特表 2024-511409 空および完全ＡＡＶキャプシドのサイズ排除クロマトグラフィー解析

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-03-13

(54)【発明の名称】空および完全ＡＡＶキャプシドのサイズ排除クロマトグラフィー解析

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/06 20060101AFI20240306BHJP

   G01N 30/88 20060101ALI20240306BHJP

   G01N 30/26 20060101ALI20240306BHJP

   G01N 30/86 20060101ALI20240306BHJP

   C12N 7/01 20060101ALN20240306BHJP

   C12N 7/02 20060101ALN20240306BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/06

G01N30/88 J

G01N30/26 A

G01N30/86 J

C12N7/01

C12N7/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023558125

(86)(22)【出願日】2022-03-21

(85)【翻訳文提出日】2023-10-27

(86)【国際出願番号】 US2022071245

(87)【国際公開番号】W WO2022204670

(87)【国際公開日】2022-09-29

(31)【優先権主張番号】63/164,206

(32)【優先日】2021-03-22

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500034653

【氏名又は名称】ジェンザイム・コーポレーション

(74)【代理人】

【識別番号】100127926

【弁理士】

【氏名又は名称】結田 純次

(74)【代理人】

【識別番号】100140132

【弁理士】

【氏名又は名称】竹林 則幸

(74)【代理人】

【識別番号】100216105

【弁理士】

【氏名又は名称】守安 智

(72)【発明者】

【氏名】ホー・モン

【テーマコード（参考）】

4B063

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QQ10

4B063QS17

4B063QX01

4B065AA95X

4B065AB01

4B065BA01

4B065BD14

4B065CA60

(57)【要約】

本明細書では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を決定する方法を提供する。方法は、二波長検出によるクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）を利用する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を決定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法。

【請求項2】

約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

完全ｒＡＡＶキャプシドの純粋試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比よりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

公知のパーセンテージの空および／または部分キャプシドを有するｒＡＡＶ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と等しいかまたはそれよりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項6】

ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法。

【請求項7】

約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である、請求項６または７に記載の方法。

【請求項9】

組成物中の空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と異なる公知のパーセ
ンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物によって確立されたパーセント完全キャプシドの間の直線関係と溶出液のＰＡ２６０／ＰＡ２３０を比較することによって決定される、請求項６～８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項10】

ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の直線関係は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントをプロットすることにより決定される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

直線関係は、％完全キャプシド＝（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０－ａ）／ｂの式によって表され、式中、ａおよびｂはＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントのプロットから決定された定数である、請求項９または１０に記載の方法。

【請求項12】

異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物は、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物を含む、請求項９～１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

複数のｒＡＡＶ調製物は、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じ血清型のｒＡＡＶキャプシドを含む、請求項９～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズが少なくとも約９０％であるウイルスゲノムを含む、請求項９～１３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項15】

複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと同じであるウイルスゲノムを含む、請求項９～１４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項16】

複数のｒＡＡＶ調製物は、同じ血清型のキャプシドを含み、完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じウイルスゲノムを含む、請求項９～１５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項17】

クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはアパタイトクロマトグラフィーである、請求項１～１６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項18】

クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーを利用する、請求項１～１７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項19】

クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項20】

クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項21】

ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、サイズ排除クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～
約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法。

【請求項22】

約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である、請求項２１または２２に記載の方法。

【請求項24】

空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物によって確立されたパーセント完全キャプシドの間の直線関係と精製ｒＡＡＶ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比を比較することによって決定される、請求項２１～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の直線関係は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントをプロットすることにより決定される、請求項２１～２４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項26】

直線関係は、％完全キャプシド＝（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０－ａ）／ｂの式によって表され、式中、ａは空キャプシドのＰＡ２６０／ＰＡ２３０であり、ｂはＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントのプロットから決定された一次方程式の傾きである、請求項２１～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物は、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物を含む、請求項２４～２６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

複数のｒＡＡＶ調製物は、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じ血清型のｒＡＡＶキャプシドを含む、請求項２４～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズが少なくとも約９０％であるウイルスゲノムを含む、請求項２４～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと同じであるウイルスゲノムを含む、請求項２４～２９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項31】

複数のｒＡＡＶ調製物は、同じ血清型のキャプシドを含み、完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じウイルスゲノムを含む、請求項２４～３０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項32】

サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを利用する、請求項２０～３１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項33】

サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約３μｍ～約１０μｍの粒子を含む、請
求項３２に記載の方法。

【請求項34】

サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約５μｍの粒子を含む、請求項３２または３３に記載の方法。

【請求項35】

サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約１００Å～約１０００Åの孔を有する粒子を含む、請求項３２～３４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項36】

サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約５００Åの孔を有する粒子を含む、請求項３２～３５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項37】

粒子は、シリカを含む、請求項３３～３６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項38】

カラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約５０ｍｍ～約３００ｍｍの間の長さを有し、具体的には、約７．８ｍｍ×約３００ｍｍ、約４．６ｍｍ×約１００ｍｍ、または約４．６ｍｍ×約１５０ｍｍである、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

サイズ排除クロマトグラフィーは、ガードカラムをさらに利用する、請求項３２～３８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項40】

ガードカラムは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムと同じ粒子を含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

ガートカラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約３０ｍｍ～約５０ｍｍの間の長さを有し、具体的には、約７．８ｍｍ×約５０ｍｍ、または約４．６×約５０ｍｍである、請求項３９または４０に記載の方法。

【請求項42】

サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、請求項２０～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

ＰＢＳは、
約１００ｍＭ～約２００ｍＭ ＮａＣｌ、
約１ｍＭ～約５ｍＭ ＫＣｌ、
約５ｍＭ～約２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および
約１ｍＭ～約３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４
を含む、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

ＰＢＳは、
約１３７ｍＭ ＮａＣｌ、
約２．７ｍＭ ＫＣｌ、
約１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および
約１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４
を含む、請求項４２または４３に記載の方法。

【請求項45】

ＰＢＳは、約６．５～約７．５または約７．０のｐＨを有する、請求項４２～４４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項46】

クロマトグラフィーは、流速約０．５ｍＬ／分～約１．０ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分～約０．８ｍＬ／分、または約０．７５ｍＬ／分で実行される、請求項２０～４５のいず
れか１項に記載の方法。

【請求項47】

クロマトグラフィーは、約４℃～約３５℃で実行される、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項48】

クロマトグラフィーは、約２５℃、約３０℃、または約３５℃で実行される、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項49】

約５μＬ～約５００μＬまたは約１０μＬ～約７５μＬがクロマトグラフィーにかけられる、請求項１～４８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項50】

組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１１～約１×１０^１４個のキャプシド粒子／ｍＬ（ｃｐ／ｍＬ）または約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬである、請求項１～４９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項51】

組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１０～約１×１０^１４個のウイルスゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）である、請求項１～５０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項52】

約７０％より多くの組成物中のｒＡＡＶ粒子は、完全ｒＡＡＶキャプシドである、請求項１～５１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項53】

約７０％～約９５％より多くの組成物中のｒＡＡＶ粒子は、完全ｒＡＡＶキャプシドである、請求項１～５２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項54】

組成物中のｒＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上の精製工程を使用して精製される、請求項１～５３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項55】

組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶ９キャプシド、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、ＡＡＶ１３キャプシド、ＡＡＶ１４キャプシド、ＡＡＶ１５キャプシド、ＡＡＶ１６キャプシド、ＡＡＶｒｈ２０キャプシド、ＡＡＶ．ｒｈ３９キャプシド、ＡＡＶ．Ｒｈ７４キャプシド、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１キャプシド、ＡＡＶ．ｈｕ３７キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシド、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＡＡＶ２．５キャプシド、ＡＡＶ２ｔＹＦキャプシド、ＡＡＶ３Ｂキャプシド、ＡＡＶ．ＬＫ０３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ６キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ７キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ８キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ９キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６キャプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、またはマウスＡＡＶキャプシド ｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルス１）を含む、請求項１～５４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項56】

組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、Ａ
ＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１３ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１４ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１５ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１６ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ２０ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ３９ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ７４ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈＭ４－１ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｈｕ３７ ＩＴＲ、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む、請求項１～５５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項57】

ｒＡＡＶゲノムは、２５００塩基～５５００塩基長である、請求項１～５６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項58】

組換えウイルス粒子は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含む、請求項１～５７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項59】

ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ５粒子およびｒＡＡＶ１粒子からなる群から選択される、請求項６～５８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項60】

ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ５粒子である、請求項５９に記載の方法。

【請求項61】

ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ５粒子であり、空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５７（相対パーセント完全キャプシド）＋０．１１３７の式から算出される、請求項６０に記載の方法。

【請求項62】

ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ１粒子である、請求項５９に記載の方法。

【請求項63】

ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ１であり、空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５４（相対パーセント完全キャプシド）＋０．０８８６の式から算出される、請求項６２に記載の方法。

【請求項64】

ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって、精製方法の１つまたはそれ以上の工程の前後に組成物の試料を回収すること、およびそれぞれの回収した試料を請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法に従って空キャプシドの相対量について解析することを含み、続けて回収した試料間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す、方法。

【請求項65】

ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって：
ａ）精製方法前または方法の精製の工程前に回収した第１の試料において、請求項１～６３のいずれか１項に記載の方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること、
ｂ）精製方法後または方法の精製の工程後に回収した第２の試料において、請求項１～３７のいずれか１項に記載の方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること
を含み、
第２の回収した試料と第１の回収した試料の間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す、方法。

【請求項66】

請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法に従ってｒＡＡＶ粒子の組成物中の空キャプシドの相対量を測定するためのキット。

【請求項67】

請求項１～６５のいずれか１項に記載の方法での使用のためのクロマトグラフィーカラ
ムおよび／または緩衝液を含む、請求項６６に記載のキット。

【請求項68】

１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上の参照標準を含む、請求項６６または６７に記載のキット。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、２０２１年３月２２に出願した米国仮特許出願第６３／１６４２０６号の優先権を主張する。

【0002】

本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子の組成物中の完全および空キャプシドの相対レベルを解析する方法に関する。方法は、二波長検出によるサイズ排除クロマトグラフィーに関する。

【背景技術】

【0003】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、サイズがおよそ４．７キロベースの直鎖状一本鎖ＤＮＡゲノムがエンベロープのない２０面体のキャプシドにパッケージされる、小さい非病原性パルボウイルスである。そのウイルスゲノムは、両側の２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）に挟まれた３つのウイルス遺伝子、ｒｅｐ（複製）、ｃａｐ（キャプシド）、およびａａｐ（アセンブリ活性化タンパク質）からなる（非特許文献１）。キャプシドは、およそ５：５：５０比で３つのウイルスタンパク質（ＶＰ）、ＶＰ１、ＶＰ２、およびＶＰ３からの６０ｍｅｒとしてアセンブルされる（非特許文献２）。治療用組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）では、ウイルスゲノムは導入遺伝子によって置き換えられるが、ＩＴＲは、正しいゲノム複製およびパッケージングのために維持される。導入遺伝子は、標的細胞核への侵入後に遺伝子発現し、治療効果を発揮するための二本鎖ＤＮＡに変換される。

【0004】

現在、希少リポタンパク質リパーゼ欠損症のためのＧｌｙｂｅｒａ（登録商標）（ＥＭＡ、２０１２）；レーバー先天性黒内障のためのＬｕｘｔｕｒｎａ（登録商標）（ＦＤＡ、２０１７）および脊髄性筋萎縮症のためのＺｏｌｇｅｎｓｍａ（登録商標）（ＦＤＡ、２０１９）（非特許文献３）の３つのｒＡＡＶ遺伝子治療が認可されている。さらに多くのｒＡＡＶが様々な疾患兆候のために臨床試験中である（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。製造中に、完全長ゲノムを持つベクター（完全キャプシド）、ゲノムを持たないベクター（空キャプシド）、ゲノムの断片を持つベクター（部分キャプシド）および非導入遺伝子関連宿主細胞ＤＮＡを持つベクターが産生される（非特許文献６）。真の完全キャプシドは所望の産物として精製されるが、空キャプシドは容易には除去されず、それらの類似した構造特性により、製剤原料（ＤＳ）中に存在することは不可避的である（非特許文献１；非特許文献７；非特許文献８）。治療転帰への空キャプシドの存在の影響はまだ完全には理解されていないが、Ｇａｏらは、マウスモデルにおいて空キャプシドが形質導入効率を減少させ、肝臓の高トランスアミナーゼ血症を誘導することを報告した（非特許文献９）。これに対して、Ｍｉｎｇｏｚｚｉらは、空キャプシドが既存の抗ＡＶＶ抗体の阻害効果を軽減するデコイとして寄与し、実際、遺伝子導入効率を増強し得ることを示した（非特許文献１０；非特許文献１１）。空キャプシドの影響とは関係なく、安全性および有効性へのそれらの影響のさらなる当分野の理解のために空キャプシドのレベルをモニターし、製品品質の一貫性を確実にするように制御する必要がある（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。

【0005】

ＡＡＶの空または完全キャプシドを定量するための複数の方法が報告されている。Ｓｏｍｍｅｒらは、試料変性後の光学濃度測定からのＡ_２６０／Ａ_２８０比に基づき、精製ＡＡＶ試料中の空キャプシドを定量した。キャプシド対ベクターゲノム比（ｃｐ／ｖｇ）は、ｑＰＣＲおよびキャプシドＥＬＩＳＡによって決定された比と十分に相関した（非特許文献１７）。しかしながら、本方法の特異性は限定されるため、非ベクタータンパク質、遊離核酸、および他の成分は、この方法の正確性に大きく影響し得る。透過電子顕微鏡法
（ＴＥＭ）を使用して、ネガティブ染色後にＡＡＶ粒子を可視化した（非特許文献１８）。空および完全キャプシドは、電子密度に基づいて区別され、計数されてパーセント完全キャプシドが得られる。Ｂｕｒｎｈａｍらは、分析用超遠心沈降速度法（ＡＵＣ－ＳＶ）実験を用い、遠心力場におけるそれらの沈降挙動に基づきＡＡＶベクターを特徴付けた（非特許文献１９）。空、完全、および部分キャプシドに加え、ＡＵＣ－ＳＶは、高次種および断片化キャプシドも分離することができる。Ｐｉｅｒｓｏｎらは、電荷検出質量分析（ＣＤＭＳ）を使用し、個々のイオンの質量対電荷比（ｍ／ｚ）および電荷（ｚ）を同時に測定することにより、空、部分および完全キャプシドの分布を決定した（非特許文献２０）。Ｌｉらは、近年、キャピラリー等電点電気泳動（ｃＩＥＦ）法を導入し、ＡＡＶベクターの空および完全の比を決定した（非特許文献２１）。これらの方法は、異なるメカニズムを使用して空および完全キャプシドを区別し、したがって、試料の組成物の補足的な洞察を提供する。しかしながら、一部の方法、例えばＡＵＣおよびＣＤＭＳは、品質管理（ＱＣ）環境での実施が困難であり、一部は、不適当なアッセイ範囲またはロースループットにより難題に直面し得る。ハイスループットで、容易に入手でき、ＱＣおよび開発研究室に配備されるクロマトグラフィー法は、したがって、空および／または完全キャプシドのレベルを決定するために有用であり得る。

【0006】

陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）は、空キャプシドと完全キャプシドの間の等電点（ｐＩ）のわずかな違いを調査することによって、いくつかの血清型中の空キャプシドのレベルを決定するために使用されている。Ｌｏｃｋらは、ＣＩＭ－ＱＡモノリシックディスクを備えた高速液体クロマトグラフィー装置を使用して、完全キャプシドから密度勾配精製ＡＡＶ８空キャプシドを分離した（非特許文献２２）。Ｆｕらは、非開示の血清型の空キャプシドおよび親和性精製ＡＡＶをＣＩＭａｃ ＡＡＶ ｆｕｌｌ／ｅｍｐｔｙ－０．１分析カラムで分離した（非特許文献２３）。Ｗａｎｇらは、ＣＩＭａｃ ＡＡＶｆｕｌｌ／ｅｍｐｔｙ－０．１分析カラムでのＡＡＶ６．２試料の空キャプシドの分離を最適化し、経験的応答変換因子を用いて蛍光シグナルに基づき空キャプシドを定量した（非特許文献２４）。これらの成功は、血清型特異的ＡＡＶの空キャプシドの定量化のためのＡＥＸ法の有用性を強調したが、各血清型の分離条件を注意深く最適化する必要があることも明確に示した。

【0007】

ｒＡＡＶ組成物のハイスループット解析のための容易に利用可能な装置を使用するアッセイが必要である。

【0008】

特許明細書および論文を含む、本明細書に引用した全ての参照は、その全体を参照によって本明細書に組み入れる。

【先行技術文献】

【非特許文献】

【0009】

【非特許文献1】Ｎａｓｏ，Ｍ．Ｆ．ら，ＢｉｏＤｒｕｇｓ ２０１７年，３１（４），３１７～３３４頁

【非特許文献2】Ｄａｙａ，Ｓ．ら，Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ ２００８年，２１（４），５８３～９３頁

【非特許文献3】Ｌｉ，Ｃ．ａｎｄ Ｓａｍｕｌｓｋｉ，Ｒ．Ｊ．，Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ ２０２０年，２１（４），２５５～２７２頁

【非特許文献4】Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．ら，Ｌａｎｃｅｔ ２０１７年，３９０（１００９７），８４９～８６０頁

【非特許文献5】Ｗａｎｇ，Ｄ．ら，Ｎａｔｕｒｅ ｒｅｖｉｅｗｓ．Ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１９年，１８（５），３５８～３７８頁

【非特許文献6】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ ２０１４年，２（１），８０～９７頁

【非特許文献7】Ｑｕ，Ｇ．ら，Ｊ Ｖｉｒｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２００７年，１４０（１～２），１８３～９２頁

【非特許文献8】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２００８年，１５（１１），８４０～８頁

【非特許文献9】Ｇａｏ，Ｋ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ２０１４年，１（９），２０１３９頁

【非特許文献10】Ｍｉｎｇｏｚｚｉ，Ｆ．ら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１３年，５（１９４），１９４ｒａ９２

【非特許文献11】Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．Ｆ．，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ０１４，２２（１），１～２頁

【非特許文献12】Ｓｃｈｎｏｄｔ，Ｍ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１７年，２８（３），１０１～１０８頁

【非特許文献13】Ｆｌｏｔｔｅ，Ｔ．Ｒ．，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１７年，２８（２），１４７～１４８頁

【非特許文献14】ＥＭＡ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｔｈｅ ｑｕａｌｉｔｙ，ｎｏｎ－ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｍｅｄｉｃｉｎａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ２０１８年

【非特許文献15】ｐ ＥＭＡ／ＣＡＴ／８０１８３／２０１４

【非特許文献16】ＦＤＡ，Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ （ＣＭＣ） Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎａｌ Ｎｅｗ Ｄｒｕｇ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（ＩＮＤｓ）２０２０年

【非特許文献17】Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３年，７（１），１２２～８頁

【非特許文献18】Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｅ．ら，Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２００６年，３４９（２），２０８～１７頁

【非特許文献19】Ｂｕｒｎｈａｍ，Ｂ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５年，２６（６），２２８～４２頁

【非特許文献20】Ｐｉｅｒｓｏｎ，Ｅ．Ｅ．ら，Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ ２０１６年，８８（１３），６７１８～２５頁

【非特許文献21】Ｌｉ，Ｔ．ら，Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ２０２０年

【非特許文献22】Ｌｏｃｋ，Ｍ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１２年，２３（１），５６～６４頁

【非特許文献23】Ｆｕ，Ｘ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１９年，３０（４），１４４～１５２頁

【非特許文献24】Ｗａｎｇ，Ｃ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ２０１９年，１５，２５７～２６３頁

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

一部の態様では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を決定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２
３０）が組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。

【0011】

一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。

【0012】

一部の実施形態では、約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である。

【0013】

一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶキャプシドの純粋試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比よりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す。一部の実施形態では、公知のパーセンテージの空および／または部分キャプシドを有するｒＡＡＶ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と等しいかまたはそれよりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す。一部の実施形態では、組成物中の空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物によって確立されたパーセント完全キャプシドの間の直線関係と溶出液のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比を比較することによって決定される。一部の実施形態では、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の直線関係は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントをプロットすることにより決定される。一部の実施形態では、直線関係は、％完全キャプシド＝（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０－ａ）／ｂの式によって表され、式中、ａは空キャプシドのＰＡ２６０／ＰＡ２３０であり、ｂはＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントのプロットから決定された一次方程式の傾きである。一部の実施形態では、異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物は、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物を含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物は、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じ血清型のｒＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズが少なくとも約９０％であるウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと同じであるウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物は、同じ血清型のキャプシドを含み、完全キャプシドは組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じウイルスゲノムを含む。

【0014】

本発明の一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはアパタイトクロマトグラフィーである。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーである。一
部の実施形態では、クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である。

【0015】

本発明の一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを利用するサイズ排除クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約３μｍ～約１０μｍの粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約５μｍの粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約１００Å～約１０００Åの孔を有する粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約５００Åの孔を有する粒子を含む。一部の実施形態では、粒子は、シリカを含む。一部の実施形態では、カラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約５０ｍｍ～約３００ｍｍの間の長さを有し、具体的には、約７．８ｍｍ×約３００ｍｍ、約４．６ｍｍ×約１００ｍｍ、または約４．６ｍｍ×約１５０ｍｍである。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、ガードカラムをさらに利用する。一部の実施形態では、ガードカラムは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムと同じ粒子を含む。一部の実施形態では、ガートカラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約３０ｍｍ～約５０ｍｍの間の長さを有し、具体的には、約７．８ｍｍ×約５０ｍｍ、または約４．６×約５０ｍｍである。

【0016】

一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態では、ＰＢＳは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ ＮａＣｌ、約１ｍＭ～約５ｍＭ ＫＣｌ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および約１ｍＭ～約３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含む。一部の実施形態では、ＰＢＳは、約１３７ｍＭ ＮａＣｌ、約２．７ｍＭ ＫＣｌ、約１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および約１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含む。一部の実施形態では、ＰＢＳは、約６．５～約７．５または約７．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、流速約０．５ｍＬ／分～約１．０ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分～約０．８ｍＬ／分、または約０．７５ｍＬ／分で実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、約４℃～約３５℃で実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、約２５℃、約３０℃、または約３５℃で実行される。一部の実施形態では、約５μＬ～約５００μＬまたは約１０μＬ～約７５μＬがクロマトグラフィーにかけられる。

【0017】

本発明の一部の実施形態では、組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１１～約１×１０^１４個のキャプシド粒子／ｍＬ（ｃｐ／ｍＬ）または約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬである。一部の実施形態では、組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１０～約１×１０^１４個のウイルスゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）である。一部の実施形態では、約７０％より多くの組成物中のｒＡＡＶ粒子が、完全ｒＡＡＶキャプシドである。一部の実施形態では、約７０％～約９５％より多くの組成物中のｒＡＡＶ粒子が、完全ｒＡＡＶキャプシドである。一部の実施形態では、組成物中のｒＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上の精製工程を使用して精製される。一部の実施形態では、組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶ９キャプシド、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、ＡＡＶ１３キャプシド、ＡＡＶ１４キャプシド、ＡＡＶ１５キャプシド、ＡＡＶ１６キャプシド、ＡＡＶｒｈ２０キャプシド、ＡＡＶ．ｒｈ３９キャプシド、ＡＡＶ．Ｒｈ７４キャプシド、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１キャプシド、ＡＡＶ．ｈｕ３７キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシド、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＡＡＶ２．５キャプシド、ＡＡＶ２ｔＹＦキャプシド、ＡＡＶ３Ｂキャプシド、ＡＡＶ．ＬＫ０３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ３キャプシド、ＡＡＶ．Ｈ
ＳＣ４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ６キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ７キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ８キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ９キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６キャプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルス１）を含む。一部の実施形態では、組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１３ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１４ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１５ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１６ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ２０ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ３９ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ７４ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈＭ４－１ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｈｕ３７ ＩＴＲ、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは２５００塩基～５５００塩基長である。一部の実施形態では、組換えウイルス粒子は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含む。

【0018】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ５粒子である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ５粒子であり、空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５７（相対パーセント完全キャプシド）＋０．１１３７の式から算出される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ１粒子である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ１粒子であり、空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５４（相対パーセント空キャプシド）＋０．０８８６の式から算出される。

【0019】

一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって、精製方法の１つまたはそれ以上の工程の前後に組成物の試料を回収すること、およびそれぞれの回収した試料を本明細書に記載のいずれかの方法に従って空キャプシドの相対量について解析することを含み、続けて回収した試料間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す方法を提供する。一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって：
ａ）精製方法前または方法の精製の工程前に回収した第１の試料において、本明細書に記載のいずれかの方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること、
ｂ）精製方法後または方法の精製の工程後に回収した第２の試料において、本明細書に記載のいずれか１つの方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること
を含み、第２の回収した試料と第１の回収した試料の間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す方法を提供する。

【0020】

一部の態様では、本発明は、本明細書に記載のいずれかの方法に従ってｒＡＡＶ粒子の組成物中の空キャプシドの相対量を測定するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法での使用のためのクロマトグラフィーカラムおよび／または緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットは、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上の参照標準を含む。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1-1】図１Ａ～図１Ｃは、様々なカラムを使用する、ＡＡＶ５試料のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の結果を示す図である。図１Ａは、ＡＡＶ５製剤原料（ＤＳ）試料のＳＥＣクロマトグラムを示す。ＤＳ試料は、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）によって、およそ５．０×１０^１２ｃｐ／ｍＬに希釈し、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）試料２５μＬをカラムにアプライした。溶出液は、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器によってモニターした。ＨＰＬＣ条件：ＳＥＣ－３００カラム（グレーのトレース）、ＳＥＣ－５００カラム（２６０ｎｍでの黒のトレース、２８０ｎｍでの黒点のトレース）、およびＳＥＣ－１０００カラム（グレーの破線のトレース）。ＳＥＣ－３００およびＳＥＣ－１０００については、２６０ｎｍでのトレースのみが、明確にするために示される。移動相：ＤＰＢＳ；流速：０．７５ｍＬ／分；カラム温度：２５℃；実行時間：２０分；２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで検出。図１Ｂは、ＳＥＣ－５００カラムによって分離された２６０ｎｍでの凝集ＡＡＶおよび単量体を示す、異なるロットのＤＳ試料のクロマトグラムを示す。挿入図は、高分子量種１（ＨＭＷＳ１、ピーク面積により０．５％）および高分子量種２（ＨＭＷＳ２、１．７％）を示す。図１Ｃは、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで検出したピーク面積を示し、注入したキャプシドの数との直線関係を示す。ＰＡ２６０／ＰＡ２８０は、試験した範囲に渡り一定なままである（５．０×１０^１０～３．５×１０^１１個のキャプシド、５．０×１０^１２ｃｐ／ｍＬの１０～７５μＬ注入）。

【図1-2】図１－１の続き。

【図2】図２は、様々な量の完全キャプシド対試料中の期待パーセント完全キャプシドを含有するＡＡＶ試料の予測および測定Ａ２６０／Ａ２８０比を示す図である。

【図3-1】図３Ａ～３Ｅは、ＡＡＶスパイク試料についての二波長検出によるＳＥＣ（ＳＥＣ－ＤＷ）の結果を示す図である。図３Ａは、２６０ｎｍでの様々なパーセンテージの完全キャプシドを含有する一連のＡＡＶ５ ＨＰＬＣ標準のクロマトグラムを示す。前から後ろへ、空キャプシド、およそ２０％～８０％完全キャプシドの量が増加したスパイク試料、および完全キャプシド（９１％完全および９％部分）。図３Ｂは、２８０ｎｍでの空、スパイク試料および完全キャプシドのクロマトグラムを示す。図３Ｃは、２３０ｎｍでの空、スパイク試料、および完全キャプシドのクロマトグラムを示す。標準試料の１つのクロマトグラムは、異なる吸光強度をもたらすローディングとして示さなかった。ＡＡＶキャプシド（注入当たり５０μＬ）を、２５℃で平衡化した、ガードカラム（ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００、５μｍ、５００Å、７．８×５０ｍｍ）を備えたサイズ排除カラム（Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００、５μｍ、５００Å、７．８×３００ｍｍ）にアプライした。キャプシドは、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．０によって、流速０．７５ｍＬ／分で溶出した。図３Ｄは、ＡＡＶ５試料のＳＥＣによる、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２８０）ならびに２６０ｎｍおよび２３０ｎｍでのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）を示す。曲線フィッティング関数は、二次回帰（ＰＡ２６０／ＰＡ２８０）を線形回帰（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）に変更した。図３Ｅは、異なる日に実行した複数のアッセイ場面から得られた、ＡＡＶ５製剤原料（ｎ＝８）、標準参照試薬（ＷＲＳ、ｎ＝４）、および空キャプシド（ｎ＝６）試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比を示す。ＤＳ（ｎ＝８）およびＷＲＳ（ｎ＝４）試料中のパーセント完全キャプシドは、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０とパーセント完全キャプシドの間で確立された直線関係に基づき算出された（ｙ＝０．００５７ｘ＋０．１１３７）。ＤＳ、ＷＲＳおよび空キャプシド試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０値の％ＲＳＤ値は、０．５８％、０．５４％および５．３０％である。ＤＳおよびＷＲＳ試料のパーセント完全キャプシドの％ＲＳＤ値は、それぞれ０．７３％および０．６７％である。

【図3-2】図３－１の続き。

【図4】図４は、カラムにアプライしたキャプシドの数に対する２６０ｎｍでのピーク面積（ＰＡ２６０）および２３０ｎｍでのピーク面積（ＰＡ２３０）を示す図である。

【図5-1】図５Ａ～５Ｄは、沈降係数分布プロットとして示す、代表的な沈降速度分析用超遠心（ＡＵＣ－ＳＶ）データを示す図である。図５Ａは、空キャプシドを示す。図５Ｂは、スパイク試料３を示す（表３参照）。図５Ｃは、スパイク試料５（表３参照）。図５Ｄは、完全キャプシドを示す。ＡＡＶ粒子の沈降は、２６０ｎｍでモニターした。生データは、ＳＥＤＦＩＴのｃ（ｓ）モデルを使用するラム方程式に適合させた。ｘ軸は、Ｓｖｅｄｂｅｒｇ単位Ｓの沈降係数を表し、ｙ軸は沈降係数の関数として濃度を表す。

【図5-2】図５－１の続き。

【図6】図６Ａ～６Ｂは、２つのスパイク試料の代表的な低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）画像を示す図である。図６Ａは、Ｃｒｙｏ－ＥＭによる、５４％完全キャプシドを含有するスパイク試料３の画像を示す。図６Ｂは、Ｃｒｙｏ－ＥＭによる、９７％完全キャプシドを含有する完全キャプシド試料の画像。空キャプシドおよび完全キャプシドは、画像Ａに示す。空および完全キャプシドの中心断面は、それぞれ、内部密度の欠損および顕著な内部密度を示す。

【図7】図７Ａ～７Ｂは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定された、スパイク試料中の完全キャプシドのパーセンテージを示す図である。図７Ａは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭから得られたスパイク試料中のパーセント完全キャプシドを示す。結果は、期待パーセント完全キャプシドに対してプロットし、線形回帰に適合させた。Ｒ^２値は、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭで０．９９７、０．９９３および０．９９３である。傾き値は、ＳＥＣ－ＤＷでは０．９８９２、ＡＵＣ－ＳＶでは１．０６２３、およびＣｒｙｏ－ＥＭでは１．０３７８である。図７Ｂは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭからの結果を示し、直接比較を可視化する棒グラフとして表す。

【図8】図８は、空キャプシド試料および完全キャプシド試料の吸光度スペクトルを示す図である。吸光度スペクトル（２２０ｎｍ～４００ｎｍ）を、獲得したＳＥ－ＨＰＬＣデータから抽出した。

【図9-1】図９Ａ～９Ｄは、第２のＡＡＶ ＤＳ候補のＳＥＣ－ＤＷ結果を示す図である。図９Ａは、２３０ｎｍおよび２６０ｎｍでの、異なるＡＡＶ５製剤原料試料（候補２）の空キャプシドのＳＥＣクロマトグラムを示す。図９Ｂは、２３０ｎｍおよび２６０ｎｍでのＡＡＶ５薬候補２のＤＳ試料のＳＥＣクロマトグラムを示す。図９Ｃは、空キャプシドおよびＤＳ試料（候補２）の抽出した吸光度スペクトルを示す。図９Ｄは、ＰＡ２６０およびＰＡ２３０が、カラムにアプライしたキャプシドの数（同じ試料からの異なる注入容積）と優れた直線性を示すことを示す。

【図9-2】図９－１の続き。

【図10】図１０は、ＡＡＶ１試料のＳＥＣによる、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２８０）ならびに２６０ｎｍおよび２３０ｎｍでのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）を示す。曲線フィッティング関数は、二次回帰（ＰＡ２６０／ＰＡ２８０）から線形回帰（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）へと変更した。

【発明を実施するための形態】

【0022】

一部の態様では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を決定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。

【0023】

一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャ
プシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。

【0024】

一般的な技術
本明細書に記載または参照する技術および手順は、通常よく理解され、一般に、当業者により従来の方法、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，４ｔｈ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，２０１２年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら ｅｄｓ．，２００３年）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ
ｅｄｓ．，１９９５年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，１９８８年）；Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ａｎｄ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２０１０年）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９８年）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９９８年）；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９３～８年）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９６年）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７年）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら，ｅｄｓ．，１９９４年）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，ｅｄｓ．，１９９１年）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，２００２年）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙら，２００４年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７年）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８～１９８９年）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，
２０００年）Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９年）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５年）；およびＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，２０１１年）に記載の広く利用される方法を使用して用いられる。

【0025】

定義
「ベクター」は、本明細書で使用する場合、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏのいずれかで、宿主細胞に送達される核酸を含む組換えプラスミドまたはウイルスを指す。

【0026】

用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、本明細書で使用する場合、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、限定はされないが、一本鎖、二本鎖または多鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然、化学もしくは生化学改変、非天然、もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含む。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的にはＲＮＡまたはＤＮＡに見出される）、または改変もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含み得る。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、合成サブユニット、例えばホスホロアミデートのポリマーを含んでもよく、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミデート（Ｐ－ＮＨ_２）または混合ホスホロアミデート－ホスホジエステルオリゴマーであり得る。さらに、二本鎖ポリヌクレオチドは、相補鎖を合成することおよび適切な条件下で鎖をアニーリングすることによるか、または適切なプライマーとＤＮＡポリメラーゼを使用してｄｅ ｎｏｖｏで相補鎖を合成することによる、化学合成の一本鎖ポリヌクレオチド産物から得られる。

【0027】

用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを指し、最小の長さに限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含有し、限定はされないが、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、および多量体を含み得る。全長タンパク質とその断片は両方とも、定義によって包含される。用語は、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等も含む。さらに、本発明の目的のため、「ポリペプチド」は、改変、例えば、タンパク質が所望の活性を維持する限り、天然配列への欠失、付加、および置換（通常、自然界で保存される）を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発により計画的、または例えばタンパク質を産生する宿主の突然変異による偶然もしくはＰＣＲ増幅によるエラーであり得る。

【0028】

「組換えウイルスベクター」は、１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ウイルス起源ではない核酸配列）を含む組換えポリヌクレオチドベクターを指す。組換えＡＡＶベクターの場合では、組換え核酸は、少なくとも１つの逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する。一部の実施形態では、組換え核酸は、２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）によって挟まれる。

【0029】

「組換えＡＡＶベクター（組換えアデノ随伴ウイルスベクター）」は、少なくとも１つのＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）に隣接する１つまたはそれ以上の異種配列（すなわち、ＡＡＶ起源ではない核酸配列）を含むポリヌクレオチドベクターを指す。一部の実施形態では、組換え核酸は、２つの逆位末端配列（ＩＴＲ）によって挟まれる。そのような組換えウイルスベクターは、好適なヘルパーウイルスによって感染された（または好適なヘル
パー機能を発現する）、ならびにＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物（すなわち、ＡＡＶ ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質）を発現する宿主細胞に存在する場合、感染性ウイルス粒子へと複製およびパッケージされる。組換えウイルスベクターが、より大きいポリヌクレオチド（例えば、染色体中または別のベクター、例えばクローニングもしくはトランスフェクションに使用されるプラスミド中）に組み込まれる場合、組換えウイルスベクターは、「プロベクター」と呼ばれ、ＡＡＶパッケージング機能および好適なヘルパー機能の存在下での複製およびカプセル化によって「レスキュー」される。組換えウイルスベクターは、限定はされないが、プラスミド、直鎖状人工染色体、脂質との複合体、リポソーム内へのカプセル化、およびウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子へのキャプシド形成を含む、多くの形態のいずれかであり得る。組換えウイルスベクターは、ＡＡＶウイルスキャプシドにパッケージされ、「組換えアデノ随伴ウイルス粒子（組換えウイルス粒子）」を生成し得る。

【0030】

「ｒＡＡＶウイルス」または「ｒＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質および上記に定義したようにキャプシド形成したｒＡＡＶベクターゲノムから構成されるウイルス粒子を指す。

【0031】

本明細書で使用する場合、「空ＡＡＶキャプシド」は、基本的にＡＡＶ核酸がキャプシド形成されないＡＡＶキャプシドである。本明細書で使用する場合、「部分ＡＡＶキャプシド」は、不完全なＡＡＶゲノム（例えば、トランケートＡＡＶゲノム、ＡＡＶゲノムの断片、または内部欠失を有するＡＡＶゲノム）をキャプシド形成したＡＡＶキャプシドである。一部の実施形態では、不完全なＡＡＶゲノムは、完全ＡＡＶキャプシド（すなわち、全長ＡＡＶゲノムを持つキャプシド）のＡＡＶゲノムの長さの約９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、または２５％より短い長さを含むかまたはそれらからなる。一部の実施形態では、不完全なＡＡＶゲノムは、完全ＡＡＶキャプシドのＡＡＶゲノムの長さの約７０％、６０％、５０％、４０％、３０％または２５％より短い長さを含むかまたはそれらからなる。パーセンテージは、最も長い配列である完全長ＡＡＶゲノムとの２つのＡＡＶゲノム配列の完全アライメントに基づいて算出する。

【0032】

「異種」は、比較されるかまたはそれが導入もしくは組み込まれる実体のものとは遺伝型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子工学技術によって異なる細胞型へと導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（発現される場合、異種ポリペプチドをコードし得る）。同様に、ウイルスベクターに組み込まれる細胞性配列（例えば遺伝子またはその部分）は、ベクターに関して異種ヌクレオチド配列である。

【0033】

用語「導入遺伝子」は、細胞に導入され、ＲＮＡへと転写され、ならびに場合により適切な条件下で翻訳および／または発現されるポリヌクレオチドを指す。複数の態様では、それが導入される細胞へと所望の特性を付与するか、またはそうでなければ所望の治療もしくは診断転帰をもたらす。別の態様では、ＲＮＡ干渉を媒介する分子、例えばｓｉＲＮＡへと転写される。

【0034】

用語「ゲノム粒子（ｇｐ）」、「ゲノム等価物」、または「ゲノムコピー」は、ウイルス力価に関して使用する場合、感染性または機能性にかかわらず、組換えウイルスＤＮＡゲノムまたはＲＮＡゲノムを含有するビリオンの数を指す。特定のベクター調製物におけるゲノム粒子の数は、例えば、Ｃｌａｒｋら（１９９９年）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１０３１～１０３９頁；Ｖｅｌｄｗｉｊｋら（２００２年）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，６：２７２～２７８頁に記載の手順によって測定される。

【0035】

用語「感染単位（ｉｕ）」、「感染性粒子」、または「複製単位」は、ウイルス力価に関して使用する場合、例えば、ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら（１９８８年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．
，６２：１９６３～１９７３頁のＡＡＶに記載の複製中心アッセイとしても公知の、感染中心アッセイで測定した、感染性および複製可能な組換えウイルスベクター粒子の数を指す。

【0036】

用語「形質導入単位（ｔｕ）」は、ウイルス力価に関して使用する場合、例えば、Ｘｉａｏら（１９９７年）Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．，１４４：１１３～１２４頁；またはＦｉｓｈｅｒら（１９９６年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：５２０～５３２頁（ＬＦＵアッセイ）に記載の機能性アッセイで測定した、機能性導入遺伝子産物の産生をもたらす感染性組換えウイルスベクター粒子の数を指す。

【0037】

当技術分野でよく理解されている用語「ＡＡＶ逆位末端配列（ＩＴＲ）」配列は、天然の一本鎖ＡＡＶゲノムの両末端に存在するおよそ１４５ヌクレオチド配列である。ＩＴＲの最外部の１２５ヌクレオチドは、２つの代替的方向のいずれかに存在し、異なるＡＡＶゲノム間および単一ＡＡＶゲノムの２つの末端間に異種性をもたらす。最外部の１２５ヌクレオチドは、自己相補性のいくつかの短い領域（Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’およびＤ領域と呼ばれる）も含有し、ＩＴＲのこの部分内で鎖内塩基対を生じさせる。

【0038】

「末端分離配列（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）」または「ｔｒｓ」は、ウイルスＤＮＡ複製中に、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質によって切断されるＡＡＶ ＩＴＲのＤ領域の配列である。変異末端分離配列は、ＡＡＶ ｒｅｐタンパク質による切断に抵抗性である。

【0039】

「ＡＡＶヘルパー機能」は、ＡＡＶを宿主細胞により複製およびパッケージされるようにする機能を指す。ＡＡＶヘルパー機能は、限定はされないが、ＡＡＶ複製およびパッケージングを助けるヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス遺伝子を含む、多くの形態のいずれかで提供される。他のＡＡＶヘルパー機能は、当技術分野で公知の、例えば、遺伝毒性剤である。

【0040】

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（欠陥パルボウイルス）を宿主細胞により複製およびパッケージさせるウイルスを指す。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶの複製を可能にする「ヘルパー機能」を提供する。多くのそのようなヘルパーウイルスが同定され、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルスおよびバキュロウイルスを含む。アデノウイルスは、多くの異なるサブグループを包含するが、サブグループＣのアデノウイルス５型（Ａｄ５）が最も一般的に使用される。ヒト、非ヒト哺乳動物および鳥類起源の多くのアデノウイルスが公知であり、受託機関、例えばＡＴＣＣから入手できる。受託機関、例えばＡＴＣＣからも入手できるヘルペスファミリーのウイルスは、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）を含む。ＡＡＶの複製のためのアデノウイルスヘルパー機能の例は、Ｅ１Ａ機能、Ｅ１Ｂ機能、Ｅ２Ａ機能、ＶＡ機能およびＥ４ｏｒｆ６機能を含む。受託機関から入手できるバキュロウイルスは、キンウワバ科（Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）核多角体病ウイルスを含む。

【0041】

ｒＡＡＶの調製物または組成物は、感染性ヘルパーウイルス粒子に対する感染性ＡＡＶ粒子の比が、少なくとも約１０^２：１；少なくとも約１０^４：１；少なくとも約１０^６：１；または少なくとも約１０^８：１もしくはそれ以上である場合、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。一部の実施形態では、調製物は、等量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在する場合、そのようなレベルのヘルパーウイルスの結果と同様に存在するであろうタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／または細胞タンパク質夾雑物は、通常、ＳＤＳゲルの
クマシー染色バンドの存在として観察される（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に相当するもの以外のバンドの出現）。

【0042】

「低減する」ことは、参照と比較して、活性、機能、および／または量を減少、低減または阻止することである。ある特定の実施形態では、「低減する」により、２０％またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。ある特定の実施形態では、「低減する」により、３０％またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。ある特定の実施形態では、「低減する」により、４０％またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態では、「低減する」により、５０％またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施形態では、「低減する」により、７５％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。

【0043】

「参照」は、本明細書で使用する場合、比較目的のために使用される任意の試料、標準、またはレベルを指す。例えば、ｒＡＡＶ粒子の組成物中の空キャプシドの相対量を測定する場合、空キャプシドの量は、公知の比率の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む調製物中のＡＡＶ粒子の量と比較される。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中の空キャプシドの除去をモニタリングする場合、産生した精製ＡＡＶは、公知の比率の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む調製物と比較される。他の例では、参照は、当技術分野で公知の標準手段を指し得る。

【0044】

「単離した」分子（例えば、核酸もしくはタンパク質）または細胞は、その自然環境の成分から同定および分離および／または回収されたことを意味する。したがって、例えば、単離したｒＡＡＶ粒子は、精製技術を使用して調製され、起源混合物、例えば培養ライセートまたは産生培養上清からそれを濃縮する。濃縮は、様々な方法、例えば、溶液中に存在するＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）の割合によって測定されるか、または第２の、起源混合物に存在する干渉する可能性がある物質、例えば、以下に既定する、ヘルパーウイルス、培地成分等を含む、産生培養夾雑物または方法中の夾雑物を含む夾雑物に関して測定される。

【0045】

「約」という言及は、本明細書の値またはパラメーターが、それ自体、その値またはパラメーターに向けられる実施形態を含む（および記載する）。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の説明を含む。

【0046】

本明細書で使用する場合、単数形の冠詞「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、他に指定しない限り、複数の参照を含む。例えば、語句「ｒＡＡＶ粒子」は、１つまたはそれ以上のｒＡＡＶ粒子を含む。

【0047】

本明細書に記載の本発明の態様および実施形態は、「含む（comprising）」、「からなる（consisting）」、および／または「～から本質的になる（consisting essentially of）」態様および実施形態を含む。

【0048】

空ｒＡＡＶキャプシドを検出および定量する方法
二波長検出
一部の態様では、本発明は、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を決定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。

【0049】

本明細書で使用する場合、用語「ＰＡ２６０／ＰＡ２３０」は、約Ａ_２５０とＡ_２７０の間（例えば、２５０ｎｍ、２５１ｎｍ、２５２ｎｍ、２５３ｎｍ、２５４ｎｍ、２５５ｎｍ、２５６ｎｍ、２５７ｎｍ、２５８ｎｍ、２５９ｎｍ、２６０ｎｍ、２６１ｎｍ、２６２ｎｍ、２６３ｎｍ、２６４ｎｍ、２６５ｎｍ、２６６ｎｍ、２６７ｎｍ、２６８ｎｍ、２６９ｎｍ、または２７０ｎｍのいずれか）での溶出液のＵＶ吸光度の任意のプロットのピーク面積と約Ａ_２２０とＡ_２４０の間（例えば、２２０ｎｍ、２２１ｎｍ、２２２ｎｍ、２２３ｎｍ、２２４ｎｍ、２２５ｎｍ、２２６ｎｍ、２２７ｎｍ、２２８ｎｍ、２２９ｎｍ、２３０ｎｍ、２３１ｎｍ、２３２ｎｍ、２３３ｎｍ、２３４ｎｍ、２３５ｎｍ、２３６ｎｍ、２３７ｎｍ、２３８ｎｍ、２３９ｎｍ、または２４０ｎｍのいずれか）での溶出液のＵＶ吸光度の任意のプロットのピーク面積の比を指す。

【0050】

一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。

【0051】

一部の実施形態では、約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２５０ｎｍと２７０ｎｍの間の任意の波長でのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、２５０ｎｍ、２５１ｎｍ、２５２ｎｍ、２５３ｎｍ、２５４ｎｍ、２５５ｎｍ、２５６ｎｍ、２５７ｎｍ、２５８ｎｍ、２５９ｎｍ、２６０ｎｍ、２６１ｎｍ、２６２ｎｍ、２６３ｎｍ、２６４ｎｍ、２６５ｎｍ、２６６ｎｍ、２６７ｎｍ、２６８ｎｍ、２６９ｎｍ、または２７０ｎｍでのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２５５ｎｍと２６５ｎｍの間の任意の波長でのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である。

【0052】

一部の実施形態では、約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２２０ｎｍと２４０ｎｍの間の任意の波長でのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２２０ｎｍ～約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度は、２２０ｎｍ、２２１ｎｍ、２２２ｎｍ、２２３ｎｍ、２２４ｎｍ、２２５ｎｍ、２２６ｎｍ、２２７ｎｍ、２２８ｎｍ、２２９ｎｍ、２３０ｎｍ、２３１ｎｍ、２３２ｎｍ、２３３ｎｍ、２３４ｎｍ、２３５ｎｍ、２３６ｎｍ、２３７ｎｍ、２３８ｎｍ、２３９ｎｍ、または２４０ｎｍでのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２２５ｎｍと２３５ｎｍの間の任意の波長でのＵＶ吸光度である。一部の実施形態では、約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である。

【0053】

一部の実施形態では、完全ｒＡＡＶキャプシドの純粋試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比よりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す。実施例で実証されたように、完全および空ＡＡＶキャプシドの相対量を決定するための他の方法が公知である；例えば、分析用超遠心および低温電子顕微鏡。分析用超遠心の例は、国際公開第２０１６／１１８５２０号明細書によって提供される。

【0054】

一部の実施形態では、組成物中の空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０と異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物によって確立されたパーセント完全キャプシドの間の直線関係と溶出液のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比を比較することによって決定される。一部の実施形態では、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の直線関係は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントをプロットすることによって決定される。一部の実施形態では、曲線フィッティングを使用して、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の関係を確立した。一部の実施形態では、曲線フィッティングを使用して、式
％完全キャプシド＝（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０－ａ）／ｂ
式中、ａは空キャプシドのＰＡ２６０／ＰＡ２３０であり、ｂはＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントのプロットから決定された一次方程式の傾きである
を作成した。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ５粒子であり、空キャプシドの相対量は、式
ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５７（相対パーセント完全キャプシド）＋０．１１３７から算出した。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ１粒子であり、空キャプシドの相対量は、式
ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５４（相対パーセント完全キャプシド）＋０．０８８６から算出した。一部の実施形態では、曲線フィッティングは、０．９、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９９、０．９９１、０．９９２、０．９９３、０．９９４、または０．９９５より大きい決定係数、Ｒ^２と直線関係を実証した。

【0055】

一部の実施形態では、異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物は、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物を含む。一部の実施形態では、３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物は、１：０、０．９：０．１、０．８：０．２、０．７：０．３、０．６：０．４、０．５：０．５、０．４：０．６、０．３：０．７、０．２：０．８、０．１：０．９、および０：１のいずれか１つの公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む。一部の実施形態では、３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物は、低レベルの空キャプシド（例えば、＞７５％完全キャプシド）、およそ等量の完全および空キャプシド（例えば、～５０％完全キャプシド）、および高レベルの空キャプシド（例えば、＜２５％完全キャプシド）を有する調製物を含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物は、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じ血清型のｒＡＡＶキャプシドを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズ（例えば、長さ）が少なくとも約９０％であるウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズ（例えば、長さ）が約９０％、９５％、１００％、１０５％または１１０％のいずれかであるウイルスゲノムを含む。パーセンテージは、２つのＡＡＶゲノム配列の完全アライメントに基づいて算出した。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較して、基本的に同じサイズであるウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルス
ゲノムと同じであるウイルスゲノムを含む。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと異なるウイルスゲノムを含む、但し、ウイルスゲノムが、（上記のように）組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズ（例えば、長さ）が少なくとも約９０％である。一部の実施形態では、複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは同じ血清型のキャプシドを含み、完全キャプシドは組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じウイルスゲノムを含む。

【0056】

クロマトグラフィー
一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法を提供する。本方法は、クロマトグラフィーを使用して、ｒＡＡＶキャプシド（例えば、完全、空および部分キャプシド）から不純物を分離する。不純物からｒＡＡＶキャプシドを分離する任意のクロマトグラフィー法が考えられる。一部の実施形態では、完全、空および部分キャプシドは一緒に溶出される。非限定的な不純物は、高分子量種、宿主細胞タンパク質、およびヘルパーウイルスタンパク質を含み得る。

【0057】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定するために使用されるクロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはアパタイトクロマトグラフィーである。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーを利用する。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である。

【0058】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、イオン交換クロマトグラフィー；例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーまたは陽イオン交換クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー材料は、正に荷電し、固相を通過または通る水溶液中の陰イオンとの交換のための遊離の陰イオンを有する固相である。一部の実施形態では、陰イオン交換材料は、第一級アミン、第二級アミン、第三級アミンまたは第四級アンモニウムイオン官能基、ポリアミン官能基、またはジエチルアミノエチル官能基を含み得る。一部の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィー材料は、負に荷電し、固相を通過または通る水溶液中の陽イオンとの交換のための遊離の陽イオンを有する固相である。陽イオン交換材料は、カルボン酸官能基またはスルホン酸官能基、例えば、限定はされないが、スルホン酸、カルボン酸、カルボキシメチルスルホン酸、スルホイソブチル、スルホエチル、カルボキシル、スルホプロピル、スルホニル、スルホキシエチル、またはオルトリン酸を含み得る。

【0059】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは親和性クロマトグラフィーであり、クロマトグラフィー材料は、ＡＡＶに特異的に結合するリガンド（例えば、抗体）を含む。

【0060】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、混合モードクロマトグラフィーである。一部の実施形態では、混合モードクロマトグラフィー材料は、１つまたはそれ以上の以下の機能が可能な官能基を含む：陰イオン交換、陽イオン交換、水素結合、および疎水性相互作用。一部の実施形態では、混合モード材料は、陰イオン交換および疎水性相互作用が可能な官能基を含む。一部の実施形態では、混合モード材料は、陽イオン交換および疎水性相互作用が可能な官能基を含む。

【0061】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。疎水性相互作用クロマトグラフィーは、疎水性により生体分子を分離する液体クロマトグラフィー技術である。

【0062】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである。一部の実施形態では、ヒドロキシアパタイトは、（Ｃａ_５（ＰＯ_４）_３ＯＨ）_２を含む。一部の実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである。一部の実施形態では、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーは、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーである。ヒドロキシアパタイト材料の例は、当技術分野で公知であり、限定はされないが、ＣＨＴセラミックヒドロキシアパタイト、Ｉ型およびＩＩ型を含む。

【0063】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーである。一部の実施形態では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、サイズ排除クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法を提供する。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、それらのサイズ、形、流体力学半径および／または容積によって生体分子を分離する液体クロマトグラフィー技術である。サイズ排除クロマトグラフィー材料は、特定の重量範囲の分子の効果的な分離のための異なる粒子サイズおよび孔サイズとして供給される。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィー材料はシリカを含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーはサイズ排除クロマトグラフィーカラムを利用する。

【0064】

一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約１μｍ～約１０μｍの粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、直径約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、または約１０μｍ以上のいずれかの粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、約１μｍと１０μｍ、１μｍと９μｍ、１μｍと８μｍ、１μｍと７μｍ、１μｍと６μｍ、１μｍと５μｍ、１μｍと４μｍ、１μｍと３μｍ、１μｍと２μｍ、２μｍと１０μｍ、２μｍと９μｍ、２μｍと８μｍ、２μｍと７μｍ、２μｍと６μｍ、２μｍと５μｍ、２μｍと４μｍ、２μｍと３μｍ、３μｍと１０μｍ、３μｍと９μｍ、３μｍと８μｍ、３μｍと７μｍ、３μｍと６μｍ、３μｍと５μｍ、３μｍと４μｍ、４μｍと１０μｍ、４μｍと９μｍ、４μｍと８μｍ、４μｍと７μｍ、４μｍと６μｍ、４μｍと５μｍ、５μｍと１０μｍ、５μｍと９μｍ、５μｍと８μｍ、５μｍと７μｍ、５μｍと６μｍ、６μｍと１０μｍ、６μｍと９μｍ、６μｍと８μｍ、６μｍと７μｍ、７μｍと１０μｍ、７μｍと９μｍ、７μｍと８μｍ、８μｍと１０μｍ、８μｍと９μｍ、または９μｍと１０μｍのいずれかの間の粒子を含む。

【0065】

一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約１００Å～約１０００Åの孔を有する粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、約１００Å、約２００Å、約３００Å、約４００Å、約５００Å、約６００Å、約７００Å、約８００Å、約９００Å、または約１０００Åのいずれかの孔を有する粒子を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、約１００Åと約１０００Å、約１００Åと約９００Å、約１００Åと約８００Å、約１００Åと約
７００Å、約１００Åと約６００Å、約１００Åと約５００Å、約１００Åと約４００Å、約１００Åと約３００Å、約１００Åと約２００Å、約２００Åと約１０００Å、約２００Åと約９００Å、約２００Åと約８００Å、約２００Åと約７００Å、約２００Åと約６００Å、約２００Åと約５００Å、約２００Åと約４００Å、約２００Åと約３００Å、約３００Åと約１０００Å、約３００Åと約９００Å、約３００Åと約８００Å、約３００Åと約７００Å、約３００Åと約６００Å、約３００Åと約５００Å、約３００Åと約４００Å、約４００Åと約１０００Å、約４００Åと約９００Å、約４００Åと約８００Å、約４００Åと約７００Å、約４００Åと約６００Å、約４００Åと約５００Å、約５００Åと約１０００Å、約５００Åと約９００Å、約５００Åと約８００Å、約５００Åと約７００Å、約５００Åと約６００Å、約６００Åと約１０００Å、約６００Åと約９００Å、約６００Åと約８００Å、約６００Åと約７００Å、約７００Åと約１０００Å、約７００Åと約９００Å、約７００Åと約８００Å、約８００Åと約１０００Å、約８００Åと約９００Å、または約９００Åと約１０００Åのいずれかの間の孔を有する粒子を含む。

【0066】

一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約５０ｍｍ～約３００ｍｍの間の長さを有する。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、約４．０ｍｍ、４．６ｍｍまたは７．８ｍｍの内径を有する。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、約５０ｍｍ、１００ｍｍ、１５０ｍｍまたは３００ｍｍの長さを有する。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、約７．８ｍｍ×約３００ｍｍ、約４．６ｍｍ×約１００ｍｍ、または約４．６ｍｍ×約１５０ｍｍである。

【0067】

一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、ガードカラムをさらに利用する。一部の実施形態では、ガードカラムは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムと同じ粒子；例えば、サイズ排除クロマトグラフィーカラムと同じ材料から作られた粒子、サイズ排除クロマトグラフィーカラムと同じサイズの粒子、およびサイズ排除クロマトグラフィーカラムの孔と同じサイズの孔を有する粒子を含む。

【0068】

一部の実施形態では、ガードカラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約３０ｍｍ～約５０ｍｍの間の長さを有する。一部の実施形態では、ガードカラムは、約４．０ｍｍ、４．６ｍｍまたは７．８ｍｍの内径を有する。一部の実施形態では、ガードカラムは、約３０ｍｍ、４０ｍｍ、または５０ｍｍの長さを有する。一部の実施形態では、ガードカラムは、約７．８ｍｍ×約５０ｍｍである。

【0069】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、移動相を利用する。一部の実施形態では、移動相は、水系移動相である。一部の実施形態では、水相は、塩溶液である（例えば、塩水溶液）。一部の実施形態では、クロマトグラフィーの移動相は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、ＰＢＳを含む。ＰＢＳは、当技術分野で公知の一般的な緩衝塩溶液である。一部の実施形態では、ＰＢＳは、約１００ｍＭ～約２００ｍＭ ＮａＣｌ、約１ｍＭ～約５ｍＭ ＫＣｌ、約５ｍＭ～約２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および約１ｍＭ～約３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含む。一部の実施形態では、ＰＢＳは、約１３７ｍＭ ＮａＣｌ、約２．７ｍＭ ＫＣｌ、約１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および約１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４を含む。

【0070】

一部の実施形態では、クロマトグラフィーの移動相は、約６．０～約８．０のｐＨを有する。一部の実施形態では、移動相のｐＨは、約６．０、６．５、７．０、７．５または８．０のいずれかである。一部の実施形態では、移動相のｐＨは、約６．０と８．０、６．５と８．０、７．０と８．０、７．５と８．０、６．０と７．５、６．５と７．５、７．０と７．５、６．０と７．０、６．５と７．０、または６．０と６．５のいずれかの間
である。一部の実施形態では、クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨが約６．０～約８．０のＰＢＳである。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨが約６．０～約８．０のＰＢＳである。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、ｐＨが約７．０のＰＢＳである。

【0071】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）は、流速約０．３ｍＬ／分～約１．０ｍＬ／分で実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、流速約０．３ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分、０．６ｍＬ／分、０．７ｍＬ／分、０．７５ｍＬ／分、０．８ｍＬ／分、０．９ｍＬ／分、または１．０ｍＬ／分のいずれかで実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、流速約０．３ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．６ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．７５ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．８ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．９ｍＬ／分と１．０ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分と０．９ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分と０．９ｍＬ／分、約０．６ｍＬ／分と０．９ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分と０．９ｍＬ／分、約０．７５ｍＬ／分と０．９ｍＬ／分、約０．８ｍＬ／分と０．９ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分と０．８ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分と０．８ｍＬ／分、約０．６ｍＬ／分と０．８ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分と０．８ｍＬ／分、約０．７５ｍＬ／分と０．８ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分と０．７５ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分と０．７５ｍＬ／分、約０．６ｍＬ／分と０．７５ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分と０．７５ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分と０．７ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分と０．７ｍＬ／分、約０．３ｍＬ／分と０．６ｍＬ／分、約０．５ｍＬ／分と０．６ｍＬ／分、または約０．３ｍＬ／分と０．５ｍＬ／分の間で実行される。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、流速約０．７５ｍＬ／分で実行される。

【0072】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）は、約４℃～約３５℃で実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、約４℃、約２０℃、約２５℃、約３０℃、または約３５℃で実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、約４℃～約３５℃、約２０℃～約３５℃、約２５℃～約３５℃、約３０℃～約３５℃、４℃～約３０℃、約２０℃～約３０℃、約２５℃～約３０℃、４℃～約２５℃、または約２０℃～約２５℃のいずれかの間で実行される。一部の実施形態では、クロマトグラフィーは、室温で実行される。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーは、約２５℃で実行される。

【0073】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む約５μＬ～約５００μＬの組成物がクロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）にかけられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む約５μＬ、約２５μＬ、約５０μＬ、約７５μＬ、約１００μＬ、約２００μＬ、約３００μＬ、約４００μＬ、または約５００μＬの組成物がクロマトグラフィーにかけられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む約５μＬと約１００μＬ、約２５μＬと約１００μＬ、約５０μＬと約１００μＬ、約７５μＬと約１００μＬ、５μＬと７５μＬ、約２５μＬと約７５μＬ、約５０μＬと約７５μＬ、５μＬと約５０μＬ、約２５μＬと約５０μＬ、または約５μＬと約２５μＬのいずれかの間の組成物がクロマトグラフィーにかけられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む約５０μＬの組成物がサイズ排除クロマトグラフィーにかけられる。

【0074】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）にかけられる組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１１～約１×１０^１４個のキャプシド粒子／ｍＬ（ｃｐ／ｍＬ）である。一部の実施形態では、クロマトグラフィーにかけられる組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１１～約１×１０^１４ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１１～約１×１０^１４ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１２～約１×１０^１４ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１２～約１×１０^１４ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１３～約１×１０^１４ｃｐ／ｍＬ、５×
１０^１３～約１×１０^１４ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１１～約５×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１１～約１×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１２～約５×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１２～約５×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１３～約５×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１１～約１×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１１～約１×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１２～約１×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１２～約１×１０^１３ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１１～約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１１～約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１２～約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬ、１×１０^１１～約１×１０^１２ｃｐ／ｍＬ、５×１０^１１～約１×１０^１２ｃｐ／ｍＬ、または１×１０^１１～約５×１０^１１ｃｐ／ｍＬのいずれかの間である。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにかけられる組成物中のｒＡＡＶの力価は、約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬである。

【0075】

一部の実施形態では、クロマトグラフィー（例えば、サイズ排除クロマトグラフィー）にかけられる組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１０～約１×１０^１４個のベクターゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）である。一部の実施形態では、クロマトグラフィーにかけられる組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１０～約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０～約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１１～約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１１～約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１２～約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１２～約１×１０^１３ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１０～約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０～約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１１～約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１１～約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１２～約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１０～約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０～約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１１～約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１１～約１×１０^１２ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１０～約５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０～約５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１１～約５×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、１×１０^１０～約１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、５×１０^１０～約１×１０^１１ｖｇ／ｍＬ、または１×１０^１０～約５×１０^１０ｖｇ／ｍＬのいずれかの間である。一部の実施形態では、サイズ排除クロマトグラフィーにかけられる組成物中のｒＡＡＶの力価は、約５×１０^１２ｖｇ／ｍＬである。

【0076】

一部の実施形態では、組成物中のｒＡＡＶ粒子の約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％より多くが完全ｒＡＡＶキャプシドである。一部の実施形態では、組成物中のｒＡＡＶ粒子の約７０％～９９％、７０％～９０％、７０％～８５％、７０％～８０％、７０％～７５％、７５％～９９％、７５％～９０％、７５％～８５％、７５％～８０％、８０％～９９％、８０％～９０％、８０％～８５％、８５％～９９％、８５％～９０％、または９０％～９９％のいずれかの間が、完全ｒＡＡＶキャプシドである。

【0077】

上記の実施形態の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ６キャプシド、または米国特許出願公開第２０１２／０１６４１０６号に記載のバリアントＡＡＶ６キャプシド、例えばＳｈＨ１０）、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶ９キャプシド（例えば、野生型ＡＡＶ９キャプシド、または米国特許出願公開第２０１３／０３２３２２６号に記載の改変ＡＡＶ９キャプシド）、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、ＡＡＶ１３キャプシド、ＡＡＶ１４キャプシド、ＡＡＶ１５キャプシド、ＡＡＶ１６キャプシド、ＡＡＶｒｈ２０キャプシド、ＡＡＶ．ｒｈ３９キャプシド、ＡＡＶ．Ｒｈ７４キャプシド、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１キャプシド、ＡＡＶ．ｈｕ３７キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシド、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＡＡＶ２．５キャプシド、ＡＡＶ２ｔＹＦキャプシド、ＡＡＶ３Ｂキャプシド、ＡＡＶ．ＬＫ０３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ３キ
ャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ６キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ７キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ８キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ９キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６キャプシド、チロシンキャプシド変異体、ヘパリン結合キャプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド（例えば、ＡＡＶ－ＤＪ／８キャプシド、ＡＡＶ－ＤＪ／９キャプシド、または米国特許出願公開第２０１２／００６６７８３号に記載の任意の他のキャプシド）、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、またはマウスＡＡＶキャプシドまたは米国特許第８２８３１５１号または国際公開第２００３／０４２３９７号に記載のＡＡＶキャプシドを含む。上記の実施形態の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶ９キャプシド、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルス１）を含む。上記の実施形態の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドＡＡＶ５キャプシドからなる群から選択されるキャプシドを含む。上記の実施形態の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５キャプシドを含む。上記の実施形態の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子はＡＡＶ１キャプシドを含む。上記の実施形態の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１３ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１４ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１５ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１６ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ２０ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ３９ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ７４ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈＭ４－１ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｈｕ３７ ＩＴＲ、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、１つのＡＡＶ血清型からのＩＴＲおよび別の血清型からのＡＡＶキャプシドを含む。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９キャプシドにキャプシド形成された、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲに隣接する治療導入遺伝子を含み得る。そのような組合せは、偽型ｒＡＡＶ粒子と呼ばれる。

【0078】

組換えアデノ随伴ウイルス粒子
本明細書に記載の方法は、空および／もしくは部分キャプシドの存在を決定する、ならびに／またはウイルス粒子（例えば、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＶＶ）粒子）の組成物中の空および／もしくは部分キャプシドの相対量を測定するために使用される。

【0079】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、約２５００塩基～約５５００塩基長である。一部の実施形態では、ｒＡＡＶゲノムは、約２５００塩基と約５５００塩基、約３０００塩基と約５５００塩基、約３５００塩基と約５５００塩基、約４０００塩基と約５５００塩基、約４５００塩基と約５５００塩基、約５０００塩基と約５５００塩基、約２５００塩基と約５０００塩基、約３０００塩基と約５０００塩基、約３５００塩基と約５０００塩基、約４０００塩基と約５０００塩基、約４５００塩基と約５０００塩基、約２５００
塩基と約４５００塩基、約３０００塩基と約４５００塩基、約３５００塩基と約４５００塩基、約４０００塩基と約４５００塩基、約２５００塩基と約４０００塩基、約３０００塩基と約４０００塩基、約３５００塩基と約４０００塩基、約２５００塩基と約３５００塩基、約３０００塩基と約３５００塩基、または約２５００塩基と約３０００塩基のいずれかの間である。

【0080】

一部の実施形態では、ウイルス粒子は、１つまたは２つのＩＴＲ（ｒＡＡＶゲノム）に隣接する導入遺伝子を含む核酸を含む組換えＡＡＶ粒子である。核酸は、ＡＡＶ粒子にキャプシド形成される。ＡＡＶ粒子は、キャプシドタンパク質も含む。一部の実施形態では、核酸は、目的のタンパク質コード配列（例えば、治療導入遺伝子）、転写の方向に作動可能に連結した成分、転写開始および終結配列を含み、それにより発現カセットを形成する制御配列を含む。発現カセットは、少なくとも１つの機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列に５’端および３’端で隣接する。「機能性ＡＡＶ ＩＴＲ配列」により、ＩＴＲ配列が、ＡＡＶビリオンのレスキュー、複製およびパッケージングを意図して機能することを意味する。その全てが、その全体を参照によって本明細書に組み入れる、Ｄａｖｉｄｓｏｎら，ＰＮＡＳ，２０００年，９７（７）３４２８～３２頁；Ｐａｓｓｉｎｉら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，７７（１２）：７０３４～４０頁；およびＰｅｃｈａｎら，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２００９年，１６：１０～１６頁を参照。本発明の一部の態様を実行するため、組換えベクターは、少なくとも全てのキャプシド形成に必須のＡＡＶの配列およびｒＡＡＶによる感染のための物理的構造を含む。本発明のベクターでの使用のためのＡＡＶ
ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を持つ必要はなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１９９４年，５：７９３～８０１頁に記載）、ヌクレオチドの挿入、欠失もしくは置換によって変更されてもよく、またはＡＡＶ ＩＴＲは、いくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来してもよい。４０を超えるＡＡＶの血清型が現在公知であり、新しい血清型および既存の血清型のバリアントが同定され続けている。Ｇａｏら，ＰＮＡＳ，２００２年，９９（１８）：１１８５４～６頁；Ｇａｏら，ＰＮＡＳ，２００３年，１００（１０）：６０８１～６頁；およびＢｏｓｓｉｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，２００３年，７７（１２）：６７９９～８１０頁を参照。任意の血清型の使用は、本発明の範囲内であると考えられる。一部の実施形態では、ｒＡＡＶベクターは、限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、チロシンキャプシド変異体、ヘパリン結合キャプシド変異体、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、またはマウスＡＡＶキャプシド等を含む、ＡＡＶ血清型由来のベクターである。一部の実施形態では、ＡＡＶの核酸は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ－１３、ＡＡＶ－１４、ＡＡＶ－１５、ＡＡＶ－１６、ＡＡＶ．ｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．ｒｈ７４、ＡＡＶ．ｒｈＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ ＤＪ等のＩＴＲを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶの核酸は、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡ
Ｖ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａ、ＡＡＶ２／２－７ｍ８、ＡＡＶ ＤＪ、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａ、ＡＡＶ２
Ｅ５４８Ａ、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａ、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋ等のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ヤギＡＡＶ、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラ、ウシＡＡＶ、マウスＡＡＶ、またはｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルス１）のキャプシドタンパク質を含む。さらなる実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、クレードＡ～Ｆ由来のＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質を含む（Ｇａｏら．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．２００４年，７８（１２）：６３８１）。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質およびＡＡＶ５キャプシドタンパク質からなる群から選択されるキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドおよびＡＡＶ５キャプシドからなる群から選択されるキャプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５キャプシドを含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１キャプシドを含む。

【0081】

異なるＡＡＶ血清型を使用して、特定の標的細胞の形質導入を最適化するかまたは、特定の標的組織（例えば、疾患組織）内の特定の細胞型を標的化する。ｒＡＡＶ粒子は、同じ血清型または混合血清型のウイルスタンパク質およびウイルス核酸を含み得る。例えば、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲを含むか、またはＡＡＶ２キャプシドタンパク質および少なくとも１つのＡＡＶ９ ＩＴＲを含み得る。さらに別の例では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ９とＡＡＶ２の両方からのキャプシドタンパク質を含み、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲをさらに含み得る。ｒＡＡＶ粒子の産生のためのＡＡＶ血清型の任意の組合せは、本明細書に各組合せが明確に言及されるように、本明細書に提供される。

【0082】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ１ ＩＴＲ、およびＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ２ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔ
ＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ３ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ４ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ５ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ６ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ７ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、Ａ
ＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ８ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ９ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。
一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ１１ ＩＴＲおよびＡＡ
Ｖ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＡＡＶ１２ ＩＴＲおよびＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、および／またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６のいずれか由来のキャプシドタンパク質を含む。

【0083】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ５キャプシドタンパク質および、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１３ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１４ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１５ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１６ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ２０ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ３９ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ７４ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈＭ４－１ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｈｕ３７ ＩＴＲ、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、および／またはマウスＡＡＶ ＩＴＲからなる群から選択されるＩＴＲを含む。

【0084】

自己相補性ＡＡＶウイルスゲノム
一部の態様では、本発明の方法は、空および／もしくは部分キャプシドの存在を決定する、ならびに／または組換え自己相補性ゲノムを含むウイルス粒子の組成物中の空および／もしくは部分キャプシドの相対量を測定するために使用される。自己相補性ゲノムを有するＡＡＶウイルス粒子および自己相補性ＡＡＶゲノムの使用の方法は、そのそれぞれが、その全体を参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第６５９６５３５号；同第７１２５７１７号；同第７７６５５８３号；同第７７８５８８８号；同第７７９０１５４号；同第７８４６７２９号；同第８０９３０５４号；および同第８３６１４５７号；ならびにＷａｎｇ Ｚ．，ら，（２００３年）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５～２１１１頁に記載される。自己相補性ゲノムを含むｒＡＡＶは、その部分的相補性配列（例えば、導入遺伝子の相補性コードおよび非コード鎖）により二本鎖ＤＮＡ分子を急速に形成するであろう。一部の実施形態では、本発明は、ＡＡＶゲノムを含むＡＡＶウイルス粒子を提供し、ｒＡＡＶゲノムは、第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療導入遺伝子コード鎖）および第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、治療導入遺伝子の非コードまたはアンチセンス鎖）を含み、第１の異種ポリヌクレオチド配列は、その全長のほとんどまたは全てに沿って第２のポリヌクレオチド配列と鎖内塩基対を形成することができる。一部の実施形態では、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対形成を促進する配列；例えば、ヘアピンＤＮＡ構造によって連
結される。ヘアピン構造は当技術分野、例えばｓｉＲＮＡ分子で公知である。一部の実施形態では、第１の異種ポリヌクレオチド配列および第２の異種ポリヌクレオチド配列は、変異ＩＴＲ（例えば、右ＩＴＲ）によって連結される。変異ＩＴＲは、末端分離配列を含むＤ領域の欠失を含む。結果として、ＡＡＶウイルスゲノムの複製時に、ｒｅｐタンパク質は変異ＩＴＲでウイルスゲノムを切断せず、５’から３’の順で以下を含む組換えウイルスゲノムはウイルスキャプシドにパッケージされる；ＡＡＶ ＩＴＲ、制御配列を含む第１の異種ポリヌクレオチド配列、変異ＡＡＶ ＩＴＲ、第１の異種ポリヌクレオチドに対して逆方向の第２の異種ポリヌクレオチドおよび第３のＡＡＶ ＩＴＲ。

【0085】

ｒＡＡＶベクターの産生
トランスフェクション、安定細胞株産生、およびアデノウイルスＡＡＶハイブリッド、ヘルペスウイルスＡＡＶハイブリッド（Ｃｏｎｗａｙ，ＪＥら，（１９９７年）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７１（１１）：８７８０～８７８９頁）およびバキュロウイルスＡＡＶハイブリッドを含む感染性ハイブリッドウイルス産生系を含む、ｒＡＡＶベクターの産生のための多くの方法が当技術分野で公知である。ｒＡＡＶウイルス粒子の産生のためのｒＡＡＶ産生培養は全て；１）例えば、ヒト由来細胞株、例えば、ＨｅＬａ、Ａ５４９、もしくは２９３細胞、またはバキュロウイルス産生系の場合、昆虫由来細胞株、例えばＳＦ－９を含む好適な宿主細胞；２）野生型もしくは変異アデノウイルス（例えば、温度感受性アデノウイルス）、ヘルペスウイルス、バキュロウイルス、またはヘルパー機能を提供するプラスミド構築物によって提供される、好適なヘルパーウイルス機能；３）ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子ならびに遺伝子産物；４）少なくとも１つのＡＡＶ ＩＴＲ配列に隣接する導入遺伝子（例えば治療導入遺伝子）；ならびに５）ｒＡＡＶ産生を支持する好適な培地および培地成分を必要とする。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子産物は、任意のＡＡＶ血清型に由来し得る。一般には、必須ではないが、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子産物は、ｒｅｐ遺伝子産物がｒＡＡＶゲノムの複製およびパッケージに機能し得る限り、ｒＡＡＶベクターゲノムのＩＴＲと同じ血清型である。当技術分野で公知の好適な培地は、ｒＡＡＶベクターの産生のために使用される。これらの培地は、限定はされないが、Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）、特に、組換えＡＡＶベクターの産生での使用のためのカスタム培地調合物に関して、そのそれぞれが、その全体を参照によって本明細書に組み入れられる、米国特許第６５６６１１８号に記載のものなどのカスタム調合物、および米国特許第６７２３５５１号に記載のＳｆ－９００ ＩＩ ＳＦＭ培地を含む、Ｈｙｃｌｏｎｅ ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓおよびＪＲＨによって生産される培地を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、アデノウイルスまたはＨＳＶによって提供される。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能はバキュロウイルスによって提供され、宿主細胞は昆虫細胞（例えば、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞）である。一部の実施形態では、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ領域をコードする核酸のｐ５プロモーターは、ｒｅｐおよび／またはｃａｐコード領域の３’に位置する。一部の実施形態では、ＡＡＶ
ｒｅｐおよびｃａｐコード領域をコードする核酸は、プラスミドｐＨＬＰ、ｐＨＬＰ１９、またはｐＨＬＰ０９（そのそれぞれの内容が、その全体を本明細書に組み入れられる、米国特許第５６２２８５６号；同第６００１６５０号；同第６０２７９３１号；同第６３６５４０３号；同第６３７６２３７号；および同第７０３７７１３号参照）。一部の実施形態では、ＡＡＶヘルパーウイルス機能は、アデノウイルスＥ１Ａ機能、アデノウイルスＥ１Ｂ機能、アデノウイルスＥ２Ａ機能、アデノウイルスＶＡ機能およびアデノウイルスＥ４ ｏｒｆ６機能を含む。

【0086】

本発明の好適なｒＡＡＶ産生培養培地は、０．５％～２０％（ｖ／ｖまたはｗ／ｖ）のレベルで、血清または血清由来組換えタンパク質を補足される。あるいは、当技術分野で公知のように、ｒＡＡＶベクターは、動物由来産物を含まない培地とも呼ばれる、無血清
条件で産生される。当業者は、ｒＡＡＶベクターの産生を支持するようにデザインされた市販またはカスタム培地が、産生培地中のｒＡＡＶの力価を増加させるために、限定はされないが、グルコース、ビタミン、アミノ酸、および／または増殖因子を含む、当技術分野で公知の１つまたはそれ以上の細胞培養成分も補足されることを認識し得る。

【0087】

一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって、１つまたはそれ以上の精製方法の工程の前後に組成物の試料を回収すること、およびそれぞれの回収した試料を本明細書に記載の方法に従って空キャプシドの相対量について解析することを含み、続けて回収した試料間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す方法を提供する。

【0088】

一部の態様では、本発明は、ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって：
ａ）精製方法前または方法の精製の工程前に回収した第１の試料において、本明細書に記載のいずれか１つの方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること、
ｂ）精製方法後または方法の精製の工程後に回収した第２の試料において、本明細書に記載の方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること
を含み、第２の回収した試料と第１の回収した試料の間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す方法を提供する。

【0089】

ｒＡＡＶ産生培養は、利用される特定の宿主細胞に好適な様々な条件下（広い温度範囲にわたり、様々な時間等）で増殖される。当技術分野で公知のように、ｒＡＡＶ産生培養は、好適な接着依存性容器、例えば、ローラーボトル、中空糸フィルター、マイクロキャリア、および充填ベッドまたは流動床バイオリアクターで培養される接着依存性培養を含む。ｒＡＡＶベクター産生培養は、例えば、スピナーフラスコ、撹拌タンクバイオリアクター、および使い捨てシステム、例えばＷａｖｅバッグシステムを含む様々な方法で培養される、懸濁適応宿主細胞、例えば、ＨｅＬａ、２９３、およびＳＦ－９細胞も含み得る。

【0090】

ｒＡＡＶベクター粒子は、産生培養の宿主細胞の溶解によるか、または米国特許第６５６６１１８号により完全に記載されるように、細胞は当技術分野で公知の条件下で培養され、無傷な細胞から培地へとｒＡＡＶ粒子の放出を引き起こす場合、産生培養からの使用済み培地の回収により、ｒＡＡＶ産生培養から回収される。細胞を溶解する好適な方法も、当技術分野で公知であり、例えば複数回の凍結／融解サイクル、ソニケーション、顕微溶液化、および化学物質、例えば界面活性剤および／またはプロテアーゼによる処置を含む。

【0091】

ｒＡＡＶベクターの精製
回収時、本発明のｒＡＡＶ産生培養は、以下の１つまたはそれ以上を含有し得る：（１）宿主細胞タンパク質；（２）宿主細胞ＤＮＡ；（３）プラスミドＤＮＡ；（４）ヘルパーウイルス；（５）ヘルパーウイルスタンパク質；（６）ヘルパーウイルスＤＮＡ；および（７）例えば、血清タンパク質、アミノ酸、トランスフェリンおよび他の低分子量タンパク質を含む培地成分。さらに、ｒＡＡＶ産生培養は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５、ＡＡＶ１６、ＡＡＶｒｈ２０、ＡＡＶ．ｒｈ３９、ＡＡＶ．Ｒｈ７４、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－ｌ、ＡＡＶ．ｈｕ３７、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ２．５、ＡＡＶ２ｔＹＦ、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ．ＬＫ０３、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ、ＡＡＶ．ＨＳＣ２、ＡＡＶ．ＨＳＣ３、ＡＡＶ．ＨＳＣ４、ＡＡＶ．ＨＳＣ５、ＡＡＶ．ＨＳＣ６、ＡＡＶ．ＨＳＣ７、ＡＡＶ．ＨＳＣ８、ＡＡＶ．ＨＳＣ９、ＡＡＶ
．ＨＳＣｌＯ、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５、またはＡＡＶ．ＨＳＣ１６からなる群から選択されるＡＡＶキャプシド血清型を有するｒＡＡＶ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養は、空ＡＡＶキャプシド（例えば、キャプシドタンパク質を含むがｒＡＡＶゲノムを含まないｒＡＡＶ粒子）をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養は、バリアントｒＡＡＶゲノム（例えば、無傷の完全長ｒＡＡＶゲノムとは異なるｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子）を含むｒＡＡＶ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養は、トランケートｒＡＡＶゲノムを含むｒＡＡＶ粒子をさらに含む。一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養は、ＡＡＶキャプシド形成ＤＮＡ不純物を含むｒＡＡＶ粒子をさらに含む。

【0092】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物を清澄化し、宿主細胞デブリを除去する。一部の実施形態では、産生培養回収物は、例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅミリスタックプラス（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋）ＨＣ ＰｏｄフィルターグレードＤＯＨＣ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅミリスタックプラス（Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋）ＨＣ ＰｏｄフィルターグレードＡ１ＨＣ、および０．２μｍフィルター Ｏｐｔｉｃａｌ ＸＬ１０ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ
Ｅｘｐｒｅｓｓ ＳＨＣ親水性膜フィルターを含む一連のデプスフィルターを通過する濾過により清澄化される。清澄化はまた、当技術分野で公知の様々な他の標準技術、例えば、遠心分離または当技術分野で公知の０．２μｍまたはそれより大きい孔サイズのアセチルセルロースフィルターを通過する濾過によっても達成される。

【0093】

一部の実施形態では、ｒＡＡＶ産生培養回収物は、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）によってさらに処置され、産生培養中に存在する任意の高分子量ＤＮＡを消化する。一部の実施形態では、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）消化は、例えば、３０分～数時間の期間、周囲温度～３７℃の範囲の温度で、最終濃度１～２．５ユニット／ｍｌのＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）を含む、当技術分野で公知の標準条件下で実行される。

【0094】

ｒＡＡＶ粒子は、以下の精製工程の１つまたはそれ以上を使用して単離または精製される。：平衡遠心；フロースルー陰イオン交換フィルトレーション；ｒＡＡＶ粒子を濃縮するためのタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＦＦ）；アパタイトクロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；ヘルパーウイルスの熱不活性化；疎水性相互作用クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉；サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による緩衝液交換；ナノフィルトレーション；および陰イオン交換クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、または親和性クロマトグラフィーによるｒＡＡＶ捕捉。これらの工程は、単独で、様々な組合せで、または異なる順で使用される。一部の実施形態では、方法は、以下に記載した順の全ての工程を含む。ｒＡＡＶ粒子を精製する方法は、例えば、ｘｉａｏら，（１９９８年）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：２２２４～２２３２頁；米国特許第６９８９２６４号および同第８１３７９４８号および国際公開第２０１０／１４８１４３号に見出される。

【0095】

キット
本発明の方法は、キットの形態で提供される。一部の実施形態では、本明細書は、本明細書に記載のいずれか１つの方法に従ってｒＡＡＶ粒子の組成物中の空キャプシドの相対量を測定するためのキットを提供する。一部の実施形態では、キットは、本方法での使用のためのクロマトグラフィーカラムおよび／または緩衝液を含む。一部の実施形態では、キットは、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上の参照標準を含む。一部の実施形態では、３つまたはそれ以上の参照標準は、１：０、０．９：０．１、０．８：０．２、０．７：０．３、０．６：０．４、０．５：０．５、０．４：０．６、０．３：０．７、０．２：０．８、０．１：０．９、および０：１のいずれか１つの公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む
。一部の実施形態では、３つまたはそれ以上の参照標準は、低レベルの空キャプシド（例えば、＞７５％完全キャプシド）、およそ等量の完全および空キャプシド（例えば、～５０％完全キャプシド）、および高レベルの空キャプシド（例えば、＜２５％完全キャプシド）を有する調製物を含む。

【0096】

例示的な実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態を提供する。
１．組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を決定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空および／または部分キャプシドの存在を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法。
２．約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である、実施形態１に記載の方法。
３．約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である、実施形態１または２に記載の方法。
４．完全ｒＡＡＶキャプシドの純粋試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比よりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．公知のパーセンテージの空および／または部分キャプシドを有するｒＡＡＶ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と等しいかまたはそれよりも低いＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、組成物中の空および／または部分キャプシドを示す、実施形態１～３のいずれか１つに記載の方法。
６．ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法。
７．約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である、実施形態６に記載の方法。
８．約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である、実施形態６または７に記載の方法。
９．組成物中の空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物によって確立されたパーセント完全キャプシドの間の直線関係と溶出液のＰＡ２６０／ＰＡ２３０を比較することによって決定される、実施形態６～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の直線関係は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントをプロットすることにより決定される、実施形態９に記載の方法。
１１．直線関係は、％完全キャプシド＝（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０－ａ）／ｂの式によって表され、式中、ａは空キャプシドのＰＡ２６０／ＰＡ２３０であり、ｂはＰＡ２６０／ＰＡ２３０対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントのプロットから決定された一次方程式の傾きである、実施形態９または１０に記載の方法。
１２．異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物は、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物を含む、実施形態９～１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．複数のｒＡＡＶ調製物は、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じ血清型のｒＡＡＶキャプシドを含む、実施形態９～１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズが少なくとも約９０％であるウイルスゲノムを含む、実施形態９～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと同じであるウイルスゲノムを含む、実施形態９～１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．複数のｒＡＡＶ調製物は、同じ血清型のキャプシドを含み、完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じウイルスゲノムを含む、実施形態９～１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、またはアパタイトクロマトグラフィーである、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．クロマトグラフィーは、カラムクロマトグラフィーを利用する、実施形態１～１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．クロマトグラフィーは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または超高速液体クロマトグラフィー（ＵＨＰＬＣ）である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーである、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．ｒＡＡＶ粒子を含む組成物中の空および／または部分キャプシドの相対量を測定する方法であって：
ａ）クロマトグラフィーの溶出液中に組成物の不純物からｒＡＡＶ粒子を分離する条件下で、サイズ排除クロマトグラフィーに組成物をかけること；
ｂ）溶出液の約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍ（Ａ_{２５０～２７０}）および約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍ（Ａ_{２２０～２４０}）でのＵＶ吸光度を測定すること、
ｃ）溶出液のＡ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}のクロマトグラムをプロットすること、
ｄ）Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}でのピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０）が組成物中の空キャプシドの相対量を示す、Ａ_{２５０～２７０}およびＡ_{２２０～２４０}プロットのｒＡＡＶ粒子を表すピーク下面積を統合すること
を含む、方法。
２２．約２５０ｎｍ～約２７０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２６０ｎｍでのＵＶ吸光度である、実施形態２１に記載の方法。
２３．約２２０ｎｍ～約２４０ｎｍでのＵＶ吸光度は、約２３０ｎｍでのＵＶ吸光度である、実施形態２１または２２に記載の方法。
２４．空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比と異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物によって確立されたパーセント完全
キャプシドの間の直線関係と精製ｒＡＡＶ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０を比較することによって決定される、実施形態２１～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間の直線関係は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントをプロットすることにより決定される、実施形態２１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．直線関係は、％完全キャプシド＝（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０－ａ）／ｂの式によって表され、式中、ａは空キャプシドのＰＡ２６０／ＰＡ２３０であり、ｂはＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドのパーセントのプロットから決定された一次方程式の傾きである、実施形態２１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．異なる公知のパーセンテージの完全キャプシドを有する複数のｒＡＡＶ調製物は、１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上のｒＡＡＶ調製物を含む、実施形態２４～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．複数のｒＡＡＶ調製物は、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じ血清型のｒＡＡＶキャプシドを含む、実施形態２４～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと比較してサイズが少なくとも約９０％であるウイルスゲノムを含む、実施形態２４～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．複数のｒＡＡＶ調製物の完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子のウイルスゲノムと同じであるウイルスゲノムを含む、実施形態２４～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．複数のｒＡＡＶ調製物は、同じ血清型のキャプシドを含み、完全キャプシドは、組成物中のｒＡＡＶ粒子と同じウイルスゲノムを含む、実施形態２４～３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．サイズ排除クロマトグラフィーは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムを利用する、実施形態２０～３１のいずれか１つに記載の方法。
３３．サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約３μｍ～約１０μｍの粒子を含む、実施形態３２に記載の方法。
３４．サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、直径約５μｍの粒子を含む、実施形態３２または３３に記載の方法。
３５．サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約１００Å～約１０００Åの孔を有する粒子を含む、実施形態３２～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．サイズ排除クロマトグラフィーカラムは、サイズが約５００Åの孔を有する粒子を含む、実施形態３２～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．粒子は、シリカを含む、実施形態３３～３６のいずれか１つに記載の方法。
３８．カラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約５０ｍｍ～約３００ｍｍの間の長さを有し、具体的には、約７．８ｍｍ×約３００ｍｍ、約４．６ｍｍ×約１００ｍｍ、または約４．６ｍｍ×約１５０ｍｍである、実施形態３２～３７のいずれか１つに記載の方法。
３９．サイズ排除クロマトグラフィーは、ガードカラムをさらに利用する、実施形態３２～３８のいずれか１つに記載の方法。
４０．ガードカラムは、サイズ排除クロマトグラフィーカラムと同じ粒子を含む、実施形態３９に記載の方法。
４１．ガートカラムは、約４．０～約７．８ｍｍの間の内径および約３０ｍｍ～約５０ｍｍの間の長さを有し、具体的には、約７．８ｍｍ×約５０ｍｍ、または約４．６×約５０ｍｍである、実施形態３９または４０に記載の方法。
４２．サイズ排除クロマトグラフィーの移動相は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、実施形態２０～４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．ＰＢＳは、
約１００ｍＭ～約２００ｍＭ ＮａＣｌ、
約１ｍＭ～約５ｍＭ ＫＣｌ、
約５ｍＭ～約２０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および
約１ｍＭ～約３ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４
を含む、実施形態４２に記載の方法。
４４．ＰＢＳは、
約１３７ｍＭ ＮａＣｌ、
約２．７ｍＭ ＫＣｌ、
約１０ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、および
約１．８ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４
を含む、実施形態４２または４３に記載の方法。
４５．ＰＢＳは、約６．５～約７．５または約７．０のｐＨを有する、実施形態４２～４４のいずれか１つに記載の方法。
４６．クロマトグラフィーは、流速約０．５ｍＬ／分～約１．０ｍＬ／分、約０．７ｍＬ／分～約０．８ｍＬ／分、または約０．７５ｍＬ／分で実行される、実施形態２０～４５に記載の方法。
４７．クロマトグラフィーは、約４℃～約３５℃で実行される、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．クロマトグラフィーは、約２５℃、約３０℃、または約３５℃で実行される、実施形態１～４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．約５μＬ～約５００μＬまたは約１０μＬ～約７５μＬがクロマトグラフィーにかけられる、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１１～約１×１０^１４個のキャプシド粒子／ｍＬ（ｃｐ／ｍＬ）または約５×１０^１２ｃｐ／ｍＬである、実施形態１～４９のいずれか１つに記載の方法。
５１．組成物中のｒＡＡＶの力価は、約１×１０^１０～約１×１０^１４個のウイルスゲノム／ｍＬ（ｖｇ／ｍＬ）である、実施形態１～５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．約７０％より多くの組成物中のｒＡＡＶ粒子は、完全ｒＡＡＶキャプシドである、実施形態１～５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．約７０％～約９５％より多くの組成物中のｒＡＡＶ粒子は、完全ｒＡＡＶキャプシドである、実施形態１～５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．組成物中のｒＡＡＶ粒子は、１つまたはそれ以上の精製工程を使用して精製される、実施形態１～５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１キャプシド、ＡＡＶ２キャプシド、ＡＡＶ３キャプシド、ＡＡＶ４キャプシド、ＡＡＶ５キャプシド、ＡＡＶ６キャプシド、ＡＡＶ７キャプシド、ＡＡＶ８キャプシド、ＡＡＶｒｈ８キャプシド、ＡＡＶ９キャプシド、ＡＡＶ１０キャプシド、ＡＡＶｒｈ１０キャプシド、ＡＡＶ１１キャプシド、ＡＡＶ１２キャプシド、ＡＡＶ１３キャプシド、ＡＡＶ１４キャプシド、ＡＡＶ１５キャプシド、ＡＡＶ１６キャプシド、ＡＡＶｒｈ２０キャプシド、ＡＡＶ．ｒｈ３９キャプシド、ＡＡＶ．Ｒｈ７４キャプシド、ＡＡＶ．ＲＨＭ４－１キャプシド、ＡＡＶ．ｈｕ３７キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０キャプシド、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０Ｌ６５キャプシド、ＡＡＶ．ＰＨＰ．Ｂキャプシド、ＡＡＶ２．５キャプシド、ＡＡＶ２ｔＹＦキャプシド、ＡＡＶ３Ｂキャプシド、ＡＡＶ．ＬＫ０３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ６キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ７キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ８キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ９キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌＯキャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣｌ １キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１２キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１３キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１４キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１５キャプシド、ＡＡＶ．ＨＳＣ１６キャプシド、ＡＡＶ２Ｒ４７１Ａキャプシド、ＡＡＶ２／２－７ｍ８キャプシド、ＡＡＶ ＤＪキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ５８７Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｅ５４８Ａキャプシド、ＡＡＶ２ Ｎ７０８Ａキャプシド、ＡＡＶ Ｖ７０８Ｋキャプシド、ヤギＡＡＶキ
ャプシド、ＡＡＶ１／ＡＡＶ２キメラキャプシド、ウシＡＡＶキャプシド、またはマウスＡＡＶキャプシドｒＡＡＶ２／ＨＢｏＶ１（キメラＡＡＶ／ヒトボカウイルス１）を含む、実施形態１～５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．組換えウイルス粒子は、ＡＡＶ１ ＩＴＲ、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、ＡＡＶ３ ＩＴＲ、ＡＡＶ４ ＩＴＲ、ＡＡＶ５ ＩＴＲ、ＡＡＶ６ ＩＴＲ、ＡＡＶ７ ＩＴＲ、ＡＡＶ８ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ８ ＩＴＲ、ＡＡＶ９ ＩＴＲ、ＡＡＶ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶｒｈ１０ ＩＴＲ、ＡＡＶ１１ ＩＴＲ、ＡＡＶ１２ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１３ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１４ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１５ ＩＴＲ、ＡＡＶ－１６ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ２０ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ３９ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈ７４ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｒｈＭ４－１ ＩＴＲ、ＡＡＶ．ｈｕ３７ ＩＴＲ、ＡＡＶ．Ａｎｃ８０ ＩＴＲ、ＡＡＶ ＤＪ
ＩＴＲ、ヤギＡＡＶ ＩＴＲ、ウシＡＡＶ ＩＴＲ、またはマウスＡＡＶ ＩＴＲを含む、実施形態１～５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．ｒＡＡＶゲノムは、２５００塩基～５５００塩基長である、実施形態１～５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．組換えウイルス粒子は、自己相補性ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ゲノムを含む、実施形態１～５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．ｒＡＡＶ粒子は、ｒＡＡＶ５粒子およびｒＡＡＶ１粒子からなる群から選択される、実施形態６～５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ５粒子である、実施形態６～５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５７（相対パーセント完全キャプシド）＋０．１１３７の式から算出される、実施形態６０に記載の方法。
６２．ｒＡＡＶ粒子はｒＡＡＶ１粒子である、実施形態６～５９のいずれか１つに記載の方法。
６３．空キャプシドの相対量は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．００５４（相対パーセント完全キャプシド）＋０．０８８６の式から算出される、実施形態６２に記載の方法。
６４．ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって、精製方法の１つまたはそれ以上の工程の前後に組成物の試料を回収すること、およびそれぞれの回収した試料を実施形態１～６３のいずれか１つに記載の方法に従って空キャプシドの相対量について解析することを含み、続けて回収した試料間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す、方法。
６５．ｒＡＡＶ粒子の組成物の精製中に空キャプシドの除去をモニタリングする方法であって：
ａ）精製方法前または方法の精製の工程前に回収した第１の試料において、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること、
ｂ）精製方法後または方法の精製の工程後に回収した第２の試料において、実施形態１～３７のいずれか１つに記載の方法に従って空キャプシドの相対量を決定すること
を含み、
第２の回収した試料と第１の回収した試料の間の空キャプシドの相対量の減少がｒＡＡＶ粒子の調製物からの空キャプシドの除去を示す、方法。
６６．実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法に従ってｒＡＡＶ粒子の組成物中の空キャプシドの相対量を測定するためのキット。
６７．実施形態１～６５のいずれか１つに記載の方法での使用のためのクロマトグラフィーカラムおよび／または緩衝液を含む、実施形態６６に記載のキット。
６８．１：０～０：１の範囲の公知の比の空キャプシドに対する完全キャプシドを含む３つまたはそれ以上の参照標準を含む、実施形態６６または６７に記載のキット。

【実施例】

【0097】

本発明は、以下の実施例を参照してより完全に理解されるであろう。しかしながら、それらは本発明の範囲を限定すると考えられるべきではない。本明細書に記載の実施例およ
び実施形態は、例示の目的のみであり、それに照らして様々な改変または変更が当業者に考えられ、本出願の趣旨および範囲ならびに添付の特許請求の範囲の範囲内に含まれることが理解される。

【0098】

実施例１：最初のサイズ排除クロマトグラフィーカラムスクリーニング
以下の実施例は、ＡＡＶ粒子のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を実行するために好適なカラムを同定する最初のスクリーニングを記載する。ＡＡＶキャプシドのＳＥＣ解析を実行する好適なカラムの選択は、主に、キャプシドの分子特性による。ＡＡＶキャプシドの分子量は３．５～６．０メガダルトンであり、キャプシドは２０～２５ｎｍの直径を有する。したがって、３００～１０００Å（３０～１００ｎｍ）の孔サイズを有するＳＥＣ樹脂は、凝集種から、ならびに試料中に存在すると予想される低分子量種および小分子から単量体ＡＡＶを分離するのに好適であると見込まれた。いずれの起こり得るふるい効果も避けるため、比較的大きな粒子サイズからなる固定相をパックした大きい内径を有する解析カラムが好まれる。Ｗａｔｅｒｓ、ＳｅｐａｘおよびＷｙａｔｔを含むいくつかのベンダーが、この目的に好適であり得るカラムを製造する。Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣカラムは、ナノメートル厚の疎水性および中性フィルムによってコートされた球状の高純度シリカによってパックされ、これらの材料は、ウイルスおよびウイルス様粒子の分離に有望であることが示された。

【0099】

結果
好ましいカラム寸法（３００×７．８ｍｍ）および粒子サイズ（５μｍ）を有するが、孔サイズが異なる（３００、５００および１０００Å）３つのカラムを、移動相としてリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を使用して、ＡＡＶ５含有試料を解析するそれらの性能について評価した。ＡＡＶ５試料のクロマトグラムを図１Ａ～１Ｃに示した。

【0100】

孔サイズの増加によって増加する保持時間でカラムから溶出した単量体ベクターは、異なる微小孔の内側および外側の溶質の拡散特性を示す（図１Ａ）。ＳＥＣ－３００カラムで得られた溶出プロファイルで観察された単量体ピークはシャープであるがわずかに歪み、単量体ピークの前に溶出されると考えられる微量の凝集体が観察されなかった。ＳＥＣ－１０００カラムで得られた溶出プロファイル（図１Ａ）は、低分子量種を表すピーク（緩衝液ピーク）に近すぎる単量体溶出を示す。５００Åの孔サイズを有するＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００カラムは、したがって、保持時間、ピーク形状および分離が十分であるようにさらなる開発のために選択された。図１Ｂに示すように、シグナルが２８０ｎｍと比較して２６０ｎｍでモニターされる場合、単量体を表すピーク面積はより高く、ほとんど完全キャプシドを含有する試料を示すおよそ１．２５のピーク面積比（ＰＡ２６０／ＰＡ２８０）を生じる。およそ５．８分および８．６分に溶出されるマイナーピークは、ＡＡＶ凝集体であり（ＨＭＷ１は０．５％およびＨＭＷＳ２は１．７％）、本方法が低レベルの凝集体を検出できることを示す。ＤＳ試料の異なる容積（５×１０^１２ｃｐ／ｍＬの１０～７５μｌ）が注入される場合、注入したキャプシド数と関連して、２６０ｎｍと２８０ｎｍでのピーク面積で優れた直線性が観察され（Ｒ^２＝０．９９７）（図１Ｃ）、試料の力価に由来することを示した。ＰＡ２６０／ＰＡ２８０比は、試験した範囲にわたり変化しないままであった。

【0101】

実施例２：ＡＡＶスパイク試料のための二波長検出を有するサイズ排除クロマトグラフィー
以下の実施例は、ＡＡＶキャプシドの調製物を解析する、二波長検出を有するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＤＷ）の使用を記載する。

【0102】

材料および方法
空キャプシド、完全キャプシドおよびスパイク試料の調製。空キャプシドは、強陰イオ
ン交換ＨＱカラムを使用して精製した。完全キャプシドは、ＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）親和性カラムおよびＨＱ陰イオン交換カラムによって単離し、塩化セシウム密度勾配遠心分離によってさらに精製し、残存する空および部分キャプシドを除去し、高純度を達成した。

【0103】

およそ２０ｍＬの精製ＡＡＶ５ウイルス（～５×１０^１３～１×１０^１４個の全ベクターゲノム）を、２０ｍＭ ＮａＨ_２ＰＯ_４、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５によって３０ｍＬに希釈し、そこに１７．８ｇの塩化セシウム（ＣｓＣｌ_２）を添加して、最終密度を１．３５ｇ／ｍＬにした。溶液を、７０ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎ遠心分離機により、１５℃で終夜、５０００ｒｐｍで遠心分離した。２つのバンドを、デュアル高強度ファイバーライトランプによって可視化した。上のバンドおよび下のバンドは、それぞれ空および完全キャプシドとしてシリンジによって回収した。試料は、１０Ｋ ＭＷＣＯ ｓｌｉｄｅ－ａ－ｌｙｚｅｒ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＭＡ）を使用して１×ＰＢＳに対して、次いでＤＳ調合物緩衝液に対して透析した。

【0104】

空および完全キャプシドは、分析用超遠心（ＡＵＣ）およびドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）およびｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって特徴付けられ、キャプシド分布およびベクターゲノム濃度を決定した。空キャプシド調製物の濃度は、ＡＡＶ滴定ＥＬＩＳＡ（Ｐｒｏｇｅｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ）またはＡ_２８０によって決定した。結果は、表１に要約した。

【0105】

【表1】

【0106】

一連の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）標準および様々な量の完全キャプシドを含有するスパイク試料は、それらのキャプシド濃度（ｃｐ／ｍＬ）に基づいて既定の比で空および完全キャプシドを混合することによって調製した。これらの材料を使用して、空および完全キャプシドのＳＥＣ－ＤＷ法を開発した。さらに、比較のため、試料は、直交アプローチ、例えば、ＵＶ測定、ＡＵＣ特徴付けおよび低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）解析を使用して評価した（実施例３参照）。

【0107】

吸光係数およびＵＶ測定。２８０ｎｍでの空キャプシドの吸光係数（ε_２８０，_{キャプシド}）は、キャプシド当たり５：５：５０のＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３の比を使用して、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３の一次配列に存在する芳香族アミノ酸の吸光度に基づいて算出した。２６０ｎｍでの空キャプシドの吸光係数（ε_{２６０，キャプシド}）は、先に公開された変換因子０．５９を使用してε_{２８０，キャプシド}を変換することによって得た（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３年，７（１），１２２～８頁）。空キャプシドの分子量（ＭＷ）は、配列情報および前述のタンパク質比に基づいて算出した。２６０ｎｍ（ε_{２６０，遺伝子}）での導入遺伝子の吸光係数およびそのＭＷは遺伝子配列に基づいて算出し、２８０ｎｍ（ε_{２８０，遺伝子}）での吸光係数は０．５５５の変
換因子で導出した（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３年，７（１），１２２～８頁）。完全キャプシドの２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの吸光係数は、各波長でのキャプシドおよび導入遺伝子の吸光係数の合計である（例えば、ε_{２６０，完全キャプシド}＝ε_{２６０，キャプシド}＋ε_{２６０，遺伝子}）。空および完全キャプシドの吸光係数を表２に要約する。研究で使用した異なる試料の予測されるＡ_２６０／Ａ_２８０比は、試料中に存在する空および完全キャプシドの相対量に基づいて算出した。

【0108】

【表2】

【0109】

空、完全およびスパイク試料のＵＶ吸光度は、ナノドロップスペクトロメーター（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ，ＭＡ）を使用して測定した。Ａ_２６０／Ａ_２８０データを、期待パーセント完全キャプシドに対してプロットし、予測Ａ_２６０／Ａ_２８０データと比較した（図２参照）。

【0110】

ＳＥＣ－二波長。ＡＡＶキャプシド（通常、注入当たり２５μＬまたは５０μＬ）を、ＣａＣｌ_２を含まず、ＭｇＣｌ_２を含まないＤｕｌｂｅｃｃｏのリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）により２５℃で平衡化したガードカラム（ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００，５μｍ，５００Å，７．８×５０ｍｍ）を備えたサイズ排除カラム（Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００，５μｍ、５００Å，７．８×３００ｍｍ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）にロードした。ＳＥＣ－５００カラムに加えて、２つのさらなるカラム（ガードカラムＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－３００，５μｍ，３００Å，７．８×５０ｍｍを備えたＳｅｐａｘ ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－３００，５μｍ，３００Å，７．８×３００ｍｍおよびガードカラムＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－１０００，５μｍ，１０００Å，７．８×５０ｍｍを備えたＳｅｐａｘ ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－１０００，５μｍ，１０００Å，７．８×３００ｍｍ）を比較のために評価した。全てのカラムは、同じ条件下で実行した。

【0111】

オートサンプラーの温度は、５℃に設定した。キャプシドは、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＣＡ）を使用して流速０．７５ｍＬ／分で、ＤＰＢＳ、ｐＨ７．０によって溶出した。溶出液は、２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび２３０ｎｍでモニターし、データはＡｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬａｂソフトウェアによって獲得した。

【0112】

２３０ｎｍ、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍでの単量体ＡＡＶのピーク面積は、ピーク面積（ＰＡ）比（例えば、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０およびＰＡ２６０／ＰＡ２８０）を算出するために使用した。パーセント完全キャプシドとのピーク面積比の相関は、ＨＰＬＣ標準および様々な量の完全キャプシドを含有するスパイク試料を使用して確立した。

【0113】

結果
ＡＡＶスパイク試料の二波長検出を有するＳＥＣ
実施例１に記載のように、様々なキャプシド標準および試料を２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで最初にモニターし、キャプシド形成した核酸およびキャプシドタンパク質はそれぞ
れ最大吸光度を有した（図１Ａ参照）（Ｐｏｒｔｅｒｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ｚ．ａｎｄ Ｚｌｏｔｎｉｃｋ，Ａ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０１０年，４０７（２），２８１～８頁）。図３Ａおよび図３ＢのＨＰＬＣ標準試料のＳＥＣクロマトグラムは、単量体が小さい凝集体ピークから十分に分離され、標準試料で得られたＰＡ２６０／ＰＡ２８０比は、試料を調製するために組み合わされた空および完全キャプシドストック溶液の比に基づいて算出されたパーセント完全キャプシドの期待値に対してプロットした（図３Ｄ）。図３Ｄに示すように、ＰＡ２６０／ＰＡ２８０比は、完全キャプシドが全キャプシドの７０％より多くを占める場合、漸近線に近づく。結果として、本方法は、完全キャプシド含量が７０％より多い場合、適当な正確さおよび正確性での完全キャプシドのパーセンテージを決定する能力が限定される。類似の限定が、ＵＶ分光法を使用してＡ_２６０／Ａ_２８０比をモニターした場合に以前にも観察され（Ｓｏｍｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２００３年，７（１），１２２～８頁）、スパイク試料のＡ_２６０／Ａ_２８０比は図２に示される。遺伝子治療候補は、製剤原料および製剤中に７０％より多くの完全キャプシドを有することが多いため、上流および下流の方法の継続的な改善のために、９０％より多くのパーセント完全キャプシドを正確にモニタリングできる方法が必要である。

【0114】

本方法の範囲を拡大するため、タンパク質検出のための他の波長の使用を評価した。理論に縛られることを望まないが、キャプシドタンパク質の吸光度は、２３０ｎｍの波長でずっと強く、優性になると仮定されたが、導入遺伝子の誘引吸光度は限定された。図３Ｃは、２３０ｎｍでの標準のＳＥＣトレースを示す。仮定のように、２６０ｎｍおよび２３０ｎｍでモニターされたピーク面積は、カラムローディングに比例し、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は試験範囲にわたり一定のままであり、固有のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比はキャプシド濃度に非依存的であったことを確認した（図４参照）。図４に示すように、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、試験したローディング範囲にわたり変化しなかった。ピーク面積比の検出および算出のためにこの新しい二波長を使用することにより、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０とパーセント完全キャプシドの間の直線関係が確立された（ｙ＝０．００５７ｘ＋０．１１３７）。適合度は優れており、０．９９９のＲ^２により判断された（図３Ｄ）。

【0115】

ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比対パーセント完全キャプシドを使用する場合、線形曲線フィットを使用する能力が重要であり、変化は、７０％を超える完全キャプシドのアッセイ範囲の拡大を可能にする。本研究で使用した完全キャプシド試料は、９１％完全および９％部分キャプシドを含有し、したがってこのレベルを超える方法の能力を評価することはできなかった。しかしながら、アッセイ範囲は、１００％完全キャプシドに拡大することができ、直線関係が観察された。ＳＥＣクロマトグラフィーの性質により、この解析は、～５×１０^１２ｃｐ／ｍＬのキャプシド濃度で小容積（例えば、１０～５０μｌ）のみを使用して実行される。さらに、本方法は、試料のｐＨおよびイオン強度を平衡化して移動相のｐＨおよびイオン強度に適合させ、したがって導入遺伝子の吸光度へのそれらの影響を最小にした（Ｗｉｌｆｉｎｇｅｒ，Ｗ．Ｗ．ら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １９９７年，２２（３），４７４～６頁，４７８～８１頁）。

【0116】

ＳＥＣ－ＤＷの特異性、再現性、およびロバスト性
上記のように、ＳＥＣ－ＤＷ法は、賦形剤および／または緩衝液成分からＡＡＶキャプシドを分離した。したがって、製剤緩衝液中の成分は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比に影響しないと期待された。サイログロブリン、γ－グロブリン、オボアルブミン、ミオグロビン、およびビタミンＢ_１２を含有するＢｉｏ－Ｒａｄのゲル濾過標準を使用して、タンパク質のどのサイズが解析と干渉し得るか推定した。８～１３分の保持時間窓で溶出したウシサイログロブリンは、このサイズ（ＭＷ６７０，０００Ｄａ）およびそれより大きいタンパク質のみが空および完全キャプシドの定量と干渉する可能性がある。このタイプのタンパク質不純物は、親和性および／または強陰イオン交換カラム精製後の試料に影響力があるレベルで存在するとは考えられなかった。ＡＡＶ試料の１４回注入後、移動相ブラン
クの注入は、単量体ＡＡＶ５の保持時間付近の両波長による検出可能なピークを示さず、先の注入からのキャリーオーバーが無いことを示す。

【0117】

ＳＥＣ－ＤＷ法を使用して、製剤原料（ＤＳ）の代表組成物中および実用参照標準（ＷＲＳ）中の完全キャプシドのパーセンテージを決定した。試料は、異なる比の空および完全キャプシドを含有するＨＰＬＣ標準を使用して作成した標準曲線に対して比較した（図３Ｄ）。次いで、解析は、異なる日の複数のアッセイ場面（異なる移動相ロット）にわたり実行した。ＰＡ２６０／ＰＡ２３０値は、ＤＳ、ＷＲＳおよび空キャプシド試料で０．５５（ｎ＝８）、０．５７（ｎ＝４）、および０．１１（ｎ＝６）であった。結果は、ＤＳおよびＷＲＳ試料が、それぞれおよそ７６％および８３％完全キャプシドを含有し（図３Ｅ）、ＡＵＣ－ＳＶによって得られた結果と類似していることを示した。空キャプシド試料のパーセント完全キャプシドは０％であった（確立された一次方程式に基づいて算出した実測値は－１．１％であった）。ＤＳ試料（ｎ＝８）およびＷＲＳ試料（ｎ＝４）のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比の％ＲＳＤ値および％完全キャプシドは１％よりも少なく、本結果が、異なるアッセイ、異なる移動相ロット、および異なる日で高度に再現可能であることを実証した。

【0118】

空および完全キャプシドストックを使用して別々に調製したスパイク試料は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比とパーセント完全キャプシドの間に類似の一次方程式（ｙ＝０．００５７ｘ＋０．１１９５）および０．９９９のＲ^２値をもたらした。同じ傾きおよび類似の切片はまた、ＳＥＣ－ＤＷ法の限定変動を示した。

【0119】

方法におけるパラメーターの変化の効果の理解を得るため、展開中に移動相のｐＨおよび流速を計画的に変えた（３つのｐＨ値、６．６、７．０、および７．５、ならびに３つの流速、０．７０、０．７５、および０．８０ｍＬ／分）。同じＤＳ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０値は、３つ全てのｐＨ条件下で０．５５であり、３つの流速で０．５４であった。パーセント完全キャプシドは７４．８～７６．４％の範囲であり、一次方程式を使用して再び確立した。これらの結果は、ＳＥＣ－ＤＷ法は、試験した変動内で強固であることを示した。

【0120】

実施例３：ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによる完全キャプシドのパーセントの決定の比較
以下の実施例は、ＡＡＶ調製物中の完全キャプシドのパーセンテージを決定する、二波長検出を有するサイズ排除クロマトグラフィー、沈降速度分析用超遠心（ＡＵＣ－ＳＶ）、および低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）の能力を比較する実験を記載する。

【0121】

材料および方法
沈降速度分析用超遠心（ＡＵＣ－ＳＶ）。空キャプシド、スパイク試料、および完全キャプシドは、１０Ｋ ＭＷＣＯ Ｓｌｉｄｅ－ａ－Ｌｙｚｅｒ（商標）またはＡｍｉｃｏｎ １０Ｋ ＭＷＣＯ遠心フィルター（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ Ｓｉｇｍａ，ＭＯ）を使用して、１×ＰＢＳ、ｐＨ７．２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に緩衝液を交換した。これらの試料の２６０ｎｍでの吸光度（Ａ_２６０）はナノドロップ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｆｉｃ，ＭＡ）を使用して測定し、試料が沈降実験のために十分濃縮されたことを確かめた（０．２≦Ａ_２６０≦０．６）。

【0122】

沈降速度実験のため、ＡＵＣ試料（～４００μＬ）を１．２ｃｍ Ｃｈａｒｃｏａｌ－ｆｉｌｌｅｄ Ｅｐｏｎ ｃｅｎｔｅｒｐｉｅｃｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）の２つのセクターの試料セクターにロードし、ＰＢＳ（～４１０μＬ）を参照セクターにロードした。細胞を４穴ローターにいれ、遠心中に少なくとも１時間、２０℃、フルバキュームで平衡化した（Ｏｐｔｉｍａ（商標）ＸＬ－Ｉ，Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ
）。ベクターを２００００ｒｐｍで沈降し、ベクターの吸光度を、連続モードの２６０ｎｍでスキャンした。

【0123】

ＡＵＣ－ＳＶデータ解析。吸光度データをＳＥＤＦＩＴにロードし、連続ｃ（ｓ）分布モデルにフィットした。メニスカスを浮かせ、時不変（ＴＩ）および半径不変（ＲＩ）ノイズ補正により、Ｌａｍｍ方程式にデータをフィットする間フリクション比は１．０に固定した。二次導関数規則を、信頼水準０．６８でフィッティングに適用した。１～２００の範囲の沈降係数を２００の分解能で使用した。ＰＢＳの公開された密度および粘度値を使用した。検出の単位での各種の相対的存在量は、ベールの法則に従って吸光度を補正することによりモル濃度の相対的存在量に変換した。各種の含量は、全体のパーセントとして報告した。データ解析の詳細は、Ｂｕｒｎｈａｍ，Ｂ．ら（Ｂｕｒｎｈａｍ，Ｂ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５年，２６（６），２２８～４２頁）に記載されている。

【0124】

低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）グリッド調製。Ｃ－ｆｌａｔ孔開きカーボングリッドを、Ｐｅｌｃｏ ＥａｓｉＧｌｏｗプラズマ洗浄装置で３０秒間、２０ｍＡで洗浄した。ガラス標本は、グリッドを手動プランジャー（ＥＭＳ－００２ Ｒａｐｉｄ Ｉｍｍｅｒｓｉｏｎ Ｆｒｅｅｚｅｒ）にロードし、４μＬのウイルスをグリッドに添加し、すぐに２秒間グリッドを片面ブロッティングし、液体エタン中で試料を凍結することにより調製した。

【0125】

Ｃｒｙｏ－ＥＭ画像化。電子顕微鏡は、３００ｋＶで加速する電圧によって操作され、Ｋ３直接電子検出器を備えたＴｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（登録商標）電子顕微鏡を使用して実行した。データは、２．５μｍでデフォーカスおよび～４８．０ｅ^－／Å^２の用量での、名目上の倍率１０５，０００×（ピクセルサイズ０．８３Å）でＳｅｒｉａｌＥＭを使用して回収した。

【0126】

Ｃｒｙｏ－ＥＭデータ解析。ＵＭａｓｓ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＣｒｙｏ－ＥＭ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙにて開発したインハウスのデータ解析ソフトウェアプログラムを使用して、空および完全キャプシドを認識および計数した。パーセント完全キャプシドの定量のため、多くの画像を処理し、およそ２，２００～８，７００個のベクターを全て解析し、各スパイク試料の空および完全キャプシドとして計数した。各試料について解析した全ての画像からの完全キャプシドの含量は全キャプシドのパーセントとして報告した。

【0127】

結果
ＡＵＣ－ＳＶによるパーセント完全キャプシド
空および完全キャプシドのＳＥＣ－ＤＷ法の適合性をさらに調べるため、先に開発された方法を使用してスパイク試料をＡＵＣ－ＳＶによって解析した（Ｂｕｒｎｈａｍ，Ｂ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５年，２６（６），２２８～４２頁参照）。スパイク試料は、まず１×ＰＢＳに緩衝液交換し、ＡＵＣセルに移し、２０，０００ｒｐｍで沈降した。ベクターの沈降は、連続モードで遠心力場に沿って２６０ｎｍでモニターし、獲得したデータはコンピュータープログラムＳＥＤＦＩＴを使用してＬａｍｍ方程式にフィットした（Ｂｒｏｗｎ，Ｐ．Ｈ．ら，Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ ２００６年，９０（１２），４６５１～６１頁）。４つの試料の代表的な沈降係数分布ｃ（ｓ）プロット（空、２つのスパイク試料および完全キャプシド）を図５に示す。

【0128】

空、部分および完全キャプシドを含む異なる種、ならびに高分子量種を、それらの沈降係数に基づいて検出および同定した（～４．３７０ヌクレオチドの導入遺伝子を含む、およそ、空キャプシドは６４～６６Ｓ、部分キャプシドは８０～９０Ｓ、および完全キャプ
シドは１０１～１０７Ｓ）。さらに、わずかな量の高分子量種が明らかである。これらの高分子量種は、全体的な空、部分および完全キャプシドの定量に含まれない。各ピークの統合は、検出の単位での各種の相対パーセンテージをもたらし、個々の種の２６０ｎｍでの吸光係数のかなりの違いのため、それはベールの法則に従って各種のモル濃度に変換された（Ｂｕｒｎｈａｍ，Ｂ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１５年，２６（６），２２８～４２頁）。図５Ａは、空キャプシド試料の亜集団の沈降係数分布プロットを示す（９８％空キャプシド（６５Ｓ）および２％部分キャプシド（８１Ｓ））。塩化セシウム密度勾配遠心分離によって精製した完全キャプシド試料の結果は図５Ｄに示し、試料が９１％完全キャプシド（１０４Ｓ）および９％部分キャプシド（８８Ｓ）を含有することを示した。８８Ｓの沈降係数を有する部分キャプシドは、およそ２，７００ヌクレオチドの断片化ゲノムを持つキャプシドを表す（Ｎａｓｓ，Ｓ．Ａ．ら，Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ ２０１８年，９，３３～４６頁）。別々のＡＵＣ－ＳＶ解析で、空試料の亜集団は、９９％空（６５Ｓ）および１％部分キャプシド（８３Ｓ）、完全キャプシド試料の亜集団は、８％部分（８６Ｓ）および９２％完全キャプシド（１０１Ｓ）であり、ＡＵＣ－ＳＶラン間の一貫性を実証する。

【0129】

図５Ｂおよび図５Ｃは、完全および空キャプシド含有試料を混合することによって調製した試料を示す。これらの試料の％完全キャプシドは、完全および空キャプシド試料の代入値および組み合わせた容積に基づき、それぞれ５５％および８２％完全キャプシドとして算出された。完全キャプシド含量は、これら２つの試料についてＡＵＣ－ＳＶにより５２％および８８％であった。ＳＥＣ－ＤＷ法からの結果は、ＡＵＣ－ＳＶの結果と非常に良く一致した（これら２つの試料のおよそ５８％および８１％）。部分キャプシドの小画分は、厳密な精製を試みても、全ての試料、特に完全キャプシド試料に存在した。部分キャプシドの存在は、主に完全キャプシドからなる製剤原料を産生することに難題を示した。部分キャプシドは、陰イオン交換クロマトグラフィー、ＳＥＣおよび透過電子顕微鏡法によって見つけることができないが、ＡＵＣ－ＳＶによって十分に区別された。さらに、ＡＵＣ－ＳＶから回収した試料は、２５μＬの注入で直接、ＳＥＣ－ＤＷによって再解析した。類似のクロマトグラフィープロファイルおよびパーセント完全キャプシドの結果が得られ、全てのキャプシドがＡＵＣ－ＳＶ実験後に無傷のままであったことを確認した。

【0130】

Ｃｒｙｏ－ＥＭによるパーセント完全キャプシド
低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ＥＭ）は、それらの凍結水和状態で空および完全キャプシドを測定することができる電子顕微鏡技術である（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１９年，３０（１２），１４４９～１４６０頁）。ガラス化キャプシドは、それらを液体エタン中で凍結することによって調製し、Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓを使用して電子顕微鏡画像を回収した。およそ５５％完全キャプシドを含有するスパイク試料で撮られたＣｒｙｏ－ＥＭ画像の１つを図６Ａに示し、代表的な完全キャプシド（顕著な内部密度を示す）および空キャプシド（内部密度がない）を丸で囲み、空キャプシドと完全キャプシドは両方ともサイズが類似していた（およそ２４ｍｍ）。図６Ｂは、完全キャプシド試料の画像から選択され、空キャプシドがほとんど同定されない。各スパイク試料では、複数の画像からの少なくとも２，２００粒子が、インハウスデータ解析ソフトウェア（ＵＭＡＳＳ Ｍｅｄｉｃａｌ ＳｃｈｏｏｌのＣｒｙｏ－ＥＭコア施設）を使用して計数された。解析した全ての画像からの結果を組合せ、完全キャプシドのパーセンテージを算出し、統計的有意性を確認した。部分キャプシドは、この研究では、Ｃｒｙｏ－ＥＭ解析によって完全キャプシドとして処置されるが、それらは３Ｄ分類によってＣｒｙｏ－ＥＭにより同定された（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｓ．ら，Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ ２０１９年，３０（１２），１４４９～１４６０頁）。空、スパイク試料および完全キャプシド試料の完全キャプシドのパーセンテージは、３、２４、３７、５４、８１、８８および９７％である。Ｃｒｙｏ－ＥＭによる試料中の解析した画像の数、完全キャプシドの総数、空キャプシドの総数、低信頼値で計数した粒子の数（アーティフ
ァクト、バックグラウンドシグナル等）、およびパーセント完全キャプシドを表３に要約する。ＳＥＣ－ＤＷ結果は、Ｃｒｙｏ－ＥＭによって測定したパーセント完全キャプシドに類似し、したがってＳＥＣ－ＤＷは、適性製造基準の実行可能な選択肢を提供する。

【0131】

【表3】

【0132】

ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定したパーセント完全キャプシドの比較
ＳＥＣ－ＤＷ法を科学的に確認するため、ＳＥＣ－ＤＷによって決定された完全キャプシドのパーセンテージは、パーセント完全キャプシドを正確に測定できる２つの最先端の高分解法：ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭからの結果と比較した。これら３つの方法は全て、天然状態のＡＡＶ試料を特徴付ける：ＳＥＣ－ＤＷのカラムを通過する溶液中、ＡＵＣ－ＳＶの遠心力場の溶液中、およびＣｒｙｏ－ＥＭの瞬間冷凍後の凍結水和状態。ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定されたスパイク試料のパーセント完全キャプシドを図７Ａ～７Ｂに示し、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定したスパイク試料中の完全キャプシドのパーセンテージを示す。３つの方法全てからの結果は、観察および期待されたパーセント完全キャプシド間の優れた直線性を示し（図７Ａ～７Ｂは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定されたスパイク試料中の完全キャプシドのパーセンテージを示す）、線形回帰からのＲ^２値によって判断した（それぞれ、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭでは、０．９９７、０．９９３、および０．９９３）。線形回帰の傾きは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭでは、０．９８９、１．０６２、および１．０３８であり、ＳＥＣ－ＤＷ法が、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭ法と比較した場合、いずれの顕著なバイアスも示さなかったことを示す。部分キャプシドは、この研究ではＣｒｙｏ－ＥＭによる完全キャプシドとして処置され、したがって、各試料の報告された完全キャプシドはＡＵＣ－ＳＶからのそれらの値よりもわずかに高かった（図７Ａ～７Ｂは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定されたスパイク試料中の完全キャプシドのパーセンテージを示す）。全体的に、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０に基づくＳＥＣ－ＤＷによるパーセント完全キャプシドは、試験した全範囲に渡り、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭからの結果（図７Ａ～７Ｂは、ＳＥＣ－ＤＷ、ＡＵＣ－ＳＶおよびＣｒｙｏ－ＥＭによって決定したスパイク試料中の完全キャプシドのパーセンテージを示す）と非常に良く一致し（０～９１％完全キャプシド、または０～９８％空キャプシド）、ＳＥＣ－ＤＷ法が正確であり信頼できることを示した。

【0133】

第２の組成物（ＤＳ）および相当する空キャプシドのＳＥＣ－ＤＷ結果
ＳＥＣ－ＤＷ法が一般化されるかどうか調べるため、異なる導入遺伝子を有するが、同じＡＡＶ血清型（ＡＡＶ５）であるＡＡＶ５ ＤＳ試料を、相当する濃縮した空キャプシドと共にＳＥＣ－ＤＷによってプロファイリングした（図９Ａ～９Ｄ）。濃縮した空キャプシドのＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は０．１２であり、方法の開発のために使用したＡＡＶ５空キャプシドとほぼ同じであり（ＰＡ２６０／ＰＡ２３０＝０．１１）、同じ血清型キャプシドのこの比の固有の性質を示している。第２のＤＳ試料のＰＡ２６０／ＰＡ２３０は０．５８であり、図３Ｄに示す直線関係を使用しておよそ８２％完全キャプシドであると見積もられた。また、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は、空キャプシドおよびＤＳ試料の両方で試験したロード範囲にわたり同じであった。これらの結果に基づき、このＳＥＣ－ＤＷ法が他のＡＡＶ５試料に一般化され、他の血清型にも一般化される可能性があると予想される。ＰＡ２６０／ＰＡ２０３とパーセント完全キャプシドの間の関係が、直接試験する試料に、アッセイパフォーマンスを確実にするために、適切なアッセイ対照、例えばＷＲＳ試料と共に適用された。

【0134】

結論
空および完全キャプシドの相対量を決定するための本明細書に記載のＳＥＣ－ＤＷ法は、開発および品質管理研究室で容易に利用可能であるＨＰＬＣ装置を使用し、試料中のパーセント完全キャプシドを直接定量し、少量の試料を必要とし（注入当たり５×１０^１２ｃｐ／ｍＬの１０～７５μＬの試料）、３つの方法の中でも最もハイスループットを提供し、現在の適性製造基準下での使用のために認定／検証される。ＳＥＣ－ＤＷ法は、さらなる試料調製、例えば変性および標識を必要とせず、マトリックスの影響はサイズ排除溶出中に効果的に排除された。

【0135】

部分キャプシドの存在は、現在の製造方法の使用では避けられないと考えられる。部分キャプシドにパッケージされる遺伝子配列は、２６０ｎｍおよび２３０ｎｍでの吸光度に寄与し、したがって、いくつかの変動を報告可能な結果に導入する。これらの変動の一部は、最初に確立された一次方程式に組み込まれ、したがって、パーセント完全キャプシドの定量への部分キャプシドの影響は限定される。球状溶質による光散乱は、レイリーの近似式に従って、λに反比例した（Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｓ．ら，Ｌａｎｃｅｔ ２０１７年，３９０（１００９７），８４９～８６０頁）。光散乱は、波長依存外挿を使用して、２３０ｎｍおよび２６０ｎｍでの吸光度について補正される。２２０～４００ｎｍでの空および完全キャプシドの吸光スペクトルは、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器によって得られたデータから除外され、顕著な光散乱は３２０～３６０ｎｍでの最小値から無視できる吸光度までに基づいて観察されなかった（図８、図９Ａ～９Ｄ参照）。

【0136】

本明細書に記載のＳＥＣ－ＤＷ法は、様々なＡＡＶ５ ＤＳ試料を使用して確立され、単量体ＡＡＶとして溶出し得る任意の他の巨大分子からの干渉がない限り、工程中の試料を試験するために適用できると期待される。工程中の試料は、濃縮機によって容易に濃縮され、適切なキャプシド濃度にすることができる。このＳＥＣ－ＤＷ法は、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０対パーセント完全キャプシドの直線関係が確立されると、他のＡＡＶ血清型に同様に適用される。低容量の試料および必要な装置を考慮すると、ＳＥＣ－ＤＷ法は、ハイスループット様式で、容易に利用可能な装置プラットフォームで空および完全キャプシド含量を決定するために有用であると期待される。

【0137】

実施例４：ＡＡＶ１スパイク試料の二波長検出を有するサイズ排除クロマトグラフィー
以下の実施例は、全ベクターゲノムの３．４６８ｋｂを有するＡＡＶ１キャプシドの調製物を解析する、二波長検出を有するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＤＷ）の使用を記載する。

【0138】

材料および方法
空キャプシド、完全キャプシドおよびスパイク試料の調製。空キャプシドは、ベンダー（Ｖｉｇｅｎｅ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から入手した。完全キャプシドは、内部で精製した。完全キャプシドは、分析用超遠心（ＡＵＣ）およびドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）（Ｂｉｏ－Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）によって特徴付けられ、キャプシド分布およびベクターゲノム濃度を決定した。空キャプシド調製物の濃度はＥＬＩＳＡによって決定し、パーセント空キャプシドはＴＥＭによって決定した。結果は、表４に要約する。

【0139】

【表4】

【0140】

一連の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）標準および様々な量の完全キャプシドを含有するスパイク試料は、それらのキャプシド濃度（ｃｐ／ｍＬ）に基づく既定した比率で空キャプシドおよび完全キャプシドを混合することにより調製した。これらの材料を使用して、空および完全キャプシドのＳＥＣ－ＤＷ法を開発した。

【0141】

ＳＥＣ二波長。ＡＡＶキャプシド（通常、注入当たり４０μＬまたは５０μＬ）は、ＣａＣｌ_２を含まず、ＭｇＣｌ_２を含まないダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）によって２５℃で平衡化したガードカラム（ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００，５μｍ，５００Å，７．８×５０ｍｍ）を備えたサイズ排除カラム（Ｓｅｐａｘ ＳＲＴ（登録商標）ＳＥＣ－５００，５μｍ，５００Å，７．８×３００ｍｍ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）にロードした。

【0142】

オートサンプラーの温度は５℃に設定した。キャプシドは、Ａｇｉｌｅｎｔ１２００シリーズＨＰＬＣ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＣＡ）を使用して、流速０．７５ｍＬ／分で、ＤＰＢＳ ｐＨ７．２によって溶出した。溶出液を、２６０ｎｍ、２８０ｎｍおよび２３０ｎｍでモニターし、データをＡｇｉｌｅｎｔ ＯｐｅｎＬａｂソフトウェアによって得た。

【0143】

２３０ｎｍ、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍでの単量体ＡＡＶのピーク面積は、ピーク面積（ＰＡ）比（例えば、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０、およびＰＡ２６０／ＰＡ２８０）を算出するために使用した。パーセント完全キャプシドとのピーク面積比の相関は、ＨＰＬＣ標準および様々な量の完全キャプシドを含有するスパイク試料を使用して確立した。

【0144】

結果
ＡＡＶ１スパイク試料の二波長検出を有するＳＥＣ
２６０ｎｍおよび２３０ｎｍでモニターしたピーク面積は、カラムローディングに比例し、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０比は試験した範囲にわたり一定なままであり、固有のＰＡ２６０／ＰＡ２３０比はキャプシド濃度に依存しなかったことを確認した。ピーク面積比の検出および算出のためにこの新しい二波長を使用することにより、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０とパーセント完全キャプシドの間の直線関係が確立された（ｙ＝０．００５４ｘ＋０．
０８８６）。適合度は優れており、０．９８７５のＲ^２によって判断した（図１０）。

【0145】

ＰＡ２６０／ＰＡ２６０２３０比対パーセント完全キャプシドを使用する場合、線形曲線フィットを使用する能力が重要であり、したがって変更は７０％完全キャプシドを超えるアッセイ範囲の拡大を可能にする。アッセイ範囲が、検出のためのＡ２６０およびＡ２８０の使用と比較して著しく拡大されるであろうことは注目に値し、完全キャプシドの量が７０％より多い場合、ＰＡ２６０／ＰＡ２３０のプラトーは観察されないが、プラトーは、完全キャプシドの量が７０％より多い場合、ＰＡ２６０／ＰＡ２８０で明らかであった。

【図1-1】

【図1-2】

【図2】

【図3-1】

【図3-2】

【図4】

【図5-1】

【図5-2】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9-1】

【図9-2】

【図10】

【国際調査報告】