特表 2024-511134 抗がん治療において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-12

(54)【発明の名称】抗がん治療において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチド

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/113 20100101AFI20240305BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 31/7088 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 31/4188 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 31/175 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 31/166 20060101ALI20240305BHJP

   A61K 31/282 20060101ALI20240305BHJP

【ＦＩ】

C12N15/113 Z ZNA

C12N15/113 130Z

A61P43/00 121

A61P35/00

A61K31/7088

A61K31/4188

A61K31/175

A61K31/166

A61K31/282

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558575

(86)(22)【出願日】2022-03-18

(85)【翻訳文提出日】2023-11-17

(86)【国際出願番号】 FR2022050497

(87)【国際公開番号】W WO2022200720

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】2102992

(32)【優先日】2021-03-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】323002277

【氏名又は名称】ユニヴェルシテ グルノーブル アルプ

(71)【出願人】

【識別番号】507042442

【氏名又は名称】インサーム （インスティテュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ ルシェルシェ メディカル）

(71)【出願人】

【識別番号】523025045

【氏名又は名称】ソントル オスピタリエ ユニヴェルシテ グルノーブル アルプ

(74)【代理人】

【識別番号】110001427

【氏名又は名称】弁理士法人前田特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】アンベール ソンドリン

(72)【発明者】

【氏名】アガス ファビエンヌ

(72)【発明者】

【氏名】ソドゥ フレデリク

(72)【発明者】

【氏名】ラヤヌ ケセム

【テーマコード（参考）】

4C086

4C206

【Ｆターム（参考）】

4C086AA01

4C086AA02

4C086AA03

4C086CB05

4C086EA16

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086ZA02

4C086ZB26

4C086ZC75

4C206AA01

4C206AA02

4C206GA07

4C206GA16

4C206GA22

4C206HA28

4C206JB16

4C206KA01

4C206MA02

4C206MA04

4C206NA05

4C206ZA02

4C206ZB26

(57)【要約】

本発明は、神経膠腫細胞に抗がん治療に対する感受性を付与することに使用するための、神経膠腫細胞中のハンチンチンタンパク質の発現レベルを低減することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【選択図】図１０

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経膠腫細胞に抗がん治療に対する感受性を付与することに使用するための、前記神経膠腫細胞中のハンチンチンタンパク質の発現レベルを低減することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４のアンチセンスオリゴヌクレオチドならびに配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４から選択される配列との配列同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、好ましくは９９％以上であるアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される、
アンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項2】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、さらに神経膠腫細胞中の６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質の発現レベルを低減することが可能である、
請求項１に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項3】

前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３５個の核酸塩基を備える、
請求項１および２のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項4】

前記神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、前記神経膠腫細胞のＤＮＡに損傷を与える治療である、
請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項5】

前記神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、ＤＮＡアルキル化剤を用いた治療である、
請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項6】

前記神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、テモゾロミド（ＴＭＺ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、プロカルバジンおよびカルボプラチンから選択されるアルキル化剤のうちの１つまたは複数の組み合わせを用いた治療である、
請求項１～５のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項7】

前記神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、テモゾロミド（ＴＭＺ）治療であり、前記神経膠腫細胞は、ＴＭＺでの致死量５０（ＬＤ５０）が３０％以上、好ましくは４０％以上低減されるような感受性が付与される、
請求項１～６のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項8】

前記神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、放射線を使用する治療である、
請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチド。

【請求項9】

請求項１～８のいずれか１つに記載の使用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ備えるか、または、当該アンチセンスオリゴヌクレオチドの塩、エステル、当該エステルの塩または医薬上許容されるプロドラッグと、医薬上許容される担体または希釈剤とを備える、医薬組成物。

【請求項10】

脳腫瘍の治療において使用するための、請求項１～８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

膠芽腫、すなわち、グレード４の星細胞腫の治療において使用される、請求項１～８のいずれか１項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、または、請求項９に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、抗がん治療において使用するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。本発明は、治療用途の分野に属し、より詳細には、アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して神経膠腫細胞に抗がん治療に対する感受性を付与することに関する。

【背景技術】

【0002】

膠芽腫（ＧＢＭ）すなわちグレード４の星細胞腫は、まれな脳腫瘍（フランスにおいては、１０万人年当たり４件）であり、その増殖は急激であり生命予後は悪く、診断後２年よりも長く生存する患者は、ほんの２％である。この腫瘍は、神経膠を起源とするので神経膠腫を呼ばれる。より最近では、制御異常脳室下帯幹細胞がＧＢＭの原因であり得ることが示されてきた（“Ｈｕｍａｎ ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ ａｒｉｓｅｓ ｆｒｏｍ ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｌｏｗ－ｌｅｖｅｌ ｄｒｉｖｅｒ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ” Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．２０１８）。この制御異常の起源となる環境要因や分子要因は、まだ明らかにされていない。この腫瘍は、複数の多少異なる細胞種から構成されている。これらの細胞の中には、がん治療に対する抵抗や腫瘍再発の原因となるまれながん幹細胞が含まれる。

【0003】

治療の第一段階は、外科的切除からなる。しかし、ＧＢＭ細胞は、急激に増殖し脳実質を侵襲するので、腫瘍全体、特にその幹細胞、を除去することはできない。経口テモゾロミド（ＴＭＺ）併用放射線療法および化学療法を２８日ごとに７日間行うサイクルを繰り返すことによって、腫瘍の再増殖を遅くすることができる。ＴＭＺは、メチル基をグアニンのＮ７位または０６位およびアデニンのＮ３位に付加するＤＮＡアルキル化剤である。メチルＯ６グアニンの存在率は、ＴＭＺによるアルキル化全体のほんの１０％未満であるが、ＴＭＺによるアポトーシスの誘導は、主にこの修飾を介して行われる。複製中に、この修飾されたグアニンは、チミンとミスマッチを起こす。このミスマッチは、ＤＮＡミスマッチ修復系（「ミスマッチ修復」をＭＭＲと略す）酵素によって認識される。これらの酵素は、これらのミスマッチの修復を繰り返し試みるが成功しない。その結果、ＤＮＡ二重鎖は、切断され、細胞周期はＧ２で停止し、アポトーシスが誘導される。しかし、再発性腫瘍は、Ｏ６－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）酵素を発現する。この酵素は、ＴＭＺで処置した後のグアニン上に存在するアルキル基を除去する。したがって、ＴＭＺは、有効でなくなる。ＴＭＺに代わる治療はない。

【0004】

したがって、腫瘍細胞のＴＭＺに対する抵抗性を低減することを目的とした、分子および細胞標的の特定を可能にするような進展が得られれば、神経膠腫を罹患する患者に恩恵を与えるであろう。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0005】

これを達成するために、本発明の目的は、神経膠腫細胞に抗がん治療に対する感受性を付与することに使用するために、神経膠腫細胞中のハンチンチンタンパク質の発現レベルを低減することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供することによって、上記短所を克服することである。

【課題を解決するための手段】

【0006】

本発明は、神経膠腫細胞に抗がん治療に対する感受性を付与することに使用するための、神経膠腫細胞中のハンチンチンタンパク質および６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質の発現レベルを低減することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドにさらに関する。

【0007】

ハンチンチンタンパク質（ＨＴＴ）は、３５０ｋＤａの多面的タンパク質（ｐｌｅｉｏｔｒｏｐｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ）である。このタンパク質は、その変異形態が主に研究されている。すなわち、その遺伝子配列のエクソン１において３６個より多くのＣＡＧトリプレットの伸長を与える変異形態である。なぜなら、ＨＴＴタンパク質をコードするこの変異遺伝子（ＣＡＧトリプレットの異常伸長を有するハンチンチン遺伝子）は、致死の神経変性病であるハンチントン病を引き起こす。野生型ＨＴＴは、細胞の幹状態を維持可能にする。実際に、異なる起源の幹／前駆細胞中のＨＴＴレベルが低減すると、早期に分化する傾向のこれらの細胞の貯蔵の枯渇が生じる（Ｇｏｄｉｎ ｅｔ ａｌ．、２０１０、Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．、２０１４、Ｌｏｐｅｓ ｅｔ ａｌ．、２０１６）。また、ＨＴＴは、上皮間葉転換に関与すること、ＨＴＴが存在しないと、乳がん細胞がより転移しやすくなったり、非がん性細胞が極性を失うことが示されてきた（Ｅｌｉａｓ ｅｔ ａｌ．、２０１５、Ｔｈｉｏｎ ｅｔ ａｌ．、２０１５）。

【0008】

アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯとも呼ぶ）は、短い合成ＤＮＡ配列（約２０塩基）であり、核酸塩基対のＣｒｉｃｋおよびＷａｔｓｏｎの原理にしたがって、対象となるメッセンジャＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を標的にする配列である。このとき、当該ｍＲＮＡは、リボヌクレアーゼＨ（ＲＮＡｓｅ Ｈ）によって分解されるので、タンパク質に翻訳されない。ＡＳＯは、核酸塩基のホスホチオエート結合および修飾を与え、特に、２’－Ｏ－メトオキシエチル（ＭＯＥ）基を３’および５’末端のヌクレオチドに付加し、これらのヌクレオチドをヌクレアーゼに対して抵抗性にし、また水溶性にする。

【0009】

本発明者らは、非常に驚いたことに、ＨＴＴタンパク質のｍＲＮＡを標的にすることによって神経膠腫細胞中のＨＴＴタンパク質の発現レベルを低減することが可能なＡＳＯと、神経膠腫細胞中のＨＴＴタンパク質およびＭＧＭＴタンパク質（それらのたんぱく質を発現する細胞を特に抗がん治療に対して抵抗性にする）の発現レベルを低減することが可能なＡＳＯとを当該細胞にトランスフェクトすることによって、通常であれば当該細胞が時間経過とともに抵抗性を有するようになるような抗がん治療に対する感受性を当該細胞に付与することができることを発見した。

【0010】

神経膠腫細胞中のＨＴＴレベルを低減するために本発明において使用されるアンチセンスオリゴヌクレオチド配列は、文献において入手可能な配列である（Ｋｏｒｄａｓｉｅｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ．２０１２，“Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａｔｅ Ａｌｌｅｌｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｕｔａｎｔ Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ” Ｓｏｕｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．２０１４）。ハンチントン病に関して、配列番号１のＡＳＯ（本明細書においてアンチセンスオリゴヌクレオチドＲＧ６０４２とも呼ぶ）を用いて臨床試験が実施されてきた。ＡＳＯ ＲＧ６０４２を４回髄腔内注射した後、ハンチントン病患者の脳脊髄液においてＨＴＴレベルが低減する（Ｔａｂｒｉｚｉ ｅｔ ａｌ．、２０１９）。

【0011】

６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質は、ＤＮＡ修復酵素である。このたんぱく質の発現は、体の異なる組織において見られる（組織特異性が低い）。脳内では、このたんぱく質は、神経細胞ではなく、内皮細胞および神経膠細胞によって発現される。

【0012】

ＭＧＭＴのレベルは、脳内では低く、通常、遺伝子のプロモータのメチル化または遺伝子の本体のメチル化とも相関関係がある（サイレンシング機構）。脳腫瘍において、放射線療法／化学療法のサイクルを繰り返した後、ＭＧＭＴを再発現するある細胞が出現し、治療によって部分的に排除された腫瘍塊の残りの細胞に「とって代わる」。これらの抵抗性細胞は、腫瘍再発の原因となる。したがって、本発明にかかる、神経膠腫細胞中のハンチンチンタンパク質および６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質の発現レベルを低減することが可能なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用は、特に、腫瘍再発現象を回避するために有利である。

【0013】

特定の実施形態において、また、本発明は、以下の特徴に対応し、当該特徴は、それぞれに独立に実施されるか、または、技術的に有効な各組み合わせにおいて実施される。

【0014】

本発明の特定の実施形態において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２～３５個の核酸塩基を備える。

【0015】

本発明の特定の実施形態において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４の配列のアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

【0016】

本発明の特定の実施形態において、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４から選択される配列との配列同一性が５０％以上、好ましくは６０％以上、より好ましくは７０％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは９０％以上、好ましくは９２％以上、より好ましくは９５％以上、好ましくは９６％以上、好ましくは９７％以上、好ましくは９８％以上、好ましくは９９％以上であるアンチセンスオリゴヌクレオチドから選択される。

【0017】

本発明の特定の実施形態において、神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、当該細胞のＤＮＡに損傷を与える治療である。

【0018】

本発明の特定の実施形態において、神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、ＤＮＡアルキル化剤を用いる治療である。当該アルキル化剤は、好ましくは、テモゾロミド（ＴＭＺ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、プロカルバジンおよびカルボプラチンから選択される。

【0019】

神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療がテモゾロミド（ＴＭＺ）を用いた治療である本発明の特定の実施形態において、神経膠腫細胞は、好ましくは、ＴＭＺの致死量５０（ＬＤ５０）が３０％以上、好ましくは４０％以上低減されるような感受性が付与される。致死量５０（ＬＤ５０）は、コントロール条件（本発明の主題であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用しない）に対して、細胞生存度（ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）が５０％低減されるＴＭＺの濃度を表す。

【0020】

本発明の特定の実施形態において、神経膠腫細胞に付与する感受性の対象となる抗がん治療は、放射線を使用する治療である。

【0021】

別の局面によると、本発明は、当該細胞に抗がん治療に対する感受性を付与することに使用するための、本発明の主題であるアンチセンスオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ備えるか、または、その塩、エステル、当該エステルの塩、または医薬上許容されるプロドラッグと、医薬上許容される担体または希釈剤とを備える医薬組成物に関する。

【0022】

本明細書において、「アンチセンスオリゴヌクレオチドを備える医薬組成物」は、医薬上許容される希釈剤中にハンチンチンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドを備える組成物を指す。医薬上許容される希釈剤は、当業者に周知されている。医薬上許容される希釈剤または担体は、限定されないが上記化合物の溶解度および投与経路を含む多くの要因に基づいて選択される。これらの考慮や検討は、当業者によってよく理解されている。

【0023】

「薬学的担体」または賦形剤は、医薬上許容される溶媒、懸濁剤または１以上の核酸を動物に送達するための任意の他の薬理学的に不活性な担体であり得、当該技術分野において知られているものである。賦形剤は、液体または固体のいずれでもよく、核酸および所与の医薬組成物の他の成分と組み合わされた際に所望される体積、整合性（ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ）などを得るように、所望の投与モードを考慮して、選択される。

【0024】

「医薬上許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理学的かつ薬学的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の活性を維持するが、当該親化合物に有害な毒物学的効果を与えない塩を指す。アンチセンスオリゴヌクレオチドのナトリウム塩は、有用であり、ヒトへの治療的投与用として十分に認められている。

【0025】

「プロドラッグ」という用語は、本明細書中で、不活性または低活性形態で調製された治療剤であって、体内またはその細胞内で内在性酵素または他の化学物質および／または状態の作用によって活性形態（すなわち、薬）に変換される治療剤を指す。

【0026】

別の局面によると、本発明は、脳腫瘍の治療において使用するための、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明にかかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ備える組成物に関する。

【0027】

別の局面によると、本発明は、膠芽腫、すなわち、グレード４の星細胞腫の治療において使用するための、上記アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは本発明にかかるアンチセンスオリゴヌクレオチドを少なくとも１つ備える組成物に関する。

【図面の簡単な説明】

【0028】

本発明は、非限定の例によって与えられ、添付の図面を参照する以下の説明を読むことによってより良く理解される。

【0029】

【図1】図１は、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ＲＧ６０４２（配列番号１）をトランスフェクトされたＵ２５１細胞系統の細胞、ＡＳＯ Ｓｃｒ（「スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）」の略）をトランスフェクトされたＵ２５１細胞系統の細胞、またはリポフェクタミン（ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）のみで処置されたＵ２５１細胞系統の細胞（コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）をＣｔｒｌと略す）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、（Ａ）に提示した実験を４回繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【図2】図２は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ８７細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＵ８７細胞系統の細胞、またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ８７細胞系統の細胞（Ｃｔｒｌ）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、（Ａ）に提示した実験を３回以上繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【図3】図３は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞（Ｃｔｒｌ）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、（Ａ）に提示した実験を５回繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【図4】図４は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞（Ｃｔｒｌ）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、（Ａ）に提示した実験を４回繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＭＧＭＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【図5】図５は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２、ＡＳＯ ＰＨ１、ＡＳＯ ＰＨ２、ＡＳＯ ＰＨ３、またはＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞から得たウエスタンブロットの結果を例示する。

【図6】図６は、図５に提示した実験を４回以上繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られた、ＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＡに、ＭＧＭＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【図7】図７は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞中の、ｑＰＣＲによって定量化されたＨＴＴ ｍＲＮＡ発現のグラフをＡに例示し、ｑＰＣＲによって定量化されたＭＧＭＴ ｍＲＮＡ発現のグラフをＢに例示する。

【図8】図８は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ２５１系統の生存細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ２５１系統の生存細胞（Ｃｔｒｌ）の割合を、受け取ったＴＭＺの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ２５１系統の細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ２５１系統の細胞（Ｃｔｒｌ）についてＬＤ５０にて測定されたＴＭＺの濃度をＢに例示する。

【図9】図９は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ８７系統の生存細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ８７系統の生存細胞（Ｃｔｒｌ）の割合を、受け取ったＴＭＺの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ８７系統の細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ８７系統の細胞（Ｃｔｒｌ）についてＬＤ５０にて測定されたＴＭＺの濃度をＢに例示する。

【図10】図１０は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の生存細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ系統の生存細胞（Ｃｔｒｌ）の割合を、受け取ったＴＭＺの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ系統の細胞（Ｃｔｒｌ）についてＬＤ５０にて測定されたＴＭＺの濃度をＢに例示する。

【図11】図１１は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＵ２５１系統の生存細胞の割合を、受け取ったロムスチンの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＵ２５１系統の細胞について４つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたロムスチンの濃度の平均をＢに例示する。

【図12】図１２は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の生存細胞の割合を、受け取ったロムスチンの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の細胞について４つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたロムスチンの濃度の平均をＢに例示する。

【発明を実施するための形態】

【0030】

アンチセンスオリゴヌクレオチドをトランスフェクトされた神経膠腫細胞を得ること

【0031】

Ｕ８７、Ｔ９８ＧおよびＵ２５１神経膠腫細胞系統を１０％のウシ胎児血清ならびに１％のペニシリンおよびストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ培地（「ダルベッコ・フォークト変法イーグル最小必須培地」）中で培養する。

【0032】

培養物が６０％コンフルエンス（ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｅ）になったら、リポフェクタミン中で４８時間、１００μＭのアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ＲＧ６０４２（配列番号１）、またはＰＨ１（配列番号２）またはＰＨ２（配列番号３）またはＰＨ３（配列番号４）またはＳｃｒを培養物にトランスフェクトする。ＡＳＯ Ｓｃｒ（「スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）」の略）は、配列番号５の配列＜Ａ＊ＣＡＴＧ＊＞Ａ＊Ｃ＊Ｃ＊Ｇ＊Ｃ＊Ａ＊Ｃ＊Ｔ＊Ｃ＊Ａ＊＜ＣＴＡＴ＊Ａ＞を有するコントロールの役割を有したＡＳＯである（ここで、＊は、ホスホロチオエート結合であり、記号＜と記号＞との間の塩基は、２’－Ｏ－メトオキシエチルＲＮＡである）。

【0033】

次いで、上記細胞は、テモゾロミド（ＴＭＺ）に対する感受性テスト、またはアルキル化剤ロムスチンに対する感受性テスト、またはハンチンチン（ＨＴＴ）および６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質レベル発現テストのいずかにおいて使用される。

【0034】

ハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質発現レベルテスト

【0035】

ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされた細胞、ＡＳＯ Ｓｃｒをトランスフェクトされた細胞、またはリポフェクタミンのみで処置された（コントロール用）細胞を、ＨＴＴタンパク質の発現レベルをテストするために回収（ｈａｒｖｅｓｔ）する。

【0036】

上記細胞をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、次いでプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を添加したＲＩＰＡ溶解バッファ中で溶解させる。バッファ中に可溶化されたタンパク質を遠心分離にかけた後、回収し、Ｌａｅｍｍｌｉローディングバッファ中で変性させ、ポリアクリルアミドゲル上に載せる。泳動後、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜上に転写する。ＨＴＴタンパク質は、Ｄ７Ｆ７抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）からの＃５６５６）とともにインキュベートして検出（ｒｅｖｅａｌ）する。ビンキュリンをローディングコントロールとして使用する。

【0037】

図１は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ２５１細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＵ２５１細胞系統の細胞、または単にリポフェクタミンのみで処置されたＵ２５１細胞系統の細胞（コントロール（ｃｏｎｔｒｏｌ）をＣｔｒｌと略す）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、Ａに提示した実験を４回繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【0038】

図２は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ８７細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＵ８７細胞系統の細胞、またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ８７細胞系統の細胞（Ｃｔｒｌ）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、Ａに提示した実験を３回以上繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【0039】

図３は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞（Ｃｔｒｌ）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、Ａに提示した実験を５回繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【0040】

このテストは、ＡＳＯ ＲＧ６０４２が神経膠腫細胞中のＨＴＴタンパク質レベルを著しく低減することを示す。

【0041】

６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質の発現レベルのテスト

【0042】

ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされた細胞、ＡＳＯ Ｓｃｒをトランスフェクトされた細胞、またはリポフェクタミンのみで処置された細胞（コントロール用）をＭＧＭＴタンパク質の発現レベルのテストするために回収する。

【0043】

プロトコルは、ＭＧＭＴタンパク質を検出するためのインキュベーションにおいて抗ＭＧＭＴ抗体（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）からの＃２７３９）を使用すること以外は、上記ＨＴＴタンパク質の発現レベルのテストのプロコルと同じである。ここでも、ビンキュリンをローディングコントロールとして使用する。

【0044】

図４は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、ＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞、またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞（Ｃｔｒｌ）から得たウエスタンブロットの結果をＡに例示し、Ａに提示した実験を４回以上繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られたＭＧＭＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。

【0045】

このテストは、ＡＳＯ ＲＧ６０４２がＴ９８Ｇ細胞中のＭＧＭＴレベルを著しく低減することを示す。

【0046】

Ｔ９８Ｇ細胞中のハンチンチン（ＨＴＴ）タンパク質および６－Ｏ－メチルグアニンＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＧＭＴ）タンパク質の発現レベルのテスト

【0047】

ＡＳＯ ＲＧ６０４２、またはＡＳＯ ＰＨ１、またはＡＳＯ ＰＨ２またはＡＳＯ ＰＨ３、またはＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞を、ＨＴＴタンパク質およびＭＧＭＴの発現レベルをテストするために回収する。

【0048】

プロトコルは、上記ＨＴＴタンパク質の発現レベルおよびＭＧＭＴタンパク質の発現レベルのためのテストのプロトコルと同じである。ここでも、ビンキュリンをローディングコントロールとして使用する。

【0049】

図５は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２、ＡＳＯ ＰＨ１、ＡＳＯ ＰＨ２、ＡＳＯ ＰＨ３、またはＡＳＯ ＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ細胞系統の細胞から得たウエスタンブロットの結果を例示する。

【0050】

図６は、図５に提示した実験を４回以上繰り返した後のウエスタンブロットにおいて得られた、ＨＴＴタンパク質レベルを定量化したものをＡに、ＭＧＭＴタンパク質レベルを定量化したものをＢに例示する。クラスカル・ウォリス検定後にダンの多重比較検定を使用する統計処理を行った。エラーバー（ｅｒｒｏｒ ｂａｒ）、ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．００１。

【0051】

図７は、ｑＰＣＲによって定量化されたＨＴＴのｍＲＮＡの発現をＡに、ｑＰＣＲによって定量化されたＭＧＭＴのｍＲＮＡの発現をＢに例示する。マン・ホイットニーのＴ検定を使用する統計処理を行った。エラーバー、ＳＥＭ、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。

【0052】

このテストは、ＡＳＯ ＲＧ６０４２、ＰＨ１、ＰＨ２およびＰＨ３がＴ９８Ｇ神経膠腫細胞中のＨＴＴおよびＭＧＭＴタンパク質レベルを著しく低減することを示す。

【0053】

テモゾロミド（ＴＭＺ）感受性テスト

【0054】

ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされた細胞またはリポフェクタミンのみで処置された細胞（コントロールをＣｔｒｌと略す）をＴＭＺ感受性テストのために回収する。

【0055】

ＴＭＺを３３．３ｍＭのクエン酸一水和物中に５０ｍＭの原液の形態で調製した。得られた溶液を超音波にかけ、ろ過し、そして後の使用まで－２０℃で冷凍する（Ｎｙｇｒｅｎ，Ｈ．，ａｎｄ Ｅｋｓｂｏｒｇ，Ｓ．（２０１２），“Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｅｍｏｚｏｌｏｍｉｄｅ ｉｎ ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ａｉｍｅｄ ｆｏｒ ｏｒａｌ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｅｐａｒｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ ａｖａｉｌａｂｌｅ ｐｏｗｄｅｒ ｆｏｒ ｉｎｆｕｓｉｏｎ”，Ｐｈａｒｍ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３，１－３）。

【0056】

上記細胞を９６ウェル培養皿に、Ｕ２５１およびＴ９８Ｇ系統については１ウェルあたり２００個の細胞数で、Ｕ８７系統については１ウェルあたり１００個の細胞数で播種する。上記細胞は、放置して２４時間生育させる。

【0057】

次いで、Ｕ８７およびＵ２５１系統の細胞は、１０μＭから１１０μＭのレートで増加させた量のＴＭＺを用いて４８時間処置し、Ｔ９８Ｇ系統の細胞は、１００μＭから１５００μＭのレートで増加させた量のＴＭＺを用いて４８時間処置する。各希釈は、３部用意してテストする。コントロール条件は、完全培養培地で処置した細胞からなる。未使用のウェルは、完全培養培地だけを含む。

【0058】

ＴＭＺを用いた４８時間の処置の終了時、ＴＭＺを含有する培地を除去し、新鮮な完全培養培地に置き換え、その中で上記細胞を放置して７２時間インキュベートする。

【0059】

次いで、異なるウェルにおける細胞生存を評価するためにＭＴＴテスト（既知の生存細胞カウントテスト）を設定する。

【0060】

次いで、ＭＴＴの黄色プローブである３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミドを各ウェルに０．５ｍｇ．ｍｌ^－１の使用濃度（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）で添加する。ウェルを９５％の空気および５％のＣＯ_２で加湿されたインキュベータにおいて３７℃で４時間インキュベートする。生存細胞中のＭＴＴプローブの低減による不溶な紫色のホルマザンに可溶化溶液（水中に１０％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および０．０１％の塩化水素（ＨＣｌ））を添加し、一晩３７℃で可溶化する。次いで、分光光度計を用いて各ウェルの内容物の光学密度（ＯＤ）を４９０ｎｍ～５７０ｎｍの波長で分析する。

【0061】

致死量５０（ＬＤ５０）は、細胞生存度がコントロール条件に対して５０％低減されるＴＭＺの濃度を表す。

【0062】

図８は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ２５１系統の生存細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ２５１系統の生存細胞（Ｃｔｒｌ）の割合を、受け取ったＴＭＺの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ２５１系統の細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ２５１系統の細胞（Ｃｔｒｌ）について、４つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたＴＭＺの平均濃度をＢに例示する。

【0063】

図９は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ８７系統の生存細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ８７系統の生存細胞（Ｃｔｒｌ）の割合を、受け取ったＴＭＺの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＵ２５１系統の細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＵ２５１系統の細胞（Ｃｔｒｌ）について、４つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたＴＭＺの平均濃度をＢに例示する。

【0064】

図１０は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の生存細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ系統の生存細胞（Ｃｔｒｌ）の割合を、受け取ったＴＭＺの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２をトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の細胞またはリポフェクタミンのみで処置されたＴ９８Ｇ系統の細胞（Ｃｔｒｌ）について、６つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたＴＭＺの平均濃度をＢに例示する。

【0065】

したがって、３つの細胞系統Ｕ８７、Ｕ２５１およびＴ９８ＧのＴＭＺのＬＤ５０は、ＨＴＴレベルが低減した培養物において低減すると思われる。

【0066】

ＨＴＴレベルの低減により、ＴＭＺのＬＤ５０が以下の率で低減する。
Ｕ８７の培養物において３２％（ＬＤ５０＝８１．７±６．２μＭ 対 ＲＧ６０４２で処置した後のＬＤ５０＝５５．０±３．０μＭ）、
Ｕ２５１の培養物において４０％（ＬＤ５０＝６１．６±３．３μＭ 対 ＲＧ６０４２で処置した後のＬＤ５０＝３６．７±２．６μＭ）、
Ｔ９８Ｇの培養物において４５％（ＬＤ５０＝９６８．１±６３．０μＭ 対 ＲＧ６０４２で処置した後のＬＤ５０＝５３１．６±５１．６μＭ）。

【0067】

アルキル化剤ロムスチンに対する感受性テスト

【0068】

ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＡＳＯ Ｓｃｒをトランスフェクトされた細胞をアルキル化剤ロムスチンに対する感受性テストのために回収する。

【0069】

ロムスチンは、純エタノール中に５０ｍｇ／ｍｌ（２１４ｍＭ）の原液の形態で調製した。溶液をろ過して滅菌し（０．２μｍ孔フィルタ）、後の使用まで－２０℃で冷凍した。

【0070】

上記Ｕ２５１およびＴ９８Ｇ系統の細胞は、９６ウェル培養皿に１ウェルあたり２００個の細胞数で播種する。細胞を放置して２４時間生育させる。

【0071】

次いで、Ｕ２５１系統の細胞は、５μＭから５００μＭのレートで増加させた量のロムスチンを用いて４８時間処置し、Ｔ９８Ｇ系統の細胞は、１００μＭから１５００μＭのレートで増加させた量のロムスチンを用いて４８時間処置する。各希釈は、３部用意してテストする。コントロール条件は、完全培養培地で処置した細胞からなる。未使用のウェルは、完全培養培地だけを含む。

【0072】

ロムスチンを用いた４８時間の処置の終了時、ロムスチンを含有する培地を除去し、新鮮な完全培養培地に置き換え、その中で上記細胞を放置して７２時間インキュベートする。

【0073】

次いで、異なるウェルにおける細胞生存を評価するために、上記ＴＭＺに対する感受性に関するテストと同様にＭＴＴテストを設定する。

【0074】

致死量５０（ＬＤ５０）は、細胞生存度がコントロール条件に対して５０％低減されるロムスチンの濃度を表す。

【0075】

図１１は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＵ２５１系統の生存細胞の割合を、受け取ったロムスチンの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＵ２５１系統の細胞について４つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたロムスチンの濃度の平均をＢに例示する。

【0076】

図１２は、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の生存細胞の割合を、受け取ったロムスチンの量の関数として示す曲線をＡに例示し、ＡＳＯ ＲＧ６０４２またはＳｃｒをトランスフェクトされたＴ９８Ｇ系統の細胞について４つの異なるＭＴＴテストにおいてＬＤ５０にて測定されたロムスチンの濃度の平均をＢに例示する。

【0077】

したがって、Ｕ２５１およびＴ９８Ｇ細胞系統のロムスチンのＬＤ５０は、ＨＴＴレベルが低減した培養物において低減すると思われる。

【0078】

ＨＴＴレベルの低減により、ロムスチンのＬＤ５０が以下の率で低減する。
Ｕ２５１の培養物において４１％（ＬＤ５０＝６６．７９±４．９μＭ 対 ＲＧ６０４２で処置した後のＬＤ５０＝３９．６４±２．０８μＭ）、
Ｔ９８Ｇの培養物において４７％（ＬＤ５０＝２７９．７±７．０９μＭ 対 ＲＧ６０４２で処置した後のＬＤ５０＝１４９．９±２．８５μＭ）。

【0079】

したがって、ＡＳＯ ＲＧ６０４２によってＨＴＴレベルが低減することによって、Ｕ２５１およびＴ９８Ｇ細胞にアルキル化剤ロムスチンに対する感受性が付与される。

【0080】

より一般には、上記に検討した本発明の実施形態は、非限定の例として記載したものであり、したがって他の変形が可能であることに留意されたい。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【配列表】

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【国際調査報告】