特表2024-511132バイオリアクター糖化種の製造のためのマルチパラメータ材料、方法、及びシステム
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-12
(54)【発明の名称】バイオリアクター糖化種の製造のためのマルチパラメータ材料、方法、及びシステム
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240305BHJP
C12M 1/34 20060101ALI20240305BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
C12M1/34 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023558570
(86)(22)【出願日】2022-03-22
(85)【翻訳文提出日】2023-11-14
(86)【国際出願番号】 US2022021295
(87)【国際公開番号】W WO2022204107
(87)【国際公開日】2022-09-29
(31)【優先権主張番号】63/165,074
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/165,063
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/165,067
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/165,071
(32)【優先日】2021-03-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】509087759
【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100095360
【弁理士】
【氏名又は名称】片山 英二
(74)【代理人】
【識別番号】100093676
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 純子
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100128761
【弁理士】
【氏名又は名称】田村 恭子
(72)【発明者】
【氏名】オマホニー－ハートネット，ケイトリン
(72)【発明者】
【氏名】マッカーシー，バリー，ジェイ．
(72)【発明者】
【氏名】ロード，クリストファー，ダブリュー．
(72)【発明者】
【氏名】ヘイズ，ロナン
(72)【発明者】
【氏名】マッデン，フィオナ
(72)【発明者】
【氏名】モウ，ジンジェ
(72)【発明者】
【氏名】マスランカ，フランシス，シー．
(72)【発明者】
【氏名】クラーク，ケビン
(72)【発明者】
【氏名】トラウト，ダニエル，エー．
(72)【発明者】
【氏名】ラナ，プシュプラジ
(72)【発明者】
【氏名】グラツィア，エマヌエーラ
(72)【発明者】
【氏名】ラファーティ，カール
(72)【発明者】
【氏名】バルス，カリーン，エム．
【テーマコード（参考）】
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA07
4B029BB11
4B029DG10
4B029FA12
4B063QA01
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4B063QR44
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4B063QS36
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
分光分析と計量化学モデリングとの組み合わせの使用を通して、分子上の糖化及び／又はグリコシル化分子上のグリカン構造を決定するための方法が記載される。加えて、非糖化分子を含む所望のレベルの糖化、及び／又はグリコシル化分子上の所望のレベルのグリカン構造を有する分子を産生するための方法及びシステムが記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
分子上の糖化を決定するための方法であって、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、複数の実行の各々について、前記分子上の糖化レベルを取得することであって、前記取得することが、第１の閾値以下の第１の体積を有する１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクター内で行われ、前記ＰＡＴツールが、スペクトルデータを取得することである、前記取得することと、
前記取得されたスペクトルデータに基づいて、前記分子上の糖化レベルを前記取得されたスペクトルデータと相関させる１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成することと、
前記ＰＡＴツールを使用して、前記分子上の糖化を測定することであって、前記測定することが、第２の閾値以上の第２の体積を有する１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内で行われて、測定されたスペクトルデータが得られることである、前記測定することと、
前記生成された１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ前記測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内の前記分子上の糖化レベルを決定することと、を含む、方法。
【請求項2】
前記取得されたスペクトルデータ及び前記測定されたスペクトルデータの組み合わせに基づいて、前記１つ又は２つ以上の回帰モデルを精緻化することを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記分子上の所望の糖化レベルを産生するために、前記決定されたレベルに基づいて、前記１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持することを更に含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記分子上の所望の糖化レベルを産生するために、前記決定されたレベルに基づいて、前記第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正することを更に含み、前記１つ又は２つ以上の動作パラメータが、任意選択的に、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含み、
前記栄養素レベルが、任意選択的に、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択され、
前記グルコースの濃度が、任意選択的に、前記測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項5】
前記取得することが、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクター内で行われる、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
（ａ）前記第１の閾値が、（ｉ）約２５０リットル以下、
（ｉｉ）約１００リットル以下、
（ｉｉｉ）約５０リットル以下、
（ｉｖ）約２５リットル以下、
（ｖ）約１０リットル以下、
（ｖｉ）約５リットル以下、
（ｖｉｉ）約２リットル以下、
（ｖｉｉｉ）約１リットル以下であり、かつ／又は
（ｂ）前記第２の閾値が、
（ｉ）約１，０００リットル以上、
（ｉｉ）約２，０００リットル以上、
（ｉｉｉ）約５，０００リットル以上、
（ｉｖ）約１０，０００リットル以上、
（ｖ）約１５，０００リットル以上、
（ｖｉ）約１０，０００～約２５，０００リットル、
（ｖｉｉ）前記第１の閾値よりも少なくとも５倍大きい、
（ｖｉｉｉ）前記第１の閾値よりも少なくとも１０倍大きい、
（ｉｘ）前記第１の閾値よりも少なくとも１００倍大きい、若しくは
（ｘ）前記第１の閾値よりも少なくとも５００倍大きい、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
（ａ）前記第１の体積が、（ｉ）約０．５～約２５０リットル、
（ｉｉ）約１～約５０リットル、
（ｉｉｉ）約１～約２５リットル、
（ｉｖ）約１～約１０リットル、若しくは
（ｖ）約１～約５リットルであり、かつ／又は
（ｂ）前記第２の体積が、
（ｉ）約１，０００～約２５，０００リットル、
（ｉｉ）約２，０００～約２５，０００リットル、
（ｉｉｉ）約５，０００～約２５，０００リットル、
（ｉｖ）約１０，０００～約２５，０００リットル、若しくは
（ｖ）約１５，０００～約２５，０００リットルである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又は非ｍＡｂである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記決定するステップが、（ａ）オンサイト若しくはオフサイト、及び／又は
（ｂ）インライン、アットライン、オンライン、オフライン、若しくはそれらの組み合わせで行われる、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
所望のレベルの糖化を有する分子を産生する方法であって、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、前記分子上の糖化を測定して、スペクトルデータを得ることであって、前記測定することが、１，０００リットル以上の体積を有するバイオリアクター内で行われるものである、前記測定することと、
１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ前記測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、前記バイオリアクター内の前記分子上の糖化のレベルを決定することであって、前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、５０リットル以下の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクター及び１，０００リットル以上の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクターからの試行実行を使用して生成されるものである、前記決定することと、
前記バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを、
前記分子上の前記糖化のレベルが所定の閾値を下回る場合、維持することと、
前記バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを、
前記分子上の前記糖化のレベルが所定の閾値を上回る場合、選択的に修正することと、を含む、方法。
【請求項13】
測定することが、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
測定することが、（ａ）１日２回以上、
（ｂ）約５～６０分毎、
（ｃ）約１０～３０分毎、
（ｄ）約１０～２０分毎、又は
（ｅ）約１２．５分毎に行われる、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
測定することが、（ａ）約２，０００リットル以上、
（ｂ）約５，０００リットル以上、
（ｃ）約１０，０００リットル以上、
（ｄ）約１５，０００リットル以上、
（ｅ）約１０，０００リットル～約２５，０００リットル、又は
（ｆ）約１５，０００リットルの体積を有するバイオリアクター内で行われる、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記決定するステップが、オンサイト又はオフサイトで行われる、請求項１２～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記測定された糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせである、請求項１２～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記バイオリアクターが、バッチリアクター、流加リアクター、又は灌流リアクターである、請求項１２～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含み、前記栄養素レベルが、任意選択的に、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択され、
前記グルコースの濃度が、任意選択的に、前記測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、請求項１２～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、請求項１２～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、請求項１２～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記所定の閾値が、前記分子上の約２０％未満の糖化である、請求項１２～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
非糖化分子を産生するためのシステムであって、前記非糖化分子を産生することができる細胞株を培養するための手段と、
糖化のレベルを測定するための手段であって、スペクトルデータを生成する、手段と、
前記スペクトルデータに基づいて１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成するための手段と、
前記細胞株における糖化のレベルを測定するための手段と、を備える、システム。
【請求項24】
前記細胞株が、哺乳動物細胞株であり、任意選択的に、前記哺乳動物細胞株が、非ヒト細胞株である、請求項２３に記載のシステム。
【請求項25】
前記培養することが、バッチ、流加、灌流、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２３又は２４に記載のシステム。
【請求項26】
培養することが、（ａ）約２，０００リットル以上、
（ｂ）約５，０００リットル以上、
（ｃ）約１０，０００リットル以上、
（ｄ）約１５，０００リットル以上、
（ｅ）約１０，０００リットル～約２５，０００リットル、又は
（ｆ）約１５，０００リットルの体積を有する、請求項２３～２５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項27】
測定することが、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる、請求項２３～２６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項28】
測定することが、（ａ）１日２回以上、
（ｂ）約５～６０分毎、
（ｃ）約１０～３０分毎、
（ｄ）約１０～２０分毎、又は
（ｅ）約１２．５分毎に行われる、請求項２３～２７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項29】
前記測定された糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２３～２８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項30】
前記非糖化分子の産生を増強するために、１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正するための手段を更に備え、前記１つ又は２つ以上の動作パラメータが、任意選択的に、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含み、
前記栄養素レベルが、任意選択的に、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択され、
前記グルコースの濃度が、任意選択的に、前記測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、請求項２３～２９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項31】
１つ又は２つ以上のグリコシル化分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）又は非ｍＡｂを含む、請求項２３～３０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項32】
前記スペクトルデータが、ラマンスペクトルを含む、請求項２３～３１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項33】
前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、請求項２３～３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項34】
非糖化分子を産生するためのシステムであって、前記非糖化分子を産生することができる細胞株を含むバイオリアクターと、
糖化を測定し、スペクトルデータを生成するプロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールと、
１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、糖化のレベルを前記スペクトルデータと相関させるプロセッサと、を備える、システム。
【請求項35】
前記バイオリアクターが、（ａ）約２，０００リットル以上、
（ｂ）約５，０００リットル以上、
（ｃ）約１０，０００リットル以上、
（ｄ）約１５，０００リットル以上、
（ｅ）約１０，０００リットル～約２５，０００リットル、又は
（ｆ）約１５，０００リットルである、請求項３４に記載のシステム。
【請求項36】
前記糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３４又は３５に記載のシステム。
【請求項37】
前記細胞株が、哺乳動物細胞株であり、任意選択的に、前記哺乳動物細胞株が、非ヒト細胞株である、請求項３４～３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項38】
前記ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、請求項３４～３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項39】
前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、請求項３４～３８のいずれか一項に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０６３号、２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０６７号、２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０７１号、及び２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０７４号の優先権を主張するものであり、これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０６３号、２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０６７号、２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０７１号、及び２０２１年３月２３日に出願された米国特許出願第６３／１６５，０７４号の優先権を主張するものであり、これらの各々の開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
（発明の分野）
本開示は、部分的には、強化されたバイオリアクター製造のためのマルチパラメータ材料、方法、及びシステムに関する。具体的には、本開示は、生産プロセス中に治療用タンパク質［例えば、組換えタンパク質及び／又はモノクローナル抗体、（monoclonal antibody、ｍＡｂ）］の糖化を制御及び監視するための方法及びシステムに関する。
本開示は、部分的には、強化されたバイオリアクター製造のためのマルチパラメータ材料、方法、及びシステムに関する。具体的には、本開示は、生産プロセス中に治療用タンパク質［例えば、組換えタンパク質及び／又はモノクローナル抗体、（monoclonal antibody、ｍＡｂ）］の糖化を制御及び監視するための方法及びシステムに関する。
【背景技術】
【0003】
糖化及びグリコシル化は、治療用タンパク質の生産において考慮されるべき重要品質特性（Critical Quality Attribute、ＣＱＡ）と考えられてきた。例えば、糖化は、治療用タンパク質の生物活性及び分子安定性に影響を及ぼす可能性がある。更に、治療用タンパク質のグリコシル化は、インビトロ及びインビボの両方で、タンパク質の凝集、溶解性、及び安定性に影響を与える可能性がある。したがって、糖化及び／又はグリコシル化の検出及び特徴付けは、治療用タンパク質の生産の重要な態様である。
【発明の概要】
【0004】
この背景に対して、本開示の発明者らは、生産プロセス中の分子（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の糖化及び／又はグリコシル化を制御及び監視するための方法及びシステムを発見した。
【0005】
一態様では、本明細書において、分子上の糖化を決定するための方法であって、プロセス分析技術（process analytical technology、ＰＡＴ）ツールを使用して、複数の実行の各々について、分子上の糖化レベルを取得することであって、前記取得することが、第１の閾値以下の第１の体積を有する１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクター内で行われ、ＰＡＴツールが、スペクトルデータを取得することである、前記取得することと、取得されたスペクトルデータに基づいて、分子上の糖化レベルを取得されたスペクトルデータと相関させる１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成することと、ＰＡＴツールを使用して、分子上の糖化を測定することであって、前記測定することが、第２の閾値以上の第２の体積を有する１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内で行われて、測定されたスペクトルデータが得られることである、前記測定することと、生成された１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内の分子上の糖化レベルを決定することと、を含む、方法が提供される。
【0006】
一実施形態では、本方法は、取得されたスペクトルデータと測定されたスペクトルデータとの組み合わせに基づいて、１つ又は２つ以上の回帰モデルを精緻化することを更に含む。
【0007】
一実施形態では、本方法は、分子上の所望の糖化レベルを産生するために、決定されたレベルに基づいて、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持することを更に含む。
【0008】
一実施形態では、本方法は、分子上の所望の糖化レベルを産生するために、決定されたレベルに基づいて、第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正することを更に含む。一実施形態では、１つ又は２つ以上の動作パラメータは、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む。一実施形態では、栄養素レベルは、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される。一実施形態では、グルコースの濃度は、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される。
【0009】
一実施形態では、取得することは、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクター内で行われる。一実施形態では、第１の閾値は、約２５０リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約１００リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約５０リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約２５リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約１０リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約５リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約２リットル以下である。一実施形態では、第１の閾値は、約１リットル以下である。一実施形態では、第２の閾値は、約１，０００リットル以上である。一実施形態では、第２の閾値は、約２，０００リットル以上である。一実施形態では、第２の閾値は、約５，０００リットル以上である。一実施形態では、第２の閾値は、約１０，０００リットル以上である。一実施形態では、第２の閾値は、約１５，０００リットル以上である。一実施形態では、第２の閾値は、約１０，０００～約２５，０００リットルである。一実施形態では、第２の閾値は、約１５，０００リットルである。一実施形態では、第２の閾値は、第１の閾値よりも少なくとも５倍大きい。一実施形態では、第２の閾値は、第１の閾値よりも少なくとも１０倍大きい。一実施形態では、第２の閾値は、第１の閾値よりも少なくとも１００倍大きい。一実施形態では、第２の閾値は、第１の閾値よりも少なくとも５００倍大きい。一実施形態では、第１の体積は、約０．５～約２５０リットルである。一実施形態では、第１の体積は、約１～約５０リットルである。一実施形態では、第１の体積は、約１～約２５リットルである。一実施形態では、第１の体積は、約１～約１０リットルである。一実施形態では、第１の体積は、約１～約５リットルである。一実施形態では、第２の体積は、約１，０００～約２５，０００リットルである。一実施形態では、第２の体積は、約２，０００～約２５，０００リットルである。一実施形態では、第２の体積は、約５，０００～約２５，０００リットルである。一実施形態では、第２の体積は、約１０，０００～約２５，０００リットルである。一実施形態では、第２の体積は、約１５，０００～約２５，０００リットルである。
【0010】
一実施形態では、ＰＡＴツールは、ラマン分光法を含む。
【0011】
一実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（partial least square、ＰＬＳ）モデルを含む。
【0012】
一実施形態では、分子は、モノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）である。一実施形態では、分子は、非ｍＡｂである。
【0013】
一実施形態では、決定するステップは、オンサイトで行われる。一実施形態では、決定するステップは、オフサイトで行われる。一実施形態では、決定するステップは、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる。一実施形態では、決定するステップは、インラインで行われる。一実施形態では、決定するステップは、オンラインで行われる。一実施形態では、決定するステップは、アットラインで行われる。一実施形態では、決定するステップは、オフラインで行われる。
【0014】
一態様では、本明細書において、所望の糖化のレベルを有する分子を産生する方法であって、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、分子上の糖化を測定して、スペクトルデータを得ることであって、前記測定することが、１，０００リットル以上の体積を有するバイオリアクター内で行われるものである、前記測定することと、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、バイオリアクター内の分子上の糖化のレベルを決定することであって、前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、５０リットル以下の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクター及び１，０００リットル以上の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクターからの試行実行を使用して生成されるものである、前記決定することと、分子上の糖化のレベルが所定の閾値を下回る場合、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持することと、分子上の糖化のレベルが所定の閾値を上回る場合、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正することと、を含む、方法が提供される。
【0015】
いくつかの実施形態では、測定することは、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、インラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オンラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、アットラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オフラインで行われる。
【0016】
いくつかの実施形態では、測定することは、１日２回以上行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約５～６０分毎に行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約１０～３０分毎に行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約１０～２０分毎に行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約１２．５分毎に行われる。
【0017】
一実施形態では、バイオリアクター体積は、約２，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約５，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１０，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１５，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルである。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１５，０００リットルである。
【0018】
いくつかの実施形態では、決定するステップは、オンサイトで行われる。いくつかの実施形態では、決定するステップは、オフサイトで行われる。
【0019】
いくつかの実施形態では、測定された糖化は、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせである。
【0020】
いくつかの実施形態では、バイオリアクターは、バッチリアクター、流加リアクター、又は灌流リアクターである。
【0021】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の動作パラメータは、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、栄養素レベルは、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、グルコースの濃度は、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される。
【0022】
いくつかの実施形態では、ＰＡＴツールは、ラマン分光法を含む。
【0023】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む。
【0024】
いくつかの実施形態では、所定の閾値は、分子上の約２０％未満の糖化である。
【0025】
一態様では、本明細書において、非糖化分子を産生するためのシステムであって、非糖化分子を産生することができる細胞株を培養するための手段と、糖化のレベルを測定するための手段と、スペクトルデータを生成する手段と、スペクトルデータに基づいて１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成するための手段と、細胞株における糖化のレベルを測定するための手段と、を備える、システムが提供される。
【0026】
いくつかの実施形態では、細胞株は、哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態では、細胞株は、非ヒト細胞株である。
【0027】
いくつかの実施形態では、培養は、バッチ、流加バッチ、灌流、又はそれらの組み合わせを含む。
【0028】
一実施形態では、培養は、約２，０００リットル以上の体積を含む。一実施形態では、培養は、約５，０００リットル以上の体積を含む。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１０，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１５，０００リットル以上である。一実施形態では、培養は、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルの体積を含む。一実施形態では、培養は、約１５，０００リットルの体積を含む。
【0029】
いくつかの実施形態では、測定することは、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オンラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、アットラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オフラインで行われる。
【0030】
いくつかの実施形態では、測定することは、１日２回以上行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約５～６０分毎に行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約１０～３０分毎に行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約１０～２０分毎に行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、約１２．５分毎に行われる。
【0031】
いくつかの実施形態では、測定された糖化は、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む。
【0032】
いくつかの実施形態では、システムは、非糖化分子の産生を増強するために、１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に改変するための手段を更に備える。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の動作パラメータは、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、栄養素レベルは、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、グルコースの濃度は、スペクトルデータに基づいて自動的に修正される。
【0033】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のグリコシル化分子は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上のグリコシル化分子は、非ｍＡｂを含む。
【0034】
いくつかの実施形態では、スペクトルデータは、ラマンスペクトルを含む。
【0035】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む。
【0036】
一態様では、本明細書において、非糖化分子を産生するためのシステムであって、非糖化分子を産生することができる細胞株を含むバイオリアクターと、糖化を測定し、スペクトルデータを生成するプロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールと、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、糖化のレベルをスペクトルデータと相関させるプロセッサと、を備える、システムが提供される。
【0037】
一実施形態では、バイオリアクターは、約２，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクターは、約５，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１０，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクター体積は、約１５，０００リットル以上である。一実施形態では、バイオリアクターは、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルである。一実施形態では、バイオリアクターは、約１５，０００リットルである。
【0038】
一実施形態では、糖化は、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む。
【0039】
一実施形態では、細胞株は、哺乳動物細胞株である。一実施形態では、哺乳動物細胞株は、非ヒト細胞株である。
【0040】
一実施形態では、ＰＡＴツールは、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む。
【0041】
一実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む。
【0042】
本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【0043】
上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。
【図2】ラマンベースのＰＬＳモデルの開発及び試験のためのプロセスフローを示す。
【図3A】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図3B】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図3C】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図3D】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図3E】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図3F】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図3G】縮小スケール（５Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（mono-glycation）（図３Ａ）、非糖化（non-glycation）（図３Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図３Ｃ）、Ｇ０（図３Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図３Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図３Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図３Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4A】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4B】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4C】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4D】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4E】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4F】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図4G】モデルから更なるデータを追加又は削除しない、製造スケール（２，０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）における、モノ糖化（図４Ａ）、非糖化（図４Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図４Ｃ）、Ｇ０（図４Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図４Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図４Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図４Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5A】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5B】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5C】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5D】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5E】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5F】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図5G】２０００Ｌスケールバッチ実行からのプロセスデータを補完したモデルを使用する、製造スケール（２０００Ｌ）バッチ（ＣＴＳＳ）モデルにおける、モノ糖化（図５Ａ）、非糖化（図５Ｂ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図５Ｃ）、Ｇ０（図５Ｄ）、Ｇ０Ｆ（図５Ｅ）、Ｇ１Ｆ（図５Ｆ）、及びＧ２Ｆ（図５Ｇ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図6】製造スケールのバイオリアクターにおける治療用タンパク質の糖化及び／又はグリコシル化プロファイルのリアルタイム監視を提供するために使用される例示的なシステムを示すプロセスフロー図６００の例示的なシステムを示す。
【図11A】（フロー１及びフロー３における）モノ糖化／非糖化（図１１Ａ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図１１Ｂ）、Ｇ０（図１１Ｃ）、Ｇ０Ｆ（図１１Ｄ）、Ｇ１Ｆ（図１１Ｅ）、及びＧ２Ｆ（図１１Ｆ）についてのＰＬＳモデルの投影変数重要度（variable importance of projection、ＶＩＰ）スコアについての傾向のオーバーレイを示す。
【図11B】（フロー１及びフロー３における）モノ糖化／非糖化（図１１Ａ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図１１Ｂ）、Ｇ０（図１１Ｃ）、Ｇ０Ｆ（図１１Ｄ）、Ｇ１Ｆ（図１１Ｅ）、及びＧ２Ｆ（図１１Ｆ）についてのＰＬＳモデルの投影変数重要度（variable importance of projection、ＶＩＰ）スコアについての傾向のオーバーレイを示す。
【図11C】（フロー１及びフロー３における）モノ糖化／非糖化（図１１Ａ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図１１Ｂ）、Ｇ０（図１１Ｃ）、Ｇ０Ｆ（図１１Ｄ）、Ｇ１Ｆ（図１１Ｅ）、及びＧ２Ｆ（図１１Ｆ）についてのＰＬＳモデルの投影変数重要度（variable importance of projection、ＶＩＰ）スコアについての傾向のオーバーレイを示す。
【図11D】（フロー１及びフロー３における）モノ糖化／非糖化（図１１Ａ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図１１Ｂ）、Ｇ０（図１１Ｃ）、Ｇ０Ｆ（図１１Ｄ）、Ｇ１Ｆ（図１１Ｅ）、及びＧ２Ｆ（図１１Ｆ）についてのＰＬＳモデルの投影変数重要度（variable importance of projection、ＶＩＰ）スコアについての傾向のオーバーレイを示す。
【図11E】（フロー１及びフロー３における）モノ糖化／非糖化（図１１Ａ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図１１Ｂ）、Ｇ０（図１１Ｃ）、Ｇ０Ｆ（図１１Ｄ）、Ｇ１Ｆ（図１１Ｅ）、及びＧ２Ｆ（図１１Ｆ）についてのＰＬＳモデルの投影変数重要度（variable importance of projection、ＶＩＰ）スコアについての傾向のオーバーレイを示す。
【図11F】（フロー１及びフロー３における）モノ糖化／非糖化（図１１Ａ）、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ（図１１Ｂ）、Ｇ０（図１１Ｃ）、Ｇ０Ｆ（図１１Ｄ）、Ｇ１Ｆ（図１１Ｅ）、及びＧ２Ｆ（図１１Ｆ）についてのＰＬＳモデルの投影変数重要度（variable importance of projection、ＶＩＰ）スコアについての傾向のオーバーレイを示す。
【図13A】細胞株１のバッチＡ：ボーラス供給（図１３Ａ）、バッチＢ：１ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１３Ｂ）、バッチＣ：１ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１３Ｃ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図13B】細胞株１のバッチＡ：ボーラス供給（図１３Ａ）、バッチＢ：１ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１３Ｂ）、バッチＣ：１ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１３Ｃ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図13C】細胞株１のバッチＡ：ボーラス供給（図１３Ａ）、バッチＢ：１ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１３Ｂ）、バッチＣ：１ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１３Ｃ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図14A】細胞株２のバッチＤ：ボーラス供給（図１４Ａ）、バッチＥ：２ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１４Ｂ）、バッチＦ：２ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１４Ｃ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図14B】細胞株２のバッチＤ：ボーラス供給（図１４Ａ）、バッチＥ：２ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１４Ｂ）、バッチＦ：２ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１４Ｃ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図14C】細胞株２のバッチＤ：ボーラス供給（図１４Ａ）、バッチＥ：２ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１４Ｂ）、バッチＦ：２ｇ／ｌへの自動フィードバック制御（図１４Ｃ）についてのラマンＰＬＳモデル予測（変動する青色の線）対オフライン測定（安定した赤色の線）を示す。
【図15A】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15B】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15C】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15D】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15E】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15F】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15G】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図15H】細胞株１のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１５Ａ）、ＶＣＤ（図１５Ｂ）、生存率％（図１５Ｃ）、ＬＤＨ（図１５Ｄ）、ｐＨ（図１５Ｅ）、Ｏ２（図１５Ｆ）、グルコース供給体積（図１５Ｇ）、力価及び糖化（図１５Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図16A】細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１６Ａ）、ＶＣＤ（図１６Ｂ）、生存率％（図１６Ｃ）、ＬＤＨ（図１６Ｄ）、ｐＨ（図１６Ｅ）、Ｏ２（図１６Ｆ）、グルコース供給体積（図１６Ｇ）、力価及び糖化（図１６Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図16B】細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１６Ａ）、ＶＣＤ（図１６Ｂ）、生存率％（図１６Ｃ）、ＬＤＨ（図１６Ｄ）、ｐＨ（図１６Ｅ）、Ｏ２（図１６Ｆ）、グルコース供給体積（図１６Ｇ）、力価及び糖化（図１６Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図16C】細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１６Ａ）、ＶＣＤ（図１６Ｂ）、生存率％（図１６Ｃ）、ＬＤＨ（図１６Ｄ）、ｐＨ（図１６Ｅ）、Ｏ２（図１６Ｆ）、グルコース供給体積（図１６Ｇ）、力価及び糖化（図１６Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図16D】細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１６Ａ）、ＶＣＤ（図１６Ｂ）、生存率％（図１６Ｃ）、ＬＤＨ（図１６Ｄ）、ｐＨ（図１６Ｅ）、Ｏ２（図１６Ｆ）、グルコース供給体積（図１６Ｇ）、力価及び糖化（図１６Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図16E】細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１６Ａ）、ＶＣＤ（図１６Ｂ）、生存率％（図１６Ｃ）、ＬＤＨ（図１６Ｄ）、ｐＨ（図１６Ｅ）、Ｏ２（図１６Ｆ）、グルコース供給体積（図１６Ｇ）、力価及び糖化（図１６Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【図16F】細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチ（図１６Ａ）、ＶＣＤ（図１６Ｂ）、生存率％（図１６Ｃ）、ＬＤＨ（図１６Ｄ）、ｐＨ（図１６Ｅ）、Ｏ２（図１６Ｆ）、グルコース供給体積（図１６Ｇ）、力価及び糖化（図１６Ｈ）についてのプロセス傾向の比較を示す。
【発明を実施するための形態】
【0044】
糖化及びグリコシル化プロファイルを測定するための現在の方法には、ボロン酸親和性クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、比色アッセイ、及び液体クロマトグラフィー質量分析（liquid chromatography mass spectrometry、ＬＣ／ＭＳ）が含まれる。これらの方法は、精密で正確な結果を提供することができるが、時間及び資源の両方を消費する。更に、サンプリングは、多くの場合、バイオリアクターから取り出される製品を犠牲にし、かつ汚染のより大きなリスクを伴う。現在の方法の別の欠点は、バッチが完了した後に製品の品質試験を必要とすることである。
【0045】
したがって、治療用タンパク質の生産全体を通した糖化及び／又はグリコシル化を正確に監視することができ、ユーザが生産プロセス中にリアルタイムで糖化及び／又はグリコシル化を制御することができるようにする方法及びシステムに対する必要性が満たされていない。
【0046】
本開示は、部分的には、生産プロセス中の分子（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の糖化及び／又はグリコシル化を制御及び監視するための方法及びシステムに関する。例えば、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールと計量化学モデリングとを組み合わせて、個々のグリコフォーム（微小不均一性）を含む糖化及びグリコシル化プロファイルを監視することができる予測モデルを開発することを伴う、特に製造スケールプロセスに焦点を当てた方法及びシステムが、本明細書に記載される。本開示はまた、部分的に、計量化学モデリングに製造スケールデータを含めることによって、モデルの予測力及び堅牢性を改善することができるという発見を対象とする。そのような方法及びシステムは、治療用タンパク質の生産プロセスにおける潜在的な品質問題がバッチに影響を与える前に特定されることを可能にし、また、プロセス変動性を低減し、収率の改善に起因して供給コストを低減し、製品のリアルタイムリリースを実行し、リードタイムを低減し、分析方法の転送及び検証プロセスの低減に起因して製品の技術移転タイムラインにプラスの影響を与えるのに役立ち得る。
【0047】
いくつかの態様では、本明細書において、ラマン分光法などのＰＡＴツールを使用してグリコシル化分子上のグリカン構造を決定し、コンピューティングデバイスによって使用され得る回帰モデルを生成して、バイオリアクター内の治療用タンパク質上の１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルを決定するための方法が提供される。他の態様では、本明細書において、スペクトルデータを生成するＰＡＴツールを使用して所望のグリカン構造を有するグリコシル化分子を産生し、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用することによって、バイオリアクター内の治療用タンパク質上の１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルを決定するための方法が提供される。次いで、所望のグリカン構造及び／又は望ましくないグリカン構造のレベルに基づいて、１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持するか、又は選択的に修正することができる。本開示はまた、１つ又は２つ以上のグリコシル化分子を産生するためのシステムを提供する。システムは、グリコシル化分子を産生することができる細胞株を含むバイオリアクターと、１つ又は２つ以上のグリカン構造を測定し、スペクトルデータを生成するＰＡＴツールと、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルをスペクトルデータと相関させるプロセッサと、を備えることができる。
【0048】
いくつかの態様では、本明細書において、ラマン分光法などのプロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して分子上の糖化を決定し、コンピューティングデバイスによって使用され得る回帰モデルを生成して、バイオリアクター内の分子上の糖化レベルを決定するための方法が提供される。他の態様では、本明細書において、スペクトルデータを生成するＰＡＴツールを使用して分子上の糖化を測定することによって、所望の糖化レベルを有する分子を生成するし、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用することによって分子上の糖化のレベルを決定する方法が提供される。次いで、糖化のレベルに基づいて、１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持するか、又は選択的に修正することができる。本開示はまた、非糖化分子を産生するためのシステムも提供する。システムは、非糖化分子を産生することができる細胞株を含むバイオリアクターと、糖化を測定し、スペクトルデータを生成するＰＡＴツールと、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して糖化のレベルをスペクトルデータと相関させるプロセッサと、を備えることができる。
【0049】
「背景技術」において、また、本明細書全体を通して各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。
【0050】
特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用される全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、あたかも本明細書に完全に記載されているように参照により組み込まれる。
【0051】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。
【0052】
本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（comprise）」という単語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、任意の他の整数若しくはステップ又は整数若しくはステップの群を除外するものではないことを意味すると理解されるであろう。本明細書に使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」という用語に置き換えることができ、又は場合によって本明細書に使用される場合、「有する（having）」という用語に置き換えることもできる。
【0053】
本明細書に使用される場合、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、ステップ、又は成分を除外する。本明細書に使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又はステップは除外しない。本出願の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、「からなる」又は「から本質的になる」という用語に置き換えることができる。
【0054】
本明細書に使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される場合、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。
【0055】
本明細書で使用される場合、「分子」という用語は、一般に、タンパク質又はその断片をいう。例示的な分子は、治療用タンパク質（例えば、組換えタンパク質若しくはｍＡｂ）又はその断片である。
【0056】
本明細書で使用される場合、「バイオリアクター」という用語は、一般に、生物学的に活性なプロセス（例えば、細胞の培養）を支持するデバイスをいう。例示的なバイオリアクターとしては、ステンレス鋼撹拌タンクバイオリアクター、エアリフトリアクター、及び使い捨てバイオリアクターが挙げられる。
【0057】
本明細書で使用される場合、「スペクトルデータ」という用語は、一般に、分光法を使用して取得される分析出力を指す。
【0058】
本明細書で使用される場合、「閾値」という用語は、一般に、特定の範囲又はレベルの下限又は上限などの少なくとも１つの限界を定義する量を指す。閾値は、経験的に決定され得るか、又は先験的に設定される所定の閾値であってもよい。
【0059】
本明細書で使用される場合、「選択的に修正する」という用語は、動作パラメータに関して使用される場合、一般に、所望の製品の最適な生産を促進し、かつ／又は望ましくない製品の生産を減少させるための１つ又は２つ以上の条件の意図的な調整を指す。
【0060】
本明細書で使用される場合、「自動的に修正される」という用語は、一般に、ユーザが動作パラメータを手動で調整する必要なく動作パラメータが調整されることを意味する。
【0061】
本明細書で使用される場合、「オンサイト」という用語は、一般に、測定又は決定が、生産が行われる同じ施設で行われることを意味する。
【0062】
本明細書で使用される場合、「オフサイト」という用語は、一般に、測定又は決定が、生産が行われる場所とは異なる施設で行われることを意味する。
【0063】
本明細書で使用される場合、「オフライン」という用語は、一般に、生産プロセスが完了した後、測定又は決定が行われ、試料の回収が手動であることを意味する。
【0064】
本明細書で使用される場合、「アットライン」という用語は、一般に、測定又は決定が生産領域内で行われ、試料の回収が手動であることを意味する。
【0065】
本明細書で使用される場合、「オンライン」という用語は、一般に、測定又は決定が生産領域内で行われ、試料の回収が自動化されていることを意味する。
【0066】
本明細書で使用される場合、「インライン」という用語は、一般に、測定又は決定が、バイオリアクター内に配置されたプローブによって生産領域内でリアルタイムで行われ、試料の回収が必要とされないことを意味する。
【0067】
本明細書に提供される実施形態の実施は、別段の指示がない限り、当業者の技能の範囲内である分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来の技術を用いる。このような技術は、文献に十分に記載されている。参照に特に好適なテキストの例としては、以下が挙げられる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（２００１）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ（１９９９）、Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．，ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（１９８５）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８６）、Ｋａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ，Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ － Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．ｂｙ Ｍｅｌｏｄｙ Ｓ．Ｃｌａｒｋ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，１９９７）、Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ）、Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．，２ｄ ｅｄ．１９８７）、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＵＳ）Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（ＵＳ）；１９９９、及びＣｌａｕｓｅｎ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２０１７．Ｉｎ：Ｖａｒｋｉ Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ ＲＤ，Ｅｓｋｏ ＪＤ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ ｏｆ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；２０１５－２０１７、及びＮａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ（ＵＳ）Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｎ Ｒｅｖｅａｌｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｈｒｏｕｇｈ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅ Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ Ｐｒｏｍｉｓｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ．Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ（ＤＣ）：Ｎａｔｉｏｎａｌ Ａｃａｄｅｍｉｅｓ Ｐｒｅｓｓ（ＵＳ）；２００６．３，Ｉｍａｇｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ。
【0068】
本出願の読者を助けるため、明細書の記載は、様々な段落若しくは節に分けられているか、又は本出願の様々な実施形態に向けられている。これらの分離は、段落又は節又は実施形態の実体を別の段落又は節又は実施形態の実体から切り離すものとみなされるべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の記載が広範な用途を有し、想到され得る様々な段落、パラグラフ、及び文章の全ての組み合わせを包含することを理解するであろう。いかなる実施形態の考察も、単なる例示であることを意味するものであり、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がこれらの実施例に限定されることを示唆することを意図するものではない。本出願は、特定の組み合わせが明示的に記載されているか否かにかかわらず、適用可能な構成要素の任意のものを、任意の組み合わせで使用することを企図する。
【0069】
５．１．治療用タンパク質
本開示は、部分的には、分子の糖化及び／又はグリコシル化を決定及び／又は測定することに関する。特定の実施形態では、分子は、治療用タンパク質である。治療用タンパク質の非限定的な例としては、例えば、抗体ベースの薬物（例えば、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ））、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、組換えタンパク質、及び血栓溶解剤が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、分子は、ｍＡｂである。いくつかの実施形態では、分子は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、抗凝固剤である。いくつかの実施形態では、分子は、血液因子である。いくつかの実施形態では、分子は、骨形成タンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、操作されたタンパク質足場である。いくつかの実施形態では、分子は、酵素である。いくつかの実施形態では、分子は、増殖因子である。いくつかの実施形態では、分子は、ホルモンである。いくつかの実施形態では、分子は、インターフェロンである。いくつかの実施形態では、分子は、インターロイキンである。いくつかの実施形態では、分子は、血栓溶解剤である。
本開示は、部分的には、分子の糖化及び／又はグリコシル化を決定及び／又は測定することに関する。特定の実施形態では、分子は、治療用タンパク質である。治療用タンパク質の非限定的な例としては、例えば、抗体ベースの薬物（例えば、ポリクローナル抗体、又はモノクローナル抗体（ｍＡｂ））、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液因子、骨形成タンパク質、操作されたタンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキン、組換えタンパク質、及び血栓溶解剤が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、分子は、ｍＡｂである。いくつかの実施形態では、分子は、組換えタンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、抗凝固剤である。いくつかの実施形態では、分子は、血液因子である。いくつかの実施形態では、分子は、骨形成タンパク質である。いくつかの実施形態では、分子は、操作されたタンパク質足場である。いくつかの実施形態では、分子は、酵素である。いくつかの実施形態では、分子は、増殖因子である。いくつかの実施形態では、分子は、ホルモンである。いくつかの実施形態では、分子は、インターフェロンである。いくつかの実施形態では、分子は、インターロイキンである。いくつかの実施形態では、分子は、血栓溶解剤である。
【0070】
５．２．糖化
本開示は、部分的には、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の糖化を決定及び／又は測定することに関する。タンパク質の糖化は、タンパク質のアミン基上の非酵素的グリコシル化であり、これは一般に、リジン側鎖上のアルファアミン末端及びイプシロンアミン基上で生じる。糖化は、非酵素反応において、グルコース、フルクトース、及びガラクトースなどの還元糖がタンパク質に共有結合するプロセスを伴う。アミノ酸と還元糖との間の反応は、１９１２年にＭａｉｌｌａｒｄ（メイラード）によって最初に記載された。感受性の高いアミン基は、還元糖のアルデヒド基と可逆的に縮合して不安定なシッフ塩基中間体を形成する。これは、自発的な多段階アマドリ転位を起こして、より安定な共有結合ケトアミンを形成することができる。この反応は、タンパク質における生物物理学的及び構造的変化を引き起こす不可逆的製品をもたらす。
本開示は、部分的には、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の糖化を決定及び／又は測定することに関する。タンパク質の糖化は、タンパク質のアミン基上の非酵素的グリコシル化であり、これは一般に、リジン側鎖上のアルファアミン末端及びイプシロンアミン基上で生じる。糖化は、非酵素反応において、グルコース、フルクトース、及びガラクトースなどの還元糖がタンパク質に共有結合するプロセスを伴う。アミノ酸と還元糖との間の反応は、１９１２年にＭａｉｌｌａｒｄ（メイラード）によって最初に記載された。感受性の高いアミン基は、還元糖のアルデヒド基と可逆的に縮合して不安定なシッフ塩基中間体を形成する。これは、自発的な多段階アマドリ転位を起こして、より安定な共有結合ケトアミンを形成することができる。この反応は、タンパク質における生物物理学的及び構造的変化を引き起こす不可逆的製品をもたらす。
【0071】
糖化は、治療用タンパク質の生物活性及び／又は分子安定性に影響を及ぼす可能性がある。例えば、本開示の例示的な治療用タンパク質を表すｍＡｂの場合、糖化は、生物学的機能部位を遮断し、かつ／又はｍＡｂの分解を引き起こすことができる。分解は、ｍＡｂの凝集を更にもたらし得る。結果として、治療用タンパク質の糖化は、生産プロセスに対する潜在的な重要品質特性（ＣＱＡ）を表す。
【0072】
５．３．グリコシル化
本開示はまた、部分的には、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の、特定のグリカン構造を含むグリコシル化を決定及び／又は測定することに関する。
本開示はまた、部分的には、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の、特定のグリカン構造を含むグリコシル化を決定及び／又は測定することに関する。
【0073】
グリコシル化は、治療用タンパク質上の特定の部位へのグリカンの結合（例えば、Ｎ結合型及び／又はＯ結合型グリコシル化）を伴う複雑な翻訳後修飾である。ｍＡｂのＮ結合型グリコシル化は、例えば、一般に、ｍＡｂ重鎖のＦｃ部分のＡｓｎ－Ｘ－Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列でのグリカンの結合を伴い、式中、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸であり得る（Ｇｈａｄｅｒｉ ｅｔ ａｌ．，２０１２）。例えば、治療用タンパク質は、２つの重鎖の各々においてＡｓｎ２９７での単一のＮ結合型グリカンを含有するＩｇＧ１分子を含むことができる。Ｎ－グリコシル化はまた、各重鎖の可変領域において生じ得る（例えば、セツキシマブ）。Ｏ結合型タンパク質のグリコシル化は、一般に、単糖Ｎ－アセチルガラクトサミンとアミノ酸のセリン又はスレオニンとの間の結合を伴う。
【0074】
治療用タンパク質の特定の領域に共有結合した炭水化物部分の配置に応じて、これらの炭水化物のクラス（「グリカン」と呼ばれる）を誘導することができる。例えば、Ｎ－グリカンには、構造がわずかに異なるＧ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆが含まれる（図１Ｂを参照）。これらのグリカンの構造におけるバリエーションは、構造におけるわずかな変化をもたらし、タンパク質活性、コンフォメーション、安全性、及び有効性に対して重大な影響を与える可能性がある。結果として、治療用タンパク質のグリコシル化は、免疫原性を含むそれらの安全性及び有効性において極めて重要な役割を有し、適切なグリコシル化は、規制当局の承認の前にｍＡｂなどの市販の治療用タンパク質の安全性及び効力を確保するために実証されなければならない重要品質特性（ＣＱＡ）の１つである。
【0075】
５．４．プロセス分析技術（ＰＡＴ）
糖化及びグリコシル化プロファイルを測定するための現在の方法には、ボロン酸親和性クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、比色アッセイ、及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）が含まれる。これらの方法は、精密で正確な結果を提供することができるが、時間及び資源の両方を消費する。更に、これらの方法を使用するサンプリングは、多くの場合、バイオリアクターから取り出される製品を犠牲にし、かつ汚染のより大きな危険性を伴う。現在の方法の別の欠点は、バッチが完了した後に製品の品質試験を必要とすることである。
糖化及びグリコシル化プロファイルを測定するための現在の方法には、ボロン酸親和性クロマトグラフィー、キャピラリー等電点電気泳動、比色アッセイ、及び液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ／ＭＳ）が含まれる。これらの方法は、精密で正確な結果を提供することができるが、時間及び資源の両方を消費する。更に、これらの方法を使用するサンプリングは、多くの場合、バイオリアクターから取り出される製品を犠牲にし、かつ汚染のより大きな危険性を伴う。現在の方法の別の欠点は、バッチが完了した後に製品の品質試験を必要とすることである。
【0076】
本明細書に提供されるように、本開示は、部分的には、プロセス分析技術（ＰＡＴ）を使用した糖化及び／又はグリコシル化の測定に関する。ＰＡＴは、バッチが完了する前に生産プロセスを制御及び監視するために使用することができるため、有利である。例えば、ＰＡＴは、試料が、インラインで測定することなどによってリアルタイムで測定されることを可能にし得るか、又はそうでなければ、生産プロセス中に、例えば、アットライン若しくはオンラインで測定されることなどによって測定され得る。リアルタイム監視は、例えば、潜在的な品質問題を、それらがバッチに影響を与える前に特定する機会を提供するため、プロセス制御を増加させることができ、プロセス変動を低減し、収率改善に起因して供給コストを低減し、製品のリアルタイムリリースを実行し、リードタイムを低減し、分析方法の転送及び検証プロセスの低減に起因して製品の技術移転タイムラインにプラスの影響を与える。対照的に、オフライン試料が測定される頻度に依存する複雑で時間のかかる方法は、糖化及びグリコシル化などのこれらのＣＱＡの限定された理解を与えるのみであり、多くの場合、バイオリアクタープロセスが完了した後にのみ評価される。したがって、生産プロセス中にＰＡＴを適用することによって、製品の品質をより慎重に監視することができ、生産された最終製品は、それらの仕様外である製品を選り分けるためにエンド・オブ・ライン試験に依存する製品と比較して、品質がより高くなるであろう。
【0077】
５．４．１．ＰＡＴツール
本明細書に提供されるように、糖化及び／又はグリコシル化を検出及び／又は測定することは、例えば、蛍光分光法、拡散反射分光法、赤外分光法（例えば、近赤外、又は中赤外）、テラヘルツ分光法、透過及び吸収分光法、ラマン分光法（表面増強ラマン分光法（Surface Enhanced Raman Spectroscopy、ＳＥＲＳ）、空間オフセットラマン分光法（Spatially Offset Raman spectroscopy、ＳＯＲＳ）、透過ラマン分光法、及び／又は共鳴ラマン分光法を含む））の分光技術を伴うＰＡＴツールを使用して実行することができる。
本明細書に提供されるように、糖化及び／又はグリコシル化を検出及び／又は測定することは、例えば、蛍光分光法、拡散反射分光法、赤外分光法（例えば、近赤外、又は中赤外）、テラヘルツ分光法、透過及び吸収分光法、ラマン分光法（表面増強ラマン分光法（Surface Enhanced Raman Spectroscopy、ＳＥＲＳ）、空間オフセットラマン分光法（Spatially Offset Raman spectroscopy、ＳＯＲＳ）、透過ラマン分光法、及び／又は共鳴ラマン分光法を含む））の分光技術を伴うＰＡＴツールを使用して実行することができる。
【0078】
例として、ラマン分光法は、計量化学モデリング（例えば、節５．４．２に記載される計量化学モデリング）と提携することができるデータを提供することができるＰＡＴツールである。これは、明瞭で鋭いスペクトルを提供し、任意選択的に、生産プロセス中にインサイツプローブを使用して、バイオリアクター内（例えば、インサイツ）で記録することができる。ラマン分光法は、レーザー技術を使用して物質の化学的フィンガープリントを提供する、振動分光技術である。
【0079】
更に、それは、ＰＡＴツールとして使用されており、代謝産物、増殖プロファイル、製品レベル、製品品質特性、栄養素供給、及びより最近では培養ｐＨを含むいくつかのバイオ治療プロセス変数の非破壊的リアルタイム測定を提供している。しかしながら、他の分光技術もまた、本明細書に提供される方法及びシステムとともに使用することができ、ラマン分光法が単に例示的なＰＡＴツールであることを理解されたい。
【0080】
本明細書に記載されるＰＡＴツールのいずれかから取得されるスペクトルは、バイオリアクター内にあるプローブを用いて（すなわち、インサイツで）、又はバイオリアクターから試料を回収し、バイオリアクターの外側で試料を測定することによって収集することができる。スペクトルを多変量解析（multivariate analysis、ＭＶＡ）と組み合わせて、糖化及び／又はグリコシル化に加えて、他の動作パラメータ（例えば、代謝産物及び／又は細胞濃度）の監視を可能にすることもできる。例えば、１つ又は２つ以上の動作パラメータ（例えば、ｐＨ、温度、圧力、溶存酸素、光学密度、酸素取り込み速度など）に関するデータを、支援情報（原材料分析、供給のタイミング及び持続時間、手動細胞計数、代謝産物レベルなど）と組み合わせて、化学計量モデリング法（第５．４．２節に記載の化学計量モデリング）によって扱うことができる生産プロセスに関する大量の高次元データを生成することができる。スペクトルは、グルコース供給の前後で収集することもできる。
【0081】
したがって、分光分析を計量化学モデリング法（例えば、第５．４．２節に記載の計量化学モデリング）と組み合わせることによって、糖化及び／又はグリコシル化のリアルタイム監視、並びに任意選択的に、生産プロセスに関する追加情報を達成することができる。したがって、ラマン分光法などの分光法は、実行が完了した後ではなく、生産プロセス中にバイオプロセスを監視する能力を提供する。結果として、分光法は、糖化及び／又はグリコシル化を測定するためのＰＡＴツールとして使用することができ、１つ又は２つ以上の動作パラメータ（例えば、栄養素供給）を制御するフィードバックループとして測定結果を実装する選択肢を有し、それによって、治療用タンパク質上の所望の量の糖化及び／又はグリコシル化、並びに任意選択的に、特定のグリカン構造がもたらされる。
【0082】
５．４．２．計量化学モデリング
本明細書に提供される分光法は、大量の高次元データを生成することができる。一般に、データは、例えば、部分最小二乗法（ＰＬＳ）、古典的最小二乗法（classic least square、ＣＬＳ）、又は主成分分析（principle component analysis、ＰＣＡ）などの既知の技術を使用して、化学計量モデリング法によって処理される。次いで、捕捉された吸収スペクトルと、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）などによってオフラインで取得された参照レベルとを用いてモデルを構築する。スペクトルは、前処理方法（いくつか例を挙げると、一次及び二次又は導関数、拡張乗算的散乱補正、平均センタリング、及び自動スケーリングなど）にかけることができる。前処理方法を使用して、流体の濁り又は光透過率、機器ドリフト、及び流体と接触しているレンズ上に蓄積した汚染物質などの干渉を軽減するのを助けることができる。前処理方法はまた、ノイズフィルターとして機能して、結果として生じる液体の蒸気圧に影響を及ぼし得る流体中の実際の組成変化にモデルが焦点を当てることを可能にする。その後、計量化学モデルを較正曲線としてＰＡＴツール分析器に実装して、糖化及び／又はグリコシル化をリアルタイムで予測する。
本明細書に提供される分光法は、大量の高次元データを生成することができる。一般に、データは、例えば、部分最小二乗法（ＰＬＳ）、古典的最小二乗法（classic least square、ＣＬＳ）、又は主成分分析（principle component analysis、ＰＣＡ）などの既知の技術を使用して、化学計量モデリング法によって処理される。次いで、捕捉された吸収スペクトルと、液体クロマトグラフィー－質量分析（ＬＣ－ＭＳ）などによってオフラインで取得された参照レベルとを用いてモデルを構築する。スペクトルは、前処理方法（いくつか例を挙げると、一次及び二次又は導関数、拡張乗算的散乱補正、平均センタリング、及び自動スケーリングなど）にかけることができる。前処理方法を使用して、流体の濁り又は光透過率、機器ドリフト、及び流体と接触しているレンズ上に蓄積した汚染物質などの干渉を軽減するのを助けることができる。前処理方法はまた、ノイズフィルターとして機能して、結果として生じる液体の蒸気圧に影響を及ぼし得る流体中の実際の組成変化にモデルが焦点を当てることを可能にする。その後、計量化学モデルを較正曲線としてＰＡＴツール分析器に実装して、糖化及び／又はグリコシル化をリアルタイムで予測する。
【0083】
したがって、いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）、古典的最小二乗（ＣＬＳ）、及び主成分分析（ＰＣＡ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、古典的最小二乗（ＣＬＳ）モデルを含む。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の回帰モデルは、主成分分析（ＰＣＡ）を含む。
【0084】
５．４．３．測定パラメータ。
本明細書に提供されるように、糖化及び／又はグリコシル化は、生産プロセス中にラマン分光法などのＰＡＴツールを使用して（例えば、アットライン、オンライン、及び／若しくはインライン）、又は生産プロセスが完了した後（例えば、オフライン）で測定することができる。したがって、いくつかの実施形態では、測定することは、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、インラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、アットラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オンラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オフラインで行われる。
本明細書に提供されるように、糖化及び／又はグリコシル化は、生産プロセス中にラマン分光法などのＰＡＴツールを使用して（例えば、アットライン、オンライン、及び／若しくはインライン）、又は生産プロセスが完了した後（例えば、オフライン）で測定することができる。したがって、いくつかの実施形態では、測定することは、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、インラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、アットラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オンラインで行われる。いくつかの実施形態では、測定することは、オフラインで行われる。
【0085】
糖化及び／又はグリコシル化はまた、任意選択的に、オンサイト又はオフサイトで測定され得る。いくつかの実施形態では、測定することは、オンサイトで行われる。いくつかの実施形態では、それはオフサイトで行われる。
【0086】
スペクトルを提供する本明細書に開示されるＰＡＴツールは、生産プロセス中に頻繁な測定を提供することができる。例えば、ラマン分光法を使用することによって、通常１５分毎に１回の頻度で１日１回のオフライン測定に限定されたプロセス変数の範囲について予測値を提供する可能性があり、単一のプローブが使用される場合、１６日間のプロセスについて１日１回のオフライン測定に対して最大３６０倍の情報量を生成する。
【0087】
したがって、いくつかの実施形態では、測定は、１日２回以上行うことができる。より頻繁な測定が所望される場合、測定することは、約５～６０分毎、約１０～３０分毎、約１０～２０分毎、又は約１２．５分毎に行われ得る。一般に、より頻繁な測定は、糖化及び／又はグリコシル化レベルのより正確な予測を可能にすることができる。次に、これは、ユーザが分子の糖化及び／又はグリコシル化レベルをより良好に制御することを可能にする。
【0088】
５．５．生産
本明細書に提供されるように、本開示は、部分的には、バイオリアクター（例えば、第５．５．１節に記載されているバイオリアクター）で生物学的に活性な生物を培養することによって（例えば、第５．５．２節に記載されている細胞培養方法を使用することによって）生産される治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）上の糖化及び／又はグリコシル化を測定することに関する。
本明細書に提供されるように、本開示は、部分的には、バイオリアクター（例えば、第５．５．１節に記載されているバイオリアクター）で生物学的に活性な生物を培養することによって（例えば、第５．５．２節に記載されている細胞培養方法を使用することによって）生産される治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）上の糖化及び／又はグリコシル化を測定することに関する。
【0089】
５．５．１．バイオリアクター
本明細書に提供されるように、本開示は、部分的には、バイオリアクターで増殖させた治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）上の糖化及び／又はグリコシル化を測定することに関する。様々なタイプのバイオリアクターを、治療用タンパク質の生産に使用することができる。例えば、バイオリアクターは、ステンレス鋼撹拌槽型バイオリアクター（stirred tank bioreactor、ＳＴＲ）、エアリフトリアクター、使い捨てバイオリアクター、又はそれらの組み合わせ（例えば、ＳＴＲと組み合わせた使い捨てバイオリアクター）であり得る。
本明細書に提供されるように、本開示は、部分的には、バイオリアクターで増殖させた治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）上の糖化及び／又はグリコシル化を測定することに関する。様々なタイプのバイオリアクターを、治療用タンパク質の生産に使用することができる。例えば、バイオリアクターは、ステンレス鋼撹拌槽型バイオリアクター（stirred tank bioreactor、ＳＴＲ）、エアリフトリアクター、使い捨てバイオリアクター、又はそれらの組み合わせ（例えば、ＳＴＲと組み合わせた使い捨てバイオリアクター）であり得る。
【0090】
バイオリアクターは、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）を生産することができる生体細胞の培養及び増殖を可能にする任意の好適な体積を有することができる。例えば、バイオリアクターの体積は、約０．５リットル（Ｌ）～約２５，０００Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２５０Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約０．５リットル（Ｌ）～約２５０Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約５０Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１Ｌ～約５０Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２５Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１Ｌ～約２５Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１０Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約５Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約５Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１０Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２５Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約５０Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１００Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２５０Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、１，０００Ｌ以上であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１，０００Ｌ～約２５，０００Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１０，０００Ｌ～約２５，０００Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１，０００Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２，０００Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約５，０００Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１０，０００Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約１５，０００Ｌ以下であり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの体積は、約２５，０００Ｌ以下であり得る。
【0091】
本明細書に提供されるように、本開示の特定の態様では、計量化学モデルは、まず、縮小スケールのバイオリアクター（例えば、２５０Ｌ未満）から取得されたデータを使用して生成することができ、計量化学モデルの堅牢性及び予測力は、製造スケールでの糖化及び／又はグリコシル化の予測に使用するための製造スケールのバイオリアクター（例えば、２，０００Ｌ以上、及び好ましくは１０，０００Ｌ～２５，０００Ｌ）から取得されたデータを使用してモデルを精緻化することによって増加させることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法及びシステムは、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクターを伴う。
【0092】
製造スケールのバイオリアクターから取得されたデータの追加は、モデルの予測能力（ability to predict）を改善する。これは、縮小スケールのプロセスではなく、製造スケールのバイオリアクターで生じるバイオリアクター培養の変化に起因し得る。例えば、培養混合時間、ＣＯ２除去、及び酸素移動速度は、製造スケールによって異なり得る。例として、製造スケールプロセスにおける酸素移動の減少は、縮小スケールでは見られないように、ｍＡｂ製品の糖化（具体的には、グリコシル化）プロファイルに影響を及ぼす可能性を有する。減少した酸素移動は、酸素が短期間存在しないバイオリアクターにおける「デッドゾーン」領域が存在する可能性をもたらす（Ａｓｔ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。これは、バイオリアクターにおける宿主細胞に対する酸化ストレスの増加をもたらす。酸化ストレスは、ｍＡｂのグリコシル化に影響を及ぼすことが報告されている。このストレスは、アセチル－ＣｏＡの形成を減少させ、次に、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃとは別に、本明細書に記載のグリコシル化標的の骨格構造の一部を形成する重要なアミドであるＮ－アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮａｃ）の減少をもたらす（Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。したがって、製造スケールのプロセスから取得されたデータを組み込むことによって、これらの変動をモデルにおいて説明することができ、モデルの予測可能性を改善するのに役立つ。
【0093】
したがって、いくつかの実施形態では、計量化学モデルは、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターから生成されたデータ、並びに１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターから生成されたデータを伴う。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約２５０Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約１００Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約５０Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約２５Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約１０Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約５Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約２Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約１Ｌ以下の最大閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約２５０Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約１００Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約５０Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約２５Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約１０Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約５Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約２Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々は、約１Ｌ以下の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積は、約０．５リットル（Ｌ）～約２５０Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、バイオリアクターの各々の体積は、約１Ｌ～約５０Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積は、約１Ｌ～約２５Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積は、約１Ｌ～約１０Ｌであり得る。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積は、約１Ｌ～約５Ｌであり得る。
【0094】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約５，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１０，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１５，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２０，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２５，０００Ｌ以上の最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約５，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１０，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの最小閾値体積を有する。好ましい実施形態では、１つ又は２つ以上のバイオリアクターの各々は、治療用タンパク質を製造するために使用されるバイオリアクターの体積に等しい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約５，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１０，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１５，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２０，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２５，０００Ｌ以上の体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約２，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、第２のバイオリアクターの各々は、約５，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、第２のバイオリアクターの各々は、約１０，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、約１５，０００Ｌ～約２５，０００Ｌの体積を有する。好ましい実施形態では、１つ又は２つ以上のバイオリアクターの各々は、治療用タンパク質を製造するために使用されるバイオリアクターの体積に等しい体積を有する。
【0095】
いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも５倍（５×）大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも１０倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも２５倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも５０倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも１００倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも２５０倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも５００倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の最大閾値体積よりも少なくとも１，０００倍大きい最小閾値体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも５倍（５×）大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも１０倍大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも２５倍大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも５０倍大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも１００倍大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも２５０倍大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも５００倍大きい体積を有する。いくつかの実施形態では、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの各々は、１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクターの各々の体積よりも少なくとも１，０００倍大きい体積を有する。
【0096】
５．５．２．細胞培養方法
本開示の治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の生産は、治療用タンパク質を生産することができる当該技術分野で既知の任意の好適な生物学的に活性な宿主細胞型を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞及び非哺乳動物細胞は、治療用タンパク質の生産のためのプラットフォームとして使用され得る。治療用タンパク質の生産のための哺乳動物宿主細胞株の非限定的な例としては、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫由来ＮＳ０及びＳｐ２／０細胞、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、並びにヒト胎児網膜芽細胞由来ＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。非哺乳動物宿主の非限定的な例としては、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質生産細胞株は、哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞株は、非ヒト細胞株である。
本開示の治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）の生産は、治療用タンパク質を生産することができる当該技術分野で既知の任意の好適な生物学的に活性な宿主細胞型を用いて行うことができる。例えば、哺乳動物細胞及び非哺乳動物細胞は、治療用タンパク質の生産のためのプラットフォームとして使用され得る。治療用タンパク質の生産のための哺乳動物宿主細胞株の非限定的な例としては、チャイニーズハムスター卵巣（Chinese hamster ovary、ＣＨＯ）細胞、マウス骨髄腫由来ＮＳ０及びＳｐ２／０細胞、ヒト胎児腎臓細胞（ＨＥＫ２９３）、並びにヒト胎児網膜芽細胞由来ＰＥＲ．Ｃ６細胞が挙げられる。非哺乳動物宿主の非限定的な例としては、例えば、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ、及びＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質生産細胞株は、哺乳動物細胞株である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞株は、非ヒト細胞株である。
【0097】
異なる宿主系は、治療用タンパク質のグリコシル化プロファイルにおける特異性及び不均一性に寄与する、様々なグリコシル化酵素及び輸送体を発現することができる。同様に、異なる宿主系は、治療用タンパク質の糖化レベルに対して異なる効果を有することができる。したがって、例えば、特定のグリカン構造及び／又は糖化レベルを有する所望の治療用タンパク質を生成することができる宿主細胞株を操作又は特異的に選択することが可能である。
【0098】
生物学的に活性な細胞の培養及び増殖は、当該技術分野で既知の様々な方法、例えば、バッチプロセス、流加プロセス、連続培養、又はそれらの組み合わせ（例えば、流加と灌流との間のハイブリッド）を使用して行うことができる。
【0099】
バッチ法では、全ての栄養素が培養の開始時に供給され、その後のバイオプロセスにおいてそれ以上添加されない。バイオプロセス全体の間、追加の栄養素は添加されないが、任意選択的に、ガス、酸、及び塩基などの制御要素が添加されてもよい。次いで、バイオプロセスは、栄養素が消費されるまで続く。
【0100】
流加法では、設定された時点で、又は栄養素が枯渇したら、栄養素が大きなボーラスとしてバイオリアクターに添加される。一般に、最初の培養で使用されたものと同じ培地が供給にも使用されるが、より濃縮されたものである。供給溶液組成物は、例えば、より大きな速度で消費されている使用済み培地栄養素を分析及び特定することなどによって、異なる培養段階におけるそれらの代謝状態に基づいて細胞を供給するように設計することができる。加えて、流加法において使用される培地は、細胞培養の必要性に適応するように、又は治療用タンパク質の生産を促進するように（例えば、細胞増殖を促進するように若しくは治療用タンパク質の生産を刺激するように）改変することができる。例えば、いくつかの実施形態では、培地は、治療用タンパク質の糖化を低減又は排除するように改変することができる。
【0101】
連続培養では、栄養素がバイオリアクターに連続的に添加され、一般に、等量の変換された栄養素溶液が同時に系から取り出される。３つの最も一般的な種類の連続培養は、ケモスタット、タービドスタット、及び灌流である。灌流法は、増殖中の培養物を通して培地を循環させ、同時に廃棄物の除去、栄養素の供給、及び製品の回収を可能にする。
【0102】
本明細書に提供されるように、いくつかの実施形態では、供給が自動化される。特定の態様では、供給が自動化され、自動化は、１つ又は２つ以上の動作パラメータ（例えば、第５．５．３節に記載の動作パラメータ）を制御する。
【0103】
５．５．３．動作パラメータ
治療用タンパク質の糖化は、生産プロセス中に起こり得、ここで、グルコースなどの還元糖が、生物学的に活性な生物（例えば、治療用タンパク質を生産する細胞培養物）のエネルギー源として使用される。糖化のレベルは、哺乳動物細胞培養プロセス中に細胞培養物に添加される糖の量によって影響され得る。加えて、ｐＨレベル、栄養素レベル、時間（例えば、培養培地の添加の頻度間隔）、温度、及びイオン強度などの他の要因が、糖化の動態及び程度に影響を及ぼし得る。更に、例えば、ヘキソース糖などの細胞培養培地で使用される特定の種類の糖、及びアクセス可能なアミノ基の特定の反応性は、タンパク質糖化に影響を及ぼし得る。
治療用タンパク質の糖化は、生産プロセス中に起こり得、ここで、グルコースなどの還元糖が、生物学的に活性な生物（例えば、治療用タンパク質を生産する細胞培養物）のエネルギー源として使用される。糖化のレベルは、哺乳動物細胞培養プロセス中に細胞培養物に添加される糖の量によって影響され得る。加えて、ｐＨレベル、栄養素レベル、時間（例えば、培養培地の添加の頻度間隔）、温度、及びイオン強度などの他の要因が、糖化の動態及び程度に影響を及ぼし得る。更に、例えば、ヘキソース糖などの細胞培養培地で使用される特定の種類の糖、及びアクセス可能なアミノ基の特定の反応性は、タンパク質糖化に影響を及ぼし得る。
【0104】
例えば、溶存酸素（dissolved oxygen、ＤＯ）レベル、バイオリアクターの培養温度、宿主細胞型、及び栄養素又はサプリメントの利用可能性などの多くのプロセスパラメータが、治療用タンパク質のグリコシル化を形成することができる。
【0105】
したがって、いくつかの実施形態では、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータは、許容可能な量の糖化及び／又はグリコシル化を有する治療用タンパク質を生産するために、決定された糖化及び／又はグリコシル化レベルに基づいて維持されるか、又は選択的に修正される。いくつかの実施形態では、動作パラメータは、温度、ｐＨレベル、溶存酸素（ＤＯ）レベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む。
【0106】
いくつかの実施形態では、動作パラメータは、温度を含む。例えば、治療用タンパク質が望ましい量の糖化及び／又はグリコシル化を有する場合、バイオリアクターの温度は、糖化及び／又はグリコシル化のレベルを測定するときのバイオリアクターにおける温度又はその付近で維持することができる。代替的に、治療用タンパク質が望ましくない量の糖化及び／又はグリコシル化を有する場合、バイオリアクターの温度は、所望の量の糖化及び／又はグリコシル化を達成するために、生産プロセスの一部又は全体について調整され得る。いくつかの実施形態では、温度は、生理学的温度である。いくつかの実施形態では、温度は、約２５℃～４２℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３５℃～３９℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３５．５℃～３７．５℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３５℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３５．５℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３６℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３６．５℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３７℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約３７．５℃の温度に維持又は調整される。特定の実施形態では、バイオリアクターにおける温度は、非生理学的温度である。いくつかの実施形態では、温度は、２５℃未満の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約４℃～約２５℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約４℃～約１０℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約４℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約５℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約６℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約７℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約８℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約９℃の温度に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、温度は、約１０℃の温度に維持又は調整される。
【0107】
いくつかの実施形態では、動作パラメータは、ｐＨレベルを含み、治療用タンパク質上の糖化及び／又はグリコシル化の測定されたレベルに応じて、維持又は修正される。例えば、治療用タンパク質が望ましい量の糖化及び／又はグリコシル化を有する場合、バイオリアクターのｐＨは、糖化及び／又はグリコシル化のレベルを測定するときのバイオリアクターにおけるｐＨレベル又はその付近で維持することができる。高ｐＨ（≧７．０）は、初期の細胞増殖期に有益であり得る。しかしながら、高ｐＨ、高乳酸、及び高浸透圧カスケードは、多くの場合、細胞増殖の遅延及び細胞死の加速を引き起こす。したがって、ｐＨレベルはまた、生物学的に活性な細胞がどの増殖期にあるのかに依存して、生産プロセスの間に調整される必要があり得る。例えば、ｐＨは、二酸化炭素及び／又は炭酸ナトリウムの添加を使用して維持又は調整することができる。
【0108】
いくつかの実施形態では、ｐＨは、生理学的ｐＨである。いくつかの実施形態では、ｐＨは、４．０～９．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、５．０～８．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．０～７．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、４．０～６．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、５．０～７である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、６．０～８．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約４．０に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約４．５に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．０に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約５．５に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．０に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．５に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．６に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．７に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．８に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約６．９に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．０に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．１に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．２に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．３に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．４に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．５に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．６に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．７に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．８に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約７．９に維持又は調整される。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約８．０に維持又は調整される。
【0109】
いくつかの実施形態では、動作パラメータは、培養培地のグルコース濃度を含む。例えば、治療用タンパク質が望ましいレベルの糖化及び／又はグリコシル化を有する場合、流加培養若しくは灌流培養などによってバイオリアクターに添加される培養培地のグルコース濃度、又はハイブリッド流加及び灌流のグルコース濃度は、糖化及び／又はグリコシル化レベルを測定するときに使用される標的濃度又はその付近で維持することができる。
【0110】
いくつかの実施形態では、動作パラメータは、培養培地のグルコース添加のための内部頻度を含む。例えば、治療用タンパク質が望ましいレベルの糖化及び／又はグリコシル化を有する場合、流加培養若しくは灌流培養、又はハイブリッド流加及び灌流のグルコース濃度などにおける、バイオリアクターへの培養培地のグルコース添加の頻度間隔は、糖化及び／又はグリコシル化レベルを測定するときの頻度又はその付近で維持することができる。いくつかの実施形態では、頻度は、培養培地の添加が連続的であるように維持又は調整される。いくつかの実施形態では、頻度は、培養培地の添加が分割間隔、例えば、６時間であるように維持又は調整される。いくつかの実施形態では、頻度は、培養培地の添加が分割間隔、例えば、１２時間であるように維持又は調整される。いくつかの実施形態では、頻度は、培養培地の添加が毎日のボーラス、例えば、２４時間であるように維持又は調整される。いくつかの実施形態では、頻度は、培養培地の添加が２４時間毎より長くなるように維持又は調整される。
【0111】
いくつかの実施形態では、動作パラメータは、栄養素レベルを含む。いくつかの実施形態では、栄養素レベルは、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、動作パラメータは、グルコースの濃度を含む。いくつかの実施形態では、動作パラメータは、乳酸塩の濃度を含む。いくつかの実施形態では、動作パラメータは、グルタミンの濃度を含む。いくつかの実施形態では、動作パラメータは、アンモニウムイオンの濃度を含む。
【0112】
特定の実施形態では、グルコース濃度は、細胞密度に応じて、約０．５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約０．５ｇ／Ｌ～約５ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約１０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約２０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約３０ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約３５ｇ／Ｌ～約４０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約１０ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約１０ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約５ｇ／Ｌ～約１０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約１０ｇ／Ｌ～約１５ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約１５ｇ／Ｌ～約２０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約２０ｇ／Ｌ～約２５ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約２５ｇ／Ｌ～約３０ｇ／Ｌに維持又は調整される。特定の実施形態では、グルコース濃度は、約３０ｇ／Ｌ～約３５ｇ／Ｌに維持又は調整される。
【0113】
例として、許容可能なレベルの糖化を有する治療用タンパク質は、グルコースなどの還元糖の濃度を維持することができる。代替的に、更なる例として、望ましくない量の糖化を有する治療用タンパクは、還元糖の濃度などの栄養素レベルを有することができ、かつ／又は培養培地添加の頻度を低減することができる。動作パラメータをどの程度調整すべきであるか否かを理解することは、当業者の技能の範囲内である。更に、他の代替的な動作パラメータを糖化レベルに従って調整することができ、上記の例は単なる例示であることが意図されていることを理解されたい。
【0114】
同様に、許容可能なレベルの特定のグリカン構造を有する治療用タンパク質は、維持された１つ又は２つ以上の動作パラメータを有し得る。代替的に、望ましくないレベルの特定のグリカン構造を有する治療用タンパク質は、特定のグリカン構造を制御するように調整された１つ又は２つ以上の動作パラメータを有することができる。
【0115】
特定の態様では、１つ又は２つ以上の動作パラメータは、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される。例えば、糖化及び／又はグリコシル化は、ＰＡＴツール（例えば、第５．４．１節に記載されているＰＡＴツール）を使用して測定することができ、１つ又は２つ以上の動作パラメータは、所望のグリカン構造のレベルが所定の閾値を上回るか又は望ましくないグリカン構造のレベルが所定の閾値を下回る場合、バイオリアクターにおいて自動的に維持され得る。代替的に、１つ又は２つ以上の動作パラメータは、所望のグリカン構造のレベルが所定の閾値を下回るか、又は望ましくないグリカン構造のレベルが所定の閾値を上回る場合、バイオリアクターにおいて自動的に修正され得る。
【0116】
治療用タンパク質上の糖化の許容可能なレベルの閾値は、一般に、経験的に決定される。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の５０％未満であろう。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、４０％未満であろう。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、３０％未満であろう。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、２５％未満であろう。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、２０％未満であろう。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、１５％未満であろう。いくつかの実施形態では、糖化の所定の閾値は、１０％未満であろう。
【0117】
したがって、いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも９０％が糖化されていないであろう。いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも８５％が糖化されていないであろう。いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも８０％が糖化されていないであろう。いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも７５％が糖化されていないであろう。いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも７０％が糖化されていないであろう。いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも６０％が糖化されていないであろう。いくつかの実施形態では、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の少なくとも５０％が糖化されていないであろう。
【0118】
治療用タンパク質上の糖化のレベルの閾値もまた、一般に、経験的に決定されるであろう。例えば、生産設定におけるバッチ間のグリコフォーム含有量におけるあるレベルの変動性が予想され、一般に、閾値は、グリコフォーム含有量においてあまりにも大きな変動性を生じない許容可能な限界であろう。したがって、いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、バイオリアクターにおける治療用タンパク質の５０％未満であろう。いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、４０％未満であろう。いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、３０％未満であろう。いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、２５％未満であろう。いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、２０％未満であろう。いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、１５％未満であろう。いくつかの実施形態では、望ましくないグリカン構造の所定の閾値は、１０％未満であろう。
【0119】
５．５．４．精製。
一般に、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）は、生産プロセス中に増殖した細胞から分泌される。生産プロセスが完了した後、治療用タンパク質を細胞から分離し、タンパク質精製（ＦＤＡ規格に従う精製を含む）に好適な当該技術分野の任意の技術を使用して精製することができる。好ましくは、精製は、宿主細胞タンパク質、核酸、及び／又は脂質などのプロセス不純物を除去するであろう。
一般に、治療用タンパク質（例えば、第５．１節に開示されている治療用タンパク質）は、生産プロセス中に増殖した細胞から分泌される。生産プロセスが完了した後、治療用タンパク質を細胞から分離し、タンパク質精製（ＦＤＡ規格に従う精製を含む）に好適な当該技術分野の任意の技術を使用して精製することができる。好ましくは、精製は、宿主細胞タンパク質、核酸、及び／又は脂質などのプロセス不純物を除去するであろう。
【0120】
精製プロセスは、１つ又は２つ以上のステップを伴うことができる。例えば、治療用タンパク質の精製は、一次回収、精製、及び／又は最終精製（polishing）ステップを伴い得る。一般に、一次回収ステップは、培養ブロスから細胞及び細胞破片を除去するための遠心分離及び／又は深層濾過、並びに治療用タンパク質製品を含有する細胞培養上清の清澄化からなる。一次回収プロセスを改善するために、当該技術分野で既知の追加の技術を更に含めることができる。例えば、単純な酸、二価カチオン、ポリカチオン性ポリマー、カプリル酸、及び刺激応答性ポリマーなどの凝集剤の使用は、細胞培養清澄化を増強し、細胞、細胞破片、ＤＮＡ、宿主細胞タンパク質（host cell protein、ＨＣＰ）、及び／又はウイルスのレベルを低減する一方、製品流内に治療用タンパク質を保持することができる。
【0121】
精製はまた、１つ又は２つ以上のクロマトグラフィー技術（例えば、親和性、イオン交換、疎水性相互作用）、レクチンベースの精製、ボロン酸ベースの精製、及び／又は濾過技術（例えば、限外濾過）を伴ってもよく、これらは、より小さな不純物から製品を分離する際の捕捉ステップとして、及び／又は全体的に体積を減少させる際の濃縮ステップとして使用される。
【0122】
任意選択的に、最終精製ステップはまた、治療用タンパク質を保存する前に、例えば、ウイルス、凝集タンパク質、及び任意の他の不純物を除去するために行われ得る。最終精製ステップは、例えば、ウイルス濾過、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び／又は濾過ステップ（例えば、限外濾過／透析濾過及び／又は滅菌濾過）を含んでもよい。
【0123】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法及びシステムは、治療用タンパク質を精製することを伴う。
【0124】
５．６．グリコシル化及び／又は糖化を決定するための方法及びシステム。
図６の図６００を参照すると、本主題は、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツール６１０を利用することができ、これは、バイオリアクター６２０内で起こる反応の態様を監視するか又はそうでなければそれを特徴付けるために、バイオリアクター６２０の内部にあるか又はその中に延びるプローブ６１２を有することができる。ＰＡＴツール６１０は、１つ又は２つ以上のデータプロセッサと、データプロセッサによって命令をロードし実行することができるメモリと、を備える。ＰＡＴツール６１０は、様々な形態をとることができ、場合によっては、バイオリアクター６２０内で起こる反応の態様を特徴付けるために、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む。場合によっては、ＰＡＴツール６１０は、ネットワーク６３０を介して、以下に記載される様々なアルゴリズムを実行することができる１つ又は２つ以上のコンピューティングシステム６４０（例えば、サーバ、パーソナルコンピュータ、タブレット、ＩｏＴデバイス、携帯電話、専用制御ユニットなど）と通信する。コンピューティングシステム６４０はまた、バイオリアクター６２０に関連付けられた１つ又は２つ以上の動作パラメータを変化させるように機能することができる。場合によっては、バイオリアクター６２０はまた、１つ又は２つ以上の遠隔コンピューティングシステム６４０と通信することができるように、ネットワーク接続性を有することができ、これは次に、バイオリアクター６２０の１つ又は２つ以上の動作パラメータを変化させることができる。
図６の図６００を参照すると、本主題は、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツール６１０を利用することができ、これは、バイオリアクター６２０内で起こる反応の態様を監視するか又はそうでなければそれを特徴付けるために、バイオリアクター６２０の内部にあるか又はその中に延びるプローブ６１２を有することができる。ＰＡＴツール６１０は、１つ又は２つ以上のデータプロセッサと、データプロセッサによって命令をロードし実行することができるメモリと、を備える。ＰＡＴツール６１０は、様々な形態をとることができ、場合によっては、バイオリアクター６２０内で起こる反応の態様を特徴付けるために、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む。場合によっては、ＰＡＴツール６１０は、ネットワーク６３０を介して、以下に記載される様々なアルゴリズムを実行することができる１つ又は２つ以上のコンピューティングシステム６４０（例えば、サーバ、パーソナルコンピュータ、タブレット、ＩｏＴデバイス、携帯電話、専用制御ユニットなど）と通信する。コンピューティングシステム６４０はまた、バイオリアクター６２０に関連付けられた１つ又は２つ以上の動作パラメータを変化させるように機能することができる。場合によっては、バイオリアクター６２０はまた、１つ又は２つ以上の遠隔コンピューティングシステム６４０と通信することができるように、ネットワーク接続性を有することができ、これは次に、バイオリアクター６２０の１つ又は２つ以上の動作パラメータを変化させることができる。
【0125】
ＰＡＴツール６１０は、上述のように、（例えば、バイオリアクター６２０における）生産プロセスをインライン又はリアルタイムでオンラインで制御及び監視するために使用され得る。ＰＡＴツール６１０は、分光技術（例えば、近赤外分光法、蛍光分光法、及びラマン分光法）を利用することができる。ラマン分光法は、近赤外分光法における水干渉及びスペクトルをあまり鋭くないものにし得る他の干渉などの他の技術のいくつかの欠点に悩まされることなく、明瞭で鋭いスペクトルを提供するので、それ自体、バイオリアクター生産プロセスにおける使用に特に好適な技術として存在する。ＰＡＴツール６１０は、物質の化学的フィンガープリントを提供する振動分光技術であるラマン分光法を実装するためのレーザーを含んでもよい。本文脈におけるＰＡＴツール６１０は、代謝産物、増殖プロファイル、製品レベル、製品品質特性、栄養素供給、培養ｐＨなどを含むいくつかのバイオ治療プロセス変数の非破壊的リアルタイム測定を提供することができるという点で技術的に有利である。
【0126】
コンピューティングシステム６４０は、ＰＡＴツール６１０からのラマン分光分析を計量化学モデリングと組み合わせて、これらの変数のリアルタイム監視を提供することができる。ラマン分光法によって取得されたスペクトルピークは、計量化学モデリングソフトウェアを使用して、（オフライン分析によって予め定義するかつ／又は測定することができる）目的の１つ又は２つ以上のプロセス変数と関連付けられる。様々なシグナル処理技術は、ＰＡＴツール６１０によって生成されたスペクトルピークを特定し、定量化することができる。シグナル処理技術の１つのタイプは、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰モデルであり、これは、ラマンシグナル対分析物濃度の線形性を考慮して、ラマンデータをモデル化するために用いられ得る。いくつかの実施形態では、線形ＰＬＳモデルが用いられ得る。特定の実施形態では、非線形ＰＬＳモデルが用いられ得る。
【0127】
ＰＡＴツール６１０を使用して、バイオリアクター６２０における大きな治療用タンパク質（例えば、ｍＡｂタンパク質）に関する態様を測定することができるか、又はそうでなければそれを特徴付けることができる。具体的には、いくつかのバリエーションにおいて、ＰＡＴツール６１０を使用して、製造スケールのバイオリアクターにおける治療用タンパク質の糖化及び／又はグリコシル化プロファイルのリアルタイム監視を提供することができる。製造スケールは、複雑な環境条件に対処する必要があるという点で、より小規模の実験室バイオリアクターとは対照的に、多くの技術的困難を提示する。本主題は、利用されるＰＡＴツール６１０、及び場合によってはラマンベースのＰＬＳモデルの使用によって、これらの技術的困難、並びに糖タンパク質形成の複雑な性質に対処する。
【0128】
本明細書のＰＡＴツール６１０、バイオリアクター６２０、及び／又はコンピューティングシステム６４０の態様は、デジタル電子回路、集積回路、特に設計されたＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）、コンピュータハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、及び／又はこれらの組み合わせで実現され得る。これらの様々な実装は、少なくとも１つのプログラム可能なプロセッサを含むプログラム可能なシステム上で実行可能及び／又は解釈可能である１つ又は２つ以上のコンピュータプログラムの実装が含まれてもよく、このプロセッサは、記憶システム、少なくとも１つの入力デバイス、及び少なくとも１つの出力デバイスからデータ及び命令を受信し、それらへデータ及び命令を送信するように接続された専用又は汎用プロセッサとすることができる。
【0129】
これらのコンピュータプログラム（プログラム、ソフトウェア、ソフトウェアアプリケーション又はコードとしても知られる）は、プログラマブルプロセッサのための機械命令を含み、高レベル手続き型及び／若しくはオブジェクト指向プログラミング言語で、並びに／又はアセンブリ／機械言語で実装され得る。本明細書で使用される場合、「機械可読媒体」という用語は、機械命令及び／又はデータをプログラマブルプロセッサに提供するために使用される、機械可読シグナルとしての機械命令を受信する機械可読媒体を含む、任意のコンピュータプログラム製品、装置、及び／又はデバイス（例えば、磁気ディスク、光ディスク、ソリッドステートドライブ、メモリ、プログラマブルロジックデバイス（Programmable Logic Device、ＰＬＤ））を指す。「機械可読信号」という用語は、プログラム可能なプロセッサに機械命令及び／又はデータを提供するために使用される任意の信号を指す。
【0130】
コンピューティングシステム６４０は、バックエンドコンポーネント（例えば、データサーバとして）、ミドルウェアコンポーネント（例えば、アプリケーションサーバ）、又はフロントエンドコンポーネント（例えば、グラフィカルユーザインターフェース若しくはウェブブラウザを有するクライアントコンピュータであって、それを介してユーザが本明細書に記載される主題の実装と相互作用することができるコンピュータ）、あるいはそのようなバックエンド、ミドルウェア、又はフロントエンドコンポーネントの任意の組み合わせを含むことができる。システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信の任意の形態又は媒体（例えば、通信ネットワーク）によって相互接続され得る。通信ネットワークの例としては、ローカルエリアネットワーク（「local area network、ＬＡＮ」）、広域ネットワーク（「wide area network、ＷＡＮ」）、及びインターネットが挙げられる。コンピューティングシステム６４０は、クライアント及びサーバを含んでもよい。クライアント及びサーバは、一般に、互いに隔たっており、典型的には、通信ネットワークを介して相互作用する。クライアント及びサーバの関係は、それぞれのコンピュータ上で実行され、かつ互いにクライアントサーバ関係を有するコンピュータプログラムによって生じる。
【0131】
図７は、グリコシル化分子上のグリカン構造の決定を示すプロセスフロー図７００であり、７１０では、スペクトルデータを取得するか、又はそうでなければそれを生成する、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、複数の実行の各々について、グリコシル化分子上の１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルが取得される。レベルは、第１の閾値以下の体積を有する１つ又は２つ以上のバイオリアクター内で起こるプロセスに基づいて取得される。その後、７２０では、取得されたスペクトルデータに基づいて、グリコシル化分子上の１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルを取得されたスペクトルデータと相関させる１つ又は２つ以上の回帰モデルが生成される。その後、７３０では、グリコシル化分子上の１つ又は２つ以上のグリカン構造は、ＰＡＴツールを使用して、第２の閾値以上の体積を有する１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内で測定されて、測定されたスペクトルデータが得られる。次いで、少なくとも１つのコンピューティングデバイスは、７４０で、生成された１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、１つ又は２つ以上のバイオリアクター内のグリコシル化分子上の１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルを決定する。
【0132】
１つ又は２つ以上の回帰モデルは、取得されたスペクトルデータと測定されたスペクトルデータとの組み合わせに基づいて精緻化され得る。
【0133】
所望のグリコシル化分子を産生するために、決定されたレベルに基づいて、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持する、かつ／又は選択的に修正する（すなわち、変更する）ことができる。１つ又は２つ以上の動作パラメータは、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む。栄養素レベルは、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される。バイオリアクターにおけるグルコースの濃度は、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正することができる。
【0134】
いくつかの変形形態では、グリコシル化分子が精製され得る。
【0135】
グリカン構造は、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆ、又はそれらの組み合わせを含む様々な形態をとることができる。
【0136】
いくつかの変形形態では、測定は、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクターを使用して行うことができる。
【0137】
第１の閾値は、約２５リットル以下を含む異なる体積であってもよい。
【0138】
第２の閾値は、約１，０００リットル以上（２，０００リットルを含む）、１０，０００～約２５，０００リットル、及び１０，０００～約１５，０００リットルを含む異なる体積に対応することができる。
【0139】
第２の閾値は、第１の閾値よりも少なくとも５倍大きく、場合によっては、第１の閾値よりも少なくとも１０倍大きく、場合によっては、第１の閾値よりも少なくとも１００倍大きく、他の場合では、第１の閾値よりも少なくとも５００倍大きくてもよい。
【0140】
ＰＡＴツールは、ラマン分光法を含む分光技術を利用することができる。
【0141】
１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含むことができるか、又はそうでなければそれを使用することができる。
【0142】
グリコシル化分子は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含むことができる。代替的に、グリコシル化分子は、非ｍＡｂを含む。
【0143】
決定は、オンサイト及び／又はオフサイトで行うことができる。更に、測定及び／又は決定は、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行うことができる。
【0144】
図８は、所望のグリカン構造を有するグリコシル化分子の産生を示すプロセスフロー図８００である。８１０では、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、１つ又は２つ以上のグリカン構造を測定して、スペクトルデータを得る。かかる測定することは、１，０００リットル以上の体積を有するバイオリアクター内で行われる。その後、８２０では、バイオリアクター内の１つ又は２つ以上のグリカン構造のレベルが、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって決定される。１つ又は２つ以上の回帰モデルは、５０リットル以下の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクター及び１，０００リットル以上の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクターからの試行実行を使用して生成される。８３０では、所望のグリカン構造のレベルが所定の閾値を上回るか又は望ましくないグリカン構造のレベルが所定の閾値を下回る場合、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータが維持される。更に、８４０では、所望のグリカン構造のレベルが所定の閾値を下回る場合、又は望ましくないグリカン構造のレベルが所定の閾値を上回る場合、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータが修正される。
【0145】
図９は、分子上の糖化を決定するためのプロセスフロー図９００である。９１０では、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、複数の実行の各々について、分子上の糖化レベルが取得される。取得することは、第１の閾値以下の体積を有する１つ又は２つ以上のバイオリアクター内で行うことができる。ＰＡＴツールは、スペクトルデータを取得することができるか、又はそうでなければそれを生成することができる。９２０では、取得されたスペクトルデータに基づいて、分子上の糖化レベルを得られたスペクトルデータと相関させる１つ又は２つ以上の回帰モデルが生成される。次いで、９３０では、ＰＡＴツールを使用して、分子上の糖化を測定することができる。測定することは、第２の閾値以上の体積を有する１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内で行って、測定されたスペクトルデータを得ることができる。その後、９４０では、生成された１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、１つ又は２つ以上のバイオリアクター内の分子上の糖化レベルが決定される。
【0146】
１つ又は２つ以上の回帰モデルは、取得されたスペクトルデータと測定されたスペクトルデータとの組み合わせに基づいて精緻化され得る。
【0147】
１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータは、分子上の糖化レベルを生成するために、決定されたレベルに基づいて維持及び／又は選択的に修正（すなわち、変更）され得る。１つ又は２つ以上の動作パラメータは、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む。栄養素レベルは、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される。バイオリアクターにおけるグルコースの濃度は、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正することができる。
【0148】
いくつかの変形形態では、測定は、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクターを使用して行うことができる。
【0149】
第１の閾値は、約２５リットル以下を含む異なる体積であってもよい。
【0150】
第２の閾値は、約１，０００リットル以上（２，０００リットルを含む）、１０，０００～約２５，０００リットル、及び１０，０００～約１５，０００リットルを含む異なる体積に対応することができる。
【0151】
第２の閾値は、第１の閾値よりも少なくとも５倍大きく、場合によっては、第１の閾値よりも少なくとも１０倍大きく、場合によっては、第１の閾値よりも少なくとも１００倍大きく、他の場合では、第１の閾値よりも少なくとも５００倍大きくてもよい。
【0152】
ＰＡＴツールは、ラマン分光法を含む分光技術を利用することができる。
【0153】
１つ又は２つ以上の回帰モデルは、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含むことができるか、又はそうでなければそれを使用することができる。
【0154】
分子は、ｍＡｂを含み得るか、又はｍＡｂであり得る。代替的に、分子は、非ｍＡｂを含むか、又は非ｍＡｂである。
【0155】
決定は、オンサイト及び／又はオフサイトで行うことができる。更に、測定及び／又は決定は、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行うことができる。
【0156】
図１０は、所望のレベルの糖化を有する分子の産生を示すプロセスフロー図１０００である。１０１０では、プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、分子上の糖化を測定して、スペクトルデータを得る。測定することは、１，０００リットル以上の体積を有するバイオリアクター内で行うことができる。その後、１０２０では、１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、バイオリアクター内の分子上の糖化のレベルを決定する。１つ又は２つ以上の回帰モデルは、５０リットル以下の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクター及び１，０００リットル以上の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクターからの試行実行を使用して生成することができる。１０３０では、分子上の糖化のレベルが所定の閾値を下回る場合、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータが維持される。加えて、１０４０では、分子上の糖化のレベルが所定の閾値を上回る場合、バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータが選択的に修正される。
【0157】
６．実施形態
Ａ１．分子上の糖化を決定するための方法であって、
プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、複数の実行の各々について、分子上の糖化レベルを取得することであって、前記取得することが、第１の閾値以下の第１の体積を有する１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクター内で行われ、前記ＰＡＴツールが、スペクトルデータを取得することである、前記取得することと、
取得されたスペクトルデータに基づいて、分子上の糖化レベルを取得されたスペクトルデータと相関させる１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成することと、
ＰＡＴツールを使用して、分子上の糖化を測定することであって、前記測定することが、第２の閾値以上の第２の体積を有する１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内で行われて、測定されたスペクトルデータが得られることである、前記測定することと、
生成された１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内の分子上の糖化レベルを決定することと、を含む、方法。
Ａ２．取得されたスペクトルデータ及び測定されたスペクトルデータの組み合わせに基づいて、１つ又は２つ以上の回帰モデルを精緻化することを更に含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．分子上の所望の糖化レベルを産生するために、決定されたレベルに基づいて、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持することを更に含む、実施形態Ａ１又はＡ２に記載の方法。
Ａ４．分子上の所望の糖化レベルを産生するために、決定されたレベルに基づいて、第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正することを更に含む、実施形態Ａ１又は実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ５．１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ４に記載の方法。
Ａ６．栄養素レベルが、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される、実施形態Ａ５に記載の方法。
Ａ７．グルコースの濃度が、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、実施形態Ａ６に記載の方法。
Ａ８．取得することが、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクター内で行われる、実施形態Ａ１～Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９．第１の閾値が、約２５０リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１０．第１の閾値が、約１００リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１１．第１の閾値が、約５０リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１２．第１の閾値が、約２５リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３．第１の閾値が、約１０リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１４．第１の閾値が、約５リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１５．第１の閾値が、約２リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１６．第１の閾値が、約１リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１７．第２の閾値が、約１，０００リットル以上である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１８．第２の閾値が、約２，０００リットル以上である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１９．第２の閾値が、約５，０００リットル以上である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２０．第２の閾値が、約１，００００リットル～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２１．第２の閾値が、約１５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２２．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも５倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも１０倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２４．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも１００倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２５．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも５００倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２６．第１の体積が、約０．５～約２５０リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２７．第１の体積が、約１～約５０リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．第１の体積が、約１～約２５リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９．第１の体積が、約１～約１０リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３０．第１の体積が、約１～約５リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３１．第２の体積が、約１，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３２．第２の体積が、約２，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３３．第２の体積が、約５，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３４．第２の体積が、約１０，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３５．第２の体積が、約１５，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３６．ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、実施形態Ａ１～Ａ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３７．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ａ１～Ａ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３８．分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、実施形態Ａ１～Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３９．分子が、非ｍＡｂである、実施形態Ａ１～Ａ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４０．決定するステップが、オンサイトで行われる、実施形態Ａ１～Ａ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４１．決定するステップが、オフサイトで行われる、実施形態Ａ１～Ａ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４２．決定するステップが、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４３．決定するステップが、インラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４４．決定するステップが、オンラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４５．決定するステップが、アットラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４６．決定するステップが、オフラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４７．取得することが、スペクトルデータを特徴付けるデータをＰＡＴツールから受信することを含む、実施形態Ａ１～Ａ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４８．生成することが、１つ又は２つ以上のコンピューティングデバイスによって実行される、実施形態Ａ１～Ａ４７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１．分子上の糖化を決定するための方法であって、
プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、複数の実行の各々について、分子上の糖化レベルを取得することであって、前記取得することが、第１の閾値以下の第１の体積を有する１つ又は２つ以上の第１のバイオリアクター内で行われ、前記ＰＡＴツールが、スペクトルデータを取得することである、前記取得することと、
取得されたスペクトルデータに基づいて、分子上の糖化レベルを取得されたスペクトルデータと相関させる１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成することと、
ＰＡＴツールを使用して、分子上の糖化を測定することであって、前記測定することが、第２の閾値以上の第２の体積を有する１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内で行われて、測定されたスペクトルデータが得られることである、前記測定することと、
生成された１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクター内の分子上の糖化レベルを決定することと、を含む、方法。
Ａ２．取得されたスペクトルデータ及び測定されたスペクトルデータの組み合わせに基づいて、１つ又は２つ以上の回帰モデルを精緻化することを更に含む、実施形態Ａ１に記載の方法。
Ａ３．分子上の所望の糖化レベルを産生するために、決定されたレベルに基づいて、１つ又は２つ以上の第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを維持することを更に含む、実施形態Ａ１又はＡ２に記載の方法。
Ａ４．分子上の所望の糖化レベルを産生するために、決定されたレベルに基づいて、第２のバイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正することを更に含む、実施形態Ａ１又は実施形態Ａ２に記載の方法。
Ａ５．１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ａ４に記載の方法。
Ａ６．栄養素レベルが、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される、実施形態Ａ５に記載の方法。
Ａ７．グルコースの濃度が、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、実施形態Ａ６に記載の方法。
Ａ８．取得することが、異なる体積を有する２つ又は３つ以上のバイオリアクター内で行われる、実施形態Ａ１～Ａ７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ９．第１の閾値が、約２５０リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１０．第１の閾値が、約１００リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１１．第１の閾値が、約５０リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１２．第１の閾値が、約２５リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１３．第１の閾値が、約１０リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１４．第１の閾値が、約５リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１５．第１の閾値が、約２リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１６．第１の閾値が、約１リットル以下である、実施形態Ａ１～Ａ８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１７．第２の閾値が、約１，０００リットル以上である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１８．第２の閾値が、約２，０００リットル以上である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ１９．第２の閾値が、約５，０００リットル以上である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２０．第２の閾値が、約１，００００リットル～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２１．第２の閾値が、約１５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２２．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも５倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２３．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも１０倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２４．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも１００倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２５．第２の閾値が、第１の閾値よりも少なくとも５００倍大きい、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２６．第１の体積が、約０．５～約２５０リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２７．第１の体積が、約１～約５０リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２８．第１の体積が、約１～約２５リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ２９．第１の体積が、約１～約１０リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３０．第１の体積が、約１～約５リットルである、実施形態Ａ１～Ａ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３１．第２の体積が、約１，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３２．第２の体積が、約２，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３３．第２の体積が、約５，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３４．第２の体積が、約１０，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３５．第２の体積が、約１５，０００～約２５，０００リットルである、実施形態Ａ１～Ａ３０のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３６．ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、実施形態Ａ１～Ａ３５のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３７．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ａ１～Ａ３６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３８．分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）である、実施形態Ａ１～Ａ３７のいずれか１つに記載の方法。
Ａ３９．分子が、非ｍＡｂである、実施形態Ａ１～Ａ３８のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４０．決定するステップが、オンサイトで行われる、実施形態Ａ１～Ａ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４１．決定するステップが、オフサイトで行われる、実施形態Ａ１～Ａ３９のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４２．決定するステップが、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４１のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４３．決定するステップが、インラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４４．決定するステップが、オンラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４５．決定するステップが、アットラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４６．決定するステップが、オフラインで行われる、実施形態Ａ１～Ａ４２のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４７．取得することが、スペクトルデータを特徴付けるデータをＰＡＴツールから受信することを含む、実施形態Ａ１～Ａ４６のいずれか１つに記載の方法。
Ａ４８．生成することが、１つ又は２つ以上のコンピューティングデバイスによって実行される、実施形態Ａ１～Ａ４７のいずれか１つに記載の方法。
【0158】
Ｂ１．所望のレベルの糖化を有する分子を産生する方法であって、
プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、分子上の糖化を測定して、スペクトルデータを得ることであって、前記測定することが、１，０００リットル以上の体積を有するバイオリアクター内で行われるものである、前記測定することと、
１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、バイオリアクター内の分子上の糖化のレベルを決定することであって、前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、５０リットル以下の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクター及び１，０００リットル以上の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクターからの試行実行を使用して生成されるものである、前記決定することと、
バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを、
分子上の糖化のレベルが所定の閾値を下回る場合、維持することと、
バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを、
分子上の糖化のレベルが所定の閾値を上回る場合、選択的に修正することと、を含む、方法。
Ｂ２．測定することが、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．測定することが、インラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ４．測定することが、オンラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ５．測定することが、アットラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ６．測定することが、オフラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ７．測定することが、１日２回以上行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８．測定することが、約５～６０分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ９．測定することが、約１０～３０分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１０．測定することが、約１０～２０分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１１．測定することが、約１２．５分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１２．バイオリアクター体積が、約２，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１３．バイオリアクター体積が、約５，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１４．バイオリアクター体積が、約１０，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５．バイオリアクター体積が、約１５，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１６．バイオリアクター体積が、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルである、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１７．バイオリアクター体積が、約１５，０００リットルである、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１８．決定するステップが、オンサイトで行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１９．決定するステップが、オフサイトで行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２０．測定された糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせである、実施形態Ｂ１～Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２１．バイオリアクターが、バッチリアクター、流加リアクター、又は灌流リアクターである、実施形態Ｂ１～Ｂ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２２．１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２３．栄養素レベルが、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される、実施形態Ｂ２２に記載の方法。
Ｂ２４．グルコースの濃度が、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、実施形態Ｂ２３に記載の方法。
Ｂ２５．ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２６．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２７．所定の閾値が、分子上の約２０％未満の糖化である、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
プロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールを使用して、分子上の糖化を測定して、スペクトルデータを得ることであって、前記測定することが、１，０００リットル以上の体積を有するバイオリアクター内で行われるものである、前記測定することと、
１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、かつ測定されたスペクトルデータに基づいて、少なくとも１つのコンピューティングデバイスによって、バイオリアクター内の分子上の糖化のレベルを決定することであって、前記１つ又は２つ以上の回帰モデルが、５０リットル以下の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクター及び１，０００リットル以上の体積を有する少なくとも１つのバイオリアクターからの試行実行を使用して生成されるものである、前記決定することと、
バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを、
分子上の糖化のレベルが所定の閾値を下回る場合、維持することと、
バイオリアクターの１つ又は２つ以上の動作パラメータを、
分子上の糖化のレベルが所定の閾値を上回る場合、選択的に修正することと、を含む、方法。
Ｂ２．測定することが、インライン、アットライン、オンライン、オフライン、又はそれらの組み合わせで行われる、実施形態Ｂ１に記載の方法。
Ｂ３．測定することが、インラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ４．測定することが、オンラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ５．測定することが、アットラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ６．測定することが、オフラインで行われる、実施形態Ｂ１又はＢ２に記載の方法。
Ｂ７．測定することが、１日２回以上行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ８．測定することが、約５～６０分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ９．測定することが、約１０～３０分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１０．測定することが、約１０～２０分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１１．測定することが、約１２．５分毎に行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１２．バイオリアクター体積が、約２，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１３．バイオリアクター体積が、約５，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１４．バイオリアクター体積が、約１０，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１５．バイオリアクター体積が、約１５，０００リットル以上である、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１６．バイオリアクター体積が、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルである、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１７．バイオリアクター体積が、約１５，０００リットルである、実施形態Ｂ１～Ｂ１１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１８．決定するステップが、オンサイトで行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ１９．決定するステップが、オフサイトで行われる、実施形態Ｂ１～Ｂ１７のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２０．測定された糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせである、実施形態Ｂ１～Ｂ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２１．バイオリアクターが、バッチリアクター、流加リアクター、又は灌流リアクターである、実施形態Ｂ１～Ｂ２０のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２２．１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２１のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２３．栄養素レベルが、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される、実施形態Ｂ２２に記載の方法。
Ｂ２４．グルコースの濃度が、測定されたスペクトルデータに基づいて自動的に修正される、実施形態Ｂ２３に記載の方法。
Ｂ２５．ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２４のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２６．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ｂ１～Ｂ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｂ２７．所定の閾値が、分子上の約２０％未満の糖化である、実施形態Ｂ１～Ｂ２６のいずれか１つに記載の方法。
【0159】
Ｃ１．非糖化分子を産生するためのシステムであって、
非糖化分子を産生することができる細胞株を培養するための手段と、
糖化のレベルを測定するための手段であって、スペクトルデータを生成する、手段と、
スペクトルデータに基づいて１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成するための手段と、
細胞株における糖化のレベルを測定するための手段と、を備える、システム。
Ｃ２．細胞株が、哺乳動物細胞株である、実施形態Ｃ１に記載のシステム。
Ｃ３．哺乳動物細胞株が、非ヒト細胞株である、実施形態Ｃ２に記載のシステム。
Ｃ４．培養することが、バッチ、流加、灌流、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ５．培養することが、約２，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ６．培養することが、約５，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ７．培養することが、約１０，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ８．培養することが、約１５，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ９．培養することが、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルの体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１０．培養することが、約１５，０００リットルの体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１１．測定することが、インサイツで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１２．測定することが、オンラインで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１３．測定することが、アットラインで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１４．測定することが、オフラインで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１５．測定することが、１日２回以上行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１６．測定することが、約５～６０分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１７．測定することが、約１０～３０分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１８．測定することが、約１０～２０分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１９．測定することが、約１２．５分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２０．測定された糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１９のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２１．非糖化分子の産生を増強するために、１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正するための手段を更に備える、実施形態Ｃ１～Ｃ２０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２２．１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ２１に記載のシステム。
Ｃ２３．栄養素レベルが、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される、実施形態Ｃ２２に記載のシステム。
Ｃ２４．グルコースの濃度が、スペクトルデータに基づいて自動的に修正される、実施形態Ｃ２３に記載のシステム。
Ｃ２５．１つ又は２つ以上のグリコシル化分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２６．１つ又は２つ以上のグリコシル化分子が、非ｍＡｂを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２７．スペクトルデータが、ラマンスペクトルを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２６のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２８．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２７のいずれか１つに記載のシステム。
非糖化分子を産生することができる細胞株を培養するための手段と、
糖化のレベルを測定するための手段であって、スペクトルデータを生成する、手段と、
スペクトルデータに基づいて１つ又は２つ以上の回帰モデルを生成するための手段と、
細胞株における糖化のレベルを測定するための手段と、を備える、システム。
Ｃ２．細胞株が、哺乳動物細胞株である、実施形態Ｃ１に記載のシステム。
Ｃ３．哺乳動物細胞株が、非ヒト細胞株である、実施形態Ｃ２に記載のシステム。
Ｃ４．培養することが、バッチ、流加、灌流、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ３のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ５．培養することが、約２，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ６．培養することが、約５，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ７．培養することが、約１０，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ８．培養することが、約１５，０００リットル以上の体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ９．培養することが、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルの体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１０．培養することが、約１５，０００リットルの体積を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１１．測定することが、インサイツで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１２．測定することが、オンラインで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１３．測定することが、アットラインで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１４．測定することが、オフラインで行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１１のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１５．測定することが、１日２回以上行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１６．測定することが、約５～６０分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１７．測定することが、約１０～３０分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１８．測定することが、約１０～２０分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ１９．測定することが、約１２．５分毎に行われる、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２０．測定された糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１９のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２１．非糖化分子の産生を増強するために、１つ又は２つ以上の動作パラメータを選択的に修正するための手段を更に備える、実施形態Ｃ１～Ｃ２０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２２．１つ又は２つ以上の動作パラメータが、ｐＨレベル、栄養素レベル、培養培地の濃度、培養培地の添加の頻度間隔、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｃ２１に記載のシステム。
Ｃ２３．栄養素レベルが、グルコースの濃度、乳酸塩の濃度、グルタミンの濃度、及びアンモニウムイオンの濃度からなる群から選択される、実施形態Ｃ２２に記載のシステム。
Ｃ２４．グルコースの濃度が、スペクトルデータに基づいて自動的に修正される、実施形態Ｃ２３に記載のシステム。
Ｃ２５．１つ又は２つ以上のグリコシル化分子が、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２６．１つ又は２つ以上のグリコシル化分子が、非ｍＡｂを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２４のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２７．スペクトルデータが、ラマンスペクトルを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２６のいずれか１つに記載のシステム。
Ｃ２８．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ｃ１～Ｃ２７のいずれか１つに記載のシステム。
【0160】
Ｄ１．非糖化分子を産生するためのシステムであって、
非糖化分子を産生することができる細胞株を含むバイオリアクターと、
糖化を測定し、スペクトルデータを生成するプロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールと、
１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、糖化のレベルをスペクトルデータと相関させるプロセッサと、を備える、システム。
Ｄ２．バイオリアクターが、約２，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ３．バイオリアクターが、約５，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ４．バイオリアクターが、約１０，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ５．バイオリアクターが、約１５，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ６．バイオリアクターが、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルである、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ７．バイオリアクターが、約１５，０００リットルである、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ８．糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ７のいずれか１つに記載のシステム。
Ｄ９．細胞株が、哺乳動物細胞株である、実施形態Ｄ１～Ｄ８のいずれか１つに記載の系。
Ｄ１０．哺乳動物細胞株が、非ヒト細胞株である、実施形態Ｄ９に記載のシステム。
Ｄ１１．ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｄ１２．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１１のいずれか１つに記載のシステム。
非糖化分子を産生することができる細胞株を含むバイオリアクターと、
糖化を測定し、スペクトルデータを生成するプロセス分析技術（ＰＡＴ）ツールと、
１つ又は２つ以上の回帰モデルを使用して、糖化のレベルをスペクトルデータと相関させるプロセッサと、を備える、システム。
Ｄ２．バイオリアクターが、約２，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ３．バイオリアクターが、約５，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ４．バイオリアクターが、約１０，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ５．バイオリアクターが、約１５，０００リットル以上である、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ６．バイオリアクターが、約１０，０００リットル～約２５，０００リットルである、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ７．バイオリアクターが、約１５，０００リットルである、実施形態Ｄ１に記載のシステム。
Ｄ８．糖化が、モノ糖化、非糖化、又はそれらの組み合わせを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ７のいずれか１つに記載のシステム。
Ｄ９．細胞株が、哺乳動物細胞株である、実施形態Ｄ１～Ｄ８のいずれか１つに記載の系。
Ｄ１０．哺乳動物細胞株が、非ヒト細胞株である、実施形態Ｄ９に記載のシステム。
Ｄ１１．ＰＡＴツールが、ラマン分光法を利用するか、又はそうでなければそれを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１０のいずれか１つに記載のシステム。
Ｄ１２．１つ又は２つ以上の回帰モデルが、部分最小二乗（ＰＬＳ）モデルを含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１１のいずれか１つに記載のシステム。
【0161】
７．実施例
本出願の以下の実施例は、本出願の本質を更に説明するためのものである。当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
本出願の以下の実施例は、本出願の本質を更に説明するためのものである。当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本明細書によって定義されるように本発明の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。
【0162】
実施例１：糖化及びグリコシル化のリアルタイム監視のための実験設計
この研究の目的は、製造スケールでの代表的なＣＨＯ細胞培養物における糖化及びグリコシル化（両方のＣＱＡ）のリアルタイム監視のためのラマンスペクトルのＰＬＳモデルを開発することであった。
この研究の目的は、製造スケールでの代表的なＣＨＯ細胞培養物における糖化及びグリコシル化（両方のＣＱＡ）のリアルタイム監視のためのラマンスペクトルのＰＬＳモデルを開発することであった。
【0163】
最初に、縮小スケールデータからのモデル開発を評価した。次いで、縮小スケールデータを製造スケールデータで補完することによって、モデル堅牢性の開発を検討した。ラマン分光法を使用することによって、製品の品質を、バイオ治療用ｍＡｂ製品の製造プロセス全体通して考慮して、上流の生産プロセス全体通してリアルタイムでＣＱＡを監視することによって、これを達成した。
【0164】
実験設計では、１８バッチのｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞株を使用した。撹拌バイオリアクタースケールは、単回使用バッグ（single use bag、ＳＵＢ）２０００Ｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、５Ｌガラス（Ａｐｐｌｉｋｏｎ Ｉｎｃ．，Ｓｃｈｉｅｄａｍ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、及び１Ｌガラス（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）であり、流加プロセスは１６～１８日間続いた。合計で、９つの１Ｌバッチ、７つの５Ｌバッチ、及び２つの２０００Ｌバッチが含まれた。０日目に、市販のシードトレインを使用して、各２０００Ｌバッチに接種した。２０００Ｌバッチからの１日目の細胞培養物を使用して、１０の縮小スケールバイオリアクターに接種した。また、０日目に、実験室シードトレインを使用して、６つの縮小スケールバイオリアクターに接種した。基本培地及び毎日の供給培地を、実行された各バッチについて使用し、全てについてプロセス制御を実装した。
【0165】
バイオリアクター実行の実行中に２つの供給戦略を用い、各々が２つの複合供給からなり、３日目に開始して各バイオリアクターに供給した。１２バッチ（２×２０００Ｌ、７×５Ｌ、３×１Ｌ）に、容器体積の規定された割合に基づいて、両方の複合供給を毎日供給した。他の６つのバッチ（６×１Ｌ）には、容器の規定された割合に基づいて、第１の複合供給を供給し、第２の複合供給を１日に複数回送達して、供給戦略研究の一部としてバイオリアクターにおけるグルコースの所定の目標レベルを維持した。全てのバイオリアクターを、同じ播種密度限界内で接種した。
【0166】
各バッチは、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、及び温度について同一の制御目標を有していた。ＤＯは、通気及び酸素散布によって４０％に制御した。６．９５のｐＨ目標は、二酸化炭素及び２．０Ｍ炭酸ナトリウムの添加を使用して維持した。温度は、細胞培養全体を通して３６．５℃（３５．５℃～３７．５℃）の設定点に制御した。スケール依存性のプロセスパラメータの撹拌は、体積当たりの電力値を使用してスケールにわたって伝達された。オフライン試料を、各バイオリアクターから毎日採取し、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＭｅｔａＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ細胞生存率アナライザ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、及びＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）オフラインアナライザを使用して、グルコース、乳酸塩、力価、生細胞密度、及び％生存率を含む代謝産物のパネルについて測定した。各バッチが完了したら、更なる試験のために、毎日の各培養試料を保持し、－７０℃で凍結した。
【0167】
糖化及びグリコシル化の分析
ｍＡｂの糖化及びグリコシル化を、ＬＣ／ＭＳ分析によってオフラインで特徴付けた。簡潔には、最初に、糖化分析のためのタンパク質試料をＥｎｄｏＳ酵素で前処理して、Ｎ結合型炭水化物を除去し、グリコフォームに基づく試料の不均一性を排除した。次いで、タンパク質試料を、高性能液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、ＨＰＬＣ）によって分離し、オンラインエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析によって分析した。次いで、クロマトグラフィーピークにわたって収集された質量／電荷データを合計し、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してデコンボリューションした。検出された糖化アイソフォームを、デコンボリューションされた質量スペクトル分析に基づいて割り当て、それらの相対存在量を、中心デコンボリューション質量スペクトルのピーク強度を使用して計算した。グリコシル化のためのタンパク質試料を、最初に、１Ｍジチオスレイトールで前処理して、個々のｍＡｂ重鎖及び軽鎖を分離した。次いで、タンパク質試料を、ＬＣ／ＭＳによって以前のように分析し、グリコシル化アイソフォームを、以前に記載されているように割り当て、定量した。
ｍＡｂの糖化及びグリコシル化を、ＬＣ／ＭＳ分析によってオフラインで特徴付けた。簡潔には、最初に、糖化分析のためのタンパク質試料をＥｎｄｏＳ酵素で前処理して、Ｎ結合型炭水化物を除去し、グリコフォームに基づく試料の不均一性を排除した。次いで、タンパク質試料を、高性能液体クロマトグラフィー（High Performance Liquid Chromatography、ＨＰＬＣ）によって分離し、オンラインエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析によって分析した。次いで、クロマトグラフィーピークにわたって収集された質量／電荷データを合計し、Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してデコンボリューションした。検出された糖化アイソフォームを、デコンボリューションされた質量スペクトル分析に基づいて割り当て、それらの相対存在量を、中心デコンボリューション質量スペクトルのピーク強度を使用して計算した。グリコシル化のためのタンパク質試料を、最初に、１Ｍジチオスレイトールで前処理して、個々のｍＡｂ重鎖及び軽鎖を分離した。次いで、タンパク質試料を、ＬＣ／ＭＳによって以前のように分析し、グリコシル化アイソフォームを、以前に記載されているように割り当て、定量した。
【0168】
バイオリアクターバッチ中のラマンスペクトルの取得
全てのバッチについて２つの機器を使用して、ラマンスペクトルを収集した。各々、－４０℃での７８５ｎｍレーザー源を含むマルチチャネルラマンＲＸＮ２システム（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）及び電荷結合素子（charge-coupled device、ＣＣＤ）を使用した。検出器を、光ファイバー励起ケーブル及び光ファイバー収集ケーブル（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）からなるＭＲプローブに接続した。滅菌バイオリアクターに挿入されたｂＩＯ－Ｏｐｔｉｃ－２２０ステンレス鋼プローブ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に取り付けられたＭＲプローブによってデータを収集した。ｉＣＲａｍａｎソフトウェア４．１．（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ａｕｔｏｃｈｅｍ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用して、全ての縮小スケールバッチ（１Ｌ、５Ｌ）についてスペクトルを取得するために、ラマンＲＸＮ２を制御した。ラマンランタイムＨＭＩ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を、全ての２０００Ｌバッチにおけるスペクトルを取得するために使用した。全てのラマンスペクトルデータの収集は、７５スキャンについて１０秒間の露光のシステム設定を使用した。これは、２．５分間のオーバーヘッド時間を含む１５分後のプローブについてのスペクトルをもたらした。ラマンスペクトルの取得は、波数１００～３，４２５ｃｍ－１に及んだ。縮小スケールの容器は、アルミホイルによって光干渉から保護した。（製造スイートにおいて設定された単回使用バイオリアクターのため、ステンレス鋼に封入されていたので、これは必要とされなかった）。システムの各使用前に、Ｈｏｌｏｌａｂ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（ＨＣＡ）（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて機器の強度較正を行い、バイオリアクタープロセス全体を通して２４時間毎に内部較正が行われるように設定した。
全てのバッチについて２つの機器を使用して、ラマンスペクトルを収集した。各々、－４０℃での７８５ｎｍレーザー源を含むマルチチャネルラマンＲＸＮ２システム（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）及び電荷結合素子（charge-coupled device、ＣＣＤ）を使用した。検出器を、光ファイバー励起ケーブル及び光ファイバー収集ケーブル（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）からなるＭＲプローブに接続した。滅菌バイオリアクターに挿入されたｂＩＯ－Ｏｐｔｉｃ－２２０ステンレス鋼プローブ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に取り付けられたＭＲプローブによってデータを収集した。ｉＣＲａｍａｎソフトウェア４．１．（Ｍｅｔｔｌｅｒ Ｔｏｌｅｄｏ Ａｕｔｏｃｈｅｍ，Ｃｏｌｕｍｂｉａ，ＭＤ）を使用して、全ての縮小スケールバッチ（１Ｌ、５Ｌ）についてスペクトルを取得するために、ラマンＲＸＮ２を制御した。ラマンランタイムＨＭＩ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を、全ての２０００Ｌバッチにおけるスペクトルを取得するために使用した。全てのラマンスペクトルデータの収集は、７５スキャンについて１０秒間の露光のシステム設定を使用した。これは、２．５分間のオーバーヘッド時間を含む１５分後のプローブについてのスペクトルをもたらした。ラマンスペクトルの取得は、波数１００～３，４２５ｃｍ－１に及んだ。縮小スケールの容器は、アルミホイルによって光干渉から保護した。（製造スイートにおいて設定された単回使用バイオリアクターのため、ステンレス鋼に封入されていたので、これは必要とされなかった）。システムの各使用前に、Ｈｏｌｏｌａｂ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（ＨＣＡ）（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて機器の強度較正を行い、バイオリアクタープロセス全体を通して２４時間毎に内部較正が行われるように設定した。
【0169】
実施例２：縮小スケールでの糖化及びグリコシル化のためのラマン分光法に基づくＰＬＳモデルの開発（フロー１）
本実施例は、ラマン分光法に基づくＰＬＳモデルが、バイオリアクターにおける生産中の例示的な治療用タンパク質生産細胞株の糖化及びグリコシル化プロファイルのために開発され得ることを実証する。
本実施例は、ラマン分光法に基づくＰＬＳモデルが、バイオリアクターにおける生産中の例示的な治療用タンパク質生産細胞株の糖化及びグリコシル化プロファイルのために開発され得ることを実証する。
【0170】
この実施例では、縮小スケール（１Ｌ及び５Ｌ）での細胞培養プロセスからのラマンデータ及びオフラインデータの両方を使用して、ｍＡｂの糖化及びグリコシル化プロファイルのための７つの計量化学ＰＬＳモデルのパネルを開発した。糖化（モノ糖化、非糖化）について、２つのモデルを検討し、グリコシル化プロファイル（Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）について、５つのモデルを検討した。Ｓｉｍｃａ１５．１（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて計量化学モデリングを行った。
【0171】
糖化及びグリコシル化についてのオフライン測定を、各バッチにおいて５日目に開始して、それらが取られた時間に基づいて、ラマンスペクトルに適合させた。この時点からモデルを構築する決定は、プロセスの経験的知識と、ＨＰＬＣによる検出可能なレベルでのｍＡｂ製品の生産とに基づいた。５日目より前の全てのデータ、ラマンスペクトル、及びオフライン測定は、モデルの構築及び試験から除外した。
【0172】
各モデルは、モデル開発のための１５バッチ（９×１Ｌ及び６×５Ｌ）の較正試料セット（calibration sample set、ＣＳＳ）と、各ＣＱＡについて生成されたＰＬＳモデルを用いて試験するためのブラインドデータセットとして使用される１バッチ（５Ｌ）の較正試験試料セット（calibration test sample set、ＣＴＳＳ）と、からなった。このバッチを、利用可能な５Ｌバッチデータから無作為にＣＴＳＳとして選択した。このフローにおける各モデルについてのＸ変数は、ラマンスペクトル（中心）であり、Ｙ変数は、モノ糖化、非糖化、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆの割合（％）についてのオフライン値（一変量スケール）であった。全てのモデルについてのラマンスペクトルの波数選択は、４１５～１８００ｃｍ－１及び２８００～３１００ｃｍ－１であった。全てのＰＬＳモデルに適用されたスペクトルフィルターは、Ｓａｖｉｔｓｋｙ－Ｇｏｌａｙ一次導関数二次（３１ｃｍ－１点）及び標準正規変量（ＳＮＶ；データは示さず）であった。
【0173】
各ＰＬＳモデルを構築し、リーブ・バッチ・アウト（leave-batch-out）交差検証（モデル開発において各バッチを１回省略する）の方法を使用することによって誤差について評価した。モデル誤差を、省略されたバッチに対するモデルの予測に基づいて平均して、交差検証の二乗平均平方根（root mean square of cross-validation、ＲＭＳＥｃｖ）を特定した。ＲＭＳＥｃｖは、モデルを構築するために使用されるデータに基づくモデルの予測力を示す。より低い平均誤差（ＲＭＳＥｃｖ）は、改善されたモデルを示した。これにより、ブラインドデータセットに対する試験のために生成されたモデルに対してどの成分番号が使用されるべきかについてのより良い情報に基づく意思決定が可能になった。Ｓｉｍｃａ１５．１における予測関数を使用して、モデルの予測能力対ＣＴＳＳを試験することにより、予測の二乗平均平方根誤差（root mean square error of prediction、ＲＭＳＥＰ）が特定された。これは、モデルの予測力対未知のデータセットを示す。各ＰＬＳモデルについて、回帰（Ｒ２）値、変動係数を記録した。このＲ２値は、モデル予測子（Ｘ変数）が説明し得るＹ変数の変化量を決定するために使用される。Ｒ２値が１に近いほど、モデルがＹ変数をより適切に説明したことになる。各モデルのそれぞれのＲＭＳＥｃｖ、ＲＭＳＥＰ、及びＲ２値に基づいて、モデルの性能を評価した。各モデルの投影の変数重要度（ＶＩＰ）も考慮した。これは、Ｙ変数を予測する際のモデルにおけるＸ変数の重要性を要約するパラメータである。１より大きい値を有するＸ変数は、Ｙ変数を説明するのに最も関連していると考えられる。
【0174】
フロー１は、ＰＬＳモデル構築のための較正データセットとしての縮小スケールデータのみの使用を評価した。開発された７つのモデル（糖化（モノ糖化、非糖化）について２つのモデル、及びグリコシル化プロファイル（Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ）について５つのモデル）の各々を、縮小スケールバッチデータのブラインドデータセットに対して予測することによって試験した。フロー１における各モデルは、ＣＳＳにおける縮小スケールプロセスデータの１５バッチからなり、１つの完全なバッチ（５Ｌ）がブラインドＣＴＳＳとして試験に使用された。
【0175】
リーブ・バッチ・アウト交差検証を使用して、各モデルの最適成分数を決定した。これは、最低のマッチングＲＭＳＥｃｖ値を有する成分の最小数として決定された。各モデルを、最適成分数について個別に評価した。交差検証からの平均Ｒ２結果は、各モデルにおける強い程度の変動性を示す。これは、検討中のモデルの各々について報告された＞０．８のＲ２値によって説明される（表１）。各モデルの精度の許容基準は、モデルＣＳＳで観察された測定値の範囲に基づいて決定された。精度の許容基準は、ＪＳＩでの計量化学モデル開発標準に従って、較正データセットにおいて使用される値の範囲の１０％として設定した。これは、オフライン分析で用いた方法の許容誤差を含む、各モデルについての誤差の潜在的な原因に基づいて、適切な許容基準であると決定された。各モデルにおける誤差を、計算された許容基準（表１）に対して二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥｃｖ、ＲＭＳＥＰ）を比較することによって評価した。ＲＭＳＥｃｖは、最適成分数を通知する。この値はまた、較正データセットに基づいて目的の変数を予測するモデルの能力を示す。各モデルについて選択された成分数は、予測誤差についての許容基準内に入るＲＭＳＥｃｖを与え、したがって、モデル開発に適切であるとみなされた。
【0176】
【表1】
【0177】
各モデルの予測精度をブラインドデータセット（５Ｌバッチ）で試験した場合、相補的な結果が観察された（表１）。Ｒ２は、モノ糖化、非糖化、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、Ｇ２Ｆ、Ｇ０について＞０．８５、及びＧ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃについて＜０．７であった。全てのＲ２値は、ブラインドデータセットに対して試験した場合に減少を示した。しかしながら、Ｇ０、モノ糖化、及び非糖化を除く全てのモデルについてのＲＭＳＥＰ値は、ＲＭＳＥｃｖについて観察された値よりも低い予測誤差を示した。＞０．９のＲ２は、必ずしもより良好なモデルを示すわけではなく、モデル評価中にＲ２値と併せてＲＭＳＥｃｖ及びＲＭＳＥＰを含む複数の因子を考慮する必要性を強化する。
【0178】
縮小スケールでのブラインドデータセットに対する試験は、Ｇ０、モノ糖化、及び非糖化モデルについて観察されたＲ２の減少及びモデル誤差のわずかな増加を示したが、これらのモデルは依然として許容基準内にあり、したがって、縮小スケールでグリコシル化を予測する際の使用に好適であるとみなすことができることに留意されたい。予測試験について観察された傾向（図３Ａ～図３Ｇ）は、使用のためのモデルの好適性を確認し、モノ糖化及び非糖化の傾向は、オフラインデータの傾向に厳密に従い、予想されるように、プロセス持続時間について互いに相補的である。Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆは、同様にオフライン傾向に従い、各々においてわずかな偏差が観察されたが、全てが許容可能な誤差基準内であった。
【0179】
各モデルにおいてＶＩＰスコア＞１を有すると特定されたラマンスペクトル領域は、許容可能な程度のモデル特異性を示した（図１１Ａ～図１１Ｆ）。糖化モデル（モノ糖化、非糖化）は、以前にグルコースＰＬＳモデルについて特定されたものと同様のラマンスペクトル領域の関連性を示したが、ある程度の二次相関は糖化タンパク質の構造に起因する可能性が高く、これらのモデルについてのグルコースとの望ましくない相関は、モデルＣＳＳにおいて使用されるデータがグルコース供給の前及び後の両方の間隔で取得されることを確実にすることによって回避された。望ましくないグルコース相関を断つために、データ収集のためにバイオリアクターバッチを実行する場合、異なるグルコース供給戦略も使用した。グリコシル化プロファイルモデル（Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆ）は、以前にグリカン成分（例えば、マンノース、フコース、ｎ－アセチルグルコサミン）と関連付けられていた領域において＞１のＶＩＰスコアを示した。これは、各グリカンに関連するラマンスペクトルにおけるピークを特定するモデルを示唆する。
【0180】
各モデルの内部関係プロットの初期評価は、モデル評価で進行するのに十分なレベルの線形性を示したが、製品力価との二次相関を考慮すると、将来の研究では、非線形ＰＬＳ法がモデル精度を潜在的に改善し得る可能性がある。いずれの場合も、モデル性能は許容可能であり、予想されるプロファイルを有する毎日のオフライン試料との密接な一致は、このフローにおいて行われるモデル開発の決定を支持する。
【0181】
バイオリアクターのプロセス中に糖化及びグリコシル化などのＣＱＡをリアルタイムで監視する能力は、ＱｂＤの重要な目標に適合し、品質の評価がプロセスに組み込まれる（ＰＤＡ．，２０１２）。プロセス内ＣＱＡ監視を使用して、重要プロセスパラメータ（critical process parameter、ＣＰＰ）と製品品質との間の因果関係を確立することができる。プロセスの特徴付けがまだ完全に完了していない製品開発の初期にこのアプローチを確立することにより、開発及びスケールアップに必要な時間を短縮することができ（Ｋｏｚｌｗｏｓｋｉ．，２００６）、製造の非効率性を低減して、製品の品質のより厳密な制御及び収率の改善を可能にすることができる（Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，２０１４）。
【0182】
ここに提示された結果は、モデル開発においてなされた決定を支持し、ラマン分光法に基づくＰＬＳモデルが、ＣＨＯ ｍＡｂ産生バイオリアクタープロセスの糖化プロファイル及びグリコシル化の両方を、グリカンプロファイルに特に焦点を当てながら予測することができることを示す。
【0183】
実施例３：縮小スケールデータを用いて開発されたモデルを使用する製造スケールでの糖化及びグリコシル化の予測（フロー２）
この実施例では、実施例２で上述したＣＳＳを使用して開発されたモデルの各々を、製造スケールで正確に予測する能力について調査した。この実施例では、モデルを開発するために、調整も追加データも使用しなかった。
この実施例では、実施例２で上述したＣＳＳを使用して開発されたモデルの各々を、製造スケールで正確に予測する能力について調査した。この実施例では、モデルを開発するために、調整も追加データも使用しなかった。
【0184】
各モデル（モノ糖化、非糖化、Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆ）を試験し、この細胞培養プロセスのための単一の製造スケールバッチ（２０００ＬバッチＡ）からのデータからなる新しいＣＴＳＳに対してＳｉｍｃａ１５．１における予測関数を使用することによって評価した。このバッチを、利用可能な２０００Ｌバッチデータから無作為にＣＴＳＳとして選択した。次いで、ＣＴＳＳを使用して、縮小スケールデータ（１Ｌ、５Ｌ）のみを使用して開発されたラマンモデルが、製造スケールでのＣＱＡを予測する能力を調査した。モデルに変更が加えられず、したがって、ＲＭＳＥｃｖの変更が観察されなかったので、リーブ・バッチ・アウト交差検証は繰り返さなかった。７つのモデルのＲＭＳＥＰ及びＲ２値の各々を、実施例２において生成されたモデルの出力と比較して、ＰＬＳモデルの開発には縮小スケールのデータのみで十分であるかどうかを決定した。
【0185】
フロー２では、モデルの堅牢性を製造スケールデータ（２０００Ｌ）に対して試験した。実施例ＩＩで上述したフロー１からの各モデルを、２０００Ｌバッチからのプロセスデータから構成される新しいブラインドＣＴＳＳに対して予測することによって試験した。ＲＭＳＥｃｖのモデル統計は、追加データがモデルに追加又はモデルから除去されなかったので、フロー１で観察されたものと同様であった。２０００Ｌブラインドデータセットに対して予測された場合、全てのモデルの場合で＞０．８０の平均Ｒ２値が観察された（表２）。これは、各モデル内の良好な変動性を示す。
【0186】
【表2】
【0187】
糖化モデルは両方とも良好に機能し、各モデル（モノ糖化及び非糖化）の場合に０．３５５３％のＲＭＳＥＰが観察された。驚くべきことに、ここで観察されたＲＭＳＥＰ値は、フロー１（実施例２に記載）で観察されたものよりも低かった。これは、治療用タンパク質（例えば、ｍＡｂ）プロセスの糖化プロファイルを監視するためのモデルを開発するのに、縮小スケールのデータのみで十分であり得ることを示す。タンパク質の糖化をもたらす相互作用は、還元糖のレベル、バイオリアクターにおける温度及び時間に依存する（Ｑｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００８）。特定の糖化部位の占有率を制御することは困難であり得るが（Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０１７）、糖化の全体的なレベルは、生産のスケールアップ中に、特定のレベルに維持することができる。したがって、糖化に典型的に寄与するプロセス変数は、全てのバイオリアクターのスケールにわたって同等のレベルで維持される。このため、縮小スケールのデータを使用することは、堅牢な糖化モデルを開発するのに十分であり得る。
【0188】
グリコシル化モデルに関する統計量は、製造スケールのデータに対して試験した場合、より多様な応答を示す。Ｇ２ＦモデルについてのＲＭＳＥＰ値は０．４０７４％であることが観察された。これは、許容基準外であり、したがって、モデルは、製造スケールでの監視における使用に好適ではないとみなされた。興味深いことに、このモデルのＲ２値は＞０．８５であった。これは、ＰＬＳモデルを評価する場合、複数の統計量を参照することの重要性を更に強調している。
【0189】
２０００Ｌバッチでは、それが進行するにつれて、ラマンモデル予測対オフライン値を示す傾向（図４Ａ～図４Ｇ）は、モデル統計量を確認する。Ｇ２Ｆは、バッチ全体にわたってオフライン測定の傾向から逸脱している（図４Ｇ）。Ｇ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃ、Ｇ０、Ｇ０Ｆ、Ｇ１Ｆのモデルは許容基準を満たし、見た目には、オフライン測定の傾向に従うようであった。Ｇ０及びＧ０Ｆ－ＧｌｃＮａｃは、フロー１で取得されたＲＭＳＥＰ値と同等か又はそれよりも低いＲＭＳＥＰ値で最良に機能した。Ｇ０Ｆ及びＧ１Ｆは、ＲＭＳＥＰ値の顕著な増加を示し、その傾向（それぞれ、図４Ｅ及び図４Ｆ）から、これらのモデルの予測能力がプロセスの７日目を過ぎて低下し始めることが観察された。既存の知識は、このプロセスが７日目／８日目に指数増殖期から定常期に移行することを示す。ＣＨＯ細胞の培養が進行し、増殖の定常期に移行するにつれて、それらは抗体産生のピークに達する。細胞のサイズ及び代謝率は、指数増殖期における速度の２倍も細胞の産生量が増加するにつれて変化する（Ｔｅｍｐｌｅｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０１３、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２０１７）。
【0190】
フロー２に提示されたモデルは、この時点で生じるプロセスの変化が、縮小スケール対製造スケールでグリコシル化プロファイルに対して異なる効果を有することを示す。複数のスケール（１Ｌ及び５Ｌ）、異なるラマンプローブ／光学系、異なるグルコース供給戦略（６×１Ｌ）、及びグルコーススパイク（１×５Ｌ）でのスペクトルを使用して、モデルに変動性を導入した後でさえ、縮小スケールのデータのみに基づくモデルの予測能力は、製造スケールで堅牢ではないことが分かった。
【0191】
モデルを組み合わせたプロファイルとして考えると、縮小スケールのデータを使用して構築されたグリコシル化モデルは、製造データに対して予測する場合、機能がより悪く、Ｇ０、Ｇ１Ｆ、及びＧ２Ｆにおいて観察される予測誤差が増加する。具体的には、Ｇ２Ｆは、予測誤差が有意に増加し（７９％）、予測誤差の許容限界（ＲＭＳＥＰ）を超えた。縮小スケールのバイオリアクタープロセスは、製造プロセスを表すように設計されているが、製造スケールでのグリコシル化動態は、縮小スケールのデータだけでは堅牢なＰＬＳモデルの開発には十分ではないほど異なることがここで明らかである。
【0192】
実施例４：製造スケールでの糖化及びグリコシル化を予測するためのラマン分光法に基づくＰＬＳモデルへの製造スケールデータの組み込み（フロー３）
この実施例は、実施例２で上述した小規模実験からのＣＳＳデータから構成され、各ＰＬＳモデルを構築するために単一の製造スケールバッチ（２０００ＬバッチＢ）からのデータを補完した更新されたＣＳＳの使用を説明する。フロー１（実施例２で上述）で開発されたモデルの較正データセットに、製造スケールデータ（２０００Ｌ）の単一バッチを補完し、同じ２０００ＬブラインドＣＴＳＳを使用して、フロー２（実施例３で上述）に従って予測試験を行った。
この実施例は、実施例２で上述した小規模実験からのＣＳＳデータから構成され、各ＰＬＳモデルを構築するために単一の製造スケールバッチ（２０００ＬバッチＢ）からのデータを補完した更新されたＣＳＳの使用を説明する。フロー１（実施例２で上述）で開発されたモデルの較正データセットに、製造スケールデータ（２０００Ｌ）の単一バッチを補完し、同じ２０００ＬブラインドＣＴＳＳを使用して、フロー２（実施例３で上述）に従って予測試験を行った。
【0193】
次いで、１６バッチ（９×１Ｌ、６×５Ｌ、及び１×２０００Ｌ）のＣＳＳを使用して、実施例２に従って７つの更新されたモデルを開発した。完了したら、次いで、各モデルについての更新されたＲＭＳＥｃｖ及び成分数を導出するために、７つのモデルの各々を、リーブ・バッチ・アウト交差検証によって評価した。Ｓｉｍｃａ１５．１における予測関数を使用して、モデルの予測能力対新しいＣＴＳＳを試験することにより、更新されたモデルについて、予測の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥＰ）及びＲ２値が特定された。前のフローと同様に、各モデルから出力されたＲＭＳＥｃｖ、ＲＭＳＥＰ、Ｒ２、及びＶＩＰ値を評価して、製造スケールでのモデルの予測能力を特定した。また、それらを使用して、フロー１及びフロー２で開発及び使用されたモデルに対して予測能力を比較して、糖化及びグリコシル化のためのラマンＰＬＳモデルのＣＳＳに製造スケールのデータを含める必要性を決定した。
【0194】
ここでのモデル（フロー３）は、フロー１（実施例２で上述）で構築されたモデルの予測力及び堅牢性に対するスケールデータの影響を調査しようとした。フロー１からのモデルは、２０００Ｌスケールバッチランからのプロセスデータを補完した。この２０００Ｌバッチデータの追加は、各モデルを開発するために１６バッチが使用されたことを意味した。ここで再び交差検証を使用して、モデル開発及び予測試験のための最適成分数を決定した。全てのモデルについて、＞０．８の平均Ｒ２値が交差検証で観察され、各モデルはまた、許容基準内のＲＭＳＥｃｖを有していた（表３）。
【0195】
【表3】
【0196】
このフローの場合、予測試験は、フロー２からの製造スケールのブラインド試験データセットを使用して完了した。各モデルについて、＞０．８０の平均Ｒ２が観察された。注目すべきことに、全てのモデルがＲＭＳＥＰ値の減少を示した。これは、全てのモデルにわたって予測誤差の減少を示す。また、各モデルのＲＭＳＥｃｖは、各モデルについて同様であるか、又はわずかに減少していることが観察された。これは、これらのモデルへの製造スケールデータの追加が小規模でのモデルの予測能力に影響を与えないことを示す。Ｇ２Ｆモデルは、ＣＳＳに製造スケールデータを補完した場合、大きく改善され、これは、ＲＭＳＥＰの０．４０７４％から０．０９１９％への減少（７７．５％の予測誤差の相対的改善）によって証明される。更に、図５Ａ～図５Ｇに見られる傾向は、フロー２（図４Ａ～図４Ｇを参照）で観察された偏差が考慮されており、モデルが製造スケールのプロセス全体を通して正確に予測することができることを示す。
【0197】
＞１のＶＩＰスコアを有する各モデルの領域を、フロー１において作成されたモデルと比較した。各モデルは、モデルに対する有意な寄与因子として類似又は同一の領域を指定した。場合によっては、特定された領域についてのスコアは、製造スケールデータ追加の結果として変化し、これは、モデル開発中になされた決定を更に支持した（図１１Ａ～図１１Ｆ）。この作業中に、モノ糖化及び非糖化の両方のモデルが開発され、各モデルは３つのフロー全てにわたって同じ結果を共有していたことに留意すべきである。結果として、単一のモデルを作成することができ、相補的な結果を推論することができる。この研究の目的のために、モデル開発においてなされた決定を支持し、かつ各々の場合で未知のデータセットに対して試験した場合に許容可能な値が得られたことを示すために、両方のモデルを作成した。
【0198】
まとめると、ここに提示された結果は、モデルの堅牢性の重要性と、モデル較正データセットを設計するときに考慮しなければならない考慮事項とを強調する。更に、この研究において、製造スケールのデータは、ＣＳＳで使用するために利用可能な全データ観察の４．４％を表すにすぎないが、それを含めることで、モデルの予測力が大幅に改善され、確実に堅牢なモデルを開発するのに役立つ。
【0199】
実施例５：細胞バイオリアクタープロセス開発に対するラマンベースのグルコースフィードバック制御の影響の評価
この研究の目的は、ＧＭＰ対応ＰＡＴ管理ツールを使用した連続ラマンベースのフィードバック制御戦略が細胞バイオリアクタープロセス（例えば、ＣＨＯ細胞バイオリアクタープロセス）に及ぼす影響を調査することであった。例示的なモデルとして、２つのＣＨＯ細胞バイオリアクタープロセスを、それらのそれぞれの開発段階及び開発戦略に基づいて選択した。各ＣＨＯ細胞のバイオリアクタープロセスに対するラマンベースのフィードバック制御戦略の影響を、細胞増殖、代謝、及び生産性、並びにボーラス供給バイオリアクタープロセスと比較した場合のいくつかの重要なプロセスパラメータ及び品質特性に関して考慮した。これらの結果は、ラマン分光法がプロセス開発及び最適化において有効なＰＡＴツールであることを実証する。
この研究の目的は、ＧＭＰ対応ＰＡＴ管理ツールを使用した連続ラマンベースのフィードバック制御戦略が細胞バイオリアクタープロセス（例えば、ＣＨＯ細胞バイオリアクタープロセス）に及ぼす影響を調査することであった。例示的なモデルとして、２つのＣＨＯ細胞バイオリアクタープロセスを、それらのそれぞれの開発段階及び開発戦略に基づいて選択した。各ＣＨＯ細胞のバイオリアクタープロセスに対するラマンベースのフィードバック制御戦略の影響を、細胞増殖、代謝、及び生産性、並びにボーラス供給バイオリアクタープロセスと比較した場合のいくつかの重要なプロセスパラメータ及び品質特性に関して考慮した。これらの結果は、ラマン分光法がプロセス開発及び最適化において有効なＰＡＴツールであることを実証する。
【0200】
実施例５．１：材料及び方法
バイオリアクター操作。２つのｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞株（細胞株１、細胞株２）を実験設計において使用した。細胞株１の３つのバイオリアクターバッチ（バッチＡ、バッチＢ、バッチＣ）及び細胞株２の３つのバイオリアクターバッチ（バッチＤ、バッチＥ、バッチＦ）を、遮光された１Ｌバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において実行し、各細胞株についてのプロセスを１４～１５日間続けた。各バッチを、０日目に、同じ播種密度限界内で、培地及び標的を使用して増殖させたシードトレインから接種した。基本培地及び供給培地を、各バッチ及びプロセス制御に使用した。細胞株１を、正常な収率のための標準細胞株として使用した。細胞株２を、より高い増殖速度及び資源需要を有する高出力細胞株として使用した。
バイオリアクター操作。２つのｍＡｂ産生ＣＨＯ細胞株（細胞株１、細胞株２）を実験設計において使用した。細胞株１の３つのバイオリアクターバッチ（バッチＡ、バッチＢ、バッチＣ）及び細胞株２の３つのバイオリアクターバッチ（バッチＤ、バッチＥ、バッチＦ）を、遮光された１Ｌバイオリアクター（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において実行し、各細胞株についてのプロセスを１４～１５日間続けた。各バッチを、０日目に、同じ播種密度限界内で、培地及び標的を使用して増殖させたシードトレインから接種した。基本培地及び供給培地を、各バッチ及びプロセス制御に使用した。細胞株１を、正常な収率のための標準細胞株として使用した。細胞株２を、より高い増殖速度及び資源需要を有する高出力細胞株として使用した。
【0201】
バイオリアクター実行の各々の間に２つの供給戦略を用いた。細胞株１の供給戦略は、複合供給及びグルコース供給からなった。バッチＡは、容器体積の規定された割合に基づいて、３日目に開始して、１日１回、複合供給及びグルコース供給の両方をボーラス供給した。バッチＢ及びバッチＣは、容器の規定された割合に基づいて、３日目に開始して、１日１回、複合供給を供給し、グルコース供給は自動化され、必要に応じて、ラマングルコース値に基づいて送達されて、バイオリアクターにおいて１ｇ／ｌグルコースの所定の目標レベルを維持した（これは事後に決定された）。細胞株２の供給戦略は、２つの複合供給及びグルコース供給からなった。バッチＤは、３日目に開始して、１日１回、複合供給及びグルコース供給の両方をボーラス供給した。複合供給は、容器体積の規定された割合を使用して送達され、グルコース供給は、その日の規定されたグルコース目標濃度を達成することに基づいた。バッチＥ及びバッチＦは、容器の規定された割合として、３日目に開始して、１日１回、両方の複合供給を供給され、グルコース供給は、自動化され、必要に応じて、ラマングルコース値に基づいて送達されて、バイオリアクターにおいて２ｇ／ｌグルコースの所定の標的レベルを維持した（これもまた事後に決定された）。各バッチは、溶存酸素（ＤＯ）、ｐＨ、及び温度について同一の制御目標を有していた。ＤＯは、通気及び酸素散布によって４０％に制御した。６．９５のｐＨ目標は、二酸化炭素及び２．０Ｍ炭酸ナトリウムの添加を使用して維持した。温度は、細胞培養全体を通して３６．５℃（３５．５℃～３７．５℃）の設定点に制御した。
【0202】
バイオリアクター性能の評価：オフライン試料分析及びオンラインパラメータ傾向。オフライン試料を、各バイオリアクターから毎日採取し、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＭｅｔａＦＬＥＸ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）、Ｖｉ－ＣＥＬＬ ＸＲ Ｃｅｌｌ Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、及びＣｅｄｅｘ Ｂｉｏ（Ｒｏｃｈｅ Ｈｏｌｄｉｎｇ ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）オフライン分析器を使用して、グルコース、乳酸塩、力価、生細胞密度、及び生存率（％）について測定した。各バッチが完了したら、更なる試験のために、毎日の各培養試料を保持し、－７０℃で凍結した。
【0203】
グルコースフィードバック制御の影響を評価する場合、糖化を考慮した。６つのバイオリアクターバッチの各々について４日目～１４／１５日目からのオフライン試料を、バッチ全体を通して生産されたｍＡｂの製品品質分析のために解凍した。ｍＡｂの糖化を、ＬＣ／ＭＳ分析によってオフラインで特徴付けた。簡潔には、全ての試料を、最初に、プロテインＡ精製を使用して精製した。次いで、糖化分析のためのタンパク質試料を、グリコフォームに基づく試料不均一性を排除するために、ＥｎｄｏＳ酵素で前処理して、Ｎ結合型炭水化物を除去した。次いで、トリフルオロ酢酸を含むアセトニトリルの勾配を使用する逆相カラム上で、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣシステム（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して、超高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってタンパク質試料を分離し、オンラインエレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析によってＸｅｖｏ Ｇ２－ＸＳ質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）で分析した。次いで、クロマトグラフィーピークにわたって収集された質量／電荷データを合計し、Ｍａｓｓｌｙｎｘ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ，ＣＡ）又はＵＮＩＦＩソフトウェア（Ｗａｔｅｒｓ Ｃｏｒｐ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用してデコンボリューションした。検出された糖化アイソフォームを、デコンボリューションされた質量スペクトル分析に基づいて割り当て、それらの相対存在量を、中心デコンボリューション質量スペクトルのピーク強度を使用して計算した。
【0204】
Ｄａｓｗａｒｅ制御ソフトウェア（Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）をバイオリアクター環境及びバイオリアクターにおけるプロセス条件の重要な指標として使用して、ｐＨ及びＯ２送達の両方のオンライン傾向を傾向付けし、両方の細胞株についてバッチ実行全体を通して比較した。オンラインデータ及びオフラインデータの両方の評価は、グルコースの自動フィードバック制御を使用した場合、観察された任意のプロセス差異についての指標を提供した。
【0205】
ラマンスペクトルの取得。－４０℃で７８５ｎｍレーザー源及び電荷結合素子（ＣＣＤ）を含むマルチチャネルラマンＲＸＮ２システム（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を使用して、各バッチについてラマンスペクトルを収集した。検出器を、光ファイバー励起ケーブル及び光ファイバー収集ケーブル（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）からなるＭＲプローブに接続した。滅菌バイオリアクターに挿入されたｂＩＯ－Ｏｐｔｉｃ－２２０ステンレス鋼プローブ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）に取り付けられたＭＲプローブによってデータを収集した。ラマンランタイムＨＭＩ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を、全てのバッチにおいて、スペクトルの取得のために使用した。全てのラマンスペクトルデータの収集は、１０秒露光を７５スキャンのシステム設定を使用し、１５分後（２．５分のオーバーヘッド時間を含む）、プローブについてスペクトルを得た。ラマンスペクトルの取得は、波数１００～３，４２５ｃｍ－１に及んだ。縮小スケールの容器は、アルミホイルによって光干渉から保護した。システムの各使用前に、Ｈｏｌｏｌａｂ Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（Ｋａｉｓｅｒ Ｏｐｔｉｃａｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．）を用いて機器の強度較正を行い、バイオリアクターのプロセス全体を通して、２４時間毎に内部較正が行われるように設定した。
【0206】
グルコースについてのラマンベースＰＬＳモデルの開発。細胞株特異的ラマンベースのグルコースＰＬＳモデルを、この研究では、細胞株１及び細胞株２について開発して、バイオリアクターにおけるグルコース濃度のリアルタイム生成を容易にし、グルコースについてのリアルタイムフィードバック制御の実行を容易にした。全ての計量化学モデリングは、ＳＩＭＣＡ１５．０（Ｕｍｅｔｒｉｃｓ Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を用いて行った。グルコースについてのオフライン測定を、それらが取られた時間に基づいて、ラマンスペクトルに適合させた。各モデルは、利用可能な場合、縮小スケール及び製造スケールのデータの較正試料セット（ＣＳＳ）からなっていた。モデル開発のための１２バッチ（６×５Ｌ、３×２０００Ｌ、及び３×１Ｌ）からなる細胞株１のモデルＣＳＳ、及び１バッチ（１Ｌ）の較正試験試料セット（ＣＴＳＳ）を、ＰＬＳモデルで試験するためのブラインドデータセットとして使用した。このバッチを、１Ｌスケールで入手可能なバッチデータから無作為にＣＴＳＳとして選択した。モデル開発のための７バッチ（３×５Ｌ及び４×１Ｌ）からなる細胞株２のモデルＣＳＳ、及び１バッチ（１Ｌ）の較正試験試料セット（ＣＴＳＳ）を、ＰＬＳモデルで試験するためのブラインドデータセットとして使用した。このバッチを、１Ｌスケールで入手可能なバッチデータから無作為にＣＴＳＳとして選択した。両方のモデルがリアルタイムフィードバック制御のために展開されるスケールであるため、ＣＴＳＳを１Ｌバッチとして選択した。全てのモデル開発データは、以前に実行された実験室スケールの研究及び製造スケールのバッチから収集された。生成されたＰＬＳモデルの各々について、ＣＳＳ内の堅牢性は、プロセス及び技術の変動性の両方を含めることによって保証された。バッチ進行との偽相関を断つために、ＣＳＳに含まれるいくつかのバッチにおいて、様々なサンプリング戦略を用いた。
【0207】
各モデルのＸ変数は、ラマンスペクトル（中心）であり、Ｙ変数は、グルコースのオフライン値（一変量スケール）であった。各モデルのラマンスペクトルの波数選択は、４１５～１８００ｃｍ－１及び２８００～３１００ｃｍ－１であった。各ＰＬＳモデルに適用されたスペクトルフィルターは、Ｓａｖｉｔｓｋｙ Ｇｏｌａｙ一次導関数二次（１５ｃｍ－１点）及び標準正規変量（ＳＮＶ；データは示さず）であった。各ＰＬＳモデルを構築し、リーブ・バッチ・アウト（leave-batch-out）交差検証（モデル開発において各バッチを１回省略する）の方法を使用することによって誤差について評価した。モデル誤差を、省略されたバッチに対するモデルの予測に基づいて平均して、交差検証の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥｃｖ）を特定した。ＲＭＳＥｃｖは、モデルを構築するために使用されるデータに基づくモデルの予測力を示す。より低い平均誤差（ＲＭＳＥｃｖ）は、改善されたモデルを示した。これにより、ブラインドデータセットに対する試験のために生成されたモデルに対してどの成分番号が使用されるべきかについてのより良い情報に基づく意思決定が可能になった。各モデルはまた、推定の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥＥ）、ＣＳＳにおけるデータ点の残差に関連するモデル性能指標（すなわち、モデルの適合）を使用して評価した。Ｓｉｍｃａ１５．１における予測関数を使用して、モデルの予測能力対ＣＴＳＳを試験することにより、予測の二乗平均平方根誤差（ＲＭＳＥＰ）が特定された。これは、モデルの予測力対未知のデータセットを示す。各ＰＬＳモデルについて、回帰（Ｒ２）値、変動係数を記録した。このＲ２値は、モデル予測子（Ｘ変数）が説明し得るＹ変数の変化量を決定するために使用される。Ｒ２値が１に近いほど、モデルがＹ変数をより適切に説明したことになる。モデル性能を、各モデルのそれぞれのＲＭＳＥＥ、ＲＭＳＥｃｖ、ＲＭＳＥＰ、及びＲ２値に基づいて評価した。
【0208】
グルコースのラマンベースのフィードバック制御の実装。グルコース供給の自動化は、ＰＡＴ管理ツール、ｓｙｎＴＱ（Ｏｐｔｉｍａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ａｕｔｏｍａｔｉｏｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ、ＵＫ）によって容易にした。簡潔には、ｓｙｎＴＱ内で作成されたオーケストレーション（レシピ）は、フィードバック制御を実行するために、ラマン機器をグルコースＰＬＳモデル及びバイオリアクターシステムにリンクさせた。ｓｙｎＴＱにおけるオーケストレーションの開始を合図に、ラマン機器は、オープンプラットフォーム通信（Open Platform Communication、ＯＰＣ）接続を介したスペクトルデータの取得を開始した。次いで、生成されたスペクトルデータが、ｓｙｎＴＱに送信され、その後、オーケストレーションのＳＩＭＣＡ Ｑエンジンブロックに含まれるグルコースＰＬＳモデルに供給された。スペクトルデータは、スペクトルデータが生成される各点のグルコース読み取り値に変換され、その後、オーケストレーション内で送達されるグルコース供給を計算するために使用される。次いで、結果として得られたグルコース供給の計算を、ｓｙｎＴＱからＤａｓｗａｒｅバイオリアクター制御ソフトウェア（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に通信して、供給が送達された後、ＯＰＣ接続を介して、バイオリアクターシステム上のグルコース供給ポンプを開始及び停止した。グルコースの目標濃度は、ラマン及びグルコースモデルデータがバイオリアクターにおけるグルコース濃度が目標値未満に低下したことを示すたびに、目標濃度にグルコース供給を開始することによって、維持された。このプロセスを、バッチの期間中、生成された各ラマンスペクトルについて繰り返した。
【0209】
実施例５．２：結果
グルコースについてのラマンベースＰＬＳモデルの開発。グルコースフィードバック制御バッチの実行前、以前に完了したバッチから収集されたラマンスペクトル及びオフライングルコースデータを使用して、ラマンベースのＰＬＳモデルを開発した。細胞株特異的グルコースモデルを、細胞株１及び細胞株２について開発した。細胞株１のモデルは、そのＣＳＳに１７０個のデータ点を含有し、細胞株２のモデルは、そのＣＳＳに１６９個のデータ点を含有した。各モデルについて最適な成分数を決定するために、リーブ・バッチ・アウト交差検証アプローチを使用した。
グルコースについてのラマンベースＰＬＳモデルの開発。グルコースフィードバック制御バッチの実行前、以前に完了したバッチから収集されたラマンスペクトル及びオフライングルコースデータを使用して、ラマンベースのＰＬＳモデルを開発した。細胞株特異的グルコースモデルを、細胞株１及び細胞株２について開発した。細胞株１のモデルは、そのＣＳＳに１７０個のデータ点を含有し、細胞株２のモデルは、そのＣＳＳに１６９個のデータ点を含有した。各モデルについて最適な成分数を決定するために、リーブ・バッチ・アウト交差検証アプローチを使用した。
【0210】
図１２Ａ及び図１２Ｂは、各細胞株についての最終モデルを要約したものである。細胞株１のグルコースモデルについてのＲＭＳＥＥは、０．１８４５ｇ／ｌであり、細胞株２のグルコースモデルについては、０．３５３２ｇ／ｌであった。両方のモデルについて＞０．９５のＲ２値と組み合わせたＲＭＳＥＥ値は、各モデル内に強い変動があることを示し、各モデルのＣＳＳに含まれるデータにおいてなされた決定を支持するのに役立つ。各モデルの予測についての許容可能な精度基準は、≦０．５ｇ／ｌであると決定された。これは、各細胞株のバイオリアクタープロセスで用いられる現在のグルコース供給目標に関連して決定された。
【0211】
プロセス制御の目的のために、この範囲外のグルコース測定値は、バイオリアクターの過剰供給又は過少供給をもたらす可能性があるので、プロセスに悪影響を及ぼす可能性がある。したがって、各モデルについての精度を、各グルコースモデルのＲＭＳＥｃｖ及びＲＭＳＥＰの許容基準への適合に関して更に検証した。細胞株１及び細胞株２のモデルのいずれも、６の最適成分数を有すると決定され、それぞれ０．２６９５ｇ／ｌ及び０．３８９５ｇ／ｌの対応するＲＭＳＥｃｖ値を有した。各モデルについて選択された成分数は、較正データセットに基づいて目的の変数を予測するモデルの能力を示す予測誤差についての許容基準内に入るＲＭＳＥｃｖを与え、したがって、モデル開発に適切であるとみなされた。モデルの各々をそれぞれのＣＴＳＳに対して試験した場合、相補的なＲＭＳＥＰ値が観察された。細胞株１のグルコースモデルは、０．２９２６ｇ／ｌのＲＭＳＥＰを有し、細胞株２のモデルは、０．２５７３ｇ／ｌのＲＭＳＥＰを有した。これらの値はいずれも、モデル開発のために確立された許容基準内（≦０．５ｇ／ｌ）であった。モデル統計量間の良好な一致は、両方のモデルの開発においてなされた設計検討が正当化され、各モデルが堅牢であり、各細胞株のバイオリアクタープロセスにおけるグルコースレベルを正確に予測し、制御することを確実にしたことを示した。
【0212】
細胞株１及び細胞株２のモデルＣＳＳは、各細胞株のプロセス開発段階の違いにより、モデル作成時のデータの利用可能性が異なる。細胞株１のモデルでは、製造スケールのバッチを含めるのに利用可能であったが、細胞株２のモデルでは、実験室スケールのデータのみが利用可能であった。これにもかかわらず、両方のモデルは、この研究の目的のために許容可能な程度の精度で開発された。細胞株１のモデルは、その現在の状態においてより容易にスケールアップされ得るが、細胞株２のモデルは、更なるデータ及びモデル調整を必要とし得る。製造スケールで収集された追加データの利用可能性は、これらのモデルを大規模なインライン展開に向けて改善することができる。
【0213】
グルコースのラマンベースのフィードバック制御の実装。この研究の場合、グルコースを所定の設定点濃度に維持する自動フィードバック制御戦略を検討した。この戦略を試験するために２つの細胞株を選択し、各戦略を二重に実行し、各細胞株について現在用いている戦略（両方の細胞株における１日１回のボーラス供給であった）と比較した。各研究は、単一のラマン機器を使用して実行され、したがって、スペクトルの取得は、約４５分毎に１回に限定された。これは、検討中の細胞株の各々についてのプロセス設定点及びグルコース消費速度について生成された以前のデータに基づいて、グルコースの自動フィードバック制御についての許容可能な間隔であると決定された。
【0214】
細胞株１のバッチについてのグルコース傾向を、図１３Ａ～図１３Ｃに概説する。図１３Ａは、細胞株１のバッチＡのボーラス供給バッチについてのラマングルコース傾向を示す。バッチ全体を通してグルコースのラマン測定値は、０．２９１７ｇ／ｌの観察されたＲＭＳＥＰで良好に機能した。ラマン測定値は、このバッチ全体を通してグルコース傾向及び消費への非常に優れた洞察を提供し、これを、グルコースの手動送達が各供給事象の目標に十分に達したかどうかを示すために使用した。バッチＡでは、グルコースについてのボーラス供給戦略が、３日目に開始して供給が行われる場合、毎日グルコースの大きなスパイクをもたらすことが観察されたが、これは、毎日オフライン測定のみを使用する場合は観察されないであろう。これは、ラマンをＰＡＴツールとして使用する場合、プロセス開発チームが利用できないであろう供給送達を制御していない場合であっても、追加のプロセス情報が利用可能であることを示す。バッチＡ全体を通してグルコース濃度は、１～３ｇ／ｌの間で変動する。
【0215】
対照的に、細胞株１のバッチＢ及びバッチＣについての自動フィードバック制御バッチ（図１３Ａ及び図１３Ｃ）は、はるかに厳密な供給プロファイルを示し、各バッチ全体を通してグルコース濃度を１ｇ／ｌに維持した。供給の開始は、各自動フィードバック制御バッチにおいて３日目に始まり、これは、バッチＡの最初のボーラス供給のタイミングに相当する。濃度の大きなスパイクは観察されず、一貫したグルコース濃度が１２日間維持された。バッチＢ及びＣについてのＲＭＳＥＰは、それぞれ０．２８８７ｇ／ｌ及び０．２９４０ｇ／ｌであった。低いＲＭＳＥＰは、ここではいずれの場合も細胞株１のグルコースモデルが強力であり、良好に機能したことを示すのに更に役立つ。低いＲＭＳＥＰは、いずれの場合も、モデルが＋／－０．５ｇ／Ｌの確立された許容基準内で、プロセスのためのグルコース濃度の正確な指標を提供し、十分に供給送達を知らせることができることを示した。
【0216】
細胞株２のグルコース傾向は、細胞株１のものと同様の結果を示し、図１４Ａ～図１４Ｃに見ることができる。バッチＤの傾向（図１４Ａ）は、細胞株２についてのボーラス供給プロセスの典型的な軌跡を示し、１回の供給送達からのグルコースの予想された大きな毎日のピークを有する。更に、ラマン監視は、はるかに情報に富んだプロセスを示し、１日１回のオフライン測定値と比較した場合、グルコース傾向をより反映する。細胞株２はグルコースに対する需要が大きいので、濃度範囲の広がりは細胞株１よりも広く、プロセス範囲が０．５～４．５ｇ／ｌである。バッチＤにおけるグルコースモデルのＲＭＳＥＰは０．２３６９ｇ／ｌであり、これは、性能の許容基準内であり、モデルによって提供されるデータが実際のプロセス値を正確に反映していることを示す。バッチＥ及びＦ（それぞれ、図１４Ｂ及び図１４Ｃ）は、２ｇ／ｌの設定点に１１日間制御された。
【0217】
これらのバッチにおいて観察された重要な差は、供給の制御が３日目に開始したが、手動ボーラス供給バッチがグルコースレベルが更に減少した４日目に開始したことであった。バッチＥ及びバッチＦの両方がグルコースを良好に制御し、それぞれ０．２５１６ｇ／ｌ及び０．２１１９ｇ／ｌのＲＭＳＥＰは、モデル性能がいずれの場合も強力であったことを示す。バッチＦのグルコース設定点が、プロセスの９日目から２ｇ／ｌの目標から上方にドリフトし始めたことが注目された。これは、グルコース供給を送達するために使用されるポンプによる較正の問題に起因すると考えられた。これにも関わらず、バッチＦは、厳密なグルコース制御範囲を有し、プロセスの最終日に目標の＋／－０．５ｇ／ｌの許容基準を外れただけであった。
【0218】
細胞株１及び細胞株２の両方についてのグルコースのラマンベースのフィードバック制御は、バイオリアクター環境にグルコースのより安定な供給を提供し、ボーラス供給バッチにおいて見られるようなグルコース濃度の劇的なシフトを防止した。ｍＡｂバイオリアクタープロセスの開発及び最適化は、明確に制御された製品品質プロファイルを有する高い製品力価の産生に焦点を当てている。ここに提示されたフィードバック制御のメカニズムは、反復可能で、一貫しており、細胞株１及び細胞株２の両方について明確な供給プロファイルを提供した。
【0219】
ラマン分光法を含むＰＡＴツールは、初期投資以外のプロセス開発に比較的低コストで組み込まれる。高スループット及び実験計画バイオリアクターバッチの実行によって、プロセス開発の初期段階で、大量のプロセスデータが非常に迅速に収集される。これらのように、初期開発バッチにおいてデータ収集のためにラマンプローブを含めることにより、強力なデータ収集が可能になり、モデル作成段階が非常に早まる。これは、プロセス開発（例えば、ｍＡｂプロセス開発）の厳しい時間的制約を妨げず、細胞株１及び細胞株２について提示されたものなど、高度なフィードバック制御戦略の実装を可能にするであろう。この研究で示されたように、この技術は、監視ツールとして豊富な追加のプロセス情報を提供することができ、バッチＡ及びバッチＤは両方とも、１日１回のオフライン測定の傾向を示す場合、そうでなければ気付かなかったであろうグルコース傾向におけるピーク及び強みを特定した。このデータに富んだアプローチとプロセス制御戦略との組み合わせにより、プロセスの開発及び強化において取られるアプローチを変更及び改善することができる。
【0220】
バイオリアクター性能の評価：オフライン試料分析及びオンラインパラメータ傾向。この研究の目的は、２つの例示的な細胞株のプロセスに対してラマンベースの自動フィードバック制御を展開し、各プロセスに対するこのフィードバック制御の影響を評価することであった。両方のプロセスは、バイオリアクターの健全性、生産性、及び環境条件に関連するプロセス変数に対する自動フィードバック制御の影響に関して考慮された。観察された影響が、各プロセスの開発段階と、この段階でのＰＡＴに焦点を当てたアプローチがプロセスの開発及び強化をどのように支援するのかということとに関連して、論じられる。
【0221】
図１５Ａ～図１５Ｈは、細胞株１についてのボーラス供給及び自動フィードバック制御バッチのプロセス傾向を示す。図１５Ａ、図１５Ｂ、及び図１５ＣにおけるＶＣＤ、生存率、及びＬＤＨの傾向によって示されるように、各バイオリアクターバッチの増殖及び健全性が同等であったことを観察することができる。各バッチのＶＣＤ傾向は、７日目／８日目に８．００～８．７５×１０＾６細胞／ｍｌの間でピークに達し、残りのプロセスでは徐々に減少した。各バッチについて、最終日に観察された生存率は、７０～７５％であり、最終日に観察されたＬＤＨは、１４００～１４５０ＩＵ／ｍｌであった。これらの傾向及び各バッチ間で観察された低度の変動性は、ラマンベースのフィードバック制御が細胞株１のプロセスに悪影響を及ぼさないことを示した。
【0222】
バイオリアクター環境における変動性は、どの供給戦略が細胞株１に対して用いられたかに依存して観察された。バッチＡ、Ｂ、及びＣについてのｐＨ傾向（図１５Ｄ）は、ボーラス供給バッチＡがｐＨ７．３まで増加し続けた７日目まで同様であり、それによって、７日目～１２日目までこのバッチの設定点内にｐＨを維持するために、一定のＣＯ２添加を必要とした。ラマン制御されたバッチＢ及びＣは、バッチＡとは異なる傾向を示し、プロセス全体を通して、７日目～１２日目の間、ｐＨが設定点の範囲内に維持され、特に、約ｐＨ７．２に維持された。図１５Ｅに見られるように、バッチＡ、Ｂ、及びＣのオンラインＯ２トレンドは、互いに異なる。二重のバッチＢ及びＣは、０日目～１５日目に送達されるＯ２に対する需要が徐々に増加することを示す。バッチＡに対するＯ２の需要は、Ｏ２の要求性がバイオリアクタープロセス全体を通して増加及び減少するので異なる。Ｏ２及びｐＨの両方について、７日目に傾向の違いが現れ始め、これはプロセスがピークＶＣＤに達する時間と一致する。ボーラス供給のバッチＡに対してフィードバック制御のバッチＢ及びＣで観察されたこれらの傾向の違いは、ピークＶＣＤ後のボーラスバッチ及びフィードバック制御バッチの細胞代謝の違いを示す可能性がある。制御上限に達しないｐＨ傾向とともにフィードバック制御のバッチＢ及びＣ全体を通して観察されたＯ２の需要が徐々に増加することは、フィードバック制御バッチにおいて維持される環境が、グルコース供給のより一貫した送達に潜在的に起因する細胞代謝に関してより好ましいことを示す可能性がある。
【0223】
細胞株１についての自動フィードバック制御バッチにおいて送達されたグルコース供給の総量は、ボーラス供給バッチよりも少なかった。図１５Ｆは、バッチＡについての５９ｍｌの最終日グルコース供給体積と比較した、バッチＢ及びＣについての５１．５ｍｌ及び５４．５ｍｌの最終日グルコース供給体積を示す。これは、バッチＢ及びＣにおいて、それぞれ１２．７％及び７．６％少ないグルコース供給が送達されることを示す。フィードバック制御のバッチＢ及びＣは、ラマン測定値が取得される間隔毎に自動的に１ｇ／Ｌの目標濃度を維持しているので、ボーラス供給のバッチＡに対してバイオリアクターにおけるグルコース濃度に対する高いレベルの制御が存在する。ここでは、自動グルコース送達が、リアルタイム測定に基づいており、バイオリアクターにおけるグルコースの需要が、１日１回のオフライン試料よりも正確に捕捉される。グルコースのボーラス送達は、以前のバッチ実行から確立された供給目標に基づいており、グルコース濃度をオフラインで測定することによって行われる。このアプローチは、バイオリアクターの現在の性能を考慮に入れておらず、バッチＡにおいてここで特定されるように、グルコース要求性の過大評価につながる可能性がある。
【0224】
細胞株１についての自動フィードバック制御は、ボーラス供給戦略と比較した場合に匹敵する製品力価をもたらした。図１５Ｇは、予想どおり、各バッチについて２．２～２．５ｇ／Ｌの最終日の力価を示す。ボーラス供給のバッチＡと比較した場合、バッチＢ及びバッチＣの両方において、製品の糖化の全体的な減少が観察された。図１５Ｈに見られるように、バッチＡについての最終日の糖化は、６．６８％で観察され、一方、バッチＢは３．７８％、バッチＣは２．８１％で観察され、それぞれ４３．４％及び５７．９％の糖化の減少を表した。細胞株１の３つのバッチ全てにおける同等の最終日の力価は、ラマンベースのフィードバック制御を使用した場合、このプロセスに対して負の影響が観察されないことを更に支持するのに役立つ。注目すべきことは、製品の糖化の顕著な改善であり、これは、ラマンベースのフィードバック制御の結果として、バッチＢ及びＣの両方におけるより低い総グルコース量に起因している可能性がある。バイオリアクターにおけるグルコースの全体的な濃度は、糖化のレベルに直接影響を与え、このＣＱＡの制御は、そうでなければプロセス開発中に達成することができなかったＰＡＴアプローチに関連する重要なプロセスの改善を特定する。
【0225】
プロセス変動の同様の評価を、細胞株２のボーラス供給バッチ及び自動フィードバック制御バッチについて検討した。図１６Ａ～図１６Ｈは、各バッチの比較を要約する。ＶＣＤ、生存率、及びＬＤＨの傾向は、バッチＤ、Ｅ、及びＦの増殖プロファイルにおける差を示す。図１６Ａは、ボーラス供給のバッチＤ及び自動フィードバック制御のバッチＥの両方が、プロセスの８日目に１０～１０．５×１０＾６細胞／ｍｌのピークＶＣＤに達したが、自動フィードバック制御のバッチＦは、１０日目に１１．９７×１０＾６細胞／ｍｌでピークに達したことを示す。ＶＣＤの低下は、ボーラス供給のバッチＤよりも自動フィードバック制御のバッチＥ及びＦにおいて低く、最終日のＶＣＤは、バッチＤにおける３．６５×１０＾６細胞／ｍｌと比較して、バッチＥ及びＦでは、それぞれ４．８１×１０＾６細胞／ｍｌ及び８．０７×１０＾６細胞／ｍｌであった。生存率及びＬＤＨの傾向は、図１６Ｂ及び図１６Ｃに見られるように、バイオリアクターの健全性の差を更に強調する。バイオリアクター生存率は、自動フィードバック制御の両方のバッチにおいてボーラス供給のバッチよりも高いままであり、プロセスの最終日では、バッチＥ（５６％）及びＦ（７２．５％）は、バッチＤ（４４．９％）よりも１１．１％及び２７．６％高い生存率を示した。ＬＤＨは、８日目から１４日目までのボーラス供給のバッチにおいて、自動化フィードバック制御のバッチよりも高いことが観察され、１４日目では、バッチＥ（６０５３ＩＵ／ｍｌ）及びＦ（４８３４．５ＩＵ／ｍｌ）は、バッチＤ（７６９４ＩＵ／ｍｌ）よりも２１％及び３７％低いことが観察された。より低いＬＤＨとともにバッチＥ及びＦについてのＶＣＤ及び生存率の両方のあまり深刻でない低下は、２ｇ／Ｌのグルコース設定点へのラマンベースのフィードバック制御戦略が、バイオリアクターにおける細胞増殖及び健全性に対して正の効果を有することを示す。バイオリアクター環境におけるより安定したグルコース濃度は、バッチＤにおいて見られるようなボーラス供給に関連する毎日のピーク及びトラフよりも、細胞株２のプロセスに対してはるかに好ましいようである。同じ長期の増殖レベルが従来の開発戦略では達成できない可能性があるので、プロセスを存続させ、より長く製品の生産高を生成する能力は、プロセス開発段階でＰＡＴを含めるための別の正当化として役立つ。
【0226】
バイオリアクターのｐＨ、Ｏ２流量、及びグルコース供給体積を、各プロセスについて１３日目までオンラインで追跡したが、接続の問題で、残りのプロセスデータがいずれの場合も記録されなかった。各バッチのｐＨ傾向は類似していることが観察され（図１６Ｄ）、毎日最大ｐＨ７．１のスパイクを示し、これは、毎日の複合供給の添加と一致した。図１６Ｅは、Ｏ２の需要も３つのバッチ全てにわたって一貫していたことを示し、各々、１０日目まで、Ｏ２の需要が徐々に増加した。１０日目以降、バッチのＯ２要求性が異なり、バッチＥ及びＦのＯ２流量の両方が＞０．５ｓｌ／ｈで維持されるのに対して、バッチＤのＯ２流量は０．５ｓｌ／ｈ未満に徐々に減少する。図１５Ｆは、約２６ｍｌのバッチＤ、Ｅ、及びＦについての同様の最終日のグルコース供給体積を示す。これらのパラメータの一貫性は、細胞株２のプロセスについてのラマンベースのフィードバック制御に関連する悪影響がないことを示す。ボーラスのバッチＤにおけるＯ２需要の低下は、１０日目以降のこのバッチにおけるより少量の生存細胞に起因する可能性が高い。興味深いことに、ボーラス供給のバッチＤ並びにラマンベースのフィードバック制御のバッチＥ及びＦの両方において送達された総グルコースは同等であった。これは、バイオリアクターの健全性に対する以前に観察された影響が、より少量の供給送達によるものではなく、代わりにグルコース供給の送達システム、１日１回のボーラスに対する１日複数回のより少ない供給によるものであったことを示す。
【0227】
グルコースの自動フィードバック制御を使用した場合、細胞株２のプロセスの生産性が増加した。図１６Ｇは、バッチＥ（５．７５ｇ／Ｌ）及びバッチＦ（５．７７ｇ／Ｌ）についての最終日の力価が、ボーラス供給のバッチＤ（４．６ｇ／Ｌ）よりも２５％高かったことを示す。製品力価の品質はまた、自動フィードバック制御のバッチにおいて改善された（図１６Ｈ）。ここで、ボーラス供給のバッチＤの最終日の製品の糖化は３．０６％であることが観察されたが、バッチＥ及びＦは、それぞれ２．１３％及び２．３７％でより低いことが観察された。３つのバッチ全てが、添加されたグルコースの同様の総体積を示す一方で、糖化の結果は、設定点濃度への連続制御が、製品の品質に関してより好ましい戦略であることを示す。増殖、製品の生産高、及び品質の改善は、細胞株２のものなどのより強化されたプロセスのためのＰＡＴ開発戦略の採用が、開発を更に駆動し、従来のバイオリアクタープロセスでは到達不可能であり得る結果をもたらすことができることを示す。
【0228】
１日１回、プラットフォーム供給戦略としてのグルコースのボーラス送達は、増殖及び製品の生産高を促進するためにバイオリアクターに栄養素を適切に送達することが示されているので、ｍＡｂバイオリアクタープロセス開発において広く考慮されている。栄養素送達に対するこのアプローチの主な懸念は、製品品質に対する影響である。グルコース濃度における大きな毎日の変動は、この研究におけるボーラス供給のバッチにおいて観察され得る（図１３Ａ及び図１４Ａ）。製品の品質に対するグルコースの影響は、主に製品の糖化の促進に見られる。糖化は、ｍＡｂバイオリアクタープロセスの重要品質特性であり、ｍＡｂに対する糖化の直接的な影響は変動し、その影響は、糖化されるｍＡｂ部位及び存在する糖化の総量に依存する可能性が最も高い。
【0229】
このプロセスの自動化は、より頻繁なバイオリアクター供給スケジュールの余分な資源要件を取り除き、現在の開発方法を補完する技術を使用してなされる更なる改善を可能にすることができるプロセス開発にＱｂＤは検討に値する。この研究において示されるようなラマンベースのＰＬＳモデルを使用する設定点グルコース濃度への自動フィードバック制御は、任意の追加の資源要件なしに、各細胞株のプロセスに対して直接的な正の影響を有した。細胞株１についての自動フィードバック制御は、ボーラス供給のバッチＡと比較した場合、バッチＢ及びバッチＣの両方で、同等の増殖プロファイル及び製品の生産高を維持ながら、全体的な製品の糖化の減少をもたらした。この改善は、自動フィードバック制御のバッチＢ及びＣに必要とされるグルコース供給の一貫した送達及び全体的な体積の減少に起因している可能性がある。細胞株１は、後期開発段階におけるプラットフォームプロセスを表す。この細胞株に対してかなりのプロセス開発が完了しているが、ラマンベースの自動フィードバック制御などのＰＡＴツールの導入は、この時点までに設計されたプロセスに対して予想される悪影響なしに、プロセス開発に利益をもたらすことができる。
【0230】
細胞株２は、細胞株１よりも開発の初期段階においてより強化されたプロセスを表す。ｍＡｂ産生バイオリアクターにおけるプロセス強化は、主にプロセスの生物学的限界に依存する。より高いＶＣＤ、細胞代謝、及び強化されたプロセスの生産性を維持するには、培地の組成及び濃縮並びに供給戦略の最適化が重要である。細胞株２に対するグルコース供給の自動化により、より最適化された供給戦略を試験することができるようになった。送達されたグルコースの総体積は、ボーラスバッチ及び自動フィードバック制御バッチの両方で同様であったが、いくつかのプロセスの改善が観察された。細胞株２についての両方の自動化フィードバック制御バッチにおけるより大きな製品の生産高及び改善された製品の品質と併せて、改善された増殖及び生存率のプロファイルは、ＰＡＴツールが開発プロセスにおいていかに有効であり得るかを強調する。プロセス開発において製品の品質及び生産高に直接影響を及ぼす能力は、ＱｂＤイニシアチブの目標に適合する。
【0231】
開発の初期又は後期段階におけるラマン分光法などのＰＡＴ技術の実装は、プロセス開発、スケールアップ、及び生産プロセスの堅牢性に大きな影響を及ぼす可能性がある。ここで、２つのＣＨＯ細胞株のバイオリアクタープロセスには、開発段階でＰＡＴ法を用いる場合、それらの現在のプロセスの効率における改善の徴候が見えた。
【0232】
開発段階におけるラマンを用いた自動フィードバック制御などの方法の採用は、貴重なデータを生成することができ、伴われるリスクは低い。プロセス開発においてＰＡＴを標準化する能力は、より効率的で費用効果の高い製造プロセスにつながる可能性がある。より効率的な開発の直接の結果として、製造スケールでの製品の生産高の増加及び／又は製品の品質の改善は、患者のための投薬量要件に影響を及ぼし得る（これにより、バッチ当たりの生成される製品の用量がより多くなり、コスト及び時間の大幅な節約につながる可能性がある）。商業的製造における開発及び実装でこのような技術を考慮することにより、プロセス効率が最大化され、新規のｍＡｂ療法に対する需要を満たすエンド・ツー・エンドのＱｂＤアプローチが創出される。
【0233】
本明細書に提供された結果は、プロセス開発においてラマン分光法をＰＡＴツールとして含めることが、製品の生産高を改善し、全体的な製品の糖化を減少させることができることを実証した。例えば、細胞株１のプロセスは、バイオリアクターへの総グルコース送達を減少させ、次に、同等の増殖プロファイル及び製品の生産高を維持しながら、ラマンベースのフィードバック制御のバッチにおいて全体的な製品の糖化を４３．７％及び５７．９％減少させることによって改善された。加えて、細胞株２のプロセスも改善され、プロセスが進行するにつれて細胞の健全性が長く維持され、細胞の生存率の低下が大幅に減少した。この改善は、このプロセスの製品の生産高を最大２５％増加させるノックオン効果を有していた。したがって、プロセス開発においてラマン分光法をＰＡＴツールとして含めることにより、プロセス開発、スケールアップ、及び製造プロセスの堅牢性に大きな影響を及ぼす可能性がある。
＊ ＊ ＊
＊ ＊ ＊
【0234】
上記の説明及び特許請求の範囲において、「～のうちの少なくとも１つ」又は「～のうちの１つ又は２つ以上」などの語句が、その前に記載される要素又は特徴の接続的なリストとともに用いられる場合がある。「及び／又は」という用語もまた、２つ又は３つ以上の要素又は特徴のリストで用いられる場合がある。それが使用される文脈によって別途暗黙的又は明示的に矛盾しない限り、そのような語句は、列挙された要素若しくは特徴のうちのいずれかを個別に、又は列挙された要素若しくは特徴のうちのいずれかを他の列挙された要素若しくは特徴のいずれかと組み合わせて意味することが意図されている。例えば、「Ａ及びＢのうちの少なくとも一方」、「Ａ及びＢのうちの１つ又は２つ以上」、及び「Ａ及び／又はＢ」という語句は各々、「Ａ単独、Ｂ単独、又はＡ及びＢを一緒に」を意味することが意図されている。また、３つ又は４つ以上の項目を含むリストについても同様の解釈が意図されている。例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの１つ又は２つ以上」、及び「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」という語句は各々、「Ａ単独、Ｂ単独、Ｃ単独、Ａ及びＢを一緒に、Ａ及びＣを一緒に、Ｂ及びＣを一緒に、又はＡ及びＢ及びＣを一緒に」を意味することが意図されている。上記及び特許請求の範囲における「～に基づいて」という用語の使用は、列挙されていない特徴又は要素も許容可能であるように、「～に少なくとも部分的に基づいて」を意味することを意図している。
【0235】
本明細書で述べた主題は、所望の構成に応じて、システム、装置、方法、及び／又は物品として実施することができる。上記の説明に記載した実現形態は、本明細書で述べた主題と一致する全ての実現形態を表すものではない。むしろ、それらは単に、説明した主題に関連する態様と一致するいくつかの例にすぎない。いくつかの変形形態について上で詳細に説明してきたが、他の改変形態又は追加形態も考えられる。具体的には、更なる特徴及び／又は変形が、本明細書に記載したものに加えて提供され得る。例えば、上述した実現形態は、開示した特徴の様々な組み合わせ及び部分的組み合わせ、並びに／又は上で開示したいくつかの更なる特徴の組み合わせ及び部分的組み合わせに関するものとなり得る。加えて、添付の図面に示しかつ／又は本明細書で説明した論理の流れは、望ましい結果を達成するために、示した特定の順序、又は逐次的な順序を必ずしも必要としない。他の実施形態が以下の特許請求の範囲に含まれ得る。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図3D】
【図3E】
【図3F】
【図3G】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図4D】
【図4E】
【図4F】
【図4G】
【図5A】
【図5B】
【図5C】
【図5D】
【図5E】
【図5F】
【図5G】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図11D】
【図11E】
【図11F】
【図12A】
【図12B】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図15C】
【図15D】
【図15E】
【図15F】
【図15G】
【図15H】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D】
【図16E】
【図16F】
【図16G】
【図16H】
【国際調査報告】