたい）。

【0234】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている１つ以上のベクターをトランスフェクトされた細胞を用い、１つ以上のベクター由来配列を含む新たな細胞系を確立する。いくつかの実施形態では、本明細書の融合タンパク質と場合によりｇＲＮＡを、または本発明のリボ核タンパク質複合体を一過性にトランスフェクトされて融合タンパク質またはリボ核タンパク質複合体の活性を通じて改変された細胞を用い、改変を含有するが他の外来性配列は完全に欠けた新たな細胞系を確立する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている１つ以上のベクターを一過性または非一過性にトランスフェクトされた細胞、またはそのような細胞に由来する細胞系を用いて１つ以上の試験化合物を評価する。

【0235】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている１つ以上のベクターを用いて非ヒトトランスジェニック動物またはトランスジェニック植物を作製する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は昆虫である。さらなる実施形態では、昆虫は害虫（蚊またはダニなど）である。いくつかの実施形態では、昆虫は植物の害虫（トウモロコシの害虫（ｃｏｒｎ ｒｏｏｔｗｏｒｍ）またはツマジロクサヨトウなど）である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は鳥類（ニワトリ、シチメンチョウ、ガチョウ、またはアヒルなど）である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック動物は哺乳類（ヒト、マウス、ラット、ハムスター、サル、類人猿、ウサギ、ブタ、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ネコ、またはイヌなど）である。

【0236】

ＶＩ．ポリペプチドとポリヌクレオチドのバリアントと断片

【0237】

本開示により、配列番号２、４、および６～１２として示されているアミノ酸配列を持つＤＮＡ分子、その活性なバリアントまたは断片、およびそれをコードするポリヌクレオチドに対して活性なシトシンデアミナーゼが提供される。

【0238】

バリアントまたは断片の活性は興味あるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比べて変化していてもよいが、そのバリアントと断片は、興味あるポリヌクレオチドまたはポリペプチドの機能を保持していなければならない。例えばバリアントまたは断片は、興味あるポリヌクレオチドまたはポリペプチドと比べたとき、活性が増大している可能性、活性が低下している可能性、活性のスペクトルが異なっている可能性、または活性が他の何らかの変化をしている可能性がある。

【0239】

シトシンデアミナーゼ活性を持つ本発明のデアミナーゼの断片とバリアントは、ＤＮＡ結合ポリペプチドまたはその断片をさらに含む融合タンパク質の一部である場合に前記活性を保持するであろう。

【0240】

「断片」という用語は、本発明のポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の一部を意味する。「断片」または「生物活性な部分」には、生物活性（すなわち核酸に対するデアミナーゼ活性）を保持するのに十分な数の連続したヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが含まれる。「断片」または「生物活性な部分」には、生物活性を保持するのに十分な数の連続したアミノ酸残基を含むポリペプチドが含まれる。本明細書に開示されているデアミナーゼの断片には、代わりの下流開始部位を使用しているため完全長配列よりも短いものが含まれる。いくつかの実施形態では、デアミナーゼの生物活性な部分は、配列番号２、４、および６～１２のいずれかの例えば１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０個、またはそれよりも多い連続したアミノ酸残基を含むポリペプチド、またはそのバリアントである。このような生物活性な部分は組み換え技術によって調製し、活性を評価することができる。

【0241】

一般に、「バリアント」は、実質的に似ている配列を意味する。ポリヌクレオチドに関しては、バリアントは、天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の内部部位に１つ以上のヌクレオチドの欠失および／または付加、および／または天然ポリヌクレオチド内の１つ以上の部位に１つ以上のヌクレオチドの置換を含む。本明細書では、「天然」または「野生型」ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然のヌクレオチド配列またはアミノ酸配列をそれぞれ含む。ポリヌクレオチドに関しては、保存的バリアントに、遺伝暗号の縮重が理由で興味ある遺伝子の天然アミノ酸配列をコードしている配列が含まれる。このような天然のアレルバリアントは、周知の分子生物学の技術（例えば下に概略を記載するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）やハイブリダイゼーション技術）を利用して同定することができる。バリアントポリヌクレオチドには、合成に由来する（例えば部位特異的突然変異誘発によって生成した）が興味あるポリペプチドまたはポリヌクレオチドをやはりコードしているポリヌクレオチドも含まれる。一般に、本明細書に開示されている１つの特定のポリヌクレオチドのバリアントは、本明細書の別の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムとパラメータによって調べると、その特定のポリヌクレオチドと少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも多く一致する配列を持つであろう。

【0242】

本明細書に開示されているある特定のポリヌクレオチド（すなわち参照ポリヌクレオチド）のバリアントは、バリアントポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの間の配列一致の割合を比較することによって評価することもできる。任意の２つのポリペプチドの間の配列一致の割合は、本明細書の別の箇所に記載されている配列アラインメントプログラムとパラメータを用いて計算することができる。本明細書に開示されているポリヌクレオチドの任意の所与のペアを、これらポリヌクレオチドがコードする２つのポリペプチドが共有する配列の一致率の比較によって評価する場合、コードされるこれら２つのポリペプチド間の配列一致の割合は、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも多い配列一致である。

【0243】

特別な実施形態では、本開示のポリヌクレオチドは、配列番号２、４、および６～１２のいずれかのアミノ酸配列と少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも多く一致するアミノ酸配列を含むシトシンデアミナーゼをコードする。

【0244】

本発明のシトシンデアミナーゼの生物活性なバリアントは、１～１５個という少数のアミノ酸残基、１～１０個という少数、例えば６～１０個、５個という少数、４個という少数、３個という少数、２個という少数、または１個という少数のアミノ酸残基が異なっている可能性がある。特別な実施形態では、これらポリペプチドはＮ末端またはＣ末端のトランケーションを含み、そこにはポリペプチドのＮ末端またはＣ末端からの５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、またはそれよりも多くのアミノ酸の欠失が少なくとも含まれる可能性がある。いくつかの実施形態では、これらポリペプチドは内部欠失を含み、そこには１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０個、またはそれよりも多くのアミノ酸の欠失が少なくとも含まれる可能性がある。

【0245】

いくつかの実施形態では、配列番号２の生物活性なポリペプチドバリアントは、配列番号１のアミノ酸残基１～１２または１９５～２３０を含まない。ある実施形態では、配列番号４の生物活性なバリアントは、配列番号３のアミノ酸残基１～１２または１９８～２０１を含まない。特別な実施形態では、配列番号６の生物活性なポリペプチドバリアントは、配列番号５のアミノ酸残基１～１５を含まない。ある実施形態では、デアミナーゼは、配列番号２と少なくとも９０％一致するアミノ酸配列を持ち、配列番号１のアミノ酸残基１～１２または１９５～２３０を含まない。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号４と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を持ち、配列番号３のアミノ酸残基１～１２または１９８～２０１を含まない。いくつかの実施形態では、デアミナーゼは、配列番号６と少なくとも９５％一致するアミノ酸配列を持ち、配列番号５のアミノ酸残基１～１５を含まない。

【0246】

本明細書に提示されているデアミナーゼを改変し、バリアントタンパク質とポリヌクレオチドを作製できると認識されている。ヒトが設計した変化は、部位特異的突然変異誘発技術を適用して導入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている配列と構造および／または機能が関連した天然の、だがまだ知られていないかまだ同定されていないポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドで、本発明の範囲に入るものを同定することもできる。シトシンデアミナーゼなどのポリペプチドの機能を変化させない保存的アミノ酸置換を、保存されていない領域で実現することができる。いくつかの実施形態では、デアミナーゼのシトシンデアミナーゼ活性を改善する改変がなされる。

【0247】

バリアントポリヌクレオチドとバリアントタンパク質には、突然変異と組み換えを起こさせる手続き（ＤＮＡシャッフリングなど）から得られる配列とタンパク質も包含される。このような手続きを利用して本明細書に開示されている１つ以上の異なるデアミナーゼ（例えば２、４、および６～１２）を操作し、望む特性を持つ新たなシトシンデアミナーゼを作り出す。このようにして、実質的に一致した配列を持つ配列領域を含んでいるためインビトロまたは生体内での相同組み換えが可能な関連配列ポリヌクレオチドの集団から、組み換えポリヌクレオチドのライブラリを生成させる。例えばこのアプローチを用いると、興味あるドメインをコードする配列モチーフを、本明細書に提示されているデアミナーゼ配列とその後同定される他のデアミナーゼ遺伝子の間でシャッフルし、興味ある特性が改善された（例えば酵素の場合にはＫ_ｍが増大した）タンパク質をコードする新たな遺伝子を得ることができる。このようなＤＮＡシャッフリングのための戦略は本分野で知られている。例えばＳｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９１：１０７４７－１０７５１；Ｓｔｅｍｍｅｒ （１９９４） Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９－３９１；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ． １５：４３６－４３８；Ｍｏｏｒｅ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ． ２７２：３３６－３４７；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９４：４５０４－４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ． （１９９８） Ｎａｔｕｒｅ ３９１：２８８－２９１；およびアメリカ合衆国特許第５，６０５，７９３号と第５，８３７，４５８号を参照されたい。「シャッフルされた」核酸は、シャッフル手続き（例えば本明細書に示されている任意のシャッフル手続き）によって生成した核酸である。シャッフルされた核酸は、２つ以上の核酸（または文字列）を例えば人工的に、そして場合によっては回帰的に（物理的または仮想的に）組み換えることによって生成する。一般に、シャッフリングプロセスでは１つ以上のスクリーニング工程を利用して興味ある核酸を同定する。このスクリーニング工程は、任意の組み換え工程の前または後に実施することができる。シャッフリングのいくつかの（だがすべてではない）実施形態では、選択の前に組み換えを多数回実施し、スクリーニングするプールの多様性を大きくすることが望ましい。組み換えと選択のプロセス全体を場合によっては回帰的に繰り返す。文脈に応じ、シャッフリングは、組み換えと選択のプロセス全体を意味するか、プロセス全体の組み換え部分だけを意味することができる。

【0248】

本明細書では、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列一致（一致する配列）」または「一致」は、指定された比較ウインドウ上で対応が最大になるようにアラインメントしたとき、それら２つの配列の中で同じである残基を意味する。配列一致の割合がタンパク質に関して用いられているときには、同じではない残基位置は、保存されたアミノ酸置換の違いであることがしばしばあり、その位置ではアミノ酸残基が似た化学的特性（例えば電荷または疎水性）の別のアミノ酸残基で置換されているため、分子の機能的特性は変化しないと認識されている。配列が保存的置換に関して異なっているときには、その置換の保存的性質に関して修正するため配列一致の割合を上方に調節することができる。そのような保存的置換が異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を持つと言われる。この調節を行なう手段は当業者に周知である。典型的には、この手段は、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとして点数化することで、配列一致の割合を大きくすることを含む。したがって例えば一致するアミノ酸には１点を与え、保存されていない置換には０点を与えた場合、保存された置換には０と１の間の点数が与えられる。保存された置換の点数は、例えばプログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、マウンテン・ヴュー、カリフォルニア州）の中に実装されているようにして計算される。

【0249】

本明細書では、「配列一致の割合」は、比較ウインドウ上で最適なアラインメントにされた２つの配列を比較することによって求まる値を意味する。その場合、ポリヌクレオチド配列のうちで比較ウインドウの中にある部分は、２つの配列の最適なアラインメントのための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでいる可能性がある。この割合は、両方の配列で核酸塩基またはアミノ酸残基が同じである位置の数を明らかにすることによって一致した位置の数を取得し、この一致した位置の数を、比較ウインドウ内の位置の総数で割り、１００を掛けることによって計算され、配列一致の割合が得られる。

【0250】

特に断わらない限り、本明細書に提示されている配列一致／類似性の値は、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ １０を用いて得られる値（以下のパラメータを用いる：ヌクレオチド配列に関しては、ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔを５０、Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを３にし、ｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いて得られる％一致と％類似性；アミノ酸配列に関しては、ＧＡＰ Ｗｅｉｇｈｔを８、Ｌｅｎｇｔｈ Ｗｅｉｇｈｔを２にし、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いて得られる％一致と％類似性）、またはこれと同等な任意のプログラムを用いて得られる値を意味する。「同等なプログラム」とは、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰ Ｖｅｒｓｉｏｎ１０によって生成させた対応するアラインメントと比較したとき、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致が同じで、配列一致の割合が同じアラインメントを生じさせる任意の配列比較プログラムを意味する。

【0251】

２つの配列が「最適なアラインメントである」のは、類似性スコアを求めるためにそれら２つの配列を、所定のアミノ酸置換マトリックス（例えばＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップ存在ペナルティ、およびギャップ延長ペナルティを用いてアラインメントさせ、そのペアの配列に関して可能な最高スコアに到達したときである。アミノ酸置換マトリックスと、それを利用して２つの配列の間の類似性を定量化することは、本分野で周知であり、例えば“Ａｔｌａｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，” Ｖｏｌ． ５， Ｓｕｐｐｌ． ３（ｅｄ． Ｍ． Ｏ． Ｄａｙｈｏｆｆ）の中のＤａｙｈｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９７８） 、「タンパク質における進化的変化のモデル」、ｐｐ． ３４５－３５２と、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ｅｔ ａｌ． （１９９２） Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８９：１０９１５－１０９１９に記載されている。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスは、配列アラインメントプロトコルにおいてデフォルトのスコアリング置換マトリックスとしてしばしば用いられる。ギャップ存在ペナルティは、アラインメントされた配列の１つに単一のアミノ酸ギャップを導入するために課され、ギャップ延長ペナルティは、すでに設けられているギャップの中にそれぞれ追加の空のアミノ酸位置を導入するために課される。アラインメントは、各配列の中で、このアラインメントが始まるアミノ酸位置と終わるアミノ酸位置によって規定され、場合によっては一方または両方の配列に１つまたは複数のギャップを挿入して、可能な最高スコアが得られるようにする。最適なアラインメントと点数化は手作業で実現することができるが、このプロセスは、コンピュータで実現されるアラインメントアルゴリズム（例えばＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２に記載されているギャップ付きＢＬＡＳＴ ２．０があり、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｗｅｂｓｉｔｅ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ）で公開されているため入手できる）を用いると容易になる。最適なアラインメントは、多数のアラインメントを含め、例えばＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ． （１９９７） Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ２５：３３８９－３４０２に記載されており、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから入手することができる）を用いて用意することができる。

【0252】

参照配列と最適なアラインメントにされたアミノ酸配列に関しては、１個のアミノ酸残基が、アラインメントの中でこの残基とペアになる参照配列中の位置に「対応する」。「位置」は、参照配列の中でＮ末端に対する相対的な位置に基づいて逐次的に同定される各アミノ酸の番号によって表わされる。最適なアラインメントを求めるときに考慮すべき欠失、挿入、トランケーション、融合などがあるため、一般に、Ｎ末端から単純に数えることによって求めたときの試験配列中のアミノ酸残基の番号は、参照配列の中の対応する位置の番号と必ずしも同じにならない。例えばアラインメントされた試験配列の中に欠失が１つ存在している場合には、参照配列の中でその欠失部位の位置に対応するアミノ酸は存在しない。アラインメントされた試験配列の中に挿入が１つ存在している場合には、その挿入は、参照配列の中のどのアミノ酸位置にも対応しない。トランケーションまたは融合がある場合には、参照配列またはアラインメントされた配列の中に、対応する配列中のどのアミノ酸にも対応しない一連のアミノ酸が存在する可能性がある。

【0253】

ＶＩＩ．抗体

【0254】

本発明のデアミナーゼ、融合タンパク質、またはデアミナーゼを含むリボ核タンパク質（配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つに示されているアミノ酸配列を持つものが含まれる）、またはその活性なバリアントまたは断片に対する抗体も包含される。抗体を作製する方法は本分野で周知である（例えばＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ （１９８８） Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク州と；アメリカ合衆国特許第４，１９６，２６５号を参照されたい）。これらの抗体は、本明細書に記載されているデアミナーゼ、または融合タンパク質、またはデアミナーゼを含むリボ核タンパク質を検出して単離するためのキットで用いることができる。したがって本開示により、本明細書に記載されているポリペプチドまたはリボ核タンパク質（例えば配列番号２、４、および６～１２のいずれかと少なくとも８５％一致する配列を含むポリペプチドが含まれる）に特異的に結合する抗体を含むキットが提供される。

【0255】

ＶＩＩＩ．興味ある標的配列の結合および／または改変のための系とリボ核タンパク質複合体、およびそれを作製する方法

【0256】

本開示により、核酸配列を標的としてその標的核酸配列を改変する系が提供される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ＲＧＮなど）とｇＲＮＡは、リボ核タンパク質複合体を興味ある核酸配列に向かわせるのに重要である；ＲＧＤＢＰに融合されたデアミナーゼポリペプチドは、標的となる核酸配列をＣからＮに改変するのに重要である。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはＣをＴに変換する。いくつかの実施形態では、デアミナーゼはＣをＧに変換する。ガイドＲＮＡは興味ある標的配列にハイブリダイズした後、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと複合体も形成し、そのことによってＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを標的配列に結合させる。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、本明細書に記載されているデアミナーゼも含む融合タンパク質の一部である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＲＧＮ（Ｃａｓ９など）である。ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドの他の例には、ＲＧＮ（国際特許出願公開第ＷＯ２０１９／２３６５６６号と第ＷＯ２０２０／１３９７８３号（それぞれの全体が参照によって組み込まれている）に記載されているＲＧＮなど）が含まれる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、またはその活性なバリアントまたは断片である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチド、またはその活性なバリアントまたは断片である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドはＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである。いくつかの実施形態では、融合タンパク質のＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＮＡガイド（ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはメガヌクレアーゼポリペプチドなど）を必要としない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ結合ポリペプチドのヌクレアーゼ活性は部分的に、または完全に不活性化されている。さらなる実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドは、ＲＧＮのアミノ酸配列（例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号７４）など）、またはその活性なバリアントまたは断片（ニッカーゼｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号７５）または他のニッカーゼＲＧＮバリアント（配列番号７５と８８～９８）など）を含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、本明細書に提示されている興味ある標的配列の結合と改変のための系は、少なくとも１つのタンパク質に結合したＲＮＡの少なくとも１つの分子であるリボ核タンパク質複合体である。本明細書に提示されているリボ核タンパク質複合体は、ＲＮＡ成分として少なくとも１つのガイドＲＮＡを含むとともに、タンパク質成分として、本発明のデアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質を含む。いくつかの実施形態では、リボ核タンパク質複合体は、融合タンパク質とガイドＲＮＡをコードするポリヌクレオチドで形質転換した後にその融合タンパク質とガイドＲＮＡの発現を可能にする条件下で培養した細胞または生物から精製する。

【0258】

デアミナーゼ、融合タンパク質、または融合タンパク質リボ核タンパク質複合体を作製する方法が提供される。このような方法は、デアミナーゼ、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列と、いくつかの実施形態ではガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む細胞を、そのデアミナーゼまたは融合タンパク質（といくつかの実施形態ではガイドＲＮＡ）が発現する条件下で培養することを含む。デアミナーゼ、融合タンパク質、または融合リボ核タンパク質はその後、培養された細胞のライセートから精製することができる。

【0259】

デアミナーゼ、融合タンパク質、または融合リボ核タンパク質複合体を生物サンプルのライセートから精製する方法は本分野で知られている（例えばサイズ排除クロマトグラフィおよび／またはアフィニティクロマトグラフィ、２Ｄ－ＰＡＧＥ、ＨＰＬＣ、逆相クロマトグラフィ、免疫沈降）。特別な方法では、デアミナーゼまたは融合タンパク質は組み換えで作製され、その精製を助けるため精製タグを含んでいる。精製タグの非限定的な例に含まれるのは、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン（ＴＲＸ）、ポリ（ＮＡＮＰ）、タンデムアフィニティ精製（ＴＡＰ）タグ、ｍｙｃ、ＡｃＶ５、ＡＵ１、ＡＵ５、Ｅ、ＥＣＳ、Ｅ２、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ｎｕｓ、Ｓｏｆｔａｇ １、Ｓｏｆｔａｇ ３、Ｓｔｒｅｐ、ＳＢＰ、Ｇｌｕ－Ｇｌｕ、ＨＳＶ、ＫＴ３、Ｓ、Ｓ１、Ｔ７、Ｖ５、ＶＳＶ－Ｇ、６×Ｈｉｓ、ビオチンカルボキシル担体タンパク質（ＢＣＣＰ）、およびカルモジュリンである。一般に、タグ付きデアミナーゼ、融合タンパク質、または融合リボ核タンパク質複合体は、免疫沈降、または本分野で知られている他の同様の方法を利用して精製される。

【0260】

「単離された」または「精製された」ポリペプチド、またはその生物活性な部分は、天然の環境で見いだされたポリペプチドに通常は付随する構成成分、またはこのポリペプチドと相互作用する構成成分を実質的または本質的に含んでいない。したがって単離または精製されたポリペプチドは、組み換え技術によって作製されるときには他の細胞材料または培地を実質的に含んでおらず、化学合成されるときには化学的前駆体または他の化合物を実質的に含んでいない。細胞材料を実質的に含んでいないタンパク質には、汚染タンパク質が（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、または１％よりも少ないタンパク質調製物が含まれる。本発明のタンパク質、またはその生物活性のある部分が組み換えによって作製されるとき、最適には、培地は、化学的前駆体を、または興味あるタンパク質なしの化学物質を、（乾燥重量で）約３０％、２０％、１０％、５％、または１％よりも少なく含む。

【0261】

興味ある標的配列に結合させるための、および／または興味ある標的配列を切断するための本明細書に提示されている特別な方法は、インビトロで組み立てられたリボ核タンパク質複合体の使用を含む。リボ核タンパク質複合体のインビトロでの組み立ては、本分野で知られている任意の方法を用いて実施することができ、その方法では、ＲＧＤＢＰポリペプチド、またはそれを含む融合タンパク質を、ＲＧＤＢＰポリペプチド、またはそれを含む融合タンパク質がガイドＲＮＡに結合できる条件下でガイドＲＮＡに接触させる。本明細書では、「接触」、「接触している」、「接触した」は、望む反応の構成要素をまとめ、望むその反応の実施に適した条件下に置くことを意味する。ＲＧＤＢＰポリペプチド、またはそれを含む融合タンパク質は、生物サンプル、細胞ライセート、または培地から精製すること、インビトロで転写すること、または化学的に合成することができる。ガイドＲＮＡは、インビトロでの転写、または化学合成を通じて生成したものを、生物サンプル、細胞ライセート、または培地から精製することができる。ＲＧＤＢＰポリペプチド、またはそれを含む融合タンパク質と、ガイドＲＮＡを溶液（例えば緩衝化生理食塩溶液）中で接触させてリボ核タンパク質複合体をインビトロで組み立てることができる。

【0262】

ＩＸ．標的配列を改変する方法

【0263】

本開示により、興味ある標的核酸分子（例えば標的ＤＮＡ分子）を改変する方法が提供される。前記方法は、ＤＮＡ結合ポリペプチドと本発明の少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質、またはそれをコードするポリヌクレオチドを標的配列、または標的配列を含む細胞、オルガネラ、または胚に送達することを含む。ある実施形態では、前記方法は、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたはそれをコードするポリヌクレオチドと、本発明の少なくとも１つのデアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む少なくとも１つの融合タンパク質、またはそれをコードするポリヌクレオチドを含む系を、標的配列、または標的配列を含む細胞、オルガネラ、または胚に送達することを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、４、および６～１２のアミノ酸配列のいずれか１つ、またはその活性なバリアントまたは断片を含む。

【0264】

いくつかの実施形態では、前記方法は、ＤＮＡ分子を、（ａ）デアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばヌクレアーゼ不活性なＲＧＮまたはニッカーゼＲＧＮなど）を含む融合タンパク質；および（ｂ）（ａ）の融合タンパク質を前記ＤＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列に向かわせるｇＲＮＡと接触させることを含み；そのとき前記ＤＮＡ分子は、融合タンパク質およびｇＲＮＡと、有効な量かつ核酸塩基の脱アミノ化に適した条件下で接触させる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ分子は疾患または障害に関係する配列を含み、核酸塩基が脱アミノ化される結果として疾患または障害に関係しない配列になる。いくつかの実施形態では、疾患または障害は動物に影響を与える。さらなる実施形態では、疾患または障害は、哺乳類（ヒト、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、サル、ラット、マウス、またはハムスターなど）に影響を与える。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は作物のアレルの中にあり、興味ある形質に関するこのアレルが特別である結果として農業的価値がより低い植物になる。核酸塩基が脱アミノ化する結果として、その形質を改善するアレルになり、植物の農業的価値が上昇する。

【0265】

前記方法がガイドＲＮＡおよび／または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを送達することを含む実施形態では、細胞または胚をその後、前記ガイドＲＮＡおよび／または融合タンパク質が発現する条件下で培養することができる。さまざまな実施形態では、前記方法は、標的配列を、ｇＲＮＡと（本発明のデアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む）融合タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体と接触させることを含む。ある実施形態では、前記方法は、標的配列を含む細胞、オルガネラ、または胚の中に本発明のリボ核タンパク質複合体を導入することを含む。本発明のリボ核タンパク質複合体として、生物サンプルから精製されたもの、組み換え産生されてその後精製されたもの、および本明細書に記載されているようにしてインビトロで組み立てられたものが可能である。標的配列または細胞オルガネラまたは胚と接触させるリボ核タンパク質複合体がインビトロで組み立てられた実施形態では、前記方法はさらに、標的配列、細胞、オルガネラ、または胚と接触させる前に複合体をインビトロで組み立てることを含むことができる。

【0266】

精製されるかインビトロで組み立てられた本発明のリボ核タンパク質複合体は、本分野で知られている任意の方法（その非限定的な例に電気穿孔が含まれる）を利用して細胞、オルガネラ、または胚の中に導入することができる。いくつかの実施形態では、本発明のデアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質と、ガイドＲＮＡをコードするか含むポリヌクレオチドを、本分野で知られている任意の方法（例えば電気穿孔）を利用して細胞、オルガネラ、または胚の中に導入する。

【0267】

ガイドＲＮＡは、標的配列に、またはこの標的配列を含む細胞、オルガネラ、または胚に送達されるか接触すると、融合タンパク質を配列特異的に前記標的配列に結合させる。標的配列はその後、融合タンパク質のデアミナーゼによって改変することができる。いくつかの実施形態では、この融合タンパク質が標的配列に結合すると、その標的配列に隣接したヌクレオチドが改変される。デアミナーゼによって改変される標的配列に隣接する核酸塩基として、標的配列の５´末端または３´末端からの１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００塩基対が可能である。本発明のデアミナーゼとＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを含む融合タンパク質は、標的となるＤＮＡ分子内の特定の位置にＣ＞Ｎ変異を導入することができる。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、標的となるＤＮＡ分子内の特定の位置にＣ＞Ｔ変異を導入する。ある実施形態では、融合タンパク質は、標的となるＤＮＡ分子内の特定の位置にＣ＞Ｇ変異を導入する。

【0268】

標的配列への融合タンパク質の結合を測定する方法は本分野で知られており、その方法に含まれるのは、クロマチン免疫沈降アッセイ、ゲル移動度シフトアッセイ、ＤＮＡプル－ダウンアッセイ、レポータアッセイ、マイクロプレート捕獲・検出アッセイである。同様に、標的配列の切断または改変を測定する方法は本分野で知られており、その方法に含まれるのはインビトロまたは生体内での切断アッセイである。この切断アッセイでは、分解産物の検出を容易にするため標的配列に適切な標識（例えば放射性同位体、蛍光物質）を付着させて、または付着させずに、ＰＣＲ、シークエンシング、またはゲル電気泳動を利用して切断を確認する。いくつかの実施形態では、切れ目トリガー式指数的増幅反応（ＮＴＥＸＰＡＲ）アッセイを利用する（例えばＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ． （２０１６） Ｃｈｅｍ． Ｓｃｉ． ７：４９５１－４９５７参照）。生体内切断は、Ｓｕｒｖｅｙｏｒアッセイ（Ｇｕｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ． （２０１０） Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ６４９：２４７－２５６）を利用して評価することができる。

【0269】

いくつかの実施形態では、前記方法は、２つ以上のガイドＲＮＡとの複合体にされた融合タンパク質の一部としてのＲＮＡ結合ＤＮＡ誘導型ポリペプチドの使用を含む。その２つ以上のガイドＲＮＡは、単一の遺伝子の異なる領域を標的にすること、または多数の遺伝子を標的にすることができる。この多重ターゲティングにより、融合タンパク質のデアミナーゼが核酸を改変し、そのことによって複数の変異を興味ある標的核酸分子（例えばゲノム）に導入することが可能になる。

【0270】

前記方法が、ニッカーゼＲＧＮなどのＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）の使用を含む（すなわち二本鎖ポリヌクレオチド（例えばｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号７５または配列番号８８～９８））の単一の鎖だけを切断できる実施形態では、前記方法は、同じ標的配列または重複する標的配列を標的としていてポリヌクレオチドの異なる鎖を切断する２つの異なるＲＧＮまたはＲＧＮバリアントを導入することを含むことができる。例えば二本鎖ポリヌクレオチドのプラス（＋）鎖だけを切断するＲＧＮニッカーゼを、二本鎖ポリヌクレオチドのマイナス（－）鎖だけを切断する第２のＲＧＮニッカーゼとともに導入することができる。いくつかの実施形態では、２つの異なる融合タンパク質が提供される。そのときそれぞれの融合タンパク質は、異なるＰＡＭ認識配列を持つ異なるＲＧＮを含むため、ヌクレオチド配列のより大きな多様性を変異の標的にすることができる。

【0271】

当業者は、本開示の方法のいずれかを利用して単一の標的配列または複数の標的配列を標的にできることがわかるであろう。したがって方法は、単一のＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドを、単一遺伝子および／または複数遺伝子の中の複数の異なる配列を標的にすることができる複数の異なるガイドＲＮＡと組み合わせて含む融合タンパク質の使用を含む。その後、融合タンパク質のデアミナーゼが、標的となる配列のそれぞれに変異を導入することになろう。本明細書には、複数の異なるガイドＲＮＡが複数の異なるＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと組み合わせて導入される方法も包含される。そのようなＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとして、複数のＲＧＮまたはＲＧＮバリアントが可能である。これらガイドＲＮＡとガイドＲＮＡ／融合タンパク質系は、単一の遺伝子および／または複数の遺伝子の中の複数の異なる配列を標的にすることができる。

【0272】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドと本発明のデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質を用い、興味ある遺伝子の中にあって標的となる遺伝子または標的となる領域に変異を生じさせることができる。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質を、標的遺伝子、または興味ある標的遺伝子の領域の飽和突然変異誘発に使用した後、ハイ－スループット順方向遺伝子スクリーニングで新規な変異および／または表現型を同定することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている融合タンパク質を用いて標的となるゲノム位置に変異を生じさせることができる。そのゲノム位置にはコードＤＮＡ配列が含まれている可能性、または含まれていない可能性がある。上述の標的突然変異誘発によって生成した細胞系のライブラリは遺伝子機能または遺伝子発現の研究にも有用である可能性がある。

【0273】

Ｘ．標的ポリヌクレオチド

【0274】

１つの側面では、本発明により、生体内、生体外、またはインビトロで真核細胞の中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法が提供される。いくつかの実施形態では、この方法は、ヒト、または非ヒト動物、または植物（微細藻類を含む）からの１個の細胞、または細胞の集団をサンプリングし、その１個または複数個の細胞を改変することを含む。培養は、任意の段階で生体外にて実施することができる。その１個または複数個の細胞は、非ヒト動物または植物（微細藻類を含む）に再導入することさえできる。

【0275】

植物栽培者は、望ましい品質（例えば収量、品質、一様性、丈夫さ、および病原体に対する抵抗性）を探すため、天然の変動性を利用して非常に有用な遺伝子を組み合わせる。これらの望ましい品質には、成長、日照時間の好み、温度条件、開花または生殖発生の開始日、脂肪酸含量、昆虫抵抗性、疾患抵抗性、線虫抵抗性、真菌抵抗性、除草剤抵抗性、さまざまな環境因子（旱魃、熱、湿度、寒さ、風、および不利な土壌状態（高塩分を含む））に対する寛容性も含まれる。有用なこれら遺伝子の供給源には、在来種または外来種、家宝種、野生植物の親戚、および誘導変異（例えば突然変異誘発剤で植物材料を処理する）が含まれる。植物栽培者は、本発明を利用することで、変異を誘導するための新たなツールを提供される。したがって当業者は、ゲノムを分析して有用な遺伝子を探し、望む特徴または形質を持つ品種の中で本発明を利用して有用な遺伝子の増加を以前の突然変異誘発剤よりも正確に誘導し、したがって植物栽培プログラムの加速と改良を実現することができる。

【0276】

本発明のデアミナーゼまたは融合タンパク質の標的ポリヌクレオチドとして、真核細胞にとって内在性または外来性の任意のポリヌクレオチドが可能である。例えば標的ポリヌクレオチドとして、真核細胞の核の中に存在するポリヌクレオチドが可能である。いくつかの実施形態では、標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えばタンパク質）をコードする配列、または非コード配列（例えば調節ポリヌクレオチドまたはジャンクＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、本発明の融合タンパク質のための標的配列はＰＡＭ（プロトスペーサ隣接モチーフ）；すなわちＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドによって認識される短い配列と関係する。ＰＡＭに必要な正確な配列と長さは使用するＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドに応じて異なるが、ＰＡＭは典型的にはプロトスペーサ（すなわち標的配列）に隣接した２～５塩基対の配列である。

【0277】

本発明の融合タンパク質の標的ポリヌクレオチドは、多数の疾患関連遺伝子とポリヌクレオチドのほか、シグナル伝達生化学経路に関係する遺伝子とポリヌクレオチドを含んでいる可能性がある。標的ポリヌクレオチドの例に、シグナル伝達生化学経路と関係する配列（例えばシグナル伝達生化学経路に関係する遺伝子またはポリヌクレオチド）が含まれる。標的ポリヌクレオチドの例に、疾患関連の遺伝子またはポリヌクレオチドが含まれる。「疾患関連の」遺伝子またはポリヌクレオチドは、疾患でない対照の組織または細胞と比べたとき、疾患に冒された組織に由来する細胞の中では異常なレベル、または異常な形態になった転写産物または翻訳産物を生じさせる任意の遺伝子またはポリヌクレオチドを意味する。それは、異常な高レベルで発現するようになる遺伝子である可能性、異常な低レベルで発現するようになる遺伝子である可能性があり、変化した発現は、疾患の発生および／または進行と相関している。疾患関連の遺伝子は、疾患の起源（例えば原因変異）に直接の責任がある変異または遺伝的バリエーションを有する遺伝子、または疾患の起源に責任がある遺伝子と連鎖平衡にある変異または遺伝的バリエーションを有する遺伝子も意味する。転写または翻訳された産物は、既知であるか未知である可能性があり、さらに、正常なレベルまたは異常なレベルである可能性がある。

【0278】

本開示の方法と組成物を用いて標的にできる疾患関連の遺伝子の非限定的な例が表２３に提示されている。いくつかの実施形態では、標的にされる疾患関連の遺伝子は、表２３に開示されていてＴ＞Ｃ変異またはＧ＞Ｃ変異を持つものである。疾患関連の遺伝子とポリヌクレオチドの追加例は、マキューズィック－ネイサンズ遺伝医学研究所、ジョンズ・ポプキンズ大学（バルティモア、メリーランド州）とアメリカ国立生物工学情報センター、国立医学図書館（ベセスダ、メリーランド州）からＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手することができる。

【0279】

いくつかの実施形態では、前記方法は、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を本発明のＤＮＡ結合ポリペプチド－デアミナーゼ融合タンパク質と接触させることを含み、そのときＤＮＡ分子は、融合タンパク質と、有効な量かつ核酸塩基の脱アミノ化に適した条件下で接触させる。ある実施形態では、前記方法は、標的ＤＮＡ配列を含むＤＮＡ分子を、（ａ）本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質；および（ｂ）（ａ）の融合タンパク質をＤＮＡ分子の標的ヌクレオチド配列に向かわせるｇＲＮＡと接触させることを含み；そのときＤＮＡ分子は、融合タンパク質およびｇＲＮＡと、有効な量かつ核酸塩基の脱アミノ化に適した条件下で接触させる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は疾患または障害に関係する配列を含み、核酸塩基が脱アミノ化される結果として疾患または障害と関係しない配列になる。いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は作物のアレルの中にあり、興味ある形質の特定のアレルの結果として農業的価値がより低い植物になる。核酸塩基が脱アミノ化する結果として、その形質を改善するアレルになり、植物の農業的価値が上昇する。

【0280】

いくつかの実施形態では、標的ＤＮＡ配列は疾患または障害に関係するＴ＞ＣまたはＧ＞Ｃという点変異を含んでおり、変異体のＣ塩基が脱アミノ化する結果として、疾患または障害に関係しない配列になる。いくつかの実施形態では、脱アミノ化は疾患または障害に関係する配列の中の点変異を修正する。

【0281】

いくつかの実施形態では、疾患または障害と関係する配列はタンパク質をコードしており、脱アミノ化によって疾患または障害に関係する配列に終止コドンが導入され、その結果として、コードされるタンパク質のトランケーションが起こる。いくつかの実施形態では、接触操作は、疾患または障害を持つ可能性が大きい対象、疾患または障害を持つ対象、または疾患または障害を持つと診断された対象の生体内で実施される。いくつかの実施形態では、疾患または障害は、ゲノムの中の点変異または単一塩基変異と関係する疾患である。いくつかの実施形態では、疾患は、遺伝性疾患、がん、代謝疾患、またはライソゾーム病である。

【0282】

ＸＩ．医薬組成物と治療の方法

【0283】

治療を必要とする対象における疾患を治療する方法が本明細書で提供される。この方法は、それを必要とする対象に、本開示の融合タンパク質、またはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のｇＲＮＡ、またはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示の融合タンパク質系、またはこれら組成物のいずれか１つによって改変される細胞、またはこれら組成物のいずれか１つを含む細胞を有効な量で投与することを含む。

【0284】

いくつかの実施形態では、治療は、治療を必要とする対象に、本開示の融合タンパク質、ｇＲＮＡ、または本開示の融合タンパク質系、またはそれをコードするポリヌクレオチドを投与することによる生体内遺伝子編集を含む。いくつかの実施形態では、治療は生体外遺伝子編集を含み、この場合には細胞は、本開示の融合タンパク質、ｇＲＮＡ、または本開示の融合タンパク質系、またはそれをコードするポリヌクレオチドを用いて生体外で遺伝子改変された後、その改変された細胞が対象に投与される。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細胞は対象に由来し、その後改変された細胞がその対象に投与される。移植されたこの細胞を本明細書では自家と呼ぶ。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された細胞は、この改変された細胞を投与される対象（すなわちレシピエント）と同じ種の中の異なる対象（すなわちドナー）に由来し、移植された細胞を本明細書では同種異系と呼ぶ。本明細書に記載されているいくつかの実施例では、細胞を培地の中で増殖させた後、それを必要とする対象に投与することができる。

【0285】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物を用いて治療する疾患は、免疫療法（キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞など）を用いて治療できる疾患である。そのような疾患の非限定的な例に含まれるのはがんである。

【0286】

いくつかの実施形態では、標的核酸塩基が脱アミノ化される結果として、遺伝子異常の修正、または遺伝子産物の機能喪失につながる点変異の修正がなされる。いくつかの実施形態では、遺伝子異常は疾患または障害（例えばライソゾーム病または代謝疾患（例えばＩ型糖尿病など））に関係する。そこでいくつかの実施形態では、本開示の組成物で治療する疾患は、その疾患または障害を治療するために、またはその疾患または障害に付随する症状を軽減するために変異させる配列（すなわちその疾患または障害の原因、またはその疾患または障害に付随する症状の原因となる配列）と関係している。

【0287】

いくつかの実施形態では、本開示の組成物で治療される疾患は原因変異と関係している。本明細書では、「原因変異」は、ゲノムの中にあって対象における疾患または障害の重症度または存在に寄与する特定の１つのヌクレオチド、複数のヌクレオチド、またはヌクレオチド配列を意味する。原因変異の修正は、疾患または障害から生じる少なくとも１つの症状の改善につながる。いくつかの実施形態では、原因変異の修正は、疾患または障害から生じる少なくとも１つの症状の改善につながる。いくつかの実施形態では、原因変異は、本明細書に開示されているデアミナーゼに融合されたＲＧＤＢＰ（例えばＲＧＮ）によって認識されるＰＡＭ部位に隣接している。原因変異は、ＲＧＤＢＰ（例えばＲＧＮ）と本開示のデアミナーゼを含む融合ポリペプチドを用いて修正することができる。原因変異に関係する疾患の非限定的な例に含まれるのは、嚢胞性線維症、ニーマン－ピック病、スプライス部位破壊によって起こる疾患、および表２３に掲載されている疾患である。疾患に関係する遺伝子と変異の追加の非限定的な例は、マキューズィック－ネイサンズ遺伝医学研究所、ジョンズ・ポプキンズ大学（バルティモア、メリーランド州）とアメリカ国立生物工学情報センター、国立医学図書館（ベセスダ、メリーランド州）からＷｏｒｌｄ Ｗｉｄｅ Ｗｅｂで入手することができる。

【0288】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法を利用して、脱活性化点変異を、疾患または障害と関係する遺伝子産物をコードする遺伝子またはアレルに導入する。例えばいくつかの実施形態では、（例えば増殖性疾患の治療において）脱活性化点変異をがん遺伝子に導入するのに融合タンパク質を用いる方法が本明細書で提供される。脱活性化変異は、いくつかの実施形態ではコード配列の中に早すぎる終止コドンを生じさせ、その結果として短縮型遺伝子産物（例えば完全長タンパク質の機能が欠けた短縮型タンパク質）が発現する可能性がある。いくつかの実施形態では、本明細書に提示されている方法の目的は、機能不全の遺伝子の機能をゲノム編集によって回復させることである。本明細書で提供される融合タンパク質は、例えばヒト細胞培養物の中で疾患関連変異を修正することにより、インビトロでの遺伝子編集に基づくヒト治療薬であることを検証できる。当業者は、本明細書で提供される融合タンパク質（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼポリペプチドを含む融合タンパク質）を用いて任意の単一のＴ＞ＣまたはＧ＞Ｃという点変異を修正できることがわかるであろう。ＣからＴまたはＧへの変異体の脱アミノ化は変異の修正につながる。

【0289】

本明細書では、「治療」または「治療する」、または「緩和する」または「改善する」は交換可能に使用される。これらの用語は、有益な結果または望む結果（その非限定的な例に治療の利益および／または予防の利益が含まれる）を得るためのアプローチを意味する。治療の利益は、治療中の１つ以上の疾患、状態、または症状の治療上重要なあらゆる改善、または治療中の１つ以上の疾患、状態、または症状に対する治療上重要なあらゆる効果を意味する。予防の利益を得るため、組成物を、特定の疾患、状態、または症状が進展するリスクのある対象に投与すること、または疾患の生理学的症状の１つ以上を、その疾患、状態、または症状がまだ出現していなくとも報告している対象に投与することができる。

【0290】

「有効な量」または「治療に有効な量」という用語は、有益な結果または望む結果を得るのに十分な薬剤の量を意味する。治療に有効な量は、対象と治療する疾患状態、対象の体重と年齢、疾患状態の重症度、投与の様式などのうちの１つ以上に依存して変化する可能性があるが、当業者は容易に決定することができる。具体的な用量は、選択した具体的な薬剤、従う投与計画、他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、および薬剤の担体となる送達系のうちの１つ以上に依存して変化する可能性がある。

【0291】

「投与」という用語は、ある方法または経路によって対象の中に活性成分を配置することを意味し、その結果として望む部位（損傷または修復の部位など）に導入された活性成分の少なくとも部分的な局在化が起こり、望む効果が生じる。細胞が投与される実施形態では、細胞を適切な任意の経路で投与して対象内の望む位置に送達し、移植された細胞の少なくとも一部、またはこの細胞の成分がその場所で生存した状態に留まるようにすることができる。対象に投与された後の細胞の生存期間は、数時間（例えば２４時間）という短期間から、数日まで、数年という長期間まで、それどころか患者の一生、すなわち長期定着までが可能である。例えば本明細書に記載されているいくつかの側面では、光受容体細胞または網膜前駆細胞の有効量が全身投与経路（腹腔内または静脈内の経路など）を通じて投与される。

【0292】

いくつかの実施形態では、投与は、ウイルス送達による投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、電気穿孔による投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、ナノ粒子送達による投与を含む。いくつかの実施形態では、投与は、リポソーム送達による投与を含む。有効な任意の投与経路を用いて本明細書に記載されている医薬組成物を有効な量で投与することができる。いくつかの実施形態では、投与は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、経口投与、直腸投与、エアロゾルによる投与、非経口投与、眼投与、肺投与、経皮投与、膣投与、耳投与、鼻投与、および局所投与によって、またはこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される方法によって投与することを含む。いくつかの実施形態では、細胞を送達するため、注射または輸液による投与を利用する。

【0293】

本明細書では、「対象」という用語は、診断、処置、または治療が望まれる任意の個体を意味する。いくつかの実施形態では、対象は動物である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類である。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。

【0294】

治療の有効性は熟練した臨床医師が判断することができる。しかし治療が「有効な治療」と見なされるのは、疾患または障害の徴候または症状の任意の１つまたはすべてが有益なやり方で変化する（例えば少なくとも１０％の減少）か、疾患に関して臨床的に受け入れられている他の症状またはマーカーが改善または向上する場合である。有効性は、入院または医学的介入の必要性によって評価される悪化を示さない（例えば疾患の進行が停止するか、少なくとも遅延する）ことによっても測定できる。これらの指標を測定する方法は当業者に知られている。治療に含まれるのは、（１）疾患の抑制（例えば症状の進行の停止または遅延）；または（２）疾患の緩和（例えば症状の後退の誘導）と；（３）症状が進行する可能性の阻止または低減である。

【0295】

本開示のＲＧＮポリペプチド、またはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のｇＲＮＡ、またはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示のデアミナーゼ、またはそれをコードするポリヌクレオチド、本開示の融合タンパク質、本開示の系（融合タンパク質を含む系など）を含むか、前記のＲＧＮポリペプチド、またはＲＧＮをコードするポリヌクレオチド、前記のｇＲＮＡ、またはｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド、前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または前記系のいずれかを含む細胞を含むとともに、医薬として許容可能な基剤を含む医薬組成物が提供される。

【0296】

本明細書では、「医薬として許容可能な基剤」は、生物を顕著に刺激せず、活性成分（例えばデアミナーゼまたは融合タンパク質、またはそれをコードする核酸分子）の活性と特性を損なわない材料を意味する。基剤は、治療中の対象への投与に適しているようにするため、十分に高純度で十分に毒性が低くなければならない。基剤は不活性であること、または医薬としての利益を持つことが可能である。いくつかの実施形態では、医薬として許容可能な基剤は、ヒトまたは他の脊椎動物への投与に適した１つ以上の適合した固体または液体の充填剤、希釈剤、またはカプセル化物質を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、医薬として許容可能な非天然の基剤を含む。いくつかの実施形態では、医薬として許容可能な基剤と活性成分は自然界で合わさって見いだされることはないため、異種である。

【0297】

本開示の方法で使用される医薬組成物は、適切な基剤、賦形剤、および他の薬剤で適切な移動、送達、寛容性などを提供するものとともに製剤化することができる。多くの適切な製剤が当業者に知られている。例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ （２１ｓｔ ｅｄ． ２００５）を参照されたい。非限定的な例に含まれるのは、減菌希釈剤（注射用の水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒など）；抗菌剤（ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸など）；バッファ（酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩など）、および等張性を調節する薬剤（塩化ナトリウムまたはデキストロースなど）である。静脈内投与される具体的な基剤は生理食塩水またはリン酸塩緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）である。経口または非経口で使用するための医薬組成物は、１用量の活性成分に適した単位用量の剤型に調製することができる。単位用量にされたこのような剤型に含まれるのは、例えば錠剤、ピル、カプセル、注射液（アンプル）、座薬などである。これら組成物は、アジュバント（保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤が含まれる）も含むことができる。微生物の作用の阻止は、さまざまな抗菌剤と抗真菌剤（例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸など）によって保障することができる。等張剤（例えば糖、塩化ナトリウムなど）を含めることも望ましい可能性がある。注射可能な医薬形態の遅延吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えばモノステアリン酸アルミニウムとゼラチン）を使用することによって実現できる。

【0298】

本開示のＲＧＮ、ｇＲＮＡ、デアミナーゼ、融合タンパク質、系（融合タンパク質を含む系が含まれる）、またはそれをコードするポリヌクレオチドを用いて改変された細胞を対象に投与するいくつかの実施形態では、細胞は、医薬として許容可能な基剤を含む懸濁液として投与される。当業者は、細胞組成物の中で使用される医薬として許容可能な基剤が、バッファ、化合物、凍結保存剤、保存剤、または他の薬剤を、対象に送達される細胞の生存に実質的に干渉する量で含むことはないことを認識しているであろう。細胞を含む製剤は、例えば細胞膜の完全性の維持を可能にする浸透バッファを含み、場合により、投与後に細胞の生存を維持するか定着を増強するための栄養素を含むことができる。このような製剤と懸濁液は、当業者に知られている、および／または定型的な実験を利用して本明細書に記載の細胞とともに使用するのに適応させることができる。

【0299】

細胞組成物は、乳化すること、またはリポソーム組成物として提供することもできるが、乳化手続きが細胞の生存に悪影響を与えないことが条件である。細胞と他のあらゆる活性成分は、医薬として許容可能で活性成分との適合性がある賦形剤と、本明細書に記載の治療法で用いるのに適した量で混合することができる。

【0300】

細胞組成物の中に含まれる追加の薬剤は、その中の成分の医薬として許容可能な塩を含むことができる。医薬として許容可能な塩には（ポリペプチドの遊離アミノ基とで形成される）酸添加塩が含まれ、無機酸（例えば塩酸またはリン酸など）または有機酸（酢酸、酒石酸、マンデル酸など）とで形成される。遊離カルボキシル基とで形成される塩は、無機塩基（例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄など）と有機塩基（イソプロピルアミン、トリメチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなど）に由来することも可能である。

【0301】

塩基編集を利用して原因変異を改変する

【0302】

本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質に基づくアプローチを利用して修正できる可能性がある遺伝性疾患の一例はニーマン－ピック病Ｃ型である。ニーマン－ピック病（ＮＰＣ）は、ＮＰＣ１遺伝子またはＮＰＣ２遺伝子（ＮＰＣ１遺伝子の配列は配列番号１２１として示されている）の中の変異によって起こる常染色体劣性ライソゾーム病であり、その結果としてコレステロールと糖スフィンゴ脂質（ＧＳＬ）が異常に蓄積する。ＮＰＣを持つ患者は典型的には４～７歳の間に発症する。主要な症状に含まれるのは、肝臓と肺の疾患、筋緊張低下、嚥下障害、精神運動発達遅滞、小脳性運動失調症、進行性認知障害、認知症、および他の神経機能障害である。若年性神経疾患発症に関係する１つの共通するバリアントはエキソン２１の中のＮＭ＿０００２７１．５（ＮＰＣ１）：ｃ．３１８２Ｔ＞Ｃ （ｐ．Ｉｌｅ１０６１Ｔｈｒ）であり、シトシン塩基編集を利用して修正することができる。本発明は、本発明の融合タンパクをさまざまな疾患の原因変異へと導く潜在的な標的配列も開示しており、その中には、ニーマン－ピック病Ｃ型を引き起こすことが知られているエキソン２１の中のＮＭ＿０００２７１．５（ＮＰＣ１）：ｃ．３１８２Ｔ＞Ｃ （ｐ．Ｉ１０６１Ｔ）変異が含まれる。

【0303】

ＸＩＩ．ポリヌクレオチド遺伝子改変を含む細胞

【0304】

本明細書で提供されるのは、本明細書に記載されているように、場合によりｇＲＮＡを有する融合タンパク質によって媒介される方法を利用して改変された興味ある標的核酸分子を含む細胞および／または生物である。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つのアミノ酸配列を含むデアミナーゼポリペプチド、またはその活性なバリアントまたは断片を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２、４、および６～１２のいずれかと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％一致するアミノ酸配列を含むシトシンデアミナーゼを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質はデアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド）を含む。さらなる実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼと、ＲＧＮまたはそのバリアント（例えばＡＰＧ０７４３３．１（配列番号７４）またはそのニッカーゼバリアントｎＡＰＧ０７４３３．１（配列番号７５）など）を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、デアミナーゼと、Ｃａｓ９またはそのバリアント（例えばｄＣａｓ９またはニッカーゼＣａｓ９など）を含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ不活性なバリアントまたはニッカーゼバリアントを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ不活性なバリアントまたはニッカーゼバリアントを含む。いくつかの実施形態では、融合タンパク質は、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドのヌクレアーゼ不活性なバリアントまたはニッカーゼバリアントを含む。

【0305】

改変された細胞として、真核細胞（例えば哺乳類、植物、昆虫、鳥類の細胞）または原核細胞が可能である。本明細書に記載されている融合タンパク質を用いる方法によって改変された少なくとも１つのヌクレオチド配列を含むオルガネラと胚も提供される。遺伝子改変された細胞、生物、オルガネラ、および胚は、改変されたヌクレオチド配列にとってヘテロ接合性またはホモ接合性であることが可能である。融合タンパク質のデアミナーゼによって変異が導入された結果として、タンパク質産物または組み込まれた配列の発現変化（上方調節または下方調節）、不活性化、または発現が起こる可能性がある。変異の結果として遺伝子が不活性化するか、機能しないタンパク質産物が発現する場合には、遺伝子改変された細胞、生物、オルガネラ、または胚は「ノックアウト」と呼ばれる。ノックアウト表現型は、欠失変異（すなわち少なくとも１つのヌクレオチドの欠失）、挿入変異（すなわち少なくとも１つのヌクレオチドの挿入）、またはナンセンス変異の（すなわち少なくとも１つのヌクレオチドが置換されて終止コドンが導入された）結果である可能性がある。

【0306】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼによって導入された変異の結果としてバリアントタンパク質産物が産生する。発現したバリアントタンパク質産物は、少なくとも１つのアミノ酸の置換、および／または少なくとも１つのアミノ酸の付加または欠失を持つ可能性がある。バリアントタンパク質産物は、野生型タンパク質と比べたときに変化した特徴または活性を示す可能性がある（その非限定的な例に、変化した酵素活性または基質特異性が含まれる）。

【0307】

いくつかの実施形態では、融合タンパク質のデアミナーゼによって変異が導入された結果としてタンパク質の発現パターンが変化する。非限定的な一例として、タンパク質産物の発現を制御する調節領域の中に変異がある結果として、タンパク質産物が過剰発現するか下方調節される可能性、または組織発現パターンまたは時間的発現パターンが変化する可能性がある。

【0308】

形質転換された細胞は従来のやり方に従ってトランスジェニック生物（植物など）の中に入れて増殖させることができる。例えばＭｃＣｏｒｍｉｃｋ ｅｔ ａｌ． （１９８６） Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ ５：８１－８４を参照されたい。次いでこれらの植物を成長させ、同じ形質転換された株、または異なる株を用いて受粉させると、遺伝子改変を持つハイブリッドが得られる。本発明により、遺伝子改変された種子が提供される。再生された植物の子孫、バリアント、および変異体も本発明の範囲に含まれるが、これらの部分が遺伝子改変を含んでいることが条件である。さらに提供されるのは、本明細書に開示されている配列を保持している加工された植物製品または副生成物（大豆粕が含まれる）である。

【0309】

本明細書に提示されている方法を用いて任意の植物種（その非限定的な例に単子葉植物と双子葉植物が含まれる）を改変することができる。興味ある植物の非限定的な例に含まれるのは、コーン（トウモロコシ）、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、木綿、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、およびナタネ、アブラナ属の種、アルファルファ、ライムギ、雑穀、ベニバナ、ピーナツ、サツマイモ、キャッサバ、コーヒー、ココナツ、パイナップル、柑橘類、ココア、茶、バナナ、アボカド、イチジク、グアバ、マンゴ、オリーブ、パパイヤ、カシューナッツ、マカダミアナッツ、アーモンド、エンバク、野菜、装飾植物、および針葉樹である。

【0310】

野菜の非限定的な例に含まれるのは、トマト、レタス、グリーンピース、ライマメ、エンドウマメ、およびキュウリ属のメンバー（キュウリ、カンタループ、およびマスクメロンなど）である。装飾植物の非限定的な例に含まれるのは、アザレア、アジサイ、ハイビスカス、バラ、チューリップ、ラッパズイセン、ペチュニア、カーネーション、ポインセチア、およびキクである。本発明の植物は、作物（例えばトウモロコシ、モロコシ、コムギ、ヒマワリ、トマト、アブラナ科植物、コショウ、ジャガイモ、木綿、イネ、ダイズ、テンサイ、サトウキビ、タバコ、オオムギ、ナタネなど）であることが好ましい。

【0311】

本明細書に提示されている方法を用いて任意の原核生物種を遺伝子改変することもできる。原核生物種の非限定的な例に含まれるのは、古細菌と細菌（例えばバシラス属の種、クレブシエラ属の種、ストレプトマイセス属の種、リゾビウム属の種、大腸菌属の種、シュードモナス属の種、サルモネラ属の種、赤痢菌属の種、ビブリオ属の種、エルシニア属の種、マイコプラズマ属の種、アグロバクテリウム、およびラクトバシラス属の種）である。

【0312】

本明細書に提示されている方法を用いて任意の真核生物種、またはそれに由来する細胞を遺伝子改変することができる。真核生物種の非限定的な例に含まれるのは、動物（例えば哺乳類、昆虫、魚類、鳥類、および爬虫類）、菌類、アメーバ、藻類、および酵母である。いくつかの実施形態では、本開示の方法によって改変される細胞には、免疫細胞（すなわち自然免疫系または適応免疫系の細胞）などの造血系起源の細胞が含まれ、その非限定的な例に含まれるのは、Ｂ細胞、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、多能性幹細胞、人工多能性幹細胞、キメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ－Ｔ）細胞、単球、マクロファージ、および樹状細胞である。

【0313】

改変された細胞は生物の中に導入することができる。これらの細胞は生体外アプローチで改変されており、自家細胞移植の場合には同じ生物（例えばヒト）に由来した可能がある。いくつかの実施形態では、細胞は、同種異系細胞移植の場合には、同じ種の別の生物（例えば別のヒト）に由来した。

【0314】

ＸＩＩＩ．キット

【0315】

本開示のいくつかの側面により、本発明のデアミナーゼを含むキットが提供される。ある実施形態では、本開示により、本発明のデアミナーゼとＤＮＡ結合ポリペプチド（例えばＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチド（ＲＧＮポリペプチド、例えばヌクレアーゼ不活性なＲＧＮまたはニッカーゼＲＧＮなど））、および場合により、ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼの間に位置するリンカーを含む融合タンパク質を含むキットが提供される。それに加えていくつかの実施形態では、キットは、適切な試薬、バッファ、および／または融合タンパク質を例えばインビトロまたは生体内でのＤＮＡまたはＲＮＡの編集に使用するための指示を含む。いくつかの実施形態では、キットは、標的を絞った核酸配列編集に適したｇＲＮＡの設計と使用に関する指示を含む。

【0316】

冠詞「１つの（ａ）」と「１つの（ａｎ）」は、本明細書では、文法的対象となる１つまたは２つ以上（すなわち少なくとも１つ）の物体を意味するのに用いられる。例として「１つのポリペプチド」は、１つ以上のポリペプチドを意味する。

【0317】

本明細書で言及されているあらゆる刊行物と特許出願は、本開示が関係する分野の当業者のレベルを示している。すべての刊行物と特許出願が、個々の刊行物または特許出願が具体的かつ個別に参照によって組み込まれていることが示されているかのようにして、参照によって本明細書に組み込まれている。

【0318】

明確な理解を目的として説明と例によって上記の本発明をいくらか詳細に記載してきたが、添付の請求項の範囲内でいくつかの変更と改変を実施できることは明らかであろう。

【0319】

非限定的な実施形態に含まれるのは、以下のものである。

【0320】

１．ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
デアミナーゼ活性を持つポリペプチド。

【0321】

２．ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
デアミナーゼ活性を持つ単離されたポリペプチド。

【0322】

３．配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む、実施形態１または２に記載のポリペプチド。

【0323】

４．配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を含む、実施形態１または２に記載のポリペプチド。

【0324】

５．デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、
ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる核酸分子。

【0325】

６．デアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、
ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる単離された核酸分子。

【0326】

７．前記デアミナーゼが、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５または６に記載の核酸分子。

【0327】

８．前記デアミナーゼが、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５または６に記載の核酸分子。

【0328】

９．前記デアミナーゼが、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれか１つと１００％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態５または６に記載の核酸分子。

【0329】

１０．前記デアミナーゼポリペプチドが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態５または６に記載の核酸分子。

【0330】

１１．前記デアミナーゼポリペプチドが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致するアミノ酸配列を持つ、実施形態５または６に記載の核酸分子。

【0331】

１２．前記ポリペプチドに機能可能に連結された異種プロモータをさらに含む、実施形態５～１１のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0332】

１３．実施形態５～１２のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。

【0333】

１４．実施形態５～１２のいずれか１つに記載の核酸分子または実施形態１３に記載のベクターを含む細胞。

【0334】

１５．原核細胞である、実施形態１４に記載の細胞。

【0335】

１６．真核細胞である、実施形態１４に記載の細胞。

【0336】

１７．前記真核細胞が哺乳類細胞である、実施形態１６に記載の細胞。

【0337】

１８．前記哺乳類細胞がヒト細胞である、実施形態１７に記載の細胞。

【0338】

１９．前記ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態１８に記載の細胞。

【0339】

２０．前記免疫細胞が幹細胞である、実施形態１９に記載の細胞。

【0340】

２１．前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態２０に記載の細胞。

【0341】

２２．前記真核細胞が昆虫細胞または鳥類細胞である、実施形態１６に記載の細胞。

【0342】

２３．前記真核細胞が菌類細胞である、実施形態１６に記載の細胞。

【0343】

２４．前記真核細胞が植物細胞である、実施形態１６に記載の細胞。

【0344】

２５．実施形態２４に記載の細胞を含む植物。

【0345】

２６．実施形態２４に記載の細胞を含む種子。

【0346】

２７．医薬として許容可能な基剤を含むとともに、実施形態１～４のいずれか１つに記載のポリペプチド、実施形態５～１２のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態１３に記載のベクター、または実施形態１４～２４のいずれか１つに記載の細胞を含む医薬組成物。

【0347】

２８．医薬として許容可能な前記基剤が、前記ポリペプチドまたは前記核酸分子にとって異種である、実施形態２７に記載の医薬組成物。

【0348】

２９．医薬として許容可能な前記基剤が天然でない、実施形態２７または２８に記載の医薬組成物。

【0349】

３０．デアミナーゼを作製する方法であって、前記デアミナーゼが発現する条件下で実施形態１４～２４のいずれか１つに記載の細胞を培養することを含む方法。

【0350】

３１．デアミナーゼを作製する方法であって、実施形態５～１２のいずれか１つに記載の核酸分子、または実施形態１３に記載のベクターを細胞の中に導入し、前記デアミナーゼが発現する条件下で前記細胞を培養することを含む方法。

【0351】

３２．前記デアミナーゼを精製することをさらに含む、実施形態３０または３１に記載の方法。

【0352】

３３．ＤＮＡ結合ポリペプチドを含むとともに、
ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つデアミナーゼ
を含む融合タンパク質。

【0353】

３４．前記デアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態３３に記載の融合タンパク質。

【0354】

３５．前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態３３に記載の融合タンパク質。

【0355】

３６．前記デアミナーゼがシトシンデアミナーゼである、実施形態３３～３５のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0356】

３７．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0357】

３８．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0358】

３９．前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドが、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態３８に記載の融合タンパク質。

【0359】

４０．前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0360】

４１．前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0361】

４２．前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0362】

４３．前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、実施形態４２に記載の融合タンパク質。

【0363】

４４．前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態３９～４１のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0364】

４５．前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0365】

４６．前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0366】

４７．前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0367】

４８．前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0368】

４９．前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0369】

５０．前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態３９に記載の融合タンパク質。

【0370】

５１．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態４２に記載の融合タンパク質。

【0371】

５２．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態４２に記載の融合タンパク質。

【0372】

５３．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つを持つアミノ酸配列を持つ、実施形態４２に記載の融合タンパク質。

【0373】

５４．少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む、実施形態３３～５３のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0374】

５５．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている、実施形態３３～５４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0375】

５６．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている、実施形態３３～５４のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0376】

５７．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態３３～５６のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0377】

５８．前記リンカー配列が、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態５７に記載の融合タンパク質。

【0378】

５９．ウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、実施形態３３～５８のいずれか１つに記載の融合タンパク質。

【0379】

６０．前記ＵＳＰが、配列番号８１として示されている配列を持つ、実施形態５９に記載の融合タンパク質。

【0380】

６１．前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態５９または６０に記載の融合タンパク質。

【0381】

６２．前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列が、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態６１に記載の融合タンパク質。

【0382】

６３．配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態３３に記載の融合タンパク質。

【0383】

６４．ＤＮＡ結合ポリペプチドとデアミナーゼを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記デアミナーゼが、
ａ）配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも８０％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｂ）配列番号１０９、１１１、および１１３のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列；
ｃ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；および
ｄ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列
からなる群から選択されるヌクレオチド配列によってコードされる、核酸分子。

【0384】

６５．前記デアミナーゼが、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態６４に記載の核酸分子。

【0385】

６６．前記デアミナーゼが、配列番号１１４～１１９のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つヌクレオチド配列によってコードされる、実施形態６４に記載の核酸分子。

【0386】

６７．前記デアミナーゼのヌクレオチド配列が、配列番号１０９、１１１、および１１３～１１９のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態６４に記載の核酸分子。

【0387】

６８．前記デアミナーゼのヌクレオチド配列が、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードする、実施形態６４に記載の核酸分子。

【0388】

６９．前記デアミナーゼのヌクレオチド配列が、配列番号２、４、６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列をコードする、実施形態６４に記載の核酸分子。

【0389】

７０．前記デアミナーゼがシトシンデアミナーゼである、実施形態６４～６９のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0390】

７１．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、実施形態６４～７０のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0391】

７２．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態６４～７０のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0392】

７３．前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態７２に記載の核酸分子。

【0393】

７４．前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0394】

７５．前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0395】

７６．前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態７３～７５のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0396】

７７．前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、実施形態７６に記載の核酸分子。

【0397】

７８．前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態７３～７５のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0398】

７９．前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0399】

８０．前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0400】

８１．前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0401】

８２．前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0402】

８３．前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0403】

８４．前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態７３に記載の核酸分子。

【0404】

８５．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７６に記載の核酸分子。

【0405】

８６．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７６に記載の核酸分子。

【0406】

８７．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つを持つアミノ酸配列を持つ、実施形態７６に記載の核酸分子。

【0407】

８８．前記融合タンパク質をコードする前記ポリペプチドがその５´末端でプロモータに機能可能に連結されている、実施形態６４～８７のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0408】

８９．前記融合タンパク質をコードする前記ポリペプチドがその３´末端でターミネータに機能可能に連結されている、実施形態６４～８８のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0409】

９０．前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態６４～８９のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0410】

９１．前記融合タンパク質が、真核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている、実施形態６４～９０のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0411】

９２．前記融合タンパク質が、原核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている、実施形態６４～９０のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0412】

９３．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている、実施形態６４～９２のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0413】

９４．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている、実施形態６４～９２のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0414】

９５．前記融合タンパク質が、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態６４～９４のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0415】

９６．前記リンカー配列が、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態９５に記載の核酸分子。

【0416】

９７．前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、実施形態６４～９６のいずれか１つに記載の核酸分子。

【0417】

９８．前記ＵＳＰが、配列番号８１として示されている配列を持つ、実施形態９７に記載の核酸分子。

【0418】

９９．前記融合タンパク質が、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態９７または９８に記載の核酸分子。

【0419】

１００．前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列が、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態９９に記載の核酸分子。

【0420】

１０１．前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態６４に記載の核酸分子。

【0421】

１０２．実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子を含むベクター。

【0422】

１０３．標的配列にハイブリダイズすることのできるガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列をさらに含む、実施形態１０２に記載のベクター。

【0423】

１０４．前記ｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである、実施形態１０３に記載のベクター。

【0424】

１０５．前記ｇＲＮＡが二重ガイドＲＮＡである、実施形態１０２に記載のベクター。

【0425】

１０６．実施形態３３～６３のいずれか１つに記載の融合タンパク質を含む細胞。

【0426】

１０７．ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をさらに含む、実施形態１０６に記載の細胞。

【0427】

１０８．前記ｇＲＮＡが単一ガイドＲＮＡである、実施形態１０７に記載の細胞。

【0428】

１０９．前記ｇＲＮＡが二重ガイドＲＮＡである、実施形態１０７に記載の細胞。

【0429】

１１０．実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子を含む細胞。

【0430】

１１１．実施形態１０２～１０５のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞。

【0431】

１１２．原核細胞である、実施形態１０６～１１１のいずれか１つに記載の細胞。

【0432】

１１３．真核細胞である、実施形態１０６～１１１のいずれか１つに記載の細胞。

【0433】

１１４．前記真核細胞が哺乳類細胞である、実施形態１１３に記載の細胞。

【0434】

１１５．前記哺乳類細胞がヒト細胞である、実施形態１１４に記載の細胞。

【0435】

１１６．前記ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態１１５に記載の細胞。

【0436】

１１７．前記免疫細胞が幹細胞である、実施形態１１６に記載の細胞。

【0437】

１１８．前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１１７に記載の細胞。

【0438】

１１９．前記真核細胞が昆虫細胞または鳥類細胞である、実施形態１１３に記載の細胞。

【0439】

１２０．前記真核細胞が菌類細胞である、実施形態１１３に記載の細胞。

【0440】

１２１．前記真核細胞が植物細胞である、実施形態１１３に記載の細胞。

【0441】

１２２．実施形態１２１に記載の細胞を含む植物。

【0442】

１２３．実施形態１２１に記載の細胞を含む種子。

【0443】

１２４．医薬として許容可能な基剤を含むとともに、実施形態３３～６３のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態１０２～１０５のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態１１４～１１８のいずれか１つに記載の細胞を含む医薬組成物。

【0444】

１２５．融合タンパク質を作製する方法であって、実施形態１０６～１２１のいずれか１つに記載の細胞を、前記融合タンパク質が発現する条件下で培養することを含む方法。

【0445】

１２６．融合タンパク質を作製する方法であって、実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子、または実施形態１０２～１０５のいずれか１つに記載のベクターを細胞の中に導入し、前記融合タンパク質が発現する条件下で前記細胞を培養することを含む方法。

【0446】

１２７．前記融合タンパク質を精製することをさらに含む、実施形態１２５または１２６に記載の方法。

【0447】

１２８．ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を作製する方法であって、細胞の中に、実施形態７２～８７のいずれか１つに記載の核酸分子を導入するとともに、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）をコードする発現カセットを含む核酸分子、または実施形態１０３～１０５のいずれか１つに記載のベクターを導入し、前記融合タンパク質と前記ｇＲＮＡが発現してＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を形成する条件下で前記細胞を培養することを含む方法。

【0448】

１２９．前記ＲＧＮ融合リボ核タンパク質複合体を精製することをさらに含む、実施形態１２８に記載の方法。

【0449】

１３０．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する系であって、
ａ）融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（ただし前記融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、前記デアミナーゼは、
ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）と；
ｂ）前記標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡ、または前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする１つ以上のヌクレオチド配列
を含み、
前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記融合タンパク質と複合体を形成し、前記融合タンパク質が前記標的ＤＮＡ配列に結合して前記標的ＤＮＡ分子を改変することを可能にする系。

【0450】

１３１．前記デアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０に記載の系。

【0451】

１３２．前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０に記載の系。

【0452】

１３３．前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードする前記ヌクレオチド配列と前記融合タンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列の少なくとも１つがプロモータに機能可能に連結されている、実施形態１３０～１３２のいずれか１つに記載の系。

【0453】

１３４．前記標的ＤＮＡ配列が真核細胞の標的ＤＮＡ配列である、実施形態１３０～１３３のいずれか１つに記載の系。

【0454】

１３５．前記標的ＤＮＡ配列が、前記ＲＧＮによって認識されるプロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態１３０～１３４のいずれか１つに記載の系。

【0455】

１３６．前記標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、実施形態１３０～１３５のいずれか１つに記載の系。

【0456】

１３７．前記細胞が真核細胞である、実施形態１３６に記載の系。

【0457】

１３８．前記真核細胞が植物細胞である、実施形態１３７に記載の系。

【0458】

１３９．前記真核細胞が哺乳類細胞である、実施形態１３７に記載の系。

【0459】

１４０．前記哺乳類細胞がヒト細胞である、実施形態１３９に記載の系。

【0460】

１４１．前記ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態１４０に記載の系。

【0461】

１４２．前記免疫細胞が幹細胞である、実施形態１４１に記載の系。

【0462】

１４３．前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１４２に記載の系。

【0463】

１４４．前記真核細胞が昆虫細胞である、実施形態１３７に記載の系。

【0464】

１４５．前記細胞が原核細胞である、実施形態１３６に記載の系。

【0465】

１４６．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0466】

１４７．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0467】

１４８．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0468】

１４９．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0469】

１５０．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0470】

１５１．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0471】

１５２．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0472】

１５３．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0473】

１５４．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0474】

１５５．前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、実施形態１５４に記載の系。

【0475】

１５６．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１５４または１５５に記載の系。

【0476】

１５７．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１５４または１５５に記載の系。

【0477】

１５８．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである、実施形態１５４または１５５に記載の系。

【0478】

１５９．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態１３０～１４５のいずれか１つに記載の系。

【0479】

１６０．前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態１３０～１５９のいずれか１つに記載の系。

【0480】

１６１．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている、実施形態１３０～１６０のいずれか１つに記載の系。

【0481】

１６２．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている、実施形態１３０～１６０のいずれか１つに記載の系。

【0482】

１６３．前記融合タンパク質が、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態１３０～１６２のいずれか１つに記載の系。

【0483】

１６４．前記リンカー配列が、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態１６３に記載の系。

【0484】

１６５．前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、実施形態１３０～１６４のいずれか１つに記載の系。

【0485】

１６６．前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、実施形態１６５に記載の系。

【0486】

１６７．前記融合タンパク質が、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態１６５または１６６に記載の系。

【0487】

１６８．前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列が、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態１６７に記載の系。

【0488】

１６９．前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態１３０に記載の系。

【0489】

１７０．前記融合タンパク質が、真核細胞の中で発現させるためにコドンが最適化されている、実施形態１３０～１６９のいずれか１つに記載の系。

【0490】

１７１．前記１つ以上のガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列と融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列が１つのベクター上に位置する、実施形態１３０～１７０のいずれか１つに記載の系。

【0491】

１７２．実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系の前記少なくとも１つのガイドＲＮＡと前記融合タンパク質を含むリボ核タンパク質複合体。

【0492】

１７３．実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系または実施形態１７２に記載のリボ核タンパク質複合体を含む細胞。

【0493】

１７４．原核細胞である、実施形態１７３に記載の細胞。

【0494】

１７５．真核細胞である、実施形態１７３に記載の細胞。

【0495】

１７６．前記真核細胞が哺乳類細胞である、実施形態１７５に記載の細胞。

【0496】

１７７．前記哺乳類細胞がヒト細胞である、実施形態１７６に記載の細胞。

【0497】

１７８．前記ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態１７７に記載の細胞。

【0498】

１７９．前記免疫細胞が幹細胞である、実施形態１７８に記載の細胞。

【0499】

１８０．前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態１７９に記載の細胞。

【0500】

１８１．前記真核細胞が昆虫細胞または鳥類細胞である、実施形態１７５に記載の細胞。

【0501】

１８２．前記真核細胞が菌類細胞である、実施形態１７５に記載の細胞。

【0502】

１８３．前記真核細胞が植物細胞である、実施形態１７５に記載の細胞。

【0503】

１８４．実施形態１８３に記載の細胞を含む植物。

【0504】

１８５．実施形態１８３に記載の細胞を含む種子。

【0505】

１８６．医薬として許容可能な基剤を含むとともに、実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系、実施形態１７２に記載のリボ核タンパク質複合体、または実施形態１７５～１８０のいずれか１つに記載の細胞を含む医薬組成物。

【0506】

１８７．標的ＤＮＡ配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって、実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系、または実施形態１７２に記載のリボ核タンパク質複合体を、前記標的ＤＮＡ分子、または前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞に送達することを含む方法。

【0507】

１８８．前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｎ変異を含む（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）、実施形態１８７に記載の方法。

【0508】

１８９．前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、実施形態１８８に記載の方法。

【0509】

１９０．前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を含む、実施形態１８８に記載の方法。

【0510】

１９１．標的配列を含む標的ＤＮＡ分子を改変する方法であって、
ａ）ＲＧＮ－デアミナーゼ複合体の組み立てを、前記ＲＧＮ－デアミナーゼ複合体が形成されるのに適した条件下で、
ｉ）前記標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡと；
ｉｉ）ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼポリペプチド（ＲＧＮ）と少なくとも１つのデアミナーゼを含む融合タンパク質（ただし前記デアミナーゼは、
Ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ＩＩ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）をインビトロで組み合わせることによって実施した後；
ｂ）前記標的ＤＮＡ分子、または前記標的ＤＮＡ分子を含む細胞を、前記インビトロで組み立てられたＲＧＮ－デアミナーゼ複合体と接触させることを含み、
前記１つ以上のガイドＲＮＡが前記標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズすることにより、前記融合タンパク質を前記標的ＤＮＡ分子に結合させ、前記標的ＤＮＡ分子の改変を起こさせる方法。

【0511】

１９２．前記デアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１に記載の方法。

【0512】

１９３．前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１に記載の方法。

【0513】

１９４．前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｎ変異を含む（ただしＮは、Ａ、Ｇ、またはＴである）、実施形態１９１～１９３のいずれか１つに記載の方法。

【0514】

１９５．前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を含む、実施形態１９４に記載の方法。

【0515】

１９６．前記改変された標的ＤＮＡ分子が、前記標的ＤＮＡ分子内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を含む、実施形態１９４に記載の方法。

【0516】

１９７．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１９１～１９６のいずれか１つに記載の方法。

【0517】

１９８．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態１９１～１９６のいずれか１つに記載の方法。

【0518】

１９９．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0519】

２００．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0520】

２０１．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0521】

２０２．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0522】

２０３．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0523】

２０４．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、配列番号７４、８２、８７、１０６、および１０７のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0524】

２０５．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0525】

２０６．前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、実施形態２０５に記載の方法。

【0526】

２０７．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２０５または２０６に記載の方法。

【0527】

２０８．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２０５または２０６に記載の方法。

【0528】

２０９．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである、実施形態２０５または２０６に記載の方法。

【0529】

２１０．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態１９１～１９８のいずれか１つに記載の方法。

【0530】

２１１．前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態１９１～２１０のいずれか１つに記載の方法。

【0531】

２１２．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている、実施形態１９１～２１１のいずれか１つに記載の方法。

【0532】

２１３．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている、実施形態１９１～２１１のいずれか１つに記載の方法。

【0533】

２１４．前記融合タンパク質が、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態１９１～２１３のいずれか１つに記載の方法。

【0534】

２１５．前記リンカー配列が、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態２１４に記載の方法。

【0535】

２１６．前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、実施形態１９１～２１５のいずれか１つに記載の方法。

【0536】

２１７．前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、実施形態２１６に記載の方法。

【0537】

２１８．前記融合タンパク質が、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態２１６または２１７に記載の方法。

【0538】

２１９．前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列が、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態２１８に記載の方法。

【0539】

２２０．前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態１９１に記載の方法。

【0540】

２２１．前記標的ＤＮＡ配列が真核細胞の標的ＤＮＡ配列である、実施形態１９１～２２０のいずれか１つに記載の方法。

【0541】

２２２．前記標的ＤＮＡ配列が、プロトスペーサ隣接モチーフ（ＰＡＭ）に隣接して位置する、実施形態１９１～２２１のいずれか１つに記載の方法。

【0542】

２２３．前記標的ＤＮＡ分子が細胞内にある、実施形態１９１～２２２のいずれか１つに記載の方法。

【0543】

２２４．前記細胞が真核細胞である、実施形態２２３に記載の方法。

【0544】

２２５．前記真核細胞が植物細胞である、実施形態２２４に記載の方法。

【0545】

２２６．前記真核細胞が哺乳類細胞である、実施形態２２４に記載の方法。

【0546】

２２７．前記哺乳類細胞がヒト細胞である、実施形態２２６に記載の方法。

【0547】

２２８．前記ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態２２７に記載の方法。

【0548】

２２９．前記免疫細胞が幹細胞である、実施形態２２８に記載の方法。

【0549】

２３０．前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態２２９に記載の方法。

【0550】

２３１．前記真核細胞が昆虫細胞である、実施形態２２４に記載の方法。

【0551】

２３２．前記細胞が原核細胞である、実施形態２２３に記載の方法。

【0552】

２３３．前記改変されたＤＮＡ分子を含む細胞を選択することをさらに含む、実施形態２２３～２３２のいずれか１つに記載の方法。

【0553】

２３４．実施形態２３３に記載の方法に従う改変された標的ＤＮＡを含む細胞。

【0554】

２３５．真核細胞である、実施形態２３４に記載の細胞。

【0555】

２３６．前記真核細胞が植物細胞である、実施形態２３５に記載の細胞。

【0556】

２３７．実施形態２３６に記載の細胞を含む植物。

【0557】

２３８．実施形態２３６に記載の細胞を含む種子。

【0558】

２３９．前記真核細胞が哺乳類細胞である、実施形態２３５に記載の細胞。

【0559】

２４０．前記哺乳類細胞がヒト細胞である、実施形態２３９に記載の細胞。

【0560】

２４１．前記ヒト細胞が免疫細胞である、実施形態２４０に記載の細胞。

【0561】

２４２．前記免疫細胞が幹細胞である、実施形態２４１に記載の細胞。

【0562】

２４３．前記幹細胞が人工多能性幹細胞である、実施形態２４２に記載の細胞。

【0563】

２４４．前記真核細胞が昆虫細胞である、実施形態２３５に記載の細胞。

【0564】

２４５．原核細胞である、実施形態２３４に記載の細胞。

【0565】

２４６．実施形態２９３～２４３のいずれか１つに記載の細胞と、医薬として許容可能な基剤を含む医薬組成物。

【0566】

２４７．遺伝性疾患に関する原因変異の修正がなされた遺伝子改変細胞を作製する方法であって、
ａ）融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（ただし前記融合タンパク質は、ＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）とデアミナーゼを含み、前記デアミナーゼは、
ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）と；
ｂ）標的ＤＮＡ配列にハイブリダイズすることのできる１つ以上のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、または前記ｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチド
を前記細胞に導入することを含み、
そのことによって前記融合タンパク質とｇＲＮＡが前記原因変異のゲノム遺伝子座に向かい、前記ゲノム配列を改変して前記原因変異を除去する方法。

【0567】

２４８．前記融合タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドが、前記細胞の中で活性なプロモータに機能可能に連結されている、実施形態２４７に記載の方法。

【0568】

２４９．前記ｇＲＮＡをコードする前記ポリヌクレオチドが、前記細胞の中で活性なプロモータに機能可能に連結されている、実施形態２４７または２４８に記載の方法。

【0569】

２５０．前記デアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２４７～２４９のいずれか１つに記載の方法。

【0570】

２５１．前記デアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２４７～２４９のいずれか１つに記載の方法。

【0571】

２５２．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２４７～２５１のいずれか１つに記載の方法。

【0572】

２５３．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＶ型ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓポリペプチドである、実施形態２４７～２５１のいずれか１つに記載の方法。

【0573】

２５４．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２４７～２５３のいずれか１つに記載の方法。

【0574】

２５５．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２４７～２５３のいずれか１つに記載の方法。

【0575】

２５６．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮが、表１の中のＲＧＮ配列のいずれか１つのアミノ酸配列を持つ、実施形態２４７～２５３のいずれか１つに記載の方法。

【0576】

２５７．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態２４７～２５３のいずれか１つに記載の方法。

【0577】

２５８．前記ＲＧＮニッカーゼが不活性なＲｕｖＣドメインを持つ、実施形態２５７に記載の方法。

【0578】

２５９．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２５７または２５８に記載の方法。

【0579】

２６０．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列を持つ、実施形態２５７または２５８に記載の方法。

【0580】

２６１．前記ＲＧＮニッカーゼが、配列番号７５と８８～９８のいずれか１つである、実施形態２５７または２５８に記載の方法。

【0581】

２６２．前記融合タンパク質の前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態２４７～２５３のいずれか１つに記載の方法。

【0582】

２６３．前記融合タンパク質が１つ以上の核局在化シグナルを含む、実施形態２４７～２６２のいずれか１つに記載の方法。

【0583】

２６４．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのアミノ末端に融合されている、実施形態２４７～２６３のいずれか１つに記載の方法。

【0584】

２６５．前記デアミナーゼが前記ＤＮＡ結合ポリペプチドのカルボキシル末端に融合されている、実施形態２４７～２６３のいずれか１つに記載の方法。

【0585】

２６６．前記融合タンパク質が、前記ＤＮＡ結合ポリペプチドと前記デアミナーゼの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態２４７～２６５のいずれか１つに記載の方法。

【0586】

２６７．前記リンカー配列が、配列番号７８または７９として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態２６６に記載の方法。

【0587】

２６８．前記融合タンパク質がウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ）をさらに含む、実施形態２４７～２６７のいずれか１つに記載の方法。

【0588】

２６９．前記ＵＳＰが配列番号８１として示されている配列を持つ、実施形態２６８に記載の方法。

【0589】

２７０．前記融合タンパク質が、前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間にリンカー配列をさらに含む、実施形態２６８または２６９に記載の方法。

【0590】

２７１．前記ＵＳＰと前記デアミナーゼまたは前記ＤＮＡ結合ポリペプチドの間の前記リンカー配列が、配列番号１２０として示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態２７０に記載の方法。

【0591】

２７２．前記融合タンパク質が、配列番号６７、６８、１４６、および１４７のいずれか１つとして示されているアミノ酸配列を持つ、実施形態２４７～２４９のいずれか１つに記載の方法。

【0592】

２７３．前記ゲノム改変が、前記標的ＤＮＡ配列内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｔ変異を導入することを含む、実施形態２４７～２７２のいずれか１つに記載の方法。

【0593】

２７４．前記ゲノム改変が、前記標的ＤＮＡ配列内に少なくとも１つのヌクレオチドのＣ＞Ｇ変異を導入することを含む、実施形態２４７～２７２のいずれか１つに記載の方法。

【0594】

２７５．前記細胞が動物細胞である、実施形態２４７～２７４のいずれか１つに記載の方法。

【0595】

２７６．前記動物細胞が哺乳類細胞である、実施形態２７５に記載の方法。

【0596】

２７７．前記細胞が、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、ブタ、またはヒトに由来する、実施形態２７６に記載の方法。

【0597】

２７８．前記原因変異の修正がナンセンス変異の修正を含む、実施形態２４７～２７７のいずれか１つに記載の方法。

【0598】

２７９．前記遺伝性疾患が表２３に掲載されている疾患である、実施形態２４７～２７８のいずれか１つに記載の方法。

【0599】

２８０．前記ｇＲＮＡが、配列番号１２２～１４４のいずれか１つを標的とするスペーサ配列、またはその相補体をさらに含む、実施形態２７９に記載の方法。

【0600】

２８１．ａ）ＤＮＡ結合ポリペプチドとシトシンデアミナーゼを含む融合タンパク質、または前記融合タンパク質をコードする核酸分子と；
ｂ）第２のシトシンデアミナーゼ、または前記第２のデアミナーゼをコードする核酸分子（ただし前記第２のデアミナーゼは、
ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）
を含む組成物。

【0601】

２８２．前記第２のシトシンデアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態２８１に記載の組成物。

【0602】

２８３．前記第２のシトシンデアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態２８１に記載の組成物。

【0603】

２８４．前記第１のシトシンデアミナーゼが、
ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ、実施形態２８１～２８３のいずれか１つに記載の組成物。

【0604】

２８５．前記第１のシトシンデアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態２８１～２８４のいずれか１つに記載の組成物。

【0605】

２８６．前記第１のシトシンデアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態２８１～２８４のいずれか１つに記載の組成物。

【0606】

２８７．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、実施形態２８１～２８６のいずれか１つに記載の組成物。

【0607】

２８８．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２８１～２８６のいずれか１つに記載の組成物。

【0608】

２８９．前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態２８８に記載の組成物。

【0609】

２９０．前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態２８９に記載の組成物。

【0610】

２９１．前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態２８９に記載の組成物。

【0611】

２９２．融合タンパク質をコードする核酸分子と第２のシトシンデアミナーゼをコードする核酸分子を含むベクター（ただし前記融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ポリペプチドと第１のシトシンデアミナーゼを含み、前記第２のシトシンデアミナーゼは、
ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）。

【0612】

２９３．前記第２のシトシンデアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態２９２に記載のベクター。

【0613】

２９４．前記第２のシトシンデアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態２９２に記載のベクター。

【0614】

２９５．前記第１のシトシンデアミナーゼが、
ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ、実施形態２９２～２９４のいずれか１つに記載のベクター。

【0615】

２９６．前記第１のシトシンデアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態２９２～２９４のいずれか１つに記載のベクター。

【0616】

２９７．前記第１のシトシンデアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態２９２～２９４のいずれか１つに記載のベクター。

【0617】

２９８．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、実施形態２９２～２９７のいずれか１つに記載のベクター。

【0618】

２９９．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態２９２～２９７のいずれか１つに記載のベクター。

【0619】

３００．前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態２９９に記載のベクター。

【0620】

３０１．前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態３００に記載のベクター。

【0621】

３０２．前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態３００に記載のベクター。

【0622】

３０３．実施形態２９２～３０２のいずれか１つに記載のベクターを含む細胞。

【0623】

３０４．ａ）ＤＮＡ結合ポリペプチドと第１のシトシンデアミナーゼを含む融合タンパク質；または前記融合タンパク質をコードする核酸分子と；
ｂ）第２のシトシンデアミナーゼ、または前記第２のデアミナーゼをコードする核酸分子（ただし前記第２のデアミナーゼは、
ｉ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｉｉ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ）
を含む細胞。

【0624】

３０５．前記第２のシトシンデアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態３０４に記載の細胞。

【0625】

３０６．前記第２のシトシンデアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態３０４に記載の細胞。

【0626】

３０７．前記第１のシトシンデアミナーゼが、
ａ）配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９０％一致する配列を持つアミノ酸配列と；
ｂ）配列番号４または６と少なくとも９５％一致する配列を持つアミノ酸配列
からなる群から選択されるアミノ酸配列を持つ、実施形態３０４～３０６のいずれか１つに記載の細胞。

【0627】

３０８．前記第１のシトシンデアミナーゼが、配列番号２と７～１２のいずれか１つと少なくとも９５％一致する配列を持つ、実施形態３０４～３０６のいずれか１つに記載の細胞。

【0628】

３０９．前記第１のシトシンデアミナーゼが、配列番号２、４、および６～１２のいずれか１つと１００％一致する配列を持つ、実施形態３０４～３０６のいずれか１つに記載の細胞。

【0629】

３１０．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドが、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮであるか；メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガー融合タンパク質、またはＴＡＬＥＮのバリアントであり、前記ヌクレアーゼ活性が低下しているか阻害されている、実施形態３０４～３０９のいずれか１つに記載の細胞。

【0630】

３１１．前記ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドである、実施形態３０４～３０９のいずれか１つに記載の細胞。

【0631】

３１２．前記ＲＮＡ誘導型ＤＮＡ結合ポリペプチドがＲＮＡ誘導型ヌクレアーゼ（ＲＧＮ）ポリペプチドである、実施形態３１１に記載の細胞。

【0632】

３１３．前記ＲＧＮがＲＧＮニッカーゼである、実施形態３１２に記載の細胞。

【0633】

３１４．前記ＲＧＮがヌクレアーゼ不活性なＲＧＮである、実施形態３１２に記載の細胞。

【0634】

３１５．医薬として許容可能な基剤を含むとともに、実施形態２８１～２９１のいずれか１つに記載の組成物、実施形態２９２～３０２のいずれか１つに記載のベクター、または実施形態３０３～３１４のいずれか１つに記載の細胞を含む医薬組成物。

【0635】

３１６．疾患を治療する方法であって、それを必要とする対象に、実施形態３３～６３のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態１０２～１０５と２９２～３０２のいずれか１つに記載のベクター、実施形態１１３～１１８、２３９～２４３、および３０３～３１４のいずれか１つに記載の細胞、実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系、実施形態１７２に記載のリボ核タンパク質複合体、実施形態２８１～２９１のいずれか１つに記載の組成物、または実施形態１２４、１８６、２４６、および３１５のいずれか１つに記載の医薬組成物を投与することを含む方法。

【0636】

３１７．前記疾患が原因変異と関係しており、前記医薬組成物が前記原因変異を修正する、実施形態３１６に記載の方法。

【0637】

３１８．前記疾患が表２３に掲載されている疾患疾患である、実施形態３１６または３１７に記載の方法。

【0638】

３１９．対象における疾患を治療するための、実施形態３３～６３のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態１０２～１０５と２９２～３０２のいずれか１つに記載のベクター、実施形態１１３～１１８、２３９～２４３、および３０３～３１４のいずれか１つに記載の細胞、実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系、実施形態１７２に記載のリボ核タンパク質複合体、または実施形態２８１～２９１のいずれか１つに記載の組成物の利用。

【0639】

３２０．前記疾患が原因変異に関係しており、前記治療が前記原因変異を修正することを含む、実施形態３１９に記載の利用。

【0640】

３２１．前記疾患が表２３に掲載されている疾患である、実施形態３１９または３２０に記載の利用。

【0641】

３２２．疾患の治療に有用な薬を製造するための、実施形態３３～６３のいずれか１つに記載の融合タンパク質、実施形態６４～１０１のいずれか１つに記載の核酸分子、実施形態１０２～１０５と２９２～３０２のいずれか１つに記載のベクター、実施形態１１３～１１８、２３９～２４３、および３０３～３１４のいずれか１つに記載の細胞、実施形態１３０～１７１のいずれか１つに記載の系、実施形態１７２に記載のリボ核タンパク質複合体、または実施形態２８１～２９１のいずれか１つに記載の組成物の利用。

【0642】

３２３．前記疾患が原因変異と関係しており、前記薬の有効量が前記原因変異を修正する、実施形態３２２に記載の利用。

【0643】

３２４．前記疾患が表２３に掲載されている疾患である、実施形態３２２または３２３に記載の利用。

【0644】

以下の実施例は説明のために提供されているのであり、限定のためではない。

【0645】

実験

【0646】

実施例１：哺乳類細胞におけるＣ塩基編集の実証

【0647】

配列番号１、３、および５として示されているデアミナーゼが両端から短縮され、その短縮型デアミナーゼが配列番号２、４、および６として示されている。細菌に由来するシトシンデアミナーゼＲＧＮが配列番号７～１２として示されている。

【0648】

【表2】

【0649】

表２のデアミナーゼが哺乳類細胞の中でシトシン塩基編集を実施できるかどうか明らかにするため、各デアミナーゼをＲＧＮニッカーゼに機能可能に融合させて融合タンパク質を作製した。（ＰＣＴ公開第ＷＯ ２０１９／２３６５６６号（参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている）ＲＧＮ ＡＰＧ０７４３３．１（配列番号７４）のＲｕｖＣドメインを脱活性化すると予測される残基を同定し、ＲＧＮを改変してニッカーゼバリアントにした（ｎＡＰＧ０７４３３．１；配列番号７５）。ＲＧＮのニッカーゼバリアントを本明細書では「ｎＲＧＮ」と呼ぶ。ＲＧＮの任意のニッカーゼバリアントを用いて本発明の融合タンパク質を作製できることを理解すべきである。

【0650】

デアミナーゼと、哺乳類での発現にコドンが最適化されたｎＲＧＮヌクレオチド配列を、Ｎ末端核局在化タグを持つ融合タンパク質として合成し、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）発現プラスミドにクローニングした。それぞれの融合タンパク質は、アミノ末端から出発すると、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号７６）、そのＣ末端に機能可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ（配列番号７７）、そのＣ末端に機能可能に連結されたデアミナーゼ、そのＣ末端に機能可能に連結されたペプチドリンカー（Ｌ１６またはＬ３２；それぞれ配列番号７８または７９として示される）、そのＣ末端に機能可能に連結されたｎＲＧＮ（例えば配列番号７５のｎＡＰＧ０７４３３．１）、最後にそのＣ末端に機能可能に連結されたヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号８０）を含む。表３は、作製して活性を調べた融合タンパク質を示す。すべての融合タンパク質が、上に記載したように、少なくとも１つのＮＬＳと３×ＦＬＡＧタグを含む。表３の中のＡＰＧ０５８４０．１－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２融合タンパク質は、（配列番号８１として示されている）ウラシル安定化タンパク質ＵＳＰ２をｎＲＧＮとヌクレオプラスミンＮＬＳの間にさらに含む。この融合タンパク質は、配列番号１２０として示されている配列を持つペプチドリンカーもｎＡＰＧ０７４３３．１とＵＳＰ２の間に含む。

【0651】

【表3】

【0652】

ｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む発現プラスミドも作製した。ヒトゲノム標的配列と、融合タンパク質をゲノム標的に導くｓｇＲＮＡ配列は、表４に示されている。

【0653】

【表4】

【0654】

表３に示されている各融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドと、表４に示されているｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドを同時に、２４ウエルのプレートの中で７５～９０％の集密度になったＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトした。その後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ９６ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造者のプロトコルに従って用いてゲノムＤＮＡを抽出した。標的とするゲノム部位に隣接するゲノム領域を、表４のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、産物を、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者のプロトコルに従って用いて精製した。その後、精製したＰＣＲ産物を次世代シークエンシングのためＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（２×２５０）に送った。結果を、ＩＮＤＥＬの形成、または特異的シトシン変異の導入に関して分析した。

【0655】

表５は、表３からの融合タンパク質と表４からのガイドＲＮＡのそれぞれの組み合わせに関するすべてのシトシン塩基編集を示す。表６～１１は、選択された代表的サンプルに関する具体的なヌクレオチド変異プロファイルを示す。標的配列内の各ヌクレオチドの位置を求めた。例えば「Ｃ１７」は、標的配列の１７位のシトシンを示す。標的配列内の各ヌクレオチドの位置は、標的配列内でＰＡＭに最も近い最初のヌクレオチドを１位にすることによって求め、位置番号はＰＡＭ配列から３´方向に離れるにつれて増加する。表６～１１は、シトシンがどのヌクレオチドへとどれだけの割合で変化したかも示す。例えば表６は、ＡＰＧ３０１２７－ｎＡＰＧ０７４３３．１融合タンパク質について、１７位のシトシンがチミジンへと０．２％の割合で変異したことを示す。

【0656】

【表5-1】

【表5-2】

【0657】

【表6】

【0658】

ＡＰＧ３０１２７は、Ｃ１７位で主にＣ＞Ｇ変換を示した。

【0659】

【表7】

【0660】

ＡＰＧ３０１２７は複数の位置（Ｃ１０、Ｃ１２、およびＣ１７が含まれる）でＣ＞Ｔ変換を示す。Ｃ１７位にはＣ＞Ｇ変換とＣ＞Ａ変換も存在する。

【0661】

【表8】

【0662】

ＡＰＧ３０１２９は、Ｃ１０位、Ｃ１２位、およびＣ１７位でＣ＞Ｔ変換を示す。

【0663】

【表9】

【0664】

ＡＰＧ３０１２５は、Ｃ１０位、Ｃ１２位、およびＣ１７位でＣ＞Ｔ変換を示す。すべての位置で、Ｃ＞Ｇ変換とＣ＞Ａ変換がＡＰＧ３０１２９サンプルとＡＰＧ３０１２７サンプルよりも少ない。

【0665】

【表10】

【0666】

１６アミノ酸リンカー（Ｌ１６）とウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ２）を持つ短縮型ＡＰＧ０５８４０（ＡＰＧ０５８４０．１）を調べた。このコンストラクトは、標的ＳＧＮ０００１６９内のいくつかの位置（Ｃ９、Ｃ１３、Ｃ１５、Ｃ２０、およびＣ２３が含まれる）で高レベルの特異的Ｃ＞Ｔ編集を示した。これは、部位特異的単一ヌクレオチド編集を生じさせるのに短縮されたデアミナーゼとより短いリンカーを相変わらず使用できることを実証している。

【0667】

【表11】

【0668】

１６アミノ酸リンカー（Ｌ１６）とウラシル安定化タンパク質（ＵＳＰ２）を持つ短縮型ＡＰＧ０５８４０（ＡＰＧ０５８４０．１）を調べた。このコンストラクトは、標的ＳＧＮ０００１７３内のいくつかの位置（Ｃ７、Ｃ８、Ｃ１０、およびＣ１７が含まれる）で高レベルの特異的Ｃ＞Ｔ編集を示した。

【0669】

実施例２：ＲＧＮとは独立なシトシンデアミナーゼ駆動オフ－ターゲット効果アッセイ

【0670】

シトシンデアミナーゼがｓｓＤＮＡに対して何らかの変異効果を及ぼすかどうかを明らかにするため、ＲＧＮとは独立なオフ－ターゲット変異アッセイを実施した。（ＰＣＴ公開第ＷＯ２０２１／２１７００２号（その全体が参照によって本明細書に組み込まれている）に記載されている）ＲＧＮ ＡＰＧ０９２９８（配列番号８２）のＲｕｖＣドメインとＨＮＨドメインを脱活性化することが予想される残基を同定し、ＲＧＮを改変してデッドバリアント（ｄＡＰＧ０９２９８；配列番号８３）にした。

【0671】

発現のためコドンが最適化されたｄＲＧＮヌクレオチド配列を、Ｎ末端核局在化タグを持つ融合タンパク質として合成し、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）発現プラスミドにクローニングした。このｄＲＧＮ融合タンパク質は、アミノ末端から出発すると、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号７６）、そのＣ末端に機能可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ（配列番号７７）、そのＣ末端に機能可能に連結されたｄＲＧＮ（例えば配列番号８３であるｄＡＰＧ０９２９８）、最後にそのＣ末端に機能可能に連結されたヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号８０）を含んでおり、ＮＬＳ－ｄＡＰＧ０９２９８－ＮＬＳ（配列番号８４）を構成している。このコンストラクトを用い、Ｒループ内にあってシトシンデアミナーゼ塩基エディタによって編集される標的配列とは無関係の位置にｓｓＤＮＡを創出した。

【0672】

ｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む発現プラスミドを作製した。ヒトゲノム標的配列と、融合タンパク質をゲノム標的へと導くｓｇＲＮＡ配列は、表４に示されている。

【0673】

【表12】

【0674】

表３に示されている融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドと、表４に示されているｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドと、ＮＬＳ－ｄＡＰＧ０９２９８－ＮＬＳのコード配列を含む発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドと、表１２に示されているｄＡＰＧ０９２９８のためのｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドを同時に、２４ウエルのプレートの中で７５～９０％の集密度になったＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトした。その後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ９６ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造者のプロトコルに従って用いてゲノムＤＮＡを抽出した。標的となるゲノム部位に隣接するゲノム領域を、表４または表１２の中のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者のプロトコルに従って用いて産物を精製した。その後、精製したＰＣＲ産物を次世代シークエンシングのためＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（２×２５０）に送った。結果を、ＩＮＤＥＬの形成または特異的シトシン変異に関して分析した。オン－ターゲットの結果は、表４の中のアンプリコンによって同定されたものであった。ＲＧＮとは独立なオフ－ターゲットの結果は、表１２の中のアンプリコンによって同定されたものであった。

【0675】

【表13】

【0676】

各サンプルで想定されるオン－ターゲット部位は高レベルのシトシン特異的変異を示した。ＳＧＮ００１１６５においてｄＡＰＧ０９２９８が結合したオフ－ターゲット部位は、６つのサンプルのうちの５つで変異したリードを示さなかった。調べた１つの標的はオフ－ターゲット位置で低い変異率を示し、リードの０．９９％が変異を持っていた。これらはＲＧＮとは独立でデアミナーゼによって駆動される変異効果である可能性があるが、サンプル中の割合が少ないことによるシークエンシングのエラーである可能性もある。

【0677】

実施例３：哺乳類細胞におけるＣ＞Ｇ塩基編集の実証

【0678】

これらの研究では、融合タンパク質の中のデアミナーゼとＲＧＮの互いに対する向きが、得られたＣ塩基エディタによって起こる塩基編集のタイプに影響を与えるかどうかを評価した。

【0679】

ＲｕｖＣドメイン（配列番号７４；ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１９／２３６５６６号（参照によって本明細書に組み込まれている））を脱活性化すると予測される残基を同定し、ＲＧＮを改変してニッカーゼバリアント（ｎＡＰＧ０７４３３．１；配列番号７５）にした。

【0680】

デアミナーゼ（ＡＰＧ０９９８０とＡＰＧ０５８４０；それぞれ配列番号１と３として示されている）と、発現のためコドンが最適化されたｎＡＰＧ０７４３３．１ヌクレオチド配列を、Ｎ末端核局在化タグを持つ融合タンパク質として合成し、ｐＴｗｉｓｔ ＣＭＶ（Ｔｗｉｓｔ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）発現プラスミドにクローニングした。それぞれの融合タンパク質は、アミノ末端から出発すると、ＳＶ４０ ＮＬＳ（配列番号７６）、そのＣ末端に機能可能に連結された３×ＦＬＡＧタグ（配列番号７７）、そのＣ末端に機能可能に連結されたｎＲＧＮ－デアミナーゼ、ペプチドリンカー（配列番号７９）によって接続されたデアミナーゼ－ｎＲＧＮ－ＵＳＰ２またはデアミナーゼ－ｎＲＧＮ融合タンパク質、最後にそのＣ末端に機能可能に連結されたヌクレオプラスミンＮＬＳ（配列番号８０）を含む。表１４は、作製して活性を調べた融合タンパク質を示す。すべての融合タンパク質が、上に記載したように、少なくとも１つのＮＬＳと３×ＦＬＡＧタグを含む。表１４の中の融合タンパク質ＡＰＧ０９９８０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２とＡＰＧ０５８４０．１－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２は、（配列番号８１として示される）ウラシル安定化タンパク質ＵＳＰ２をｎＲＧＮとヌクレオプラスミンＮＬＳの間にさらに含む。融合タンパク質ＡＰＧ０９９８０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２とＡＰＧ０５８４０．１－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２は、配列番号１２０として示される配列を持つペプチドリンカーもｎＡＰＧ０７４３３．１とＵＳＰ２の間に含む。

【0681】

【表14】

【0682】

ｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む発現プラスミドも作製した。ヒトゲノム標的配列と、融合タンパク質をゲノム標的に導くｓｇＲＮＡ配列は、表１５に示されている。

【0683】

【表15】

【0684】

表１４に示されている融合タンパク質のコード配列を含む発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドと、表１５に示されているｓｇＲＮＡをコードする発現カセットを含む５００ｎｇのプラスミドを同時に、２４ウエルのプレートの中で７５～９０％の集密度になったＨＥＫ２９３ＦＴ細胞にＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００試薬（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてトランスフェクトした。その後、細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。インキュベーションの後、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ ９６ Ｔｉｓｓｕｅ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－Ｎａｇｅｌ）を製造者のプロトコルに従って用いてゲノムＤＮＡを抽出した。標的となるゲノム部位に隣接するゲノム領域を、表１５の中のプライマーを用いてＰＣＲで増幅し、ＺＲ－９６ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を製造者のプロトコルに従って用いて産物を精製した。その後、精製したＰＣＲ産物を次世代シークエンシングのためＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑ（２×２５０）に送った。結果を、ＩＮＤＥＬ形成または特異的シトシン変異に関して分析した。

【0685】

表１６～２０は、表１４からの融合タンパク質と表１５からのガイドＲＮＡの各組み合わせに関するシトシン塩基編集を示す。標的配列内の各ヌクレオチドの位置を求めた。「Ｃ１６」は、例えば標的配列の１６位にあるシトシンを示す。標的配列内の各ヌクレオチドの位置は、標的配列内でＰＡＭに最も近い最初のヌクレオチドを１位にすることによって求め、位置番号はＰＡＭ配列から３´方向に離れるにつれて増加する。表１６～２０は、シトシンがどのヌクレオチドへとどれだけの割合で変化したかも示す。例えば表１６は、ＡＰＧ０５８４０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２融合タンパク質について、１６位のシトシンがチミジンへと１１％の割合で変異したことを示す。

【0686】

【表16】

【0687】

コンストラクトＡＰＧ０５８４０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２全体の中でデアミナーゼがＮ末端上にある向きでは、ＳＧＮ０００９２８内のＣ１６位とＣ２１位で高レベルの特異的Ｃ＞Ｔ変換が明らかである。

【0688】

【表17】

【0689】

コンストラクトＡＰＧ０５８４０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２全体の中でデアミナーゼがＮ末端上にある向きでは、ＳＧＮ０００９３０内のＣ１７位とＣ２２位で高レベルの特異的Ｃ＞Ｔ変換が明らかである。いくらかのＣ＞Ｇ変換がＣ１７位で明らかである。

【0690】

【表18】

【0691】

ニッカーゼにつながれたデアミナーゼの向きが逆転し、デアミナーゼがＣ末端につながれているとき、主要な編集結果は、標的ＳＧＮ０００９２８内のＣ１６位のＣ＞Ｇ変換である。Ｎ末端にある構成と比べて非常に少ないＣ＞Ｔ変換が明らかである。

【0692】

【表19】

【0693】

デアミナーゼがニッカーゼのＣ末端につながれているとき、主要な編集結果は、標的ＳＧＮ０００９３０内のＣ１７位のＣ＞Ｇ変換である。

【0694】

【表20】

【0695】

第２のデアミナーゼモジュールＡＰＧ０９９８０を用いると、ニッカーゼのＣ末端につながれているときに優勢な変異結果はＣ１７位のＣ＞Ｇ変換であるという同じ傾向が明らかである。

【0696】

【表21】

【0697】

ＡＰＧ０５８４０がｎＡＰＧ０７４３３．１のＮ末端につながれているとき、主要な変異結果はガイドＳＧＮ０００９３０を用いたＣ１７位のＣ＞Ｇ変換である。

【0698】

【表22】

【0699】

この表の中のデータは多数回の編集実験の平均である。変異したリードの割合は、各サンプル中の塩基編集率の推定値である。欠失を持つリードの割合は、サンプル中の欠失率の推定値である。ｎＡＰＧ０７４３３．１へのＡＰＧ０９９８０のＣ末端融合体は、ＵＳＰありとＵＳＰなしのＮ末端融合体よりも低い欠失率を持つ。

【0700】

ＡＰＧ０５８４０－ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＵＳＰ２は、ガイドＳＧＮ０００９３０の中のＣ１７位と、ＳＧＮ０００９２８の中のＣ１６位とＣ２１位の位置で主にＣ＞Ｔ変換を示した。ｎＡＰＧ０７４３３．１－ＡＰＧ０９９８０とｎＡＰＧ０７４３３．１－ＡＰＧ０５８４０は、これら同じ位置で主にＣ＞Ｇ変換を示した。すべてのコンストラクトが同じウインドウ内で編集を示した。

【0701】

実施例４：疾患原因変異を修正するための標的を絞った塩基編集

【0702】

ｗｏｒｌｄ ｗｉｄｅ ｗｅｂを通じてＮＣＢＩ ＣｌｉｎＶａｒウェブサイトで入手できるＮＣＢＩ ＣｌｉｎＶａｒデータベースから臨床バリアントのデータベースを取得した。病原性単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）をこのリストから同定した。ゲノム遺伝子座の情報を利用して、各ＳＮＰと重複するか各ＳＮＰを取り囲む領域内のＣＲＩＳＰＲ標的を同定した。原因変異を標的とするためにＲＧＮ（例えばＡＰＧ０７４３３．１またはそのバリアントなど）と組み合わせた塩基編集を利用して修正できる一群のＳＮＰが表２３に掲載されている。下記の表２３には、各疾患の１つの通称だけが掲載されている。「ＲＳ＃」は、ＮＣＢＩウェブサイトのＳＮＰデータベースにおけるＲＳアクセッション番号に対応する。「名称」の列は、遺伝子座の識別子、遺伝子名、遺伝子内の変異の位置、および変異から生じた変化を含有する。

【0703】

【表23】

【0704】

実施例５：植物細胞における遺伝子編集活性の実証

【0705】

Ｌｉら、２０１３年（Ｎａｔ． Ｂｉｏｔｅｃｈ． ３１：６８８－６９１）から改変したプロトコルを用いて本発明のＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質の塩基編集活性を植物細胞で実証する。簡単に述べると、ＳＶ４０核局在化シグナル（配列番号７６）に機能可能に連結されたＲＧＮ－デアミナーゼ融合タンパク質を植物細胞の中で発現させることのできる発現カセットと、植物ＰＤＳ遺伝子の中にあって適切なＰＡＭ配列に隣接した１つ以上の部位を標的とするガイドＲＮＡをコードする第２の発現カセットを含む発現ベクターを、ＰＥＧを媒介とする形質転換を利用してベンサミアナタバコ葉肉プロトプラストに導入する。形質転換されたプロトプラストを暗所で３６時間までインキュベートする。ＤＮｅａｓｙ Ｐｌａｎｔ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡをプロトプラストから単離する。ＲＧＮ標的部位に隣接するゲノム領域をＰＣＲで増幅し、産物を精製し、精製したＰＣＲ産物をＩｌｌｕｍｉｎａ ＭｉＳｅｑで次世代シークエンシングを利用して分析する。典型的には、アンプリコンごとに１００，０００個の２５０ｂｐのペアード－エンドリード（２×１００，０００リード）が生成する。ＣＲＩＳＰＲｅｓｓｏ（Ｐｉｎｅｌｌｏ， ｅｔ ａｌ． ２０１６ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ， ３４：６９５－６９７）を用いてリードを分析し、編集率を計算する。出力アラインメントをＩＮＤＥＬ情報、または特定のシトシン変異の導入に関して分析する。

【配列表】

2024511131000001.app

【国際調査報告】