特表2024-511349タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規塩およびこれらの用途
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-13
(54)【発明の名称】タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規塩およびこれらの用途
(51)【国際特許分類】
C07D 471/04 20060101AFI20240306BHJP
A61K 31/4545 20060101ALI20240306BHJP
A61P 37/08 20060101ALI20240306BHJP
A61P 17/00 20060101ALI20240306BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240306BHJP
A61P 1/04 20060101ALI20240306BHJP
【ＦＩ】
C07D471/04 104Z
A61K31/4545
A61P37/08
A61P17/00
A61P29/00
A61P1/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023556851
(86)(22)【出願日】2022-03-16
(85)【翻訳文提出日】2023-09-14
(86)【国際出願番号】 KR2022003702
(87)【国際公開番号】W WO2022197103
(87)【国際公開日】2022-09-22
(31)【優先権主張番号】10-2021-0034296
(32)【優先日】2021-03-16
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(31)【優先権主張番号】10-2021-0048814
(32)【優先日】2021-04-14
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514311689
【氏名又は名称】エイチケー イノ．エヌ コーポレーション
【住所又は居所原語表記】２３９ Ｏｓｏｎｇｓａｅｎｇｍｙｅｏｎｇ ２－ｒｏ， Ｏｓｏｎｇ－ｅｕｐ， Ｈｅｕｎｇｄｅｏｋ－ｇｕ， Ｃｈｅｏｎｇｊｕ－ｓｉ， Ｃｈｕｎｇｃｈｅｏｎｇｂｕｋ－ｄｏ， ２８１５８， Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】イ，ジュヒョン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ヨンジュ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ジュン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ハンナ
(72)【発明者】
【氏名】チェ，ジョンヨル
(72)【発明者】
【氏名】クォン，ジェホン
(72)【発明者】
【氏名】キム，ドンギュ
(72)【発明者】
【氏名】ピョン，イェジ
(72)【発明者】
【氏名】シン，ヒョンウ
(72)【発明者】
【氏名】ユン，ダスル
(72)【発明者】
【氏名】イ，イェリン
(72)【発明者】
【氏名】チョン，スンヒ
(72)【発明者】
【氏名】ファン，ドソク
【テーマコード（参考）】
4C065
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C065AA04
4C065BB04
4C065CC01
4C065DD02
4C065EE02
4C065HH02
4C065JJ07
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4C065LL01
4C065PP02
4C065PP12
4C086AA01
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4C086CB05
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4C086MA01
4C086MA04
4C086NA05
4C086ZA68
4C086ZA89
4C086ZB11
4C086ZB13
(57)【要約】
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規塩およびこれらの用途に関し、新規塩は、水溶解度に優れ、物理的、化学的安定性に優れているため、医薬品の製剤化に有用に活用することができる。また、ヘテロ環化合物またはこれらの塩は、アトピー性皮膚炎および炎症性腸疾患をそれぞれ効果的に治療および予防することができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩であって、前記有機酸塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項2】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの塩酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項3】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの臭化水素酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項4】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドのリン酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項5】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドのカムシル酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項6】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドのシュウ酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項7】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドのメシル酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項8】
前記有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドのナパジシル酸塩である、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項9】
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドと有機酸は、１：１～１：１．３当量比で含まれるものである、請求項１に記載のＮ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの有機酸塩。
【請求項10】
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療または予防用組成物。
【請求項11】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項１０に記載のアトピー性皮膚炎の治療または予防用組成物。
【請求項12】
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、炎症性腸疾患の治療または予防用組成物。
【請求項13】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項１２に記載の炎症性腸疾患の治療または予防用組成物。
【請求項14】
前記炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎またはクローン病である、請求項１２に記載の炎症性腸疾患の治療または予防用組成物。
【請求項15】
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩の治療学的に有効な量を個体に投与することを含む、アトピー性皮膚炎の治療または予防方法。
【請求項16】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項１５に記載のアトピー性皮膚炎の治療または予防方法。
【請求項17】
Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩の治療学的に有効な量を個体に投与することを含む、炎症性腸疾患の治療または予防方法。
【請求項18】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項１７に記載の炎症性腸疾患の治療または予防方法。
【請求項19】
アトピー性皮膚炎の治療または予防のための、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項20】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項１９に記載の使用。
【請求項21】
炎症性腸疾患の治療または予防のための、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項22】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項２１に記載の使用。
【請求項23】
アトピー性皮膚炎の治療または予防用薬剤の製造のための、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項24】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項２３に記載の使用。
【請求項25】
炎症性腸疾患の治療または予防用薬剤の製造のための、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩の使用。
【請求項26】
前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩である、請求項２５に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規塩およびこれらの用途に関する。
【背景技術】
【0002】
一般に、同一の薬物において、非晶質、一つ以上の結晶形、塩などのそれぞれの形態において溶解度や溶出特性および生体利用率のような薬学的に重要な性質に差があり得ることは明らかな事実である。薬物の薬学的に許容される塩は、数多くの種類が知られており、研究が進められているが、同一の塩であっても薬物ごとにその性質が異なり、溶解度をはじめとする安定性など、薬学的に重要に考慮すべき性質を全て満たす理想的な塩を得るのは難しいことである。
【0003】
ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫｓ）は、他のタンパク質をリン酸化してタンパク質の活性、位置および機能を調節し、様々な細胞内過程を制御する酵素である。ヤヌスキナーゼは、炎症性サイトカインの細胞内受容体に位置し、炎症性サイトカインが受容体と結合してリン酸化した後、ＳＴＡＴ分子との作用を通じて炎症性サイトカインのシグナルを細胞内に伝達する。このように様々な炎症性サイトカインによるシグナル伝達の過度な活性化は、私たちの体の免疫システムが自分を攻撃するようになり、その結果、自己免疫疾患が発生する。近年、選択的ＪＡＫ１阻害剤、ウパダシチニブおよびアブロシチニブの第ＩＩ相および第ＩＩＩ相臨床試験において、ＪＡＫ１阻害剤がアルツハイマー病の重症度や症状を素早く改善することが報告されている。
【0004】
一方、アトピー性皮膚炎（ＡＤ、Ａｔｏｐｉｃ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ）は、最も一般的な慢性炎症性皮膚疾患の一つである。Ｔｈ（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ）２、Ｔｈ２２、および一部のＴｈ１およびＴｈ１７のサイトカインレベルが上昇すると、アトピー性皮膚炎の皮膚病変で異常な免疫活性化が引き起こされる。最近アトピー性皮膚炎の治療のために免疫標的治療剤の使用が増加しており、ＩＬ－４受容体を標的とするモノクローナル抗体であるデュピルマブがアトピー性皮膚炎の治療剤として承認された。アトピー性皮膚炎に罹患している患者が増加し続けるにつれて、優れた治療効果を示す治療薬に対する需要は続いている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】韓国公開特許第２０１９－００４３４３７号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
本発明の一目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規な塩を提供することである。
【0007】
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、アトピー性皮膚炎の治療または予防用の薬学的組成物を提供することである。
【0008】
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む、炎症性腸疾患の治療または予防用の薬学的組成物を提供する
ことである。
ことである。
【0009】
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の、アトピー性皮膚炎を治療または予防する用途に関する。
【0010】
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の、炎症性腸疾患を治療または予防する用途に関する。
【0011】
本発明の別の目的は、アトピー性皮膚炎の治療または予防のための薬剤の製造における、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである。
【0012】
本発明の別の目的は、炎症性腸疾患の治療または予防のための薬剤の製造における、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供することである。
【0013】
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与することを含む、アトピー性皮膚炎の治療または予防方法を提供することである。
【0014】
本発明の別の目的は、タンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を個体に投与することを含む、炎症性腸疾患の治療または予防方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0015】
本出願の発明者らは、従来の化合物と同等以上の薬理学的活性を有しつつ、熱および水分に対する安定性を向上して類縁物質の発生を最小限に抑えられる、物理化学的性質が改善された化合物を見出すために鋭意努力した結果、本発明によるヘテロ環化合物の塩が、吸湿性が低く、物理化学的性質に優れ、熱および水分に安定しているだけでなく、溶解度も改善できるという効果を確認し、本発明を完成した。
【0016】
さらに、本発明によるヘテロ環化合物およびその薬学的に許容可能な塩の、アトピー治療用途および炎症性腸疾患治療用途を見出した。
【0017】
本発明によるヘテロ環化合物およびその薬学的に許容可能な塩は、アトピー性皮膚炎マウスモデルにおいて、他の選択的ＪＡＫ１阻害剤よりもアトピー性皮膚炎と類似した皮膚重症度を経口および局所投与により効果的に阻害することができた。また、インビトロでのヒト全血分析において、本発明のヘテロ環化合物は、他のＪＡＫ阻害剤より安全面で有利な最高の選択的ＪＡＫ１阻害剤であることが証明された。さらに、本発明によるヘテロ環化合物およびその薬学的に許容可能な塩は、炎症性腸疾患モデルにおいても治療効果を確認することができた。
【0018】
新規塩およびその製造方法
本発明によるタンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規な塩において、ヘテロ環化合物は、下記化学式Ｉで表される。
本発明によるタンパク質キナーゼ阻害剤としてのヘテロ環化合物の新規な塩において、ヘテロ環化合物は、下記化学式Ｉで表される。
【0019】
【化1】
【0020】
前記化学式Ｉで表される化合物の名称は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミド（Ｎ－（４－（１－（２－ｃｙａｎｏａｃｅｔｙｌ）－３－ｍｅｔｈｙｌ－１，２，３，６－ｔｅｔｒａｈｙｄｒｏｐｙｒｉｄｉｎ－４－ｙｌ）－１Ｈ－ｐｙｒｒｏｌｏ［２，３－ｂ］ｐｙｒｉｄｉｎ－６－ｙｌ）ｃｙｃｌｏｐｒｏｐａｎｅｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）である。
【0021】
前記化学式Ｉのヘテロ環化合物は、（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドおよび（Ｒ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドのそれぞれを示すものであってもよく、またはこれらの混合物であってもよい。
【0022】
一実施形態において、本発明におけるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、下記化学式ＩＩで表される化合物またはその薬学的に許容可能な塩であってもよい。
【0023】
【化2】
【0024】
前記化学式ＩＩで表されるヘテロ環化合物の名称は、（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドである。
【0025】
本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の有機酸塩であってもよい。ここで、前記有機酸塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、リン酸塩、ナパジシル酸塩、カムシル酸塩またはシュウ酸塩を含む。
【0026】
本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドと有機酸を含む有機酸塩であり、ここで、有機酸塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、メシル酸塩、リン酸塩、ナパジシル酸塩、カムシル酸塩またはシュウ酸塩であってもよい。
【0027】
本発明における有機酸塩は、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドと有機酸を１：１～１：１．３当量比で含んでいてもよい。
【0028】
本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、高純度で得ることができる。
【0029】
また、本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な
塩は、高温および高湿の条件下においても優れた安定性を示し、光安定性にも優れているため、熱および水分に対して長期間安定して保持できる。また、本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、優れた溶解度および物理化学的性質を示し、生体利用率にも優れている。さらに、本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、吸湿性が低く、周りの水分を吸収しないため、長期間水分含有量が変化することなく保持できる。
塩は、高温および高湿の条件下においても優れた安定性を示し、光安定性にも優れているため、熱および水分に対して長期間安定して保持できる。また、本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、優れた溶解度および物理化学的性質を示し、生体利用率にも優れている。さらに、本発明において、前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩は、吸湿性が低く、周りの水分を吸収しないため、長期間水分含有量が変化することなく保持できる。
【0030】
本発明の化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の塩は、経口または経皮で投与されてもよい。
【0031】
本発明の化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の塩は、アトピー性皮膚炎を治療または予防することができる。
【0032】
本発明の化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の塩は、炎症性腸疾患を治療または予防することができる。炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎またはクローン病を含んでもよい。
【0033】
本発明において、前記化学式Ｉまたは化学式ＩＩで表されるヘテロ環化合物の薬学的に許容可能な塩の製造方法は、
（Ａ）前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物を有機溶媒に溶解または懸濁させるステップ；
（Ｂ）塩酸、臭素酸、メタンスルホン酸、リン酸、１，５－ナフタレンジスルホン酸、カンファースルホン酸、およびシュウ酸のうちから選択されるいずれか一つの有機酸を添加して攪拌し、前記ヘテロ環化合物の塩を形成するステップ；および
（Ｃ）攪拌して以前のステップで形成された塩を固化するステップを含んでもよい。
（Ａ）前記化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物を有機溶媒に溶解または懸濁させるステップ；
（Ｂ）塩酸、臭素酸、メタンスルホン酸、リン酸、１，５－ナフタレンジスルホン酸、カンファースルホン酸、およびシュウ酸のうちから選択されるいずれか一つの有機酸を添加して攪拌し、前記ヘテロ環化合物の塩を形成するステップ；および
（Ｃ）攪拌して以前のステップで形成された塩を固化するステップを含んでもよい。
【0034】
前記製造方法は、さらに（Ｄ）反溶媒を加えて個体を熟成させるステップを含んでもよい。
【0035】
前記（Ａ）ステップにおいて、前記化学式Ｉまたは化学式ＩＩで表されるヘテロ環化合物は、無晶形または結晶形であってもよい。
【0036】
前記（Ａ）ステップの有機溶媒は、酢酸エチル、アセトン、メタノール、エタノール、イソプロパノール、アセトニトリル、２－ブタノンまたはこれらの混合物を含む。
【0037】
前記（Ｂ）ステップにおいて、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドと有機酸を１：１～１：１．３当量比で混合してもよい。
【0038】
アトピー性皮膚炎の治療または予防の用途
（１）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物である、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療または予防用組成物を提供する。
（１）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物である、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、アトピー性皮膚炎の治療または予防用組成物を提供する。
【0039】
（２）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を投与することを含む、アトピー性皮膚炎を治療または予防する方法を提供する。
【0040】
（３）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の、アトピー性皮膚炎の治療または予防のための用途を提供する。
【0041】
（４）本発明は、アトピー性皮膚炎の治療または予防のための薬剤を生産するための、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。
【0042】
（５）前記（１）、（２）、（３）または（４）による本発明において、「アトピー性皮膚炎」は、その発生の直接的または間接的な原因を問わず、当業界でアトピー性皮膚炎に分類される全ての疾患を含む意味として使用される。通常、アトピー性皮膚炎は、その発症時期または発症対象によって、幼児型アトピー性皮膚炎、小児型アトピー性皮膚炎、成人型アトピー性皮膚炎および妊婦アトピー性皮膚炎に分類されるが、本発明において、アトピー性皮膚炎は、これらの全てのアトピー性皮膚炎を含むものとして定義される。
【0043】
（６）前記（１）、（２）、（３）、（４）または（５）による本発明において、前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩であってもよい。
【0044】
炎症性腸疾患の治療または予防の用途
（７）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物である、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、炎症性腸疾患の治療または予防用組成物を提供する。
（７）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物である、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、炎症性腸疾患の治療または予防用組成物を提供する。
【0045】
（８）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学的組成物を投与することを含む、炎症性腸疾患を治療または予防する方法を提供する。
【0046】
（９）本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の、炎症性腸疾患の治療または予防のための用途を提供する。
【0047】
（１０）本発明は、炎症性腸疾患の治療または予防のための薬剤を生産するための、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。
【0048】
（１１）前記（７）、（８）、（９）または（１０）による本発明において、「炎症性腸疾患」は、腸に発生する原因不明の慢性的な炎症を意味し、通常、特発性炎症性腸疾患である潰瘍性大腸炎とクローン病を指すものであるが、韓国で比較的一般的な腸管型ベーチェット病（Ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ Ｂｅｈｃｅｔ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）も含んでもよい。また、炎症性腸疾患は、細菌性、ウイルス性、アメーバ性、結核性腸炎などの感染性腸炎と、虚血性腸疾患、放射線腸炎など、腸管に発生する全ての炎症性疾患を総称するものとして定義する。
【0049】
（１２）前記（７）、（８）、（９）、（１０）または（１１）による本発明において、前記薬学的に許容可能な塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩であってもよい。
【0050】
前記（１）または（７）による本発明のアトピー性皮膚炎または炎症性腸疾患の予防または治療のための薬学的組成物は、薬学的に許容可能な添加剤、通常用いられる適切な担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤または希釈剤をさらに含んでいてもよい。
【0051】
前記「薬学的に許容可能な添加剤」は、生物体を刺激することなく、注入される化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤または希釈剤を含んでもよい。本発明で用いられる前記添加剤の種類は、特に限定されず、当技術分野で通常用いられ薬学的に許容可能な添加剤であればいずれも使用可能である。前記添加剤の非限定的な例としては、マンニトール、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、コロイド状二酸化ケイ素、微結晶セルロース、クロスカルメロースナトリウム、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウムまたはこれらの混合物を含んでいてもよい。また、必要に応じて、酸化防止剤、緩衝液および／または静菌剤など、他の通常の添加剤を添加して用いてもよい。
【0052】
本発明のアトピー性皮膚炎または炎症性腸疾患の治療または予防効果を示す化合物は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物である、Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドまたはその薬学的に許容可能な塩であり、ここで、前記塩は、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩、メシル酸塩またはナパジシル酸塩であってもよい。
【0053】
本発明において、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、経口または経皮で投与してもよい。
【0054】
本発明において、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩の投与量は、薬学的に有効な量でなければならない。「薬学的に有効な量」とは、医学的治療に適用可能な合理的な恩恵／リスク比で疾患を予防または治療するのに十分な量を意味し、有効量の水準は、製剤化方法、患者の状態および体重、性別、年齢、重症度、薬物の形態、投与経路および期間、排泄速度、薬物に対する感受性などの要因に応じて、当業者によって多様に選択できる。有効量は、当業者に認識されているように、処理の経路、賦形剤の使用および他の薬剤との併用可能性によって変わる。
【0055】
一実施形態において、本発明の化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、経皮剤として０．１～５％、経口剤としては１０～２００ｍｇ／ｋｇ用量で投与してもよい。一例として、経皮剤として０．３～３％、経口剤としては５０～２００ｍｇ／ｋｇ用量で投与してもよい。
【0056】
一例として、本発明の化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩は、１０～１８０ｍｇ／ｋｇ用量で経口投与してもよい。
【0057】
経口投与用に製剤化される場合、錠剤、トローチ剤（ｔｒｏｃｈｅｓ）、ロゼンジ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、水溶性懸濁液、油性懸濁液、調製粉末、顆粒、エマルジョン、ハードカプセル、ソフトカプセル、シロップまたはエリキシル剤（ｅｌｉｘｉｒｓ）などに製剤化してもよい。
【0058】
経皮剤として製剤化される場合、例えば、溶液、懸濁液、ジェル、クリーム、乳液などの剤形に製造してもよい。
【発明の効果】
【0059】
本発明による化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物の新規塩は、水溶解度に優れ、物理的、化学的安定性に優れているため、医薬品の製剤化に有用に活用することができる。
【0060】
また、本発明は、化学式Ｉで表されるヘテロ環化合物またはその薬学的に許容可能な塩を用いることにより、炎症性サイトカインの受容体であるヤヌスキナーゼを効果的に阻害
することができ、アトピー性皮膚炎および炎症性腸疾患をそれぞれ効果的に治療および予防することができる。
することができ、アトピー性皮膚炎および炎症性腸疾患をそれぞれ効果的に治療および予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【発明を実施するための形態】
【0062】
以下、本発明の実施例について詳細に説明する。別段の定義がない限り、技術用語または科学用語を含めて本明細書で用いられる全ての用語は、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者にとって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に用いられる辞書に定義されているような用語は、関連技術の文脈上の意味と一致する意味を有するものとして解釈されるべきであり、本出願で明確に定義しない限り、理想的または過度に形式的な意味として解釈されない。
【0063】
図面それぞれにおいて、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊＜０．００１である。
【0064】
製造例１：（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドの合成
特許文献１に開示されている方法にしたがって表題の化合物を製造した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．４４（ｓ，１Ｈ），１０．５７（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１．８，３．７Ｈｚ，１Ｈ），６．１７－６．０３（ｍ，１Ｈ），４．３１－４．０１（ｍ，６Ｈ），３．９６－３．６２（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｍＪ＝３６．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０２（ｓ，１Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ），０．８４－０．７３（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ３６４（Ｍ＋Ｈ）＋
特許文献１に開示されている方法にしたがって表題の化合物を製造した。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ－ｄ６）δ１１．４４（ｓ，１Ｈ），１０．５７（ｓ，１Ｈ），７．８４（ｄ，Ｊ＝１０．２Ｈｚ，１Ｈ），７．３４（ｄ，Ｊ＝３．１Ｈｚ，１Ｈ），６．４８（ｄｄ，Ｊ＝１．８，３．７Ｈｚ，１Ｈ），６．１７－６．０３（ｍ，１Ｈ），４．３１－４．０１（ｍ，６Ｈ），３．９６－３．６２（ｍ，２Ｈ），３．０２（ｍＪ＝３６．６Ｈｚ，１Ｈ），２．０２（ｓ，１Ｈ），０．８８（ｓ，３Ｈ），０．８４－０．７３（ｍ，４Ｈ）；ＭＳ（ＥＳＩ＋）ｍ／ｚ３６４（Ｍ＋Ｈ）＋
【0065】
実施例１：塩酸塩の製造
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにメタノール９０ｍＬを入れて攪拌し、５０℃まで加熱した。次いで、塩酸（ｉｎ ＭｅＯＨ）１．１ｅｑ．をゆっくりと滴加および５０℃で２時間攪拌して溶液を得た。前記溶液を常温に冷却して沈殿させた。次いで、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量３１．１ｇ、収率９４％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図１に示す。
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにメタノール９０ｍＬを入れて攪拌し、５０℃まで加熱した。次いで、塩酸（ｉｎ ＭｅＯＨ）１．１ｅｑ．をゆっくりと滴加および５０℃で２時間攪拌して溶液を得た。前記溶液を常温に冷却して沈殿させた。次いで、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量３１．１ｇ、収率９４％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図１に示す。
【0066】
実施例２：臭化水素酸塩の製造
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにアセトン３００ｍＬを入れて攪拌した。次いで、臭化水素酸１．１ｅｑ．をゆっくりと滴加および攪拌し、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量３４．４ｇ、収率９４％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図２に示す。
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにアセトン３００ｍＬを入れて攪拌した。次いで、臭化水素酸１．１ｅｑ．をゆっくりと滴加および攪拌し、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量３４．４ｇ、収率９４％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図２に示す。
【0067】
実施例３：リン酸塩の製造
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにメタノール９０ｍＬを入れて攪拌し、５０℃まで加熱した。次いで、リン酸１．０５ｅｑ．を添加および５０℃で１時間攪拌して溶液を得た。前記溶液を常温に冷却し、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量４０ｇ、収率８５％）をオレンジ色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図３に示す。
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにメタノール９０ｍＬを入れて攪拌し、５０℃まで加熱した。次いで、リン酸１．０５ｅｑ．を添加および５０℃で１時間攪拌して溶液を得た。前記溶液を常温に冷却し、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量４０ｇ、収率８５％）をオレンジ色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図３に示す。
【0068】
実施例４：カムシル酸塩の製造
２０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにエタノール２００ｍＬを入れて攪拌した。次いで、カンファースルホン酸１．０５ｅｑ．を添加および常温で攪拌し、濾過してエタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量２４．１ｇ、収率９２％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図４に示す。
２０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにエタノール２００ｍＬを入れて攪拌した。次いで、カンファースルホン酸１．０５ｅｑ．を添加および常温で攪拌し、濾過してエタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量２４．１ｇ、収率９２％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図４に示す。
【0069】
実施例５：シュウ酸塩の製造
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにアセトニトリル５１０ｍＬを入れて攪拌した。次いで、シュウ酸１．０５ｅｑ．を添加および常温で攪拌し、濾過してアセトニトリルで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量２９．１ｇ、収率６６％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図５に示す。
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにアセトニトリル５１０ｍＬを入れて攪拌した。次いで、シュウ酸１．０５ｅｑ．を添加および常温で攪拌し、濾過してアセトニトリルで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量２９．１ｇ、収率６６％）を黄色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図５に示す。
【0070】
実施例６：メシル酸塩の製造
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドに酢酸エチル３００ｍＬを入れて攪拌し、５０℃まで加熱した。次いで、メタンスルホン酸１．１ｅｑ．をゆっくりと滴加および同じ温度で攪拌し続け、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量３５．３ｇ、収率９３％）をオレンジ色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図６に示す。
３０ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドに酢酸エチル３００ｍＬを入れて攪拌し、５０℃まで加熱した。次いで、メタンスルホン酸１．１ｅｑ．をゆっくりと滴加および同じ温度で攪拌し続け、濾過してメタノールで洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物（収量３５．３ｇ、収率９３％）をオレンジ色粉末として得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図６に示す。
【0071】
実施例７：ナパジシル酸塩の製造
１ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにアセトニトリル２０ｍＬを入れて攪拌した。次いで、５０℃に昇温して１，５－ナフタレンジスルホン酸１．０５ｅｑ．を添加および攪拌し、濾過して洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物を得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図７に示す。
１ｇの（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミドにアセトニトリル２０ｍＬを入れて攪拌した。次いで、５０℃に昇温して１，５－ナフタレンジスルホン酸１．０５ｅｑ．を添加および攪拌し、濾過して洗浄した後、真空乾燥して、表題化合物を得た。表題化合物の形成を確認するためにＮＭＲ分析を行った。その結果を図７に示す。
【0072】
分析および測定方法
１．水溶解度の測定
水溶解度は、飽和溶液（２０ｍｇ／０．５ｍＬ）を室温で２４時間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）して測定した。溶液中の液状を取り０．２２μｍＰＶＤＦフィルターを用いて濾過した。濾液は、ＬＣ分析のために１０倍希釈した。
１．水溶解度の測定
水溶解度は、飽和溶液（２０ｍｇ／０．５ｍＬ）を室温で２４時間振盪（ｓｈａｋｉｎｇ）して測定した。溶液中の液状を取り０．２２μｍＰＶＤＦフィルターを用いて濾過した。濾液は、ＬＣ分析のために１０倍希釈した。
【0073】
ＬＣ分析は、以下の方法で行った。
【0074】
【表1】
【0075】
【表2】
【0076】
２．物理的安定性評価実験
物理的安定性を評価するために、検体を（（ＬＰＤＥ＋Ｎ２）＋Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
１ｇ＋ＬＤＰＥ）＋Ａｌ－Ｂａｇで包装し、苛酷条件（６０℃±２℃／８０％ＲＨ±５％）で苛酷２／４週間保管した後、評価した。
物理的安定性を評価するために、検体を（（ＬＰＤＥ＋Ｎ２）＋Ｓｉｌｉｃａ ｇｅｌ
１ｇ＋ＬＤＰＥ）＋Ａｌ－Ｂａｇで包装し、苛酷条件（６０℃±２℃／８０％ＲＨ±５％）で苛酷２／４週間保管した後、評価した。
【0077】
３．光安定性評価実験
検体をＬＤＰＥ ｂａｇで包装してＶｉｓｉｂｌｅ（１．２Ｍ Ｌｕｘ－ｈ）、ＵＶ（２００Ｗ－ｈ／ｍ２）およびＵＶ＋Ｖｉｓｉｂｌｅのそれぞれの条件下で保管した後、評価した。
検体をＬＤＰＥ ｂａｇで包装してＶｉｓｉｂｌｅ（１．２Ｍ Ｌｕｘ－ｈ）、ＵＶ（２００Ｗ－ｈ／ｍ２）およびＵＶ＋Ｖｉｓｉｂｌｅのそれぞれの条件下で保管した後、評価した。
【0078】
４．吸湿性評価実験
検体を相対湿度が３３％、５３％、７５％および９３％に調整されたガラスデシケータに入れ、２週間および４週間保管した後、評価した。
検体を相対湿度が３３％、５３％、７５％および９３％に調整されたガラスデシケータに入れ、２週間および４週間保管した後、評価した。
【0079】
分析／測定／評価結果
１．水溶解度測定結果
実施例１～６で得られた塩の水溶解度測定結果を下記表１に示す。
１．水溶解度測定結果
実施例１～６で得られた塩の水溶解度測定結果を下記表１に示す。
【0080】
【表3】
【0081】
表１を参照すれば、本発明による塩の水溶解度は、少なくとも０．９ｍｇ／ｍＬ以上であることが確認できる。特に、塩酸塩、臭化水素酸塩、カムシル酸塩、シュウ酸塩およびリン酸塩の水溶解度は、１．９ｍｇ／ｍＬ以上で優れており、さらに塩酸塩、臭化水素酸塩およびシュウ酸塩は、４ｍｇ／ｍＬ超の非常に優れた水溶解度を示すことが確認できる。
【0082】
２．物理的安定性評価結果
実施例１～４で得られた塩の物理的安定性評価結果を下記表２に示す。
表２において、ｉｎｉｔｉａｌは、塩を製造した後に測定した結果であり、Ｓ２ＷおよびＳ４Ｗは、それぞれ苛酷条件に暴露された状態で２週間後および４週間後に測定した結果である。
実施例１～４で得られた塩の物理的安定性評価結果を下記表２に示す。
表２において、ｉｎｉｔｉａｌは、塩を製造した後に測定した結果であり、Ｓ２ＷおよびＳ４Ｗは、それぞれ苛酷条件に暴露された状態で２週間後および４週間後に測定した結果である。
【0083】
【表4】
【0084】
【表5】
【0085】
表２を参照すれば、苛酷条件に暴露前／後の純度、含有量などの結果から、本発明による塩は、水分および熱に対する安定性に優れていることが確認できる。特に、純度において、苛酷条件に暴露されてからも個々の類縁物質および総類縁物質のそれぞれは、原料薬品の品質基準にも適合することが確認できる。
【0086】
３．光安定性評価結果
前記光安定性評価方法により得られた本発明の実施例１～５による塩に関する結果は、
下記表３の通りである。
前記光安定性評価方法により得られた本発明の実施例１～５による塩に関する結果は、
下記表３の通りである。
【0087】
【表6】
【0088】
【表7】
【0089】
表３を参照すれば、本発明による塩は、紫外線および可視光線に対する安定性に優れていることが確認できる。特に、純度において、苛酷条件に暴露されてからも個々の類縁物質および総類縁物質のそれぞれは、原料薬品の品質基準にも適合することが確認できる。
【0090】
４．吸湿性評価結果
前記吸湿性評価方法により得られた本発明の実施例１～４による塩に関する結果は、下記表４の通りである。
前記吸湿性評価方法により得られた本発明の実施例１～４による塩に関する結果は、下記表４の通りである。
【0091】
【表8】
【0092】
【表9】
【0093】
表４を参照すれば、本発明による塩は、吸湿性が低いことが確認できる。
【0094】
実験例１：ＡＤＰ－Ｇｌｏキナーゼアッセイ
（１）ＪＡＫ１ キナーゼアッセイ（ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）
製造例１で得られた化学式ＩＩで表されるヘテロ環化合物である、（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミド（以下、化合物１という）１０ｍＭをＤＭＳＯに希釈し、５つの濃度のサンプル（１，０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、０．１６ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ
ＡＴＰと１０ｍｇ／ｍＬ ＩＲＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１／４０および１／５０に希釈
して準備した。また、２２２ｎｇ／μＬのＪＡＫ１ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ
ｂｕｆｆｅｒで１／８に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＩＲＳおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＪＡＫ１ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ１ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３２ｎＭ）。
（１）ＪＡＫ１ キナーゼアッセイ（ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）
製造例１で得られた化学式ＩＩで表されるヘテロ環化合物である、（Ｓ）－Ｎ－（４－（１－（２－シアノアセチル）－３－メチル－１，２，３，６－テトラヒドロピリジン－４－イル）－１Ｈ－ピロロ［２，３－ｂ］ピリジン－６－イル）シクロプロパンカルボキサミド（以下、化合物１という）１０ｍＭをＤＭＳＯに希釈し、５つの濃度のサンプル（１，０００ｎＭ、２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、０．１６ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ
ＡＴＰと１０ｍｇ／ｍＬ ＩＲＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒでそれぞれ１／４０および１／５０に希釈
して準備した。また、２２２ｎｇ／μＬのＪＡＫ１ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ
ｂｕｆｆｅｒで１／８に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＩＲＳおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＪＡＫ１ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ１ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度２００ｎＭ、４０ｎＭ、８ｎＭ、１．６ｎＭ、０．３２ｎＭ）。
【0095】
次いで、各チューブに５μＬのＡＤＰ－ｇｌｏを入れて３０℃で４０分間反応させた後、１０μＬのｋｉｎａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを入れて室温で１５分間反応させた。反応物１８μＬを３８４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、プレートリーダーを用いて発光度（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。
【0096】
（２）ＪＡＫ２ キナーゼアッセイ（ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）
１０ｍＭの化合物１をＤＭＳＯに希釈し、４つの濃度のサンプル（５，０００ｎＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭおよび５ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ ＡＴＰを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ
ｂｕｆｆｅｒで１／４０に希釈して準備した。ＩＧＦ１Ｒｔｉｄｅは、原液を１ｍｇ／ｍＬ用いた。１００ｎｇ／μＬのＪＡＫ２ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／２０に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＩＧＦ１Ｒｔｉｄｅおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＪＡＫ２ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ２ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ）。
１０ｍＭの化合物１をＤＭＳＯに希釈し、４つの濃度のサンプル（５，０００ｎＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭおよび５ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ ＡＴＰを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ
ｂｕｆｆｅｒで１／４０に希釈して準備した。ＩＧＦ１Ｒｔｉｄｅは、原液を１ｍｇ／ｍＬ用いた。１００ｎｇ／μＬのＪＡＫ２ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／２０に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＩＧＦ１Ｒｔｉｄｅおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＪＡＫ２ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ２ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ）。
【0097】
次いで、各チューブに５μＬのＡＤＰ－ｇｌｏを入れて３０℃で４０分間反応させた後、１０μＬのｋｉｎａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを入れて室温で１５分間反応させた。反応物１８μＬを３８４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、プレートリーダーを用いて発光度を測定した。
【0098】
（３）ＪＡＫ３ キナーゼアッセイ（ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）
１０ｍＭの化合物１をＤＭＳＯに希釈し、４つの濃度のサンプル（５０，０００ｎＭ、５，０００ｎＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ ＡＴＰを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／４０に希釈して準備した。Ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅは、原液を１ｍｇ／ｍＬ用いた。１００ｎｇ／μＬのＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／２０に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＰｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ）。
１０ｍＭの化合物１をＤＭＳＯに希釈し、４つの濃度のサンプル（５０，０００ｎＭ、５，０００ｎＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ ＡＴＰを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／４０に希釈して準備した。Ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅは、原液を１ｍｇ／ｍＬ用いた。１００ｎｇ／μＬのＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／２０に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＰｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度１０，０００ｎＭ、１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ）。
【0099】
次いで、各チューブに５μＬのＡＤＰ－ｇｌｏを入れて３０℃で４０分間反応させた後、１０μＬのｋｉｎａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを入れて室温で１５分間反応させた。反応物１８μＬを３８４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、プレートリーダーを用いて発光度（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。
【0100】
（４）Ｔｙｋ２ キナーゼアッセイ（ｋｉｎａｓｅ ａｓｓａｙ）
１０ｍＭの化合物１をＤＭＳＯに希釈し、５つの濃度のサンプル（５，０００ｎＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ ＡＴＰを１Ｘ ｋｉ
ｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／４０に希釈して準備した。Ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅは、原液を１ｍｇ／ｍＬ用いた。１００ｎｇ／μＬのＴｙｋ２ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／２に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＰｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＴｙｋ２ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ）。
１０ｍＭの化合物１をＤＭＳＯに希釈し、５つの濃度のサンプル（５，０００ｎＭ、５００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ）を準備した。１０ｍＭ ＡＴＰを１Ｘ ｋｉ
ｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／４０に希釈して準備した。Ｐｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅは、原液を１ｍｇ／ｍＬ用いた。１００ｎｇ／μＬのＴｙｋ２ ｅｎｚｙｍｅを１Ｘ ｋｉｎａｓｅ ｂｕｆｆｅｒで１／２に希釈して準備した。このように準備した１μＬのＡＴＰ、１μＬのＰｏｌｙ（Ｇｌｕ４、Ｔｙｒ１）ｐｅｐｔｉｄｅおよび１μＬの化合物１を混合し、最後に２μＬのＴｙｋ２ ｅｎｚｙｍｅを入れて３０℃で４０分間反応させた。ここで、ｂｌａｎｋ用としてＪＡＫ３ ｅｎｚｙｍｅを入れていないチューブと、陽性対照群として化合物１を入れていないチューブを一緒に準備した（サンプルの最終濃度１，０００ｎＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ、０．１ｎＭ）。
【0101】
次いで、各チューブに５μＬのＡＤＰ－ｇｌｏを入れて３０℃で４０分間反応させた後、１０μＬのｋｉｎａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔを入れて室温で１５分間反応させた。反応物１８μＬを３８４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに移し、プレートリーダーを用いて発光度（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を測定した。
【0102】
実験例２：インビトロ細胞アッセイ（Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ）
１．実験細胞（細胞株）の準備
ＵＴ－７／ＥＰＯ細胞は、ＥＰＯ受容体を発現する赤白血病細胞株（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であって、多くの先行研究でＪＡＫ１およびＪＡＫ２活性によって媒介されるＥＰＯ誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を評価するモデルとして頻繁に用いられている。したがって、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２の活性を評価するためにＵＴ－７／ＥＰＯ細胞を準備した。
１．実験細胞（細胞株）の準備
ＵＴ－７／ＥＰＯ細胞は、ＥＰＯ受容体を発現する赤白血病細胞株（ｅｒｙｔｈｒｏｌｅｕｋｅｍｉｃ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）であって、多くの先行研究でＪＡＫ１およびＪＡＫ２活性によって媒介されるＥＰＯ誘導ＳＴＡＴ５リン酸化を評価するモデルとして頻繁に用いられている。したがって、ＪＡＫ１およびＪＡＫ２の活性を評価するためにＵＴ－７／ＥＰＯ細胞を準備した。
【0103】
また、ＮＫ－９２細胞は、ナチュラルキラー細胞株（ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）としてＩＬ－２依存的に成長し、末梢血単核細胞（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ）に由来するため、ＩＬ－２によるＪＡＫ１およびＪＡＫ３の活性を評価するのに適している。したがって、ＪＡＫ１およびＪＡＫ３の活性を評価するためにＮＫ－９２細胞を準備した。
【0104】
さらに、Ｕ２ＯＳ細胞は、ＩＦＮ－ａｌｐｈａ Ｂ２およびＩＦＮ－γによるＪＡＫ１／ＴＹＫ２シグナル活性およびＳＴＡＴ１のリン酸化と関連があるという文献が存在する。したがって、ＳＴＡＴ１シグナルが強く発現する細胞株であるため、ＪＡＫ１およびＴＹＫ２を評価するためにＵ２ＯＳ細胞を準備した。
【0105】
２．試験物質および刺激源の調製
（１）試験物質の準備
試験物質をＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭに調製し、２０μＬずつ分注して－２０℃で保管した。
（１）試験物質の準備
試験物質をＤＭＳＯに溶解して１０ｍＭに調製し、２０μＬずつ分注して－２０℃で保管した。
【0106】
（２）刺激源の準備
ＥＰＯ：２０００Ｕ／０．５ｍＬのｓｔｏｃｋを５０μＬずつ分注して冷蔵保管した。
ＩＬ－２：２００μｇ／ｍＬのｓｔｏｃｋを調製し、５μＬずつ分注して保管し、２ｎｇ／ｍｌで処理した（ＩＬ－２１μｇ／ｍｌ＝１３０００Ｕ／ｍｌ）。
ＩＦＮ－ａｌｐｈａ Ｂ２：１×１０Ｕ／ｍＬのｓｔｏｃｋを希釈して用い、３００００Ｕ／ｍｌになるように処理した。
ＥＰＯ：２０００Ｕ／０．５ｍＬのｓｔｏｃｋを５０μＬずつ分注して冷蔵保管した。
ＩＬ－２：２００μｇ／ｍＬのｓｔｏｃｋを調製し、５μＬずつ分注して保管し、２ｎｇ／ｍｌで処理した（ＩＬ－２１μｇ／ｍｌ＝１３０００Ｕ／ｍｌ）。
ＩＦＮ－ａｌｐｈａ Ｂ２：１×１０Ｕ／ｍＬのｓｔｏｃｋを希釈して用い、３００００Ｕ／ｍｌになるように処理した。
【0107】
（３）Ａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍの準備
ＵＴ－７／ＥＰＯ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ：ＭＥＭ－ａｌｐｈａ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１２５６１－０５６）に５％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが含有されるように準備して用いた。
ＮＫ－９２ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ：ＨＢＳＳ、１％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが含有さ
れるように準備して用いた。
Ｕ２ＯＳ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ：ＨＢＳＳ、１％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが含有されるように準備して用いた。
ＵＴ－７／ＥＰＯ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ：ＭＥＭ－ａｌｐｈａ（Ｇｉｂｃｏ、ｃａｔ＃１２５６１－０５６）に５％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが含有されるように準備して用いた。
ＮＫ－９２ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ：ＨＢＳＳ、１％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが含有さ
れるように準備して用いた。
Ｕ２ＯＳ ｃｅｌｌ ａｓｓａｙ：ＨＢＳＳ、１％ＦＢＳおよび１％Ｐ／Ｓが含有されるように準備して用いた。
【0108】
３．サンプルの準備
培養中の細胞を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）した後、ＰＢＳで洗浄した。細胞株の大きさおよび適正反応濃度を設定し、１×１０５～１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した（５０μＬ／ｗｅｌｌ）。試験物質は、処理しようとする濃度の４Ｘで調製、１／５ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して５～６つの濃度で準備した。試験物質は、ａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍに１：１０００に希釈して２０μＬ／ｗｅｌｌで処理した。薬物処理をしない無処理群は、２０μＬ／ｗｅｌｌのａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍを処理し、１時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
培養中の細胞を遠心分離（１，０００ｒｐｍ、５分）した後、ＰＢＳで洗浄した。細胞株の大きさおよび適正反応濃度を設定し、１×１０５～１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように９６ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅにシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した（５０μＬ／ｗｅｌｌ）。試験物質は、処理しようとする濃度の４Ｘで調製、１／５ずつ連続希釈（ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して５～６つの濃度で準備した。試験物質は、ａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍに１：１０００に希釈して２０μＬ／ｗｅｌｌで処理した。薬物処理をしない無処理群は、２０μＬ／ｗｅｌｌのａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍを処理し、１時間ＣＯ２インキュベーターで培養した。
【0109】
試験物質を処理して１～２時間後に、サイトカインを１０μＬ／ｗｅｌｌ（最終ＥＰＯ濃度１Ｕ／ｍＬ、最終ＩＬ－２濃度２ｎｇ／ｍＬ、最終ＩＦＮ－ａｌｐｈａ Ｂ２濃度３００００Ｕ／ｍＬ）で処理した。ここで、サイトカイン単独処理群と無処理群が含まれるように試験を設計し、無処理群は、細胞をシーディング（ｓｅｅｄｉｎｇ）した後、ａｓｓａｙ ｍｅｄｉｕｍのみ１０μＬ処理した。
【0110】
前記のように、サイトカインで２０分間刺激した後、５Ｘ ＲＩＰＡ Ｂｕｆｆｅｒで細胞を３０分間溶解させ、４℃で５分間１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上清を新しいチューブに移してＥＬＩＳＡを行うか、または使用前まで－８０℃で保管した。
【0111】
４．ＥＬＩＳＡの実施
Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｃａｔ ｎｏ．７１１３、７２３４Ｃ）のプロトコルにしたがって行った。
Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ＥＬＩＳＡ ＫＩＴ（Ｃａｔ ｎｏ．７１１３、７２３４Ｃ）のプロトコルにしたがって行った。
【0112】
実験例３：ヒト全血アッセイ（Ｈｕｍａｎ ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ ａｓｓａｙ）
１．ＴＥＳＴ１：ＣＤ４＋ｃｅｌｌにおけるＩＬ－６誘導ＳＴＡＴ１リン酸化評価
製造例１で得られた化合物１のストックソリューション（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、蒸留水を用いて希釈した後、４％ ＤＭＳＯを用いて１／５に連続希釈した。１．７ｍＬ エッペンドルフチューブを用いて採取した１００μＬの全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に５μＬの試験物質を入れて混合した後、３７℃で４５分間培養した。
１．ＴＥＳＴ１：ＣＤ４＋ｃｅｌｌにおけるＩＬ－６誘導ＳＴＡＴ１リン酸化評価
製造例１で得られた化合物１のストックソリューション（ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を、蒸留水を用いて希釈した後、４％ ＤＭＳＯを用いて１／５に連続希釈した。１．７ｍＬ エッペンドルフチューブを用いて採取した１００μＬの全血（ｗｈｏｌｅ ｂｌｏｏｄ）に５μＬの試験物質を入れて混合した後、３７℃で４５分間培養した。
【0113】
ＩＬ－６（１０μｇ／ｍｌ）を０．１％ＢＳＡ／ＤＷを用いてそれぞれ１μｇ／ｍＬになるように希釈した。５μＬのＩＬ－６を入れて（最終濃度５０ｎｇ／ｍＬ）３７℃で１５分間培養した。ここで、非刺激対照群としては、５μＬのＤＰＢＳを添加した。Ｌｙｓｅ／ｆｉｘ ｂｕｆｆｅｒ ５Ｘを蒸留水で１Ｘに希釈して用いた。
【0114】
３７℃でｐｒｅ－ｗａｒｍｉｎｇしたｌｙｓｅ／ｆｉｘ ｂｕｆｆｅｒを各チューブに９００μＬずつ追加して３７℃で２０分間培養した後、遠心分離器で５００ｘｇで８分間遠心分離し、上清を除去し、ＦＡＣＳ ｂｕｆｆｅｒ １ｍＬで洗浄（ｗａｓｈ）した。洗浄工程を繰り返した。次いで、氷に予め入れておいたＢＤ Ｐｈｏｓｆｌｏｗ（登録商標） Ｐｅｒｍ ｂｕｆｆｅｒを４００μＬ入れ、氷で３０分間培養した後、スピンダウンした。洗浄緩衝液（ｗａｓｈ ｂｕｆｆｅｒ）で１回洗浄した後、緩衝液（ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（登録商標） ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）で再懸濁（ｒｅｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ）した。
【0115】
ＣＤ４とｐＳＴＡＴ１の二重染色（ｄｏｕｂｌｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）のために、染色
緩衝液（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）にａｎｔｉ－ＣＤとａｎｔｉ－ｐＳＴＡＴ１を混合し、サンプルそれぞれに添加した。サンプルが含まれたチューブを手で軽く叩いて抗体と細胞がよく混ざるようにした後、４℃で一晩放置した。翌日にＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて結果を分析した。
緩衝液（ｓｔａｉｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ）にａｎｔｉ－ＣＤとａｎｔｉ－ｐＳＴＡＴ１を混合し、サンプルそれぞれに添加した。サンプルが含まれたチューブを手で軽く叩いて抗体と細胞がよく混ざるようにした後、４℃で一晩放置した。翌日にＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用いて結果を分析した。
【0116】
２．ＴＥＳＴ２～６
サイトカインの種類および量を下記表５の通りにしたことを除いて、ＴＥＳＴ１の実験と実質的に同様の方法によりＴＥＳＴ２～ＴＥＳＴ６をそれぞれ行った。
サイトカインの種類および量を下記表５の通りにしたことを除いて、ＴＥＳＴ１の実験と実質的に同様の方法によりＴＥＳＴ２～ＴＥＳＴ６をそれぞれ行った。
【0117】
【表10】
【0118】
３．分析方法：資料収集およびＩＣ５０算出
ＦｌｏｗＪｏで分析した数値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ ｓｏｆｔｗａｒｅ（製品名）を用いてＩＣ５０値を算出した。
ＦｌｏｗＪｏで分析した数値をＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５ ｓｏｆｔｗａｒｅ（製品名）を用いてＩＣ５０値を算出した。
【0119】
Ｎｏ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ（ＮＴＲ）を基準に設定し、サイトカインによって誘導されたＳＴＡＴのリン酸化で誘導された程度を相対比率（％ｃｏｎｔｒｏｌ）に変換した。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ（ｖｅｒｓｉｏｎ ５．０）を用いて、各試験物質の濃度別活性で用量反応曲線（ｄｏｓｅ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｐｌｏｔ）を求め、ＩＣ５０値を算出した。
【0120】
実験例１～３の結果
前述した実験例１～３で得られた結果は、以下の通りである。
前述した実験例１～３で得られた結果は、以下の通りである。
【0121】
【表11】
【0122】
前記結果を参照すれば、本発明による化合物１は、ＪＡＫ１阻害活性に非常に優れていることが確認できる。
【0123】
実験例４：Ｂａｓｏｐｈｉｌ細胞におけるＩＬ－４分泌阻害能
ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１Ｘ １０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地に希釈して分注した。３７℃インキュベー
ターで１８時間以上培養した。
ＲＢＬ－２Ｈ３細胞を２４ ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅに１Ｘ １０５ ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌになるように１０％ＦＢＳ ＥＭＥＭ培地に希釈して分注した。３７℃インキュベー
ターで１８時間以上培養した。
【0124】
ＰＭＡ（５０ｎｍｏｌ／Ｌ）、Ａ２３１８７（１μｍｏｌ／Ｌ）刺激下で試験物質（化合物１）を濃度別（最終濃度０、０．１、０．５、１μＭ）に処理した。３７℃インキュベーターで２４時間培養した。次いで、氷の上で反応を終了させた後、培養上清をＩＬ－４ ＥＬＩＳＡ ｋｉｔでＩＬ－４の分泌程度を測定した。その結果を図８に示す。
【0125】
図８は、化合物１のＢａｓｏｐｈｉｌ細胞におけるＩＬ－４分泌阻害能の実験結果を示すグラフである。
【0126】
図８を参照すれば、本発明による化合物１を処理した群において、対照群（ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べＩＬ－４の濃度が低いことを確認できる。すなわち、本発明による化合物１は、ＩＬ－４分泌を阻害することが分かり、特に、０．５μＭおよび１μＭの濃度で化合物１を処理した場合、陰性対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べてほぼ１／２以上に著しく減少させられることを確認した。
【0127】
実験例５：ＩＬ－１３、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－α分泌能
細胞培養培地５０ｍＬにＤＮａｓｅＩ（２０００ｕｎｉｔ／ｍＬ）５０μＬを入れて混合した（ｅｎｚｙｍｅと細胞を用いるため、培地は３７℃水槽で温めて用いた）。また、アトピー患者のＰＭＢＣを３７℃水槽で素早く溶かした。
細胞培養培地５０ｍＬにＤＮａｓｅＩ（２０００ｕｎｉｔ／ｍＬ）５０μＬを入れて混合した（ｅｎｚｙｍｅと細胞を用いるため、培地は３７℃水槽で温めて用いた）。また、アトピー患者のＰＭＢＣを３７℃水槽で素早く溶かした。
【0128】
準備した培地にＰＭＢＣをゆっくりと流し入れ、３７℃で５分間反応させた。遠心分離器を用いて２００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、上清（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔｓ）を除去した後、細胞培養培地１ｍＬで懸濁させてカウントした。
【0129】
２×１０５ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ｗｅｌｌになるように細胞培養培地に希釈して９６ウェルプレートにシーディングした。
【0130】
陰性対照群のｗｅｌｌを除く全てのｗｅｌｌに、ＰＢＭＣ活性化培地（０．５μｇ／ｍｌ ＣＤ３ ａｎｔｉｂｏｄｙ、５μｇ／ｍｌ ＣＤ２８ ａｎｔｉｂｏｄｙ）を５０μＬずつ入れた（陰性対照群のｗｅｌｌには、細胞培養培地を５０μＬずつ入れた）。
【0131】
試験物質を各濃度に合わせてｗｅｌｌに５０μＬずつ入れた（最終濃度１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、１、０００ｎＭ、陰性対照群のｗｅｌｌには、細胞培養培地を５０μＬずつ入れた）。
【0132】
３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した後、２００ｒｐｍで１５分間プレートごと遠心分離し、懸濁液１５０μＬを取って丸底タイプの９６ウェルプレートに入れ、－８０℃の急速冷凍庫（ｄｅｅｐ ｆｒｅｅｚｅｒ）で保管した。
【0133】
培養上清サンプルを溶かした後、ＥＬＩＳＡ ｋｉｔのデータシートプロトコルにしたがってＥＬＩＳＡを行った。その結果を図９に示す。
【0134】
図９は、本発明の化合物１のＩＬ－１３、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－α分泌能の評価結果グラフを示す図面である。
【0135】
図９を参照すれば、アトピー性皮膚炎患者のａｎｔｉ－ＣＤ３およびａｎｔｉ－ＣＤ２８活性化したＰＢＭＣにおいて、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αのそれぞれが減少していることを確認できる。特に、化合物１を１００ｎＭおよび１，０００ｎＭの濃度で実験した群では、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０およびＴＮＦ－αのそれぞれが有意に減少
していることを確認できる。
していることを確認できる。
【0136】
実験例６：ＤＮＣＢ誘導モデル（ｔｏｐｉｃａｌ）
１．アトピーモデルの誘導および試験物質の処理（図１０）
ＮＣ／Ｎｇａマウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔した後、背中の毛（耳の下から尻尾の上まで）を除去した。ＮＣ／Ｎｇａマウスは、剃毛の際に皮膚についた微細な傷を回復させるため２４時間放置した。
１．アトピーモデルの誘導および試験物質の処理（図１０）
ＮＣ／Ｎｇａマウスをイソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）で麻酔した後、背中の毛（耳の下から尻尾の上まで）を除去した。ＮＣ／Ｎｇａマウスは、剃毛の際に皮膚についた微細な傷を回復させるため２４時間放置した。
【0137】
治癒後に、アセトン／オリーブオイル（３：１）に入っている１％の１－クロロ－２，４－ジニトロベンゼン（ＤＮＣＢ）２００μＬを背中の皮膚に局所的に塗布した（１次皮膚塗布）。２次皮膚塗布は、感作のために３日後に行った。
【0138】
１次皮膚塗布を行って７日後からはアセトン／オリーブオイル（３：１）に入っている０．４％のＤＮＣＢ１５０μＬを局所的に塗布し、５週間週３回ずつ背中の皮膚に塗布した。
【0139】
実施例３で得られた化合物１のリン酸塩（以下、リン酸塩化合物という）を試験物質とし、試験物質は、１次皮膚塗布を行った日より２週間後からＤＮＣＢを塗布する前に先に処理した。試験物質の投与量は、投与当日に測定したマウスの体重を基に計算し、試験物質は、ガラススティックを用いてアトピー皮膚に局所塗布した（２８日間１日２回ずつ合計５６回、治療間隔６時間）。対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）には、０．５％ メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（０．５％ＭＣ）を投与した。
【0140】
２．剖検
１次皮膚塗布を行ってから６週目に、試験動物を剖検した。具体的には、試験動物は、イソフルランを用いて麻酔した後、後大静脈から注射器でなるべく多い血液を採取し、血栓活性化剤が入っている５ｍＬ真空管で保管した。血液は、凝固させるために室温で１５～２０分間放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
１次皮膚塗布を行ってから６週目に、試験動物を剖検した。具体的には、試験動物は、イソフルランを用いて麻酔した後、後大静脈から注射器でなるべく多い血液を採取し、血栓活性化剤が入っている５ｍＬ真空管で保管した。血液は、凝固させるために室温で１５～２０分間放置した後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。
【0141】
３．評価方法
（１）臨床アトピー性皮膚炎スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅ）
アトピー性皮膚炎スコアは、５つの症状（紅斑、乾燥、皮膚浮腫および血腫、侵食、角化）それぞれに対し、なし（０）、軽症（１）、中等症（２）、重症（３）の段階で評価した。臨床的重症度を示す総スコアは、全てのスコアの合計で定義した（最大スコア：１５）。評価は、週２回、同じ研究者が同時に行った。
（１）臨床アトピー性皮膚炎スコア（Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｔｏｐｉｃ Ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ Ｓｃｏｒｅ）
アトピー性皮膚炎スコアは、５つの症状（紅斑、乾燥、皮膚浮腫および血腫、侵食、角化）それぞれに対し、なし（０）、軽症（１）、中等症（２）、重症（３）の段階で評価した。臨床的重症度を示す総スコアは、全てのスコアの合計で定義した（最大スコア：１５）。評価は、週２回、同じ研究者が同時に行った。
【0142】
（２）かゆみ行動テスト
４週目にかゆみ行動を評価するために、マウスをケージに入れて引っ掻く頻度を３０分間評価した。
４週目にかゆみ行動を評価するために、マウスをケージに入れて引っ掻く頻度を３０分間評価した。
【0143】
（３）血清ＩｇＥおよびヒスタミン
血清中ＩｇＥおよびヒスタミンＥＬＩＳＡキットを用いて定量分析を行った。
血清中ＩｇＥおよびヒスタミンＥＬＩＳＡキットを用いて定量分析を行った。
【0144】
（４）脾臓／体重
脾臓とマウスの体重を測定した後、脾臓の対体重比（相対臓器重量）を計算した。
脾臓とマウスの体重を測定した後、脾臓の対体重比（相対臓器重量）を計算した。
【0145】
（５）ｑＲＴ－ＰＣＲ
ＴＡＲＣ、ＴＳＬＰ、ＩＬ－４、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは、皮膚組織を用いてｑＲＴ－ＰＣＲで定量化した。
ＴＡＲＣ、ＴＳＬＰ、ＩＬ－４、ＩＬ－１βおよびＴＮＦ－αは、皮膚組織を用いてｑＲＴ－ＰＣＲで定量化した。
【0146】
（６）組織病理学的分析
剖検当日、１０％中性緩衝ホルマリン溶液の皮膚をＨ＆Ｅおよびトルイジンブルーで染色して分析した。
剖検当日、１０％中性緩衝ホルマリン溶液の皮膚をＨ＆Ｅおよびトルイジンブルーで染色して分析した。
【0147】
図１１～１６の実験例６の評価結果を全て参照すれば、本発明によるリン酸塩化合物は、アトピー性皮膚炎の症状を改善することが確認できる。図１１～１６において、「ｃｏｍｐｏｕｎｄ１」は、実施例３で得られた「リン酸塩化合物」を意味するものである。
【0148】
具体的には、図１１は、実験例６の臨床アトピー性皮膚炎スコアの結果を示すグラフであり、これを参照すれば、リン酸塩化合物を投与した群の皮膚重症度スコア（ｓｋｉｎ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）は、有意に減少していることが確認できる。
【0149】
図１２は、実験例６のかゆみ行動テストの結果を示すグラフである。図１２を参照すれば、リン酸塩化合物を投与した群において、引っ掻く行動が対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて少なくとも３０％以上減少していることが確認できる。特に、リン酸塩化合物３％投与群は、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて５０％以上減少しており、正常マウス（Ｎｏｒｍａｌ）レベルまで著しく減少していることが確認できる。
【0150】
図１３および図１４は、実験例６のサイトカイン分析結果（血漿、皮膚）を示す図面であり、図１３（上）のグラフは、血漿ヒスタミン濃度（ｎｇ／ｍＬ）を、図１３（下）は、血漿ＩｇＥ濃度（ｎｇ／ｍＬ）を示す。図１３および図１４を参照すれば、リン酸塩化合物が投与された群で血漿および皮膚のアトピー性皮膚炎関連サイトカインが減少していることを確認できる。
【0151】
図１５は、実験例６の脾臓の対体重比の計算結果を示すグラフであり、リン酸塩化合物を投与した群において脾臓の対体重比の値が減少していることを確認できる。
【0152】
図１６は、実験例６の皮膚染色結果を示す図面であり、リン酸塩化合物の処理がアトピー性皮膚炎の組織学的特徴を変化させたことを確認できる。
【0153】
実験例７：ＤＮＣＢ誘導モデル（ＰＯ）
リン酸塩化合物を経口で投与したことを除いて、実験例６のＤＮＣＢモデル（ｔｏｐｉｃａｌ）と実質的に同様にＤＮＣＢ誘導された動物モデルを準備し、実施例３で得られたリン酸塩化合物を投与した。リン酸塩化合物の投与は、２８日間１日２回ずつ合計５６回経口投与し、投与間隔は８時間であった。投与量（１０ｍＬ／ｋｇ）は、投与当日に測定した体重を基に計算し、１ｍＬ注射器とゾンデを用いてマウスの口から胃内に投与した。対照群には０．５％メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（０．５％ＭＣ）を投与した。
リン酸塩化合物を経口で投与したことを除いて、実験例６のＤＮＣＢモデル（ｔｏｐｉｃａｌ）と実質的に同様にＤＮＣＢ誘導された動物モデルを準備し、実施例３で得られたリン酸塩化合物を投与した。リン酸塩化合物の投与は、２８日間１日２回ずつ合計５６回経口投与し、投与間隔は８時間であった。投与量（１０ｍＬ／ｋｇ）は、投与当日に測定した体重を基に計算し、１ｍＬ注射器とゾンデを用いてマウスの口から胃内に投与した。対照群には０．５％メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）（０．５％ＭＣ）を投与した。
【0154】
図１７は、実験例７の臨床アトピー性皮膚炎スコアの結果を示すグラフであり、図１８は、実験例７のかゆみ行動テストの結果を示すグラフであり、図１９は、実験例７の脾臓の対体重比の計算結果を示すグラフである。図１７～図１９において、「ｃｏｍｐｏｕｎｄ１」は、実施例３で得られた「リン酸塩化合物」を意味するものである。
【0155】
【0156】
実験例８：ＤＳＳ誘導モデル（図２０）
１．大腸炎の誘導および試験物質の処理
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに大腸炎を誘発するために、飲み水に３％Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｐｈａｔｅ（ＤＳＳ）を処理して８日間毎朝提供し、陰性対照群には０％ＤＳＳを提供した。
１．大腸炎の誘導および試験物質の処理
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスに大腸炎を誘発するために、飲み水に３％Ｄｅｘｔｒａｎ Ｓｏｄｉｕｍ Ｓｕｌｐｈａｔｅ（ＤＳＳ）を処理して８日間毎朝提供し、陰性対照群には０％ＤＳＳを提供した。
【0157】
マウスを複数の群にグルーピングした後（ｄａｙ０）、１日から７日まで毎日午前９時と午後５時に０．５％メチルセルロース（ｍｅｔｈｙｌｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）および製造例１で得られた化合物１を試験物質とし、マウスに経口投与した。８日目に試験動物を剖検した。
【0158】
２．分析方法
（１）動物の疾患活動性指数
疾患活動性指数（ＤＡＩ）は、疾患の重症度を表すために体重、便濃度および便血液スコアで計算した。研究開始時と開始後２４時間ごとに体重と飲食摂取をモニタリングして評価し、糞便サンプルは、０、３、５、７日に回収して下記表６にしたがって分析した。
（１）動物の疾患活動性指数
疾患活動性指数（ＤＡＩ）は、疾患の重症度を表すために体重、便濃度および便血液スコアで計算した。研究開始時と開始後２４時間ごとに体重と飲食摂取をモニタリングして評価し、糞便サンプルは、０、３、５、７日に回収して下記表６にしたがって分析した。
【0159】
【表12】
【0160】
（２）結腸（ｃｏｌｏｎ）の重量対長さ比
剖検して得た結腸の重量および長さをそれぞれ測定した後、重量対長さ比を計算した。
剖検して得た結腸の重量および長さをそれぞれ測定した後、重量対長さ比を計算した。
【0161】
（３）血漿と大腸内バイオマーカーの検出
８日目に心臓から、ＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固剤が含まれた遠心分離チューブに血液を採取した。遠心分離（７０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、血漿を分離し、ＫＣおよびＭＩＰ－２をＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔで測定した。
８日目に心臓から、ＥＤＴＡ－Ｋ２抗凝固剤が含まれた遠心分離チューブに血液を採取した。遠心分離（７０００ｒｐｍ、１０分、４℃）した後、血漿を分離し、ＫＣおよびＭＩＰ－２をＭｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｋｉｔで測定した。
【0162】
大腸組織の一部（各動物に対して同一の位置）からｍＲＮＡを抽出し、組織のＭＸ２およびＴＮＦ－ａｌｐｈａの発現量をｑＰＣＲで分析した。
【0163】
（３）組織病理学スコア
１０％ホルマリンで固定した大腸部分をパラフィンを用いて切断し、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ染色した。結腸の組織学的変化に関する基準は、下記表７にしたがった。
１０％ホルマリンで固定した大腸部分をパラフィンを用いて切断し、ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ－ｅｏｓｉｎ染色した。結腸の組織学的変化に関する基準は、下記表７にしたがった。
【0164】
【表13】
【0165】
【0166】
図２１は、実験例８の疾患活動性指数の分析結果を示すグラフである。
【0167】
図２１を参照すれば、正常群を除く全ての群において、経時的に疾患活動性指数が増加することを確認できるが、本発明の化合物１を投与した群における疾患活動性指数は、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べてその増加程度が低いことが分かる。特に、化合物１の９０ｍｇ／ｋｇ投与群では、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて疾患活動性指数が半分程度に減少していることが分かる。
【0168】
図２２は、実験例８の結腸の重量対長さ比の結果を示すグラフである。
【0169】
図２２を参照すれば、正常群以外の全ての群において、正常群に比べて重量対長さ比が高いことが分かる。しかし、化合物１が投与された群は、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べてその値が低いことが確認できる。これにより、対照群は、大腸に炎症が起きた状態がそのまま維持または悪化し、大腸の重量が増加して長さが減少した反面、化合物１が投与された群では、大腸炎が改善され、症状が軽くなったことを確認することができる。
【0170】
図２３は、実験例８の血漿と大腸内バイオマーカーの検出結果を示す図面である。
【0171】
図２３を参照すれば、本発明の化合物１を投与した群は、大腸炎症環境において、血漿中増加するバイオマーカーであるＫＣおよびＭＩＰ－２のそれぞれの濃度が減少していることを確認できる。また、本発明の化合物１を投与した群の結腸中ＭＸ２およびＴＮＦ－ａｌｐｈａの発現量も減少していることが確認できる。これらより、結腸で炎症と関連したバイオマーカーの増加も防げることが分かる。
【0172】
図２４は、実験例８の組織病理学スコアの結果を示すグラフであり、本発明の化合物１を投与した群は、組織病理学スコアが低くなったことを確認できる。
【0173】
実験例９：ＤＮＢＳ誘導モデル（図２５）
１．大腸炎の誘導および試験物質の処理
毎週ＤＮＢＳで大腸炎を誘発する前に、実験動物は２４時間絶食した。絶食した動物は、イソフルランで軽く麻酔し、長さ８ｃｍのカテーテルチューブをラットの肛門に挿入した後、ＤＮＢＳ［１５ｍｇ（１ｓｔ ｗｅｅｋ）、３０ｍｇ（２ｎｄ ｗｅｅｋ）、４５ｍｇ（３ｒｄ ｗｅｅｋ） ａｎｄ ６０ｍｇ（４ｔｈ ｗｅｅｋ） ｉｎ ２５０μＬ
５０％ ｅｔｈａｎｏｌ］溶液２５０μＬを注射器ポンプで１００μＬ／分の速度でゆっくりと注入し、大腸炎を誘発した。溶液を注入した後、溶液が動物の腸に均等に広がり体外に漏れないように、Ｈｅａｄ－ｄｏｗｎ姿勢を１分間保持した。
１．大腸炎の誘導および試験物質の処理
毎週ＤＮＢＳで大腸炎を誘発する前に、実験動物は２４時間絶食した。絶食した動物は、イソフルランで軽く麻酔し、長さ８ｃｍのカテーテルチューブをラットの肛門に挿入した後、ＤＮＢＳ［１５ｍｇ（１ｓｔ ｗｅｅｋ）、３０ｍｇ（２ｎｄ ｗｅｅｋ）、４５ｍｇ（３ｒｄ ｗｅｅｋ） ａｎｄ ６０ｍｇ（４ｔｈ ｗｅｅｋ） ｉｎ ２５０μＬ
５０％ ｅｔｈａｎｏｌ］溶液２５０μＬを注射器ポンプで１００μＬ／分の速度でゆっくりと注入し、大腸炎を誘発した。溶液を注入した後、溶液が動物の腸に均等に広がり体外に漏れないように、Ｈｅａｄ－ｄｏｗｎ姿勢を１分間保持した。
【0174】
製造例１で得られた化合物１を試験物質とし、試験物質は、体重を基に個体別の投与量を換算し、体重ｋｇ当たり１０ｍＬを１日１回、週７日、合計４週間経口投与した。
【0175】
２．評価方法
（１）大腸の重量および長さの比率測定
犠牲された実験動物から摘出した大腸組織は、大腸の長さを測定するために写真撮影を行った。撮影した写真は、画像解析ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｓｕｉｔｅ Ｖ４）を用いて大腸の長さを測定した。写真撮影を終えた組織は、盲腸を除去した後、縦軸に開いて生理食塩水で洗浄し、重量を測定した。測定した重量と長さを用いて大腸比率（ｍｇ／ｃｍ）（＝大腸重量（ｍｇ）／大腸長さ（ｃｍ））を換算した。
（１）大腸の重量および長さの比率測定
犠牲された実験動物から摘出した大腸組織は、大腸の長さを測定するために写真撮影を行った。撮影した写真は、画像解析ソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
Ｓｕｉｔｅ Ｖ４）を用いて大腸の長さを測定した。写真撮影を終えた組織は、盲腸を除去した後、縦軸に開いて生理食塩水で洗浄し、重量を測定した。測定した重量と長さを用いて大腸比率（ｍｇ／ｃｍ）（＝大腸重量（ｍｇ）／大腸長さ（ｃｍ））を換算した。
【0176】
（２）血清におけるバイオマーカーの測定
剖検の際に採取した血清におけるＣａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ ＆ ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）およびＩＦＮ－γは、ＥＬＩＳＡにより分析した。
剖検の際に採取した血清におけるＣａｌｐｒｏｔｅｃｔｉｎ ＆ ｃ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ｐｒｏｔｅｉｎ（ＣＲＰ）およびＩＦＮ－γは、ＥＬＩＳＡにより分析した。
【0177】
（３）免疫組織化学染色
大腸組織の免疫組織化学的変化を観察するために、それぞれのスライドに抗体ＭＸ２を反応させ、組織においてＭＸ２が発現する部位を計算した。
大腸組織の免疫組織化学的変化を観察するために、それぞれのスライドに抗体ＭＸ２を反応させ、組織においてＭＸ２が発現する部位を計算した。
【0178】
【0179】
図２６を参照すれば、試験物質である化合物１は、ＩＢＤ ｒａｔモデルで効能を示すことが確認できる。化合物１の投与群が、対照群（Ｖｅｈｉｃｌｅ）に比べて有意に低いレベルの前炎症性サイトカインを生成したことが確認できる。
【0180】
実験例１０：ＨＤＭ誘導モデル
１．アトピーモデルの誘導および試験物質の処理（図２７）
（１）初回の誘発方法
ＮＣ／Ｎｇａマウスの耳および首の後ろ部分をシェーバーで剃毛した後、除毛剤を適量塗布して除毛を行った。除毛剤をふき取った後、アトピー性皮膚炎誘発試薬（Ｂｉｏｓｔｉｒ社製、日本）約１００ｍｇをマイクロピペットチップを用いて耳および首の後ろ部分に均一に塗布した。
１．アトピーモデルの誘導および試験物質の処理（図２７）
（１）初回の誘発方法
ＮＣ／Ｎｇａマウスの耳および首の後ろ部分をシェーバーで剃毛した後、除毛剤を適量塗布して除毛を行った。除毛剤をふき取った後、アトピー性皮膚炎誘発試薬（Ｂｉｏｓｔｉｒ社製、日本）約１００ｍｇをマイクロピペットチップを用いて耳および首の後ろ部分に均一に塗布した。
【0181】
（２）２回目以降の誘発方法
必要に応じてシェーバーで剃毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットを用いて耳および首の後ろ部分に均一に塗布した。ドライヤーで冷風乾燥させた後、約２～３時間自然乾燥させた。ＡＤ誘発試薬約１００ｍｇをマイクロピペットチップを用いて耳および首の後ろ部分に均一に塗布した。全ての前処理は、週２回、合計６週間に１１回処理した。
必要に応じてシェーバーで剃毛した後、４％ＳＤＳ水溶液１５０μＬをマイクロピペットを用いて耳および首の後ろ部分に均一に塗布した。ドライヤーで冷風乾燥させた後、約２～３時間自然乾燥させた。ＡＤ誘発試薬約１００ｍｇをマイクロピペットチップを用いて耳および首の後ろ部分に均一に塗布した。全ての前処理は、週２回、合計６週間に１１回処理した。
【0182】
（３）投与試験物質の調製
試験物質として実施例３で得られた化合物１のリン酸塩を適量秤量し、局所ビヒクル（ａｃｅｔｏｎｅ：ＤＭＳＯ＝７：１ｖ／ｖ）に溶かして調製した。調製および投薬の際に試験物質は、遮光状態を保持し、遮光冷蔵条件で３日ごとに調製して用いた。
試験物質として実施例３で得られた化合物１のリン酸塩を適量秤量し、局所ビヒクル（ａｃｅｔｏｎｅ：ＤＭＳＯ＝７：１ｖ／ｖ）に溶かして調製した。調製および投薬の際に試験物質は、遮光状態を保持し、遮光冷蔵条件で３日ごとに調製して用いた。
【0183】
（４）投与
アトピースコアが２．１～２．３点に達する時点から試験物質の投与を始め、試験物質の投与開始日（Ｄａｙ０）から剖検日まで２回／日、３週間皮膚中央部に直接塗布した。
アトピースコアが２．１～２．３点に達する時点から試験物質の投与を始め、試験物質の投与開始日（Ｄａｙ０）から剖検日まで２回／日、３週間皮膚中央部に直接塗布した。
【0184】
２．剖検
剖検日の２４時間前にＡＤ誘発物質を塗布して感作し、剖検の１時間前に薬物を投与および塗布した。アトピー性皮膚炎を誘発して２４時間後に動物を麻酔し、麻酔されたことを確認してから開腹し、後大静脈から注射器で採血を行った。採血後に該動物を安楽死させ、誘発部位（皮膚および耳）を摘出した。摘出した皮膚は、２つに分け、半分は、１０％中性緩衝ホルマリン溶液に固定し、残り半分は、分析前まで超低温冷凍庫（約－７０℃）で保管した。
剖検日の２４時間前にＡＤ誘発物質を塗布して感作し、剖検の１時間前に薬物を投与および塗布した。アトピー性皮膚炎を誘発して２４時間後に動物を麻酔し、麻酔されたことを確認してから開腹し、後大静脈から注射器で採血を行った。採血後に該動物を安楽死させ、誘発部位（皮膚および耳）を摘出した。摘出した皮膚は、２つに分け、半分は、１０％中性緩衝ホルマリン溶液に固定し、残り半分は、分析前まで超低温冷凍庫（約－７０℃）で保管した。
【0185】
３．評価方法
（１）臨床アトピー性皮膚炎スコア
アトピー性皮膚炎を評価するために、アトピー性皮膚炎の誘発を開始して０週目から皮膚臨床指数評価（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を行った。皮膚臨床指数評価（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、擦り傷／侵食（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）および鱗屑／乾燥（ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ）に対して、なし（０）、軽症（１）、中等症（２）、重症（３）で評価し、評価段階は、Ｂｉｏｓｔｉｒ目視評価を基に決めた。その後、各項目別スコアの合計を最終スコアとして評価した。
（１）臨床アトピー性皮膚炎スコア
アトピー性皮膚炎を評価するために、アトピー性皮膚炎の誘発を開始して０週目から皮膚臨床指数評価（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）を行った。皮膚臨床指数評価（Ｍａｔｓｕｄａ ｅｔ ａｌ．，１９９７）は、紅斑／出血（ｅｒｙｔｈｅｍａ／ｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ）、浮腫（ｅｄｅｍａ）、擦り傷／侵食（ｅｘｃｏｒｉａｔｉｏｎ／ｅｒｏｓｉｏｎ）および鱗屑／乾燥（ｓｃａｌｉｎｇ／ｄｒｙｎｅｓｓ）に対して、なし（０）、軽症（１）、中等症（２）、重症（３）で評価し、評価段階は、Ｂｉｏｓｔｉｒ目視評価を基に決めた。その後、各項目別スコアの合計を最終スコアとして評価した。
【0186】
（２）ＥＬＩＳＡ分析
剖検日に採血した血液を遠心分離して得た血清で血中ＩｇＥ濃度を分析し、摘出した皮膚を用いてＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－３１を分析した。分析は、汎用ｋｉｔを用いて行った。
剖検日に採血した血液を遠心分離して得た血清で血中ＩｇＥ濃度を分析し、摘出した皮膚を用いてＩＬ－１β、ＩＬ－４、ＩＬ－１３、ＴＮＦ－α、ＩＬ－６、ＩＬ－３１を分析した。分析は、汎用ｋｉｔを用いて行った。
【0187】
その結果を図２８～図３０に示す。図２８～図３０において、＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、ａｎｄ ＊＊＊ｐ＜０．００１（ｎ＝８）である。図２８～図３０において、「ｃｏｍｐｏｕｎｄ１（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）」は、実施例３で得られた「リン酸塩化合物」を意味する。
【0188】
図２８は、実験例１０の臨床アトピー性皮膚炎スコアの結果を示すグラフであり、リン酸塩化合物を投与した全ての群の皮膚重症度スコア（ｓｋｉｎ ｓｅｖｅｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ）は、有意に減少していることが確認できる。
【0189】
【0190】
【0191】
以上、本発明の好ましい実施例を参照して説明したが、当該技術分野の当業者は、以下の特許請求の範囲に記載された本発明の思想および領域から逸脱しない範囲内で様々な修
正および変更できることを理解するであろう。
正および変更できることを理解するであろう。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【図30】
【国際調査報告】