特表 2024-511299 医薬品として使用するためのコラーゲン抽出物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-13

(54)【発明の名称】医薬品として使用するためのコラーゲン抽出物

(51)【国際特許分類】

   A61K 35/614 20150101AFI20240306BHJP

   A61P 17/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240306BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240306BHJP

【ＦＩ】

A61K35/614

A61P17/00

A61P43/00 107

A61K45/00

A61P43/00 121

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553480

(86)(22)【出願日】2022-02-25

(85)【翻訳文提出日】2023-10-10

(86)【国際出願番号】 GB2022050521

(87)【国際公開番号】W WO2022185033

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】2103046.5

(32)【優先日】2021-03-04

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523333434

【氏名又は名称】ジェラゲン リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＪＥＬＬＡＧＥＮ ＬＴＤ

(74)【代理人】

【識別番号】110000774

【氏名又は名称】弁理士法人 もえぎ特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】スプラッグ，アンドリュー マーンズ

(72)【発明者】

【氏名】バーナード，アルメロ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4C084NA14

4C084ZA512

4C084ZA891

4C084ZB352

4C084ZC022

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA04

4C087AA05

4C087BB05

4C087MA13

4C087MA16

4C087MA22

4C087MA28

4C087MA34

4C087MA55

4C087NA14

4C087ZA89

4C087ZB22

(57)【要約】

本発明は、表皮水疱症の治療に使用するためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物、当該コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物を含む医薬組成物、および本発明のコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物の製造方法に関する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

表皮水疱症の治療に使用するためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物であって、前記コラーゲン含有抽出物が加水分解物の形態のコラーゲンを含む、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項2】

前記加水分解物の形態のコラーゲンが、前記抽出物の加熱処理によって製造される、請求項１に記載のコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項3】

前記治療すべき前記表皮水疱症が、単純性表皮水疱症（ＥＢＳ）、接合型表皮水疱症（ＪＥＢ）、ジストロフィー性表皮水疱症（ＤＥＢ）、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、および／またはキンドラー症候群（ＫＳ）から選択される、請求項１または請求項２に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項4】

前記コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、
（ａ）ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５遺伝子の活性化を介して、真皮の凝集力向上と細胞の基底層構造化を支援する、
（ｂ）ＭＭＰ－３活性をダウンレギュレートし、重症ＲＤＥＢの治療効果を改善する、
（ｃ）ＦＮ１遺伝子の活性化を介して、細胞接着、成長、移動、および分化の改善を支援する、
（ｄ）ＣＯＬ３Ａ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＳＰＡＲＣ、およびＬＵＭ遺伝子の活性化を介して、細胞外マトリックスの合成、コラーゲン線維の組織化、および構造化を促進する、
（ｅ）ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＡ５、およびＣＤＣ４２遺伝子の活性化を介して、真皮の凝集力向上と細胞の基底層構造化を支援する、
（ｆ）上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＳＩＲＴ４、およびＳＩＲＴ６の活性化を介して、真皮の再生と保護を支援する；
（ｇ）遺伝子ＥＰＰＫおよびＬＯＲの活性化を介して、真皮細胞接合構造の改善を支援する、および／または
（ｈ）ＥＢの水疱形成に関与するＭＭＰ３の活性化を抑制することにより、細胞外マトリックス構造の改善を支援する、
請求項１～３のいずれか１項に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項5】

前記抽出物の供給源がクラゲである、請求項１～４のいずれか１項に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項6】

前記クラゲがサイフォゾア綱である、請求項５に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項7】

前記クラゲが、リゾストマス・プルモ、ロピレマ・エスクレンタム、ロピレマ・ノマディカ、ストモロフス・メレアグリス、アウレリア種、ネモピレマ・ノムライ、カシオペア・アンドロメダ、ネモピレマ・ノムライ、クリサオラ種、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上である、請求項５または請求項６に記載の使用するためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項8】

前記クラゲが、リゾストマス・プルモである、請求項７に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項9】

前記コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物が、溶液、粉末、スポンジマトリックス、ナノファイバー電気紡糸マトリックス、ヒドロゲル、または凍結乾燥形態の形態である、請求項１～８のいずれか１項に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項10】

前記コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物が、好ましくは、多血小板血漿（ＰＲＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－Ｂ、ＴＧＦ－Ｂ２、ＴＧＦ－Ｂ３）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、顆粒球－単球コロニー刺激増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）から選択される少なくとも１つの成長因子、および／または、好ましくはナノ銀（ｎａｎｏ ｓｉｌｖｅｒ）、ペニシリン、オフロキサシン、テトラサイクリン、アミノグリコシドおよびエリスロマイシン、フルクロキサシリン、クラリスロマイシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、コアモキシクラブ、（ペニシリン中の）コトリモキサゾール、セフトリアキソン、タゾバクタム含有ピペラシリン、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、リネゾリド、および／または標準治療抗菌薬、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの抗菌化合物と組み合わせて投与される、請求項１～９のいずれか１項に記載の使用のためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項11】

前記コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物が、１回あたり０．０１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌ、好ましくは１回あたり１ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１回あたり１ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌの用量で投与される、請求項１～１０のいずれか１項に記載の使用のためのコラーゲン性海洋無脊椎動物抽出物。

【請求項12】

請求項１～１１のいずれか１項に記載のコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物を含む医薬組成物。

【請求項13】

前記組成物が、少なくとも１つの薬学的に許容される化合物をさらに含む、請求項１２に記載の医薬組成物。

【請求項14】

前記薬学的に許容される化合物が、成長因子、抗菌剤、抗生物質、および／または別の表皮水疱症治療剤を含む群から選択される１つ以上である、請求項１３に記載の医薬組成物。

【請求項15】

前記組成物が、局所適用に通常使用される任意の形態、好ましくは、クリーム、軟膏、マスク、美容液、ミルク、ローション、ペースト、フォーム、エアゾール、スティック、シャンプー、コンディショナー、パッチ、ヒドロアルコール性または油性水溶液、水中油型または油中水型または多重エマルション、水性または油性ゲル、液状、ペースト状または固体の無水製品、電気紡糸コラーゲンナノファイバーマトリックス、膜および／または球状体を使用した水相中の油分散体で製剤化され、これらの球状体は、ナノスフェア、ナノカプセルなどの高分子ナノ粒子、またはイオン性タイプおよび／または非イオン性タイプの脂質小胞であり、より好ましくは、電気紡糸コラーゲンナノファイバーマトリックスおよび／または膜である、請求項１２～１４のいずれか１項に記載の医薬組成物。

【請求項16】

（ａ）海洋無脊椎動物可溶性コラーゲンを４０℃～１００℃で１０分～１２０分、好ましくは６０℃～８０℃で４５分～９０分加熱し、前記コラーゲン物質を加水分解するステップと、
（ｂ）前記加水分解物を回収するステップと、
を含む、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物の製造方法。

【請求項17】

前記方法が、ステップ（ｂ）の前で、ステップ（ａ）の後に、得られた物質の精製をさらに含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記精製が膜ろ過またはクロマトグラフィー精製による、請求項１７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、表皮水疱症の治療に使用するためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物、当該コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物を含む医薬組成物、および本発明のコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物の製造方法に関する。

【背景技術】

【0002】

表皮水疱症（ＥＢ）は、皮膚が非常に容易に水疱になったり、びらんを起こしたりする遺伝性皮膚疾患群である。ＥＢ患者では、ささいな傷や、こすったりひっかいたりといった摩擦に反応して水疱が形成される。ほとんどの場合、ＥＢの発症は出生時またはその直後である。世界中で５０万人がこの病気に罹患していると推定され、その多くが子供である。

【0003】

人間の皮膚は、表皮と呼ばれる一番外側の層と、真皮と呼ばれるその下の層の２層から成る。健康な皮膚を有する個人では、これらの２つの層の間にタンパク質のアンカーが存在し、２つの層が互いに独立して動く（剪断される）のを防いでいる。生まれつきのＥＢ患者では、２つの皮膚層をつなぎ合わせるタンパク質のアンカーが欠落しているため、皮膚が非常にもろくなる。

【0004】

重症度は軽度から致命的なものまである。合併症には食道狭窄が含まれる場合があり、切断が必要な場合もある。ＥＢの最も潜在的に危険な合併症は扁平上皮癌（ＳＣＣ）である。残念ながら、ＳＣＣはしばしば浸潤性で、ＥＢ患者では急速に転移する。さらに、最良の治療戦略について明確なコンセンサスは得られていない。ＥＢには主に５つのタイプがあり、水疱形成の深さやレベルによって分類される：

【0005】

１．単純性表皮水疱症（ＥＢＳ）
水疱形成は表皮と呼ばれる皮膚の上層で起こる。基底膜の真上（基底層）の皮膚の癒着不足によって特徴付けられる。ＥＢＳはＥＢの最も一般的なタイプで、症例の約５５％を占める。ＥＢＳは一般に他のタイプのＥＢより軽いが、水疱形成は痛みを伴い、擦過によって容易に悪化する。ＥＢＳに関連する遺伝子には以下のものがある：Ｋ_５／ＫＲＴ５（ケラチン－５）、Ｋ_１４（ケラチン１４）、ＴＧＭ５（トランスグルタミナーゼ－５）、ＤＳＰ（デスモプラキン）、ＰＫＰ１（プラコフィリン－１）、ＰＬＥＣ（プレクチン）、ＤＳＴ（ジストニン）；ＩＴＧＡ６（α６Ｂ４インテグリン１）、およびＩＴＧＲ４（α６Ｂ４インテグリン）、ＩＴＧＡ６（α６Ｂ４インテグリン１）、およびＩＴＧＲ４（α６Ｂ４インテグリン）、ＣＯＬ１７Ａ１（ＸＶＩＩ型コラーゲン）、およびＪＵＰ（接合型プラコグロビン）。

【0006】

２．接合型表皮水疱症（ＪＥＢ）
水疱形成は、表皮（皮膚の上層）と真皮（下層）の間の接合部に位置する基底膜部内の透明帯と呼ばれる皮膚層で起こる。ＪＥＢはＥＢの中で最も重症のタイプで、症例の約５％を占める。ＪＥＢに関連する遺伝子は、ＬＡＭＡ３（ラミニン－３３２）、ＬＡＭＢ３（ラミニン－３３２）、ＬＡＭＣ２（ラミニン－３３２）、ＣＯＬ１７Ａ１（ＸＶＩＩ型コラーゲン）；ＩＴＧＡ６（α６Ｂ４インテグリン１）、およびＩＴＧＲ４（α６Ｂ４インテグリン）を含む。

【0007】

３．ジストロフィー性表皮水疱症（ＤＥＢ）
表皮と真皮の間の接着に問題があるため、基底膜で組織の剥離と水疱形成が起こる。遺伝形式は優性遺伝（ＤＤＥＢ）と劣性遺伝（ＲＤＥＢ）があるが、ＤＥＢのすべての型は、アンカーフィブリルタンパク質、すなわち皮膚の弾力性の完全性および構造的完全性に不可欠な構造タンパク質であるＶＩＩ型コラーゲンをコード化する遺伝子の変異に起因する。ＤＥＢはＥＢの中でも特に重症のタイプである。扁平上皮癌（ＳＣＣ）はＤＥＢ患者における死亡率の圧倒的な最大の原因であり、５５歳までに８０％がＳＣＣに罹患する。ＤＥＢは症例の約３０％を占める。ＲＤＥＢでは、ある種の遺伝子（および対応するタンパク質）がアップレギュレートされており、ＭＭＰ－３がＶＩＩ型コラーゲンからなるアンカーフィブリルの分解によって皮膚の水疱形成に重要な役割を果たしている可能性が示唆されている（Ｄ．Ｓａｗａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，１７４（２）：１００３－８。

【0008】

４．後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）
ＥＢＡは非遺伝的自己免疫疾患であり、ＶＩＩ型コラーゲンに対する抗体の発現によって引き起こされる。皮膚の水疱を調べると、表皮と真皮の間の基底膜に抗体が沈着していることがわかる。この型のＥＢは非常にまれで、遺伝性はなく、そして通常は成人期に発症する。

【0009】

５．キンドラー症候群（ＫＳ）
水疱形成は基底膜部内の複数のレベル、またはその下の皮膚層で起こる。この症候群はこの病気ではまれで、手足の水疱、皮膚の色の変化、口、腸、目などの内壁の領域に対する損傷によって特徴付けられる。ＫＳに関連する遺伝子にはＦＥＲＭＴ１（キンドリン－１）がある。

【0010】

特にＤＥＢはＣＯＬ７Ａ１遺伝子の変異によって引き起こされる。ＣＯＬ７Ａ１の変異はＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）と呼ばれるタンパク質の欠損につながり、このタンパク質は表皮と真皮という２つの皮膚層の適切な結合に不可欠である。ＶＩＩ型コラーゲン（Ｃ７）は、ヒトやその他の動物の皮膚に存在するコラーゲンである。Ｃ７は表皮と真皮の間の基底膜部（ＢＭＺ）に局在し、Ｃ７を構成するアンカーフィブリル（ＡＦ）と呼ばれる大きな構造をしている。ＡＦは表皮と真皮をつなぎ合わせている。

【0011】

今日、この病態を完治させる治療法はなく、創傷ケア、疼痛コントロール、感染症コントロール、栄養サポート、および合併症の予防と治療で主に構成される疾患管理となっている。臨床検査や画像検査による合併症のモニタリングも重要であるが、これらの検査の頻度は、ＥＢのタイプや各人の重症度によって異なるだろう。ＥＢの管理には、皮膚科医、創傷ケアを専門とするＥＢ看護師、作業療法士、栄養士、およびソーシャルワーカーを含む医療ケア供給者の集学的なチームを必要とする。その他、必要に応じてさまざまな専門家に相談してもよい。疾病管理は、年齢、重症度、症状、合併症、および優先順位などに応じて、一人ひとりに個別に行われる。

【0012】

コラーゲンをＥＢに利用しようとする様々な試みは、成功を収めていない。例えば、ＰＴＲ－０１コラーゲンとして知られる治験中の治療法は、劣性ジストロフィー性表皮水疱症の治療に組換えＶＩＩ型（ｒＣ７）を使用しようとしている。ｒＣ７は、患者に静脈内に送達され、欠陥のあるＶＩＩ型コラーゲンを、それが必要とされる部位で健康なコラーゲンと置き換える、潜在的な疾患修飾薬である。動物における前臨床研究では、組換えＶＩＩ型の有望な結果が示されているが、生体内での局所のｒＣ７ゲルは、無傷の皮膚には浸透しないため、開放病変にしか使用できない。さらに、ｒＣ７の静脈内投与（ＩＶ）はＥＢには適切であるとはみなされない。ｒＣ７の静脈内投与では、毒性問題を作り出すようである。

【0013】

この種のコラーゲンを使うことには、無数のデメリットがある。例えば、ヒトＣ７の精製された形態は、ヒトの皮膚、羊膜、ケラチノサイトまたは皮膚線維芽細胞などの皮膚細胞からごく少量しか抽出できない。しかしながら、このような供給源から、このようにして大量のＣ７を生成することはできない。さらに、組織工学において哺乳類のコラーゲン（ウシおよびブタ）を使用することは、病気やウイルス感染のかなりのリスクを伴い、哺乳類由来のコラーゲンの精製にはかなりの費用を伴うこともよく知られている。

【0014】

したがって、これらの欠点を克服する、ＥＢに対する効率的な治療法が必要とされている。

【0015】

驚くべきことに、本出願人は、海洋無脊椎動物由来のコラーゲン含有抽出物が上記の欠点を欠き、ＥＢ治療の機会を提供することを確認した。本発明は、海洋無脊椎動物コラーゲン含有抽出物が哺乳類由来または魚類由来コラーゲンと比較して物理化学的性質が大きく異なるにもかかわらず、加熱処理した海洋無脊椎動物コラーゲン含有抽出物を（哺乳類由来コラーゲン含有抽出物の加熱処理とは異なり）ＥＢ治療に有用な治療用遺伝子調節に使用できるという全く予期せぬ発見に基づくものである。具体的には、海洋無脊椎動物由来のコラーゲン含有抽出物を加熱処理することで、ＥＢにおいて欠陥のある主要遺伝子の発現をアップレギュレートすることができ、ＥＢに罹患した皮膚においてアンカータンパク質の発現が増加する。

【発明の概要】

【0016】

本発明の第一の態様において、表皮水疱症の治療に使用するためのコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物が提供される。

【0017】

海洋無脊椎動物とは、海洋生息地に生息する無脊椎動物を指す。海洋無脊椎動物は海洋の巨視的生物のほとんどを占め、多種多様なボディプランを有する。それらは３０以上の門に分類され、無腔類、環形動物（多毛類およびウミヒル）、腕足動物（上面と下面に硬い「弁」（殻）を有する海洋動物）、苔虫動物（コケ動物または海のマットとしても知られる）、歯顎動物（一般に矢虫として知られる）、頭索動物（現代の海洋ではナメクジウオに代表される）、刺胞動物（クラゲ、イソギンチャク、およびサンゴなど）、甲殻類（ロブスター、カニ、エビ、ザリガニ、フジツボ、ヤドカリ、シャコ、およびカイアシ類を含む）、有櫛動物（クシクラゲとして知られ、繊毛で泳ぐ最大の動物）、棘皮動物（ヒトデ、クモヒトデ、ウニ、タコノマクラ、ナマコ、ウミユリ、およびシャリンヒトデを含む）、ユムシ動物（ユムシ）、顎口虫類（沿岸の浅い水域の下の砂や泥に生息する透明な体を有する細長い糸状の虫）、腹毛動物（しばしば毛深い背中と呼ばれ、堆積物の粒子の間に主に間質的に見られる）、半索動物（腸鰓類を含む、群生しない、蠕虫の形をした生物）、曲形動物（比較的長い茎と固い触手の「王冠」を有するゴブレット型の固着性水生動物、内肛動物とも呼ばれる）、動吻動物（分節状で手足のない動物、あらゆる深さの泥や砂の中に広く分布し、マッドドラゴンとも呼ばれる）、胴甲動物（非常に小型から微視的な海洋堆積物に生息する動物）、軟体動物（貝類、イカ、タコ、ツブ貝、オウムガイ、コウイカ、ウミウシ、ホタテ貝、巻貝、無板目、尾腔綱、単板目、ヒザラガイ類、および掘足類を含む）、吸口虫類（ウミユリ（ｃｒｉｎｏｉｄｓ）または「ウミユリ類（ｓｅａ ｌｉｌｉｅｓ）」に寄生する小さな海洋虫）、紐形動物（「リボン虫」または「ヒモムシ」としても知られる）、直泳動物（最も単純な多細胞生物の一つ）、箒虫動物（触手冠（触手の「王冠」であり、柔らかい体を支えて保護するためにキチンの直立した管を構築する）で濾過摂食する海洋動物）、平板動物（直径約１ミリメートルで、構造が最も単純な小さくて平らな多細胞動物）、海綿動物（海綿、水を循環させる多くの細孔と水路を有する体を持つ多細胞生物）、鰓曳動物（海の泥に生息する海洋虫）、ウミグモ類（ウミグモとも呼ばれる）、星口動物（ピーナッツワームとも呼ばれ、左右対称で分節のない海洋虫のグループである）、尾索動物亜門（ホヤまたはシーポークとも呼ばれ、海の岩や海底上の同様の適切な表面に付着している濾過摂食動物）、渦虫類および単生類の一部の扁形動物、珍渦虫属（海洋虫のような種を２つだけ含む左右相称動物）、剣尾類（多数の絶滅系統とカブトガニ類の科の新しい４種のみを含む）カブトガニ）を含む。

【0018】

好ましくは、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は刺胞動物、より好ましくはクラゲ由来である。

【0019】

「刺胞動物」とは、イソギンチャクやサンゴなどのポリプや、クラゲなどのメデューサに代表される水生動物門を指す。ポリポイドまたはメデューソイド刺胞動物は、放射状または二放射状に対称的で、口という単一の身体開口部を有する無頭の動物である。

【0020】

「クラゲ」は、刺胞動物門の主要部分である水母亜門のゼラチン質成員のメデューサ期を指す。クラゲは主に自由遊泳する海洋性のゼラチン状の動物プランクトン性生物で、傘状のベルと尾を引く触手を持つが、一部は移動できず、茎で海底に固定されている。ベルは脈動することができ、推進力と高効率の運動を提供する。触手は刺細胞で武装されており、獲物の捕獲や捕食者からの防御に使われることがある。クラゲのライフサイクルは複雑で、通常、メデューサは有性期であり、プラヌラ幼生は広範囲に分散することができ、その後に定住性のポリプ期が続く。

【0021】

クラゲは、サイフォゾア綱からであってもよく、好ましくは、クラゲは、リゾストマス・プルモ、ロピレマ・エスクレンタム、ロピレマ・ノマディカ、ストモロフス・メレアグリス、アウレリア種、ネモピレマ・ノムライ、カシオペア・アンドロメダ、ネモピレマ・ノムライ、クリサオラ種、またはそれらの任意の組み合わせを含む群から選択される１つ以上である。

【0022】

樽クラゲとして通常知られる「リゾストマス・プルモ」は、リゾストマ科のサイフォメドゥーサを含む群から選択される１つ以上である。北東部と大西洋南部、アドリア海、地中海、黒海、およびアゾフ海に生息する。通常、直径は最大４０センチで、パラソルの大きさは１メートルにもなる大型の青いクラゲである。４本の腕があり、マニュビウムで８本の結合された腕に分かれている。傘の周りに触手を有しない。ムツ、ブリ、およびトラフグなどの小魚は、傘の下や腕の間に避難する。８本の腕の先端には共生藻である褐虫藻が共生しており、褐虫藻は住処と光と引き換えに餌を生産し、使われなかった余剰分はクラゲにより消費される。Ｒ．プルモコラーゲンは２本の鎖１αと２αから成り、ヘパリン結合部位が三重らせんの中ではなく、タンパク質の直鎖部分に位置するだろう。

【0023】

ビゼンクラゲである「ロピレマ・エスキュレンタム」は、太平洋の温帯海域に生息するクラゲの一種である。ロピレマ・エスクレンタムのメデューサ・ステージには、他の根口くらげ目の成員同様、ベルの縁に触手がない。その代わり、ベルの下には高度に枝分かれした８本の口腕があり、それらは基部で融合し、多数の二次口が開いている。

【0024】

「ロピレマ・ノマディカ」はインド洋と太平洋の熱帯暖海に生息するクラゲである。胴部は水色で、ベルは丸みを帯びている。体重は１０ｋｇまで成長し、ベルの直径は一般的に４０～６０ｃｍだが、最大９０ｃｍになることもある。

【0025】

「スモロフス・メレアグリス」、またはキャノンボールクラゲは、アメリカ南東部とメキシコ湾岸に最も多く生息している。高さ１２．７ｃｍ、幅１８．０ｃｍの小型クラゲである。このクラゲには、通常の触手の代わりに、１６本の短い叉状の融合口腕がある。ストモロフス・メレアグリスには粘液で覆われた二次的な口ヒダ（肩甲骨）もあり、これは小さな獲物を捕らえるためと考えられている。

【0026】

「オーレリア種」またはオーレリアオーリタは、オーレリア属の広く研究されている種である。このクラゲは半透明で、通常直径約２５～４０ｃｍ（１０～１６インチ）、ベルの上部を通して容易に見える４つの馬蹄形の生殖腺で見分けることができる。触手でメデューサ、プランクトン、および軟体動物などを集め、体内に取り込んで消化する。限られた動きしかできず、泳いでいても流れに流される。

【0027】

「ネモピレマ・ノムライ」は、日本海に生息する２ｍおよび２２０ｋｇに達する巨大クラゲである。体色は半透明の青みがかった色で、下にある触手は若い個体では黄色がかっており、成長すると茶色がかった個体となる。

【0028】

「カシオペア・アンドロメダ」は、逆さクラゲと呼ばれる多くの刺胞動物の一種である。通常、潮間帯の砂地や干潟、浅いラグーン、およびマングローブ周辺に生息する。イソギンチャクと間違われることも多いこのクラゲは、通常口を上に向けている。黄褐色のベルには白や淡い筋や斑点があり、呼吸し、餌を集めるために腕に水を通し、脈動する。

【0029】

より好ましくは、当該クラゲはリゾストマス・プルモである。

【0030】

コラーゲンは動物体の細胞外マトリックスに最も豊富なタンパク質のひとつである。すべてのコラーゲン分子の中心的な特徴は、硬い三本鎖らせん構造である。Ｉ型とＩＩＩ型は結合組織に見られるコラーゲンの主なタイプで、全コラーゲンの９０％を占める。コラーゲンは機械的強度の役割のほかに、シグナル伝達分子としても機能し、細胞の移動、分化（Ｂｏｓｎａｋｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ，２００５．Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．，３１９（２）：２４３－５３）および増殖（Ｐｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ，１９９８．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４２（２）：５８７－９４）を制御し、ならびに止血において機能する（Ｆａｒｎｄａｌｅ ｅｔ ａｌ，２００４．Ｊ． Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，２（４）：５６１－７３）。

【0031】

好ましくは、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、単純性表皮水疱症（ＥＢＳ）、接合型表皮水疱症（ＪＥＢ）、ジストロフィー性表皮水疱症（ＤＥＢ）、後天性表皮水疱症（ＥＢＡ）、および／またはキンドラー症候群（ＫＳ）の治療に使用するためのものである。

【0032】

好ましくは、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、ジストロフィー性表皮水疱症（ＤＥＢ）の治療に使用するためのものである。

【0033】

一実施形態において、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は：
（ａ）ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＡ５、ＫＲＴ５遺伝子の活性化を介して、真皮の凝集力向上と細胞の基底層構造化を支援する、
（ｂ）ＭＭＰ－３活性をダウンレギュレートし、重症ＲＤＥＢの治療効果を改善する、
（ｃ）ＦＮ１遺伝子の活性化を介して、細胞接着、成長、移動、および分化の改善を支援する、
（ｄ）ＣＯＬ３Ａ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＳＰＡＲＣ、およびＬＵＭ遺伝子の活性化を介して、細胞外マトリックスの合成、コラーゲン線維の組織化、および構造化を促進する；
（ｅ）ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＡ５、およびＣＤＣ４２遺伝子の活性化を介して、真皮の凝集力向上と細胞の基底層構造化を支援する、
（ｆ）上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＳＩＲＴ４、およびＳＩＲＴ６の活性化を介して、真皮の再生と保護を支援する、
（ｇ）遺伝子ＥＰＰＫおよびＬＯＲの活性化を介して、真皮細胞接合構造の改善を支援する、および／または
（ｈ）ＥＢの水疱形成に関与するＭＭＰ３の活性化を抑制することにより、細胞外マトリックス構造の改善を支援する。

【0034】

「細胞外マトリックス」とは、コラーゲン、酵素、および糖タンパク質などの細胞外高分子の三次元ネットワークを指し、周囲の細胞を構造的および生化学的に支援する（Ｔｈｅｏｃｈａｒｉｓ ＡＤ ｅｔ ａｌ．２０１６．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，９７：４－２７）。２０１６．Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，９７：４－２７）．ＥＣＭの組成は多細胞構造によって異なる。しかしながら、細胞接着、細胞間通信、および分化は、ＥＣＭの共通の機能である（Ａｂｅｄｉｎ ａｎｄ Ｋｉｎｇ．２０１０．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２０（１２）：７３４－４２）。

【0035】

一実施形態において、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、遺伝子ＣＯＬ７Ａ１、ＣＯＬ１７Ａ１、ＤＳＰ、ＩＴＧＡ６、ＩＴＧＢ４、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、ＬＯＸ、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＦＮ１、およびＫＲＴ５の活性化を介して、改善された真皮－表皮接合部（ＤＥＪ）の凝集および細胞の基底層構造化を支援するために使用するためのものである。さらに、当該加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物は、遺伝子ＭＭＰ３の発現を低下させる。

【0036】

「真皮－表皮接合部」とは、表皮の基底層ケラチノサイトと真皮の間の界面を指し、皮膚が剪断力に抵抗するのを助ける。ＤＥＪは、ヘミデスモソーム、アンカーフィラメント、アンカーフィブリル、ＶＩＩ型コラーゲンから構成され、これらが結合して真皮と表皮を結びつけている。

【0037】

「活性化」とは、本発明によるコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物が、目的の遺伝子の転写および／またはそのような遺伝子によってコード化されるタンパク質の発現を刺激することを意味する。

【0038】

ＣＤＣ４２遺伝子は、Ｒｈｏサブファミリーの低分子量ＧＴＰａｓｅタンパク質をコード化しており、これは細胞形態、移動、エンドサイトーシス、細胞周期進行を含む多様な細胞機能を規制するシグナル伝達経路を制御している。このタンパク質は酵母のｃｄｃ４２－１変異体を補完することができる。がん遺伝子Ｄｂｌの産物は、このタンパク質からのＧＤＰの解離を特異的に触媒することが報告された。このタンパク質は、神経性ウィスコット－アルドリッチ症候群タンパク質（Ｎ－ＷＡＳＰ）と直接結合することでアクチン重合を制御し得、それに続いてＡｒｐ２／３複合体を活性化する。この遺伝子の選択的スプライシングにより、複数の転写バリアントが生じる。この遺伝子の偽遺伝子が３、４、５、７、８、および２０番染色体に同定されている。

【0039】

ＣＯＬ３Ａ１はＩＩＩ型コラーゲンをコード化する遺伝子であり、ＩＩＩ型コラーゲンは肉芽組織のコラーゲンであり、より丈夫なＩ型コラーゲンが合成される前に、若い線維芽細胞によって速やかに産生される。またＩＩＩ型コラーゲンは、網状線維、動脈壁、皮膚、腸、および子宮にも存在する。

【0040】

ＣＯＬ７Ａ１遺伝子は、ＶＩＩ型コラーゲンを組み立てるために使用されるタンパク質を作るための命令を提供する。ＶＩＩ型コラーゲンは、皮膚を強化し、安定させるために不可欠な役割を果たす。ＣＯＬ７Ａ１遺伝子から産生されるタンパク質はプロα１（ＶＩＩ）鎖と呼ばれ、ＶＩＩ型コラーゲンの成分である。３本のプロα１（ＶＩＩ）鎖が撚り合わさり、プロコラーゲンとして知られる３本鎖のロープ状分子を形成する。プロコラーゲン分子は細胞から分泌され、酵素によって処理され、末端から余分なタンパク質セグメントが取り除かれる。これらの分子が処理されると、成熟したＶＩＩ型コラーゲンの細長い束に配置される。ＶＩＩ型コラーゲンは、アンカーフィブリルと呼ばれる皮膚の構造物の主要成分である。これらのフィブリルは、表皮基底膜部として知られる領域で見られ、これは、表皮と呼ばれる皮膚の最上層と真皮と呼ばれる下層の間に位置する２層の膜である。アンカーフィブリルは、表皮基底膜と真皮をつなぐことによって、皮膚の２つの層をつなぎ合わせている。

【0041】

ＣＯＬ１７Ａ１遺伝子は、ＸＶＩＩ型コラーゲンを組み立てるために使用されるタンパク質を作るための命令を提供する。ＸＶＩＩ型コラーゲンは膜貫通タンパク質であり、表皮の接着に関与する細胞内と細胞外の構造要素間の連結を維持するのに重要な役割を果たす。ＣＯＬ１７Ａ１はこの遺伝子の正式名称である。これはＸＶＩＩ型コラーゲンのα鎖をコード化する。コラーゲンＸＶＩＩは、コラーゲンＸＩＩＩ、ＸＸＩＩＩ、およびＸＸＶと同様に膜貫通タンパク質である。コラーゲンＸＶＩＩは、ケラチノサイトの下の膜への接着を仲介する真皮－表皮基底膜部の多タンパク質複合体であるヘミデスモソームの構造成分である。また、コラーゲンＸＶＩＩは、角膜上皮の完全性を維持する上で重要なタンパク質でもあるようである。この遺伝子の変異は、全般萎縮性良性表皮水疱症や接合型表皮水疱症、再発性角膜びらんと関連しており、この遺伝子の発現は様々な癌で異常である。

【0042】

ＤＳＰ遺伝子はデスモプラキンの集合体をコード化する。デスモプラキンは、心筋細胞や表皮細胞におけるデスモソーム構造の重要な成分であり、隣接する細胞の接する点で構造的完全性を維持するために機能する。

【0043】

上皮成長因子（ＥＧＦ）遺伝子は、上皮成長因子スーパーファミリーのメンバーをコード化する。コード化されたプレプロテインはタンパク質分解され、５３アミノ酸の上皮成長因子ペプチドを生成する。このタンパク質は強力な分裂促進因子として働き、多くのタイプの細胞の成長、増殖、分化に重要な役割を果たす。このタンパク質は、細胞表面の受容体である上皮成長因子受容体に高い親和性で結合することによって作用する。選択的スプライシングの結果、複数の転写バリアントが生じ、そのうちの少なくとも１つはタンパク質分解的に処理されるプレプロタンパク質をコード化する。

【0044】

ＥＰＰＫまたはＫＲＴ９遺伝子はＩ型ケラチン９をコード化し、Ｉ型ケラチン９は、手のひらと足底の末端に分化した表皮にのみ発現する中間フィラメント鎖である。

【0045】

ＦＢＮ１はフィブリリン１をコード化する遺伝子であり、フィブリリン１は、真皮の細胞外マトリックスのミクロフィブリルの主要成分であり、弾性線維の形成に関与している。フィブリリン１はまた、異なるサイトカインや成長因子の制御にも関与し、弾性結合組織と非弾性結合組織の両方に存在する。

【0046】

ＦＢＮ２はフィブリリン－２をコード化する遺伝子であり、フィブリリン－２は、細胞外マトリックスに輸送される。細胞外マトリックスにおいて、フィブリリン－２は他のタンパク質に結合してミクロフィブリルと呼ばれる糸状のフィラメントを形成する。ミクロフィブリルは弾性繊維の一部となり、皮膚、靭帯、および血管の伸縮を可能にする。研究者らは、フィブリリン－２が胚発生の過程で弾性線維の組み立てを誘導する役割を担っていることを示唆している。ミクロフィブリルはまた、目のレンズ、神経、および筋肉を支えるより硬い組織にも貢献している。さらに、ミクロフィブリルはトランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ－β）タンパク質と呼ばれるある特定の増殖因子を保持し、不活性な状態を保っている。ミクロフィブリルから放出された時にＴＧＦ－β増殖因子は活性化され、全身の組織の成長と修復に影響を与える。

【0047】

ＦＮ１はフィブロネクチン１をコード化する。フィブロネクチンは創傷治癒に重要な細胞外マトリックスタンパク質である。

【0048】

ＩＴＧＡ６遺伝子はＩＴＧＡ６タンパク質産物の組み立てをコード化する。インテグリンはα鎖とβ鎖を構成する細胞表面タンパク質である。所定の鎖が複数のパートナーと結合して、異なるインテグリンになることもある。例えば、α６はＴＳＰ１８０と呼ばれるインテグリンではβ４と、インテグリンＶＬＡ－６ではβ１と結合する。インテグリンは細胞接着だけでなく、細胞表面を介したシグナル伝達にも関与することが知られている。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコード化する２つの転写変異体が見つかっている。腸上皮におけるこのインテグリン鎖の特異的欠損、ひいてはヘミデスモソームの欠損は、長期にわたる大腸炎と浸潤性腺癌を誘発する。

【0049】

ＩＴＧＢ４遺伝子は産物のＩＴＧＢ４タンパク質サブユニットをコード化する。インテグリンはαサブユニットとβサブユニットで構成されるヘテロ二量体であり、非共有結合的に結合した膜貫通型糖タンパク質受容体である。αポリペプチドとβポリペプチドの異なる組み合わせは、リガンド結合特異性が異なる複合体を形成する。インテグリンは細胞－マトリックス間や細胞－細胞間の接着を仲介し、遺伝子発現や細胞増殖を制御するシグナルを伝達する。この遺伝子は、ラミニンの受容体であるインテグリンβ４サブユニットをコード化する。このサブユニットはα６サブユニットと会合する傾向があり、浸潤癌の生物学において極めて重要な役割を果たしていると考えられる。この遺伝子の変異は幽門閉鎖を伴う表皮水疱症と関連する。この遺伝子には、異なるアイソフォームをコード化する複数の選択的スプライシング転写変異体が見つかっている。

【0050】

ＫＲＴ５遺伝子はケラチン－５タンパク質をコード化する。このタンパク質はケラチン１４と二量体化し、基底上皮細胞の細胞骨格を構成する中間フィラメント（ＩＦ）を形成する。このタンパク質は、単純性表皮水疱症、乳がん、および肺がんなど、いくつかの病気に関与している。

【0051】

ＬＡＭＡ５遺伝子は脊椎動物のラミニンα鎖の１つをコード化する。ラミニンは細胞外マトリックス糖タンパク質のファミリーであり、基底膜の主要な非コラーゲン含有構成成分である。これらは細胞接着、分化、移動、シグナル伝達、神経突起伸長、および転移を含むさまざまな生物学的プロセスに関係があるとされている。ラミニンは、ラミニンα、β、およびγ（それぞれ旧Ａ、Ｂ１、およびＢ２）の３本の同一でない鎖からなり、それぞれ異なる鎖で形成された３本の短腕と、３本すべての鎖からなる長腕から成る十字形構造を形成する。それぞれのラミニン鎖は、異なる遺伝子によってコード化されるマルチドメインタンパク質である。この遺伝子によってコード化されるタンパク質は、ラミニン－１０（ラミニン－５１１）、ラミニン－１１（ラミニン－５２１）、およびラミニン－１５（ラミニン－５２３）のα－５サブユニットである。

【0052】

ＬＯＲ遺伝子は、終末分化した表皮細胞に見られる角化細胞被膜の主要なタンパク質成分であるロリクリンをコード化する。

【0053】

ＬＯＸ遺伝子はリシルオキシダーゼをコード化する。ＬＯＸ酵素は、コラーゲンとエラスチンを架橋することにより、動物の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）のリモデリングに重要である。

【0054】

ＬＵＭはルミカンをコード化する遺伝子であり、小ロイシンリッチプロテオグリカン（ＳＬＲＰ）ファミリーの細胞外マトリックスタンパク質である。このタンパク質は角膜の主要なケラタン硫酸プロテオグリカンであるが、体中のほとんどの間葉系組織に遍在している。ルミカンは、コラーゲンフィブリルの組織化と円周方向の成長、角膜の透明性、および上皮細胞の移動と組織修復に関与している。角膜の透明性は、コラーゲン線維がフィブリル内空間のルミカン（およびケラトカン）によって正確に整列されることによって可能になる。

【0055】

ＭＭＰ３はストロメライシン－１をコード化する遺伝子であり、マトリックスメタロプロテアーゼ－３としても知られている。マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）ファミリーのタンパク質は、胚発生、生殖、および組織リモデリングなどの正常な生理的過程や、関節炎および転移などの疾患過程における細胞外マトリックスの分解に関与している。ほとんどのＭＭＰは不活性プロタンパク質として分泌され、細胞外プロテイナーゼによって切断されると活性化される。ストロメライシン－１はフィブロネクチン、ラミニン、コラーゲンＩＩＩ、ＩＶ、ＩＸ、およびＸ、および軟骨プロテオグリカンを分解する。

【0056】

ＳＩＲＴ４遺伝子はサーチュインファミリーのタンパク質をコード化する。サーチュインファミリーのメンバーはサーチュインコアドメインによって特徴付けられ、４つのクラスに分類される。ヒトのサーチュインは、モノＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性を有する細胞内制御タンパク質として機能している可能性があることが、研究によって示唆されている。この遺伝子によってコード化されるタンパク質は、サーチュインファミリーのクラスＩＶに含まれる。

【0057】

ＳＩＲＴ６遺伝子は、細胞ストレス抵抗性、ゲノムの安定性、老化、およびエネルギー恒常性に関係しているＮＡＤ依存性酵素であるサーチュインファミリーのメンバーをコード化する。コード化されたタンパク質は核に局在し、ＡＤＰリボシルトランスフェラーゼ活性とヒストン脱アセチル化酵素活性を示し、ＤＮＡ修復、テロメアクロマチンの維持、炎症、脂質代謝、およびグルコース代謝において役割を果たす。選択的スプライシングにより、異なるアイソフォームをコード化する複数の転写バリアントが生じる。

【0058】

ＳＰＡＲＣはオステオネクチンまたは「システインリッチ酸性マトリックス関連タンパク質」をコード化する遺伝子である。このタンパク質は骨のコラーゲンが石灰化するのに必要だが、細胞外マトリックスの合成や細胞の形状変化の促進にも関与している。この遺伝子産物は腫瘍抑制と関連しているが、腫瘍細胞の浸潤を促進する細胞形状の変化に基づく転移とも相関している。この遺伝子には異なるアイソフォームをコード化する３つの転写変異体が見つかっている。

【0059】

ＴＮＦα遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する多機能性炎症性サイトカインをコード化する。このサイトカインは主にマクロファージによって分泌される。これは、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＢＲに結合することができ、したがって、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＢＲを介して機能する。このサイトカインは、細胞増殖、分化、アポトーシス、脂質代謝、および凝固など、幅広い生物学的プロセスの制御に関与している。

【0060】

「真皮」とは、皮膚を構成する２つの主要な細胞層のうち、下層または内側の層である。「真皮」またはコリウムは、表皮（これとともに皮膚組織を構成する）と皮下組織の間にある皮膚の層であり、主に高密度の不規則な結合組織からなり、ストレスや緊張から身体を守るクッションとなる。真皮は、乳頭部と呼ばれる表皮に隣接した表層部と、網状真皮として知られる深部の厚い部の２層に分かれている。真皮は基底膜を介して表皮としっかりとつながっている。真皮の構造成分は、コラーゲン、弾性線維、および線維外マトリックスである（Ｐｅｎｇｆｅｉ Ｌｕ ｅｔ．ａｌ．，２０１１．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ．Ｄｅｃ；３（１２））。それはまた、触覚を司る機械受容器と熱覚を司る熱受容器を含む。さらに、毛包、汗腺、皮脂腺（油腺）、アポクリン腺、リンパ管、神経、および血管が真皮に存在する。これらの血管は、真皮細胞と表皮細胞の両方に栄養と老廃物の除去を提供する。

【0061】

「基底層」または基底層は、表皮の５つの層のうち最も深い層である。これは柱状または立方体の細胞の単層である。細胞はデスモソームとヘミデスモソームによって互いに、またその上の有棘層細胞と接着している。核は大きく、卵形で、および細胞の大部分を占める。基底細胞の中には、分裂して新しい細胞を作り出す能力を有する幹細胞のように働くものもあれば、表皮無毛の皮膚（無毛）、増殖亢進表皮（皮膚疾患による）を固定する役割のあるものもある。（ＭｃＧｒａｔｈ ＪＡ ｅｔ ａｌ．（２００４）．Ｒｏｏｋ’ｓ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ（７ｔｈ ｅｄ．）．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ．ｐ．４１９０．）。

【0062】

「細胞接合構造」は、隣接する細胞間、あるいは細胞と細胞外マトリックスとの接触を提供する多タンパク質複合体から成る。それらはまた、上皮の細胞間バリアを構築し、細胞間輸送を規制する。それらは特に上皮組織に多く存在する。

【0063】

「炎症」とは、病原体、損傷した細胞、刺激物などの有害な刺激に対する身体組織の複雑な生物学的反応の一部であり、免疫細胞、血管、および分子メディエーターが関与する防御反応である。炎症の機能は、細胞傷害の最初の原因を除去し、壊死細胞や、最初の傷害と炎症過程で傷ついた組織を除去し、組織の修復を開始することである。

【0064】

「敏感肌」とは、肌がかゆみや刺激を感じやすい肌の状態を指す。

【0065】

ＴＮＦα遺伝子は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）スーパーファミリーに属する多機能性炎症性サイトカインをコード化する。このサイトカインは主にマクロファージによって分泌される。ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＢＲに結合することができ、したがって、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＢＲを介して機能する。このサイトカインは、細胞増殖、分化、アポトーシス、脂質代謝、および凝固など、幅広い生物学的プロセスの制御に関与している。

【0066】

一実施形態において、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、加水分解物の形態のコラーゲンを含む。

【0067】

「加水分解物の形態」とは、水分子が１つ以上の化学結合を切断する化学反応（すなわち加水分解）から生じる生成物を指す。この用語は、水を求核剤とする置換反応、脱離反応、およびフラグメンテーション反応を指す。

【0068】

コラーゲン含有抽出物およびその中のコラーゲンの加水分解は、タンパク質分解酵素の作用を通してまたは加熱処理によってなど、当技術分野で公知の任意の方法を用いて実施することができる。好ましくは、加水分解物の形態のコラーゲンは、コラーゲン含有抽出物の熱処理によって製造される。

【0069】

一実施形態では、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、溶液、粉末、微粉化粉末、スポンジマトリックス、ナノファイバー電気紡糸マトリックス、ヒドロゲル、または凍結乾燥形態の形態である。

【0070】

「スポンジマトリックス」とは、柔らかく、柔軟性が高く、多孔質で、親水性のマトリックスのことで、合成および／または天然の異なるポリマーのブレンドで構成され、高い柔軟性と吸収能力を有する。このようなスポンジは、本発明の抽出物を吸収し、接触によって人の皮膚表面で放出するために使用することができる。

【0071】

「ナノファイバー電気紡糸マトリックス」とは、数百ナノメートルの繊維径までのポリマー溶液またはポリマー溶融物の糸でできたマトリックスを指す。このようなマトリックスは、生物学的標的の治療や置換のために細胞や薬物物質を浸透させることができるため、医療目的に有用である。例えば、ナノファイバー創傷被覆材は、創傷の微生物感染を防ぐ優れた能力を持つ。

【0072】

「ハイドロゲル」とは、ポリマーの絡み合いおよび／または共有結合架橋によって解離が防止された可溶性コラーゲン繊維のネットワークを指す。このようなポリマー鎖は親水性であるため、高吸収素材となる。ハイドロゲルはコロイド懸濁液から形成することもできる。ハイドロゲルの物理的性質は、製造ルートによって調整することができる。

【0073】

「凍結乾燥」とは、凍結させるステップと、その後に物質を真空下に置くステップによって、物質から水分が除去されていることを示す。

【0074】

好ましくは、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、溶液、粉末、微粉化粉末、スポンジマトリックス、ナノファイバー電気紡糸マトリックス、ヒドロゲル、または凍結乾燥形態の形態である。

【0075】

一実施形態において、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、好ましくは、多血小板血漿（ＰＲＰ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－Ｂ、ＴＧＦ－Ｂ２、ＴＧＦ－Ｂ３）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、顆粒球－単球コロニー刺激増殖因子、血小板由来増殖因子、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ１）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、および／または血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）から選択される少なくとも１つの成長因子、および／または、好ましくはナノ銀（ｎａｎｏ ｓｉｌｖｅｒ）、ペニシリン、オフロキサシン、テトラサイクリン、アミノグリコシドおよびエリスロマイシン、フルクロキサシリン、クラリスロマイシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、コアモキシクラブ、（ペニシリン中の）コトリモキサゾール、セフトリアキソン、タゾバクタム含有ピペラシリン、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、リネゾリド、および／または標準治療抗菌薬、またはそれらの組み合わせから選択される少なくとも１つの抗菌化合物と組み合わせて投与される。

【0076】

一実施形態において、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、１回あたり０．０１ｇ／Ｌ～２００ｇ／Ｌ、好ましくは１回あたり１ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１回あたり１ｇ／Ｌ～２０ｇ／Ｌの用量で投与される。他の実施形態において、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物は、２ｇ／Ｌ～１７５ｇ／Ｌ、３ｇ／Ｌ～１５０ｇ／Ｌ、４ｇ／Ｌ～１２５ｇ／Ｌ、５ｇ／Ｌ～１００ｇ／Ｌ、６ｇ／Ｌ～９０ｇ／Ｌ、７ｇ／Ｌ～８０ｇ／Ｌ、８ｇ／Ｌ～７０ｇ／Ｌ、９ｇ／Ｌ～６０ｇ／Ｌ、１０ｇ／Ｌ～５０ｇ／Ｌ、１１ｇ／Ｌ～４５ｇ／Ｌ、１２ｇ／Ｌ～４０ｇ／Ｌ、１３ｇ／Ｌ～３５ｇ／Ｌ、１４ｇ／Ｌ～３０ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ～２９ｇ／Ｌ、１６ｇ／Ｌ～２８ｇ／Ｌ、１７ｇ／Ｌ～２７ｇ／Ｌ、１８ｇ／Ｌ～２６ｇ／Ｌ、または１９ｇ／Ｌ～２５ｇ／Ｌの用量で投与される。

【0077】

第二の態様において、本発明によるコラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物を含む医薬組成物が提供される。

【0078】

一実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される化合物をさらに含む。

【0079】

好ましくは、当該薬学的に許容される化合物は、成長因子、抗菌剤、抗生物質、抗炎症剤、および／または別の表皮水疱症治療剤からなる群から選択される１つ以上である。

【0080】

「成長因子」とは、細胞の成長、増殖、治癒、細胞分化を刺激することができる天然に存在する物質である。

【0081】

「抗菌剤」とは、微生物を死滅させたり、その増殖を防いだりする薬剤である。抗菌薬は主に作用する微生物によって分類することができる。例えば、「抗生物質」は細菌に対して使用され、抗真菌薬は真菌に対して使用される。

【0082】

「抗炎症剤」とは、炎症および／または腫れを低減させる性質を有する物質である。抗炎症剤の例としては、ステロイド系抗炎症剤（コルチコステロイドなど）および非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤなど）が挙げられる。

【0083】

「その他の表皮水疱症治療剤」とは、表皮水疱症の症状または影響の予防または治療に有効な、あらゆるタイプのその他の化合物を指す。

【0084】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの成長因子をさらに含む。好ましい実施形態において、少なくとも成長因子は、血小板豊富血漿（ＰＲＰ）、上皮成長因子３８（ＥＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子－β（ＴＧＦ－Ｂ、ＴＧＦ－Ｂ２、ＴＧＦ－Ｂ３）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、顆粒球－単球コロニー刺激成長因子、血小板由来成長因子、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、および／または血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、またはそれらの任意の組み合わせである。

【0085】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの抗菌剤をさらに含む。好ましい実施形態において、少なくとも１つの抗菌剤は、ナノ銀、ペニシリン、オフロキサシン、テトラサイクリン、アミノグリコシドおよびエリスロマイシン、フルクロキサシリン、クラリスロマイシン、ドキシサイクリン、ゲンタマイシン、メトロニダゾール、コアモキシクラブ、（ペニシリン中の）コトリモキサゾール、セフトリアキソン、タゾバクタム含有ピペラシリン、クリンダマイシン、シプロフロキサシン、バンコマイシン、テイコプラニン、リネゾリド、および／または標準治療抗菌薬、またはそれらの組み合わせである。

【0086】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの抗炎症剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの抗炎症剤は、コルチコステロイドなどのステロイド系抗炎症剤、またはアスピリンサルサレート、ジフルニサル、イブプロフェン、ケトプロフェン、ナブメトン、ピロキシカム、ナプロキセン、ジクロフェナク、インドメタシン、またはスリンダクなどの非ステロイド系抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）であり得る。

【0087】

一実施形態において、当該医薬組成物は、局所適用に通常使用される任意の形態、好ましくは、微粉化粉末、クリーム、軟膏、マスク、美容液、ミルク、ローション、ペースト、フォーム、エアゾール、スティック、シャンプー、コンディショナー、パッチ、ヒドロアルコール性または油性水溶液、水中油型または油中水型または多重エマルション、水性または油性ゲル、液状、ペースト状または固体の無水製品、電気紡糸コラーゲンナノファイバーマトリックス、膜および／または球状体を使用した水相中の油分散体で製剤化され、これらの球状体は、ナノスフェア、ナノカプセルなどの高分子ナノ粒子、またはイオン性タイプおよび／または非イオン性タイプの脂質小胞であり、より好ましくは、電気紡糸コラーゲンナノファイバーマトリックスおよび／または膜である。

【0088】

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤および／または担体を含む。適切な薬学的に許容される賦形剤および担体の例としては、滅菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール；フルクトース、グルコースおよびガラクトースのような単糖；スクロース、ラクトース、およびトレハロースのような非還元性二糖；ラフィノースおよびメレジトースなどの非還元性オリゴ糖；マルトデキストリン、デキストラン、およびシクロデキストリンなどの非還元性デンプン由来多糖；およびマンニトールおよびキシリトールなどの非還元性アルジトールが挙げられる。さらに適切な賦形剤としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンなどのセルロース調製剤、ゼラチン、トラガントガム、および／またはポリビニルピロリドンが挙げられる。

【0089】

第３の態様では、以下のステップを含む、コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物の製造方法が提供される：
（ａ）海洋無脊椎動物可溶性コラーゲンを４０℃～１００℃で１０分～１２０分、好ましくは６０℃～８０℃で４５分～９０分加熱し、物質を加水分解すること、
（ｂ）前記加水分解物を回収すること。

【0090】

コラーゲン含有海洋無脊椎動物抽出物の製造方法のいくつかの実施形態において、ステップ（ａ）は、プロテアーゼ酵素の添加を含む。

【0091】

プロテアーゼまたはペプチダーゼは、タンパク質やポリペプチドに存在するペプチド結合の加水分解を触媒する酵素である。プロテアーゼは、ポリペプチド鎖上の作用部位によって、エキソペプチダーゼおよびエンドペプチダーゼの２つのグループに分けられる。エキソペプチダーゼはポリペプチド鎖の末端に作用し、エンドペプチダーゼはポリペプチド鎖の内側にランダムに作用する（Ｒａｖｅｅｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ．２０１８．Ｆｏｏｄ Ｔｅｃｈｎｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，５６（１）：１６－３０．）。好ましくは、本発明によるプロテアーゼは、コラーゲンを加水分解することができ、例えば、ペプシン、マトリックスメタロペプチダーゼ、パパイン、および／またはプロコラーゲンペプチダーゼである。より好ましくは、当該プロテアーゼはペプシンまたはペプシンホモログである。

【0092】

本発明のコラーゲン含有海洋無脊椎動物エキスの製造方法は、ステップ（ｂ）の前で、ステップ（ａ）の後に、得られた物質を精製することをさらに含むことができる。好ましい実施形態において、材料は膜ろ過またはクロマトグラフィー精製によって精製される。

【0093】

海洋無脊椎動物の解剖学的環境からコラーゲン物質を「単離」または「精製」する方法は複数あり、そのような方法は当業者によく知られている。例えば、クラゲの異なる解剖学的部位を酸性溶液に浸す酸抽出によって、クラゲからコラーゲン物質を精製することができる。「浸す」または「浸される」とは、コラーゲン物質を遊離させるために、クラゲを酸溶液の中で十分な時間インキュベートするプロセスを指す。コラーゲン物質を精製するための代替的な方法として、酵素抽出があり、この方法によって、コラーゲン物質を遊離させるために、クラゲを少なくとも１つのタンパク質分解酵素と十分な時間、解剖学的環境の分解を促進する条件下でインキュベートする。酵素抽出法の正確な温度、ｐＨ、およびインキュベーション時間は、使用するタンパク質分解酵素によって異なる。最も適した条件は、当業者にはよく知られているだろう。非限定的な例として、酵素ペプシンを酸性条件下でクラゲ材料とインキュベートし、コラーゲン物質を遊離させることができる。

【図面の簡単な説明】

【0094】

【図1】ロリクリンの免疫標識の結果を示す。（Ａ）は一次抗体を含まない陰性対照の結果を示す。（Ｂ）は、０日目（Ｊ０）の対照バッチを示す。（Ｃ）は、８日目（Ｊ８）の対照バッチを示す。（Ｄ）は、８日目（Ｊ８）のＰ１バッチを示す。（Ｅ）は、８日目（Ｊ８）のＰ２バッチを示す。

【図2】ＳＩＲＴ－４の免疫標識の結果を示す。（Ａ）は一次抗体を含まない陰性対照の結果を示す。（Ｂ）は、０日目（Ｊ０）の対照バッチを示す。（Ｃ）は、８日目（Ｊ８）の対照バッチを示す。（Ｄ）は、８日目（Ｊ８）のＰ１バッチを示す。（Ｅ）は、８日目（Ｊ８）のＰ２バッチを示す。

【図3】ＳＩＲＴ－６の免疫標識の結果を示す。（Ａ）は一次抗体を含まない陰性対照の結果を示す。（Ｂ）は、０日目（Ｊ０）の対照バッチを示す。（Ｃ）は、８日目（Ｊ８）の対照バッチを示す。（Ｄ）は、８日目（Ｊ８）のＰ１バッチを示す。（Ｅ）は、８日目（Ｊ８）のＰ２バッチを示す。

【図4】コラーゲンＶＩＩの免疫標識の結果を示す。（Ａ）は一次抗体を含まない陰性対照の結果を示す。（Ｂ）は、０日目（Ｊ０）の対照バッチを示す。（Ｃ）は、８日目（Ｊ８）の対照バッチを示す。（Ｄ）は、８日目（Ｊ８）のＰ１バッチを示す。（Ｅ）は、８日目（Ｊ８）のＰ２バッチを示す。

【図5】コラーゲンＩＩＩの免疫標識の結果を示す。（Ａ）は一次抗体を含まない陰性対照の結果を示す。（Ｂ）は、０日目（Ｊ０）の対照バッチを示す。（Ｃ）は、８日目（Ｊ８）の対照バッチを示す。（Ｄ）は、８日目（Ｊ８）のＰ１バッチを示す。（Ｅ）は、８日目（Ｊ８）のＰ２バッチを示す。

【図6】コラーゲンＶの免疫標識の結果を示す。（Ａ）は一次抗体を含まない陰性対照の結果を示す。（Ｂ）は、０日目（Ｊ０）の対照バッチを示す。（Ｃ）は、８日目（Ｊ８）の対照バッチを示す。（Ｄ）は、８日目（Ｊ８）のＰ１バッチを示す。（Ｅ）は、８日目（Ｊ８）のＰ２バッチを示す。

【図7】コラーゲン含有クラゲ抽出物中のタンパク質のサイズ分布に対する熱処理の効果を表示する代表的なＳＤＳ ＰＡＧＥ画像（３～８％酢酸トリスゲル）を示す。レーン１：分子量マーカー、レーン２～４：天然のコラーゲン性クラゲ抽出物、レーン５：空、レーン６～８：加熱処理したコラーゲンクラゲ抽出物。

【図8A】健康なヒト皮膚外植片を熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理した結果を示す。熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物処理有り、および無しのコラーゲン７を染色した外植片スライスの代表的な免疫蛍光像である。

【図8B】健康なヒト皮膚外植片を熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理した結果を示す。未処理および処理した外植片スライス（ｎ＝１０）におけるコラーゲン７染色面積の平均パーセンテージを示すグラフである。コラーゲン７の染色面積のパーセンテージは、未処理の対照（１００％）に対して正規化し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。

【図9】半定量的ＲＴ－ＰＣＲ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ）により決定された、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理した後の健康なヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）におけるＣＯＬ７遺伝子発現を示す。処理したＮＨＥＫ（ｎ＝３）におけるＣＯＬ７ ｍＲＮＡの平均発現レベルを、未処理の対照細胞（１．０）に対する相対値で示し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。

【図10】実施例１０に記載の分析に従って、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物処理の有り、および無しのコラーゲン７について染色した外植片スライスの代表的な画像免疫蛍光像を示す。ラミニン５およびケラチン５を染色した外植片スライスについても同様の画像を作成した。

【発明を実施するための形態】

【実施例】

【0095】

実施例１：Ｒ．プルモコラーゲンの特性評価
Ｒ．プルモコラーゲン（天然のものまたは加熱処理により加水分解されたもの）の物理化学的特性を表１に示す。

【0096】

【表1】

【0097】

クラゲコラーゲンの細胞傷害性も検査された。クラゲコラーゲンの生体適合性（３．７ｍｇ．ｍＬ－１）は、間接接触によるＩＳＯ １０９９３－５ ２００９方法に従い、細胞培養物の細胞傷害性の測定（マウス線維芽細胞Ｌ９２９）によって評価された。結果によると、天然クラゲ抽出物も加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物も用いた試験条件下では細胞傷害性が検出されなかったと示されている。

【0098】

実施例２：ロリクリン、サーチュイン－４および６、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｖ型コラーゲン、およびＶＩＩ型コラーゲンの合成の免疫標識によるクラゲのコラーゲン加水分解物の評価
直径約１ｃｍの外植片１２個が、褐色肌の５１歳女性の腹部形成手術から調製された。外植片は、５％のＣＯ２を豊富に含む湿潤雰囲気中の３７℃のＢＥＭ（ＢＩＯ－ＥＣの外植培地）環境に置かれた。以下の表２は、得られた外植片に用いられた処理条件を示す。

【0099】

【表2】

【0100】

Ｐ１およびＰ２は、（以下の表３のように）異なる濃度のＲ．プルモコラーゲン加水分解物である。Ｊ０およびＪ８は、それぞれ０日目と８日目を意味する。

【0101】

【表3】

【0102】

本試験の目的は、処理済み外植片から取り付けられた切片に対して次の免疫標識を実行することである。
－ ロリクリンの免疫標識
－ サーチュイン－４の免疫標識
－ サーチュイン－６の免疫標識
－ ＶＩＩ型コラーゲンの免疫標識
－ ＩＩＩ型コラーゲンの免疫標識
－ Ｖ型コラーゲンの免疫標識

【0103】

製品Ｐ１（０．１ｍｇ／ｍＬ）およびＰ２（１ｍｇ／ｍＬ）が上記の外植片に適用され、８日後に腹部形成術対照（Ｔ０）および未処理対照（Ｔ）と比較された。

【0104】

組織処理
ミクロトームタイプ・マイノット、ライカＲＭ２１２５を使用して５μｍの切片を作製し、スーパーフロスト（登録商標）組織学的ガラススライドに載せた。ライカＣＭ３０５０クリオスタットを使用して７μｍの切片を作製し、スーパーフロスト（登録商標）プラスのシラン処理済み組織学的ガラススライドに載せた。

【0105】

顕微鏡観察を、ＤＭＬＢなどのライカ顕微鏡やオリンパスＢＸ４３を使用した光学顕微鏡によって行った。写真はオリンパスＤＰ７２カメラとＣｅｌｌＩＤソフトウェアで撮影された。

【0106】

ａ．ロリクリンの免疫標識
ロリクリンは、ロリクリンに対するポリクローナル抗体を用いてフォーマル化（ｆｏｒｍａｌｉｓｅｄ）パラフィン切片上に標識され（コーヴァンス（Ｃｏｖａｎｃｅ）、参照ＩＤ：ＰＲＢ－１４Ｐ）、ビオチン増幅／ストレプトアビジン・システムを用いて、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％－Ｔｗｅｅｎ２０で１／１６００に希釈し、０．０５％まで室温で１時間反応させた。青みがかった紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰで発現させた（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、参照ＩＤ：ＳＫ ４６００）。標識は免疫標識オートマトン（自動染色装置、ダコ）を用いて実行され、顕微鏡検査によって評価された。当該ロットはＴ０、ＴＪ８、Ｐ１Ｊ８、Ｐ２Ｊ８である。

【0107】

ｂ．サーチュイン－４の免疫標識（ＳＩＲＴ－４）
サーチュイン－４は、サーチュイン－４に対するポリクローナル抗体を用いてフォーマル（ｆｏｒｍａｌ）パラフィン切片上に標識され（ジーンテックス（Ｇｅｎｅ Ｔｅｘ）、参照ＩＤ：ＧＴＸ５１７９８）、ビオチン増幅／ストレプトアビジン・システムを用いて、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％－Ｔｗｅｅｎ２０で１／１００に希釈し、０．０５％まで室温で１時間反応させた。青みがかった紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰで発現させた（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、参照ＩＤ：ＳＫ ４６００）。標識は免疫標識オートマトン（自動染色装置、ダコ）を用いて実行され、顕微鏡検査によって評価された。当該ロットはＴ０、ＴＪ８、Ｐ１Ｊ８、Ｐ２Ｊ８である。

【0108】

ｃ．サーチュイン－６の免疫標識（ＳＩＲＴ－６）
サーチュイン－６は、サーチュイン－６に対するポリクローナル抗体を用いてフォーマル（ｆｏｒｍａｌ）パラフィン切片上に標識され（ノーバスバイオロジカルズ（Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）、参照ＩＤ：ＮＢ１００－２５２２Ｐ）、ビオチン／ストレプトアビジン増幅システムを用いて、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％－Ｔｗｅｅｎ２０で１／１００に希釈し、０．０５％まで室温で１時間反応させ、赤みがかった紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰで発現させた（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、参照ＩＤ：ＳＫ ４６００）。標識は免疫標識オートマトン（自動染色装置、ダコ）を用いて実行され、顕微鏡検査によって評価された。当該ロットはＴ０、ＴＪ８、Ｐ１Ｊ８、Ｐ２Ｊ８である。

【0109】

ｄ．ＶＩＩ型コラーゲンの免疫標識
ＶＩＩ型コラーゲンは、ＶＩＩ型コラーゲンに対するモノクローナル抗体で凍結切片上に標識され（サンタクルーズ、参照ＩＤ：ｓｃ－５３２２６、クローンＬＨ７．２）、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％－Ｔｗｅｅｎ２０で１／１００に希釈し、０．０５％まで室温で１時間反応させ、アレクサフルオール４８８で発現させた（ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、参照ＩＤ：Ａ１１００８）。標識は免疫標識オートマトン（自動染色装置、ダコ）を用いて実行され、顕微鏡検査によって評価された。当該ロットはＴ０、ＴＪ８、Ｐ１Ｊ８、Ｐ２Ｊ８である。

【0110】

ｅ．ＩＩＩ型コラーゲンの免疫標識
ＩＩＩ型コラーゲンは、ＩＩＩ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体で凍結切片上に標識され（ＳＢＡ、参照ＩＤ：１３３０－０１）、ビオチン／ストレプトアビジン増幅システムを用いて、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％－Ｔｗｅｅｎ２０で１／１００に希釈し、０．０５％まで室温で１時間反応させ、赤みがかった紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰで発現させた（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、参照ＩＤ：ＳＫ ４６００）。マーキングは手動で行われ、顕微鏡検査によって評価された。当該ロットはＴ０、ＴＪ８、Ｐ１Ｊ８、Ｐ２Ｊ８である。

【0111】

ｆ．Ｖ型コラーゲンの免疫標識
Ｖ型コラーゲンは、Ｖ型コラーゲンに対するポリクローナル抗体を用いてフォーマル（ｆｏｒｍａｌ）パラフィン切片上に標識され（ノボテック（Ｎｏｖｏｔｅｃ）、参照ＩＤ：２０５１１）、ビオチン／ストレプトアビジン増幅システムを用いて、ＰＢＳ－ＢＳＡ０．３％－Ｔｗｅｅｎ２０で１／１００に希釈し、０．０５％まで室温で１時間反応させ、青みがかった紫色のペルオキシダーゼ基質であるＶＩＰで発現させた（ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、参照ＩＤ：ＳＫ ４６００）。標識は免疫標識オートマトン（自動染色装置、ダコ）を用いて実行され、顕微鏡検査によって評価された。当該ロットはＴ０、ＴＪ８、Ｐ１Ｊ８、Ｐ２Ｊ８である。

【0112】

結果および結論
ロリクリンの結果を図１に示す。０日目、対照バッチＴ０では、ロリクリンのマーキングが顆粒層内で比較的鮮明、あるいは鮮明に現れている。８日目、対照バッチＴＪ８では、ロリクリンの発現は顆粒層で中程度である。対照ロットＴＪ８と比較して、Ｐ１とＰ２のどちらもロリクリン発現の僅かな増加を誘導する。

【0113】

ＳＩＲＴ－４の結果を図２に示す。０日目、対照バッチＴ０では、サーチュイン－４のマーキングが表皮で比較的鮮明に現れている。８日目、対照バッチＴＪ８では、サーチュイン－４の発現は表皮で極めて鮮明、あるいは鮮明である。対照ロットＴＪ８に比べ、Ｐ１はサーチュイン－４発現の僅かな減少または中程度の減少を誘導し、Ｐ２はサーチュイン－４発現の中程度の減少を誘導する。

【0114】

ＳＩＲＴ－６の結果を図３に示す。０日目、対照バッチＴ０では、サーチュイン－６のマーキングが表皮で比較的鮮明、あるいは鮮明に現れている。８日目、対照バッチＴＪ８では、サーチュイン－６の発現は表皮で鮮明である。対照ロットＴＪ８に比べ、Ｐ１はサーチュイン－６発現の僅かな減少を誘導し、Ｐ２はサーチュイン－６の発現に、いかなる観察可能な変化も誘導しない。

【0115】

ＶＩＩ型コラーゲンの結果を図４に示す。０日目、対照バッチＴ０では、ＶＩＩ型コラーゲンの標識は、真皮と表皮の接合部に沿って弱い。８日目、対照バッチＴＪ８では、真皮表皮接合部に沿ったＶＩＩ型コラーゲンの発現は低から中程度である。対照ロットＴＪ８と比較して、Ｐ１とＰ２のどちらもＶＩＩ型コラーゲン発現の中程度の増加を誘導する。

【0116】

ＩＩＩ型コラーゲンの結果を図５に示す。０日目、対照バッチＴ０では、真皮乳頭におけるＩＩＩ型コラーゲンのマーキングは、極めて鮮明である。８日目、対照バッチＴＪ８では、真皮乳頭層におけるＩＩＩ型コラーゲンの発現は明らかに低い。対照ロットＴＪ８と比較して、Ｐ１とＰ２のどちらもＩＩＩ型コラーゲンの発現に観察可能な変化を誘導しない。

【0117】

Ｖ型コラーゲンの結果を図６に示す。０日目、対照バッチＴ０では、真皮乳頭層におけるＶ型コラーゲンのマーキングは鮮明、あるいは非常に鮮明である。８日目、対照バッチＴＪ８では、真皮乳頭層におけるＶ型コラーゲンの発現は鮮明である。対照ロットＴＪ８に比べ、Ｐ１はＶ型コラーゲン発現の中程度の減少を誘導し、Ｐ２はＶ型コラーゲン発現の非常に明らかな減少を誘導する。

【0118】

上記の免疫標識実験で得られた結果の概要を表４に示す。

【0119】

【表4】

【0120】

実施例３：ヒト線維芽細胞の一次培養に対するリゾストマ・プルモコラーゲン含有抽出物の効果についてのインビトロ試験
本発明による加水分解コラーゲン含有抽出物をヒト線維芽細胞に２４時間適用した後、細胞内および細胞外のコラーゲンを、天然コラーゲン（Ｉ型からＶ型コラーゲン）の三重らせん構造（Ｇｌｙ－Ｘ－Ｙ）ｎに対して特別な親和性を持つ赤色色素シリウス（ダイレクトレッド８０）で定量した。色素とコラーゲンの複合体の吸光度は５４０ｎｍで測定された。超音波処理後、ブラッドフォード法を用いて総タンパク質画分を評価した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ １９７６；７２：２４８－５４）。

【0121】

試験システム
一次ヒト線維芽細胞を調製し、細胞にはマイコプラズマが存在しないことが確認された。

【0122】

細胞は、４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭ安定化Ｌ－グルタミンまたはグルタミン、１０％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＳＣ）、５０ＩＵ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞は湿潤雰囲気（３７℃、５％ ＣＯ２）に保持された。細胞は継代６回を使用した。

【0123】

参照要素
陰性対照：１％ＳＶＦを含む培地
陽性対照：１％ＳＶＦを含む培地中の１０ｎｇ／ｍｌのトランスフォーミング増殖因子β１（ＴＧＦβ）

【0124】

希釈系列の定義
本発明による５つの濃度のコラーゲン含有抽出物を試験した。加水分解コラーゲン含有抽出物の初期濃度（８．２５ｍｇ／ｍｌ）を、５００、１００、１０、１０、５、および１μｇ／ｍｌに減少させた。各条件と参照要素で、３連で試験した。

【0125】

試験プロトコル：
細胞播種：細胞を２４ウェルの培養プレートに５０，０００細胞／ｃｍ^２で播種し、一晩インキュベートした（３７℃、５％ ＣＯ２）

【0126】

細胞と試験品または基準品との接触：試験品または参照品の希釈は、１％ＳＶＦの培地で実行された。培地は吸引され、異なる濃度の試験品または参照品の５００μｌと置き換えられた。プレートを、２４時間±１時間インキュベートした（３７℃、５％ ＣＯ２）。

【0127】

コラーゲン合成と細胞密度の評価：次いで、各ウェルの培地をサンプリングし、細胞層を５００μｌの濃縮プロテアーゼ阻害剤カクテルで２回すすいだ。培地と阻害剤のセット全体を同じチューブにプールした。

【0128】

各ウェルの細胞層を５００μｌの濃縮プロテアーゼ阻害剤カクテルに１回かき取り、ウェルを再度５００μｌのカクテルで１回すすいだ。細胞外マトリックスを構成する２体積を１つのチューブにまとめ、超音波プローブで４０秒間処理した。

【0129】

各画分のコラーゲンを赤色色素シリウスと複合体化し、遠心分離し、０．１Ｍ ＨＣＩで洗浄した後、ペレットを０．５Ｍ ＮａＯＨに溶解させた。色素とコラーゲンの複合体の吸光度は５４０ｎｍで測定された。校正範囲は、同じ条件下でコラーゲンチューブあたり０～１０μｇに設定されている。

【0130】

ＰＢＳ中の４００μｇ／ｍｌのＢＳＡ溶液から確立された校正範囲に対して、ブラッドフォード法を用いて総タンパク質量を評価した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．７２：２４８－５４）。９６ウェルプレート内で各サンプル３０μｌをブラッドフォード試薬２８０μｌと混合した。プレートを暗所、室温で約１５分間インキュベートした。ブラッドフォード試薬からなる試薬ブランクに対して、６２０ｎｍで吸光度を測定した。

【0131】

結果
上述の実験の結果を以下の表５に要約する。

【0132】

【表5】

【0133】

加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物を用いた処理により、１０μｇ／ｍｌのコラーゲン製品を使用した場合、細胞マトリックスにおけるコラーゲン合成が大幅に増加し、最大８４％増加した。

【0134】

実施例４：加水分解魚類コラーゲン（ペプタンＳＲマリン）との比較データ
実施例３で実施したものと同じ実験を、５００、１００、および１０μｇ／ｍｌの加水分解魚類コラーゲン（ペプタンＳＲマリン）を使用して行われた。加水分解クラゲと魚類コラーゲンを使用した時に得られた結果を以下の表６で比較する。

【0135】

【表6】

【0136】

加水分解魚類コラーゲンは、１０μｇ／ｍｌの濃度で最大６８％の効果がある。反応は濃度に反比例するようで、加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物で得られる値よりも低いままである。

【0137】

実施例５：ヒトの皮膚外植片における遺伝子発現に対する加水分解コラーゲン含有抽出物の評価
生体モデル
ネイティブスキン（登録商標）皮膚外植片が使用されたが、これは固体の高栄養化マトリックスに包埋されたヒトの正常な皮膚の生検である。表皮表面は空気と接触した状態に保たれており、局所適用が可能である。

【0138】

使用した外植片は、フィッツパトリックスケールで３の色素沈着に相当する３２歳の女性の腹部形成術から調製された。

【0139】

この実施例で使用した加水分解コラーゲン含有抽出物は、１００μｇ／ｍｌ（０．１ｇ／Ｌ）に濃縮された。

【0140】

実験は以下の条件で３回行われた。
－ 皮膚外植片（対照）未処理（ｎ＝３）
－ 皮膚移植片＋加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物（ＢＴ－１０Ｒ＆Ｄ）０．１ｇ／Ｌ（ｎ＝３）
－ 皮膚外植片＋加水分解魚類コラーゲン（２１３２４１５－１／２８０５２０１８）０．１ｇ／Ｌ（ｎ＝３）

【0141】

外植片は、朝と夕方に新たに製品を適用され、２日間製品で処理された。

【0142】

備考：加水分解魚類コラーゲンは表皮を弱めるようである。実際に、処理後、外植片を打ち抜き、製品にさらされていない皮膚を除去することにより、外植片はＲＮＡ抽出用に用意された。表皮が真皮から僅かに剥がれているのが観察された。

【0143】

培養段階の終わりに、外植片をインサートから取り出し、マイクロ流体ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して皮膚外植片の遺伝子発現を特徴付けた。

【0144】

結果／結論
各プライマーペアの特異性は、すべての条件で解離曲線分析によって検証され、二重ピークの問題のある点は分析から除外した。次に、ΔΔＣＴを計算するため、参照遺伝子と対照条件を使用して各ＣＴを正規化し、相対発現は、式２－ΔΔＣＴを使用してΔΔＣＴの関数として計算した。

【0145】

各条件について、平均値に対する標準誤差（ＳＥＭ）が計算され、ＳＥＭ値が大きすぎる点（ＳＥＭと３つの値の平均の差が４０％を超える）は分析から除外した。結果は、参照条件に対する過剰発現または部分発現の割合として表す。

【0146】

処理によって誘導された目的の遺伝子の発現の変化を、以下の表７（加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物）および表８（加水分解魚類コラーゲンペプチド）に示す。

【0147】

【表7】

【0148】

加水分解Ｒ．プルモコラーゲン含有抽出物はＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＣＮ、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＬＯＸ、ＬＵＭ、ＳＰＡＲＣ、ＣＤＣ４２、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＡ５、ＰＩ３、ＥＧＦ、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ６、ＭＧＳＴ１、ＴＮＦＡ、ＥＰＰＫ１、ＥＶＰＬ、ＦＬＧ、ＬＯＲ、ＰＯＭＣ、ＤＫＫ１の合成を増加させることができ、ＭＭＰ３、ＨＢＥＧＦ、ＰＩ３、ＬＯＸＬ１の合成を減少させることができた。

【0149】

【表8-1】

【表8-2】

【0150】

加水分解魚類コラーゲンはＬＯＸＬ１、Ｐ４ＨＡ１、ＣＤ４４、ＣＤＣ４２、ＣＯＬ４Ａ１、ＣＴＮＮＡ１、ＩＴＧＡ２、ＬＡＭＣ２、ＰＸＮ、ＳＤＣ４、ＰＩ３、ＴＩＭＰ１、ＭＭＰ１、ＭＭＰ３、ＨＢＥＧＦ、ＳＩＲＴ６、ＴＩＮＦ２、ＩＧＦＢＰ６、ＧＬＲＸ、ＳＩＲＴ３、ＳＯＤ２、ＣＯＸ２、ＩＬ１Ａ、ＩＬ６、ＩＬ８、Ｓ１００Ａ７、ＴＮＦＡ、ＩＶＬ、ＴＧＭ１、ＰＯＭＣ、ＤＫＫ１の合成を増加させることができ、ＣＯＬ１Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＣＮ、ＳＰＡＲＣ、ＣＯＬ１７Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＦＮ１、ＬＡＭＡ５、ＳＤＣ１、ＭＭＰ９、ＡＱＰ１、ＡＱＰ３、ＣＡＴ、ＭＳＲＢ２、ＥＶＰＬ、ＦＬＧ、ＬＯＲの合成を減少させることができる。

【0151】

これらの結果は、Ｒ．プルモコラーゲン含有抽出物が遺伝子ＣＯＬ３Ａ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＳＰＡＲＣ、ＬＵＭ、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＡ５、ＣＤＣ４２、ＥＧＦ、ＳＩＲＴ４、ＳＩＲＴ６、ＥＰＰＫ、ＬＯＲ、ＴＮＦＡの発現を効果的に活性化でき、ＭＭＰ３の発現を減少させることを示している。

【0152】

前述の通り、Ｒ．プルモコラーゲン含有抽出物はＣＯＬ７Ａ１の発現を＋１７０％増加させる。Ｉｚｍｉｒｙａｎｅｔ ａｌによる研究（Ｅｘ ｖｉｖｏ ＣＯＬ７Ａ１ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ ｅｐｉｄｅｒｍｏｌｙｓｉｓ ｂｕｌｌｏｓａ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ａｎｄ ｈｏｍｏｌｏｇｙ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｒｅｐａｉｒ （２０１８）． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， １２， ５５４－５６７．）では、ＲＤＥＢ細胞におけるＣＯＬ７Ａ１転写物の再発現が最大１５％であると推定されることが示され、皮膚移植片中の最大１９％は、真皮と表皮が分離することなくアンカーフィブリルを形成するのに十分だった。したがって、Ｒ．プルモコラーゲン含有抽出物で見られる効果は、ＥＢ治療の有望な機会を示している。ＣＯＬ７Ａ１合成の増加は、Ｒ．プルモコラーゲン抽出物がＥＢ治療との関連で治療的関連性があることを示唆している。

【0153】

対照的に、魚類コラーゲン加水分解物は、ＣＯＬ７Ａ１を含む多くのＥＢ関連遺伝子の合成を減少させる。

【0154】

実施例６：ヒト皮膚生検におけるＥＢに関連する遺伝子のエクスビボでの活性化に対する加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物の効果を決定するための試験
方法：
コラーゲン含有クラゲ抽出物および対照試料を、健康な皮膚外植片であるＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）（固体の高栄養価マトリックス中に包埋された全層皮膚生検）上で、その表皮表面を空気と接触させたままの状態で、エクスビボで試験した。

【0155】

コラーゲン含有抽出物の加水分解は、抽出物を８０℃まで６０分間加熱することによって実施した。図７は、コラーゲン含有クラゲ抽出物中に存在するタンパク質のサイズ分布における加熱処理の効果を実証する代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥを示す。

【0156】

外植片を以下の条件下で試験した。
－ 抽出物の処理なし、
－ 未処理のコラーゲン含有クラゲ抽出物（０．１ｍｇ／ｍＬ）への曝露、
－ 加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物（０．１ｍｇ／ｍＬ）への曝露、
－ 加熱処理したコラーゲン含有哺乳動物抽出物（０．１ｍｇ／ｍＬ）への曝露。

【0157】

これらの外植片をこれらの試験抽出物に２４時間曝露した。そのインキュベーション後、皮膚外植片からＲＮＡを抽出し、次いでｃＤＮＡに逆転写した。９０個の遺伝子の発現を、マイクロ流体技術ＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｉｏｍａｒｋ（登録商標）－Ｆｌｕｉｄｉｇｍ）によって３連で評価し、参照遺伝子の発現に対して正規化した。活性化効果または阻害効果を確認するために、値を未処理対照と比較した。これらの結果を、未処理対照に対する発現率に関して表した。

【0158】

結果
異なる処理後のヒト外植片におけるＥＢ関連遺伝子発現の有意な変化を以下の表９に要約する（マイクロ流体ＲＴ－ｑＰＣＲ法によって測定）。

【0159】

【表9】

【0160】

表９の結果は、重要なＥＢ関連遺伝子の発現の増加が、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物での外植片の処理と密接に関連しており、同様の方法で処理された哺乳動物抽出物中には一般に存在しなかったことを示す。非加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物は、加熱処理した抽出物と同様にＥＢ関連遺伝子発現を活性化しなかったことから、観察された効果は、加水分解コラーゲン含有クラゲ抽出物に特異的であることが強く示唆される。

【0161】

加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物に曝露された外植片のいくつかにおいて、他のＥＢ関連遺伝子の発現の増加が観察された。具体的には、ＣＯＬ３Ａ１、ＣＯＬ５Ａ１、ＤＣＮ、ＦＮ１、ＦＢＮ１、ＦＢＮ２、ＩＴＧＡ２、ＬＯＸ、ＬＵＭ、ＳＰＡＲＣ、およびＣＤＣ４２の発現の増加が観察された。ＭＭＰ３遺伝子発現の減少も観察された。ＭＭＰ３のアップレギュレーションは重症型のＲＤＥＢと関連しているため、その発現の減少は、その疾患の罹患者にとって有益である可能性がある。

【0162】

実施例７：健康なヒト皮膚外植片におけるＶＩＩ型コラーゲンタンパク質の発現をエクスビボで評価するための試験
方法：
加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物を、健康な皮膚外植片ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）（固体の高栄養価マトリックス中に包埋された全層皮膚生検）上で、その表皮表面を空気と接触させたままの状態で、エクスビボで試験した。この実験は５人のドナー（Ｎ＝５）に対して実施し、外植片を、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物を含む試験品目に５日間曝露した。

【0163】

処理後、皮膚外植片をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ラベル付けできるように切断した。コラーゲンＶＩＩを免疫蛍光法によってラベル付けし、蛍光顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社製ＤＭ５０００Ｂ）によって観察した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、対照と比較する相対的定量法によって、蛍光強度を測定する。１０枚の写真／１０件の条件で基底層のレベルで測定されたラベル付けした面積の平均値（％）を、±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）とともに表し、製品について得られた結果を未処理条件と比較した。

【0164】

結果
図８Ａに示される固定された外植片の免疫蛍光染色の結果は、未処理の対照と比較して、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理された外植片に存在するコラーゲンＶＩＩタンパク質のレベルの増加を示す。処理した外植片に見られた増加を定量し、未処理対照に対するコラーゲンＶＩＩタンパク質の標識面積における増加の割合（％）として表した（図８Ｂ）。

【0165】

実施例８：健康なヒトケラチノサイト（ＮＨＥＫ）におけるＶＩＩ型コラーゲンの遺伝子発現を評価するためのインビトロ試験
方法：
健康なヒト表皮ケラチノサイト（ＮＨＥＫ）を、加熱処理されたコラーゲン含有クラゲ抽出物を含有する適切な培地で培養した。処理は３７℃で４８時間行った。ＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡの発現を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍを用いた半定量的ＰＣＲ法によって測定した。ｍＲＮＡの発現レベルを計算し、参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）で正規化した。活性化効果または阻害効果（ｎ＝３）を示すために、値を未処理対照に対して報告し、エラーバーは平均値の標準誤差を表す。

【0166】

結果
図９に示される結果は、加熱処理されたコラーゲン含有クラゲ抽出物でのＮＨＥＫの処理が、未処理対照と比較してＣＯＬ７Ａ１ ｍＲＮＡの発現の有意な増加をもたらすことを示す。この観察は、上記の実施例７に記載される免疫染色データと一致する。

【0167】

実施例９：健康なヒト皮膚外植片生検におけるＶＩＩ型コラーゲン、ケラチン５およびラミニン５の発現に対するコラーゲン含有クラゲ抽出物を評価するためのエクスビボ試験。
方法：
本試験では、エクスビボによる健康なヒト皮膚モデルにおけるコラーゲン７、ラミニン５、およびケラチン５のタンパク質発現に対する加熱処理されたコラーゲン含有クラゲ抽出物の効果を評価した。この試験は、皮膚外植片ＮａｔｉｖｅＳｋｉｎ（登録商標）（固体の高栄養価マトリックス中に包埋された全層皮膚生検）上で、その表皮表面を空気と接触させたままの状態で実施した。この皮膚生検は、局所的に塗布された製剤の任意の側方拡散を防止するマトリックス中にしっかりと包埋される。この試験は、１０人のドナー（ｎ＝１０）に対して実施し、外植片を、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物を用いて試験品目に５日間曝露した。

【0168】

処理後、皮膚外植片をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、ラベル付けできるように切断した。目的のバイオマーカーを免疫蛍光によってラベル付けし、蛍光顕微鏡（ライカマイクロシステムズ社製ＤＭ５０００Ｂ）で観察した。Ｉｍａｇｅ Ｊソフトウェアを使用して、対照と比較する相対的定量法によって、蛍光強度を測定する（定量されたバイオマーカー＝コラーゲン７、ケラチン５およびラミニン５）。

【0169】

タンパク質標識の蛍光強度の平均を１０枚の写真／１０件の条件で測定し、±平均値の標準誤差（ＳＥＭ）が表される。加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物について得られた結果を、未処理条件と比較した。図１０は、免疫染色分析に使用した代表的な画像を示す。

【0170】

結果
エクスビボでの健康なヒト皮膚におけるラミニン５、コラーゲン７およびケラチン５タンパク質発現に関する１０人のドナーすべてについての全体的な結果を、以下の表１０、１１および１２に示す。これらの結果は、試験した全てのタンパク質の発現が、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理された外植片において増加することを示す。コラーゲン７についてほぼ２５％の増加が観察され、これは、多くのタイプのＥＢの疾患機構に非常に関係している。

【0171】

【表10】

【0172】

【表11】

【0173】

【表12】

【0174】

実施例１０：ヒト疾患線維芽細胞株（ＤＥＢ、ＥＢＳ、およびＪＥＢ）において、加熱処理したクラゲコラーゲン含有抽出物がラミニン－５、コラーゲンＩＶ、およびコラーゲンＶＩＩの遺伝子活性化およびタンパク質発現に及ぼす影響を検討したインビトロ試験
実験の設定
本試験では、ＥＢ疾患細胞株におけるコラーゲン７、ラミニン５、およびコラーゲン４のｍＲＮＡおよびタンパク質発現に対する加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物の効果を評価した。この試験は、ＥＢに罹患した３人のドナーのヒト線維芽細胞を用いて行われた。

【0175】

ドナー１＝Ｄ１＝男性、６歳、単純性ＥＢ（ＳＥＢ）
単純性表皮水疱症（ＥＢＳ）は、ケラチン５またはケラチン１４をコード化する遺伝子の変異に起因する疾患である。

【0176】

ドナー２＝Ｄ２＝女性、１２歳、ジストロフィー性ＥＢ（ＤＥＢ）
ジストロフィー性表皮水疱症（ＤＥＢ）は、皮膚および粘膜の脆弱性によって特徴付けられる遺伝性表皮水疱症（ＥＢ）の一種で、水疱や表在性潰瘍を生じる。ＤＥＢは、ＶＩＩ型コラーゲンタンパク質をコード化するＣＯＬ７Ａ１（３ｐ２１．３１）遺伝子の変異によって引き起こされる。この遺伝子の変異は、コラーゲンＶＩＩの機能を変化させ、産生を減少させ、あるいは破壊する。

【0177】

ドナー３＝Ｄ３＝男性、８カ月、接合部ＥＢ（ＪＥＢ）
接合型表皮水疱症は、基底膜部の透明帯内での水疱形成によって特徴付けられる皮膚疾患である。接合型表皮水疱症は、ＬＡＭＡ３、ＬＡＭＢ３、ＬＡＭＣ２、およびＣＯＬ１７Ａ１遺伝子の変異に起因することが最も多い。

【0178】

健康な皮膚との比較を可能にするため、ＮＨＤＦ（正常ヒト皮膚線維芽細胞）、女性、２０歳を使用した。

【0179】

ｍＲＮＡ分析
試験抽出物を添加した、または添加しない適切な培地で細胞を処理し、３７℃で４８時間インキュベートした。処理後、細胞からＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写した。ＣＯＬ４Ａ１、ＣＯＬ７Ａ１、ＬＡＭＣ２ ｍＲＮＡの発現は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ７３００ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍの半定量的ＰＣＲ法で測定した。ｍＲＮＡの発現レベルを計算し、参照遺伝子（ＧＡＰＤＨ）で正規化した。値は、活性化または抑制効果を表すために、未処理の対照に対して報告され、結果は誘導因子として表される。ｍＲＮＡ発現が±４０％（ｎ＝３）の時、結果は有意とみなされる。

【0180】

タンパク質発現解析
試験抽出物を添加した、または添加しない適切な培地で細胞を処理し、３７℃で４８時間インキュベートした。処理後、細胞を洗浄し、ホルマリンで固定した。透過処理後、細胞を抗コラーゲン４抗体、抗コラーゲン７抗体または抗ラミニン５抗体、および関連する蛍光標識二次抗体（ＡＬＥＸＡ）とインキュベートした。最後に、核をＤＡＰＩで標識した。

【0181】

標識されたタンパク質は、自動蛍光顕微鏡Ｃｅｌｌｉｎｓｉｇｈｔ ＣＸ７ Ｈｉｇｈ－Ｃｏｎｔｅｎｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｐｌａｔｆｏｒｍ（サーモフィッシャー社）で観察され、定量された。蛍光強度±平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表す（ｎ＝３）。値は対照と比較した。有意性はｐ値と相関する：ｎｓ＝有意ではない、^＊ｐ値＜０．５、^＊＊ｐ値＜０．０１、^＊＊＊ｐ値＜０．００１。

【0182】

結果
ｍＲＮＡとタンパク質の発現解析結果を、以下の表１３、１４、および１５にまとめる。

【0183】

【表13】

【0184】

【表14】

【0185】

【表15】

【0186】

ｍＲＮＡの定量から、加熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理すると、試験したすべての種類のＥＢ線維芽細胞でＣＯＬ４Ａ１遺伝子の発現が有意に増加することを示した。さらに、ＬＡＭＣ２遺伝子の発現は、熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理したＤＥＢ細胞で有意に増加した。

【0187】

タンパク質の発現に関連して、免疫染色分析から、熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物で処理したＳＥＢ細胞とＪＥＢ細胞は、存在するラミニン５タンパク質のレベルが有意に増加したことが示された。さらに、処理したＳＥＢ細胞とＪＥＢ細胞では、コラーゲン７タンパク質のレベルが上昇した。

【0188】

この試験は、ＥＢ皮膚の線維芽細胞に対して熱処理したコラーゲン含有クラゲ抽出物が、基底層のラミナ関連タンパク質であるコラーゲン４、コラーゲン７、およびラミニン５に新たな好影響を与えることを実証する。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8A】

【図8B】

【図9】

【図10】

【国際調査報告】